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▶ リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-20
(54)【発明の名称】タンパク質の翻訳後修飾のタンデム質量タグ多重化定量
(51)【国際特許分類】
G01N 27/62 20210101AFI20230313BHJP
C07K 1/13 20060101ALI20230313BHJP
C07K 16/00 20060101ALN20230313BHJP
【ＦＩ】
G01N27/62 V ZNA
G01N27/62 X
C07K1/13
C07K16/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022545340
(86)(22)【出願日】2021-01-26
(85)【翻訳文提出日】2022-07-26
(86)【国際出願番号】 US2021015146
(87)【国際公開番号】W WO2021154764
(87)【国際公開日】2021-08-05
(31)【優先権主張番号】62/966,151
(32)【優先日】2020-01-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】597160510
【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100140132
【弁理士】
【氏名又は名称】竹林 則幸
(72)【発明者】
【氏名】ユアン・マオ
(72)【発明者】
【氏名】アンドリュー・クラインバーグ
【テーマコード（参考）】
2G041
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G041CA01
2G041DA05
2G041EA04
2G041FA12
2G041GA09
2G041HA01
2G041JA02
2G041JA04
2G041KA01
2G041LA08
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA50
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA65
4H045FA15
4H045FA74
(57)【要約】
単一の質量分析（ＭＳ）実行において複数の試料の翻訳後修飾などの複数の質属性を定量化する方法が開示され、該方法は、試料を消化するのに十分な条件下で、２つ以上の試料を消化溶液と接触させることであって、各試料は、別々に消化され、消化溶液は、トリスを含まない緩衝溶液である、接触させることと、２つ以上の消化された試料の各々内のペプチドを特定のタンデム質量タグ（ＴＭＴ）標識試薬で標識するのに十分な条件下で、消化された試料の各々を特定のＴＭＴ標識試薬と接触させることと、２つ以上の消化された試料の各々内のペプチドの標識をクエンチすることと、等体積の２つ以上の標識され、消化された試料を、単一の混合試料溶液に混合することと、標的化質量スペクトル分析によって単一の混合試料溶液を分析し、それによって、２つ以上の試料の複数の質属性が単一の質量分析（ＭＳ）実行において定量化されることを可能にすることと、を含む。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
単一の質量分析（ＭＳ）実行において複数の試料の複数の質属性を定量化する方法であって、２つ以上の試料を消化するのに十分な条件下で、前記２つ以上の試料を消化溶液と接触させることであって、各試料は、別々に消化され、前記消化溶液は、トリスを含まない緩衝溶液である、接触させることと、
前記２つ以上の消化された試料の各々内のペプチドを特定のタンデム質量タグ（ＴＭＴ）標識試薬で標識するのに十分な条件下で、前記２つ以上の消化された試料の各々を前記特定のＴＭＴ標識試薬と接触させることと、
前記２つ以上の消化された試料の各々内のペプチドの標識をクエンチすることと、
等体積の前記２つ以上の標識され、消化された試料を、単一の混合試料溶液に混合することと、
標的化質量スペクトル分析によって前記単一の混合試料溶液を分析し、それによって、前記２つ以上の試料の複数の質属性が単一のＭＳ実行において定量化されることを可能にすることと、を含む、方法。
【請求項2】
複数の質属性は、翻訳後修飾（ＰＴＭ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＰＴＭは、脱アミド化、酸化、糖化、ジスルフィド形成、Ｎ末端ピログルタミン酸形成、Ｃ末端リジン除去、およびグリコシル化のうちの１つ以上を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＰＴＭは、グリコシル化を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
単一のＭＳ実行において複数の質属性を定量化することは、標的化質量スペクトルにおいて生成された結果として生じるレポートイオンの抽出されたピーク面積からＰＴＭの相対存在量を定量化することによって、前記ＰＴＭを定量化することを含む、請求項２～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記２つ以上の消化された試料の各々を特定のＴＭＴ標識試薬と接触させる前に、前記２つ以上の消化された試料の各々を小分子添加剤と接触させることをさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記小分子添加剤は、ＢＯＣ－Ｙ－ＯＨ、ｐ－クレゾール、ヒドロキシ－フェニル酢酸（ＨＰＡＡ）、ヒドロキシ安息香酸（ＨＢＡ）、アセトアミノフェン、およびｐ－アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項8】
前記小分子添加剤は、ＰＡＢＡである、請求項６に記載の方法。
【請求項9】
前記ペプチドは、糖ペプチドである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記糖ペプチドは、モノクローナル抗体から取得される、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記モノクローナル抗体は、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、または混合アイソタイプのものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
２つ以上の試料は、２～１１個の試料である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
分析される２または試料を取得することをさらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記２つ以上の試料を消化するのに十分な条件下で前記２つ以上の試料を消化溶液と接触させる前に、消化のための前記２つ以上の試料を調製することをさらに含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
消化前に前記２つ以上の試料を調製することは、試料の変性および還元を可能にする条件下で、前記２つ以上の試料の各々を変性および還元溶液と接触させることと、試料のアルキル化を可能にする条件下で、前記２つ以上の変性および還元された試料の各々をアルキル化溶液と接触させることと、を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
標的化質量スペクトル分析によって前記単一の混合試料溶液を分析することは、単一の混合試料を分離カラムに適用することと、溶出した試料成分に対して標的化質量スペクトル分析を行うことと、を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記分離カラムは、液体クロマトグラフィーカラムである、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
溶出した試料成分に対して標的化質量スペクトル分析を行うことは、エレクトロスプレーイオン化を適用して前記溶出した試料成分から荷電イオンを生成することと、前記生成された荷電イオンを測定することと、を含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項19】
単一の質量分析（ＭＳ）実行において複数の試料の翻訳後修飾（ＰＴＭ）を定量化する方法であって、２つ以上の試料を消化するのに十分な条件下で、前記２つ以上の試料を消化溶液と接触させることであって、各試料は、別々に消化され、前記消化溶液は、トリスを含まない緩衝溶液である、接触させることと、
前記２つ以上の消化された試料の各々を小分子添加剤と接触させることと、
前記２つ以上の消化された試料の各々内のペプチドを特定のタンデム質量タグ（ＴＭＴ）標識試薬で標識するのに十分な条件下で、前記２つ以上の消化された試料の各々を前記特定のＴＭＴ標識試薬と接触させることと、
前記２つ以上の消化された試料の各々内のペプチドの標識をクエンチすることと、
等体積の前記２つ以上の標識され、消化された試料を、単一の混合試料溶液に混合することと、
標的化質量スペクトル分析によって前記単一の混合試料溶液を分析し、それによって、前記２つ以上の試料のＰＴＭが単一のＭＳ実行において定量化されることを可能にすることと、を含む、方法。
【請求項20】
前記ＰＴＭは、脱アミド化、酸化、糖化、ジスルフィド形成、Ｎ末端ピログルタミン酸形成、Ｃ末端リジン除去、およびグリコシル化のうちの１つ以上を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項21】
ＰＴＭは、グリコシル化を含む、請求項２０記載の方法。
【請求項22】
ＰＴＭを定量化することは、標的化質量スペクトルにおいて生成された結果として生じるレポートイオンの抽出されたピーク面積からＰＴＭの相対存在量を定量化することを含む、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記小分子添加剤は、ＢＯＣ－Ｙ－ＯＨ、ｐ－クレゾール、ヒドロキシ－フェニル酢酸（ＨＰＡＡ）、ヒドロキシ安息香酸（ＨＢＡ）、アセトアミノフェン、およびｐ－アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）からなる群から選択される、請求項１９～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記小分子添加剤は、ＰＡＢＡである、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記ペプチドは、糖ペプチドである、請求項１９～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記糖ペプチドは、モノクローナル抗体から取得される、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記モノクローナル抗体は、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、または混合アイソタイプのものである、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
２つ以上の試料は、２～１６個の試料である、請求項１９～２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
分析される２または試料を取得することをさらに含む、請求項１９～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記２つ以上の試料を消化するのに十分な条件下で前記２つ以上の試料を消化溶液と接触させる前に、消化のための前記２つ以上の試料を調製することをさらに含む、請求項１９～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
消化前に前記２つ以上の試料を調製することは、試料の変性および還元を可能にする条件下で、前記２つ以上の試料の各々を変性および還元溶液と接触させることと、試料のアルキル化を可能にする条件下で、前記２つ以上の変性および還元された試料の各々をアルキル化溶液と接触させることと、を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
標的化質量スペクトル分析によって前記単一の混合試料溶液を分析することは、単一の混合試料を分離カラムに適用することと、溶出した試料成分に対して標的化質量スペクトル分析を行うことと、を含む、請求項１９～３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
前記分離カラムは、液体クロマトグラフィーカラムである、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
溶出した試料成分に対して標的化質量スペクトル分析を行うことは、エレクトロスプレーイオン化を適用して前記溶出した試料成分から荷電イオンを生成することと、前記生成された荷電イオンを測定することと、を含む、請求項３２または３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
配列表の参照
本出願は、２０２１年１月２６日に作成され、１４６２バイトを含むファイル１０６９３ＷＯ０１－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｔｘｔとしてコンピュータ可読形式で提出された配列表を参照により組み込む。
本出願は、２０２１年１月２６日に作成され、１４６２バイトを含むファイル１０６９３ＷＯ０１－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｔｘｔとしてコンピュータ可読形式で提出された配列表を参照により組み込む。
【0002】
本発明は、バイオ医薬品に関し、治療用モノクローナル抗体などのタンパク質の翻訳後修飾のタンデム質量タグ（ＴＭＴ）多重化定量に関する。
【背景技術】
【0003】
１９８６年に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって最初に承認されて以来、組換えモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、高い特異性、長い循環半減期、免疫細胞エフェクター応答を引き起こす可能性、および小分子薬物と比較してより少ない副作用などにより、薬物開発パイプラインおよびバイオ医薬品市場における種々のヒト疾患の処置において最も急速に成長しているクラスのバイオ治療薬のうちの１つとして浮上している。現在までに、およそ８０種のＩｇＧ ｍＡｂ薬物産物がＦＤＡおよび欧州医薬品庁（ＥＭＡ）によって承認されており、７０種超が後期開発段階にある。
【0004】
