特表 2023-512304 ＫＬＫ５に対する抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-24

(54)【発明の名称】ＫＬＫ５に対する抗体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20230316BHJP

   C07K 16/40 20060101ALI20230316BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230316BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230316BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230316BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230316BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230316BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20230316BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230316BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230316BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20230316BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20230316BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20230316BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230316BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C07K16/40 ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

A61K39/395 N

A61P43/00 105

A61P17/00

A61P37/08

A61P11/06

A61P35/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022547072

(86)(22)【出願日】2021-02-01

(85)【翻訳文提出日】2022-09-16

(86)【国際出願番号】 EP2021052249

(87)【国際公開番号】W WO2021156171

(87)【国際公開日】2021-08-12

(31)【優先権主張番号】2001447.8

(32)【優先日】2020-02-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】2008022.2

(32)【優先日】2020-05-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＢＲＩＪ

２．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】514232085

【氏名又は名称】ユーシービー バイオファルマ エスアールエル

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】デディ、ネーシャ

(72)【発明者】

【氏名】エリオット、ピーター チャールズ

(72)【発明者】

【氏名】レイセン、セッペ フランス ローマン

(72)【発明者】

【氏名】メイソン、ショーン

(72)【発明者】

【氏名】マクミラン、デイヴィッド ジェイムズ

(72)【発明者】

【氏名】ネス、ギリアン クレア

(72)【発明者】

【氏名】ペンゴ、ニッコロ

(72)【発明者】

【氏名】レッドヘッド、マーティン アンソニー

(72)【発明者】

【氏名】ターナー、アリソン

(72)【発明者】

【氏名】タイソン、ケリー ルイーズ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA10

4B064CA19

4B064DA01

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C085AA14

4C085AA16

4C085BB11

4C085EE01

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、ＫＬＫ５に結合して阻害する抗体、及びＫＬＫ５の不均衡によって引き起こされる疾患を治療するためにそれを使用する方法に関する。特に、本発明は、阻害性抗ＫＬＫ５抗体、並びにネザートン病、アトピー性皮膚炎及びがんの治療におけるそれらの使用に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

カリクレイン５（ＫＬＫ５）に結合するモノクローナル抗体であって、可変軽鎖及び可変重鎖を含み、及び
ａ．可変軽鎖は、配列番号１又は７又は８又は９を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ
ｂ．可変重鎖は、配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６又は配列番号１０～２９のいずれか一つ、好ましくは１０、１１、１３～１６、１８、２０、２２～２５、２７若しくは２９のいずれか１つを含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、上記モノクローナル抗体。

【請求項2】

ａ．可変軽鎖が、配列番号７を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ
ｂ．可変重鎖が、配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１０又は１４又は２３を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、請求項１に記載の抗体。

【請求項3】

ａ．可変軽鎖が、配列番号７を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ
ｂ．可変重鎖が、配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２３を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、請求項１又は２に記載の抗体。

【請求項4】

抗体が、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項5】

抗体が、完全長抗体である、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項6】

完全長抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４又はＩｇＧ４Ｐから選択される、請求項５に記載の抗体。

【請求項7】

抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ又はＶ_ＨＨから選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項8】

抗体が、
ａ．配列番号３０又は３４又は３８又は４２又は４６を含む可変軽鎖、及び／又は
ｂ．配列番号３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０２又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２２又は１２６又は１３０又は１３４、好ましくは３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２６又は１３４を含む可変重鎖を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項9】

抗体が、
ａ．配列番号３８を含む可変軽鎖、及び／又は
ｂ．配列番号１１０を含む可変重鎖を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項10】

抗体が、
ａ．配列番号３６又は４０又は４４又は４８を含む軽鎖、及び
ｂ．配列番号５２又は５６又は６０又は６４又は６８又は７２又は７６又は８０又は８４又は８８又は９２又は９６又は１００又は１０４又は１０８又は１１２又は１１６又は１２０又は１２４又は１２８又は１３２又は１３６、好ましくは５２又は５６又は６０又は６４又は６８又は７２又は７６又は８０又は８４又は８８又は９２又は９６又は１００又は１０８又は１１２又は１１６又は１２０又は１２８又は１３６を含む重鎖を含む、請求項１から６又は８又は９のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項11】

抗体が、
ａ．配列番号４０を含む軽鎖、及び
ｂ．配列番号１１２を含む重鎖を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項12】

ＫＬＫ５が、配列番号１４２若しくは１４３若しくは１４４を含むヒトＫＬＫ５又は配列番号１５１を含むカニクイザルＫＬＫ５である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項13】

カリクレイン５（ＫＬＫ５）に結合し、抗体が、配列番号１４２を参照して、Ｌｅｕ２１２、Ｓｅｒ２１３、Ｇｌｎ２１４、Ｌｙｓ２１５、Ａｒｇ２１６、Ｇｌｕ２１８、Ａｓｐ２１９、Ａｌａ２２０、Ｐｒｏ２２２、Ｇｌｙ２３３、Ｐｒｏ２６９、Ａｓｎ２７０及びＰｒｏ２７２からなる群からの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ以上のアミノ酸残基を含むヒトＫＬＫ５のエピトープに結合する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項14】

エピトープが、Ｘ線結晶学によって特徴付けられる、請求項１３に記載の抗体。

【請求項15】

抗体が、
ａ．ＫＬＫ５のプロテアーゼ活性を阻害又は低下させ、及び／又は
ｂ．ＫＬＫ５がＬＥＫＴＩ又はＬＥＫＴＩの断片に結合すると、ＫＬＫ５に結合し、及び／又は
ｃ．ＫＬＫ５の結合についてＬＥＫＴＩ又はＬＥＫＴＩの断片と競合せず、及び／又は
ｄ．ＬＥＫＴＩ又はＬＥＫＴＩの断片に結合したＫＬＫ５と複合体を形成する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項16】

ＬＥＫＴＩの断片が、配列番号１４５のアミノ酸１～６４を含むヒトＬＥＫＴＩドメイン５又は配列番号１５２のアミノ酸１～７１を含むＬＥＫＴＩドメイン８である、請求項１５に記載の抗体。

【請求項17】

抗体が、ヒトＫＬＫ５、好ましくは配列番号１４４を含むヒトＫＬＫ５及びカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）（カニクイザル（ｃｙｎｏ））ＫＬＫ５、好ましくは配列番号１５１を含むカニクイザルＫＬＫ５に結合する、請求項１から１６のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項18】

抗体が、ヒト若しくはカニクイザルカリクレイン２（ＫＬＫ２）、又はヒト若しくはカニクイザルカリクレイン４（ＫＬＫ４）、又はヒト若しくはカニクイザルカリクレイン７（ＫＬＫ７）に結合しない、請求項１から１７のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項19】

請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体とＫＬＫ５の結合について競合し、及び
ａ．ＫＬＫ５に結合について、請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体をクロスブロックするか、又は請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体によってクロスブロックされ、又は
ｂ．請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体と同じエピトープにＫＬＫ５に結合する抗体であって、
該抗体が、配列番号３８による配列と少なくとも９０％の同一性又は類似性を有する重鎖可変領域を含み、及び／又は配列番号１１０による配列と少なくとも９０％の同一性又は類似性を有する軽鎖可変領域を含む、上記抗体。

【請求項20】

請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体をコードする、単離されたポリヌクレオチド。

【請求項21】

ポリヌクレオチドが、
ａ．軽鎖可変領域であって、ポリヌクレオチドが、
ｉ．配列番号３１又は３５又は３９又は４３又は４７と少なくとも９０％同一であり、又は
ｉｉ．配列番号３１又は３５又は３９又は４３又は４７を含み、又は
ｉｉｉ．配列番号３１又は３５又は３９又は４３又は４７から本質的になる、上記軽鎖可変領域、或いは
ｂ．重鎖可変領域であって、ポリヌクレオチドが、
ｉ．配列番号３３又は５１又は５５又は５９又は６３又は６７又は７１又は７５又は７９又は８３又は８７又は９１又は９５又は９９又は１０３又は１０７又は１１１又は１１５又は１１９又は１２３又は１２７又は１３１又は１３５と少なくとも９０％同一であり、又は
ｉｉ．配列番号３３又は５１又は５５又は５９又は６３又は６７又は７１又は７５又は７９又は８３又は８７又は９１又は９５又は９９又は１０３又は１０７又は１１１又は１１５又は１１９又は１２３又は１２７又は１３１又は１３５を含み、又は
ｉｉｉ．配列番号３３又は５１又は５５又は５９又は６３又は６７又は７１又は７５又は７９又は８３又は８７又は９１又は９５又は９９又は１０３又は１０７又は１１１又は１１５又は１１９又は１２３又は１２７又は１３１又は１３５から本質的になる、上記重鎖可変領域、或いは
ｃ．軽鎖であって、ポリヌクレオチドが、
ｉ．配列番号３７又は４１又は４５又は４９と少なくとも９０％同一であり、又は
ｉｉ．配列番号３７又は４１又は４５又は４９を含み、又は
ｉｉｉ．配列番号３７又は４１又は４５又は４９から本質的になる、上記軽鎖、或いは
ｄ．重鎖であって、ポリヌクレオチドが、
ｉ．配列番号５３又は５７又は６１又は６５又は６９又は７３又は７７又は８１又は８５又は８９又は９３又は９７又は１０１又は１０５又は１０９又は１１３又は１１７又は１２１又は１２５又は１２９又は１３３又は１３７と少なくとも９０％同一であり、又は
ｉｉ．配列番号５３又は５７又は６１又は６５又は６９又は７３又は７７又は８１又は８５又は８９又は９３又は９７又は１０１又は１０５又は１０９又は１１３又は１１７又は１２１又は１２５又は１２９又は１３３又は１３７を含み、又は
ｉｉｉ．配列番号５３又は５７又は６１又は６５又は６９又は７３又は７７又は８１又は８５又は８９又は９３又は９７又は１０１又は１０５又は１０９又は１１３又は１１７又は１２１又は１２５又は１２９又は１３３又は１３７から本質的になる、上記重鎖をコードする、
請求項２０に記載の単離されたポリヌクレオチド。

【請求項22】

請求項２０又は２１のいずれか一項に記載の１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む、クローニングベクター又は発現ベクター。

【請求項23】

宿主細胞であって、
ａ．請求項２０又は２１のいずれか一項に記載の１つ又は複数のポリヌクレオチド、又は
ｂ．請求項２２に記載の１つ又は複数の発現ベクターを含む、宿主細胞。

【請求項24】

請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体を産生するための方法であって、請求項２３に記載の宿主細胞を、抗体を産生するのに適した条件下で培養すること、及び宿主細胞によって産生された抗体を単離することを含む、上記方法。

【請求項25】

請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体と、１つ又は複数の薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤とを含む医薬組成物。

【請求項26】

治療に使用するための、請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片又は請求項２５に記載の医薬組成物。

【請求項27】

ＫＬＫ５の調節不全又はＫＬＫ５の阻害の調節不全を特徴とする疾患の治療に使用するための、請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体又は請求項２５に記載の医薬組成物。

【請求項28】

疾患が、ネザートン症候群、アトピー性皮膚炎、魚鱗癬、酒さ、喘息又はがん、例えば卵巣がん若しくは膀胱がん又はそれらの組合せから選択される、請求項２７に記載の使用のための抗体。

【請求項29】

疾患がネザートン症候群である、請求項２８に記載の使用のための抗体。

【請求項30】

疾患がアトピー性皮膚炎である、請求項２８に記載の使用のための抗体。

【請求項31】

患者におけるＫＬＫ５の調節不全又はＫＬＫ５の阻害の調節不全を特徴とする疾患を治療する方法であって、治療有効量の請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体又は請求項２５に記載の医薬組成物を患者に投与する工程を含む、上記方法。

【請求項32】

疾患が、ネザートン症候群、アトピー性皮膚炎、魚鱗癬、酒さ、喘息又はがん、例えば卵巣がん若しくは膀胱がんから選択される、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

疾患がネザートン症候群である、請求項３２に記載の使用のための抗体。

【請求項34】

疾患がアトピー性皮膚炎である、請求項３２に記載の使用のための抗体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＫＬＫ５に結合して阻害する抗体、及びＫＬＫ５の調節不全によって引き起こされる疾患を治療するために、その抗体を使用する方法に関する。特に、本発明は、抗ＫＬＫ５抗体、並びにネザートン病、先天性魚鱗癬などの魚鱗癬、アトピー性皮膚炎、及びがんの治療におけるその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

カリクレイン関連ペプチダーゼ（ＫＬＫとして知られている）は、ヒトゲノム内のプロテアーゼコード遺伝子（染色体１９ｑ１３．４）の最大の連続したクラスターによってコードされる、１５の高度に保存されたトリプシン又はキモトリプシン様セリンプロテアーゼの単一ファミリーを構成する（Ｓｏｔｉｒｏｐｏｕｌｏｕ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，２００９；ＪＢＣ ２８４：４８，３２９８９－９４）。

【0003】

ＫＬＫタンパク質は、不活性なプロフォームを分泌するようにタンパク質分解的にプロセシングされる不活性なプレ－プロフォームとして合成される。そのようなプロフォームは、その後、他のＫＬＫ若しくはエンドペプチダーゼによって、又はＫＬＫ５などの自己触媒的切断によって、Ｎ末端プロペプチドの特異的なタンパク質分解的除去によって成熟ペプチダーゼに活性化される。ＫＬＫ５はトリプシン様活性を有する。そのプレ－プロフォームにおいて、２９個のアミノ酸のシグナルペプチド、それに続く３７個のアミノ酸の活性化ペプチドを含む。活性な成熟形態は、プロテアーゼ活性を担うセリン－プロテアーゼドメインを含む成熟酵素を含む２３７個のアミノ酸からなる（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｉ．Ｐ ｅｔ ａｌ．，２００５；ＪＢＣ ２８０：１５，１４６２８－３５）。

【0004】

ＫＬＫ５は多くの組織に見られるが、皮膚で最も豊富に発現されるようである。ＫＬＫ７と共に、ＫＬＫ５は、ＫＬＫ７と共に皮膚の上部棘及び顆粒レベルで発現され、そこでケラチノサイトは最終分化を受け、角質層を構築する角質細胞に変換される。角質層は、外部環境に対するバリアとして機能し、落屑のプロセスによって排出される角質細胞の絶え間ない置換によって維持される。ＫＬＫ５は、プロ－ＫＬＫ７及び他のカリクレインを活性化することができるので、落屑におけるその役割は不可欠である。

【0005】

活性化後、成熟ＫＬＫ５は、ＳＰＩＮＫ５遺伝子によってコードされる内因性阻害剤リンパ上皮カザール型阻害剤（ＬＥＫＴＩ）によって不活性化される（Ｃｈａｖａｎｓ Ｐ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３７，５６－６５）。ＬＥＫＴＩは、ＫＬＫ５と密接な複合体を形成する１５ドメインのセリンプロテアーゼ阻害剤ドメインを含む。ｐＨの変動により、複合体から活性ＫＬＫ５を放出する酸性ｐＨとのこの緊密な相互作用が左右される（Ｄｅｒａｉｓｏｎ Ｃ ｅｔ ａｌ．２００７；Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ １８ ３６０７－１９）。

【0006】

ＳＰＩＮＫ５遺伝子の機能喪失変異は、重度の炎症、皮膚の落屑、ＩｇＥレベルの上昇及び一定のアレルギー症状を伴う魚鱗癬の症状を特徴とする稀な常染色体劣性皮膚疾患であるネザートン症候群を引き起こす（Ｈｏｖｎａｎｉａｎ Ａ．２０１３；Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ ３５１ ２８９－３００）。表皮プロテアーゼ活性亢進に次いで、ＬＥＫＴＩの欠如は、デスモグレイン及びデスモソームに対するＫＬＫ５活性によって引き起こされる角質層剥離を引き起こし、これは、アトピー性皮膚炎様病変を引き起こす様々なアレルゲンに対して高い透過性を与える。ＫＬＫ７に対するＫＬＫ５活性はまた、アレルゲン及び微生物の透過並びにＩＬ－１βの産生をもたらす不完全な皮膚バリアに寄与する。

【0007】

ＳＰＩＮＫ５^－／^－マウスは、疾患の皮膚及び炎症の様子を複製するネザートン症候群を非常によく連想させる表現型を再現する（Ｙａｎｔ Ｔ ｅｔ ａｌ．；２００４，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １８ ２３５４－５８）。ネザートン症候群患者のＳＰＩＮＫ５^－／^－表皮は、ＫＬＫ５－ＰＡＲ２－ＴＳＬＰ（胸腺間質リンホポエチン）軸を含む炎症促進性経路及びシグナル伝達促進性経路の活性化を持続すると考えられる無競争のＫＬＫ５及びＫＬＫ７プロテアーゼ活性を示す。ＳＰＩＮＫ５^－／^－及びＫＬＫ５^－／^－マウスの両方において、ＫＬＫ５ノックアウトは、ＬＥＫＴＩノックアウトのこのような皮膚症状を矯正するのに十分であり、皮膚恒常性におけるＫＬＫ５の重要な役割を示している。

【0008】

近年、いくつかの研究が、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）とＬＥＫＴＩ多型との間の遺伝的関連を報告しており、ＬＥＫＴＩの異常なバリアントが発現されている（Ｈｏｖｎａｎｉａｎ Ａ．２０１３；Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ ３５１ ２８９－３００）。

【0009】

現在まで、ＫＬＫ７阻害剤は臨床開発中であるが、ＫＬＫ５特異的療法は存在しない。ＬＥＫＴＩを置き換えることを目的とした他のアプローチが追求されており、それには、ＳＰＩＮＫ５レンチウイルスベクター又はアデノウイルスベクターによる遺伝子付加、及び遺伝子補正された患者ケラチノサイトの自己移植片が含まれる（Ｄｉ ＷＬ．ｅｔ ａｌ．；２０１１，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １９ ４０８－１６）。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

したがって、ＫＬＫ５の調節不全に関連する又はそれによって引き起こされる疾患において治療効果を発揮し得る、ＫＬＫ５を阻害することを目的とした受動免疫療法などの抗ＫＬＫ５療法が依然として必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明は、以下の実施形態による阻害性抗ＫＬＫ５抗体を提供することによって上記の必要性に対処する。

【0012】

実施形態１：カリクレイン５（ＫＬＫ５）に結合するモノクローナル抗体であって、可変軽鎖及び可変重鎖を含み、及び
ａ．可変軽鎖は、配列番号１又は７又は８又は９を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ
ｂ．可変重鎖は、配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６又は配列番号１０～２９のいずれか一つ、好ましくは１０、１１、１３～１６、１８、２０、２２～２５、２７若しくは２９のいずれか１つを含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、上記モノクローナル抗体。

【0013】

実施形態２：ａ．可変軽鎖は、配列番号７を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、
ｂ．可変重鎖は、配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１０又は１４又は２３を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、実施形態１に記載の抗体。

【0014】

実施形態３：ａ．可変軽鎖は、配列番号７を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、
ｂ．可変重鎖は、配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２３を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、実施形態１又は２に記載の抗体。

【0015】

実施形態４：抗体が、キメラ抗体又はヒト化抗体である、実施形態１から３のいずれか一項に記載の抗体。

【0016】

実施形態５：抗体が、完全長抗体である、実施形態１から４のいずれか一項に記載の抗体。

【0017】

実施形態６：完全長抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４又はＩｇＧ４Ｐから選択される、実施形態５に記載の抗体。

【0018】

実施形態７：抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ又はＶ_ＨＨから選択される、実施形態１から４のいずれか一項に記載の抗体。

【0019】

実施形態８：抗体が、
ａ．配列番号３０又は３４又は３８又は４２又は４６を含む可変軽鎖、及び／又は
ｂ．配列番号３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０２又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２２又は１２６又は１３０又は１３４、好ましくは３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２６又は１３４を含む可変重鎖を含む、実施形態１から７のいずれか一項に記載の抗体。

【0020】

実施形態９：抗体が、
ａ．配列番号３８を含む可変軽鎖、及び／又は
ｂ．配列番号１１０を含む可変重鎖を含む、実施形態１から８のいずれか一項に記載の抗体。

【0021】

実施形態１０：抗体が、
ａ．配列番号３６又は４０又は４４又は４８を含む軽鎖、及び
ｂ．配列番号５２又は５６又は６０又は６４又は６８又は７２又は７６又は８０又は８４又は８８又は９２又は９６又は１００又は１０４又は１０８又は１１２又は１１６又は１２０又は１２４又は１２８又は１３２又は１３６、好ましくは５２又は５６又は６０又は６４又は６８又は７２又は７６又は８０又は８４又は８８又は９２又は９６又は１００又は１０８又は１１２又は１１６又は１２０又は１２８又は１３６を含む重鎖を含む、実施形態１から６又は８又は９のいずれか一項に記載の抗体。

【0022】

実施形態１１：抗体が、
ａ．配列番号４０を含む軽鎖、及び
ｂ．配列番号１１２を含む重鎖を含む、実施形態１から８のいずれか一項に記載の抗体。

【0023】

実施形態１２：ＫＬＫ５が、配列番号１４２若しくは１４３若しくは１４４を含むヒトＫＬＫ５又は配列番号１５１を含むカニクイザルＫＬＫ５である、実施形態１から１１のいずれか一項に記載の抗体。

【0024】

実施形態１３：カリクレイン５（ＫＬＫ５）に結合し、抗体が、配列番号１４２を参照して、Ｌｅｕ２１２、Ｓｅｒ２１３、Ｇｌｎ２１４、Ｌｙｓ２１５、Ａｒｇ２１６、Ｇｌｕ２１８、Ａｓｐ２１９、Ａｌａ２２０、Ｐｒｏ２２２、Ｇｌｙ２３３、Ｐｒｏ２６９、Ａｓｎ２７０及びＰｒｏ２７２からなる群からの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ以上のアミノ酸残基を含むヒトＫＬＫ５のエピトープに結合する、実施形態１から１２のいずれか一項に記載の抗体。

【0025】

実施形態１４：エピトープが、Ｘ線結晶学によって特徴付けられる、実施形態１３に記載の抗体。

【0026】

実施形態１５：抗体が、
ａ．ＫＬＫ５のプロテアーゼ活性を阻害又は低下させ、及び／又は
ｂ．ＫＬＫ５がＬＥＫＴＩ又はＬＥＫＴＩの断片に結合すると、ＫＬＫ５に結合し、及び／又は
ｃ．ＫＬＫ５の結合についてＬＥＫＴＩ又はＬＥＫＴＩの断片と競合せず、及び／又は
ｄ．ＬＥＫＴＩ又はＬＥＫＴＩの断片に結合したＫＬＫ５と複合体を形成する、実施形態１から１４のいずれか一項に記載の抗体。

【0027】

実施形態１６：ＬＥＫＴＩの断片が、配列番号１４５のアミノ酸１～６４を含むヒトＬＥＫＴＩドメイン５又は配列番号１５２のアミノ酸１～７１を含むＬＥＫＴＩドメイン８である、実施形態１５に記載の抗体。

【0028】

実施形態１７：抗体が、ヒトＫＬＫ５、好ましくは配列番号１４４を含むヒトＫＬＫ５及びカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）（カニクイザル（ｃｙｎｏ））ＫＬＫ５、好ましくは配列番号１５１を含むカニクイザルＫＬＫ５に結合する、実施形態１から１６のいずれか一項に記載の抗体。

【0029】

実施形態１８：抗体が、ヒト若しくはカニクイザルカリクレイン２（ＫＬＫ２）、又はヒト若しくはカニクイザルカリクレイン４（ＫＬＫ４）、又はヒト若しくはカニクイザルカリクレイン７（ＫＬＫ７）に結合しない、実施形態１から１７のいずれか一項に記載の抗体。

【0030】

実施形態１９：実施形態１から１８のいずれか一項に記載の抗体とＫＬＫ５の結合について競合し、及び
ａ．ＫＬＫ５に結合について、実施形態１から１８のいずれか一項に記載の抗体をクロスブロックするか、又は実施形態１から１８のいずれか一項に記載の抗体によってクロスブロックされ、又は
ｂ．実施形態１から１８のいずれか一項に記載の抗体と同じエピトープにＫＬＫ５に結合する抗体であって、
前記抗体が、配列番号３８による配列と少なくとも９０％の同一性又は類似性を有する重鎖可変領域を含み、及び／又は配列番号１１０による配列と少なくとも９０％の同一性又は類似性を有する軽鎖可変領域を含む、上記抗体。

【0031】

実施形態２０：実施形態１から１８のいずれか一項に記載の抗体をコードする、単離されたポリヌクレオチド。

【0032】

実施形態２１：ポリヌクレオチドが、
ａ．軽鎖可変領域であって、ポリヌクレオチドが、
ｉ．配列番号３１又は３５又は３９又は４３又は４７と少なくとも９０％同一であり、又は
ｉｉ．配列番号３１又は３５又は３９又は４３又は４７を含み、又は
ｉｉｉ．配列番号３１又は３５又は３９又は４３又は４７から本質的になる、軽鎖可変領域、又は
ｂ．重鎖可変領域であって、ポリヌクレオチドが、
ｉ．配列番号３３又は５１又は５５又は５９又は６３又は６７又は７１又は７５又は７９又は８３又は８７又は９１又は９５又は９９又は１０３又は１０７又は１１１又は１１５又は１１９又は１２３又は１２７又は１３１又は１３５と少なくとも９０％同一であり、又は
ｉｉ．配列番号３３又は５１又は５５又は５９又は６３又は６７又は７１又は７５又は７９又は８３又は８７又は９１又は９５又は９９又は１０３又は１０７又は１１１又は１１５又は１１９又は１２３又は１２７又は１３１又は１３５を含み、又は
ｉｉｉ．配列番号３３又は５１又は５５又は５９又は６３又は６７又は７１又は７５又は７９又は８３又は８７又は９１又は９５又は９９又は１０３又は１０７又は１１１又は１１５又は１１９又は１２３又は１２７又は１３１又は１３５から本質的になる、重鎖可変領域、又は
ｃ．軽鎖であって、ポリヌクレオチドが、
ｉ．配列番号３７又は４１又は４５又は４９と少なくとも９０％同一であり、又は
ｉｉ．配列番号３７又は４１又は４５又は４９を含み、又は
ｉｉｉ．配列番号３７又は４１又は４５又は４９から本質的になる、軽鎖、又は
ｄ．重鎖であって、ポリヌクレオチドが、
ｉ．配列番号５３又は５７又は６１又は６５又は６９又は７３又は７７又は８１又は８５又は８９又は９３又は９７又は１０１又は１０５又は１０９又は１１３又は１１７又は１２１又は１２５又は１２９又は１３３又は１３７と少なくとも９０％同一であり、又は
ｉｉ．配列番号５３又は５７又は６１又は６５又は６９又は７３又は７７又は８１又は８５又は８９又は９３又は９７又は１０１又は１０５又は１０９又は１１３又は１１７又は１２１又は１２５又は１２９又は１３３又は１３７を含み、又は
ｉｉｉ．配列番号５３又は５７又は６１又は６５又は６９又は７３又は７７又は８１又は８５又は８９又は９３又は９７又は１０１又は１０５又は１０９又は１１３又は１１７又は１２１又は１２５又は１２９又は１３３又は１３７から本質的になる、重鎖をコードする、実施形態２０に記載の単離されたポリヌクレオチド。

【0033】

実施形態２２：実施形態２０又は２１のいずれか一項に記載の１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む、クローニングベクター又は発現ベクター。

【0034】

実施形態２３：宿主細胞であって、
ａ．実施形態２０又は２１のいずれか一項に記載の１つ又は複数のポリヌクレオチド、又は
ｂ．実施形態２２に記載の１つ又は複数の発現ベクターを含む、宿主細胞。

【0035】

実施形態２４：実施形態１から１８のいずれか一項に記載の抗体を産生するための方法であって、実施形態２３に記載の宿主細胞を、抗体を産生するのに適した条件下で培養すること、及び宿主細胞によって産生された抗体を単離することを含む、上記方法。

【0036】

実施形態２５：実施形態１から１８のいずれか一項に記載の抗体と、１つ又は複数の薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤とを含む医薬組成物。

【0037】

実施形態２６：治療に使用するための、実施形態１から１８のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片又は実施形態２５に記載の医薬組成物。

【0038】

実施形態２７：ＫＬＫ５の調節不全又はＫＬＫ５の阻害の調節不全を特徴とする疾患の治療に使用するための、実施形態１から１８のいずれか一項に記載の抗体又は実施形態２５に記載の医薬組成物。

【0039】

実施形態２８：疾患が、ネザートン症候群、アトピー性皮膚炎、魚鱗癬、酒さ、喘息又はがん、例えば卵巣がん若しくは膀胱がん又はそれらの組合せから選択される、実施形態２７に記載の使用のための抗体。

【0040】

実施形態２９：疾患がネザートン症候群である、実施形態２８に記載の使用のための抗体。

【0041】

実施形態３０：疾患がアトピー性皮膚炎である、実施形態２８に記載の使用のための抗体。

【0042】

実施形態３１：患者におけるＫＬＫ５の調節不全又はＫＬＫ５の阻害の調節不全を特徴とする疾患を治療する方法であって、治療有効量の実施形態１から１８のいずれか一項に記載の抗体又は実施形態２５に記載の医薬組成物を患者に投与する工程を含む、方法。

【0043】

実施形態３２：疾患が、ネザートン症候群、アトピー性皮膚炎、魚鱗癬、酒さ、喘息又はがん、例えば卵巣がん若しくは膀胱がんから選択される、実施形態３１に記載の方法。

【0044】

実施形態３３：疾患がネザートン症候群である、実施形態３２に記載の使用のための抗体。

【0045】

実施形態３４：疾患がアトピー性皮膚炎である、実施形態３２に記載の使用のための抗体。

【図面の簡単な説明】

【0046】

【図1】抗体１０２７３によるＫＬＫ５刺激ケラチノサイトからのＩＰ－１放出の阻害の図である。ウサギ抗体１０２７３の存在下又は非存在下、ＫＬＫ５でケラチノサイトを刺激した後に培養培地中に放出されたＩＰ－１の量を決定した。抗体１０２７３はＩＰ－１の放出を阻害したが、アイソタイプ対照抗体は阻害効果を示さなかった。

【図2】抗体１０２７３及びＬＥＫＴＩ－Ｄ５ Ｆｃタンパク質の基質濃度に対してＫ_ｏｂｓ値をプロットした図である。示されるデータは、２ｎＭの抗体１０２７３及び２ｎＭのＬＥＫＴＩ Ｄ５ Ｆｃについてのものである。この傾きは、抗体１０２７３が非競合的阻害剤である一方で、ＬＥＫＴＩタンパク質が競合的阻害剤であることを示している。

