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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-23
(54)【発明の名称】オボアルブミン及びその天然バリアントの発現
(51)【国際特許分類】
C12N 1/15 20060101AFI20230315BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230315BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20230315BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20230315BHJP
C07K 14/77 20060101ALN20230315BHJP
C12R 1/685 20060101ALN20230315BHJP
【ＦＩ】
C12N1/15 ZNA
C12N1/19
C12P21/02 C
C12N15/12
C07K14/77
C12R1:685
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022542767
(86)(22)【出願日】2021-01-14
(85)【翻訳文提出日】2022-09-09
(86)【国際出願番号】 EP2021050650
(87)【国際公開番号】W WO2021144342
(87)【国際公開日】2021-07-22
(31)【優先権主張番号】20151815.6
(32)【優先日】2020-01-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】520384840
【氏名又は名称】ザ プロテイン ブルワリー ビー．ヴイ．
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｒｅｗｅｒｙ Ｂ．Ｖ．
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100123995
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 雅一
(72)【発明者】
【氏名】アーナウツ， ジョイス ジョゼフィーヌ エリザベス
(72)【発明者】
【氏名】バスケス ヴィタリ， マリア
(72)【発明者】
【氏名】パレニコヴァ， ルーシー
(72)【発明者】
【氏名】ローレ， ニールス
(72)【発明者】
【氏名】クライネ ハール， マロエ
(72)【発明者】
【氏名】ライングード， ジョス
(72)【発明者】
【氏名】マースデン， ステファン ロバート
(72)【発明者】
【氏名】デ ラート， ヴィルヘルムス テオドルス アントニウス マリア
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064AG24
4B064BJ12
4B064CA05
4B064CA06
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA10
4B065AA58X
4B065AA60X
4B065AA61X
4B065AA62X
4B065AA63X
4B065AA65X
4B065AA69X
4B065AA70X
4B065AB01
4B065AC14
4B065CA24
4B065CA41
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA70
4H045EA01
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、真菌細胞における、このようなタンパク質、例えば、オボアルブミンの発現による、ヒトによる摂取のための動物由来のタンパク質の、動物によらない作製に関する。本発明は、オボアルブミンなど、動物由来のタンパク質の作製のために改変された真菌細胞と、これらの細胞が、動物由来のタンパク質の作製のために使用される方法とに関する。
【選択図】 なし
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
目的の動物由来食用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含み、前記ヌクレオチド配列が、コードされる目的のタンパク質の、真菌宿主細胞による発現をもたらすことが可能である、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されている真菌宿主細胞。
【請求項2】
前記調節配列が、高度発現真菌タンパク質のプロモーターであり、好ましくは、前記高度発現真菌タンパク質が、酸安定性αアミラーゼ、α－アミラーゼ、タカアミラーゼ、グルコアミラーゼ、キシラナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、スクラーゼ、アセトアミダーゼ、スーパーオキシドディスムターゼから選択され、より好ましくは、前記プロモーターが、クロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼプロモーターである、請求項１に記載の真菌宿主細胞。
【請求項3】
前記目的の動物由来食用タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、前記プロモーターが由来する、前記高度発現真菌タンパク質の天然コドン使用に照らしてコドン最適化されており、好ましくは、前記高度発現真菌タンパク質が、クロコウジカビグルコアミラーゼである、請求項１又は請求項２に記載の真菌宿主細胞。
【請求項4】
前記発現カセットが、前記高度発現真菌タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子座に組み込まれ、好ましくは、前記遺伝子座が、増幅遺伝子座であり、より好ましくは、前記遺伝子座が、クロコウジカビｇｌａＡ遺伝子座である、請求項１～３のいずれか一項に記載の真菌宿主細胞。
【請求項5】
前記発現カセットが、高度発現分泌真菌タンパク質に由来するシグナル配列をコードするヌクレオチド配列と、任意選択で、前記目的の動物由来食用タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列に、インフレームで、作動可能に連結されたプロ配列とを含み、好ましくは、前記シグナル配列、及び任意選択のプロ配列が、クロコウジカビグルコアミラーゼプレプロ配列である、請求項１～４のいずれか一項に記載の真菌宿主細胞。
【請求項6】
前記発現カセットが、Ｎ末端からＣ末端の方向に：目的のタンパク質のＮ末端へと融合しているクロコウジカビグルコアミラーゼプレプロ配列；任意選択で、成熟クロコウジカビグルコアミラーゼアミノ酸配列のうちの、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％；任意選択で、切断型リンカーポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする、請求項５に記載の真菌宿主細胞。
【請求項7】
前記宿主細胞が、酵母又は糸状菌であり、好ましくは、糸状菌宿主細胞が、黒斑病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ）、アポフィソミセス・バリアビリス（Ａｐｏｐｈｙｓｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、アスペルギルス・フミガートゥス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、ニホンコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アワモリコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）、クラドフィアロフォラ属（Ｃｌａｄｏｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ）種、フォンセケア・ペドロソイ（Ｆｏｎｓｅｃａｅａ ｐｅｄｒｏｓｏｉ）、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種、フサリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・ソラニー（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）、リクテイミア属（Ｌｉｃｈｔｈｅｉｍｉａ）種、リクテイミア・コリムビフェラ（Ｌｉｃｈｔｈｅｉｍｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ）、リクテイミア・ラモーサ（Ｌｉｃｈｔｈｅｉｍｉａ ｒａｍｏｓａ）、ミセリオフトーラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）種、ミセリオフトーラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、クモノスカビ属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）種、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ）、リゾムコール属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）種、リゾムコール・プシルス（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、トリコフィトン属（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）種、トリコフィトン・インテルディギターレ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ）、及び紅色白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ）から選択される種に属し、これらのうち、クロコウジカビ種の株が、最も好ましい、請求項１～６のいずれか一項に記載の真菌宿主細胞。
【請求項8】
前記宿主細胞が、酵母様形態で増殖する能力を有する糸状菌株であり、好ましくは、前記株が、クロコウジカビ株であるＣＩＣＣ２４６２、又はＣＩＣＣ２４６２株の単一コロニー分離株及び／若しくは派生株である、請求項７に記載の真菌宿主細胞。
【請求項9】
目的の動物由来食用タンパク質が、ヘムタンパク質、乳タンパク質、又は卵タンパク質であり、好ましくは、卵白タンパク質であり、最も好ましくは、オボアルブミンである、請求項１～８のいずれか一項に記載の真菌宿主細胞。
【請求項10】
前記オボアルブミンが、ニワトリ、ペリカン、ウズラ、ハト、ダチョウ、チドリ、シチメンチョウ、カモ、ガチョウ、カモメ、ホロホロチョウ、ヤケイ、クジャク、ヤマウズラ、キジ、エミュー、レア、及びキーウィからなる群から選択される鳥類に由来するオボアルブミンのアミノ酸配列に対する、少なくとも５０％の同一性を伴うアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の真菌宿主細胞。
【請求項11】
目的の動物由来食用タンパク質を作製するためのプロセスであって、ａ）請求項１～１０のいずれか一項に記載の真菌宿主細胞を、前記目的のタンパク質の発現をもたらす条件下で、発酵槽の培地において培養するステップと；
ｂ）任意選択で、前記目的のタンパク質を回収するステップと
を含み、
好ましくは、前記目的のタンパク質が、オボアルブミンである
プロセス。
【請求項12】
ステップａ）において、前記真菌宿主細胞が、ｐＨ５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、若しくは７．５以上であるか、又はｐＨ９．０、８．５、若しくは８．０以下であるｐＨで培養される、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項13】
ステップａ）において、発酵槽における培地への機械力の入力が、２．５、２．０、１．８、１．６、１．４、１．０、０．５、０．２、又は０．１ｋＷ／ｍ３を超えない、請求項１１又は１２に記載のプロセス。
【請求項14】
ステップｂ）において、前記目的のタンパク質の回収が、少なくとも第１のアニオン交換ステップを含み、ステップａ）において得られた培養培地が、ｐＨ６～９の範囲のｐＨにおいて、０．０８ＭのＮａＣｌのイオン強度と同等未満のイオン強度で、アニオン交換カラムへとアプライされ、前記目的のタンパク質が、フロースルーに回収され、任意選択で、第１のアニオン交換ステップにおいて得られたフロースルーが、第１のステップと同一の条件下で、第２のアニオン交換ステップにかけられ、前記目的のタンパク質が、第２のアニオン交換ステップに由来するフロースルーに回収され、好ましくは、前記目的のタンパク質が、オボアルブミンである、請求項１１～１３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項15】
目的の動物由来食用タンパク質を、前記タンパク質が発現されている、真菌宿主細胞の使用済み培養培地から精製するためのプロセスであって、ａ）使用済み培養培地が、ｐＨ６～９の範囲のｐＨにおいて、０．０８ＭのＮａＣｌのイオン強度と同等未満のイオン強度で、アニオン交換カラムへとアプライされ、前記目的のタンパク質が、フロースルーに回収され、好ましくは、前記目的のタンパク質が、オボアルブミンである、第１のアニオン交換ステップと；
ｂ）任意選択で、ステップａ）において得られたフロースルーが、第１のステップと同一の条件下で、アニオン交換にかけられ、前記目的のタンパク質が、フロースルーに回収される、第２のアニオン交換ステップと
を含み、
好ましくは、前記目的のタンパク質が、オボアルブミンである
プロセス。
【請求項16】
目的の動物由来食用タンパク質の作製のための、請求項１～１０のいずれか一項に記載の真菌宿主細胞、又は請求項１１～１５のいずれか一項に記載のプロセスの使用であって、好ましくは、前記目的のタンパク質が、オボアルブミンである使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、分子微生物学、食品技術、及び発酵技術の分野に関する。特に、本発明は、真菌細胞における、このようなタンパク質、例えば、オボアルブミンの発現による、ヒトによる摂取のための動物由来のタンパク質の、動物によらない作製に関する。本発明は、オボアルブミンなど、動物由来のタンパク質の作製のために改変された真菌細胞と、これらの細胞が、このようなタンパク質を作製するのに使用される方法とに関する。
【背景技術】
【0002】
卵白は、多くの食品適用において、結合、起泡、ゲル化を目的として使用される。世界人口は、２０５０年には、７０億人から９０億人へと増加し、２１００年には、１１０億へと増加すると予測され、世界の食品生産は、大幅に増加する必要がある。これと同時に、地球規模の温暖化のために、利用可能な農耕用地表及び真水の灌漑水が低減している。卵の生産プロセスは、ニワトリへと施されるダイズ及び穀類の栽培を介して、著明量の水を要求する。このプロセスについての、さらなる検討事項は、肥料を介する窒素の排出、卵産物におけるサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）及びリステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）によるヒト健康への脅威、並びに養鶏場における抗生剤の使用により引き起こされる抗生剤耐性の増大を含むアウトプットである。ヒトの健康は、養鶏場におけるダニを駆除するのに使用され、卵自体に蓄積されうる、フィプロニルなど、大量の殺虫剤の使用により、さらに脅かされる。これらの懸念を念頭に、良好な栄養価及び機能的特性を伴う、植物ベースの食用生成物に対する、とりわけ、完全菜食主義者である摂取者（動物由来生成物を摂取しない）からの要望が増大している。
【0003】
卵白タンパク質を、オボアルブミンと同様に、微生物において発現させ、それらを、滅菌発酵槽において培養するという概念は、機能的成分を、卵白と同様に得るための代替法と考えられうる。卵白タンパク質を、発酵により作製するために、生産は、より土地資源効率的であり、より水資源効率的であり、地球規模の温暖化因子への寄与を軽減することが好ましい。１ヘクター当たりのオボアルブミンの生産量は、１ヘクター当たり平均７トンの鶏餌（１ヘクター当たり１０トンのトウモロコシ及び４トンのダイズ）を仮定し、次いで、卵１ｋｇ当たり２ｋｇの鶏餌及び卵１個当たり６％の卵白タンパク質（残りは、卵殻、卵黄、及び水である）を仮定することにより計算された。卵白タンパク質におけるオボアルブミンが５４％であると仮定すると、動物価値連鎖系によるオボアルブミン総生産量は、１年当たりに得られるオボアルブミン：７×０．０６×０．５４／２＝１１３ｋｇである。
【0004】
アンモニアを、真菌系における窒素供給源として使用する場合の、糖からのタンパク質の生産量は、重量ベースで、最大２０％である。真菌により産生されるタンパク質は、細胞から、培養培地へと分泌され、次いで、目的のタンパク質は、精密濾過、濾過、遠心分離、又はこれらの組合せを介して、細胞を、分泌型タンパク質から分離することにより、発酵槽から採取されうる。次いで、無細胞タンパク質溶液は、必要な場合、限外濾過又は真空蒸発により、所望のタンパク質濃度へと濃縮されうる。その後、タンパク質は、セルラーゼ（トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ））又はアミラーゼ（アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））など、存在しうる真菌バックグラウンドタンパク質からさらに精製されうる。次いで、タンパク質は、凍結乾燥又は噴霧乾燥など、当技術分野で公知の方法により、粉末へと乾燥させられる。
【0005】
代替法は、水資源効率的で、高収率である、サトウキビ若しくはテンサイ、又はトウモロコシなどの糖科作物を使用しうる。こうして、１年当たり１ヘクター当たり１５～２０トンを超える糖を採取しうる。２０％の糖収率及び１ヘクター当たり１７．５トンの糖を仮定すると、理論的には、１ヘクター当たり３５００ｋｇのオボアルブミンが採取されうる。これは、前述された、現行の卵生産プロセスの３０倍である。
【0006】
真菌は、最大で、１００ｇ／Ｌのタンパク質を産生するが、酵母は、同じ糖入力で、１０ｇ／Ｌを産生するに過ぎないので、酵母を使用すると、動物系に対する改善が、３倍だけであるのに対し、真菌により、本発明者らは、３０倍の土地使用低減を達することができると考えられうる。多くの真菌及び酵母が、酵素及び他のタンパク質の作製のために、産業的スケールで利用されている。最もよく利用される酵母は、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、メタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、及びハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）である。Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）については、報告された、発酵培養液１Ｌ当たりの最大タンパク質発現が、約数ｇである（ｖａｎ Ｏｏｙｅｎら、２００６）のに対し、メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）については、同発現が、約２倍である（Ｗｅｒｔｅｎ Ｍ．Ｗ．Ｔ．ら、２０１９）。しかし、メチロトローフ酵母（メタノール資化酵母）の加工に基づく生産プロセスは、誘導剤としてのメタノールに依拠するプロモーターの使用のために、防爆発酵設備の設置を要求する。大半の工業用酵素は、アスペルギルス属種、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、ミセリオフトーラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）などの糸状真菌により作製される。糸状真菌は、酵母のタンパク質分泌能の数倍である、それらの極高タンパク質分泌能で公知である。例えば、Ｄｙａｄｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．（ＵＳ）により、工業用タンパク質及び工業用酵素並びに医薬用タンパク質及び医薬用酵素の生産のために開発され、かつて、クリソスポリウム・ラクナウウェンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）Ｃ１として公知であった、Ｍ．テルモフィラ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）について、１００ｇ／Ｌを超える、分泌型タンパク質の生産力価が報告されている（Ｖｉｓｓｅｒ Ｈ．ら、２０１１）。クロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）及びＴ．レエセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）について、生産力価は、質数十ｇ／Ｌであり、おそらく、タンパク質１００ｇ／Ｌを超える力価に達すると考えられる（Ｏｗｅｎ Ｗａｒｄ、２０１２）。
【0007】
ニワトリオボアルブミンは、酵母である、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｍｅｒｃｅｒｅａｕ－Ｐｕｉｊａｌｏｎ Ｏ．ら、１９８０）、及びメタノール資化酵母（Ｉｔｏ Ｋ．ら、２００５）において発現されている。Ｉｔｏらにより報告されたオボアルブミンの全分泌量が、約１０ｍｇ／Ｌであったのに対し、出芽酵母では、オボアルブミンは、無細胞抽出物における、タンパク質５～２０ｎｇ／ｍｇの間の量で見出された。メタノール資化酵母により分泌されたオボアルブミンは、ニワトリオボアルブミンと比較した場合に、モノグリコシル化又はジグリコシル化されていることが見出されたが、Ｎ末端のアセチル化及びリン酸化は見出されなかった（Ｉｔｏ Ｋ．ら、２００５、前出）。ニワトリオボアルブミン分子は、主にモノグリコシル化されており、Ｎ末端は、ゼロ、１つ又は２つのセリン残基において、アセチル化及びリン酸化されている（Ｎｉｓｂｅｔ Ａ．Ｄ．ら、１９８１）。Ｃｌａｒａ Ｆｏｏｄｓ ＣＯ．、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ（ＵＳ）は、それらの特許出願（米国特許第２０１８３５５０２０ Ａ１号）において、鶏卵に存在するオボアルブミンを含む、いくつかのタンパク質の、メタノール資化酵母におけるクローニング及び過剰発現について記載している。しかし、作製されたオボアルブミンの量については、言及されていない。
【0008】
文献では、異なる鳥類に由来するオボアルブミンの異種発現について報告されている。Ｋｒｉｚｋｏｖａら（１９９２）は、ウズラから、ｃＤＮＡを単離し、出芽酵母において発現させた。タンパク質は、無細胞抽出物において検出された。Ｙａｎｇら（２００９）は、ヒメウズラオボアルブミン遺伝子のクローニング、及びメタノール資化酵母における過剰発現について記載したが、報告された収率は、５．４５ｇ／Ｌの分泌オボアルブミンであった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
しかし、当技術分野では、オボアルブミンなどの卵白タンパク質を含む、食肉タンパク質、乳タンパク質、及び家禽タンパク質など、ヒト摂取のための動物由来タンパク質の微生物によるより効率的な作製が、依然として必要とされている。本発明は、糸状真菌における、このような動物由来のタンパク質の発現のための手段及び方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0010】
一態様では、本発明は、目的の動物由来食用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含み、ヌクレオチド配列が、コードされる目的のタンパク質の、真菌宿主細胞による発現をもたらすことが可能である、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されている真菌宿主細胞に関する。
【0011】
一実施形態では、調節配列が、高度発現真菌タンパク質のプロモーターであり、好ましくは、高度発現真菌タンパク質が、酸安定性αアミラーゼ、α－アミラーゼ、タカアミラーゼ、グルコアミラーゼ、キシラナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、スクラーゼ、アセトアミダーゼ、スーパーオキシドディスムターゼから選択され、より好ましくは、プロモーターが、クロコウジカビグルコアミラーゼプロモーターである、本発明に従う真菌宿主細胞真菌宿主細胞が提供される。
【0012】
一実施形態では、目的の動物由来食用タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、プロモーターが由来する、高度発現真菌タンパク質の天然コドン使用に照らしてコドン最適化されており、好ましくは、高度発現真菌タンパク質が、クロコウジカビグルコアミラーゼである、本発明に従う真菌宿主細胞真菌宿主細胞が提供される。
【0013】
一実施形態では、発現カセットが、高度発現真菌タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子座に組み込まれ、好ましくは、遺伝子座が、増幅遺伝子座であり、より好ましくは、遺伝子座が、クロコウジカビｇｌａＡ遺伝子座である、本発明に従う真菌宿主細胞真菌宿主細胞が提供される。一部の実施形態では、発現カセットは、遺伝子置換により、遺伝子座に組み込まれ、好ましくは、発現カセットは、真菌ゲノムにおける、高度発現真菌タンパク質をコードする遺伝子の、１つを超えるコピーを置きかえ、より好ましくは、遺伝子座は、クロコウジカビｇｌａＡ遺伝子座である。
【0014】
一実施形態では、発現カセットが、高度発現分泌真菌タンパク質に由来するシグナル配列をコードするヌクレオチド配列と、任意選択で、目的の動物由来食用タンパク質をコードするヌクレオチド配列に、インフレームで、作動可能に連結されたプロ配列とを含み、好ましくは、シグナル配列、及び任意選択のプロ配列が、クロコウジカビグルコアミラーゼプレプロ配列である、本発明に従う真菌宿主細胞真菌宿主細胞が提供される。
【0015】
一実施形態では、発現カセットが、Ｎ末端からＣ末端の方向に：目的のタンパク質のＮ末端へと融合しているクロコウジカビグルコアミラーゼプレプロ配列；任意選択で、成熟クロコウジカビグルコアミラーゼアミノ酸配列のうちの、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％；任意選択で、切断型リンカーポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする、本発明に従う真菌宿主細胞真菌宿主細胞が提供される。
【0016】
一実施形態では、宿主細胞が、酵母又は糸状菌であり、好ましくは、糸状菌宿主細胞が、黒斑病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ）、アポフィソミセス・バリアビリス（Ａｐｏｐｈｙｓｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、アスペルギルス属種、アスペルギルス・フミガートゥス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、ニホンコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アワモリコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、ショウユコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）、クラドフィアロフォラ属（Ｃｌａｄｏｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ）種、フォンセケア・ペドロソイ（Ｆｏｎｓｅｃａｅａ ｐｅｄｒｏｓｏｉ）、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種、フサリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・ソラニー（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）、リクテイミア属（Ｌｉｃｈｔｈｅｉｍｉａ）種、リクテイミア・コリムビフェラ（Ｌｉｃｈｔｈｅｉｍｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ）、リクテイミア・ラモーサ（Ｌｉｃｈｔｈｅｉｍｉａ ｒａｍｏｓａ）、ミセリオフトーラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）種、ミセリオフトーラ・テルモフィラ、クモノスカビ属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）種、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ）、リゾムコール属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）種、リゾムコール・プシルス（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、トリコデルマ属種、トリコデルマ・レエセイ、トリコフィトン属（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）種、トリコフィトン・インテルディギターレ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ）、及び紅色白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ）から選択される種に属し、これらのうち、クロコウジカビ種の株が、最も好ましい、本発明に従う真菌宿主細胞真菌宿主細胞が提供される。
【0017】
一実施形態では、宿主細胞が、酵母様形態で増殖する能力を有する糸状菌株であり、好ましくは、株が、クロコウジカビ株であるＣＩＣＣ２４６２、又はＣＩＣＣ２４６２株の単一コロニー分離株及び／若しくは派生株である、本発明に従う真菌宿主細胞が提供される。
【0018】
一実施形態では、目的の動物由来食用タンパク質が、ヘムタンパク質、乳タンパク質、又は卵タンパク質であり、好ましくは、卵白タンパク質であり、最も好ましくは、オボアルブミンである、本発明に従う真菌宿主細胞真菌宿主細胞が提供される。
【0019】
一実施形態では、オボアルブミンが、ニワトリ、ペリカン、ウズラ、ハト、ダチョウ、チドリ、シチメンチョウ、カモ、ガチョウ、カモメ、ホロホロチョウ、ヤケイ、クジャク、ヤマウズラ、キジ、エミュー、レア、及びキーウィからなる群から選択される鳥類に由来するオボアルブミンのアミノ酸配列に対する、少なくとも５０％の同一性を伴うアミノ酸配列を含む、本発明に従う真菌宿主細胞真菌宿主細胞が提供される。
【0020】
さらなる態様では、目的の動物由来食用タンパク質を作製するためのプロセスであって、
ａ）請求項１～１０のいずれか一項に記載の真菌宿主細胞を、目的のタンパク質の発現をもたらす条件下で、発酵槽の培地において培養するステップと；
ｂ）任意選択で、目的のタンパク質を回収するステップと
を含み、
好ましくは、目的のタンパク質が、オボアルブミンである
プロセスが提供される。
ａ）請求項１～１０のいずれか一項に記載の真菌宿主細胞を、目的のタンパク質の発現をもたらす条件下で、発酵槽の培地において培養するステップと；
ｂ）任意選択で、目的のタンパク質を回収するステップと
を含み、
好ましくは、目的のタンパク質が、オボアルブミンである
プロセスが提供される。
【0021】
一実施形態では、ステップａ）において、真菌宿主細胞が、ｐＨ５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、若しくは８．５以上であるｐＨ、及び／又は１０、９．５．９．０、８．５、８．０、７．５、若しくは７．０以下であるｐＨで培養される、本発明に従うプロセスが提供される。
【0022】
一実施形態では、ステップａ）において、発酵槽における培地への機械力の入力が、２．５、２．０、１．８、１．６、１．４、１．０、０．５、０．２、又は０．１ｋＷ／ｍ３を超えない、本発明に従う真菌宿主細胞プロセスが提供される。
【0023】
一実施形態では、ステップａ）において、真菌宿主細胞が、気泡塔が装備された発酵槽において培養され、好ましくは、宿主細胞が、発酵槽における培地への機械力の入力を伴わずに培養される、本発明に従うプロセスが提供される。
【0024】
さらなる態様では、目的の動物由来食用タンパク質の作製のための、本発明に従う真菌宿主細胞、又は本発明に従うプロセスの使用であって、好ましくは、目的のタンパク質が、オボアルブミンである使用が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】選択された可食鳥類についての、オボアルブミンのアミノ酸配列アライメントを示す図である。ニワトリオボアルブミン配列では、アレルギー誘発性エピトープを、枠囲いにより描示する。１とマークされた枠囲いは、ＩｇＥアレルギー誘発性エピトープ（Ｍｉｎｅ及びＲｕｐａ、２００３）を指し示し；２とマークされた枠囲いは、ＩＥＤＢデータベース及びＳＥＤＢデータベースに由来するエピトープを指し示し；、３とマークされた枠囲いは、好塩基球誘導エピトープ（Ｈｏｎｍａら、１９９６）を指し示す。
【図2】全ゲノムに基づく、クロコウジカビについてのコドン使用表である。
