特表 2023-512043 ムコ多糖症ＩＶＡの治療

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-23

(54)【発明の名称】ムコ多糖症ＩＶＡの治療

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/864 20060101AFI20230315BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20230315BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20230315BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20230315BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230315BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230315BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230315BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230315BHJP

   A61P 39/02 20060101ALI20230315BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230315BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230315BHJP

【ＦＩ】

C12N15/864 100Z

C12N15/55 ZNA

C12N15/11 Z

C12N7/01

C12N5/10

C12N1/21

C12N1/15

C12N1/19

A61P39/02

A61K35/76

A61K48/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022546078

(86)(22)【出願日】2021-01-28

(85)【翻訳文提出日】2022-09-01

(86)【国際出願番号】 US2021015436

(87)【国際公開番号】W WO2021154956

(87)【国際公開日】2021-08-05

(31)【優先権主張番号】62/967,499

(32)【優先日】2020-01-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】518362720

【氏名又は名称】レジェンクスバイオ インコーポレーテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100097456

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 徹

(72)【発明者】

【氏名】デビン マクドガルド

(72)【発明者】

【氏名】スブハ カルムチル‐メレチル

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AA95X

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065CA31

4B065CA44

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZC371

4C084ZC372

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZC37

(57)【要約】

本明細書では、ムコ多糖症ＩＶＡ型（ＭＰＳ ＩＶＡ）を治療するための遺伝子治療の方法を提供しており、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を使用して、ＭＰＳ ＩＶＡの診断を受けたヒト対象の骨に、ヒトＮ－アセチルガラクトサミン－６－硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）を送達することを含む。また、本明細書では、当該遺伝子治療の方法で使用することができるｒＡＡＶと、当該ｒＡＡＶの作製方法も提供する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって：
（ａ）ＡＡＶキャプシド；及び
（ｂ）ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接するヒトＮ－アセチルガラクトサミン－６－硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含み、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、骨－肝臓タンデムプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、前記導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳをコードし、また、前記骨－肝臓タンデムプロモーターは、骨特異的プロモーターと、肝臓特異的プロモーターとを含み、また、前記骨－肝臓タンデムプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列に機能的に連結する、前記組換えアデノ随伴ウイルス。

【請求項2】

ｒＡＡＶであって：
（ａ）ＡＡＶキャプシド；及び
（ｂ）ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含み、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、骨－肝臓タンデムプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、前記導入遺伝子は、酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードし、また、前記骨－肝臓タンデムプロモーターは、骨特異的プロモーター及び肝臓特異的プロモーターを含み、及び前記骨－肝臓タンデムプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列に機能的に連結する、前記ｒＡＡＶ。

【請求項3】

前記酸性オリゴペプチドが、Ｄ８である、請求項２に記載のｒＡＡＶ。

【請求項4】

前記骨特異的プロモーターが、Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターである、請求項１～３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項5】

前記Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターが：
（ａ）配列番号２３と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号２３と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号２３と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号２３と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号２３と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号２３と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
請求項４に記載のｒＡＡＶ。

【請求項6】

前記Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターが、配列番号２３と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項４に記載のｒＡＡＶ。

【請求項7】

前記骨特異的プロモーターが、最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターである、請求項１～３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項8】

前記最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターが：
（ａ）配列番号２４と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号２４と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号２４と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号２４と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号２４と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号２４と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
請求項７に記載のｒＡＡＶ。

【請求項9】

前記最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターが、配列番号２４と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載のｒＡＡＶ。

【請求項10】

前記肝臓特異的プロモーターが、ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーターである、請求項１～９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項11】

前記ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーターが：
（ａ）配列番号２２と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号２２と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号２２と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号２２と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号２２と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号２２と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
請求項１０に記載のｒＡＡＶ。

【請求項12】

前記ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーターが、配列番号２２と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載のｒＡＡＶ。

【請求項13】

前記骨－肝臓タンデムプロモーターが、ＡｐｏＥエンハンサーをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項14】

前記骨－肝臓タンデムプロモーターが、ＡｐｏＥエンハンサーを含む肝制御領域をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項15】

前記ＡｐｏＥエンハンサーが：
（ａ）配列番号２０と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号２０と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号２０と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号２０と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号２０と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号２０と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
請求項１３または１４に記載のｒＡＡＶ。

【請求項16】

前記ＡｐｏＥエンハンサーが、配列番号２０と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１３または１４に記載のｒＡＡＶ。

【請求項17】

前記肝制御領域が：
（ａ）配列番号１９と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号１９と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号１９と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号１９と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号１９と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号１９と、少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
請求項１４に記載のｒＡＡＶ。

【請求項18】

前記肝制御領域が、配列番号１９と、少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１４に記載のｒＡＡＶ。

【請求項19】

前記骨－肝臓タンデムプロモーターが、ＬＢＴＰ１プロモーターである、請求項１～３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項20】

前記ＬＢＴＰ１プロモーターが：
（ａ）配列番号１７と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号１７と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号１７と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号１７と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号１７と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号１７と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
請求項１９に記載のｒＡＡＶ。

【請求項21】

前記ＬＢＴＰ１プロモーターが、配列番号１７と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載のｒＡＡＶ。

【請求項22】

前記骨－肝臓タンデムプロモーターが、ＬＢＴＰ２プロモーターである、請求項１～３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項23】

前記ＬＢＴＰ２プロモーターが：
（ａ）配列番号１８と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号１８と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号１８と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号１８と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号１８と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号１８と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
請求項２２に記載のｒＡＡＶ。

【請求項24】

前記ＬＢＴＰ２プロモーターが、配列番号１８と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項２２に記載のｒＡＡＶ。

【請求項25】

ｒＡＡＶであって：
（ａ）ＡＡＶキャプシド；及び
（ｂ）ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含み、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、前記導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳをコードし、及び前記Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列に機能的に連結する、前記ｒＡＡＶ。

【請求項26】

ｒＡＡＶであって：
（ａ）ＡＡＶキャプシド；及び
（ｂ）ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含み、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、前記導入遺伝子は、酸性オリゴペプチドに融合するｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードし、及び前記Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列に機能的に連結する、前記ｒＡＡＶ。

【請求項27】

前記酸性オリゴペプチドが、Ｄ８である、請求項２６に記載のｒＡＡＶ。

【請求項28】

前記Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターが：
（ａ）配列番号２３と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号２３と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号２３と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号２３と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号２３と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号２３と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
請求項２５～２７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項29】

前記Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターが、配列番号２３と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項２５～２７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項30】

ｒＡＡＶであって：
（ａ）ＡＡＶキャプシド；及び
（ｂ）ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含み、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、前記導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳをコードし、及び前記最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列に機能的に連結する、前記ｒＡＡＶ。

【請求項31】

ｒＡＡＶであって：
（ａ）ＡＡＶキャプシド；及び
（ｂ）ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含み、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、前記導入遺伝子は、酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードし、及び前記最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列に機能的に連結する、前記ｒＡＡＶ。

【請求項32】

前記酸性オリゴペプチドが、Ｄ８である、請求項３１に記載のｒＡＡＶ。

【請求項33】

前記最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターが：
（ａ）配列番号２４と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号２４と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号２４と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号２４と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号２４と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号２４と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
請求項３０～３２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項34】

前記最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターが、配列番号２４と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項３０～３２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項35】

前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、イントロンをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１～３４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項36】

前記イントロンが、キメライントロンである、請求項３５に記載のｒＡＡＶ。

【請求項37】

前記キメライントロンが、β－グロビン／Ｉｇイントロンである、請求項３６に記載のｒＡＡＶ。

【請求項38】

前記β－グロビン／Ｉｇイントロンが：
（ａ）配列番号１０と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号１０と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号１０と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号１０と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号１０と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号１０と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
請求項３７に記載のｒＡＡＶ。

【請求項39】

前記β－グロビン／Ｉｇイントロンが、配列番号１０と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項３７に記載のｒＡＡＶ。

【請求項40】

前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列をコドン最適化する、請求項１～３９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項41】

前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列では、ＣｐＧ部位が枯渇している、請求項１～４０のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項42】

前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列が：
（ａ）配列番号１２と、少なくとも８０％が同一である；
（ｂ）配列番号１２と、少なくとも８５％が同一である；
（ｃ）配列番号１２と、少なくとも９０％が同一である；
（ｄ）配列番号１２と、少なくとも９５％が同一である；
（ｅ）配列番号１２と、少なくとも９８％が同一である；または
（ｆ）は配列番号１２と、１００％同一である、
ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１～４１のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項43】

前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１２と、１００％同一であるｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１～４１のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項44】

前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列が、ポリアデニル化シグナルを含む、請求項１～４３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項45】

前記ポリアデニル化シグナルが、β－グロビンポリアデニル化シグナルである、請求項４４に記載のｒＡＡＶ。

【請求項46】

前記β－グロビンポリアデニル化シグナルが：
（ａ）配列番号２５と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号２５と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号２５と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号２５と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号２５と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号２５と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
請求項４５に記載のｒＡＡＶ。

【請求項47】

前記β－グロビンポリアデニル化シグナルが、配列番号２５と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項４５に記載のｒＡＡＶ。

【請求項48】

前記ポリアデニル化シグナルが、ウサギグロビンポリＡ部位である、請求項４４に記載のｒＡＡＶ。

【請求項49】

前記ウサギグロビンポリＡ部位が：
（ａ）配列番号９と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号９と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号９と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号９と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号９と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号９と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
請求項４８に記載のｒＡＡＶ。

【請求項50】

前記ウサギグロビンポリＡ部位が、配列番号９と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項４８に記載のｒＡＡＶ。

【請求項51】

前記ＡＡＶが、ＡＡＶ８である、請求項１～５０のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項52】

前記ＡＡＶが、ＡＡＶ９である、請求項１～５０のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項53】

請求項１～５２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶと、医薬として許容可能な担体とを含む医薬組成物。

【請求項54】

ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、骨－肝臓タンデムプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、前記導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳをコードし、また、前記骨－肝臓タンデムプロモーターは、骨特異的プロモーターと、肝臓特異的プロモーターとを含み、及び前記骨－肝臓タンデムプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列に機能的に連結する、前記ポリヌクレオチド。

【請求項55】

ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、骨－肝臓タンデムプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、前記導入遺伝子は、酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードし、また、前記骨－肝臓タンデムプロモーターは、骨特異的プロモーターと、肝臓特異的プロモーターとを含み、及び前記骨－肝臓タンデムプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列に機能的に連結する、前記ポリヌクレオチド。

【請求項56】

前記酸性オリゴペプチドが、Ｄ８である、請求項５５に記載のポリヌクレオチド。

【請求項57】

前記骨特異的プロモーターが、Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターである、請求項５４～５６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項58】

前記Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターが：
（ａ）配列番号２３と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号２３と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号２３と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号２３と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号２３と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号２３と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
請求項５７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項59】

前記Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターが、配列番号２３と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項５７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項60】

前記骨特異的プロモーターが、最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターである、請求項５４～５６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項61】

前記最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターが：
（ａ）配列番号２４と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号２４と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号２４と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号２４と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号２４と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号２４と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
請求項６０に記載のポリヌクレオチド。

【請求項62】

前記最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターが、配列番号２４と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項６０に記載のポリヌクレオチド。

【請求項63】

前記肝臓特異的プロモーターが、ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーターである、請求項５４～６２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項64】

前記ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーターが：
（ａ）配列番号２２と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号２２と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号２２と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号２２と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号２２と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号２２と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
請求項６３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項65】

前記ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーターが、配列番号２２と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項６３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項66】

前記骨－肝臓タンデムプロモーターが、ＡｐｏＥエンハンサーをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項５４～６５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項67】

前記骨－肝臓タンデムプロモーターが、ＡｐｏＥエンハンサーを含む肝制御領域をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項５４～６５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項68】

前記ＡｐｏＥエンハンサーが：
（ａ）配列番号２０と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号２０と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号２０と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号２０と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号２０と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号２０と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
請求項６６または６７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項69】

前記ＡｐｏＥエンハンサーが、配列番号２０と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項６６または６７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項70】

前記肝制御領域が：
（ａ）配列番号１９と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号１９と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号１９と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号１９と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号１９と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号１９と、少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
請求項６７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項71】

前記肝制御領域が、配列番号１９と、少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項６７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項72】

前記骨－肝臓タンデムプロモーターが、ＬＢＴＰ１プロモーターである、請求項５４～５６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項73】

前記ＬＢＴＰ１プロモーターが：
（ａ）配列番号１７と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号１７と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号１７と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号１７と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号１７と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号１７と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
請求項７２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項74】

前記ＬＢＴＰ１プロモーターが、配列番号１７と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項７２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項75】

前記骨－肝臓タンデムプロモーターが、ＬＢＴＰ２プロモーターである、請求項５４～５６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項76】

前記ＬＢＴＰ２プロモーターが：
（ａ）配列番号１８と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号１８と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号１８と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号１８と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号１８と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号１８と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
請求項７５に記載のポリヌクレオチド。

【請求項77】

前記ＬＢＴＰ２プロモーターが、配列番号１８と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項７５に記載のポリヌクレオチド。

【請求項78】

ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、前記導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳをコードし、及び前記Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列に機能的に連結する、前記ポリヌクレオチド。

【請求項79】

ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、前記導入遺伝子は、酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳをコードし、及び前記Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列に機能的に連結する、前記ポリヌクレオチド。

【請求項80】

前記酸性オリゴペプチドが、Ｄ８である、請求項７９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項81】

前記Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターが：
（ａ）配列番号２３と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号２３と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号２３と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号２３と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号２３と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号２３と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
請求項７８～８０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項82】

前記Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターが、配列番号２３と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項７８～８０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項83】

ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、前記導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳをコードし、及び前記最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列に機能的に連結する、前記ポリヌクレオチド。

【請求項84】

ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、前記導入遺伝子は、酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードし、及び前記最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列に機能的に連結する、前記ポリヌクレオチド。

【請求項85】

前記酸性オリゴペプチドが、Ｄ８である、請求項８４に記載のポリヌクレオチド。

【請求項86】

前記最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターが：
（ａ）配列番号２４と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号２４と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号２４と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号２４と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号２４と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号２４と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
請求項８３～８５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項87】

前記最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターが、配列番号２４と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項８３～８５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項88】

前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、イントロンをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項５４～８７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項89】

前記イントロンが、キメライントロンである、請求項８８に記載のポリヌクレオチド。

【請求項90】

前記キメライントロンが、β－グロビン／Ｉｇイントロンである、請求項８９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項91】

前記β－グロビン／Ｉｇイントロンが：
（ａ）配列番号１０と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号１０と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号１０と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号１０と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号１０と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号１０と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
請求項９０に記載のポリヌクレオチド。

【請求項92】

前記β－グロビン／Ｉｇイントロンが、配列番号１０と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項９０に記載のポリヌクレオチド。

【請求項93】

前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列をコドン最適化する、請求項５４～９２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項94】

前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列では、ＣｐＧ部位が枯渇している、請求項５４～９３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項95】

前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列が：
（ａ）配列番号１２と、少なくとも８０％が同一である；
（ｂ）配列番号１２と、少なくとも８５％が同一である；
（ｃ）配列番号１２と、少なくとも９０％が同一である；
（ｄ）配列番号１２と、少なくとも９５％が同一である；
（ｅ）配列番号１２と、少なくとも９８％が同一である；または
（ｆ）は配列番号１２と、１００％同一である、
ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項５４～９４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項96】

前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１２と、１００％同一であるｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項５４～９４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項97】

前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列が、ポリアデニル化シグナルを含む、請求項５４～９６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項98】

前記ポリアデニル化シグナルが、β－グロビンポリアデニル化シグナルである、請求項９７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項99】

前記β－グロビンポリアデニル化シグナルが：
（ａ）配列番号２５と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号２５と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号２５と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号２５と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号２５と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号２５と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
請求項９８に記載のポリヌクレオチド。

【請求項100】

前記β－グロビンポリアデニル化シグナルが、配列番号２５と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項９８に記載のポリヌクレオチド。

【請求項101】

前記ポリアデニル化シグナルが、ウサギグロビンポリＡ部位である、請求項９７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項102】

前記ウサギグロビンポリＡ部位が：
（ａ）配列番号９と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号９と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号９と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号９と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号９と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号９と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
請求項１０１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項103】

前記ウサギグロビンポリＡ部位が、配列番号９と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１０１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項104】

前記ＡＡＶが、ＡＡＶ８である、請求項５４～１０３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項105】

前記ＡＡＶが、ＡＡＶ９である、請求項５４～１０３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項106】

請求項５４～１０５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶプラスミド。

【請求項107】

請求項５４～１０５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または請求項１０６に記載のｒＡＡＶプラスミドを含むエクスビボ細胞。

【請求項108】

ｒＡＡＶを作製する方法であって、エクスビボ細胞を、請求項１０６に記載のｒＡＡＶプラスミドと、ＡＡＶ遺伝子Ｒｅｐ、Ｃａｐ、ＶＡ、Ｅ２ａ、及びＥ４のヌクレオチド配列を集合的に含む１つ以上のヘルパープラスミドとでトランスフェクトすることを含む、前記方法。

【請求項109】

ムコ多糖症ＩＶＡ型（ＭＰＳ ＩＶＡ）の診断を受けたヒト対象を治療する方法であって、請求項１～５２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ、または請求項５３の医薬組成物をヒト対象に投与することを含む、前記方法。

【請求項110】

ＭＰＳ ＩＶＡの診断を受けたヒト対象を治療する方法であって、前記ヒト対象に対して、請求項１～２４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ、または請求項１～２４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶに直接的または間接的に従属している場合には請求項３５～５２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶを投与することで、ｈＧＡＬＮＳ、または酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質の治療有効量を、前記ヒト対象の骨及び肝臓に送達する、ことを含む前記方法。

【請求項111】

前記ｈＧＡＬＮＳまたは融合タンパク質を、肝細胞で産生して、同細胞から分泌することで、マンノース－６－リン酸でグリコシル化する、請求項１１０に記載の方法。

【請求項112】

ＭＰＳ ＩＶＡの診断を受けたヒト対象を治療する方法であって、前記ヒト対象に対して、請求項２５～３４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ、または請求項２５～３４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶに直接的または間接的に従属している場合には請求項３５～５２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶを投与することで、ｈＧＡＬＮＳ、または酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質の治療有効量を、前記ヒト対象の骨に送達する、ことを含む前記方法。

【請求項113】

ｒＡＡＶであって：
（ａ）ＡＡＶキャプシド；及び
（ｂ）ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含み、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、プロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、前記導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳをコードし、また、前記プロモーターをコードする前記ヌクレオチド配列を、前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列に機能的に連結し、及び前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列は：
（ａ）配列番号２７と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２７と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号２７と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号２７と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号２７と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列；または
（ｆ）配列番号２７と、１００％同一であるヌクレオチド配列、
を含む、前記ｒＡＡＶ。

【請求項114】

前記ＡＡＶキャプシドが、ＡＡＶ８キャプシド、またはそのバリアントである、請求項１３に記載のｒＡＡＶ。

【請求項115】

前記ＡＡＶキャプシドが、ＡＡＶ９キャプシド、またはそのバリアントである、請求項１３に記載のｒＡＡＶ。

【請求項116】

ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、プロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、及び前記プロモーターをコードする前記ヌクレオチド配列を、前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列に機能的に連結する、前記ポリヌクレオチド。

【請求項117】

前記プロモーターが、ＴＢＧである、請求項１１３～１１５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ、または請求項１１６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項118】

前記プロモーターをコードする前記ヌクレオチド配列が：
（ａ）配列番号６と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号６と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号６と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号６と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号６と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列；または
（ｆ）配列番号６と、１００％同一であるヌクレオチド配列、
を含む、請求項１１３～１１５または１１７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ、または請求項１１６～１１７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項119】

前記プロモーターが、ＣＡＧである、請求項１１３～１１５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ、または請求項１１６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項120】

前記プロモーターをコードする前記ヌクレオチド配列が：
（ａ）配列番号２８と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２８と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号２８と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号２８と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号２８と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列；または
（ｆ）配列番号２８と、１００％同一であるヌクレオチド配列、
を含む、請求項１１３～１１５または１１９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ、または請求項１１６または１１９に記載のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項121】

前記プロモーターが、ＬＳＰＸ１である、請求項１１３～１１５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ、または請求項１１６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項122】

前記プロモーターをコードする前記ヌクレオチド配列が：
（ａ）配列番号１３と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１３と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号１３と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号１３と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号１３と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列；または
（ｆ）配列番号１３と、１００％同一であるヌクレオチド配列、
を含む、請求項１１３～１１５または１２１のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ、または請求項１１６または１２１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項123】

前記プロモーターが、ＬＭＴＰ６である、請求項１１３～１１５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ、または請求項１１６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項124】

前記プロモーターをコードする前記ヌクレオチド配列が：
（ａ）配列番号１６と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１６と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号１６と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号１６と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号１６と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列；または
（ｆ）配列番号１６と、１００％同一であるヌクレオチド配列、
を含む、請求項１１３～１１５または１２３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ、または請求項１１６または１２４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項125】

前記プロモーターが、ＬＢＴＰ２である、請求項１１３～１１５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ、または請求項１１６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項126】

前記プロモーターをコードする前記ヌクレオチド配列が：
（ａ）配列番号１８と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１８と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号１８と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号１８と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号１８と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列；または
（ｆ）配列番号１８と、１００％同一であるヌクレオチド配列、
を含む、請求項１１３～１１５または１２５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ、または請求項１１６または１２５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項127】

前記ＡＡＶ－ＩＴＲが、ＡＡＶ２－ＩＴＲである、請求項１１３～１１５または１１７～１２６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ、または請求項１１６～１２６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項128】

請求項１１３～１１５または１１７～１２７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶと、医薬として許容可能な担体とを含む医薬組成物。

【請求項129】

ムコ多糖症ＩＶＡ型（ＭＰＳ ＩＶＡ）の診断を受けたヒト対象を治療する方法であって、ヒト対象に対して、請求項１１３～１１５または１１７～１２７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ、または請求項１２８に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０２０年１月２９日出願の米国仮出願第６２／９６７，４９９号の利益を主張し、当該出願の全内容を、参照により、本明細書で援用する。

【0002】

電子的に提出した配列表の援用
本願は、本出願と一緒に提出した、２０２０年１月２１日に作成した、４７，６０１バイトのサイズを有する「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿１２６５６－１３０－２２８．ｔｘｔ」の名称を付したテキストファイルの配列表を、参照により、援用する。

【0003】

１．分野
本分野は、ムコ多糖症ＩＶＡ型（ＭＰＳ ＩＶＡ）の治療に関する。本明細書では、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が関係するＭＰＳ ＩＶＡを治療するための方法及び組成物を提供する。

【背景技術】

【0004】

２．背景
ムコ多糖症ＩＶＡ型（ＭＰＳ ＩＶＡ、モルキオＡ症候群）は、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－硫酸スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の欠損を原因とする常染色体劣性リソソーム貯蔵障害である（Ｋｈａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．，２０１７；１２０（１－２）：７８－９５）。この酵素の欠損により、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、コンドロイチン６－硫酸（Ｃ６Ｓ）、及びケラタン硫酸（ＫＳ）が進行性に蓄積することで、不完全骨化、及び発育の継続的不均衡とともに、全身性かつ特有の骨格形成異常に至り、その結果、短頸及び短躯、頸髄圧迫、気管閉塞、鳩胸、関節弛緩、脊柱後側弯、外反股、ならびに外反膝が認められる。この疾患の他の臨床症状としては、難聴、心弁膜症及び角膜混濁を挙げることができる。患者において、２００個を超える異なる変異が特定されており、米国内の有病率は、２５０，０００人に１人ほどである。

【0005】

重症型の患者は、治療しなければ、２０代または３０代で、気道障害、頸髄合併症または心弁膜症で死亡する（Ｋｈａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．，２０１７；１２０（１－２）：７８－９５、Ｔｏｍａｔｓｕ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．２０１６；１１７，１５０－１５６、Ｍｏｎｔａｎｏ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．２００７；３０，１６５－１７４、Ｔｏｍａｔｓｕ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｓ．Ｒｅｐ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｄｉｓｏｒｄ．２０１２；２０１２，６５－７７、Ｐｉｚａｒｒｏ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．２０１６；１０２，ｅ３２９－３３１）。現在、臨床診療において、ＭＰＳ ＩＶＡ患者に対する支持療法として、酵素補充療法（ＥＲＴ）、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）及び様々な外科的介入が利用可能である。２０１４年２月、ＦＤＡは、ＥＲＴ（エロスルファーゼアルファ）の使用を認可した（Ｈｅｎｄｒｉｋｓｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ．，２０１４；３７（６）：９７９－９９０）。現在の標準ケアであるＥＲＴでは、ＭＰＳ ＩＶＡ患者の軟組織病態と日常生活活動（ＡＤＬ）が部分的に改善されるが、これらの療法は、それらの病変の無血管の特徴により、骨及び軟骨においては、及ぼす作用が非常に限られている。ＥＲＴの現時点での制約としては、ｉ）週に１回、５～６時間注射する必要があること、ｉｉ）薬物が循環血液から速やかに除去されること、ｉｉｉ）治療費が非常に高額であること（患者１人当たり年間５００，０００ドル）、及びｖ）薬物の骨への浸透が限定的であることがある（Ａｌｇａｈｉｍ ａｎｄ Ａｌｍａｓｓｉ，Ｔｈｅｒ Ｃｌｉｎ Ｒｉｓｋ Ｍａｎａｇ．，２０１３；９：４５－５３、Ｔｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１１；１２：９３１－９４５）。ＭＰＳ ＩＶＡに関しては、現時点では、組み換えヒトＮ－アセチルガラクトサミン－６－硫酸スルファターゼ（ｒｈＧＡＬＮＳ：Ｖｉｍｉｚｉｍ（商標）、エロスルファーゼアルファ）を週に１回投与しても、ＭＰＳ ＩＶＡ患者の骨及び軟骨の病変に対する作用は得られない。ＨＳＣＴは、骨に対して、ＥＲＴよりも大きい作用を及ぼし得るが、この細胞ベースの療法は、すべての患者に適用可能であるとは限らない。適合ドナーが限られており、有効な治療を行うには年齢制限があり、精通している施設が不足しており、その施術には、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、感染症及びその他の合併症などの死亡リスクがあるからである（Ｔｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ Ｄｅｖｅｌ Ｔｈｅｒ．，２０１５；９：１９３７－１９５３）。この意味では、ＭＰＳ ＩＶＡ用の新規薬物、特に、ＭＰＳ ＩＶＡ患者の骨格形成異常を治療するための新規薬物が至急必要である。

【0006】

遺伝子治療は、１回限りの永続的な療法となる可能性がある。ウイルスベクター及び非ウイルスベクターを用いた遺伝子移入の非臨床試験の多くでは、ＭＰＳ疾患におけるこの療法の潜在的な治療能力が示された。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、治療用遺伝子を標的臓器に送達するための魅力的なビヒクルである。そのベクターは、導入遺伝子産物を長期的に発現させるとともに、免疫原性のリスクが低いからである。これらの利点により、ＭＰＳ Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ及びＶＩ用として、ＡＡＶを介した遺伝子治療の臨床試験が行われているか、または予定されている（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ；Ｓａｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｏｒｐｈａｎ Ｄｒｕｇｓ，２０１６；４，９４１－９５１）。充分な酵素を軟骨病変及び成長板領域に送達すると、ＭＰＳ ＩＶＡ患者の骨格形成異常が解消される可能性がある。我々の以前の研究では、ＡＡＶ２ベクターを用いてＧＡＬＮＳ遺伝子を移入すると、組織において治療的な酵素レベルが得られることが示された（Ａｌｍｅｃｉｇａ－Ｄｉａｚ，Ｃ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．２０１８；８４，５４５－５５１）が、ＡＡＶを介した遺伝子治療が、ＭＰＳ ＩＶＡマウスモデルの骨格病変を矯正することを示した試験は現時点では存在しない。

【0007】

フルオロフォアＡｌｅｘａ－４８８にコンジュゲートしたｒｈＧＡＬＮＳを１０ｍｇ／ｋｇ、野生型マウスに、１日おきに５回静脈内注射したところ、その酵素が成長板及び関節軟骨で検出されたことをＤｖｏｒａｋ－Ｅｗｅｌｌらは示した（Ｄｖｏｒａｋ－Ｅｗｅｌｌ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１０；５，ｅ１２１９４）。この知見から、高レベルの循環酵素によって、酵素を軟骨病変の中まで浸透させることができることを示している。ＡＡＶ８ベクターが、肝臓への形質導入効率のよいこと、及び組み換えＡＡＶ８ベクターを使用すると、初期世代のＡＡＶ２ベクターと比較して、肝臓への遺伝子移入の効率性が１０～１００倍高いことが示された（Ｇａｏ，Ｇ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００２；９９，１１８５４－１１８５９）。肝臓特異的プロモーターの利用により、宿主の免疫応答が有意に軽減された。肝臓指向性ＡＡＶ遺伝子治療は、ユビキタスプロモーターと比べて、導入遺伝子産物に対して免疫寛容を誘導することが報告されているからである（Ｍｉｎｇｏｚｚｉ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００３；１１１，１３４７－１３５６、Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００４；９，２３１－２４０、Ｄｏｂｒｚｙｎｓｋｉ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００６；１０３，４５９２－４５９７、Ｃａｏ，Ｏ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２００７；１１０，１１３２－１１４０、Ｍｉｎｇｏｚｚｉ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２００７；１１０，２３３４－２３４１）。この免疫応答の抑制により、導入遺伝子産物の長期的な発現をもたらすことができる（Ｗａｎｇ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０００；１，１５４－１５８、Ｓｏｎｄｈｉ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００５；１２，１６１８－１６３２）。肝臓特異的プロモーターと組み合わせた組み換えＡＡＶ８ベクターによって、ＭＰＳ ＶＩのマウスモデル及びネコモデルの骨格病変に対する作用が大きくなったことが以前の研究によって示された（Ｔｅｓｓｉｔｏｒｅ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００８；１６，３０－３７、Ｃｏｔｕｇｎｏ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１１；１９，４６１－４６９）。

【0008】

ＭＰＳ ＩＶＡ患者では、ＭＰＳのすべての型の中で最も重篤な骨格異常が見られ（Ｍｅｌｂｏｕｃｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．２０１８；１２４，１－１０）、骨ターゲティング型の方策であれば、軟骨領域に浸透するのに充分な酵素を供給できる。短い酸性アミノ酸タグをいくつかの酵素のＮ末端またはＣ末端に結合することで、骨へのターゲティングが増強されることを我々は以前に示した（Ｍｏｎｔａｎｏ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．２００８；９４，１７８－１８９、Ｔｏｍａｔｓｕ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０；１８，１０９４－１１０２）。ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）は、骨における主な無機成分であり、カルシウムイオンを含む正帯電表面を有する。骨のシアロタンパク質及びオステオポンチンは、ＨＡに結合し、これらのリン酸化酸性糖タンパク質は、負電荷を持つ酸性アミノ酸（Ａｓｐ及びＧｌｕ）の反復配列を有し、骨ターゲティング型の方策の標的候補となり得る（Ｏｌｄｂｅｒｇ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８８；２６３，１９４３０－１９４３２、Ｋａｓｕｇａｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．２０００；１５，９３６－９４３）。

【0009】

ｒＡＡＶは、その安全性プロファイル、汎用性、及び特定の機能に合わせて操作できる点により、多くの疾患における広範な遺伝子治療用途で利用できる（例えば、Ｎａｓｏ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＤｒｕｇｓ．２０１７；３１（４）：３１７－３３４を参照されたい）。神経筋疾患、眼疾患及び免疫疾患を含む広範な遺伝子疾患に関して、ＡＡＶ遺伝子治療を用いた臨床試験が行われている（例えば、Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０１６，３：１６０３４を参照されたい）。

【0010】

本明細書における参照文献の引用は、それらが本開示の先行技術であると認めるものとしては解釈してならない。

【発明の概要】

【0011】

３．概要
本明細書では、ムコ多糖症ＩＶＡ型（ＭＰＳ ＩＶＡ）を治療するための遺伝子治療の方法を提供しており、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を用いて、ＭＰＳ ＩＶＡの診断を受けたヒト対象の骨に、ヒトＮ－アセチルガラクトサミン－６－硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）を送達することを含む。また、本明細書では、当該遺伝子治療の方法で使用できるｒＡＡＶと、当該ｒＡＡＶの作製方法と、当該ｒＡＡＶを作製する際に使用できるポリヌクレオチド、プラスミド及び細胞を提供する。

【0012】

ある態様では、本明細書では：（ａ）ＡＡＶキャプシド（例えば、ＡＡＶ８キャプシド、またはＡＡＶ９キャプシド）；及び、（ｂ）ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）（例えば、ＡＡＶ２－ＩＴＲ、ＡＡＶ８－ＩＴＲ、またはＡＡＶ９－ＩＴＲ）が隣接するヒトＮ－アセチルガラクトサミン－６－硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）発現カセットを含む組み換えＡＡＶゲノムを含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供し、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、酸性オリゴペプチド（例えば、Ｄ８）に融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードする導入遺伝子などの導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、また、当該肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列は、上記した融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結している。さらに特定の実施形態では、当該肝臓特異的プロモーターは、サイロキシン結合性グロブリン（ＴＢＧ）プロモーターである。

【0013】

別の態様では、本明細書では：（ａ）ＡＡＶキャプシド（例えば、ＡＡＶ８キャプシド、またはＡＡＶ９キャプシド）；及び、（ｂ）ＡＡＶ－ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２－ＩＴＲ、ＡＡＶ８－ＩＴＲ、またはＡＡＶ９－ＩＴＲ）が隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組み換えＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列と、当該ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含み、また、当該肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列が、当該ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結している。特定の実施形態では、当該肝臓特異的プロモーターは、ＴＢＧプロモーターである。

【0014】

別の態様では、本明細書では：（ａ）ＡＡＶキャプシド（例えば、ＡＡＶ８キャプシド）；及び（ｂ）ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接するヒトＮ－アセチルガラクトサミン－６－硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供し、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、骨－肝臓タンデムプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列とを含み、また、当該導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳをコードし、また、当該骨－肝臓タンデムプロモーターは、骨特異的プロモーターと、肝臓特異的プロモーターとを含み、また、当該骨－肝臓タンデムプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。

【0015】

別の態様では、本明細書では：（ａ）ＡＡＶキャプシド（例えば、ＡＡＶ８キャプシド）；及び（ｂ）ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、骨－肝臓タンデムプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列とを含み、また、当該導入遺伝子は、酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードし、また、当該骨－肝臓タンデムプロモーターは、骨特異的プロモーターと、肝臓特異的プロモーターとを含み、また、当該骨－肝臓タンデムプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。特定の実施形態では、当該酸性オリゴペプチドは、Ｄ８である。

【0016】

特定の実施形態では、当該骨特異的プロモーターは、Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターである。特定の実施形態では、当該Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２３と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２３と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0017】

特定の実施形態では、当該骨特異的プロモーターは、最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターである。特定の実施形態では、当該最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２４と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２４と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0018】

特定の実施形態では、当該肝臓特異的プロモーターは、ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーターである。特定の実施形態では、当該ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーターは、配列番号２２と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーターは、配列番号２２と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0019】

特定の実施形態では、当該骨－肝臓タンデムプロモーターは、ＡｐｏＥエンハンサーをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。特定の実施形態では、当該骨－肝臓タンデムプロモーターは、ＡｐｏＥエンハンサーを含む肝制御領域をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。特定の実施形態では、当該ＡｐｏＥエンハンサーは、配列番号２０と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該ＡｐｏＥエンハンサープロモーターは、配列番号２０と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該肝制御領域は、配列番号１９と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該肝制御領域は、配列番号１９と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0020】

特定の実施形態では、当該骨－肝臓タンデムプロモーターは、ＬＢＴＰ１プロモーターである。特定の実施形態では、ＬＢＴＰ１プロモーターは、配列番号１７と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該ＬＢＴＰ１プロモーターは、配列番号１７と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0021】

特定の実施形態では、当該骨－肝臓タンデムプロモーターは、ＬＢＴＰ２プロモーターである。特定の実施形態では、当該ＬＢＴＰ２プロモーターは、配列番号１８と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該ＬＢＴＰ２プロモーターは、配列番号１８と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0022】

別の態様では、本明細書では：（ａ）ＡＡＶキャプシド（例えば、ＡＡＶ８キャプシド）；及び（ｂ）ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、当該導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳをコードし、また、当該Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列を、導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。

【0023】

別の態様では、本明細書では：（ａ）ＡＡＶキャプシド（例えば、ＡＡＶ８キャプシド）；及び（ｂ）ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、当該導入遺伝子は、酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードし、また、Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列を、導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。特定の実施形態では、当該酸性オリゴペプチドは、Ｄ８である。

【0024】

特定の実施形態では、当該Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２３と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２３と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0025】

別の態様では、本明細書では：（ａ）ＡＡＶキャプシド（例えば、ＡＡＶ８キャプシド）；及び（ｂ）ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列とを含み、また、当該導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳをコードし、また、最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列を、導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。

