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特表2023-512372ビオチン－ストレプトアビジン切断組成物及びライブラリ断片切断
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-27
(54)【発明の名称】ビオチン－ストレプトアビジン切断組成物及びライブラリ断片切断
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6806 20180101AFI20230317BHJP
C12Q 1/6874 20180101ALI20230317BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20230317BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6806 Z
C12Q1/6874 Z
C12M1/00 A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021576683
(86)(22)【出願日】2021-02-02
(85)【翻訳文提出日】2021-12-23
(86)【国際出願番号】 US2021016228
(87)【国際公開番号】W WO2021158556
(87)【国際公開日】2021-08-12
(31)【優先権主張番号】62/969,440
(32)【優先日】2020-02-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500358711
【氏名又は名称】イルミナ インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】ダン・カオ
(72)【発明者】
【氏名】ジェフリー・エス・フィッシャー
(72)【発明者】
【氏名】フィオナ・ケイパー
(72)【発明者】
【氏名】タルン・クマール・クラーナー
(72)【発明者】
【氏名】トン・リュウ
(72)【発明者】
【氏名】ブラク・オクムス
(72)【発明者】
【氏名】ヴィクター・ジェー・キジャーノ
(72)【発明者】
【氏名】クリフォード・リー・ワン
(72)【発明者】
【氏名】イル－シュアン・ウ
(72)【発明者】
【氏名】シ・ミン・シャオ
(72)【発明者】
【氏名】ホンシア・シュ
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029AA23
4B029BB20
4B063QA01
4B063QA13
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR32
4B063QR35
4B063QS34
4B063QX01
(57)【要約】
ビオチン－ストレプトアビジン切断組成物の一例は、ホルムアミド試薬及び塩緩衝液を含む。ホルムアミド試薬は、ビオチン－ストレプトアビジン切断組成物の総体積に基づいて、約１０％～約５０％の範囲の量でビオチン－ストレプトアビジン切断組成物中に存在する。塩緩衝液は、ビオチン－ストレプトアビジン切断組成物の残部を構成する。いくつかの例では、ビオチン－ストレプトアビジン切断組成物は、ライブラリ断片を固体支持体から切断するために使用される。他の例では、他の機構を使用して、ライブラリ断片を固体支持体から切断する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ビオチン－ストレプトアビジン切断組成物であって、約１０体積％～約５０体積％のホルムアミド試薬と、
残部として塩緩衝液と、を含む、ビオチン－ストレプトアビジン切断組成物。
【請求項2】
前記ホルムアミド試薬が、１００％ホルムアミドである、請求項１に記載のビオチン－ストレプトアビジン切断組成物。
【請求項3】
前記塩緩衝液が、水中約０．７５Ｍの塩化ナトリウム及び約７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む、請求項１又は２に記載のビオチン－ストレプトアビジン切断組成物。
【請求項4】
前記塩緩衝液が、約０．２５重量％～約１．５重量％の生体適合性界面活性剤を更に含む、請求項３に記載のビオチン－ストレプトアビジン切断組成物。
【請求項5】
前記組成物が、約５０％の前記ホルムアミド試薬及び約５０％の前記塩緩衝液を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のビオチン－ストレプトアビジン切断組成物。
【請求項6】
前記組成物が、約４０％の前記ホルムアミド試薬及び約６０％の前記塩緩衝液を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のビオチン－ストレプトアビジン切断組成物。
【請求項7】
ビオチン－ストレプトアビジン切断組成物であって、ホルムアミド及び任意選択的な緩衝液を含む約１０体積％～約５０体積％のホルムアミド試薬と、
塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、及び生体適合性界面活性剤を含む残部として塩緩衝液と、からなる、ビオチン－ストレプトアビジン切断組成物。
【請求項8】
方法であって、ライブラリ断片をフローセルに導入することであって、前記ライブラリ断片がストレプトアビジンコーティング固体支持体に付着している、導入することと、
ビオチン－ストレプトアビジン切断組成物を前記フローセルに導入することであって、前記ビオチン－ストレプトアビジン切断組成物が、
約１０体積％～約５０体積％のホルムアミド試薬と、
残部として塩緩衝液と、を含む、導入することと、
前記ビオチン－ストレプトアビジン切断組成物を約６０℃～約７０℃の範囲の温度で前記フローセル内でインキュベートすることを許容し、それにより、前記ライブラリ断片のうちの少なくともいくつかを前記固体支持体から放出させ、前記フローセルの表面上の増幅プライマーに播種させることと、を含む、方法。
【請求項9】
前記ビオチン－ストレプトアビジン切断組成物が約２分間～約５分間の範囲の時間にわたって前記フローセル内でインキュベートされることが許容される、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記ストレプトアビジンコーティング固体支持体のうちの少なくともいくつかが、前記フローセルの表面上のビオチン捕捉部位に結合した状態になり、前記ビオチン－ストレプトアビジン切断組成物を前記フローセル内でインキュベートすることを前記許容することが、同様に、前記結合したストレプトアビジンコーティング固体支持体のうちの少なくともいくつかを前記ビオチン捕捉部位から放出させる、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項11】
インキュベーション後に前記ビオチン－ストレプトアビジン切断組成物を前記フローセルからすすぎ、それにより、前記ストレプトアビジンコーティング固体支持体及びあらゆる未播種ライブラリ断片を除去することを更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記ホルムアミド試薬と前記塩緩衝液とを混合することによって前記ビオチン－ストレプトアビジン切断組成物を調製することを更に含む、請求項８～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記ホルムアミド試薬が、１００％ホルムアミドを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記塩緩衝液が、水中約０．７５Ｍの塩化ナトリウム及び約７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項15】
前記塩緩衝液が、約０．２５重量％～約１．５重量％の生体適合性界面活性剤を更に含む、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
キットであって、ストレプトアビジンコーティング固体支持体と、
一方の末端にビオチンを付着させたアダプター配列であって、前記ビオチンが前記ストレプトアビジンコーティング固体支持体に付着するようになる、アダプター配列と、
断片化されて前記アダプター配列に付着するようになるゲノム配列を含む試料流体と、
ビオチン－ストレプトアビジン切断組成物であって、
約１０体積％～約５０体積％のホルムアミド試薬と、
残部として塩緩衝液と、を含む、キット。
【請求項17】
前記ホルムアミド試薬が、１００％ホルムアミドである、請求項１６に記載のキット。
【請求項18】
前記塩緩衝液が、水中約０．７５Ｍの塩化ナトリウム及び約７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む、請求項１６又は１７に記載のキット。
【請求項19】
前記塩緩衝液が、約０．２５重量％～約１．５重量％の生体適合性界面活性剤を更に含む、請求項１６～１８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項20】
方法であって、デスチオビオチン化ライブラリ断片をフローセルに導入することであって、前記デスチオビオチン化ライブラリ断片がストレプトアビジンコーティング固体支持体に付着している、導入することと、
切断組成物を前記フローセルに導入することであって、前記切断組成物が約１８℃～約３０℃の範囲の温度であり、前記切断組成物が、
遊離ビオチンと、
塩緩衝液と、を含む、導入することと、
前記切断組成物の前記温度を約６０℃～約７０℃まで上昇させ、それにより、前記ライブラリ断片のうちの少なくともいくつかを前記固体支持体から放出させ、前記フローセルの表面上の増幅プライマーに播種させることと、を含む、方法。
【請求項21】
前記塩緩衝液が、水中約０．７５Ｍの塩～約０．８５Ｍの塩を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記遊離ビオチンが、約２．５μＭ～約１０ｍＭの範囲の濃度で前記切断組成物中に存在する、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項23】
前記塩緩衝液が、水中約０．７５Ｍの塩化ナトリウム及び約７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
ライブラリ調製流体であって、液体キャリアと、
前記液体キャリア中のライブラリ調製ビーズと、を含み、各ライブラリ調製ビーズが、
固体支持体と、
前記固体支持体に付着したトランスポソーム複合体と、を含み、前記トランスポソーム複合体が、
トランスポサーゼ酵素と、
前記トランスポサーゼ酵素に結合した二本鎖分子であって、
３’トランスポゾン末端配列、アダプター配列、切断部位、及び５’連結末端配列を含む転移鎖（transferred strand）であって、前記アダプター配列及び前記５’連結末端配列が前記切断部位に隣接している、転移鎖と、
３’トランスポゾン末端配列を含む非転移鎖と、を含む、二本鎖分子と、
前記切断部位をスプリントするように、前記アダプター配列の少なくとも一部分及び前記５’連結末端配列の少なくとも一部分にハイブリダイズされたスプリント配列と、を含む、ライブラリ調製流体。
【請求項25】
前記切断部位が、化学的に切断可能な切断部位、酵素的に切断可能な切断部位、及び光切断可能な（photocleavable）切断部位からなる群から選択される、請求項２４に記載のライブラリ調製流体。
【請求項26】
方法であって、複数の調製済ライブラリ調製ビーズを反応容器に導入することであって、前記調製済ライブラリ調製ビーズの各々が、
固体支持体と、
前記固体支持体に付着した複数の架橋分子と、を含み、前記架橋分子の各々が、
二本鎖ＤＮＡ断片と、
転移鎖であって、その５’末端で前記二本鎖ＤＮＡ断片の各鎖にそれぞれ付着しており、各転移鎖が、３’トランスポゾン末端配列、第１のアダプター配列、切断部位、及び５’連結末端配列を含み、前記アダプター配列及び前記５’連結末端配列が前記切断部位に隣接している、転移鎖と、