【図3A】９６ウェル深型ウェルプレート（ＤＷＰ）又はシェークフラスコ（試料ごとに、どの供給源に由来するのかが言明される）において発酵させられ、選択されたクロコウジカビのオボアルブミン形質転換体についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥの例を示す図である。ＯＶＡ原液は、オボアルブミン標準物質（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）に対応する。５μｌのベンチマーク（ＢｅｎｃｈＭａｒｋ）（商標）Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒｗｅｒｅをゲルにロードして、タンパク質バンドの分子量を決定した。 Ａ）レーンは、クロコウジカビの野生型、以下の異なる発現構築物及びＯＶＡ標準物質：１．ＢＺＡＳＮＩ．２２ａ（シェークフラスコ）；２．ＤＤＤＫ部位を伴う、ＧＬＡ５０２キャリアであるニワトリＯＶＡ（ＣＯ ｇｌａＡ）（シェークフラスコ）；３．ニワトリＯＶＡ（ＣＯ ｇｌａＡ、ＤＷＰ）；４．ニワトリＯＶＡ（全ゲノムＣＯ、ＤＷＰ）；５．ペリカンＯＶＡ（全ゲノムＣＯ、ＤＷＰ）；６．ウズラＯＶＡ（全ゲノムＣＯ、ＤＷＰ）；７．ＢＺＡＳＮＩ．４８（シェークフラスコ）；８．ニワトリＯＶＡ（ＣＯ ｇｌａＡ、ＤＷＰ）；９．ペリカンＯＶＡ（ＣＯ ｇｌａＡ、ＤＷＰ）；１０．ＯＶＡ標準物質（０．０５ｇ／ｌ）；１１．ＯＶＡ標準物質（０．１ｇ／ｌ）；及び１２．ＯＶＡ標準物質（０．３ｇ／ｌ）を保有する、クロコウジカビのＯＶＡ形質転換体を含有する。レーン２～６における試料は、ＢＺＡＳＮＩ．２２ａバックグラウンドにおいて作製し、レーン８及び９における試料は、ＢＺＡＳＮＩ．４８バックグラウンドにおいて作製した。ＯＶＡは、オボアルブミンを表し、ＣＯは、コドン最適化を表す。
【図3B】９６ウェル深型ウェルプレート（ＤＷＰ）又はシェークフラスコ（試料ごとに、どの供給源に由来するのかが言明される）において発酵させられ、選択されたクロコウジカビのオボアルブミン形質転換体についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥの例を示す図である。ＯＶＡ原液は、オボアルブミン標準物質（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）に対応する。５μｌのベンチマーク（ＢｅｎｃｈＭａｒｋ）（商標）Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒｗｅｒｅをゲルにロードして、タンパク質バンドの分子量を決定した。 Ｂ）レーンは、クロコウジカビの野生型、以下の異なる発現構築物及びＯＶＡ標準物質：１．ＢＺＡＳＮＩ．２２ａ（シェークフラスコ）；２．ＤＤＤＫ部位を伴う、ＧＬＡ５０２キャリアであるニワトリＯＶＡ（ＣＯ ｇｌａＡ、シェークフラスコ）；３．ニワトリＯＶＡ（ＣＯ ｇｌａＡ、ＤＷＰ）；４．ＢＺＡＳＮＩ．４８（シェークフラスコ）；５．ニワトリＯＶＡ（ＣＯ ｇｌａＡ、シェークフラスコ）；６．ＧＬＡ５４ニワトリＯＶＡ（ＣＯ ｇｌａＡ、シェークフラスコ）形質転換体１；７．ＧＬＡ５４ニワトリＯＶＡ（ＣＯ ｇｌａＡ、シェークフラスコ）形質転換体２；８．ＧＬＡ１００ニワトリＯＶＡ（ＣＯ ｇｌａＡ、シェークフラスコ）形質転換体１；９．ＧＬＡ１００ニワトリＯＶＡ（ＣＯ ｇｌａＡ、シェークフラスコ）形質転換体２；１０．ＧＬＡ５０２ニワトリＯＶＡ（ＣＯ ｇｌａＡ、シェークフラスコ）形質転換体１；１１．ＧＬＡ５０２ニワトリＯＶＡ（ＣＯ ｇｌａＡ、シェークフラスコ）形質転換体２；１２．ＯＶＡ標準物質（０．０５ｇ／ｌ）；１３．ＯＶＡ標準物質（０．１ｇ／ｌ）；及び１４．ＯＶＡ標準物質（０．３ｇ／ｌ）を保有する、クロコウジカビのＯＶＡ形質転換体を含有する。レーン２及び３における試料は、ＢＺＡＳＮＩ．２２ａバックグラウンドにおいて作製し、レーン６～１１における試料は、ＢＺＡＳＮＩ．４８バックグラウンドにおいて作製した。
【図4】５日目（ｄ５）及び６日目（ｄ６）における、ＤＷＰ（深型ウェルプレート）培養物の上清において、ニワトリオボアルブミンポリクローナル抗体を、使用するウェスタンブロットにより検出される、クロコウジカビのＢＺＥＳＣＯ．２２形質転換体（レーン２５及び２６）、及びＢＺＥＳＣＯ．２３形質転換体（バックグラウンドレーン２０）における、ニワトリオボアルブミンの過剰発現を示す図である。左パネルは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに対応し、右パネルは、左パネルにおいて示される、同一のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルのウェスタンブロットに対応する。各パネルにおける、右端の矢印は、標準物質（単量体）のオボアルブミン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）の位置を指し示し、上記で見出された２つの矢印は、互いに、クロコウジカビにおいて過剰発現されたニワトリオボアルブミンを指し示す。
【図5】クロコウジカビＢＺＡＳＮＩ．３３の上清の発酵試料の濾過物（０．２μｍ）についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す図である。Ｓ１～Ｓ５は、それぞれ、５Ｌの発酵槽における発酵の０．５、１７．５、３２、４１、４７．５時間後の時点に対応する。矢印は、ニワトリオボアルブミンの分泌を描示する。オボアルブミン標準物質（図５の左図）は、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎから購入した。
【図6】シェークフラスコにおけるクロコウジカビＢＺＡＳＮＩ．６０において産生されたニワトリオボアルブミンの精製を示す図である。（Ａ）アニオン交換カラムにおける精製の第１のステップである。（Ｂ）第１のステップから得られたフロースルー画分であって、オボアルブミンを含有するフロースルー画分を使用する、アニオン交換カラムにおける、第２ステップの精製である。
【発明を実施するための形態】
【0026】
定義
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される技術用語及び学術用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。当業者は、本発明の実施において使用されうる、本明細書で記載される方法及び材料と同様の又は同等である、多くの方法及び材料を認識するであろう。実際、本発明は、いかなる形であれ、この方法に限定されない。
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される技術用語及び学術用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。当業者は、本発明の実施において使用されうる、本明細書で記載される方法及び材料と同様の又は同等である、多くの方法及び材料を認識するであろう。実際、本発明は、いかなる形であれ、この方法に限定されない。
【0027】
下記では、本発明の目的で、以下の用語が規定される。
【0028】
本文献及びその特許請求の範囲では、「～を含む」という動詞及びその活用形は、この語に後続する項目が含まれ、詳細に言及されない項目が除外されないことを意味するように、非限定的な意味で使用される。加えて、不定冠詞「ある（ａ）」又は「ある（ａｎ）」による、要素への言及は、文脈が、要素のうちの１つが存在し、１つだけが存在することを明確に要求しない限りにおいて、１つを超える要素が存在する可能性を除外しない。不定冠詞「ある（ａ）」又は「ある（ａｎ）」は通例、「少なくとも１つの」を意味する。
【0029】
本明細書で使用される、「及び／又は」という用語は、言明される場合のうちの１つ又は複数が、単独で、又は言明される場合のうちの少なくとも１つ、最大で、言明される場合の全てと組み合わせて生じうることを指し示す。
【0030】
本明細書で、「少なくとも」と共に使用される、特定の値は、この特定の値、又はこれを超える値を意味する。例えば、「少なくとも２」は、「２つ又はこれを超える」、すなわち、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、・・・などと同じ意味であると理解される。
【0031】
数値と関連して使用される場合の「約」又は「およそ」（例えば、約１０）は、値が、所与の値（１０の値）より、値の０．１％大きい値又は小さい値でありうることを意味することが好ましい。
【0032】
本明細書では、「相同性」、「配列同一性」などの用語は、互換的に使用される。本明細書では、配列同一性は、配列を比較することにより決定される、２つ若しくはこれを超えるアミノ酸（ポリペプチド又はタンパク質）配列、又は２つ若しくはこれを超える核酸（ポリヌクレオチド）配列の間の関係として規定される。当技術分野では、「同一性」はまた、このような配列の連なりの間のマッチにより決定される通り、アミノ酸又は核酸配列の間の、配列類縁性程度も意味する。２つのアミノ酸配列の間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存的アミノ酸置換基を、第２のポリペプチドの配列と比較することにより決定される。「同一性」及び「類似性」は、公知の方法により、たやすく計算されうる。
【0033】
「配列同一性」及び「配列類似性」は、２つの配列の長さに応じて、グローバルアルゴリズム又はローカルアライメントアルゴリズムを使用する、２つのペプチド配列又は２つのヌクレオチド配列のアライメントにより決定されうる。同様の長さの配列が、好ましくは、配列を、全長にわたり、最適にアライメントする、グローバルアライメントアルゴリズム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム）を使用してアライメントされるのに対し、実質的に異なる長さの配列は、好ましくは、ローカルアライメントアルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム）を使用してアライメントされる。配列は、少なくともある特定の最小の配列同一性百分率（下記で規定される通り）を共有する場合（例えば、デフォルトパラメータを使用する、ＧＡＰプログラム又はＢＥＳＴＦＩＴプログラムにより、最適にアライメントされた場合）、「実質的に同一」又は「本質的に同様」であると称される。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈによるグローバルアライメントアルゴリズムを使用して、２つの配列を、マッチの数を最大化し、ギャップの数を最小化して、それらの全長（ｅｎｔｉｒｅ ｌｅｎｇｔｈ（ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ））にわたりアライメントする。グローバルアライメントは、２つの配列が、同様の長さを有する場合に、配列同一性を決定するのに使用されると適切である。一般に、ＧＡＰのデフォルトパラメータは、ギャップ創出ペナルティー＝５０（ポリヌクレオチド）／８（タンパク質）、及びギャップ伸長ペナルティー＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）として使用される。ヌクレオチドのために、使用されるデフォルト評定マトリックスは、ｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質のために、デフォルト評定マトリックスは、Ｂｌｏｓｕｍ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２、ＰＮＡ、Ｓ８９、９１５～９１９）である。配列同一性百分率のための、配列アライメント及び配列スコアは、上記のＧＡＰについて、同じパラメータを使用するか、又はデフォルトの設定（「ｎｅｅｄｌｅ」及び「ｗａｔｅｒ」の両方について、タンパク質アライメント及びＤＮＡアライメントの両方について、デフォルトのギャップ開始ペナルティーは、１０．０であり、デフォルトのギャップ伸長ペナルティーは、０．５であり；デフォルトの評定マトリックスは、タンパク質については、Ｂｌｏｓｕｍ６２であり、ＤＮＡについては、ＤＮＡＦｕｌｌである）を使用する、ＥｍｂｏｓｓＷＩＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１０．０において、Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．、９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ ９２１２１－３７５２ ＵＳＡから市販されている、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．３などのコンピュータプログラムを使用するか、又は「ｎｅｅｄｌｅ」プログラム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈグローバルアルゴリズムを使用する）、若しくは「ｗａｔｅｒ」プログラム（Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎローカルアルゴリズムを使用する）など、オープンソースのソフトウェアを使用して決定されうる。配列が、実質的に異なる全長を有する場合は、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用するローカルアライメントなどのローカルアライメントが好ましい。
【0034】
代替的に、類似性百分率又は同一性百分率は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムを使用して、公開データベースに対して検索することにより決定されうる。こうして、本発明の核酸配列及びタンパク質配列は、例えば、公開データベースに対して、検索を実施して、他のファミリーメンバー又は類縁の配列を同定するための、「クエリー配列」として、さらに使用されうる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３～１０による、ＢＬＡＳＴｎプログラム及びＢＬＡＳＴｘプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）を使用して実施されうる。ＢＬＡＳＴによるヌクレオチド検索は、スコア＝１００、ワード長＝１２とするＮＢＬＡＳＴプログラムにより、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るように実施されうる。ＢＬＡＳＴによるタンパク質検索は、スコア＝５０、ワード長＝３とするＢＬＡＳＴｘプログラムにより、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るように実施されうる。比較を目的として、ギャップ付きアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５（１７）：３３８９～３４０２において記載されている通りに、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴが利用されうる。ＢＬＡＳＴプログラム及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを活用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴｘ及びＢＬＡＳＴｎ）のデフォルトパラメータが使用されうる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／における、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのホームページを参照されたい。
【0035】
任意選択で、当業者に明らかである通り、アミノ酸類似性の程度の決定において、当業者はまた、いわゆる「保存的」アミノ酸置換も考慮に入れることができる。保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基の互換可能性を指す。保存的置換のためのアミノ酸残基のクラスの例は、下記の表に与えられる。
【表1】
【表2】
【表3】
【0036】
本明細書で使用される、「選択的にハイブリダイズすること」、「選択的にハイブリダイズする」という用語、及び同様の用語は、その下で、ヌクレオチド配列が、互いと、少なくとも６６％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも８５％、なおより好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９８％、又はより好ましくは、少なくとも９９％相同であり、典型的に、なおも互いとハイブリダイズする、ハイブリダイゼーション及び洗浄のための条件について記載することが意図される。すなわち、このようなハイブリダイズする配列は、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも８５％、なおより好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９８％、又はより好ましくは、少なくとも９９％の配列同一性を共有しうる。
【0037】
好ましい、このようなハイブリダイゼーション条件についての非限定例は、約４５℃、６倍濃度の塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）におけるハイブリダイゼーションに続く、約５０℃、好ましくは、約５５℃、好ましくは、約６０℃であり、なおより好ましくは、約６５℃、１倍濃度のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳにおける、１回又は複数回の洗浄である。
【0038】
高度に厳密な条件は、例えば、約６８℃、５倍濃度ＳＳＣ／５倍濃度デンハルト液／１．０％のＳＤＳにおけるハイブリダイゼーション、及び室温、０．２倍濃度ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳにおける洗浄を含む。代替的に、洗浄は、４２℃で実施されうる。
【0039】
当業者は、どの条件が、厳密なハイブリダイゼーション条件、及び高度に厳密なハイブリダイゼーション条件に該当するのかが分かるであろう。当技術分野では、このような条件に関する、さらなる指針は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．；並びにＡｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（３版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９５；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．）において、たやすく入手可能である。
【0040】
当然ながら、本発明の核酸の部分と、特異的にハイブリダイズするように使用される、本発明のポリヌクレオチドであれば、ポリ（Ａ）の連なり又はその相補体を含有する核酸分子（例えば、事実上、任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）とハイブリダイズしないので、ポリＡ配列（ｍＲＮＡの３’末端ポリ（Ａ）トラクトなど）、又はＴ（又はＵ）残基の相補的連なりだけとハイブリダイズするポリヌクレオチドであれば、このような本発明のポリヌクレオチドに含まれないであろう。
【0041】
本明細書では、「核酸構築物」又は「核酸ベクター」は、組換えＤＮＡ技術の使用から得られる、人工の核酸分子を意味するように理解される。したがって、「核酸構築物」という用語は、天然に存在する核酸分子を含まないが、核酸構築物は、天然に存在する核酸分子（の一部）を含みうる。「発現ベクター」又は「発現構築物」という用語は、このような配列と適合性の宿主細胞又は宿主生物における遺伝子の発現をもたらすことが可能なヌクレオチド配列を指す。これらの発現ベクターは、典型的に、少なくとも、適切な転写調節配列を含み、任意選択で、３’側転写終結シグナルを含む。発現エンハンサーエレメントなど、発現をもたらすのに必要又は有用な、さらなる因子もまた存在しうる。発現ベクターは、適切な宿主細胞へと導入され、宿主細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物における、コード配列の発現をもたらすであろう。発現ベクターは、本発明の宿主細胞又は生物における複製に適するであろう。
【0042】
本明細書で使用される、「プロモーター」又は「転写調節配列」という用語は、１つ又は複数のコード配列の転写を制御するように機能し、コード配列の転写開始部位の転写の方向に照らして、上流に配置され、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対する結合性部位、転写開始部位、並びに転写因子結合性部位、抑制型タンパク質結合性部位、及び活性化型タンパク質結合性部位、並びにプロモーターからの転写の量を調節するように、直接的に、又は間接的に作用することが、当業者に公知である、他の任意のヌクレオチド配列を含むがこれらに限定されない、他の任意のＤＮＡ配列の存在により、構造的に同定される核酸断片を指す。「構成的」プロモーターとは、大半の生理学的条件下及び発生条件下にある、大半の組織において活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターとは、例えば、化学的誘導剤の適用により、生理学的に又は発生的に調節されるプロモーターである。誘導性プロモーターはまた、存在するが、誘導されない場合もある。
【0043】
「選択用マーカー」という用語は、当業者が精通している用語であり、本明細書では、発現されると、選択用マーカーを含有する、１つ又は複数の細胞について選択するのに使用されうる、任意の遺伝子実体について記載するのに使用される。「レポーター」という用語は、マーカーと互換的に使用されうるが、主に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）など、目視可能なマーカーを指すように使用される。選択用マーカーは、顕性の場合もあり、潜性の場合もあり、双方向の場合もある。
【0044】
本明細書で使用される、「作動可能に連結された」という用語は、機能的な関係における、ポリヌクレオチドエレメントの連結を指す。核酸は、別の核酸配列と、機能的な関係に置かれた場合に、「作動可能に連結」されている。例えば、転写調節配列は、コード配列の転写に影響を及ぼす場合に、コード配列に作動可能に連結されている。「作動可能に連結された」とは、連結されるＤＮＡ配列が、典型的に、連続しており、必要な場合、２つのタンパク質コード領域を、連続的に接続し、リーディングフレームにおいて接続することを意味する。
【0045】
「タンパク質」又は「ポリペプチド」という用語は、互換的に使用され、特異的な作用方式、サイズ、三次元構造、又は由来を指すことなく、アミノ酸鎖からなる分子を指す。
【0046】
「遺伝子」という用語は、細胞において、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）へと転写される領域（転写領域）を含み、適切な調節領域（例えば、プロモーター）に作動可能に連結されたＤＮＡ断片を意味する。遺伝子は、通例、プロモーター、５’側リーダー配列、コード領域、エクソン、イントロン、並びに、例えば、ポリアデニル化部位及び／又は転写終結部位を含む、３’側非翻訳配列（３’末端）など、いくつかの作動可能に連結された断片を含むであろう。
【0047】
「遺伝子の発現」とは、適切な調節領域、特に、プロモーターに作動可能に連結されたＤＮＡ領域が、生物学的に活性である、すなわち、生物学的に活性のタンパク質又はペプチドへの翻訳が可能であるＲＮＡへと転写されるプロセスを指す。
【0048】
所与の（組換え）核酸分子又は（組換え）ポリペプチド分子と、所与の宿主生物又は宿主細胞との関係を指し示すのに使用される場合の、「相同な」という用語は、天然では、核酸分子又はポリペプチド分子が、同じ種、好ましくは、同じ亜種又は株の宿主細胞又は宿主生物により産生されることを意味すると理解される。宿主細胞と相同である場合、ポリペプチドをコードする核酸配列は、典型的に（しかし、必ずしもそうではない）、その天然の環境とは別の（異種）プロモーター配列であり、該当する場合、別の（異種）分泌シグナル配列、及び／又はターミネーター配列に作動可能に連結されるであろう。調節配列、シグナル配列、ターミネーター配列などもまた、宿主細胞と相同でありうることが理解される。この文脈では、「相同」配列エレメントを使用するだけで、遺伝子改変生物（ＧＭＯ）の「自己クローニング」（本明細書では、自己クローニングは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ ９８／８１／ＥＣ Ａｎｎｅｘ ＩＩにおける規定の通りに規定される）の構築が可能となる。２つの核酸配列の類縁性を指し示すのに使用される場合、「相同な」という用語は、１つの一本鎖核酸配列が、相補性である一本鎖核酸配列とハイブリダイズしうることを意味する。ハイブリダイゼーションの程度は、配列間の同一性の量、並びに本明細書の前出で論じられた、温度及び塩濃度などのハイブリダイゼーション条件を含む、多数の因子に依存しうる。
【0049】
核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はタンパク質に関して使用される場合の、「異種」及び「外因性」という用語は、それが存在する生物、細胞、ゲノム配列又はＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列の一部として天然に存在しないか、或いはそれが天然で見出される細胞又は配列における位置とは異なる、細胞、又はゲノム配列若しくはＤＮＡ配列若しくはＲＮＡ配列における、１つ若しくは複数の位置において見出される核酸又はタンパク質を指す。異種核酸又は異種タンパク質、及び外因性核酸又は外因性タンパク質は、それが導入される細胞に内因性ではなく、別の細胞から得られるか、又は合成により作製されるか、若しくは組換えにより作製されている。必ずしもそうではないが、一般に、このような核酸は、タンパク質、すなわち、ＤＮＡが転写されるか、又は発現される細胞により、通常は、産生されない、外因性タンパク質をコードする。同様に、外因性ＲＮＡは、外因性ＲＮＡが存在する細胞において、通常は、発現されないタンパク質をコードする。異種核酸／外因性核酸及び異種タンパク質／外因性タンパク質はまた、外来核酸又は外来タンパク質とも称されうる。本明細書では、当業者が、それが発現される細胞に対して外来であると認識する、任意の核酸又はタンパク質が、異種核酸若しくは外因性核酸又は異種タンパク質若しくは外因性タンパク質という用語により包含される。異種及び外因性という用語はまた、核酸配列又はアミノ酸配列の非天然の組合せ、すなわち、組み合わされた配列のうちの少なくとも２つが、互いに対して外来である組合せへも適用される。異種及び外因性という用語はまた、詳細に述べると、他の点では内因性である核酸又はタンパク質の、天然に存在しない修飾形へも適用される。
【0050】
本明細書では、酵素の「特異的活性」とは、全宿主細胞タンパク質１ｍｇ当たりの酵素活性の単位で、通例表される、全宿主細胞タンパク質量当たりの、特定の酵素の活性量を意味するように理解される。本発明の文脈では、特定の酵素の特異的活性は、（他の点では同一な）野生型宿主細胞におけるこの酵素の特異的活性と比較して、増大する場合もあり、低下する場合もある。
【0051】
本明細書では、「発酵」又は「発酵過程」という用語は、業界で使用される、その一般的な定義に従い、酸素の存在下又は非存在下において生じる、任意の（大スケールの）微生物過程であって、少なくとも１つの微生物の培養を含み、好ましくは、微生物が、１つ又は複数の有機基質の消費を代償として、有用な生成物をもたらす微生物過程として、広義に規定される。したがって、本明細書では、「発酵」という用語は、それが、微生物が、酸素の非存在下で、炭水化物からエネルギーを抽出する、限定的な微生物過程として規定される、より厳密な学術的定義より、はるかに広義の定義を有する。本明細書では同様に、「発酵生成物」という用語も、酸素の存在下又は非存在下において生じる、（大スケールの）微生物過程でもたらされる、任意の有用な生成物として、広義に規定される。
【0052】
本発明者らは、驚くべきことに、最適化された発酵プロセス及び回収プロセスにおいて使用される、特別にデザインされた真菌宿主細胞において、オボアルブミンを発現させることにより、所望の機能的特性を有する、オボアルブミンなど、鳥類の卵タンパク質を効率的に作製することが可能であることを見出した。
【0053】
真菌宿主細胞
したがって、第１の態様において、本発明は、宿主細胞が、目的のタンパク質を産生することを可能とするように、真菌宿主細胞の遺伝子改変に関する。したがって、本発明の真菌宿主細胞は、好ましくは、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列（例えば、オボアルブミン）であって、コードされる目的のタンパク質の、真菌宿主細胞による発現をもたらすことが可能である、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。
したがって、第１の態様において、本発明は、宿主細胞が、目的のタンパク質を産生することを可能とするように、真菌宿主細胞の遺伝子改変に関する。したがって、本発明の真菌宿主細胞は、好ましくは、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列（例えば、オボアルブミン）であって、コードされる目的のタンパク質の、真菌宿主細胞による発現をもたらすことが可能である、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。
【0054】
真菌宿主は、本明細書で、真菌クレード（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．、１９６２、「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ Ｍｙｃｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）の全ての種を含む真核微生物として規定される、「真菌」に属する宿主細胞である。したがって、真菌という用語は、糸状真菌及び酵母の両方を含む。本明細書では、「糸状真菌」とは、真菌クレード及び卵菌クレード（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈら、「Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ ａｎｄ Ｂｉｓｂｙ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｆｕｎｇｉ」、８版、１９９５、ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）により規定される）の全ての糸状形態を含む真核微生物と規定される。糸状真菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及び他の複合多糖から構成される菌糸性細胞壁により特徴づけられる。栄養増殖は、菌糸伸長であり、炭素異化は、偏性好気性である。好ましい糸状菌宿主細胞は、アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、アポフィソミセス属（Ａｐｏｐｈｙｓｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス属、クラドスフィアロフォラ属（Ｃｌａｄｏｓｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ）、フォンセケア属（Ｆｏｎｓｅｃａｅａ）、フサリウム属、リクテイミア属、ミセリオフトーラ属、クモノスカビ属、リゾムコール属、トリコデルマ属、及びトリコフィトン属を含むがこれらに限定されない属から選択される属に属する宿主細胞である。より好ましくは、糸状菌宿主細胞は、黒斑病菌、アポフィソミセス・バリアビリス、アスペルギルス属種、アスペルギルス・フミガートゥス、アスペルギルス・フラブス、ニホンコウジカビ、クロコウジカビ、アワモリコウジカビ、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・テレウス、クラドフィアロフォラ属種、フォンセケア・ペドロソイ、フサリウム属種、フサリウム・オキシスポルム、フサリウム・ソラニー、リクテイミア属種、リクテイミア・コリムビフェラ、リクテイミア・ラモーサ、ミセリオフトーラ属種、ミセリオフトーラ・テルモフィラ、クモノスカビ属種、クモノスカビ、リゾムコール属種、リゾムコール・プシルス、リゾムコール・ミエヘイ、トリコデルマ属種、トリコデルマ・レエセイ、トリコフィトン属種、トリコフィトン・インテルディギターレ、及び紅色白癬菌から選択される種に属する。最も好ましい糸状菌宿主細胞は、クロコウジカビ種の株である。
【0055】
糸状真菌のいくつかの株は、例えば、クロコウジカビ株である、ＣＢＳ ５１３．８８、ＣＢＳ１２４．９０３、及びＣＩＣＣ２４６２；ニホンコウジカビである、ＡＴＣＣ ２０４２３、ＩＦＯ ４１７７、ＡＴＣＣ １０１１、ＣＢＳ２０５．８９、ＡＴＣＣ ９５７６、ＡＴＣＣ １４４８８～Ｃ１４４９１、ＡＴＣＣ １１６０１、及びＡＴＣＣ １２８９２；Ｐ．クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ＣＢＳ ４５５．９５、ペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ）ＡＴＣＣ ３８０６５、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）Ｐ２、タラロミセス・エメルソニイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）ＣＢＳ １２４．９０２、アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ＡＴＣＣ ３６２２５又はＡＴＣＣ ４８２７２、トリコデルマ・レエセイＡＴＣＣ ２６９２１又はＡＴＣＣ ５６７６５又はＡＴＣＣ ２６９２１、ショウユコウジカビＡＴＣＣ １１９０６、及びクリソスポリウム・ラクナウウェンセＡＴＣＣ ４４００６、並びにこれらの派生株を含む、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ Ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｅｎｔｒｕｍ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＩＣＣ）、及びＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐａｔｅｎｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ）など、多数の培養物コレクションにおいて、一般にたやすくアクセス可能である。