【図3A】サイズ排除クロマトグラフィーのパネルＡ及びＢは、ヒトＫＬＫ５単独（実線トレース）、ウサギＦａｂ抗体１０２７３単独（点線トレース）、ヒトＫＬＫ５＋ＬＥＫＴＩ－Ｄ５ Ｆｃ（長い破線トレース、パネルＡ）又はヒトＫＬＫ５＋ＬＥＫＴＩ Ｄ８ Ｆｃ（長い破線トレース、パネルＢ）及びヒトＫＬＫ５＋ＬＥＫＴＩ Ｄ５ Ｆｃ＋ウサギＦａｂ抗体１０２７３（短い破線トレース、パネルＡ）又はヒトＫＬＫ５＋ＬＥＫＴＩ Ｄ８ Ｆｃ＋ウサギＦａｂ抗体１０２７３（短い破線トレース、パネルＢ）の溶出プロファイルを示す図である。

【図3B】サイズ排除クロマトグラフィーのパネルＡ及びＢは、ヒトＫＬＫ５単独（実線トレース）、ウサギＦａｂ抗体１０２７３単独（点線トレース）、ヒトＫＬＫ５＋ＬＥＫＴＩ－Ｄ５ Ｆｃ（長い破線トレース、パネルＡ）又はヒトＫＬＫ５＋ＬＥＫＴＩ Ｄ８ Ｆｃ（長い破線トレース、パネルＢ）及びヒトＫＬＫ５＋ＬＥＫＴＩ Ｄ５ Ｆｃ＋ウサギＦａｂ抗体１０２７３（短い破線トレース、パネルＡ）又はヒトＫＬＫ５＋ＬＥＫＴＩ Ｄ８ Ｆｃ＋ウサギＦａｂ抗体１０２７３（短い破線トレース、パネルＢ）の溶出プロファイルを示す図である。

【図4A】図３Ａに示すＳＥＣからのピーク画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す図である。レーン１はＭＷマーカー、レーン２及び３は二成分ＫＬＫ５＋ＬＥＫＴＩ Ｄ５複合体の画分、レーン４及び５は三成分ＫＬＫ５＋ＬＥＫＴＩ Ｄ５＋ウサギＦａｂ抗体１０２７３複合体のピーク画分。

【図4B】図３Ｂに示すＳＥＣからのピーク画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す図である。レーン１はＭＷマーカー、レーン２及び３は二成分ＫＬＫ５＋ＬＥＫＴＩ Ｄ８複合体のピーク画分、レーン４及び５は三成分ＫＬＫ５＋ＬＥＫＴＩ Ｄ８＋ウサギＦａｂ抗体１０２７３複合体のピーク画分。

【図5】Ｘ線結晶学研究のために産生されたＫＬＫ５のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す図である。レーンＭはＭＷマーカー。レーン１はキフネンシン（ｋｉｆ）の存在下で増殖させた培養物から精製したヒトＫＬＫ５。レーン２はキフネンシン培養物から精製し、エンドグリコシダーゼＨ（エンドＨ）で処理したヒトＫＬＫ５。

【図6】ウサギＦａｂ抗体１０２７３との複合体におけるヒトＫＬＫ５エピトープの概略図である。Ｆａｂ重鎖及び軽鎖は、模式図にそれぞれ暗表面及び明表面で、透明な表面で示されている。抗体１０２７３が結合したヒトＫＬＫ５上のエピトープを形成する残基Ｌｅｕ２１２（１６３）、Ｓｅｒ２１３（１６４）、Ｇｌｎ２１４（１６５）、Ｌｙｓ２１５（１６６）、Ａｒｇ２１６（１６７）、Ｇｌｕ２１８（１６９）、Ａｓｐ２１９（１７０）、Ａｌａ２２０（１７１）、Ｐｒｏ２２２（１７３）、Ｇｌｙ２３３（１８４）、Ｐｒｏ２６９（２２３）、Ａｓｎ２７０（２２４）及びＰｒｏ２７２（２２６）を黒い棒として示す。

【図7】ウサギＦａｂ抗体１０２３６及び１０２７３との複合体におけるヒトＫＬＫ５の結晶構造の２つの配向を示す図である。ヒトＫＬＫ５をリボンの形として示し、ウサギＦａｂ抗体１０２３６及び１０２７３を立体の表面として示す。

【図8】抗体１０２７３のウサギ可変軽鎖配列のヒト化を示す図である。移植片１０２７３ｇＬ２、１０２７３ｇＬ２ Ｑ１Ｒ、１０２７３ｇＬ２ Ｑ１Ｋ及び１０２７３ｇＬ２ Ｑ１Ｈは、アクセプターフレームワークとしてＩＧＫＶ１Ｄ－１３ヒト生殖細胞系を使用した抗体１０２７３のウサギ可変軽鎖のヒト化移植片である。ＣＤＲを太字／下線で示す。ｐＩ全体の増加をもたらすＣＤＲＬ１の変異を太字／下線で示し、Ｑ１Ｒ、Ｑ１Ｋ又はＱ１Ｈを強調している。

【図9】抗体１０２７３のウサギ可変重鎖配列のヒト化を示す図である。移植片１０２７３ｇＨ１、ｇＨ４、ｇＨ５、ｇＨ８、ｇＨ１０及びｇＨ１１は、アクセプターフレームワークとしてＩＧＨＶ３－６６ヒト生殖細胞系を使用して可変重鎖を使用する抗体１０２７３のウサギ可変重鎖のヒト化移植片である。ＣＤＲを太字／下線で示す。ドナー残基を太字／斜体で示し、Ｖ２４、Ｉ４８、Ｇ４９、Ｋ７１、Ｓ７３及びＶ７８を灰色の網掛けで示す。潜在的なＤＰ加水分解部位（Ｄ１１６Ｅ）を除去するため、又はｐＩ（Ｄ１１６Ｎ）を増加させるためのＣＤＲ－Ｈ３の変異を太字／下線で示し、強調している。

【図10】抗体１０２７３のヒト化移植片によるヒトＫＬＫ５の阻害を示す図である。抗体１０２７３のヒト化移植片バリアントをアッセイして、それらがＫＬＫ５活性を阻害する程度を決定した。パーセント阻害値を計算し、データを例８に記載のようにプロットした。Ｎｏ Ｉｎｈ＝阻害剤なし、Ｎｏ Ｓｕｂ＝基質なし、Ｎｏ Ｅｎｚ＝酵素なし。

【図11】異なる組成及びｐＨの２つの緩衝液中での抗体１０２７３のヒト化移植片の凝集安定性に対するボルテックスの効果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0047】

ここで、特定の非限定的な態様及びその実施形態に関して、並びに特定の図及び例を参照して、本開示を説明する。

【0048】

技術用語は、別段の指示がない限り、常識によって使用される。特定の意味が特定の用語に伝えられる場合、用語の定義は、その用語が使用される文脈で与えられる。

【0049】

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語が本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、他の要素を排除するものではない。本開示の目的のために、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｏｆ）」という用語の好ましい具体化であると考えられる。

【0050】

単数名詞を指すときに不定冠詞又は定冠詞、例えば「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」又は「その（ｔｈｅ）」が使用される場合、特に明記されない限り、これはその名詞の複数形を含む。

【0051】

本明細書で使用される場合、「治療」、「治療すること」などの用語は、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患又はその症状を完全に又は部分的に予防するという点で予防的であってもよく、及び／又は疾患及び／又は疾患に起因する有害作用の部分的又は完全な治癒という点で治療的であってもよい。したがって、治療は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、（ａ）疾患の素因を有する可能性があるが、疾患を有するとまだ診断されていない対象において、疾患が発生するのを予防すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、疾患の発症を停止させること、及び（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患の後退を引き起こすことを含む。

【0052】

「治療有効量」とは、疾患を治療するために哺乳動物又は他の対象に投与された場合、疾患のそのような治療をもたらすのに十分な抗αシヌクレイン抗体又はその抗原結合断片の量を指す。治療有効量は、抗αシヌクレイン抗体又はその抗原結合断片、疾患及びその重症度、並びに治療される対象の年齢、体重などに応じて変化する。

【0053】

「単離された」という用語は、本明細書を通して、場合によっては、抗体、抗原結合断片又はポリヌクレオチドが、自然界で生じ得るものとは異なる物理的環境に存在することを意味する。

【0054】

本発明の第１の態様では、カリクレイン５（ＫＬＫ５）に結合する抗体が提供され、モノクローナル抗体は、可変軽鎖及び可変重鎖を含み、及び
ａ．可変軽鎖は、配列番号１又は７又は８又は９を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ
ｂ．可変重鎖は、配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６又は配列番号１０～２９のいずれか１つ、好ましくは１０、１１、１３～１６、１８、２０、２２～２５、２７若しくは２９のいずれか１つを含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。

【0055】

カリクレイン５（ＫＬＫ５、ＫＬＫ－Ｌ２、ＳＣＴＥ又は任意の他の既知の同義語）はトリプシン様活性を有する。これはプレプロフォームで発現され、バイオインフォマティクスツールＳｉｇｎａｌＰ ５．０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）による２９個のアミノ酸のシグナルペプチドと、それに続く３７個のアミノ酸のプロペプチド配列とを含む。プロペプチドの切断は、セリンプロテアーゼに典型的な残基の触媒三連を有する活性部位を有する、２３７個のアミノ酸からなる活性成熟酵素を産生する（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｉ．Ｐ ｅｔ ａｌ．，２００５；ＪＢＣ ２８０：１５，１４６２８－３５）。

【0056】

別段特定されない限り、ＫＬＫ５という用語は、任意の天然のプレフォーム及びプロフォーム（すなわち、シグナル配列及び活性化ペプチドを含む未処理のＫＬＫ５）、選択的スプライシング又は天然のバリアント、変異体及び他の種からのＫＬＫ５（マウス、カニクイザルなど）並びに活性ＫＬＫ５（自己切断又はその他から生じる）を指す。ヒトＫＬＫ５が特定される場合、ヒトＫＬＫ５は、配列番号１４４に示される配列（活性ヒトＫＬＫ５）を含む。本明細書で言及される他のＫＬＫ５配列は、配列番号１４３（シグナル配列を欠くヒトＫＬＫ５プロフォーム）又は配列番号１４２（シグナル配列お及びプロペプチド配列を有する完全長ヒトＫＬＫ５）、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９Ｙ３３７に対応する配列、又は５５位及び１５３位に変異を含む天然バリアント（配列番号１４２を参照）を含む。これらの変異の例は、残基５５でのＧｌｙからＡｒｇへの変異（Ｇ５５Ｒ）及び／又は残基１５３でのＡｓｐからＡｓｎへの変異（Ｄ１５３Ｎ）を有する、配列番号１４２による残基２３～２９３を含むヒトＫＬＫ５を含む。

【0057】

本発明による抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５－４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，４：７２）及びＥＢＶ－ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｐｐ７７－９６，Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）などの当技術分野で公知の任意の方法によって調製することができる。

【0058】

本発明で使用するための抗体はまた、例えばＢａｂｃｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３（１５）：７８４３－７８４８ｌ、国際公開第９２／０２５５１号、国際公開第２００４／０５１２６８号及び国際公開第２００４／１０６３７７号により記載される方法によって、特定の抗体を産生するように選択された単一リンパ球から産生した免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡをクローニングし発現させることにより、単一リンパ球抗体法を用いて産生することができる。

【0059】

一実施形態では、カリクレイン５（ＫＬＫ５）に結合する抗体は、配列番号７を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む可変軽鎖、並びに配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号１０又は１４又は２３を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む可変重鎖を含む。

【0060】

好ましい一実施形態では、カリクレイン５（ＫＬＫ５）に結合する抗体は、配列番号７を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む可変軽鎖、並びに配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号２３を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む可変重鎖を含む。

【0061】

本発明による抗体は、３つが重鎖由来であり、３つが軽鎖由来である相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。一般に、ＣＤＲはフレームワーク内にあり、共に可変領域を形成する。慣例により、抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域内のＣＤＲは、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３と呼ばれ、軽鎖可変領域内のＣＤＲは、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３と呼ばれる。それらは、各鎖のＮ末端からＣ末端の方向に連続して番号付けされる。

【0062】

ＣＤＲは、従来、Ｋａｂａｔらによって考案されたシステムに従ってナンバリングされる。このシステムは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，ＵＳＡ（以下「Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（前出）」）に記載されている。この番号付けシステムは、別段の指示がない限り、本明細書で使用される。

【0063】

Ｋａｂａｔ残基の名称は、アミノ酸残基の直鎖状の番号付けと必ずしも直接対応しない。実際の直鎖状のアミノ酸配列は、基本可変ドメイン構造のフレームワーク又は相補性決定領域（ＣＤＲ）にかかわらず、構造成分の短縮又は挿入に対応する厳密なＫａｂａｔナンバリングよりも少ない又は追加のアミノ酸を含むことができる。残基の正しいＫａｂａｔナンバリングは、抗体の配列における相同性の残基と「標準的な」Ｋａｂａｔナンバリング配列とのアラインメントによって、所与の抗体について決定することができる。

【0064】

重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って、残基３１～３５（ＣＤＲ－Ｈ１）、残基５０～６５（ＣＤＲ－Ｈ２）及び残基９５～１０２（ＣＤＲ－Ｈ３）に位置する。しかし、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９０１－９１７（１９８７））によれば、ＣＤＲ－Ｈ１と等価なループは、残基２６から残基３２まで延びる。したがって、特に指示しない限り、本明細書で使用される「ＣＤＲ－Ｈ１」は、ＫａｂａｔナンバリングシステムとＣｈｏｔｈｉａのトポロジカルループ定義との組合せによって記載される残基２６から３５を指すことが意図される。

【0065】

軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って、残基２４～３４（ＣＤＲ－Ｌ１）、残基５０～５６（ＣＤＲ－Ｌ２）及び残基８９～９７（ＣＤＲ－Ｌ３）に位置する。

【0066】

ＣＤＲループに加えて、第４のループが、ＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｌ２又はＣＤＲ－Ｈ２）と、フレームワーク３（ＦＲ３）によって形成されるＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｌ３又はＣＤＲ－Ｈ３）との間に存在する。Ｋａｂａｔナンバリングシステムは、フレームワーク３を重鎖の位置６６～９４及び軽鎖の位置５７～８８として定義する。

【0067】

本開示の文脈で使用される「抗体」という用語は、全抗体及びその機能的に活性な断片、すなわち、抗原結合断片とも呼ばれる、抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む分子を含む。抗体に関して本明細書に記載される特徴は、文脈上他に指示されない限り、抗原結合断片にも適用される。抗体は、モノクローナル、多価、多重特異性、二重特異性、完全ヒト、ヒト化又はキメラであってもよい（又はそれらに由来してもよい）。

【0068】

「免疫グロブリン（Ｉｇ）」としても公知の全抗体は、一般に、インタクト又は完全長抗体、すなわち、特徴的なＹ字形三次元構造を規定するように集合するジスルフィド結合によって相互に連結された２つの重鎖及び２つの軽鎖の要素を含む抗体に関する。古典的な天然全抗体は、１つの抗原タイプに結合するという点で単一特異性であり、２つの独立した抗原結合ドメインを有するという点で二価である。「インタクト抗体」、「完全長抗体」及び「全抗体」という用語は、本明細書で定義されるＦｃ領域を含む、天然の抗体構造に類似した構造を有する単一特異性二価抗体を指すために互換的に使用される。

【0069】

各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。各重鎖は、Ｉｇクラスに応じて、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）と、３つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３、又は４つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４で構成される重鎖定常領域（ＣＨ）とで構成される。Ｉｇ又は抗体の「クラス」は定常領域のタイプを指し、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭを含み、それらのいくつかはサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に更に分割することができる。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。

【0070】

本明細書で使用される「定常領域」又は「定常ドメイン」という用語は、可変領域の外側にある抗体のドメインを指すために互換的に使用される。定常ドメインは、同じアイソタイプの全ての抗体において同一であるが、アイソタイプごとに異なる。典型的には、重鎖の定常領域は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、３つ又は４つの定常ドメインを含むＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－、場合によりＣＨ４によって形成される。

【0071】

本発明の抗体分子の定常領域ドメインは、存在する場合、提案される抗体の機能、特に、必要とされ得るエフェクター機能を考慮して選択することができる。例えば、定常領域ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭドメインであってもよい。特に、ヒトＩｇＧ定常領域ドメインは、抗体が治療用途を意図しており、抗体エフェクター機能が必要とされる場合、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプのものを使用することができる。或いは、抗体が治療目的のために意図され、抗体エフェクター機能が必要とされない場合、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプを使用することができる。これらの定常領域ドメインの配列バリアントも使用することができることが理解されるであろう。例えば、２４１位のセリン（Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従ってナンバリング）プロリンに変更されたＩｇＧ４が、Ａｎｇａｌら（Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３）に記載されている。単一のアミノ酸置換は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析中に観察されるようなキメラマウス／ヒト（ＩｇＧ４）抗体の不均一性を消失させ（Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３０，１０５－１０８）、これを使用することができる。これは、本明細書ではＩｇＧ４Ｐと呼ばれる。この単一のアミノ酸置換は、ＩｇＧ４分子の重鎖が交換してキメラ分子を産生する自然な傾向を妨げる。

【0072】

「Ｆｃ領域」、「Ｆｃ断片」又は単に「Ｆｃ」は、第１の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含む抗体のＣ末端領域を指すために互換的に使用される。したがって、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＧの最後の２つの定常ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３、又はＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常ドメイン、並びにこれらのドメインに対する可撓性ヒンジＮ末端を指す。ヒトＩｇＧ１重鎖Ｆｃ領域は、本明細書において、残基Ｃ２２６からそのカルボキシル末端までを含むと定義され、ナンバリングはＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従う。ヒトＩｇＧ１の文脈において、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従って、下側ヒンジは、２２６～２３６位を指し、ＣＨ２ドメインは、２３７～３４０位を指し、ＣＨ３ドメインは、３４１～４４７位を指す。他の免疫グロブリンの対応するＦｃ領域は、配列アラインメントによって同定することができる。

【0073】

本開示の文脈において、存在する場合、定常領域又はＦｃ領域は、上記で定義したように天然であってもよく、又は機能的ＦｃＲ結合ドメイン、好ましくは機能的ＦｃＲｎ結合ドメインを含む限り、様々な方法で修飾されてもよい。好ましくは、修飾定常領域又はＦｃ領域は、機能性及び／又は薬物動態を改善する。修飾は、Ｆｃ断片の特定の部分の欠失を含むことができる。修飾は、抗体の生物学的特性に影響を及ぼすことができる様々なアミノ酸置換を更に含むことができる。ＦｃＲｎ結合、したがってインビボ半減期を増加させるための変異も存在してもよい。修飾は、抗体のグリコシル化プロファイルの修飾を更に含むことができる。天然Ｆｃ断片は、２９７位（Ａｓｎ２９７）のアスパラギン残基に結合したＮ－グリカンが２つの重鎖のそれぞれに存在するＣＨ２ドメイン中でグリコシル化される。本開示の文脈において、抗体は、例えば、改善された特性、例えば改善されたエフェクター機能、又は改善された血清半減期をもたらす特定のグリコシル化プロファイルを有するように遺伝子操作された糖修飾されてもよい。

【0074】

抗体の抗原結合断片としては、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ及びｄｓｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体又はナノボディ（例えば、ＶＨ若しくはＶＬ、又はＶＨＨ若しくはＶＮＡＲ）が挙げられる。本発明で使用するための他の抗体断片としては、国際公開第２０１１／１１７６４８号、国際公開第２００５／００３１６９号、国際公開第２００５／００３１７０号及び国際公開第２００５／００３１７１号（これらは全て参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているＦａｂ及びＦａｂ’断片が挙げられる。

【0075】

これらの抗体断片を産生及び製造する方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１６，１６５－１８１を参照されたい）。

【0076】

本明細書で使用される典型的な「Ｆａｂ’断片」又は「Ｆａｂ’」は、重鎖と軽鎖の対を含み、重鎖は可変領域ＶＨ、定常ドメインＣＨ１及び天然又は修飾ヒンジ領域を含み、軽鎖は可変領域ＶＬ及び定常ドメインＣＬを含む。本開示によるＦａｂ’の二量体は、例えば二量体化がヒンジによるものであってもよいＦ（ａｂ’）２を産生する。

【0077】

本明細書で使用される「単一ドメイン抗体」という用語は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片を指す。単一ドメイン抗体の例としては、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ又はＶ－ＮＡＲが挙げられる。

【0078】

「Ｆｖ」は、２つの可変ドメイン、例えば、同族対又は親和性成熟可変ドメイン、すなわちＶＨ及びＶＬ対などの協同可変ドメインを指す。

【0079】

本明細書で使用される「一本鎖可変断片」又は「ｓｃＦｖ」は、ＶＨ可変ドメインとＶＬ可変ドメインとの間のペプチドリンカーによって安定化される一本鎖可変断片を指す。

【0080】

本明細書で使用される「ジスルフィド安定化一本鎖可変断片」又は「ｄｓｓｃＦｖ」は、ＶＨとＶＬ可変ドメイン間とのペプチドリンカーによって安定化され、ＶＨとＶＬとの間のドメイン間ジスルフィド結合も含む一本鎖可変断片を指す（例えば、Ｗｅａｔｈｅｒｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２５（３２１－３２９），２０１２、国際公開第２００７１０９２５４号を参照されたい）。

【0081】

可変ドメインＶＨとＶＬとの間のジスルフィド結合は、以下に列挙する残基のうちの２つの間にある（文脈上別段の指示がない限り、以下のリストではＫａｂａｔナンバリングが用いられる）（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６，７８１－７８８ Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ（１９９７）、Ｗｅａｔｈｅｒｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２５（３２１－３２９），２０１２、Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８，８２５－８３１ Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ（１９９５）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３７７ １３５－１３９ Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ（１９９５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ Ｖｏｌ．９０ ｐｐ．７５３８－７５４２ Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ（１９９３）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １９，３５－４７ Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９ １３６２－１３６７、Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９０）。Ｋａｂａｔナンバリングが参照される場合、関連する参照は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１（５^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．），ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，ＵＳＡである。

【0082】

・ＶＨ３７＋ＶＬ９５Ｃ、
・ＶＨ４４＋ＶＬ１００、
・ＶＨ４４＋ＶＬ１０５、
・ＶＨ４５＋ＶＬ８７、
・ＶＨ５５＋ＶＬ１０１、
・ＶＨ１００＋ＶＬ５０、
・ＶＨ１００ｂ＋ＶＬ４
・ＶＨ９８＋ＶＬ４６、
・ＶＨ１０１＋ＶＬ４６、
・ＶＨ１０５＋ＶＬ４３、
・ＶＨ１０６＋ＶＬ５７、
及び分子内に位置する可変領域対におけるそれに対応する１つ又は複数の位置を含む。

【0083】

本明細書で使用される「抗体」という用語はまた、一価、すなわち１つの抗原結合ドメイン（例えば、「半抗体」とも呼ばれる、相互接続された全長重鎖及び全長軽鎖を含む１アーム抗体）のみを含む抗体を包含する。

【0084】

「抗体」という用語はまた、複数の特異性、例えば二重特異性又は三重特異性又は多重特異性抗体を含む多価抗体を包含する。

【0085】

本明細書で使用される「多重特異性（Ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）」又は「多重特異性（ｍｕｌｔｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体」は、少なくとも２つの結合ドメイン、すなわち２つ以上の結合ドメイン、例えば２つ又は３つの結合ドメインを有する本明細書に記載の抗体を指し、少なくとも２つの結合ドメインは、２つの異なる抗原又は同じ抗原上の２つの異なるエピトープに独立して結合する（マルチパラトピックとも呼ばれる）。多重特異性抗体は、一般に、各特異性（抗原）に対して一価である。本明細書に記載の多重特異性抗体は、一価及び、例えば二価、三価、四価の多重特異性抗体を包含する。

【0086】

本明細書で使用される「抗原結合ドメイン」は、標的抗原と特異的に相互作用する１つ又は複数の可変ドメインの一部又は全部、例えば一対の可変ドメインＶＨ及びＶＬの一部又は全部を含む抗体の一部を指す。結合ドメインは、単一ドメイン抗体を含むことができる。一実施形態では、各結合ドメインは一価である。好ましくは、各結合ドメインは、１つ以下のＶＨ及び１つのＶＬを含む。

【0087】

様々な多重特異性抗体フォーマットが当技術分野で公知である。様々な分類が提案されているが、多重特異性ＩｇＧ抗体フォーマットは、一般に、例えばＳｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７（２０１５）：９５－１０６に記載されているように、二重特異性ＩｇＧ、付加ＩｇＧ、多重特異性（例えば、二重特異性）抗体断片、多重特異性（例えば、二重特異性）融合タンパク質、及び多重特異性（例えば、二重特異性）抗体コンジュゲートが挙げられる。

【0088】

二重特異性抗体を作製するための技術としては、ＣｒｏｓｓＭａｂ技術（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ １５４（２０１９）２１－３１）、Ｋｎｏｂｓ－ｉｎ－ｈｏｌｅｓエンジニアリング（例えば、国際公開第１９９６０２７０１１号、国際公開第１９９８０５０４３１号）、ＤｕｏＢｏｄｙ技術（例えば、国際公開第２０１１１３１７４６号）、Ａｚｙｍｅｔｒｉｃ技術（例えば、国際公開第２０１２０５８７６８号）が挙げられるが、これらに限定されない。二重特異性抗体を作製するための更なる技術が、例えば、Ｇｏｄａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐａｔｅｎｔｓ，２８：３，２５１－２７６に記載されている。二重特異性抗体としては、特にＣｒｏｓｓＭａｂ抗体、ＤＡＦ（ツー・イン・ワン）、ＤＡＦ（フォー・イン・ワン）、ＤｕｔａＭａｂ、ＤＴ－ｌｇＧ、Ｋｎｏｂｓ－ｉｎ－ｈｏｌｅｓ共通ＬＣ、Ｋｎｏｂｓ－ｉｎ－ｈｏｌｅｓアセンブリ、電荷対、Ｆａｂアーム交換、ＳＥＥＤｂｏｄｙ、Ｔｒｉｏｍａｂ、ＬＵＺ－Ｙ、Ｆｃａｂ、κλ－ｂｏｄｙ及び直交Ｆａｂが挙げられる。

【0089】

付加ＩｇＧは、古典的には、ＩｇＧの重鎖及び／又は軽鎖のＮ末端及び／又はＣ末端に追加の抗原結合ドメイン又は抗原結合断片を付加することによって操作された全長ＩｇＧを含む。そのような追加の抗原結合断片の例としては、ｓｄＡｂ抗体（例えば、ＶＨ又はＶＬ）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｖが挙げられる。付加ＩｇＧ抗体フォーマットとしては、例えばＳｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍａｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７（２０１５）：９５－１０６に記載されているように、特にＤＶＤ－ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｈ）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－（Ｈ）ｌｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）－Ｆｖ、ＩｇＧ（Ｌ、Ｈ）－Ｆｖ、ＩｇＧ（Ｈ）－Ｖ、Ｖ（Ｈ）－ｌｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）－Ｖ、Ｖ（Ｌ）－ＩｇＧ、ＫＩＨ ＩｇＧ－ｓｃＦａｂ、２ｓｃＦｖ－ｌｇＧ、ＩｇＧ－２ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ４－ｌｇ、Ｚｙｂｏｄｙ及びＤＶＩ－ＩｇＧ（フォー・イン・ワン）が含まれる。

【0090】

例えばＳｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，ｆｏｒ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７（２０１５）：９５－１０６に記載されているように、多重特異性抗体断片としては、ナノボディ、ナノボディ－ＨＡＳ、ＢｉＴＥ、二重特異性抗体、ＤＡＲＴ、ＴａｎｄＡｂ、ｓｃ二重特異性抗体、ｓｃ－二重特異性抗体－ＣＨ３、二重特異性抗体－ＣＨ３、トリプルボディ、ミニ抗体、ミニボディ、Ｔｒｉ Ｂｉミニボディ、ｓｃＦｖ－ＣＨ３ＫＩＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＣＨ－ＣＬ－ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）２－ｓｃＦｖ２、ｓｃＦｖ－ＫＩＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、四価ＨＣＡｂ、ｓｃ二重特異性抗体－Ｆｃ、二重特異性抗体－Ｆｃ、タンデムｓｃＦｖ－Ｆｃ、及び細胞内抗体が挙げられる。

【0091】

多重特異性融合タンパク質としては、Ｄｏｃｋ ａｎｄ Ｌｏｃｋ、ＩｍｍＴＡＣ、ＨＳＡｂｏｄｙ、ｓｃ二重特異性抗体－ＨＡＳ、及びタンデムｓｃＦｖ－Ｔｏｘｉｎが挙げられる。多重特異性抗体コンジュゲートとしては、ＩｇＧ－ＩｇＧ、Ｃｏｖ－Ｘ－Ｂｏｄｙ、及びｓｃＦｖ１－ＰＥＧ－ｓｃＦｖ２が挙げられる。

【0092】

追加の多重特異性抗体フォーマットは、例えばタンデムｓｃＦｖ、トリプルボディ、Ｆａｂ－ＶＨＨ、ｔａＦｖ－Ｆｃ、ｓｃＦｖ４－Ｉｇ、ｓｃＦｖ２－Ｆｃａｂ、ｓｃＦｖ４－ＩｇＧについては、例えばＢｒｉｎｋｍａｎｎ ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，ｍＡｂｓ，９：２，１８２－２１２（２０１７）、特に図２に記載されている。バイボディ、トリボディ及びその産生方法は、例えば国際公開第９９／３７７９１号に開示されている。

【0093】

付加ＩｇＧ及び付加Ｆａｂは、例えば、国際公開第２００９／０４０５６２号、国際公開第２０１００３５０１２号、国際公開第２０１１／０３０１０７号、国際公開第２０１１／０６１４９２号、国際公開第２０１１／０６１２４６号及び国際公開第２０１１／０８６０９１号に記載されているように、少なくとも１つの追加の抗原結合ドメイン（例えば、２つ、３つ又は４つの追加の抗原結合ドメイン）、例えば単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨ又はＶＬ、又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖを当該ＩｇＧ又はＦａｂの重鎖及び／又は軽鎖のＮ末端及び／又はＣ末端に付加することによって操作された全ＩｇＧ又はＦａｂ断片をそれぞれ含む。特に、Ｆａｂ－Ｆｖフォーマットは、国際公開第２００９／０４０５６２号に最初に開示され、そのジスルフィド安定化バージョンであるＦａｂ－ｄｓＦｖは、国際公開第２０１０／０３５０１２号に最初に開示された。ｄｓＦｖがＦｖのＶＬ又はＶＨドメインとＦａｂのＬＣ又はＨＣのＣ末端との間の単一リンカーを介してＦａｂに連結されている単一リンカーＦａｂ－ｄｓＦｖは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４／０９６３９０号に最初に開示された。ＩｇＧの重鎖又は軽鎖のＣ末端にｄｓＦｖを付加することによって操作された全長ＩｇＧ１を含む付加ＩｇＧは、国際公開第２０１５／１９７７８９号に最初に開示され、参照により本明細書に組み込まれる。

【0094】

或いは、別の多重特異性フォーマットは、２つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖに連結されたＦａｂを含み、各ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖは同じ又は異なる標的（例えば、治療標的に結合する１つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖと、例えばアルブミンに結合することによって半減期を延長する１つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖ）に結合する。そのような抗体断片は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／１９７７７２号に記載されている。別のフォーマットは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／０６８５７１号及びＤａｖｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｂｓ，８（７）１３１９－１３３５（２０１６）に記載されているように、ただ１つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖに連結されたＦａｂを含む。