【0026】

別の態様では、本明細書では：（ａ）ＡＡＶキャプシド（例えば、ＡＡＶ８キャプシド）；及び（ｂ）ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列とを含み、また、当該導入遺伝子は、酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードし、また、最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列を、導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。特定の実施形態では、当該酸性オリゴペプチドは、Ｄ８である。

【0027】

特定の実施形態では、当該最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２４と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２４と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0028】

本明細書に記載したｒＡＡＶの態様及び実施形態の様々な実施形態では、ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、イントロンをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。特定の実施形態では、当該イントロンは、キメライントロンである。特定の実施形態では、当該キメライントロンは、β－グロビン／Ｉｇイントロンである。特定の実施形態では、当該β－グロビン／Ｉｇイントロンは、配列番号１０と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該β－グロビン／Ｉｇイントロンは、配列番号１０と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0029】

本明細書に記載したｒＡＡＶの態様及び実施形態の様々な実施形態では、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列をコドン最適化する。本明細書に記載したｒＡＡＶの態様及び実施形態の様々な実施形態では、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列では、ＣｐＧ部位が枯渇している。特定の実施形態では、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号１２と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％が同一であるｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号１２と、１００％同一であるｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含む。

【0030】

本明細書に記載したｒＡＡＶの態様及び実施形態の様々な実施形態では、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列は、ポリアデニル化シグナルを含む。特定の実施形態では、当該ポリアデニル化シグナルは、β－グロビンポリアデニル化シグナルである。特定の実施形態では、当該β－グロビンポリアデニル化シグナルは、配列番号２５と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該β－グロビンポリアデニル化シグナルは、配列番号２５と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該ポリアデニル化シグナルは、ウサギグロビンポリＡ部位である。特定の実施形態では、当該ウサギグロビンポリＡ部位は、配列番号９と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該ウサギグロビンポリＡ部位は、配列番号９と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0031】

本明細書に記載したｒＡＡＶの態様及び実施形態の様々な実施形態では、当該ＡＡＶは、ＡＡＶ８である。本明細書に記載したｒＡＡＶの態様及び実施形態の様々な実施形態では、当該ＡＡＶは、ＡＡＶ９である。

【0032】

別の態様では、本明細書で提供するのは、本明細書で提供するｒＡＡＶと、医薬として許容可能な担体を含む医薬組成物である。

【0033】

別の態様では、本明細書では、ＡＡＶ－ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２－ＩＴＲ、ＡＡＶ８－ＩＴＲ、またはＡＡＶ９－ＩＴＲ）が隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、導入遺伝子、例えば、酸性オリゴペプチド（例えば、Ｄ８）に融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードする導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。特定の実施形態では、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、当該肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列は、当該融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結している。さらに特定の実施形態では、当該肝臓特異的プロモーターは、ＴＢＧプロモーターである。

【0034】

別の態様では、本明細書では、ＡＡＶ－ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２－ＩＴＲ、ＡＡＶ８－ＩＴＲ、またはＡＡＶ９－ＩＴＲ）が隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列と、ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含み、当該肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列が、そのｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結している。特定の実施形態では、当該肝臓特異的プロモーターは、ＴＢＧプロモーターである。

【0035】

別の態様では、本明細書では、ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、骨－肝臓タンデムプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列とを含み、また、当該導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳをコードし、また、当該骨－肝臓タンデムプロモーターは、骨特異的プロモーターと、肝臓特異的プロモーターとを含み、また、当該骨－肝臓タンデムプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。

【0036】

別の態様では、本明細書では、ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、骨－肝臓タンデムプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列とを含み、また、当該導入遺伝子は、酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードし、また、当該骨－肝臓タンデムプロモーターは、骨特異的プロモーターと、肝臓特異的プロモーターを含み、また、当該骨－肝臓タンデムプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。特定の実施形態では、当該酸性オリゴペプチドは、Ｄ８である。

【0037】

特定の実施形態では、当該骨特異的プロモーターは、Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターである。特定の実施形態では、当該Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２３と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２３と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0038】

特定の実施形態では、当該骨特異的プロモーターは、最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターである。特定の実施形態では、当該最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２４と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２４と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0039】

特定の実施形態では、当該肝臓特異的プロモーターは、ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーターである。特定の実施形態では、当該ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーターは、配列番号２２と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーターは、配列番号２２と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0040】

特定の実施形態では、当該骨－肝臓タンデムプロモーターは、ＡｐｏＥエンハンサーをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。特定の実施形態では、当該骨－肝臓タンデムプロモーターは、ＡｐｏＥエンハンサーを含む肝制御領域をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。特定の実施形態では、当該ＡｐｏＥエンハンサーは、配列番号２０と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該ＡｐｏＥエンハンサープロモーターは、配列番号２０と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該肝制御領域は、配列番号１９と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該肝制御領域は、配列番号１９と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0041】

特定の実施形態では、当該骨－肝臓タンデムプロモーターは、ＬＢＴＰ１プロモーターである。特定の実施形態では、当該ＬＢＴＰ１プロモーターは、配列番号１７と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該ＬＢＴＰ１プロモーターは、配列番号１７と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0042】

特定の実施形態では、当該骨－肝臓タンデムプロモーターは、ＬＢＴＰ２プロモーターである。特定の実施形態では、当該ＬＢＴＰ２プロモーターは、配列番号１８と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該ＬＢＴＰ２プロモーターは、配列番号１８と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0043】

別の態様では、本明細書では、ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、当該導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳをコードし、また、当該Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。

【0044】

別の態様では、本明細書では、ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、当該導入遺伝子は、酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードし、また、当該Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。特定の実施形態では、当該酸性オリゴペプチドは、Ｄ８である。

【0045】

特定の実施形態では、当該Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２３と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２３と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0046】

別の態様では、本明細書では、ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、当該導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳをコードし、また、当該Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。

【0047】

別の態様では、本明細書では、ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、当該導入遺伝子は、酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードし、また、当該最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。特定の実施形態では、当該酸性オリゴペプチドは、Ｄ８である。

【0048】

特定の実施形態では、当該最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２４と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２４と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0049】

本明細書に記載したポリヌクレオチドの態様及び実施形態の様々な実施形態では、ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、イントロンをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。特定の実施形態では、当該イントロンは、キメライントロンである。特定の実施形態では、当該キメライントロンは、β－グロビン／Ｉｇイントロンである。特定の実施形態では、当該β－グロビン／Ｉｇイントロンは、配列番号１０と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該β－グロビン／Ｉｇイントロンは、配列番号１０と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0050】

本明細書に記載したポリヌクレオチドの態様及び実施形態の様々な実施形態では、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列をコドン最適化する。本明細書に記載したポリヌクレオチドの態様及び実施形態の様々な実施形態では、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列では、ＣｐＧ部位が枯渇している。特定の実施形態では、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号１２と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％が同一であるｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号１２と、１００％同一であるｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含む。

【0051】

本明細書に記載したポリヌクレオチドの態様及び実施形態の様々な実施形態では、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、ポリアデニル化シグナルを含む。特定の実施形態では、当該ポリアデニル化シグナルは、β－グロビンポリアデニル化シグナルである。特定の実施形態では、当該β－グロビンポリアデニル化シグナルは、配列番号２５と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該β－グロビンポリアデニル化シグナルは、配列番号２５と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該ポリアデニル化シグナルは、ウサギグロビンポリＡ部位である。特定の実施形態では、当該ウサギグロビンポリＡ部位は、配列番号９と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該ウサギグロビンポリＡ部位は、配列番号９と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0052】

本明細書に記載したポリヌクレオチドの態様及び実施形態の様々な実施形態では、当該ＡＡＶは、ＡＡＶ８である。本明細書に記載したポリヌクレオチドの態様及び実施形態の様々な実施形態では、当該ＡＡＶは、ＡＡＶ９である。

【0053】

別の態様では、本明細書では、本明細書で提供するポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶプラスミドを提供する。

【0054】

別の態様では、本明細書では、本明細書で提供するポリヌクレオチドまたは本明細書で提供するｒＡＡＶプラスミドを含むエクスビボ細胞を提供する。

【0055】

別の態様では、本明細書では、ｒＡＡＶの作製方法を提供し、当該方法は、エクスビボ細胞を、本明細書に記載したｒＡＡＶプラスミドと、ＡＡＶ遺伝子Ｒｅｐ、Ｃａｐ、ＶＡ、Ｅ２ａ、及びＥ４のヌクレオチド配列を集合的に含む１つ以上のヘルパープラスミドとでトランスフェクトすることを含む。

【0056】

別の態様では、本明細書では、ムコ多糖症ＩＶＡ型（ＭＰＳ ＩＶＡ）の診断を受けたヒト対象の治療方法を提供し、当該方法は、当該ヒト対象に対して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは本明細書で提供する医薬組成物を投与することを含む。

【0057】

別の態様では、本明細書では、ＭＰＳ ＩＶＡの診断を受けたヒト対象を治療する方法を提供し、当該方法は、本明細書に記載したｒＡＡＶを当該対象に対して投与することで、当該ヒト対象の骨及び肝臓に、ｈＧＡＬＮＳ、または酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質（事例に応じて）の治療有効量を送達することを含む。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳまたは融合タンパク質を、肝細胞で産生して、同細胞から分泌することで、マンノース－６－リン酸でグリコシル化する。

【0058】

別の態様では、本明細書では、ＭＰＳ ＩＶＡの診断を受けたヒト対象を治療する方法を提供し、当該方法は、本明細書に記載したｒＡＡＶを当該対象に対して投与することで、当該ヒト対象の骨に、ｈＧＡＬＮＳ、または酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質（事例に応じて）の治療有効量を送達することを含む。

【0059】

別の態様では、本明細書では、ＭＰＳ ＩＶＡの診断を受けたヒト対象の治療方法を提供し、当該方法は、当該ヒト対象に対して、本明細書で提供するｒＡＡＶを投与することで、導入遺伝子、例えば、酸性オリゴペプチド（例えば、Ｄ８）に融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードする導入遺伝子の治療有効量を、当該ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋、及び／または心臓弁に送達することを含む。特定の実施形態では、当該ｈＧＡＬＮＳを、肝細胞で産生して、同細胞から分泌することで、マンノース－６－リン酸でグリコシル化する。

【0060】

別の態様では、本明細書では、ＭＰＳ ＩＶＡの診断を受けたヒト対象の治療方法を提供し、当該方法は、当該ヒト対象に対して、本明細書で提供するｒＡＡＶを投与することで、肝細胞で産生して、同細胞から分泌することで、マンノース－６－リン酸でグリコシル化されるｈＧＡＬＮＳの治療有効量を、当該ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達することを含む。

【0061】

別の態様では、本明細書では、ＭＰＳ ＩＶＡの診断を受けたヒト対象の治療方法を提供し、当該方法は、当該ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に、酸性オリゴペプチド（例えば、Ｄ８）に融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質の治療有効量を送達することを含み、当該融合タンパク質を、ｒＡＡＶゲノム（例えば、組み換えＡＡＶ８ゲノム（すなわち、ＡＡＶ８ゲノムの主鎖を含む組み換えゲノム））から産生する。

【0062】

別の態様では、本明細書では、ＭＰＳ ＩＶＡの診断を受けたヒト対象の治療方法を提供し、当該方法は、当該ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に、導入遺伝子、例えば、酸性オリゴペプチド（例えば、Ｄ８）に融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードする導入遺伝子をコードする導入遺伝子の治療有効量を送達することを含み、当該融合タンパク質は、ｒＡＡＶゲノム（例えば、組み換えＡＡＶ８ゲノム（すなわち、ＡＡＶ８ゲノムの主鎖を含む組み換えゲノム））から産生し、そして、肝細胞で産生して、同細胞から分泌することで、マンノース－６－リン酸でグリコシル化する。

【0063】

別の態様では、本明細書では、ＭＰＳ ＩＶＡの診断を受けたヒト対象の治療方法を提供し、当該方法は、ｒＡＡＶゲノム（例えば、組み換えＡＡＶ８ゲノム（すなわち、ＡＡＶ８ゲノムの主鎖を含む組み換えゲノム））から産生され、そして、肝細胞で産生して、同細胞から分泌することで、マンノース－６－リン酸でグリコシル化するｈＧＡＬＮＳの治療有効量を、当該ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋、及び／または心臓弁に送達することを含む。

【0064】

ＭＰＳ ＩＶＡの診断を受けたヒト対象の治療方法の特定の態様及び実施形態では、当該ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋、及び／または心臓弁に送達することを含み、当該骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋、及び／または心臓弁に送達する工程は、骨、及び／または軟骨に送達する工程である。

【0065】

ＭＰＳ ＩＶＡの診断を受けたヒト対象の治療方法の特定の態様及び実施形態では、当該ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋、及び／または心臓弁に送達することを含み、当該骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達する工程は、（ａ）骨、及び／または軟骨、ならびに（ｂ）靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、心筋、及び／または心臓弁に送達する工程である。

【0066】

ある態様では、本明細書では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供し、当該ｒＡＡＶは：（ａ）ＡＡＶキャプシド（例えば、ＡＡＶ８キャプシド、またはＡＡＶ９キャプシド）；及び（ｂ）ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接するヒトＮ－アセチルガラクトサミン－６－硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含み、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、プロモーターをコードするヌクレオチド配列と、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列とを含み、また、当該導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳをコードし、また、当該プロモーターをコードするヌクレオチド配列を、導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。

【0067】

ある態様では、本明細書では、ＡＡＶ－ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２－ＩＴＲ）に隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、プロモーターをコードするヌクレオチド配列と、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列とを含み、また、当該プロモーターをコードする配列を、導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。

【0068】

一部の態様では、当該プロモーターは、ＴＢＧである。一部の態様では、当該プロモーターをコードするヌクレオチド配列は：配列番号６と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号６と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号６と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号６と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号６と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列；または、配列番号６と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0069】

一部の態様では、当該プロモーターは、ＣＡＧである。一部の態様では、当該プロモーターをコードするヌクレオチド配列は：配列番号２８と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号２８と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号２８と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号２８と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号２８と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列；または、配列番号２８と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0070】

一部の態様では、当該プロモーターは、ＬＳＰＸ１である。一部の態様では、当該プロモーターをコードするヌクレオチド配列は：配列番号１３と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号１３と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号１３と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号１３と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号１３と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列；または、配列番号１３と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0071】

一部の態様では、当該プロモーターは、ＬＭＴＰ６である。一部の態様では、当該プロモーターをコードするヌクレオチド配列は：配列番号１６と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号１６と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号１６と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号１６と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号１６と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列；または、配列番号１６と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0072】

一部の態様では、当該プロモーターは、ＬＢＴＰ２である。一部の態様では、当該プロモーターをコードするヌクレオチド配列は：配列番号１８と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号１８と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号１８と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号１８と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号１８と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列；または、配列番号１８と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0073】

一部の態様では、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列は：配列番号２７と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号２７と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号２７と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号２７と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号２７と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列；または、配列番号２７と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0074】

一部の態様では、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列は：配列番号３と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号３と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号３と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号３と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号３と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列；または、配列番号３と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0075】

一部の態様では、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列は：配列番号１２と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号１２と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号１２と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号１２と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号１２と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列；または、配列番号１２と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0076】

一部の態様では、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列は：配列番号２と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号２と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号２と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号２と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号２と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列；または、配列番号２と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0077】

ある態様では、本明細書では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供し、当該ｒＡＡＶは：（ａ）ＡＡＶキャプシド（例えば、ＡＡＶ８キャプシド、またはＡＡＶ９キャプシド）；及び（ｂ）ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）（例えば、ＡＡＶ２－ＩＴＲ）に隣接するヒトＮ－アセチルガラクトサミン－６－硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含み、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、プロモーターをコードするヌクレオチド配列と、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列とを含み、また、当該導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳをコードし、また、当該プロモーターをコードするヌクレオチド配列を、導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結し、また、導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列は：配列番号２７と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号２７と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号２７と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号２７と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列；配列番号２７と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列；または、配列番号２７と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0078】

一部の態様では、本明細書では、本開示の１つ以上のｒＡＡＶと、医薬として許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。一部の態様では、本明細書では、ムコ多糖症ＩＶＡ型（ＭＰＳ ＩＶＡ）の診断を受けたヒト対象を治療する方法を提供しており、本開示の１つ以上のｒＡＡＶを、ヒト対象に投与することを含む。
３．１ 例示的実施形態
１．組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって：
（ａ）ＡＡＶキャプシド；及び
（ｂ）ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接するヒトＮ－アセチルガラクトサミン－６－硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含み、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、骨－肝臓タンデムプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、前記導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳをコードし、また、前記骨－肝臓タンデムプロモーターは、骨特異的プロモーターと、肝臓特異的プロモーターとを含み、また、前記骨－肝臓タンデムプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列に機能的に連結する、前記組換えアデノ随伴ウイルス。
２．ｒＡＡＶであって：
（ａ）ＡＡＶキャプシド；及び
（ｂ）ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含み、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、骨－肝臓タンデムプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、前記導入遺伝子は、酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードし、また、前記骨－肝臓タンデムプロモーターは、骨特異的プロモーター及び肝臓特異的プロモーターを含み、また、前記骨－肝臓タンデムプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列に機能的に連結する、前記ｒＡＡＶ。
３．前記酸性オリゴペプチドが、Ｄ８である、請求項２に記載のｒＡＡＶ。
４．前記骨特異的プロモーターが、Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターである、パラグラフ１～３のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ。
５．前記Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターが：
（ａ）配列番号２３と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号２３と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号２３と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号２３と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号２３と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号２３と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
パラグラフ４に記載のｒＡＡＶ。
６．前記Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターが、配列番号２３と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、パラグラフ４に記載のｒＡＡＶ。
７．前記骨特異的プロモーターが、最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターである、パラグラフ１～３のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ。
８．前記最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターが：
（ａ）配列番号２４と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号２４と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号２４と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号２４と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号２４と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号２４と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
パラグラフ７に記載のｒＡＡＶ：
９．前記最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターが、配列番号２４と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、パラグラフ７に記載のｒＡＡＶ。
１０．前記肝臓特異的プロモーターが、ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーターである、パラグラフ１～９のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ。
１１．前記ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーターが：
（ａ）配列番号２２と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号２２と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号２２と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号２２と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号２２と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号２２と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
パラグラフ１０に記載のｒＡＡＶ：
１２．前記ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーターが、配列番号２２と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、パラグラフ１０に記載のｒＡＡＶ。
１３．前記骨－肝臓タンデムプロモーターが、ＡｐｏＥエンハンサーをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、パラグラフ１～１２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ。
１４．前記骨－肝臓タンデムプロモーターが、ＡｐｏＥエンハンサーを含む肝制御領域をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、パラグラフ１～１２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ。
１５．前記ＡｐｏＥエンハンサーが：
（ａ）配列番号２０と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号２０と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号２０と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号２０と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号２０と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号２０と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
パラグラフ１３または１４に記載のｒＡＡＶ。
１６．前記ＡｐｏＥエンハンサーが、配列番号２０と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、パラグラフ１３または１４に記載のｒＡＡＶ。
１７．前記肝制御領域が：
（ａ）配列番号１９と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号１９と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号１９と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号１９と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号１９と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号１９と、少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
パラグラフ１４に記載のｒＡＡＶ。
１８．前記肝制御領域が、配列番号１９と、少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、パラグラフ１４に記載のｒＡＡＶ。
１９．前記骨－肝臓タンデムプロモーターが、ＬＢＴＰ１プロモーターである、パラグラフ１～３のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ。
２０．前記ＬＢＴＰ１プロモーターが：
（ａ）配列番号１７と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号１７と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号１７と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号１７と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号１７と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号１７と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
パラグラフ１９に記載のｒＡＡＶ。
２１．前記ＬＢＴＰ１プロモーターが、配列番号１７と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、パラグラフ１９に記載のｒＡＡＶ。
２２．前記骨－肝臓タンデムプロモーターが、ＬＢＴＰ２プロモーターである、パラグラフ１～３のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ。
２３．前記ＬＢＴＰ２プロモーターが：
（ａ）配列番号１８と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号１８と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号１８と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号１８と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号１８と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号１８と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
パラグラフ２２に記載のｒＡＡＶ。
２４．前記ＬＢＴＰ２プロモーターが、配列番号１８と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、パラグラフ２２に記載のｒＡＡＶ。
２５．ｒＡＡＶであって：
（ａ）ＡＡＶキャプシド；及び
（ｂ）ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含み、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、前記導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳをコードし、及び前記Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列に機能的に連結する、前記ｒＡＡＶ。
２６．ｒＡＡＶであって：
（ａ）ＡＡＶキャプシド；及び
（ｂ）ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含み、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、前記導入遺伝子は、酸性オリゴペプチドに融合するｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードし、及び前記Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列に機能的に連結する、前記ｒＡＡＶ。
２７．前記酸性オリゴペプチドが、Ｄ８である、パラグラフ２６に記載のｒＡＡＶ。
２８．前記Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターが：
（ａ）配列番号２３と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号２３と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号２３と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号２３と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号２３と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号２３と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
パラグラフ２５～２７のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ。
２９．前記Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターが、配列番号２３と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、パラグラフ２５～２７のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ。
３０．ｒＡＡＶであって：
（ａ）ＡＡＶキャプシド；及び
（ｂ）ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含み、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、前記導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳをコードし、及び前記最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列に機能的に連結する、前記ｒＡＡＶ。
３１．ｒＡＡＶであって：
（ａ）ＡＡＶキャプシド；及び
（ｂ）ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含み、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、前記導入遺伝子は、酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードし、及び前記最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列に機能的に連結する、前記ｒＡＡＶ。
３２．前記酸性オリゴペプチドが、Ｄ８である、パラグラフ３１に記載のｒＡＡＶ。
３３．前記最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターが：
（ａ）配列番号２４と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号２４と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号２４と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号２４と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号２４と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号２４と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
パラグラフ３０～３２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ。
３４．前記最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターが、配列番号２４と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、パラグラフ３０～３２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ。
３５．前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、イントロンをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、パラグラフ１～３４のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ。
３６．前記イントロンが、キメライントロンである、パラグラフ３５に記載のｒＡＡＶ。
３７．前記キメライントロンが、β－グロビン／Ｉｇイントロンである、パラグラフ３６に記載のｒＡＡＶ。
３８．前記β－グロビン／Ｉｇイントロンが：
（ａ）配列番号１０と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号１０と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号１０と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号１０と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号１０と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号１０と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
パラグラフ３７に記載のｒＡＡＶ。
３９．前記β－グロビン／Ｉｇイントロンが、配列番号１０と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、パラグラフ３７に記載のｒＡＡＶ。
４０．前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列をコドン最適化する、パラグラフ１～３９のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ。
４１．前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列では、ＣｐＧ部位が枯渇している、パラグラフ１～４０のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ。
４２．前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列が：
（ａ）配列番号１２と、少なくとも８０％が同一である；
（ｂ）配列番号１２と、少なくとも８５％が同一である；
（ｃ）配列番号１２と、少なくとも９０％が同一である；
（ｄ）配列番号１２と、少なくとも９５％が同一である；
（ｅ）配列番号１２と、少なくとも９８％が同一である；または
（ｆ）は配列番号１２と、１００％同一である、
ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含む、パラグラフ１～４１のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ。
４３．前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１２と、１００％同一であるｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含む、パラグラフ１～４１のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ。
４４．前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列が、ポリアデニル化シグナルを含む、パラグラフ１～４３のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ。
４５．前記ポリアデニル化シグナルが、β－グロビンポリアデニル化シグナルである、パラグラフ４４に記載のｒＡＡＶ。
４６．前記β－グロビンポリアデニル化シグナルが：
（ａ）配列番号２５と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号２５と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号２５と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号２５と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号２５と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号２５と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
パラグラフ４５に記載のｒＡＡＶ。
４７．前記β－グロビンポリアデニル化シグナルが、配列番号２５と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、パラグラフ４５に記載のｒＡＡＶ。
４８．前記ポリアデニル化シグナルが、ウサギグロビンポリＡ部位である、パラグラフ４４に記載のｒＡＡＶ。
４９．ウサギグロビンポリＡ部位が：
（ａ）配列番号９と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号９と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号９と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号９と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号９と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号９と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
パラグラフ４８に記載のｒＡＡＶ。
５０．前記ウサギグロビンポリＡ部位が、配列番号９と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、パラグラフ４８に記載のｒＡＡＶ。
５１．前記ＡＡＶが、ＡＡＶ８である、パラグラフ１～５０のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ。
５２．前記ＡＡＶが、ＡＡＶ９である、パラグラフ１～５０のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ。
５３．パラグラフ１～５２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶと、医薬として許容可能な担体とを含む医薬組成物。
５４．ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、骨－肝臓タンデムプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、前記導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳをコードし、また、前記骨－肝臓タンデムプロモーターは、骨特異的プロモーターと、肝臓特異的プロモーターとを含み、及び前記骨－肝臓タンデムプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列に機能的に連結する、前記ポリヌクレオチド。
５５．ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、骨－肝臓タンデムプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、前記導入遺伝子は、酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードし、また、前記骨－肝臓タンデムプロモーターは、骨特異的プロモーターと、肝臓特異的プロモーターとを含み、及び前記骨－肝臓タンデムプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列に機能的に連結する、前記ポリヌクレオチド。
５６．前記酸性オリゴペプチドが、Ｄ８である、パラグラフ５５に記載のポリヌクレオチド。
５７．前記骨特異的プロモーターが、Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターである、パラグラフ５４～５６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
５８．前記Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターが：
（ａ）配列番号２３と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号２３と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号２３と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号２３と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号２３と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号２３と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
パラグラフ５７に記載のポリヌクレオチド。
５９．前記Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターが、配列番号２３と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、パラグラフ５７に記載のポリヌクレオチド。
６０．前記骨特異的プロモーターが、最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターである、パラグラフ５４～５６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
６１．前記最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターが：
（ａ）配列番号２４と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号２４と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号２４と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号２４と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号２４と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号２４と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
パラグラフ６０に記載のポリヌクレオチド。
６２．前記最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターが、配列番号２４と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、パラグラフ６０に記載のポリヌクレオチド。
６３．前記肝臓特異的プロモーターが、ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーターである、パラグラフ５４～６２のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
６４．前記ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーターが：
（ａ）配列番号２２と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号２２と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号２２と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号２２と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号２２と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号２２と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
パラグラフ６３に記載のポリヌクレオチド。
６５．前記ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーターが、配列番号２２と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、パラグラフ６３に記載のポリヌクレオチド。
６６．前記骨－肝臓タンデムプロモーターが、ＡｐｏＥエンハンサーをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、パラグラフ５４～６５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
６７．前記骨－肝臓タンデムプロモーターが、ＡｐｏＥエンハンサーを含む肝制御領域をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、パラグラフ５４～６５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
６８．前記ＡｐｏＥエンハンサーが：
（ａ）配列番号２０と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号２０と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号２０と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号２０と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号２０と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号２０と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
パラグラフ６６または６７に記載のポリヌクレオチド。
６９．前記ＡｐｏＥエンハンサーが、配列番号２０と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、パラグラフ６６または６７に記載のポリヌクレオチド。
７０．前記肝制御領域が：
（ａ）配列番号１９と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号１９と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号１９と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号１９と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号１９と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号１９と、少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
パラグラフ６７に記載のポリヌクレオチド。
７１．前記肝制御領域が、配列番号１９と、少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、パラグラフ６７に記載のポリヌクレオチド。
７２．前記骨－肝臓タンデムプロモーターが、ＬＢＴＰ１プロモーターである、パラグラフ５４～５６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
７３．前記ＬＢＴＰ１プロモーターが：
（ａ）配列番号１７と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号１７と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号１７と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号１７と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号１７と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号１７と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
パラグラフ７２に記載のポリヌクレオチド。
７４．前記ＬＢＴＰ１プロモーターが、配列番号１７と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、パラグラフ７２に記載のポリヌクレオチド。
７５．前記骨－肝臓タンデムプロモーターが、ＬＢＴＰ２プロモーターである、パラグラフ５４～５６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
７６．前記ＬＢＴＰ２プロモーターが：
（ａ）配列番号１８と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号１８と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号１８と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号１８と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号１８と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号１８と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
パラグラフ７５に記載のポリヌクレオチド。
７７．前記ＬＢＴＰ２プロモーターが、配列番号１８と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、パラグラフ７５に記載のポリヌクレオチド。
７８．ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、前記導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳをコードし、及び前記Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列に機能的に連結する、前記ポリヌクレオチド。
７９．ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、前記導入遺伝子は、酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳをコードし、及び前記Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列に機能的に連結する、前記ポリヌクレオチド。
８０．前記酸性オリゴペプチドが、Ｄ８である、パラグラフ７９に記載のポリヌクレオチド。
８１．前記Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターが：
（ａ）配列番号２３と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号２３と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号２３と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号２３と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号２３と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号２３と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
パラグラフ７８～８０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
８２．前記Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターが、配列番号２３と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、パラグラフ７８～８０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
８３．ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、前記導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳをコードし、及び前記最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列に機能的に連結する、前記ポリヌクレオチド。
８４．ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、前記導入遺伝子は、酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードし、及び前記最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列に機能的に連結する、前記ポリヌクレオチド。
８５．前記酸性オリゴペプチドが、Ｄ８である、パラグラフ８４に記載のポリヌクレオチド。
８６．前記最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターが：
（ａ）配列番号２４と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号２４と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号２４と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号２４と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号２４と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号２４と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
パラグラフ８３～８５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
８７．前記最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターが、配列番号２４と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、パラグラフ８３～８５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
８８．前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、イントロンをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、パラグラフ５４～８７のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
８９．前記イントロンが、キメライントロンである、パラグラフ８８に記載のポリヌクレオチド。
９０．前記キメライントロンが、β－グロビン／Ｉｇイントロンである、パラグラフ８９に記載のポリヌクレオチド。
９１．前記β－グロビン／Ｉｇイントロンが：
（ａ）配列番号１０と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号１０と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号１０と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号１０と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号１０と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号１０と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
パラグラフ９０に記載のポリヌクレオチド。
９２．前記β－グロビン／Ｉｇイントロンが、配列番号１０と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、パラグラフ９０に記載のポリヌクレオチド。
９３．前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列をコドン最適化する、パラグラフ５４～９２のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
９４．前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列では、ＣｐＧ部位が枯渇している、パラグラフ５４～９３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
９５．前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列が：
（ａ）配列番号１２と、少なくとも８０％が同一である；
（ｂ）配列番号１２と、少なくとも８５％が同一である；
（ｃ）配列番号１２と、少なくとも９０％が同一である；
（ｄ）配列番号１２と、少なくとも９５％が同一である；
（ｅ）配列番号１２と、少なくとも９８％が同一である；または
（ｆ）は配列番号１２と、１００％同一である、
ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含む、パラグラフ５４～９４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
９６．前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１２と、１００％同一であるｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含む、パラグラフ５４～９４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
９７．前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列が、ポリアデニル化シグナルを含む、パラグラフ５４～９６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
９８．前記ポリアデニル化シグナルが、β－グロビンポリアデニル化シグナルである、パラグラフ９７に記載のポリヌクレオチド。
９９．前記β－グロビンポリアデニル化シグナルが：
（ａ）配列番号２５と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号２５と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号２５と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号２５と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号２５と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号２５と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
パラグラフ９８に記載のポリヌクレオチド。
１００．前記β－グロビンポリアデニル化シグナルが、配列番号２５と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、パラグラフ９８に記載のポリヌクレオチド。
１０１．前記ポリアデニル化シグナルが、ウサギグロビンポリＡ部位である、パラグラフ９７に記載のポリヌクレオチド。
１０２．前記ウサギグロビンポリＡ部位が：
（ａ）配列番号９と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）配列番号９と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｃ）配列番号９と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｄ）配列番号９と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む；
（ｅ）配列番号９と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含む；または
（ｆ）配列番号９と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
パラグラフ１０１に記載のポリヌクレオチド。
１０３．前記ウサギグロビンポリＡ部位が、配列番号９と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、パラグラフ１０１に記載のポリヌクレオチド。
１０４．前記ＡＡＶが、ＡＡＶ８である、パラグラフ５４～１０３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１０５．前記ＡＡＶが、ＡＡＶ９である、パラグラフ５４～１０３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１０６．パラグラフ５４～１０５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶプラスミド。
１０７．パラグラフ５４～１０５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、またはパラグラフ１０６に記載のｒＡＡＶプラスミドを含むエクスビボ細胞。
１０８．ｒＡＡＶを作製する方法であって、エクスビボ細胞を、パラグラフ１０６に記載のｒＡＡＶプラスミドと、ＡＡＶ遺伝子Ｒｅｐ、Ｃａｐ、ＶＡ、Ｅ２ａ、及びＥ４のヌクレオチド配列を集合的に含む１つ以上のヘルパープラスミドとでトランスフェクトすることを含む、前記方法。
１０９．ムコ多糖症ＩＶＡ型（ＭＰＳ ＩＶＡ）の診断を受けたヒト対象を治療する方法であって、パラグラフ１～５２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ、またはパラグラフ５３の医薬組成物をヒト対象に投与することを含む、前記方法。
１１０．ＭＰＳ ＩＶＡの診断を受けたヒト対象を治療する方法であって、前記ヒト対象に対して、パラグラフ１～２４のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ、またはパラグラフ１～２４のいずれか１つに記載のｒＡＡＶに直接的または間接的に従属している場合にはパラグラフ３５～５２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶを投与することで、ｈＧＡＬＮＳ、または酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質の治療有効量を、前記ヒト対象の骨及び肝臓に送達する、ことを含む前記方法。
１１１．前記ｈＧＡＬＮＳまたは融合タンパク質を、肝細胞で産生して、同細胞から分泌することで、マンノース－６－リン酸でグリコシル化する、パラグラフ１１０に記載の方法。
１１２．ＭＰＳ ＩＶＡの診断を受けたヒト対象を治療する方法であって、前記ヒト対象に対して、パラグラフ２５～３４のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ、またはパラグラフ２５～３４のいずれか１つに記載のｒＡＡＶに直接的または間接的に従属している場合にはパラグラフ３５～５２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶを投与することで、ｈＧＡＬＮＳ、または酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質の治療有効量を、前記ヒト対象の骨に送達する、ことを含む前記方法。
１１３．ｒＡＡＶであって：
（ａ）ＡＡＶキャプシド；及び
（ｂ）ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含み、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、プロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、前記導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳをコードし、また、前記プロモーターをコードする前記ヌクレオチド配列を、前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列に機能的に連結し、及び前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列は：
（ａ）配列番号２７と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２７と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号２７と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号２７と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号２７と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列；または
（ｆ）配列番号２７と、１００％同一であるヌクレオチド配列、
を含む、前記ｒＡＡＶ。
１１４．前記ＡＡＶキャプシドが、ＡＡＶ８キャプシド、またはそのバリアントである、パラグラフ１３に記載のｒＡＡＶ。
１１５．前記ＡＡＶキャプシドが、ＡＡＶ９キャプシド、またはそのバリアントである、パラグラフ１３に記載のｒＡＡＶ。
１１６．ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、プロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含む、及び前記プロモーターをコードする前記ヌクレオチド配列を、前記導入遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列に機能的に連結する、前記ポリヌクレオチド。
１１７．前記プロモーターが、ＴＢＧである、パラグラフ１１３～１１５のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ、またはパラグラフ１１６に記載のポリヌクレオチド。
１１８．前記プロモーターをコードする前記ヌクレオチド配列が：
（ａ）配列番号６と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号６と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号６と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号６と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号６と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列；または
（ｆ）配列番号６と、１００％同一であるヌクレオチド配列、
を含む、パラグラフ１１３～１１５または１１７のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ、またはパラグラフ１１６～１１７のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１１９．前記プロモーターが、ＣＡＧである、パラグラフ１１３～１１５のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ、またはパラグラフ１１６に記載のポリヌクレオチド。
１２０．プロモーターをコードするヌクレオチド配列が：
（ａ）配列番号２８と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２８と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号２８と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号２８と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号２８と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列；または
（ｆ）配列番号２８と、１００％同一であるヌクレオチド配列、
を含む、パラグラフ１１３～１１５または１１９のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ、またはパラグラフ１１６または１１９に記載のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１２１．前記プロモーターが、ＬＳＰＸ１である、パラグラフ１１３～１１５のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ、またはパラグラフ１１６に記載のポリヌクレオチド。
１２２．前記プロモーターをコードする前記ヌクレオチド配列が：
（ａ）配列番号１３と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１３と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号１３と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号１３と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号１３と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列；または
（ｆ）配列番号１３と、１００％同一であるヌクレオチド配列、
を含む、パラグラフ１１３～１１５または１２１のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ、またはパラグラフ１１６または１２１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１２３．前記プロモーターが、ＬＭＴＰ６である、パラグラフ１１３～１１５のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ、またはパラグラフ１１６に記載のポリヌクレオチド。
１２４．前記プロモーターをコードする前記ヌクレオチド配列が：
（ａ）配列番号１６と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１６と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号１６と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号１６と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号１６と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列；または
（ｆ）配列番号１６と、１００％同一であるヌクレオチド配列、
を含む、パラグラフ１１３～１１５または１２３のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ、またはパラグラフ１１６または１２４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１２５．前記プロモーターが、ＬＢＴＰ２である、パラグラフ１１３～１１５のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ、またはパラグラフ１１６に記載のポリヌクレオチド。
１２６．前記プロモーターをコードする前記ヌクレオチド配列が：
（ａ）配列番号１８と、少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１８と、少なくとも８５％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号１８と、少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号１８と、少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号１８と、少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列；または
（ｆ）配列番号１８と、１００％同一であるヌクレオチド配列、
を含む、パラグラフ１１３～１１５または１２５のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ、またはパラグラフ１１６または１２５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１２７．前記ＡＡＶ－ＩＴＲが、ＡＡＶ２－ＩＴＲである、請求項１１３～１１５または１１７～１２６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ、または請求項１１６～１２６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
１２８．請求項１１３～１１５または１１７～１２７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶと、医薬として許容可能な担体とを含む医薬組成物。
１２９．ムコ多糖症ＩＶＡ型（ＭＰＳ ＩＶＡ）の診断を受けたヒト対象を治療する方法であって、ヒト対象に対して、請求項１１３～１１５または１１７～１２７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ、または請求項１２８に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
４．略語