第２のアダプター配列であって、その３’末端で前記二本鎖ＤＮＡ断片の各鎖にそれぞれ付着している、第２のアダプター配列と、
前記切断部位をスプリントするように、前記第１のアダプター配列の少なくとも一部分及び前記５’連結末端配列の少なくとも一部分にハイブリダイズされたスプリント配列と、を含む、導入することと、
前記調製済ライブラリ調製ビーズを切断剤に曝露して前記切断部位を除去することであって、これにより、前記複数の架橋分子が前記スプリントを介して前記固体支持体に付着したままになる、除去することと、
前記フローセルを前記スプリント及び前記二本鎖ＤＮＡ断片の解離温度まで加熱することと、を含む、方法。
【請求項27】
前記反応容器が、フローセルであり、前記複数のライブラリ調製ビーズのうちの少なくともいくつかが、前記フローセルの表面上に固定された状態になり、
前記方法が、前記ライブラリ調製ビーズを前記切断剤に曝露する前に、非固定化ライブラリ調製ビーズを前記フローセルから除去することを更に含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記切断部位が、化学的切断部位であり、前記調製済ライブラリ調製ビーズを前記切断剤に曝露することが、化学的切断剤を前記反応容器に導入することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項29】
前記切断部位が、酵素的切断部位であり、前記調製済ライブラリ調製ビーズを前記切断剤に曝露することが、酵素的切断剤を前記反応容器に導入することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項30】
前記切断部位が、光切断可能切断部位であり、前記調製済ライブラリ調製ビーズを前記切断剤に曝露することが、切断を活性化する波長の光を前記反応容器に照射することを含む、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２０年２月３日に出願された米国特許仮出願第６２／９６９，４４０号の利益を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年２月３日に出願された米国特許仮出願第６２／９６９，４４０号の利益を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
生物学的アレイは、タンパク質、核酸などを含む分子を検出、分析、及び／又は精製するために使用される広範囲のツールの１つである。いくつかの用途では、アレイは、目的の分子を捕捉することができるプローブを含むように操作される。他の用途では、アレイは、結合対の一方のメンバーで操作され、目的の分子は、結合対の他方のメンバーで標識又はタグ付けされる。結合対の例としては、ビオチン及びアビジン又はストレプトアビジンが挙げられる。ビオチンに対するアビジン又はストレプトアビジンの親和性は、最も強い非共有結合性生物学的相互作用のうちの１つである。更に、ビオチン標識が標識分子の機能を妨害することはめったにない。これらの特性は、ビオチン及びアビジン又はビオチン及びストレプトアビジンを様々な生物学的用途に特に望ましいものにする。
【0003】
いくつかの生物学的用途では、目的の分子が条件付き及び制御された様式で繋留又は連結されることが望ましく、繋留又は連結が特定の時点で切断され、切断された目的の分子の解離が制御される。いくつかの事例では、ビオチン及びアビジン又はビオチン及びストレプトアビジン相互作用の強度が条件付き及び／又は制御された切断を困難にする可能性がある。
【発明の概要】
【0004】
ライブラリ断片をそれらが付着している固体支持体から切断するために使用され得る組成物及び方法が本明細書に開示される。組成物の一例は、ビオチン－ストレプトアビジン結合を迅速かつ効果的に切断することができる。組成物の別の例は、ライブラリ断片の空間的放出を可能にする条件下で活性化される。方法の一例は、ライブラリ断片の固体支持体からの２段階放出を含む。２段階放出の切断機構は直交しており、それ故に、第１の切断機構は不安定であり、第２の切断機構は安定している。第２の切断機構は、ライブラリ断片の空間的放出を可能にする。
【0005】
本組成物及び本方法は、フローセル上で使用されてもよい。本明細書に開示される実施例の各々は、フローセル表面上の化学的性質、例えば、高分子ヒドロゲル、増幅プライマーなど）に悪影響を及ぼすことなく、フローセル表面上で使用することができる。
【0006】
本明細書に開示される第１の態様は、ビオチン－ストレプトアビジン切断組成物であり、このビオチン－ストレプトアビジン切断組成物は、約１０体積％～約５０体積％のホルムアミド試薬と、残部として塩緩衝液と、を含む。
【0007】
本明細書に開示される第２の態様は、ビオチン－ストレプトアビジン切断組成物であり、このビオチン－ストレプトアビジン切断組成物は、ホルムアミド及び任意選択的な緩衝液を含む約１０体積％～約５０体積％のホルムアミド試薬と、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、及び生体適合性界面活性剤を含む残部として塩緩衝液と、からなる。
【0008】
本明細書に開示される第３の態様は、方法であり、この方法は、ライブラリ断片をフローセルに導入することであって、ライブラリ断片がストレプトアビジンコーティング固体支持体に付着している、導入することと、ビオチン－ストレプトアビジン切断組成物をフローセルに導入することであって、ビオチン－ストレプトアビジン切断組成物が、約１０体積％～約５０体積％のホルムアミド試薬と、残部として塩緩衝液と、を含む、導入することと、ビオチン－ストレプトアビジン切断組成物を約６０℃～約７０℃の範囲の温度でフローセル内でインキュベートすることを許容し、それにより、ライブラリ断片のうちの少なくともいくつかを固体支持体から放出させ、フローセルの表面上の増幅プライマーに播種させることと、を含む。
【0009】
本明細書に開示される第４の態様は、キットであり、このキットは、ストレプトアビジンコーティング固体支持体と、一方の末端にビオチンを付着させたアダプター配列であって、ビオチンがストレプトアビジンコーティング固体支持体に付着するようになる、アダプター配列と、断片化されてアダプター配列に付着するようになるゲノム配列を含む試料流体と、約１０体積％～約５０体積％のホルムアミド試薬及び残部として塩緩衝液を含むビオチン－ストレプトアビジン切断組成物と、を含む。
【0010】
本明細書に開示される第５の態様は、方法であり、この方法は、デスチオビオチン化ライブラリ断片をフローセルに導入することであって、デスチオビオチン化ライブラリ断片がストレプトアビジンコーティング固体支持体に付着している、導入することと、切断組成物をフローセルに導入することであって、切断組成物が約１８℃～約３０℃の範囲の温度であり、切断組成物が遊離ビオチン及び塩緩衝液を含む、導入することと、切断組成物の温度を約６０℃～約７０℃まで上昇させ、それにより、ライブラリ断片のうちの少なくともいくつかを固体支持体から放出させ、フローセルの表面上の増幅プライマーに播種させることと、を含む。
【0011】
本明細書に開示される第６の態様は、ライブラリ調製流体であり、このライブラリ調製流体は、液体キャリアと、液体キャリア中のライブラリ調製ビーズとを含み、各ライブラリ調製ビーズは、固体支持体と、固体支持体に付着したトランスポソーム複合体とを含み、トランスポソーム複合体は、トランスポサーゼ酵素と、トランスポサーゼ酵素に結合した二本鎖分子であって、３’トランスポゾン末端配列、アダプター配列、切断部位、及び５’連結末端配列を含む転移鎖（transferred strand）であって、アダプター配列及び５’連結末端配列が切断部位に隣接している、転移鎖と、３’トランスポゾン末端配列を含む非転移鎖と、を含む、二本鎖分子と、切断部位をスプリントするように、アダプター配列の少なくとも一部分及び５’連結末端配列の少なくとも一部分にハイブリダイズされるスプリント配列と、を含む。
【0012】
本明細書に開示される第７の態様は、方法であり、この方法は、複数の調製済ライブラリ調製ビーズを反応容器に導入することであって、調製済ライブラリ調製ビーズの各々が、固体支持体と、固体支持体に付着した複数の架橋分子と、を含み、架橋分子の各々が、二本鎖ＤＮＡ断片と、転移鎖であって、その５’末端で二本鎖ＤＮＡ断片の各鎖にそれぞれ付着しており、各転移鎖が、３’トランスポゾン末端配列、第１のアダプター配列、切断部位、及び５’連結末端配列を含み、第１のアダプター配列及び５’連結末端配列が切断部位に隣接している、転移鎖と、第２のアダプター配列であって、その３’末端で二本鎖ＤＮＡ断片の各鎖にそれぞれ付着している、第２のアダプター配列と、切断部位をスプリントするように、第１のアダプター配列の少なくとも一部分及び５’連結末端配列の少なくとも一部分にハイブリダイズされたスプリント配列６８と、を含む、導入することと、調製済ライブラリ調製ビーズを切断剤に曝露して切断部位を除去することであって、これにより、複数の架橋分子がスプリントを介して固体支持体に付着したままになる、除去することと、反応容器をスプリント及び二本鎖ＤＮＡ断片の解離温度まで加熱することと、を含む。
【0013】
これらの態様のうちのいずれか１つのいずれの特徴も任意の望ましい様式で一緒に組み合わせられてもよいことを理解すべきである。更に、第１の態様及び／又は第２の態様及び／又は第３の態様及び／又は第４の態様及び／又は第５の態様及び／又は第６の態様及び／又は第７の態様の特徴の任意の組み合わせが、本明細書に開示される実施例のうちのいずれかと組み合わせられて、例えば、改善されたビオチン－ストレプトアビジン結合切断を含む、本開示に記載される利益を達成することができることを理解すべきである。
【0014】
本開示の例の特徴は、以下の詳細な説明及び図面を参照することにより明らかになろう。図面において、同様の参照番号は、類似なものではあるが、おそらく同一ではない構成要素に対応している。簡潔にするために、前述の機能を有する参照番号又は特徴は、それらが現れる他の図面と関連させて記載してもよく、記載しなくてもよい。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1A】本明細書に開示される標的材料の異なる例の概略図である。
【図1B】本明細書に開示される標的材料の異なる例の概略図である。
【図2A】非転移鎖のタグ付け前（２Ａ）、タグ付け中（２Ｂ）、並びにタグ付け後及びライゲーション中（２Ｃ）のライブラリ調製ビーズの一部分の概略図である。
【図2B】非転移鎖のタグ付け前（２Ａ）、タグ付け中（２Ｂ）、並びにタグ付け後及びライゲーション中（２Ｃ）のライブラリ調製ビーズの一部分の概略図である。
【図2C】非転移鎖のタグ付け前（２Ａ）、タグ付け中（２Ｂ）、並びにタグ付け後及びライゲーション中（２Ｃ）のライブラリ調製ビーズの一部分の概略図である。
【図3A】フローセルの一例の上面図である。
【図4】調製済ライブラリ調製ビーズからの配列決定可能なライブラリ断片の二重機構放出を示す概略フロー図である。
【図5】切断組成物（Ｘ軸）中のホルムアミド試薬の体積％に対する、テトラクロロフルオレセイン（tetrachloro-fluorescein：ＴＥＴ）ＱＣプライマーの蛍光強度（Ｙ軸）を示すグラフである。
【図6】様々な洗浄工程後に残留するビーズの割合を示す棒グラフである。
【図7】高塩条件下で遊離ビオチン又はデスチオビオチンに曝露されたときの異なる温度でのデスチオビオチン化ＤＮＡ放出の割合を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【0016】