ＩｇＧ ｍＡｂは、複数のジスルフィド結合を介して共有結合してＹ型構造を形成する２つの同一の重鎖および軽鎖からなるおよそ１５０ｋＤａの共有結合ヘテロテトラマータンパク質である。ｍＡｂは、サイズが大きく構造が複雑であるため、細胞培養、精製、製剤化および保存中に、Ｆｃグリコシル化、メチオニン（Ｍｅｔ）酸化、アスパラギン（Ａｓｎ）脱アミド化、アスパラギン酸（Ａｓｐ）環化／異性化、Ｎ末端グルタミン（Ｇｌｎ）またはグルタミン酸（Ｇｌｕ）環化、Ｃ末端リジン（Ｌｙｓ）クリッピング、非酵素的Ｌｙｓ糖化およびトリスルフィド結合などの多種多様な翻訳後修飾（ＰＴＭ）を受けやすい。ＰＴＭは、構造的不均一性の主な原因であり得、ｍＡｂの生理化学的特性の調節において重要な役割を果たし得る。影響を受けた残基の位置（例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）における）に依存するグリコシル化、脱アミド化および酸化などの一部のＰＴＭは、安定性、機能、免疫原性および薬物動態／薬力学に対して有害な影響を与える場合もあり、これらは通常、薬物開発中の綿密なモニタリングのための抗体の重要な質属性（ＣＱＡ）と考えられている（非特許文献１；非特許文献２）。ほとんどのＩｇＧ抗体における重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）および３（ＣＨ３）の界面に位置する２つの保存されたＭｅｔ残基の酸化は、熱安定性（非特許文献３）、プロテインＡ結合（非特許文献４）、ＦｃＲｎ結合（非特許文献５）、およびＩｇＧ抗体の循環半減期（非特許文献６）を減少させ得るが、溶媒に曝露されたＣＤＲにおけるＭｅｔまたはトリプトファン（Ｔｒｐ）酸化およびＡｓｎ脱アミド化は、抗原結合および効力に潜在的に影響を及ぼし得る（非特許文献７；非特許文献８）。抗体のＦｃ領域内の重鎖ＣＨ２の保存されたＡｓｎにおけるＮ結合型グリコシル化もまた、ｍＡｂの構造および安定性を維持するために重要であり、一部の場合では、ＦＣγ受容体への結合を調節することによって、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）などの下流エフェクター機能を調節することができる（非特許文献９）。したがって、治療用抗体の開発、生産および貯蔵中に、ＰＴＭ、特にＣＱＡとみなされるもののレベルを特徴付け、および制御し、産物の質を保証し、最終的な安全性および効力に対する任意の潜在的な効果を定義することが不可欠である。
【0005】
液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）によるペプチドマッピングは、分子レベルで治療用抗体を特徴付けるためにバイオ医薬品産業内で使用されている（非特許文献１０；非特許文献１１）。この方法は、非還元（非還元ペプチドマッピング）または還元（還元ペプチドマッピング）条件下でのタンパク質の酵素（すなわち、典型的にはトリプシン）消化、続いて得られたペプチドの分離および紫外線（ＵＶ）検出および／または質量分析（ＭＳ）による分析を含むボトムアップ方法論を使用するものであり、鎖間および鎖内ジスルフィド結合によって維持される構造統合性の評価、タンパク質アミノ酸の配列の確認、ならびに生産、加工または保存中に生じ得る翻訳後および化学修飾の際の部位特異的定量の提供という利点をもたらすものである（非特許文献１２）。
【0006】
ＰＴＭ分析のためのＬＣ－ＭＳベースのペプチドマッピング法において、部位特異的ＰＴＭは、対応する天然ペプチドおよび修飾ペプチドのＥＩＣピーク面積の合計に対する、ＰＴＭを含有する修飾ペプチドの抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）ピーク面積の比を計算することによって、酵素消化物のＭＳ１スペクトルから定量化される。合理化されたペプチドマッピングワークフローは、ＬＣ－ＭＳ機器およびバイオインフォマティクスソフトウェアの急速な進歩に起因して、単一のＬＣ－ＭＳ実行において、高い配列カバレッジを生成し、抗体試料の複数の属性（例えば、異なる部位特異的ＰＴＭ）を効率的に特徴付けることができるが、部位特異的ＰＴＭの相対的定量のためのこの従来の無標識アプローチは、試料調製および個々の試料についての質量分析データ取得を必要とする。これには、かなりの時間を要する可能性があり、薬物開発中のモノクローナル抗体の特徴付けについての高まる要求に対応することが困難となっている。ペプチドマッピング技術に対する最近の研究の進歩は、スループットを増加させるための自動化システムまたは試料調製時間を短縮するためのオンライン消化システムの開発など、試料調製効率の改善に主に焦点が当てられている（非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５）。しかしながら、試料サイズが増加すると、試料のＬＣ－ＭＳデータ取得に必要な機器時間も直線的に増加し、これは、タンパク質特徴付けのためのペプチドマッピングワークフローの全体的な効率を制限するだけでなく、ペプチドマッピングにおける消化物のＬＣ－ＭＳ分析中の時間および温度関連機器変動、機器ハードウェアおよびソフトウェアグリッチまたはオートサンプラーにおける試料保存安定性から生じるＰＴＭ定量に大きな変動性をもたらす可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．２００７，９６，１－２６
【非特許文献2】Ｍａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．２０１０，２７，５４４－５５７
【非特許文献3】Ｈｏｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２０１０，９，１７１６－１７２８
【非特許文献4】Ｂｅｒｔｏｌｏｔｔｉ－Ｃｉａｒｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９，４６，１８７８－１８８２
【非特許文献5】Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１４，８６，３４６８－３４７５
【非特許文献6】Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１，４８，８６０－８６６
【非特許文献7】Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．２００９，９８，３５０９－３５２１
【非特許文献8】Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．２００９，９８，３５０９－３５２１
【非特許文献9】Ｊｅｎｎｅｗｅｉｎ，Ｍ．Ｆ．；Ａｌｔｅｒ，Ｇ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１７，３８，３５８－３７２
【非特許文献10】Ｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１３，８５，７１５－７３６
【非特許文献11】Ｓａｎｄｒａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．２０１４，１３３５，８１－１０３
【非特許文献12】Ｍｏｕｃｈａｈｏｉｒ，Ｔ．；Ｓｃｈｉｅｌ，Ｊ．Ｅ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１８，４１０，２１１１－２１２６
【非特許文献13】Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１１，４１１，２８４－２９１
【非特許文献14】Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．２０１９，１０８，３５４０－３５４９
【非特許文献15】Ｍａｏ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ．２０１９，１１，７６７－７７８
【発明の概要】
【0008】
一態様では、本発明は、単一の質量分析（ＭＳ）実行において複数の試料の複数の質属性を定量化する方法を提供し、該方法は、２つ以上の試料を消化するのに十分な条件下で、２つ以上の試料を消化溶液と接触させることであって、各試料は、別々に消化され、消化溶液は、トリスを含まない緩衝溶液である、接触させることと、２つ以上の消化された試料の各々内のペプチドを特定のタンデム質量タグ（ＴＭＴ）標識試薬で標識するのに十分な条件下で、２つ以上の消化された試料の各々を特定のＴＭＴ標識試薬と接触させることと、２つ以上の消化された試料の各々内のペプチドの標識をクエンチすることと、等体積の２つ以上の標識され、消化された試料を、単一の混合試料溶液に混合することと、標的化質量スペクトル分析によって単一の混合試料溶液を分析し、それによって、２つ以上の試料の複数の質属性が単一の質量分析（ＭＳ）実行において定量化されることを可能にすることと、を含む。
【0009】
一部の実施形態では、複数の質属性は、翻訳後修飾（ＰＴＭ）を含む。
【0010】
一部の実施形態では、ＰＴＭは、脱アミド化、酸化、糖化、ジスルフィド形成、Ｎ末端ピログルタミン酸形成、Ｃ末端リジン除去、およびグリコシル化のうちの１つ以上を含む。
【0011】
一部の実施形態では、ＰＴＭは、グリコシル化を含む。
【0012】
一部の実施形態では、単一のＭＳ実行において複数の質属性を定量化することは、標的化質量スペクトルにおいて生成された結果として生じるレポートイオンの抽出されたピーク面積からＰＴＭの相対存在量を定量化することによって、ＰＴＭを定量化することを含む。
【0013】
一部の実施形態では、本方法は、２つ以上の消化された試料の各々を特定のＴＭＴ標識試薬と接触させる前に、２つ以上の消化された試料の各々を小分子添加剤と接触させることをさらに含む。
【0014】
一部の実施形態では、小分子添加剤は、ＢＯＣ－Ｙ－ＯＨ、ｐ－クレゾール、ヒドロキシ－フェニル酢酸（ＨＰＡＡ）、ヒドロキシ安息香酸（ＨＢＡ）、アセトアミノフェン、およびｐ－アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）からなる群から選択される。
【0015】
一部の実施形態では、小分子添加剤は、ＰＡＢＡである。
【0016】
一部の実施形態では、ペプチドは、糖ペプチドである。
【0017】
一部の実施形態では、糖ペプチドは、モノクローナル抗体から取得される。
【0018】
一部の実施形態では、モノクローナル抗体は、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、または混合アイソタイプのものである。
【0019】
一部の実施形態では、２つ以上の試料は、２～１６個の試料である。
【0020】
一部の実施形態では、本方法は、分析される２または試料を取得することをさらに含む。
【0021】
一部の実施形態では、本方法は、２つ以上の試料を消化するのに十分な条件下で２つ以上の試料を消化溶液と接触させる前に、消化のための２つ以上の試料を調製することをさらに含む。
【0022】
一部の実施形態では、消化前に２つ以上の試料を調製することは、試料の変性および還元を可能にする条件下で、２つ以上の試料の各々を変性および還元溶液と接触させることと、試料のアルキル化を可能にする条件下で、２つ以上の変性および還元された試料の各々をアルキル化溶液と接触させることと、を含む。
【0023】
一部の実施形態では、標的化質量スペクトル分析によって単一の混合試料溶液を分析することは、単一の混合試料を分離カラムに適用することと、溶出した試料成分に対して標的化質量スペクトル分析を行うことと、を含む。
【0024】
一部の実施形態では、分離カラムは、液体クロマトグラフィーカラムである。
【0025】
一部の実施形態では、溶出した試料成分に対して標的化質量スペクトル分析を行うことは、エレクトロスプレーイオン化を適用して溶出した試料成分から荷電イオンを生成することと、生成された荷電イオンを測定することと、を含む。
【0026】
本発明の一態様では、単一の質量分析（ＭＳ）実行において複数の試料の翻訳後修飾（ＰＴＭ）を定量化する方法は、２つ以上の試料を消化するのに十分な条件下で、２つ以上の試料を消化溶液と接触させることであって、各試料は、別々に消化され、消化溶液は、トリスを含まない緩衝溶液である、接触させることと、２つ以上の消化された試料の各々を小分子添加剤と接触させることと、２つ以上の消化された試料の各々内のペプチドを特定のタンデム質量タグ（ＴＭＴ）標識試薬で標識するのに十分な条件下で、２つ以上の消化された試料の各々を特定のＴＭＴ標識試薬と接触させることと、２つ以上の消化された試料の各々内のペプチドの標識をクエンチすることと、等体積の２つ以上の標識され、消化された試料を、単一の混合試料溶液に混合することと、標的化質量スペクトル分析によって単一の混合試料溶液を分析し、それによって、２つ以上の試料のＰＴＭが単一のＭＳ実行において定量化されることを可能にすることと、を含む。
【0027】
一部の実施形態では、ＰＴＭは、脱アミド化、酸化、糖化、ジスルフィド形成、Ｎ末端ピログルタミン酸形成、Ｃ末端リジン除去、およびグリコシル化のうちの１つ以上を含む。
【0028】
一部の実施形態では、ＰＴＭは、グリコシル化を含む。
【0029】
一部の実施形態では、ＰＴＭを定量化することは、標的化質量スペクトルにおいて生成された結果として生じるレポートイオンの抽出されたピーク面積からＰＴＭの相対存在量を定量化することを含む。
【0030】
一部の実施形態では、小分子添加剤は、ＢＯＣ－Ｙ－ＯＨ、ｐ－クレゾール、ヒドロキシ－フェニル酢酸（ＨＰＡＡ）、ヒドロキシ安息香酸（ＨＢＡ）、アセトアミノフェン、およびｐ－アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）からなる群から選択される。
【0031】
一部の実施形態では、小分子添加剤は、ＰＡＢＡである。
【0032】
一部の実施形態では、ペプチドは、糖ペプチドである。
【0033】
一部の実施形態では、糖ペプチドは、モノクローナル抗体から取得される。
【0034】
一部の実施形態では、モノクローナル抗体は、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、または混合アイソタイプのものである。
【0035】
一部の実施形態では、２つ以上の試料は、２～１６個の試料である。
【0036】
一部の実施形態では、本方法は、分析される２または試料を取得することをさらに含む。
【0037】
一部の実施形態では、本方法は、２つ以上の試料を消化するのに十分な条件下で２つ以上の試料を消化溶液と接触させる前に、消化のための２つ以上の試料を調製することをさらに含む。
【0038】
一部の実施形態では、消化前に２つ以上の試料を調製することは、試料の変性および還元を可能にする条件下で、２つ以上の試料の各々を変性および還元溶液と接触させることと、試料のアルキル化を可能にする条件下で、２つ以上の変性および還元された試料の各々をアルキル化溶液と接触させることと、を含む。
【0039】