【表1】

【0079】

５．図面の簡単な説明
上記した、及びその他の目的、特徴、及び利点は、添付した図面に例示した通り、本発明の特定の実施形態の下記の説明から明らかである。それらの図面は、必ずしも、縮尺通りに描かれておらず、本発明の様々な実施形態の原理を説明することに重点を置いている。

【図面の簡単な説明】

【0080】

【図1】ｒＡＡＶゲノムの概略図である。

【0081】

【図2A】ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳプラスミド、ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳ－ＣｏＯｐｔプラスミド、ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳプラスミド、またはＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳ－ＣｏＯｐｔプラスミドのいずれかをトランスフェクションした後のＨｕＨ－７細胞において、細胞内酵素活性を求めた（ｎ＝２）。

【図2B】ＨｕＨ－７細胞で求めた細胞内酵素活性の個々の実験結果を示している。

【図2C】ＨｕＨ－７細胞に、ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳプラスミド、ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳ－ＣｏＯｐｔプラスミド、ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳプラスミド、またはＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳ－ＣｏＯｐｔプラスミドをトランスフェクションした後、培地中の酵素活性を求めた（ｎ＝２）。

【図2D】培地中の酵素活性をＨｕＨ－７細胞で求めたものの個々の実験結果を示している。

【0082】

【図3】ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳプラスミド、ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳ－ＣｏＯｐｔプラスミド、ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳプラスミド、またはＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳ－ＣｏＯｐｔプラスミドのいずれかをトランスフェクションした後のＨｅｐＧ２細胞で、細胞内酵素活性を求めた。

【0083】

【図4】ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳを４週齢のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）及び免疫寛容性マウス（ＧＡＬＮＳ^{ｔｍ（ｈＣ７９Ｓ．ｍＣ７６Ｓ）ｓｌｕ}、Ｍｔｏｌ）に投与したインビボ試験のスケジュールである。血液における酵素アッセイ及びＫＳアッセイのスケジュールを示している。用量について記載している場合、１キログラム当たりのベクターコピー数（ｖｃ／ｋｇ）及び１キログラム当たりの遺伝子コピー数（ＧＣ／ｋｇ）は同義的に使用している。

【0084】

【図5A】ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳｒ、またはＡＡＶ－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳを投与した後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）の白血球（ＷＢＣ）で測定した経時的なｈＧＡＬＮＳ酵素活性である。

【図5B】ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳｒ、またはＡＡＶ－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳを投与した後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）の血漿で測定した経時的なｈＧＡＬＮＳ酵素活性である。

【0085】

【図6】ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳ（ｎ＝４）、またはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳ（ｎ＝４）を投与した後のＭｔｏｌマウスの血漿で測定した経時的なｈＧＡＬＮＳ酵素活性である。

【0086】

【図7A】ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）の肝臓で測定したｈＧＡＬＮＳ酵素活性である。

【図7B】Ｍｔｏｌマウスの肝臓で測定したｈＧＡＬＮＳ酵素活性である。

【図7C】ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）の心臓及びＭｔｏｌマウスの心臓で測定したｈＧＡＬＮＳ酵素活性である。

【図7D】ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）の骨及びＭｔｏｌマウスの骨で測定したｈＧＡＬＮＳ酵素活性である。

【0087】

【図8】ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳ、またはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）の血漿におけるモノ硫酸化ＫＳレベルである。

【0088】

【図9A】ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳ、またはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳでＭｔｏｌマウスの血漿における経時的なモノ硫酸化ＫＳレベルを未処置のＭｔｏｌマウス及びＷＴマウスと比較したものである。

【図9B】ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳ、またはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスの血漿におけるモノ硫酸化ＫＳレベルは、１６週齢において、未処置のＭｔｏｌマウスのレベルと比べて有意に低かった（ｎ＝４～５、平均±標準偏差、^＊：ＷＴに対するｐ＜０．０５、＃：未処置群に対するｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡ）。

【0089】

【図10】ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）、未処置のマウスまたはＷＴマウスにおいて経時的に測定した血中のｄｉＨＳ－０Ｓレベルである。

【0090】

【図11A】骨の病理スコアのグラフ図である。ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）において、ＡＡＶ８－ｈＧＡＬＮＳベクターまたはＡＡＶ８－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳベクターを投与してから１２週間後に、骨の病態を組織病理学的解析によって評価した。

【図11B】膝関節（Ｌｉｇ－靭帯、Ｍ－半月板、Ｆ－大腿骨、Ｔ－脛骨）の組織病態である。

【図11C】大腿関節軟骨の組織病態（４０倍拡大画像）である。

【図11D】大腿関節軟骨の組織病態（４０倍拡大画像）である。

【図11E】大腿関節軟骨の組織病態（４０倍拡大画像）である。

【図11F】大腿関節軟骨の組織病態（４０倍拡大画像）である。

【図11G】大腿骨成長板の組織病態（４０倍拡大画像）である。

【図11H】大腿骨成長板の組織病態（４０倍拡大画像）である。

【図11I】大腿骨成長板の組織病態（４０倍拡大画像）である。

【図11J】大腿骨成長板の組織病態（４０倍拡大画像）である。

【図11K】半月板の組織病態（４０倍拡大画像）である。

【図11L】靭帯の組織病態（脛骨側、４０倍拡大画像）である。

【図11M】心臓弁の基部の組織病態（４０倍拡大画像）である。

【図11N】心臓弁の基部の組織病態（４０倍拡大画像）である。

【図11O】心臓弁の組織病態（４０倍拡大画像）である。

【図11P】心臓弁の組織病態（４０倍拡大画像）である。

【0091】

【図12A】ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳを投与した後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）及びＭｔｏｌマウスの肝臓でそれぞれ測定したｈＧＡＬＮＳ酵素活性レベルを未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）、未処置のＭｔｏｌマウス、及び野生型マウスと比較したものである（ｎ＝３～８、平均±標準偏差）。

【図12B】ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳを投与した後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）の脾臓及びＭｔｏｌマウスの脾臓でそれぞれ測定したｈＧＡＬＮＳ酵素活性レベルを未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）、未処置のＭｔｏｌマウス、及び野生型マウスと比較したものである（ｎ＝３～８、平均±標準偏差）。

【図12C】ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳを投与した後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）の肺及びＭｔｏｌマウスの肺でそれぞれ測定したｈＧＡＬＮＳ酵素活性レベルを、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）、未処置のＭｔｏｌマウス及び野生型マウスと比較したものである（ｎ＝３～８、平均±標準偏差）。

【0092】

【図13A】ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳを投与した後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）の骨及びＭｔｏｌマウスの骨でそれぞれ測定したｈＧＡＬＮＳ酵素活性レベルを未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）、未処置のＭｔｏｌマウス、及び野生型マウスと比較したものである（ｎ＝３～８、平均±標準偏差）。

【図13B】ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳを投与した後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）の心臓及びＭｔｏｌマウスの心臓でそれぞれ測定したｈＧＡＬＮＳ酵素活性レベルを未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）、未処置のＭｔｏｌマウス、及び野生型マウスと比較したものである（ｎ＝３～８、平均±標準偏差）。

【0093】

【図14】ＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）の血漿におけるモノ硫酸化ＫＳレベルを、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス及び未処置の野生型マウスと比較したものである（ｎ＝４～８、平均±標準偏差）。

【0094】

【図15A】ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスの血漿における経時的なモノ硫酸化ＫＳレベルを、未処置のＭｔｏｌマウス及びＷＴマウスと比較したものである。

【図15B】ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスの血漿におけるモノ硫酸化ＫＳレベルは、１６週齢において、未処置のＭｔｏｌマウスレベルと比べて有意に低かった（ｎ＝４～５、平均±標準偏差、^＊：ＷＴに対するｐ＜０．０５、＃：未処置群に対するｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡ）。

【0095】

【図16A】ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）の肝臓におけるモノ硫酸化ＫＳレベルを未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス、及び未処置の野生型マウスと比較したものである。ｎ＝３～８、平均±標準偏差であり、^＊は、ＷＴに対するｐ＜０．０５であり、＃は、未処置群に対するｐ＜０．０５である（一元ＡＮＯＶＡ）。

【図16B】ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）の肺におけるモノ硫酸化ＫＳレベルを未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス、及び未処置の野生型マウスと比較したものである。ｎ＝３～８、平均±標準偏差であり、^＊は、ＷＴに対するｐ＜０．０５であり、＃は、未処置群に対するｐ＜０．０５である（一元ＡＮＯＶＡ）。

【図16C】ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスの肝臓におけるモノ硫酸化ＫＳレベルを未処置のＭｔｏｌマウス、及び未処置の野生型マウスと比較したものである。ｎ＝３～８、平均±標準偏差であり、^＊は、ＷＴに対するｐ＜０．０５であり、＃は、未処置群に対するｐ＜０．０５である（一元ＡＮＯＶＡ）。

【0096】

【図17A】野生型マウスにおける大腿骨成長板の組織病態（４０倍拡大画像）である（軟骨細胞はいずれも空胞化しておらず、カラム構造は充分に組織化されていた）。

【図17B】未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）における大腿骨成長板の組織病態（４０倍拡大画像）である（軟骨細胞はいずれも空胞化しており、カラム構造は大部分が崩壊し、歪んでいた）。

【図17C】未処置のＭｔｏｌマウスにおける大腿骨成長板の組織病態（４０倍拡大画像）である（軟骨細胞はいずれも空胞化しており、カラム構造は大部分が崩壊し、歪んでいた）。

【図17D】ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスにおける大腿骨成長板の組織病態（４０倍拡大画像）である（軟骨細胞の空胞化は中度であったが、カラム構造は良質であった）。

【図17E】ＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスにおける大腿骨成長板の組織病態（４０倍拡大画像）である（軟骨細胞の空胞化は中度であったが、カラム構造は部分的に回復していた）。

【0097】

【図18】Ａは、未処置の野生型マウス、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）、またはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）の大腿骨成長板で測定した軟骨細胞の細胞サイズである。ｎ＝４～６であり、平均±標準偏差であり、^＊は、ＷＴに対するｐ＜０．０５である（一元ＡＮＯＶＡ）。Ｂは、未処置の野生型マウス、未処置のＭｔｏｌマウス、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウス、またはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスの大腿骨成長板で測定した軟骨細胞の細胞サイズである。ｎ＝４～６であり、平均±標準偏差であり、^＊は、ＷＴに対するｐ＜０．０５であり、＃は、未処置群に対するｐ＜０．０５である（一元ＡＮＯＶＡ）。Ｃは、未処置の野生型マウス、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）、またはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）の脛骨成長板で測定した軟骨細胞の細胞サイズである。ｎ＝４～６であり、平均±標準偏差であり、^＊は、ＷＴに対するｐ＜０．０５である（一元ＡＮＯＶＡ）。Ｄは、未処置の野生型マウス、未処置のＭｔｏｌマウス、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウス、またはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスの脛骨成長板で測定した軟骨細胞の細胞サイズである。ｎ＝４～６であり、平均±標準偏差であり、^＊は、ＷＴに対するｐ＜０．０５であり、＃は、未処置群に対するｐ＜０．０５である（一元ＡＮＯＶＡ）。

【0098】

【図19】ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）、及びＭｔｏｌマウスにおける心臓弁の組織病態（４０倍拡大画像）を未処置のマウスと比較したものである。

【0099】

【図20】ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスにおける心筋の組織病態（４０倍拡大画像）を未処置のＭｔｏｌマウスと比較したものである。

【0100】

【図21A】未処置の野生型マウス、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウス、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウス、またはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウスの心臓弁組織の病理スコアである。（ｎ＝４～６、平均±標準偏差であり、^＊は、ＷＴに対するｐ＜０．０５であり、＃は、未処置群に対するｐ＜０．０５である（一元ＡＮＯＶＡ））。

【図21B】未処置の野生型マウス、未処置のＭｔｏｌマウス、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウス、またはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスの心臓弁組織の病理スコアである。（ｎ＝４～６、平均±標準偏差であり、^＊は、ＷＴに対するｐ＜０．０５であり、＃は、未処置群に対するｐ＜０．０５である（一元ＡＮＯＶＡ））。

【図21C】未処置の野生型マウス、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウス、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウス、またはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウスの心筋組織の病理スコアである。（ｎ＝４～６、平均±標準偏差である）。

【図21D】未処置の野生型マウス、未処置のＭｔｏｌマウス、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウス、またはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスの心筋組織の病理スコアである。（ｎ＝４～６、平均±標準偏差である。）

【0101】

【図22】ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳを投与した後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）の血漿で測定した経時的なｈＧＡＬＮＳ酵素活性である（ｎ＝４～７、平均＋標準偏差）。

【0102】

【図23】ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳを投与した後のＭｔｏｌマウスの血漿で測定した経時的なｈＧＡＬＮＳ酵素活性である（ｎ＝４～５、平均＋標準偏差）。

【0103】

【図24A】ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける血液及び組織中のヒトＮ－アセチルガラクトサミン－６－硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）酵素活性である。（Ａ）ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳウイルスベクター及びＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳウイルスベクターのゲノムの概略的な構造である。血液試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから、１週間おきに、１６週齢まで採取し、（Ｂ）ノックアウト（ＫＯ）マウス及び（Ｃ）寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおいて、血漿中のｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝４～７）。骨標的シグナルを含むＡＡＶベクター、または骨標的シグナルを含まないＡＡＶベクターを注射してから１２週間後に、組織試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取した。ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスにおいて、（Ｄ）肝臓、（Ｅ）脾臓、（Ｆ）肺、（Ｇ）腎臓、（Ｈ）心臓及び（Ｉ）骨（肢骨）を含む組織におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝３～８。統計値は、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって解析し、データは、平均±標準偏差として示している。^＊：ｐ＜０．０５）。ＡＡＶベクターを静脈内送達してから１２週間後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｊ）に示されている。ＡＡＶベクターを静脈内送達してからから１２週間後のＭＴＯＬマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｋ）に示されている。

【図24B】ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける血液及び組織中のヒトＮ－アセチルガラクトサミン－６－硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）酵素活性である。（Ａ）ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳウイルスベクター及びＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳウイルスベクターのゲノムの概略的な構造である。血液試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから、１週間おきに、１６週齢まで採取し、（Ｂ）ノックアウト（ＫＯ）マウス及び（Ｃ）寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおいて、血漿中のｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝４～７）。骨標的シグナルを含むＡＡＶベクターまたは骨標的シグナルを含まないＡＡＶベクターを注射してから１２週間後に、組織試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取した。ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスにおいて、（Ｄ）肝臓、（Ｅ）脾臓、（Ｆ）肺、（Ｇ）腎臓、（Ｈ）心臓及び（Ｉ）骨（肢骨）を含む組織におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝３～８。統計値は、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって解析し、データは、平均±標準偏差として示している。^＊：ｐ＜０．０５）。ＡＡＶベクターを静脈内送達してから１２週間後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｊ）に示されている。ＡＡＶベクターを静脈内送達してからから１２週間後のＭＴＯＬマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｋ）に示されている。

【図24C】ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける血液及び組織中のヒトＮ－アセチルガラクトサミン－６－硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）酵素活性である。（Ａ）ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳウイルスベクター及びＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳウイルスベクターのゲノムの概略的な構造である。血液試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから、１週間おきに、１６週齢まで採取し、（Ｂ）ノックアウト（ＫＯ）マウス及び（Ｃ）寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおいて、血漿中のｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝４～７）。骨標的シグナルを含むＡＡＶベクターまたは骨標的シグナルを含まないＡＡＶベクターを注射してから１２週間後に、組織試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取した。ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスにおいて、（Ｄ）肝臓、（Ｅ）脾臓、（Ｆ）肺、（Ｇ）腎臓、（Ｈ）心臓及び（Ｉ）骨（肢骨）を含む組織におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝３～８。統計値は、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって解析し、データは、平均±標準偏差として示している。^＊：ｐ＜０．０５）。ＡＡＶベクターを静脈内送達してから１２週間後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｊ）に示されている。ＡＡＶベクターを静脈内送達してからから１２週間後のＭＴＯＬマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｋ）に示されている。

【図24D】ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける血液及び組織中のヒトＮ－アセチルガラクトサミン－６－硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）酵素活性である。（Ａ）ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳウイルスベクター及びＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳウイルスベクターのゲノムの概略的な構造である。血液試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから、１週間おきに、１６週齢まで採取し、（Ｂ）ノックアウト（ＫＯ）マウス及び（Ｃ）寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおいて、血漿中のｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝４～７）。骨標的シグナルを含むＡＡＶベクターまたは骨標的シグナルを含まないＡＡＶベクターを注射してから１２週間後に、組織試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取した。ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスにおいて、（Ｄ）肝臓、（Ｅ）脾臓、（Ｆ）肺、（Ｇ）腎臓、（Ｈ）心臓及び（Ｉ）骨（肢骨）を含む組織におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝３～８。統計値は、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって解析し、データは、平均±標準偏差として示している。^＊：ｐ＜０．０５）。ＡＡＶベクターを静脈内送達してから１２週間後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｊ）に示されている。ＡＡＶベクターを静脈内送達してからから１２週間後のＭＴＯＬマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｋ）に示されている。

【図24E】ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける血液及び組織中のヒトＮ－アセチルガラクトサミン－６－硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）酵素活性である。（Ａ）ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳウイルスベクター及びＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳウイルスベクターのゲノムの概略的な構造である。血液試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから、１週間おきに、１６週齢まで採取し、（Ｂ）ノックアウト（ＫＯ）マウス及び（Ｃ）寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおいて、血漿中のｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝４～７）。骨標的シグナルを含むＡＡＶベクターまたは骨標的シグナルを含まないＡＡＶベクターを注射してから１２週間後に、組織試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取した。ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスにおいて、（Ｄ）肝臓、（Ｅ）脾臓、（Ｆ）肺、（Ｇ）腎臓、（Ｈ）心臓及び（Ｉ）骨（肢骨）を含む組織におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝３～８。統計値は、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって解析し、データは、平均±標準偏差として示している。^＊：ｐ＜０．０５）。ＡＡＶベクターを静脈内送達してから１２週間後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｊ）に示されている。ＡＡＶベクターを静脈内送達してからから１２週間後のＭＴＯＬマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｋ）に示されている。

【図24F】ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける血液及び組織中のヒトＮ－アセチルガラクトサミン－６－硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）酵素活性である。（Ａ）ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳウイルスベクター及びＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳウイルスベクターのゲノムの概略的な構造である。血液試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから、１週間おきに、１６週齢まで採取し、（Ｂ）ノックアウト（ＫＯ）マウス及び（Ｃ）寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおいて、血漿中のｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝４～７）。骨標的シグナルを含むＡＡＶベクターまたは骨標的シグナルを含まないＡＡＶベクターを注射してから１２週間後に、組織試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取した。ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスにおいて、（Ｄ）肝臓、（Ｅ）脾臓、（Ｆ）肺、（Ｇ）腎臓、（Ｈ）心臓及び（Ｉ）骨（肢骨）を含む組織におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝３～８。統計値は、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって解析し、データは、平均±標準偏差として示している。^＊：ｐ＜０．０５）。ＡＡＶベクターを静脈内送達してから１２週間後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｊ）に示されている。ＡＡＶベクターを静脈内送達してからから１２週間後のＭＴＯＬマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｋ）に示されている。

【図24G】ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける血液及び組織中のヒトＮ－アセチルガラクトサミン－６－硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）酵素活性である。（Ａ）ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳウイルスベクター及びＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳウイルスベクターのゲノムの概略的な構造である。血液試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから、１週間おきに、１６週齢まで採取し、（Ｂ）ノックアウト（ＫＯ）マウス及び（Ｃ）寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおいて、血漿中のｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝４～７）。骨標的シグナルを含むＡＡＶベクターまたは骨標的シグナルを含まないＡＡＶベクターを注射してから１２週間後に、組織試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取した。ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスにおいて、（Ｄ）肝臓、（Ｅ）脾臓、（Ｆ）肺、（Ｇ）腎臓、（Ｈ）心臓及び（Ｉ）骨（肢骨）を含む組織におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝３～８。統計値は、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって解析し、データは、平均±標準偏差として示している。^＊：ｐ＜０．０５）。ＡＡＶベクターを静脈内送達してから１２週間後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｊ）に示されている。ＡＡＶベクターを静脈内送達してからから１２週間後のＭＴＯＬマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｋ）に示されている。

【図24H】ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける血液及び組織中のヒトＮ－アセチルガラクトサミン－６－硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）酵素活性である。（Ａ）ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳウイルスベクター及びＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳウイルスベクターのゲノムの概略的な構造である。血液試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから、１週間おきに、１６週齢まで採取し、（Ｂ）ノックアウト（ＫＯ）マウス及び（Ｃ）寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおいて、血漿中のｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝４～７）。骨標的シグナルを含むＡＡＶベクターまたは骨標的シグナルを含まないＡＡＶベクターを注射してから１２週間後に、組織試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取した。ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスにおいて、（Ｄ）肝臓、（Ｅ）脾臓、（Ｆ）肺、（Ｇ）腎臓、（Ｈ）心臓及び（Ｉ）骨（肢骨）を含む組織におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝３～８。統計値は、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって解析し、データは、平均±標準偏差として示している。^＊：ｐ＜０．０５）。ＡＡＶベクターを静脈内送達してから１２週間後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｊ）に示されている。ＡＡＶベクターを静脈内送達してからから１２週間後のＭＴＯＬマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｋ）に示されている。

【図24I】ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける血液及び組織中のヒトＮ－アセチルガラクトサミン－６－硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）酵素活性である。（Ａ）ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳウイルスベクター及びＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳウイルスベクターのゲノムの概略的な構造である。血液試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから、１週間おきに、１６週齢まで採取し、（Ｂ）ノックアウト（ＫＯ）マウス及び（Ｃ）寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおいて、血漿中のｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝４～７）。骨標的シグナルを含むＡＡＶベクターまたは骨標的シグナルを含まないＡＡＶベクターを注射してから１２週間後に、組織試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取した。ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスにおいて、（Ｄ）肝臓、（Ｅ）脾臓、（Ｆ）肺、（Ｇ）腎臓、（Ｈ）心臓及び（Ｉ）骨（肢骨）を含む組織におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝３～８。統計値は、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって解析し、データは、平均±標準偏差として示している。^＊：ｐ＜０．０５）。ＡＡＶベクターを静脈内送達してから１２週間後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｊ）に示されている。ＡＡＶベクターを静脈内送達してからから１２週間後のＭＴＯＬマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｋ）に示されている。

【図24J】ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける血液及び組織中のヒトＮ－アセチルガラクトサミン－６－硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）酵素活性である。（Ａ）ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳウイルスベクター及びＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳウイルスベクターのゲノムの概略的な構造である。血液試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから、１週間おきに、１６週齢まで採取し、（Ｂ）ノックアウト（ＫＯ）マウス及び（Ｃ）寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおいて、血漿中のｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝４～７）。骨標的シグナルを含むＡＡＶベクターまたは骨標的シグナルを含まないＡＡＶベクターを注射してから１２週間後に、組織試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取した。ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスにおいて、（Ｄ）肝臓、（Ｅ）脾臓、（Ｆ）肺、（Ｇ）腎臓、（Ｈ）心臓及び（Ｉ）骨（肢骨）を含む組織におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝３～８。統計値は、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって解析し、データは、平均±標準偏差として示している。^＊：ｐ＜０．０５）。ＡＡＶベクターを静脈内送達してから１２週間後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｊ）に示されている。ＡＡＶベクターを静脈内送達してからから１２週間後のＭＴＯＬマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｋ）に示されている。

【図24K】ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける血液及び組織中のヒトＮ－アセチルガラクトサミン－６－硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）酵素活性である。（Ａ）ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳウイルスベクター及びＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳウイルスベクターのゲノムの概略的な構造である。血液試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから、１週間おきに、１６週齢まで採取し、（Ｂ）ノックアウト（ＫＯ）マウス及び（Ｃ）寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおいて、血漿中のｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝４～７）。骨標的シグナルを含むＡＡＶベクターまたは骨標的シグナルを含まないＡＡＶベクターを注射してから１２週間後に、組織試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取した。ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスにおいて、（Ｄ）肝臓、（Ｅ）脾臓、（Ｆ）肺、（Ｇ）腎臓、（Ｈ）心臓及び（Ｉ）骨（肢骨）を含む組織におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝３～８。統計値は、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって解析し、データは、平均±標準偏差として示している。^＊：ｐ＜０．０５）。ＡＡＶベクターを静脈内送達してから１２週間後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｊ）に示されている。ＡＡＶベクターを静脈内送達してからから１２週間後のＭＴＯＬマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｋ）に示されている。

【0104】

【図25A】ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける血液及び組織中のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）レベルである。血液試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから１週間おきに、１６週齢まで採取し、（Ａ）ノックアウト（ＫＯ）マウス及び（Ｂ）寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおいて、血漿中のモノ硫酸化ＫＳレベルを測定した（ｎ＝４～８）。骨標的シグナルを含むＡＡＶベクター、または骨標的シグナルを含まないＡＡＶベクターを注射してから１２週間後に、組織試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取した。ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスにおいて、（Ｃ）肝臓及び（Ｄ）肺を含む組織におけるＫＳの量を測定した（ｎ＝４～８）。統計値は、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって解析した。データは、平均±標準偏差として表している。^＊は、ｐ＜０．０５である。

【図25B】ミノグリカン（ＧＡＧ）レベルである。血液試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから１週間おきに、１６週齢まで採取し、（Ａ）ノックアウト（ＫＯ）マウス及び（Ｂ）寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおいて、血漿中のモノ硫酸化ＫＳレベルを測定した（ｎ＝４～８）。骨標的シグナルを含むＡＡＶベクター、または骨標的シグナルを含まないＡＡＶベクターを注射してから１２週間後に、組織試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取した。ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスにおいて、（Ｃ）肝臓及び（Ｄ）肺を含む組織におけるＫＳの量を測定した（ｎ＝４～８）。統計値は、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって解析した。データは、平均±標準偏差として表している。^＊は、ｐ＜０．０５である。

【図25C】ミノグリカン（ＧＡＧ）レベルである。血液試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから１週間おきに、１６週齢まで採取し、（Ａ）ノックアウト（ＫＯ）マウス及び（Ｂ）寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおいて、血漿中のモノ硫酸化ＫＳレベルを測定した（ｎ＝４～８）。骨標的シグナルを含むＡＡＶベクター、または骨標的シグナルを含まないＡＡＶベクターを注射してから１２週間後に、組織試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取した。ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスにおいて、（Ｃ）肝臓及び（Ｄ）肺を含む組織におけるＫＳの量を測定した（ｎ＝４～８）。統計値は、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって解析した。データは、平均±標準偏差として表している。^＊は、ｐ＜０．０５である。

【図25D】ミノグリカン（ＧＡＧ）レベルである。血液試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから１週間おきに、１６週齢まで採取し、（Ａ）ノックアウト（ＫＯ）マウス及び（Ｂ）寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおいて、血漿中のモノ硫酸化ＫＳレベルを測定した（ｎ＝４～８）。骨標的シグナルを含むＡＡＶベクター、または骨標的シグナルを含まないＡＡＶベクターを注射してから１２週間後に、組織試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取した。ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスにおいて、（Ｃ）肝臓及び（Ｄ）肺を含む組織におけるＫＳの量を測定した（ｎ＝４～８）。統計値は、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって解析した。データは、平均±標準偏差として表している。^＊は、ｐ＜０．０５である。

【0105】

【図26A】ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける骨の病態の矯正である。トルイジンブルー染色解析によって、ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスの膝関節における成長板の光学顕微鏡観察を用いて、軟骨細胞の空胞化の矯正を評価した。ノックアウト（ＫＯ）マウス及び寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおける骨の病態を野生型、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ、及び骨標的シグナルを含むＡＡＶ８ベクターまたは骨標的シグナルを含まないＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡと比較した。スケールバーは２５μｍである。

【図26B】ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける骨の病態の矯正である。トルイジンブルー染色解析によって、ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスの膝関節における関節円板の光学顕微鏡観察を用いて、軟骨細胞の空胞化の矯正を評価した。ノックアウト（ＫＯ）マウス及び寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおける骨の病態を野生型、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ、及び骨標的シグナルを含むＡＡＶ８ベクターまたは骨標的シグナルを含まないＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡと比較した。スケールバーは２５μｍである。

【図26C】大腿骨または脛骨の成長板病変における軟骨細胞の細胞サイズをＩｍａｇｅ Ｊというソフトウェアによって定量した。データは、野生型群からの変化倍率で表した。ｎ＝４～７である。統計値は、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって解析した。データは、平均±標準偏差として表している。^＊は、ｐ＜０．０５である。

【0106】

【図27】ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける心臓の病態の矯正である。トルイジンブルー染色解析によって、ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスの（Ａ）心臓弁及び（Ｂ）心筋の光学顕微鏡観察を用いて、空胞化の矯正を評価した。ノックアウト（ＫＯ）マウス及び寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおける心臓の病態を野生型、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ、及び骨標的シグナルを含むＡＡＶ８ベクターまたは骨標的シグナルを含まないＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡと比較した。矢印は、疾患と関連する小胞の位置を示している。スケールバーは、２５μｍである。

【0107】

【図28】ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける循環抗ｈＧＡＬＮＳ抗体の力価である。骨標的シグナルを含むＡＡＶ８ベクターまたは骨標的シグナルを含まないＡＡＶ８ベクターを注射してから１２週間後に、血漿をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取した。循環抗ｈＧＡＬＮＳ抗体の力価を間接ＥＬＩＳＡアッセイによって検出した。ＯＤ４０５値をマイクロプレート分光光度計で測定した（ｎ＝４～８）。統計値は、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって解析した。データは、平均±標準偏差として表している。^＊は、ｐ＜０．０５である。

【0108】

【図29】骨標的シグナルを有する最適化ｈＧＡＬＮＳまたは骨標的シグナルを有さない最適化ｈＧＡＬＮＳの評価である。Ｈｕｈ－７細胞に、骨標的シグナルを有するか、または骨標的シグナルを有さないｈＧＡＬＮＳまたはコドン最適化ｈＧＡＬＮＳを発現するＡＡＶ８ベクタープラスミドをそれぞれトランスフェクションした。トランスフェクションから４８時間後、細胞ペレットと培地を回収し、ｈＧＡＬＮＳ活性を測定した。（Ａ）ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳプラスミド、ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳ－ＣｏＯｐｔプラスミド、ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳプラスミドまたはＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳ－ＣｏＯｐｔプラスミドのいずれかをトランスフェクションした後、ＨｕＨ－７細胞において、細胞内酵素活性を求めた。（Ｂ）ＨｕＨ－７細胞に、ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳプラスミド、ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳ－ＣｏＯｐｔプラスミド、ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳプラスミドまたはＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳ－ＣｏＯｐｔプラスミドをトランスフェクションした後、その培地中の酵素活性を求めた。データは、平均として表されている。ｎ＝２である。

【0109】

【図30】ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける血液中のヘパラン硫酸（ＨＳ）レベルである。血液試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取し、ノックアウト（ＫＯ）マウス及び寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおいて、血漿中のｄｉＨＳ－０Ｓレベルを１６週齢において測定した。データは、平均±標準偏差として表している。ＡＡＶは、アデノ随伴ウイルス、ＴＢＧは、サイロキシン結合性グロブリン、ｈＧＡＬＮＳは、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－硫酸スルファターゼである。

【0110】

【図31】ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける組織中のヘパラン硫酸（ＨＳ）レベルである。骨標的シグナルを含むＡＡＶベクターまたは骨標的シグナルを含まないＡＡＶベクターを注射してから１２週間後に、組織試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取した。肝臓、脾臓、肺及び腎臓を含む組織中のｄｉＨＳ－０Ｓの量をＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスにおいて測定した。データは、平均±標準偏差として表している。

【0111】

【図32】ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける骨の病態の矯正である。トルイジンブルー染色解析によって、ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスの膝関節における（Ａ）靭帯及び（Ｂ）半月板の光学顕微鏡観察を用いて、軟骨細胞の空胞化の矯正を評価した。ノックアウト（ＫＯ）マウス及び寛容性マウス（Ｍｔｏｌ）における骨の病態を野生型、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ、及び骨標的シグナルを含むＡＡＶ８ベクターまたは骨標的シグナルを含まないＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡと比較した。矢印は、疾患と関連する小胞の位置を示している（スケールバーは２５μｍである）。

【0112】

【図33】肝臓特異的ＡｐｏＥエンハンサー／肝制御領域が５’に、そして、ＡＴＧトリヌクレオチド（ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ））が枯渇したｈＡＡＴプロモーターが３’に隣接しており、肝細胞特異的発現を駆動する最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターフラグメント（Ｌｕ， Ｘ．， ｅｔ ａｌ． ＪＢＣ ２８１， ６２９７－６３０６， Ｊａｎｕａｒｙ １２， ２００６）（配列番号２４）を示すＬＢＴＰ１プロモーターマップ。キメラβ－グロビン／Ｉｇイントロンを、プロモーター配列の下流（３’）、すなわち、ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）の下流に置いた。最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターフラグメントは、骨芽細胞特異的発現を駆動し、そして、全長Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターの転写活性フラグメントである、ことが決定されている（Ｌｕ， Ｘ．， ｅｔ ａｌ． ＪＢＣ ２８１， ６２９７－６３０６， Ｊａｎｕａｒｙ １２， ２００６）。

【0113】

【図34】全長Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーター（Ｌｕ， Ｘ．， ｅｔ ａｌ． ＪＢＣ ２８１， ６２９７－６３０６， Ｊａｎｕａｒｙ １２， ２００６）（配列番号２３）が、肝臓特異的ＡｐｏＥエンハンサー／肝制御領域を５’に、そして、ＡＴＧトリヌクレオチド（ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ））が枯渇したｈＡＡＴプロモーターを３’に隣接させることで、肝細胞特異的発現を駆動することを示すＬＢＴＰ２プロモーターマップである。

【0114】

【図35】全長Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーター駆動ｈＧＡＬＮＳを発現するＡＡＶコンストラクトの概略図である。

【0115】

【図36】最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーター駆動ｈＧＡＬＡＮＳを発現するＡＡＶコンストラクトの概略図である。

【0116】

【図37】肝細胞及び骨芽細胞特異的発現のためのＬＢＴＰ１プロモーター駆動ｈＧＡＬＮＳを発現するＡＡＶコンストラクトの概略図。当該コンストラクトは：骨芽細胞特異的発現を駆動する最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターフラグメントを含む。最小のＳｐ７プロモーターフラグメントは、５’に肝臓特異的ＡｐｏＥエンハンサーを、そして、３’にＡＴＧトリヌクレオチド（ｈＡＡＴΔ）が枯渇したｈＡＡＴプロモーターが隣接しており、肝細胞特異的発現、キメライントロン、及びコドン最適化、そして、ＣｐＧネガティブＧＡＬＮＳタンパク質コード配列を駆動する。

【0117】

【図38】肝細胞及び骨芽細胞特異的発現のためのＬＢＴＰ２プロモーター駆動ｈＧＡＬＮＳを発現するＡＡＶコンストラクトの概略図。当該コンストラクトは：骨芽細胞特異的発現を駆動する全長Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターフラグメントを含む。当該全長Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターフラグメントは、５’に肝臓特異的ＡｐｏＥエンハンサーを、そして、３’にＡＴＧトリヌクレオチド（ｈＡＡＴΔ）が枯渇したｈＡＡＴプロモーターが隣接しており、肝細胞特異的発現、キメライントロン、及びコドン最適化、そして、ＣｐＧネガティブＧＡＬＮＳタンパク質コード配列を駆動する。

【0118】

【図39】骨梁の関心体積を、白色領域（左側が骨梁、右側が皮質骨）で示す。

【発明を実施するための形態】

【0119】

６．詳細な説明
本発明は、特定のｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を、ムコ多糖症ＩＶＡ型（ＭＰＳ ＩＶＡ）の動物モデルにおいて投与したところ、モニタリング期間全体を通じて、高レベルのｈＧＡＬＮＳ酵素活性が維持され、骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋、及び心臓弁を含む組織が改善され、酵素補充療法（ＥＲＴ）で得られる改善を上回る改善が認められた、との驚くべき知見に少なくとも部分的に基づくものである。

【0120】

本明細書では、治療の必要なヒト対象のＭＰＳ ＩＶＡの治療に使用するｒＡＡＶを記載している。これらのｒＡＡＶは、ｈＧＡＬＮＳをコードする組み換えＡＡＶゲノムを含む。当該ｒＡＡＶは、ＭＰＳ ＩＶＡ患者に投与でき、その結果、ｈＧＡＬＮＳが合成され、ｈＧＡＬＮＳが、骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋、及び／または心臓弁のような罹患組織に送達され、それにより、病態が改善され、その疾患の進行が抑えられる。