いくつかの配列決定用途では、ＤＮＡライブラリ断片は、固体支持体（例えば、ビーズ）上のフローセルに導入される。ライブラリ断片が生成されるより長い遺伝物質の隣接性情報を保存することができるため、固体支持体の使用が望ましい場合がある。いくつかの事例では、ＤＮＡライブラリ断片は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を使用して固体支持体に付着される。フローセル上のライブラリ播種及び増幅のために、ビオチン化ＤＮＡライブラリ断片は、固体支持体から放出されなければならない。本発明者らは、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を破壊するのに十分に強力ないくつかの試薬も、フローセル表面上のプライマーへのビオチン化ＤＮＡライブラリ断片のハイブリダイゼーションを妨害するか、又はそれに別様に悪影響を及ぼすことを見出した。一例として、強力な変性試薬（例えば、約９５％のホルムアミド及び約１０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ethylenediaminetetraacetic acid：ＥＤＴＡ））及び高温のインキュベーション（例えば、９０℃で２分間）がビオチン－ストレプトアビジン相互作用を破壊することが見出されたが、放出されたビオチン化ＤＮＡライブラリ断片は、フローセル表面にハイブリダイズしない。
【0017】
一例では、ビオチン化ＤＮＡライブラリ断片を完全に放出するビオチン－ストレプトアビジン結合を効率的に破壊することができる切断組成物が、本明細書に開示される。放出時に、切断組成物中で、ビオチン化ＤＮＡライブラリ断片はハイブリダイゼーションを受けることができる。したがって、本明細書に開示される切断組成物は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を効率的に破壊し、即時ハイブリダイゼーションを確実にする。本切断組成物は、７０℃以下の温度でも有効である。７０℃は大半のフローセルの動作温度を下回るものであり、それ故に、フローセルにおける切断組成物の使用は、フローセル表面上の化学的性質、例えば、高分子ヒドロゲル、増幅プライマーなど）に悪影響を及ぼさない。
【0018】
本明細書に開示される切断組成物は、ビオチン－ストレプトアビジン結合を非常に迅速に、効果的に破壊することができる。いくつかの事例では、インキュベーション時間は、約２分間～約５分間の範囲である。これらの時間は、１５分間の振盪及び１５分間のインキュベーションを含み得る他の方法、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（sodium dodecyl sulfate：ＳＤＳ）、尿素、及びビオチンを含む方法と比較して有意に短縮された時間である。
【0019】
本明細書に開示される切断組成物は、ビオチン－ストレプトアビジンの結合対を破壊することが望ましい他の用途で使用されてもよい。
【0020】
別の例では、ビオチン化ＤＮＡライブラリ断片は、デスチオビオチン化ＤＮＡライブラリ断片で置き換えられる。この例では、切断は、ライブラリ断片の空間的放出を可能にする条件下で活性化される。「空間的放出」とは、ＤＮＡ断片が、慣性流体混合の不在下で放出され、したがって、断片が解放された固体支持体の近傍でフローセル表面上に制御可能に拡散及び播種することができることを意味する。フローセル表面上で切断が起こる場合、切断条件は、フローセル表面上の化学的性質、例えば、高分子ヒドロゲル、増幅プライマーなど）に悪影響を及ぼすことがない。
【0021】
更に別の例では、ＤＮＡライブラリ断片は、二重放出機構で固体支持体に付着している。二重放出機構は、切断部位及びスプリントを含み、その両方がライブラリ断片を固体支持体に保持し、その各々が異なる放出プロセスを含む。ライブラリ断片放出が望まれる場合、好適な切断剤を使用して切断部位を最初に除去し、次いで、熱を使用してスプリントを除去してもよい。切断条件が２つの直交プロセス（一方のプロセスが他方のプロセスを開始しない、それに影響を及ぼさない、又はそれを別様に妨害しない）を含むため、この例は、ライブラリ断片の制御放出を可能にする。
【0022】
定義
【0023】
本明細書で使用される用語は、別段の指定がない限り、関連技術の通常の意味をとるものと理解されるであろう。本明細書で使用されるいくつかの用語及びそれらの意味は、以下に記載される。
【0024】
本明細書で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上明確に別段の指示がない限り、単数形並びに複数形の両方を指す。本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、「包含する」、「含有する」又は「特徴とする」と同義であり、包括的又は非限定的であり、更なる列挙されていない要素又は方法工程を除外しない。
【0025】
「一例」、「別の例」、「例」などへの本明細書全体を通じての言及は、例に関連して記載されている特定の要素（例えば、特徴、構造、組成、構成、及び／又は特性）が、本明細書に記載されている少なくとも１つの例に含まれており、他の例に存在しても、存在しなくてもよいことを意味している。更に、文脈上明確に別段の指示がない限り、任意の例に関する記載される要素は、様々な例において任意の好適な様式で組み合わせられ得ることを理解すべきである。
【0026】
特許請求の範囲を含む本開示全体で使用される「実質的に」及び「約」という用語は、処理における変動などに起因するような小さな変動を記載及び説明するために使用される。例えば、それらの用語は、表示値から±１０％以下、例えば、表示値から±５％以下、例えば、表示値から±２％以下、例えば、表示値から±１％以下、例えば、表示値から±０．５％以下、例えば、表示値から±０．２％以下、例えば、表示値から±０．１％以下、例えば、表示値から±０．０５％以下を指すことができる。
【0027】
更に、本明細書で提供される範囲は、明示的に列挙されているかのように、表示範囲及び表示範囲内の任意の値又は部分範囲を含むことを理解すべきである。例えば、約２ｍｍ～約３００ｍｍによって表される範囲は、約２ｍｍ～約３００ｍｍの明示的に記載された限界だけでなく、約１５ｍｍ、２２．５ｍｍ、２４５ｍｍなどの個々の値、及び約２０ｍｍ～約２２５ｍｍなどの部分範囲も含むと解釈するべきである。
【0028】
アダプター：例えば、ライゲーション又はタグメンテーションによって核酸分子に融合され得る直鎖状オリゴヌクレオチド配列。好適なアダプターの長さは、約１０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、又は約１２ヌクレオチド～約６０ヌクレオチド、又は約１５ヌクレオチド～約５０ヌクレオチドの範囲であり得る。アダプターは、ヌクレオチド及び／又は核酸の任意の組み合わせを含み得る。いくつかの例では、アダプターは、プライマー、例えば、ユニバーサルヌクレオチド配列（例えば、Ｐ５又はＰ７配列）を含むプライマーの少なくとも一部分に相補的な配列を含むことができる。具体的な一例として、配列の一方の末端におけるアダプターは、第１のフローセルプライマーの少なくとも一部分に相補的な配列を含み、断片の他方の末端におけるアダプターは、第２のフローセルプライマーの少なくとも一部分と同一の配列を含む。相補的アダプターは、第１のフローセルプライマーにハイブリダイズすることができ、同一のアダプターは、その相補的コピーのための鋳型であり、クラスタリング中に第２のフローセルプライマーにハイブリダイズすることができる。いくつかの例では、アダプターは、配列決定プライマー配列又は配列決定結合部位を含むことができる。異なるアダプターの組み合わせを、ＤＮＡ断片などの核酸分子に組み込むことができる。
【0029】
化学的捕捉部位：標的材料（例えば、複合体、タンパク質バイオマーカなど）の局在化を可能にする化学的特性で修飾されているフローセル表面の一部分。一例では、捕捉部位は、化学的捕捉剤（すなわち、標的分子（例えば、複合体）に付着、保持、又は結合することができる材料、分子又は部分）を含んでもよい。化学捕捉剤の一例は、標的材料（又は標的材料に付着した連結部分）に結合し得る受容体リガンド結合対（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、レクチン、炭水化物、核酸結合タンパク質、エピトープ、抗体など）のメンバーを含む。化学捕捉剤の更に別の例は、標的材料と静電相互作用、水素結合、又は共有結合（例えば、チオールジスルフィド交換、クリックケミストリ、ディールス・アルダー反応など）を形成することができる化学試薬である。
【0030】
複合体：固体支持体などのキャリア、及びキャリアに付着した配列決定可能な核酸断片。本明細書に開示される実施例のうちのいくつかでは、キャリアはまた、他のメンバーが捕捉部位の一部であるビオチン－ストレプトアビジン結合対の一方のメンバーを含む。
【0031】
堆積：手動又は自動であってもよく、いくつかの事例では、表面特性の変更をもたらす、任意の好適な塗布技術。一般に、堆積は、蒸着技術、コーティング技術、グラフト技術などを使用して行われ得る。いくつかの具体的な例としては、化学蒸着（chemical vapor deposition：ＣＶＤ）、スプレーコーティング（例えば、超音波スプレーコーティング）、スピンコーティング、ダンク又はディップコーティング、ドクターブレードコーティング、液滴分配（puddle dispensing）、フロースルーコーティング、エアロゾル印刷、スクリーン印刷、マイクロコンタクト印刷、インクジェット印刷などが挙げられる。
【0032】
くぼみ：基材又はパターン化された樹脂による隙間領域によって少なくとも部分的に囲まれる表面開口部を有する、基材又はパターン化された樹脂における別個の凹状の機構。くぼみは、表面の開口部において、例として、円形、楕円形、正方形、多角形、星形（任意の数の頂点を持つ）などの、様々な形状をとることができる。表面と直交するように取られたくぼみの断面は、湾曲形状、正方形、多角形、双曲線、円錐、角のある形状などであることができる。例として、くぼみは、ウェル又は２つの相互接続されたウェルであり得る。くぼみはまた、尾根、階段状の作りなど、より複雑な構造を有し得る。
【0033】
デスチオビオチン：ビオチンよりもアビジン及びストレプトアビジンにしっかりと結合しない、硫黄を含まないビオチン類似体。この用語はまた、デュアルデスチオビオチン及びトリプルデスチオビオチンを含んでもよい。
【0034】
各々：アイテムのコレクションを指して使用される場合、各々がコレクション内の個々のアイテムを識別するが、必ずしもコレクション内の全てのアイテムを指すわけではない。明示的な開示又は文脈がそうでないことを明確に指示する場合、例外が生じ得る。
【0035】
フローセル：反応を実行することができるチャンバ（例えば、フローチャネルを含んでもよい）と、チャンバに試薬を送達するための入口と、チャンバから試薬を除去するための出口とを有する容器。いくつかの例では、チャンバは、チャンバ内で発生する反応の検出を可能にする。例えば、チャンバは、アレイ、光学的に標識された分子などの光学的検出を可能にする１つ以上の透明な表面を含み得る。
【0036】
フローチャネル：液体試料を選択的に受け取ることができ、結合又はその他の方法で付着した２つの構成要素間に画定された領域。いくつかの例では、フローチャネルは、２つのパターン化された又はパターン化されていない配列決定表面の間に画定され得、したがって、配列決定表面の１つ以上の構成要素と流体連通し得る。
【0037】
断片：遺伝物質の一部分又は一片（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）。隣接性が保存されたライブラリ断片は、断片化されているより長い核酸試料のより小さい一片であり、より長い核酸試料の隣接性情報が断片に保存されている。
【0038】
核酸分子又は試料：任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドであり、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらの類似体、又はそれらの混合物を含み得る。この用語は、一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドを指す場合がある。