【0095】

多重特異性抗体の他の公知のフォーマットは、以下を含む。
二重特異性抗体は、本明細書で用いる場合、第１のＦｖのＶＨが第２のＦｖのＶＬに連結され、第１のＦｖのＶＬが第２のＦｖのＶＨに連結されるように、２つのＦｖ間リンカーを有する２つのＦｖ対、第１のＶＨ／ＶＬ対及び更なるＶＨ／ＶＬ対を指す。

【0096】

トリアボディは、本明細書で用いる場合、３つのＦｖ及び３つのＦｖ間リンカーを含む二重特異性抗体と同様のフォーマットを指す。

【0097】

テトラボディは、本明細書で用いる場合、４つのＦｖ及び４つのＦｖ間リンカーを含む二重特異性抗体と同様のフォーマットを指す。

【0098】

タンデムｓｃＦｖは、本明細書で用いる場合、単一のＦｖ間リンカーが存在するように単一のリンカーを介して連結された少なくとも２つのｓｃＦｖを指す。

【0099】

タンデムｓｃＦｖ－Ｆｃは、本明細書で用いる場合、少なくとも２つのタンデムｓｃＦｖを指し、それぞれが、例えばヒンジを介して、定常領域断片－ＣＨ２ＣＨ３のＣＨ２ドメインのＮ末端に付加されている。

【0100】

Ｆａｂ－Ｆｖは、本明細書で用いる場合、以下の重鎖のＣＨ１及び軽鎖のＣＬのそれぞれのＣ末端に付加された可変領域を有するＦｖ断片を指す。フォーマットは、そのＰＥＧ化バージョンとして提供することができる。

【0101】

Ｆａｂ’－Ｆｖは、本明細書で用いる場合、Ｆａｂ部分がＦａｂ’によって置き換えられているＦａｂＦｖと同様である。フォーマットは、そのＰＥＧ化バージョンとして提供することができる。

【0102】

Ｆａｂ－ｄｓＦｖは、本明細書で用いる場合、Ｆｖ内ジスルフィド結合が付加Ｃ末端可変領域を安定化するＦａｂＦｖを指す。フォーマットは、そのＰＥＧ化バージョンとして提供することができる。

【0103】

Ｆａｂ－ｓｃＦｖは、本明細書で用いる場合、軽鎖又は重鎖のＣ末端にｓｃＦｖが付加されたＦａｂ分子である。

【0104】

Ｆａｂ’－ｓｃＦｖは、本明細書で用いる場合、軽鎖又は重鎖のＣ末端にｓｃＦｖが付加されたＦａｂ’分子である。

【0105】

ＤｉＦａｂは、本明細書で用いる場合、重鎖のＣ末端を介して連結された２つのＦａｂ分子を指す。

【0106】

ＤｉＦａｂ’は、本明細書で用いる場合、そのヒンジ領域内の１つ又は複数のジスルフィド結合を介して連結された２つのＦａｂ’分子を指す。

【0107】

本明細書で用いる場合、ｓｃ二重特異性抗体は、分子が３つのリンカーを含み、そのＶＨ末端及びＶＬ末端がそれぞれ更なるＦｖ対の可変領域の１つに連結されている通常のｓｃＦｖを形成するような、Ｆｖ内リンカーを含む二重特異性抗体である。

【0108】

Ｓｃ二重特異性抗体－Ｆｃは、本明細書で用いる場合、２つのｓｃ二重特異性抗体であり、各ｓｃ二重特異性抗体は、定常領域断片－ＣＨ２ＣＨ３のＣＨ２ドメインのＮ末端に、例えばヒンジを介して付加されている。

【0109】

ＳｃＦｖ－Ｆｃ－ｓｃＦｖは、本明細書で用いる場合、４つのｓｃＦｖを指し、各ｓｃＦｖは、－ＣＨ２ＣＨ３断片の重鎖及び軽鎖の両方のＮ末端及びＣ末端に付加されている。

【0110】

Ｓｃ二重特異性抗体－ＣＨ３は、本明細書で用いる場合、例えばヒンジを介してＣＨ３ドメインにそれぞれ連結された２つのｓｃ二重特異性抗体分子を指す。

【0111】

ＩｇＧ－ｓｃＦｖは、本明細書で用いる場合、各重鎖又は各軽鎖のＣ末端にｓｃＦｖを有する完全長抗体である。

【0112】

ｓｃＦｖ－ＩｇＧは、本明細書で用いる場合、各重鎖又は各軽鎖のＮ末端にｓｃＦｖを有する完全長抗体である。

【0113】

Ｖ－ＩｇＧは、本明細書で用いる場合、各重鎖又は各軽鎖のＮ末端に可変ドメインを有する完全長抗体である。

【0114】

ＩｇＧ－Ｖは、本明細書で用いる場合、各重鎖又は各軽鎖のＣ末端に可変ドメインを有する完全長抗体である。

【0115】

ＤＶＤ－Ｉｇ（二重ＶドメインＩｇＧとしても知られる）は、各重鎖及び各軽鎖のＮ末端に１つずつ、４つの更なる可変ドメインを有する完全長抗体である。

【0116】

本発明によるモノクローナル抗体は、好ましくは完全長抗体である。より好ましくは、完全長抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４又はＩｇＧ４Ｐから選択される。

【0117】

別の実施形態では、モノクローナル抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ又はＶＨＨから選択される。

【0118】

一実施形態では、本発明による抗体は、抗体が産生された動物のフレームワーク領域を含むことができる。例えば、抗体がウサギにおいて産生された場合、抗体は上記で定義されたＣＤＲ及びウサギ抗体のフレームワーク領域、例えば配列番号３０による軽鎖可変領域（そのヌクレオチド配列は配列番号３１に示される）及び配列番号３２による重鎖可変領域（そのヌクレオチド配列は配列番号３３に示される）を含む抗体を含む。

【0119】

一実施形態では、抗体は、キメラ又はヒト化であってもよい。或いは、抗体はヒトであってもよい。

【0120】

キメラ抗体は、典型的には、組換えＤＮＡ法を用いて産生される。ヒトのＬ及びＨ鎖のコード配列を、対応する非ヒト（例えば、マウス又はウサギ）のＨ及びＬ定常領域で置き換えることによってＤＮＡを修飾することができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ；ＰＮＡＳ ８１，６８５１（１９８４））。

【0121】

ヒト抗体は、抗体の可変領域又は全長鎖がヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られる場合、特定の生殖細胞系配列の「生成物」であるか又はそれに「由来する」重鎖若しくは軽鎖可変領域又は全長重鎖若しくは軽鎖を含む。そのような系には、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを目的の抗原で免疫すること、又はファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーを目的の抗原でスクリーニングすることが含まれる。ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列の「生成物」であるか又はそれに「由来する」ヒト抗体又はその断片は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖細胞系免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、ヒト抗体の配列に配列が最も近い（すなわち、最大％の同一性）ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列を選択することによって、同定することができる。特定のヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列の「生成物」であるか又はそれに「由来する」ヒト抗体は、例えば、天然に存在する体細胞変異又は部位特異的変異の意図的な導入に起因して、生殖細胞系配列と比較してアミノ酸の相違を含むことができる。しかし、選択されたヒト抗体は、典型的には、他の種の生殖細胞系免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖系列配列）と比較した場合、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列が少なくとも９０％同一であり、ヒト抗体をヒトであると同定するアミノ酸残基を含有する。特定の場合において、ヒト抗体は、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列が少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、若しくは少なくとも９５％、又は更には少なくとも９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であってもよい。典型的には、特定のヒト生殖細胞系配列に由来するヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と１０個以下のアミノ酸の差を示す。特定の場合において、ヒト抗体は、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と５個以下、又は更には４個、３個、２個若しくは１個以下のアミノ酸の差を示し得る。

【0122】

ヒト抗体は、当業者に公知の多くの方法によって産生することができる。ヒト抗体は、ヒト骨髄腫又はマウス－ヒトヘテロミエローマ細胞株（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ；（１９８４）１３３：３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ５１－６３，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ，１９８７）を使用するハイブリドーマ法によって産生することができる。代替的な方法には、ファージライブラリー又はトランスジェニックマウスの使用が含まれ、その両方がヒト可変領域レパートリーを利用する（Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ；（１９９４）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２：４３３－４５５，Ｇｒｅｅｎ ＬＬ，（１９９９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１ １－２３）。

【0123】

本発明の好ましい一実施形態では、本発明による抗体はヒト化されている。

【0124】

好ましい一実施形態では、カリクレイン５（ＫＬＫ５）に結合するモノクローナル抗体は、可変軽鎖及び可変重鎖を含み、及び
ａ．可変軽鎖は、配列番号１又は７又は８又は９を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ
ｂ．可変重鎖は、配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６又は配列番号１０～２９のいずれか１つ、好ましくは１０、１１、１３～１６、１８、２０、２２～２５、２７若しくは２９のいずれか１つを含むＣＤＲ－Ｈ３を含み、
抗体はヒト化され、より好ましくは可変軽鎖は配列番号７を含むＣＤＲ－Ｌ１を含み、及び可変重鎖は配列番号２３を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。

【0125】

更に好ましい一実施形態では、本発明によるモノクローナル抗体は、好ましくはカリクレイン５（ＫＬＫ５）に結合し、かつ可変軽鎖及び可変重鎖を含む完全長抗体であり、及び
ａ．可変軽鎖は、配列番号１又は７又は８又は９を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ
ｂ．可変重鎖は、配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６又は配列番号１０～２９のいずれか一つ、好ましくは１０、１１、１３～１６、１８、２０、２２～２５、２７若しくは２９のいずれか１つを含むＣＤＲ－Ｈ３を含み、
抗体はヒト化され、より好ましくは可変軽鎖は配列番号７を含むＣＤＲ－Ｌ１を含み、可変重鎖は配列番号２３を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。更により好ましくは、完全長抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４又はＩｇＧ４Ｐから選択される。

【0126】

本明細書で使用される場合、「ヒト化」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖が、アクセプター抗体（例えば、ヒト抗体）の重鎖及び／又は軽鎖可変領域フレームワークに移植されたドナー抗体（例えば、マウス又はウサギモノクローナル抗体などの非ヒト抗体）由来の１つ又は複数のＣＤＲ（所望であれば、１つ又は複数の修飾ＣＤＲを含む）を含む抗体を指す。総説については、Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，５３５－５３９，１９９８を参照されたい。一実施形態では、全ＣＤＲが移入されるのではなく、本明細書中上記で記載されるＣＤＲのいずれか１つからの特異性決定残基の１つ又は複数のみがヒト抗体フレームワークに移入される（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６，２５－３４を参照されたい）。一実施形態では、上記の１つ又は複数のＣＤＲからの特異性決定残基のみがヒト抗体フレームワークに移入される。別の実施形態では、上記のＣＤＲの各々からの特異性決定残基のみがヒト抗体フレームワークに移入される。

【0127】

ＣＤＲが移植される場合、マウス、霊長類及びヒトフレームワーク領域が含まれる、ＣＤＲが由来するドナー抗体のクラス／タイプを考慮して、任意の適切なアクセプター可変領域フレームワーク配列を使用することができる。

【0128】

好ましくは、本発明によるヒト化モノクローナル抗体は、ヒトアクセプターフレームワーク領域並びに本明細書で具体的に提供されるＣＤＲの１つ又は複数を含む可変ドメインを有する。したがって、一実施形態では、ＫＬＫ５に結合するヒト化モノクローナル抗体であって、可変ドメインがヒトアクセプターフレームワーク領域及び非ヒトドナーＣＤＲを含むヒト化モノクローナル抗体が提供される。

【0129】

本発明において使用することができるヒトフレームワークの例は、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ及びＰＯＭ（Ｋａｂａｔ他、前出）である。例えば、ＫＯＬ及びＮＥＷＭを重鎖に使用することができ、ＲＥＩを軽鎖に使用することができ、ＥＵ、ＬＡＹ及びＰＯＭを重鎖及び軽鎖の両方に使用することができる。或いは、ヒト生殖細胞系配列を使用することができ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／で入手可能である。

【0130】

本発明によるヒト化抗体において、アクセプター重鎖及び軽鎖は、必ずしも同じ抗体に由来する必要はなく、所望であれば、異なる鎖に由来するフレームワーク領域を有する複合鎖を含むことができる。

【0131】

本発明によるヒト化モノクローナル抗体の軽鎖に適したフレームワーク領域は、配列番号１３８を含み、そのヌクレオチド配列が配列番号１３９に示されているヒト生殖細胞系ＩＧＫＶ１Ｄ－１３ ＪＫ４に由来する。

【0132】

本発明によるヒト化モノクローナル抗体の重鎖に適したフレームワーク領域は、配列番号１４０に示される配列を含み、そのヌクレオチド配列が配列番号１４１に示されるヒト生殖細胞系ＩＧＨＶ３－６６ ＪＨ６に由来する。

【0133】

したがって、一実施形態では、ＫＬＫ５に結合するヒト化モノクローナル抗体が提供され、抗体は可変軽鎖及び可変重鎖を含み、及び
ａ．可変軽鎖は、配列番号１又は７又は８又は９を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ
ｂ．可変重鎖は、配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６又は配列番号１０～２９のいずれか１つ、好ましくは１０、１１、１３～１６、１８、２０、２２～２５、２７若しくは２９のいずれか１つを含むＣＤＲ－Ｈ３を含み、
より好ましくは、可変軽鎖は配列番号７を含むＣＤＲ－Ｌ１を含み、可変重鎖は配列番号２３を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み、軽鎖フレームワーク領域は配列番号１３８を含むヒト生殖細胞系ＩＧＫＶ１Ｄ－１３ ＪＫ４に由来し、重鎖フレームワーク領域は配列番号１４０を含むヒト生殖細胞系ＩＧＨＶ３－６６ ＪＨ６に由来する。

【0134】

本発明によるヒト化モノクローナル抗体において、フレームワーク領域は、アクセプター抗体のものと同じ正確な配列を有していなくてもよい。例えば、異常な残基は、そのアクセプター鎖クラス又はタイプについて、より頻繁に生じる残基に変更されてもよい。或いは、アクセプターフレームワーク領域中の選択された残基は、それらがドナー抗体中の同じ位置に見出される残基に対応するように変更されてもよい（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３－３２４を参照されたい）。そのような変更は、ドナー抗体の親和性を回復するのに必要な最小限に保たれるべきである。変更する必要があり得るアクセプターフレームワーク領域中の残基を選択するためのプロトコルは、国際公開第９１／０９９６７号（これは参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。

【0135】

したがって、一実施形態では、フレームワーク中の１、２、３、４、５、６、７又は８個の残基が代替アミノ酸残基で置換される。

【0136】

したがって、一実施形態では、少なくとも可変重鎖の（配列番号１４０を参照して）２４、４８、４９、７１、７３及び７８の各位置の残基がドナー残基である、本発明によるヒト化モノクローナル抗体が提供される。

【0137】

好ましくは、可変重鎖の２４位の残基は（アラニンの代わりに）バリン残基であり、４８位の残基は（バリンの代わりに）イソロイシンであり、４９位の残基は（セリンの代わりに）グリシンであり、７１位の残基は（アルギニンの代わりに）リジンであり、７３位の残基は（アスパラギンの代わりに）セリンであり、７８位の残基は（ロイシンの代わりに）バリンである。

【0138】

したがって、ＫＬＫ５に結合するヒト化モノクローナル抗体が提供され、抗体は、
ａ．可変軽鎖が、配列番号１又は７又は８又は９を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む、上記可変軽鎖、及び
ｂ．可変重鎖が、配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６又は配列番号１０～２９のいずれか１つ、好ましくは１０、１１、１３～１６、１８、２０、２２～２５、２７若しくは２９のいずれか１つを含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、上記可変重鎖を含み、
より好ましくは、可変軽鎖は配列番号７を含むＣＤＲ－Ｌ１を含み、可変重鎖は配列番号２３を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み、軽鎖フレームワーク領域は配列番号１３８を含むヒト生殖細胞系ＩＧＫＶ１Ｄ－１３ ＪＫ４に由来し、重鎖フレームワーク領域は配列番号１４０を含むヒト生殖細胞系ＩＧＨＶ３－６６ ＪＨ６に由来し、可変重鎖の（配列番号１４０を参照して）２４、４８、４９、７１、７３及び７８位のアミノ酸残基はドナー残基である。

【0139】

したがって、一実施形態では、ＫＬＫ５に結合するヒト化モノクローナル抗体は、
ａ．配列番号３４又は３８又は４２又は４６を含む可変軽鎖、及び
ｂ．配列番号５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０２又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２２又は１２６又は１３０又は１３４、好ましくは３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２６又は１３４を含む可変重鎖を含む。

【0140】

好ましくは、ＫＬＫ５に結合するヒト化モノクローナル抗体は、
ａ．配列番号３８を含む可変軽鎖、及び
ｂ．配列番号１１０を含む可変重鎖を含む。

【0141】

一実施形態では、本発明は、本明細書に開示される配列と８０％類似又は同一である配列、例えば関連する配列、例えば可変ドメイン配列、ＣＤＲ配列、又はＣＤＲを除く可変ドメイン配列の一部又は全部にわたって８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％類似又は同一である配列を含む抗体を提供する。一実施形態では、関連する配列は配列番号３８である。一実施形態では、関連する配列は配列番号１１０である。

【0142】

一実施形態では、ＫＬＫ５に結合するモノクローナル抗体は、軽鎖及び重鎖を含み、可変軽鎖は、配列番号３８に含まれる配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性若しくは類似性を有する配列を含み、及び／又は可変重鎖は、配列番号１１０に含まれる配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性若しくは類似性を有する配列を含む。

【0143】

本明細書で使用される「同一性」、「同一の」又はその文法的変形は、アライメントされた配列の任意の特定の位置で、アミノ酸残基が配列間で同一であることを示す。本明細書で使用される「類似度」、「類似の」又はそれらの文法的変形は、アライメントされた配列内の任意の特定の位置で、アミノ酸残基が配列間で類似のタイプであることを示す。例えば、イソロイシン又はバリンの代わりにロイシンを用いてもよい。互いに置換され得る他のアミノ酸としては、限定されないが、
－フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）、
－リジン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）、
－アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）、
－アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）、及び
－システイン及びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）が挙げられる。

【0144】

同一性及び類似性の程度は、容易に計算することができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１、ＮＣＢＩから入手可能なＢＬＡＳＴ（商標）ソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、Ｇｉｓｈ，Ｗ．＆Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２．Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２、Ｚｈａｎｇ，Ｊ．＆Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．１９９７，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６）。

【0145】

一実施形態では、抗体は、好ましくはＩｇＧ１、及びＩｇＧ４又はＩｇＧ４Ｐから選択される完全長抗体である。

【0146】

したがって、本発明は、カリクレイン５（ＫＬＫ５）に結合し、かつ
ａ．可変軽鎖が、配列番号１又は７又は８又は９を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む、上記可変軽鎖、及び
ｂ．可変重鎖が、配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６又は配列番号１０～２９のいずれか１つ、好ましくは１０、１１、１３～１６、１８、２０、２２～２５、２７若しくは２９のいずれか１つを含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、上記可変重鎖を含み、
より好ましくは、可変軽鎖が配列番号７を含むＣＤＲ－Ｌ１を含み、可変重鎖が配列番号２１を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、完全長ヒト化モノクローナル抗体を提供し、及び抗体は、ＩｇＧ４Ｐアイソフォームである。

【0147】

本発明はまた、ＫＬＫ５に結合し、
ａ．配列番号３６又は４０又は４４又は４８を含む軽鎖、及び
ｂ．配列番号５２又は５６又は６０又は６４又は６８又は７２又は７６又は８０又は８４又は８８又は９２又は９６又は１００又は１０４又は１０８又は１１２又は１１６又は１２０又は１２４又は１２８又は１３２又は１３６、好ましくは３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２６又は１３４を含む重鎖を含む、全長ヒト化モノクローナル抗体を提供する。

【0148】

好ましくは、ＫＬＫ５に結合する全長ヒト化モノクローナル抗体は、
ａ．配列番号４０を含む軽鎖、及び
ｂ．配列番号１１２を含む重鎖を含む。

【0149】

一実施形態では、ＫＬＫ５に結合するモノクローナル抗体は、配列番号４０に示される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％類似又は同一である軽鎖であって、抗体がＣＤＲ－Ｌ１については配列番号７（又は配列番号１若しくは８若しくは９）を含む配列、ＣＤＲ－Ｌ２については配列番号２を含む配列、及びＣＤＲ－Ｌ３については配列番号３を含む配列を有する、上記軽鎖と、配列番号１１２に示される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％類似又は同一である重鎖であって、抗体がＣＤＲ－Ｈ１については配列番号４、ＣＤＲ－Ｈ２については配列番号５、及びＣＤＲ－Ｈ３については配列番号６又は配列番号１０～２９のいずれか１つ、好ましくは配列番号１０、１１、１３～１６、１８、２０、２２～２５、２７若しくは２９のいずれか１つを含む配列を有する、上記重鎖と、を含む。

【0150】

更に別の実施形態では、ＫＬＫ５に結合するモノクローナル抗体は、配列番号３８を含む軽鎖可変領域及び配列番号１１０を含む重鎖可変領域を含むＦａｂ’断片である。

【0151】

別の実施形態では、ＫＬＫ５に結合するモノクローナル抗体は、配列番号４０を含む軽鎖及び配列番号１１２を含む重鎖を含む全長ＩｇＧ４抗体である。

【0152】

抗体が様々な翻訳後修飾を受け得ることも当業者によって理解されるであろう。これらの修飾の種類及び程度は、多くの場合、抗体を発現するために使用される宿主細胞株並びに培養条件に依存する。そのような修飾には、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性化及びアスパラギン脱アミド化のバリエーションを含むことができる。頻繁な修飾は、（Ｈａｒｒｉｓ，ＲＪ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ７０５：１２９－１３４，１９９５に記載されているように）カルボキシペプチダーゼの作用によるカルボキシ末端塩基性残基（リジン又はアルギニンなど）の喪失である。したがって、抗体重鎖のＣ末端リジンは存在しなくてもよい。

【0153】

一実施形態では、抗体由来のＣ末端アミノ酸は、翻訳後修飾中に切断される。

【0154】

一実施形態では、抗体由来のＮ末端アミノ酸は、翻訳後修飾中に切断される。

【0155】

別の実施形態では、本発明によるモノクローナル抗体は、好ましくは配列番号１４４又は１４３又は１４２を含むヒトＫＬＫ５に結合し、カニクイザル（カニクイザル）ＫＬＫ５、好ましくは配列番号１５１を含むカニクイザルＫＬＫ５にも結合する。

【0156】

一実施形態では、モノクローナル抗体は、ヒト及び／又はカニクイザルカリクレイン５（ＫＬＫ５）に結合し、抗体は可変軽鎖及び可変重鎖を含み、及び
ａ．可変軽鎖は、配列番号１又は７又は８又は９を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、可変重鎖は、配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６又は配列番号１０～２９のいずれか１つ、好ましくは１０、１１、１３～１６、１８、２０、２２～２５、２７若しくは２９のいずれか１つを含むＣＤＲ－Ｈ３を含み、又は
ｂ．可変軽鎖は、配列番号３０又は３４又は３８又は４２又は４６を含み、可変重鎖は、配列番号３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０２又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２２又は１２６又は１３０又は１３４、好ましくは３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２６又は１３４を含み、又は
ｃ．モノクローナル抗体は、軽鎖及び重鎖を含む完全長抗体であり、軽鎖は、配列番号３６又は４０又は４４又は４８を含み、重鎖は、配列番号５２又は５６又は６０又は６４又は６８又は７２又は７６又は８０又は８４又は８８又は９２又は９６又は１００又は１０４又は１０８又は１１２又は１１６又は１２０又は１２４又は１２８又は１３２又は１３６、好ましくは５２又は５６又は６０又は６４又は６８又は７２又は７６又は８０又は８４又は８８又は９２又は９６又は１００又は１０８又は１１２又は１１６又は１２０又は１２８又は１３６を含む。

【0157】

好ましい実施形態では、モノクローナル抗体は、ヒト及び／又はカニクイザルカリクレイン５（ＫＬＫ５）に結合し、抗体は可変軽鎖及び可変重鎖を含み、
ａ．可変軽鎖は、配列番号７を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、可変重鎖は、配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号２３を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み、又は
ｂ．可変軽鎖は、配列番号３８を含み、可変重鎖は、配列番号１１０を含み、又は
ｃ．モノクローナル抗体は、軽鎖及び重鎖を含む完全長抗体であり、軽鎖は配列番号４０を含み、重鎖は配列番号１１２を含む。

【0158】

別の実施形態では、本発明によるモノクローナル抗体は、ヒト若しくはカニクイザルカリクレイン２（ＫＬＫ２）、又はヒト若しくはカニクイザルカリクレイン４（ＫＬＫ４）、又はヒト若しくはカニクイザルカリクレイン７（ＫＬＫ７）に結合しない。言い換えれば、抗体はＫＬＫ５に特異的であり、他のカリクレインには特異的ではない。

【0159】

本明細書で使用される「特異的」は、特異的である抗原のみを認識する抗体、又は非特異的である抗原（ガンマシヌクレイン及びベータシヌクレイン）への結合と比較して、特異的である抗原（例えばＫＬＫ５）に対して有意に高い結合親和性、例えば少なくとも５、６、７、８、９、１０倍高い結合親和性を有する抗体を指すことを意図する。

【0160】

一実施形態では、モノクローナル抗体は、ヒト及び／又はカニクイザルＫＬＫ５に結合し、ヒト若しくはカニクイザルＫＬＫ２、又はヒト若しくはカニクイザルＫＬＫ４、又はヒト若しくはカニクイザルＫＬＫ７に結合せず、抗体は可変軽鎖及び可変重鎖を含み、及び
ａ．可変軽鎖は、配列番号１又は７又は８又は９を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ可変重鎖は、配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６又は配列番号１０～２９のいずれか１つ、好ましくは１０、１１、１３～１６、１８、２０、２２～２５、２７若しくは２９のいずれか１つを含むＣＤＲ－Ｈ３を含み、又は
ｂ．可変軽鎖は、配列番号３０又は３４又は３８又は４２又は４６を含み、かつ可変重鎖は、配列番号３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０２又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２２又は１２６又は１３０又は１３４、好ましくは３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２６又は１３４を含み、又は
ｃ．モノクローナル抗体は、軽鎖及び重鎖を含む完全長抗体であり、軽鎖は、配列番号３６又は４０又は４４又は４８を含み、かつ重鎖は、配列番号５２又は５６又は６０又は６４又は６８又は７２又は７６又は８０又は８４又は８８又は９２又は９６又は１００又は１０４又は１０８又は１１２又は１１６又は１２０又は１２４又は１２８又は１３２又は１３６、好ましくは５２又は５６又は６０又は６４又は６８又は７２又は７６又は８０又は８４又は８８又は９２又は９６又は１００又は１０８又は１１２又は１１６又は１２０又は１２８又は１３６を含む。

【0161】

好ましい実施形態では、モノクローナル抗体は、ヒト及び／又はカニクイザルＫＬＫ５に結合し、ヒト若しくはカニクイザルＫＬＫ２、又はヒト若しくはカニクイザルＫＬＫ４、又はヒト若しくはカニクイザルＫＬＫ７に結合せず、抗体は可変軽鎖及び可変重鎖を含み、
ａ．可変軽鎖は、配列番号７を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、可変重鎖は、配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号２３を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み、又は
ｂ．可変軽鎖は、配列番号３８を含み、可変重鎖は、配列番号１１０を含み、又は
ｃ．モノクローナル抗体は、軽鎖及び重鎖を含む完全長抗体であり、軽鎖は配列番号４０を含み、重鎖は配列番号１１２を含む。

【0162】

一実施形態では、本発明によれば、ＫＬＫ５への抗体の結合は、約７ｎＭ以下、好ましくは５００ｐＭ以下、好ましくは約４００ｐＭ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）を特徴とする。

【0163】

本明細書で使用される「Ｋ_Ｄ」という用語は、Ｋ_ｄ対Ｋ_ａ（すなわち、Ｋ_ｄ／Ｋ_ａ）の比から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される解離定数を指す。Ｋ_ｄ及びＫ_ａは、それぞれ、特定の抗原－抗体（又はその抗原結合断片）相互作用の解離速度及び会合速度を指す。抗体のＫ_Ｄ値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定することができる。抗体のＫ_Ｄを決定する方法は、表面プラズモン共鳴、例えば本明細書の例に記載のＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムを使用し、組換えＫＬＫ５又はその適切な融合タンパク質／ポリペプチドを使用することによるものである。一例では、親和性は、本明細書の例に記載の組換えＫＬＫ５を使用して測定される。表面プラズモン共鳴の場合、標的分子を固相に固定化し、フローセルに沿って移動する移動相中のリガンドに曝露する。固定化された標的にリガンドが結合すると、局所屈折率が変化してＳＰＲ角が変化し、反射光の強度の変化を検出することによってリアルタイムで監視することができる。ＳＰＲシグナルの変化速度を分析して、結合反応の会合相及び解離相の見かけの速度定数を得ることができる。これらの値の比により、見かけの平衡定数（親和性）が得られる（例えば、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：２５６０－６５（１９９３）を参照されたい）。

【0164】

一実施形態では、本発明による抗体は、ヒトＫＬＫ５に対して、カニクイザル又はマウスＫＬＫ５よりも高い結合親和性（すなわち、より小さいＫ_Ｄ）を有する。「親和性」という用語は、抗体とＫＬＫ５との間の相互作用の強度を指す。

【0165】

一実施形態では、本発明によるモノクローナル抗体は、ＫＬＫ５プロテアーゼ活性をブロックするために８００ｐＭ未満のＩＣ_５０を有し、好ましくは、本発明によるモノクローナル抗体は、本明細書に記載のインビトロアッセイでＫＬＫ５プロテアーゼ活性をブロックするために１８ｐＭ未満のＩＣ_５０を有する。

【0166】

本明細書で使用されるＩＣ_５０という用語は、本発明ではＫＬＫ５のプロテアーゼ活性である、特定の生物学的又は生化学的機能を阻害する際の抗体などの物質の有効性の尺度である最大半量阻害濃度を指す。ＩＣ_５０は、所与の生物学的プロセス又は機能又は活性を半分阻害するために特定の物質がどの程度必要であるかを示す定量的尺度である。

【0167】

本発明の別の実施形態では、ＫＬＫ５に結合するモノクローナル抗体であって、抗体は、可変軽鎖及び可変重鎖を含み、及び
ａ．可変軽鎖は、配列番号１又は７又は８又は９を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、
ｂ．可変重鎖は、配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６又は配列番号１０～２９のいずれか１つ、好ましくは１０、１１、１３～１６、１８、２０、２２～２５、２７若しくは２９のいずれか１つを含むＣＤＲ－Ｈ３を含み、
抗体は、ＫＬＫ５のプロテアーゼ活性を阻害又は低下させる。