【0056】
本明細書では、「酵母」は、真核微生物と規定され、主に、単細胞形態で増殖する、真菌クレードの全ての種を含む。酵母は、単細胞葉状体の出芽により増殖する場合もあり、生物の分裂により増殖する場合もある。代替的に、真菌宿主細胞は、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、又はヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）を含む属から選択される属、より好ましくは、クルイベロミセス・ラクティス種、出芽酵母種、ハンヌセラ・ポフィモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）種、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）種、及びメタノール資化酵母種から選択される種に属する酵母宿主細胞である。
【0057】
したがって、タンパク質又は核酸分子を指す場合の「真菌」という用語は、それらのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列が、それぞれ、真菌において天然に存在するタンパク質又は核酸を意味する。
【0058】
特に好ましい一実施形態では、糸状菌宿主細胞は、増殖するか、又は増殖する能力を有し、「酵母様形態」を伴う株の宿主細胞である。本明細書で、糸状菌宿主細胞について使用される「酵母様形態」という用語は、糸状菌が、短い菌糸で、菌糸をほとんど分枝させずに増殖することを指し示す。酵母様形態で増殖するクロコウジカビの参照株は、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｅｎｔｒｕｍ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＩＣＣ、Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ６、Ｎｏ．２４ Ｙａｒｄ、Ｊｉｕｘｉａｎｑｉａｏ Ｍｉｄｄｌｅ Ｒｏａｄ、Ｃｈａｏｙａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ、Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ；ｗｗｗ．ｃｈｉｎａ－ｃｉｃｃ．ｏｒｇ）から得られる、ＣＩＣＣ２４６２株である。クロコウジカビＣＩＣＣ２４６２株は、グルコアミラーゼの産業的産出において使用され、胞子を産生しない、クロコウジカビの形態変異株であり、低粘度の発酵培養液を結果としてもたらす、短い菌糸体、太い菌糸を有し、強力な酵素産生株であり、プロテアーゼ活性が低度であり、耐浸透圧性であり、高密度液中発酵に適する（Ｚｈａｎｇら、Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ．、２０１６、１５：６８）。
【0059】
本明細書では、酵母様形態で増殖する糸状菌株は、好ましくは、糸状菌株と、参照ＣＩＣＣ２４６２株とが、同一の条件下で増殖させられる場合に、ａ）糸状菌株の菌糸が、平均で、長さが、参照ＣＩＣＣ２４６２株の菌糸の５、１０、２０、５０、又は１００％を超えず；ｂ）糸状菌株の菌糸が、平均で、参照ＣＩＣＣ２４６２株の菌糸の５、１０、２０、５０、又は１００％を超えない分枝を示す特徴のうちの少なくとも１つを伴う糸状菌株として規定される。好ましい糸状菌宿主細胞は、クロコウジカビ株であるＣＩＣＣ２４６２、又はＣＩＣＣ２４６２株の単一コロニー分離株及び／若しくは派生株である株である。
【0060】
「酵母様形態」で増殖する糸状菌株を、宿主細胞として使用することの利点は、この株が、発酵槽において、通気のために要求する培地への機械力の入力を最小とする条件下で培養され、エネルギー費用の節減をもたらしうることである。加えて、使用する機械力の減少は、せん断力を低減し、これにより、タンパク質及び細胞の破壊を低減し、これは、収率を増大させ、細胞破砕物などによるフィルターの目詰まりを低減することにより、濾過を容易とする。
【0061】
一実施形態では、本発明の真菌宿主細胞は、グルコアミラーゼ（例えば、ｇｌａＡ）、酸安定性アルファ－アミラーゼ（例えば、ａｍｙＡ）又は中性アルファ－アミラーゼ（例えば、ａｍｙＢＩ及びａｍｙＢＩＩ）などのアミラーゼ、シュウ酸ヒドロラーゼ（例えば、ｏａｈＡ）、マイコトキシンの生合成に関与するタンパク質、及びプロテアーゼ、並びにＫＵ７０、ＫＵ８０、ｈｄｆＡ、及びｈｄｆＢによりコードされるタンパク質、又はこれらの相同体から選択される、少なくとも１つの酵素又はタンパク質の特異的活性又は量を低減するか、又は消失させる遺伝子改変を含む。好ましくは、宿主において、遺伝子改変は、酵素又はタンパク質の特異的活性又は量を、同一の条件下で培養された場合における、遺伝子改変を欠く、対応する宿主細胞と比較して、９０、７５、５０、２０、１０、５、２、又は１％を超えない酵素又はタンパク質の特異的活性又は量まで低減する。より好ましくは、遺伝子改変は、宿主細胞における酵素又はタンパク質の特異的活性又は量を、完全に消失させる。
【0062】
宿主細胞における、グルコアミラーゼ（例えば、ｇｌａＡ）、酸安定性アルファ－アミラーゼ（例えば、ａｍｙＡ）、及び中性アルファ－アミラーゼ（例えば、ａｍｙＢＩ及びａｍｙＢＩＩ）のうちの１つ又は複数の発現を低減するか、又は消失させることの利点は、細胞のエネルギー及び資源が、これらの副産物のために利用されずにすむこと、並びに／又は存在する副産物が少量となるので、目的のオボアルブミン生成物の、下流におけるプロセシングが簡略化されることだけでなく、最も重要なことは、オボアルブミンの食品適用の多くにおいて、これらの酵素の、デンプン及びデンプン由来の基質への影響が、好ましくは、回避されることである。
【0063】
宿主細胞における、シュウ酸ヒドロラーゼ（ｏａｈＡ）の発現を低減するか、又は消失させることの利点は、宿主細胞によるシュウ酸の産生が低下するか、又は見られなくなることである。シュウ酸は、食品適用など、多くの適用において、望ましくない副産物である。さらに、宿主細胞によるシュウ酸の産生の低減又は消失は、この酸による、培養培地のｐＨの所望されない低下を低減する。このような低ｐＨの回避は、緩衝への要求を低下させ、生成物収率を改善し、産生されるオボアルブミンの凝集／沈殿を回避する。
【0064】
このような毒素は、作業従事者、利用者、及び環境に対して、健康上の危険を提示するので、目的の生成物の発酵時における、これらの毒素の形成はとりわけ所望されないが、宿主細胞における、マイコトキシンの生合成に関与するタンパク質の発現を低減するか、又は消失させることの利点はこれを低減又は回避することである。
【0065】
宿主細胞における、プロテアーゼの発現を低減するか、又は消失させることの利点は、目的のオボアルブミン生成物の収率及び品質に対する、宿主細胞プロテアーゼの負の影響を低減することである。宿主細胞における、１つ又は複数のプロテアーゼの発現を低減するか、又は消失させるために好ましい遺伝子改変は、例えば、真核細胞における、プロテアーゼの転写活性化因子であるｐｒｔＴを含む。プロテアーゼの、いくつかの真菌転写活性化因子については、近年、国際公開第００／２０５９６号、国際公開第０１／６８８６４号、国際公開第２００６／０４０３１２号、及び国際公開第２００７／０６２９３６号において記載されている。これらの転写活性化因子は、クロコウジカビ、Ａ．フミガートゥス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、Ｐ．クリソゲナム、及びＡ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）から単離した。これらのプロテアーゼ遺伝子の転写活性化因子は、プロテアーゼ分解に対して感受性であるポリペプチドを、真菌細胞において作製するための方法を改善するのに使用されうる。宿主細胞が、ｐｒｔＴを欠損する場合、宿主細胞は、ｐｒｔＴによる転写制御下にあるプロテアーゼの産生を低下させるであろう。したがって、本発明に従う宿主細胞が、ｐｒｔＴを欠損すると有利である。本発明の宿主細胞は、ｐｅｐＡなど、主要なプロテアーゼを、さらに欠損する場合がある。
【0066】
宿主細胞において、グルコアミラーゼ（例えば、ｇｌａＡ）、酸安定性アルファ－アミラーゼ（例えば、ａｍｙＡ）又は中性アルファ－アミラーゼ（例えば、ａｍｙＢＩ及びａｍｙＢＩＩ）などのアミラーゼ、シュウ酸ヒドロラーゼ（例えば、ｏａｈＡ）、マイコトキシンの生合成に関与するタンパク質、及びプロテアーゼから選択される、少なくとも１つの酵素又はタンパク質の特異的活性又は量を低減するか、又は消失させる遺伝子改変をもたらすための手段及び方法については、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１１／００９７００号が参照される。
【0067】
バックグラウンドの（内因性）分泌タンパク質量を低減するために、本発明の宿主細胞において適用されうる、さらなる遺伝子改変は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｈａｎｇら（２０１６、前出）により記載されるａｍｙＲの不活化又は欠失である。
【0068】
発現カセット
一態様では、本発明に従う真菌宿主細胞における、目的のタンパク質の発現のための発現カセットが提供される。好ましくは、発現カセットは、目的の動物由来食用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは、コードヌクレオチド配列は、コードされる目的のタンパク質の、真菌宿主細胞による発現を実行又は制御する、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結される。発現調節配列は、好ましくは、コード配列に作動可能に連結された、少なくとも、転写調節配列又はプロモーターを含む。発現カセットは、好ましくは、翻訳開始配列、分泌シグナル配列、転写終結配列、ポリアデニル化シグナルなどの調節配列をさらに含む。発現エンハンサーエレメントなど、発現をもたらすのに必要又は有用な、さらなる因子もまた存在しうる。一実施形態では、調節配列は、高度発現真菌タンパク質の調節配列である。
一態様では、本発明に従う真菌宿主細胞における、目的のタンパク質の発現のための発現カセットが提供される。好ましくは、発現カセットは、目的の動物由来食用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは、コードヌクレオチド配列は、コードされる目的のタンパク質の、真菌宿主細胞による発現を実行又は制御する、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結される。発現調節配列は、好ましくは、コード配列に作動可能に連結された、少なくとも、転写調節配列又はプロモーターを含む。発現カセットは、好ましくは、翻訳開始配列、分泌シグナル配列、転写終結配列、ポリアデニル化シグナルなどの調節配列をさらに含む。発現エンハンサーエレメントなど、発現をもたらすのに必要又は有用な、さらなる因子もまた存在しうる。一実施形態では、調節配列は、高度発現真菌タンパク質の調節配列である。
【0069】
本発明に従う発現カセットにおけるコード配列に作動可能に連結されるプロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、又はハイブリッドプロモーターでありうる。使用されうる、好ましい誘導性プロモーターの例は、デンプン誘導性プロモーター、銅誘導性プロモーター、オレイン酸誘導性プロモーターである。
【0070】
好ましいプロモーターは、高度発現真菌タンパク質のプロモーターである。高度発現真菌遺伝子に由来する、好ましいプロモーターは、真菌又は糸状菌酸安定性のαアミラーゼ、α－アミラーゼ、タカアミラーゼ、グルコアミラーゼ、キシラナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、スクラーゼ、アセトアミダーゼ、及びスーパーオキシドディスムターゼをコードする遺伝子から得られるプロモーターを含む。その詳細な例は、Ａ．オリゼのタカアミラーゼ、クロコウジカビの中性アルファ－アミラーゼ、クロコウジカビの酸安定性アルファ－アミラーゼ、クロコウジカビ又はアワモリコウジカビ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）のグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）をコードする遺伝子に由来するプロモーターを含む。糸状菌細胞における使用のために、特に、好ましいプロモーターは、クロコウジカビ及びアワモリコウジカビのグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）プロモーター、又はこれらの機能的部分である。好ましい実施形態では、プロモーターだけでなく、また、翻訳開始配列、分泌シグナル配列、転写終結配列、ポリアデニル化シグナルなど、さらなる調節配列も、表示の高度発現真菌タンパク質に由来し、これらのうち、クロコウジカビ及びアワモリコウジカビのグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）の調節配列が最も好ましい。
【0071】
発現カセットは、好ましくは、発現カセットに加えて、選択用マーカー遺伝子、宿主細胞のゲノムの特異的遺伝子座における組込みのターゲティングのための配列、及び／又は自己複製のための配列など、さらなる配列エレメントを含みうる、発現ベクターの一部である。
【0072】
発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順にかけることが簡便であり、目的のポリヌクレオチドの発現をもたらしうる、任意のベクター（例えば、プラスミド又はウイルス）でありうる。ベクターの選択は、典型的に、ベクターが導入される宿主細胞との、ベクターの適合性に依存するであろう。ベクターは、直鎖状プラスミドの場合もあり、閉環状プラスミドの場合もある。ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、その複製が、染色体内複製に依存しない、染色体外実体として存在するベクター、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、又は人工染色体でありうる。自己維持型クローニングベクターは、ＡＭＡ１配列（例えば、Ａｌｅｋｓｅｎｋｏ及びＣｌｕｔｔｅｒｂｕｃｋ（１９９７）、Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．、２１：３７３～３９７を参照されたい）を含みうる。代替的に、ベクターは、宿主細胞へと導入されると、ゲノムへと組み込まれ、それが組み込まれた染色体（複数可）と共に複製されるベクターでありうる。好ましくは、組込型クローニングベクターは、クローニングベクターの組込みを、この所定の遺伝子座へとターゲティングするための、宿主細胞のゲノムの、所定の標的遺伝子座におけるＤＮＡ配列と相同であるＤＮＡ断片を含む。ターゲティングされた組込みを促進するために、クローニングベクターは、好ましくは、宿主細胞を形質転換する前に直鎖化される。直鎖化は、好ましくは、クローニングベクターの、少なくとも１つの末端であるが、好ましくは、いずれの末端も、標的遺伝子座と相同な配列により挟まれるように実施される。標的遺伝子座を挟む相同配列の長さは、好ましくは、少なくとも３０ｂｐ、５０ｂｐ、０．１ｋｂ、０．２ｋｂ、０．５ｋｂ、１ｋｂ、若しくは１．５ｋｂであるか、好ましくは、少なくとも２．０ｋｂ、より好ましくは、少なくとも２．５ｋｂであるか、又は、最も好ましくは、少なくとも３．０ｋｂである。
【0073】
発現ベクター／カセットをターゲティングするための、好ましい相同配列は、真菌又は糸状菌の酸安定性αアミラーゼ、α－アミラーゼ、タカアミラーゼ、グルコアミラーゼ、キシラナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、及びスクラーゼをコードする遺伝子から得られる配列など、高度発現真菌遺伝子に由来する配列である。より好ましくは、発現ベクター／カセットをターゲティングするための相同配列は、高度発現真菌遺伝子を含む遺伝子座であって、ニホンコウジカビ（例えば、ＩＦ０４１７７株）における、タカアミラーゼ遺伝子など、真菌ゲノムにおいて増幅される遺伝子座、又は、例えば、ＣＢＳ ５１３．８８株及びＣＩＣＣ２４６２株において増幅される、クロコウジカビ（米国特許第６４３２６７２ Ｂ１号及び米国特許第８７３４７８２ Ｂ２号を参照されたい）のｇｌａＡ遺伝子座をターゲティングする配列である。好ましい実施形態では、発現カセットは、高度発現真菌タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子座に組み込まれる。好ましくは、前記遺伝子座は、真菌ゲノムにおいて増幅される遺伝子座であり、より好ましくは、遺伝子座は、クロコウジカビｇｌａＡ遺伝子座である。
【0074】
一実施形態では、発現カセットは、単一クロスオーバーを介する（相同）組換えにより組み込まれる。好ましくは、前記遺伝子座は、真菌ゲノムにおいて増幅される遺伝子座であり、より好ましくは、遺伝子座は、クロコウジカビｇｌａＡ遺伝子座である。
【0075】
別の実施形態では、発現カセットは、高度発現真菌タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子座における（相同）遺伝子置換（すなわち、二重クロスオーバー）により組み込まれる。好ましくは、前記遺伝子座は、真菌ゲノムにおいて増幅される遺伝子座であり、発現カセットは、真菌宿主細胞のゲノムにおいて、高度発現真菌タンパク質をコードする遺伝子のうちのいくつかのコピー又は各コピーを置きかえ、より好ましくは、遺伝子座は、クロコウジカビｇｌａＡ遺伝子座である。
【0076】
一実施形態では、真菌宿主細胞は、好ましくは、真菌宿主細胞のゲノムへと組み込まれた発現カセットの複数のコピーを含む。好ましくは、真菌宿主細胞は、好ましくは、真菌宿主細胞のゲノムへと組み込まれた発現カセットの、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、又は３０コピーを、より好ましくは、高度発現内因性真菌遺伝子を含む遺伝子座など、所定の位置において含む。
【0077】
ベクターは、好ましくは、形質転換細胞の容易な選択を可能とする、１つ又は複数の選択用マーカーを含有する。共形質転換法を使用する場合、１つのベクターが、選択用マーカーを含有しうるのに対し、別のベクターは、目的のポリヌクレオチド、又は目的の核酸構築物を含有しうるが、ベクターは、宿主細胞の形質転換のために、同時に使用される。選択用マーカーとは、その産物が、殺生物剤耐性又はウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に対する原栄養性などをもたらす遺伝子である。糸状菌宿主細胞における使用のための選択用マーカーは、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｂｌｅＡ（フレオマイシン結合性）、ｈｙｇＢ（ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン－５’－リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、及びｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）のほか、他の種に由来する同等物を含むがこれらに限定されない群から選択されうる。アスペルギルス属宿主細胞における使用のためには、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）又はＡ．オリゼの、ａｍｄＳ遺伝子（米国特許第５８７６９８８号、米国特許第６５４８２８５ Ｂ１号）及びｐｙｒＧ遺伝子、並びにストレプトミセス・ヒグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）のｂａｒ遺伝子が好ましい。より好ましくは、ａｍｄＳ遺伝子が使用され、なおより好ましくは、Ａ．ニデュランス又はクロコウジカビに由来するａｍｄＳ遺伝子が使用される。最も好ましい選択マーカー遺伝子は、Ａ．ニデュランスのｇｐｄＡプロモーターへと融合しているＡ．ニデュランスのａｍｄＳコード配列（欧州特許第０６３５５７４ Ｂ１号を参照されたい）である。他の糸状真菌に由来するＡｍｄＳ遺伝子もまた使用されうる（米国特許第６５４８２８５ Ｂ１号）。
【0078】
当業者には、本発明の発現ベクター及び発現カセットを構築するための手段及び方法が周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、前出；及びＡｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｗｉｌｅｙ ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ、１９９５を参照されたい）。
【0079】
一実施形態では、本発明の発現カセットにおいて、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、好ましくは、そのコドン使用を最適化するように、問題の宿主細胞のヌクレオチド配列へと適合させられる。酵素をコードするヌクレオチド配列の、宿主細胞の一般的コドン使用への適合性は、ＣＡＩ（ｃｏｄｏｎ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）として表される。本明細書では、ＣＡＩ（ｃｏｄｏｎ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）は、遺伝子のコドン使用の、特定の宿主細胞又は生物における高度発現遺伝子のコドン使用への相対適合性の尺度として規定される。各コドンの相対適合性（ｗ）は、各コドンの使用の、同じアミノ酸について、最も夥多なコドンの使用に対する比である。ＣＡＩ指数は、これらの相対適合性値の幾何平均として規定される。非同義コドン及び終結コドン（遺伝子コードに依存する）は除外される。ＣＡＩ値は、０～１の範囲であり、値が高いほど、最も夥多なコドンの比率が大きいことを指し示す（Ｓｈａｒｐ及びＬｉ、１９８７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５：１２８１－１２９５を参照されたい；Ｊａｎｓｅｎら、２００３、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３Ｊ＿（８）：２２４２～５１もまた参照されたい）。適合させられたヌクレオチド配列は、好ましくは、少なくとも０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、又は０．９のＣＡＩを有する。
【0080】
好ましい実施形態では、本発明の発現カセットにおいて、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、好ましくは、そのコドン使用を最適化するように、問題の宿主細胞における高度発現タンパク質のコドン使用、好ましくは、問題の宿主細胞に内因性である高度発現タンパク質のコドン使用へと適合させられる。より好ましくは、本発明の発現カセットにおいて、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、そのコドン使用を最適化するように、酸安定性αアミラーゼ、α－アミラーゼ、タカアミラーゼ、グルコアミラーゼ、キシラナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、及びスクラーゼから選択される高度発現タンパク質のコドン使用へと適合させられる。目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、例えば、ＯＰＴＩＭＩＳＥＲ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅｓ．ｕｒｖ．ｅｓ／ＯＰＴＩＭＩＳＥＲ／；Ｐｕｉｇｂｏ Ｐ．ら、２００７、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、３５、Ｗ１２６～Ｗ１３１）など、オンラインで入手可能なＤＮＡ最適化ツール、又はコドン最適化合成遺伝子の市販サービスプロバイダー（例えば、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ＵＳＡ）を使用することにより、高度発現タンパク質のコドン使用へと適合させられうる。
【0081】
さらに好ましい実施形態では、発現カセットは、プロモーターに作動可能に連結された、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、コード配列は、プロモーターに対して天然であるコード配列に照らしてコドン最適化されており、好ましくは、プロモーターは、高度発現真菌タンパク質のための遺伝子に対して天然であるプロモーターであり、より好ましくは、高度発現真菌タンパク質は、好ましくは、上記に表示の高度発現真菌タンパク質であり、これらのうち、グルコアミラーゼが最も好ましい。
【0082】
なおさらに好ましい実施形態では、発現カセットは、クローニングベクターの組込みを、この所定の遺伝子座へとターゲティングするための、宿主細胞のゲノムの、所定の標的遺伝子座におけるＤＮＡ配列と相同であるＤＮＡ断片をさらに含み、好ましくは、標的遺伝子座は、発現カセットにおけるプロモーターに対して天然である、高度発現真菌タンパク質の遺伝子座であり、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコドン使用は、これに照らして最適化され、好ましくは、高度発現真菌タンパク質は、好ましくは、上記に表示の高度発現真菌タンパク質であり、これらのうち、クロコウジカビグルコアミラーゼが最も好ましい。
【0083】
一実施形態では、発現カセットは、真菌宿主細胞からの、目的のタンパク質の分泌を方向付けるために、目的のタンパク質のコード配列に作動可能に連結される、Ｎ末端の分泌シグナル配列を含む。「シグナル配列」とは、目的のタンパク質のアミノ末端に作動可能に連結された場合に、宿主真菌からの、このようなタンパク質の分泌を可能とするアミノ酸配列である。このようなシグナル配列は、通常、目的のタンパク質と会合するシグナル配列（すなわち、天然のシグナル配列）の場合もあり、他の供給源に由来する（すなわち、目的のタンパク質に対して、外来又は異種のシグナル配列の）場合もある。シグナル配列は、シグナル配列及び目的のタンパク質の翻訳を可能とするように、天然のシグナル配列を活用することにより、又は適正なリーディングフレームにおいて、外来シグナル配列をコードするＤＮＡ配列を、目的のタンパク質をコードするＤＮＡ配列へと接続することにより、異種ポリペプチドに作動可能に連結される。本発明における使用のための、好ましいシグナル配列は、酸安定性αアミラーゼ、α－アミラーゼ、タカアミラーゼ、グルコアミラーゼ、キシラナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、及びスクラーゼなど、高度発現分泌真菌タンパク質に由来するシグナルを含み、これらのうち、クロコウジカビグルコアミラーゼが最も好ましい。
【0084】
さらに好ましい実施形態では、発現カセットは、目的のタンパク質を、融合タンパク質の一部としてコードする。好ましくは、発現カセットは、目的のタンパク質が、そのＮ末端において、高度発現分泌真菌タンパク質のうちの少なくとも一部と融合している融合タンパク質をコードする。より好ましくは、発現カセットは、目的のタンパク質が、そのＮ末端において、好ましくは、高度発現分泌真菌タンパク質のうちの少なくともシグナル配列を含む高度発現分泌真菌タンパク質のうちの少なくともＮ末端部分と融合している融合タンパク質をコードする。融合タンパク質はまた、高度発現分泌真菌タンパク質のプロ配列、及び／又は成熟高度発現分泌真菌タンパク質のさらなる部分もさらに含みうる。代替的に、シグナル配列は、プレプロ配列を含有しうる。目的のタンパク質が、分泌型タンパク質である場合、高度発現分泌真菌タンパク質のＮ末端部分を、目的の成熟分泌型タンパク質のＮ末端へと融合させうる。代替的に、Ｎ末端を、成熟タンパク質の起始部へと（例えば、真菌細胞における、可能なミスプロセシングを回避するように、プロセシングの後で）融合させうる。目的のタンパク質が、分泌型タンパク質ではない場合、高度発現分泌真菌タンパク質のＮ末端部分は、目的のタンパク質のＮ末端メチオニンを置きかえうる。
【0085】
発現カセットは、融合タンパク質をコードし、この場合、目的のタンパク質を、グルコアミラーゼのプロ配列、ウシキモシンのプロ配列、スブチリシンのプロ配列、ＨＩＶプロテアーゼを含むレトロウイルスプロテアーゼのプロ配列、並びにトリプシン、第Ｘａ因子、コラゲナーゼ、クロストリプシン、スブチリシン、キモシン、酵母ＫＥＸ２プロテアーゼ、及びアスペルギルス属ＫＥＸＢにより認識及び切断されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列などの切断型リンカーポリペプチドを介して、そのＮ末端融合パートナーへと融合させることがさらに好ましい。特に、好ましい切断型リンカーは、天然のアスペルギルス属ＫＥＸ２様（ＫＥＸＢ）プロテアーゼにより切断されうる、ＫＥＸ２プロテアーゼ認識部位（Ｌｙｓ－Ａｒｇ）である。
【0086】
好ましい実施形態では、発現カセットは、Ｎ末端からＣ末端の方向に：目的のタンパク質へと融合しているクロコウジカビグルコアミラーゼプレプロ配列；任意選択で、成熟クロコウジカビグルコアミラーゼアミノ酸配列のうちの、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％；任意選択で、切断型リンカーポリペプチド及び／又はＫＥＸ２（Ｌｙｓ－Ａｒｇ）切断部位を含む融合タンパク質をコードする。これらの例：プレプロ配列と、目的のタンパク質へと融合させた、ＫＥＸ２（Ｌｙｓ－Ａｒｇ）切断部位を含む、８アミノ酸の合成ペプチドとを含む、最初の５０２アミノ酸、又はプレプロ配列を含む、５４若しくは１００アミノ酸だけを伴い、目的のタンパク質へと融合させた、ＫＥＸ２（Ｌｙｓ－Ａｒｇ）切断部位に前置される、クロコウジカビグルコアミラーゼのさらなる切断体については、本明細書の実施例に記載されている。
目的の動物由来の食用タンパク質
本発明は、通常、動物に由来し、ヒトによる摂取のための食品の調製において一般に使用されるタンパク質の、動物によらない作製に関する。原則として、通常、動物又は動物の一部から得られるか、又はこれらにより産生され、ヒトによる摂取のための食品の調製において使用されうる、任意のタンパク質が、本発明に従い、動物によらない方式で作製されるのに適する。しかし、より詳細に述べると、本発明は、乳製品タンパク質及び家禽タンパク質、より詳細には、乳タンパク質及び卵タンパク質の、動物によらない作製に関する。
目的の動物由来の食用タンパク質
本発明は、通常、動物に由来し、ヒトによる摂取のための食品の調製において一般に使用されるタンパク質の、動物によらない作製に関する。原則として、通常、動物又は動物の一部から得られるか、又はこれらにより産生され、ヒトによる摂取のための食品の調製において使用されうる、任意のタンパク質が、本発明に従い、動物によらない方式で作製されるのに適する。しかし、より詳細に述べると、本発明は、乳製品タンパク質及び家禽タンパク質、より詳細には、乳タンパク質及び卵タンパク質の、動物によらない作製に関する。
【0087】
一実施形態では、目的の動物由来食用タンパク質は、乳タンパク質、好ましくは、ウシ（ｃａｔｔｌｅ（すなわち、ウシ（ｂｏｖｉｎｅ又はＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ））、バッファロー（水牛を含む）、ヤギ、ヒツジ、若しくはラクダのミルク、又はヤク、ウマ、トナカイ、及びロバなど、他のそれほど一般的でない乳動物のミルクにおいて存在するタンパク質である。目的のタンパク質は、カゼインの場合もあり、β－ラクトグロブリン、α－ラクトアルブミン、ウシ血清アルブミン、又は免疫グロブリンなどの乳清タンパク質の場合もある。
【0088】
一実施形態では、目的の動物由来食用タンパク質は、ヘムタンパク質、好ましくは、非ヒト動物、より好ましくは、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、又はヒツジなどの哺乳動物に由来するヘムタンパク質である。好ましい動物由来のヘムタンパク質は、ヘモグロビン及びミオグロビンを含む。本発明に従い作製される、動物由来のヘムタンパク質は、食肉代替品において、赤色ヘム結合鉄タンパク質として適用されうる。
【0089】
一実施形態では、目的の動物由来食用タンパク質は、卵タンパク質、すなわち、鳥類の卵に存在するタンパク質である。本明細書で使用される、「鳥類」という用語は、家畜化鳥類、及び野生鳥類などの非家畜化鳥類の両方を含む。鳥類は、例えば、家禽（ｐｏｕｌｔｒｙ、ｆｏｗｌ）、水鳥、狩猟鳥、走鳥類（例えば、飛べない鳥）、ニワトリ（ｃｈｉｃｋｅｎ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ））、ウズラ、シチメンチョウ、カモ、ダチョウ（ｏｓｔｒｉｃｈ（Ｓｔｒｕｔｈｉｏ ｃａｍｅｌｕｓ））、ソマリアダチョウ（Ｓｏｍａｌｉ ｏｓｔｒｉｃｈ（Ｓｔｒｕｔｈｉｏ ｍｏｌｙｂｄｏｐｈａｎｅｓ））、ガチョウ、カモメ、ホロホロチョウ、キジ、エミュー（ｅｍｕ（Ｄｒｏｍａｉｕｓ ｎｏｖａｅｈｏｌｌａｎｄｉａｅ））、アメリカレア（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｒｈｅａ（Ｒｈｅａ ａｍｅｒｉｃａｎａ））、ダーウィンレア（Ｄａｒｗｉｎ’ｓ ｒｈｅａ（Ｒｈｅａ ｐｅｎｎａｔａ））、及びキーウィを含む。好ましくは、目的の動物由来食用タンパク質は、卵白タンパク質である。卵白タンパク質は、オボアルブミン、オボトランスフェリン、オボムコイド、Ｇ１６２Ｍ Ｆ１６７Ａオボムコイド、オボグロブリンＧ２、オボグロブリンＧ３、α－オボムチン、β－オボムチン、リゾチーム、オボインヒビター、オボグリコプロテイン、フラビンタンパク質、オボマクログロブリン、オボスタチン、シスタチン、アビジン、オボアルブミン関連タンパク質Ｘ、及びオボアルブミン関連タンパク質Ｙ（例えば、米国特許第２０１８号／０３５５０２０を参照されたい）からなる群から選択される卵白タンパク質でありうる。特に好ましい卵白タンパク質は、オボアルブミンである。