【0121】

提供しているのは、ＡＡＶキャプシドと、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）が隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組み換えＡＡＶゲノムとを含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）である。特定の実施形態では、当該ｒＡＡＶキャプシドは、血清型ＡＡＶ８のキャプシドと、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％が同一である。特定の実施形態では、当該ｒＡＡＶキャプシドのアミノ酸配列は、配列番号１と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％が同一である。特定の実施形態では、当該ｒＡＡＶキャプシドのアミノ酸配列は、配列番号１と、８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、９５～９９％、または９９～９９．９％が同一である。特定の実施形態では、当該ｒＡＡＶキャプシドのアミノ酸配列は、配列番号１と同一である。特定の実施形態では、当該ｒＡＡＶキャプシドのアミノ酸配列は、配列番号１を含む。特定の実施形態では、当該ｒＡＡＶキャプシドは、血清型ＡＡＶ９キャプシドと、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％が同一である。特定の実施形態では、当該ｒＡＡＶキャプシドのアミノ酸配列は、配列番号２６と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％が同一である。特定の実施形態では、当該ｒＡＡＶキャプシドのアミノ酸配列は、配列番号２６と、８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、９５～９９％、または９９～９９．９％が同一である。特定の実施形態では、当該ｒＡＡＶキャプシドのアミノ酸配列は、配列番号２６と同一である。特定の実施形態では、当該ｒＡＡＶキャプシドのアミノ酸配列は、配列番号２６を含む。ｒＡＡＶキャプシドに関するさらなる詳細については、セクション６．１．１を参照されたい。一部の実施形態では、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該酸性オリゴペプチドは、Ｄ８である。特定の実施形態では、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、肝臓特異的プロモーター（例えば、サイロキシン結合性グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター）をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、骨－肝臓タンデムプロモーター（例えば、ＬＢＴＰ１またはＬＢＴＰ２プロモーター）をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、また、当該骨－肝臓タンデムプロモーターは、骨特異的プロモーター、及び肝臓特異的プロモーターを含む。特定の実施形態では、骨特異的プロモーターは、Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーター、または最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターである。特定の実施形態では、当該肝臓特異的プロモーターは、ｈＡＡＴプロモーター、または、好ましくは、ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーターである。特定の実施形態では、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、ポリＡ部位をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。その他の実施形態では、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、肝臓特異的プロモーター（例えば、ＴＢＧプロモーター）をコードするヌクレオチド配列と、ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含み、当該肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列は、そのｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結している。特定の実施形態では、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、ポリＡ部位をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。

【0122】

また、本明細書では、本明細書に記載したようなｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドを提供する。さらに、本明細書で提供する方法及び組成物と一緒に使用するためのｒＡＡＶを作製する目的で、本明細書で提供するポリヌクレオチドを含むプラスミド及び細胞（例えば、エクスビボ宿主細胞）を提供する。

【0123】

本発明では、本明細書に記載したｒＡＡＶの作製方法をさらに提供する。

【0124】

また、本明細書では、ムコ多糖症ＩＶＡ型（ＭＰＳ ＩＶＡ）の診断を受けたヒト対象の治療方法を提供する。ある態様では、当該方法は、本明細書に記載したｒＡＡＶを、当該ヒト対象に投与することを含む。別の態様では、当該方法は、グリコシル化ｈＧＡＬＮＳ（例えば、肝細胞で産生して、同細胞から分泌することで、マンノース－６－リン酸でグリコシル化されるｈＧＡＬＮＳ）を、その罹患組織（複数可）に送達することを含む。別の態様では、当該方法は、酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をその罹患組織（複数可）に送達することを含む。当該融合タンパク質は、肝細胞で産生して、同細胞から分泌することで、マンノース－６－リン酸でグリコシル化することができる。

【0125】

本発明では、本明細書に記載したｒＡＡＶを含む医薬組成物及びキットをさらに提供する。

【0126】

本明細書で提供するｒＡＡＶは、セクション６．１に記載されており、当該セクションでは、セクション６．１．１でのｒＡＡＶキャプシドの説明と、セクション６．１．２でのｈＧＡＬＮＳ発現カセットの説明を含む。セクション６．２には、本明細書で提供するｒＡＡＶの作製方法、ならびに当該方法で使用できるポリヌクレオチド、プラスミド及び細胞が説明されている。セクション６．３には、ＭＰＳ ＩＶＡの診断を受けたヒト対象の治療方法が、標的患者集団、投与経路及び投与レジメンを含めて説明されている。セクション６．４には、併用療法が説明されている。セクション６．５には、疾患マーカー、及び臨床転帰の評価方法が説明されている。セクション７には、限定を意図していない実施例を示している。

【0127】

理論に拘束される訳ではないが、本発明のｒＡＡＶの作製、組成物及び使用方法は、ＭＰＳ ＩＶＡに対する治療として、ｈＧＡＬＮＳ酵素を、ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、半月板、及び／または心臓弁になおも送達するように修正することができる。

【0128】

６．１ 組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）
本明細書では、治療の必要なヒト対象のＭＰＳ ＩＶＡの治療に有用なｒＡＡＶを提供しており、当該ｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシドと、ｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組み換えＡＡＶゲノムとを含む。

【0129】

ある態様では、本明細書では：（ａ）ＡＡＶキャプシド（例えば、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９キャプシド）；及び、（ｂ）ＡＡＶ－ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２－ＩＴＲ）が隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むｒＡＡＶを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードする導入遺伝子などの導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む。当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含み得、当該肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列は、当該融合タンパク質をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結している。

【0130】

別の態様では、本明細書では：（ａ）ＡＡＶキャプシド（例えば、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９キャプシド）；及び、（ｂ）ＡＡＶ－ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２－ＩＴＲ）が隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むｒＡＡＶを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列と、ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列とを含み、また、当該肝臓特異的プロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列は、ｈＧＡＬＮＳをコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結している。

【0131】

別の態様では、本明細書では：（ａ）ＡＡＶキャプシド（例えば、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９キャプシド）；及び（ｂ）ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、骨－肝臓タンデムプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列とを含み、また、当該導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳをコードし、また、当該骨－肝臓タンデムプロモーターは、骨特異的プロモーターと、肝臓特異的プロモーターを含み、そして、当該骨－肝臓タンデムプロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列を、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。

【0132】

別の態様では、本明細書では：（ａ）ＡＡＶキャプシド（例えば、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９キャプシド）；及び（ｂ）ＡＡＶ－ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２－ＩＴＲ）に隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、骨－肝臓タンデムプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、当該導入遺伝子は、酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードし、また、当該骨－肝臓タンデムプロモーターは、骨特異的プロモーターと、肝臓特異的プロモーターとを含み、そして、当該骨－肝臓タンデムプロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列を、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。特定の実施形態では、当該酸性オリゴペプチドは、Ｄ８である。

【0133】

別の態様では、本明細書では：（ａ）ＡＡＶキャプシド（例えば、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９キャプシド）；及び（ｂ）ＡＡＶ－ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２－ＩＴＲ）に隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、当該導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳをコードし、そして、当該Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列を、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。

【0134】

別の態様では、本明細書では：（ａ）ＡＡＶキャプシド（例えば、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９キャプシド）；及び（ｂ）ＡＡＶ－ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２－ＩＴＲ）に隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、当該導入遺伝子は、酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードし、そして、当該Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列を、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。特定の実施形態では、当該酸性オリゴペプチドは、Ｄ８である。

【0135】

別の態様では、本明細書では：（ａ）ＡＡＶキャプシド（例えば、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９キャプシド）；及び（ｂ）ＡＡＶ－ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２－ＩＴＲ）に隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、当該導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳをコードし、そして、最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列を、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。

【0136】

別の態様では、本明細書では：（ａ）ＡＡＶキャプシド（例えば、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９キャプシド）；及び（ｂ）ＡＡＶ－ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２－ＩＴＲ）に隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、当該導入遺伝子は、酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードし、そして、最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列を、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。特定の実施形態では、当該酸性オリゴペプチドは、Ｄ８である。

【0137】

特定の実施形態では、本明細書では：（ａ）ＡＡＶ９キャプシド；及び（ｂ）ＡＡＶ２－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２発現カセットは、ＣＡＧプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、当該導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳ（または、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２）をコードし、そして、当該ＣＡＧプロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列を、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。一部の実施形態では、このコンストラクトには、例えば、本開示の実施例１２に開示した通り、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２の別名がある。

【0138】

特定の実施形態では、本明細書では：（ａ）ＡＡＶ９キャプシド；及び（ｂ）ＡＡＶ２－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２発現カセットは、ＬＭＴＰ６プロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、当該導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳ（または、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２）をコードし、そして、当該ＬＭＴＰ６プロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列を、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。一部の実施形態では、このコンストラクトには、例えば、本開示の実施例１２に開示した通り、ＡＡＶ９－ＬＭＴＰ６－ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２の別名がある。

【0139】

特定の実施形態では、本明細書では：（ａ）ＡＡＶ９キャプシド；及び（ｂ）ＡＡＶ２－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２発現カセットは、ＬＢＴＰ２プロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、当該導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳ（または、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２）をコードし、そして、当該ＬＢＴＰ２プロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列を、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。一部の実施形態では、このコンストラクトには、例えば、本開示の実施例１２に開示した通り、ＡＡＶ９－ＬＢＴＰ２－ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２の別名がある。

【0140】

特定の実施形態では、本明細書では：（ａ）ＡＡＶ８キャプシド；及び（ｂ）ＡＡＶ２－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２発現カセットは、ＣＡＧプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、当該導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳ（または、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２）をコードし、そして、当該ＣＡＧプロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列を、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。一部の実施形態では、このコンストラクトには、例えば、本開示の実施例１２に開示した通り、ＡＡＶ８－ＣＡＧ－ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２の別名がある。

【0141】

特定の実施形態では、本明細書では：（ａ）ＡＡＶ８キャプシド；及び（ｂ）ＡＡＶ２－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２発現カセットは、ＬＭＴＰ６プロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、当該導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳ（または、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２）をコードし、そして、当該ＬＭＴＰ６プロモーターをコードするヌクレオチド配列を、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。一部の実施形態では、このコンストラクトには、例えば、本開示の実施例１２に開示した通り、ＡＡＶ８－ＬＭＴＰ６－ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２の別名がある。

【0142】

特定の実施形態では、本明細書では：（ａ）ＡＡＶ８キャプシド；及び（ｂ）ＡＡＶ２－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２発現カセットは、ＬＢＴＰ２プロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、当該導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳ（または、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２）をコードし、そして、当該ＬＢＴＰ２プロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列を、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。一部の実施形態では、このコンストラクトには、例えば、本開示の実施例１２に開示した通り、ＡＡＶ８－ＬＢＴＰ２－ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２の別名がある。

【0143】

特定の実施形態では、本明細書では：（ａ）ＡＡＶ８キャプシド；及び（ｂ）ＡＡＶ２－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２発現カセットは、ＴＢＧプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、当該導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳ（または、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２）をコードし、そして、当該ＴＢＧプロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列を、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。一部の実施形態では、このコンストラクトには、例えば、本開示の実施例１２に開示した通り、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２の別名がある。

【0144】

特定の実施形態では、本明細書では：（ａ）ＡＡＶ８キャプシド；及び（ｂ）ＡＡＶ２－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２発現カセットは、ＬＳＰＸ１プロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、当該導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳ（または、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２）をコードし、そして、当該ＬＳＰＸ１プロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列を、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。一部の実施形態では、このコンストラクトには、例えば、本開示の実施例１２に開示した通り、ＡＡＶ８－ＬＳＰＸ１－ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２の別名がある。

【0145】

特定の実施形態では、本明細書では：（ａ）ＡＡＶ８キャプシド；及び（ｂ）ＡＡＶ２－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳｃｏ発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳｃｏ発現カセットは、ＴＢＧプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、当該導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳ（または、ｈＧＡＬＮＳｃｏ）をコードし、そして、当該ＴＢＧプロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列を、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。一部の実施形態では、このコンストラクトには、例えば、本開示の実施例１２に開示した通り、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳｃｏの別名がある。

【0146】

本明細書に記載した態様及び実施形態の様々な実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ８である。本明細書に記載したｒＡＡＶの態様及び実施形態の様々な実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ９である。

【0147】

特定の実施形態では、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列を含み、そのｈＧＡＬＮＳタンパク質が、肝臓で発現されるようになっており、そのｈＧＡＬＮＳタンパク質は、肝細胞から分泌されると、骨、軟骨、及び関連組織、ならびに心臓弁といった重篤な影響を受けた臓器など、これらに限定されないその他の組織に移動する。

【0148】

本明細書で提供するｒＡＡＶの様々な成分について、以下に詳細に説明する。

【0149】

６．１．１ キャプシド
キャプシドは、ウイルスゲノムを包み込んで保護すると同時に、宿主環境と相互作用する、ウイルスのタンパク質シェルである。本発明に従って、本明細書で提供するｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシドを含む。特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、天然に見られるＡＡＶのキャプシド（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、またはＡＡＶ１１のキャプシド）である。別の特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、例えば、天然に見られるＡＡＶのキャプシド（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶ１１のキャプシド）のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９％、または１００％が同一であるアミノ酸配列を有することで、天然に見られるＡＡＶのキャプシドから誘導されたものである。

【0150】

特定の実施形態では、本明細書に記載した本発明に従って使用できるＡＡＶバリアントキャプシドとしては、Ｚｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１２（６）：１０５６－１０６８に記載しているようなＡｎｃ８０またはＡｎｃ８０Ｌ６５があり、その文献は、参照により、その全内容を援用する。特定の実施形態では、本明細書に記載した本発明に従って使用できるＡＡＶバリアントキャプシドは、米国特許第９，１９３，９５６号、同第９，４５８，５１７号、及び同第９，５８７，２８２号、ならびに米国特許出願公開第２０１６／０３７６３２３号に記載しているようなＬＧＥＴＴＲＰまたはＬＡＬＧＥＴＴＲＰというアミノ酸挿入の１つを含み、それらの特許はそれぞれ、参照により、その全内容を本明細書で援用する。特定の実施形態では、本明細書に記載した本発明に従って使用できるＡＡＶバリアントキャプシドとしては、米国特許第９，１９３，９５６号、同第９，４５８，５１７号及び同第９，５８７，２８２号、ならびに米国特許出願公開第２０１６／０３７６３２３号に記載しているようなＡＡＶ．７ｍ８があり、それらの特許はそれぞれ、参照により、その全内容を本明細書で援用する。特定の実施形態では、本明細書に記載した本発明に従って使用できるＡＡＶバリアントキャプシドとしては、米国特許第９，５８５，９７１号に開示されているいずれかのＡＡＶ（ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂなど）がある。特定の実施形態では、本発明に従って使用できるＡＡＶバリアントキャプシドとしては、米国特許第７，２８２，１９９号、同第７，９０６，１１１号、同第８，５２４，４４６号、同第８，９０６，６７５号、同第８，９９９，６７８号、同第８，６２８，９６６号、同第８，９２７，５１４号、同第８，７３４，８０９号、同第９，２８４，３５７号、同第９，４０９，９５３号、同第９，１６９，２９９号、同第９，１９３，９５６号、同第９４５８５１７号、同第９，５８７，２８２号、同第９，７３７，６１８号、同第９，８４０，７１９号、米国特許出願公開第２０１５／０３７４８０３号、同第２０１５／０１２６５８８号、同第２０１７／００６７９０８号、同第２０１３／０２２４８３６号、同第２０１６／０２１５０２４号、同第２０１７／００５１２５７号、及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０３３６３０号、同第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２８８１７号、同第ＰＣＴ／２００２／０３３６２９号、同第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１３３７５号、同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号、同第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５号、同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４２４７２号、同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２７３９２号という特許及び特許出願のいずれかに開示されているものがあるが、これらに限らず、これらの特許及び特許出願はそれぞれ、参照により、その全内容を本明細書で援用する。

【0151】

特定の実施形態では、前掲の一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）を使用し得る。特定の実施形態では、自己相補型ベクター、例えばｓｃＡＡＶも使用し得る（例えば、Ｗｕ，２００７，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１８（２）：１７１－８２、ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，２００１，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ ８，Ｎｕｍｂｅｒ １６，Ｐａｇｅｓ１２４８－１２５４、ならびに米国特許第６，５９６，５３５号、同第７，１２５，７１７号及び同第７，４５６，６８３号（これらの文献はそれぞれ、参照により、その全内容を本明細書で援用する）を参照されたい）。

【0152】

特定の実施形態では、本発明のｒＡＡＶに含まれるＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ８のキャプシドであるか、ＡＡＶ８のキャプシドから誘導されたものである。ＡＡＶ８は、その他の血清型よりも、肝臓への形質導入効率が高く、ヒトＡＡＶに対する抗体への反応性が低い。重要なことに、ＡＡＶ８キャプシドの所定の領域は、核移行及びキャプシド脱殻を媒介することで、肝臓への高度な形質導入に寄与する（Ｔｅｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１４，４５４－４５５：２２７－２３６、Ｎａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，２００７ ８１（２２）：１２２６０－１２２７１）。その結果、ＡＡＶ８は、肝細胞に対する向性を有する（Ｓａｎｄｓ，Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２０１１；８０７：１４１－１５７）。特定の実施形態では、本発明のｒＡＡＶに含まれるＡＡＶキャプシドのアミノ酸配列は、ＡＡＶ８キャプシドのアミノ酸配列（配列番号１）と同一である。特定の実施形態では、本発明のｒＡＡＶに含まれるＡＡＶキャプシドのアミノ酸配列は、ＡＡＶ８キャプシドのアミノ酸配列（配列番号１）と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも９９．９％が同一である一方で、ＡＡＶ８キャプシドがウイルスゲノムを包み込む能力、かつ好ましくは、ＡＡＶ８キャプシドが肝細胞に高効率で形質導入させる能力を保持している。特定の実施形態では、本発明のｒＡＡＶに含まれるＡＡＶキャプシドのアミノ酸配列は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個または３０個のアミノ酸残基以外は、ＡＡＶ８キャプシドのアミノ酸配列（配列番号１）と同一である一方で、ＡＡＶ８キャプシドがウイルスゲノムを包み込む能力、かつ好ましくは、ＡＡＶ８キャプシドが肝細胞に高効率で形質導入させる能力を保持している。本明細書に記載した治療方法の特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳタンパク質を肝臓で標的発現させるのに、ＡＡＶ８を使用する。

【0153】

特定の実施形態では、ｒＡＡＶに含まれるＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ９のキャプシドである、またはＡＡＶ９のキャプシドに由来する。特定の実施形態では、ｒＡＡＶに含まれるＡＡＶキャプシドのアミノ酸配列は、ＡＡＶ９キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２６）と同一である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶに含まれるＡＡＶキャプシドのアミノ酸配列は、ＡＡＶ９キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２６）と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％が同一である、その一方で、ＡＡＶ９キャプシドがウイルスゲノムを包み込む能力、かつ好ましくは、ＡＡＶ９キャプシドが肝細胞に高効率で形質導入させる能力を保持している。特定の実施形態では、ｒＡＡＶに含まれるＡＡＶキャプシドのアミノ酸配列は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個または３０個のアミノ酸残基を除くＡＡＶ９キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２６）と同一である、その一方で、ＡＡＶ９キャプシドがウイルスゲノムを包み込む能力、かつ好ましくは、ＡＡＶ９キャプシドが肝細胞に高効率で形質導入させる能力を保持している。本明細書に記載した治療方法の特定の実施形態では、ＡＡＶ９は、ｈＧＡＬＮＳタンパク質の標的肝臓発現のために使用する。

【0154】

６．１．２ ｈＧＡＬＮＳ発現カセット
ＡＡＶは、末端に２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む直鎖状一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ゲノムを有する。ＡＡＶは、エンドサイトーシスによって細胞に進入する（Ｍｅｉｅｒ ａｎｄ Ｇｒｅｂｅｒ，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．，２００４；６ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ１５２－６３）。キャプシドが破壊されると、ｓｓＤＮＡゲノムが放出され、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＮＤＡ）に変換され、そのｄｓＤＮＡから、そのウイルスゲノムによってコードされる遺伝子を発現させることができる（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１２：８７３－８８０）。

【0155】

本発明によれば、本明細書で提供するｒＡＡＶは、組み換えＡＡＶゲノムを含む。その組み換えＡＡＶゲノムは、ＡＡＶゲノムまたはそのバリアントの主鎖（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶ１１のゲノム、またはそのバリアントの主鎖）を含むことができる。一部の実施形態では、組換えＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ８ゲノムまたはそのバリアントの主鎖を含むことができる。一部の実施形態では、組換えＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ９ゲノムまたはそのバリアントの主鎖を含むことができる。特定の実施形態では、組換えＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ８ゲノムまたはそのバリアントの主鎖を含む。特定の実施形態では、組換えＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ９ゲノムまたはそのバリアントの主鎖を含む。

【0156】

本発明によれば、組換えＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ－ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２－ＩＴＲ）に隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む。一部の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、ｈＧＡＬＮＳｃｏである。一部の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２である。一部の実施形態では、組換えＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ８ゲノムまたはそのバリアントの主鎖を含み、また、ＡＡＶ－ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２－ＩＴＲ）に隣接するｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２発現カセットを含む。一部の実施形態では、組換えＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ９ゲノムまたはそのバリアントの主鎖を含み、また、ＡＡＶ－ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２－ＩＴＲ）に隣接するｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２発現カセットを含む。一部の実施形態では、組換えＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ８ゲノムまたはそのバリアントの主鎖を含み、また、ＡＡＶ－ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２－ＩＴＲ）に隣接するｈＧＡＬＮＳｃｏ発現カセットを含む。一部の実施形態では、組換えＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ９ゲノムまたはそのバリアントの主鎖を含み、また、ＡＡＶ－ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２－ＩＴＲ）に隣接するｈＧＡＬＮＳｃｏ発現カセットを含む。一部の実施形態では、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含み得、また、当該肝臓特異的プロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列は、当該融合タンパク質をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結している。その他の実施形態では、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、肝臓特異的プロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列と、ｈＧＡＬＮＳをコードする当該ヌクレオチド配列を含み、また、当該肝臓特異的プロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列は、ｈＧＡＬＮＳをコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結している。

【0157】

（ａ）ｈＧＡＬＮＳ
一部の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳは、ｈＧＡＬＮＳ、ｈＧＡＬＮＳｃｏ、Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳ、Ｄ８－ＧＡＬＮＳｃｏ、またはｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２の１つ以上である。一部の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳは、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２である。一部の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳは、ｈＧＡＬＮＳｃｏである。一部の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳは、ｈＧＡＬＮＳである。一部の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳは、Ｄ８－ＧＡＬＮＳｃｏである。一部の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳは、Ｄ８－ＧＡＬＮＳである。

【0158】

特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳ、または融合タンパク質のｈＧＡＬＮＳ部分をコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号２、３または２７の配列を含む。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳ、または融合タンパク質のｈＧＡＬＮＳ部分をコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号２、３または２７に記載の配列と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％が同一である。

【0159】

特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳをコードする当該ヌクレオチド配列は、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２である。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳ、または融合タンパク質のｈＧＡＬＮＳ部分をコードする当該ヌクレオチド配列は、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２である。一部の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳ、または融合タンパク質のｈＧＡＬＮＳ部分をコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号２７の配列を含む。一部の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳ、または融合タンパク質のｈＧＡＬＮＳ部分をコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号２７に記載の配列と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％が同一である。

【0160】

特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳをコードする当該ヌクレオチド配列は、ｈＧＡＬＮＳｃｏである。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳ、または融合タンパク質のｈＧＡＬＮＳ部分をコードする当該ヌクレオチド配列は、ｈＧＡＬＮＳｃｏである。一部の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳ、または融合タンパク質のｈＧＡＬＮＳ部分をコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号３の配列を含む。一部の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳ、または融合タンパク質のｈＧＡＬＮＳ部分をコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号３に記載の配列と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％が同一である。

【0161】

特定の実施形態では、当該融合タンパク質をコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号４または５の配列を含む。特定の実施形態では、当該融合タンパク質をコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号４または５に示されている配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％が同一である。

【0162】

特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳ、または融合タンパク質のｈＧＡＬＮＳ部分をコードする当該ヌクレオチド配列は、ｈＧＡＬＮＳ（例えば、ｈＧＡＬＮＳ、ｈＧＡＬＮＳｃｏ、Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳ、Ｄ８－ＧＡＬＮＳｃｏ、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２）のｃＤＮＡ配列を含む。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳ、または融合タンパク質のｈＧＡＬＮＳ部分をコードする当該ヌクレオチド配列は、ｈＧＡＬＮＳのｃＤＮＡ配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％が同一である。

【0163】

特定の実施形態では、当該融合タンパク質をコードする当該ヌクレオチド配列は、当該融合タンパク質のｃＤＮＡ配列を含む。特定の実施形態では、当該融合タンパク質をコードする当該ヌクレオチド配列は、当該融合タンパク質のｃＤＮＡ配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％が同一である。

【0164】

特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳをコードする当該ヌクレオチド配列、または当該融合タンパク質をコードする当該ヌクレオチド配列は、例えば、当業者に公知のいずれかのコドン最適化技術によって、コドン最適化している（例えば、Ｑｕａｘ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ５９：１４９－１６１のレビューを参照されたい）。

【0165】

特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳをコードする当該ヌクレオチド配列、または当該融合タンパク質をコードする当該ヌクレオチド配列では、ＣｐＧ部位が枯渇している。

【0166】

本明細書に記載した態様及び実施形態の様々な実施形態では、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列を、コドン最適化する。本明細書に記載したｒＡＡＶの態様及び実施形態の様々な実施形態では、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列では、ＣｐＧ部位が枯渇している。特定の実施形態では、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列は、ｈＧＡＬＮＳをコードする当該ヌクレオチド配列を含み、この配列は、配列番号１２と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が同一である。特定の実施形態では、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列は、ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含み、この配列は、配列番号１２と、１００％同一である。

【0167】

（ｂ）酸性オリゴペプチド
酸性オリゴペプチドは、骨及び軟骨の主成分であるヒドロキシアパタイトに対する結合親和性が高い。本明細書で使用する用語「酸性オリゴペプチド」は、グルタミン酸（Ｅ）残基、及び／またはアスパラギン酸（Ｄ）残基の反復アミノ酸配列を有するオリゴペプチドのことを指す。酸性オリゴペプチドのアミノ酸残基の数は、例えば、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個とし得る。特定の実施形態では、酸性オリゴペプチドのアミノ酸残基の数は、４～８つである。特定の実施形態では、酸性オリゴペプチドのアミノ酸残基の数は、６～８つである。特定の実施形態では、酸性オリゴペプチドのアミノ酸残基の数は、６つである。別の特定の実施形態では、酸性オリゴペプチドのアミノ酸残基の数は、８つである。

【0168】

特定の実施形態では、本発明の酸性オリゴペプチドは、Ｄ８（すなわち、８個のアスパラギン酸残基からなるアミノ酸配列を有するオリゴペプチド）である。別の実施形態では、本発明の酸性オリゴペプチドは、Ｅ６（すなわち、６個のグルタミン酸残基からなるアミノ酸配列を有するオリゴペプチド）である。Ｅ６の配列は、Ｔｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，１８（６）：１１０９４－１１０２に説明されており、参照により、その全内容を本明細書で援用する。

【0169】

特定の実施形態では、当該酸性オリゴペプチドは、ｈＧＡＬＮＳのＮ末端に融合している。別の実施形態では、当該酸性オリゴペプチドは、ｈＧＡＬＮＳのＣ末端に融合している。

【0170】

特定の実施形態では、当該酸性オリゴペプチドは、ｈＧＡＬＮＳに直接融合しており、介在するアミノ酸配列を持っていない。別の特定の実施形態では、当該酸性オリゴペプチドは、リンカーアミノ酸配列（例えば、長さが１～１０個、２～８個、または４～６個のアミノ酸残基であるアミノ酸配列）を介して、ｈＧＡＬＮＳに融合している。

【0171】

特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳ酵素を、骨及び軟骨の区域でのリソソームに送達して、骨及び軟骨の病態を改善することができる。

【0172】

（ｃ）遺伝子発現のプロモーター及び修飾因子：
特定の実施形態では、本明細書に記載したｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、遺伝子の送達または遺伝子の発現を調節する成分（例えば、「発現制御エレメント」）を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載したｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、遺伝子の発現を調節する成分を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載したｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、細胞に対する結合または標的化に影響を及ぼす成分を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載したｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、取り込みをした後に、細胞内のｈＧＡＬＮＳの局在化に影響を及ぼす成分を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載したｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、例えば、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットを取り込んだ細胞について検出または選択を行う目的で、検出可能または選択可能なマーカーとして利用可能な成分を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載したｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、１つ以上のプロモーターをコードするヌクレオチド配列（複数可）を含み、それらの少なくとも１つは、ｈＧＡＬＮＳ、または酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結している。特定の実施形態では、当該プロモーターは、構成的プロモーターとすることができる。代替的な実施形態では、当該プロモーターは、誘導性プロモーターとすることができる。

【0173】

特定の実施形態では、当該プロモーターは、ＣＡＧプロモーターである。一部の実施形態では、当該ＣＡＧプロモーターは、配列番号２８に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、当該ＣＡＧプロモーターは、配列番号２８と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、当該ＣＡＧプロモーターは、配列番号２８のヌクレオチド配列、または配列番号２８の一部を含む。

【0174】

一部の実施形態では、部分とは、例えば、本開示のプロモーターと、約または少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が同一である。例えば、一部の実施形態では、配列番号２８の一部のヌクレオチド配列を含むＣＡＧプロモーターは、配列番号２８の約または少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％を含むＣＡＧプロモーターである。

【0175】

特定の実施形態では、当該プロモーターは、肝臓特異的プロモーターである。

【0176】

当該肝臓特異的プロモーターとして、サイロキシン結合性グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター（例えば、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｇｅｎｅ，５０６（２）：２８９－９４（参照により、その全内容を本明細書で援用する）を参照されたい）があるが、これに限定されない。特定の実施形態では、ＴＢＧプロモーターは、配列番号６と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が同一である。特定の実施形態では、ＴＢＧプロモーターは、配列番号６と１００％同一であるヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ＴＢＧプロモーターは、配列番号６のヌクレオチド配列、または配列番号６の一部を含む。

【0177】

特定の実施形態では、当該肝臓特異的プロモーターは、配列番号１３に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該肝臓特異的プロモーターは、配列番号１４に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該肝臓特異的プロモーターは、配列番号１５に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該肝臓特異的プロモーターは、配列番号１３である。特定の実施形態では、当該肝臓特異的プロモーターは、配列番号１４である。特定の実施形態では、当該肝臓特異的プロモーターは、配列番号１５である。特定の実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、配列番号１３、または配列番号１３の一部を含む。特定の実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、配列番号１４、または配列番号１５の一部を含む。特定の実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、配列番号１５または配列番号１５の一部を含む。

【0178】

特定の実施形態では、当該プロモーターは、肝臓、及び筋肉に特異的なプロモーターである。

【0179】

特定の実施形態では、肝臓及び筋肉に特異的な当該プロモーターは、配列番号１６に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、肝臓及び筋肉に特異的な当該プロモーターは、配列番号１６である。特定の実施形態では、肝臓及び筋肉に特異的な当該プロモーターは、配列番号１６、または配列番号１６の一部を含む。

【0180】

特定の実施形態では、当該プロモーターは、骨特異的プロモーター、及び肝臓特異的プロモーターを含む、骨－肝臓タンデムプロモーターを含む、または当該タンデムプロモーターである。

【0181】

特定の実施形態では、当該骨特異的プロモーターは、Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターである。特定の実施形態では、当該Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２３と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２３と１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２３、または配列番号２３の一部を含む。

【0182】

特定の実施形態では、当該骨特異的プロモーターは、最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターである。特定の実施形態では、当該最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２４と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２４と１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２４、または配列番号２４の一部を含む。

【0183】

特定の実施形態では、当該肝臓特異的プロモーターは、ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーターである。特定の実施形態では、当該ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーターは、配列番号２２と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーターは、配列番号２２と１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーターは、配列番号２２、または配列番号２２の一部を含む。

【0184】

特定の実施形態では、当該肝臓特異的プロモーターは、ｈＡＡＴプロモーターである。特定の実施形態では、当該ｈＡＡＴプロモーターは、配列番号２１と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該ｈＡＡＴプロモーターは、配列番号２１と１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該ｈＡＡＴプロモーターは、配列番号２１、または配列番号２１の一部を含む。

【0185】

特定の実施形態では、当該骨－肝臓タンデムプロモーターは、エンハンサーをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。特定の実施形態では、当該エンハンサーは、肝臓特異的エンハンサーである。特定の実施形態では、当該肝臓特異的実施形態は、ＡｐｏＥエンハンサーである。特定の実施形態では、当該骨－肝臓タンデムプロモーターは、肝臓特異的エンハンサー（例えば、ＡｐｏＥエンハンサー）を含む肝制御領域をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。特定の実施形態では、当該ＡｐｏＥエンハンサーは、配列番号２０と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該ＡｐｏＥエンハンサープロモーターは、配列番号２０と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該ＡｐｏＥエンハンサープロモーターは、配列番号２０、または配列番号２０の一部を含む。特定の実施形態では、当該肝制御領域は、配列番号１９と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、配列番号１９と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該肝制御領域は、配列番号１９と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該肝制御領域は、配列番号１９、または配列番号１９の一部を含む。特定の実施形態では、当該エンハンサー（例えば、ＡｐｏＥエンハンサー）、及び当該肝制御領域は、当該骨特異的プロモーターの上流にある。

【0186】

特定の実施形態では、当該骨－肝臓タンデムプロモーターは、ＬＢＴＰ１プロモーターである（例えば、図３３及び３７を参照されたい）。特定の実施形態では、当該ＬＢＴＰ１プロモーターは、配列番号１７と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該ＬＢＴＰ１プロモーターは、配列番号１７と１００％が同一ヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該ＬＢＴＰ１プロモーターは、配列番号１７、または配列番号１７の一部を含む。

【0187】

特定の実施形態では、当該骨－肝臓タンデムプロモーターは、ＬＢＴＰ２プロモーターである（例えば、図３４及び３８を参照されたい）。特定の実施形態では、当該ＬＢＴＰ２プロモーターは、配列番号１８と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が同一あるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該ＬＢＴＰ２プロモーターは、配列番号１８と１００％が同一ヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ＬＢＴＰ１プロモーターは、配列番号１８、または配列番号１８の一部を含む。

【0188】

特定の実施形態では、当該プロモーターは、骨特異的プロモーターを含む、または当該プロモーターである。

【0189】

特定の実施形態では、当該骨特異的プロモーターは、Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターである（例えば、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１９， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １５：１０１－１１１；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， ２００６， Ｊ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２８１（１０） ：６２９７－６３０６；及び、Ｎｉｓｈｉｏ ｅｔ ａｌ．， ２００６， Ｇｅｎｅ ３７２ ：６２－７０を参照されたい；これらの全内容を、参照により、本明細書で援用する）。特定の実施形態では、当該Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２３と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２３と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む（例えば、図３５を参照されたい）。特定の実施形態では、当該Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２３、または配列番号２３の一部を含む。

【0190】

特定の実施形態では、当該骨特異的プロモーターは、最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターである。特定の実施形態では、当該最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２４と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２４と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む（例えば、図３６を参照されたい）。特定の実施形態では、当該最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２４、または配列番号２４の一部を含む。

【0191】

特定の実施形態では、当該プロモーターは、肝臓特異的プロモーターを含む、または当該肝臓特異的プロモーターである。

【0192】

特定の実施形態では、当該肝臓特異的プロモーターは、ｈＡＡＴプロモーターである。特定の実施形態では、当該ｈＡＡＴプロモーターは、配列番号２１と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該ｈＡＡＴプロモーターは、配列番号２１と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該ｈＡＡＴプロモーターは、配列番号２１、または配列番号２１の一部を含む。

【0193】

特定の実施形態では、当該肝臓特異的プロモーターは、ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーターである。特定の実施形態では、当該ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーターは、配列番号２２と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が同一であるであるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーターは、配列番号２２と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーターは、配列番号２２、または配列番号２１の一部を含む。配列番号２２は、セクション８（配列表）に下線で示しているＡＴＧからＧＴＧへの修飾を含む。

【0194】

特定の実施形態では、当該プロモーターは、ｈＧＡＬＮＳまたは当該融合タンパク質の発現を高める１つ以上のエレメントを含む。特定の実施形態では、当該プロモーターは、ＴＡＴＡボックスを含む。

【0195】

特定の実施形態では、その１つ以上のプロモーターエレメントは、互いに反転または移動することができる。特定の実施形態では、当該プロモーターのエレメントは、協同的に機能するように配置することができる。特定の実施形態では、当該プロモーターのエレメントは、独立して機能するように配置することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載したｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、肝臓特異的なＴＢＧプロモーター、ヒトＣＭＶ前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳ）長鎖末端反復、及びラットインスリンプロモーターからなる群から選択する１つ以上のプロモーターを含む。特定の実施形態では、本明細書で提供するｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、１つ以上の組織特異的プロモーターを含む。特定の実施形態では、その組織特異的プロモーターは、肝臓特異的プロモーターである。特定の実施形態では、そのＴＢＧプロモーターは、配列番号６のヌクレオチド配列を有する。