【0168】

本発明内で、「阻害する」（及びその文法的変形）という用語は、ＫＬＫ５の生物学的活性に関して本発明による抗体が有する効果を示す。好ましくは、ＫＬＫ５の生物学的活性は、プロテアーゼ活性、好ましくはセリンプロテアーゼ活性である。この効果は、ＫＬＫ５のセリンプロテアーゼ活性の完全又は部分的な妨害をもたらす。

【0169】

理論に拘束されることを望むものではないが、本発明によるモノクローナル抗体は、ＫＬＫ５に結合し、ＫＬＫ５のプロテアーゼ活性（好ましくはセリンプロテアーゼ活性）を阻害（例えば、完全に又は部分的に）又は低下させ、及び／又は
ｉ）ＫＬＫ５がＬＥＫＴＩ又はＬＥＫＴＩの断片に結合すると、ＫＬＫ５に結合し、及び／又は
ｉｉ）ＫＬＫ５の結合についてＬＥＫＴＩ又はＬＥＫＴＩの断片と競合せず、及び／又は
ｉｉｉ）ＬＥＫＴＩ又はＬＥＫＴＩの断片に結合したＫＬＫ５と複合体を形成する（すなわち、本発明の抗体、ＫＬＫ５及びＬＥＫＴＩ、又はＬＥＫＴＩの断片を含む複合体を形成する）と考えられる。

【0170】

「複合体を形成する」（及びその任意の文法的変形）という用語は、ＫＬＫ５がＬＥＫＴＩなどの別のタンパク質、又はＬＥＫＴＩの断片、又は別の抗体若しくはＦａｂなどの抗体断片に既に結合している場合、本発明による抗体がＫＬＫ５に結合することができることを意味する。

【0171】

好ましくは、本明細書で特許請求される抗体は、ＫＬＫ５のプロテアーゼ活性を阻害又は低下させ、及び／又はＫＬＫ５がＬＥＫＴＩ又はＬＥＫＴＩの断片に結合すると、ＫＬＫ５に結合し、及び／又はＫＬＫ５の結合についてＬＥＫＴＩ又はＬＥＫＴＩの断片と競合せず、及び／又はＬＥＫＴＩ又はＬＥＫＴＩの断片に結合したＫＬＫ５と複合体を形成する。

【0172】

本発明において、「ＬＥＫＴＩ」という用語は、１５個のドメインからなるリンパ上皮カザール型関連阻害剤を指し、プロテアーゼであるフューリンなどのプロタンパク質変換酵素によってより小さい機能性断片に切断され、１つ又は複数のドメインからなるＬＥＫＴＩの断片をもたらす。これらの断片は細胞外空間に分泌され、そこでＫＬＫ５などのプロテアーゼと阻害性複合体を形成することができる。ＬＥＫＴＩは、セリンプロテアーゼ阻害剤カザール型５（ＳＰＩＮＫ５）としても知られており、ヒトにおいてＳＰＩＮＫ５遺伝子によってコードされるタンパク質である。ヒトでは、ＬＥＫＴＩ ｍＲＮＡの３つのスプライスバリアントが産生され、それらのＣＯＯＨ末端領域のみが異なるタンパク質の全長、長い及び短いアイソフォームをもたらす。

【0173】

ＳＰＩＮＫ５は、セリンプロテアーゼの阻害剤をコードする染色体５ｑ３２に位置する遺伝子ファミリークラスターのメンバーである。これには、「ＬＥＫＴＩ」という用語内に本発明にも含まれる他の表皮タンパク質ＳＰＩＮＫ６及びＬＥＫＴＩ－２（ＳＰＩＮＫ９）が含まれる。

【0174】

ＫＬＫ５に結合し、ＫＬＫ５の生物学的（すなわち、プロテアーゼ）活性を阻害することができるが、ＫＬＫ５の結合についてＬＥＫＴＩ又はＬＥＫＴＩの断片と競合しない抗体に関連する利点は、ＬＥＫＴＩがＫＬＫ５：ＬＥＫＴＩ複合体から解離する条件、例えば表皮の基底層から角質層へと次第に酸性になる環境において、ＫＬＫ５活性の阻害を可能にし得ることである。

【0175】

これらの実施形態では、ＬＥＫＴＩの断片は、好ましくは、配列番号１４５のアミノ酸１～６４を含むヒトＬＥＫＴＩドメイン５又は配列番号１５２のアミノ酸１～７１を含むＬＥＫＴＩドメイン８である。

【0176】

一実施形態では、本発明によるモノクローナル抗体は、配列番号１４２を参照して、Ｌｅｕ２１２、Ｓｅｒ２１３、Ｇｌｎ２１４、Ｌｙｓ２１５、Ａｒｇ２１６、Ｇｌｕ２１８、Ａｓｐ２１９、Ａｌａ２２０、Ｐｒｏ２２２、Ｇｌｙ２３３、Ｐｒｏ２６９、Ａｓｎ２７０及びＰｒｏ２７２からなる群からの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ以上のアミノ酸残基を含むヒトＫＬＫ５のエピトープに結合する。好ましくは、エピトープはＸ線結晶学によって特徴付けられる。括弧内の数字はプロテアーゼ命名法に対応する。

【0177】

本発明内で、「エピトープ」という用語は、立体構造エピトープと直鎖状エピトープの両方に互換的に使用される。立体構造エピトープは、抗原のアミノ酸一次配列の不連続部分から構成され、直鎖状エピトープは、連続したアミノ酸によって形成される配列によって形成される。

【0178】

エピトープは、本発明によって提供される抗体のいずれか１つと組み合わせて、当技術分野で公知の任意の適切なエピトープマッピング方法によって同定することができる。そのような方法の例としては、本発明の抗体又はその断片への結合について、全長ＫＬＫ５に由来する様々な長さのペプチドをスクリーニングすること、及び抗体によって認識されるエピトープの配列を含む、抗体に特異的に結合することができる最小断片を同定することが挙げられる。ＫＬＫ５ペプチドは、合成的に又はＫＬＫ５のタンパク質分解消化によって産生することができる。抗体に結合するペプチドは、例えば、質量分析によって同定することができる。ＮＭＲ分光法又はＸ線結晶学などの方法を使用して、抗体が結合したエピトープを同定することができる。典型的には、エピトープの決定をＸ線結晶学によって行う場合、ＣＤＲから４Å以内の抗原のアミノ酸残基は、エピトープのアミノ酸残基部分であると考えられる。一旦同定されると、エピトープは、本発明の抗体に結合する断片を調製するのに役立つ可能性があり、必要に応じて、同じエピトープに結合する更なる抗体を得るための免疫原として使用することができる。

【0179】

本発明を説明する態様及び実施形態に示されるエピトープは、好ましくは、Ｘ線結晶学によって特徴付けられるエピトープである。

【0180】

更に、本発明はまた、配列番号１４２を参照して、アミノ酸残基Ｌｅｕ２１２、Ｓｅｒ２１３、Ｇｌｎ２１４、Ｌｙｓ２１５、Ａｒｇ２１６、Ｇｌｕ２１８、Ａｓｐ２１９、Ａｌａ２２０、Ｐｒｏ２２２、Ｇｌｙ２３３、Ｐｒｏ２６９、Ａｓｎ２７０及びＰｒｏ２７２を含むヒトＫＬＫ５のエピトープに結合する抗体とクロスブロックするか、又は該抗体によってクロスブロックされることによって、ＫＬＫ５、好ましくはヒトＫＬＫ５との結合について競合する抗体を提供し、抗体は
１．可変軽鎖及び可変重鎖であって、可変軽鎖が、配列番号７を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、可変重鎖が、配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号２３を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、可変軽鎖及び可変重鎖、又は
２．配列番号３８を含む可変軽鎖、及び配列番号１１０を含む可変重鎖を含む。

【0181】

一実施形態では、そのような競合する抗体は、配列番号１１０を含む配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する重鎖可変領域を有し、及び／又は配列番号３８を含む配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する軽鎖可変領域を有する。

【0182】

本発明の抗体として、「競合する」、「クロスブロックする」、「クロスブロックされる」又は「ヒトＫＬＫ５上の同じエピトープに結合する」抗体（及びその任意の文法的変形）とは、本発明の抗体に結合したＫＬＫ５と複合体を形成することができない抗体を指す。

【0183】

競合する抗体は、当技術分野における任意の適切な方法を使用して、例えば競合ＥＬＩＳＡ又はＢＩＡｃｏｒｅアッセイを使用することによって同定することができ、クロスブロックすることによって又はクロスブロックされることによって、競合する抗体によるＫＬＫ５の結合が、本発明の抗体の結合を妨げ、又はその逆も同様である。そのような競合アッセイは、単離された天然若しくは組換えＫＬＫ５又はその適切な融合タンパク質／ポリペプチドを使用することができる。一例では、組換えヒト活性ＫＬＫ５（例えば、配列番号１４４を含む）を使用して競合を測定する。

【0184】

本発明はまた、本明細書に記載及び特許請求され、ＫＬＫ５と複合体を形成する抗体が提供され、ＫＬＫ、好ましくはヒトＫＬＫ５は、別の抗体に結合し（又は結合していてもよい）、別の抗体は、
１．配列番号１７５を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１７６を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号１７７を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む可変軽鎖、並びに配列番号１７８を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１７９を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号１６０を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む可変重鎖、及び／は
２．配列番号１６１を含む可変軽鎖及び配列番号１６３を含む可変重鎖、及び／又は
３．配列番号１６２を含むヌクレオチドによってコードされる可変軽鎖及び配列番号１６４を含むヌクレオチドによってコードされる可変重鎖を含む。

【0185】

一実施形態では、本発明による抗体は、ＫＬＫ５に結合し、
１．可変軽鎖及び可変重鎖であって、可変軽鎖が、配列番号１又は７を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、可変重鎖が、配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号１０～２９、好ましくは１０、１１、１３～１６、１８、２０、２２～２５、２７又は２９を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、可変軽鎖及び可変重鎖、又は
２．配列番号３０又は３４又は３８又は４２又は４６を含む可変軽鎖、及び配列番号３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０２又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２２又は１２６又は１３０又は１３４、好ましくは３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２６又は１３４を含む可変重鎖を含み、
抗体は、別の抗体に結合したＫＬＫ５、好ましくはヒトＫＬＫ５と複合体を形成し、別の抗体は、
１．配列番号１７５を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１７６を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号１７７を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む可変軽鎖、並びに配列番号１７８を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１７９を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号１６０を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む可変重鎖、及び／又は
２．配列番号１６１を含む可変軽鎖及び配列番号１６３を含む可変重鎖、及び／又は
３．配列番号１６２を含むヌクレオチドによってコードされる可変軽鎖及び配列番号１６４を含むヌクレオチドによってコードされる可変重鎖を含む。

【0186】

更に、本発明はまた、
ａ．ＫＬＫ５、好ましくはヒトＫＬＫ５、及び
ｂ．ＫＬＫ５に結合し、
１．可変軽鎖及び可変重鎖であって、可変軽鎖が、配列番号１又は７を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、可変重鎖が、配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号１０～２９、好ましくは１０、１１、１３～１６、１８、２０、２２～２５、２７又は２９を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、可変軽鎖及び可変重鎖、又は
２．配列番号３０又は３４又は３８又は４２又は４６を含む可変軽鎖、及び配列番号３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０２又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２２又は１２６又は１３０又は１３４、好ましくは３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２６又は１３４を含む可変重鎖を含む、抗体、及び
ｃ．ＫＬＫ５に結合し、
１．配列番号１７５を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１７６を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号１７７を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む可変軽鎖、並びに配列番号１７８を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１７９を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号１６０を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む可変重鎖であって、抗体がヒト化されていてもよい、可変軽鎖及び可変重鎖、及び／又は
２．配列番号１６１を含む可変軽鎖及び配列番号１６３を含む可変重鎖、及び／又は
３．配列番号１６２を含むヌクレオチドによってコードされる可変軽鎖及び配列番号１６４を含むヌクレオチドによってコードされる可変重鎖を含む、別の抗体を含む、ＫＬＫ５抗体複合体を含む。

【0187】

いわゆる「別の抗体」は、以下の例によって示されるように、本明細書に記載のエピトープとは異なり、重複しないエピトープにＫＬＫ５、好ましくはヒトＫＬＫ５に結合することを理解されたい。この点において、そのような抗体は互いに競合しない。

【0188】

本発明による抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法を使用して得ることができる。その融合タンパク質を含むＫＬＫ５、ＫＬＫ５を（組換え的又は天然に）発現する細胞を使用して、ＫＬＫ５を特異的に認識する抗体を産生することができる。本明細書に記載の様々な形態のＫＬＫ５を使用することができる。

【0189】

一実施形態では、使用される抗原は、活性ＫＬＫ５であり、好ましくは以下の例に記載されるように産生される。

【0190】

宿主を免疫するために使用するためのＫＬＫ５又はその断片は、発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞から当技術分野で公知の製法によって調製することができるか、又は天然の生物学的供給源から回収することができる。ＫＬＫ５又はその断片は、いくつかの例では、例えばアフィニティータグなどに融合された融合タンパク質などのより大きなタンパク質の一部であってもよい。

【0191】

本発明によるＫＬＫ５に対して産生された抗体は、動物の免疫化が必要な場合、公知の慣習的なプロトコルを使用して、動物、好ましくは非ヒト動物にＫＬＫ５を投与することによって得ることができ、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ（ｅｄ．），Ｖｏｌ ４，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９８６）を参照されたい。ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ラクダ又はブタなどの多くの温血動物を免疫化することができる。しかし、マウス、ウサギ、ブタ及びラットが一般に最も適している。

【0192】

抗体のスクリーニングは、ＫＬＫ５への結合を測定するアッセイ及び／又はＫＬＫ５生物学的活性、好ましくはＫＬＫ５プロテアーゼ活性の阻害を測定するアッセイを使用して行うことができる。

【0193】

モノクローナル抗体を含む抗体は、酸性及び／又は塩基性官能基を含有し、それによって分子に正味の正電荷又は負電荷を与える。全体的な「観察される」電荷の量は、実体の絶対アミノ酸配列、３Ｄ構造中の荷電基の局所環境及び分子の環境条件に依存する。等電点（ｐＩ）は、特定の分子又はその溶媒に接触可能な表面が正味の電荷を持たないｐＨである。一例では、本発明によるＫＬＫ５結合するモノクローナル抗体は、適切な等電点を有するように操作することができる。これにより、より堅牢な特性、特に適切な溶解度及び／又は安定性プロファイル及び／又は改善された精製特性を有する抗体を得ることができる。

【0194】

したがって、一実施形態では、ＫＬＫ５に結合するモノクローナル抗体は、
ａ．配列番号３０又は３４又は３８又は４２又は４６を含む可変軽鎖、及び配列番号３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０２又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２２又は１２６又は１３０又は１３４、好ましくは３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２６又は１３４を含む可変重鎖、又は
ｂ．配列番号３６又は４０又は４４又は４８を含む軽鎖、及び配列番号５２又は５６又は６０又は６４又は６８又は７２又は７６又は８０又は８４又は８８又は９２又は９６又は１００又は１０４又は１０８又は１１２又は１１６又は１２０又は１２４又は１２８又は１３２又は１３６、好ましくは５２又は５６又は６０又は６４又は６８又は７２又は７６又は８０又は８４又は８８又は９２又は９６又は１００又は１０８又は１１２又は１１６又は１２０又は１２８又は１３６を含む重鎖を含み、
モノクローナル抗体は、最初に同定された抗体の等電点とは異なる等電点を有するように操作される。

【0195】

抗体は、例えば、酸性アミノ酸残基を１つ又は複数の塩基性アミノ酸残基で置換するなど、アミノ酸残基を置換することによって操作することができる。或いは、塩基性アミノ酸残基を導入してもよいし、又は酸性アミノ酸残基を除去してもよい。或いは、許容できないほど高いｐＩ値を分子が有する場合、必要に応じて、ｐＩを低下させるために酸性残基を導入することができる。ｐＩを操作する場合、抗体又は断片の望ましい活性を保持するために注意を払わなければならないことが重要である。したがって、一実施形態では、操作された抗体は、「未修飾」抗体又は断片と同じ又は実質的に同じ活性を有する。

【0196】

^＊＊ＥｘＰＡＳＹ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／ｐｉ＿ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌ、及びｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｕｔ－ａｒｌｅｓ．ｕｐ．ｕｎｉｖ－ｍｒｓ．ｆｒ／ｗ３ｂｂ／ｄ＿ａｂｉｍ／ｃｏｍｐｏ－ｐ．ｈｔｍｌなどのプログラムを使用して、抗体の等電点を予測することができる。

【0197】

本発明によって提供される抗体の親和性は、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して変更することができることが理解されるであろう。したがって、本発明はまた、ＫＬＫ５、特にヒトＫＬＫ５に対する改善された親和性を有する抗体のバリアントに関する。そのようなバリアントは、ＣＤＲの変異（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４，３９２－４０３，１９９５）、鎖シャッフリング（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，７７９－７８３，１９９２）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の変異株の使用（Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５０，３５９－３６８，１９９６）、ＤＮＡシャッフリング（Ｐａｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８，７２４－７３３，１９９７）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５６，７７－８８，１９９６）及び有性ＰＣＲ（ｓｅｘｕａｌ ＰＣＲ）（Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，２８８－２９１，１９９８）を含むいくつかの親和性成熟プロトコルによって得ることができる。

【0198】

所望であれば、本発明による抗体は、１つ又は複数のエフェクター分子にコンジュゲートすることができる。エフェクター分子は、本発明の抗体に結合することができる単一部分を形成するように連結された単一のエフェクター分子又は２つ以上のそのような分子を含むことができることが理解されるであろう。エフェクター分子に連結された抗体の断片を得ることが望ましい場合、これは、抗体断片が直接又はカップリング剤を介してエフェクター分子に連結される標準的な化学的又は組換えＤＮＡ手順によって調製することができる。そのようなエフェクター分子を抗体にコンジュゲートさせるための技術は、当技術分野で公知である（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７，ｐｐ．６２３－５３、Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９－５８及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８３，６７－１２３を参照されたい）。特定の化学的手順としては、例えば、国際公開第９３／０６２３１号、国際公開第９２／２２５８３号、国際公開第８９／００１９５号、国際公開第８９／０１４７６号及び国際公開第０３／０３１５８１号に記載されているものが挙げられる。或いは、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、例えば国際公開第８６／０１５３３号及び欧州特許第０３９２７４５号に記載されているように、組換えＤＮＡ手順を使用して連結させることができる。

【0199】

本明細書で使用されるエフェクター分子という用語は、例えば抗悪性腫瘍薬、薬物、毒素、生物学的に活性なタンパク質、例えば酵素、他の抗体又は抗体断片、合成又は天然に存在するポリマー、核酸及びその断片、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ及びその断片、放射性核種、特に放射性ヨウ化物、放射性同位体、キレート化金属、ナノ粒子、並びに蛍光化合物又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光法によって検出することができる化合物などのレポーター基を含む。

【0200】

エフェクター分子の例としては、細胞に有害な（例えば、死滅させる）任意の薬剤を含む細胞毒又は細胞傷害剤を挙げることができる。例としては、コンブレスタチン、ドラスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、マイタンシノイド、スポンジスタチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミアステリン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン並びにそれらの類似体又はホモログが挙げられる。

【0201】

エフェクター分子としてはまた、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、５－フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシス－ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアマイシン又はデュオカルマイシン）、及び抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0202】

他のエフェクター分子としては、１１１Ｉｎ及び９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリフォルニウム２５２、イリジウム１９２及びタングステン１８８／レニウム１８８などのキレート化放射性核種、又は限定されないがアルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイド及びスラミンなどの薬物が挙げられる。

【0203】

他のエフェクター分子としては、タンパク質、ペプチド及び酵素が挙げられる。目的の酵素としては、タンパク質分解酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。目的のタンパク質、ポリペプチド及びペプチドとしては、免疫グロブリン、毒素、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素又はジフテリア毒素、タンパク質、例えば、インスリン、腫瘍壊死因子、α－インターフェロン、β－インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子又は組織プラスミノーゲン活性化因子、血栓剤又は抗血管新生剤、例えば、アンギオスタチン又はエンドスタチン、又は生物学的応答調節剤、例えば、リンホカイン、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）又は他の成長因子及び免疫グロブリンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0204】

他のエフェクター分子としては、例えば診断に有用な検出可能な物質を挙げることができる。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性核種、（陽電子放出断層撮影に使用するための）陽電子放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。診断薬として使用するために抗体にコンジュゲートさせることができる金属イオンについては、一般に米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。適切な酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、適切な補欠分子族としては、ストレプトアビジン、アビジン及びビオチンが挙げられ、適切な蛍光物質としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル及びフィコエリトリンが挙げられ、適切な発光物質としては、ルミノールが挙げられ、適切な生物発光物質としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが挙げられ、適切な放射性核種としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ及び９９Ｔｃが挙げられる。

【0205】

別の例では、エフェクター分子は、インビボでの抗体の半減期を増加させ、及び／又は抗体の免疫原性を低下させ、及び／又は免疫系に対する上皮バリアを横切る抗体の送達を増強することができる。このタイプの適切なエフェクター分子の例としては、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質、又は国際公開第０５／１１７９８４号に記載されているものなどのアルブミン結合化合物が挙げられる。

【0206】

エフェクター分子がポリマーである場合、一般に、合成又は天然に存在するポリマー、例えば置換されてもよい直鎖若しくは分岐鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレン若しくはポリオキシアルキレンポリマー又は分岐若しくは非分岐多糖、例えばホモ又はヘテロ多糖であってもよい。

【0207】

上記の合成ポリマー上に存在し得る特定の任意の置換基としては、１つ又は複数のヒドロキシ、メチル又はメトキシ基が挙げられる。

【0208】

合成ポリマーの具体例としては、置換されていてもよい直鎖若しくは分岐鎖ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）ポリ（ビニルアルコール）又はその誘導体、特に置換されていてもよいポリ（エチレングリコール）、例えばメトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体が挙げられる。

【0209】

具体的な天然に存在するポリマーとしては、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン又はそれらの誘導体が挙げられる。

【0210】

一実施形態では、ポリマーは、アルブミン又はその断片、例えばヒト血清アルブミン又はその断片である。

【0211】

本明細書で使用される「誘導体」は、反応性誘導体、例えば、マレイミドなどのチオール選択的反応性基を含むことを意図している。反応性基は、ポリマーに直接又はリンカーセグメントを介して連結されていてもよい。そのような基の残基は、場合によっては、抗体断片とポリマーとの間の連結基として生成物の一部を形成することが理解されるであろう。

【0212】

ポリマーのサイズは、所望に応じて変化させることができるが、一般に、５００Ｄａ～５００００Ｄａ、例えば５０００～４００００Ｄａ、例えば２００００～４００００Ｄａの平均分子量範囲である。ポリマーサイズは、特に、生成物の意図される用途、例えば腫瘍などの特定の組織に局在する能力又は循環半減期を延長する能力に基づいて選択することができる（総説については、Ｃｈａｐｍａｎ，２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４，５３１－５４５を参照されたい）。したがって、例えば、生成物が循環を離れ、例えば腫瘍の治療に使用するために組織に浸透することを意図している場合、例えば約５０００Ｄａの分子量を有する低分子量ポリマーを使用することが有利である可能性がある。生成物が循環中に留まる用途では、例えば２００００Ｄａ～４００００Ｄａの範囲の分子量を有する高分子量ポリマーを使用することが有利である可能性がある。

【0213】

適切なポリマーとしては、ポリアルキレンポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）、又は特にメトキシポリ（エチレングリコール）若しくはその誘導体、特に約１５０００Ｄａ～約４００００Ｄａの範囲の分子量を有するものが挙げられる。

【0214】

一例では、本発明による抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に結合している。特定の一実施形態では、本発明による抗体及びＰＥＧ分子は、抗体断片中に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基、例えば任意の遊離アミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシル又はカルボキシル基を介して結合することができる。そのようなアミノ酸は、抗体断片中に天然に存在してもよいか、又は組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第５，２１９，９９６号、米国特許第５，６６７，４２５号、国際公開第９８／２５９７１号、国際公開第２００８／０３８０２４号を参照されたい）を使用して抗体に操作することができる。一例では、本発明の抗体は、修飾Ｆａｂ断片であり、修飾とは、エフェクター分子の付着を可能にするために、その重鎖のＣ末端に１つ又は複数のアミノ酸を付加することである。適切には、追加のアミノ酸は、エフェクター分子が結合することができる１つ又は複数のシステイン残基を含む修飾ヒンジ領域を形成する。複数の部位を使用して、２つ以上のＰＥＧ分子を結合することができる。

【0215】

適切には、ＰＥＧ分子は、抗体断片中に位置する少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して共有結合している。修飾抗体断片に結合した各ポリマー分子は、断片中に位置するシステイン残基の硫黄原子に共有結合することができる。共有結合は、一般に、ジスルフィド結合、又は特に硫黄－炭素結合である。チオール基が結合点として使用される場合、適切に活性化されたエフェクター分子、例えば、マレイミド又はシステイン誘導体などのチオール選択的誘導体を使用することができる。活性化されたポリマーは、上記のポリマー修飾抗体断片の調製における出発材料として使用することができる。活性化されたポリマーは、α－ハロカルボン酸又はエステル、例えばヨードアセトアミド、イミド、例えばマレイミド、ビニルスルホン又はジスルフィドなどのチオール反応性基を含む任意のポリマーであってもよい。そのような出発材料は、商業的に得ることができ（例えば、Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｉｎｃ．、米国アラバマ州ハンツビル）、又は従来の化学的手順を使用して商業的に入手可能な出発材料から調製することができる。特定のＰＥＧ分子としては、２０Ｋメトキシ－ＰＥＧ－アミン（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ、及びＳｕｎＢｉｏから得ることができる）及びＭ－ＰＥＧ－ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒから得ることができる）が挙げられる。

【0216】

一実施形態では、抗体は、例えば欧州特許第０９４８５４４号又は欧州特許第１０９００３７号（“Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，１９９２，Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ（ｅｄ），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、“Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，１９９７，Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（ｅｄｓ），Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ及び“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，１９９８，Ｍ．Ａｓｌａｍ ａｎｄ Ａ．Ｄｅｎｔ，Ｇｒｏｖｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｃｈａｐｍａｎ，Ａ．２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ２００２，５４：５３１－５４５も参照されたい）に開示されている方法に従って、ＰＥＧ化されている、すなわちＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））が共有結合している修飾Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片又はｄｉＦａｂである。一例では、ＰＥＧはヒンジ領域内のシステインに結合している。一例では、ＰＥＧ修飾Ｆａｂ断片は、修飾ヒンジ領域内の単一のチオール基に共有結合したマレイミド基を有する。リジン残基は、マレイミド基に共有結合していてもよく、リジン残基上の各アミン基に、約２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーが結合していてもよい。したがって、Ｆａｂ断片に結合したＰＥＧの総分子量は、約４０，０００Ｄａであってもよい。

【0217】

特定のＰＥＧ分子としては、ＰＥＧ２ＭＡＬ４０Ｋ（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒから得ることができる）としても知られる、Ｎ，Ｎ’－ビス（メトキシポリ（エチレングリコール）分子量２０，０００）修飾リジンの２－［３－（Ｎ－マレイミド）プロピオンアミド］エチルアミドが挙げられる。

【0218】

ＰＥＧリンカーの代替供給源としては、ＧＬ２－４００ＭＡ３（式中、以下の構造におけるｍは５である）及びＧＬ２－４００ＭＡ（式中、ｍは２である）を供給するＮＯＦが挙げられ、ｎは約４５０である。

【化1】

【0219】

したがって、一実施形態では、ＰＥＧは、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ２－４００ＭＡ３として知られている、２，３－ビス（メチルポリオキシエチレン－オキシ）－１－｛［３－（６－マレイミド－１－オキソヘキシル）アミノ］プロピルオキシ｝ヘキサン（２アーム分岐ＰＥＧ、－ＣＨ２）３ＮＨＣＯ（ＣＨ２）５－ＭＡＬ、分子量４０，０００である。

【0220】

以下のタイプの更なる代替ＰＥＧエフェクター分子は、

【化2】

Ｄｒ Ｒｅｄｄｙ、ＮＯＦ及びＪｅｎｋｅｍから入手可能である。

【0221】

一実施形態では、本発明によるＦａｂ又はＦａｂ’は、ＰＥＧ分子にコンジュゲートされる。

【0222】

一実施形態では、本開示は、１つ又は複数のＰＥＧポリマー、例えば４０ｋＤａのポリマー（複数可）などの１つ又は２つのポリマーを含むＦａｂ’ＰＥＧ分子を提供する。

【0223】

本開示によるＦａｂ’－ＰＥＧ分子は、Ｆｃ断片とは無関係の半減期を有するという点で特に有利であり得る。一実施形態では、ＰＥＧ分子、デンプン分子又はアルブミン分子などのポリマーにコンジュゲートされたＦａｂ’が提供される。一実施形態では、ＰＥＧ分子、デンプン分子又はアルブミン分子などのポリマーにコンジュゲートされたｓｃＦｖが提供される。一実施形態では、本開示によるＦａｂ又はＦａｂ’は、ヒト血清アルブミンにコンジュゲートされる。一実施形態では、抗体又は断片は、例えば半減期を増加させるために、デンプン分子にコンジュゲートされる。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，０１７，７３９号に記載されているタンパク質にデンプンをコンジュゲートさせる方法。

【0224】

本発明はまた、本発明による抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明による単離されたポリヌクレオチドは、例えば化学処理によって生成された合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はそれらの任意の組合せを含むことができる。

【0225】

分子生物学の標準的な技術を使用して、本発明の抗体をコードするＤＮＡ配列を調製することができる。所望のＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成技術を使用して完全に又は部分的に合成することができる。部位特異的変異誘発及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を必要に応じて使用することができる。