【0039】
「鋳型」核酸分子（又は鎖）は、解析されることになる配列を指し得る。
【0040】
核酸分子中のヌクレオチドは、天然に存在する核酸及びそれらの機能性類似体を含み得る。機能性類似体の例は、配列特異的な形式で核酸にハイブリダイズすることができるか、又は特定のヌクレオチド配列の複製のための鋳型として使用され得る。天然に存在するヌクレオチドは、一般に、ホスホジエステル結合を含有する骨格を有する。類似体構造は、当技術分野で知られている様々なもののいずれかを含む代替骨格結合を有することができる。天然に存在するヌクレオチドは、一般に、デオキシリボース糖（例えば、ＤＮＡに見られる）又はリボース糖（例えば、ＲＮＡに見られる）を有する。類似体構造は、当技術分野で知られている様々なもののいずれかを含む代替糖部分を有することができる。ヌクレオチドは、天然又は非天然の塩基を含むことができる。天然のＤＮＡは、アデニン、チミン、シトシン、及び／又はグアニンのうちの１つ以上を含むことができ、天然のＲＮＡは、アデニン、ウラシル、シトシン、及び／又はグアニンのうちの１つ以上を含むことができる。ロックド核酸（locked nucleic acid：ＬＮＡ）及び架橋核酸（bridged nucleic acid：ＢＮＡ）などの任意の非天然塩基が使用され得る。
【0041】
プライマー：ライブラリ断片に付着したアダプターなど、標的配列にハイブリダイズし得る核酸分子。一例として、増幅プライマーは、鋳型増幅及びクラスタ生成の開始点として機能し得る。別の例として、合成された核酸（鋳型プライマー）鎖は、合成された核酸鎖に相補的な新しい鎖の合成をプライミングするために、（例えば、配列決定プライマー）がハイブリダイズし得る部位を含み得る。任意のプライマーは、ヌクレオチド又はそれらの類似体の任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの例では、プライマーは、一本鎖のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである。プライマーの長さは、任意の数の塩基の長さであることができ、様々な非天然ヌクレオチドを含むことができる。一例では、配列決定プライマーは、１０～６０塩基、又は２０～４０塩基の範囲の短鎖である。
【0042】
配列決定可能な核酸断片：３’及び５’末端にアダプターを有する遺伝物質の一部分。配列決定可能な核酸断片では、各アダプターは、既知のユニバーサル配列（例えば、フローセル上のプライマーの少なくとも一部分に相補的又はそれと同一）及び配列決定プライマー配列を含む。両方のアダプターは、インデックス（バーコード又はタグ）配列を含むこともできる。一例では、一端（例えば、Ｐ５’又はＰ５配列を含む）は、固体支持体インデックスを含み得、他端（Ｐ７又はＰ７’配列を含む）は、試料インデックスを含み得る。配列決定可能な核酸断片は、トランスポゾンの挿入を介して結合されてもよく、挿入されたＤＮＡ分子は固体支持体（例えば、ビーズ）の表面に固定化され、又は、結合対若しくは他の切断可能なリンカを介して直接固定化され、又は、ハイブリダイゼーションにより結合され、相補的アダプター配列が固体支持体の表面上に存在する。
【0043】
配列決定表面：それにグラフトされた１つ以上のタイプの増幅プライマーを有する高分子ヒドロゲルを含む。配列決定表面はまた、増幅プライマーで又は増幅プライマーの近くで、複合体を固定化するための化学的捕捉剤を含んでもよい。
【0044】
固体支持体：例えば、球形、卵形、微小球、又は規則的若しくは不規則な寸法を有するかどうかにかかわらずその他の認識される粒子形状を特徴とする形状を有する、硬質又は半硬質の材料で作製された小体（small body）。固体支持体は、それに対して付着した配列決定ライブラリを有することができる。
【0045】
標的材料：ビオチン－ストレプトアビジン結合又はデスチオビオチン－ストレプトアビジン結合を含む、任意の物質。
【0046】
転移鎖及び非転移鎖：「転移鎖」という用語は、２つのハイブリダイズされたトランスポゾン末端の転移した部分を含む配列を指す。同様に、「非転移鎖」という用語は、２つのハイブリダイズされたトランスポゾン末端の非転写部分を含む配列を指す。転移鎖の３’末端は、インビトロ転位反応において二本鎖断片に連結又は転移される。転移されたトランスポゾン末端配列に相補的なトランスポゾン末端配列を呈する非転移鎖は、インビトロ転位反応において二本鎖断片に連結又は転移されない。
【0047】
トランスポサーゼ：トランスポゾン末端含有組成物（例えば、トランスポゾン、トランスポゾン末端、トランスポゾン末端組成物）を備えた機能複合体を形成し、例えば、インビトロ転位反応で、それがインキュベートされる二本鎖ＤＮＡ試料へのトランスポゾン末端含有組成物の挿入又は転位を触媒することができる、酵素。本明細書に提示されるトランスポサーゼはまた、レトロトランスポゾン及びレトロウイルスからのインテグラーゼを含み得る。本明細書に記載の多くの例は、Ｔｎ５トランスポサーゼ及び／又は過活性Ｔｎ５トランスポサーゼに言及するが、意図された目的でＤＮＡ試料に５’タグを付けて断片化するのに十分な効率でトランスポゾン末端を挿入し得る任意の転位システムを使用し得ることが理解される。特定の例では、転位システムは、トランスポゾン末端をランダムに又はほぼランダムな様式で挿入し、ＤＮＡ試料に５’タグを付けて断片化することができる。
【0048】
トランスポソーム複合体：組込み酵素（例えば、インテグラーゼ又はトランスポサーゼ）と、組込み認識部位（例えば、トランスポサーゼ認識部位）を含む核酸との間で形成される複合体。例えば、トランスポソーム複合体は、非共有結合複合体形成を支持する条件下で二本鎖トランスポゾンＤＮＡとプレインキュベートされたトランスポサーゼ酵素であり得る。二本鎖トランスポゾンＤＮＡは、例えば、Ｔｎ５ＤＮＡ、Ｔｎ５ＤＮＡの一部分、トランスポゾン末端組成物、トランスポゾン末端組成物の混合物、又は過活性Ｔｎ５トランスポサーゼなどのトランスポサーゼと相互作用することができる他の二本鎖ＤＮＡを含み得る。
【0049】
トランスポゾン末端：インビトロ転位反応で機能するトランスポサーゼ又はインテグラーゼ酵素との複合体を形成するために必要な、ヌクレオチド配列（「トランスポゾン末端配列」）のみを呈する、二本鎖核酸ＤＮＡ。いくつかの例では、トランスポゾン末端は、転位反応においてトランスポサーゼと機能複合体を形成することができる。例として、トランスポゾン末端は、１９塩基対（base pair：ｂｐ）外端（outer end：「ＯＥ」）トランスポゾン末端、内端（inner end：「ＩＥ」）トランスポゾン末端、又は野生型若しくは変異体Ｔｎ５トランスポサーゼによって認識される「モザイク末端」（mosaic end：「ＭＥ」）トランスポゾン末端を含むことができる。トランスポゾン末端は、インビトロ転位反応においてトランスポサーゼ又はインテグラーゼ酵素と機能複合体を形成するのに好適な任意の核酸又は核酸類似体を含み得る。例えば、トランスポゾン末端は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾された塩基、非天然の塩基、修飾された骨格を含み得、一方の鎖又は両方の鎖にニックを含み得る。「ＤＮＡ」という用語は、トランスポゾン末端の組成物に関連して本開示では使用されてもよいが、任意の好適な核酸又は核酸類似体がトランスポゾン末端において利用され得ることが理解されるべきである。
【0050】
切断組成物
【0051】
本明細書に開示される切断組成物の第１の例は、７０℃以下の温度でビオチン－ストレプトアビジン相互作用を破壊するのに好適である。
【0052】
切断組成物の第１の例は、約１０体積％～約５０体積％のホルムアミド試薬と、残部として塩緩衝液とを含む。
【0053】
ホルムアミド試薬は、ホルムアミド：
を含み、これはまた、メタンアミドとしても知られている。いくつかの例では、ホルムアミド試薬は、ホルムアミドを単独で含んでもよい（いかなる他の構成要素も含まない）。したがって、いくつかの例では、ホルムアミド試薬は、１００％ホルムアミドである。他の例では、ホルムアミド試薬は、ホルムアミド及び任意選択的な緩衝液を含んでもよい。
【化1】
【0054】
切断組成物の第１の例の残部は、塩緩衝液である。任意の好適な塩緩衝液を使用してもよい。例として、塩緩衝液は、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、又はそれらの組み合わせを含む水溶液である。具体的な一例では、塩緩衝液は、水中約０．７５Ｍ（７５０ｍＭ）の塩化ナトリウム及び約７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む。いくつかの例では、塩緩衝液は、約０．５Ｍの塩化ナトリウム～約３Ｍの塩化ナトリウム、及び／又は約５０ｍＭのクエン酸ナトリウム～約３００ｍＭのクエン酸ナトリウムを有する水を含む。
【0055】
塩緩衝液はまた、生体適合性界面活性剤を含んでもよい。好適な生体適合性界面活性剤の例は、ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート又はポリソルベート２０（Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈによってＴＷＥＥＮ（商標）２０として市販されている）である。いくつかの例では、塩緩衝液は、（塩緩衝液の総重量に基づいて）約０．２５重量％～約１．５重量％の生体適合性界面活性剤を更に含む。
【0056】
切断組成物の第１の例は、約１０体積％～約５０体積％のホルムアミド試薬と、残部として塩緩衝液とを含む。したがって、切断組成物の第１の例における塩緩衝液（及び、その個々の構成要素）の量は、存在するホルムアミド試薬の量に依存する。例として、切断組成物の第１の例は、約１０体積％のホルムアミド試薬及び約９０体積％の塩緩衝液；又は約２０体積％のホルムアミド試薬及び約８０体積％の塩緩衝液；又は約３０体積％のホルムアミド試薬及び約７０体積％の塩緩衝液；又は約４０体積％のホルムアミド試薬及び約６０体積％の塩緩衝液；又は約５０体積％のホルムアミド試薬及び約５０体積％の塩緩衝液を含んでもよい。より多量（５０％超）のホルムアミド試薬が含まれる場合、増幅プライマーにハイブリダイズされた放出ライブラリ断片は、２５℃で変性する可能性があり、これは望ましくない。
【0057】
いくつかの例では、切断組成物の第１の例は、ホルムアミド及び任意選択的な緩衝液を含む約１０体積％～約５０体積％のホルムアミド試薬と、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、及び生体適合性界面活性剤を含む残部として塩緩衝液と、からなる。この例では、切断組成物の第１の例は、いかなる他の構成要素も含まない。
【0058】
本明細書に開示される切断組成物の第２の例は、約６０℃～約７０℃の範囲の温度でデスチオビオチン－ストレプトアビジン相互作用を破壊するのに好適である。
【0059】
切断組成物の第２の例としては、遊離ビオチン及び塩緩衝液が挙げられる。
【0060】
切断組成物の第２の例における遊離ビオチンの量は、部分的には、切断組成物で破壊されるデスチオビオチン－ストレプトアビジン相互作用の量に依存する。一例では、遊離ビオチンは、破壊されるデスチオビオチン－ストレプトアビジン相互作用の量よりも約１０モル～約１００モル高い範囲の量で存在してもよい。具体的な一例として、遊離ビオチンは、約２．５μＭ～約１０ｍＭの範囲の濃度で切断組成物の第２の例に存在する。別の例では、遊離ビオチンは、約４μＭ～約８ｍＭの範囲の濃度で切断組成物の第２の例に存在する。
【0061】