【0196】

特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、１つ以上のさらなる発現制御エレメントを含み、それらは、エンハンサー（例えば、アルファｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー）をコードするヌクレオチド配列、リプレッサー、イントロンまたはキメライントロン（例えば、ニワトリβ－アクチン遺伝子の第１のイントロン）をコードするヌクレオチド配列、及び／またはポリＡ部位（例えば、ウサギグロビンポリＡ部位）をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。特定の実施形態では、ウサギグロビンポリＡ部位をコードするヌクレオチド配列は、配列番号９の配列を有する。特定の実施形態では、当該イントロンをコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号１０の配列を有する。特定の実施形態では、当該アルファｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサーをコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号１１の配列を有する。

【0197】

特定の実施形態では、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、アルファｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー、イントロンをコードするヌクレオチド配列、ＴＢＧプロモーターをコードするヌクレオチド配列、ｈＧＡＬＮＳ、または酸性オリゴペプチド（好ましくは、Ｄ８）に融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、及びウサギグロビンポリＡ部位をコードするヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該ウサギグロビンポリＡ部位をコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号９の配列を有する。特定の実施形態では、当該イントロンをコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号１０の配列を有する。特定の実施形態では、当該アルファｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサーをコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号１１の配列を有する。

【0198】

特定の実施形態では、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、１つ以上のさらなる発現制御エレメントを含み、それらは、エンハンサー（例えば、本明細書に記載したＡｐｏＥエンハンサー）をコードするヌクレオチド配列、及び／またはポリＡ部位（例えば、本明細書に記載したβ－グロビンポリアデニル化シグナル、または本明細書に記載したウサギグロビンポリＡ部位）をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。特定の実施形態では、当該ウサギグロビンポリＡ部位をコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号９の配列を有する。

【0199】

本明細書に記載したｒＡＡＶの態様及び実施形態の様々な実施形態では、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、イントロンをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。特定の実施形態では、当該イントロンは、キメライントロンである。特定の実施形態では、当該キメライントロンは、β－グロビン／Ｉｇイントロンである。特定の実施形態では、当該β－グロビン／Ｉｇイントロンは、配列番号１０と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該β－グロビン／Ｉｇイントロンは、配列番号１０と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0200】

本明細書に記載したｒＡＡＶの態様及び実施形態の様々な実施形態では、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列は、ポリアデニル化シグナルを含む。特定の実施形態では、当該ポリアデニル化シグナルは、β－グロビンポリアデニル化シグナルである。特定の実施形態では、当該β－グロビンポリアデニル化シグナルは、配列番号２５と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該β－グロビンポリアデニル化シグナルは、配列番号２５と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該ポリアデニル化シグナルは、ウサギグロビンポリＡ部位である。特定の実施形態では、当該ウサギグロビンポリＡ部位は、配列番号９と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該ウサギグロビンポリＡ部位は、配列番号９と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0201】

（ｄ）逆方向末端反復
本発明の一部の実施形態では、本明細書に記載したｈＧＡＬＮＳ発現カセット（例えば、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２、ｈＧＡＬＮＳｃｏ、Ｄ８－ＧＡＬＮＳｃｏ、ｈＧＡＬＮＳ、またはＤ８－ｈＧＡＬＮＳ）は、２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接している。特定の実施形態では、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、ｈＧＡＬＮＳｃｏである。特定の実施形態では、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２である。ＩＴＲ配列は、組み換え遺伝子発現カセットをビリオンに包み込むために使用し得る（例えば、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７９（１）：３６４－３７９、米国特許第７，２８２，１９９Ｂ２号、米国特許第７，７９０，４４９Ｂ２号、米国特許第８，３１８，４８０Ｂ２号、米国特許第８，９６２，３３２Ｂ２号、及び国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０７６４６６号を参照されたい、それぞれの全内容を、参照により、本明細書で援用する）。一部の実施形態では、隣接するＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲである。一部の実施形態では、隣接するＩＴＲは、ＡＡＶ９ ＩＴＲである。特定の実施形態では、隣接するＩＴＲは、ＡＡＶ８ ＩＴＲである。特定の実施形態では、当該ＩＴＲ配列は、配列番号７の配列を有することができる。特定の実施形態では、当該ＩＴＲ配列は、配列番号８の配列を有することができる。特定の実施形態では、当該５’ＩＴＲは、配列番号７の配列を有することができる。特定の実施形態では、当該３’ＩＴＲは、配列番号８の配列を有することができる。

【0202】

（ｅ）非翻訳領域
特定の実施形態では、本明細書に記載したｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、１つ以上の非翻訳領域（ＵＴＲ）、例えば、３’及び／または５’ＵＴＲを含む。特定の実施形態では、当該ＵＴＲは、所望のタンパク質発現レベルに関して最適化する。特定の実施形態では、当該ＵＴＲは、当該ｈＧＡＬＮＳの当該ｍＲＮＡ半減期に関して最適化する。特定の実施形態では、当該ＵＴＲは、当該ｈＧＡＬＮＳの当該ｍＲＮＡの安定性に関して最適化する。特定の実施形態では、当該ＵＴＲは、当該ｈＧＡＬＮＳの当該ｍＲＮＡの二次構造に関して最適化する。

【0203】

６．１．３． 医薬組成物及びキット
特定の実施形態では、本発明では、本明細書で提供するｒＡＡＶと、医薬として許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。当該医薬組成物は、個別の単回用量単位形態として調製し得る。本明細書で提供する医薬組成物は、例えば、非経口投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、髄腔内投与、または経皮投与のために製剤することができる。特定の実施形態では、当該医薬組成物は、静脈内投与用に製剤する。当業者であれば、好適な医薬として許容可能な（例えば、静脈内投与、及び肝細胞での形質導入のための）担体を容易に選択する。

【0204】

本明細書では、本明細書に記載した医薬組成物を含むキットを提供しており、１つ以上の容器を具備している。医薬組成物を入れることができる容器として、ボトル、袋、アンプル、チューブ、吸入器、バッグ、バイアル、及び容器があるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、当該キットは、当該医薬組成物の投与に関する説明書を含む。特定の実施形態では、当該キットは、当該医薬組成物を投与する上で使用可能な器具を含んでおり、当該器具として、シリンジ、無針注射器、点滴バッグ、パッチ、及び吸入器があるが、これらに限定されない。

【0205】

本明細書に記載したｒＡＡＶを使用した遺伝子治療でＭＰＳ ＩＶＡを治療する場合に使用可能な器具及び血液循環システムも提供している。当業者であれば、このような器具及びシステムを容易に選択する。

【0206】

６．２ ｒＡＡＶＳの製造
また、本明細書では、本明細書で提供するｒＡＡＶを作製する上で使用可能な本明細書に記載したようなｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチド、プラスミド、及び細胞、それに、本明細書で提供するｒＡＡＶの作製方法を提供する。

【0207】

６．２．１ ポリヌクレオチド、プラスミド、及び細胞
本明細書では、ｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドを提供する。

【0208】

ある態様では、本明細書では、ＡＡＶ－ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２－ＩＴＲ）が隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、酸性オリゴペプチド（例えば、Ｄ８）に融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードする当該導入遺伝子などの導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、肝臓特異的プロモーター（例えば、ＴＢＧプロモーター）をコードするヌクレオチド配列をさらに含み得るものであり、当該肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列は、当該融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結している。一部の実施形態では、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、ＣＡＧプロモーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含み得る。一部の実施形態では、ＣＡＧプロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列は、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結する。特定の実施形態では、当該ＣＡＧプロモーターは、配列番号２８に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、当該ＣＡＧプロモーターは、配列番号２８である。特定の実施形態では、当該肝臓特異的プロモーターは、配列番号１３に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該肝臓特異的プロモーターは、配列番号１４に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該肝臓特異的プロモーターは、配列番号１５に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該肝臓特異的プロモーターは、配列番号１３である。特定の実施形態では、当該肝臓特異的プロモーターは、配列番号１４である。特定の実施形態では、当該肝臓特異的プロモーターは、配列番号１５である。

【0209】

別の態様では、本明細書では、ＡＡＶ－ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２－ＩＴＲ）が隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、肝臓特異的プロモーター（例えば、ＴＢＧプロモーター）をコードするヌクレオチド配列と、ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含み、当該肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列が、当該ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結している。

【0210】

ある態様では、本明細書で提供するのは、ＡＡＶ－ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２－ＩＴＲ）が隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドであって、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、酸性オリゴペプチド（例えば、Ｄ８）に融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードする当該導入遺伝子などの導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、プロモーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含み得、当該プロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列は、当該融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結している。特定の実施形態では、当該プロモーターは、ＣＡＧプロモーターである。

【0211】

ある態様では、本明細書では、ＡＡＶ－ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２－ＩＴＲ）が隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、酸性オリゴペプチド（例えば、Ｄ８）に融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードする当該導入遺伝子などの導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、肝臓及び筋肉に特異的なプロモーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含み得、当該肝臓及び筋肉に特異的なプロモーターをコードするヌクレオチド配列は、当該融合タンパク質をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結している。特定の実施形態では、肝臓及び筋肉に特異的な当該プロモーターは、配列番号１６に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該プロモーターは、配列番号１６である。

【0212】

別の態様では、本明細書では、ＡＡＶ－ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２－ＩＴＲ）が隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、プロモーターをコードするヌクレオチド配列と、ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含み、当該プロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列が、当該ｈＧＡＬＮＳをコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結している。特定の実施形態では、当該プロモーターは、ＣＡＧプロモーターである。特定の実施形態では、当該プロモーターは、配列番号２８に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該プロモーターは、配列番号１３に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該プロモーターは、配列番号１４に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該プロモーターは、配列番号１５に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該プロモーターは、配列番号１６に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該プロモーターは、配列番号２８である。特定の実施形態では、当該プロモーターは、配列番号１３である。特定の実施形態では、当該プロモーターは、配列番号１４である。特定の実施形態では、当該プロモーターは、配列番号１５である。特定の実施形態では、当該プロモーターは、配列番号１６である。特定の実施形態では、当該プロモーターは、配列番号２８を含む。特定の実施形態では、当該プロモーターは、配列番号１３を含む。特定の実施形態では、当該プロモーターは、配列番号１４を含む。特定の実施形態では、当該プロモーターは、配列番号１５を含む。特定の実施形態では、当該プロモーターは、配列番号１６である。ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、セクション６．１．２で説明したようなものにすることができる。

【0213】

特定の実施形態では、本明細書では、ＡＡＶ－ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２－ＩＴＲ）に隣接するｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２発現カセットを含むポリヌクレオチドを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２発現カセットは、ＴＢＧプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２またはｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列とを含み、また、当該ＴＢＧプロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列を、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２またはｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結する。特定の実施形態では、当該ＴＢＧプロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号６と、１００％同一である。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号２７と、１００％同一である。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳをコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号１２と、１００％同一である。特定の実施形態では、ＴＢＧプロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号６に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号２７に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳをコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号１２に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。

【0214】

特定の実施形態では、本明細書では、ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接するｈＧＡＬＮＳｃｏ発現カセットを含むポリヌクレオチドを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳｃｏ発現カセットは、ＴＢＧプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、ｈＧＡＬＮＳｃｏまたはｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列とを含み、また、当該ＴＢＧプロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列を、ｈＧＡＬＮＳｃｏまたはｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結する。特定の実施形態では、当該ＴＢＧプロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号６と、１００％同一である。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳｃｏをコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号３と、１００％同一である。特定の実施形態では、ＴＢＧプロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号６に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号３に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳをコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号１２と、１００％同一である。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳをコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号１２に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。

【0215】

特定の実施形態では、本明細書では、ＡＡＶ－ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２－ＩＴＲ）に隣接するｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２発現カセットを含むポリヌクレオチドを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２発現カセットは、ＣＡＧプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２またはｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列とを含み、また、当該ＣＡＧプロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列を、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２またはｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結する。特定の実施形態では、当該ＣＡＧプロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号２８と、１００％同一である。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号２７と、１００％同一である。特定の実施形態では、当該ＣＡＧプロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号２８に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号２７に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳをコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号１２と、１００％同一である。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳをコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号１２に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。

【0216】

特定の実施形態では、本明細書では、ＡＡＶ－ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２－ＩＴＲ）に隣接するｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２発現カセットを含むポリヌクレオチドを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２発現カセットは、ＬＳＰＸ１プロモーターをコードするヌクレオチド配列と、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２またはｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列とを含み、また、当該ＬＳＰＸ１プロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列を、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２またはｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結する。特定の実施形態では、当該ＬＳＰＸ１プロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号１３と、１００％同一である。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号２７と、１００％同一である。特定の実施形態では、当該ＬＳＰＸ１プロモーターをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１３に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号２７に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳをコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号１２と、１００％同一である。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳをコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号１２に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。

【0217】

特定の実施形態では、本明細書では、ＡＡＶ－ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２－ＩＴＲ）に隣接するｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２発現カセットを含むポリヌクレオチドを提供、当該ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２発現カセットは、ＬＭＴＰ６プロモーターをコードするヌクレオチド配列と、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２またはｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列とを含み、また、ＬＭＴＰ６プロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列を、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２またはｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結する。特定の実施形態では、当該ＬＭＴＰ６プロモーターをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１６と、１００％同一である。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号２７と、１００％同一である。特定の実施形態では、当該ＬＭＴＰ６プロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号１６に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号２７に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳをコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号１２と、１００％同一である。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳをコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号１２に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。

【0218】

特定の実施形態では、本明細書では、ＡＡＶ－ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２－ＩＴＲ）に隣接するｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２発現カセットを含むポリヌクレオチドを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２発現カセットは、ＬＢＴＰ２プロモーターをコードするヌクレオチド配列と、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２またはｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列とを含み、また、当該ＬＢＴＰ２プロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列を、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２またはｈＧＡＬＮＳをコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。特定の実施形態では、当該ＬＢＴＰ２プロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号１８と、１００％同一である。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号２７と、１００％同一である。特定の実施形態では、当該ＬＢＴＰ２プロモーターをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１８に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号２７に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳをコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号１２と、１００％同一である。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳをコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号１２に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。

【0219】

特定の実施形態では、本明細書では、ＡＡＶ－ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２－ＩＴＲ）に隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、骨－肝臓タンデムプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、当該導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳをコードし、また、当該骨－肝臓タンデムプロモーターは、骨特異的プロモーターと、肝臓特異的プロモーターとを含み、そして、当該骨－肝臓タンデムプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。

【0220】

別の特定の態様では、本明細書では、ＡＡＶ－ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２－ＩＴＲ）に隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、骨－肝臓タンデムプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、当該導入遺伝子は、酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードし、また、当該骨－肝臓タンデムプロモーターは、骨特異的プロモーターと、肝臓特異的プロモーターとを含み、そして、当該骨－肝臓タンデムプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。特定の実施形態では、酸性オリゴペプチドは、Ｄ８である。

【0221】

特定の実施形態では、当該骨特異的プロモーターは、Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターである。特定の実施形態では、当該Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２３と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２３と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0222】

特定の実施形態では、当該骨特異的プロモーターは、最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターである。特定の実施形態では、当該最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２４と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２４と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0223】

特定の実施形態では、当該肝臓特異的プロモーターは、ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーターである。特定の実施形態では、当該ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーターは、配列番号２２と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーターは、配列番号２２と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0224】

特定の実施形態では、当該骨－肝臓タンデムプロモーターは、ＡｐｏＥエンハンサーをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。特定の実施形態では、当該骨－肝臓タンデムプロモーターは、ＡｐｏＥエンハンサーを含む肝制御領域をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。特定の実施形態では、当該ＡｐｏＥエンハンサーは、配列番号２０と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該ＡｐｏＥエンハンサープロモーターは、配列番号２０と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該肝制御領域は、配列番号１９と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該肝制御領域は、配列番号１９と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0225】

特定の実施形態では、当該骨－肝臓タンデムプロモーターは、ＬＢＴＰ１プロモーターである。特定の実施形態では、当該ＬＢＴＰ１プロモーターは、配列番号１７と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該ＬＢＴＰ１プロモーターは、配列番号１７と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0226】

特定の実施形態では、当該骨－肝臓タンデムプロモーターは、ＬＢＴＰ２プロモーターである。特定の実施形態では、当該ＬＢＴＰ２プロモーターは、配列番号１８と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該ＬＢＴＰ２プロモーターは、配列番号１８と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0227】

別の特定の態様では、本明細書では、ＡＡＶ－ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２－ＩＴＲ）に隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、当該導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳをコードし、そして、当該Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列を、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。

【0228】

別の特定の態様では、本明細書では、ＡＡＶ－ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２－ＩＴＲ）に隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、当該導入遺伝子は、酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードし、そして、当該Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列を、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。特定の実施形態では、当該酸性オリゴペプチドは、Ｄ８である。

【0229】

特定の実施形態では、当該Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２３と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２３と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0230】

別の特定の態様では、本明細書では、ＡＡＶ－ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２－ＩＴＲ）に隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、当該導入遺伝子は、ｈＧＡＬＮＳをコードし、そして、当該最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。

【0231】

別の特定の態様では、本明細書では、ＡＡＶ－ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２－ＩＴＲ）に隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドを提供し、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含み、また、当該導入遺伝子は、酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードし、そして、当該最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列を、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列に機能的に連結する。特定の実施形態では、当該酸性オリゴペプチドは、Ｄ８である。

【0232】

特定の実施形態では、当該最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２４と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、配列番号２４と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0233】

本明細書に記載したポリヌクレオチドの態様及び実施形態の様々な実施形態では、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、イントロンをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。特定の実施形態では、当該イントロンは、キメライントロンである。特定の実施形態では、当該キメライントロンは、β－グロビン／Ｉｇイントロンである。特定の実施形態では、当該β－グロビン／Ｉｇイントロンは、配列番号１０と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が同一である。特定の実施形態では、当該β－グロビン／Ｉｇイントロンは、配列番号１０と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0234】

本明細書に記載したポリヌクレオチドの態様及び実施形態の様々な実施形態では、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列を、コドン最適化する。本明細書に記載したポリヌクレオチドの態様及び実施形態の様々な実施形態では、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列では、ＣｐＧ部位が枯渇している。特定の実施形態では、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号１２と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％が同一ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列は、配列番号１２と、１００％同一であるｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含む。

【0235】

本明細書に記載したポリヌクレオチドの態様及び実施形態の様々な実施形態では、当該導入遺伝子をコードする当該ヌクレオチド配列は、ポリアデニル化シグナルを含む。特定の実施形態では、当該ポリアデニル化シグナルは、β－グロビンポリアデニル化シグナルである。特定の実施形態では、当該β－グロビンポリアデニル化シグナルは、配列番号２５と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該β－グロビンポリアデニル化シグナルは、配列番号２５と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該ポリアデニル化シグナルは、ウサギグロビンポリＡ部位である。特定の実施形態では、当該ウサギグロビンポリＡ部位は、配列番号９と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該ウサギグロビンポリＡ部位は、配列番号９と、１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0236】

本明細書に記載したポリヌクレオチドの態様及び実施形態の様々な実施形態では、当該ＡＡＶは、ＡＡＶ８である。本明細書に記載したポリヌクレオチドの態様及び実施形態の様々な実施形態では、当該ＡＡＶは、ＡＡＶ９である。

【0237】

特定の実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、ｓｓＤＮＡの形態である。別の特定の実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、ｄｓＤＮＡの形態である。

【0238】

また、本明細書では、本明細書で提供するポリヌクレオチドを含むプラスミド（以下、「ｒＡＡＶプラスミド」と称する）を提供する。特定の実施形態では、当該ｒＡＡＶプラスミドは、ｓｓＤＮＡプラスミドである。別の特定の実施形態では、当該ｒＡＡＶプラスミドは、ｄｓＤＮＡプラスミドである。一部の実施形態では、当該ｒＡＡＶプラスミドは、環状の形態である。その他の実施形態では、当該ｒＡＡＶプラスミドは、直鎖状の形態である。

【0239】

特定の実施形態では、本明細書に記載したコンストラクトは、次の成分（ＬＳＰＸ１）：（１）当該発現カセットに隣接するＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）；（２）ａ）２つのタンデムＭｉｋ／ＢｉｋＥエンハンサー、ｂ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｃ）ヒトＡＡＴ（ｈＡＡＴ）プロモーター、ｄ）ポリＡシグナル、及びｅ）任意に、イントロンを含む制御エレメント；（３）ｈＧＡＬＮＳ、ｈＧＡＬＮＳｃｏ、またはｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載したコンストラクトは、次の成分：（１）当該発現カセットに隣接するＡＡＶ２逆方向末端反復；（２）ａ）２つのタンデムＭｉｋ／ＢｉｋＥエンハンサー、ｂ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｃ）ｈＡＡＴプロモーター、ｄ）ウサギβ－グロビンポリＡシグナル、及びｅ）任意に、ヒトβ－グロビンとＩｇ重鎖とに由来するキメライントロンを含む制御エレメント；及び（３）ｈＧＡＬＮＳ、ｈＧＡＬＮＳｃｏ、またはｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列を含む。

【0240】

特定の実施形態では、本明細書に記載したコンストラクトは、次の成分（ＬＳＰＸ２）：（１）当該発現カセットに隣接するＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）；（２）ａ）２つのタンデムＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）ｈＡＡＴプロモーター、ｃ）ポリＡシグナル、及びｄ）任意に、イントロンを含む制御エレメント；及び（３）ｈＧＡＬＮＳ、ｈＧＡＬＮＳｃｏ、またはｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載したコンストラクトは、次の成分：（１）当該発現カセットに隣接するＡＡＶ２逆方向末端反復；（２）ａ）２つのタンデムＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）ｈＡＡＴプロモーター、ｃ）ポリＡシグナル、及びｅ）任意に、ヒトβ－グロビンとＩｇ重鎖とに由来するキメライントロンを含む制御エレメント；及び（３）ｈＧＡＬＮＳ、ｈＧＡＬＮＳｃｏ、またはｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列を含む。

【0241】

特定の実施形態では、本明細書に記載したコンストラクトは、次の成分（ＬＴＰ１）：（１）当該発現カセットに隣接するＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）；（２）ａ）２つのタンデムＭｉｋ／ＢｉｋＥエンハンサー、ｂ）ＴＢＧプロモーター、ｃ）ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｄ）ポリＡシグナル、及びｅ）任意に、イントロンを含む制御エレメント；及び、（３）ｈＧＡＬＮＳ、ｈＧＡＬＮＳｃｏ、またはｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載したコンストラクトは、次の成分：（１）当該発現カセットに隣接するＡＡＶ２逆方向末端反復、（２）ａ）２つのタンデムＭｉｋ／ＢｉｋＥエンハンサー、ｂ）ＴＢＧプロモーター、ｃ）ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｄ）ポリＡシグナル、及びｅ）任意に、ヒトβ－グロビンとＩｇ重鎖とに由来するキメライントロンを含む制御エレメント；及び（３）ｈＧＡＬＮＳ、ｈＧＡＬＮＳｃｏ、またはｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列を含む。

【0242】

特定の実施形態では、本明細書に記載したコンストラクトは、次の成分（ＬＴＰ２）：（１）当該発現カセットに隣接するＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）；（２）ａ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）２つのタンデムＭｉｋ／ＢｉｋＥエンハンサー、ｃ）ＴＢＧプロモーター、ｄ）ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｅ）ポリＡシグナル；及びｆ）任意に、イントロンを含む制御エレメント；及び、（３）ｈＧＡＬＮＳ、ｈＧＡＬＮＳｃｏ、またはｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載したコンストラクトは、次の成分：（１）当該発現カセットに隣接するＡＡＶ２逆方向末端反復；（２）ａ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）２つのタンデムＭｃｋＥエンハンサー、ｃ）ＴＢＧプロモーター、ｄ）ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｅ）ポリＡシグナル；及びｆ）任意に、ヒトβ－グロビンとＩｇ重鎖とに由来するキメライントロンを含む制御エレメント；及び（３）ｈＧＡＬＮＳ、ｈＧＡＬＮＳｃｏ、またはｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列を含む。

【0243】

特定の実施形態では、本明細書に記載したコンストラクトは、次の成分（ＬＭＴＰ６）：（１）当該発現カセットに隣接するＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）；（２）ａ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）３つのタンデムＭｃｋＥエンハンサー、ｃ）ＣＫプロモーター、ｄ）ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｅ）ポリＡシグナル；及びｆ）任意に、イントロンを含む制御エレメント；及び、（３）ｈＧＡＬＮＳ、ｈＧＡＬＮＳｃｏ、またはｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載したコンストラクトは、次の成分：（１）当該発現カセットに隣接するＡＡＶ２逆方向末端反復；（２）ａ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）３つのタンデムＭｃｋＥエンハンサー、ｃ）ＣＫプロモーター、ｄ）ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｅ）ポリＡシグナル；及びｆ）任意に、ヒトβ－グロビンとＩｇ重鎖とに由来するキメライントロンを含む制御エレメント；及び（３）ｈＧＡＬＮＳ、ｈＧＡＬＮＳｃｏ、またはｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列を含む。

【0244】

特定の実施形態では、本明細書に記載したコンストラクトは、次の成分（肝臓－骨タンデムプロモーター１（ＬＢＴＰ１））：（１）当該発現カセットに隣接するＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）；（２）ａ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｃ）ポリＡシグナル、ｄ）任意に、イントロン、及びｅ）Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーター、または最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターを含む制御エレメント；及び、（３）ｈＧＡＬＮＳ、ｈＧＡＬＮＳｃｏ、またはｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載したコンストラクトは、次の成分：（１）当該発現カセットに隣接するＡＡＶ２逆方向末端反復；（２）ａ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｃ）ウサギβ－グロビンポリＡシグナル、またはβ－グロビンポリアデニル化シグナル、ｄ）任意に、ヒトβ－グロビンと、Ｉｇ重鎖とに由来するキメライントロン；及びｅ）最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターを含む制御エレメント；及び（３）ｈＧＡＬＮＳ、ｈＧＡＬＮＳｃｏ、またはｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳ、ｈＧＡＬＮＳｃｏ、またはｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列は、酸性オリゴペプチド（セクション６．１．２（ｂ）に記載した酸性オリゴペプチドなど、例えば、Ｄ８）に融合する。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳ、ｈＧＡＬＮＳｃｏ、またはｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列では、ＣｐＧ部位が枯渇している。

【0245】

特定の実施形態では、本明細書に記載したコンストラクトは、次の成分（肝臓－骨タンデムプロモーター２（ＬＢＴＰ２））：（１）当該発現カセットに隣接するＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）；（２）ａ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｃ）ポリＡシグナル、ｄ）任意に、イントロン、及びｅ）Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターを含む制御エレメント；及び、（３）ｈＧＡＬＮＳ、ｈＧＡＬＮＳｃｏ、またはｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載したコンストラクトは、次の成分：（１）当該発現カセットに隣接するＡＡＶ２逆方向末端反復；（２）ａ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｃ）ウサギβ－グロビンポリＡシグナル、またはβ－グロビンポリアデニル化シグナル、ｄ）任意に、ヒトβ－グロビンと、Ｉｇ重鎖とに由来するキメライントロン；及びｅ）Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターを含む制御エレメント；及び（３）ｈＧＡＬＮＳ、ｈＧＡＬＮＳｃｏ、またはｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳ、ｈＧＡＬＮＳｃｏ、またはｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列は、酸性オリゴペプチド（セクション６．１．２（ｂ）に記載した酸性オリゴペプチドなど、例えば、Ｄ８）に融合する。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳ、ｈＧＡＬＮＳｃｏ、またはｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列では、ＣｐＧ部位が枯渇している。

【0246】

特定の実施形態では、本明細書に記載したコンストラクトは、次の成分（ＬＢＴＰ１）：（１）ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）、（２）ＡｐｏＥエンハンサー、３）最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーター４）ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、５）任意に、イントロン、（６）ｈＧＡＬＮＳ、ｈＧＡＬＮＳｃｏ、またはｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列、（７）ポリＡシグナル、及び（８）ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）を、この順序で含む。特定の実施形態では、本明細書に記載したコンストラクトは、次の成分（ＬＢＴＰ１）：（１）ＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）、（２）ＡｐｏＥエンハンサー、３）最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーター４）ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、５）任意に、ヒトβ－グロビンと、Ｉｇ重鎖とに由来するキメライントロン、（６）ｈＧＡＬＮＳ、ｈＧＡＬＮＳｃｏ、またはｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列、（７）ウサギβ－グロビンポリＡシグナル、またはβ－グロビンポリアデニル化シグナル、及び（８）ＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）を、この順序で含む。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳ、ｈＧＡＬＮＳｃｏ、またはｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列は、酸性オリゴペプチド（セクション６．１．２（ｂ）に記載した酸性オリゴペプチドなど、例えば、Ｄ８）に融合する。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳ、ｈＧＡＬＮＳｃｏ、またはｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列では、ＣｐＧ部位が枯渇している。

【0247】

特定の実施形態では、本明細書に記載したコンストラクトは、次の成分（ＬＢＴＰ２）：（１）ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）、（２）ＡｐｏＥエンハンサー、３）Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーター、４）ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、５）任意に、イントロン、（６）ｈＧＡＬＮＳ、ｈＧＡＬＮＳｃｏ、またはｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列、（７）ポリＡシグナル、及び（８）ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）を、この順序で含む。特定の実施形態では、本明細書に記載したコンストラクトは、次の成分（ＬＢＴＰ２）：（１）ＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）、（２）ＡｐｏＥエンハンサー、３）Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーター、４）ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、５）任意に、ヒトβ－グロビンと、Ｉｇ重鎖とに由来するキメライントロン、（６）ｈＧＡＬＮＳ、ｈＧＡＬＮＳｃｏ、またはｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列、（７）ウサギβ－グロビンポリＡシグナル、またはβ－グロビンポリアデニル化シグナル、及び（８）ＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）を、この順序で含む。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳ、ｈＧＡＬＮＳｃｏ、またはｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列は、酸性オリゴペプチド（セクション６．１．２（ｂ）に記載した酸性オリゴペプチドなど、例えば、Ｄ８）に融合する。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳ、ｈＧＡＬＮＳｃｏ、またはｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２をコードする当該ヌクレオチド配列では、ＣｐＧ部位が枯渇している。

【0248】

さらに、本明細書では、本明細書で提供するｒＡＡＶを発現する（例えば、組み換え発現する）細胞（好ましくは、エクスビボ細胞）を提供する。特定の実施形態では、当該細胞（好ましくは、エクスビボ細胞）は、本明細書で提供するポリヌクレオチド、または本明細書で提供するｒＡＡＶプラスミドを含む。特定の実施形態では、当該細胞（好ましくは、エクスビボ細胞）は、ＡＡＶのＲｅｐ、Ｃａｐ及びＡｄ５の機能をもたらすヘルパーポリヌクレオチド（複数可）、またはヘルパープラスミドをさらに含む。当該細胞（好ましくは、エクスビボ細胞）は、哺乳動物宿主細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３－Ｔ細胞、Ａ５４９細胞、ＷＥＨＩ細胞、１０Ｔ１／２細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＢＳＣ１細胞、ＢＳＣ４０細胞、ＢＭＴ１０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、Ｓａｏｓ細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＨｅｐＧ２細胞、初代線維芽細胞、肝細胞、及び筋芽細胞とすることができる。当該哺乳動物宿主細胞は、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、またはハムスターに由来することができる。特定の実施形態では、当該哺乳動物宿主細胞は、ヒト胎児腎細胞２９３（ＨＥＫ２９３細胞）、またはＨＥＫ２９３－Ｔ細胞である。

【0249】

６．２．２ ｒＡＡＶの作製方法
本明細書で提供するｒＡＡＶの作製方法を提供する。特定の実施形態では、当該方法は、セクション６．２．１に示しているｒＡＡＶプラスミドと、ＡＡＶのＲｅｐ、Ｃａｐ及びＡｄ５の機能を併せ持つ１つ以上のヘルパープラスミドとを、細胞（好ましくは、エクスビボ細胞）にトランスフェクションすることを含む。特定の実施形態では、１つ以上の当該ヘルパープラスミドは、ＡＡＶのＲｅｐ遺伝子、Ｃａｐ遺伝子、ＶＡ遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＥ４遺伝子のヌクレオチド配列を併せ持つ。

【0250】

遺伝子治療の用途に供する本明細書で提供するｒＡＡＶの作製には、当該技術分野で公知の方法、例えば、Ｃｌｅｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２７：１６００２（参照により、その全内容を本明細書で援用する）に記載しているような方法を使用することができる。特定の実施形態では、プラスミドＤＮＡのトランスフェクションは、当該技術分野で公知のように、リン酸カルシウムプラスミド沈殿を使用して、ヒト胎児腎２９３細胞（ＨＥＫ２９３細胞）、またはＨＥＫ２９３－Ｔ細胞で、ｒＡＡＶプラスミドと、ＡＡＶのＲｅｐ及びＣａｐの機能、ならびにＡｄ５遺伝子（ＶＡ ＲＮＡ、Ｅ２ａ、及びＥ４）をもたらすヘルパープラスミド（複数可）で行う。特定の実施形態では、Ｒｅｐ遺伝子、Ｃａｐ遺伝子、及びＡｄ５遺伝子は、同じヘルパープラスミドに存在することができる。特定の実施形態では、ＡＡＶのＲｅｐ、Ｃａｐ、及びＡｄ５の機能を、別々のプラスミドから得る２ヘルパー法（すなわち、トリプルトランスフェクション）を使用する。特定の実施形態では、当該ＨＥＫ２９３細胞は、動物成分、及び抗生物質不含培地で、浮遊状態での増殖に適合させることができる。

【0251】

特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、パッケージング細胞株、及びプロデューサー細胞株を使用して作製できる。本明細書で提供するｒＡＡＶは、哺乳動物宿主細胞、例えば、Ａ５４９細胞、ＷＥＨＩ細胞、１０Ｔ１／２細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＢＳＣ１細胞、ＢＳＣ４０細胞、ＢＭＴ１０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３－Ｔ細胞、Ｓａｏｓ細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＨｅｐＧ２細胞、初代線維芽細胞、肝細胞、及び筋芽細胞を使用して生産し得る。本明細書で提供するｒＡＡＶは、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、またはハムスターに由来する宿主細胞を使用して生産し得る。特定の実施形態では、宿主細胞内でウイルスを産生させる手段、例えば、複製遺伝子、及びキャプシド遺伝子（例えば、ＡＡＶのＲｅｐ遺伝子及びＣａｐ遺伝子）と、本明細書で提供するｒＡＡＶプラスミドを導入することで、安定細胞株を遺伝子操作できる。特定の実施形態では、本発明のｒＡＡＶは、ＨＥＫ２９３細胞を使用して生産できる。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、Ｓｆ９昆虫細胞において、ｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子、及び当該ｒＡＡＶのゲノムをコードする遺伝子を有する３つの組み換えバキュロウイルスプラスミドに共感染させて産生させることができる。

【0252】

細胞は、当業者が容易に選択する適切なプロトコルに従って、培養、トランスフェクション、及び回収を行うことができる。特定の実施形態では、当該細胞は、ウシ胎仔血清、グルコース、ペニシリン、ストレプトマイシン、及び１－グルタミンなど、これらに限定されない成分を含むダルベッコ改変イーグル基礎培地（ＤＭＥＭ）で培養することができる（ＭｃＣｌｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．２０１１，（５７）：３３４８、Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１２，７９８：２６７－２８４）。細胞は、当業者であれば選択が容易である成分においてトランスフェクションできる。特定の実施形態では、トランスフェクションは、培地溶液で行うことができ、その培地溶液として、ＤＭＥＭ、及びイスコブ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）があるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、トランスフェクションは、４６時間、４７時間、４８時間、４９時間、５０時間、５１時間、５２時間、５３時間、５４時間、５５時間、５６時間、５７時間、５８時間、５９時間、６０時間、６１時間、６２時間、６３時間、６４時間、６５時間、６６時間、６７時間、６８時間、６９時間、７０時間、５０～５５時間、５５～６０時間、６０～６５時間、または６５～７０時間の時間をかけて行うことができる。トランスフェクションした後に、細胞を掻き取って、培養ウェルから細胞を剥がす、そして、それらのウェルを洗浄して、トランスフェクションした細胞をすべて回収することで、細胞を集めることができる。

【0253】

ＡＡＶ８キャプシドを含むｒＡＡＶの作製方法については、参照により、その全内容を本明細書で援用する米国特許第７，２８２，１９９Ｂ２号のＤｅｔａｉｌｅｄ ＤｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎのＳｅｃｔｉｏｎ ＩＶを参照されたい。例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）解析によって、当該ベクターのゲノムコピー力価を求め得る。ビリオンは、例えば、ＣｓＣｌ_２沈降法によって回収し得る。特定の実施形態では、本明細書で記載したｒＡＡＶは、単離したｒＡＡＶまたは精製したｒＡＡＶである。