一部の実施形態では、標的化質量スペクトル分析によって単一の混合試料溶液を分析することは、単一の混合試料を分離カラムに適用することと、溶出した試料成分に対して標的化質量スペクトル分析を行うことと、を含む。
【0040】
一部の実施形態では、分離カラムは、液体クロマトグラフィーカラムである。
【0041】
一部の実施形態では、溶出した試料成分に対して標的化質量スペクトル分析を行うことは、エレクトロスプレーイオン化を適用して溶出した試料成分から荷電イオンを生成することと、生成された荷電イオンを測定することと、を含む。
【0042】
様々な実施形態では、上記または本明細書で考察される実施形態の特徴または構成要素のうちのいずれかは組み合わせられ得、そのような組み合わせは本開示の範囲内に包含される。上記または本明細書で考察されるいずれの特定の値も、上記または本明細書で考察される別の関連値と組み合わされて、それらの値が範囲の上限および下限を表す範囲を列挙することができ、かかる範囲およびかかる範囲内にあるすべての値は本開示の範囲内に包含される。上記または本明細書で考察される値のうちの各々は、１％、５％、１０％または２０％の変動で表され得る。例えば、１０ｍＭの濃度は、１０ｍＭ±０．１ｍＭ（１％変動）、１０ｍＭ±０．５ｍＭ（５％変動）、１０ｍＭ±１ｍＭ（１０％変動）、または１０ｍＭ±２ｍＭ（２０％変動）として表され得る。他の実施形態は、後述の発明を実施するための形態の精査から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0043】
【図1A】ｍＡｂ－Ａにおける２つの代表的なＴＭＴ標識ペプチドのレポートイオン存在量に対するＮＣＥ（３５～７０）の効果（図１Ａ）、および従来のアプローチからのＰＴＭ定量結果とともにｍＡｂ－Ａにおける異なるタイプのＰＴＭの相対的定量に対するＮＣＥ（３５～７０）の効果を示す（図１Ｂ）。図１Ｂでは、各部位特異的ＰＴＭの左から右への列の順序は、対照（ＴＭＴなし）、ＮＣＥ３５、ＮＣＥ４０、ＮＣＥ５０、ＮＣＥ５５、ＮＣＥ６０、ＮＣＥ７０である。
【図1B】ｍＡｂ－Ａにおける２つの代表的なＴＭＴ標識ペプチドのレポートイオン存在量に対するＮＣＥ（３５～７０）の効果（図１Ａ）、および従来のアプローチからのＰＴＭ定量結果とともにｍＡｂ－Ａにおける異なるタイプのＰＴＭの相対的定量に対するＮＣＥ（３５～７０）の効果を示す（図１Ｂ）。図１Ｂでは、各部位特異的ＰＴＭの左から右への列の順序は、対照（ＴＭＴなし）、ＮＣＥ３５、ＮＣＥ４０、ＮＣＥ５０、ＮＣＥ５５、ＮＣＥ６０、ＮＣＥ７０である。
【図2A】ｍＡｂ－ＢにおけるＬｙｓ糖化の定量に対するＮＣＥ（３５～１００）の効果（図２Ａ）およびｍＡｂ－ＢにおけるＮ末端Ｇｌｕでのピログルタミン酸の定量に対するＮＣＥ（２７～１００）の効果（図２Ｂ）を示す。黒色エラーバー：二重でのＰＴＭ割合の標準偏差。図２Ａの列の順序付け（左から右）は、対照（ＴＭＴなし）、ＮＣＥ３５、ＮＣＥ４０、ＮＣＥ５０、ＮＣＥ５５、ＮＣＥ６０、ＮＣＥ７０、ＮＣＥ８０、ＮＣＥ９０、およびＮＣＥ１００である。図２Ｂの列の順序付け（左から右）は、対照（ＴＭＴなし）、ＮＣＥ２７、ＮＣＥ３０、ＮＣＥ３５、ＮＣＥ４０、ＮＣＥ５０、ＮＣＥ５５、ＮＣＥ６０、ＮＣＥ７０、ＮＣＥ８０、ＮＣＥ９０、およびＮＣＥ１００である。
【図2B】ｍＡｂ－ＢにおけるＬｙｓ糖化の定量に対するＮＣＥ（３５～１００）の効果（図２Ａ）およびｍＡｂ－ＢにおけるＮ末端Ｇｌｕでのピログルタミン酸の定量に対するＮＣＥ（２７～１００）の効果（図２Ｂ）を示す。黒色エラーバー：二重でのＰＴＭ割合の標準偏差。図２Ａの列の順序付け（左から右）は、対照（ＴＭＴなし）、ＮＣＥ３５、ＮＣＥ４０、ＮＣＥ５０、ＮＣＥ５５、ＮＣＥ６０、ＮＣＥ７０、ＮＣＥ８０、ＮＣＥ９０、およびＮＣＥ１００である。図２Ｂの列の順序付け（左から右）は、対照（ＴＭＴなし）、ＮＣＥ２７、ＮＣＥ３０、ＮＣＥ３５、ＮＣＥ４０、ＮＣＥ５０、ＮＣＥ５５、ＮＣＥ６０、ＮＣＥ７０、ＮＣＥ８０、ＮＣＥ９０、およびＮＣＥ１００である。
【図4A】６つのＴＭＴチャネルにおけるｍＡｂ－Ｅ中の４つのＰＴＭの１：１：１：１：１：１の比での相対的定量の評価を示す。プールしたＴＭＴ標識試料を３回の測定から調製し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって二重に分析した。箱ひげ図は、平均（大きい点）、２５～７５パーセンタイル（箱）、および５～９５パーセンタイル（ひげ）を示す。従来のアプローチから計算されたＰＴＭの割合を破線で示す。
【図4B】６つのＴＭＴチャネルにおけるｍＡｂ－Ｅ中の４つのＰＴＭの１：１：１：１：１：１の比での相対的定量の再現性の評価を示す。プールしたＴＭＴ標識試料を３回の測定から調製し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって二重に分析した。箱ひげ図は、平均（点）、２５パーセンタイルおよび７５パーセンタイル（箱）、ならびに５パーセンタイルおよび９５パーセンタイル（ひげ）を示す。従来のアプローチから計算されたＰＴＭの割合を破線で示す。
【図5】６つのＴＭＴチャネルにおけるｍＡｂ－Ａ中の４つのＰＴＭの１：２：４：８：１６：３２の比での相対的定量の感度の評価を示す。プールしたＴＭＴ標識試料を３回の測定から調製し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって二重に分析した。箱ひげ図は、平均（点）、２５パーセンタイルおよび７５パーセンタイル（箱）、ならびに５パーセンタイルおよび９５パーセンタイル（ひげ）を示す。従来のアプローチから計算されたＰＴＭの割合を破線で示す。
【図6】標的化ＭＳ／ＭＳに基づくアプローチ（黒色バー）および従来のアプローチ（ストライブバー）によるｍＡｂ－Ａの強制分解試料のＰＴＭ定量を示す。黒色エラーバー：二重でのＰＴＭ割合の標準偏差。各部位特異的ＰＴＭについての左から右へのバーの順序は、ｍＡｂ－Ａ－Ｓ０（ＴＭＴなし）、ｍＡｂ－Ａ－Ｓ０（ＴＭＴ－１２６）、ｍＡｂ－Ａ－Ｓ１（ＴＭＴなし）、ｍＡｂ－Ａ－Ｓ１（ＴＭＴ－１２７）、ｍＡｂ－Ａ－Ｓ２（ＴＭＴなし）、ｍＡｂ－Ａ－Ｓ２（ＴＭＴ－１２８）、ｍＡｂ－Ａ－Ｓ３（ＴＭＴなし）、ｍＡｂ－Ａ－Ｓ３（ＴＭＴ－１２９）、ｍＡｂ－Ａ－Ｓ４（ＴＭＴなし）、ｍＡｂ－Ａ－Ｓ４（ＴＭＴ－１３０）、ｍＡｂ－Ａ－Ｓ５（ＴＭＴなし）、ｍＡｂ－Ａ－Ｓ５（ＴＭＴ－１３１）である。
【図7A】標的化ＭＳ／ＭＳに基づくアプローチ（黒色バー）および従来のアプローチ（ストライブバー）によって異なるプロセス領域から製造されたｍＡｂ－Ｆの同等性試料のＰＴＭ定量を示す。図７Ａは、レベル＞２．５％のＰＴＭを示し、図７Ｂは、レベル≦２．５％のＰＴＭを示す。黒色エラーバー：二重でのＰＴＭ割合の標準偏差。図７Ａおよび７Ｂの両方の各部位特異的ＰＴＭの左から右へのバーの順序は、ｍＡｂ－Ｆ－Ｐ１（ＴＭＴなし）、ｍＡｂ－Ｆ－Ｐ１（ＴＭＴ－１２８）、ｍＡｂ－Ｆ－Ｐ２（ＴＭＴなし）、ｍＡｂ－Ｆ－Ｐ２（ＴＭＴ－１２９）、ｍＡｂ－Ｆ－Ｐ３（ＴＭＴなし）、ｍＡｂ－Ｆ－Ｐ３（ＴＭＴ－１３０）、ｍＡｂ－Ｆ－Ｐ４（ＴＭＴなし）、ｍＡｂ－Ｆ－Ｐ４（ＴＭＴ－１３１）である。
【図7B】標的化ＭＳ／ＭＳに基づくアプローチ（黒色バー）および従来のアプローチ（ストライブバー）によって異なるプロセス領域から製造されたｍＡｂ－Ｆの同等性試料のＰＴＭ定量を示す。図７Ａは、レベル＞２．５％のＰＴＭを示し、図７Ｂは、レベル≦２．５％のＰＴＭを示す。黒色エラーバー：二重でのＰＴＭ割合の標準偏差。図７Ａおよび７Ｂの両方の各部位特異的ＰＴＭの左から右へのバーの順序は、ｍＡｂ－Ｆ－Ｐ１（ＴＭＴなし）、ｍＡｂ－Ｆ－Ｐ１（ＴＭＴ－１２８）、ｍＡｂ－Ｆ－Ｐ２（ＴＭＴなし）、ｍＡｂ－Ｆ－Ｐ２（ＴＭＴ－１２９）、ｍＡｂ－Ｆ－Ｐ３（ＴＭＴなし）、ｍＡｂ－Ｆ－Ｐ３（ＴＭＴ－１３０）、ｍＡｂ－Ｆ－Ｐ４（ＴＭＴなし）、ｍＡｂ－Ｆ－Ｐ４（ＴＭＴ－１３１）である。
【図8】標的化ＭＳ／ＭＳに基づくアプローチ（黒色バー）および従来のアプローチ（点描バー）によるｍＡｂ－Ｅのトリスルフィド標準試料のトリスルフィド定量を示す。異なるトリスルフィドレベルを有するｍＡｂ－Ｅトリスルフィド標準を、Ｈ２Ｓストレス試料および参照標準試料を異なる比で混合することによって生成した。ｍＡｂ－Ｅ－ＴＳ０（１００：０）、ｍＡｂ－Ｅ－ＴＳ１（７５：２５）、ｍＡｂ－Ｅ－ＴＳ２（５０：５０）、ｍＡｂ－Ｅ－ＴＳ３（２５：７５）およびｍＡｂ－Ｅ－ＴＳ４（０：１００）である。
【図9】異なるＴＭＴタグならびにＷＱＱＧペプチド（配列番号３の残基１～４）およびＴＴＰＰペプチド（配列番号４の残基１～４）の異なるアイソフォームを有するＴＭＴ標識種の相対存在量に対する、ＴＭＴ標識中の異なる小分子添加剤の効果を示す。それぞれの種におけるＴＭＴ標識部位を強調した（太字）。Ｂｏｃ－Ｙ：Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－チロシン；ＨＰＡＡ：４－ヒドロキシフェニル酢酸；ＨＢＡ：４－ヒドロキシ安息香酸；ＰＡＢＡ：４－アミノ安息香酸。
【図10】例示的なタンデム質量タグおよび例示的なタンデム質量タグ試薬の構造を示す。
【図11】例示的な過剰標識防止試薬－ＢＯＣ－Ｙ－ＯＨ、ｐ－クレゾール、ヒドロキシフェニル酢酸（ＨＰＡＡ）、ヒドロキシ安息香酸（ＨＢＡ）、アセトアミノフェン、および／またはｐ－アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）の化学構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【0044】
本発明が記載される前に、記載される特定の方法および実験条件が異なり得るため、本発明がかかる方法および条件に限定されないことを、理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定することを企図するものではないことも理解されるべきである。任意の実施形態または実施形態の特徴は、互いに組み合わせることができ、そのような組み合わせは、本発明の範囲内に明示的に含まれる。
【0045】
別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特定の列挙された数値に関して使用されるとき、その値が列挙された値から１％以下だけ変動し得ることを意味する。例えば、本明細書で使用される場合、「約１００」という表現は、９９および１０１ならびにそれらの間のすべての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。
【0046】
本明細書に記載されるものと同様または同等のいずれの方法および材料も本発明の実施または試験に使用され得るが、好ましい方法および材料をこれから説明する。本明細書において言及されるすべての特許、出願および非特許刊行物は、それらの全体の参照により本明細書に組み込まれる。
【0047】
本明細書で使用される略語
ＡＣＮ：アセトニトリル
ＡＤＣＣ：抗体依存性細胞傷害性
Ａｓｎ：アスパラギン
ＡＵＣ：曲線下面積
Ｂｏｃ－Ｙ：Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－チロシン
ＣＤＣ：補体依存性細胞傷害
ＣＤＲ：相補性決定領域
ＣＱＡ：重要な質属性
ＣＶ：変動係数
ＥＩＣ：抽出イオンクロマトグラフ
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着アッセイ
ＥＳＩ－ＭＳ：エレクトロスプレーイオン化質量分析
ＦＡ：ギ酸
ＦＤＡ：食品医薬品局
ＦＬＲ：蛍光検出
ＨＢＡ：４－ヒドロキシ安息香酸
ＨＣ：重鎖
ＨＩＬＩＣ：親水性相互作用液体クロマトグラフィー
ＨＰＡＡ：４－ヒドロキシフェニル酢酸
ＩｇＧ：免疫グロブリンＧ
ＬＣ：軽鎖
ＬＣ－ＭＳ：液体クロマトグラフィー－質量分析
ｍＡｂ：モノクローナル抗体
Ｍｅｔ：メチオニン
ＭＳ：質量分析
ＭＷ：分子量
ＮＣＥ：正規化衝突エネルギー
ＰＡＢＡ：４－アミノ安息香酸
ＰＫ：薬物動態
ＰＲＯＣＡ：プロカインアミド
ＰＱＡ：産物の質属性
ＰＴＭ：翻訳後修飾
ＲＰ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ：逆相液体クロマトグラフィータンデム質量分析
ＳＰＥ：固相抽出
ＴＣＥＰ－ＨＣｌ：トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＭＴ：タンデム質量タグ
ＵＶ：紫外線
ＡＣＮ：アセトニトリル
ＡＤＣＣ：抗体依存性細胞傷害性
Ａｓｎ：アスパラギン
ＡＵＣ：曲線下面積
Ｂｏｃ－Ｙ：Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－チロシン
ＣＤＣ：補体依存性細胞傷害
ＣＤＲ：相補性決定領域
ＣＱＡ：重要な質属性
ＣＶ：変動係数
ＥＩＣ：抽出イオンクロマトグラフ
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着アッセイ
ＥＳＩ－ＭＳ：エレクトロスプレーイオン化質量分析
ＦＡ：ギ酸
ＦＤＡ：食品医薬品局
ＦＬＲ：蛍光検出
ＨＢＡ：４－ヒドロキシ安息香酸
ＨＣ：重鎖
ＨＩＬＩＣ：親水性相互作用液体クロマトグラフィー
ＨＰＡＡ：４－ヒドロキシフェニル酢酸
ＩｇＧ：免疫グロブリンＧ
ＬＣ：軽鎖
ＬＣ－ＭＳ：液体クロマトグラフィー－質量分析
ｍＡｂ：モノクローナル抗体
Ｍｅｔ：メチオニン
ＭＳ：質量分析
ＭＷ：分子量
ＮＣＥ：正規化衝突エネルギー
ＰＡＢＡ：４－アミノ安息香酸
ＰＫ：薬物動態
ＰＲＯＣＡ：プロカインアミド
ＰＱＡ：産物の質属性
ＰＴＭ：翻訳後修飾
ＲＰ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ：逆相液体クロマトグラフィータンデム質量分析
ＳＰＥ：固相抽出
ＴＣＥＰ－ＨＣｌ：トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＭＴ：タンデム質量タグ
ＵＶ：紫外線
【0048】
定義