切断組成物の第２の例の残部は、塩緩衝液である。塩を含む任意の好適な水溶液を使用してもよい。いくつかの例では、塩は、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、又はそれらの組み合わせである。塩緩衝液は、比較的高い塩濃度を有する。例えば、塩緩衝液は、水中約０．７５Ｍの塩～約０．８５Ｍの塩を含む。具体的な一例では、塩緩衝液は、水中約０．７５Ｍ（７５０ｍＭ）の塩化ナトリウム及び約７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む。
【0062】
塩緩衝液はまた、生体適合性界面活性剤を含んでもよい。好適な生体適合性界面活性剤の例としては、ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート又はポリソルベート２０（Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈによってＴＷＥＥＮ（商標）２０として市販されている）が挙げられる。いくつかの例では、塩緩衝液は、約０．１重量％～約１重量％の生体適合性界面活性剤を更に含む。
【0063】
いくつかの例では、切断組成物の第２の例は、遊離ビオチンと、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、及び生体適合性界面活性剤を含む残部として塩緩衝液と、からなる。この例では、切断組成物の第２の例は、いかなる他の構成要素も含まない。
【0064】
ビオチン－ストレプトアビジン結合又はデスチオビオチン－ストレプトアビジン結合を含む標的材料
【0065】
本明細書に開示されるいくつかの例では、第１の切断組成物は、破壊されるビオチン－ストレプトアビジン結合を含む任意の標的材料と共に使用されてもよい。本明細書に開示される他の例では、第２の切断組成物は、破壊されるデスチオビオチン－ストレプトアビジン結合を含む任意の標的材料と共に使用されてもよい。これらの例のうちのいずれでも、標的材料は、複合体であってもよい。
【0066】
複合体１０Ａ及び１０Ｂのいくつかの例が、それぞれ、図１Ａ及び図１Ｂに示される。本明細書に開示される方法のいくつかの例では、複合体１０Ａ、１０Ｂは、固体支持体１２、及びビオチン－ストレプトアビジン結合を介して固体支持体１２に付着したＤＮＡライブラリ断片１４、１４’、１４”を含む。本明細書に開示される方法の他の例では、複合体１０Ａ、１０Ｂは、固体支持体１２、及びデスチオビオチン－ストレプトアビジン結合を介して固体支持体１２に付着したＤＮＡライブラリ断片１４、１４’、１４”を含む。
【0067】
固体支持体１２は、ガラス（例えば、制御された細孔ガラスビーズ）、磁気応答性材料、プラスチック、例えば、アクリル、ポリスチレン、又はスチレンと別の材料とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン又はポリテトラフルオロエチレン（Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｏｕｒｓ ＣｏからのＴＥＦＬＯＮ（登録商標））；アガロース、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ビーズ（Ｃｙｔｉｖｉａから入手可能なアガロースの架橋ビーズ形態）、又はＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）ビーズ（Ｃｙｔｉｖｉａから入手可能なデキストランの架橋ビーズ形態）などの多糖類又は架橋多糖類；ナイロン；ニトロセルロース；樹脂；シリコン及び変性シリコンを含むシリカ又はシリカ系材料；炭素繊維；金属；無機ガラス；光ファイバーバンドル；又は他の様々なポリマーであり得るが、これらに限定されない。
【0068】
「磁気応答性」材料は、磁場に対応する。磁気応答性固体支持体の例は、磁気応答性材料を含むか、又はそれらから構成される。磁気応答性材料の例としては、常磁性材料、強磁性材料、フェリ磁性材料、及びメタ磁性材料が挙げられる。好適な常磁性材料の例としては、鉄、ニッケル、及びコバルト、並びにＦｅ３Ｏ４、ＢａＦｅ１２Ｏ１９、ＣｏＯ、ＮｉＯ、Ｍｎ２Ｏ３、Ｃｒ２Ｏ３、及びＣｏＭｎＰなどの金属酸化物が挙げられる。市販例の１つには、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標）Ｍ－２８０ストレプトアビジン（ストレプトアビジンコーティング超常磁性ビーズ）が上げられる。いくつかの例では、磁気応答性材料は、ポリマービーズのシェルに埋め込まれる。他の例では、磁気応答性材料はビーズ形態であり、酸化シリコン又は窒化シリコンなどの不動態化材料でコーティングされる。
【0069】
固体支持体１２の任意の例は、固形ビーズ、多孔質ビーズ、又は中空ビーズの形態を有してもよい。
【0070】
図１Ａ又は図１Ｂには示されていないが、固体支持体１２は、ビオチン－ストレプトアビジン結合対又はデスチオビオチン－ストレプトアビジン結合対の一方のメンバーで官能化される。「結合対」は、一般に、互いに付着することができる２つの剤（例えば、材料、分子、部分）を指す。本明細書に開示されるいくつかの例では、結合対は、ストレプトアビジン及びビオチンを含む。本明細書に開示される他の例では、結合対は、ストレプトアビジン及びデスチオビオチンを含む。結合対のストレプトアビジンは、固体支持体１２の表面に配置されてもよく、結合対のビオチン又はデスチオビオチン（その各々が参照番号２０で表される）は、ＤＮＡライブラリ断片１４、１４’、１４’’に付着されてもよい。
【0071】
いくつかの例では、固体支持体１２上のストレプトアビジンは、それが、（ｉ）ＤＮＡライブラリ断片１４、１４’、１４’’に付着したビオチン又はデスチオビオチン２０に結合することができる点、及び（ｉｉ）フローセルの配列決定表面上のビオチン又はデスチオビオチン捕捉部位に結合することができる点で、多官能性であってもよい。他の例では、固体支持体１２は、２つの異なる結合対メンバー、例えば（ｉ）ストレプトアビジン（ＤＮＡライブラリ断片１４、１４’、１４’’に付着したビオチン又はデスチオビオチン２０に結合することができる）、及び（ｉｉ）別のメンバー（フローセルの配列決定表面上で捕捉部位に結合することができる）で官能化させてもよい。
【0072】
固体支持体１２の官能化は、固体支持体１２をストレプトアビジンにより単独で、又は別の結合対メンバーと組み合わせて、コーティングすることを含んでもよい。
【0073】
ＤＮＡライブラリ断片１４、１４’、１４’’は、固体支持体１２に付着している。各ＤＮＡライブラリ断片１４、１４’、１４’’は、３’及び５’末端にアダプター（例えば、１８、１８’、１８’’、２２、２２’、２２’’）を有する長い遺伝物質の一部（例えば、断片１６、１６’、１６’’）を含む。ＤＮＡライブラリ断片１４、１４’、１４’’は、より長い遺伝物質を断片化し、断片の末端に望ましいアダプターを組み込む任意のライブラリ調製技術を使用して調製されてもよい。いくつかの好適なライブラリ調製技術は、図１Ａ及び図１Ｂを参照して説明される。しかしながら、他のライブラリ調製技術もまた使用され得ることを理解すべきである。
【0074】
図１Ａは、ＤＮＡライブラリ断片１４、１４’を含む複合体１０Ａの例を示す。これらのＤＮＡライブラリ断片１４、１４’は、断片１６、１６’（より大きな核酸試料由来）及び断片１６、１６’の対向する末端におけるアダプター１８、２２又は１８’、２２’を含むため、配列決定可能である。断片１６、１６’の隣接性は、固体支持体１２上で保存される。
【0075】
複合体１０Ａを作製するための方法の例が本明細書に記載されるが、配列決定可能な核酸断片１４、１４’が、ビオチン－ストレプトアビジン結合対又はデスチオビオチン－ストレプトアビジン結合対を介して固体支持体１２に付着するものであるならば、他の方法を使用してもよいことを理解すべきである。
【0076】
図１Ａに示す複合体１０Ａを形成する方法の一例では、アダプター配列１８、１８’は、ビオチン又はデスチオビオチン２０に結合される。一例では、アダプター配列１８、１８’は、第１の配列決定プライマー配列（例えば、読み取り１配列決定プライマー配列）及びフローセル上の増幅プライマー（例えば、Ｐ５）のうちの１つの少なくとも一部分に相補的な第１の配列（Ｐ５’）を含んでもよい（図３Ａ、図３Ｂ、及び図３Ｃに示される）。アダプター配列１８、１８’は、インデックス配列又はバーコート配列も含み得る。アダプター配列１８、１８’はビオチン又はデスチオビオチン２０に結合し、その結果、次に、ビオチン－ストレプトアビジン結合対又はデスチオビオチン－ストレプトアビジン結合対のストレプトアビジンを含む固体支持体１２の表面に結合することができる。
【0077】
この例では、トランスポソーム複合体（図示せず）もまた、ライブラリ調製法の開始時に固体支持体１２に結合されてもよい。トランスポソーム複合体を固体支持体１２、にロードする前に、部分的なＹアダプターをトランスポサーゼ酵素（例えば、２つのＴｎ５分子）と混合し、トランスポソーム複合体を形成してもよい。部分的なＹアダプターは、互いにハイブリダイズする２つのモザイク末端配列（又は他のトランスポゾン末端配列）を含んでもよい。モザイク末端配列の一方は、２つの遊離末端を有することから、遊離のモザイク末端配列と呼ばれ、例えば、一方の末端はアダプター１８、１８’に付着することができ、他方の末端はタグ付け中に、断片化されたＤＮＡ鎖１６、１６’に付着することができる。このモザイク末端配列は、転移鎖の一部である。モザイク末端配列の他方は、別のアダプター（例えば、２２、２２’）に付着させることができ、アダプターは、第２の配列決定プライマー配列（例えば、読み取り２配列決定プライマー配列）、及びフローセル上の別の増幅プライマー（Ｐ７）の少なくとも一部分と同一である第２の配列（Ｐ７）を含む。増幅中、同一の配列により、フローセル上の他の増幅プライマー（Ｐ７）の少なくとも一部分に相補的なコピーの形成が可能になる。アダプター配列２２、２２’は、タグ付け中に断片化されたＤＮＡ鎖１６、１６’に付着されず、したがって、非転移鎖の一部である。
【0078】
トランスポソーム複合体を固体支持体１２上にロードすることは、トランスポソーム複合体を固体支持体１２と混合すること、遊離モザイク末端の遊離末端をアダプター配列１８、１８’の３’末端にライゲーションするための好適な条件に混合物を曝露することを含んでもよい。個々のトランスポソーム複合体は、固体支持体１２上のアダプター配列１８、１８’の各々に付着されてもよい。
【0079】
次いで、複合体１０Ａを形成するこの方法の例では、タグ付けプロセスが行われ得る。より長い核酸試料（例えば、ＤＮＡ）を含む流体（例えば、タグ付け緩衝液）が、アダプター配列１８、１８’及びそれに結合したトランスポソーム複合体を有する固体支持体１２に追加されてもよい。試料がトランスポソーム複合体と接触すると、より長い核酸試料にタグ付けられる。より長い核酸試料は断片１６、１６’に断片化され、（例えば、遊離モザイク（又は他のトランスポゾン）末端配列の他方の遊離末端のライゲーションによって）各々がその５’末端で部分的なＹアダプターにタグ付けされる。より長い核酸試料の連続的なタグ付けにより、結果としてトランスポソーム複合体間で複数の架橋分子が得られる。架橋分子は、固体支持体１２の周囲を包み込む。トランスポソーム複合体は、架橋分子としてより長い核酸試料の隣接性を維持する。
【0080】
次いで、トランスポサーゼ酵素を、ドデシル硫酸ナトリウム（sodium dodecyl sulfate：ＳＤＳ）処理又は熱若しくはプロテイナーゼＫ消化によって除去することができる。トランスポサーゼ酵素を除去すると、断片１６、１６’が固体支持体１２に付着したままになる。
【0081】
配列決定可能なＤＮＡライブラリ断片１４、１４’を完成させるために、試料断片１６、１６’がアダプター配列２２及び２２’に確実に付着するように、更なる伸長及びライゲーションが行われる。得られた複合体１０Ａは図１Ａに示される。
【0082】