【0254】

複数のＡＡＶ血清型が同定されている。特定の実施形態では、本明細書で提供するｒＡＡＶまたはポリヌクレオチドは、ＡＡＶの１つ以上の血清型に由来する１つ以上の成分を含む。特定の実施形態では、本明細書で提供するｒＡＡＶまたはポリヌクレオチドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、またはＡＡＶ１１の１つ以上に由来する１つ以上の成分を含む。特定の実施形態では、本明細書で提供するｒＡＡＶまたはポリヌクレオチドは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、またはＡＡＶ１１の血清型の１つ以上に由来する１つ以上の成分を含むことができる。特定の実施形態では、本明細書で提供するｒＡＡＶまたはポリヌクレオチドは、ＡＡＶ８血清型の１つ以上の成分を含むことができる。特定の実施形態では、本明細書で提供するｒＡＡＶまたはポリヌクレオチドは、ＡＡＶ９血清型に由来する１つ以上の成分を含むことができる。ＡＡＶ成分の核酸配列、ならびに組み換えＡＡＶ、及び組み換えＡＡＶキャプシドの作製方法は、例えば、米国特許第７，２８２，１９９Ｂ２号、米国特許第７，７９０，４４９Ｂ２号、米国特許第８，３１８，４８０Ｂ２号、米国特許第８，９６２，３３２Ｂ２号及び国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０７６４６６号に記載されており、これらの各々を、参照により、その全内容を本明細書で援用する。特定の実施形態では、本明細書では、ｈＧＡＬＮＳをコードするｒＡＡＶ８を提供する。

【0255】

特定の実施形態では、ｒＡＡＶ８を説明しており、このものは、（ｉ）調節エレメントの制御下で、ｈＧＡＬＮＳ、または酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質を含み、かつ、ＩＴＲが隣接する発現カセットを含む組み換えゲノムと、（ｉｉ）ＡＡＶ８キャプシドタンパク質のアミノ酸配列を有する、またはＡＡＶ８キャプシドタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％が同一であり、その一方で、ＡＡＶ８キャプシドが奏するウイルスゲノムを包み込む能力、かつ好ましくは、肝細胞に高効率で形質導入させるというＡＡＶ８キャプシドが奏する能力も保持しているウイルスキャプシドを含む。特定の実施形態では、ＡＡＶ８キャプシドは、配列番号１の配列において、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、または３０個のアミノ酸が置換された配列を有しており、かつ、ＡＡＶ８キャプシドが奏するウイルスゲノムを包み込む能力、かつ好ましくは、ＡＡＶ８キャプシドが奏する肝細胞に高効率で形質導入させる能力も保持している。

【0256】

特定の実施形態では、ｒＡＡＶ９を説明しており、このものは、（ｉ）調節エレメントの制御下で、ｈＧＡＬＮＳ、または酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質を含み、かつ、ＩＴＲが隣接する発現カセットを含む組み換えゲノムと、（ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質のアミノ酸配列を有する、またはＡＡＶ８キャプシドタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２６）と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％同一であり、その一方で、ＡＡＶ９キャプシドが奏するウイルスゲノムを包み込む能力、かつ好ましくは、肝細胞に高効率で形質導入させるというＡＡＶ９キャプシドが奏する能力も保持しているウイルスキャプシドを含む。特定の実施形態では、ＡＡＶ９キャプシドは、配列番号２６の配列において、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、または３０個のアミノ酸が置換された配列を有しており、かつ、ＡＡＶ９キャプシドが奏するウイルスゲノムを包み込む能力、かつ好ましくは、ＡＡＶ９キャプシドが奏する肝細胞に高効率で形質導入させる能力も保持している。

【0257】

６．２．３ 有効性の評価
インビトロアッセイ、例えば、細胞培養アッセイを使用して、本明細書に記載したｒＡＡＶからのｈＧＡＬＮＳの発現を測定することができる、すなわち、例えば、当該ｒＡＡＶの効能を示すことができる。当該アッセイで使用する細胞として、Ａ５４９細胞、ＷＥＨＩ細胞、１０Ｔ１／２細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＢＳＣ１細胞、ＢＳＣ４０細胞、ＢＭＴ１０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３－Ｔ細胞、ＨｕＨ７細胞、Ｓａｏｓ細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＨｅｐＧ２細胞、初代線維芽細胞、肝細胞及び筋芽細胞があるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、細胞培養アッセイで使用する細胞は、ＨｕＨ７細胞を含む。特定の実施形態では、本発明のｒＡＡＶをトランスフェクションした細胞は、ｈＧＡＬＮＳ酵素活性について解析できる。

【0258】

動物モデルを使用して、本明細書に記載したｒＡＡＶからのｈＧＡＬＮＳの発現と、その有効性を評価し得る。ＭＰＳ ＩＶＡのマウスモデルについては、説明がされている（例えば、Ｔｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １２（２４）：３３４９－３３５８を参照されたい）。ＭＰＳ ＩＶＡのマウスモデルは、マウスＧＡＬＮＳのエキソン２が標的破壊されている。これらのマウスは、検出可能なＧＡＬＮＳ酵素活性が認められず、尿においてＧＡＧレベルの上昇が検出される。２月齢において、細網内皮系細胞であるクッパー細胞、及び脾臓の内側を覆う類洞内皮細胞で、ＧＡＧの貯蔵の増加が認められる。１２月齢では、糸球体の内臓上皮細胞及び心臓弁基部の細胞で空胞変性が認められるが、肝細胞及び尿細管上皮細胞などの実質細胞には存在しない。海馬及び新皮質のニューロン、髄膜細胞で、ＧＡＧのリソソーム貯蔵が認められる。このマウスモデルの角膜上皮細胞では、野生型と比べて、ケラタン硫酸（ＫＳ）及びコンドロイチン－６－硫酸（Ｃ６Ｓ）が増加するが、このマウスモデルでは、骨格の適応症状は認められない。加えて、ヒトＧＡＬＮＳに対する寛容性を持つＭＰＳ ＩＶＡのマウスモデルも説明がされている（例えば、Ｔｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １４（２２）：３３２１－３３３５を参照されたい）。本明細書に記載したｒＡＡＶからのｈＧＡＬＮＳの発現と、その有効性を評価するための例示的なアッセイについては、セクション７での実施例を参照されたい。

【0259】

一部の実施形態では、当該方法は、遺伝子治療ベクター、例えば、調節エレメントと、機能性ｈＧＡＬＮＳタンパク質の発現を増加させる導入遺伝子を組み合わせたベクターを含む。機能性ｈＧＡＬＮＳタンパク質の発現は、１）サンドイッチＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、組織学的染色、及び液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）など、これらに限定されない、当業者に公知の幾つかのタンパク質（ｈＧＡＬＮＳ）決定アッセイ；２）酵素アッセイまたは機能アッセイなどの幾つかのタンパク質活性アッセイ、及び／または；３）ケラタン硫酸（ＫＳ）、グリコサミノグリカン（ＣＡＧ）、及び／またはコンドロイチン－６－硫酸（Ｃ６Ｓ）検出など、これらに限定されない、幾つかの基質検出アッセイで測定し得、そして、ヒトの治療に有効または好適であると判断され得る（Ｈｉｎｔｚｅ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ２０１１：６ ６９－７８）。このようなインビトロ及びインビボでの細胞試験、血液試験、及び組織試験を使用して、ｈＧＡＬＮＳの量及び機能の特性を評価した結果は、特定の療法の有効性と相関することが示されており（Ｈｉｎｔｚｅ、Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ，２０１１、前掲）、その結果を使用して、本明細書に記載したベクターを用いた遺伝子治療によるＭＰＳ ＩＶＡ治療の効果を評価した。

【0260】

したがって、本発明は、対象の組織細胞、例えば、対象の肝臓、筋肉、白血球、腎臓、肺、脾臓、心臓、骨、または軟骨細胞での細胞内ｈＧＡＬＮＳ酵素活性を野生型レベルよりも向上させる、またはｈＧＡＬＮＳ酵素活性アッセイによって、例えば、本発明の実施例２、３及び８に記載しているようなアッセイ形式、または実質的に同様のアッセイを使用して測定した場合に、細胞内ｈＧＡＬＮＳの酵素活性を、野生型ｈＧＡＬＮＳの活性レベルの約２倍、野生型ｈＧＡＬＮＳの活性レベルの約５倍、野生型ｈＧＡＬＮＳの活性レベルの約１０倍、野生型ｈＧＡＬＮＳの活性レベルの約２５倍、野生型ｈＧＡＬＮＳの活性レベルの約４０倍、野生型ｈＧＡＬＮＳの活性レベルの約５０倍、野生型ｈＧＡＬＮＳの活性レベルの約６０倍、野生型ｈＧＡＬＮＳの活性レベルの約７０倍、野生型ｈＧＡＬＮＳの活性レベルの約７５倍、野生型ｈＧＡＬＮＳの活性レベルの約８０倍、野生型ｈＧＡＬＮＳの活性レベルの約８５倍、野生型ｈＧＡＬＮＳの活性レベルの約９０倍、野生型ｈＧＡＬＮＳの活性レベルの約９５倍、または野生型ｈＧＡＬＮＳの活性レベルの約１００倍にまで向上させる方法、及び遺伝子治療用ベクターを提供する。一部の実施形態では、本発明の遺伝子治療は、当該対象に対して遺伝子治療を実施してから２週間後に、ｈＧＡＬＮＳの活性レベルを、実施前のレベルまたは未治療の対象での平均レベルよりも上昇させる方法を提供する。一部の実施形態では、当該遺伝子治療は、当該対象に対して当該遺伝子治療を実施してから２週間後に、ｈＧＡＬＮＳの活性レベルを上昇させる方法を提供する。一部の実施形態では、当該遺伝子治療は、当該遺伝子治療を実施してから２週間後に、当該対象の血液または組織、例えば、肝臓、筋肉、腎臓、肺、脾臓、心臓、骨または軟骨でのｈＧＡＬＮＳの活性レベルを上昇させる方法を提供する。一部の実施形態では、当該対象でのｈＧＡＬＮＳの活性レベルの上昇は、その遺伝子治療を実施してから１０週間後に測定する。

【0261】

本発明は、当該対象でのＫＳの血中（例えば血漿または血清）レベルまたは組織レベルを、未治療の野生型対象でのＫＳのレベルよりも低下させる、またはＫＳアッセイによって、例えば、本発明の実施例２、３及び８に記載しているようなアッセイ形式または実質的に同様のアッセイを使用して測定した場合に、ＫＳレベルを、野生型ＫＳレベルの約１．１分の１、野生型ＫＳレベルの約１．２分の１、野生型ＫＳレベルの約１．３分の１、野生型ＫＳレベルの約１．４分の１、野生型ＫＳレベルの約１．５分の１、野生型ＫＳレベルの約１．６分の１、野生型ＫＳレベルの約１．７分の１、野生型ＫＳレベルの約１．８分の１、野生型ＫＳレベルの約１．９分の１、野生型ＫＳレベルの約２分の１、野生型ＫＳレベルの約２．５分の１、野生型ＫＳレベルの約３分の１、野生型ＫＳレベルの約３．５分の１、または野生型ＫＳレベルの約４分の１にまで低下させる方法、及び遺伝子治療ベクターも提供する。一部の実施形態では、当該遺伝子治療は、当該対象に当該遺伝子治療を実施してから２週間後に、ＫＳレベルを低下させる方法を提供する。一部の実施形態では、当該遺伝子治療は、当該対象に当該遺伝子治療を実施してから２週間後に、ＫＳの組織中レベルを低下させる方法を提供する。一部の実施形態では、ＫＳアッセイは、血中または組織中のモノ硫酸化ＫＳを測定することを含み、当該遺伝子治療は、当該対象に対して当該遺伝子治療を実施してから２週間後に、モノ硫酸化ＫＳレベルを低下させる方法を提供する。

【0262】

６．３ 治療方法
本明細書では、ＭＰＳ ＩＶＡの診断を受けたヒト対象を治療する方法を提供する。

【0263】

ある態様では、当該方法は、本明細書に記載したｒＡＡＶ、または本明細書に記載した医薬組成物をヒト対象に対して投与することを含む。

【0264】

別の態様では、本明細書では、ＭＰＳ ＩＶＡの診断を受けたヒト対象を治療する方法を提供しており、本明細書で提供するｒＡＡＶをヒト対象に投与することで、ヒト対象の骨及び肝臓に、治療有効量のｈＧＡＬＮＳ、または酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質（事例に応じて）を送達する、ことを含む。特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳまたは融合タンパク質を、肝細胞で産生して、同細胞から分泌することで、マンノース－６－リン酸でグリコシル化する。

【0265】

別の態様では、本明細書では、ＭＰＳ ＩＶＡの診断を受けたヒト対象を治療する方法を提供しており、本明細書で提供するｒＡＡＶをヒト対象に投与することで、ヒト対象の骨に、治療有効量のｈＧＡＬＮＳ、または酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質（事例に応じて）を送達することを含む。

【0266】

別の態様では、当該方法は、当該ヒト対象に、本明細書で提供するｒＡＡＶを投与することで、酸性オリゴペプチドに融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードする導入遺伝子などの導入遺伝子の治療有効量を、当該ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達すること（例えば、骨及び／または軟骨に送達すること）を含む。特定の実施形態では、当該ｈＧＡＬＮＳは、肝細胞で産生して、同細胞から分泌することで、マンノース－６－リン酸でグリコシル化される。

【0267】

別の態様では、当該方法は、当該ヒト対象に、本明細書で提供するｒＡＡＶを投与することで、肝細胞で産生して、同細胞から分泌することで、マンノース－６－リン酸でグリコシル化されるｈＧＡＬＮＳの治療有効量を、当該ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、成長板、半月板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達すること（例えば、骨及び／または軟骨に送達すること）を含む。

【0268】

別の態様では、当該方法は、酸性オリゴペプチド（セクション６．１．２（ｂ）に記載の酸性オリゴペプチド、例えば、Ｄ８など）に融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質の治療有効量を、当該ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、成長板、半月板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達すること（例えば、骨及び／または軟骨に送達すること）を含み、当該融合タンパク質は、ｒＡＡＶゲノムから産生される。当該ｒＡＡＶゲノムは、セクション６．１．２で記載のｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含み得る。

【0269】

別の態様では、当該方法は、酸性オリゴペプチド（セクション６．１．２（ｂ）に記載の酸性オリゴペプチド、例えば、Ｄ８など）に融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質の治療有効量を、当該ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、成長板、半月板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達すること（例えば、骨及び／または軟骨に送達すること）を含み、当該融合タンパク質は、ｒＡＡＶゲノムから産生され、そして、肝細胞で産生して、同細胞から分泌することで、マンノース－６－リン酸でグリコシル化される。当該ｒＡＡＶゲノムは、セクション６．１．２に記載しているようなｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含み得る。一部の実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、ＣＡＧプロモーターをコードするヌクレオチド配列を含み、また、当該ＣＡＧプロモーターをコードする当該ヌクレオチド配列を、当該融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結する。特定の実施形態では、当該ＣＡＧプロモーターは、配列番号２８に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含む。特定の実施形態では、当該ｒＡＡＶゲノムは、肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列を含み、また、当該肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列は、当該融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結する。特定の実施形態では、当該肝臓特異的プロモーターは、ＴＢＧプロモーターである。特定の実施形態では、当該肝臓特異的プロモーターは、配列番号１３に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該肝臓特異的プロモーターは、配列番号１４に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該肝臓特異的プロモーターは、配列番号１５に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該肝臓特異的プロモーターは、配列番号２８である。特定の実施形態では、当該肝臓特異的プロモーターは、配列番号１３である。特定の実施形態では、当該肝臓特異的プロモーターは、配列番号１４である。特定の実施形態では、当該肝臓特異的プロモーターは、配列番号１５である。

【0270】

別の態様では、当該方法は、酸性オリゴペプチド（セクション６．１．２（ｂ）に記載の酸性オリゴペプチド、例えば、Ｄ８など）に融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質の治療有効量を、当該ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、成長板、半月板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達すること（例えば、骨及び／または軟骨に送達すること）を含み、当該融合タンパク質は、ｒＡＡＶゲノムから産生され、そして、肝細胞で産生して、同細胞から分泌することで、マンノース－６－リン酸でグリコシル化される。当該ｒＡＡＶゲノムは、セクション６．１．２に記載のｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含み得る。特定の実施形態では、当該ｒＡＡＶゲノムは、肝臓及び筋肉に特異的なプロモーターをコードするヌクレオチド配列を含み、当該肝臓及び筋肉に特異的なプロモーターをコードするヌクレオチド配列を、当該融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結する。特定の実施形態では、当該肝臓及び筋肉に特異的なプロモーターは、配列番号１６に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を示すヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該プロモーターは、配列番号１６である。

【0271】

別の態様では、当該方法は、酸性オリゴペプチド（セクション６．１．２（ｂ）に記載の酸性オリゴペプチド、例えば、Ｄ８など）に融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質の治療有効量を、当該ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、成長板、半月板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達すること（例えば、骨及び／または軟骨に送達すること）を含み、当該融合タンパク質は、ｒＡＡＶゲノムから産生され、そして、肝細胞で産生して、同細胞から分泌することで、マンノース－６－リン酸でグリコシル化される。当該ｒＡＡＶゲノムは、セクション６．１．２に記載のｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含み得る。特定の実施形態では、当該ｒＡＡＶゲノムは、プロモーターをコードするヌクレオチド配列を含み、当該プロモーターをコードするヌクレオチド配列を、当該融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結する。特定の実施形態では、当該プロモーターは、ＣＡＧプロモーターである。

【0272】

別の態様では、当該方法は、ｒＡＡＶゲノムから産生され、そして、肝細胞で産生して、同細胞から分泌することで、マンノース－６－リン酸でグリコシル化されるｈＧＡＬＮＳの治療有効量を、当該ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、成長板、半月板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達すること（例えば、骨及び／または軟骨に送達すること）を含む。当該ｒＡＡＶゲノムは、セクション６．１．２に記載のｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含み得る。特定の実施形態では、当該ｒＡＡＶゲノムは、肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列を含み、当該肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列を、ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結する。特定の実施形態では、当該肝臓特異的プロモーターは、ＴＢＧプロモーターである。

【0273】

別の態様では、当該方法は、ｒＡＡＶゲノムから産生され、そして、肝細胞で産生して、同細胞から分泌することで、マンノース－６－リン酸でグリコシル化されるｈＧＡＬＮＳの治療有効量を、当該ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、成長板、半月板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達すること（例えば、骨及び／または軟骨に送達すること）を含む。当該ｒＡＡＶゲノムは、セクション６．１．２に記載しているようなｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含み得る。特定の実施形態では、当該ｒＡＡＶゲノムは、プロモーターをコードするヌクレオチド配列を含み、当該プロモーターをコードするヌクレオチド配列を、ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結する。特定の実施形態では、当該プロモーターは、配列番号２８に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該プロモーターは、配列番号１３に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該プロモーターは、配列番号１４に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該プロモーターは、配列番号１５に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該プロモーターは、配列番号１６に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該プロモーターは、配列番号２８である。特定の実施形態では、当該プロモーターは、配列番号１３である。特定の実施形態では、当該プロモーターは、配列番号１４である。特定の実施形態では、当該プロモーターは、配列番号１５である。特定の実施形態では、当該プロモーターは、配列番号１６である。

【0274】

本明細書に記載した治療方法の様々な実施形態では、当該ｒＡＡＶまたはｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶの１つ以上の血清型に由来する１つ以上の成分を含む。特定の実施形態では、当該ｒＡＡＶまたはｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶ１１の１つ以上に由来する１つ以上の成分を含む。特定の実施形態では、当該ｒＡＡＶまたはｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０またはＡＡＶ１１血清型の１つ以上に由来する１つ以上の成分を含む。特定の実施形態では、当該ｒＡＡＶまたはｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ８血清型の１つ以上の成分を含む。特定の実施形態では、当該ｒＡＡＶまたはｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ９血清型の１つ以上の成分を含む。ＡＡＶ成分の核酸配列、ならびに組み換えＡＡＶ及び組み換えＡＡＶキャプシドの作製方法は、例えば、米国特許第７，２８２，１９９Ｂ２号、米国特許第７，７９０，４４９Ｂ２号、米国特許第８，３１８，４８０Ｂ２号、米国特許第８，９６２，３３２Ｂ２号及び国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０７６４６６号に記載されており、これらの各々を、参照により、その全内容を本明細書で援用する。

【0275】

本明細書に記載した治療方法の様々な実施形態では、骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋、及び／または心臓弁に送達する工程は、（ａ）骨、及び／または軟骨、ならびに（ｂ）靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋、及び／または心臓弁に送達する工程である。

【0276】

６．３．１ 標的患者集団
本発明によれば、当該ヒト対象または患者は、ＭＰＳ ＩＶＡ（モルキオＡ症候群）の診断を受けた個体である。特定の実施形態では、その患者では、心臓弁の形態異常、齲歯、頸髄脊髄症、頸椎亜脱臼、コンドロイチン硫酸の尿中排泄、特徴的な粗い顔、腸骨翼狭窄、外反股、不均衡型短躯、低身長、長管骨骨端変形、肋骨胸郭フレア、外反膝、灰色のエナメル質、聴覚障害、肝腫大、脊柱前弯過度、歯突起形成不全、鼠径ヘルニア、関節弛緩、若年発症、ケラタン硫酸の尿中排泄、脊柱後弯、拡大した肘、下顎前突、骨幹端の拡大、角膜実質の混濁、骨粗鬆症、腰椎卵円化、扁平脊椎、尖った近位第２～第５中手骨、胸骨の突出、頻回の上気道感染、拘束性換気障害、脊柱側弯症、手の尺側偏位、広幅な口、及び広幅な歯間などのＭＰＳ ＩＶＡ症状の１つ以上が認められる。

【0277】

特定の実施形態では、当該患者は、ｈＧＡＬＮＳによる治療に応答する者として確認されている。

【0278】

特定の実施形態では、当該患者は、重篤かつ急速進行性の早発型ＭＰＳ ＩＶＡである。別の特定の実施形態では、当該患者は、緩徐進行性の遅発型ＭＰＳ ＩＶＡである。

【0279】

特定の実施形態では、当該患者は、成人（少なくとも１６歳）である。別の特定の実施形態では、当該患者は、青年期（１２～１５歳）である。別の特定の実施形態では、当該患者は、小児（１２歳未満）である。

【0280】

特定の実施形態では、当該患者は、６歳未満である。

【0281】

６．３．２ 投与と用量
本明細書に記載したｒＡＡＶの投与経路、及びヒト患者に投与するｒＡＡＶの量は、当該疾患の重症度、当該ヒト患者の病態、及び治療にあたる医師の知見に基づいて定めることができる。

【0282】

（ａ）治療用量
特定の実施形態では、ヒト対象に投与するｒＡＡＶの量は、ｈＧＡＬＮＳの治療有効量を、罹患組織（骨、軟骨、靭帯、半月板、及び／または心臓弁）に供給する上で充分な量である。

【0283】

特定の実施形態では、用量は、本明細書で提供するｒＡＡＶを介して、当該ヒト対象に投与するゲノムコピー数で測定する。特定の実施形態では、１×１０^１０～１×１０^１６ゲノムコピーを投与する。別の特定の実施形態では、１×１０^１０～１×１０^１１ゲノムコピーを投与する。別の特定の実施形態では、１×１０^１１～１×１０^１２ゲノムコピーを投与する。別の特定の実施形態では、１×１０^１２～１×１０^１３ゲノムコピーを投与する。別の特定の実施形態では、１×１０^１３～１×１０^１４ゲノムコピーを投与する。別の特定の実施形態では、１×１０^１４～１×１０^１５ゲノムコピーを投与する。別の特定の実施形態では、１×１０^１５～１×１０^１６ゲノムコピーを投与する。

【0284】

理論に拘束される訳ではないが、投与したｒＡＡＶの少なくとも１０％が、投与を受けたヒト対象の肝臓に感染する。特定の実施形態では、投与したｒＡＡＶの１０～１５％、１５～２０％、２０～２５％、２５～３５％、３０～４０％、３５～４５％、４０～５０％、４５～５５％、５０～６０％、５５～６５％、６０～７０％、６５～７５％、７０～８０％、７５～８５％、８０～９０％、８５～９５％または９０～１００％が、当該ヒト対象の肝臓に感染する。

【0285】

理論に拘束される訳ではないが、当該ｒＡＡＶウイルスゲノムから発現するｈＧＡＬＮＳ酵素の少なくとも１０％が、肝細胞で発現する。特定の実施形態では、当該ｒＡＡＶウイルスゲノムから発現するｈＧＡＬＮＳ酵素の１０～１５％、１５～２０％、２０～２５％、２５～３５％、３０～４０％、３５～４５％、４０～５０％、４５～５５％、５０～６０％、５５～６５％、６０～７０％、６５～７５％、７０～８０％、７５～８５％、８０～９０％、８５～９５％または９０～１００％が、肝細胞で発現する。

【0286】

理論に拘束される訳ではないが、当該ｒＡＡＶウイルスゲノムから発現するｈＧＡＬＮＳ酵素の少なくとも１０％が、当該ヒト対象の罹患組織（例えば、骨）に到達する。特定の実施形態では、当該ｒＡＡＶウイルスゲノムから発現するｈＧＡＬＮＳ酵素の１０～１５％、１５～２０％、２０～２５％、２５～３５％、３０～４０％、３５～４５％、４０～５０％、４５～５５％、５０～６０％、５５～６５％、６０～７０％、６５～７５％、７０～８０％、７５～８５％、８０～９０％、８５～９５％または９０～１００％が、当該ヒト対象の罹患組織（例えば、骨）に到達する。

【0287】

理論に拘束される訳ではないが、当該ｒＡＡＶウイルスゲノムから発現するｈＧＡＬＮＳ酵素の少なくとも１０％が、肝細胞で発現して、当該細胞から分泌されることによってグリコシル化される。特定の実施形態では、当該ｒＡＡＶウイルスゲノムから発現するｈＧＡＬＮＳ酵素の１０～１５％、１５～２０％、２０～２５％、２５～３５％、３０～４０％、３５～４５％、４０～５０％、４５～５５％、５０～６０％、５５～６５％、６０～７０％、６５～７５％、７０～８０％、７５～８５％、８０～９０％、８５～９５％または９０～１００％が、肝細胞で発現して、当該細胞から分泌されることによってグリコシル化される。

【0288】

理論に拘束される訳ではないが、肝細胞によりグリコシル化されたｈＧＡＬＮＳ酵素の少なくとも１０％が、当該ヒト対象の罹患組織（例えば、骨）に到達する。特定の実施形態では、肝細胞によりグリコシル化されたｈＧＡＬＮＳ酵素の１０～１５％、１５～２０％、２０～２５％、２５～３５％、３０～４０％、３５～４５％、４０～５０％、４５～５５％、５０～６０％、５５～６５％、６０～７０％、６５～７５％、７０～８０％、７５～８５％、８０～９０％、８５～９５％または９０～１００％が、当該ヒト対象の罹患組織（例えば、骨）に到達する。

【0289】

（ｂ）投与経路
特定の実施形態では、当該ｒＡＡＶは、ヒト対象に投与するために医薬組成物に存在させることができる（セクション６．１．３を参照されたい）。

【0290】

当該ｒＡＡＶは、例えば、非経口投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、髄腔内投与、または経皮投与することができる。特定の実施形態では、本発明のｒＡＡＶは、静脈内投与する。

【0291】

６．４ 併用療法
６．４．１ 免疫抑制との併用療法
ｒＡＡＶの送達の際には、免疫反応を最小限に抑える必要があるが、ｈＧＡＬＮＳ遺伝子を欠損しているので、当該酵素または本発明のｒＡＡＶに対する寛容性を潜在的に欠いているヒト対象では、遺伝子治療に関連する最も明白な潜在的な毒性源が、発現したｈＧＡＬＮＳタンパク質に対して免疫を発動させる。したがって、特定の実施形態では、当該患者においては、特に、ｈＧＡＬＮＳのレベルがゼロに近い重篤な疾患である患者を治療する場合には、免疫抑制療法との併用治療を行うのが得策である。ミコフェノール酸と組み合わせたタクロリムスまたはラパマイシン（シロリムス）のレジメンを使用する免疫抑制療法、または組織移植術で使用するその他の免疫抑制レジメンを利用することができる。このような免疫抑制治療剤は、遺伝子治療を行っている最中に投与し得、特定の実施形態では、免疫抑制療法による前治療が好ましい場合もある。免疫抑制療法は、治療にあたる医師の判断に基づいて、遺伝子治療で治療した後にも継続することができ、その後、免疫寛容が誘導されたら、例えば、１８０日後に中止し得る。

【0292】

特定の実施形態では、本明細書で提供する治療方法は、ヒト患者に、プレドニゾロン、ミコフェノール酸、及びタクロリムスを含む免疫抑制レジメンを実施することをさらに含む。特定の実施形態では、本明細書で提供する治療方法は、ヒト患者に、プレドニゾロン、ミコフェノール酸、及びラパマイシン（シロリムス）を含む免疫抑制レジメンを実施することをさらに含む。特定の実施形態では、本明細書で提供する治療方法は、ヒト患者に、タクロリムスを使用しない免疫抑制レジメンを実施することをさらに含む。特定の実施形態では、本明細書で提供する治療方法は、ヒト患者に、メチルプレドニゾロン、及び／またはプレドニゾロンなどの１つ以上の副腎皮質ステロイド、ならびにタクロリムス、及び／またはシロリムスを含む免疫抑制レジメンを実施することをさらに含む。特定の実施形態では、当該免疫抑制療法は、（ａ）タクロリムス、及びミコフェノール酸、または（ｂ）ラパマイシン、及びミコフェノール酸を組み合わせたものを当該対象に対して、ｈＧＡＬＮＳによる治療前に、またはその治療と同時に投与し、そして、その後に継続することを含む。特定の実施形態では、当該免疫抑制療法は、１８０日後に中止する。特定の実施形態では、その免疫抑制療法は、３０日後、６０日後、９０日後、１２０日後、１５０日後、または１８０日後に中止する。

【0293】

６．４．２ その他の治療法との併用療法
本明細書に記載したｒＡＡＶをヒト対象に投与することに関連して、本明細書に記載した実施形態の方法は、その他の利用可能な治療を実施する併用療法を含む。さらなる当該治療は、遺伝子治療による治療前に、その治療と同時に、またはその治療後に実施し得る。ＭＰＳ ＩＶＡに利用可能な治療であって、本発明の遺伝子治療と組み合わせることができる治療として、酵素補充療法（ＥＲＴ）、及び／またはＨＳＣＴ療法があるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ＥＲＴは、組み換えＤＮＡ技術によって、ヒト細胞株が産生したＤ８－ｈＧＡＬＮＳ酵素を使用して行うことができる。このような酵素を産生させる上で使用可能なヒト細胞株として、ＨＴ－２２、ＳＫ－Ｎ－ＭＣ、ＨＣＮ－１Ａ、ＨＣＮ－２、ＮＴ２、ＳＨ－ＳＹ５ｙ、ｈＮＳＣ１１、ＲｅＮｃｅｌｌ ＶＭ、ヒト胎児腎細胞２９３（ＨＥＫ２９３細胞）、ＨＥＫ２９３－Ｔ、線維肉腫ＨＴ－１０８０、ＨＫＢ－１１、ＣＡＰ、ＨｕＨ－７、及び網膜細胞株のＰＥＲ．Ｃ６またはＲＰＥがあるが、これらに限定されない（例えば、参照により、その全内容を援用する、Ｄｕｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３６（６）：１１１０－１１２２“Ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ：ｈｉｓｔｏｒｙ，ｓｔａｔｕｓ，ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓを参照されたい）。

【0294】

６．５ 疾患マーカー、及び治療評価
特定の実施形態では、本明細書に記載した治療方法の有効性は、骨、軟骨、靭帯、半月板、心臓弁、尿、及び／または血清において、疾患のバイオマーカー（ＧＡＧ、ＫＳ、及びＣ６Ｓの貯蔵）の減少、及び／またはｈＧＡＬＮＳ酵素活性の高まりを測定してモニタリングし得る。炎症、及びその他の安全性事象の徴候もモニタリングし得る。

【0295】

特定の実施形態では、本明細書に記載した治療方法の有効性を、患者の疾患バイオマーカーのレベルを測定することでモニタリングする。特定の実施形態では、その疾患バイオマーカーのレベルは、患者の血清で測定する。特定の実施形態では、当該疾患バイオマーカーのレベルは、患者の尿で測定する。特定の実施形態では、当該疾患バイオマーカーは、ＧＡＧである。特定の実施形態では、当該疾患バイオマーカーは、ＫＳである。特定の実施形態では、当該疾患バイオマーカーは、Ｃ６Ｓである。特定の実施形態では、当該疾患バイオマーカーは、ｈＧＡＬＮＳ酵素活性である。

【0296】

特定の実施形態では、本明細書に記載した治療方法の有効性は、患者のリソソーム貯蔵障害に関連する身体的特徴を測定してモニタリングできる。特定の実施形態では、当該身体的特徴を、貯蔵病変とすることができる。特定の実施形態では、当該身体的特徴を、短頸及び短躯とすることができる。特定の実施形態では、当該身体的特徴を、鳩胸とすることができる。特定の実施形態では、当該身体的特徴を、関節弛緩とすることができる。特定の実施形態では、当該身体的特徴を、脊柱後側弯とすることができる。特定の実施形態では、当該身体的特徴を、気管閉塞とすることができる。特定の実施形態では、当該身体的特徴を、脊髄圧迫とすることができる。特定の実施形態では、当該身体的特徴を、聴覚障害とすることができる。特定の実施形態では、当該身体的特徴を、角膜混濁とすることができる。特定の実施形態では、当該身体的特徴を、骨及び関節の変形とすることができる。特定の実施形態では、当該身体的特徴を、心臓弁疾患とすることができる。特定の実施形態では、当該身体的特徴を、気道の拘束／閉塞とすることができる。このような身体的特徴は、当業者に公知のいずれかの方法で測定し得る。

【0297】

７．実施例
本明細書で提供する特定の実施形態を、以下の実施例で示すが、これらに限定されない。

【0298】

７．１ 実施例１．ｒＡＡＶゲノムをコードするプラスミド、及びインビトロトランスフェクションアッセイのデザイン
ｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組み換えＡＡＶゲノムであって、ＡＡＶ８キャプシドに包み込まれる組み換えＡＡＶゲノムを作製するために、当該組み換えＡＡＶゲノムをコードするプラスミドをデザインした。ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳ（当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含み、その発現は、肝臓特異的なＴＢＧプロモーターの調節下で行われる）、ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳ ＣｏＯｐｔ（当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、ｈＧＡＬＮＳをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含み、その発現は、肝臓特異的なＴＢＧプロモーターの調節下で行われる）、ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳ（当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、Ｄ８に融合したｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、その調節は、肝臓特異的なＴＢＧプロモーターの調節下で行われる）、またはＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳ ＣｏＯｐｔ（当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、Ｄ８に融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含み、その発現は、肝臓特異的なＴＢＧプロモーターの調節下で行われる）の４つのプラスミドをデザイン及び作製した。得られたｒＡＡＶは：（ａ）ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）が隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組み換えＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶであって、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、肝臓特異的なＴＢＧプロモーター配列に機能的に連結したｈＧＡＬＮＳ ｃＤＮＡ配列と、ポリＡ部位をコードするヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶ；及び、（ｂ）ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接するｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組み換えＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶであって、当該ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、肝臓特異的なＴＢＧプロモーター配列に機能的に連結されたＤ８－ｈＧＡＬＮＳ ｃＤＮＡ配列と、ポリＡ部位をコードするヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶ、という２つのカテゴリーに属する（図１）。Ｄ８は、骨を標的とするアスパラギン酸オクタペプチドである。

【0299】

次に、ｈＧＡＬＮＳの発現をインビトロで試験するために、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－３０００のプロトコルを使用して、ヒト肝細胞癌（ＨｕＨ７）細胞に、それら４つのプラスミドの１つをトランスフェクションした。４８時間のインキュベーションを行った後に、トランスフェクションした当該ＨｕＨ７細胞と上清を回収し、そして、細胞ペレット及び培地でのＧＡＬＮＳ酵素活性について解析した。ＧＦＰプラスミドをトランスフェクションしたＨｕＨ７細胞を、コントロールとして使用した。ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳプラスミドまたはＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳ ＣｏＯｐｔプラスミドをトランスフェクションしたところ、細胞内のｈＧＡＬＮＳ酵素活性は、同程度の向上を示した（図２Ａ及び２Ｂ）。ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳプラスミドまたはＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳ ＣｏＯｐｔプラスミドをトランスフェクションした後にも、細胞内酵素活性は高まったが、ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳプラスミドまたはＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳ ＣｏＯｐｔプラスミドをトランスフェクションした場合よりも、その程度は低かった（図２Ａ及び２Ｂ）。細胞培地で検出された酵素活性は、いずれのプラスミドをトランスフェクションした場合でも高まった（図２Ｃ及び２Ｄ）。

【0300】

同様に、ｈＧＡＬＮＳの発現をインビトロで試験するために、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－３０００のプロトコルを使用して、ヒト肝癌細胞（ＨｅｐＧ２）に、上記した４つのプラスミドの１つをトランスフェクションした（図３）。７２時間のインキュベーションを行った後に、トランスフェクションしたＨｅｐＧ２細胞を回収し、そして、細胞ペレットでのｈＧＡＬＮＳ酵素活性について解析した。ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳプラスミドまたはＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳ ＣｏＯｐｔプラスミドをトランスフェクションしたところ、細胞内のｈＧＡＬＮＳ酵素活性は、コントロールのプラスミドをトランスフェクションした場合と比べて高まっていた。ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳプラスミドまたはＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳ ＣｏＯｐｔプラスミドをトランスフェクションしたところ、コントロールのプラスミドと比較して、ｈＧＡＬＮＳ活性を押し上げるまでには至らなかった。