【0226】

一実施形態では、本発明による単離されたポリヌクレオチドは、
ａ．軽鎖可変領域であって、ポリヌクレオチドが、
ｉ．配列番号３１又は３５又は３９又は４３又は４７と少なくとも９０％同一であり、又は
ｉｉ．配列番号３１又は３５又は３９又は４３又は４７を含み、又は
ｉｉｉ．配列番号３１又は３５又は３９又は４３又は４７から本質的になる、軽鎖可変領域、又は
ｂ．重鎖可変領域であって、ポリヌクレオチドが、
ｉ．配列番号３３又は５１又は５５又は５９又は６３又は６７又は７１又は７５又は７９又は８３又は８７又は９１又は９５又は９９又は１０３又は１０７又は１１１又は１１５又は１１９又は１２３又は１２７又は１３１又は１３５と少なくとも９０％同一であり、又は
ｉｉ．配列番号３３又は５１又は５５又は５９又は６３又は６７又は７１又は７５又は７９又は８３又は８７又は９１又は９５又は９９又は１０３又は１０７又は１１１又は１１５又は１１９又は１２３又は１２７又は１３１又は１３５を含み、又は
ｉｉｉ．配列番号３３又は５１又は５５又は５９又は６３又は６７又は７１又は７５又は７９又は８３又は８７又は９１又は９５又は９９又は１０３又は１０７又は１１１又は１１５又は１１９又は１２３又は１２７又は１３１又は１３５から本質的になる、重鎖可変領域、
ｃ．軽鎖であって、ポリヌクレオチドが、
ｉ．配列番号３７又は４１又は４５又は４９と少なくとも９０％同一であり、又は
ｉｉ．配列番号３７又は４１又は４５又は４９を含み、又は
ｉｉｉ．配列番号３７又は４１又は４５又は４９から本質的になる、軽鎖、
ｄ．重鎖であって、ポリヌクレオチドが、
ｉ．配列番号５３又は５７又は６１又は６５又は６９又は７３又は７７又は８１又は８５又は８９又は９３又は９７又は１０１又は１０５又は１０９又は１１３又は１１７又は１２１又は１２５又は１２９又は１３３又は１３７と少なくとも９０％同一であり、又は
ｉｉ．配列番号５３又は５７又は６１又は６５又は６９又は７３又は７７又は８１又は８５又は８９又は９３又は９７又は１０１又は１０５又は１０９又は１１３又は１１７又は１２１又は１２５又は１２９又は１３３又は１３７を含み、又は
ｉｉｉ．配列番号５３又は５７又は６１又は６５又は６９又は７３又は７７又は８１又は８５又は８９又は９３又は９７又は１０１又は１０５又は１０９又は１１３又は１１７又は１２１又は１２５又は１２９又は１３３又は１３７から本質的になる、重鎖をコードする。

【0227】

一実施形態では、本発明は、本発明の抗体Ｆａｂ’断片又はＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体の可変重鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、３３又は５１又は５５又は５９又は６３又は６７又は７１又は７５又は７９又は８３又は８７又は９１又は９５又は９９又は１０３又は１０７又は１１１又は１１５又は１１９又は１２３又は１２７又は１３１又は１３５に示される配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。配列番号３１又は３５又は３９又は４３又は４７で示される配列を含む本発明の抗体Ｆａｂ’断片又はＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体の可変軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドも提供される。

【0228】

別の実施形態では、本発明は、本発明のＩｇＧ４（Ｐ）抗体の重鎖及び軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、重鎖をコードするポリヌクレオチドが配列番号５３又は５７又は６１又は６５又は６９又は７３又は７７又は８１又は８５又は８９又は９３又は９７又は１０１又は１０５又は１０９又は１１３又は１１７又は１２１又は１２５又は１２９又は１３３又は１３７で示される配列を含み、軽鎖をコードするポリヌクレオチドが配列番号３７又は４１又は４５又は４９で示される配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。

【0229】

本発明はまた、本明細書に記載の１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むクローニング又は発現ベクターを提供する。一例では、本発明によるクローニング又は発現ベクターは、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５又は１３７から選択される配列を含む１つ又は複数の単離されたポリヌクレオチドを含む。

【0230】

ベクターを構築することができる一般的な方法、トランスフェクション方法及び培養方法は、当業者に公知である。この点に関しては、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，１９９９，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ），Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ及びＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇによるＭａｎｉａｔｉｓ Ｍａｎｕａｌを参照されたい。

【0231】

本発明による１つ又は複数の単離されたポリヌクレオチド配列、又は本発明の抗体をコードする１つ又は複数の単離されたポリヌクレオチド配列を含む１つ又は複数のクローニングベクター又は発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。任意の適切な宿主細胞／ベクター系を、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド配列の発現のために使用することができる。細菌、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、及び他の微生物系を使用することができ、又は真核生物、例えば哺乳動物、宿主細胞発現系を使用することができる。適切な哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ、骨髄腫又はハイブリドーマ細胞が挙げられる。

【0232】

本発明での使用に適した種類のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）としては、ＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用することができるＣＨＯ－ＤＧ４４細胞及びＣＨＯ－ＤＸＢ１１細胞などのｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞、又はグルタミン合成酵素選択可能マーカーと共に使用することができるＣＨＯＫ１－ＳＶを含むＣＨＯ及びＣＨＯ－Ｋ１細胞を挙げることができる。抗体の発現に使用される他の細胞型としては、リンパ球系細胞株、例えば、ＮＳＯ骨髄腫細胞及びＳＰ２細胞、ＣＯＳ細胞が挙げられる。宿主細胞は、本発明による単離されたポリヌクレオチド配列又は発現ベクターで安定に形質転換又はトランスフェクトすることができる。

【0233】

一実施形態では、本発明による宿主細胞は、本発明の単離されたポリヌクレオチド配列を含む、好ましくは配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５又は１３７を含む単離されたポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターで安定にトランスフェクトされたＣＨＯ－ＤＧ４４細胞である。

【0234】

本発明はまた、本発明によるＫＬＫ５結合する抗体を産生するための方法であって、本発明による宿主細胞をモノクローナル抗体の産生に適した条件下で培養すること、及びそのようにして産生したモノクローナル抗体を単離することを含む方法を提供する。

【0235】

抗体は、重鎖又は軽鎖のみを含んでもよく、この場合、宿主細胞をトランスフェクトするために重鎖又は軽鎖ポリヌクレオチド配列のみを使用する必要がある。重鎖及び軽鎖の両方を含む抗体の産生について、細胞株は、軽鎖をコードする第１のベクター及び重鎖をコードする第２のベクターの２つのベクターでトランスフェクトすることができる。或いは、軽鎖及び重鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含む単一のベクターを使用することができる。

【0236】

したがって、宿主細胞を培養し、抗体を発現させ、抗体を単離し、場合により精製して単離された抗体を得るための製法が提供される。したがって、一実施形態では、ＫＬＫ５、好ましくはヒトＫＬＫ５に結合する単離されたモノクローナル抗体、例えばヒト化モノクローナル抗体、特に本発明による抗体を、実質的に精製したもの、特にエンドトキシン及び／又は宿主細胞タンパク質若しくはＤＮＡを含まない又は実質的に含まないものが提供され、
モノクローナル抗体は、ＫＬＫ、好ましくはヒトＫＬＫ５に結合し、及び
ａ．配列番号１又は７又は８又は９を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む可変軽鎖、並びに配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６又は配列番号１０～２９のいずれか１つ、好ましくは１０、１１、１３～１６、１８、２０、２２～２５、２７若しくは２９のいずれか１つを含むＣＤＲ－Ｈ３を含む可変重鎖、又は
ｂ．配列番号３０又は３４又は３８又は４２又は４６を含む可変軽鎖、及び配列番号３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０２又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２２又は１２６又は１３０又は１３４、好ましくは３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２６又は１３４を含む可変重鎖、又は
ｃ．軽鎖及び重鎖であって、軽鎖が配列番号３６又は４０又は４４又は４８を含み、重鎖が配列番号５２又は５６又は６０又は６４又は６８又は７２又は７６又は８０又は８４又は８８又は９２又は９６又は１００又は１０４又は１０８又は１１２又は１１６又は１２０又は１２４又は１２８又は１３２又は１３６、好ましくは５２又は５６又は６０又は６４又は６８又は７２又は７６又は８０又は８４又は８８又は９２又は９６又は１００又は１０８又は１１２又は１１６又は１２０又は１２８又は１３６を含む、上記軽鎖及び重鎖
を含む。

【0237】

エンドトキシンを実質的に含まないとは、一般に、エンドトキシン含有量が抗体産物１ｍｇ当たり１ＥＵ又はそれ未満、例えば産物１ｍｇ当たり０．５又は０．１ＥＵを指すことを意図する。

【0238】

宿主細胞タンパク質又はＤＮＡを実質的に含まないとは、一般に、必要に応じて、宿主細胞タンパク質及び／又はＤＮＡ含有量が抗体産物１ｍｇ当たり４００μｇ以下、例えば１ｍｇ当たり１００μｇ以下、特に１ｍｇ当たり２０μｇを指すことを意図する。

【0239】

本発明の抗体は、病理学的状態の処置、診断及び／又は予防において有用であるので、本発明はまた、本発明による抗体を薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤の１つ又は複数と組み合わせて含む医薬組成物又は診断組成物を提供する。

【0240】

好ましくは、医薬組成物又は診断組成物は、ＫＬＫ５、好ましくはヒトＫＬＫ５に結合する抗体を含み、及び抗体は、
ａ．配列番号１又は７又は８又は９を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む可変軽鎖、並びに配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６又は配列番号１０～２９のいずれか１つ、好ましくは１０、１１、１３～１６、１８、２０、２２～２５、２７若しくは２９のいずれか１つを含むＣＤＲ－Ｈ３を含む可変重鎖、又は
ｂ．配列番号３０又は３４又は３８又は４２又は４６を含む可変軽鎖、並びに配列番号３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０２又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２２又は１２６又は１３０又は１３４、好ましくは３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２６又は１３４を含む可変重鎖、又は
ｃ．軽鎖及び重鎖であって、軽鎖が配列番号３６又は４０又は４４又は４８を含み、重鎖が配列番号５２又は５６又は６０又は６４又は６８又は７２又は７６又は８０又は８４又は８８又は９２又は９６又は１００又は１０４又は１０８又は１１２又は１１６又は１２０又は１２４又は１２８又は１３２又は１３６、好ましくは５２又は５６又は６０又は６４又は６８又は７２又は７６又は８０又は８４又は８８又は９２又は９６又は１００又は１０８又は１１２又は１１６又は１２０又は１２８又は１３６を含む、上記軽鎖及び重鎖
を含む。

【0241】

一実施形態では、本発明による抗体が唯一の有効成分である。別の実施形態では、本発明による抗体は、１つ又は複数の追加の有効成分と組み合わせられる。或いは、医薬組成物は、唯一の有効成分である本発明による抗体を含み、他の治療薬、診断薬又は緩和薬と組み合わせて（例えば、同時に、連続的に、又は別々に）患者に個別に投与することができる。

【0242】

別の実施形態では、医薬組成物は、
ＫＬＫ５、好ましくはヒトＫＬＫ５に結合する抗体であって、かつ
ａ．配列番号１又は７又は８又は９を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む可変軽鎖、並びに配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６又は配列番号１０～２９のいずれか１つ、好ましくは１０、１１、１３～１６、１８、２０、２２～２５、２７若しくは２９のいずれか１つを含むＣＤＲ－Ｈ３を含む可変重鎖、又は
ｂ．配列番号３０又は３４又は３８又は４２又は４６を含む可変軽鎖、並びに配列番号３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０２又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２２又は１２６又は１３０又は１３４、好ましくは３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２６又は１３４を含む可変重鎖、又は
ｃ．軽鎖及び重鎖を含む完全長抗体であるモノクローナル抗体であって、軽鎖が配列番号３６又は４０又は４４又は４８を含み、かつ重鎖が配列番号５２又は５６又は６０又は６４又は６８又は７２又は７６又は８０又は８４又は８８又は９２又は９６又は１００又は１０４又は１０８又は１１２又は１１６又は１２０又は１２４又は１２８又は１３２又は１３６、好ましくは５２又は５６又は６０又は６４又は６８又は７２又は７６又は８０又は８４又は８８又は９２又は９６又は１００又は１０８又は１１２又は１１６又は１２０又は１２８又は１３６を含む、上記モノクローナル抗体
を含む上記抗体、
並びに１つ又は複数の薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含む。

【0243】

好ましくは、医薬組成物は、ＫＬＫ５に結合する抗体であって、ＫＬＫ５、好ましくはヒトＫＬＫ５に結合し、配列番号３８の軽鎖可変領域及び配列番号１１０の重鎖可変領域を含む抗体を含む。

【0244】

本発明による医薬組成物は、必要とされる治療有効量を特定するために患者に適切に投与することができる。

【0245】

本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、標的疾患若しくは状態を治療、改善若しくは予防するため、又は検出可能な治療効果若しくは予防効果を示すために必要な治療剤の量を指す。任意の抗体について、治療有効量は、細胞培養アッセイ又は動物モデル、通常はげっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ又は霊長類のいずれかで最初に推定することができる。動物モデルを使用して、適切な濃度範囲及び投与経路を決定することもできる。次いで、そのような情報を使用して、ヒトにおける有用な投与量及び投与経路を決定することができる。

【0246】

ヒト対象に対する正確な治療有効量は、疾患状態の重症度、対象の一般的な健康状態、対象の年齢、体重及び性別、食事、投与の時間及び頻度、薬物の組合せ、反応感受性及び治療に対する耐性／応答に依存する。一般に、治療有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇ、例えば１００ｍｇ／Ｋｇなどの０．１ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇである。医薬組成物は、用量あたり所定量の本発明の活性薬剤を含有する単位用量形態で好都合に提供することができる。

【0247】

治療用組成物中の薬学的に許容される担体は、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体を更に含むことができる。更に、湿潤剤若しくは乳化剤又はｐＨ緩衝物質などの補助物質が、そのような組成物中に存在してもよい。そのような担体は、患者が摂取するために、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー及び懸濁液として医薬組成物を製剤化することができる

【0248】

投与に適した形態としては、例えば注射又は注入による、例えばボーラス注射又は持続注入による、静脈内、吸入可能又は皮下形態の非経口投与に適した形態が挙げられる。生成物が注射又は注入用である場合、生成物は油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又はエマルジョンの形態をとることができ、懸濁化剤、保存剤、安定化剤及び／又は分散剤などの製剤化剤を含むことができる。或いは、本発明による抗体は、使用前に適切な滅菌液体で再構成するために、乾燥形態であってもよい。注射前の液体ビヒクル中への溶解又は液体ビヒクル中への懸濁に適した固体形態も調製することができる。

【0249】

製剤化すると、本発明の組成物は対象に直接投与することができる。したがって、医薬の製造のための本発明による抗体の使用が本明細書で提供される。

【0250】

好ましくは、本発明による医薬組成物は、ヒト対象への投与に適合している。

【0251】

したがって、別の態様では、本発明は、ＫＬＫ５、好ましくはヒトＫＬＫ５に結合し、
ａ．配列番号１又は７又は８又は９を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む可変軽鎖、並びに配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６又は配列番号１０～２９のいずれか１つ、好ましくは１０、１１、１３～１６、１８、２０、２２～２５、２７若しくは２９のいずれか１つを含むＣＤＲ－Ｈ３を含む可変重鎖、又は
ｂ．配列番号３０又は３４又は３８又は４２又は４６を含む可変軽鎖、並びに配列番号３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０２又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２２又は１２６又は１３０又は１３４、好ましくは３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２６又は１３４を含む可変重鎖、又は
ｃ．軽鎖及び重鎖であって、軽鎖が配列番号３６又は４０又は４４又は４８を含み、重鎖が配列番号５２又は５６又は６０又は６４又は６８又は７２又は７６又は８０又は８４又は８８又は９２又は９６又は１００又は１０４又は１０８又は１１２又は１１６又は１２０又は１２４又は１２８又は１３２又は１３６、好ましくは５２又は５６又は６０又は６４又は６８又は７２又は７６又は８０又は８４又は８８又は９２又は９６又は１００又は１０８又は１１２又は１１６又は１２０又は１２８又は１３６を含む、上記軽鎖及び重鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。

【0252】

好ましい実施形態では、ＫＬＫ５、好ましくはヒトＫＬＫ５に結合するモノクローナル抗体は、
１．可変軽鎖及び可変重鎖であって、可変軽鎖が、配列番号７を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、可変重鎖が、配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号２３を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、可変軽鎖及び可変重鎖、又は
２．配列番号３８を含む可変軽鎖、及び配列番号１１０を含む可変重鎖、又は
３．配列番号４０を含む軽鎖及び配列番号１１２を含む重鎖を含む。

【0253】

特に、治療における使用は、ＫＬＫ５の調節不全又はＫＬＫ５の阻害の調節不全を特徴とする１つ又は複数の疾患の治療における使用を含む。

【0254】

更に別の態様では、本発明は、患者におけるＫＬＫ５の調節不全又はＫＬＫ５の阻害の調節不全を特徴とする１つ又は複数の疾患を治療する方法を提供し、方法は、ＫＬＫ５に結合する治療有効量のモノクローナル抗体を当該患者に投与することを含み、抗体は、ＫＬＫ５、好ましくはヒトＫＬＫ５に結合し、かつ
ａ．配列番号１又は７又は８又は９を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む可変軽鎖、並びに配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６又は配列番号１０～２９のいずれか１つ、好ましくは１０、１１、１３～１６、１８、２０、２２～２５、２７若しくは２９のいずれか１つを含むＣＤＲ－Ｈ３を含む可変重鎖、又は
ｂ．配列番号３０又は３４又は３８又は４２又は４６を含む可変軽鎖、並びに配列番号３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０２又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２２又は１２６又は１３０又は１３４、好ましくは３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２６又は１３４を含む可変重鎖、又は
ｃ．軽鎖及び重鎖であって、軽鎖が配列番号３６又は４０又は４４又は４８を含み、重鎖が配列番号５２又は５６又は６０又は６４又は６８又は７２又は７６又は８０又は８４又は８８又は９２又は９６又は１００又は１０４又は１０８又は１１２又は１１６又は１２０又は１２４又は１２８又は１３２又は１３６、好ましくは５２又は５６又は６０又は６４又は６８又は７２又は７６又は８０又は８４又は８８又は９２又は９６又は１００又は１０８又は１１２又は１１６又は１２０又は１２８又は１３６を含む、上記軽鎖及び重鎖
を含む。

【0255】

更に別の態様では、ＫＬＫ５、好ましくはヒトＫＬＫ５に結合するモノクローナル抗体、又はモノクローナル抗体を含む医薬組成物であって、モノクローナル抗体又は組成物は、ＫＬＫ５の調節不全又はＫＬＫ５の阻害の調節不全を特徴とする１つ又は複数の疾患の治療に使用するためのものであり、抗体は、
ａ．配列番号１又は７又は８又は９を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む可変軽鎖、並びに配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６又は配列番号１０～２９のいずれか１つ、好ましくは１０、１１、１３～１６、１８、２０、２２～２５、２７若しくは２９のいずれか１つを含むＣＤＲ－Ｈ３を含む可変重鎖、又は
ｂ．配列番号３０又は３４又は３８又は４２又は４６を含む可変軽鎖、並びに配列番号３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０２又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２２又は１２６又は１３０又は１３４、好ましくは３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２６又は１３４を含む可変重鎖、又は
ｃ．軽鎖及び重鎖であって、軽鎖が配列番号３６又は４０又は４４又は４８を含み、重鎖が配列番号５２又は５６又は６０又は６４又は６８又は７２又は７６又は８０又は８４又は８８又は９２又は９６又は１００又は１０４又は１０８又は１１２又は１１６又は１２０又は１２４又は１２８又は１３２又は１３６、好ましくは５２又は５６又は６０又は６４又は６８又は７２又は７６又は８０又は８４又は８８又は９２又は９６又は１００又は１０８又は１１２又は１１６又は１２０又は１２８又は１３６を含む、上記軽鎖及び重鎖
を含む。

【0256】

好ましい一実施形態では、本発明は、患者におけるＫＬＫ５の調節不全又はＫＬＫ５の阻害の調節不全を特徴とする１つ又は複数の疾患を治療する方法を提供し、方法は、ＫＬＫ５、好ましくはヒトＫＬＫ５に結合し、
１．可変軽鎖及び可変重鎖であって、可変軽鎖が、配列番号７を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、可変重鎖が、配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号２３を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、可変軽鎖及び可変重鎖、又は
２．配列番号３８を含む可変軽鎖、及び配列番号１１０を含む可変重鎖、又は
３．配列番号４０を含む軽鎖及び配列番号１１２を含む重鎖を含む、治療有効量の抗体を当該患者に投与することを含む。

【0257】

別の好ましい一実施形態では、ＫＬＫ５、好ましくはヒトＫＬＫ５に結合するモノクローナル抗体、又はモノクローナル抗体を含む医薬組成物であって、抗体又は医薬組成物は、ＫＬＫ５の調節不全又はＫＬＫ５の阻害の調節不全を特徴とする１つ又は複数の疾患の治療に使用するためのものであり、抗体は、
１．可変軽鎖及び可変重鎖であって、可変軽鎖が、配列番号７を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、可変重鎖が、配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号２３を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、可変軽鎖及び可変重鎖、又は
２．配列番号３８を含む可変軽鎖、及び配列番号１１０を含む可変重鎖、又は
３．配列番号４０を含む軽鎖及び配列番号１１２を含む重鎖を含む。

【0258】

好ましくは、ＫＬＫ５の調節不全又はＫＬＫ５の阻害の調節不全を特徴とする１つ又は複数の疾患は、ネザートン症候群、アトピー性皮膚炎、魚鱗癬、酒さ、喘息又はがん、例えば卵巣がん若しくは膀胱がん又はそれらの組合せから選択される。

【0259】

したがって、本発明は、患者におけるネザートン症候群、アトピー性皮膚炎、魚鱗癬、酒さ、喘息又はがん、例えば卵巣がん若しくは膀胱がん又はそれらの組合せを治療する方法を提供し、方法は、ＫＬＫ５、好ましくはヒトＫＬＫ５に結合する治療有効量のモノクローナル抗体、又はモノクローナル抗体を含む医薬組成物を当該患者に投与することを含み、抗体又は医薬組成物は、
ａ．配列番号１又は７又は８又は９を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む可変軽鎖、並びに配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６又は配列番号１０～２９のいずれか１つ、好ましくは１０、１１、１３～１６、１８、２０、２２～２５、２７若しくは２９のいずれか１つを含むＣＤＲ－Ｈ３を含む可変重鎖、又は
ｂ．配列番号３０又は３４又は３８又は４２又は４６を含む可変軽鎖、並びに配列番号３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０２又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２２又は１２６又は１３０又は１３４、好ましくは３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２６又は１３４を含む可変重鎖、又は
ｃ．軽鎖及び重鎖であって、軽鎖が配列番号３６又は４０又は４４又は４８を含み、重鎖が配列番号５２又は５６又は６０又は６４又は６８又は７２又は７６又は８０又は８４又は８８又は９２又は９６又は１００又は１０４又は１０８又は１１２又は１１６又は１２０又は１２４又は１２８又は１３２又は１３６、好ましくは５２又は５６又は６０又は６４又は６８又は７２又は７６又は８０又は８４又は８８又は９２又は９６又は１００又は１０８又は１１２又は１１６又は１２０又は１２８又は１３６を含む、上記軽鎖及び重鎖
を含む。

【0260】

より好ましくは、方法は、ネザートン症候群及び／又はアトピー性皮膚炎を治療するためのものである。

【0261】

別の態様では、ＫＬＫ５、好ましくはヒトＫＬＫ５に結合するモノクローナル抗体、又はモノクローナル抗体を含む医薬組成物が提供され、抗体又は医薬組成物は、ネザートン症候群、アトピー性皮膚炎、魚鱗癬、酒さ、喘息又はがん、例えば卵巣がん若しくは膀胱がん又はそれらの組合せの治療に使用するためのものであり、モノクローナル抗体又は医薬組成物は、
ａ．配列番号１又は７又は８又は９を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む可変軽鎖、並びに配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６又は配列番号１０～２９のいずれか１つ、好ましくは１０、１１、１３～１６、１８、２０、２２～２５、２７若しくは２９のいずれか１つを含むＣＤＲ－Ｈ３を含む可変重鎖、又は
ｂ．配列番号３０又は３４又は３８又は４２又は４６を含む可変軽鎖、並びに配列番号３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０２又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２２又は１２６又は１３０又は１３４、好ましくは３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２６又は１３４を含む可変重鎖、又は
ｃ．軽鎖及び重鎖であって、軽鎖が配列番号３６又は４０又は４４又は４８を含み、重鎖が配列番号５２又は５６又は６０又は６４又は６８又は７２又は７６又は８０又は８４又は８８又は９２又は９６又は１００又は１０４又は１０８又は１１２又は１１６又は１２０又は１２４又は１２８又は１３２又は１３６、好ましくは５２又は５６又は６０又は６４又は６８又は７２又は７６又は８０又は８４又は８８又は９２又は９６又は１００又は１０８又は１１２又は１１６又は１２０又は１２８又は１３６を含む、上記軽鎖及び重鎖
を含む。

【0262】

より好ましくは、抗体は、ネザートン症候群及び／又はアトピー性皮膚炎の治療に使用するためのものである。

【0263】

別の好ましい実施形態では、本発明は、患者におけるネザートン症候群、アトピー性皮膚炎、魚鱗癬、酒さ、喘息又はがん、例えば卵巣がん若しくは膀胱がん又はそれらの組合せを治療する方法を提供し、方法は、ＫＬＫ５、好ましくはヒトＫＬＫ５に結合する治療有効量の抗体、又はモノクローナル抗体を含む医薬組成物を当該患者に投与することを含み、抗体又は医薬組成物は、
１．可変軽鎖及び可変重鎖であって、可変軽鎖が、配列番号７を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、可変重鎖が、配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号２３を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、上記可変軽鎖及び可変重鎖、又は
２．配列番号３８を含む可変軽鎖、及び配列番号１１０を含む可変重鎖、又は
３．配列番号４０を含む軽鎖及び配列番号１１２を含む重鎖
を含む。

【0264】

より好ましくは、方法は、ネザートン症候群及び／又はアトピー性皮膚炎を治療するためのものである。

【0265】

別の好ましい一実施形態では、ＫＬＫ５、好ましくはヒトＫＬＫ５に結合する抗体、又はモノクローナル抗体を含む医薬組成物であって、抗体又は医薬組成物は、ネザートン症候群、アトピー性皮膚炎、魚鱗癬、酒さ、喘息又はがん、例えば卵巣がん若しくは膀胱がん又はそれらの組合せの治療に使用するためのものであり、抗体又は医薬組成物は、
１．可変軽鎖及び可変重鎖であって、可変軽鎖が、配列番号７を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、可変重鎖が、配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号２３を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、可変軽鎖及び可変重鎖、又は
２．配列番号３８を含む可変軽鎖、及び配列番号１１０を含む可変重鎖、又は
３．配列番号４０を含む軽鎖及び配列番号１１２を含む重鎖を含む。

【0266】

より好ましくは、抗体は、ネザートン症候群及び／又はアトピー性皮膚炎の治療に使用するためのものである。

【0267】

或いは、本発明はまた、ＫＬＫ５、好ましくはヒトＫＬＫ５に結合する抗体、又はモノクローナル抗体を含む医薬組成物の使用を提供し、抗体又は医薬組成物は、ＫＬＫ５の調節不全又はＫＬＫ５の阻害の調節不全を特徴とする１つ又は複数の疾患を治療するための医薬品の製造するためのものであり、そのような調節不全は、好ましくはネザートン症候群、アトピー性皮膚炎、魚鱗癬、酒さ、喘息又はがん、例えば卵巣がん若しくは膀胱がん又はそれらの組合せ、より好ましくはネザートン症候群及び／又はアトピー性皮膚炎であり、抗体は、
ａ．配列番号１又は７又は８又は９を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む可変軽鎖、並びに配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６又は配列番号１０～２９のいずれか１つ、好ましくは１０、１１、１３～１６、１８、２０、２２～２５、２７若しくは２９のいずれか１つを含むＣＤＲ－Ｈ３を含む可変重鎖、又は
ｂ．配列番号３０又は３４又は３８又は４２又は４６を含む可変軽鎖、並びに配列番号３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０２又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２２又は１２６又は１３０又は１３４、好ましくは３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２６又は１３４を含む可変重鎖、又は
ｃ．軽鎖及び重鎖であって、軽鎖が配列番号３６又は４０又は４４又は４８を含み、重鎖が配列番号５２又は５６又は６０又は６４又は６８又は７２又は７６又は８０又は８４又は８８又は９２又は９６又は１００又は１０４又は１０８又は１１２又は１１６又は１２０又は１２４又は１２８又は１３２又は１３６、好ましくは５２又は５６又は６０又は６４又は６８又は７２又は７６又は８０又は８４又は８８又は９２又は９６又は１００又は１０８又は１１２又は１１６又は１２０又は１２８又は１３６を含む、上記軽鎖及び重鎖
を含む。

【0268】

また、診断的活性薬剤として又は診断アッセイにおいて、例えば、ネザートン症候群、アトピー性皮膚炎、魚鱗癬、酒さ、喘息又はがん、例えば卵巣がん若しくは膀胱がんを診断するための、ＫＬＫ５に結合する抗体の使用が本発明により提供され、抗体は、ＫＬＫ５、好ましくはヒトＫＬＫ５に結合する。

【0269】

より好ましくは、モノクローナル抗体は、
ａ．配列番号１又は７又は８又は９を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む可変軽鎖、並びに配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６又は配列番号１０～２９のいずれか１つ、好ましくは１０、１１、１３～１６、１８、２０、２２～２５、２７若しくは２９のいずれか１つを含むＣＤＲ－Ｈ３を含む可変重鎖、又は
ｂ．配列番号３０又は３４又は３８又は４２又は４６を含む可変軽鎖、並びに配列番号３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０２又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２２又は１２６又は１３０又は１３４、好ましくは３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２６又は１３４を含む可変重鎖、又は
ｃ．軽鎖及び重鎖であって、軽鎖が配列番号３６又は４０又は４４又は４８を含み、重鎖が配列番号５２又は５６又は６０又は６４又は６８又は７２又は７６又は８０又は８４又は８８又は９２又は９６又は１００又は１０４又は１０８又は１１２又は１１６又は１２０又は１２４又は１２８又は１３２又は１３６、好ましくは５２又は５６又は６０又は６４又は６８又は７２又は７６又は８０又は８４又は８８又は９２又は９６又は１００又は１０８又は１１２又は１１６又は１２０又は１２８又は１３６を含む、上記軽鎖及び重鎖
を含む。

【0270】

診断は、好ましくは、生物学的試料に対して行うことができる。「生物学的試料」は、個体から得られた様々な試料タイプを包含し、診断アッセイ又はモニタリングアッセイに使用することができる。定義は、血漿及び血清などの血液、並びに尿及び唾液、脳脊髄液などの生物学的起源の他の液体試料、皮膚生検又は組織培養物などの生検標本などの固体組織試料、又はそれに由来する細胞及びその子孫を包含する。この定義はまた、例えば、試薬による処理、可溶化、又はポリヌクレオチドなどの特定の成分の濃縮などによって、それらの調達後に何らかの方法で操作された試料を含む。

【0271】

診断試験は、好ましくは、ヒト又は動物の身体と接触していない生物学的試料に対して行うことができる。このような診断試験は、インビトロ試験とも呼ばれる。インビトロ診断試験は、ｉ）生物学的試料を本明細書に記載の抗体と接触させる工程、及びｉｉ）ＫＬＫ５への抗体の結合を検出する工程を含む、個体から得られた生物学的試料中のＫＬＫ５を検出するインビトロ方法に依存することができる。検出されたＫＬＫ５レベル又はＫＬＫ５の特定の翻訳後修飾形態（任意のプロフォームを含む）の存在を適切な対照と比較することによって、ＫＬＫ５の調節不全又はＫＬＫ５の阻害の調節不全を特徴とする１つ又は複数の疾患を同定することができる。したがって、そのような検出方法を使用して、対象（胚又は胎児を含む）が、ＫＬＫ５の調節不全又はＫＬＫ５の阻害の調節不全を特徴とする疾患を有するか、又は発症するリスクがあるかどうかを判定することができる。