各配列決定可能なＤＮＡライブラリ断片１４、１４’は、いずれかの末端にそれぞれのアダプター配列１８及び２２又は１８’及び２２’が付着した、隣接性が保存されたライブラリ断片１６、１６’を含む。アダプター配列１８、１８’は、最初に固体支持体１２に結合したものであり、第１の配列決定プライマー配列、及びフローセルプライマーの一方に相補的な第１の配列を含む。アダプター配列１８、１８’は、ビオチン－ストレプトアビジン結合対又はデスチオビオチン－ストレプトアビジン結合対のビオチン又はデスチオビオチンに付着している。アダプター配列２２、２２’は部分的なＹアダプターからのものであり、別のフローセルプライマーと同一の第２の配列及び第２の配列決定プライマー配列を含む。配列決定可能な各ＤＮＡライブラリ断片１４、１４’には、増幅（例えば、ブリッジ増幅など）及び配列決定に好適なアダプターが含まれるため、ＰＣＲ増幅は行われない。したがって、これらの断片１４、１４’は配列決定可能である。更に、隣接性が保存されたライブラリ断片１６、１６’は同じ長い核酸試料に由来するものであることから、元の試料の隣接性が保存され、ライブラリ断片１４、１４’は連結された長い読み取りアプリケーションに好適であり得る。
【0083】
図１Ｂは、固体支持体１２と、ビオチン－ストレプトアビジン結合対又はデスチオビオチン－ストレプトアビジン結合対を使用して固体支持体１２に付着した配列決定可能ＤＮＡライブラリ断片１４’’とを含む、別の複合体１０Ｂを示す。一例では、ＰＣＲを含まないヌクレオチドライブラリをチューブ中に作り出し、次いで、そのライブラリをチューブ中の固体支持体１２にハイブリダイズさせる。図１Ｂに示す例では、アダプター１８’’、２２’’は、チューブ内のライブラリ断片１６’’に追加され、そこに付着するビオチン又はデスチオビオチン２０を有するプライマーは、チューブ内でアダプター１８’’にハイブリダイズされ、次に、配列決定可能な核酸断片１４’’は、ビオチン－ストレプトアビジン結合対又はデスチオビオチン－ストレプトアビジン結合対を介して固体支持体１２に結合される。別の例では、固体支持体１２は、ビオチン－ストレプトアビジン結合対を介して支持体１２に付着したプライマー（例えば、支持体１２上のストレプトアビジン及びプライマーに付着したビオチン又はデスチオビオチン２０）を有してもよい。これらのプライマーは、ライブラリ断片１６、１６’に付着したアダプター１８’’にハイブリダイズする（したがって、プライマー及びビオチン又はデスチオビオチン２０は、断片１６、１６’の一方の末端にあり、他端にはない）。更に他の例では、伸長は、鎖置換酵素を使用して行われ得る。これにより、完全に二本鎖のライブラリ（例えば、図１Ｂに示すように、フォークやＹアダプターがない）が得られる。
【0084】
前述のように、ＤＮＡライブラリ断片１４、１４’、１４’’が、ビオチン－ストレプトアビジン結合対又はデスチオビオチン－ストレプトアビジン結合対を介して固体支持体１２に付着している限り、他のライブラリ調製技術を使用してもよい。
【0085】
二重放出機構を有するライブラリ調製ビーズ
【0086】
本明細書に開示されるいくつかの例では、ＤＮＡライブラリ断片１６、１６’、１６’’は、固体支持体１２に付着し、二重放出機構で固体支持体１２から放出可能である。二重放出機構は、切断部位及びスプリントを含み、これらの各々は、図２Ａ～図２Ｃを参照してより詳細に説明される。
【0087】
タグ付け前のライブラリ調製ビーズ１１の例を図２Ａに示す。ライブラリ調製ビーズ１１は、固体支持体１２、及び固体支持体１２に付着したトランスポソーム複合体５２を含み、トランスポソーム複合体５２は、（ｉ）トランスポサーゼ酵素５４と、（ｉｉ）トランスポサーゼ酵素５４に結合した二本鎖分子５６であって、この二本鎖分子５６が、（ｉｉａ）３’トランスポゾン末端配列６２Ａ、アダプター配列１８、切断部位６４、及び５’連結末端配列６６を含む転移鎖５８であって、アダプター配列１８及び５’連結末端配列６６が切断部位６４に隣接している、転移鎖５８と、（ｉｉｂ）３’トランスポゾン末端配列６２Ｂを含む非転移鎖６０と、を含む、二本鎖分子５６と、（ｉｉｉ）切断部位６４をスプリントするように、アダプター配列１８の少なくとも一部分及び５’連結末端配列６６の少なくとも一部分にハイブリダイズされたスプリント配列６８と、を含む。
【0088】
固体支持体１２は、本明細書に記載の例のうちのいずれかであってもよい。
【0089】
上述のように、トランスポソーム複合体５２は、トランスポサーゼ酵素５４を含む。トランスポサーゼ酵素５４は、本明細書に記載の例のうちのいずれかであってもよい。図２Ａに示される例では、トランスポソーム５４は、二本鎖分子５６に結合する各モノマーＡ、Ｂを有する二量体（例えば、Ｔｎ５）を含む。したがって、トランスポソーム複合体５２のこの例は、トランスポサーゼ酵素５４、及びトランスポサーゼ酵素５４のモノマーＡ、Ｂにそれぞれ結合した２つの二本鎖分子５６を含む。各二本鎖分子５６は、ハイブリダイズされた３’トランスポゾン末端配列６２Ａ、６２Ｂを含む。３’トランスポゾン末端配列６２Ａ及び３’トランスポゾン末端配列６２Ｂは、互いに相補的であり、トランスポサーゼ酵素５４と複合体を形成するために必要なヌクレオチド配列のみを含む。したがって、モノマーＡ、Ｂは、それぞれ、そのハイブリダイズされた３’トランスポゾン末端配列６２Ａ、６２Ｂを介して二本鎖分子５６に結合する。
【0090】
二本鎖分子５６の３’トランスポゾン末端配列６２Ａは、転移鎖５８の一部分を構成する。３’トランスポゾン末端配列６２Ａに加えて、転移鎖５８はまた、３’トランスポゾン末端配列６２Ａに連結されたアダプター配列１８を含み、切断部位６４はアダプター配列１８に連結され、５’連結末端配列６６は切断部位６４に連結されている。したがって、アダプター配列１８及び５’連結末端配列６６は、切断部位６４に隣接している。
【0091】
アダプター配列１８は、本明細書に開示される実施例のうちのいずれかであってもよい。増幅がフローセルの表面上で行われる場合、アダプター配列１８は、第１の配列決定プライマー配列（例えば、読み取り１配列決定プライマー配列）、フローセル上の増幅プライマー（例えば、Ｐ５）のうちの１つの少なくとも一部分に相補的な第１の配列（例えば、Ｐ５’）、及び／又はインデックス若しくはバーコード配列を含んでもよい。
【0092】
切断部位６４は、化学的に切断可能な切断部位、酵素的に切断可能な切断部位、及び光切断可能な（photocleavable）切断部位からなる群から選択される。
【0093】
いくつかの例では、切断部位６４は、化学的に切断可能な切断部位及び酵素的に切断可能な切断部位からなる群から選択される。化学的に切断可能な切断部位は、化学的に切断可能な核酸塩基、化学的に切断可能な修飾核酸塩基、又は化学的に切断可能なリンカ（例えば、核酸塩基間）を含んでもよい。化学的に切断可能な核酸塩基、修飾核酸塩基、又はリンカの例としては、ビシナルジオール（例えば、過ヨウ素酸によって切断可能な１，２－ジオール）、ジスルフィド、シラン、アゾベンゼン、光切断可能な基、アリルＴ（アリル官能基を有するチミンヌクレオチド類似体）、アリルエーテル、又はアジド官能性エーテルが挙げられる。酵素的に切断可能な切断部位は、酵素的に切断可能な核酸塩基であってもよい。酵素的に切断可能な核酸塩基は、グリコシラーゼ及びエンドヌクレアーゼとの反応、又はエキソヌクレアーゼとの反応による切断の影響を受けやすい場合がある。酵素的に切断可能な核酸塩基の具体的な一例は、デオキシウラシル（deoxyuracil：ｄＵ）であり、これは、ＵＳＥＲ酵素（ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）とＤＮＡグリコシラーゼ－リアーゼエンドヌクレアーゼＶＩＩＩとの混合物）によって標的化され得る。他の無塩基部位を使用してもよい。酵素的に切断可能な核酸塩基の別の具体的な例はＲＮＡであり、ＲＮａｓｅで標的化することができる。
【0094】
他の例では、切断部位６４は、光切断可能な部位であってもよい。光切断可能な部位は、特定の波長の光への曝露による切断の影響を受けやすい場合がある。光切断部位の例は、以下の構造を有するニトロベンジルリンカである。
これは、３６５ｎｍの光を照射すると切断される。
【化2】
【0095】
５’連結末端配列６６は、固体支持体１２の表面に付着することができるヌクレオチド配列又は結合対メンバーであってもよい。いくつかの例では、固体支持体１２は、５’連結末端配列６６への共有結合のために、表面に反応性基を有してもよい。そのような反応性基の例としては、カルボン酸、第一級脂肪族アミン、芳香族アミン、芳香族クロロメチル（例えば、塩化ビニルベンジル）、アミド、ヒドラジド、アルデヒド、ヒドロキシル、チオール、及びエポキシが挙げられる。これらの反応性基は、固体支持体１２の表面に本質的に存在してもよく、又は任意の好適な官能化技術（例えば、化学反応、固体支持体１２の反応性基含有ポリマーなどによるコーティング）を通して固体支持体１２の表面に組み込まれてもよい。他の例では、固体支持体１２は、結合対の一方のメンバーでコーティングされてもよく、５’連結末端配列６６は、結合対の他方のメンバーに付着してもよい。
【0096】
スプリント配列６８は、アダプター配列１８の少なくとも一部分に相補的な部分、及び５’連結末端配列６６の少なくとも一部分に相補的な部分を有する、ヌクレオチド配列である。スプリント配列６８のそれぞれの部分は、スプリント配列６８が切断部位６４を架橋するように、アダプター配列１８及び５’連結末端配列６６のそれぞれの部分にハイブリダイズする。切断部位６４をスプリント又は架橋するスプリント配列６８の部分は、切断部位６４に付着していない。図２Ａ～図２Ｃには示されていないが、スプリント６８のいくつかの例は、５’連結末端配列６６全体に相補的な部分を含んでもよい。この例では、スプリント６８の３’末端は、結合対又は共有結合を介して固体支持体１２に付着してもよい。
【0097】
二本鎖分子５６の３’トランスポゾン末端配列６２Ｂは、非転移鎖６０の全体を構成する。
【0098】
図２Ｂは、ライブラリ調製ビーズ１１を含むタグ付けプロセスを概略的に示す。ＤＮＡ試料７０は、ライブラリ調製ビーズ１１と混合されてもよい。ＤＮＡ試料７０は、ＤＮＡであってもよく、又はＲＮＡ試料に由来する相補的ＤＮＡ（complementary DNA：ｃＤＮＡ）であってもよい。ＲＮＡ試料のｃＤＮＡ試料への変換は、逆転写酵素を利用する逆転写を使用して行ってもよい。いくつかの例では、逆転写及び第２の鎖の合成のためのキットが使用される。これらの例では、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの大容量ｃＤＮＡ逆転写キットが使用され得る。他の例では、逆転写及び鋳型スイッチ（第２の鎖用）用のキットが使用される。これらの例では、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓの鋳型スイッチングＲＴ酵素混合物が使用され得る。
【0099】
ＤＮＡ試料７０は、ライブラリ調製流体を生成するために、キャリア液体（例えば、タグ付け緩衝液）に組み込まれてもよい。このライブラリ調製流体は、ライブラリ調製ビーズ１１と混合されてもよい。トランスポソーム複合体５２は、試料ＤＮＡ７０に結合し、図２Ｂ中の稲妻によって示されるＤＮＡ骨格内に２つのニックを生成する。これにより、断片１６、１６’が作成される。図２Ｂに示される例では、ニックは、いずれかの鎖上で９塩基離れている。トランスポソーム複合体５２は、ニック間に７、８、９、１０、１１、又は１２ｂｐのギャップを生成できることを理解されたい。各トランスポソーム複合体５２の２つの鎖のうちの一方（例えば、転移鎖５８）は、各ニック位置で各断片１６、１６’の５’末端にライゲーションされる。転移鎖５８の各断片１６、１６’への付着を図２Ｃに示す。
【0100】
次いで、トランスポサーゼ酵素５４（モノマーＡ及びＢの両方）は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）処理又は熱若しくはプロテイナーゼＫ消化によって除去されてもよい。トランスポサーゼ酵素５４を除去すると、断片１６、１６’が転移鎖５８を介して固体支持体１２に付着したままになる。
【0101】