【0301】

７．２ 実施例２．ＭＰＳ ＩＶＡノックアウト（ｇａｌｎｓ－／－）マウスへのｒＡＡＶのインビボ投与
肝臓特異的プロモーターＴＢＧの制御下で天然型のヒトＧＡＬＮＳ（ｈＧＡＬＮＳ）を発現できるウイルスゲノムを含むｒＡＡＶ８（ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳ、一部の図では、ＡＡＶ８－ｈＧＡＬＮＳとして示している）、または肝臓特異的プロモーターの制御下で、アスパラギン酸オクタペプチド（Ｄ８）を有するｈＧＡＬＮＳを発現できるウイルスゲノムを含むｒＡＡＶ８（ＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳ、一部の図では、ＡＡＶ８－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳとして示している）を作製した。ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳ ＣｏＯｐｔプラスミド、及びＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳ ＣｏＯｐｔプラスミドのそれぞれを使用して、ウイルスゲノムを作製した。これら２種類のウイルスをそれぞれ、４週齢のＭＰＳ ＩＶＡノックアウト（ＫＯ）マウス、及びＭｔｏｌ免疫寛容マウスに、体重１ｋｇ当たり５×１０^１３ＧＣの用量で静脈内投与した。ＫＯマウスは、ｍＧＡＬＮＳのエキソン２が標的破壊されており、検出可能なＧＡＬＮＳ酵素活性を持たない。Ｍｔｏｌマウスは、ヒトＧＡＬＮＳタンパク質に対して免疫寛容状態になっている。未処置のＫＯマウス、及び野生型（ＷＴ）マウスを、コントロールとした。これらのマウスは、注射した後に、１４週間モニタリングした。血液を週に２回採取し、ｈＧＡＬＮＳ活性、及びケラタン硫酸（ＫＳ）についてアッセイした。ｒＡＡＶの投与、血液採取、ＧＡＬＮＳ酵素アッセイ、及びＫＳアッセイのスケジュールを、図４に示している。検視時に、骨の病態を組織病理学的解析で評価した。

【0302】

図５Ａに見られるように、ｒＡＡＶ処置マウスの白血球（ＷＢＣ）において、ｈＧＡＬＮＳ酵素活性が向上し、治療から１０週間後に、ＷＴマウスのレベル近くにまで達した。ｒＡＡＶの投与から２週間後に、すべてのｒＡＡＶ処置マウスの血漿におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性は、ＷＴマウスでのレベルと比べて、平均で２０倍（ＷＴマウスでのレベルと比べて５～１００倍の範囲）上昇した（図５Ｂ）。この上昇は、１４週間のモニタリング期間にわたって維持された（図５Ｂ）。同様のデータを、図２２に示す。ＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスでの血漿中の酵素活性レベルは、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスでのレベルよりも有意に高かった（図６）が、いずれの処置群の酵素活性レベルも、ＷＴのレベルよりも上昇した。同様のデータを、図２３に示す。

【0303】

ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウスの肝臓で測定したｈＧＡＬＮＳ活性を、ＷＴマウスの肝臓でのｈＧＡＬＮＳ活性と比較した（図７Ａ）。ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスは、肝臓でのｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、ＷＴのレベルと比べて４０倍高かったのに対して、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスは、肝臓でのｈＧＡＬＮＳ活性が、ＷＴのレベルよりも８倍高かった。ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスの肝臓でのｈＧＡＬＮＳ活性は、未処置のＭｔｏｌマウス（ＰＢＳ処置マウス）よりも高かった（図７Ｂ）。ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスは、肝臓でのｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、未処置のマウスと比べて５０倍高かったのに対して、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスは、肝臓におけるｈＧＡＬＮＳ活性が、未処置のＭｔｏｌマウスよりも８倍高かった。ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳを投与した後に、ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）、及びＭｔｏｌマウスの肝臓でそれぞれ測定したｈＧＡＬＮＳの活性レベルを、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）、未処置のＭｔｏｌマウス、及び野生型マウスと比較したものに関するさらなるデータについては、図１２Ａを参照されたい（ｎ＝３～８、平均±標準偏差）。

【0304】

ｈＧＡＬＮＳ活性は、（ａ）ＷＴマウス、（ｂ）未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウス、（ｃ）ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウス、（ｄ）ＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウス、（ｅ）未処置のＭｔｏｌマウス、（ｆ）ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウス、及び（ｇ）ＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスの心臓でも測定した（図７Ｃ）。ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウス及びＭｔｏｌマウスのいずれでも、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したマウス及びＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスの両方とも、心臓でのｈＧＡＬＮＳ活性レベルが、未処置のマウスと比べて高かった。ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳを投与した後に、ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）及びＭｔｏｌマウスのそれぞれの心臓で測定したｈＧＡＬＮＳ活性レベルを、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）、未処置のＭｔｏｌマウス、及び野生型マウスの場合と比較したものに関するさらなるデータについては、図１３Ｂを参照されたい（ｎ＝３～８、平均±標準偏差）。

【0305】

同様に、ｈＧＡＬＮＳ活性を、（ａ）ＷＴマウス、（ｂ）未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウス、（ｃ）ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウス、（ｄ）ＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウス、（ｅ）未処置のＭｔｏｌマウス、（ｆ）ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウス、及び（ｇ）ＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスの骨で測定した（図７Ｄ）。ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウス及びＭｔｏｌマウスのいずれでも、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したマウス及びＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスの両方とも、骨でのｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、未処置のマウスと比べて高かった。ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳを投与した後に、ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）及びＭｔｏｌマウスのそれぞれの骨で測定したｈＧＡＬＮＳ活性レベルを、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）、未処置のＭｔｏｌマウス、及び野生型マウスと比較したものに関するさらなるデータについては、図１３Ａを参照されたい（ｎ＝３～８、平均±標準偏差）。

【0306】

ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウス及びＭｔｏｌマウスのいずれでも、処置したマウスの肝臓、心臓、及び骨でのｈＧＡＬＮＳ活性レベルは、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳベクターまたはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳベクターの送達後に上昇した。加えて、血液でのｈＧＡＬＮＳ酵素活性と、骨でのｈＧＡＬＮＳ酵素活性との間に、直接的な相関関係が認められた。

【0307】

ｈＧＡＬＮＳ酵素活性レベルは、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳを投与した後に、ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）の脾臓、及びＭｔｏｌマウスの脾臓でも、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）、未処置のＭｔｏｌマウス、及び野生型マウスと比較する形で、それぞれ測定した（ｎ＝３～８、平均±標準偏差）（図１２Ｂ）。ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウス、及びＭｔｏｌマウスのいずれでも、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したマウス、及びＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスの両方とも、脾臓におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、未処置のマウスと比べて高かった。

【0308】

加えて、ｈＧＡＬＮＳ酵素活性レベルは、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳを投与した後に、ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）の肺、及びＭｔｏｌマウスの肺でも、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）、未処置のＭｔｏｌマウス、及び野生型マウスと比較する形で、それぞれ測定した（ｎ＝３～８、平均±標準偏差）（図１２Ｃ）。ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウス、及びＭｔｏｌマウスのいずれでも、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したマウス、及びＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスの両方とも、肺でのｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、未処置のマウスと比べて高かった。

【0309】

血中ケラタン硫酸（ＫＳ）レベルを測定した。ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウスでは、いずれの群でも、ｒＡＡＶで治療することで、投与から２週間後に、血漿中のモノ硫酸化ケラタン硫酸（ＫＳ）レベルが、ＷＴのレベルまで低下した（図８及び図１４）。両方のｒＡＡＶ処置群でのこれらの血漿中レベルの低下は、注射から１２週間後の検視時まで維持された。対照的に、未処置のＫＯマウスの血漿中のＫＳレベルは低下せず、モニタリングした期間にわたって上昇したままであった。ＭｔｏｌマウスにｒＡＡＶのいずれを投与した場合も、血漿中のモノ硫酸化ケラタン硫酸（ＫＳ）レベルは、治療から２週間後に、ＷＴのレベルと比べて低下し、その血漿中ＫＳレベルは、未処置のＭｔｏｌマウスと比べて有意に低下した（図９Ａ～９Ｂ、及び図１５Ａ～１５Ｂ）。しかしながら、血中ｄｉＨＳ－０Ｓレベルは、未処置のマウス群、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したマウス群、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したマウス群、及びＷＴマウス群で、差異は認められなかった（図１０）。

【0310】

モノ硫酸化ＫＳレベルを、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）の肝臓、Ｍｔｏｌマウスの肝臓、及びＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）の肺で、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス、及び未処置の野生型マウスと比較する形で、それぞれ測定した（図１６Ａ～１６Ｃ）。ｒＡＡＶのいずれを投与した場合でも、未処置のマウスと比べて、肝臓でのモノ硫酸化ＫＳが有意に低下した、そして、肺でのモノ硫酸化ＫＳも有意に低下した。ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）、及びＭｔｏｌマウスの肝臓、及び肺でのＫＳレベルは、ＡＡＶベクターを投与した後は、ほぼ正常化した。

【0311】

これらの処置ＫＯマウスの肝臓の組織病理学的評価は、洞内皮細胞、及びクッパー細胞でのＧＡＧ貯蔵が完全に解消されたことを示した。

【0312】

ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳ及びＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳの投与したところ、モニタリング期間にわたって、ＫＯマウスモデル及びＭｔｏｌマウスモデルの血漿において、高レベルの酵素活性が維持された。このように循環酵素が継続的に存在することにより、血漿中のＫＳがＷＴのレベルまで低下し、そのレベルは、ＥＲＴによって得られる改善よりも有意な改善である（Ｔｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００８，１７（６）：８１５－８２４）。血漿中ＫＳレベルは、両方のマウスモデルでも、そして、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳ及びＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳの両方についても、ｒＡＡＶを投与してから２週間後に正常化したが、ＫＯマウスをＥＲＴで処置した従前の研究では、血漿中ＫＳレベルは、週に１回注入してから１２週間後でも正常化しなかった（Ｔｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００８，１７（６）：８１５－８２４）。加えて、高い酵素レベルが、循環時間の長期化と相まって、骨及び軟骨への浸透を高めたことで、これらの領域での貯蔵性が改善した。

【0313】

ｒＡＡＶで処置して１２週間後にマウスを安楽死させ、組織を摘出し、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の貯蔵について評価した。組織をトルイジンブルーで染色した。骨の病態を組織病理学的解析によって評価したが、病理スコアを、ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウスに関してグラフ図で表している（図１１Ａ）。図１１Ｂは、膝関節（ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウス）の染色画像を示している。

【0314】

図１１Ｃは、ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウスの大腿関節軟骨を４０倍に拡大した染色画像を示している。未処置のマウス（左パネル）では、表層細胞が破壊されており、軟骨細胞が風船様になり、空胞化していた。さらに、当該カラム構造は歪み、崩壊していた。対照的に、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳのいずれかで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウスの組織では、表層細胞は組織化されており、軟骨細胞の空胞化の程度は小さく、カラム構造は維持されていた（右の２つのパネル）。これらの様相は、図１１Ｄ～１１Ｆに、さらに詳細に示している。

【0315】

図１１Ｇは、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウスまたはｒＡＡＶで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウスの大腿骨成長板を４０倍に拡大した染色画像を示している。その未処置のマウス（左パネル）では、軟骨細胞は空胞化しており、当該カラム構造は大部分が崩壊し、歪んでいた。ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスの軟骨細胞（中央パネル）も空胞化していたが、カラム構造の歪みは中度に過ぎなかった。対照的に、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウスの組織（右パネル）では、軟骨細胞の空胞化は中度であり、カラム構造は、より組織化されていた。これらの様相は、図１１Ｈ～１１Ｊにさらに詳細に示している。図１７Ａ～１７Ｅにも、（Ａ）野生型マウス（いずれの軟骨細胞も空胞化しておらず、カラム構造は充分に組織化されていた）、（Ｂ）未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）（軟骨細胞はいずれも空胞化しており、カラム構造は大部分が崩壊し、歪んでいた）、（Ｃ）未処置のＭｔｏｌマウス（軟骨細胞はいずれも空胞化しており、カラム構造は大部分が崩壊し、乱れていた）、（Ｄ）ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウス（軟骨細胞の空胞化は中度であったが、カラム構造は良質であった）、及び（Ｅ）ＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウス（軟骨細胞の空胞化は中度であったが、カラム構造は部分的に回復していた）の大腿骨成長板を４０倍に拡大した染色画像を示している。

【0316】

図１８Ａは、未処置の野生型マウス、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）、またはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）の大腿骨及び脛骨の成長板で測定した軟骨細胞の細胞サイズを示している。図１８Ｂは、未処置の野生型マウス、未処置のＭｔｏｌマウス、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウス、またはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスの大腿骨成長板で測定した軟骨細胞の細胞サイズを示している。図１８Ｃは、未処置の野生型マウス、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）、またはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ－／－）の脛骨成長板で測定した軟骨細胞の細胞サイズを示している。図１８Ｄは、未処置の野生型マウス、未処置のＭｔｏｌマウス、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウス、またはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスの脛骨成長板で測定した軟骨細胞の細胞サイズを示している。

【0317】

ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス及びＭｔｏｌマウスの成長板での軟骨細胞のサイズ及びカラム構造はいずれも、ＡＡＶ遺伝子移入後に実質的に改善した。

【0318】

図１１Ｋは、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウスまたはｒＡＡＶで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウスの半月板を４０倍に拡大した染色画像を示している。未処置のマウス（左パネル）では、当該細胞の大半が風船様になり、空胞化していた。ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスの半月板の細胞の一部（中央パネル）は空胞化していた。ＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスの組織の細胞の大半（右パネル）は、空胞化していなかった。

【0319】

図１１Ｌは、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウスまたはｒＡＡＶで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウスの脛骨側の靭帯を４０倍に拡大した染色画像を示している。未処置のマウス（左パネル）では、当該細胞の大半が空胞化していた。ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスの靭帯の細胞の一部（右の２つのパネル）は、空胞化したままであった。

【0320】

図１１Ｍは、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウスまたはｒＡＡＶで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウスの心臓弁の基部を４０倍に拡大した染色画像を示している。未処置のマウス（左パネル）の僧帽弁基部の細胞の多くは空胞化していたが、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したマウス（中央パネル）またはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したマウス（右パネル）の僧帽弁組織の基部には、空胞化した細胞は認められなかった。未処置のマウスの組織のこれらの様相は、図１１Ｎにさらに詳細に示している。心臓弁の組織で、同様の結果が認められた（図１１Ｏ）。Ｍｔｏｌマウスでの同様の結果は、図１９（下パネル）に示している。未処置のマウス（左パネル）の心臓弁細胞の多くは、空胞化していたが、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したマウス（中央パネル）、またはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したマウス（右パネル）の心臓弁組織では、空胞化した細胞は認められなかった。未処置のマウスの組織のこれらの様相を、図１１Ｐにさらに詳細に示している。

【0321】

図２０は、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスの心筋（４０倍拡大画像）の組織病態を、未処置のＭｔｏｌマウスと比較したものを示している。

【0322】

心臓弁及び心筋では、ＡＡＶによる遺伝子移入後、ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウス及びＭｔｏｌマウスのいずれでも、明らかに空胞化した細胞は認められなかった。

【0323】

図２１Ａは、未処置の野生型マウス、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウス、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウス、またはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウスの心臓弁組織の病理スコアを示している。図２１Ｂは、未処置の野生型マウス、未処置のＭｔｏｌマウス、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウス、またはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスの心臓弁組織の病理スコアを示している。図２１Ｃは、未処置の野生型マウス、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウス、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウス、またはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ－／－）マウスの心筋組織の病理スコアを示している。図２１Ｄは、未処置の野生型マウス、未処置のＭｔｏｌマウス、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウス、またはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスの心筋組織の病理スコアを示している。

【0324】

Ｍｔｏｌマウスでも、骨の病態を組織病理学的解析で評価した。独立ｔ検定を使用して、未処置群とそれぞれの処置群との病理スコアの差について調べた（スコア：０（正常）～３（重度））。表１を参照されたい。

【0325】

【表2】

【0326】

いずれのウイルスも、関節軟骨、関節軟骨周辺の靭帯及び半月板、ならびに脛骨及び大腿骨の成長板領域でのＧＡＧ貯蔵を低下させた。骨及び軟骨で認められたＧＡＧ貯蔵の低下は、ＡＡＶ－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスでは比較的大きかった。

【0327】

ｒＡＡＶで処置したマウスでは、骨、成長板、関節軟骨、半月板、靭帯、及び心臓組織は、実質的に改善した。加えて、処置マウスでは、心臓弁及び心臓弁基部の異常に関して、ほぼ完全寛解が得られ、心臓弁基部及び心臓弁のいずれにおいても、明らかに空胞化した細胞は認められなかった。これらの結果から、ＥＲＴ処置マウスでは、成長板において、空胞化した細胞の消失が認められず、成長板において、カラム構造が崩壊しており、心臓弁において、実質的に空胞化した細胞が認められているので、ＥＲＴよりも有意な改善が示されている（Ｔｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００８，１７（６）：８１５－８２４）。

【0328】

肝臓以外の組織で治療効果が認められた（ｈＧＡＬＮＳタンパク質、及びＤ８－ｈＧＡＬＮＳタンパク質が産生された）ことから、マンノース－６－リン酸受容体が、クロスコレクションを媒介したことを示唆している。

【0329】

７．３ 実施例３．肝臓を標的としたＡＡＶ８による遺伝子治療は、ムコ多糖症ＩＶＡマウスモデルにおいて、骨格及び心血管の病態を改善する
この実施例は、本明細書に記載した実施例１～２を含むその他の実施例で説明及び実施した実験に関連するものであり、実施例１～２の追加データを提供する。この実施例では、肝臓特異的なサイロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーターの制御下で、ｈＧＡＬＮＳを、骨標的シグナルと一緒に、または骨標的シグナルが無いままに発現するＡＡＶ８ベクターを評価し、ＭＰＳ ＩＶＡの疾患の両方のマウスモデルの骨及び心臓の病変において、これらの組み換えＡＡＶ８ベクターの治療有効性を試験する。骨及び心臓のいずれも、この障害で影響を受ける主要臓器である。

【0330】

７．３．１ 結果
（ａ）血液及び組織でのＧＡＬＮＳ酵素活性：ＡＡＶ－ｈＧＡＬＮＳを送達すると、ＭＰＳ ＩＶＡのマウスモデルの血漿及び各種組織において、ＧＡＬＮＳ活性が顕著に向上する。
ＭＰＳ ＩＶＡである２つのマウスモデル（ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ、及びＭｔｏｌ）では、ｈＧＡＬＮＳ活性の欠損、血液及び組織でのＫＳレベルの上昇、ならびに軟骨細胞、半月板、靭帯、心筋及び心臓弁などの各種組織内での貯蔵物質（小胞）に関して、ヒト疾患を再現する。これらのバイオマーカーは、これらのマウスモデルにおいて、表現型の重症度、及び幾つかのアプローチの治療有効性を評価する目的で広く利用されている（Ｔｏｍａｔｓｕ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２００８，１７，８１５－８２４、Ｔｏｍａｔｓｕ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２００３，１２，３３４９－３３５８、Ｔｏｍａｔｓｕ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２００５，１４，３３２１－３３３５、Ｔｏｍａｔｓｕ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２０１０，１８，１０９４－１１０２）。この試験では、我々は、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳｃｏ、及びＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳｃｏ（図２４Ａ）を、４週齢のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ、及びＭＴＯＬマウスに、体重１ｋｇ当たり５×１０^１３ＧＣという均一な用量で静脈内送達した。それらのマウスを、注射後１２週間かけてモニタリングし、血液試料を１週間おきに採取して、酵素活性及びＫＳレベルを解析した。加えて、検視時に、酵素活性及びＫＳレベルのための組織試料を異なる臓器から採取し、また、組織病理解析のための膝関節及び心臓弁も摘出した。

【0331】

ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスの血漿中酵素活性を、図２４Ｂ～２４Ｃに示している。未処置のＭＰＳ ＩＶＡマウスでは、血漿でのｈＧＡＬＮＳ活性は検出されなかった。注射から２週間後に、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスでの血漿中のｈＧＡＬＮＳ活性は、野生型マウスにおける活性と比べて、有意に向上した。注射から２週間後に、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳに由来する酵素活性は、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳに由来する活性よりも高かったが、注射から１２週間後には、これらの２つのＡＡＶベクターにおいて、血漿中のｈＧＡＬＮＳ活性に差異は認められなかった。両方のＡＡＶベクターで処置したＭＴＯＬマウスでも、血漿中のｈＧＡＬＮＳ活性は、注射から２週間後に、野生型マウスでの活性と比べて、有意に向上した。ＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスの酵素活性のレベルは、試験期間全体を通じて、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスの活性よりも高かったことから、骨標的シグナルを有するｈＧＡＬＮＳは、おそらく、組織への取り込みが低下して、天然型のｈＧＡＬＮＳと比べて、血液循環が長くなったものと示唆された。これらの結果から、いずれのＭＰＳ ＩＶＡマウスモデルにおいても、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳを１回注射した後に、超生理学的レベルの循環ｈＧＡＬＮＳ活性が得られるとともに、試験の間は、高レベルの酵素活性が維持されたことが示された。

【0332】

ＡＡＶベクターのＩＶ送達から１２週間後の肝臓でのｈＧＡＬＮＳ活性のレベルを、図２４Ｊ及び図２４Ｋに示す。すべての処置ＭＰＳ ＩＶＡマウスでのｈＧＡＬＮＳの活性レベルは、未処置のＭＰＳ ＩＶＡマウスでの活性よりも有意に高かった。ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスでの平均酵素活性レベルは、野生型マウスで認められたレベルよりも４９倍高く、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスでの平均酵素活性レベルは、９倍高かった。ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスでは、ｈＧＡＬＮＳ活性は、野生型マウスで認められたレベルよりも６０倍高く、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＴＯＬマウスでは、９倍高かった。ＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスの肝臓でのＧＡＬＮＳ活性は、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスでの活性よりも有意に低かった。

【0333】

ＭＰＳ ＩＶＡマウスの組織において、組織中のｈＧＡＬＮＳ活性のレベルを調べて、ｈＧＡＬＮＳ欠損の潜在的クロスコレクションを評価した。ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスの両方において、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮまたはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置した後は、いずれも、脾臓、肺、腎臓、骨（肢骨）及び心臓を含めて、調べたすべての組織で、ｈＧＡＬＮＳ活性が認められた（図２４Ｊ～２４Ｋ）。その酵素活性は、脾臓及び心臓において、野生型レベルと同程度以上であったとともに、肺及び腎臓では、多少低レベルの活性が認められた。とりわけ、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳで処置したＫＯマウスの骨では、野生型酵素活性の３７％の活性が認められ、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＫＯマウスの骨では、野生型酵素活性の２０％の活性が認められた。また、これらの２つのＡＡＶベクターで処置したＭＴＯＬマウスでは、野生型酵素活性の５７％の活性と、４３％の活性が認められた。これらの結果から、ＡＡＶによる遺伝子移入後、安定した超生理学的レベルのｈＧＡＬＮＳ酵素が、ＭＰＳ ＩＶＡマウスの骨を含む各種組織内へのその酵素の浸透に寄与することが示唆されている。骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性レベルは、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳとＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳにおいて、統計的な差異は認められなかった。

【0334】

（ｂ）ＡＡＶ－ＧＡＬＮＳを送達した結果、血液及び組織におけるモノ硫酸化ＫＳのレベルは低下した
我々は、ＫＳの主成分であるモノ硫酸化ＫＳを、ＭＰＳ ＩＶＡマウスの血漿及び組織において測定した。ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスでの血漿中のモノ硫酸化ＫＳのレベルを、図２５Ａ～２５Ｂに示す。ＡＡＶベクターを投与する前に、未処置のＫＯマウスでの血漿中ＫＳレベルは、野生型マウスでのレベルよりも有意に高かった（平均：１６．３ｎｇ／ｍｌに対して４１．８ｎｇ／ｍｌ）。注射から２週間後に、両方のＡＡＶベクターに関して、血漿中のモノ硫酸化ＫＳレベルは完全に正常化しており、このレベルは、少なくともさらに１０週間（検視時）維持していた。モノ硫酸化ＫＳレベルは、４週齢の野生型マウス及び未処置のＭＴＯＬマウスにおいて同程度であった。野生型マウスにおけるモノ硫酸化ＫＳレベルは、試験全体を通じて一定レベルに維持した；しかしながら、未処置のＭＴＯＬマウスでのモノ硫酸化ＫＳのレベルは、加齢に伴って徐々に上昇した。上記したＡＡＶベクターのいずれかで処置したＭＴＯＬマウスは、試験期間全体を通じて、正常レベルを維持した。１６週齢では、ＡＡＶベクターで処置したＭＴＯＬマウスでのモノ硫酸化ＫＳレベルは、未処置のＭＴＯＬマウスでのレベルと比べて、有意に低下した。

【0335】

ＭＰＳ ＩＶＡマウスの組織でのモノＫＳレベルを測定する。検視時に、ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスの両方の組織に、ＧＡＧの過剰貯蔵が認められた。ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスの肝臓及び肺でのモノ硫酸化ＫＳの量は、いずれのＡＡＶベクターを注射しても、１２週間後には有意に減少した（図２５Ｃ～２５Ｄ）。ｈＧＡＬＮＳを発現するこれらのＡＡＶベクターがその他のＧＡＧレベルに及ぼす作用を評価するために、ＭＰＳ ＩＶＳマウスの血液及び組織でのヘパラン硫酸（ＨＳ）のレベルを解析した。ＫＯマウス及びＭｔｏｌマウスのいずれも、血漿中のｄｉＨＳ－０Ｓは正常レベルであり、また、そのレベルは、ＡＡＶベクターの注射後に影響を受けなかった（図３０）。肝臓及び肺の組織でのｄｉＨＳ－０Ｓレベルも、ＡＡＶベクターの注射から１２週間後は、すべての群の間で、変化は認められなかった（図３１）。

【0336】

（ｃ）ＡＡＶ ＧＡＬＮＳベクターの送達によって、ＭＰＳ ＩＶＡマウスでの骨及び軟骨の病態が改善した
ＭＰＳ ＩＶＡマウスにおいて、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳを注射してから１２週間後に、骨（大腿骨及び脛骨）ならびに心臓（心筋及び心臓弁）などの組織を評価した。

【0337】

１６週齢の未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスで、ＧＡＧ貯蔵小胞が、大腿骨及び脛骨の成長板（硝子軟骨）（図２７Ａ）、関節円板（図２７Ｂ）、膝関節周辺の靭帯（図３２Ａ）、及び半月板（図３２Ｂ）に認められた。成長板では、崩壊したカラム構造とともに、風船様になり、空胞化した軟骨細胞も認められた（図２７Ａ～２７Ｂ）。ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＫＯマウスでは、膝関節における成長板、関節軟骨、靭帯及び半月板は、貯蔵物質が部分的に減少し、軟骨細胞のカラム構造は改善したが、依然として崩壊しており、乱れた状態のままであった。これらのＡＡＶベクターで処置したＭＴＯＬマウスでは、膝関節における成長板、関節軟骨、靭帯、及び半月板は、貯蔵が観察可能な程度を上回る程度にまで減少しており、成長板及び関節軟骨のカラム構造では、未処置のＭＴＯＬマウスよりも大きな回復が認められた。

【0338】

成長板の軟骨細胞での空胞化の改善を客観的に評価するために、ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスの成長板病変において、軟骨細胞の細胞サイズを定量した（４Ｃ）。我々は、これらの成長板病変において、軟骨細胞サイズの中度の減少を認め、その減少は、ＭＴＯＬマウスにおいて、統計学的に有意な状態にまで達した。未処置のＭＰＳ ＩＶＡマウスでは、心臓弁と心筋でＧＡＧ貯蔵小胞が認められた。ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳは、処置したＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスの上記した心臓病変を、ほぼ完全に消失させた（図２７Ａ～２７Ｂ）。

【0339】

（ｄ）抗ｈＧＡＬＮＳ抗体の循環
全体として、ＡＡＶ８ベクターの注射から１２週間後に、ＫＯマウスでの骨の病態の改善は、ＭＴＯＬマウスにおける改善と比べて顕著ではなかった。ｈＧＡＬＮＳに対する液性応答の可能性を調べるために、ｈＧＡＬＮＳに対する抗体力価を酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）で測定した。プレートにコーティングした完全長ｒｈＧＡＬＮＳを使用することで、間接ＥＬＩＳＡ法によって、血漿中の抗ｈＧＡＬＮＳ抗体を検出した。ＡＡＶベクターで処置したＫＯマウスに由来する血漿では、循環抗ｈＧＡＬＮＳ抗体のレベルが、その他の群に由来するレベルと比べて有意に高かった（ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳで処置したＫＯにおいて、光学密度（ＯＤ）単位は、０．５０±０．３８または０．６２±０．４３であった）（図２８）。循環抗ｈＧＡＬＮＳ抗体は、野生型マウス、未処置のＫＯマウス、及びＭＴＯＬマウスでは検出されなかった。

【0340】

７．３．２ 材料及び方法
（ａ）ＡＡＶ ｈＧＡＬＮＳ発現カセットの開発
ｈＧＡＬＮＳを含むＡＡＶ８ベクターを開発するために、我々は、ｈＧＡＬＮＳの最適化コドン配列を決定した。肝臓特異的なＴＢＧプロモーターの制御下で、５２６個のアミノ酸に翻訳される１５６９ｂｐの最適化配列を、ＡＡＶ８キャプシドに包み込んだ。骨標的シグナルを含むベクタープラスミドでは、アスパラギン酸オクタペプチド（Ｄ８）配列を、ｈＧＡＬＮＳのＮ末端シグナルペプチドの後に挿入し、主要骨基質であるヒドロキシアパタイトに対する親和性に富んだ骨標的ｈＧＡＬＮＳを作製した（図２４Ａ）。Ｈｕｈ－７細胞へのトランスフェクション実験を行った後に、これらのＡＡＶベクタープラスミドが、ＧＡＬＮＳを産生することを確認した。そのコドン最適化オープンリーディングフレームに由来する細胞内及び細胞外のｈＧＡＬＮＳの活性レベルは、天然型のｈＧＡＬＮＳコード配列によって産生されるレベルと同程度であった（図２９Ａ～２９Ｂ）。

【0341】

（ｂ）発現カセットのデザイン及びＡＡＶベクターの作製
ＡＡＶ８ベクターに包み込む目的で、天然型ＧＡＬＮＳ導入遺伝子と、Ｄ８を含むＧＡＬＮＳ導入遺伝子とを保有する発現カセットをデザインした（図２８）。骨標的シグナルであるアスパラギン酸オクタペプチド（Ｄ８）配列は、ｈＧＡＬＮＳのＮ末端シグナルペプチドの後に挿入した。このデザインでは、肝臓特異的なサイロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーターを、ウサギベータグロブリンポリアデニル化テール（ポリＡ）と共に含めた。我々は、当該マウス試験のための両方のベクターに、コドン最適化したｈＧＡＬＮＳ配列を使用した。我々は、Ｈｕｈ－７細胞を使用するトランスフェクション実験で、これらの発現カセットプラスミドのＧＡＬＮＳ酵素活性を確認した。我々は、トランスフェクションから４８時間後に、細胞溶解物及び上清の両方で、活性レベルを求めた（図２９Ａ～２９Ｂ）。そのコドン最適化コンストラクトから得たＧＡＬＮＳ活性レベルは、天然型ｈＧＡＬＮＳコード配列がもたらすレベルと同程度であった。

【0342】

当社、ＲＥＧＥＮＸＢＩＯ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）のＧＭＰベクター作製プロトコルをスケールダウンして得たプロトコルに従って、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳベクター及びＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳベクターを作製した。簡潔に説明すると、ＨＥＫ２９３細胞（ＲＧＸ２９３）に、ヘルパープラスミド、ＡＡＶ８キャプシドプラスミド、及びｈＧＡＬＮＳ／Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳプラスミドを含む導入遺伝子プラスミドを、トリプルトランスフェクションした。アフィニティークロマトグラフィーを使用して、パッケージを終えたベクターを、細胞培養上清から精製し、そして、Ｄｉｇｉｔａｌ Ｄｒｏｐｌｅｔ ＰＣＲ（ＢｉｏＲａｄ）法を使用して、力価の測定を行った。

【0343】

（ｃ）マウスモデル、及びインビボ試験デザイン
我々は、２つのＭＰＳ ＩＶＡマウスモデルを使用して、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳ及びＡＡＶ８－ＴＢＧ－Ｄ８－ｈＧＡＬＮＳの潜在的な治療能力を試験した（Ｔｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２００３；１２（２４）：３３４９－３３５８、Ｔｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２００５；１４，３３２１－３３３５）。第１のタイプは、ｇａｌｎｓ遺伝子が破壊されたＧａｌｎｓノックアウトマウスモデル（ＫＯ：Ｇａｌｎｓ－／－）である（Ｔｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２００３；１２（２４）：３３４９－３３５８）。第２のタイプは、β－グロビン／ＩｇイントロンにおいてｈＧＡＬＮＳを発現する導入遺伝子と、エキソン２に隣接する活性部位での変異（Ｃ７６Ｓ）とを含むヒトＧＡＬＮＳに対して寛容性を有しており、それにより、標的変異誘発によって、マウスＧａｌｎｓ遺伝子に、不活性なｈＧＡＬＮＳコード配列にＣ７９Ｓという活性部位の変異と、Ｃ７６Ｓの変異の両方を導入するマウスモデル（Ｍｔｏｌ：Ｇａｌｎｓ^{ｔｍ（ｈＣ７９Ｓ．ｍＣ７６Ｓ）ｓｌｕ}）である（Ｔｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２００５；１４，３３２１－３３３５）。いずれのモデルでも、血液及び組織において、検出可能な酵素活性は認められず、主に、細網内皮系クッパー細胞、心臓弁、心筋、ならびに成長板及び関節軟骨などの軟骨細胞内で、貯蔵物質の蓄積が認められた。

【0344】

我々は、以前に、２つのＭＰＳ ＩＶＡマウスモデル、すなわち、Ｃ５７ＢＬ／６をバックグラウンドとするＭＰＳ ＩＶＡノックアウトマウス（Ｇａｌｎｓ－／－）（Ｔｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２００３；１２（２４）：３３４９－３３５８）、及びヒトＧＡＬＮＳタンパク質に対する寛容性を有するＭＰＳ ＩＶＡマウス（Ｇａｌｎｓ^{ｔｍ（ｈＣ７９Ｓ．ｍＣ７６Ｓ）ｓｌｕ}）（Ｔｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ． Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２００５；１４，３３２１－３３３５）の開発について説明をした。ＧＡＬＮＳノックアウトマウスモデル（ＫＯ：Ｇａｌｎｓ－／－）は、ＧＡＬＮＳ遺伝子を標的破壊して開発した（Ｔｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２００３；１２（２４）：３３４９－３３５８）。ヒトＧＡＬＮＳに対する寛容性を有するマウスモデル（Ｍｔｏｌ：ｇａｌｎｓ^{ｔｍ（ｈＣ７９Ｓ．ｍＣ７６Ｓ）ｓｌｕ}）は、β－グロブリン／ＩｇイントロンでｈＧＡＬＮＳを発現する導入遺伝子と、エキソン２に隣接する活性部位に変異（Ｃ７６Ｓ）を含み、それにより、Ｃ７９Ｓ活性部位変異と、不活性なｈＧＡＬＮＳコード配列との両方が導入される（Ｔｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２００５；１４，３３２１－３３３５）。両方のマウスモデルでは、血液及び組織において、検出可能な酵素活性は認められず、主に、細網内皮系クッパー細胞、心臓弁、及び心筋、ならびに成長板及び関節軟骨などの軟骨細胞内で、貯蔵物質の蓄積が認められた。

【0345】

１４日目に、実験コホートのジェノタイピングをＰＣＲで行った。４週齢のホモ接合型ＭＰＳ ＩＶＡマウスを、いずれかのＡＡＶ８ベクターで、５×１０^１３ＧＣ／ｋｇの均一な用量で静脈内処置した。別のコホートのＭＰＳ ＩＶＡマウスと、罹患していないＣ５７ＢＬ／６同腹子に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を投与した。総投与体積は、マウス１匹当たり約１００μｌであった。マウスの取り扱い、及び実験については、すべて、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｎｅｍｏｕｒｓ／Ａｌｆｒｅｄ Ｉ．ｄｕＰｏｎｔ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｆｏｒ Ｃｈｉｌｄｒｅｎから許可を得た。