【0272】

したがって、本発明は、ＫＬＫ５に結合する抗体を提供し、抗体は、ＫＬＫ５、好ましくはヒトＫＬＫ５に結合し、抗体は、ＫＬＫ５の調節不全又はＫＬＫ５の阻害の調節不全を特徴とする１つ又は複数の疾患の診断、好ましくはネザートン症候群、アトピー性皮膚炎、魚鱗癬、酒さ、喘息又はがん、例えば卵巣がん若しくは膀胱がんの診断に使用するためのものであり、抗体は、
ａ．配列番号１又は７又は８又は９を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む可変軽鎖、並びに配列番号４を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６又は配列番号１０～２９のいずれか１つ、好ましくは１０、１１、１３～１６、１８、２０、２２～２５、２７若しくは２９のいずれか１つを含むＣＤＲ－Ｈ３を含む可変重鎖、又は
ｂ．配列番号３０又は３４又は３８又は４２又は４６を含む可変軽鎖、並びに配列番号３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０２又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２２又は１２６又は１３０又は１３４、好ましくは３２又は５０又は５４又は５８又は６２又は６６又は７０又は７４又は７８又は８２又は８６又は９０又は９４又は９８又は１０６又は１１０又は１１４又は１１８又は１２６又は１３４を含む可変重鎖、又は
ｃ．軽鎖及び重鎖であって、軽鎖が配列番号３６又は４０又は４４又は４８を含み、かつ重鎖が配列番号５２又は５６又は６０又は６４又は６８又は７２又は７６又は８０又は８４又は８８又は９２又は９６又は１００又は１０４又は１０８又は１１２又は１１６又は１２０又は１２４又は１２８又は１３２又は１３６、好ましくは５２又は５６又は６０又は６４又は６８又は７２又は７６又は８０又は８４又は８８又は９２又は９６又は１００又は１０８又は１１２又は１１６又は１２０又は１２８又は１３６を含む、上記軽鎖及び重鎖
を含む。

【0273】

本発明に含まれる配列を表１に示す。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【表1-6】

【表1-7】

【表1-8】

【表1-9】

【表1-10】

【表1-11】

【表1-12】

【表1-13】

【表1-14】

【表1-15】

【表1-16】

【表1-17】

【表1-18】

【表1-19】

【表1-20】

【表1-21】

【表1-22】

【表1-23】

【表1-24】

【表1-25】

【表1-26】

【表1-27】

【表1-28】

【表1-29】

【表1-30】

【表1-31】

【表1-32】

【表1-33】

【表1-34】

【表1-35】

【0274】

ここで、添付の図面に示された実施形態を参照して、例として本発明を更に説明する。

【実施例】

【0275】

例１：カリクレインタンパク質及びＬＥＫＴＩドメインのクローニング、発現及び精製
配列番号１４２によるタンパク質をコードする最適化されたヌクレオチド配列を、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位を使用して自家哺乳動物発現ベクターにクローニングし、タグのないヒトＫＬＫ５タンパク質をコードするベクターを作製した。

【0276】

マウス及びカニクイザル（カニクイザル（ｃｙｎｏ））ＫＬＫ５配列を同様にクローニングすることにより、それぞれ配列番号１５０及び１５１を含むこれらのタンパク質の活性形態を産生することができた。

【0277】

（Ｕｎｉｐｒｏｔにおける番号付けに従って）それぞれ残基２９２～３５３及び４９０～５５８を含むヒトＬＥＫＴＩ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＮＱ３８）のドメイン５（Ｄ５）及びドメイン８（Ｄ８）をクローニングし、インビトロアッセイにおいて参照タンパク質として使用するために発現させた。

【0278】

どちらも哺乳動物細胞における発現のために最適化されたヒトＬＥＫＴＩドメイン５及びドメイン８ヌクレオチド配列を、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ部位を使用して、ウサギＦｃタグをコードする自家哺乳動物発現ベクターに別々にクローニングし、Ｃ末端ウサギＦｃタグを有するＬＥＫＴＩドメイン５配列（配列番号１４５）又はＣ末端ウサギＦｃタグを有するＬＥＫＴＩドメイン８配列（配列番号１５２）のいずれかをコードするベクターを作製した。コードされたタンパク質は、それぞれＬＥＫＴＩ Ｄ５ウサギＦｃ及びＬＥＫＴＩ Ｄ８ウサギＦｃと呼ばれる。

【0279】

製造業者のプロトコルに従ってＥｘｐｉ ２９３（商標）発現系（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））を使用した一過性トランスフェクションによって、ＫＬＫ５、ＬＥＫＴＩドメイン５及びＬＥＫＴＩドメイン８ウサギＦｃ融合タンパク質を発現させた。発現中、ＫＬＫ５は自己活性化して、上清中に活性ＫＬＫ５（配列番号１４４、又は配列番号１４２の残基Ｉ６７～Ｓ２９３を含む）をもたらす。トランスフェクションの５日後に細胞を回収し、精製のために上清を直ちに使用した。ヒト（又はマウス又はカニクイザル）活性ＫＬＫ５を含む上清を緩衝液Ａ（５０ｍＭトリスｐＨ７．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ）で４倍希釈し、ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰ陽イオン交換カラムにロードした。結合したタンパク質を、緩衝液Ａ（５０ｍＭトリスｐＨ７．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ）及び緩衝液Ｂ（５０ｍＭトリスｐＨ７．０、１Ｍ ＮａＣｌ）を使用して合計１０カラム体積にわたって生成された塩勾配で溶出した。精製されたヒト（又はマウス又はカニクイザル）活性ＫＬＫ５を含有する画分をプールし、濃縮し、ｐＨ７．２の２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロールで平衡化したＳ２００ ２６／６０カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーによって更に精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析により、タンパク質が発現中にグリコシル化を受けたことが示された。質量分析による分析の結果、予想される分子量が得られた。

【0280】

ヒトＬＥＫＴＩ Ｄ５ウサギＦｃ融合タンパク質（配列番号１４５による）を含む上清を最初にプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーに供した。上清を５ｍｌのＨｉｔｒａｐ（商標）プロテインＡカラムにロードした。結合したタンパク質を１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ２．０で溶出し、画分を２Ｍトリス塩酸ｐＨ８．５で中和した。ＬＥＫＴＩ Ｄ５ウサギＦｃ融合タンパク質を含有する画分をプールし、濃縮し、ＰＢＳで平衡化したＳ２００ ２６／６０カラムを使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって更に精製した。次いで、ヒトＬＥＫＴＩ Ｄ５ウサギＦｃ融合タンパク質を含有する画分をプールし、濃縮した。ＬＥＫＴＩ Ｄ８ウサギＦｃ融合タンパク質（配列番号１５２による）を、トランスフェクトした細胞培養上清から同様に精製した。

【0281】

ＬＥＫＴＩ Ｄ５ Ｆａｂ融合分子（配列番号１６９及び１７０による）を発現させ、陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。Ｇｌｙ_４Ｓｅｒリンカーをコードする配列によって５’及び３’末端に隣接したＬＥＫＴＩドメイン５ヌクレオチド配列を、アルブミンに特異的なＦａｂの重鎖配列のフレームワーク３（参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０２００１１８６８号に記載）に組み込み、１０×Ｈｉｓ配列をコードするタグもＦａｂ Ｈ鎖の３’末端に配置した。ＬＥＫＴＩ Ｄ５ Ｆａｂ融合重鎖を哺乳動物細胞における発現のために最適化し、自家発現ベクターにクローニングし、ＣＨＯＳＸＥ細胞において、哺乳動物発現のためにも最適化された適切な軽鎖で同時トランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、通気フラスコ内で３２℃で１３日間培養した。上清を回収し、濃縮し、２０ｍＭトリス、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に緩衝液交換した後、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラムにロードした。結合したタンパク質を、緩衝液Ａ（２０ｍＭトリスｐＨ７．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ）及び緩衝液Ｂ（２０ｍＭトリスｐＨ７．０、１Ｍ ＮａＣｌ）を使用して合計１０カラム体積にわたって生成された塩勾配で溶出した。ＬＥＫＴＩ Ｄ５ Ｆａｂ融合物を含有する画分をプールし、ＰＢＳ ｐＨ７．４で平衡化したＳ２００カラムを使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって更に精製した。関連画分をプールした。

【0282】

全長ＫＬＫ７をコードするヒトヌクレオチド配列及びカニクイザルヌクレオチド配列を、ヒトＫＬＫ５と同様の様式で発現させ、プロＫＬＫ７（それぞれ配列番号１４６及び１４８を含む）を生成した。ＫＬＫ５とは異なり、ＫＬＫ７は発現中に自己活性化せず、そのため、ヒト、マウス及びカニクイザルＫＬＫ７（それぞれ配列番号１４７、１８６及び１４９を含む）の活性形態を、サーモリシンを使用して精製タンパク質からプロペプチド配列を切断することによって作製した。ヒト、マウス又はカニクイザルプロＫＬＫ７（それぞれ配列番号１４６、１８５及び１４８を含む）を活性化緩衝液（５０ｍＭトリスｐＨ７．５、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｂｒｉｊ３５）において１ｍｇ／ｍｌに希釈した。Ｓｉｇｍａ（商標）製のサーモリシン（２５ｍｇ）を消化緩衝液（５０ＭトリスｐＨ８．０、０．５ｍＭ ＣａＣｌ_２）２５ｍｌに再懸濁し、各ＫＬＫ７タンパク質に１：１０の比で３７℃で４５分間添加した後、陰イオン交換ＤＥＡＥ樹脂（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標））と混合してサーモリシンを結合させ、除去した。フロースルーを活性（ヒト、マウス又はカニクイザル）ＫＬＫ７として回収した。

【0283】

ヒト、マウス及びカニクイザルＫＬＫ７の活性形態を５０ｍＭトリスｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール、１ｍＭ ＥＤＴＡに緩衝液交換し、約３．２ｍｇ／ｍｌに濃縮した。

【0284】

ヒトＫＬＫ２は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標）（カタログ番号４１０４－ＳＥ－０１０）から活性タンパク質として供給された。

【0285】

ヒトＫＬＫ４は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標）（カタログ番号１７１９－ＳＥ）からプロフォームとして供給され、以下のように活性化された。ヒトプロＫＬＫ４を、５０ｍＭトリス、１０ｍＭ ＣａＣｌ_２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５中で２００μｇ／ｍＬに希釈し、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標）（カタログ番号３０９７－ＺＮ）から供給される細菌サーモリシンを同じ緩衝液で２μｇ／ｍＬに希釈した。等量のプロヒトＫＬＫ４とサーモリシンを合わせ、室温で１０分間インキュベートして活性化させた。ＥＤＴＡで反応を停止し、最終濃度を１０ｍＭにした。

【0286】

例２：ＫＬＫ５での免疫化による抗体の産生
雌ニュージーランドホワイトウサギ（２ｋｇ超）に、等量の完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ（商標））と混合した１００μｇの０．４ｍｇ／ｍＬのヒト活性ＫＬＫ５及びヒト活性ＫＬＫ７（例１に従って発現）による皮下免疫化を行った。動物に、等量の不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ（商標））と混合した１００μｇの同じ免疫原を含むブースト注射を２１日間隔で行った。最終ブーストの１４日後に脾臓、骨髄及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単一細胞懸濁液を調製し、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）中の１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で－８０℃で凍結した時点で終了とした。

【0287】

Ｂ細胞培養物を、Ｔｉｃｋｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５ Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ：２０（４），４９２－４９７に記載されている方法と同様の方法を用いて調製した。手短に言えば、免疫化動物由来のリンパ節細胞、脾細胞又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、１０％ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（商標））、２％ＨＥＰＥＳ溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（商標））、２％Ｌ－グルタミン溶液（Ｇｉｂｃｏ（商標））、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ（商標））、０．２％Ｎｏｒｍｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ（商標））、０．１％β－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ（商標））を補充した２００μｌ／ウェルＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ（商標））を含むバーコード化９６ウェル組織培養プレートにおいて、Ｂ細胞刺激上清（ＢＳＳ）の存在下又は非存在下で、ＣＤ４０Ｌ及びＩＬ－２を発現する支持細胞を使用して、ウェル当たり２０００細胞の密度で培養した。有糸分裂促進剤であるＰｈｏｒｂｏｌ－１２－ミリスタート－１３－アセタート（ＰＭＡ）及びフィトヘマグルチニン－Ｌ（ＰＨＡ－Ｌ）の存在下でＰＢＭＣを６日間培養することによってＢＳＳを生成し、上清を回収する。プレートを３７℃及び５％ＣＯ_２で６日間インキュベートした。全ての免疫化動物由来のＢ細胞を使用して培養物をセットアップし、合計で約１×１０^９個のＢ細胞をスクリーニングした。

【0288】

６日後、標的抗原源としてビオチン化ヒトＫＬＫ５でコーティングしたＳｏｌ－Ｒ２ストレプトアビジンビーズ（ＴＴＰ Ｌａｂｔｅｃｈ（商標））及びカウンタースクリーニングのために関連ＫＬＫ７でコーティングしたＳｏｌ－Ｒ４ストレプトアビジンビーズ（ＴＴＰ Ｌａｂｔｅｃｈ（商標））を使用した多重均一蛍光ベースの結合アッセイによって、ヒトＫＬＫ５（例１のように生成）への結合について上清をスクリーニングした。Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ－Ｌｉｎｋ Ｒａｐｉｄ Ｂｉｏｔｉｎ Ｔｙｐｅ Ｂ（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ（商標））を使用して、提供者のプロトコルと比較して５倍モル過剰のタンパク質を使用してタンパク質をビオチン化し、全てのリジン残基の完全な修飾を回避した。バーコード化９６ウェル組織培養プレートからの合計１０μＬの上清を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｒａｖｏリキッドハンドラを使用して、上記のようなビオチン化ＫＬＫ被覆Ｓｏｌ－Ｒビーズ及びＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗ウサギＦｃ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（商標））を含有するバーコード化３８４ウェル黒色壁アッセイプレートに移した。１時間のインキュベーション後、プレートをミラーボール機器（ＴＴＰ－Ｌａｂｔｅｃｈ（商標））で読み取った。

【0289】

一次スクリーニングに続いて、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＢｉｏｍｅｋＮＸＰ（商標）ヒットピッキングロボットを使用して、ＫＬＫ５への結合について陽性の上清を、９６ウェルバーコード化マスタープレート上に固定し、細胞培養プレートのＢ細胞を－８０℃で凍結した。最初に、蛍光マイクロボリュームアッセイ技術（ＦＭＡＴ）によって、固定された上清を再スクリーニングして、ヒトＫＬＫ５への結合を確認した。手短に言えば、１０μＬの上清をバーコード化黒色グライナープレートに移した。５０μＬ／プレートの１０μｍスーパーアビジン（Ｂａｎｇｓ Ｂｅａｄｓ（商標））をヒトビオチン化ＫＬＫ５でコーティングし、Ａｌｅｘａ－６４７（商標）ヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｆｃ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（商標））と混合した。次いで、上清を添加し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ８２００でプレートを読み取った。

【0290】

複数の抗体がＫＬＫ５に結合すると同定され、その後、ＫＬＫ５を特異的に阻害する能力及び他のカリクレインを超えるＫＬＫ５に対する特異性について調査した。

【0291】

例３：ＫＬＫ５阻害抗体の同定
複合体Ｂ細胞上清中に存在するプロテアーゼ及びプロテアーゼ阻害剤のうち、ＫＬＫ５活性を特異的に阻害することができる抗体を同定するために、スクリーニングアッセイを開発した。Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ｂｌａｃｋ ３８４（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（商標））を、炭酸緩衝液中１０μｇ／ｍＬのＦ（ａｂ’）_２断片ヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｆｃ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（商標））でコーティングし、４℃で一晩放置した。プレートをＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＢｉｏｔｅｋ（商標）プレートウォッシャで３回洗浄し、２０μＬ／ウェルＰＢＳ／１％ＢＳＡで室温で１時間ブロックした。次いで、Ｂ細胞上清をプレートに添加し、阻害についての陽性対照として２５μＬの１ｎＭ ＬＥＫＴＩ Ｄ５ウサギＦｃ融合タンパク質を対照ウェルに添加し、阻害についての陰性対照としてアッセイ緩衝液Ａ（５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．６）を対照ウェルの別個のセットに添加した。プレートを室温で一晩インキュベートし、次いでＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＢｉｏｔｅｋ（商標）プレートウォッシャで３回洗浄した。アッセイ緩衝液Ａ中の１０μＬの２５０ｐＭヒトＫＬＫ５を各ウェルに添加し、プレートを室温で一晩インキュベートして完全に会合させた。アッセイ緩衝液Ａ中のＢｏｃ－ＶＰＲ－ＡＭＣ基質（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（商標））を最終濃度６００μＭまでウェルに添加し、ＰＨＥＲＡＳｔａｒ ＦＳＸ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ（商標））プレートリーダを使用して４時間後に蛍光（λ_ｅｘ３８０ｎｍ λ_ｅｍ４３０ｎｍ）を決定した。

【0292】

データを分析して、以下の式を使用してＫＬＫ５活性の阻害率を決定した。

【数1】

【0293】

試験が試験抗体についての蛍光値である場合、陽性は、阻害ウェルについての陽性対照の蛍光値の平均であり、陰性は、阻害ウェルについての陰性対照の平均蛍光値である。

【0294】

４０％超の阻害を示した上清をヒットとみなした。これは、スクリーニングされた上清の全ての約４％に達した。これらの抗体を可変領域回収のために選択した。

【0295】

特異的抗体分泌細胞を同定して、活性化Ｂ細胞の異種集団から抗体可変領域遺伝子を回収することを可能にするために、デコンボリューション工程を実施しなければならなかった。蛍光フォーカス法（Ｃｌａｒｇｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４）を使用した。手短に言えば、ビオチン化ヒトＫＬＫ５で被覆したストレプトアビジンビーズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（商標））及びヤギ抗ウサギＦｃ断片特異的ＦＩＴＣコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（商標））の存在下、抗体分泌細胞を３７℃で１時間、静的にインキュベートした。次いで、抗原特異的抗体分泌細胞を、それらを取り囲む蛍光ハローから同定した。次いで、オリンパス製の顕微鏡を使用して同定した複数のこれらの個々のＢ細胞クローンを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）マイクロマニピュレータで採取し、ＰＣＲチューブに入れた。単一細胞からのｃＤＮＡを標準的なＲＴ－ＰＣＲによって得て、重鎖及び軽鎖の可変免疫グロブリン配列の後続のＰＣＲを、免疫グロブリン遺伝子特異的プライマーを使用して行い、続いて重複ベクター部位を組み込んだネステッドＰＣＲを行って、ウサギＩｇＧ（ＶＨ）又はウサギκ（ＶＬ）哺乳動物発現ベクターに可変領域を直接クローニングさせた。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））及び１２５ｍｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒ（商標）フラスコ中で３０ｍｌの容量で発現させた組換え抗体を使用して、重鎖及び軽鎖構築物をＥｘｐｉＨＥＫ－２９３細胞に同時トランスフェクトした。５～７日の培養後、上清を回収し、抗体を、ＡＫＴＡ純粋クロマトグラフィーシステムを使用したプロテインＡ親和性捕捉によって精製した。１ｍｌのプロテインＡ ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をシステムに取り付け、カラムをＰＢＳ ｐＨ７．４で平衡化した後、細胞培養上清を０．２５ｍｌ／分の流速でカラムにアプライした。次いで、カラムをＰＢＳ ｐＨ７．４で洗浄し、結合した材料をクエン酸ナトリウムｐＨ３．４で溶出し、適切な体積の２Ｍトリス塩酸ｐＨ８．５で中和した。溶出画分をＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）ｐＨ７．４に緩衝液交換し、０．２２μｍフィルターに通した。最終精製材料を、Ａ２８０スキャン、ＳＥ－ＵＰＬＣ（ＢＥＨ２００法）、及びＰＴＳ Ｅｎｄｏｓａｆｅシステムを使用してエンドトキシンについてアッセイした。

【0296】

この分析から、ウサギ抗体１０２３６及び１０２７３は強力な阻害を示し、更なる特徴付けのために選択した。

【0297】

例４：ＫＬＫ５特異的阻害抗体の同定
次いで、精製したウサギ抗体１０２３６及び１０２７３をスクリーニングして、ＫＬＫ５に対する阻害活性を確認し、マウス及びカニクイザルＫＬＫ５及びＫＬＫ７と共にＫＬＫ２、ＫＬＫ４及びＫＬＫ７を含むヒト配列カリクレインファミリーメンバーのパネルを使用することによってＫＬＫ５に対する特異性を決定した。６００ｎＭ～２０ｐＭの範囲を有する１０点の半対数希釈系列を各抗体について調製し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＦＸ（商標）及びＭｕｌｔｉｄｒｏｐ Ｓｙｓｔｅｍを使用して５ｕＬを黒色３８４ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（商標）、カタログ番号３５７５）に移した。１５μＬの活性組換えカリクレインタンパク質を関連するウェルに添加して、以下の最終アッセイ濃度であるアッセイ緩衝液Ａ（５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２００μＭ ＥＤＴＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．６）中の６０ｐＭヒトＫＬＫ５、２５０ｐＭヒトＫＬＫ７、５００ｐＭヒトＫＬＫ２、３０ｐＭヒトＫＬＫ４、３０ｐＭカニクイザルＫＬＫ５、５００ｐＭカニクイザルＫＬＫ７、３０ｐＭマウスＫＬＫ５又は１０ｎＭマウスＫＬＫ７を達成した。対照として、２０μＬのアッセイ緩衝液Ａを０％の活性のためにウェルに添加し、阻害に対する陽性対照として、ＬＥＫＴＩ Ｄ５ウサギＦｃを同じ抗体濃度範囲で使用し、５μＬのアッセイ緩衝液Ａ中の１５μＬのヒトＫＬＫ５を１００％の活性のために使用した。プレートを室温で一晩インキュベートした後、マルチドロップデバイスを使用して以下のペプチド基質、ヒトＫＬＫ５（３００μＭ）、ヒトＫＬＫ２（３０μＭ）、マウスＫＬＫ５（３００μＭ）及びカニクイザルＫＬＫ５（４５０μＭ）についてはＢｏｃ－ＶＰＲ－ＡＭＣ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（商標））、ヒト及びカニクイザルＫＬＫ７（それぞれ９０μＭ及び１５０μＭ）についてはＫＨＬＦ－ＡＭＣ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（商標））、ヒトＫＬＫ４（２００μＭ）についてはＰＦＲ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標））、並びにマウスＫＬＫ７（１５０μＭ）についてはＭｃａ－ＲＰＫＰＶＥ－Ｎｖａｌ－ＷＲＫ（Ｄｎｐ）－ＮＨ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標））を添加した。試料を４時間インキュベートし、Ｂｏｃ－ＶＰＲ－ＡＭＣ、ＰＦＲ－ＡＭＣ及びＫＨＬＦ－ＡＭＣについてはλ_ｅｘ３８０ｎｍ及びλ_ｅｍ４３０ｎｍで、Ｍｃａ－ＲＰＫＰＶＥ－Ｎｖａｌ－ＷＲＫ（Ｄｎｐ）－ＮＨ２についてはλ_ｅｘ３２０ｎｍ及びλ_ｅｍ４００ｎｍで、Ｐｈｅｒａｓｔａｒ ＦＳＸプレートリーダ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ（商標））で読み取った。データを分析して、例３に記載の阻害率を決定した。データを試験抗体の濃度に対してプロットし、４パラメータシグモイドをフィッティングしてＩＣ５０（Ｇｅｎｅｄａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ（商標））を決定した。

【0298】

ウサギ抗体１０２３６に加えて、この測定について、抗体１０２３６及び１０２７３のウサギ可変領域のポリヌクレオチド配列を、Ｓ１７１Ｃ変異を含むマウスＣカッパベクターの改変版にクローン化して、ウサギＶＫ軽鎖に見られマウス定常領域に存在しない追加のジスルフィド結合を再現した（ウサギ抗体１０２７３ ｍＩｇＧについては配列番号１５５及び１５６、ウサギ抗体１０２３６ ｍＩｇＧについては配列番号１５９及び１６０）。これにより、ウサギ抗体１０２３６ ｍＩｇＧについては配列番号１５７及び１５８、ウサギ抗体１０２７３ ｍＩｇＧについては配列番号１５３及び１５４を含む抗体が得られた。

【0299】

ウサギ抗体１０２３６及び１０２７３ ｍＩｇＧは、ヒトＫＬＫ５の強力な阻害を示し、試験した他のヒトファミリーメンバー（ヒトＫＬＫ２、４及び７）に対して活性（すなわち、例２の選択基準による４０％閾値未満）はなかった。カニクイザルＫＬＫ７ではなく、カニクイザルＫＬＫ５の強力な阻害も実証された。マウスＫＬＫ５又はＫＬＫ７のいずれに対しても阻害活性は明らかではなかった。ウサギ抗体１０２３６、１０２７３及びＬＥＫＴＩ Ｄ５ウサギＦｃについてのＩＣ_５０結果を表２に示す。

【表2】

【0300】

例５：ＫＬＫ５特異的Ａｂの親和性の決定
ヒトＫＬＫ５に結合するマウスＩｇＧ分子の動態を、２５℃での表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００）によって評価した。

【0301】

ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、アミンカップリング化学を介してＣＭ５センサーチップ上に約７０００ＲＵのレベルまで固定化した。各分析サイクルは、抗Ｆｃ表面への抗ＫＬＫ５ ＩｇＧ分子の捕捉、３０μｌ／分で３００秒間のＫＬＫ５分析物（本発明者らが調製）の注入、続いて６００秒間の解離からなった。各サイクルの終わりに、５０ｍＭ ＨＣｌの６０秒間の注入、続いて５ｍＭ ＮａＯＨの３０秒間の注入及び５０ｍＭ ＨＣｌの最終６０秒間の注入を用いて、１０μＬ／分の流速で表面を再生した。ＮａＣｌを補充したＨＢＳ－ＥＰ＋ランニング緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中２０ｎＭ～０．２５ｎＭ（４×３倍連続希釈）で最終濃度３００ｍＭまでヒトＫＬＫ５を滴定した。器具のノイズ及びドリフトを差し引くために、緩衝液ブランク注入を含めた。

【0302】

Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して１：１結合モデルを使用して速度論的パラメータを決定した。

【0303】

ウサギ抗体１０２３６及び１０２７３の親和性を表３に示す。

【表3】

【0304】

例６：抗体１０２７３の特徴付け
ウサギ抗体１０２７３のＫＬＫ５－ＰＡＲ２細胞アッセイ
ＫＬＫ５は、ケラチノサイトの表面でプロテアーゼ活性化受容体－２（ＰＡＲ２）受容体を活性化することが示されている（Ｋ．Ｏｉｋｏｎｏｍｏｐｏｕｌｏｕ ｅｔ ａｌ．Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ：ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（ＰＡＲ）．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，３８７（２００６），ｐｐ．８１７－８２４）。これにより、ＮＦＫＢによって駆動される炎症カスケード、及びＴＳＬＰなどの関連するサイトカインの放出がもたらされる。

【0305】

ＰＡＲ２はＧｑ共役Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）であるため、活性化はホスホリパーゼのシグナル伝達及びイノシトール一リン酸（ＩＰ－１）の生成をもたらす。組換えＫＬＫ５への曝露によるＨａＣａｔケラチノサイト上に発現される内因性ＰＡＲ２の活性化を、Ｃｉｓｂｉｏ製アッセイキットを使用したＩＰ１の検出によって監視した。

【0306】

コンフルエントなＨａＣａｔ細胞を回収し、３８４ Ｆｌｕｏｂｌｏｃｋプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（商標））に１０，０００細胞／ウェルで播種し、ＤＭＥＭ培地＋１０％ＦＢＳ＋２ｍＭ Ｌ－グルタミン＋ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））中、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩培養し、その後、ＩＰ－Ｏｎｅ Ｇｑアッセイプロトコル（Ｃｉｓｂｉｏ（商標））に従って処理した。試験する抗体を、２μＭの最高濃度から１×刺激緩衝液（ＩＰ－Ｏｎｅ Ｇｑアッセイキット、Ｃｉｓｂｉｏ（商標））で段階希釈し、２００ｎＭヒト組換えＫＬＫ５の存在下、３７℃で１時間インキュベートした。抗体／ＫＬＫ５混合物をＨａＣａｔ細胞に添加し、イノシトール１リン酸（ＩＰ１）をＩＰ－Ｏｎｅ Ｇｑアッセイプロトコルに従って検出し、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏプレートリーダで６６５ｎＭ及び６２０ｎＭで蛍光を読み取った。

【0307】

抗体１０２７３は、ＫＬＫ５処理ＨａＣａｔ細胞からのＩＰ１放出をほぼ完全に阻害することができ（図１）、ＩＰ１放出の同様の最大阻害を示したが、ＬＥＫＴＩタンパク質と比較してより大きな効力を示した。

【0308】

抗体１０２７３の作用機序
非競合的酵素阻害剤は、酵素の活性を低下させるが、基質の存在下又は非存在下で酵素に等しく良好に結合することができる。阻害剤及び基質は両方とも酵素に同時に結合することができるが、切断された生成物を形成することができず、酵素－基質－阻害剤複合体は酵素－基質又は酵素－阻害剤複合体のいずれかに分解することしかできない。非競合的阻害剤では、阻害速度は基質濃度の増加によって影響されない。

【0309】

抗体１０２７３又はＬＥＫＴＩ－Ｄ５ Ｆｃタンパク質を、ＫＬＫ５に対するＩＣ５０の３００、３０又は３倍のいずれかでアッセイ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス、２００μＭ ＥＤＴＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．６）中で調製した（上記参照）。１０μＬの抗体をＣｏｒｎｉｎｇ低結合性黒色低フランジ３８４ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標））に添加した。３０ｍＭ～３００μＭのＢｏｃ－ＶＰＲ－ＡＭＣ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（商標））の５段階希釈物１０μＬをプレートに添加した。Ｐｈｅｒａｓｔａｒ ＦＳＸプレートリーダ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ（商標））を使用して、１０μＬの１．８ｎＭ ＫＬＫ５（Ｂｏｃ－ＶＰＲ－ＡＭＣは１ｍＭ未満）又は１８０ｐＭ ＫＬＫ５（Ｂｏｃ－ＶＰＲ－ＡＭＣは１ｍＭ超）のいずれかの注入を介して反応を同時に開始し、３０秒ごとに蛍光（λｅｘ３８０ｎｍ λｅｍ４３０ｎｍ）を監視した。最終反応条件は、抗体１０２７３又はＬＥＫＴＩ－Ｄ５ Ｆｃタンパク質を、（上記のように）決定されたＫＬＫ５に対するＩＣ５０の１００、１０又は１倍で含み、Ｂｏｃ－ＶＰＲ－ＡＭＣの段階希釈液は１０ｍＭ～１００μＭであり、６０又は６００ｐＭ ＫＬＫ５であった。抗体又はＫＬＫ５をアッセイ緩衝液で置換することによって陰性対照を調製した。