【0090】
オボアルブミン
本発明に従い、動物によらない方式で作製される、特に好ましい目的の動物由来食用タンパク質は、卵白タンパク質であるオボアルブミンである。
本発明に従い、動物によらない方式で作製される、特に好ましい目的の動物由来食用タンパク質は、卵白タンパク質であるオボアルブミンである。
【0091】
一実施形態では、本発明の発現カセットにおいてコードされるオボアルブミンは、ニワトリ、ペリカン、ウズラ、ハト、ダチョウ、チドリ、シチメンチョウ、カモ、ガチョウ、カモメ、ホロホロチョウ、ヤケイ、クジャク、ヤマウズラ、キジ、エミュー、レア、及びキーウィからなる群から選択される鳥類に由来するオボアルブミンのアミノ酸配列に対する、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の同一性を伴うアミノ酸配列を含み、これらのうちで、ニワトリ、ハト、ペリカン、及びウズラが、好ましい。
【0092】
一実施形態では、本発明の発現カセットにおいてコードされるオボアルブミンは、配列番号１～６のうちの少なくとも１つに対する、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の同一性を伴うアミノ酸配列を含む。
【0093】
可食鳥類に由来する、代替的オボアルブミン配列は、それぞれ、シチメンチョウ及びヤマウズラについて、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＡＣ１６６６４．１及びＰＯＩ２７９８９．１を含む。カモ、ガチョウ、ホロホロチョウ、キジ、エミュー、及びキーウィのオボアルブミン配列の例は、それぞれ、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００１２９８０９８．１、ＸＰ＿０１３０５６５７４．１、ＸＰ＿０２１２４１９７６．１、ＸＰ＿０３１４４５１３３．１、ＸＰ＿０２５９５６５２２．１、及びＸＰ＿０２５９３２４９７．１の下に見出されうる。一実施形態では、オボアルブミンは、１つを超える種に由来するアミノ酸配列を含みうる。
【0094】
一実施形態では、オボアルブミンのアミノ酸配列は、アレルギー誘発性を低減するか、又は消失させるように修飾される。オボアルブミン、例えば、ニワトリオボアルブミンのアレルギー誘発性は、アレルギー誘発性オボアルブミンの、アレルギー誘発性エピトープにおける、１つ又は複数のアミノ酸を、他の鳥類種に由来する、アレルギー誘発性でない、１つ又は複数のオボアルブミンの配列の対応する位置に存在する、異なるアミノ酸で置きかえることにより低減されうる。アレルギー誘発性の評価を行うのに使用される方法は、後続の抗原投与被験に先立つ、バイオインフォマティクス法を含むがこれらに限定されない。
【0095】
発酵
本発明のさらなる態様は、目的の動物由来食用タンパク質を作製するためのプロセスに関する。プロセスは、好ましくは、ａ）本発明に従う真菌宿主細胞を、目的のタンパク質の発現をもたらす条件下で、発酵槽の培地において培養するステップと；ｂ）任意選択で、目的のタンパク質を回収するステップとを含む。
本発明のさらなる態様は、目的の動物由来食用タンパク質を作製するためのプロセスに関する。プロセスは、好ましくは、ａ）本発明に従う真菌宿主細胞を、目的のタンパク質の発現をもたらす条件下で、発酵槽の培地において培養するステップと；ｂ）任意選択で、目的のタンパク質を回収するステップとを含む。
【0096】
本発明の真菌細胞の発酵は、攪拌槽型反応槽において実行されうる。真菌の産業的液中発酵の大半による、この選択の理由は、とりわけ、増殖する真菌菌糸体の形態の影響を受ける、液中培養物における、（糸状）真菌バイオマスのレオロジーにある。結果として、一実施形態では、本発明の発酵プロセスは、攪拌槽型反応槽において実行される。好ましい実施形態では、しかし、目的のタンパク質、特に、オボアルブミンの培地における沈殿及び／又は凝集を防止又は低減するために、発酵槽における培地への機械力は、制限される。したがって、一実施形態では、発酵槽における培地への機械力の入力（真菌宿主の培養時における）は、１．４、１．０、０．５、０．２、又は０．１ｋＷ／ｍ３を超えない。
【0097】
機械力（の制限）の使用に代えて、又はこれに加えて、本発明のプロセスのために、気泡塔を利用することもできる。一般に、真菌の増殖、特に、糸状真菌の菌糸体の増殖は、高粘性溶液をもたらす場合があり、これは、発酵槽における培地の通気に負の影響を及ぼし、これにより、増殖及び生成物の形成に負の影響を及ぼしうる。酸素及び栄養物の、反応槽内の粘性培地への、良好な移動を得るために、攪拌のための高電力が必要とされるが、これは、特に、オボアルブミンの場合に、作製される、目的のタンパク質の培地において、沈殿及び／又は凝集をもたらしうる。しかし、それらの形態が変更された糸状真菌株、例えば、それらの菌糸体増殖が、「酵母様形態」として記載されうる糸状真菌、例えば、短い菌糸で、菌糸をほとんど分枝させない糸状真菌であれば、気泡塔が装備された反応槽においてもまた発酵させられうるであろう（例えば、バイオリアクターの種類の記載については、ｖａｎ’ｔ Ｒｉｅｔ及びＴｒａｍｐｅｒ、１９９１を参照されたい）。結果として、一実施形態では、発酵は、気泡塔において、好ましくは、発酵槽における培地への機械力の入力（例えば、攪拌のための）を伴わずに実行される。この場合、培養された培地は、培地中を、上方へと移動する気泡（例えば、空気又は酸素）により「攪拌」又は混合される。一実施形態では、発酵は、攪拌槽型反応槽と、気泡塔との組合せで実行される。さらなる実施形態では、気泡塔は、回分方式、流加方式、又は反復流加方式を使用する。一実施形態では、稼働が、１０％（単位容量当たりの細胞個数）を超える濃縮細胞容量、さらに、２５％、３０％、４０％を超える濃縮細胞容量、なお又は、場合によって、４５％の濃縮細胞容量で実行される、高細胞密度発酵を適用する。一実施形態では、気泡塔は、＞０．５ｖｖｍ（１分間当たりの培養液置換容量）のガス容量、さらに、０．７ｖｖｍを超えるガス容量、最も好ましくは、１．０ｖｖｍのガス容量で実行される。空気は、発酵槽による良好な混合と、通気とをもたらす。したがって、一実施形態では、気泡は、４～６ｍｍの配管における小孔を通してスパージングされる。
【0098】
当技術分野では、一般に、本発明の真菌宿主細胞の増殖の培地が公知である。好ましい実施形態では、本発明の真菌宿主細胞を培養するための培地は、既知組成培地である（糸状）真菌を増殖させるための、既知組成培地の典型的組成については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第２０１４０３４２３９６ Ａ１号において記載されている。発酵槽におけるｐＨは、アンモニアを、滴定剤として使用して制御することができる。
【0099】
好ましくは、プロセスは、グルコース、スクロース、イソマルトース、及びマルトデキストリンのうちの少なくとも１つを含む炭素供給源を使用する。炭素供給源は、シックジュース（テンサイ加工の中間体）、又は９５ＤＥシロップなど、イソマルトース及びマルトデキストリンを含むシロップの形態で送達されうる。グルコースを伴う１つの例は、グルコアミラーゼプロモーターの誘導化合物としてのイソマルトースであるマルトースを含む、３０～９５ＤＥシロップを含む。
【0100】
一実施形態では、発酵のｐＨは、３～８ｐＨの間で維持しうるが、４～７ｐＨの間で維持する可能性が最も高い。しかし、発現されるタンパク質の種類に応じて、この範囲は、さらに微調整することができる。例えば、クロコウジカビを使用する、相同な酵素の作製に最適のｐＨは、３．５～５．５ｐＨである。異種発現動物タンパク質の場合、より高いｐＨ範囲が好ましい。例えば、ｐＩ値を、約４．８～５とするオボアルブミンには、５～７ｐＨのｐＨが好ましい。さらに、発酵時におけるｐＨをモニタリングすることにより、プロテアーゼの誘導スペクトルを変更することができる。結果として、一実施形態では、真菌宿主細胞は、ｐＨ５．０、５．５、６．０、６．５、又は７以上であるｐＨで培養される。
【0101】
加工
一実施形態では、目的のタンパク質は、発現カセットにおける、分泌シグナル配列の存在により、真菌宿主細胞から、発酵培地へと分泌される、分泌型タンパク質として作製される。このように分泌された、目的のタンパク質は、発酵培養液から、異なる方式で回収されうる。したがって、一実施形態では、方法は、任意選択で、卵白の回収である、ステップｂ）を含む。一実施形態では、回収は、発酵時における回収である。一実施形態では、回収は、発酵後における回収である。一実施形態では、回収は、発酵時における回収及び発酵後における回収の両方である。目的のタンパク質の回収は、好ましくは、少なくとも、（溶解させられた）目的のタンパク質を含む培地からの、真菌バイオマスの分離を含む。微生物性バイオマスを分離する可能性のうちの１つは、遠心分離による分離である。なおより好ましくは、発酵させられた培養液は、発酵の終了時におけるタンパク質の放出の準備ができている場合があり、これに、バイオマスの遠心分離による、放出されたタンパク質の、直接的な分離が後続しうる。したがって、一実施形態では、回収は、遠心分離による回収である。遠心分離による分離の後で、上清は、通例、分泌型タンパク質の大半を含有する。結果として、さらなる実施形態では、上清は、さらなる加工を要求しうる。一実施形態では、上清は、０．２μｍのフィルターを使用して精密濾過されうる。当業者には、残存する真菌バイオマス断片を除去する、このような実施が公知であろう。加えて、上清は、限外濾過液から、低分子量成分をさらに分離するように、分子量カットオフ値を、典型的に、１０ｋＤａ又は２０ｋＤａの可変値とする膜を通して限外濾過されうる。一実施形態では、このようなさらなる加工は、上清の濃縮もまた行われる、限外濾過を含む。しかし、タンパク質の性質に応じて、疎水性タンパク質は、通例、バイオマスに付着する傾向を有する。このような例は、例えば、酵母であるクルイベロミセス・ラクティス、及び糸状菌であるクロコウジカビにおけるリパーゼの発現について記載する、米国特許第８７０３４６３ Ｂ２号において見出されうる。この例では、溶液のｐＨを変化させることにより、タンパク質を、バイオマスから放出させた。
一実施形態では、目的のタンパク質は、発現カセットにおける、分泌シグナル配列の存在により、真菌宿主細胞から、発酵培地へと分泌される、分泌型タンパク質として作製される。このように分泌された、目的のタンパク質は、発酵培養液から、異なる方式で回収されうる。したがって、一実施形態では、方法は、任意選択で、卵白の回収である、ステップｂ）を含む。一実施形態では、回収は、発酵時における回収である。一実施形態では、回収は、発酵後における回収である。一実施形態では、回収は、発酵時における回収及び発酵後における回収の両方である。目的のタンパク質の回収は、好ましくは、少なくとも、（溶解させられた）目的のタンパク質を含む培地からの、真菌バイオマスの分離を含む。微生物性バイオマスを分離する可能性のうちの１つは、遠心分離による分離である。なおより好ましくは、発酵させられた培養液は、発酵の終了時におけるタンパク質の放出の準備ができている場合があり、これに、バイオマスの遠心分離による、放出されたタンパク質の、直接的な分離が後続しうる。したがって、一実施形態では、回収は、遠心分離による回収である。遠心分離による分離の後で、上清は、通例、分泌型タンパク質の大半を含有する。結果として、さらなる実施形態では、上清は、さらなる加工を要求しうる。一実施形態では、上清は、０．２μｍのフィルターを使用して精密濾過されうる。当業者には、残存する真菌バイオマス断片を除去する、このような実施が公知であろう。加えて、上清は、限外濾過液から、低分子量成分をさらに分離するように、分子量カットオフ値を、典型的に、１０ｋＤａ又は２０ｋＤａの可変値とする膜を通して限外濾過されうる。一実施形態では、このようなさらなる加工は、上清の濃縮もまた行われる、限外濾過を含む。しかし、タンパク質の性質に応じて、疎水性タンパク質は、通例、バイオマスに付着する傾向を有する。このような例は、例えば、酵母であるクルイベロミセス・ラクティス、及び糸状菌であるクロコウジカビにおけるリパーゼの発現について記載する、米国特許第８７０３４６３ Ｂ２号において見出されうる。この例では、溶液のｐＨを変化させることにより、タンパク質を、バイオマスから放出させた。
【0102】
一般に、採取されたバイオマスから、分泌型タンパク質を放出させるために、いくつかの手法について調べることができる。一実施形態では、採取されたバイオマスは、再懸濁させることができる。一実施形態では、被験溶液における再懸濁は、例えば、１：１、１：２、１：３、１：４（バイオマス：溶液）の比における再懸濁である。一実施形態では、採取されたバイオマスを、設定された温度で、ある特定の時間にわたりインキュベートする。任意選択で、溶液は、攪拌されうる。当業者には、採取されたバイオマスから、タンパク質を遊離させるために利用可能な代替法が公知である。１つの方法が利用される場合もあり、方法の組合せが利用される場合もあることが公知であろう。一実施形態では、タンパク質を、バイオマスから遊離させるために、方法は、溶液のｐＨを増大させるか、又は低下させて、露出されたタンパク質表面の電荷を変更する結果として、タンパク質の可溶性を変化させるステップを含む。一実施形態では、溶解は、タンパク質が、正味のゼロ電荷を有する場合のｐＨである、タンパク質の等電点（ｐＩ）から、少なくとも１ｐＨ単位分だけ増大させられる。
【0103】
例えば、ｐＩ値を伴うタンパク質には、６～１０ｐＨである、約５５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液を使用することができる。一実施形態では、タンパク質を、バイオマスから遊離させるために、方法は、異なる塩濃度を使用して、タンパク質の、バイオマスとの相互作用に影響を及ぼすステップを含む。例えば、０．１～１Ｍの範囲のＮａＣｌ、又は５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液を、異なる濃度、例えば、０．２～２Ｍの硫酸アンモニウムと共に使用することができる。一実施形態では、タンパク質を、バイオマスから遊離させるために、方法は、非イオン性界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０の使用を含む。
【0104】
任意選択で、発現されたタンパク質を含有する発酵培養液の精密濾過及び限外濾過の後、次のステップは、精製を伴いうる。代替的に、精密濾過及び限外濾過は、要求されない場合がある。精製法の選択は、タンパク質の安定性、純度、及び収率に影響を及ぼしうるが、異なる方法と関連する費用、持続可能性、及び廃水流量も異なる。精製時に最も重要な基準のうちの１つは、凝集又は変性に起因するタンパク質損失の低減である。当業者は、以下の方法が、典型的に、タンパク質の精製に適用されることを認識するであろう。一実施形態では、精製は、硫酸アンモニウム沈殿法；水二相系（ＡＢＳ）法；及びクロマトグラフィー法のうちの１つ又は複数である。さらなる実施形態では、精製は、アニオン交換クロマトグラフィー；カチオン交換クロマトグラフィー；疎水性相互作用クロマトグラフィー；及びサイズ除外クロマトグラフィーのうちの１つ又は複数から選択されるクロマトグラフィーである。
【0105】
硫酸アンモニウム沈殿法とは、タンパク質の塩析としてもまた公知の、高塩濃度の存在下におけるタンパク質の可溶性に基づく精製法である。塩イオンは、分子間の相互作用を可能とする結果として、タンパク質の凝集及び沈殿をもたらしうる、タンパク質分子における電荷を遮蔽する。これが生じる塩濃度は、タンパク質間で異なる、天然タンパク質の特性に依存する。一実施形態では、タンパク質溶液を、適切な塩を使用して、タンパク質重量対総重量比による１％（ｗ／ｗ％）～９０ｗ／ｗ％の範囲にあるある特定の百分率になるように飽和させる。一実施形態では、タンパク質溶液を、ある特定の温度、選択された飽和百分率において攪拌する。一実施形態では、タンパク質溶液を、ある特定の持続時間にわたり、０～１０℃とする。一実施形態では、沈殿させられたタンパク質は、遠心分離を介して回収することができる。このような方法は、卵白からのオボアルブミンの精製に適用されている。一実施形態では、精製プロセスは、硫酸アンモニウム沈殿を使用するステップを含む。好ましい実施形態では、硫酸アンモニウム沈殿は、オボアルブミンを、卵白から精製するのに使用される。例えば、一実施形態では、オボアルブミンは、６０飽和％～７０飽和％など、５０飽和％～９０飽和％の間の範囲における硫酸アンモニウム沈殿を含む方法において、卵白から沈殿させられる。前記方法は、発酵ステップ、又は発酵終了時の精製ステップにおいて適用されうる。
【0106】
水二相系（ＡＢＳ）は、タンパク質精製に使用される場合、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）相及び塩相を含みうる。この方法は、工業用大スケールにおいて、容易に適用可能である利点を有し、クロマトグラフィーなど、他のタンパク質精製法と比較した場合に、低費用である。さらに、ＰＥＧが再生可能である結果として、廃水流量の減少をもたらしうる。精製の原理は、目的のタンパク質の、ＰＥＧ又は塩との相互作用に基づく。（Ａｓｅｎｊｏ，Ｊ．Ａ及びＡｎｄｒｅｗｓ，Ｂ．Ａ．（２０１１）；Ｒｉｔｏ－Ｐａｌｏｍａｒｅｓ，Ｍ．（２００４））。この系は、卵白からのオボアルブミンの精製に使用されている。ＡＢＳを、卵白の精製に使用する、このような方法、及び適切な代替法は、当業者に公知であろう（Ｗｅｎ，Ｃ．ら（２０１９）；Ｍｅｉｈｕ，Ｍ．ら（２０１３））。
【0107】
タンパク質精製ステップにおいて適用される、異なる種類のクロマトグラフィー法は、タンパク質の、樹脂との相互作用に関するそれらの性質において異なる。イオン交換クロマトグラフィー（アニオン又はカチオン）は、タンパク質の電荷（それぞれ、負又は正の）を使用して、タンパク質を、溶液において異なる形で帯電した不純物（ＤＮＡ、他のタンパク質、ウイルスなど）から分離する。アニオン交換クロマトグラフィーでは、アニオン交換剤は、正に帯電している。アニオン交換剤は、例えば、ジエチルアミノメチル（ＤＥＡＥ）基から構成される、弱いアニオン交換剤の場合もあり、例えば、四級アンモニウム（Ｑ）基から構成される、強いアニオン交換剤の場合もある。強いアニオン交換剤が、全ｐＨ範囲にわたり安定であるのに対し、弱いアニオン交換剤は、ｐＨ限界を有する。目的のタンパク質が、アニオン交換剤に結合するためには、正味の負帯電タンパク質を得るように、使用される緩衝液（リン酸カリウム、トリス－ＨＣｌなど）のｐＨが、目的のタンパク質の等電点を上回る、少なくとも１つのｐＨ値を取るものとする。その後、タンパク質は、モル濃度が増大する適切な塩（塩化ナトリウム、硫酸アンモニウムなど）を使用して、又は緩衝液のｐＨを低下させることにより、アニオン交換剤との、それらの相互作用の強度に基づき、カラムから溶離される（Ｈａｑ，Ａ．ら（１９９９）；Ｍｅｄｖｅ，Ｊ．ら（１９９８）；Ｋｏｐａｃｉｅｑｉｃｚ，Ｗ．ら（１９８３）；Ｒｏｓｓｏｍａｎｄｏ，Ｅ．Ｆ．（１９９０）；Ｇｏｏｄｉｎｇ，Ｋ．Ｍ．及びＳｃｈｍｕｃｋ，Ｍ．Ｎ．（１９８５））。カチオン交換クロマトグラフィーの原理は、正に帯電した樹脂ではなく、負に帯電した樹脂を使用することを除き、アニオン交換クロマトグラフィーと同様である。カチオン交換剤は、例えば、カルボキシメチルセルロース（ＣＭセルロース）基から構成される、弱いカチオン交換剤の場合もあり、例えば、スルホプロピル（ＳＰ）基から構成される、強いカチオン交換剤の場合もある。結合性タンパク質が、カチオン交換剤に結合するためには、正帯電タンパク質を得るように、緩衝液のｐＨが、タンパク質の等電点を下回る、少なくとも１つのｐＨ値を取るものとする。タンパク質のローディング及び溶離は、アニオン交換クロマトグラフィーについて記載された、ローディング及び溶離と同様である。疎水性相互作用クロマトグラフィーは、疎水性を、タンパク質と、樹脂との相互作用のベースとして探索する。タンパク質の結合は、タンパク質の疎水性パッチの露出を刺激する、高塩濃度（通例、硫酸アンモニウム）下で生じ、溶離は、低塩濃度下で行われる（Ｓｏｎｉ，Ｂ．ら（２００８）；Ｓｈａｌｔｉｅｌ，Ｓ．（１９７４）；ＭｃＣｕｅ，Ｊ．Ｔ．（２００９）；Ｑｕｅｉｒｏｚ，Ｊ．Ａ．ら（２００１）；Ｇｏｏｄｉｎｇ，Ｄ．Ｌ．ら（１９８６）；Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｅ．ら（１９９４）；Ｎａｒｈｉ，Ｌ．Ｌｏ．ら（１９８９））。当業者には、卵白を精製するためにクロマトグラフィー法を使用する、このような方法、及び適切な代替法が公知であろう（Ａｗａｄｅ，Ａ．Ｃ．ら（１９９４）；Ｇｕｅｒｉｎ－Ｄｕｂｉａｒｄ，Ｃ．ら（２００５）；Ｃｒｏｇｕｅｎｎｅｃ，Ｔ．ら（２０００）；Ｇｅｎ，Ｆ．ら（２０１２））。目的のタンパク質の精製に、サイズ除外クロマトグラフィーを使用する場合、タンパク質は、流体力学的体積に基づき分離される。タンパク質は、小孔サイズが異なるビーズを充填されたカラムを通って流過する。小型のタンパク質は、小孔を、大型のタンパク質より容易に充填する結果として、大型のタンパク質について、溶離時間の短縮をもたらし、小型のタンパク質について、溶離時間の延長をもたらす。カラムにおける多孔性ビーズは、アガロースビーズの場合もあり、デキストランビーズの場合もあり、ポリアクリルアミドビーズの場合もある。タンパク質は、通例、低塩濃度（例えば、塩化ナトリウム）を含有する、適切な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）を伴う定組成で溶離される（Ｍｏｒｉ，Ｓ．及びＢａｒｔｈ，Ｈ．Ｇ．（２０１３）；Ａｎｄｒｅ，Ａ．Ｓ．Ａ．Ｈ．－Ｋ．及びＳｃｈｗａｒｍ，Ｋ．Ｓ．（２０１６）；Ｌｕｏ，Ｊ．ら（２０１３））。
【0108】
一態様では、本発明は、目的の動物由来食用タンパク質を精製するためのプロセスに関する。目的の動物由来食用タンパク質は、オボアルブミンなど、本明細書で規定されるタンパク質でありうる。一実施形態では、目的の動物由来食用タンパク質は、培養培地から精製される。一実施形態では、培養培地は、目的の動物由来食用タンパク質の作製時に、微生物宿主（細胞）が培養された培養培地である。したがって、培養培地は、タンパク質が発現された、微生物宿主（細胞）の使用済み培養培地でありうる。一実施形態では、微生物宿主細胞は、アスペルギルス属又はクロコウジカビである宿主細胞など、本明細書で規定される、真菌宿主細胞である。一実施形態では、目的の動物由来食用タンパク質は、微生物宿主細胞から、培養培地へと分泌される。この実施形態では、好ましくは、タンパク質が産生された、微生物宿主細胞のバイオマスは、好ましくは、目的の動物由来食用タンパク質が、タンパク質が産生された培養培地から精製される、精製のための任意の後続のステップの前に、使用済み培養培地から除去される。
【0109】
一実施形態では、本発明は、目的の動物由来食用タンパク質を、本明細書で規定される、目的のタンパク質を作製するためのプロセスにおいて得られた使用済み培養培地から精製するためのプロセスに関する。
【0110】
一実施形態では、目的の動物由来食用タンパク質を精製するためのプロセスは、少なくとも第１のアニオン交換ステップを含む。
【0111】
イオン交換樹脂は、公知の方法に従い調製されうる。典型的に、樹脂が、その対イオンに結合することを可能とする、ポリペプチドと、１つ又は複数の不純物とを含む試料又は組成物を樹脂へとロードする前に、平衡化緩衝液を、イオン交換樹脂に通すことができる。平衡化緩衝液が、ローディング緩衝液と同じであれば好都合であるが、これが要求されるわけでない。
【0112】
一実施形態では、目的の動物由来食用タンパク質を精製するためのプロセスは、目的のタンパク質を含む水溶液を用意するステップと、試料を、少なくとも第１のアニオン交換クロマトグラフィーステップ、例えば、本明細書で記載されるアニオン交換クロマトグラフィーにかけるステップとを含む。アニオン交換樹脂のために、マトリックスへと、共有結合的に接合される帯電基は、例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、四級アミノエチル（ＱＡＥ）、及び／又は四級アンモニウム（Ｑ）でありうる。一部の実施形態では、利用されるアニオン交換樹脂は、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムである。アニオン交換クロマトグラフィーは、例えば、キュー・セファロース（Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ）（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、キュー・セファロース（商標）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、キュー・セファロース（商標）ＸＬ、カプト（ＣＡＰＴＯ）（商標）Ｑ、ＤＥＡＥ、トーヨーパール・ギガキャップ（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＧＩＧＡＣＡＰ）（商標） Ｑ、フラクトゲル（ＦＲＡＣＴＯＧＥＬ）（商標）（商標）ＡＥ（トリメチルアミノエチル、四級アンモニア樹脂）、エシュモノ（ＥＳＨＭＵＮＯ）（商標）Ｑ、ヌビア（ＮＵＶＩＡ）（商標） Ｑ、又はウノスフェア（ＵＮＯＳＰＨＥＲＥ）（商標）Ｑを使用して実施されうる。四級アミン樹脂又は「Ｑ樹脂」（例えば、カプト（商標）Ｑ、キュー・セファロース（商標）、キューエーイー・セファデックス（ＱＡＥ ＳＥＰＨＡＤＥＸ）（商標））；ジエチルアミノエタン（ＤＥＡＥ）樹脂（例えば、ディーイーエーイー・トリスアクリル（ＤＥＡＥ－ＴＲＩＳＡＣＲＹＬ）（商標）、ディーイーエーイー・セファロース（ＤＥＡＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ）（商標）、ベンゾイル化ナフトイル化ＤＥＡＥ、ジエチルアミノエチルセファセル（ＳＥＰＨＡＣＥＬ）（商標））；アンバージェット（ＡＭＢＥＲＪＥＴ）（商標）樹脂；アンバーリスト（ＡＭＢＥＲＬＹＳＴ）（商標）樹脂；アンバーライト（ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ）（商標）樹脂（例えば、アンバーライト（商標）ＩＲＡ－６７、アンバーライト（商標）強塩基性、アンバーライト（商標）弱塩基性）、コレスチルアミン樹脂、プロパック（ＰｒｏＰａｃ）（商標）を含むがこれらに限定されない、本発明の範囲内にある、他のアニオン交換剤も使用されうる。樹脂（例えば、プロパック（商標）ＳＡＸ－１０、プロパック（商標）ＷＡＸ－１０、プロパック（商標）ＷＣＸ－１０）；ティーエスケーゲル（ＴＳＫ－ＧＥＬ）（商標）樹脂（例えば、ＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡＥ－ＮＰＲ；ＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡＥ－５ＰＷ）；及びアクレイム（ＡＣＣＬＡＩＭ）（商標）樹脂である。
【0113】
一実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーは、ハイトラップ・カプトＱ（ＨｉＴｒａｐ Ｃａｐｔｏ Ｑ）（商標）ＡＥＣ（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して実施される。
【0114】
こうして、第１のアニオン交換ステップにおいて、目的の動物由来食用タンパク質を含む培地は、アニオン交換樹脂と接触させられる。一実施形態では、アニオン交換樹脂は、クロマトグラフィーカラムに含有され、目的のタンパク質を含む培地は、カラムへとロード又はアプライされる。
【0115】
一実施形態では、目的のタンパク質を含む培地は、１００、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、２、又は１ｍＭ ＮａＣｌ以下である、イオン強度又は塩濃度で、アニオン交換樹脂と接触させられる。
【0116】
一実施形態では、目的のタンパク質を含む培地は、約６～約９、例えば、約７～約８．５、約７．５～約８．３、例えば、約８のｐＨで、アニオン交換樹脂と接触させられる。ローディング緩衝液、洗浄緩衝液、及び溶離緩衝液は、１つ又は複数の緩衝剤を含みうる。例えば、緩衝剤は、トリス、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＳＳＣ、ＭＥＳ、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、又はこれらの組合せでありうる。緩衝剤の濃度は、約１ｍＭ～約２５０ｍＭの間、例えば、約１０ｍＭ～約１００ｍＭの間、約１５ｍＭ～約５０ｍＭの間、約２０ｍＭ～約３０ｍＭの間、例えば、約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、又は約５０ｍＭである。
【0117】
こうして、一実施形態では、目的のタンパク質を含む培地は、透析又は透析濾過など、それ自体当技術分野で公知の手段による、アニオン交換樹脂との接触のために、上述のイオン強度及びｐＨへと調整される。
【0118】
一実施形態では、目的のタンパク質を含む培地はまた、例えば、上記で記載された通りに、精密濾過（バイオマスを除去するための）及び限外濾過（目的のタンパク質を濃縮するための）のうちの少なくとも１つなど、アニオン交換樹脂と接触させられる前に、他の前処理にもかけられうる。
【0119】
一部の実施形態では、目的のタンパク質を含む培地を、アニオン交換にかけるステップは、約２３℃又はこれ未満、約１８℃又はこれ未満、又は約１６℃又はこれ未満、例えば、約２３℃、約２０℃、約１８℃、又は約１６℃の温度で実施される。
【0120】
一実施形態では、目的のタンパク質は、第１のアニオン交換ステップから、非結合画分、すなわち、イオン交換樹脂に結合していない画分にいて回収される。こうして、クロマトグラフィーカラムにおいて、第１のアニオン交換ステップが実施されると、目的のタンパク質は、フロースルーにおいて回収されうる。任意選択で、フロースルーは、１００、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、２、又は１ｍＭ ＮａＣｌ以下のイオン強度又は塩濃度で、１回又は複数回の洗浄及び／又は溶離と組み合わされる場合があり、好ましくは、約６～約９、例えば、約７～約８．５、約７．５～約８．３、例えば、約８のｐＨで組み合わされうる。
【0121】
一実施形態では、第１のアニオン交換ステップから得られた、目的のタンパク質は、第１のアニオン交換ステップと、実質的に同一の条件下で実施される、第２のアニオン交換ステップにかけられうる。
【0122】
一実施形態では、１つ又は２つのアニオン交換ステップから得られた、目的のタンパク質は、当業者に一般に公知の手段及び方法を使用する脱塩及び凍結乾燥のうちの少なくとも１つにかけられうる。
【0123】
本発明のこの態様に従う、使用済み培地からアニオン交換により精製される、目的の動物由来食用タンパク質は、任意の本明細書で記載される、目的の動物由来食用タンパク質でありうる。好ましくは、精製される、目的のタンパク質は、オボアルブミン、より好ましくは、ニワトリ、ペリカン、ウズラ、ハト、ダチョウ、チドリ、シチメンチョウ、カモ、ガチョウ、カモメ、ホロホロチョウ、ヤケイ、クジャク、ヤマウズラ、キジ、エミュー、レア、及びキーウィからなる群から選択される鳥類に由来するオボアルブミンであり、これらのうちで、ニワトリ、ハト、ペリカン、及びウズラが最も好ましい。
【0124】
卵白
発現されたオボアルブミン、卵白（ａｌｂｕｍｅｎ又はｅｇｇ ｗｈｉｔｅ）と称されうる、オボアルブミンなど、微生物により産生された動物タンパク質は、食品適用と同様にそれらを使用することが可能であるために、好ましくは、対応する動物由来のタンパク質の機能的特性と同等な機能的特性を呈する。一実施形態では、発現されたオボアルブミンは、組成物の一部である。したがって、発現されたオボアルブミンを、卵白（ａｌｂｕｍｅｎ又はｅｇｇ ｗｈｉｔｅ）組成物と称する場合がある。代替的に、当業者は、発現されたオボアルブミンを、真菌由来の、発現されたオボアルブミン、真菌由来の卵白（ａｌｂｕｍｅｎ又はｅｇｇ ｗｈｉｔｅ）と称する場合がある。
発現されたオボアルブミン、卵白（ａｌｂｕｍｅｎ又はｅｇｇ ｗｈｉｔｅ）と称されうる、オボアルブミンなど、微生物により産生された動物タンパク質は、食品適用と同様にそれらを使用することが可能であるために、好ましくは、対応する動物由来のタンパク質の機能的特性と同等な機能的特性を呈する。一実施形態では、発現されたオボアルブミンは、組成物の一部である。したがって、発現されたオボアルブミンを、卵白（ａｌｂｕｍｅｎ又はｅｇｇ ｗｈｉｔｅ）組成物と称する場合がある。代替的に、当業者は、発現されたオボアルブミンを、真菌由来の、発現されたオボアルブミン、真菌由来の卵白（ａｌｂｕｍｅｎ又はｅｇｇ ｗｈｉｔｅ）と称する場合がある。
【0125】