【0346】

（ｄ）血液及び組織の回収
約１００μｌの血液を、ＥＤＴＡが入ったチューブ（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）に、１週間おきに、試験対象のすべてのマウスから得た。その血液を、８，０００ｒｐｍで、１０分遠心分離し、ＧＡＬＮＳ酵素アッセイ及びＧＡＧアッセイを行うまで、分離した血漿を、－２０℃に保持した。１６週齢時に、マウスをＣＯ_２チャンバーで安楽死させ、２０ｍｌの０．９％生理食塩水でかん流した。肝臓、腎臓、肺、脾臓、心臓、及び膝関節を摘出し、ＧＡＬＮＳ酵素アッセイ及びＧＡＧアッセイで処理するまで、－８０℃で保存した。加えて、各種組織の試料を採取し、組織病理解析に向けて、１０％中性緩衝ホルマリンで保存した。

【0347】

（ｅ）ＧＡＬＮＳ活性アッセイ
以前に説明したようにして（Ｔｏｉｅｔｔａ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００１；１２，２００７－２０１６）、血液及び組織でのＧＡＬＮＳ活性を求めた。ホモジナイザーを使用して、２５ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、及び１ｍｍｏｌ／ｌのフェニルメチルスルホニルフルオリドからなるホモジナイズ緩衝剤で、凍結した組織をホモジナイズした。組織溶解物または血漿と、２２ｍＭ ４－メチルウンベリフェリル－β－ガラクトピラノシド－６－硫酸（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｏｕｎｔ Ｐｒｏｓｐｅｃｔ，ＩＬ，ＵＳＡ）とを含む、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ 酢酸ナトリウム、ｐＨ４．３を、３７℃で、１６時間インキュベーションした。続いて、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅに由来する１０ｍｇ／ｍｌのβ－ガラクトシダーゼ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含む０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ 酢酸ナトリウム、ｐＨ４．３を反応試料に加え、そして、さらなるインキュベーションを、３７℃で、２時間行った。その試料を、反応停止液（１Ｍ グリシン、ＮａＯＨ、ｐＨ １０．５）に移し、そして、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｖｉｃｔｏｒ Ｘ４ プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で、当該プレートを、３６６ｎｍの励起光と、４５０ｎｍの発光とで読み取りをした。活性は、放出した４－メチルウンベリフェロンのナノモル／１時間／血漿のマイクロリットルまたはタンパク質のミリグラムとして表した。タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で決定した。

【0348】

（ｆ）組織からのＧＡＧの抽出
各種マウス組織からのＧＡＧの抽出法は、Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，が開発した方法（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００８；２８３，３１２３７－３１２４５）の変法であった。簡潔に説明すると、摘出した組織を、液体窒素で凍結し、そして、ホモジナイザーを使用して、アセトンでホモジナイズした。得られた粉末を、遠心真空下で乾燥した。脱脂組織粉末を、０．５Ｍ ＮａＯＨに懸濁し、５０℃で、２時間インキュベーションして、そのコアタンパク質からＧＡＧ鎖を除去した。１Ｍ ＨＣｌで中和した後に、ＮａＣｌを、終濃度が３Ｍになるまで加えた。不溶物質を遠心分離で除去し、そして、上清のｐＨを、１ＭのＨＣｌで、１．０未満に調整した。沈殿したヌクレオチドを遠心分離で除去し、そして、上清を１Ｍ ＮａＯＨで中和した。１．３％酢酸カリウムを含む２倍量のエタノールを加えて、粗ＧＡＧを沈殿させた。遠心分離した後に、沈殿物を蒸留水に溶解させた。

【0349】

（ｇ）ＧＡＧアッセイ
以前に説明したようにして（Ｏｇｕｍａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．２００７；２１，３５６－３６２、Ｏｇｕｍａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００７；３６８，７９－８６、Ｓｈｉｍａｄａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．ＪＩＭＤ．Ｒｅｐ．２０１４；１６，１５－２４、Ｓｈｉｍａｄａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．ＪＩＭＤ．Ｒｅｐ．２０１５；２１，１－１３、Ｋｕｂａｓｋｉ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．２０１７；４０，１５１－１５８）、血液及び組織でのＧＡＧレベルを、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで測定した。簡潔に説明すると、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）と試料とを、９６ウェルレシーバープレートの９６ウェルオメガ１０Ｋフィルタープレート（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ，ＵＳＡ）に入れた。試料を、１５分間、２，５００ｇで遠心分離した。そのフィルタープレートを新規のレシーバープレートに移し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、内部標準（ＩＳ）としての５μｇ／ｍＬ コンドロシン、１ｍＵ ヘパリチナーゼ、及び１ｍＵ ケラタナーゼＩＩのカクテル混合物を、当該フィルタープレートに加えた。試料を、３７℃の水槽で、一晩インキュベーションした。続いて、それらの試料を、１５分間、２，５００ｇで遠心分離した。機器は、６４６０トリプルクアッド質量分析計を装備した１２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から構成されていた。６０℃に恒温したＨｙｐｅｒｃａｒｂカラム（内径２．０ｍｍ、長さ５０ｍｍ、粒子５μｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で、二糖類を分離した。移動相は、５ｍＭ 酢酸アンモニウム（ｐＨ１１．０）（溶出液Ａ）から１００％ アセトニトリル（溶出液Ｂ）の勾配溶出相であった。その流速は０．７ｍｌ／分であり、そして、勾配は、１００％溶出液Ａで０分、７０％溶出液Ａで１分、７０％溶出液Ａで２分、０％溶出液Ａで２．２０分、０％溶出液Ａで２．６０分、１００％溶出液Ａで２．６１分、１００％溶出液Ａで５分であった。質量分析計は、エレクトロスプレーイオン化法を使用して、ネガティブイオンモードで作動させた（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｊｅｔ Ｓｔｒｅａｍ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。特定の前駆体イオン及び産物イオンのｍ／ｚを使用して、それぞれの二糖類を、それぞれ定量した（ＩＳ：３５４．３→１９３．１、モノ硫酸化ＫＳ：４６２→９７、ＨＳ－０Ｓ ３７８．３→１７５．１）。注入体積は、１０μｌであり、また、実行時間は１試料当たり５分であった。

【0350】

（ｈ）トルイジンブルー染色、及び病理学的評価
以前に発表されたようにして（Ｔｏｍａｔｓｕ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２００５，１４，３３２１－３３３５）、トルイジンブルー染色を行った。簡潔に説明すると、１６週齢のＭＰＳ ＩＶＡマウス及びＷＴマウスから膝関節及び僧帽弁を摘出して、貯蔵顆粒のレベルを、光学顕微鏡観察で評価した。２％パラホルムアルデヒド及び４％グルタルアルデヒドを含むＰＢＳで組織を固定し、そして、四酸化オスミウムで後固定を行ってから、Ｓｐｕｒｒ樹脂に包埋した。続いて、トルイジンブルー染色した厚さ０．５μｍの切片を検査した。大腿骨または脛骨の成長板での軟骨細胞の細胞サイズ（空胞化）を評価するために、それぞれのマウスについて、増殖区域内の約３００個の軟骨細胞を、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアで測定し、そして、結果を野生型群からの変化倍率として表した。

【0351】

（ｉ）酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によるＧＡＬＮＳに対する抗体の検出
以前に発表されたようにして（Ｔｏｍａｔｓｕ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２００３；１２，９６１－９７３）、間接ＥＬＩＳＡ法を使用して、処置マウス及び未処置マウスの血漿でのＧＡＬＮＳに対する抗体を検出した。簡潔に説明すると、２μｇ／ｍｌの精製ｒｈＧＡＬＮＳ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）を含む１５ｍＭ Ｎａ_２ＣＯ_３、３５ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、０．０２％ ＮａＮ_３（ｐＨ９．６）で、９６ウェルマイクロタイタープレートを、一晩、コーティングした。これらのウェルを、ＴＢＳ－Ｔ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ＴＷＥＥＮ２０）で３回洗浄してから、３％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）で、１時間、室温で、ブロックした。ＴＢＳ－Ｔで３回洗浄した後に、マウス血漿をＴＢＳ－Ｔで１００倍希釈した液を、それらのウェルに加え、そして、３７℃で、２．５時間インキュベーションした。それらのウェルを、ＴＢＳ－Ｔで４回洗浄してから、ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）の１：１，０００希釈液を含むＴＢＳ－Ｔを、それらのウェルに加え、そして、室温で、１時間インキュベーションした。それらのウェルを、ＴＢＳ－Ｔで３回洗浄し、そして、ＴＢＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で２回洗浄した。ペルオキシダーゼ基質（ＡＢＴＳ溶液、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を加え（１００μｌ／ウェル）、そして、プレートを、室温で、３０分インキュベーションした。１％ＳＤＳを加えて、その反応を停止させ、そして、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｖｉｃｔｏｒ Ｘ４プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で、それらのプレートを、４１０ｎｍの光学密度で読み取った。

【0352】

（ｊ）統計解析
すべてのデータは、平均及び標準偏差（ＳＤ）として表した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって、多重比較検定を行った。その統計学的に有意な差は、ｐ＜０．０５とした。

【0353】

７．４ 実施例４．酵素への長期間の暴露が骨の病態に及ぼす作用を評価する
以下の試験は、酵素への長期間の暴露が骨の病態に及ぼす作用を評価する目的で行う。この試験では、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳｃｏを、４週齢のＭＰＳＩＶＡ ＫＯマウスに、体重１ｋｇ当たり５×１０^１３ＧＣの用量で投与する。コントロール群は、同じ週齢の未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス、及び未処置の野生型マウスである。この試験では、３群のマウス（６～１０匹／群）を使用する。注射から２４週間後または４８週間後のいずれかの期間にわたって、それらのマウスをモニタリングし、そして、血液試料を１週間おきに採取して、酵素活性及びＫＳレベルを解析する。加えて、検視時に、酵素活性及びＫＳレベルのための組織試料を異なる臓器から摘出し、そして、組織病理解析のために膝関節及び心臓弁を摘出する。

【0354】

同様に、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳｃｏを、４週齢のＭＴＯＬマウスに、体重１ｋｇ当たり５×１０^１３ＧＣの用量で送達する。コントロール群は、同じ週齢の未処置のＭＴＯＬマウス及び未処置の野生型マウスを含む。この試験では、３群のマウス（６～１０匹／群）を使用する。注射から２４週間後または４８週間後のいずれかの期間にわたって、それらのマウスをモニタリングし、そして、血液試料を１週間おきに採取して、酵素活性及びＫＳレベルを解析する。加えて、検視時に、酵素活性及びＫＳレベルのための組織試料を異なる臓器から摘出し、そして、組織病理解析のために膝関節及び心臓弁を摘出する。

【0355】

７．５ 実施例５．新生仔試験：早期介入が骨の病態に及ぼす作用を評価する
下記の試験を新生仔マウスで行って、早期介入が骨の病態に及ぼす作用を評価する。この試験では、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳｃｏを、ＭＰＳＩＶＡ ＫＯ新生仔マウスに、体重１ｋｇ当たり５×１０^１３ＧＣの用量で投与する。コントロール群は、同じ週齢の未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス、及び未処置の野生型マウスを含む。それらのマウスを１６週齢に殺処分し、血液試料を１週間おきに採取して、酵素活性及びＫＳレベルを解析する。加えて、検視時に、酵素活性及びＫＳレベルのための組織試料を異なる臓器から摘出し、そして、組織病理解析のために膝関節及び心臓弁を摘出する。

【0356】

同様に、我々は、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳｃｏを、新生仔ＭＴＯＬマウスに対して、体重１ｋｇ当たり５×１０^１３ＧＣの用量で送達した。コントロール群は、同じ週齢の未処置のＭＴＯＬマウス及び未処置の野生型マウスを含む。この試験では、３群のマウス（６匹／群）を使用する。それらのマウスを１６週齢時に殺処分し、血液試料を１週間おきに採取して、酵素活性及びＫＳレベルを解析する。加えて、検視時に、酵素活性及びＫＳレベルのための組織試料を異なる臓器から摘出し、そして、組織病理解析のために膝関節及び心臓弁を摘出する。

【0357】

７．６ 実施例６．新規の発現カセットの評価
下記の試験を行って、最適化プロモーターコンストラクトを、有効性の改善について評価する。この試験では、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳｃｏ、ＡＡＶ８－ＣＡＧ－ｈＧＡＬＮＳｃｏ、ＡＡＶ８－プロモーター１－ｈＧＡＬＮＳｃｏ、ＡＡＶ８－プロモーター２－ｈＧＡＬＮＳｃｏ、ＡＶＶ９－プロモーター２－ｈＧＡＬＮＳｃｏを、４週齢のＭＰＳＩＶＡ ＫＯマウスに対して、体重１ｋｇ当たり１×１０^１３ＧＣの用量で投与する（１０匹のマウス／群）。コントロール群は、同じ週齢の未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス、及び未処置の野生型マウスを含む。１２週間または４８週間のいずれかの期間にわたって、それらのマウスをモニタリングし、そして、血液試料を１週間おきに採取して、酵素活性及びＫＳレベルを解析する。加えて、検視時に、酵素活性及びＫＳレベルのための組織試料を異なる臓器から摘出し、そして、組織病理解析のために膝関節及び心臓弁を摘出する。

【0358】

７．７ 実施例７．後期ＡＡＶ遺伝子治療試験
下記の試験を行って、後期ＡＡＶ遺伝子治療の有効性を評価する。この試験では、ＡＡＶ－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳｃｏ、ＡＡＶ－ＣＡＧ－ｈＧＡＬＮＳｃｏ、ＡＡＶ－プロモーター１－ｈＧＡＬＮＳｃｏ、ＡＡＶ－プロモーター２－ｈＧＡＬＮＳｃｏ、ＡＶＶ－プロモーター２－ｈＧＡＬＮＳｃｏを、８～１０週齢のＭＰＳＩＶＡ ＫＯマウス（５匹のマウス／群）に対して投与する。未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスをコントロールとして使用する。一定の期間にわたって、それらのマウスをモニタリングする、血液試料を１週間おきに採取して、酵素活性及びＫＳレベルを解析する。加えて、検視時に、酵素活性及びＫＳレベルのための組織試料を異なる臓器から摘出し、そして、組織病理解析のために膝関節及び心臓弁を摘出する。

【0359】

同様に、ＡＡＶ－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳｃｏ、ＡＡＶ－ＣＡＧ－ｈＧＡＬＮＳｃｏ、ＡＡＶ－プロモーター１－ｈＧＡＬＮＳｃｏ、ＡＡＶ－プロモーター２－ｈＧＡＬＮＳｃｏ、ＡＶＶ－プロモーター２－ｈＧＡＬＮＳｃｏを、８～１０週齢のＭＴＯＬマウス（５匹のマウス／群）に対して投与する。未処置のＭＴＯＬマウスをコントロールとして使用する。一定の期間にわたって、それらのマウスをモニタリングし、そして、血液試料を１週間おきに採取して、酵素活性及びＫＳレベルを解析する。加えて、検視時に、酵素活性及びＫＳレベルのための組織試料を異なる臓器から摘出し、そして、組織病理解析のために膝関節及び心臓弁を摘出する。
７．８ 実施例８．骨－肝臓タンデムプロモーター駆動コンストラクト
ＬＢＴＰ１（骨－肝臓タンデムプロモーター）駆動コンストラクトは、図３３及び３７に例示した構成要素を含むように構築した。ＬＢＴＰ１プロモーターは、骨芽細胞特異的発現を促す最小限のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターフラグメントを含む。当該最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターは、Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターの転写活性フラグメントであると決定されている（Ｌｕ， Ｘ．， ｅｔ ａｌ． ＪＢＣ ２８１， ６２９７－６３０６， Ｊａｎｕａｒｙ １２， ２００６）。当該ＬＢＴＰ１配列は、肝臓特異的ＡｐｏＥエンハンサー／肝制御領域が５’に隣接しており、かつ、ＡＴＧトリヌクレオチド（ｈＡＡＴΔＡＴＧ）が枯渇したｈＡＡＴプロモーターが３’に隣接しており、肝細胞特異的発現を駆動する最小Ｓｐ７プロモーターフラグメント（配列番号２４）のコピーを１つ含む。キメラβ－グロビン／Ｉｇイントロンを、プロモーター配列の下流（３’）、すなわち、ｈＡＡＴΔＡＴＧの下流に配置した。
ＬＢＴＰ２（骨－肝臓タンデムプロモーター）駆動コンストラクトは、図３４及び３８に例示した構成要素を含むように構築する。ＬＢＴＰ２プロモーターは、次のようにデザイン及び遺伝子操作した。完全長Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーター（Ｌｕ， Ｘ．， ｅｔ ａｌ． ＪＢＣ ２８１， ６２９７－６３０６， Ｊａｎｕａｒｙ １２， ２００６）（配列番号２３）は、肝臓特異的ＡｐｏＥエンハンサー／肝制御領域が５’に隣接しており、かつ、ＡＴＧトリヌクレオチド（ｈＡＡＴΔＡＴＧ）が枯渇したｈＡＡＴプロモーターが３’に隣接しており、肝細胞特異的発現を駆動する。キメラβ－グロビン／Ｉｇイントロンを、プロモーター配列の下流（３’）、すなわち、ｈＡＡＴΔＡＴＧの下流に配置した。
理論にも拘束されることを望む訳ではないが、下流のプロモーターから除去したＡＴＧ部位を有するタンデムプロモーターは、２つのｍＲＮＡ転写物－１つは、宿主細胞転写機構に依存するそれぞれのプロモーターが駆動する－の発現を可能にする－しかしながら、タンパク質の翻訳開始は、カセット内のタンパク質コード配列の単一の意図した開始コドンで起こる。この戦略は、タンパク質開始コドンの上流に余分なＡＴＧ部位を含むタンデムプロモーターと比較して、より効率的で、かつ堅実な発現を提供する。

【0360】

７．９ 実施例９．骨－肝臓タンデムプロモーターをベースとしたコンストラクトを利用するＭＰＳ ＩＶＡの治療
ＭＰＳ ＩＶＡを有する対象は、セクション７．８、実施例８に記載したコンストラクトを含むＡＡＶ８またはＡＡＶ９の投与を受け、当該コンストラクトは、骨と肝臓で治療有効濃度の導入遺伝子産物を生成する上で十分な用量で、ＧＡＬＮＳ導入遺伝子（例えば、ＧＡＬＮＳ、ＧＡＬＮＳｃｏ、またはＧＡＬＮＳｃｏ／ＣｐＧ－）をコードする。投与は、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、髄腔内、または経皮投与で行う。治療の後に、対象は、疾患のバイオマーカー（ＧＡＧ、ＫＳ、及びＣ６Ｓ貯蔵ストレージなど）の減少、及び／または骨、軟骨、靭帯、半月板、心臓弁、尿、及び／または血清でのｈＧＡＬＮＳ酵素活性の増加について評価する。炎症や、その他の安全事象の兆候もモニタリングする。

【0361】

７．１０． 実施例１０．完全長で、かつ最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーター駆動コンストラクト
完全長Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーター（骨特異的プロモーター）駆動コンストラクトを、図３５に例示した構成要素を含むように構築した。

【0362】

最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーター（骨特異的プロモーター）駆動コンストラクトを、図３６に示す構成要素を含むように構築した。

【0363】

７．１１ 実施例１１．完全長または最小のＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターをベースとしたコンストラクトを使用するＭＰＳ ＩＶＡの治療
ＭＰＳ ＩＶＡを有する対象は、セクション７．１０ 実施例１０に記載したコンストラクトを含むＡＡＶ８またはＡＡＶ９の投与を受け、当該コンストラクトは、骨と肝臓で治療有効濃度の導入遺伝子産物を生成する上で十分な用量で、ＧＡＬＮＳ導入遺伝子（例えば、ＧＡＬＮＳ、ＧＡＬＮＳｃｏ、またはＧＡＬＮＳｃｏ／ＣｐＧ－）をコードする。投与は、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、髄腔内、または経皮投与で行う。治療の後に、対象は、疾患のバイオマーカー（ＧＡＧ、ＫＳ、及びＣ６Ｓ貯蔵ストレージなど）の減少、及び／または骨、軟骨、靭帯、半月板、心臓弁、尿、及び／または血清でのｈＧＡＬＮＳ酵素活性の増加について評価する。炎症や、その他の安全事象の兆候もモニタリングする。

【0364】

７．１２ 実施例１２．ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスの異なる発現系でのｈＧＡＬＮＳを包み込んだＡＡＶベクター
目的：この試験の目的は、モルキオＡ症候群に対するＡＡＶ遺伝子治療の有効性を改善する最適化したプロモーターコンストラクトを実証することである。

【0365】

動物：オスとメスの両方のマウスを含むＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスを、すべての群で、同数を使用する。マウスは、治療開始時に約４週齢であり、また、投与時の体重は約２０ｇである。ＧＡＬＮＳノックアウトマウスモデル（ＫＯ：Ｇａｌｎｓ－／－）は、ＧＡＬＮＳ遺伝子を標的破壊して開発した。これらのマウスは、血液や組織で検出可能な酵素活性を持っておらず、主に、細網内皮クッパー細胞、心臓弁と筋肉、及び成長板と関節軟骨などの軟骨細胞内に貯蔵物質の蓄積を示した。実験コホートの遺伝子型判定を、１４日目にＰＣＲで行った。それぞれの試験動物には、研究を構成する集団内で独自の番号を割り当てる。この番号は、それぞれのケージの見やすいところに置かれたケージカードに記載している。ケージカードには、試験番号、群、用量、性別が記載してある。用量及び／または検視を容易にするために、動物を、コホートに分ける。生データの記録と検査試料については、独自の試験動物番号を使用する。

【0366】

供給源、同定、及び保管条件：試験物質は、様々なプロモーターエレメントの制御下でｈＧＡＬＮＳを発現する精製ＡＡＶベクターである。試験物質を、冷凍アリコートとして提供する。試験物質は：１）ビヒクル；２）ｖｉｍｉｚｉｍ（登録商標）（エロスルファーゼアルファ）；３）ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２；４）ＡＡＶ８－ＣＡＧ－ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２；５）ＡＡＶ８－ＬＳＰＸ１－ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２；６）ＡＡＶ８－ＬＭＴＰ６－ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２；７）ＡＡＶ８－ＬＢＴＰ２－ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２；８）ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２；９）ＡＡＶ９－ＬＭＴＰ６－ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２；１０）ＡＡＶ９－ＬＢＴＰ２－ｈＧＡＬＮＳｃｏＶ２；及び、１１）ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ｈＧＡＬＮＳｃｏである。

【0367】

投与製剤の調製：試験物質製剤は、それぞれの投与日に、それぞれの群での投与のための使用を容易にする凍結原体して提供する。試験物質を始めて解凍する時に、試験物質を少量に分注して、適切なラベルを付けて複数回の注射に使用し、かつ、－８０℃で凍結保存する。投与溶液の調製のための計算は、以下の通りである：総ＧＣ／動物＝用量（ＧＣ／ｋｇ体重）×動物の体重；必要な原液の総量＝総ＧＣ／動物／原液の濃度（ＧＣ／ｍＬ）＝ｘｍＬ（ｘは、所望の注入量である）。投与の準備をしている間、材料は、室温で、最長で４時間維持することができる。

【0368】

【表3】

【0369】

体重と臨床観察を記録し、そして、血液試料を生物分析のために回収する。動物を、１２週間後に安楽死させて、分子的、生物分析的、及び組織病理学的評価のために、選択した組織を採取する。

【0370】

試験手順：この研究で使用する動物は、研究群に無作為に分ける。ベクターの選択に偏りが無く利用できる場合に、ＫＯ動物に対してベクターを投与する。

【0371】

投与用量：全動物に対して、割り当てた群に指定した試験物質を単回で静脈内投与する。投与するウイルス粒子の数を決定するために、投与日に、全動物の体重を測定する。すべての群の動物の体重を隔週で測定し、そして、最初の投与日から罹患率と死亡率を定期的に観察する。臨床徴候は、研究期間を通して定期的に記録する。臨床効果、病気、及び／または死亡の兆候について動物の観察を行う。

【0372】

試料回収：血液試料（約１００μＬ）を、顎下腺静脈から隔週で回収し、そして、血漿試料を調製する。血漿試料は、ＡＡＶ遺伝子治療の有効性を決定するための酵素活性ならびにＧＡＧレベルの試験に使用する。試料は、用時まで、－８０℃で維持する。

【0373】

検視：すべての群の動物を、試験物質／ビヒクルを投与して１２週間後に安楽死させる。研究期間中に瀕死と判断したあらゆる動物（複数可）はすべて安楽死させ、そして、可能であれば、いつでも試料を回収する。検視では、すべての動物から血液試料を回収して、血漿試料（個々の試料の半量から）と、血清試料（個々の試料の残余の半量から）を調製し、それらを、－８０℃で保存する。これらの試料を使用して、酵素活性ならびにケラタン硫酸のレベルを検出する。選択した組織試料を複製して回収し、組織酵素活性、ＫＳレベル、ベクターコピー数、及び遺伝子発現をアッセイする。試料を回収し、瞬間冷凍し、用時まで－８０℃で保存する。組織酵素活性分析には、心臓、肝臓、骨格筋（上腕二頭筋、腓腹筋）、肺、腎臓、脾臓、気管、膝蓋骨などの臓器を使用する。心臓、肝臓、肺、脾臓、気管、膝蓋骨などの臓器は、組織のＫＳレベルの分析のために使用する。心臓、肝臓、骨格筋（上腕二頭筋、腓腹筋）、肺、腎臓、脾臓、気管、利用可能な骨／軟骨組織、生殖腺、及び脳は、ベクター生体内分布分析（ｇＤＮＡ－ｑＰＣＲ）に使用する。心臓、肝臓、骨格筋（上腕二頭筋、腓腹筋）、肺、腎臓、脾臓、気管、及び利用可能な骨／軟骨組織は、遺伝子発現分析（ＲＮＡ－ｑＲＴ－ＰＣＲ）に使用する。膝関節－１、脛骨、前肢関節－２、心臓弁と基部、肝臓、脳、及び脾臓は、組織学的分析のためにホルマリン固定する。大腿骨はエタノールで保存して、マイクロＣＴ分析に使用する。

【0374】

分析：酵素活性アッセイ：ホモジナイザーを使用して、凍結組織を、２５ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．２と、１ｍｍｏｌ／ｌ フェニルメチルスルホニルフルオリドからなるホモジナイザー緩衝剤でホモジナイズする。組織溶解物または血漿、及び２２ｍＭ ４－メチルウンベリフェリル－β－ガラクトピラノシド－６－硫酸塩（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｏｕｎｔ Ｐｒｏｓｐｅｃｔ，ＩＬ，ＵＳＡ）を含む０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．３で、３７℃で、１６時間、インキュベーションする。次に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ（ＳｉｇｍＡ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ，ＵＳＡ）由来の１０ｍｇ／ｍｌ β－ガラクトシダーゼを含む０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ 酢酸ナトリウム、ｐＨ４．３を、反応試料に加え、そして、３７℃で、２時間、インキュベーションする。試料を停止溶液（１Ｍグリシン、ＮａＯＨ、ｐＨ１０．５）に移し、そして、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｖｉｃｔｏｒ Ｘ４プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で、３６６ｎｍで励起させ、そして、４５０ｎｍで発光させて、プレートを読み取る。活性は、放出した４－メチルウンベリフェロンのナノモル／時間／血漿のマイクロリットルまたはタンパク質のミリグラムで表す。タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で決定する。

【0375】

ＧＡＧ（ＫＳ）の抽出とＫＳレベルの分析：簡潔に説明すると、切除した組織を液体窒素で凍結し、ホモジナイザーを使用してアセトンでホモジナイズする。得られた粉末を、遠心真空下で乾燥させる。脱脂した組織粉末を、０．５Ｍ ＮａＯＨに懸濁し、そして、５０℃で、２時間インキュベーションして、コアタンパク質からＧＡＧ鎖を除去する。１Ｍ ＨＣｌで中和した後に、ＮａＣｌを最終濃度が３Ｍになるように添加する。次に、不溶性物質を遠心分離によって除去し、上清のｐＨを、１Ｍ ＨＣｌで１．０未満に調整する。沈殿したヌクレオチドを、遠心分離により除去し、そして、上清を１Ｍ ＮａＯＨで中和する。粗ＧＡＧは、１．３％酢酸カリウムを含む２倍量のエタノールを加えて沈殿させる。遠心分離した後に、沈殿物を、蒸留水に溶解させる。

【0376】

ＧＡＧアッセイ：血液及び組織のＧＡＧレベルを、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで測定する。簡潔に説明すると、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）と試料を、９６ウェルレシーバープレートの９６ウェルオメガ１０Ｋフィルタープレート（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ，ＵＳＡ）にロードする。試料を、２，５００ｇで、１５分間遠心分離する。次に、フィルタープレートを新規のレシーバープレートに移し、そして、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、内部標準（ＩＳ）として５μｇ／ｍＬのコンドロシン、１ｍＵヘパリチナーゼ、及び１ｍＵケラタナーゼＩＩのカクテル混合物を、フィルタープレートに加える。試料を、３７℃の水浴で一晩インキュベーションした後に、２，５００ｇで、１５分間、遠心分離する。この装置は、６４６０トリプルクワッド質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を備えた１２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＬＣシステムからなる。二糖類は、６０℃に恒温したＨｙｐｅｒｃａｒｂカラム（内径２．０ｍｍ、長さ５０ｍｍ；５μｍ粒子；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で分離する。移動相は、５ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ１１．０（溶液Ａ）～１００％アセトニトリル（溶液Ｂ）に至る勾配溶出である。流速は、０．７ｍｌ／分であり、そして、勾配は、次の通りである：０分で１００％溶液Ａ、１分で７０％溶液Ａ、２分で７０％溶液Ａ、２．２０分で０％溶液Ａ、２．６０分で０％溶液Ａ、２．６１分で１００％溶液Ａ、５分で１００％溶液Ａである。質量分析計は、ネガティブイオンモード（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｊｅｔ Ｓｔｒｅａｍテクノロジー）のエレクトロスプレーイオン化で作動する。特定の前駆体イオン、及び産物イオン、ｍ／ｚを使用して、それぞれの二糖類を、それぞれ定量する（ＩＳ、３５４．３→１９３．１；モノ硫酸化ＫＳ、４６２→９７；ＨＳ－０Ｓ ３７８．３→１７５．１）。注入量は１０μＬで、分析時間は、５分／試料である。

【0377】

ベクター分布分析：総ゲノムＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ Ｐｕｒｅｇｅｎｅキットを使用して、取扱説明書（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）に従って選択した組織から精製する。マウスの凍結試料から抽出したゲノムＤＮＡのデジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）分析は、ウサギｂ－グロブリン（ｒＢＧ）ポリＡに関する特定のプライマーとプローブ配列、すなわち：フォーワードプライマー、５’－ ＧＣＣＡＡＡＡＡＴＴＡＴＧＧＧＧＡＣＡＴ－３’；リバースプライマー，５’－ＡＴＴＣＣＡＡＣＡＣＡＣＴＡＴＴＧＣＡＡＴＧ－３’；及び、プローブ， ６ＦＡＭ－ＡＴＧＡＡＧＣＣＣＣＴＴＧＡＧＣＡＴＣＴＧＡＣＴＴＣＴ－ＱＳＹを使用して実行する。ゲノムＤＮＡは、酵素消化またはＭ２２０ Ｆｏｃｕｓｅｄ－ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｏｒ（Ｃｏｖａｒｉｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）のいずれかを使用して、フラグメント化の有無について試験する。ｒＢＧ ＴａｑＭａｎアッセイ（ＦＡＭ標識）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）は、ＡＡＶベクターの定量的ｄＰＣＲ分析に使用する。Ｔｆｒｃｄ ＰＣＲには、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＴｆｒｃ ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ａｓｓａｙ（ＶＩＣ（登録商標）ラベル）を使用する。この分析に使用した機器は、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）３ＤデジタルＰＣＲ ２０Ｋ Ｃｈｉｐ Ｋｉｔ ｖ２：Ａ２６３１６（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。ＰＣＲ増幅プロファイルは、ＡＢＩ Ｇｅｎｅａｍｐ ９７００ ＰＣＲ－Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ｗ／ Ｄｕａｌ Ｆｌａｔ Ｂｌｏｃｋｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して、次のように実施する：９６℃で１０分間；６０℃で２分間と９８℃で３０秒間を３９サイクル；６０℃で２分間；最終的に１０℃に保つ。ＰＣＲ増幅した後に、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３Ｄ機器でチップを読み取って、ＶＩＣ及びＦＡＭチャネルに陽性ウェルの数、ＤＮＡが無いウェルの数、及び空のウェルを得る。データ分析とチップの品質評価は、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３Ｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｕｉｔｅを使用して行う。Ｔｆｒｃの結果を２コピーのリファレンスとして使用して、マウスゲノムあたりのＡＡＶのコピー数を計算する。

【0378】

組織病理学的分析：１６週齢のＭＰＳ ＩＶＡ及びＷＴマウスから得た膝関節及び僧帽弁を、光学顕微鏡で貯蔵顆粒のレベルを評価するために使用する。２％パラホルムアルデヒド、４％グルタルアルデヒドを含むＰＢＳで組織を固定し、そして、四酸化オスミウムで後固定して、Ｓｐｕｒｒ樹脂に包埋した。続いて、トルイジンブルー染色した厚さ０．５μｍの切片を検査する。大腿骨または脛骨の成長板での軟骨細胞の細胞サイズ（空胞化）を評価するために、それぞれのマウスについて、増殖区域内の約３００個の軟骨細胞を、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアで測定し、そして、結果を野生型群からの変化倍率として表す。

【0379】

マイクロＣＴ分析：マイクロＣＴ試料を調製する前に、大腿骨を事前に検視する。次に、大腿骨を、生理食塩水（０．９％生理食塩水）を染み込ませたガーゼで包み、そして、スキャンバイアルに軸方向に積み重ねる。スキャンセッションごとに３つまでを、１つのバイアルに積み重ねることができる。ＳｋｙＳｃａｎ １２７５システムで生じる速度が故に、骨全体のスキャンを行い、続いて、完全なスキャンデータから関心体積のデータを得る。

【0380】

スキャン：スキャン条件は、表３の設定に従って、４つの大腿骨試料すべてについて設定する。スキャンの間に、２Ｄ投影画像を得る。

【表4】

【0381】

再構成：画質に関連する要素を調整して、３Ｄ量レンダリング用に、それぞれの試料の断面画像を準備する。表４に、再構成補正係数を示す。

【表5】

【0382】

定量分析：形態学的分析を、Ｂｒｕｋｅｒ ＣＴＡｎソフトウェア（ｖ１．１８．８．０）で実行した。関心体積（ＶＯＩ）は、皮質骨と骨梁の両方で同一に保たれており、骨の間での物理的な差異は無かった。報告されている標準出力変数は、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ ＆ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｂｏｕｘｓｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１０）のガイドラインと一致している。

【0383】

骨梁ＶＯＩ：遠位骨端板を使用して最初に特定した骨梁のＶＯＩ。この共通するマークから、開始点は２５０μｍ近位になり、そして、２．５ｍｍ伸びる。スライスごとの関心領域は、自動プロトコルを使用して定義しており、骨内皮質壁から一定の距離（通常は、約１ｍｍ）離間しているものを含む。ＲＯＩに成長板が含まれないように、あらゆる努力が払われている。

【0384】

皮質骨ＶＯＩ：皮質骨の関心体積を、遠位骨端板の開始点と、近位大転子の最高点とに基づいて決定する。これらの２つの解剖学的目印の間で骨の全長を得る。骨の全長に５５％を乗じて、近位転子から半分強において開始位置を定める。この開始点から合計で０．５ｍｍ下を、ＶＯＩとして捕捉する。関心領域は、皮質骨全体を含み、そして、存在し得る骨梁を除去するために後処理を行う（図３９）。

【表6】

８．配列表

【表7】

【0385】

９．均等物及び参照による援用
本発明の特定の実施形態を参照しながら、本発明について詳細に説明しているが、機能的に均等である変形形態が、本発明の範囲内であることを理解されたい。実際のところ、上記した説明、及び添付の図面から、当業者であれば、本明細書に示されており、かつ説明がされている形態に加えて、本発明の様々な修正形態は自明である。このような修正形態は、添付の請求項の範囲内に含まれるように意図している。当業者であれば、常法に過ぎない実験を使用して、本明細書に記載した本発明の特定の実施形態に対する数多くの均等物を認識する、または、それらを突き止めることができる。このような均等物は、以下の請求項に含まれるように意図している。

【0386】

本明細書に記載した刊行物、特許、及び特許出願は、いずれも個々の刊行物、特許、及び特許出願が、参照により、その全内容を援用することが、あたかも具体的かつ個々に記載されているのと同程度に、参照により、本明細書で援用する。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図11E】

【図11F】

【図11G】

【図11H】

【図11I】

【図11J】

【図11K】

【図11L】

【図11M】

【図11N】

【図11O】

【図11P】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13A】

【図13B】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図17A】

【図17B】

【図17C】

【図17D】

【図17E】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21A】

【図21B】

【図21C】

【図21D】

【図22】

【図23】

【図24A】

【図24B】

【図24C】

【図24D】

【図24E】

【図24F】

【図24G】

【図24H】

【図24I】

【図24J】

【図24K】

【図25A】

【図25B】

【図25C】

【図25D】

【図26A】

【図26B】

【図26C】

【図27A】

【図27B】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32A】

【図32B】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【手続補正書】

【提出日】2022-11-01

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2023512043000001.app

【国際調査報告】