【0310】

各時点でのバックグラウンド蛍光を差し引き、蛍光を時間に対してプロットすることによってデータを分析した。データを以下の式に当てはめた（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）。

【数2】

【0311】

これにより、観察された時間依存性阻害率ｋ_ｏｂｓを決定することができ、ここでｖ_ｉは初期反応速度であり、ｖ_ｓは最終速度である。阻害機構を決定するために、基質濃度に対してｋ_ｏｂｓの値をプロットした（図２）。

【0312】

抗体１０２７３によるＫＬＫ５の阻害速度は、基質濃度の増加と共に変化せず、抗体１０２７３がＫＬＫ５の非競合的阻害剤であることを実証した（図２Ａ）。ＬＥＫＴＩ－Ｄ５ Ｆｃタンパク質は、基質濃度の増加に伴う阻害速度の減少を示し、競合的な作用機序を実証する（図２Ｂ）。

【0313】

抗体１０２７３の存在下でのＫＬＫ５へのＬＥＫＴＩ結合
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験を実施して、抗体１０２７３がヒトＫＬＫ５への結合についてＬＥＫＴＩ Ｄ５タンパク質と競合するかどうかを決定した。これらのアッセイにより、ＬＥＫＴＩ Ｄ５ Ｆａｂ融合物のＫＬＫ５タンパク質単独に対する親和性と、抗体１０２７３と複合体化したヒトＫＬＫ５に対する親和性を比較することができた。

【0314】

Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標））を使用して、ヒトＫＬＫ５へのＬＥＫＴＩ Ｄ５ Ｆａｂ融合タンパク質の結合の速度論的測定を得た。表面を調製するために、ＣＭ５チップ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標））を、最初にＥＤＣ／ＮＨＳ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標））の混合物の５分間の注入（３０μＬ分^－１）、続いて酢酸緩衝液、ｐＨ５．０中の１００μｇ ｍＬ^－１のＬＥＫＴＩ Ｄ５ Ｆａｂ融合物（ＵＣＢ）（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標））の注入で活性化し、チップ表面上に８０ＲＵ固定化ＬＥＫＴＩ Ｄ５ Ｆａｂ融合物を得た。最後に、１Ｍ塩酸エタノールアミン－ＮａＯＨ、ｐＨ８．５の注入を利用して表面を不活性化した。次いで、ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標））中のヒトＫＬＫ５の濃度を０．３２ｎＭから３２ｎＭに増加させて、単一サイクル動態モードで注入した。緩衝液のみの注入から得られた値を、ＫＬＫ５注入について得られた値から差し引いて、ＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウェア（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標））の１：１結合モデルに当てはめることによって動態を決定した。

【0315】

ヒトＫＬＫ５がウサギ抗体１０２７３によって結合された場合に、ヒトＬＥＫＴＩがヒトＫＬＫ５に結合することができるかどうかを決定するために、例４に記載したように、ヤギ抗ウサギＦｃポリクローナルを使用して抗体捕捉表面を調製し、次いで、Ａｂ１０２７３を補足した。次いで、表面が飽和に達するまで２０ｎＭのヒトＫＬＫ５を注入した。次いで、ＬＥＫＴＩ Ｄ５ Ｆａｂ融合タンパク質（例１に記載されるように産生される）を３０ｐＭ～１００ｎＭの濃度で注入した。緩衝液のみを注入した値を、分析物で得られた値から最初に差し引いた後、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）評価ソフトウェア（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標））における１：１結合速度論モデルにフィッティングした。

【0316】

参照として、ヒトＫＬＫ５との相互作用を監視する前に、ＬＥＫＴＩ Ｄ５ Ｆａｂ融合タンパク質をチップ表面に固定化した。ヒトＬＥＫＴＩ Ｄ５ Ｆａｂ融合タンパク質は、ヒトＫＬＫ５が既にウサギ抗体１０２７３と複合体を形成している場合、１９．７ｎＭの親和性でヒトＫＬＫ５に結合することができた（表４）。ウサギ抗体１０２７３の非存在下でのヒトＫＬＫ５に対するヒトＬＥＫＴＩの親和性はより高い（４０ｐＭ）が、この分析により、ヒトＬＥＫＴＩの存在下又は非存在下でヒトＫＬＫ５に結合することにより、ウサギ抗体１０２７３がヒトＫＬＫ５に更なる阻害活性を提供することができることが実証される。

【表4】

【0317】

ＬＥＫＴＩ－ＫＬＫ５－抗体１０２７３複合体形成
ＫＬＫ５は、Ｎ末端のＴＥＶ切断可能な８ｘＨｉｓタグを有する分泌タンパク質としてＨＥＫ２９３細胞で産生された。タンパク質を最初に、馴化培地からＮｉ^２＋アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ＫＬＫ５を含有するＮｉ^２＋カラムからの画分をプールし、ＴＥＶプロテアーゼで消化してＨｉｓタグを除去し、次いで、第２のＮｉ親和性工程を実施してＴＥＶプロテアーゼを除去し、切断されたＫＬＫ５をカラムに流した。第２のＮｉ^２＋カラムからのフロースルー画分を濃縮し、５０ｍＭトリスｐＨ７、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５％グリセロール中のサイズ排除カラムで実行した。ＳＥＣからのＫＬＫ５画分をプールし、約１０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、－８０℃で保存した。

【0318】

配列番号１７３によるＬＥＫＴＩドメイン５（ＬＥＫＴＩ Ｄ５ Ｆｃ ＴＥＶ）及び配列番号１７４によるＬＥＫＴＩドメイン８（ＬＥＫＴＩ Ｄ８ Ｆｃ ＴＥＶ）は、Ｃ末端のＴＥＶ切断性Ｆｃタグを有する分泌タンパク質としてＨＥＫ２９３細胞において産生された。これらのタンパク質を、プロテインＡビーズ上に馴化培地を通過させることによって精製した。結合したタンパク質を０．１Ｍクエン酸、ｐＨ２．０で溶出し、画分を２Ｍトリス塩酸、ｐＨ８．５の添加によって中和した。ＬＥＫＴＩドメイン５又はドメイン８のいずれかを含有するプロテインＡカラムからの画分をプールし、ＦｃタグをＴＥＶプロテアーゼで除去して、ＬＥＫＴＩ Ｄ５又はＬＥＫＴＩ Ｄ８を得た。切断されたタンパク質をサイズ排除クロマトグラフィーのために約１５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。ＳＥＣはＰＢＳ、ｐＨ７．２中で行った。ＬＥＫＴＩ含有画分をプールし、約１０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、－８０℃で凍結保存した。

【0319】

ウサギＦａｂ抗体１０２７３を分泌タンパク質としてＨＥＫ２９３細胞で発現させた。配列番号１６６及び１６８を含む発現構築物を１：１のモル比で共トランスフェクトした。分泌されたＦａｂ（配列番号１６５及び１６７を含む）を、馴化培地をプロテインＧビーズ上に通過させることによって精製し、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７で溶出した。画分を２Ｍトリス塩酸、ｐＨ８．５の添加によって中和した。タンパク質をＰＢＳ、ｐＨ７．２に透析し、次いで約１０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、－８０℃で凍結保存した。

【0320】

最初に２５μＭのＫＬＫ５を２５μＭのＬＥＫＴＩ Ｄ５又はＬＥＫＴＩ Ｄ８と共に氷上で６０分間インキュベートし、次いで２５μＭのウサギＦａｂ抗体１０２７３を添加し、氷上で更に６０分間インキュベートすることによってＫＬＫ５、ＬＥＫＴＩ Ｄ５又はＬＥＫＴＩ Ｄ８、及びウサギＦａｂ抗体１０２７３の複合体を形成した。ＰＢＳ、ｐＨ７．２で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００サイズ排除カラムに混合物を注入し、これをＨＰＬＣに連続して接続した。ピーク画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析のために収集した。図３Ａ及び図３Ｂは、ヒトＫＬＫ５単独（実線トレース、右端）、ウサギＦａｂ抗体１０２７３単独（点線トレース）、ヒトＫＬＫ＋ＬＥＫＴＩ Ｄ５又はＤ８の二成分複合体（それぞれ図３Ａ又は図３Ｂ、長い破線）、及びＫＬＫ５＋ＬＥＫＴＩ Ｄ５又はＤ８＋ウサギＦａｂ抗体１０２７３の三成分複合体（それぞれ図３Ａ又は図３Ｂ、短い破線、左端）のＳＥＣクロマトグラムを示す。

【0321】

図４Ａ及び４Ｂに示すように、各ピークの成分の分子量（ＭＷ）をＳＤＳ ＰＡＧＥによって確認した。

【0322】

ＫＬＫ５、ＬＥＫＴＩ Ｄ５又はＬＥＫＴＩ Ｄ８とウサギＦａｂ抗体１０２７３との間の複合体は、ヒトＫＬＫ５を各ＬＥＫＴＩ断片と個別に混合し、次いで、二成分複合体をウサギＦａｂ抗体１０２７３とインキュベートすることによって、１：１：１の比で混合すると容易に形成した。ＳＥＣ上及びピーク画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥによって二成分複合体及び三成分複合体が観察され、これらが安定であり、他の種からの単離／精製に適していることが示された。

【0323】

例７：ＫＬＫ５／Ｆａｂ抗体１０２７３／Ｆａｂ抗体１０２３６複合体の結晶化
結晶学研究のために、５ｍＭの最終濃度でキフネンシン（Ｓｉｇｍａ（登録商標））を添加して、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現系（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））を製造者のプロトコルに従って使用する一過性トランスフェクションによってヒトＫＬＫ５を発現させた。キフネンシンは、マンノシダーゼＩ酵素の強力な阻害剤であり、主に高マンノース糖タンパク質を産生するために細胞培養において使用される。

【0324】

ＫＬＫ５の発現中、タンパク質は自己活性化して、上清中に活性ＫＬＫ５タンパク質（配列番号１４２又は配列番号１４４の残基Ｉ６７～Ｓ２９３（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ９Ｙ３３７ナンバリング））をもたらす。トランスフェクションの５日後に細胞を回収し、精製のために上清を直ちに使用した。ヒトＫＬＫ５を含む上清を緩衝液Ａ（５０ｍＭトリスｐＨ７．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ）で４倍希釈し、ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰ陽イオン交換カラムにロードした。結合したタンパク質を、１０カラム容量にわたって緩衝液Ｂ（５０ｍＭトリスｐＨ７．０、１Ｍ ＮａＣｌ）勾配で溶出した。精製ヒトＫＬＫ５を含有する分画をプールし、濃縮し、ｐＨ７．２の２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化したＳ２００ ２６／６０でのサイズ排除クロマトグラフィーによって更に精製した。ＫＬＫ５はＳＤＳ－ＰＡＧＥによって特徴付けられ、高マンノースグリコシル化タンパク質の予想分子量（ＭＷ）約３５～３８ｋＤａと一致するゲル上の位置に移動した。

【0325】

次いで、ヒトＫＬＫ５タンパク質を１：１００の比でエンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）タンパク質で処理し、４℃で一晩インキュベートして、構造研究のために均一な脱グリコシル化ＫＬＫ５タンパク質を形成した。エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）は、ストレプトマイセス・プリカタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｌｉｃａｔｕｓ）からクローニングされ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で過剰発現される組換えグリコシダーゼである。Ｅｎｄｏ Ｈは、高マンノースのキトビオースコア及びＮ結合型糖タンパク質由来の限られた数のハイブリッドオリゴ糖を切断する。Ｅｎｄｏ Ｈは複合グリカンを切断しない。酵素的切断は、オリゴ糖のジアセチルキトビオースのコア中の２つのＮ－アセチルグルコサミン残基の間であり、アスパラギン上に１つのＮ－アセチルグルコサミン残基を残す。この工程は、均質なヒトＫＬＫ５が結晶学的研究に利用可能であることを確実にするために実行された。ＫＬＫ５はＳＤＳ－ＰＡＧＥによって特徴付けられ（図５）、脱グリコシル化タンパク質の予想分子量（ＭＷ）約２５ｋＤａと一致するゲル上の位置に移動した。

【0326】

ウサギＦａｂ抗体１０２７３を例６に記載されるように発現させた。ウサギＦａｂ抗体１０２３６（配列番号１８１及び１８３を含む）を、ウサギＦａｂ抗体１０２７３について記載されるように発現させた。手短に言えば、配列番号１８２及び１８４を含む発現構築物を１：１のモル比で共トランスフェクトした。分泌されたＦａｂタンパク質のそれぞれを、馴化培地をプロテインＧビーズ上に通過させることによって精製し、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７で溶出した。画分を２Ｍトリス塩酸、ｐＨ８．５の添加によって中和した。それぞれの個々のタンパク質をＰＢＳ、ｐＨ７．２に透析し、約１０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、－８０℃で凍結保存した。

【0327】

１：１．５：１．５のヒトＫＬＫ５／ウサギＦａｂ抗体１０２７３／ウサギＦａｂ抗体１０２３６複合体を作製し、４℃で一晩インキュベートし、サイズ排除クロマトグラフィー（２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２溶出緩衝液）によって精製した。複合体を含有する単一のピークを結晶化前に約１０．８ｍｇ／ｍｌに濃縮した。

【0328】

いくつかの市販の結晶化スクリーニングを使用して、ヒトＫＬＫ５／ウサギＦａｂ抗体１０２７３／ウサギＦａｂ抗体１０２３６複合体の結晶化条件を同定した。これらは、Ｓｗｉｓｓｃｉ ９６ウェル２液滴ＭＲＣ結晶化プレート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ、カタログ番号ＭＤ１１－００－１００から供給）を使用して、シッティングドロップ形式で実施した。最初に、Ｍｉｃｒｏｌａｂ ＳＴＡＲ液体処理システム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を使用して、スクリーン中の各結晶化溶液７５μＬをリザーバに充填した。次いで、Ｍｏｓｑｕｉｔｏリキッドハンドラ（ＴＴＰ ＬａｂＴｅｃｈ）を使用して、３００ｎＬのヒトＫＬＫ５／ウサギＦａｂ抗体１０２７３／ウサギＦａｂ抗体１０２３６複合体及び３００ｎＬのリザーバ溶液を結晶化プレートのウェルに分注した。ＭＩＤＡＳ＋ＨＴ－９６スクリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ、カタログ番号ＭＤ１－１０７）の条件１６（ウェルＢ４）で単結晶が得られた。この条件は、４５％ｖ／ｖのペンタエリスリトールプロポキシラート（５／４）、０．２Ｍ ＮａＣｌ及び０．１Ｍ ＭＥＳ一水和物ｐＨ６．０を含有する。結晶を液体窒素中で急速冷凍し、回折データをビームラインＩ０３（Ｄｉａｍｏｎｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ、英国）で収集した。データを指数化し、ＸＤＳ（Ｋａｂｓｃｈ，Ｗ．ＸＤＳ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６６，１２５－１３２（２０１０））を使用して統合した後、ＡＩＭＬＥＳＳ（２．Ｅｖａｎｓ ＰＲ，Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ ＧＮ．Ｈｏｗ ｇｏｏｄ ａｒｅ ｍｙ ｄａｔａ ａｎｄ ｗｈａｔ ｉｓ ｔｈｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ？Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２０１３；６９（Ｐｔ７）：１２０４－１２１４）を使用してスケーリングした。ヒトＫＬＫ５／ウサギＦａｂ抗体１０２７３／ウサギＦａｂ抗体１０２３６複合体構造を、Ｐｈｅｎｉｘソフトウェア一式（Ａｄａｍｓ ＰＤ，Ａｆｏｎｉｎｅ ＰＶ，Ｂｕｎｋｏｃｚｉ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｐｈｅｎｉｘ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１１；５５（１）：９４－１０６）のＰｈａｓｅｒ（ＭｃＣｏｙ，Ａ．Ｊ．，Ｇｒｏｓｓｅ－Ｋｕｎｓｔｌｅｖｅ，Ｒ．Ｗ．，Ａｄａｍｓ，Ｐ．Ｄ．，Ｗｉｎｎ，Ｍ．Ｄ．，Ｓｔｏｒｏｎｉ，Ｌ．Ｃ．，＆Ｒｅａｄ，Ｒ．Ｊ．Ｐｈａｓｅｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．（２００７）．４０，６５８－６７４）を用いた分子置換によって解明した。この手順では、ＫＬＫ５構造２ＰＳＸ（Ｄｅｂｅｌａ Ｍ，Ｇｏｅｔｔｉｇ Ｐ，Ｍａｇｄｏｌｅｎ Ｖ，Ｈｕｂｅｒ Ｒ，Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ ＮＭ，Ｂｏｄｅ Ｗ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｚｉｎｃ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ５．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００７ Ｎｏｖ ２；３７３（４）：１０１７－３１）及び専売のＦａｂモデルを分子置換鋳型として使用した。許容可能なＲｗｏｒｋ、Ｒｆｒｅｅ及びラマチャンドラン統計（Ｍｏｌｐｒｏｂｉｔｙ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．（２０１８）ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙ：Ｍｏｒｅ ａｎｄ ｂｅｔｔｅｒ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｄａｔａ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｌｌ－ａｔｏｍ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７：２９３－３１５）で分析した場合）が得られるまで、Ｃｏｏｔ（Ｐ．Ｅｍｓｌｅｙ；Ｂ．Ｌｏｈｋａｍｐ；Ｗ．Ｇ．Ｓｃｏｔｔ；Ｃｏｗｔａｎ（２０１０）．“Ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｏｏｔ”．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ．Ｄ６６：４８６－５０１）及びｐｈｅｎｉｘ．ｒｅｆｉｎｅ（Ｔｏｗａｒｄｓ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｐｈｅｎｉｘ．ｒｅｆｉｎｅ．Ｐ．Ｖ．Ａｆｏｎｉｎｅ，Ｒ．Ｗ．Ｇｒｏｓｓｅ－Ｋｕｎｓｔｌｅｖｅ，Ｎ．Ｅｃｈｏｌｓ，Ｊ．Ｊ．Ｈｅａｄｄ，Ｎ．Ｗ．Ｍｏｒｉａｒｔｙ，Ｍ．Ｍｕｓｔｙａｋｉｍｏｖ，Ｔ．Ｃ．Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ，Ａ．Ｕｒｚｈｕｍｔｓｅｖ，Ｐ．Ｈ．Ｚｗａｒｔ，ａｎｄ Ｐ．Ｄ．ＡｄａｍｓＡｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６８，３５２－６７（２０１２））を手動モデル完成及び改良の以下のサイクルで使用した。

【0329】

ヒトＫＬＫ５／ウサギＦａｂ抗体１０２７３／ウサギＦａｂ抗体１０２３６複合体は、結晶非対称単位で観察された。ＣＣＰ４ソフトウェア一式中のＮＣＯＮＴを使用して、Ｆａｂ１０２７３及びＦａｂ１０２３６分子によって認識されるＫＬＫ５上のエピトープを決定した。ＫＬＫ５アミノ酸ナンバリングは、ＵｎｉｔＰｒｏｔＫＢエントリーＱ９ Ｙ３３７に基づいており、括弧内はキモトリプシノゲンに基づく標準的なプロテアーゼナンバリングである。表５は、本発明が最初に記載された時点での精密化統計を示す。

【表5】

【0330】

４Å接触距離でウサギＦａｂ抗体１０２７３によって結合されたヒトＫＬＫ５エピトープは、配列番号１６６を参照して、残基Ｌｅｕ２１２（１６３）、Ｓｅｒ２１３（１６４）、Ｇｌｎ２１４（１６５）、Ｌｙｓ２１５（１４２）、Ａｒｇ２１６（１６７）、Ｇｌｕ２１８（１６９）、Ａｓｐ２１９（１７０）、Ａｌａ２２０（１７１）、Ｐｒｏ２２２（１７３）、Ｇｌｙ２３３（１８４）、Ｐｒｏ２６９（２２３）、Ａｓｎ２７０（２２４）及びＰｒｏ２７２（２２６）から構成され、括弧内の数字はプロテアーゼ命名法に対応する。結合部位を図６により詳細に示す。

【0331】

エピトープの近くにあるが、ヒトＫＬＫ５とウサギＦａｂ抗体１０２７３との間の５Åの接触距離にある他のアミノ酸残基は、配列番号１４２を参照してＡｌａ１８１（１３２）、Ｖａｌ２１１（１６２）、Ｔｙｒ２２１（１７２）、Ａｓｐ２３４（１８５）及びＡｒｇ２７１（２２５）を含み、括弧内の数字はプロテアーゼ命名法に対応する。図７に示すように、抗体１０２３６及び１０２７３は、非常に別個の重複しない結合部位を有し、ヒトＫＬＫ５上の異なるエピトープに結合する。

【0332】

例８：抗体１０２７３のヒト化及び特徴付け
Ａｂ１０２７３のヒト化
ウサギ抗体１０２７３を、ウサギＶ領域からのＣＤＲをヒト生殖細胞系抗体Ｖ領域フレームワークに移植することによってヒト化した。抗体の活性を回復するために、ウサギＶ領域からのいくつかのフレームワーク残基もヒト化配列に保持した。これらの残基は、Ａｄａｉｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．国際公開第９１／０９９６７号）によって概説されたプロトコルを用いて選択した。設計されたヒト化配列と共に、ウサギ抗体（ドナー）Ｖ領域配列とヒト生殖細胞系（アクセプター）Ｖ領域配列とのアラインメントを図８及び９に示す。ドナーからアクセプター配列に移植されたＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ／Ｋａｂａｔの組合せ定義が使用されるＣＤＲ－Ｈ１（Ａｄａｉｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．国際公開第９１／０９９６７号を参照されたい）を除いて、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７）によって定義される通りである。

【0333】

抗体１０２７３については、ヒトＶ領域ＩＧＫＶ１Ｄ－１３＋ＪＫ４Ｊ領域（ＩＭＧＴ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）を軽鎖ＣＤＲのアクセプターとして選択した。ヒト化軽鎖移植片ｇＬ２中のフレームワーク残基は全てヒト生殖細胞系遺伝子由来である（図８）。

【0334】

ヒトＶ領域ＩＧＨＶ３－６６＋ＪＨ６Ｊ領域（ＩＭＧＴ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）を、抗体１０２７３の重鎖ＣＤＲのアクセプターとして選択した。多くのウサギ抗体と同様に、抗体１０２７３のＶＨ遺伝子は、選択されたヒトアクセプターよりも短い。ヒトアクセプター配列とアライメントされた場合、抗体１０２７３のＶＨ領域のフレームワーク１は、ヒト化抗体に保持されているＮ末端残基を欠いている（図９）。１０２７３ウサギＶＨ領域のフレームワーク３はまた、βシート鎖ＤとＥとの間のループに２つの残基（７５及び７６）を欠いており、ヒト化移植片では、ギャップは選択されたヒトアクセプター配列からの対応する残基（リジン７５、Ｋ７５；アスパラギン７６、Ｎ７６）で満たされる（図９）。１０２７３重鎖のヒト化移植片中のフレームワーク残基は全て、ドナー残基バリン（Ｖ２４）、イソロイシン（Ｉ４８）、グリシン（Ｇ４９）、リジン（Ｋ７１）、セリン（Ｓ７３）又はバリン（Ｖ７８）がそれぞれ保持された残基２４、４８、４９、７１、７３及び７８を含む群からの１つ又は複数の残基を除いて、ヒト生殖細胞系遺伝子に由来する。残基Ｇ４９の保持は、ヒト化抗体の完全な効力に必須であった。ＣＤＲＨ３における潜在的な加水分解部位を、１１６位のアスパラギン酸残基をグルタミン酸（Ｄ１１６Ｅ）で置換することによって、移植片ｇＨ３において修飾した。

【0335】

ヒト化１０２７３抗体のｐＩは約６．２である。下流処理中のイオン交換クロマトグラフィーによる不純物の除去を容易にするために、移植片ｇＬ２の配列番号１を参照して、ＣＤＲＬ１中の残基１をグルタミン（Ｑ）からアルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）又はヒスチジン（Ｈ）残基のいずれかに変異させることによってｐＩを増加させた。更に、ＣＤＲＨ３（配列番号６を参照して）の残基１９をアスパラギン酸（Ｄ）からアスパラギン（Ｎ）残基に変異させてｐＩを更に増加させ、予想外に、ＣＤＲＨ３（Ｄ１９Ｎ）の変異もまた、ＫＬＫ５に対する親和性の増加をもたらした。

【0336】

移植片抗体１０２７３ ｇＬ２－Ｑ２４ＲｇＨ１－Ｄ１１６Ｎでは、ＣＤＲ－Ｈ３は６個のチロシン残基を含む。この移植片の変異体を調製し、個々のチロシン残基をフェニルアラニン残基で置換して移植片１０２７３ ｇＬ２－Ｑ１ＲｇＨ１－Ｄ１９Ｎ－Ｙ４Ｆ、１０２７３ ｇＬ２－Ｑ１ＲｇＨ１－Ｄ１９Ｎ－Ｙ６Ｆ、１０２７３ ｇＬ２－Ｑ１ＲｇＨ１－Ｄ１９Ｎ－Ｙ９Ｆ、１０２７３ ｇＬ２－Ｑ１ＲｇＨ１－Ｄ１９Ｎ－Ｙ１２Ｆ、１０２７３ ｇＬ２－Ｑ１ＲｇＨ１－Ｄ１９Ｎ－Ｙ１５Ｆ、１０２７３ ｇＬ２－Ｑ１ＲｇＨ１－Ｄ１９Ｎ－Ｙ１６Ｆを生成した。更なる変異体は、配列番号６を参照して、１５位及び１６位の二重チロシンの前に生じるトレオニンを変異させ、移植片１０２７３ ｇＬ２－Ｑ１ＲｇＨ１－Ｄ１９Ｎ－Ｔ１４Ｖ及び１０２７３ ｇＬ２－Ｑ１ＲｇＨ１－Ｄ１９Ｎ－Ｔ１４Ｓをもたらすことによって調製した。

【0337】

ヒトＫＬＫ５への結合に関するこれらの移植片の動態を、２５℃での表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００）によって評価した。

【0338】

ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、アミンカップリング化学を介してＣＭ５センサーチップ上に約７０００ＲＵのレベルまで固定化した。各分析サイクルは、抗Ｆｃ表面への抗ＫＬＫ５ ＩｇＧ分子の捕捉、３０μｌ／分で１８０秒間のＫＬＫ５分析物（本発明者らが調製）の注入、続いて６００秒間の解離からなった。各サイクルの終わりに、５０ｍＭ ＨＣｌの６０秒間の注入、続いて５ｍＭ ＮａＯＨの３０秒間の注入及び５０ｍＭ ＨＣｌの最終６０秒間の注入を用いて、１０μＬ／分の流速で表面を再生した。ＮａＣｌを補充したＨＢＳ－ＥＰ＋ランニング緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中２０ｎＭ～０．７４ｎＭ（３×３倍連続希釈）で最終濃度３００ｍＭまでヒトＫＬＫ５を滴定した。器具のノイズ及びドリフトを差し引くために、緩衝液ブランク注入を含めた。

【0339】

Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して１：１結合モデルを使用して速度論的パラメータを決定した。

【0340】

表６は、全ての変異が、それらが由来する親抗体又は移植片抗体と同様又はそれに近い親和性でＫＬＫ５に依然として結合することができる抗体をもたらすわけではないことを示す。

【表6】

【0341】

ヒト化抗体のプロファイリング
ＫＬＫ５選択性
ウサギ抗体１０２７３のヒト化が他のカリクレインよりもＫＬＫ５選択性を変化させず、親和性又は阻害活性を低下させないことを確認にするために、一連の調査を行った。

【0342】

次いで、精製抗体をスクリーニングして、例４に記載の方法に従ってＫＬＫ５に対する阻害活性を確認した。抗体を、６００ｎＭ～２０ｐＭの範囲を有する１０点の半対数希釈系列で試験した。Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＦＸ（商標）及びＭｕｌｔｉｄｒｏｐ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、５μＬの各抗体を黒色３８４ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（商標）、カタログ番号３５７５）に移し、アッセイ緩衝液Ａ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス、２００μＭ ＥＤＴＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．６中の１５μＬの選択された活性組換えカリクレイン酵素を添加して、以下の最終アッセイ濃度６０ｐＭのヒトＫＬＫ５（ＵＣＢ）、２５０ｐＭのＫＬＫ７（ＵＣＢ）、５００ｐＭのＫＬＫ２（Ｒ＆Ｄ）、３０ｐＭのＫＬＫ４（ＵＣＢ）、並びに３０ｐＭのカニクイザル組換えＫＬＫ５（ＵＣＢ）、５００ｐＭのカニクイザルＫＬＫ７、３０ｐＭのマウスＫＬＫ５（ＵＣＢ）及び５ｎＭのマウスＫＬＫ７（ＵＣＢ）を達成した。ＵＣＢで調製した酵素を括弧内に示し、例１で上記のように調製する。市販の酵素の供給源を括弧内に示す。

【0343】

２０μＬのアッセイ緩衝液Ａのみを０％活性のためにウェルに添加した。ＬＥＫＴＩ Ｄ５ウサギＦｃ（上記のように調製したＵＣＢ）を阻害活性の基準として使用し、したがって、１０２３６ Ａｂｓ抗体に利用される同じ濃度範囲の５μｌのＬＥＫＴＩ Ｄ５ウサギＦｃを１５μｌのカリクレイン酵素に添加した。５μＬのアッセイ緩衝液Ａに添加した１５μＬのヒトＫＬＫ５を１００％活性基準として使用した。

【0344】

抗体及びカリクレインを室温で一晩インキュベートした。マルチドロップを使用して以下のペプチド基質、ヒトＫＬＫ５（３００μＭ）、ヒトＫＬＫ２（３０μＭ）、マウスＫＬＫ５（３００μＭ）及びカニクイザルＫＬＫ５（４５０μＭ）についてはＢｏｃ－ＶＰＲ－ＡＭＣ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（商標））、ヒト及びカニクイザルＫＬＫ７（それぞれ９０μＭ及び１５０μＭ）についてはＫＨＬＦ－ＡＭＣ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（商標））、ヒトＫＬＫ４（２００μＭ）についてはＰＦＲ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標））、並びにマウスＫＬＫ７（１５０μＭ）についてはＭｃａ－ＲＰＫＰＶＥ－Ｎｖａｌ－ＷＲＫ（Ｄｎｐ）－ＮＨ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標））を添加した。試料を４時間インキュベートし、Ｂｏｃ－ＶＰＲ－ＡＭＣ、ＰＦＲ－ＡＭＣ及びＫＨＬＦ－ＡＭＣについてはλ_ｅｘ３８０ｎｍ及びλ_ｅｍ４３０ｎｍで、Ｍｃａ－ＲＰＫＰＶＥ－Ｎｖａｌ－ＷＲＫ（Ｄｎｐ）－ＮＨ２についてはλ_ｅｘ３２０ｎｍ及びλ_ｅｍ４００ｎｍで、Ｐｈｅｒａｓｔａｒ ＦＳＸプレートリーダ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ（商標））で読み取った。データを分析して、例３に記載の阻害率を決定した。データを試験抗体の濃度に対してプロットし、４パラメータシグモイドをフィッティングしてＩＣ５０（Ｇｅｎｅｄａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ（商標））を決定した。