本明細書で使用する「抗体」という用語は、４つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合によって相互接続された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖からなる免疫グロブリン分子（すなわち、「完全抗体分子」）、ならびにこれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）またはその抗原結合断片を指すよう企図される。各重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」または「ＶＨ」）および重鎖定常領域（ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインからなる）からなる。種々の実施形態において、重鎖は、ＩｇＧアイソタイプのものであり得る。一部の場合において、重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４から選択される。一部の実施形態、重鎖は、アイソタイプＩｇＧ１／ＩｇＧ２またはＩｇＧ４／ＩｇＧ２のキメラヒンジ領域を任意で含む、アイソタイプＩｇＧ１またはＩｇＧ４の重鎖である。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲまたは「ＶＬ」）および軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる。「抗体」という用語は、任意のアイソタイプまたはサブクラスのグリコシル化および非グリコシル化免疫グロブリンの両方への言及を含む。「抗体」という用語は、組換え手段によって調製、発現、作製または単離された抗体分子、例えば、抗体を発現するようにトランスフェクトされた宿主細胞から単離された抗体を含む。抗体構造に関する総説については、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，ＩＭＧＴ ｕｎｉｑｕｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ Ｉｇ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｖ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ，２７（１）Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５－７７（２００３）；およびＭ．Ｐｏｔｔｅｒ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，２（１）Ｓｕｒｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２７－４２（１９８３）を参照されたい。
本明細書で使用する「抗体」という用語は、４つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合によって相互接続された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖からなる免疫グロブリン分子（すなわち、「完全抗体分子」）、ならびにこれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）またはその抗原結合断片を指すよう企図される。各重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」または「ＶＨ」）および重鎖定常領域（ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインからなる）からなる。種々の実施形態において、重鎖は、ＩｇＧアイソタイプのものであり得る。一部の場合において、重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４から選択される。一部の実施形態、重鎖は、アイソタイプＩｇＧ１／ＩｇＧ２またはＩｇＧ４／ＩｇＧ２のキメラヒンジ領域を任意で含む、アイソタイプＩｇＧ１またはＩｇＧ４の重鎖である。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲまたは「ＶＬ」）および軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる。「抗体」という用語は、任意のアイソタイプまたはサブクラスのグリコシル化および非グリコシル化免疫グロブリンの両方への言及を含む。「抗体」という用語は、組換え手段によって調製、発現、作製または単離された抗体分子、例えば、抗体を発現するようにトランスフェクトされた宿主細胞から単離された抗体を含む。抗体構造に関する総説については、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，ＩＭＧＴ ｕｎｉｑｕｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ Ｉｇ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｖ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ，２７（１）Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５－７７（２００３）；およびＭ．Ｐｏｔｔｅｒ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，２（１）Ｓｕｒｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２７－４２（１９８３）を参照されたい。
【0049】
抗体という用語はまた、２つ以上の異なるエピトープに結合することができるヘテロ四量体免疫グロブリンを含む「二重特異性抗体」を包含する。単一の重鎖および単一の軽鎖ならびに６つのＣＤＲを含む二重特異性抗体の半分は、１つの抗原またはエピトープに結合し、抗体のもう半分は、異なる抗原またはエピトープに結合する。一部の場合において、二重特異性抗体は、同じ抗原に結合することができるが、異なるエピトープまたは非重複エピトープにおいて結合することができる。一部の場合において、二重特異性抗体の両半分は、二重特異性を保持しながら同一の軽鎖を有する。二重特異性抗体は、米国特許出願公開第２０１０／０３３１５２７号（２０１０年１２月３０日）に概して記載されている。
【0050】
抗体の「抗原結合部分」（または「抗体断片」）という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片と、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片と、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片と、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片と、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ２４１：５４４－５４６）と、（ｖｉ）単離されたＣＤＲ、および（ｖｉｉ）ＶＬおよびＶＨ領域が対合して一価分子を形成する単一タンパク質鎖を形成するように合成リンカーによって連結されたＦｖ断片の２つのドメインである、ＶＬおよびＶＨからなるｓｃＦｖと、が挙げられる。ダイアボディなどの一本鎖抗体の他の形態も、「抗体」という用語に包含される（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）９０ ＰＮＡＳ Ｕ．Ｓ．Ａ．６４４４－６４４８；およびＰｏｌｊａｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４）２ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １１２１－１１２３を参照されたい）。
【0051】
さらに、抗体およびその抗原結合断片は、当該分野で概して公知の標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して得られ得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照されたい）。トランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を生成するための方法もまた、当該分野で公知である。例えば、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術（例えば、ＵＳ６，５９６，５４１、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）を参照されたい）またはモノクローナル抗体を生成するための任意の他の公知の方法を使用して、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する所望の抗原に対する高親和性キメラ抗体が最初に単離される。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術は、マウスが抗原刺激に対する応答においてヒト可変領域と、マウス定常領域と、を含む、抗体を生成するように、ヒト重鎖可変領域と、ヒト軽鎖可変領域と、を含む、ゲノムが内在性マウス定常領域座に動作可能に連結されたトランスジェニックマウスの生成を包含する。抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域をコードするＤＮＡに動作可能に連結する。次に、完全ヒト抗体を発現することができる細胞においてＤＮＡを発現させる。
【0052】
「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図する。本発明のヒトｍＡｂは、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３における、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発によってまたはインビボでの体細胞突変異によって導入された変異）によってコードされないアミノ酸残基を含み得る。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトＦＲ配列へと移植されたｍＡｂを含むことは企図されない。この用語は、非ヒト哺乳類において、または非ヒト哺乳類の細胞において組換え産生された抗体を含む。この用語は、ヒト対象から単離された、またはヒト対象において生成された抗体を含むよう意図されるものではない。
【0053】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、例えば疾患または障害の改善、予防および／または治療を必要とする動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。
【0054】
「翻訳後修飾」（ＰＴＭ）は、タンパク質生合成後のタンパク質の共有結合修飾を指す。翻訳後修飾は、アミノ酸側鎖またはタンパク質のＣ末端もしくはＮ末端で起こり得る。抗体の例示的な翻訳後修飾としては、脱アミド化、酸化、糖化、ジスルフィド形成、Ｎ末端ピログルタミン酸形成、Ｃ末端リジン除去、およびグリコシル化が挙げられる。
【0055】
「タンデム質量タグ」（ＴＭＴ）という用語は、タンパク質、ペプチドおよび核酸などの生体高分子の質量分析（ＭＳ）ベースの定量化および同定に使用される化学標識である。ＴＭＴは、同重体質量タグと称される試薬のファミリーに属する。それらは、ゲルまたは抗体に基づく定量化の代替法を提供するが、これらおよび他の方法と組み合わせて使用することもできる。タンパク質の定量を補助することに加えて、ＴＭＴタグはまた、ＲＰＬＣ－ＭＳ分析において、リンペプチドなどの特定の高度に親水性の分析物の検出感度を増加させることができる。現在、市販されている６種類のＴＭＴが存在しており（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）、すなわち、ＴＭＴｚｅｒｏ（非同位体置換コア構造）と、ＴＭＴｄｕｐｌｅｘ（単一同位体置換を有する質量タグの同重体対）と、ＴＭＴｓｉｘｐｌｅｘ（５つの同位体置換を有する６つの質量タグの同重体セット）と、ＴＭＴ１０－ｐｌｅｘ（ＴＭＴｓｉｘｐｌｅｘレポーター領域を使用するが、異なる元素同位体を使用して０．００６３Ｄａの質量差を作り出す１０個の同位体質量タグのセット）と、ＴＭＴｐｒｏ（元のＴＭＴとは異なるレポーターおよび質量正規化器を有する１６ｐｌｅｘバージョン）と、ＴＭＴｐｒｏ Ｚｅｒｏと、が存在している。タグは、４つの領域、すなわち、質量レポーター領域（Ｍ）、切断可能リンカー領域（Ｆ）、質量正規化領域（Ｎ）およびタンパク質反応性基（Ｒ）を含有する。すべてのタグの化学構造は同一であるが、質量レポーターおよび質量正規化領域が各タグにおいて異なる分子量を有するように、それぞれが種々の位置で置換された同位体を含有する。タグの組み合わされたＭ－Ｆ－Ｎ－Ｒ領域は、クロマトグラフィーまたは電気泳動分離の間および単一のＭＳモードにおいて、異なるタグで標識された分子が区別できないように、同じ総分子量および構造を有する。ＭＳ／ＭＳモードで断片化すると、ペプチド骨格の断片化から配列情報が得られ、同時にタグの断片化から定量化データが得られ、質量レポーターイオンが生じる。
【0056】
本明細書で使用される「糖ペプチド／糖タンパク質」という用語は、それらの合成中または合成後に、共有結合した炭水化物またはグリカンを有する修飾されたペプチド／タンパク質である。ある特定の実施形態では、糖ペプチドは、モノクローナル抗体から、例えば、モノクローナル抗体のプロテアーゼ消化物から取得される。
【0057】
本明細書で使用される場合、「グリカン」という用語は、１つ以上の糖単位を含む化合物である。これらは概してグルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびＮ－アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）を含む（Ｆｒａｎｋ Ｋｊｅｌｄｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００３，７５，２３５５－２３６１）。モノクローナル抗体などの糖タンパク質のグリカン部分は、その機能または細胞内の位置を特定するための重要な特性である。例えば、特定のモノクローナル抗体は、特定のグリカン部分で修飾される。
【0058】
本明細書で使用される「試料」という用語は、少なくとも分析物分子、例えば、モノクローナル抗体から得られるような糖ペプチドを含み、例えば、分離、分析、抽出、濃縮、またはプロファイリングを含む、本発明の方法に従って操作される分子の混合物を指す。
【0059】
「分析」または「分析すること」という用語は、本明細書で使用される場合、互換的に使用され、目的の分子（例えば、ペプチド）を分離、検出、単離、精製、可溶化、検出、および／または特性評価する種々の方法のいずれかを指す。例としては、これらに限定されないが、固相抽出、固相マイクロ抽出、電気泳動、質量分析（例えば、ＥＳＩ－ＭＳ、ＳＰＥ ＨＩＬＩＣ、またはＭＡＬＤＩ－ＭＳ）、液体クロマトグラフィー（例えば、高速、例えば、逆相、順相、またはサイズ排除）、イオン対液体クロマトグラフィー、液－液抽出（例えば、加速流体抽出、超臨界流体抽出、マイクロ波支援抽出、膜抽出、ソックスレー抽出）、沈殿、清澄化、電気化学検出、染色、元素分析、エドモンド分解、核磁気共鳴、赤外線分析、フローインジェクション分析、キャピラリー電気クロマトグラフィー、紫外線検出、およびそれらの組み合わせなどが挙げられる。
【0060】
本明細書で使用される「プロファイリング」という用語は、試料中のペプチドなどのタンパク質の含量、組成、または特徴的な比を提供するために組み合わせて使用される種々の分析方法のいずれかを指す。
【0061】