配列決定可能な断片１４、１４’（図１Ａに示される例と同様の両末端にアダプター１８、２２を含む）の形成を完了するために、試料断片１６、１６’が非転移鎖６０及び／又は追加のアダプター配列２２に付着することを確実にするために、更なる伸長及びライゲーションが行われる。いくつかの事例では、非転移鎖６０が（例えば、熱又は酵素的消化を介して）除去され、次いで、アダプター配列２２は、（例えば、伸長ライゲーションを介して）断片１６、１６’の３’末端に付加される。他の事例では、非転移鎖６０は断片１６、１６’の３’末端にライゲーションされ、次いで、アダプター２２は、ここでライゲーションされた非転移鎖６０に付加される。
【0102】
配列決定可能な断片１４、１４’を固体支持体１２から放出することが望ましい場合、二重放出機構は、図４を参照して本明細書で更に説明されるように使用されてもよい。
【0103】
フローセル
【0104】
いくつかの例では、複合体１０Ａ、１０Ｂ、又は調製済ライブラリ調製ビーズ１１’（図４に示される）は、増幅及び配列決定のためフローセルに導入される。フローセル２４の例の上面図が図３Ａに示される。図３Ｂ及び図３Ｃを参照して考察されるように、フローセル２４のいくつかの例は、２つの配列決定する対向した配列決定表面を含む。パターン化されていない配列決定表面３０、３０’の例が図３Ｂに示され、パターン化された配列決定表面３２、３２’の例が図３Ｃに示される。各配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’は基材（図３Ａで２６として概ね示される）によって支持され、フローチャネル（図３Ａで２８として概ね示される）は配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’の間に画定される。他の例では、フローセル２４は、基材によって支持された１つの配列決定表面、及び基材に付着した蓋を含む。これらの例では、フローチャネル２８は、配列決定表面３０又は３２と蓋との間に画定される。
【0105】
これらの例のうちのいずれでも、基材２６は、単層／材料であってもよい。単層基材の例は、図３Ｂの参照番号２６Ａ及び２６Ａ’に示される。好適な単層基材の例２６Ａ、２６Ａ’は、エポキシシロキサン、ガラス、修飾又は官能化ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレン、スチレンと他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン（ＣｈｅｍｏｕｒｓのＴＥＦＬＯＮ（登録商標）など）を含む）、環状オレフィン／シクロオレフィンポリマー（cyclo-olefin polymer：ＣＯＰ）（ＺｅｏｎのＺＥＯＮＯＲ（登録商標）など）、ポリアミドなど）、ナイロン（ポリアミド）、セラミック／酸化セラミック、シリカ、溶融シリカ、又はシリカベースの材料、ケイ酸アルミニウム、シリコン及び修飾シリコン（例えば、ホウ素ドープｐ＋シリコン）、窒化シリコン（Ｓｉ３Ｎ４）、酸化シリコン（ＳｉＯ２）、五酸化タンタル（Ｔａ２Ｏ５）又は他の酸化タンタル（ＴａＯｘ）、酸化ハフニウム（ＨｆＯ２）、炭素、金属、無機ガラスなどを含む。
【0106】
基材２６はまた、多層構造であり得る。多層基材の例は、図３Ｃの参照番号２６Ｂ及び２６Ｂ’に示される。多層構造２６Ｂ、２６Ｂ’のいくつかの例は、表面に酸化タンタル又は別のセラミック酸化物のコーティング層を備えたガラス又はシリコンを含む。図３Ｃを特に参照すると、多層構造２６Ｂ、２６Ｂ’の他の例は、その上にパターン化された樹脂３６、３６’を有する下部支持体３４、３４’を含む。多層基材２６Ｂ、２６Ｂ’の更に他の例は、シリコンオンインシュレータ（silicon-on-insulator：ＳＯＩ）基材を含み得る。
【0107】
一例では、基材２６（単層であるか、多層である）は、約２ｍｍ～約３００ｍｍの範囲の直径、又は最大約１０フィート（～３メートル）までの最大寸法を有する長方形のシート又はパネルを有し得る。一例では、基材２６は、約２００ｍｍ～約３００ｍｍの範囲の直径を有するウェーハである。別の例では、基材２４は、約０．１ｍｍ～約１０ｍｍの範囲の幅を有するダイである。例示的な寸法が提供されているが、任意の好適な寸法を有する基材２６を使用することができることを理解すべきである。別の例として、３００ｍｍの丸いウェーハよりも大きい表面積を有する長方形の支持体であるパネルが使用され得る。
【0108】
図３Ａに示す例では、フローセル２４は、フローチャネル２８を含む。いくつかのフローチャネル２８が示されるが、任意の数のチャネル２８がフローセル２４（例えば、単一のチャネル２８、４つのチャネル２８など）に含まれ得ることを理解すべきである。本明細書に開示される実施例のうちのいくつかでは、各フローチャネル２８は、２つの配列決定表面（例えば、３０と３０’又は３２と３２’）と２つの付着した基材（例えば、２６Ａ及び２６Ａ’又は２６Ｂ及び２６Ｂ’）との間で画定される領域である。本明細書に開示される実施例の他の例では、各フローチャネル２８は、１つの配列決定表面（例えば、３０又は３２）と蓋との間に画定された領域である。本明細書に記載の流体は、フローチャネル２８に導入され、かつそれから除去され得る。各フローチャネル２８は、フローセル２４内で互いにフローチャネル２８から分離され得、その結果、任意の特定のフローチャネル２８に導入された流体は、隣接するフローチャネル２８に流れ込まない。
【0109】
フローチャネル２８の一部分は、基材２６の材料に部分的に依存する任意の好適な技術を使用し、基材２６内に画定され得る。一例では、フローチャネル２８の一部分がガラス基材２６へとエッチングされる。別の例では、フローチャネル２８の一部分は、フォトリソグラフィ、ナノインプリントリソグラフィなどを使用し、多層基材２８Ｂ、２８Ｂ’の樹脂３６、３６’へとパターン化され得る。更に別の例では、別個の材料（例えば、図３Ｂ及び図３Ｃの材料５０）は基材２６に適用され、別個の材料がフローチャネル２８の壁の少なくとも一部分を画定してもよい。
【0110】
一例では、フローチャネル２８は直線の構成を有する。フローチャネル２８の長さ及び幅は、それぞれ、基材２６の長さ及び幅よりも小さくてもよく、その結果、フローチャネル２８を取り囲む基材表面の一部分は、別の基材２６への取り付けに利用可能である。いくつかの事例では、各フローチャネル２８の幅は、少なくとも約１ｍｍ、少なくとも約２．５ｍｍ、少なくとも約５ｍｍ、少なくとも約７ｍｍ、少なくとも約１０ｍｍ、又はそれ超であり得る。いくつかの事例では、各フローチャネル２８の長さは、少なくとも約１０ｍｍ、少なくとも約２５ｍｍ、少なくとも約５０ｍｍ、少なくとも約１００ｍｍ、又はそれ超であり得る。各フローチャネル２８の幅及び／又は長さは、上で指定された値よりも大きい、より小さい、又はそれらの間であり得る。別の例では、フローチャネル２８は正方形（例えば、１０ｍｍ×１０ｍｍ）である。
【0111】
各フローチャネル２８の深さは、例えば、マイクロコンタクト、エアロゾル、又はインクジェット印刷を使用し、流路壁を画定する別個の材料を堆積する場合、複数の単層の厚さまで小さくすることができる。他の例では、各フローチャネル２８の深さは、約１μｍ、約１０μｍ、約５０μｍ、約１００μｍ、又はそれ超であり得る。一例では、深さは、約１０μｍ～約１００μｍの範囲であり得る。別の例では、深さは約５μｍ以下である。各フローチャネル２８の深さは、上で指定された値よりも大きい、小さい、又はそれらの間であることを理解すべきである。フローチャネル２８の深さはまた、例えば、パターン化された配列決定表面３２、３２’が使用される場合、フローセル２４の長さ及び幅に沿って変化してもよい。
【0112】
図３Ｂは、パターン化されていない対向する配列決定表面３０、３０’を含むフローセル２４の断面図を示す。一例では、これらの表面３０、３０’の各々は、基材２６Ａ、２６Ａ’上に調製され得、次に、基材２６Ａ、２６Ａ’は、フローセル２４の例を形成するために互いに付着し得る。接着剤、結合を助ける放射線吸収材料などの任意の好適な結合材料５０を使用し、基材２６Ａ、２６Ｂを共に結合し得る。
【0113】
図３Ｂに示す例では、フローチャネル２８の一部は、単層基材２６Ａ、２６Ａ’の各々に画定される。例えば、各基材２６Ａ、２６Ａ’は、その中に画定された凹状領域３８、３８’を有し得、凹状領域には配列決定表面３０、３０’の構成要素が導入され得る。配列決定表面３０、３０’の構成要素によって占有されていない凹状領域３８、３８’内の任意の空間は、フローチャネル２８の一部であると見なされ得ることを理解すべきである。
【0114】
配列決定表面３０、３０’は、高分子ヒドロゲル４０、４０’、高分子ヒドロゲル４０、４０’に付着した増幅プライマー４２、４２’、及び化学的捕捉部位４４、４４’を含む。
【0115】
高分子ヒドロゲル４０、４０’の例としては、ポリ（Ｎ－（５－アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド－コ－アクリルアミド、ＰＡＺＡＭなどのアクリルアミドコポリマーが挙げられる。ＰＡＺＡＭ及び他のいくつかの形態のアクリルアミドコポリマーは、次の構造（Ｉ）で表され、
（式中、
ＲＡは、アジド、任意選択で置換アミノ、任意選択で置換アルケニル、任意選択で置換アルキン、ハロゲン、任意選択で置換ヒドラゾン、任意選択で置換ヒドラジン、カルボキシル、ヒドロキシ、任意選択で置換テトラゾール、任意選択で置換テトラジン、ニトリルオキシド、ニトロン、硫酸塩、及びチオールからなる群から選択され、
ＲＢはＨ又は任意選択で置換アルキルであり、
ＲＣ、ＲＤ、及びＲＥは各々、Ｈ及び任意選択で置換アルキルからなる群から独立して選択され、
－（ＣＨ２）ｐ－の各々は、任意選択で置き換えられ得、
ｐは１～５０の範囲の整数であり、
ｎは１～５０，０００の範囲の整数であり、及び
ｍは、１～１００，０００の範囲の整数である）。
【化3】
ＲＡは、アジド、任意選択で置換アミノ、任意選択で置換アルケニル、任意選択で置換アルキン、ハロゲン、任意選択で置換ヒドラゾン、任意選択で置換ヒドラジン、カルボキシル、ヒドロキシ、任意選択で置換テトラゾール、任意選択で置換テトラジン、ニトリルオキシド、ニトロン、硫酸塩、及びチオールからなる群から選択され、
ＲＢはＨ又は任意選択で置換アルキルであり、
ＲＣ、ＲＤ、及びＲＥは各々、Ｈ及び任意選択で置換アルキルからなる群から独立して選択され、
－（ＣＨ２）ｐ－の各々は、任意選択で置き換えられ得、
ｐは１～５０の範囲の整数であり、
ｎは１～５０，０００の範囲の整数であり、及び
ｍは、１～１００，０００の範囲の整数である）。
【0116】
当業者であれば、構造（Ｉ）において繰り返される特徴「ｎ」及び「ｍ」の配置が代表的なものであり、モノマーサブユニットがポリマー構造（例えば、ランダム、ブロック、パターン化、又はそれらの組み合わせ）中に任意の順序で存在し得ることを認識する。
【0117】
ＰＡＺＡＭ及び他の形態のアクリルアミドコポリマーの分子量は、約５ｋＤａ～約１５００ｋＤａ又は約１０ｋＤａ～約１０００ｋＤａの範囲であり得るか、あるいは具体的な例では、約３１２ｋＤａであり得る。
【0118】
いくつかの例では、ＰＡＺＡＭ及び他の形態のアクリルアミドコポリマーは線状ポリマーである。他のいくつかの例では、ＰＡＺＡＭ及び他の形態のアクリルアミドコポリマーは、軽度に架橋されたポリマーである。
【0119】
他の例では、高分子ヒドロゲル４０、４０’は、構造（Ｉ）の変形であり得る。一例では、アクリルアミドユニットはＮ，Ｎージメチルアクリルアミド
で置き換えられ得る。この例では、構造（Ｉ）のアクリルアミドユニットは
で置き換えられ得、ＲＤ、ＲＥ、及びＲＦは各々Ｈ又はＣ１～Ｃ６アルキルであり、ＲＧ及びＲＨは各々Ｃ１～Ｃ６アルキルである（アクリルアミドの場合のようにＨではない）。この例では、ｑは、１～１００，０００の範囲の整数であってもよい。別の例では、アクリルアミドユニットに加えて、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミドが使用され得る。この例では、構造（Ｉ）は繰り返す特徴「ｎ」及び「ｍ」に加えて