焼成、ゲル化などの複合適用における、微生物により産生された、本発明の動物タンパク質の挙動を予測するために、実験室規模の実験が適用されることで、食品適用試験の、妥当なサイズへのスケールダウンが容易となり、測定及び標準物質との比較の実施を可能となる。結果として、本発明のタンパク質が特徴づけられうる。本明細書で使用される、「卵白」という用語は、１つ又は複数の卵白タンパク質又は卵白関連タンパク質について記載し、このようなタンパク質は、ｔｅｎｐ、クラステリン、ＣＨ２１、ＶＭＯ－１、ビテロゲニン、透明帯プロテインＣ、ＢＣ型オボトランスフェリン、オボインヒビター前駆体、オボムコイド前駆体、クラステリン前駆体、Ｈｅｐ２１タンパク質前駆体、オボグリコプロテイン前駆体、細胞外脂肪酸結合性タンパク質、細胞外脂肪酸結合性タンパク質前駆体、プロスタグランジンＤ２シンターゼ前駆体（脳）、マーカータンパク質、ビテロゲニン１、ビテロゲニン２、ビテロゲニン２前駆体、ビテロゲニン３、リボフラビン結合性タンパク質、ヘモペキシン、血清アルブミン前駆体、アポリポタンパク質Ｄ、オボセクレトグロブリン、Ｈｅｐ２１、グルタチオンペルオキシダーゼ３、リポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼ／軟骨形成関連リポカリン、アポビテレニン１、ＤＫＫ（ｄｉｃｋｋｏｐｆ）関連タンパク質３、ガリナシン１１（ＶＭＯ－１１、トリβ－ディフェンシン１１）、血清アルブミン（ａ－リベチン）、ガリン、分泌トリプシンインヒビター、リンパ球抗原８６、アクチン、Ｉｇｐ鎖Ｃ領域、スルフヒドリルオキシダーゼ１、ヒストンＨ４、アンジオポエチン様タンパク質３、ユビキチン、オボカリクシン３２、ポリマー性免疫グロブリン受容体、ペプチジルプロリルシス／トランスイソメラーゼＢ、アミノペプチダーゼＥｙ、プレイオトロフィン、ミドカイン、レニン／プロレニン受容体、ＴＩＭＰ－２、ＴＩＭＰ－３、ヒストンＨ２Ｂバリアント、ＩｇＸ鎖、ＦＡＭＣ３タンパク質、ａ－エノラーゼ、６０Ｓ酸性リボソームタンパク質ＰＩ、シトタクチン／テネイシン、ＣＥＰＵ－１、セレノプロテイン、伸長因子１－ａ１、精巣上体分泌タンパク質、Ｅｌ、１４－３－３タンパク質（ゼータ）、オルファクトメジン様タンパク質３、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ２、Ｐ－２－マイクログロブリン、ＲＧＤ－ＣＡＰ、アポリポタンパク質Ｂ、ゴルジ体タンパク質１、コルヒチン、プロテアソーム７型サブユニット、アポリポタンパク質Ａ－Ｉ、真核開始因子４Ａ－ＩＩ、ＡＳＰＩＣ／軟骨酸性タンパク質１、トリオースリン酸イソメラーゼ、プロテアソームａ型サブユニット、ＩｇＸ鎖Ｃ領域、ＰＬＯＤ１（ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ－ｌｙｓｉｎｅ ２－ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ ５－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ １）、ＡＤＰリボシル化因子５、カルモジュリン、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼイソメラーゼ、アネキシンＩ、伸長因子２、ペルオキシレドキシン１、ＨＳＰ７０、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＡ３、カルレチクリン、４０Ｓリボソームタンパク質ＳＡ／ラミニン受容体１、ａ－アクチニン４、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド、ビタミンＤ結合性タンパク質、セマフォリン３Ｃ、エンドプラスミン、カタラーゼ、肝ａ－アミラーゼ、一過性ＥＲ ＡＴＰアーゼ、カドヘリン１、アンジオテンシン転換酵素、骨形成タンパク質１、グアニンヌクレオチド結合性タンパク質サブユニット１２様１、ヒスチジンアンモニアリアーゼ、アネキシンＡ２、１－カテニン、ＲＡＢ－ＧＤＰ解離インヒビター、ラミンＡ、オボクレイジン１１６、アミノペプチダーゼ、ＨＳＰ９０－ａ、低酸素症上方調節タンパク質１、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ９０）コグネイト１、ＡＴＰクエン酸シンターゼ、及びミオシン９を含むがこれらに限定されないことが理解されるであろう。
【0126】
オボアルブミン、卵白（ａｌｂｕｍｅｎ又はｅｇｇ ｗｈｉｔｅ）と称されうる、目的のタンパク質のゲル化特性を決定するのに、貯蔵弾性率、損失弾性率、ゲル強度、破断応力、変形、ヤング係数などのゲル流体力学特徴を得るために、振動式レオメーター（例えば、ＭＣＲ ｓｅｒｉｅｓ、Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ）又は引張試験機が使用される場合がある。典型的に、タンパク質のゲル化特性についての精緻な情報を得ようとするなら、当業者は、タンパク質濃度及び塩濃度を変動させて調製されるゲル（Ｋａｔｏ，Ａ．ら（２０１３）；Ｈｕａ，Ｙ．ら（２００５）；Ｒａｗｄｋｕｅｎ，Ｓ．ら（２００９））を、オボアルブミンゲル（Ｅｇｅｌａｎｄｓｄａｌ，Ｂ．（１９８０）；Ｓｈｉｔａｍｏｒｉ，Ｓ．ら（１９８４）；Ｍａｔｓｕｄｏｍｉ，Ｎ．ら（１９９１）；Ｈａｔｔａ，Ｈ．ら（１９８６）；Ｓｈｉｇｅｒｕ，Ｈ．及びＳｈｕｒｙｏ，Ｎ．（１９８５）；Ｃｒｅｕｓｏｔ，Ｎ．ら（２０１１））などに適合させることになる。このような例では、タンパク質の濃度は、好ましくは、５％～１５％の間など、３％～２０％の間の範囲でありうる。塩（例えば、塩化ナトリウム）は、２０～１００ｍＭの間など、０～２００ｍＭの間の範囲でありうる。溶液のｐＨは、５～８の間、又は６．５～７．５の間など、３～９の間の範囲でありうる。溶液は、１５～１２０分間、好ましくは、６０～９０分間など、４５～１２０分間の範囲の時間にわたり加熱されうる。一例では、溶液は、７０～９０℃の間など、６０～１００℃の間にわたり加熱されうる。この後、ゲルを、室温へと冷却すると、レオロジー測定にかける準備ができている。
【0127】
前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、卵白組成物は、１００ｇ～１５００ｇ、５００ｇ～１５００ｇ、又は７００ｇ～１５００ｇの範囲内のゲル強度を有しうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、卵白組成物は、卵白のゲル強度を超えるゲル強度を有しうる。
【0128】
タンパク質の、別の重要な品質は、その可溶性である。一実施形態では、タンパク質の可溶化は、異なるｗｔ％（重量％）のタンパク質を、ｐＨを変動させる緩衝液と混合することにより決定される。さらなる実施形態では、タンパク質溶液は、ある特定の時間にわたり攪拌され、次いで、遠心分離される。上清におけるタンパク質の量は、タンパク質の可溶性の測定のための、ブラッドフォード法、デュマ法、２８０ｎｍにおける吸光度法、ビウレット法などなど、適切なタンパク質決定法を使用して測定されうる。
【0129】
前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、卵白組成物は、６～１０の範囲内のｐＨを有しうる。
【0130】
別の重要な食用タンパク質の適用は、起泡である。目的のタンパク質の起泡特性を決定するために、タンパク質溶液を調製し、適切な方法により、例えば、ホモジナイゼーション又はブレンディングにより、ある特定の長さの時間にわたり攪拌することができる。測定用シリンダーを使用して、３０秒後における全泡量を観察し、泡量を規定する。全泡量を、１～２４時間の範囲の時間にわたり記録し、泡量が減少する割合（容量％）により、泡安定性を規定する。泡安定性は、この場合には、泡のうちの半分が消失するのに必要とされる半減時間を指す、半減期として表されうる。
【0131】
前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、卵白タンパク質組成物は、少なくとも３０ｍｍの泡高を有しうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、卵白タンパク質組成物は、卵白の泡高を超える泡高を有しうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、卵白タンパク質組成物は、泡立ての３０分間後において、最大で１０ｍｍ又は最大で５ｍｍの泡高を有しうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、卵白タンパク質組成物は、泡立ての３０分間後において、卵白の泡高に満たない泡高を有しうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、卵白タンパク質組成物は、４０ｇ～１００ｇなど、３０ｇ～１００ｇの範囲内の泡強度を有しうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、卵白タンパク質組成物は、卵白の泡強度を超える泡高を有しうる。
【0132】
前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、卵白組成物は、卵白の泡高を超える泡高を有しうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、卵白組成物は、泡立ての３０分間後において、最大で１０ｍｍ又は最大で５ｍｍの泡高を有しうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、卵白組成物は、泡立ての３０分間後において、卵白の泡高に満たない泡高を有しうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、卵白組成物は、４０ｇ～１００ｇなど、３０ｇ～１００ｇの範囲内の泡強度を有しうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、卵白組成物は、卵白の泡強度を超える泡高を有しうる。
【0133】
タンパク質の、さらに重要な機能特性は、その乳化特性である。この特性を測定するために、ある特定のｐＨを伴うタンパク質溶液を、適切な油と混合することができる。この溶液は、適切な方法により、例えば、ホモジナイゼーション又はブレンディングにより、ある時間にわたり攪拌される。当技術分野では、乳化特性を決定するための代替法が公知である。１つのこのような方法は、乳化相、水相、及び油相の容量に基づく。さらなる方法は、分光光度計を使用して測定されうる、エマルジョンの濁度に基づく。
【0134】
前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、オボアルブミン組成物は、６～１０の範囲内のｐＨを有しうる。
【0135】
卵白組成物
前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、発現されるオボアルブミンは、組成物の一部でありうる。発現されるオボアルブミンはまた、本明細書で記載される通り、卵白として公知でもありうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、方法は、食品添加剤を、卵白組成物としてもまた公知の、オボアルブミン組成物へと添加するステップをさらに含みうる。一態様では、本開示は、発現されたオボアルブミン、又はその組成物の一部としてのオボアルブミンを含む加工済み可食生成物を提示する。結果として、本開示は、本明細書で記載される卵白を含む、加工済み可食生成物を提示する。一態様では、本開示は、発現されたオボアルブミンと、１つ若しくは複数の卵白タンパク質又はこれらの断片とを含む加工済み可食生成物を提示する。したがって、本開示は、本明細書で記載される、発現されたオボアルブミンと、１つ若しくは複数の卵白関連タンパク質又はこれらの断片とを含む加工済み可食生成物を提示する。一部の実施形態では、１つ又は複数の卵白タンパク質は、オボアルブミン、オボトランスフェリン、オボムコイド、Ｇ１６２Ｍ Ｆ１６７Ａオボムコイド、オボグロブリンＧ２、オボグロブリンＧ３、リゾチーム、オボインヒビター、オボグリコプロテイン、フラビンタンパク質、オボマクログロブリン、オボスタチン、シスタチン、アビジン、オボアルブミン関連タンパク質Ｘ、オボアルブミン関連タンパク質Ｙ、及びこれらの任意の組合せからなる群に由来する組合せなど、オボトランスフェリン、オボムコイド、Ｇ１６２Ｍ Ｆ１６７Ａオボムコイド、オボグロブリンＧ２、オボグロブリンＧ３、ａ－オボムチン、（３－オボムチン、リゾチーム、オボインヒビター、オボグリコプロテイン、フラビンタンパク質、オボマクログロブリン、オボスタチン、シスタチン、アビジン、オボアルブミン関連タンパク質Ｘ、オボアルブミン関連タンパク質Ｙ、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択されうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、加工済み可食生成物は、オボアルブミンと、２つ若しくはこれを超えるか、３つ若しくはこれを超えるか、４つ若しくはこれを超えるか、５つ若しくはこれを超えるか、又は６つ若しくはこれを超える卵白タンパク質又はこれらの断片とを含みうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、加工済み可食生成物は、１つ若しくは複数であるか、２つ若しくはこれを超えるか、３つ若しくはこれを超えるか、５つ若しくはこれを超えるか、１０若しくはこれを超えるか、又は２０若しくはこれを超える卵白タンパク質を欠く場合がある。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、加工済み可食生成物は、食用生成物、飲用生成物、栄養補助食品、食品添加剤、医薬生成物、衛生生成物、並びに食用生成物及び飲用生成物からなる群に由来する組合せなど、これらの任意の組合せからなる群から選択されうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、オボアルブミン組成物又は可食生成物は、水をさらに含みうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、オボアルブミン組成物又は可食生成物は、最大で、９５％の百分率の水を有しうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、オボアルブミン組成物又は可食生成物は、８０％～９５％の範囲内の百分率の水を有しうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、オボアルブミン組成物又は可食生成物は、乾燥重量で、少なくとも９０％タンパク質を含みうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、オボアルブミン組成物又は可食生成物は、食品添加剤をさらに含みうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、食品添加剤は、甘味剤、塩、炭水化物、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択されうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、オボアルブミン組成物又は可食生成物は、コレステロールを欠く場合がある。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、オボアルブミン組成物又は可食生成物は、乾燥重量で５％未満の脂肪を含みうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、オボアルブミン組成物又は可食生成物は、脂肪、飽和脂肪、又はトランス脂肪を欠く場合がある。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、オボアルブミン組成物又は可食生成物は、グルコースを欠く場合がある。
前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、発現されるオボアルブミンは、組成物の一部でありうる。発現されるオボアルブミンはまた、本明細書で記載される通り、卵白として公知でもありうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、方法は、食品添加剤を、卵白組成物としてもまた公知の、オボアルブミン組成物へと添加するステップをさらに含みうる。一態様では、本開示は、発現されたオボアルブミン、又はその組成物の一部としてのオボアルブミンを含む加工済み可食生成物を提示する。結果として、本開示は、本明細書で記載される卵白を含む、加工済み可食生成物を提示する。一態様では、本開示は、発現されたオボアルブミンと、１つ若しくは複数の卵白タンパク質又はこれらの断片とを含む加工済み可食生成物を提示する。したがって、本開示は、本明細書で記載される、発現されたオボアルブミンと、１つ若しくは複数の卵白関連タンパク質又はこれらの断片とを含む加工済み可食生成物を提示する。一部の実施形態では、１つ又は複数の卵白タンパク質は、オボアルブミン、オボトランスフェリン、オボムコイド、Ｇ１６２Ｍ Ｆ１６７Ａオボムコイド、オボグロブリンＧ２、オボグロブリンＧ３、リゾチーム、オボインヒビター、オボグリコプロテイン、フラビンタンパク質、オボマクログロブリン、オボスタチン、シスタチン、アビジン、オボアルブミン関連タンパク質Ｘ、オボアルブミン関連タンパク質Ｙ、及びこれらの任意の組合せからなる群に由来する組合せなど、オボトランスフェリン、オボムコイド、Ｇ１６２Ｍ Ｆ１６７Ａオボムコイド、オボグロブリンＧ２、オボグロブリンＧ３、ａ－オボムチン、（３－オボムチン、リゾチーム、オボインヒビター、オボグリコプロテイン、フラビンタンパク質、オボマクログロブリン、オボスタチン、シスタチン、アビジン、オボアルブミン関連タンパク質Ｘ、オボアルブミン関連タンパク質Ｙ、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択されうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、加工済み可食生成物は、オボアルブミンと、２つ若しくはこれを超えるか、３つ若しくはこれを超えるか、４つ若しくはこれを超えるか、５つ若しくはこれを超えるか、又は６つ若しくはこれを超える卵白タンパク質又はこれらの断片とを含みうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、加工済み可食生成物は、１つ若しくは複数であるか、２つ若しくはこれを超えるか、３つ若しくはこれを超えるか、５つ若しくはこれを超えるか、１０若しくはこれを超えるか、又は２０若しくはこれを超える卵白タンパク質を欠く場合がある。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、加工済み可食生成物は、食用生成物、飲用生成物、栄養補助食品、食品添加剤、医薬生成物、衛生生成物、並びに食用生成物及び飲用生成物からなる群に由来する組合せなど、これらの任意の組合せからなる群から選択されうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、オボアルブミン組成物又は可食生成物は、水をさらに含みうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、オボアルブミン組成物又は可食生成物は、最大で、９５％の百分率の水を有しうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、オボアルブミン組成物又は可食生成物は、８０％～９５％の範囲内の百分率の水を有しうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、オボアルブミン組成物又は可食生成物は、乾燥重量で、少なくとも９０％タンパク質を含みうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、オボアルブミン組成物又は可食生成物は、食品添加剤をさらに含みうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、食品添加剤は、甘味剤、塩、炭水化物、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択されうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、オボアルブミン組成物又は可食生成物は、コレステロールを欠く場合がある。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、オボアルブミン組成物又は可食生成物は、乾燥重量で５％未満の脂肪を含みうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、オボアルブミン組成物又は可食生成物は、脂肪、飽和脂肪、又はトランス脂肪を欠く場合がある。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、オボアルブミン組成物又は可食生成物は、グルコースを欠く場合がある。
【0136】
前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、方法は、オボアルブミン組成物を、脱糖するか、安定化させるか、又はこれからグルコースを除去するステップをさらに含みうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、方法は、オボアルブミン組成物を、低温殺菌するか、又は超高温殺菌するステップをさらに含みうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、方法は、オボアルブミン組成物を乾燥させるステップをさらに含みうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、方法は、オボアルブミン組成物又はその一部を、酵素、化学物質、又は機械により消化することをさらに含みうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、卵白組成物は、少なくとも１、２、３、又は６カ月間の保管寿命を有しうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、卵白組成物又は可食生成物は、卵白と比べて、アレルギー誘発性が低減されている場合がある。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、卵白組成物又は可食生成物は、液体でありうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、卵白組成物又は可食生成物は、固体又は粉末でありうる。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、卵白組成物又は可食生成物は、凍結されている場合がある。前述の実施形態のうちのいずれか一つでは、卵白組成物又は可食生成物は、一部又は全ての天然クロコウジカビタンパク質を含みうる。代替的に、卵白組成物又は可食生成物は、全ての天然クロコウジカビタンパク質から精製されている場合がある。
【0137】
本明細書で飲用される、全ての特許及び参考文献は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。
【0138】
本発明は、以下の実施例により、さらに記載されるが、これらは、本発明の範囲を限定するものとしてはみなされないものとする。
【実施例】
【0139】
一般的分子生物学法
そうでないことが指し示されない限りにおいて、使用される方法は、標準的な生化学法である。適切な一般的方法についての教科書の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９９５）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃを含む。
そうでないことが指し示されない限りにおいて、使用される方法は、標準的な生化学法である。適切な一般的方法についての教科書の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９９５）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃを含む。
【0140】
株
クロコウジカビ株であるＢＺＡＳＮＩ．２２ａは、ＣＩＣＣ２４６２の急速増殖型単一コロニー分離株である。ＢＺＡＳＮＩ．２２ａは、ｒＤＮＡのＩＴＳシーケンシング、及びゲノムのリシーケンシング（ＢａｓｅＣｌｅａｒ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）により特徴づけた。クロコウジカビ株であるＢＺＡＳＮＩ．３３は、ＧＬＡキャリアＯＶＡ発現カセット（ＢＺＥＳＣＯ．２３においてクローニングされる）を伴う、クロコウジカビＢＺＡＳＮＩ．２２ａの高コピー形質転換体である。
クロコウジカビ株であるＢＺＡＳＮＩ．２２ａは、ＣＩＣＣ２４６２の急速増殖型単一コロニー分離株である。ＢＺＡＳＮＩ．２２ａは、ｒＤＮＡのＩＴＳシーケンシング、及びゲノムのリシーケンシング（ＢａｓｅＣｌｅａｒ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）により特徴づけた。クロコウジカビ株であるＢＺＡＳＮＩ．３３は、ＧＬＡキャリアＯＶＡ発現カセット（ＢＺＥＳＣＯ．２３においてクローニングされる）を伴う、クロコウジカビＢＺＡＳＮＩ．２２ａの高コピー形質転換体である。
【0141】
ＢＺＡＳＮＩ．４８は、ＢＺＡＳＮＩ．２２ａの単一コロニー分離株である。ＢＺＡＳＮＩ．６０は、ＧＬＡプレプロペプチドＯＶＡ発現カセットを伴う、クロコウジカビＢＺＡＳＮＩ．４８の高コピー形質転換体である。
【0142】
クローニングを目的として、Ｂｉｏｋｅから入手した、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ製のＮＥＢ １０－ベータコンピテント大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ））細胞、及びＮＥＢ ５－アルファコンピテント大腸菌細胞を使用した。
【0143】
代替的株は、クロコウジカビＣＢＳ５１３．８８株（野生型）、ＮＲＲＬ３株（野生型）及びクロコウジカビＣＩＣＣ２４６２株を含む。
【0144】
プラスミド及びオリゴヌクレオチドプライマー
実施例において使用されるプラスミドを、表１に列挙する。実施例において使用されるプライマーを、表２に列挙する。
実施例において使用されるプラスミドを、表１に列挙する。実施例において使用されるプライマーを、表２に列挙する。
【表4】
【表5】
【0145】
キット
アガロースゲルからの、ＰＣＲ断片の精製及びＤＮＡ断片の抽出のために、ウィザード（Ｗｉｚａｒｄ）（登録商標）ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ ｃｌｅａｎ－ｕｐシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。精製されたＰＣＲ産物を、ゼロブラント（Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ）（商標）トポ（ＴＯＰＯ）（商標）ＰＣＲクローニングキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による、ピーシーアール（ＰＣＲ）（商標）ブラントＩＩ－トポ（Ｂｌｕｎｔ ＩＩ－ＴＯＰＯ）（登録商標）ベクターにライゲーションした。増幅されたプラスミドは、Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）により単離した。Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ反応は、ＮＥＢ Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により実行した。Ｇｉｂｓｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓは、ＮＥＢ Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により実行した。
アガロースゲルからの、ＰＣＲ断片の精製及びＤＮＡ断片の抽出のために、ウィザード（Ｗｉｚａｒｄ）（登録商標）ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ ｃｌｅａｎ－ｕｐシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。精製されたＰＣＲ産物を、ゼロブラント（Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ）（商標）トポ（ＴＯＰＯ）（商標）ＰＣＲクローニングキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による、ピーシーアール（ＰＣＲ）（商標）ブラントＩＩ－トポ（Ｂｌｕｎｔ ＩＩ－ＴＯＰＯ）（登録商標）ベクターにライゲーションした。増幅されたプラスミドは、Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）により単離した。Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ反応は、ＮＥＢ Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により実行した。Ｇｉｂｓｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓは、ＮＥＢ Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により実行した。
【0146】
酵素
ＤＮＡ操作のための酵素（例えば、消化酵素である、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ反応酵素）は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手可能であり、製造元のプロトコールに従い使用した。
ＤＮＡ操作のための酵素（例えば、消化酵素である、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ反応酵素）は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手可能であり、製造元のプロトコールに従い使用した。
【0147】
培地
オボアルブミン発現カセットの構築において使用される培地：適切な抗生剤（ネオマイシン５０μｇ／ｍｌ、又はクロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌ）を伴う、液体ＬＢ培地（１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌの酵母抽出物、５ｇ／ｌのＮａＣｌ）、及び固体ＬＢ培地（１５ｇ／ｌの寒天の添加）である。
オボアルブミン発現カセットの構築において使用される培地：適切な抗生剤（ネオマイシン５０μｇ／ｍｌ、又はクロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌ）を伴う、液体ＬＢ培地（１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌの酵母抽出物、５ｇ／ｌのＮａＣｌ）、及び固体ＬＢ培地（１５ｇ／ｌの寒天の添加）である。
【0148】
クロコウジカビの形質転換体の形質転換及び選択のために使用される培地：適切な選択培地（１５ｍＭの塩化セシウムと組み合わせた、抗生剤であるヒグロマイシン４００μｇ／ｍｌ、又は１０ｍＭのアセトアミド）を伴う、下層寒天培地（１８７．３６ｇ／ＬのＤ－サッカロース；０．５ｇ／ｋｇのＫＣｌ；４ｇ／ｋｇのＫＨ２ＰＯ４；１．１ｇ／ｋｇのＮａ２ＨＰＯ４；１．５ｇ／ｋｇのクエン酸；２ｇ／ｋｇのＭｇＳＯ４・７水和物；０．０１ｇ／ｋｇのＦｅＳＯ４・７水和物；０．１ｇ／ｋｇのＣａＣｌ２・２水和物；０．０１２５ｇ／ｋｇのＺｎＳＯ４・７水和物；０．０１２ｇ／ｋｇのＭｎＣｌ２・４水和物；０．００１６ｇ／ｋｇのＣｕＳＯ４・５水和物；０．０００９ｇ／ｋｇのＫＩ、９ｇ／Ｌのアガロースを伴い、初期ｐＨを６とする）、適切な選択培地（１５ｍＭの塩化セシウムと組み合わせた、抗生剤であるヒグロマイシン５００μｇ／ｍｌ、又は１０ｍＭのアセトアミド）を伴う、上層寒天培地（０．５ｇ／ｋｇのＫＣｌ；４ｇ／ｋｇのＫＨ２ＰＯ４；１．１ｇ／ｋｇのＮａ２ＨＰＯ４；１．５ｇ／ｋｇのクエン酸；２ｇ／ｋｇのＭｇＳＯ４・７水和物；０．０１ｇ／ｋｇのＦｅＳＯ４・７水和物；０．１ｇ／ｋｇのＣａＣｌ２・２水和物；０．０１２５ｇ／ｋｇのＺｎＳＯ４・７水和物；０．０１２ｇ／ｋｇのＭｎＣｌ：２・４水和物；０．００１６ｇ／ｋｇのＣｕＳＯ４・５水和物；０．０００９ｇ／ｋｇのＫＩ、１１ｇ／ＬのＤ－グルコース、９ｇ／Ｌの寒天を伴い、初期ｐＨを６とする）、及び適切な選択培地（１５ｍＭの塩化セシウムと組み合わせた、抗生剤であるヒグロマイシン５００μｇ／ｍｌ、又は１０ｍＭのアセトアミド）を伴う最小培地（０．５ｇ／ｋｇのＫＣｌ；４ｇ／ｋｇのＫＨ２ＰＯ４；１．１ｇ／ｋｇのＮａ２ＨＰＯ４；１．５ｇ／ｋｇのクエン酸；２ｇ／ｋｇのＭｇＳＯ４・７水和物；０．０１ｇ／ｋｇのＦｅＳＯ４・７水和物；０．１ｇ／ｋｇのＣａＣｌ２・２水和物；０．０１２５ｇ／ｋｇのＺｎＳＯ４・７水和物；０．０１２ｇ／ｋｇのＭｎＣｌ：２・４水和物；０．００１６ｇ／ｋｇのＣｕＳＯ４・５水和物；０．０００９ｇ／ｋｇのＫＩ、１１ｇ／ＬのＤ－グルコース、９ｇ／Ｌの寒天を伴い、初期ｐＨを６とする）である。ヒグロマイシンを、形質転換体の選択のために使用する場合、形質転換プレート及び最小プレートは、０．５４ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ窒素供給源を含有していた。胞子形成寒天（０．５４ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ、０．５ｇ／ｋｇのＫＣｌ；４ｇ／ｋｇのＫＨ２ＰＯ４；１．１ｇ／ｋｇのＮａ２ＨＰＯ４；１．５ｇ／ｋｇのクエン酸；２ｇ／ｋｇのＭｇＳＯ４・７水和物；０．０１ｇ／ｋｇのＦｅＳＯ４・７水和物；０．１ｇ／ｋｇのＣａＣｌ２・２水和物；０．０１２５ｇ／ｋｇのＺｎＳＯ４・７水和物；０．０１２ｇ／ｋｇのＭｎＣｌ：２・４水和物；０．００１６ｇ／ｋｇのＣｕＳＯ４・５水和物；０．０００９ｇ／ｋｇのＫＩ、１１ｇ／ＬのＤ－グルコース、１４ｇ／Ｌの寒天、及び４４．７３ｇ／ＬのＫＣｌを伴い、初期ｐＨを６とする）を使用して、クロコウジカビ形質転換体を精製した。
【0149】
深型ウェルプレートにおけるオボアルブミン形質転換体スクリーニングのために使用される培地：ＰＤＡ（２０ｇ／Ｌのデキストロース、１５ｇ／Ｌの寒天、及び４ｇ／Ｌのバレイショデンプン）である。産出培地（ＰＭ）（０．５ｇ／ｋｇのＫＣｌ；４ｇ／ｋｇのＫＨ２ＰＯ４；１．１ｇ／ｋｇのＮａ２ＨＰＯ４；１．５ｇ／ｋｇのクエン酸；２ｇ／ｋｇのＭｇＳＯ４・７水和物；０．０１ｇ／ｋｇのＦｅＳＯ４・７水和物；０．１ｇ／ｋｇのＣａＣｌ２・２水和物；０．０１２５ｇ／ｋｇのＺｎＳＯ４・７水和物；０．０１２ｇ／ｋｇのＭｎＣｌ：２・４水和物；０．００１６ｇ／ｋｇのＣｕＳＯ４・５水和物；０．０００９ｇ／ｋｇのＫＩ、８８ｇ／ＬのＤ－グルコース、７０ｇ／Ｌのクエン酸、１２．５ｇ／ＬのＬ－グルタミン、１１ｇ／Ｌのクエン酸三アンモニウムを伴い、初期ｐＨを５．２５とする）とする。