本明細書で使用される場合、「接触させること」は、少なくとも２つの物質を溶液または固相で一緒にすることを含む。
【0062】
本明細書で使用される「標的化質量分析」は、特定の時間に特定の質量（ｍ／ｚ）のイオンに対して多段階のタンデム質量分析（ＭＳｎ、ｎ＝２または３）を使用する質量分析技術である。ｍ／ｚおよび時間の値は、以前の分析から導出される包含リストにおいて定義される。
【0063】
ＭＳ／ＭＳまたはＭＳ２としても知られる「タンデム質量分析」は、２つ以上の質量分析計が、化学試料を分析するそれらの能力を増加させるために、付加的反応ステップを使用してともに結合される、機器分析における技術である。タンデムＭＳの一般的な使用は、タンパク質およびペプチドなどの生体分子の分析である。所与の試料の分子がイオン化され、第１の分光計（ＭＳ１と称される）が、これらのイオンをそれらの質量電荷比（しばしばｍ／ｚまたはｍ／Ｑとして与えられる）によって分離する。ＭＳ１から来る特定のｍ／ｚ比のイオンが選択され、次いで、例えば、衝突誘起解離、イオン－分子反応、または光解離によって、より小さい断片イオンに分割される。次いで、これらの断片は、第２の質量分析計（ＭＳ２）に導入され、次いで、ｍ／ｚ比によって断片を分離し、それらを検出する。断片化ステップは、通常の質量分析計において非常に類似したｍ／ｚ比を有するイオンを同定および分離することを可能にする。
【0064】
一般的な説明
液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）と組み合わせたペプチドマッピングは、薬物開発中にモノクローナル抗体の質属性（例えば、翻訳後修飾（ＰＴＭ））を定量化するための重要な分析技術となっている。しかしながら、ＰＴＭの相対的定量のための従来の無標識アプローチは、個々の消化された試料のＬＣ－ＭＳデータ取得のために大量の機器時間を必要とし、これは、特にタンパク質特徴付けのための増加し続ける要求とともに、ペプチドマッピング技術の効率を制限している。
液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）と組み合わせたペプチドマッピングは、薬物開発中にモノクローナル抗体の質属性（例えば、翻訳後修飾（ＰＴＭ））を定量化するための重要な分析技術となっている。しかしながら、ＰＴＭの相対的定量のための従来の無標識アプローチは、個々の消化された試料のＬＣ－ＭＳデータ取得のために大量の機器時間を必要とし、これは、特にタンパク質特徴付けのための増加し続ける要求とともに、ペプチドマッピング技術の効率を制限している。
【0065】
したがって、効率が向上したタンパク質特徴付け方法が必要とされている。開示された発明は、かかる必要性に応えるものである。
【0066】
本明細書では、モノクローナル抗体を含むタンパク質の多重化された部位特異的ＰＴＭ定量のための、標的化質量分析と組み合わせた新しいタンデム質量タグ（ＴＭＴ）ベースのアプローチが開示される。この新しい方法は、本明細書において報告される研究に基づくものであり、本発明者らは、このアプローチが単一のＬＣ－ＭＳ実行において複数の試料についての質属性（例えば、ＰＴＭ）の同時定量を可能にするという驚くべき発見をした。特に、この方法では、複数の消化された抗体試料が、タンデム質量タグバリアントで化学的に標識され、等体積で混合した後、次いで標的化質量分析を用いて分析される。差次標識されたペプチドは、各バリアントの同じ分子構造および質量のために、インタクトなペプチドの完全なＭＳスペクトルにおいて識別不可能であるが、各バリアント標識ペプチドは、質量分析計内で断片化される場合、ＭＳ／ＭＳスペクトルにおいて固有の「レポートイオン」を生成し、それにより、異なる試料中のペプチドを識別し、対応する試料中のペプチドの存在量を表す。各試料中のＰＴＭの相対存在量は、標的化ＭＳ／ＭＳスペクトル中の対応するバリアント標識天然および修飾ペプチドから生成された得られたレポートイオンの抽出ピーク面積から定量化され、それによって、単一のＬＣ－ＭＳ実行において、市販のＴＭＴ試薬の現在の多重化能力に起因する最大１６－ｐｌｅｘなどの複数の試料について複数の質属性（例えば、ＰＴＭ）の同時定量を可能にし、ＰＴＭ定量におけるデータ取得時間および実行間変動が有意に低減される。
【0067】
一部の実施形態では、本方法は、ＴＭＴペプチドを調製することを含む。一部の実施形態では、試料の調製は、試料変性および還元を可能にする条件下で試料を変性および還元溶液と接触させることと、試料アルキル化を可能にする条件下で変性および還元された試料をアルキル化溶液と接触させることと、試料消化およびＴＭＴ標識を可能にする条件下でアルキル化試料を消化溶液と接触させることと、試料消化を停止する条件下で消化された試料をクエンチ溶液と接触させること、を含む。次いで、調製されたＴＭＴペプチドを、例えばＬＣ－ＭＳによって分析することができる。
【0068】
一部の実施形態では、消化を可能にする条件下で試料を消化溶液と接触させることは、ｐＨ７．５～８のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液などのトリスを含まない緩衝液中を除いて、標準的な消化プロトコルに従うことを含む。一部の実施形態では、ＰＢＳ溶液のｐＨは、ＴＭＴ試薬を消化溶液に添加する前に調整される。タンデム質量タグ（ＴＭＴ）セットは、ペプチド（Ｎ末端およびリジン、任意の塩基性ＮＨ２）と容易に反応し、等しい分子量（同じＭＳ１質量）を有し、各タグの周りの重原子分布に起因して異なるＭＳ２レポーター断片イオンを生成する試薬である。例示的なＴＭＴは、図１０に提供されており、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）から市販されている。市販のＴＭＴは、ＮＨ２基（Ｎ末端、リジン）とのみ反応することが知られているが、本発明者らは、本明細書において、ＴＭＴがＯＨ基（チロシン、スレオニン、セリン）とも有意に反応し得ることを発見した。この反応性は、積分を複雑にし、各ペプチドを複数の形態に分割し、各ピークのシグナルを減少させ、ＴＭＴの過剰標識をもたらすという点で問題であった。本明細書に開示される方法は、高濃度の小分子添加剤（例えば、ペプチド１モル当たり１００モルの小分子添加剤）を添加することによってこれらの制限を解決し、ＴＭＴがペプチド上のＮＨ２基と依然として迅速に反応することを可能にするが、これは、過剰なＴＭＴをペプチドから遠ざけ、ＴＭＴ－ペプチドの大部分が単一の形態で存在することを可能にし、積分が容易となる。一部の例では、この小分子添加剤は、ＢＯＣ－Ｙ－ＯＨ、ｐ－クレゾール、ヒドロキシフェニル酢酸（ＨＰＡＡ）、ヒドロキシ安息香酸（ＨＢＡ）、アセトアミノフェン、および／またはｐ－アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）である。これらの試薬の化学構造を図１１に提供する。一部の実施形態では、本方法は、各ＴＭＴ試薬を添加する前に、消化物試料に小分子添加剤を添加することを含む。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されているＴＭＴ試薬などの各ＴＭＴ試薬をＡＣＮに溶解し、各タンパク質試料に添加し、室温などで１時間インキュベートする。すべての反応をクエンチし、例えば、４未満のｐＨにクエンチした後、１つの試料に合わせ、続いてＬＣ－ＭＳを評価する。実施形態では、本方法は、ＬＣ注入のために試料を調製することと、標的化ＭＳ２を実行することによってそれを評価することと、を含む。
【0069】
開示された方法は、還元（ＰＴＭ％）および非還元（トリスルフィド％）ペプチドマッピングとともに使用することができる。実施形態において、非還元ペプチドマッピングの場合、非還元ペプチドは過剰標識されないので、ＰＡＢＡなどの過剰標識阻害剤は必要とされない。
【0070】
一部の実施形態では、試料はペプチドを含む。例えば、試料は、ＰＴＭを有するペプチドを含む。一部の実施形態において、ペプチドは、モノクローナル抗体から取得される糖ペプチドなどの糖ペプチドである。一部の実施形態では、モノクローナル抗体は、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、または混合アイソタイプのものである。
【0071】
一部の実施形態では、試料はモノクローナル抗体であり、消化溶液はトリプシンなどの１つ以上のプロテアーゼを含む。一部の例では、本方法は、１つ以上のプロテアーゼで消化された抗体などのモノクローナル抗体から取得される糖ペプチドなどの糖ペプチドを特徴付ける／分析するために使用される。例えば、本方法はタンパク質、例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）治療薬のグリコシル化を特徴付ける。ある特定の実施形態では、任意の介在ステップにおける試料は、濃縮、希釈、脱塩などを行ってもよい。
【0072】
実施形態において、分離カラムは、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分離カラムである。ＨＰＬＣを含む液体クロマトグラフィーを使用して、モノクローナル抗体を含むペプチドを分析することができる。陰イオン交換クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、高速陰イオン交換クロマトグラフィー、および順相（ＮＰ）クロマトグラフィー（ＮＰ－ＨＰＬＣを含む）を含む種々の形態の液体クロマトグラフィーを使用して、これらの構造を研究することができる（例えば、Ａｌｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ６７６：１９１－２０２（１９９４）を参照されたい）。親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）は、部分的に水性の移動相を用いて行うことができるＮＰ－ＨＰＬＣのバリアントであり、ペプチド、炭水化物、核酸、および多くのタンパク質の順相分離を可能にする。ＨＩＬＩＣの溶出順序は、最も極性が低いものから最も極性が高いものであり、逆相ＨＰＬＣにおけるものとは反対である。ＨＰＬＣは、例えば、Ｗａｔｅｒｓ（例えば、Ｗａｔｅｒｓ ２６９５ Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣシステム）、Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ＧｉｌｓｏｎなどからのＨＰＬＣシステムで行うことができる。
【0073】
一部の実施形態では、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析は、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣペプチドＢＥＨ Ｃ１８カラムを使用することによって行われる。カラム温度は、例えば、市販のカラムヒーターを使用して、クロマトグラフィーの実行を通して一定温度に維持することができる。一部の実施形態では、カラムは、約１８℃～約７０℃、例えば、約３０℃～約６０℃、約４０℃～約５０℃、例えば、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、または約７０℃の温度で維持される。一部の実施形態では、カラム温度は約４０℃である。一部の実施形態では、実行時間は、約１５～約２４０分、例えば、約２０～約７０分、約３０～約６０分、約４０～約９０分、約５０分～約１００分、約６０～約１２０分、約５０～約８０分であり得る。ＬＣ後、溶出液をＭＳ／ＭＳ分析に供する。
【0074】
標的化または非標的化ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析などの一部の実施形態では、各ＴＭＴ標識試料のアリコートは、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣペプチドＢＥＨ Ｃ１８カラム上で分離される。次いで、溶出液をエレクトロスプレーし、ＭＳ／ＭＳ実験のためのペプチド断片化のために使用されるＨＣＤを用いて、Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓハイブリッド質量分析計によって分析する。ＴＭＴ標識天然および修飾ペプチドのトリガーｍ／ｚ、ｚ、標的保持時間窓および衝突エネルギーを含有する標的リストを包含リストにロードして、ＭＳ１サーベイスキャンで検出された前駆体のＭＳ／ＭＳ分析をガイドする。次いで、ペプチドおよびＰＴＭの同定を決定する。一部の実施形態では、各ＰＴＭの割合は、修飾ペプチドおよび天然ペプチドのピーク面積の合計に対する修飾ペプチドの抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）ピーク面積を使用して計算される。
【実施例】
【0075】
以下の実施例は、本発明の方法をどのように作製および使用するかについての完全な開示および説明を当業者に提供するために提示され、本発明者らが本発明とみなすものの範囲を限定することを意図しない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力はしてきたが、いくつかの実験上のエラーおよび偏差が考慮されるべきである。別段に示されない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、室温は約２５℃であり、圧力は大気圧またはそれに近い圧力である。
【0076】
実施例１：材料および化学物質。