【0345】

Ａｂ １０２７３のヒト化移植片は、ＫＬＫ５に対する特異性を保持し、試験した他のＫＬＫファミリーメンバーの阻害をほとんど又は全く示さなかった（データは示さず）。

【0346】

ヒト化移植片によるＫＬＫ５の阻害レベル
ヒト化Ａｂ ２７３移植片バリアントによって媒介されるＫＬＫ５活性の阻害レベルを確認するために、捕捉アッセイを開発した。

【0347】

Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ黒色３８４ウェルプレート（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（商標））を、炭酸塩コーティング緩衝液中１０μｇ／ｍＬのＦ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（商標））でコーティングし、４℃で一晩放置した。プレートをＰＢＳ及び０．００５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＢｉｏｔｅｋ（商標）プレートウォッシャで３回洗浄し、プレートを１％ＢＳＡを含む２０μＬ／ウェルＰＢＳで室温で１時間ブロックした。プレートを上記のように洗浄し、１０μｌの５ｎＭ抗体（アッセイ緩衝液１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス、２００μＭ ＥＤＴＡ、０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．６を用いてストックから希釈した）を適切なウェルに添加した。プレートを密封し、室温で一晩インキュベートした後、洗浄した。次いで、１０μｌの２５０ｐＭ ＫＬＫ５（アッセイ緩衝液中のストックから希釈）を関連ウェルに添加し、室温で４時間インキュベートした後、１０μｌの６００ｍＭ ＢＶＰＲ－ＡＭＣ基質を添加した。抗体を除去し、「最大活性」対照ウェルについてはアッセイ緩衝液で置き換え、一方、「最小活性」対照ウェルには基質又は酵素を加えなかった（アッセイ緩衝液で置き換えた）。蛍光（λ_ｅｘ３８０ｎｍ λ_ｅｍ４３０ｎｍ）を、ＰｈｅｒａＳｔａｒ ＦＳＸプレートリーダを用いて４時間にわたって１時間ごとに読み取った。

【0348】

データを分析して、ＫＬＫ５値の阻害率を得た。各時間０値をその等価な時間４時間値から差し引いて、正規化されたベースライン補正されたデータセットを得た。以下の式を使用して、正規化された蛍光値を阻害％に変換した。

【数3】

Ｍｉｎ＝最小活性値、Ｍａｘ＝最大活性値

【0349】

データをプロットして、図１０に示す棒グラフを生成した。阻害パーセント値は９５％～９７％の範囲であり、抗体１０２７３移植片がＫＬＫ５酵素活性をほぼ完全に阻害することができたことを実証した。

【0350】

例９：ヒト化抗体の生物物理学的特徴付け
質量分析による抗体の特徴付け
各抗体の同定は、Ｘｅｖｏ Ｇ２ Ｑ－ＴｏＦ質量分析計を備えたＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣシステムを使用したＬＣ－ＭＳによる、重鎖及び軽鎖のインタクト質量測定によって確認した。試料（約５μｇ）を、１５０ｍＭ酢酸アンモニウム中の５ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を用いて３７℃で４０分間還元した。ＬＣカラムは、０．６ｍＬ／分の流速で、９５％溶媒Ａ（水／０．０２％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／０．０８％ギ酸）及び５％溶媒Ｂ（９５％アセトニトリル／５％水／０．０２％ＴＦＡ／０．０８％ギ酸）で平衡化した、４５０Å、２．７μｍ、８０℃に保持されたＷａｔｅｒｓ ＢｉｏＲｅｓｏｌｖｅＴ ＲＰ ｍＡｂポリフェニルであった。タンパク質を８．８分間にわたって５％～５０％溶媒Ｂの勾配で溶出し、続いて９５％溶媒Ｂで洗浄し、再平衡化した。ＵＶデータを２８０ｎｍで取得した。ＭＳ条件は以下の、イオンモード：ＥＳＩ正イオン、分解モード、質量範囲：４００～５０００ｍ／ｚ及びＮａＩによる外部較正の通りであったＷａｔｅｒｓ ＭａｓｓＬｙｎｘ及びＭａｘＥｎｔソフトウェアを使用してデータを分析した。

【0351】

インタクト質量（還元鎖）は、軽鎖について観察された質量が予想質量と一致することを示した。しかし、１０２７３ ｇＬ２－Ｑ１ＲｇＨ１－Ｄ１９Ｎ－Ｙ９Ｆを除く１０２７３の全ての分子について、観察された重鎖質量と予想された重鎖質量との間に＋８０ダルトンの差が見られた（表７）。

【0352】

これは、重鎖におけるＴｙｒ９の翻訳後修飾であると同定され、抗スルホチロシン抗体を用いたウェスタンブロッティングによって、硫酸化であると確認された。更に、１０２７３ ｇＬ２－Ｑ１ＲｇＨ１－Ｄ１９Ｎをアワビのスルファターゼと共に３７℃で１時間インキュベートすると、インタクト質量分析によって判断されるように、＋８０Ｄａ修飾の割合が約１７％減少した。

【表7】

【0353】

熱安定性（Ｔｍ）測定
融解温度（Ｔｍ）又はアンフォールディングの中点の温度を、Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒアッセイを用いて決定した。

【0354】

Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒアッセイでは、蛍光色素ＳＹＰＲＯ（登録商標）ｏｒａｎｇｅを使用して、温度が上昇するにつれて露出する疎水性領域に結合することによってタンパク質アンフォールディングプロセスを監視した。反応混合物は、試験緩衝液で５０００倍濃縮物から希釈した５μＬの３０×ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓ６６５１）を含有した。ＰＢＳ ｐＨ７．４中０．２ｍｇ／ｍＬの１０２７３ Ａｂ試料４５μＬを色素に添加し、混合した。この溶液１０μＬを３８４ ＰＣＲ光学ウェルプレートに四連で分注し、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ７リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ（商標））で実行した。ＰＣＲシステム加熱デバイスを２０℃に設定し、１．１℃／分の速度で９９℃に増加させた。電荷結合デバイスはウェルの蛍光変化を監視した。蛍光強度の増加をプロットし、勾配の変曲点を使用して見かけの中点温度（Ｔｍ）を生成した。

【0355】

全ての抗体について２つのアンフォールディング転移が観察された。第１のドメインはＣＨ２ドメインに起因する可能性があり、第２のドメインはＦａｂアンフォールディングドメイン及びＣＨ３ドメインのＴｍの平均に起因する可能性がある。

【0356】

１０２７３ ＩｇＧ４Ｐ抗体間で熱安定性に差はなかった（表８）。予想通り、対応するＩｇＧ４Ｐフォーマットと比較して、抗体１０２７３ ｇＬ２ｇＨ１のＩｇＧ１フォーマットについて熱安定性の増加が観察された。（Ｈｅａｄｓ ｅｔ ａｌ“Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ＩｇＧ１ ａｎｄ ＩｇＧ４ Ｆａｂ ｄｏｍａｉｎｓ：ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｇｈｔ－ｈｅａｖｙ ｉｎｔｅｒｃｈａｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ”．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ２０１２；２１：１３１５－２２）。

【表8】

【0357】

３つのヒト化ＩｇＧ４Ｐ抗体、抗体１０２７３ ｇＬ２Ｈ１、ｇＬ２Ｑ１Ｒ－ｇＨ１Ｄ１９Ｎ及びｇＬ２Ｑ１Ｒ－ｇＨ４Ｄ１９Ｎ並びにＩｇＧ１形式の抗体１０２７３ ｇＬ２ｇＨ１について、更なる生物物理学的特徴付けを行った。

【0358】

実験的な等電点（ｐＩ）測定
ｉＣＥ３（商標）全キャピラリイメージングキャピラリ等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）システム（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を使用して、ｐＩを実験的に決定した。１０２７３ Ａｂ試料を、３０μＬの試料（ＨＰＬＣグレードの水中の１ｍｇ／ｍＬストックから）、３５μＬの１％メチルセルロース溶液（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ、１０１８７６）、４μＬのｐＨ３～１０のファルマライト（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ、０４２－８４８）、０．５μＬの４．６５合成ｐＩマーカー、０．５μＬの９．７７合成ｐＩマーカー（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ、１０２２２３及び１０２２１９）、及び１２．５μＬの８Ｍ尿素溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））を混合することによって調製した。ＨＰＬＣグレードの水を使用して最終容量を１００μｌにした。試料を１．５ｋＶで１分間集束させ、続いて３ｋＶで５分間集束させ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅソフトウェアを使用してキャピラリの２８０ｎｍ画像を撮影した。得られた電気泳動図をｉＣＥ３ソフトウェアを用いて分析し、ｐＩ値を割り当てた（ｐＩマーカー間の線形関係）。

【0359】

軽鎖Ｑ１Ｒ及び重鎖Ｄ１９Ｎにおける変異の結果として、より高いｐＩが観察された。アイソタイプ、すなわちＩｇＧ４Ｐの代わりにＩｇＧ１の違いも、実験ｐＩの増加をもたらした。変異とアイソタイプの変化の両方を、第１のイオン交換工程（ＡＥＸ）における宿主細胞タンパク質の除去のための産生中に利用することができる。ｐＩの増加は、より一般的な緩衝液（ｐＨ５～６付近）での製剤化も可能にする。

【表9】

【0360】

疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、疎水性が高い順に分子を分離する。分子は、高濃度の極性塩の存在下で疎水性固定相に結合し、塩の濃度が低下するにつれて移動相に脱着する。保持時間がより長いと、より大きい見かけの疎水性に等しくなる。

【0361】

２ｍｇ／ｍＬの１０２７３ Ａｂ試料を１．６Ｍ硫酸アンモニウム及びＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１：２に希釈した。１０μｇ（１０μＬ）の試料を、蛍光検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２００二成分ＨＰＬＣに直列に接続したＤｉｏｎｅｘ ＰｒｏＰａｃ（商標）ＨＩＣ－１０カラム（１００ｍｍ×４．６ｍｍ）に注入した。分離を固有蛍光（励起波長及び発光波長、それぞれ２８０ｎｍ及び３４０ｎｍ）によって監視した。緩衝液Ａ（０．８Ｍ硫酸アンモニウム、１００ｍＭリン酸、ｐＨ７．４）及び緩衝液Ｂ（１００ｍＭリン酸、ｐＨ７．４）を使用して、試料を以下の勾配溶出、（ｉ）０％Ｂで２分間保持、（ｉｉ）３０分間で０～１００％Ｂまでの直線勾配（０．８ｍＬ／分）、（ｉｉｉ）次の試料注入の前にカラムを１００％Ｂで２分間洗浄し、０％Ｂで１０分間再平衡化することを使用して分析した。カラム温度を２０℃に維持した。保持時間（分）を表１０に示す。

【表10】

【0362】

保持時間、すなわち見かけの疎水性のわずかな差のみが、異なる１０２７３抗体間で観察され、全てが平均より大きい測定値を示すと考えられ、したがって凝集する傾向を潜在的に示す（Ｊａｉｎ ｅｔ ａｌ “Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ－ｓｔａｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌａｎｄｓｃａｐｅ” Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１７ Ｊａｎ ３１；１１４（５）：９４４－９４９．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１６１６４０８１１４．Ｅｐｕｂ ２０１７ Ｊａｎ １７）。したがって、全ての分子が、ＨＩＣマトリックスに結合するより大きな傾向を示した。ＨＩＣマトリックスは、製造におけるイオン交換の代替工程として使用されてきた。

【0363】

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）測定を使用した溶解度測定
コロイド安定性（溶解度）の理解は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿の効果を調べることから導き出すことができる。ＰＥＧを使用して、ＰＥＧの濃度（ｗ／ｖ）を増加させ、溶液中に残存するタンパク質の量を測定することによって、定量的に定義可能な様式でタンパク質溶解度を低下させた。このアッセイは、従来の濃縮方法を使用せずに高濃度溶解度の効果を模倣するのに役立つ。

【0364】

ストック４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ３３５０（Ｍｅｒｃｋ、２０２４４４）溶液をＰＢＳ ｐＨ７．４、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１２５ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ５．０（一般的な貯蔵緩衝液）及び５０ｍＭヒスチジン、２５０ｍＭプロリンｐＨ５．５（一般的な製剤前緩衝液）中で調製した。連続滴定をａｓｓｉｓｔ ｐｌｕｓ液体処理ロボット（Ｉｎｔｅｇｒａ、４５０５）によって行い、４０％～１５．４％の範囲のＰＥＧ３３５０を得た。非平衡沈殿を最小限に抑えるために、試料調製は、１０２７３ Ａｂ試料とＰＥＧ溶液とを１：１の体積比で混合することからなった。３５μＬのＰＥＧ３３５０ストック溶液を、９６ウェルｖ底ＰＣＲプレート（Ａ１～Ｈ１）に液体処理ロボットによって加えた。３５μＬの２ｍｇ／ｍＬ １０２７３ Ａｂ溶液をＰＥＧストック溶液に添加して、１ｍｇ／ｍＬの試験濃度を得た。この溶液を自動化された低速反復ピペッティングによって混合し、３７℃で０．５時間インキュベートして非平衡凝集体を再溶解した。次いで、試料を２０℃で２４時間インキュベートした。その後、試料プレートを２０℃、４０００×ｇで１時間遠心分離した。５０μＬの上清をＵＶ－Ｓｔａｒ（登録商標）、ハーフエリア、９６ウェル、μＣｌｅａｒ（登録商標）、マイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、６７５８０１）に分注した。タンパク質濃度を、ＦＬＵＯｓｔａｒ（登録商標）Ｏｍｅｇａマルチ検出マイクロプレートリーダ（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）を使用して２８０ｎｍでのＵＶ分光光度法によって決定した。得られた値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７．０４を使用してプロットし、ＰＥＧ中点（ＰＥＧ）スコアを、シグモイド用量応答（可変勾配）フィットの中点から導いた。

【0365】

データを表１１に示し、ＰＥＧ中点（％）が高いほど、高濃度の安定性／溶解性の可能性が高くなる。

【0366】

ｐＨ７．４では、１０２７３ ｇＬ２ｇＨ１（ＩｇＧ４Ｐ）が最も高いＰＥＧ中点（最大の予測溶解度）を示すが、アセタートｐＨ５では最も低い溶解度を示す。この傾向は、ＰＢＳ ｐＨ７．４とアセタートｐＨ５との間で予測溶解度に差がなかった、対応するＩｇＧ１分子とは異なっていた。１０２７３ｇＬ２－Ｑ１ＲｇＨ１－Ｄ１９Ｎ及び１０２７３ ｇＬ２－Ｑ１ＲｇＨ４－Ｄ１９Ｎの両方が、ＰＢＳ ｐＨ７．４及びヒスチジンｐＨ５．５緩衝液において同様のＰＥＧ中点を示したが、アセタートｐＨ５では低下した。

【表11】

【0367】

気液界面での応力の影響（凝集アッセイ）
タンパク質は、疎水性表面が疎水性環境（空気）に提示され、親水性表面が親水性環境（水）に提示される空気－液体界面にさらされるとアンフォールドする傾向がある。タンパク質溶液を撹拌すると、凝集を促進することができる大きな気液界面が得られる。このアッセイは、産生（例えば、限外濾過）中に分子が受けるストレスを模倣し、異なる抗体分子を区別しようとするためにストリンジェントな条件を提供するのに役立つ。

【0368】

Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｃｏｍｆｏｒｔ（商標）を使用してボルテックスすることによって、ＰＢＳ ｐＨ７．４又は５０ｍＭ酢酸ナトリウム及び１２５ｍ塩化ナトリウムｐＨ５の中の試料にストレスを与えた。ボルテックスする前に、適切な吸光係数（１．４６ Ａｂｓ ２８０ｎｍ、１ｍｇ／ｍＬ、経路長１ｃｍ）を使用して濃度を１ｍｇ／ｍＬに調整し、Ｖａｒｉａｎ Ｃａｒｙ ５０－Ｂｉｏ分光光度計（登録商標）を使用して２８０ｎｍ、３４０ｎｍ及び５９５ｎｍでの吸光度を得て、時間０の読み取り値を確立した。各試料を１．５ｍＬコニカルＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）型キャップ付きチューブ（３×２５０μＬ）に細分し、１４００ｒｐｍ、２５℃で４時間ボルテックスした。Ｖａｒｉａｎ Ｃａｒｙ（登録商標）５０－Ｂｉｏ分光光度計を使用した５９５ｎｍでの試料の測定によって凝集（濁度）を監視した。

【0369】

異なる抗体についての２つの緩衝液中の４時間での凝集傾向を表１２及び図１１に示す。

【表12】

【0370】

ＩｇＧ１ １０２７３ｇＬ２ｇＨ１は、両方の緩衝液において最大の凝集安定性を示し、一般に、全ての１０２７３抗体がＰＢＳ ｐＨ７．４においてより凝集安定であった。

【0371】

円二色性（ＣＤ）によるグアニジン塩酸塩アンフォールディングを使用した化学変性（アンフォールディング）
堅牢性の試験として化学変性剤（塩酸グアニジン）を使用して抗体をアンフォールディングさせた。

【0372】

ＤｒａｇｏｎＦｌｙ（登録商標）（英国ケンブリッジのＴＴＰ ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して、９６ウェルプレート中の４８ウェルにわたって、グアニジンＨＣｌを０～４Ｍで滴定し、試料を８０μＬの総体積中７．５μＭ（最終）で添加した後、室温で一晩平衡化した。７０μＬを自動円二色性（Ｃｈｉｒｏｓｃａｎ（商標）：ＡＣＤ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ、英国レザーヘッド）による分析のためにディープウェルプレートに移した。円二色性測定は、１秒／時点で０．５ｎｍのステップサイズ、１ｎｍの帯域幅及び０．２ｍｍの経路長のフローセルキュベットを使用して、遠ＵＶ領域２６０～１９０ｎｍで取得した。２１０ｎｍでのＣＤシグナルを、Ｏｒｉｇｉｎ ９ｂのシグモーダル二用量応答曲線にフィッティングさせた。

【0373】

試験した１０２７３抗体は、化学変性中点（Ｃｍ）（表１３）に従って同様の変性プロファイルを有するようであり、２つの見かけの遷移があり、したがって化学変性剤と同様の堅牢性を示した。

【表13】

【0374】

ＡＣ－ＳＩＮＳ（親和性捕捉自己相互作用ナノ粒子分光法）を用いた自己相互作用の評価。
ＡＣ－ＳＩＮＳアッセイ（Ｌｉｕ Ｙ．ＭＡｂｓ．２０１４ Ｍａｒ－Ａｐｒ；６（２）：４８３－９２）において１０２７３抗体のセットを試験し、自己相互作用傾向を評価し、したがって凝集安定性について報告した。

【0375】

ヤギ抗ヒトＦｃγ特異的捕捉抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．３に緩衝液交換し、０．４ｍｇ／ｍＬに希釈し、４５０μＬのクエン酸安定化２０ｎｍ金ナノ粒子（ＴｅｄＰｅｌｌａ、米国）に５０μＬを添加し、室温で一晩放置した。コンジュゲート化ナノ粒子を５５μＬのＰＥＧ－チオールで１時間ブロックし、２１，０００×ｇで６分間遠心分離し、上清を除去し、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．３に再懸濁して最終容量１５０μＬにした。

【0376】

１０２７３抗体をＰＢＳ、ｐＨ７．４（２００μＬ）中で２２μｇ／ｍＬに希釈し、等量の非特異的全ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）に添加し、短時間ボルテックスし、７２μＬを９６ウェルプレートに添加した。８μＬのナノ粒子を各ウェルに添加した（ｎ＝４）。吸光度をＢＭＧプレートリーダで５００～６００ｎｍから読み取り、ローレンツカーブ（ＲＳｈｉｎｙ）に適合させ、ＰＢＳのみを試料から差し引いて、表１４に詳述するΔλｍａｘを得た。Δλｍａｘが大きいほど、自己相互作用の傾向が大きくなる。試験した１０２７３抗体は、低いλｍａｘ及びΔλｍａｘ（ＰＢＳバックグラウンドから）を示し、自己相互作用の傾向が低いことを示唆した。

【表14】

【配列表フリーテキスト】

【0377】

配列表３０ ＜２２３＞ウサギＶＬ
配列表３１ ＜２２３＞ウサギＶＬヌクレオチド
配列表３２ ＜２２３＞ウサギＶＨ
配列表３３ ＜２２３＞ウサギＶＨヌクレオチド
配列表３５ ＜２２３＞１０２７３ ｇＬ２ ＶＬヌクレオチド
配列表３６ ＜２２３＞１０２７３ ｇＬ２軽鎖
配列表３７ ＜２２３＞１０２７３ ｇＬ２軽鎖ヌクレオチド
配列表３９ ＜２２３＞１０２７３ ｇＬ２ ＶＬ Ｑ１Ｒヌクレオチド
配列表４０ ＜２２３＞１０２７３ ｇＬ２軽鎖Ｑ１Ｒ
配列表４１ ＜２２３＞１０２７３ ｇＬ２軽鎖Ｑ１Ｒヌクレオチド
配列表４３ ＜２２３＞１０２７３ ｇＬ２ Ｌ Ｑ１Ｋヌクレオチド
配列表４４ ＜２２３＞１０２７３ ｇＬ２軽鎖Ｑ１Ｋ
配列表４５ ＜２２３＞１０２７３ ｇＬ２軽鎖Ｑ１Ｋヌクレオチド
配列表４７ ＜２２３＞１０２７３ ｇＬ２ ＶＬ Ｑ１Ｈヌクレオチド
配列表４８ ＜２２３＞１０２７ ｇＬ２軽鎖Ｑ１Ｈ
配列表４９ ＜２２３＞１０２７３ ｇＬ２軽鎖Ｑ１Ｈヌクレオチド
配列表５１ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１ ＶＨヌクレオチド
配列表５２ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１重鎖
配列表５３ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１重鎖ヌクレオチド
配列表５５ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１ ＶＨ Ｄ１９Ｎヌクレオチド
配列表５６ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１重鎖Ｄ１９Ｎ
配列表５７ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１重鎖Ｄ１９Ｎヌクレオチド
配列表５９ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１ ＶＨ Ｄ１９Ｅヌクレオチド
配列表６０ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１重鎖Ｄ１９Ｅ
配列表６１ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１重鎖Ｄ１９Ｅヌクレオチド
配列表６３ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ４ ＶＨヌクレオチド
配列表６４ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ４重鎖
配列表６５ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ４重鎖ヌクレオチド
配列表６７ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ４ ＶＨ Ｄ１９Ｎヌクレオチド
配列表６８ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ４重鎖Ｄ１９Ｎ
配列表６９ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ４重鎖Ｄ１９Ｎヌクレオチド
配列表７１ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ５ ＶＨヌクレオチド
配列表７２ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ５重鎖
配列表７３ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ５重鎖ヌクレオチド
配列表７５ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ５ ＶＨ Ｄ１９Ｎヌクレオチド
配列表７６ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ５重鎖Ｄ１９Ｎ
配列表７７ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ５重鎖Ｄ１９Ｎヌクレオチド
配列表７９ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ８ ＶＨヌクレオチド
配列表８０ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ８重鎖
配列表８１ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ８重鎖ヌクレオチド
配列表８３ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ ＶＨ Ｄ１９Ｎヌクレオチド
配列表８４ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ８重鎖Ｄ１９Ｎ
配列表８５ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ８重鎖Ｄ１９Ｎヌクレオチド
配列表８６ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１０ ＶＨヌクレオチド
配列表８７ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１０ ＶＨヌクレオチド
配列表８８ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１０重鎖
配列表８９ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１０重鎖ヌクレオチド
配列表９１ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１０ ＶＨ Ｄ１９Ｎヌクレオチド
配列表９２ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１０重鎖Ｄ１９Ｎ
配列表９３ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１０重鎖Ｄ１９Ｎヌクレオチド
配列表９５ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１１ ＶＨヌクレオチド
配列表９６ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１１重鎖
配列表９７ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１１重鎖ヌクレオチド
配列表９９ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１１ ＶＨ Ｄ１９Ｎヌクレオチド
配列表１００ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ １１重鎖Ｄ１９Ｎ
配列表１０１ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ １１重鎖Ｄ１９Ｎヌクレオチド
配列表１０３ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１ ＶＨ Ｙ４Ｆ Ｄ１９Ｎヌクレオチド
配列表１０４ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１重鎖Ｙ４Ｆ Ｄ１９Ｎ
配列表１０５ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１重鎖Ｙ４Ｆ Ｄ１９Ｎヌクレオチド
配列表１０７ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１ ＶＨ Ｙ６Ｆ Ｄ１９Ｎヌクレオチド
配列表１０８ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１重鎖Ｙ６Ｆ Ｄ１９Ｎ
配列表１０９ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１重鎖Ｙ６Ｆ Ｄ１９Ｎヌクレオチド
配列表１１１ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１ ＶＨ Ｙ９Ｆ Ｄ１９Ｎヌクレオチド
配列表１１２ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１重鎖Ｙ９Ｆ Ｄ１９Ｎ
配列表１１３ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１重鎖Ｙ９Ｆ Ｄ１９Ｎヌクレオチド
配列表１１５ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１ ＶＨ Ｙ１２Ｆ Ｄ１９Ｎヌクレオチド
配列表１１６ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１重鎖Ｙ１２Ｆ Ｄ１９Ｎ
配列表１１７ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１重鎖Ｙ１２Ｆ Ｄ１９Ｎヌクレオチド
配列表１１９ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１ ＶＨ Ｙ１５Ｆ Ｄ１９Ｎヌクレオチド
配列表１２０ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１重鎖Ｙ１５Ｆ Ｄ１９Ｎ
配列表１２１ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１重鎖Ｙ１５Ｆ Ｄ１９Ｎヌクレオチド
配列表１２３ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１ ＶＨ Ｙ１６Ｆ Ｄ１９Ｎヌクレオチド
配列表１２４ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１重鎖Ｙ１６Ｆ Ｄ１９Ｎ
配列表１２５ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１重鎖Ｙ１６Ｆ Ｄ１９Ｎヌクレオチド
配列表１２６ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１ ＶＨ Ｔ１４Ｎ Ｄ１９Ｎヌクレオチド
配列表１２７ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１ ＶＨ Ｔ１４Ｎ Ｄ１９Ｎヌクレオチド
配列表１２８ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１重鎖Ｔ１４Ｎ Ｄ１９Ｎ
配列表１２９ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１重鎖Ｔ１４Ｎ Ｄ１９Ｎヌクレオチド
配列表１３１ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１ ＶＨ Ｔ１４Ｖ Ｄ１９Ｎヌクレオチド
配列表１３２ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１重鎖Ｔ１４Ｖ Ｄ１９Ｎ
配列表１３３ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１重鎖Ｔ１４Ｖ Ｄ１９Ｎヌクレオチド
配列表１３５ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１ ＶＨ Ｔ１４Ｓ Ｄ１９Ｎヌクレオチド
配列表１３６ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１重鎖Ｔ１４Ｓ Ｄ１９Ｎ
配列表１３７ ＜２２３＞１０２７３ ｇＨ１重鎖Ｔ１４Ｓ Ｄ１９Ｎヌクレオチド
配列表１３８ ＜２２３＞ヒトＩＧＫＶ１Ｄ－１３ ＪＫ４アクセプターフレームワーク
配列表１３９ ＜２２３＞ヒトＩＧＫＶ１Ｄ－１３ ＪＫ４アクセプターフレームワークヌクレオチド
配列表１４０ ＜２２３＞ヒトＩＧＨＶ３－６６ ＪＨ６アクセプターフレームワーク
配列表１４１ ＜２２３＞ヒトＩＧＨＶ３－６６ ＪＨ６アクセプターフレームワークヌクレオチド
配列表１４２ ＜２２３＞ヒトＫＬＫ５ （シグナル配列を有する全長）
配列表１４３ ＜２２３＞ヒトＫＬＫ５プロフォーム
配列表１４４ ＜２２３＞活性ヒトＫＬＫ５
配列表１４５ ＜２２３＞ヒトＬＥＫＴＩ Ｄ５ウサギＦｃ
配列表１４６ ＜２２３＞ヒトＫＬＫ７プロフォーム
配列表１４７ ＜２２３＞活性ヒトＫＬＫ７
配列表１４８ ＜２２３＞カニクイザルＫＬＫ７プロフォーム
配列表１４９ ＜２２３＞活性カニクイザルＫＬＫ７
配列表１５０ ＜２２３＞活性マウスＫＬＫ５
配列表１５１ ＜２２３＞活性カニクイザルＫＬＫ５
配列表１５２ ＜２２３＞ヒトＬＥＫＴＩ Ｄ８ウサギＦｃ
配列表１５３ ＜２２３＞ウサギ１０２７３ ｍＩｇＧ軽鎖
配列表１５４ ＜２２３＞ウサギ１０２７３ ｍＩｇＧ重鎖
配列表１５５ ＜２２３＞ウサギ１０２７３ ｍＩｇＧ軽鎖ヌクレオチド
配列表１５６ ＜２２３＞ウサギ１０２７３ ｍＩｇＧ重鎖ヌクレオチド
配列表１５７ ＜２２３＞ウサギ１０２３６ ｍＩｇＧ軽鎖
配列表１５８ ＜２２３＞ウサギ１０２３６ ｍＩｇＧ重鎖
配列表１５９ ＜２２３＞ウサギ１０２３６ ｍＩｇＧ軽鎖ヌクレオチド
配列表１６０ ＜２２３＞ウサギ１０２３６ ｍＩｇＧ重鎖ヌクレオチド
配列表１６１ ＜２２３＞１０２３６軽鎖Ｆａｂ
配列表１６２ ＜２２３＞１０２３６軽鎖Ｆａｂヌクレオチド
配列表１６３ ＜２２３＞１０２３６重鎖Ｆａｂ
配列表１６４ ＜２２３＞１０２３６重鎖Ｆａｂヌクレオチド
配列表１６５ ＜２２３＞１０２７３軽鎖Ｆａｂ
配列表１６６ ＜２２３＞１０２７３軽鎖Ｆａｂヌクレオチド
配列表１６７ ＜２２３＞１０２７３重鎖Ｆａｂ
配列表１６８ ＜２２３＞１０２７３重鎖Ｆａｂヌクレオチド
配列表１６９ ＜２２３＞ヒトＬＥＫＴＩ Ｄ５ Ｆａｂ Ｈ鎖
配列表１７０ ＜２２３＞ヒトＬＥＫＴＩ Ｄ５ Ｆａｂ Ｌ鎖
配列表１７１ ＜２２３＞ウサギ／ヒトキメラ軽鎖（ｈＣＫ Ｓ１７１Ｃ） １０２３６
配列表１７２ ＜２２３＞ウサギ／ヒトキメラ重鎖１０２３６
配列表１８１ ＜２２３＞１０２３６ウサギＶＬ
配列表１８２ ＜２２３＞１０２３６ウサギＶＬヌクレオチド
配列表１８３ ＜２２３＞１０２３６ウサギＶＨ
配列表１８４ ＜２２３＞１０２３６ウサギＶＨヌクレオチド
配列表１８５ ＜２２３＞マウスＫＬＫ７プロフォーム
配列表１８６ ＜２２３＞活性マウスＫＬＫ７

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

2023512304000001.app

【国際調査報告】