【0150】
シェークフラスコにおけるオボアルブミン形質転換体スクリーニングために使用される培地：ＰＤＡ．ＰＭ．ＧＹＥ培地（２０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２２ｇ／ＬのＤ－グルコースを伴い、初期ｐＨを５とする）である。ＫＭ３．０（５ｇ／Ｌの尿素、５０ｇ／ＬのＤ－グルコース、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．５５ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７水和物、０．０００１２５ＺｎＳＯ４・７水和物、０．０００１ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７水和物、０．００６ｇ／ＬのＭｎＣｌ：２・４水和物、０．０５ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２水和物、０．３ｇ／ｌＫＣｌ、１．５ｇ／Ｌのクエン酸を伴い、初期ｐＨを５とする）とする。
【0151】
５Ｌスケールの発酵槽において使用される発酵培地：オボアルブミンを作製するために、米国特許出願公開第２０１４／０３４２３９６ Ａ１号において記載されている通りに、５．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４を使用し、マルトデキストリン（１０％）と共に、グルコース（９０％）をフィードし、１２．５％のアンモニウム溶液、０．２３ｇ／Ｌの消泡剤であるＢＴ０３（ｖａｎ Ｍｅｅｕｗｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して、ｐＨを制御するように滴定しながら、既知組成発酵培地を使用した。
【0152】
クロコウジカビの発酵
深型ウェルプレート（ＤＷＰ）における発酵のための培地については、上記で記載されている。接種及び発酵は、以下の方式で実行した。２００μｌのグリセロール原液を、ＰＤＡプレートに入れ、３ｍｌのＰＭを添加し、まず、プレートを振盪して、菌糸体を拡散させ、次いで、３２℃で、３日間にわたりインキュベートした。菌糸体をほぐすように、Ｔ字型スパチュラによりスクラッチした、増殖させた真菌菌糸体の上に、５ｍｌのＰＭ培地を添加することにより、プレートのＰＤＡ＋ＰＭ培地全体を採取した。全菌糸体を、滅菌トレーに回収して、より均質の接種物とした。０．５ｍｌの、均質化された菌糸体を、ＤＷＰへと移した。ＤＷＰを、インキュベーターにおいて、３４℃、３５０ｒｐｍで、６日間にわたりインキュベートした（Ｉｎｆｏｒｓ ｍｉｎｉｔｒｏｎ；ストローク：２．５ｃｍ）。上清を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用する解析のために使用した。
深型ウェルプレート（ＤＷＰ）における発酵のための培地については、上記で記載されている。接種及び発酵は、以下の方式で実行した。２００μｌのグリセロール原液を、ＰＤＡプレートに入れ、３ｍｌのＰＭを添加し、まず、プレートを振盪して、菌糸体を拡散させ、次いで、３２℃で、３日間にわたりインキュベートした。菌糸体をほぐすように、Ｔ字型スパチュラによりスクラッチした、増殖させた真菌菌糸体の上に、５ｍｌのＰＭ培地を添加することにより、プレートのＰＤＡ＋ＰＭ培地全体を採取した。全菌糸体を、滅菌トレーに回収して、より均質の接種物とした。０．５ｍｌの、均質化された菌糸体を、ＤＷＰへと移した。ＤＷＰを、インキュベーターにおいて、３４℃、３５０ｒｐｍで、６日間にわたりインキュベートした（Ｉｎｆｏｒｓ ｍｉｎｉｔｒｏｎ；ストローク：２．５ｃｍ）。上清を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用する解析のために使用した。
【0153】
シェークフラスコ（ＫＭ３．０）における発酵のための培地については、上記で記載されている。接種及び発酵は、以下の方式で実行した。２００μｌのグリセロール原液を、ＰＤＡプレートに入れ、３ｍｌのＰＭを添加し、まず、プレートを振盪して、菌糸体を拡散させ、次いで、３２℃で、３日間にわたりインキュベートした。菌糸体をほぐすように、Ｔ字型スパチュラによりスクラッチした、プレートのＰＤＡ＋ＰＭ培地全体を採取し、菌糸体を、ステリストッパー（Ｓｔｅｒｉｓｔｏｐｐｅｒｓ）を伴う、３００ｍｌのバッフル付きシェークフラスコに、３５ｍｌのＧＹＥ培地と共に接種し、次いで、インキュベーター（Ｉｎｆｏｒｓ ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ；ストローク：２．５ｃｍ）において、３２℃、２２０ｒｐｍで、２日間にわたりインキュベートした。１ｍｌのＧＹＥ培養物を、ステリストッパーを伴う、１００ｍｌのバッフルなしシェークフラスコに、２２ｍｌのＫＭ３．０培地と共に接種し、次いで、２２ｍｌのＫＭ３．０培地において、３２℃、１２０ｒｐｍで、６日間にわたりインキュベートした。上清を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用する解析のために使用した。
【0154】
５Ｌの発酵槽における培地は、上記で記載された通りに調製した。グルコースを、＞１０ｇ／Ｌに制御するように、グルコースをフィードした。発酵槽を混合するように、攪拌を行い、最適のタンパク質量をもたらすのに十分な酸素を供給した。ｐＨを、ｐＨ６．５に設定し、発酵槽を、３２℃に保持した。ｐＨを、ｐＨ５～７の間に制御し、温度を、３１～３３℃の間に制御した。
【0155】
クロコウジカビ形質転換体の精製
初代形質転換体を、ヒグロマイシン又はアセトアミドを伴う最小培地に再画線接種し、増殖性（陽性）形質転換体を、オボアルブミン遺伝子、及びヒグロマイシン耐性又はアセトアミダーゼ耐性のコード遺伝子の存在についてのコロニーＰＣＲにより解析した。コロニーＰＣＲの後における陽性形質転換体を、胞子形成のために、胞子形成用寒天へと移した。単一の胞子形成性コロニーを選択し、ヒグロマイシン又はアセトアミドを伴う最小培地に画線接種した。オボアルブミン遺伝子、及びヒグロマイシン耐性又はアセトアミダーゼ耐性のコード遺伝子の存在を確認するために、単一コロニーのゲノムＤＮＡを単離した。
クロコウジカビ形質転換体についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析及びウェスタンブロット解析
ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、小スケールの発酵の後で実行した。試料調製物は、７．８μｌの上清、３μｌのニューページ（ＮｕＰＡＧＥ）（登録商標）ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）試料緩衝液（４倍濃度）、及び１．２μｌのニューページ（登録商標）還元剤（１０倍濃度）であり、これを、９５℃で、１０分間にわたり変性させた。１０μｌの試料を、ボルト（Ｂｏｌｔ）（商標）８％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｌｕｓ ＳＤＳ－ＰＡＧＥにロードし、５μｌのベンチマーク（商標）Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒを添加した。２０倍濃度ニューページ（登録商標）ＳＤＳ用ＭＯＰＳランニングバッファー、２００ｍｌの１倍濃度ニューページ（登録商標）ランニングバッファーにより、１リットルの１倍濃度ニューページ（登録商標）ランニングバッファーを調製し、０．５ｍｌのニューページ（登録商標）抗酸化剤を、システムの内側チャンバーに添加し、１倍濃度ニューページ（登録商標）ランニングバッファーの残りを、外側チャンバーに添加した。製造元のプロトコールに従い、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥの染色は、製造元のプロトコールに従い、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ Ｓａｆｅｓｔａｉｎにより実行した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥプロトコールで使用された、全ての化学物質は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製である。
初代形質転換体を、ヒグロマイシン又はアセトアミドを伴う最小培地に再画線接種し、増殖性（陽性）形質転換体を、オボアルブミン遺伝子、及びヒグロマイシン耐性又はアセトアミダーゼ耐性のコード遺伝子の存在についてのコロニーＰＣＲにより解析した。コロニーＰＣＲの後における陽性形質転換体を、胞子形成のために、胞子形成用寒天へと移した。単一の胞子形成性コロニーを選択し、ヒグロマイシン又はアセトアミドを伴う最小培地に画線接種した。オボアルブミン遺伝子、及びヒグロマイシン耐性又はアセトアミダーゼ耐性のコード遺伝子の存在を確認するために、単一コロニーのゲノムＤＮＡを単離した。
クロコウジカビ形質転換体についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析及びウェスタンブロット解析
ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、小スケールの発酵の後で実行した。試料調製物は、７．８μｌの上清、３μｌのニューページ（ＮｕＰＡＧＥ）（登録商標）ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）試料緩衝液（４倍濃度）、及び１．２μｌのニューページ（登録商標）還元剤（１０倍濃度）であり、これを、９５℃で、１０分間にわたり変性させた。１０μｌの試料を、ボルト（Ｂｏｌｔ）（商標）８％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｌｕｓ ＳＤＳ－ＰＡＧＥにロードし、５μｌのベンチマーク（商標）Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒを添加した。２０倍濃度ニューページ（登録商標）ＳＤＳ用ＭＯＰＳランニングバッファー、２００ｍｌの１倍濃度ニューページ（登録商標）ランニングバッファーにより、１リットルの１倍濃度ニューページ（登録商標）ランニングバッファーを調製し、０．５ｍｌのニューページ（登録商標）抗酸化剤を、システムの内側チャンバーに添加し、１倍濃度ニューページ（登録商標）ランニングバッファーの残りを、外側チャンバーに添加した。製造元のプロトコールに従い、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥの染色は、製造元のプロトコールに従い、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ Ｓａｆｅｓｔａｉｎにより実行した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥプロトコールで使用された、全ての化学物質は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製である。
【0156】
上清９６深型ウェルプレート（小スケール発酵）において増殖させた、５日齢（ｄ５）及び６日齢（ｄ６）の培養物を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて解析し（図４の左パネル）、ニトロセルロース膜にブロッティングし（図４の右パネル）、ニワトリオボアルブミンポリクローナル抗体（ウサギ／ＩｇＧオボアルブミンポリクローナル抗体；型番：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＰＡ１１９６、及びヤギ抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰコンジュゲート；型番：Ｓｉｇｍａ ＡＢ１２２５）により検出した。
【0157】
ＮＣＢＩデータベースからのオボアルブミン配列の選択、及びそれらのコンピュータによる解析
異なる鳥類種から、代替的オボアルブミンを得るために、ニワトリオボアルブミンタンパク質配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＡＢ５９９５６．１）を使用して、ＮＣＢＩデータベースを、Ｂｌａｓｔ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ．，Ｓ．Ｆ．ら（１９９７）、「Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：３３８９～３４０２）にかけた。複数の配列を見出し、これらから、以下の基準：
ｉ）選択された鳥類の卵についてのヒト使用歴（Ｗｉｋｉｐｅｄｉａにおける検索に基づく情報）；
ｉｉ）鶏卵アレルギー誘発性エピトープ（Ｍｉｎｅ Ｙ．及びＲｕｐａ Ｐ．（２００３）、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１０３、４４６～４５３）；アレルゲンデータベース：ＩＥＤＢ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／ｈｏｍｅ＿ｖ３．ｐｈｐａｎｄＳＥＤＢ－ｈｔｔｐ：／／ｓｅｄｂ．ｂｉｃｐｕ．ｅｄｕ．ｉｎ／ｈｏｍｅ．ｐｈｐ）の非存在；及び
ｉｉｉ）鳥類の系統発生的距離（Ｊａｒｖｉｓ Ｅ．Ｄ．ら（２０１４）、「Ｗｈｏｌｅ－ｇｅｎｏｍｅ ａｎａｌｙｓｅｓ ｒｅｓｏｌｖｅ ｅａｒｌｙ ｂｒａｎｃｈｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅｅ ｏｆ ｌｉｆｅ ｏｆ ｍｏｄｅｒｎ ｂｉｒｄｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４６（６２１５）、１３２０～１３３１）
に従い、５つの代替的ニワトリオボアルブミンを選び出した。
異なる鳥類種から、代替的オボアルブミンを得るために、ニワトリオボアルブミンタンパク質配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＡＢ５９９５６．１）を使用して、ＮＣＢＩデータベースを、Ｂｌａｓｔ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ．，Ｓ．Ｆ．ら（１９９７）、「Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：３３８９～３４０２）にかけた。複数の配列を見出し、これらから、以下の基準：
ｉ）選択された鳥類の卵についてのヒト使用歴（Ｗｉｋｉｐｅｄｉａにおける検索に基づく情報）；
ｉｉ）鶏卵アレルギー誘発性エピトープ（Ｍｉｎｅ Ｙ．及びＲｕｐａ Ｐ．（２００３）、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１０３、４４６～４５３）；アレルゲンデータベース：ＩＥＤＢ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／ｈｏｍｅ＿ｖ３．ｐｈｐａｎｄＳＥＤＢ－ｈｔｔｐ：／／ｓｅｄｂ．ｂｉｃｐｕ．ｅｄｕ．ｉｎ／ｈｏｍｅ．ｐｈｐ）の非存在；及び
ｉｉｉ）鳥類の系統発生的距離（Ｊａｒｖｉｓ Ｅ．Ｄ．ら（２０１４）、「Ｗｈｏｌｅ－ｇｅｎｏｍｅ ａｎａｌｙｓｅｓ ｒｅｓｏｌｖｅ ｅａｒｌｙ ｂｒａｎｃｈｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅｅ ｏｆ ｌｉｆｅ ｏｆ ｍｏｄｅｒｎ ｂｉｒｄｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４６（６２１５）、１３２０～１３３１）
に従い、５つの代替的ニワトリオボアルブミンを選び出した。
【0158】
これらの基準を満たすオボアルブミン配列の選択は、ダチョウ（Ｓｔｒｕｔｈｉｏ ｃａｍｅｌｕｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）；ペリカン（Ｐｅｌｅｃａｎｕｓ ｃｒｉｓｐｕｓ）；ハト（Ｃｏｌｕｍｂａ ｌｉｖｉａ）；ウズラ（Ｃｏｔｕｒｎｉｘ ｃｏｔｕｒｎｉｘ）；及びチドリ（Ｃｈａｒａｄｒｉｕｓ ｖｏｃｉｆｅｒｕｓ）（図１及び配列番号２～６を参照されたい）に由来する配列の選択であるが、この選択に限定されない。
【0159】
全ゲノムベースのコドン使用を伴う、オボアルブミン発現カセットの構築
選択されたオボアルブミンを、クロコウジカビにおいて過剰発現させるために、本発明者らは、以下の方式で、発現カセットを構築した：
ｉ）タンパク質配列（配列番号１～６）を、対応するＤＮＡコード配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ合成のためのインプットとして使用した。クロコウジカビにおける発現のためのコドン最適化は、クロコウジカビＣＢＳ５１３．８８（図２；ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／を参照されたい）の完全コドン使用に基づき、遺伝子合成は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ＵＳ）により行った。対応するＤＮＡコード配列は、配列表において、配列番号７～１２の下に言及される。各配列の起始部及び終端部に、ＢｓａＩ酵素の制限部位を付加して、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ反応を容易とし、ｐＵＣ５７－ｋａｎ（配列番号１３）もクローニングした。
選択されたオボアルブミンを、クロコウジカビにおいて過剰発現させるために、本発明者らは、以下の方式で、発現カセットを構築した：
ｉ）タンパク質配列（配列番号１～６）を、対応するＤＮＡコード配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ合成のためのインプットとして使用した。クロコウジカビにおける発現のためのコドン最適化は、クロコウジカビＣＢＳ５１３．８８（図２；ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／を参照されたい）の完全コドン使用に基づき、遺伝子合成は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ＵＳ）により行った。対応するＤＮＡコード配列は、配列表において、配列番号７～１２の下に言及される。各配列の起始部及び終端部に、ＢｓａＩ酵素の制限部位を付加して、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ反応を容易とし、ｐＵＣ５７－ｋａｎ（配列番号１３）もクローニングした。
【0160】
ｉｉ）グルコアミラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＰ０４４９９．１）の分泌シグナル配列（配列番号１４）からなるプレプロペプチドを、細胞外におけるオボアルブミンの分泌を駆動するのに使用した。配列を、合成により作製し、対応するオボアルブミンアミノ酸配列の、第２のアミノ酸（天然のニワトリオボアルブミンに基づく）へと直接融合させた。
【0161】
ｉｉｉ）代替的オボアルブミン発現カセットでは、オボアルブミンコード配列を、その最初の５０２アミノ酸をコードする、切断型グルコアミラーゼ遺伝子配列へと融合させた。このグルコアミラーゼ配列は、Ｎ末端に、その分泌シグナルプレプロ配列を含む。グルコアミラーゼの５０２アミノ酸と、成熟オボアルブミン配列の起始部との間に、ＫＥＸ２（Ｌｙｓ－Ａｒｇ）切断部位を含む、８アミノ酸の合成ペプチド（配列番号１５及び１６）を挿入した。同様の切断型グルコアミラーゼタンパク質配列が、クロコウジカビの分泌経路を介する相同なキャリアとして使用されたが、これは、異種タンパク質の産出を著明に増大させることが報告された（Ｊｅｅｎｅｓ，Ｄ．Ｊ．ら（１９９３）、「Ａ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎ ｆｏｒ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ」、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１０７、２６７～２７２）。
【0162】
グルコアミラーゼ遺伝子の調節配列（ＧｅｎＢａｎｋ：Ａｎ０３ｇ０６５５０）を、目的の遺伝子の高発現を駆動し、効率的な転写物の終結を確認するために使用した。ｇｌａＡプロモーター及びｇｌａＡターミネーターを、それぞれ、プライマー４０６及び４０８（配列番号１７及び１８）、並びにプライマー４０９及び４１０（配列番号１９及び２０）により、宿主であるクロコウジカビＢＺＡＳＮＩ．２２ａ株からＰＣＲ増幅し、ウィザード（登録商標）ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ ｃｌｅａｎ－ｕｐシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）により精製した。これらの精製ＰＣＲ産物を、ゼロブラント（商標）トポ（商標）ＰＣＲクローニングキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による、ピーシーアール（商標）ブラントＩＩ－トポ（登録商標）ベクターにライゲーションし、これにより、ＮＥＢ １０－ベータコンピテント大腸菌細胞を形質転換した。陽性の大腸菌形質転換体に由来するプラスミドを、制限酵素解析及びＤＮＡシーケンシングにより、インサートの、適正な配列及び配向性について点検した。構築されたプラスミドの全てについては、表１を参照されたい。
【0163】
ＮＥＢ Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；配列番号２２のプラスミドｐＧＧＡを伴う）を使用して、１０００ｂｐのｇｌａＡプロモーター、プレプロペプチド又はキャリアタンパク質、オボアルブミンコード配列、及び６００ｂｐのｇｌａＡターミネーターからなる発現カセットをアセンブルし、これにより、ＮＥＢ １０－ベータコンピテント大腸菌細胞を形質転換した。陽性の大腸菌形質転換体に由来するプラスミドを、制限酵素解析及びＤＮＡシーケンシングにより、インサートの、適正な配列及び配向性について点検した。構築されたプラスミドの全てについては、表１を参照されたい。ＧＬＡタンパク質融合体の構築は、上記で言及された通りに実行した。
【0164】
遺伝子特異的コドン使用を伴う、オボアルブミン発現カセットの構築
クロコウジカビにおいて、異種タンパク質を発現させるための、コドン使用最適化のための別の手法について調べるために、本発明者らは、高度に発現されたクロコウジカビ遺伝子であるｇｌａＡを選択し、コドン使用の最適化を、そのコドン優先性に基づかせた。本発明者らは、以下の方式で、発現カセットを構築した：
ニワトリオボアルブミン（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＭＦ３２１６５９．１）のｃＤＮＡを、クロコウジカビにおいて、オボアルブミンを発現させるための、コドン使用最適化のためのインプットとして使用した。オンラインで入手可能な解析ツールである、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ Ｓｕｉｔｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｏｒｇ／ｓｍｓ２／ｃｏｄｏｎ＿ｕｓａｇｅ．ｈｔｍｌ）（表３Ａを参照されたい）を使用して、クロコウジカビグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）ｃＤＮＡ（ＮＣＢＩ参照番号：ＸＭ＿００１３９０４９３．２）のコドン使用を解析した。その後、オンラインで入手可能なＤＮＡ最適化ツールである、ＯＰＴＩＭＩＳＥＲ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅｓ．ｕｒｖ．ｅｓ／ＯＰＴＩＭＩＳＥＲ／；Ｐｕｉｇｂｏ Ｐ．ら、２００７、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、３５、Ｗ１２６～Ｗ１３１）を使用し、クロコウジカビＣＢＳ５１３．８８のｇｌａＡ ｃＤＮＡのコドン使用表（表３Ａ）を、インプットとして使用して、ニワトリオボアルブミンｃＤＮＡを、コドン最適化した。全ｃＤＮＡ配列を通した、同等な変化の分布を考慮に入れ、結果として得られたニワトリオボアルブミンｃＤＮＡを、ｇｌａＡ ｃＤＮＡのコドン使用表（表３Ｂ、配列番号３２を参照されたい）との、最も緊密なマッチとするように、手作業により、さらに適正化した。遺伝子合成は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ＵＳ）により行った。細胞外において、タンパク質の分泌を方向付けるように、オボアルブミンタンパク質配列のメチオニンを、クロコウジカビのグルコアミラーゼ（ＧＬＡ）プレプロ配列（配列番号１４）で置きかえた（オボアルブミンは、切断されず、成熟タンパク質の一部として残存する、内部シグナル配列（残基２１～４７）を含むことに留意されたい）。対応するＤＮＡコード配列は、配列表において、配列番号３０の下に言及される。Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔにより、ニワトリオボアルブミンコード配列を、デスティネーションプラスミドであるｐＵＣ５７（配列番号３１）において合成し、これを、ＢＺＥＳＣＯ．２１（配列番号３２）と名付けた。
クロコウジカビにおいて、異種タンパク質を発現させるための、コドン使用最適化のための別の手法について調べるために、本発明者らは、高度に発現されたクロコウジカビ遺伝子であるｇｌａＡを選択し、コドン使用の最適化を、そのコドン優先性に基づかせた。本発明者らは、以下の方式で、発現カセットを構築した：
ニワトリオボアルブミン（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＭＦ３２１６５９．１）のｃＤＮＡを、クロコウジカビにおいて、オボアルブミンを発現させるための、コドン使用最適化のためのインプットとして使用した。オンラインで入手可能な解析ツールである、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ Ｓｕｉｔｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｏｒｇ／ｓｍｓ２／ｃｏｄｏｎ＿ｕｓａｇｅ．ｈｔｍｌ）（表３Ａを参照されたい）を使用して、クロコウジカビグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）ｃＤＮＡ（ＮＣＢＩ参照番号：ＸＭ＿００１３９０４９３．２）のコドン使用を解析した。その後、オンラインで入手可能なＤＮＡ最適化ツールである、ＯＰＴＩＭＩＳＥＲ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅｓ．ｕｒｖ．ｅｓ／ＯＰＴＩＭＩＳＥＲ／；Ｐｕｉｇｂｏ Ｐ．ら、２００７、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、３５、Ｗ１２６～Ｗ１３１）を使用し、クロコウジカビＣＢＳ５１３．８８のｇｌａＡ ｃＤＮＡのコドン使用表（表３Ａ）を、インプットとして使用して、ニワトリオボアルブミンｃＤＮＡを、コドン最適化した。全ｃＤＮＡ配列を通した、同等な変化の分布を考慮に入れ、結果として得られたニワトリオボアルブミンｃＤＮＡを、ｇｌａＡ ｃＤＮＡのコドン使用表（表３Ｂ、配列番号３２を参照されたい）との、最も緊密なマッチとするように、手作業により、さらに適正化した。遺伝子合成は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ＵＳ）により行った。細胞外において、タンパク質の分泌を方向付けるように、オボアルブミンタンパク質配列のメチオニンを、クロコウジカビのグルコアミラーゼ（ＧＬＡ）プレプロ配列（配列番号１４）で置きかえた（オボアルブミンは、切断されず、成熟タンパク質の一部として残存する、内部シグナル配列（残基２１～４７）を含むことに留意されたい）。対応するＤＮＡコード配列は、配列表において、配列番号３０の下に言及される。Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔにより、ニワトリオボアルブミンコード配列を、デスティネーションプラスミドであるｐＵＣ５７（配列番号３１）において合成し、これを、ＢＺＥＳＣＯ．２１（配列番号３２）と名付けた。
【0165】
代替的に、オボアルブミンコード配列を、クロコウジカビの分泌経路を通して、キャリアの役割を果たす、切断型グルコアミラーゼ遺伝子配列（配列番号３３）へと融合させた。分泌されたオボアルブミンを、ＧＬＡキャリアから放出するために、エンテロキナーゼ切断部位（ＤＤＤＤＫ）を、キャリアタンパク質と、天然オボアルブミンの起始部との間に付加した。エンテロキナーゼ切断部位を付加された、切断型グルコアミラーゼ遺伝子を、プライマー２７６及び２８６（配列番号３４及び３５）により、クロコウジカビＢＺＡＳＮＩ．２２ａのゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。
【0166】
両方のオボアルブミン構築物（ＧＬＡキャリア融合体を伴うオボアルブミン構築物、及びこれを伴わないオボアルブミン構築物）の構築は、インフュージョンＰＣＲ（Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲ）を使用して行った。ＧＬＡキャリア融合体を伴わない構築物のために、ｇｌａＡのプロモーターは、プライマー２７６及び２７７（配列番号３４及び３６）により、ターミネーターは、プライマー２８０及び２８１（配列番号３７及び３８）により、いずれも、クロコウジカビＢＺＡＳＮＩ．２２ａのゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。ニワトリオボアルブミンＯＲＦは、プラスミドであるＢＺＥＳＣＯ．２１（配列番号３２）を、鋳型として使用して、プライマー２７８及び２７９（配列番号３９及び４０）によりＰＣＲ増幅した。ＧＬＡキャリア－オボアルブミン融合構築物のために、ｇｌａＡのプロモーターと、ＧＬＡキャリアタンパク質に対応する、切断型ｇｌａＡ遺伝子とは、プライマー２７６及び２８６（配列番号３４及び３５）により、ターミネーター（それぞれ、配列番号３７及び３８に対応する、プライマー２８０及び２８１）も併せて、いずれも、クロコウジカビＢＺＡＳＮＩ．２２ａのゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。ニワトリオボアルブミンＯＲＦは、プライマー２８７及び２７９（配列番号４１及び４０）により、ＢＺＥＳＣＯ．２１（配列番号３２）からＰＣＲ増幅した。それぞれ、カセットの５’末端及び３’末端においてアライメントするプライマーによる重複伸長ＰＣＲを使用して、上記で記載された発現カセットの部分をアセンブルした。得られた産物を、制限－ライゲーションにより、ｐＵＣ５７－Ｂｒｉｃｋベクター（配列番号４２）へとクローニングした。ＧＬＡキャリア融合体を伴わない完全構築物を、ＢＺＥＳＣＯ．２２（配列番号４３）と名付け、ＧＬＡキャリア融合構築物を、ＢＺＥＳＣＯ．２３（配列番号４４）と名付けた。ニワトリオボアルブミン発現カセット（ＧＬＡキャリア融合体を伴うニワトリオボアルブミン発現カセット、及びこれを伴わないニワトリオボアルブミン発現カセット）を、プライマー２７６及び２８１（配列番号３４及び３８）によりＰＣＲ増幅し、プライマー４０４及び４０５（配列番号４６及び４７）により、ｐＣＮＳ４３（配列番号４５）からＰＣＲ増幅された、ヒグロマイシン選択マーカーを含有するＤＮＡ断片と共に、クロコウジカビ株であるＢＺＡＳＮＩ．２２ａを形質転換した。
【0167】
クロコウジカビの高発現遺伝子であるｇｌａＡのコドン使用最適化に基づき選択された、他のオボアルブミンコード遺伝子を過剰発現させるために、本発明者らは、以下の方式で、発現カセットを構築した：ｉ）ダチョウ、ペリカン、ハト、ウズラ、及びチドリオボアルブミンのタンパク質配列（配列番号２～６）を、クロコウジカビＣＢＳ５１３．８８のｇｌａＡ ｃＤＮＡのコドン使用表（表３Ａ）を使用する、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ＵＳ）による遺伝子合成、及びそれらの自家遺伝子合成、コドン最適化アルゴリズムのためのインプットとして使用した。細胞外において、タンパク質の分泌を方向付けるように、オボアルブミンタンパク質配列の＋１位におけるメチオニンを、クロコウジカビのグルコアミラーゼ（ＧＬＡ）プレプロペプチド配列（配列番号１４）で置きかえた（オボアルブミンは、切断されず、成熟タンパク質の一部として残存する、内部シグナル配列（残基２１～４７）を含むことに留意されたい）。対応するＤＮＡコード配列は、配列表において、配列番号６５～６９の下に言及される。配列を、ｐＵＣ５７－ｋａｎ（配列番号１３）において、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより送達し、５’末端及び３’末端において、ＢｓａＩ酵素の制限部位を付加することにより、さらに修飾して、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ反応を容易とした。ｇｌａＡプロモーター及びｇｌａＡターミネーターを、それぞれ、プライマー４０６及び４０８（配列番号１７及び１８）、並びにプライマー４０９及び４１０（配列番号１９及び２０）により、宿主であるクロコウジカビＢＺＡＳＮＩ．２２ａ株からＰＣＲ増幅し、ウィザード（登録商標）ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ ｃｌｅａｎ－ｕｐシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）により精製した。これらの精製ＰＣＲ産物を、ゼロブラント（商標）トポ（商標）ＰＣＲクローニングキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による、ピーシーアール（商標）ブラントＩＩ－トポ（登録商標）ベクターにライゲーションし、これにより、ＮＥＢ １０－ベータコンピテント大腸菌細胞を形質転換した。陽性の大腸菌形質転換体に由来するプラスミドを、制限酵素解析及びＤＮＡシーケンシングにより、インサートの、適正な配列及び配向性について点検した。構築されたプラスミドの全てについては、表１を参照されたい。