この研究におけるすべてのヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ４モノクローナル抗体（ｍＡｂ－Ａ、ｍＡｂ－Ｂ、ｍＡｂ－Ｃ、ｍＡｂ－ＤおよびｍＡｂ－Ｅ）は、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ（Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）で産生された。ｍＡｂ－Ａ安定性試料は、異なるストレス条件下で対照試料をインキュベートすることによって作製し、それぞれｍＡｂ－Ａ－Ｓ０（対照）、ｍＡｂ－Ａ－Ｓ１（Ｔ＝４５℃、ｔ＝２８日）、ｍＡｂ－Ａ－Ｓ２（Ｔ＝２５℃、ｔ＝６ヶ月）およびｍＡｂ－Ａ－Ｓ３（Ｔ＝５℃、ｔ＝２４ヶ月）と標識した。ｍＡｂ－Ｂ同等性試料を４つの異なるプロセス領域で製造し、それぞれｍＡｂ－Ｂ－Ｐ１、ｍＡｂ－Ｂ－Ｐ２、ｍＡｂ－Ｂ－Ｐ３およびｍＡｂ－Ｂ－Ｐ４と標識した。異なるトリスルフィドレベルを有するｍＡｂ－Ｅトリスルフィド標準を、Ｈ２Ｓストレス試料および参照標準試料を異なる比で混合することによって生成し、それぞれｍＡｂ－Ｅ－ＴＳ０（１００：０）、ｍＡｂ－Ｅ－ＴＳ１（７５：２５）、ｍＡｂ－Ｅ－ＴＳ２（５０：５０）、ｍＡｂ－Ｅ－ＴＳ３（２５：７５）およびｍＡｂ－Ｅ－ＴＳ４（０：１００）と標識した。５×Ｒａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆ緩衝液を含むＲａｐｉｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎ－グリコシダーゼＦ（Ｒａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆ）は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）から購入した。氷酢酸（純度≧９９％）、ヨードアセトアミド、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、４－アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、４－ヒドロキシ安息香酸（ＨＢＡ）、４－ヒドロキシフェニル酢酸（ＨＰＡＡ）およびＮ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－チロシン（Ｂｏｃ－Ｙ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。配列決定グレードのトリプシンおよびＡｓｐ－Ｎは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入した。タンデム質量タグ（ＴＭＴ）同重体試薬、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ－ＨＣｌ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、配列決定グレード）およびアセトニトリル（Ｏｐｔｉｍａ ＬＣ／ＭＳ）は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から購入した。ＵｌｔｒａＰｕｒｅ １．０ Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入し、高純度水はＭｉｌｌｉ－Ｑ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入した。
この研究におけるすべてのヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ４モノクローナル抗体（ｍＡｂ－Ａ、ｍＡｂ－Ｂ、ｍＡｂ－Ｃ、ｍＡｂ－ＤおよびｍＡｂ－Ｅ）は、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ（Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）で産生された。ｍＡｂ－Ａ安定性試料は、異なるストレス条件下で対照試料をインキュベートすることによって作製し、それぞれｍＡｂ－Ａ－Ｓ０（対照）、ｍＡｂ－Ａ－Ｓ１（Ｔ＝４５℃、ｔ＝２８日）、ｍＡｂ－Ａ－Ｓ２（Ｔ＝２５℃、ｔ＝６ヶ月）およびｍＡｂ－Ａ－Ｓ３（Ｔ＝５℃、ｔ＝２４ヶ月）と標識した。ｍＡｂ－Ｂ同等性試料を４つの異なるプロセス領域で製造し、それぞれｍＡｂ－Ｂ－Ｐ１、ｍＡｂ－Ｂ－Ｐ２、ｍＡｂ－Ｂ－Ｐ３およびｍＡｂ－Ｂ－Ｐ４と標識した。異なるトリスルフィドレベルを有するｍＡｂ－Ｅトリスルフィド標準を、Ｈ２Ｓストレス試料および参照標準試料を異なる比で混合することによって生成し、それぞれｍＡｂ－Ｅ－ＴＳ０（１００：０）、ｍＡｂ－Ｅ－ＴＳ１（７５：２５）、ｍＡｂ－Ｅ－ＴＳ２（５０：５０）、ｍＡｂ－Ｅ－ＴＳ３（２５：７５）およびｍＡｂ－Ｅ－ＴＳ４（０：１００）と標識した。５×Ｒａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆ緩衝液を含むＲａｐｉｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎ－グリコシダーゼＦ（Ｒａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆ）は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）から購入した。氷酢酸（純度≧９９％）、ヨードアセトアミド、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、４－アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、４－ヒドロキシ安息香酸（ＨＢＡ）、４－ヒドロキシフェニル酢酸（ＨＰＡＡ）およびＮ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－チロシン（Ｂｏｃ－Ｙ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。配列決定グレードのトリプシンおよびＡｓｐ－Ｎは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入した。タンデム質量タグ（ＴＭＴ）同重体試薬、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ－ＨＣｌ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、配列決定グレード）およびアセトニトリル（Ｏｐｔｉｍａ ＬＣ／ＭＳ）は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から購入した。ＵｌｔｒａＰｕｒｅ １．０ Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入し、高純度水はＭｉｌｌｉ－Ｑ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入した。
【0077】
ｍＡｂの還元ペプチドマッピング。還元ペプチドマッピングを実施して、ｍＡｂ－Ａ安定性およびｍＡｂ－Ｂ同等性試料についてのＰＴＭレベル（例えば、Ｎ末端Ｇｌｎ／Ｇｌｕ環化、Ｍｅｔ酸化、Ａｓｎ脱アミド化、Ａｓｐ環化／異性化、Ｃ末端Ｌｙｓクリッピング、Ｌｙｓ糖化、およびＦｃグリコシル化）を定量化した。５００μｇの各試料を５ｍＭ酢酸に緩衝液交換して、ＴＭＴ反応性化合物（例えば、ヒスチジン、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）を除去し、次いで、５ｍＭ酢酸中、５ｍＭ ＴＣＥＰ－ＨＣｌの存在下、８０℃で１０分間、変性および還元した。変性および還元後、各試料を８Ｍ尿素を含有する１００ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ８．０）で希釈し、暗所、室温で３０分間ヨードアセトアミドでアルキル化した。アルキル化後、各試料を５０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ８．０）でさらに希釈して、尿素濃度を１Ｍ未満に低下させた。トリプシン消化のために、各希釈試料を、酵素対基質比１：２０（ｗ／ｗ）でトリプシンとともに３７℃で４時間インキュベートした。Ａｓｐ－Ｎ消化のために、各希釈試料を、Ａｓｐ－Ｎと、酵素対基質比１：５０（ｗ／ｗ）で、３７℃で４時間インキュベートした。グリコシル化定量のための脱グリコシル化試料を生成するために、各トリプシン消化試料のアリコートを、ＰＮＧａｓｅ Ｆ（１ｍＵ／μｇタンパク質）とともに３７℃でさらに１時間インキュベートして、ペプチドレベルでＮ結合型グリカンを除去した。トリプシン、Ａｓｐ－ＮまたはＰＮＧａｓｅ Ｆ消化後、各消化試料を２つの等しいアリコートに分割した。一方のアリコートを１０％ＴＦＡの添加によってクエンチしてトリプシン消化を停止させ、オンラインＬＣ－ＭＳ分析に供し、他方のアリコートをその後のＴＭＴ標識手順に供した。
【0078】
非還元ｍＡｂのトリプシンペプチドマッピング。非還元ペプチドマッピングを実施して、ｍＡｂ－Ｃ、ｍＡｂ－ＤおよびｍＡｂ－Ｅトリスルフィド標準についてのトリスルフィドレベルを定量化した。５００μｇの各試料を１００ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．５）に緩衝液交換して、ＴＭＴ反応性化合物（例えば、ヒスチジン、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）を除去し、次いで、１００ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．５中の１．０ｍＭヨードアセトアミドを含有する８Ｍ尿素中、５０℃で１０分間、暗所で変性させた。変性後、１００ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．５）を添加して尿素濃度を５倍に希釈した。次いで、各試料を、トリプシンを用いて、１：２０（ｗ／ｗ）の酵素対基質比で、３７℃で４時間消化した。トリプシン消化後、各消化試料を２つの等しいアリコートに分割した。一方のアリコートを１０％ＴＦＡの添加によってクエンチしてトリプシン消化を停止させ、オンラインＬＣ－ＭＳ分析に供し、他方のアリコートをその後のＴＭＴ標識手順に供した。
【0079】
還元および非還元ｍＡｂ消化物のＴＭＴ標識。ＴＭＴ６－ｐｌｅｘ試薬を、製造業者のプロトコル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って４１μＬのアセトニトリルに溶解した。還元および非還元ペプチドマッピング実験における各消化試料のアリコート（１００μｇ）を、標識のために、過剰標識対照試薬（ＰＡＢＡ、ＨＢＡ、ＨＰＡＡまたはＢｏｃ－Ｙ）（タンパク質１モル当たり１００モルの試薬）の存在下で、アセトニトリルに溶解した４１μＬのＴＭＴタグとともに周囲温度で１時間インキュベートした。１０％ＴＦＡを添加することによって標識反応を停止させた。ｍＡｂ－Ａ安定性試料、ｍＡｂ－Ｂ同等性試料およびｍＡｂ－Ｅトリスルフィド標準のＴＭＴ標識消化物をそれぞれ等量でプールし、次いでＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に供した。
【0080】
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析。非標的化ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために、各消化物のアリコート（およそ８μｇ）を、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣペプチドＢＥＨ Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ、２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、粒径１．７μｍ、孔径１３０Å）に注入した。ペプチドを、７５分間かけて０．１％移動相Ｂから３５％移動相Ｂに増加させた線形勾配（移動相Ａ：水中０．０５％ＴＦＡ；移動相Ｂ：アセトニトリル中０．０４５％ＴＦＡ）を用いて、流速０．２５ｍＬ／分、カラム温度４０℃で溶出させた。次いで、溶出液をエレクトロスプレーし、ＭＳ／ＭＳ実験のためのペプチド断片化に用いられる高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）を用いて、Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓハイブリッド質量分析計によって分析した。機器をポジティブモードで操作し、以下の取得パラメータ、すなわち、ＭＳ１分解能＝７０，０００；ＭＳ１ ＡＧＣ標的＝１×１０６；ＭＳ１最大注入時間＝５０ｍｓ；ＭＳ１スキャン範囲＝４００～２，０００ｍ／ｚ；ＭＳ２分解能＝１７，５００；ＭＳ２ ＡＧＣ標的＝１×１０５；最大注入時間＝１００ｍｓ；ＴｏｐＮ＝５；単離窓＝４．０ｍ／ｚ；正規化衝突エネルギー＝２７；アンダーフィル比＝１０％；ペプチドマッチ＝好ましい；同位体排除＝オン；動的排除＝１０秒に設定した。
【0081】
標的化ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために、各ＴＭＴ標識試料のアリコート（およそ８μｇ）を、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣペプチドＢＥＨ Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ、２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、粒径１．７μｍ、孔径１３０Å）上で、１５０分かけて０．１％移動相Ｂから４０％移動相Ｂに増加させたより長い線形勾配（移動相Ａ：水中０．０５％ＴＦＡ；移動相Ｂ：アセトニトリル中０．０４５％ＴＦＡ）を用いて、流速０．２５ｍＬ／分、カラム温度４０℃で分離した。次いで、溶出液をエレクトロスプレーし、ＭＳ／ＭＳ実験のためのペプチド断片化のために使用されるＨＣＤを用いて、Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓハイブリッド質量分析計によって分析した。ＴＭＴ標識天然および修飾ペプチドのトリガーｍ／ｚ、ｚ、標的保持時間窓および衝突エネルギーを含有する標的リストを包含リストにロードして、ＭＳ１サーベイスキャンで検出された前駆体のＭＳ／ＭＳ分析をガイドした。機器をポジティブモードで操作し、以下の取得パラメータ、すなわち、ＭＳ１分解能＝１７，５００；ＭＳ１ ＡＧＣ標的＝１×１０６；ＭＳ１最大注入時間＝５０ｍｓ；ＭＳ１スキャン範囲＝４００～２，０００ｍ／ｚ；ＭＳ２分解能＝１７，５００；ＭＳ２ ＡＧＣ標的＝１×１０５；最大注入時間＝１００ｍｓ；固定第１質量＝１００；単離窓＝２．０ｍ／ｚ；正規化衝突エネルギー＝２７～１００に設定した。
【0082】
データ分析。ペプチドおよびＰＴＭの同定は、（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ；Ｂｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１２，４０，１３．３０．１－１２．２０．１４を参照されたい）によって決定し、手動で検証した。部位特異的ＰＴＭの相対的定量のための無標識アプローチにおいて、天然ペプチドおよび修飾ペプチドの両方の第１の同位体ピークのｍ／ｚに基づくＭＳ１スペクトルにおける抽出イオンクロマトグラムを生成し、抽出ピーク面積をｓｋｙｌｉｎｅ－ｄａｉｌｙ（ＭａｃＣｏｓｓ Ｌａｂ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＷＡ；ＭａｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１０，２６，９６６－９６８を参照されたい）を用いて積分した。
【0083】
各ＰＴＭの割合は、修飾ペプチドおよび天然ペプチドのピーク面積の合計に対する修飾ペプチドの抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）ピーク面積を使用して計算した。部位特異的ＰＴＭの相対的定量のための標的化ＭＳ／ＭＳベースのアプローチにおいて、天然ペプチドおよび修飾ペプチドの両方のレポートイオンのｍ／ｚに基づくＭＳ／ＭＳスペクトルにおける抽出イオンクロマトグラムを作成し、ｓｋｙｌｉｎｅ－ｄａｉｌｙ（ＭａｃＣｏｓｓ Ｌａｂ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＷＡ）を用いて抽出ピーク面積を積分した。各ＰＴＭの割合は、修飾ペプチドおよび天然ペプチドからのレポートイオンのピーク面積の合計に対する修飾ペプチドからのレポートイオンのＥＩＣピーク面積を使用して計算した。
【0084】
実施例２：ＰＴＭ定量のためのＨＣＤ衝突エネルギー最適化
ＴＭＴペプチドは、衝突活性化時に定量的情報を生成する同重体アミン反応性標識で標識される。ＴＭＴレポートイオンは、衝突エネルギーによるアミド結合の切断を通じて形成され、タンデム質量スペクトルの低質量領域において１２６～１３１ｍ／ｚのイオンのクラスターを生成する（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００３，７５，１８９５－１９０４）。ＰＴＭ定量のためのＴＭＴベースのアプローチにおいて、天然ペプチドおよび修飾ペプチドの標的化ＭＳ／ＭＳスペクトルにおいて生成されたレポートイオンが、ＰＴＭ割合計算のために用いられる。ＭＳ／ＭＳスペクトルにおいて生成されたＴＭＴレポートイオンの存在量は、ＴＭＴ標識ペプチドに適用されたＨＣＤ細胞における正規化衝突エネルギー（ＮＣＥ）と相関する。ｍＡｂ－Ａ中のＴＭＴ標識ペプチドのレポートイオン存在量に対するＮＣＥ（３５～７０）の効果を、図１Ａに示すように調査した。レポートイオン強度は、ＮＣＥを５０または５５まで増加させたときに最大となり、次いで、ＮＣＥを７０までさらに増加させることによって減少した。しかしながら、３５のＮＣＥは、ペプチド同定のための豊富な断片化情報をもたらす傾向があり、より大きなＮＣＥは、ＮＣＥの増加につれてより少ない断片化情報をもたらす。例えば、ＮＣＥを７０に増加させた場合、ＭＳ／ＭＳスペクトル中に保持された断片化情報はごくわずかであった。
ＴＭＴペプチドは、衝突活性化時に定量的情報を生成する同重体アミン反応性標識で標識される。ＴＭＴレポートイオンは、衝突エネルギーによるアミド結合の切断を通じて形成され、タンデム質量スペクトルの低質量領域において１２６～１３１ｍ／ｚのイオンのクラスターを生成する（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００３，７５，１８９５－１９０４）。ＰＴＭ定量のためのＴＭＴベースのアプローチにおいて、天然ペプチドおよび修飾ペプチドの標的化ＭＳ／ＭＳスペクトルにおいて生成されたレポートイオンが、ＰＴＭ割合計算のために用いられる。ＭＳ／ＭＳスペクトルにおいて生成されたＴＭＴレポートイオンの存在量は、ＴＭＴ標識ペプチドに適用されたＨＣＤ細胞における正規化衝突エネルギー（ＮＣＥ）と相関する。ｍＡｂ－Ａ中のＴＭＴ標識ペプチドのレポートイオン存在量に対するＮＣＥ（３５～７０）の効果を、図１Ａに示すように調査した。レポートイオン強度は、ＮＣＥを５０または５５まで増加させたときに最大となり、次いで、ＮＣＥを７０までさらに増加させることによって減少した。しかしながら、３５のＮＣＥは、ペプチド同定のための豊富な断片化情報をもたらす傾向があり、より大きなＮＣＥは、ＮＣＥの増加につれてより少ない断片化情報をもたらす。例えば、ＮＣＥを７０に増加させた場合、ＭＳ／ＭＳスペクトル中に保持された断片化情報はごくわずかであった。
【0085】
Ｍｅｔ酸化、Ａｓｎ脱アミド化、Ａｓｐ環化／異性化、Ｃ末端ＬｙｓクリッピングおよびＦｃグリコシル化について、異なるＮＣＥにおける天然および修飾ペプチドの標的化ＭＳ／ＭＳスペクトルにおいて生成されたレポートイオンによるｍＡｂ－Ａにおける異なるＰＴＭタイプの定量を調べ、従来のＭＳ１ベースのアプローチによるＰＴＭ定量と比較した。３５～７０のＮＣＥで異なるＰＴＭの割合に有意差はなく、ＰＴＭ割合は、ＭＳ１サーベイスキャンにおける天然および修飾前駆体ペプチドの第１の同位体ピークを割合計算に使用した従来のアプローチ（図１Ｂを参照されたい）を使用することによって定量化されたものと同等であったことに留意されたい。これは、ＰＴＭ定量のための標的化ＭＳ／ＭＳベースのアプローチの実現可能性を実証するものである。結果はまた、異なるＮＣＥでのレポートイオン存在量の変化傾向が、天然ペプチドと修飾ペプチドとの間で類似していることを示す。ペプチド配列確認のための適切な断片化情報を維持しながら、少量のＰＴＭを定量化する感度を最大化するために、Ｍｅｔ酸化、Ａｓｎ脱アミド化、Ａｓｐ環化／異性化、Ｃ末端ＬｙｓクリッピングおよびＦｃグリコシル化の定量のためにＮＣＥ５５を選択した。
【0086】
ピログルタミン酸（ＰｙｒｏＥまたはＰｙｒｏＱ）を形成するための軽鎖または重鎖におけるＮ末端ＧｌｎまたはＧｌｕの環化は、Ｎ末端修飾の主要なタイプである（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ．２０１４，６，１１４５－１１５４）。しかしながら、この修飾は、ペプチドのＮ末端をブロックすることによって、ＴＭＴ標識試薬とＮ末端アミン基との反応を阻害し、これは、この修飾を定量化するためのこの多重化アプローチの能力を制限する。この制限を克服するために、Ｎ末端にＧｌｎまたはＧｌｕを含有するｍＡｂ－ＡからのＮ末端ペプチドを調べたが、Ｃ末端にリジン残基も調べた。天然ペプチドでは、リジン側鎖のＮ末端アミン基およびε－アミノ基の両方をＴＭＴタグで標識することができるが、修飾ペプチドでは、ブロックされたＮ末端アミン基のためにリジン側鎖のε－アミノ基のみを標識することができる。このＰＴＭ定量のために天然および修飾ペプチドから生成されたレポートイオンを使用する実現可能性を評価するために、異なるＮＣＥ（２７～１００）におけるピログルタミン酸の割合を計算し、従来のアプローチから得られたものと比較した。図２Ｂに示されるように、このアプローチは、従来のアプローチ（ＰｙｒｏＱについてもＮＣＥ３５）と比較してＮＣＥ３５で最も匹敵する結果をもたらした。減少した割合は、より高いおよびより低いＮＣＥで観察され、ＮＣＥ２７およびＮＣＥ５５では、ピログルタミン酸の割合は、従来のアプローチからの割合のわずか約５０％であった。したがって、ピログルタミン酸定量のためにＮＣＥ３５を選択した。
【0087】
また、レポートイオンを使用することによるｍＡｂ－ＢおよびｍＡｂ－Ｃ（異なるレベルを有する）におけるＬｙｓ糖化の定量を調査した。糖化は、還元糖（例えば、グルコース、フルクトース）による一級アミンの修飾をもたらし得る非酵素的プロセスである。リジン残基は、１６２．０５Ｄａの側鎖質量の増加を伴うタンパク質内の糖化に特に高感度であり、一級アミン側鎖を塩基性から中性に変化させることによって電荷不均一性を生成する（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ．２０１４，６，１１４５－１１５４）。
【0088】
Ｌｙｓの糖化は、糖化されたＬｙｓ部位におけるトリプシンによるペプチド結合の切断を阻害するので、天然のＬｙｓ残基を有するペプチドと比較して異なる長さを有する糖化されたＬｙｓ残基を有するペプチドを生じる。したがって、Ｌｙｓ部位での糖化産物を分析するために、Ａｓｐ－Ｎ消化によるペプチドマッピングを行った。Ｎ末端Ｇｌｎ／Ｇｌｕピログルタミン酸と同様に、糖化は、リジン残基の物理的特性を変化させ、リジン残基をＴＭＴ試薬に対して反応性にしないため、天然ペプチドおよび糖化ペプチド上で標識されたＴＭＴタグの数を異ならせることができる。このＰＴＭの定量に対する異なるＮＣＥ（３５～１００）の効果の調査から、異なるＮＣＥでも異なる割合が得られ、より高いＮＣＥがより高い割合の糖化をもたらすことが明らかとなった。ＮＣＥを９０～１００まで増加させた場合、従来のアプローチから定量化された割合に匹敵する割合を達成することができる（図２）。ピログルタミン酸および糖化のＰＴＭ定量について観察されたＮＣＥへの強い依存性は、天然ペプチドと修飾ペプチドとの間の異なるＮＣＥによるレポートイオン存在量の一貫性のない変化傾向に起因し得る。例えば、レポートイオン存在量は、天然ペプチドおよび糖化ペプチドについてそれぞれ５５および７０の異なるＮＣＥで最大化された。したがって、従来のアプローチに匹敵する定量を達成するために、ＮＣＥ９０を選択してＬｙｓ糖化を定量化した。なお、豊富な断片化情報がないため、より低いＮＣＥ（３５など）を用いたプレ実行を使用して、ペプチド配列およびリジン修飾を確認することができることに留意されたい。
【0089】
トリスルフィドはまた、組換えＩｇＧのすべてのサブクラスに存在することが見出された一般的な修飾である。トリスルフィド結合は、モノクローナル抗体中の軽鎖ペプチドと重鎖ペプチドとの間に存在することが多い（Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０，４００，８９－９８）。このトリスルフィド修飾は、硫黄原子を重鎖および軽鎖間ジスルフィド結合に挿入することによって生じ（Ｃｙｓ－Ｓ－Ｓ－Ｃｙｓ＋Ｈ２Ｓ＋［Ｏ］→Ｃｙｓ－Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｃｙｓ＋Ｈ２Ｏ）、３１．９７Ｄａの質量増加をもたらす。トリスルフィド結合の存在は、熱安定性、ならびに抗原結合および効力に影響を及ぼさないことが報告されている。しかしながら、トリスルフィドレベルは、生産バイオリアクター中の微量Ｈ２Ｓレベルの変動のために、ロット間およびプロセス間で変動する可能性があるため、トリスルフィドレベルは通常、細胞培養プロセス開発中にモノクローナル抗体試料中でモニタされる。トリスルフィド定量のための多重化方法を開発するために、異なるＮＣＥでの定量結果を、それぞれｍＡｂ－Ｃ（ＩｇＧ１）およびｍＡｂ－Ｄ（ＩｇＧ４）モノクローナル抗体について調べた。興味深いことに、トリスルフィドの割合は、図３Ａおよび３Ｂにおいて実証されるように、Ｍａｂ－ＣおよびｍＡｂ－Ｄの両方についてＮＣＥとの明確な線形関係を示した。ＮＣＥを５５に増加させた場合、このアプローチから定量化されたトリスルフィド％は、ＩｇＧ１抗体およびＩｇＧ４抗体の両方において従来のアプローチと同等であるため、トリスルフィド定量のための最適化ＮＣＥとして選択した。
【0090】
実施例３：ＴＭＴ試薬の過剰標識を阻害するための小分子添加剤。
リジン側鎖のＮ末端アミン基およびε－アミノ基に加えて、ＴＭＴ標識は、チロシン（Ｔｙｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）およびセリン（Ｓｅｒ）においても生じ得、これらのアミノ酸における水酸基とのオフターゲット反応から生じることが報告されている（Ｚｅｃｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２０１９，１８，１４６８－１４７８）。このＴＭＴ過剰標識は、天然ペプチドおよび修飾ペプチドの応答を、異なる数のＴＭＴタグで標識された複数の種に分けることによって、このアプローチにおけるＰＴＭ定量の感度を低下させ得る。例えば、本発明者らの研究は、酸化されやすいメチオニンを含有するＩｇＧの重鎖の保存されたＣＨ３ドメインに位置するトリプシンペプチド（配列番号３、ＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫ）からのＰＴＭ定量においてこれを観察した。ＴＭＴ標識後、異なるＴＭＴタグ（最大６個）を有する種の混合物が観察され、３個、４個および５個のＴＭＴタグを含有する種について複数のアイソフォームも観察された。図９に提供される表１は、異なるＴＭＴタグおよび異なるアイソフォームを有するＷＱＱＧペプチド（配列番号３の残基１～４）の種の相対存在量を要約している。このペプチドの高度に不均一なＴＭＴ標識は、総存在量を、０．２～２２．０％の範囲の相対存在量を有する１５個もの異なる形態に分配しており、標的化ＭＳ／ＭＳベースのアプローチを使用することによって、特にレベルが低い場合、このペプチドにおけるＭｅｔ酸化を定量化するという重要な課題を提起している。
リジン側鎖のＮ末端アミン基およびε－アミノ基に加えて、ＴＭＴ標識は、チロシン（Ｔｙｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）およびセリン（Ｓｅｒ）においても生じ得、これらのアミノ酸における水酸基とのオフターゲット反応から生じることが報告されている（Ｚｅｃｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２０１９，１８，１４６８－１４７８）。このＴＭＴ過剰標識は、天然ペプチドおよび修飾ペプチドの応答を、異なる数のＴＭＴタグで標識された複数の種に分けることによって、このアプローチにおけるＰＴＭ定量の感度を低下させ得る。例えば、本発明者らの研究は、酸化されやすいメチオニンを含有するＩｇＧの重鎖の保存されたＣＨ３ドメインに位置するトリプシンペプチド（配列番号３、ＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫ）からのＰＴＭ定量においてこれを観察した。ＴＭＴ標識後、異なるＴＭＴタグ（最大６個）を有する種の混合物が観察され、３個、４個および５個のＴＭＴタグを含有する種について複数のアイソフォームも観察された。図９に提供される表１は、異なるＴＭＴタグおよび異なるアイソフォームを有するＷＱＱＧペプチド（配列番号３の残基１～４）の種の相対存在量を要約している。このペプチドの高度に不均一なＴＭＴ標識は、総存在量を、０．２～２２．０％の範囲の相対存在量を有する１５個もの異なる形態に分配しており、標的化ＭＳ／ＭＳベースのアプローチを使用することによって、特にレベルが低い場合、このペプチドにおけるＭｅｔ酸化を定量化するという重要な課題を提起している。
【0091】
ＴＭＴ過剰標識を阻害するために、８：１～１：１の範囲の異なるＴＭＴ対タンパク質（ｗｔ／ｗｔ）比を最初に調査した。ＴＭＴ試薬の量を減少させることにより、過剰標識を最小限に抑えることができるが、ペプチドの過少標識を増加させることもできる。例えば、標的ペプチドの標識効率は、比を８：１から１：１に変化させると、９０％超から約３５％に低下させることができる。あるいは、ＴＭＴ標識の間に消化物にスパイクされた異なるヒドロキシル含有小分子（ＰＡＢＡ、ＨＢＡ、ＨＰＡＡおよびＢｏｃ－Ｙ）を、過剰量のＴＭＴ試薬と反応し、過剰標識を阻害するためのこれらのオフターゲットアミノ酸残基の競合試薬として評価した。図９に示すように、これらの小分子を添加すると、実際にペプチドのＴＭＴ過剰標識がある程度阻害された。ＷＱＱＧペプチド（配列番号３の残基１～４）については、３つのＴＭＴタグを含有する種は依然として過剰標識された産物であるが、３ＴＭＴ標識ペプチドの複数のアイソフォームは、このペプチドに関連するすべての種の総存在量の５０％超を含む単一の優性型に収束した。５個および６個のＴＭＴタグを含有する種は有意に抑制され、代わりに２個および３個のＴＭＴタグが濃縮された。同様の阻害効果は、他のＴＴＰＰペプチドについても見ることができ、小分子の添加は、３ＴＭＴ標識産物の形成を２６％から＜７％に抑制し、予想される２ＴＭＴ標識産物を約９４％まで濃縮した。４つの小分子のすべてが、ＴＭＴ過剰標識を阻害する能力を実証したが、ＰＡＢＡは、他の小分子と比較して、そのより高い親水性、より低い分子量を考慮することによって、最も好適な競合試薬として選択されており、これは、標的化されたペプチドに干渉し、質量分析バックグラウンドシグナルを導入する可能性が低い。