【0168】
ＮＥＢ Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；配列番号２２のプラスミドｐＧＧＡを伴う）を使用して、１０００ｂｐのｇｌａＡプロモーター、オボアルブミンコード配列を伴うグルコアミラーゼプレプロペプチド、及び６００ｂｐのｇｌａＡターミネーターからなる発現カセットをアセンブルし、これにより、ＮＥＢ １０－ベータコンピテント大腸菌細胞を形質転換した。陽性の大腸菌形質転換体に由来するプラスミドを、制限酵素解析及びＤＮＡシーケンシングにより、インサートの、適正な配列及び配向性について点検した。構築されたプラスミドの全て（配列番号７０～７４）については、表１を参照されたい。
【0169】
クロコウジカビゲノムターゲティング単一クロスオーバー組込み構築物のために、ｇｌａＡ遺伝子座の下流における１５００ｂｐの領域を使用した（３’’ｇｌａＡとマークされる）。この３’’ｇｌａＡ部分を、宿主であるクロコウジカビＢＺＡＳＮＩ．２２ａから、プライマー７２８及び７２９（配列番号７５及び７６）によりＰＣＲ増幅した。異なる発現カセット（ｇｌａＡプロモーター－コドン最適化オボアルブミン遺伝子－ｇｌａＡターミネーター）を、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ構築物（配列番号７０～７４）、及びＢＺＥＳＣＯ．２２（配列番号４３）から、プライマー７３３及び７３４（配列番号７７及び７８）によりＰＣＲ増幅した。プラスミド骨格部分を、プラスミドであるｐＵＣ１９（配列番号７９）から、プライマー４３１及び４３２（配列番号８０及び８１）によりＰＣＲ増幅した。全てのＰＣＲ産物を、ウィザード（登録商標）ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ ｃｌｅａｎ－ｕｐシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）により精製した。ＮＥＢ Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙクローニングキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、１５００ｂｐの３’’ｇｌａＡ部分、異なる発現カセット、及びプラスミド骨格からなる組込み構築物をアセンブルし、これにより、ＮＥＢ ５－アルファコンピテント大腸菌細胞を形質転換した。陽性の大腸菌形質転換体に由来するプラスミドを、制限酵素解析及びＤＮＡシーケンシングにより、インサートの、適正な配列及び配向性について点検した。構築されたプラスミドの全て（配列番号８２～８７）については、表１を参照されたい。
【表6】
【0170】
遺伝子特異的コドン使用を伴う、代替的ＧＬＡキャリア融合体オボアルブミン発現カセットの構築
選択されたオボアルブミンを、クロコウジカビにおいて過剰発現させるために、本発明者らは、クロコウジカビに由来する、異なるサイズの切断型グルコアミラーゼを伴う、代替的オボアルブミン発現カセットを構築した。切断型キャリア配列の選択は、グルコアミラーゼの三次構造に基づき、発現されたオボアルブミンの、下流におけるプロセシングを容易とするように、切断型タンパク質のｐＩ及び分子量を考慮に入れた。最適化されたオボアルブミンコード配列を、それぞれ、ＧＬＡの最初の５４、１００、及び５０２アミノ酸をコードする、３つの異なる切断型グルコアミラーゼ遺伝子配列へと融合させた。これらのグルコアミラーゼ配列の全ては、それらの固有の分泌シグナルプレプロペプチド配列を、Ｎ末端において含んだ。
選択されたオボアルブミンを、クロコウジカビにおいて過剰発現させるために、本発明者らは、クロコウジカビに由来する、異なるサイズの切断型グルコアミラーゼを伴う、代替的オボアルブミン発現カセットを構築した。切断型キャリア配列の選択は、グルコアミラーゼの三次構造に基づき、発現されたオボアルブミンの、下流におけるプロセシングを容易とするように、切断型タンパク質のｐＩ及び分子量を考慮に入れた。最適化されたオボアルブミンコード配列を、それぞれ、ＧＬＡの最初の５４、１００、及び５０２アミノ酸をコードする、３つの異なる切断型グルコアミラーゼ遺伝子配列へと融合させた。これらのグルコアミラーゼ配列の全ては、それらの固有の分泌シグナルプレプロペプチド配列を、Ｎ末端において含んだ。
【0171】
最初の５４アミノ酸（ＧＬＡ５４、配列番号８８及び８９）からなる、グルコアミラーゼ配列は、グルコアミラーゼタンパク質のプレプロペプチド配列、最初のアルファヘリックスへと翻訳され、ＫＥＸ２（Ｌｙｓ－Ａｒｇ）切断部位の付加で終わる。最初の１００アミノ酸（ＧＬＡ１００、配列番号９０及び９１）からなる、グルコアミラーゼ配列は、グルコアミラーゼタンパク質のプレプロペプチド配列、及び最初の３つのアルファヘリックスへと翻訳され、ＫＥＸ２（Ｌｙｓ－Ａｒｇ）切断部位の付加で終わる。最初の５０２アミノ酸（配列番号１３０及び１６）からなる、グルコアミラーゼ配列は、プレプロペプチド配列、及びデンプン結合性ドメインを伴わない、グルコアミラーゼタンパク質へと翻訳される。グルコアミラーゼの５０２アミノ酸と、成熟オボアルブミン配列の起始部との間に、ＫＥＸ２（Ｌｙｓ－Ａｒｇ）切断部位を含む、８アミノ酸の合成ペプチドを挿入した。３つの異なる切断型グルコアミラーゼバリアントの対応するＤＮＡコード配列は、デスティネーションプラスミドであるｐＵＣ５７－ｋａｎ（配列番号１３）において、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ＵＳ）により合成した。各配列の５’末端及び３’末端に、ＢｓａＩ酵素の制限部位を付加して、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ反応を容易とした。
【0172】
同様の切断型グルコアミラーゼタンパク質配列が、クロコウジカビの分泌経路を介する相同なキャリアとして使用されたが、これは、異種タンパク質の産出を著明に増大させることが報告された（Ｊｅｅｎｅｓ，Ｄ．Ｊ．ら、１９９３、前出）。グルコアミラーゼ遺伝子の調節配列（ＧｅｎＢａｎｋ：Ａｎ０３ｇ０６５５０）を、目的の遺伝子の高発現を駆動し、効率的な転写の終結を確認するために使用した。
【0173】
発現カセットの構築のために、ｇｌａＡプロモーター及びｇｌａＡターミネーターを、それぞれ、プライマー４０６及び４０８（配列番号１７及び１８）、並びにプライマー４０９及び４１０（配列番号１９及び２０）により、宿主であるクロコウジカビＢＺＡＳＮＩ．２２ａ株からＰＣＲ増幅し、ウィザード（登録商標）ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ ｃｌｅａｎ－ｕｐシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）により精製した。これらの精製ＰＣＲ産物を、ゼロブラント（商標）トポ（商標）ＰＣＲクローニングキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による、ピーシーアール（商標）ブラントＩＩ－トポ（登録商標）ベクターにライゲーションし、これにより、ＮＥＢ １０－ベータコンピテント大腸菌細胞を形質転換した。陽性の大腸菌形質転換体に由来するプラスミドを、制限酵素解析及びＤＮＡシーケンシングにより、インサートの、適正な配列及び配向性について点検した。構築されたプラスミドの全てについては、表１を参照されたい。
【0174】
オボアルブミンコード配列を、ダチョウＯＶＡ（配列番号９２及び９３）については、プライマー７１５及び４２２により、配列番号６５を伴う、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ＵＳ）合成ＤＮＡコード配列から、チドリＯＶＡ（配列番号９４及び９５）については、プライマー７１６及び４２４により、配列番号６９を伴う、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ＵＳ）合成ＤＮＡコード配列から、ペリカンＯＶＡ（配列番号９６及び９７）については、プライマー７１７及び４２６により、配列番号６６を伴う、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ＵＳ）合成ＤＮＡコード配列から、ハトＯＶＡ（配列番号９８及び９９）については、プライマー７１８及び７２８により、配列番号６７を伴う、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ＵＳ）合成ＤＮＡコード配列から、ウズラＯＶＡ（配列番号１００及び１０１）については、プライマー７１９及び４３０により、配列番号６８を伴う、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ＵＳ）合成ＤＮＡコード配列からＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅された全てのオボアルブミン遺伝子を、ウィザード（登録商標）ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ ｃｌｅａｎ－ｕｐシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）により精製した。ＮＥＢ Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；配列番号２２のプラスミドｐＧＧＡを伴う）を使用して、１０００ｂｐのｇｌａＡプロモーター、３つの異なるグルコアミラーゼバリアント、コドン最適化されたオボアルブミンコード配列、及び６００ｂｐのｇｌａＡターミネーターからなる発現カセットをアセンブルし、これにより、ＮＥＢ １０－ベータコンピテント大腸菌細胞を形質転換した。陽性の大腸菌形質転換体に由来するプラスミドを、制限酵素解析及びＤＮＡシーケンシングにより、インサートの、適正な配列及び配向性について点検した。構築されたプラスミドの全て（配列番号１０２～１１６）については、表１を参照されたい。
【0175】
ニワトリオボアルブミン（配列番号３０）を伴うＧＬＡキャリア融合構築物の構築のために、既に構築されたプラスミドを、ＰＣＲ鋳型として使用して、ｉ）３つの異なるグルコアミラーゼバリアントを伴う、ｇｌａＡプロモーター；並びにｉｉ）コドン最適化ニワトリオボアルブミン、ｇｌａＡターミネーター、プラスミド骨格、及び単一クロスオーバー組込み部分（３’’ｇｌａＡ）をＰＣＲ増幅した。表４には、ＧＬＡキャリア発現カセットのうちの、どの部分が、どの鋳型構築物から、プライマーの組合せによりＰＣＲ増幅されたのかが記載される。
【表7】
【0176】
全てのＰＣＲ産物を、ウィザード（登録商標）ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ ｃｌｅａｎ－ｕｐシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）により精製し、ＮＥＢ Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙクローニングキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してアセンブルし、これらにより、ＮＥＢ ５－アルファコンピテント大腸菌細胞を形質転換した。陽性の大腸菌形質転換体に由来するプラスミドを、制限酵素解析及びＤＮＡシーケンシングにより、インサートの、適正な配列及び配向性について点検した。構築されたプラスミドの全て（配列番号１２５～１２７）については、表１を参照されたい。
【0177】
過剰発現カセットによる形質転換、及びクロコウジカビ形質転換体の選択
クロコウジカビの形質転換は、Ｂａｌａｎｃｅら（Ｂａｌｌａｎｃｅ Ｄ．Ｊ．ら（１９８３）、「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ｂｙ ｔｈｅ ｏｒｏｔｉｄｉｎｅ－５’－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｃａｒボックスｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１１２、２８４～２８９）によるプロトコールに基づいた。形質転換のために、５’側ｇｌａＡプロモーター（フォワードプライマー４０６、配列番号１７）のＤＮＡ配列、及び３’側ｇｌａＡターミネーター（リバースプライマー４１０、配列番号２０）のＤＮＡ配列においてアライメントするプライマーを使用して、オボアルブミンコード遺伝子及びｇｌａＡ調節配列、並びに多様なＧＬＡベースのキャリア配列を含有する、発現カセットの全体をＰＣＲ増幅した。このＤＮＡ断片と、プライマー４０４及び４０５（配列番号４６及び４７）により、ｐＣＮＳ４３（表１を参照されたい）からＰＣＲ増幅された、ヒグロマイシン選択マーカーとにより共形質転換を行い、形質転換体を、抗生剤であるヒグロマイシンを補充された最小培地を含有するプレートにおいて選択した。初代形質転換体を、ヒグロマイシンを伴う最小培地に再画線接種し、増殖性（陽性）形質転換体を、オボアルブミン遺伝子及びヒグロマイシンの存在についてのコロニーＰＣＲ（配列番号４８～６１のプライマー組合せについては、表５を参照されたい）により解析した。単一胞子精製手順を介して、陽性コロニーを精製し、小スケール発酵のための接種物を調製するのに使用した。
クロコウジカビの形質転換は、Ｂａｌａｎｃｅら（Ｂａｌｌａｎｃｅ Ｄ．Ｊ．ら（１９８３）、「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ｂｙ ｔｈｅ ｏｒｏｔｉｄｉｎｅ－５’－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｃａｒボックスｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１１２、２８４～２８９）によるプロトコールに基づいた。形質転換のために、５’側ｇｌａＡプロモーター（フォワードプライマー４０６、配列番号１７）のＤＮＡ配列、及び３’側ｇｌａＡターミネーター（リバースプライマー４１０、配列番号２０）のＤＮＡ配列においてアライメントするプライマーを使用して、オボアルブミンコード遺伝子及びｇｌａＡ調節配列、並びに多様なＧＬＡベースのキャリア配列を含有する、発現カセットの全体をＰＣＲ増幅した。このＤＮＡ断片と、プライマー４０４及び４０５（配列番号４６及び４７）により、ｐＣＮＳ４３（表１を参照されたい）からＰＣＲ増幅された、ヒグロマイシン選択マーカーとにより共形質転換を行い、形質転換体を、抗生剤であるヒグロマイシンを補充された最小培地を含有するプレートにおいて選択した。初代形質転換体を、ヒグロマイシンを伴う最小培地に再画線接種し、増殖性（陽性）形質転換体を、オボアルブミン遺伝子及びヒグロマイシンの存在についてのコロニーＰＣＲ（配列番号４８～６１のプライマー組合せについては、表５を参照されたい）により解析した。単一胞子精製手順を介して、陽性コロニーを精製し、小スケール発酵のための接種物を調製するのに使用した。
【0178】
形質転換はまた、選択マーカーとしてのＡ．ニデュランスアセトアミダーゼ遺伝子をコードするＤＮＡ断片によっても実行されうる。対応するＤＮＡ断片は、ｐＢＺ００２６（配列番号６２）から、プライマー４１１及び４１５（配列番号６３及び６４）によりＰＣＲ増幅することができる。形質転換体を、唯一の窒素供給源としてのアセトアミドを補充された最小培地を含有するプレートにおいて選択した。ｇｌａＡ遺伝子に基づく、オボアルブミンのコドン最適化を伴う、単一のクロスオーバー組込み構築物、及びニワトリオボアルブミンを伴う、異なるＧＬＡ融合構築物を、アセトアミド選択マーカーとライゲーションし、形質転換のために、プライマー７８７及び７８９（配列番号１２８及び１２９）によりＰＣＲ増幅した。初代形質転換体を、オボアルブミンコード遺伝子の存在について、コロニーＰＣＲにより解析し、ヒグロマイシン－オボアルブミン共形質転換体について、上記で記載した通りに、さらなる解析を進めた。
【表8】
【0179】
深型ウェルプレートにおける小スケールの発酵
発酵は、グルコース摂取に至るまで（のべ約６日間にわたり）実行し、異なる発酵日に、培養物の上清を採取した。上清は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて解析した（図３Ａ及び３Ｂを参照されたい）。発現させたニワトリオボアルブミンが、その通りのものであることを確認するために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥブロットを、ニトロセルロース膜へと転写し、市販のニワトリオボアルブミンポリクローナル抗体を使用するウェスタンブロットにより検出した（図４を参照されたい）。このブロットから（及び市販のニワトリオボアルブミンの移動度との比較にもまた基づき）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにおいて、ニワトリオボアルブミンと同様の移動度を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質バンドは、選択された鳥類オボアルブミンの過剰発現を表していることが仮定された。最も有望な形質転換体について、大スケール（５Ｌ）発酵を実施した。
発酵は、グルコース摂取に至るまで（のべ約６日間にわたり）実行し、異なる発酵日に、培養物の上清を採取した。上清は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて解析した（図３Ａ及び３Ｂを参照されたい）。発現させたニワトリオボアルブミンが、その通りのものであることを確認するために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥブロットを、ニトロセルロース膜へと転写し、市販のニワトリオボアルブミンポリクローナル抗体を使用するウェスタンブロットにより検出した（図４を参照されたい）。このブロットから（及び市販のニワトリオボアルブミンの移動度との比較にもまた基づき）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにおいて、ニワトリオボアルブミンと同様の移動度を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質バンドは、選択された鳥類オボアルブミンの過剰発現を表していることが仮定された。最も有望な形質転換体について、大スケール（５Ｌ）発酵を実施した。
【0180】
多様なオボアルブミンを過剰発現する形質転換体についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析に基づき、ニワトリオボアルブミンの、ｇｌａＡによるコドン最適化について、ニワトリオボアルブミン又は他のオボアルブミンの、全クロコウジカビゲノムベースのコドン最適化と比較して、最高度の発現が得られた。さらに、ニワトリオボアルブミンの過剰発現は、ペリカンに由来するオボアルブミンと同様に、小スケールで発酵させた場合に、２つの異なる分子量タンパク質バンドとして現れた（図４）。他方、ウズラオボアルブミンは、市販のオボアルブミンのサイズで泳動する、単一のバンドとして現れた（図３Ａ）。ダチョウオボアルブミン及びハトオボアルブミンの発現は、社外の試験サービスにより提供される、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるタンパク質識別法を使用して検証した（データは示さない）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析に基づくと、全ての異なるＧＬＡキャリア融合構築物は、ニワトリオボアルブミンの産出をもたらす（図３Ｂ）。
【0181】
シェークフラスコにおける小スケール発酵
発酵は、グルコース摂取に至るまで（のべ約６日間にわたり）実行し、異なる発酵日に、培養物の上清を採取した。インキュベーター（Ｉｎｆｏｒｓ Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ；ストローク：２．５ｃｍ）の１分間当たりの回転数（ｒｐｍ）が、シェークフラスコにおけるオボアルブミンの産出に、極めて重要であった。１２０ｒｐｍでは、産出は、極めて良好であったが、２２０ｒｐｍでは、オボアルブミンの産出は、見られなかった。上清は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて解析した（図３Ａ及び３Ｂを参照されたい）。電源の入力は、Ｗｏｌｆ Ｋｌｏｃｋｎｅｒ及びＪｏｃｈｅｎ Ｂｕｃｈｓ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１２年６月、３０巻、６号により記載される方法に従い計算することができる。
発酵は、グルコース摂取に至るまで（のべ約６日間にわたり）実行し、異なる発酵日に、培養物の上清を採取した。インキュベーター（Ｉｎｆｏｒｓ Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ；ストローク：２．５ｃｍ）の１分間当たりの回転数（ｒｐｍ）が、シェークフラスコにおけるオボアルブミンの産出に、極めて重要であった。１２０ｒｐｍでは、産出は、極めて良好であったが、２２０ｒｐｍでは、オボアルブミンの産出は、見られなかった。上清は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて解析した（図３Ａ及び３Ｂを参照されたい）。電源の入力は、Ｗｏｌｆ Ｋｌｏｃｋｎｅｒ及びＪｏｃｈｅｎ Ｂｕｃｈｓ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１２年６月、３０巻、６号により記載される方法に従い計算することができる。
【0182】
５Ｌの発酵槽における発酵
最良のニワトリオボアルブミン産出形質転換体の１つである、クロコウジカビＢＺＡＳＮＩ．３３を、５Ｌの発酵槽において増殖させた。図５は、精密濾過された上清についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の結果を示す。４０時間後以降は、ニワトリオボアルブミンの産出を検出することができた。深型ウェルプレート又はシェークフラスコにおいて産出されたニワトリオボアルブミン（図３及び４）と比較して、５Ｌの発酵培養液では、ニワトリオボアルブミンは、単一バンドとして現れた。
最良のニワトリオボアルブミン産出形質転換体の１つである、クロコウジカビＢＺＡＳＮＩ．３３を、５Ｌの発酵槽において増殖させた。図５は、精密濾過された上清についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の結果を示す。４０時間後以降は、ニワトリオボアルブミンの産出を検出することができた。深型ウェルプレート又はシェークフラスコにおいて産出されたニワトリオボアルブミン（図３及び４）と比較して、５Ｌの発酵培養液では、ニワトリオボアルブミンは、単一バンドとして現れた。
【0183】
卵白（ａｌｂｕｍｅｎ）及び卵白培養液（ａｌｂｕｍｅｎ）の攪拌
ニワトリ卵白（卵白）（５４％のオボアルブミンを伴う）の特性を、攪拌型発酵槽において評価した。標準構成におけるＳａｒｔｏｒｉｕｓ製のＣｐｌｕｓ発酵槽において、６００ｒｐｍを超えても、固体卵白（卵白）は観察されなかったが、９００ｒｐｍ以上では、固体卵白（卵白）が現れた。６００ｒｐｍでは、電源入力は、１．４ｋＷ／ｍ３である。鶏卵固体は、３２℃、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ製のＣｐｌｕｓ発酵槽における攪拌の２２時間後に現れる。
ニワトリ卵白（卵白）（５４％のオボアルブミンを伴う）の特性を、攪拌型発酵槽において評価した。標準構成におけるＳａｒｔｏｒｉｕｓ製のＣｐｌｕｓ発酵槽において、６００ｒｐｍを超えても、固体卵白（卵白）は観察されなかったが、９００ｒｐｍ以上では、固体卵白（卵白）が現れた。６００ｒｐｍでは、電源入力は、１．４ｋＷ／ｍ３である。鶏卵固体は、３２℃、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ製のＣｐｌｕｓ発酵槽における攪拌の２２時間後に現れる。
【表9】
【0184】
オボアルブミンの精製
アニオン交換クロマトグラフィーを、オボアルブミンの精製のための例として使用した。リン酸カリウム緩衝液又はトリス－ＨＣｌ緩衝液など、タンパク質（複数可）に結合し、これを溶離させるための緩衝液は、２０～５０ｍＭの範囲のモル濃度を有した。緩衝液のｐＨは、６～９において変動した。オボアルブミンが溶離したときの塩（ＮａＣｌなど）濃度は、０．０～０．３Ｍの間の範囲である。
アニオン交換クロマトグラフィーを、オボアルブミンの精製のための例として使用した。リン酸カリウム緩衝液又はトリス－ＨＣｌ緩衝液など、タンパク質（複数可）に結合し、これを溶離させるための緩衝液は、２０～５０ｍＭの範囲のモル濃度を有した。緩衝液のｐＨは、６～９において変動した。オボアルブミンが溶離したときの塩（ＮａＣｌなど）濃度は、０．０～０．３Ｍの間の範囲である。
【0185】
代替的に、サイズ除外クロマトグラフィーを使用して、サイズが実質的に異なるタンパク質を分離した。緩衝液（リン酸カリウム緩衝液又はトリス－ＨＣｌ緩衝液など）のモル濃度は、１０～５０ｍＭの間の範囲である。緩衝液のｐＨは、６～９の間の範囲である。塩（ＮａＣｌなど）のモル濃度は、０．１～０．３Ｍの間の範囲である。定組成溶離の流量は、１０～２００ｃｍ／時間の範囲である。
【0186】
例として述べると、アニオン交換クロマトグラフィーを使用する、クロコウジカビ（ＢＺＡＳＮＩ．６０）の精密濾過物から過剰発現されたニワトリオボアルブミンの精製を、図６Ａに示す。オボアルブミンは、以下のプロトコールを使用して精製した。精密濾過物を、出発溶離剤である、２５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８に対して透析濾過した。試料を、アニオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ Ｃａｐｔｏ Ｑ ＡＥＣ Ｃｏｌｕｍｎ、５ｍＬ、Ｃｙｔｉｖａ）にロードした。ロードされた試料のフロースルーを回収した。次に、タンパク質を、２５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８中に、０．０８ＭのＮａＣｌで溶離させた。全ての他のタンパク質は、２５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８中に、０．３ＭのＮａＣｌで溶離させた。０．０８ＭのＮａＣｌで溶離されたオボアルブミンは、約９０～９８％の純度で、オボアルブミンを含有する。フロースルーは、約７０～９０％の純度で、オボアルブミンを含有する。オボアルブミンをさらに精製するために、この試料を、第２のアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＣ）精製のための出発試料として使用することができる。第２のＡＥＣ精製は、第１のＡＥＣ精製のフロースルーである、出発試料を除き、第１のＡＥＣ精製と同一である。これについての例を、図６Ｂに示す。この精製の回収率は、８５％であった。
【0187】
被験生成物
ａ）起泡性
１０～１５０ｍｇ／ｍＬの範囲のタンパク質含量を使用する。被験溶液のｐＨは、典型的に、２～１１の範囲とする。攪拌時間は、適切な方法（例えば、ホモジナイゼーション、ブレンディング）を使用して、１～２０分間の範囲とし、この後、泡を、適切な測定用シリンダーへとへと移す。測定用シリンダーを使用して、３０秒後における全泡量を観察し、泡量を規定する。全泡量を、１～２４時間の範囲の時間経過にわたり観察し、泡量が減少する割合により、泡安定性を規定する。
ａ）起泡性
１０～１５０ｍｇ／ｍＬの範囲のタンパク質含量を使用する。被験溶液のｐＨは、典型的に、２～１１の範囲とする。攪拌時間は、適切な方法（例えば、ホモジナイゼーション、ブレンディング）を使用して、１～２０分間の範囲とし、この後、泡を、適切な測定用シリンダーへとへと移す。測定用シリンダーを使用して、３０秒後における全泡量を観察し、泡量を規定する。全泡量を、１～２４時間の範囲の時間経過にわたり観察し、泡量が減少する割合により、泡安定性を規定する。
【0188】
ｂ）可溶性
１～１０ｇの範囲のタンパク質含量を、１０～１０００ｍＬの範囲の量の緩衝液へと添加する。緩衝液のｐＨは、２～１２、より好ましくは、３～７の範囲である。タンパク質溶液を、３０～１２０分間の範囲の時間にわたり攪拌する。この後、溶液を、２０００～２００００×ｇの速度で、１０～６０分間の時間にわたり遠心分離する。この後、上清のタンパク質含量を測定する。
１～１０ｇの範囲のタンパク質含量を、１０～１０００ｍＬの範囲の量の緩衝液へと添加する。緩衝液のｐＨは、２～１２、より好ましくは、３～７の範囲である。タンパク質溶液を、３０～１２０分間の範囲の時間にわたり攪拌する。この後、溶液を、２０００～２００００×ｇの速度で、１０～６０分間の時間にわたり遠心分離する。この後、上清のタンパク質含量を測定する。
【0189】
ｃ）乳化
１～１００ｍｇ／ｍＬの範囲のタンパク質含量を、２～１０の範囲のｐＨで、溶液中に懸濁させる。この後、溶液を、適切な油と混合する。タンパク質溶液の、最終混合物中ｗｔ％は、５０ｗｔ％～１００ｗｔ％の範囲である。油の、最終混合物中ｗｔ％は、０ｗｔ％～５０ｗｔ％の範囲である。混合物を、１～１０分間の範囲の時間にわたり攪拌する。測定用シリンダーを使用して、乳化相、水相、及び油相の全容量を観察する。相間の比は、乳化能を規定する。乳化相、水相、及び油相の全容量を、１～１００時間の範囲の時間にわたり記録する。容量が変化する速度は、乳化安定性を規定する。
１～１００ｍｇ／ｍＬの範囲のタンパク質含量を、２～１０の範囲のｐＨで、溶液中に懸濁させる。この後、溶液を、適切な油と混合する。タンパク質溶液の、最終混合物中ｗｔ％は、５０ｗｔ％～１００ｗｔ％の範囲である。油の、最終混合物中ｗｔ％は、０ｗｔ％～５０ｗｔ％の範囲である。混合物を、１～１０分間の範囲の時間にわたり攪拌する。測定用シリンダーを使用して、乳化相、水相、及び油相の全容量を観察する。相間の比は、乳化能を規定する。乳化相、水相、及び油相の全容量を、１～１００時間の範囲の時間にわたり記録する。容量が変化する速度は、乳化安定性を規定する。
【0190】
代替的に、目的のタンパク質の乳化特性は、エマルジョンの濁度に基づく。記載された通りに、エマルジョンを調製した後で、試料を採取し、適切な溶液（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）中に、１０～５００倍の範囲の希釈率で希釈する。希釈液の濁度を、適切な吸光度（例えば、ドデシル硫酸ナトリウムについて：５００ｎｍ）で測定する。次いで、吸光度、分光光度計の光路、油相の容量、エマルジョンが形成される前におけるタンパク質の濃度を使用して、乳化活性指数を計算する。乳化安定性も同様に、０～２４時間の範囲の時点でエマルジョン試料を採取し、この後、上記で記載された通りに、濁度を測定することにより決定されうる。時間経過にわたる乳化活性指数は、乳化安定性を指し示す。次に、エマルジョンを、６０～１００℃の温度範囲で、１０～６０分間の時間範囲にわたり加熱する。エマルジョンを冷却した後で、試料を採取し、前出で記載された通りに、その濁度を測定する。これらの試料の乳化活性指数を計算した後で、これらの値を、乳化安定性を計算するのに使用しうる。
【0191】
ｄ）ゲル化
３０～２００ｍｇ／ｍＬの範囲のタンパク質含量を使用する。塩（例えば、塩化ナトリウム）モル濃度は、０～２００ｍＭの間の範囲である。溶液のｐＨは、３～９の間の範囲である。溶液を、４５～１２０分間の温度範囲で、６０～１００℃の時間範囲にわたり加熱する。この後、ゲルを、室温へと冷却すると、レオロジー測定にかける準備ができている。
３０～２００ｍｇ／ｍＬの範囲のタンパク質含量を使用する。塩（例えば、塩化ナトリウム）モル濃度は、０～２００ｍＭの間の範囲である。溶液のｐＨは、３～９の間の範囲である。溶液を、４５～１２０分間の温度範囲で、６０～１００℃の時間範囲にわたり加熱する。この後、ゲルを、室温へと冷却すると、レオロジー測定にかける準備ができている。
【0192】
被験生成物：アレルギー誘発性
ＩｇＥ抗体を含有する、感作者又はアレルギー者の血清は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアレルギー誘発性研究を実施し、タンパク質のアレルギー誘発性を検討するのに使用される。
ＩｇＥ抗体を含有する、感作者又はアレルギー者の血清は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアレルギー誘発性研究を実施し、タンパク質のアレルギー誘発性を検討するのに使用される。
【0193】
ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）及び免疫ブロット法を使用して、タンパク質が、アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体に結合する能力を探索する。また、Ｇａｌ ｄ ２（ニワトリオボアルブミンの主要なアレルゲン）に対するアレルギー者に由来するＩｇＥ抗体を、免疫ブロット法アッセイにおいて使用して、Ｇａｌ ｄ ２エピトープも特徴づける。タンパク質がＩｇＥ抗体に結合する能力は、結合が、炎症性メディエーターの放出を引き起こすことを常に意味するわけではなく、したがって、アレルギー性反応を引き起こすことを常に意味するわけではない。
【0194】
タンパク質が、炎症性メディエーターの放出を誘導する能力は、通例、好塩基球活性化試験（ＢＡＴ）により探索する。アレルギー性個体に由来するＢＡＴ好塩基球を、アレルゲンへと曝露し、アレルゲンへの曝露時におけるヒスタミンの産生を観察する。
【0195】
参考文献
1. Duong-Ly, K. C. & Gabelli, S. B.Salting out of proteins using ammonium sulfate precipitation. in Methods inenzymology 541, 85-94 (Elsevier, 2014).
2. Abeyrathne, E., Lee, H. Y. & Ahn, D.U. Sequential separation of lysozyme, ovomucin, ovotransferrin, and ovalbuminfrom egg white. Poult. Sci. 93, 1001-1009 (2014).
3. Asenjo, J. A. & Andrews, B. A.Aqueous two-phase systems for protein separation: a perspective. J. Chromatogr.A 1218, 8826-8835 (2011).
4. Rito-Palomares, M. Practical applicationof aqueous two-phase partition to process development for the recovery ofbiological products. J. Chromatogr. B 807, 3-11 (2004).
5. Pereira, M. M. et al. Single-steppurification of ovalbumin from egg white using aqueous biphasic systems.Process Biochem. 51, 781-791 (2016).
6. Wen, C., Ge, T., Zhao, Y., Zhou, H.& Shi, L. Method for co-preparing ovalbumin and ovotransferrin. 7 (2019).
7. Meihu, M., Fang, G., Qun, H. &Xiaowei, Z. Method for jointly extracting a variety of proteins from egg white.11 (2013).
8. Haq, A., Lobo, P. I., Al-Tufail, M.,Rama, N. R. & Al-Sedairy, S. T. Immunomodulatory effect of Nigella sativaproteins fractionated by ion exchange chromatography. Int. J. Immunopharmacol.21, 283-295 (1999).
9. Medve, J., Lee, D. & Tjerneld, F.Ion-exchange chromatographic purification and quantitative analysis ofTrichoderma reesei cellulases cellobiohydrolase I, II and endoglucanase II byfast protein liquid chromatography. J. Chromatogr. A 808, 153-165 (1998).
10. Kopaciewicz, W., Rounds, M. A.,Fausnaugh, J. & Regnier, F. E. Retention model for high-performanceion-exchange chromatography. J. Chromatogr. A 266, 3-21 (1983).
11. Rossomando, E. F. [24] Ion-exchangechromatography. in Methods in enzymology 182, 309-317 (Elsevier, 1990).
12. Gooding, K. M. & Schmuck, M. N.Comparison of weak strong high-performance anion-exchange chromatography. J.Chromatogr. A 327, 139-146 (1985).
13. Awade, A. C., Moreau, S., Molle, D.,Brule, G. & Maubois, J.-L. Two-step chromatographic procedure for thepurification of hen egg white ovomucin, lysozyme, ovotransferrin and ovalbuminand characterization of purified proteins. J. Chromatogr. A 677, 279-288(1994).
14. Guerin-Dubiard, C. et al. Hen egg whitefractionation by ion-exchange chromatography. J. Chromatogr. A 1090, 58-67(2005).
15. Croguennec, T., Nau, F., Pezennec, S.& Brule, G. Simple rapid procedure for preparation of large quantities ofovalbumin. J. Agric. Food Chem. 48, 4883-4889 (2000).
16. Geng, F. et al. Co-purification ofchicken egg white proteins using polyethylene glycol precipitation andanion-exchange chromatography. Sep. Purif. Technol. 96, 75-80 (2012).
17. Soni, B., Trivedi, U. & Madamwar,D. A novel method of single step hydrophobic interaction chromatography for thepurification of phycocyanin from Phormidium fragile and its characterizationfor antioxidant property. Bioresour. Technol. 99, 188-194 (2008).
18. Shaltiel, S. Hydrophobicchromatography. in Methods in enzymology 34, 126-140 (Elsevier, 1974).
19. McCue, J. T. Theory and use ofhydrophobic interaction chromatography in protein purification applications. inMethods in enzymology 463, 405-414 (Elsevier, 2009).
20. Queiroz, J. A., Tomaz, C. T. &Cabral, J. M. S. Hydrophobic interaction chromatography of proteins. J.Biotechnol. 87, 143-159 (2001).
21. Gooding, D. L., Schmuck, M. N., Nowlan,M. P. & Gooding, K. M. Optimization of preparative hydrophobic interactionchromatographic purification methods. J. Chromatogr. A 359, 331-337 (1986).
22. Watanabe, E., Tsoka, S. & Asenjo,J. A. Selection of chromatographic protein purification operations based onphysicochemical properties. Ann. N. Y. Acad. Sci. 721, 348-364 (1994).
23. Narhi, L. O., Kita, Y. & Arakawa,T. Hydrophobic interaction chromatography in alkaline pH. Anal. Biochem. 182,266-270 (1989).
24. Mori, S. & Barth, H. G. Sizeexclusion chromatography. (Springer Science & Business Media, 2013).
25. Andre, A. S. A. H.-K. & Schwarm, K.S. Size-Exclusion Chromatography for Preparative Purification of Biomolecules.(2016).
26. Luo, J., Zhou, W., Su, Z., Ma, G. &Gu, T. Comparison of fully-porous beads and cored beads in size exclusionchromatography for protein purification. Chem. Eng. Sci. 102, 99-105 (2013).
27. Kato, A., Ibrahim, H. R., Watanabe, H.,Honma, K. & Kobayashi, K. Structural and gelling properties of dry-heatedegg white proteins. J. Agric. Food Chem. 38, 32-37 (1990).
28. Hua, Y., Cui, S. W., Wang, Q., Mine, Y.& Poysa, V. Heat induced gelling properties of soy protein isolatesprepared from different defatted soybean flours. Food Res. Int. 38, 377-385(2005).
29. Rawdkuen, S., Sai-Ut, S., Khamsorn, S.,Chaijan, M. & Benjakul, S. Biochemical and gelling properties of tilapiasurimi and protein recovered using an acid-alkaline process. Food Chem. 112,112-119 (2009).
30. Egelandsdal, B. Heat‐induced gelling insolutions of ovalbumin. J. Food Sci. 45, 570-574 (1980).
31. Shitamori, S., Kojima, E. &Nakamura, R. Changes in the heat-induced gelling properties of ovalbumin duringits conversion to S-ovalbumin. Agric. Biol. Chem. 48, 1539-1544 (1984).
32. Matsudomi, N., Ishimura, Y. & Kato,A. Improvement of gelling properties of ovalbumin by heating in dry state.Agric. Biol. Chem. 55, 879-881 (1991).
33. Hatta, H., Kitabatake, N. & Doi, E.Turbidity and hardness of a heat-induced gel of hen egg ovalbumin. Agric. Biol.Chem. 50, 2083-2089 (1986).
34. Shigeru, H. & Shuryo, N.Contribution of hydrophobicity, net charge and sulfhydryl groups to thermalproperties of ovalbumin. Can. Inst. Food Sci. Technol. J. 18, 290-295 (1985).
35. Creusot, N., Wierenga, P. A., Laus, M.C., Giuseppin, M. L. F. & Gruppen, H. Rheological properties of patatingels compared with β‐lactoglobulin, ovalbumin, and glycinin. J. Sci. FoodAgric. 91, 253-261 (2011).
36. Morr, C. V et al. A collaborative studyto develop a standardized food protein solubility procedure. J. Food Sci. 50,1715-1718 (1985).
37. Kato, A., Ibrahim, H. R., Watanabe, H.,Honma, K. & Kobayashi, K. New approach to improve the gelling and surfacefunctional properties of dried egg white by heating in dry state. J. Agric.Food Chem. 37, 433-437 (1989).
38. Jambrak, A. R., Mason, T. J., Lelas,V., Herceg, Z. & Herceg, I. L. Effect of ultrasound treatment on solubilityand foaming properties of whey protein suspensions. J. Food Eng. 86, 281-287(2008).
39. Bera, M. B. & Mukherjee, R. K.Solubility, emulsifying, and foaming properties of rice bran proteinconcentrates. J. Food Sci. 54, 142-145 (1989).
40. Sathe, S. K. & Salunkhe, D. K.Functional properties of the great northern bean (Phaseolus vulgaris L.)proteins: emulsion, foaming, viscosity, and gelation properties. J. Food Sci.46, 71-81 (1981).
41. Kato, A., Tsutsui, N., Matsudomi, N.,Kobayashi, K. & Nakai, S. Effects of partial denaturation on surfaceproperties of ovalbumin and lysozyme. Agric. Biol. Chem. 45, 2755-2760 (1981).
42. Pearce, K. N. & Kinsella, J. E.Emulsifying properties of proteins: evaluation of a turbidimetric technique. J.Agric. Food Chem. 26, 716-723 (1978).
43. Chobert, J. M., Sitohy, M. Z. &Whitaker, J. R. Solubility and emulsifying properties of caseins modifiedenzymatically by Staphylococcus aureus V8 protease. J. Agric. Food Chem. 36,220-224 (1988).
44. Mine, Y., Noutomi, T. & Haga, N.Emulsifying and Structural Properties of Ovalbumin. J. Agric. Food Chem. 39,443-446 (1991).
45. Yasumatsu, K. et al. Whipping andemulsifying properties of soybean products. Agric. Biol. Chem. 36, 719-727(1972).
46. Kato, A., Murata, K. & Kobayashi,K. Preparation and characterization of ovalbumin-dextran conjugate havingexcellent emulsifying properties. J. Agric. Food Chem. 36, 421-425 (1988).
47. Owen ward, Production of recombinantproteins by filamentous fungi Biotechnology Advances 30 (2012) 1119-1139
48. Marc. W.T. Werten et al. Production of protein-based polymers in Pichia pastoris,Biotechnology Advances 37 (2019) 642-666.
49. Klaas van t Riet & Johannes Tramper,Basic Bioreactor Design, Marcel Dekker Inc. ISBN 0-8247-8446-4 1991.
50. Albert. J.J. van Ooyen et al. Heterologous protein production in the yeast Kluyveromyces lactis,FEMS Yeast Res 6 (2006) 381-392.
51. Nisbet et al. (1981), The completeAmino-Acid sequence of hen ovalbumin; Eur. J. Biochem 115 (1981)
52. Yang et al. Cloning of a novelovalbumin gene from quail oviduct and its heterologous expression in Pichiapastoris. Journal of Basic Microbiology (2009), 49, S73-S78.
53. Krizkova L. et al. Expression ofJapanese quail ovalbumin in Saccharomyces cerevisiae. Folia Microbiol (Praha).1992;37(4):273-8
54. H. Visser et al. Development of amature fungal technology and production platform for industrial enzymes basedon a Myceliophthora thermophila isolate, previously known as Chrysosporiumlucknowense C1 Industrial Biotechnology. Published in Volume: 7 Issue 3: July1, 2011
55. O. Mercereau-Puijalon et al. Synthesis of a chicken ovalbumin-like protein in the yeast Saccharomycescerevisiae; Gene Volume 11, Issues 1-2, October 1980, Pages 163-167
56. Ito K. et al. Structuralcharacteristics of hen egg ovalbumin expressed in yeast Pichia pastoris Biosci.Biotechnol. Biochem. 69 (4), 755-761 (2005).
1. Duong-Ly, K. C. & Gabelli, S. B.Salting out of proteins using ammonium sulfate precipitation. in Methods inenzymology 541, 85-94 (Elsevier, 2014).
2. Abeyrathne, E., Lee, H. Y. & Ahn, D.U. Sequential separation of lysozyme, ovomucin, ovotransferrin, and ovalbuminfrom egg white. Poult. Sci. 93, 1001-1009 (2014).
3. Asenjo, J. A. & Andrews, B. A.Aqueous two-phase systems for protein separation: a perspective. J. Chromatogr.A 1218, 8826-8835 (2011).
4. Rito-Palomares, M. Practical applicationof aqueous two-phase partition to process development for the recovery ofbiological products. J. Chromatogr. B 807, 3-11 (2004).
5. Pereira, M. M. et al. Single-steppurification of ovalbumin from egg white using aqueous biphasic systems.Process Biochem. 51, 781-791 (2016).
6. Wen, C., Ge, T., Zhao, Y., Zhou, H.& Shi, L. Method for co-preparing ovalbumin and ovotransferrin. 7 (2019).
7. Meihu, M., Fang, G., Qun, H. &Xiaowei, Z. Method for jointly extracting a variety of proteins from egg white.11 (2013).
8. Haq, A., Lobo, P. I., Al-Tufail, M.,Rama, N. R. & Al-Sedairy, S. T. Immunomodulatory effect of Nigella sativaproteins fractionated by ion exchange chromatography. Int. J. Immunopharmacol.21, 283-295 (1999).
9. Medve, J., Lee, D. & Tjerneld, F.Ion-exchange chromatographic purification and quantitative analysis ofTrichoderma reesei cellulases cellobiohydrolase I, II and endoglucanase II byfast protein liquid chromatography. J. Chromatogr. A 808, 153-165 (1998).
10. Kopaciewicz, W., Rounds, M. A.,Fausnaugh, J. & Regnier, F. E. Retention model for high-performanceion-exchange chromatography. J. Chromatogr. A 266, 3-21 (1983).
11. Rossomando, E. F. [24] Ion-exchangechromatography. in Methods in enzymology 182, 309-317 (Elsevier, 1990).
12. Gooding, K. M. & Schmuck, M. N.Comparison of weak strong high-performance anion-exchange chromatography. J.Chromatogr. A 327, 139-146 (1985).
13. Awade, A. C., Moreau, S., Molle, D.,Brule, G. & Maubois, J.-L. Two-step chromatographic procedure for thepurification of hen egg white ovomucin, lysozyme, ovotransferrin and ovalbuminand characterization of purified proteins. J. Chromatogr. A 677, 279-288(1994).
14. Guerin-Dubiard, C. et al. Hen egg whitefractionation by ion-exchange chromatography. J. Chromatogr. A 1090, 58-67(2005).
15. Croguennec, T., Nau, F., Pezennec, S.& Brule, G. Simple rapid procedure for preparation of large quantities ofovalbumin. J. Agric. Food Chem. 48, 4883-4889 (2000).
16. Geng, F. et al. Co-purification ofchicken egg white proteins using polyethylene glycol precipitation andanion-exchange chromatography. Sep. Purif. Technol. 96, 75-80 (2012).
17. Soni, B., Trivedi, U. & Madamwar,D. A novel method of single step hydrophobic interaction chromatography for thepurification of phycocyanin from Phormidium fragile and its characterizationfor antioxidant property. Bioresour. Technol. 99, 188-194 (2008).
18. Shaltiel, S. Hydrophobicchromatography. in Methods in enzymology 34, 126-140 (Elsevier, 1974).
19. McCue, J. T. Theory and use ofhydrophobic interaction chromatography in protein purification applications. inMethods in enzymology 463, 405-414 (Elsevier, 2009).
20. Queiroz, J. A., Tomaz, C. T. &Cabral, J. M. S. Hydrophobic interaction chromatography of proteins. J.Biotechnol. 87, 143-159 (2001).
21. Gooding, D. L., Schmuck, M. N., Nowlan,M. P. & Gooding, K. M. Optimization of preparative hydrophobic interactionchromatographic purification methods. J. Chromatogr. A 359, 331-337 (1986).
22. Watanabe, E., Tsoka, S. & Asenjo,J. A. Selection of chromatographic protein purification operations based onphysicochemical properties. Ann. N. Y. Acad. Sci. 721, 348-364 (1994).
23. Narhi, L. O., Kita, Y. & Arakawa,T. Hydrophobic interaction chromatography in alkaline pH. Anal. Biochem. 182,266-270 (1989).
24. Mori, S. & Barth, H. G. Sizeexclusion chromatography. (Springer Science & Business Media, 2013).
25. Andre, A. S. A. H.-K. & Schwarm, K.S. Size-Exclusion Chromatography for Preparative Purification of Biomolecules.(2016).
26. Luo, J., Zhou, W., Su, Z., Ma, G. &Gu, T. Comparison of fully-porous beads and cored beads in size exclusionchromatography for protein purification. Chem. Eng. Sci. 102, 99-105 (2013).
27. Kato, A., Ibrahim, H. R., Watanabe, H.,Honma, K. & Kobayashi, K. Structural and gelling properties of dry-heatedegg white proteins. J. Agric. Food Chem. 38, 32-37 (1990).
28. Hua, Y., Cui, S. W., Wang, Q., Mine, Y.& Poysa, V. Heat induced gelling properties of soy protein isolatesprepared from different defatted soybean flours. Food Res. Int. 38, 377-385(2005).
29. Rawdkuen, S., Sai-Ut, S., Khamsorn, S.,Chaijan, M. & Benjakul, S. Biochemical and gelling properties of tilapiasurimi and protein recovered using an acid-alkaline process. Food Chem. 112,112-119 (2009).
30. Egelandsdal, B. Heat‐induced gelling insolutions of ovalbumin. J. Food Sci. 45, 570-574 (1980).
31. Shitamori, S., Kojima, E. &Nakamura, R. Changes in the heat-induced gelling properties of ovalbumin duringits conversion to S-ovalbumin. Agric. Biol. Chem. 48, 1539-1544 (1984).
32. Matsudomi, N., Ishimura, Y. & Kato,A. Improvement of gelling properties of ovalbumin by heating in dry state.Agric. Biol. Chem. 55, 879-881 (1991).
33. Hatta, H., Kitabatake, N. & Doi, E.Turbidity and hardness of a heat-induced gel of hen egg ovalbumin. Agric. Biol.Chem. 50, 2083-2089 (1986).
34. Shigeru, H. & Shuryo, N.Contribution of hydrophobicity, net charge and sulfhydryl groups to thermalproperties of ovalbumin. Can. Inst. Food Sci. Technol. J. 18, 290-295 (1985).
35. Creusot, N., Wierenga, P. A., Laus, M.C., Giuseppin, M. L. F. & Gruppen, H. Rheological properties of patatingels compared with β‐lactoglobulin, ovalbumin, and glycinin. J. Sci. FoodAgric. 91, 253-261 (2011).
36. Morr, C. V et al. A collaborative studyto develop a standardized food protein solubility procedure. J. Food Sci. 50,1715-1718 (1985).
37. Kato, A., Ibrahim, H. R., Watanabe, H.,Honma, K. & Kobayashi, K. New approach to improve the gelling and surfacefunctional properties of dried egg white by heating in dry state. J. Agric.Food Chem. 37, 433-437 (1989).
38. Jambrak, A. R., Mason, T. J., Lelas,V., Herceg, Z. & Herceg, I. L. Effect of ultrasound treatment on solubilityand foaming properties of whey protein suspensions. J. Food Eng. 86, 281-287(2008).
39. Bera, M. B. & Mukherjee, R. K.Solubility, emulsifying, and foaming properties of rice bran proteinconcentrates. J. Food Sci. 54, 142-145 (1989).
40. Sathe, S. K. & Salunkhe, D. K.Functional properties of the great northern bean (Phaseolus vulgaris L.)proteins: emulsion, foaming, viscosity, and gelation properties. J. Food Sci.46, 71-81 (1981).
41. Kato, A., Tsutsui, N., Matsudomi, N.,Kobayashi, K. & Nakai, S. Effects of partial denaturation on surfaceproperties of ovalbumin and lysozyme. Agric. Biol. Chem. 45, 2755-2760 (1981).
42. Pearce, K. N. & Kinsella, J. E.Emulsifying properties of proteins: evaluation of a turbidimetric technique. J.Agric. Food Chem. 26, 716-723 (1978).
43. Chobert, J. M., Sitohy, M. Z. &Whitaker, J. R. Solubility and emulsifying properties of caseins modifiedenzymatically by Staphylococcus aureus V8 protease. J. Agric. Food Chem. 36,220-224 (1988).
44. Mine, Y., Noutomi, T. & Haga, N.Emulsifying and Structural Properties of Ovalbumin. J. Agric. Food Chem. 39,443-446 (1991).
45. Yasumatsu, K. et al. Whipping andemulsifying properties of soybean products. Agric. Biol. Chem. 36, 719-727(1972).
46. Kato, A., Murata, K. & Kobayashi,K. Preparation and characterization of ovalbumin-dextran conjugate havingexcellent emulsifying properties. J. Agric. Food Chem. 36, 421-425 (1988).
47. Owen ward, Production of recombinantproteins by filamentous fungi Biotechnology Advances 30 (2012) 1119-1139
48. Marc. W.T. Werten et al. Production of protein-based polymers in Pichia pastoris,Biotechnology Advances 37 (2019) 642-666.
49. Klaas van t Riet & Johannes Tramper,Basic Bioreactor Design, Marcel Dekker Inc. ISBN 0-8247-8446-4 1991.
50. Albert. J.J. van Ooyen et al. Heterologous protein production in the yeast Kluyveromyces lactis,FEMS Yeast Res 6 (2006) 381-392.
51. Nisbet et al. (1981), The completeAmino-Acid sequence of hen ovalbumin; Eur. J. Biochem 115 (1981)
52. Yang et al. Cloning of a novelovalbumin gene from quail oviduct and its heterologous expression in Pichiapastoris. Journal of Basic Microbiology (2009), 49, S73-S78.
53. Krizkova L. et al. Expression ofJapanese quail ovalbumin in Saccharomyces cerevisiae. Folia Microbiol (Praha).1992;37(4):273-8
54. H. Visser et al. Development of amature fungal technology and production platform for industrial enzymes basedon a Myceliophthora thermophila isolate, previously known as Chrysosporiumlucknowense C1 Industrial Biotechnology. Published in Volume: 7 Issue 3: July1, 2011
55. O. Mercereau-Puijalon et al. Synthesis of a chicken ovalbumin-like protein in the yeast Saccharomycescerevisiae; Gene Volume 11, Issues 1-2, October 1980, Pages 163-167
56. Ito K. et al. Structuralcharacteristics of hen egg ovalbumin expressed in yeast Pichia pastoris Biosci.Biotechnol. Biochem. 69 (4), 755-761 (2005).
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】
【国際調査報告】