【0092】
実施例４：ＴＭＴ多重化ＰＴＭ定量の再現性および感度。
ＰＴＭ定量のためのこの標的化ＭＳ／ＭＳベースのアプローチの再現性および感度を評価するために、３つの調製物（３回の測定）からのｍＡｂ－Ａ試料の各トリプシン消化物を、１：１：１：１：１：１および１：２：４：８：１６：３２の既知の比で６つの部分に等分し、次いで６重ＴＭＴタグで標識した。各比率における３つのプールされた試料を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって２回（２つの複製）分析した。０．６～３．３％（従来のアプローチに基づいて計算された割合）の範囲のレベルを有する４つの代表的なＰＴＭ（Ｌｙｓ糖化、Ａｓｎ脱アミド化、Ａｓｐ環化／異性化およびＭｅｔ酸化）を選択して、このアプローチの定量再現性および感度を評価した。天然および修飾ペプチドの抽出されたレポートイオンクロマトグラムの積分ピーク面積を使用して、各ＴＭＴチャネルにおける４つのＰＴＭの割合を計算した。図４Ａには、６つのＴＭＴチャネルにおけるｍＡｂ－Ｅ中の４つのＰＴＭの１：１：１：１：１：１の比での相対的定量の評価が示されている。図４Ｂは、１：１：１：１：１：１の比での６つのＴＭＴチャネルにおけるｍＡｂ－Ｅ中の４つのＰＴＭの相対的定量の再現性の評価を示している。
ＰＴＭ定量のためのこの標的化ＭＳ／ＭＳベースのアプローチの再現性および感度を評価するために、３つの調製物（３回の測定）からのｍＡｂ－Ａ試料の各トリプシン消化物を、１：１：１：１：１：１および１：２：４：８：１６：３２の既知の比で６つの部分に等分し、次いで６重ＴＭＴタグで標識した。各比率における３つのプールされた試料を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって２回（２つの複製）分析した。０．６～３．３％（従来のアプローチに基づいて計算された割合）の範囲のレベルを有する４つの代表的なＰＴＭ（Ｌｙｓ糖化、Ａｓｎ脱アミド化、Ａｓｐ環化／異性化およびＭｅｔ酸化）を選択して、このアプローチの定量再現性および感度を評価した。天然および修飾ペプチドの抽出されたレポートイオンクロマトグラムの積分ピーク面積を使用して、各ＴＭＴチャネルにおける４つのＰＴＭの割合を計算した。図４Ａには、６つのＴＭＴチャネルにおけるｍＡｂ－Ｅ中の４つのＰＴＭの１：１：１：１：１：１の比での相対的定量の評価が示されている。図４Ｂは、１：１：１：１：１：１の比での６つのＴＭＴチャネルにおけるｍＡｂ－Ｅ中の４つのＰＴＭの相対的定量の再現性の評価を示している。
【0093】
図５は、それぞれ０．１５、０．３０、０．６０、１．２、２．４および４．８μｇの試料ローディング量に対応する、１：２：４：８：１６：３２の比で６つのＴＭＴチャネルにおいて定量化された４つのＰＴＭの平均割合およびＲＳＤを示している。異なるローディング量で定量化された４つのＰＴＭの平均割合および相対標準偏差（ＲＳＤ）は、Ｌｙｓ糖化について０．６～０．９％および３．３～２９．０％、Ａｓｎ脱アミド化について１．６～１．９％および３．６～７．２％、Ａｓｐ環化／異性化について２．４～２．６％および３．４～７．３％、ならびにＭｅｔ酸化について３．３～３．５％および３．６～９．４％の範囲であった。全体として、異なるローディング量で定量化されたこれらのＰＴＭの平均割合は、本研究で調査したＬｙｓ糖化などの低存在量ＰＴＭ（およそ０．６％）についてさえ、従来のアプローチから計算されたもの（およそ５．０μｇローディング量）と同等であった。ローディング量が０．１５μｇであった場合、この低レベルのＬｙｓ糖化を定量化するために２９．０％（＞１５％）のＲＳＤで大きな変動が観察されたが（これは、ＮＣＥ９０での修飾ペプチドから生成されたレポートイオンの非常に低い存在量に起因し得る）、より高いレベルまたはより大きいローディング量でのＰＴＭ定量のＲＳＤはすべて１５％以内であり、試料ローディング量がわずかおよそ０．１５μｇである場合、１．０％という低いレベルでの多重化ＰＴＭ定量に対して本アプローチが高感度であること実証された。
【0094】
実施例５：ｍＡｂ－Ａの安定性試料についてのＴＭＴ多重化ＰＴＭ定量。
ｍＡｂ－Ａの安定性試料を、この標的化ＭＳ／ＭＳベースのアプローチによって分析した。対照試料を含む合計４つの試料を、還元条件下でトリプシンによって消化し、次いで４重ＴＭＴ試薬（１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、および１３１チャネル）で標識した。プールした試料を、ＰＴＭ定量のためにＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。ＴＭＴ標識を伴わない個々の消化試料もまた、ＰＴＭ定量のための従来のアプローチによって分析した。図６は、このアプローチを使用した６つの試料の多重化ＰＴＭ定量結果を、比較のための従来のアプローチにおいて定量化された結果とともに要約している。ＰＴＭ定量の比較可能な結果が、２つのアプローチの両方において観察された。Ｍｅｔ２５８およびＭｅｔ４３４での酸化、Ａｓｎ３９０での脱アミド化およびＡｓｐ２８６での環化／異性化のレベルに対する温度効果が観察され、４５℃および２５℃でインキュベートした試料は、対照試料および５℃でインキュベートした試料よりも高いレベルを示した。さらに、これらのＰＴＭは、２５℃で６ヶ月間インキュベートした試料よりも４５℃で２８日間インキュベートした試料においてわずかに高いレベルを示した。対照試料を５℃で２４ヶ月間インキュベートした試料と比較した場合、レベルに有意差はなかった。他の部位での酸化、脱アミド化および環化／異性化について、それらのレベルは、本研究において試験されたストレス条件にかかわらず、４つすべての試料において同等であった。このケーススタディは、抗体試料中のＰＴＭレベルの差を定量化するこのアプローチの能力を実証するものである。
ｍＡｂ－Ａの安定性試料を、この標的化ＭＳ／ＭＳベースのアプローチによって分析した。対照試料を含む合計４つの試料を、還元条件下でトリプシンによって消化し、次いで４重ＴＭＴ試薬（１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、および１３１チャネル）で標識した。プールした試料を、ＰＴＭ定量のためにＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。ＴＭＴ標識を伴わない個々の消化試料もまた、ＰＴＭ定量のための従来のアプローチによって分析した。図６は、このアプローチを使用した６つの試料の多重化ＰＴＭ定量結果を、比較のための従来のアプローチにおいて定量化された結果とともに要約している。ＰＴＭ定量の比較可能な結果が、２つのアプローチの両方において観察された。Ｍｅｔ２５８およびＭｅｔ４３４での酸化、Ａｓｎ３９０での脱アミド化およびＡｓｐ２８６での環化／異性化のレベルに対する温度効果が観察され、４５℃および２５℃でインキュベートした試料は、対照試料および５℃でインキュベートした試料よりも高いレベルを示した。さらに、これらのＰＴＭは、２５℃で６ヶ月間インキュベートした試料よりも４５℃で２８日間インキュベートした試料においてわずかに高いレベルを示した。対照試料を５℃で２４ヶ月間インキュベートした試料と比較した場合、レベルに有意差はなかった。他の部位での酸化、脱アミド化および環化／異性化について、それらのレベルは、本研究において試験されたストレス条件にかかわらず、４つすべての試料において同等であった。このケーススタディは、抗体試料中のＰＴＭレベルの差を定量化するこのアプローチの能力を実証するものである。
【0095】
実施例６：ｍＡｂ－Ｂの試料の同等性のためのＴＭＴ多重化ＰＴＭ定量。
本実施例は、異なるプロセス領域から製造されたモノクローナル抗体の同等の質を実証するために、ｍＡｂ－Ｆの同等性試料中のＰＴＭレベルを定量化することを示す。合計４つの比較試料を、還元条件下でトリプシンによって消化し、次いで、４重ＴＭＴ試薬（１２８、１２９、１３０および１３１チャネル）で標識した。プールした試料を、ＰＴＭ定量のためにＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。ＴＭＴ標識を伴わない個々の消化試料もまた、ＰＴＭ定量のための従来のアプローチによって分析した。両方のアプローチからの４つの同等性試料のＰＴＭ定量結果を図７Ａおよび７Ｂに要約している。２つのアプローチは、匹敵するＰＴＭ割合を定量化し、Ｍｅｔ酸化、Ａｓｎ脱アミド化、Ａｓｐ環化および異性化ならびにＣ末端リジンを含むすべてのＰＴＭは、異なるプロセス領域から製造された４つのｍＡｂ－Ｂ試料において匹敵するレベルを示した。図７Ａは、レベル＞２．５％のＰＴＭを示し、図７Ｂは、レベル≦２．５％のＰＴＭを示している。
本実施例は、異なるプロセス領域から製造されたモノクローナル抗体の同等の質を実証するために、ｍＡｂ－Ｆの同等性試料中のＰＴＭレベルを定量化することを示す。合計４つの比較試料を、還元条件下でトリプシンによって消化し、次いで、４重ＴＭＴ試薬（１２８、１２９、１３０および１３１チャネル）で標識した。プールした試料を、ＰＴＭ定量のためにＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。ＴＭＴ標識を伴わない個々の消化試料もまた、ＰＴＭ定量のための従来のアプローチによって分析した。両方のアプローチからの４つの同等性試料のＰＴＭ定量結果を図７Ａおよび７Ｂに要約している。２つのアプローチは、匹敵するＰＴＭ割合を定量化し、Ｍｅｔ酸化、Ａｓｎ脱アミド化、Ａｓｐ環化および異性化ならびにＣ末端リジンを含むすべてのＰＴＭは、異なるプロセス領域から製造された４つのｍＡｂ－Ｂ試料において匹敵するレベルを示した。図７Ａは、レベル＞２．５％のＰＴＭを示し、図７Ｂは、レベル≦２．５％のＰＴＭを示している。
【0096】
実施例７：ｍＡｂ－Ｅのトリスルフィド標準試料についてのＴＭＴ多重化ＰＴＭ定量。
トリスルフィド標準試料を作製して、細胞培養プロセス開発中のインプロセス試料のトリスルフィドレベルをモニタリングするための較正曲線を確立した。ここで、本発明者らは、標的化ＭＳ／ＭＳに基づくアプローチを適用して、Ｈ２Ｓストレスを受けた試料を参照標準試料と、それぞれ１００：０、７５：２５、５０：５０、２５：７５および０：１００の異なる比で混合することによって生成されたｍＡｂ－Ｅの５つのトリスルフィド標準試料におけるトリスルフィドレベルを定量化した。５つのトリスルフィド標準試料を非還元条件下でトリプシンによって消化し、次いで、５重ＴＭＴ試薬（１２６、１２７、１２８、１２９および１３０チャネル）で標識した。プールした試料を、トリスルフィド定量のためにＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。ＴＭＴ標識を伴わない個々の消化試料もまた、比較のために従来のアプローチによって分析した。図８に示すように、このアプローチで定量化された標準試料のトリスルフィドレベルは、それぞれ１４．９％、１１．１％、７．５％、３．２％および０．１％であった。これらの結果は、ストレスをかけた試料と参照標準試料との混合比に基づいて計算された値と良好に整合しており、従来のアプローチで得られた値にも匹敵し、対応するトリスルフィドレベルはそれぞれ１５．２％、１１．７％、７．８％、３．２％および０．１％であった。
トリスルフィド標準試料を作製して、細胞培養プロセス開発中のインプロセス試料のトリスルフィドレベルをモニタリングするための較正曲線を確立した。ここで、本発明者らは、標的化ＭＳ／ＭＳに基づくアプローチを適用して、Ｈ２Ｓストレスを受けた試料を参照標準試料と、それぞれ１００：０、７５：２５、５０：５０、２５：７５および０：１００の異なる比で混合することによって生成されたｍＡｂ－Ｅの５つのトリスルフィド標準試料におけるトリスルフィドレベルを定量化した。５つのトリスルフィド標準試料を非還元条件下でトリプシンによって消化し、次いで、５重ＴＭＴ試薬（１２６、１２７、１２８、１２９および１３０チャネル）で標識した。プールした試料を、トリスルフィド定量のためにＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。ＴＭＴ標識を伴わない個々の消化試料もまた、比較のために従来のアプローチによって分析した。図８に示すように、このアプローチで定量化された標準試料のトリスルフィドレベルは、それぞれ１４．９％、１１．１％、７．５％、３．２％および０．１％であった。これらの結果は、ストレスをかけた試料と参照標準試料との混合比に基づいて計算された値と良好に整合しており、従来のアプローチで得られた値にも匹敵し、対応するトリスルフィドレベルはそれぞれ１５．２％、１１．７％、７．８％、３．２％および０．１％であった。
【0097】
開示されたＴＭＴベースの多重化アプローチは、ＰＴＭ定量のための現在のペプチドマッピングワークフローと適合性があり、試料調製手順に対する変更は最小限であるが、特に試料の大きなセットが分析される場合、質量分析データ取得時間を有意に短縮する。本明細書では、ＮＣＥを３５から９０に調整することによって、従来のアプローチにおける割合に匹敵する割合を達成しながら、標的化ＭＳ／ＭＳスペクトル中の天然および修飾ペプチドから生成されるレポートイオンによって、異なるタイプのＰＴＭを定量化することが実現可能であることを実証している。このアプローチは、低い試料ローディング量であっても１．０％という低いレベルでＰＴＭを定量化するための優れた再現性および感度を提供することが示される。このアプローチの多重化特徴は、単一のＬＣ－ＭＳ実行において複数の試料の質属性を定量化することによって、ＬＣ－ＭＳベースのタンパク質生物薬剤特徴付けの分析能力を前進させるが、また、試料が従来のアプローチにおいてＬＣ－ＭＳによって個々に分析される場合に遭遇し得るＰＴＭ定量における実行間変動性を低減し、それにより、正確かつ再現可能なＰＴＭ定量のための質量分析データの質を改善する。全体として、異なる症例研究におけるモノクローナル抗体試料の分析について本明細書で実証されるように、開発されたアプローチは、薬物開発の異なる段階におけるモノクローナル抗体の特徴付けに対する高まる要求により良好に応えるするために、従来のアプローチと比較してより効率的な方法を提供する。
【0098】
本発明は、本明細書に記載される具体的な実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されたものに加えて本発明の様々な修正は、前述の記載および添付の図から当業者には明らかであろう。そのような変更は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】
【国際調査報告】