を含み得、ＲＤ、ＲＥ、及びＲＦは各々Ｈ又はＣ１～Ｃ６アルキルであり、ＲＧ及びＲＨは各々Ｃ１～Ｃ６アルキルである。この例では、ｑは、１～１００，０００の範囲の整数であってもよい。
【化4】
【化5】
【化6】
【0120】
高分子ヒドロゲル４０、４０’の別の例として、構造（Ｉ）における繰り返す特徴「ｎ」は、構造（ＩＩ）を有する複素環式アジド基を含むモノマーで置き換えられ得、
式中、Ｒ１はＨ又はＣ１～Ｃ６アルキルであり、Ｒ２はＨ又はＣ１～Ｃ６アルキルであり、Ｌは、炭素、酸素、及び窒素からなる群から選択される２～２０個の原子と、炭素上の１０個の任意選択の置換基及び鎖中の任意選択的な窒素原子を有する線状鎖を含むリンカであり、Ｅは、炭素、酸素、及び窒素からなる群から選択される１～４個の原子を含む線状鎖であり、その線状鎖中の炭素原子及び任意の窒素原子上に任意選択的な置換基を含み、Ａは、Ｈ又はＣ１～Ｃ４アルキルがＮに付着したＮ置換アミドであり、Ｚは窒素含有複素環である。Ｚの例としては、単環構造又は縮合構造として存在する５～１０員環が挙げられる。Ｚのいくつかの具体的な例としては、ピロリジニル、ピリジニル、又はピリミジニルが挙げられる。
【化7】
【0121】
更に別の例として、高分子ヒドロゲル４０、４０’は、構造（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）の各々の繰り返し単位を含み得、
Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ１ｂ及びＲ２ｂの各々は、水素、任意選択で置換アルキル又は任意選択で置換フェニルから独立して選択され、Ｒ３ａ及びＲ３ｂの各々は、水素、任意選択で置換アルキル、任意選択で置換フェニル、又は任意選択で置換Ｃ７～Ｃ１４アラルキルから独立して選択され、Ｌ１及びＬ２の各々は、任意選択で置換アルキレンリンカ又は任意選択で置換ヘテロアルキレンリンカから独立して選択される。
【化8】
【0122】
オリゴヌクレオチドプライマー４２、４２’をグラフトするように官能化されるものであるならば、その他の分子を使用して、高分子ヒドロゲル４０、４０’を形成することもできることを理解すべきである。好適なポリマー層の他の例としては、アガロースなどのコロイド構造、又はゼラチンなどのポリマーメッシュ構造、又はポリアクリルアミドポリマー及びコポリマー、シランフリーアクリルアミド（silane free acrylamide：ＳＦＡ）、又はアジド分解バージョンのＳＦＡなどの架橋ポリマー構造を有するものが挙げられる。好適なポリアクリルアミドポリマーの例は、アクリルアミドとアクリル酸若しくはビニル基を含むアクリル酸とから、又は［２＋２］光付加環化反応を形成するモノマーから合成され得る。好適な高分子ヒドロゲル４２の更に他の例としては、アクリルアミドとアクリレートとの混合コポリマーが挙げられる。本明細書に開示される実施例では、星状ポリマー、星型又は星型ブロックポリマー、デンドリマーなどを含む分岐ポリマーなど、アクリルモノマー（例えば、アクリルアミド、アクリレートなど）を含む様々なポリマー構造は利用され得る。例えば、モノマー（例えば、アクリルアミドなど）は、ランダムに又はブロックで、星型ポリマーの分岐（アーム）に組み込まれ得る。
【0123】
高分子ヒドロゲル４０、４０’を凹状領域３８、３８’に導入するために、高分子ヒドロゲル４０、４０’の混合物が生成され得、次にそれぞれの基材２６Ａ、２６Ａ’（凹状領域３８、３８’が画定される）に適用され得る。一例では、高分子ヒドロゲル４０、４０’は、混合物（例えば、水との混合物、又はエタノールと水との混合物）中に存在し得る。次に、混合物は、スピンコーティング、浸漬又は浸漬コーティング、あるいは正圧又は負圧下での材料のフロー、又は別の好適な技術を使用し、それぞれの基材表面（凹状領域３８、３８’を含む）に適用され得る。これらのタイプの技術は、高分子ヒドロゲル４０、４０’を基材２６Ａ、２６Ａ’のそれぞれの基材上に（例えば、凹状領域３８、３８’及びそれに隣接する隙間領域４６、４６’に）全面的（blanketly）に堆積させる。他の選択的堆積技術（例えば、マスク、制御された印刷技術などを含む）を使用し、隙間領域４６、４６’ではなく、凹状領域３８、３８’に高分子ヒドロゲルを特異的に堆積させることができる。
【0124】
いくつかの例では、基材表面（凹状領域３８、３８’を含む）が活性化され得、次に、混合物（高分子ヒドロゲル４０、４０’を含む）がそれに適用され得る。一例では、シラン又はシラン誘導体（例えば、ノルボルネンシラン）は、蒸着、スピンコーティング、又は他の堆積方法を使用し、基材表面に堆積され得る。別の例では、基材表面はプラズマ灰化に曝露されて、高分子ヒドロゲル４０、４０’に付着し得る表面活性化剤（例えば、－ＯＨ基）を生成することができる。
【0125】
高分子ヒドロゲル４０、４０’の化学的性質に応じて、適用された混合物は硬化プロセスに曝露され得る。一例では、硬化は、室温（例えば、約１８℃～約２５℃）～約９５℃の範囲の温度で、約１ミリ秒～約数日の範囲の時間にわたって行われてもよい。
【0126】
次いで、凹状領域３８、３８’の周囲の隙間領域４６、４６’から高分子ヒドロゲル４０、４０’を除去し、かつ凹状領域３８、３８’の表面上に高分子ヒドロゲル４０、４０’を少なくとも実質的に無傷のまま残すために、研磨が行われ得る。
【0127】
配列決定表面３０、３０’はまた、高分子ヒドロゲル４０、４０’に付着した増幅プライマー４２、４２’を含む。
【0128】
グラフトプロセスが行われて、増幅プライマー４２、４２’が凹状領域３８、３８’の高分子ヒドロゲル４０、４０’にグラフトされ得る。一例では、増幅プライマー４２、４２’は、プライマー４２、４２’の５’末端又はその近傍における一点共有結合性付着によって、高分子ヒドロゲル４０、４０’に固定化され得る。この付着により、（ｉ）プライマー４２、４２’のアダプター特異的部分が、その同族の配列決定可能な核酸断片にアニーリングするように自由になり、（ｉｉ）３’ヒドロキシル基が、プライマー伸長のために自由になる。この目的のために、任意の好適な共有結合を使用することができる。使用され得る末端プライマーの例は、アルキン末端プライマー（例えば、高分子ヒドロゲル４０、４０’のアジド表面部分に付着し得る）、又はアジド末端プライマー（例えば、高分子ヒドロゲル４０、４０’のアルキン表面部分に付着し得る）を含む。
【0129】
好適なプライマー４２、４２’の具体的な例としては、ＨｉＳｅｑ（商標）、ＨｉＳｅｑＸ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）、ＭｉＳｅｑＤＸ（商標）、ＭｉＮＩＳｅｑ（商標）、ＮｅｘｔＳｅｑ（商標）、ＮｅｘｔＳｅｑＤＸ（商標）、ＮｏｖａＳｅｑ（商標）、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）、ＩＳＥＱ（商標）、及び他の装置プラットフォームでの配列決定のためにＩｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．により販売される市販のフローセルの表面上で使用される、Ｐ５プライマー及びＰ７プライマーが挙げられる。Ｐ５プライマー及びＰ７プライマーのいずれも、高分子ヒドロゲル４０、４０’の各々にグラフトされ得る。
【0130】
一例では、グラフトは、フロースルー堆積（例えば、一時的に結合された蓋を使用する）、ダンクコーティング、スプレーコーティング、液滴分配、又はプライマー４２、４２’を高分子ヒドロゲル４０、４０’に付着させる別の好適な方法によるものであり得る。これらの例示的な技術の各々は、プライマー４２、４２’、水、緩衝液、及び触媒を含み得るプライマー溶液又は混合物を利用し得る。グラフト法のうちのいずれかを用いて、プライマー４２、４２’は、凹状領域３８、３８’において高分子ヒドロゲル４０、４０’の反応基と反応し、周囲の基材２６Ａ、２６Ａ’に対して親和性を有さない。したがって、プライマー４２、４２’は、高分子ヒドロゲル４０、４０’に選択的にグラフトする。
【0131】
図３Ｂに示す例では、化学的捕捉部位４４、４４’は、高分子ヒドロゲル４０、４０’の少なくとも一部に付着又は適用される化学的捕捉剤を含む。本明細書で開示される化学的捕捉剤の任意の例を使用してもよい。いくつかの例では、化学的捕捉剤は、ビオチンであってもよく、これは、ストレプトアビジンコーティング複合体１０Ａ、１０Ｂをフローセル配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’に付着させるのに役立ち得る。他の例では、化学的捕捉剤は、ビオチン－ストレプトアビジン結合対以外の結合対の別のメンバーであってもよい。これらの他の例では、複合体１０Ａ、１０Ｂは、２つの異なる結合対メンバー、例えば（ｉ）ストレプトアビジン（ＤＮＡライブラリ断片１４、１４’、１４’’に付着したビオチン２０に結合することができる）、及び（ｉｉ）別のメンバー（フローセルの配列決定表面上で捕捉部位４４、４４’の化学的捕捉剤に結合することができる）を含む。これらの他の例では、化学的捕捉剤は、結合対の非ビオチンメンバーであってもよく、結合対の他方のメンバーは、ストレプトアビジンに加え、固体支持体１２に付着する。
【0132】
いくつかの例では、高分子ヒドロゲル４０、４０’の遊離官能基（例えば、プライマー４２、４２’に付着しないもの）は、いくつかの化学的捕捉部位４４、４４’が高分子ヒドロゲル４０、４０’の表面にわたって形成されるよう、化学的捕捉剤で官能化され得る。一例では、クリックケミストリを使用し、アルキン－ＰＥＧ－ビオチンリンカ又はアルキン－ビオチン遊離アジド基を、高分子ヒドロゲル４０、４０’上の遊離アジドに共有結合させることができる。別の例では、増幅プライマー４２、４２’に相補的なプライマーは、このプライマーに付着した化学的捕捉剤（例えば、ビオチン又は結合対の別のメンバー）を有してもよい。これらの相補的なプライマーは、いくつかの増幅プライマー４２、４２’にハイブリダイズされ、化学的捕捉部位４４、４４’が形成され得る。
【0133】
別の例では、化学的捕捉剤は、マイクロコンタクト印刷、エアロゾル印刷などを使用して望ましい場所に堆積され、化学捕捉部位４４、４４’が形成され得る。更に別の例では、マスク（例えば、フォトレジスト）は、化学的捕捉剤が堆積され、したがって化学的捕捉部位４４、４４’が形成される空間／場所を画定するために使用され得る。次に、（例えば、リフトオフ、溶解、又は別の好適な技術を介して）化学的捕捉剤が堆積され得、マスクが除去される。この例では、化学的捕捉部位４４、４４’は、化学的捕捉剤の単層又は薄層を含み得る。
【0134】
図３Ｃは、パターン化された対向する配列決定表面３２、３２’を含むフローセル２４の断面図を示す。一例では、これらの表面３２、３２’の各々は、基材２６Ｂ、２６Ｂ’上に調製され得、次に、基材２６Ｂ、２６Ｂ’は、フローセル２４の例を形成するために互いに（例えば、材料５０を介して）付着し得る。
【0135】
図３Ｃに示す例では、フローセル２４は、多層基材２６Ｂ、２６Ｂ’を含み、その各々は、支持体３４、３４’及び支持体３４、３４’上に配置されたパターン化された材料３６、３６’を含む。パターン化された材料３６、３６’は、隙間領域４６、４６’によって分離されたくぼみ４８、４８’を画定する。
【0136】
図３Ｃに示す例では、パターン化された材料３６、３６’はそれぞれ、支持体３４、３４’に配置される。くぼみ４８、４８’及び隙間領域４６、４６’を形成するために選択的に堆積、又は堆積及びパターン化され得る任意の材料が、パターン化された材料３６、３６’に使用され得ることを理解すべきである。
【0137】
一例として、無機酸化物は、蒸着、エアロゾル印刷、又はインクジェット印刷を介して支持体３４、３４’に選択的に適用され得る。好適な無機酸化物の例としては、酸化タンタル（例えば、Ｔａ２Ｏ５）、酸化アルミニウム（例えば、Ａｌ２Ｏ３）、酸化シリコン（例えば、ＳｉＯ２）、酸化ハフニウム（例えば、ＨｆＯ２）などが挙げられる。
【0138】
別の例として、樹脂は支持体３４、３４’に塗布されてからパターン化され得る。好適な堆積技術としては、化学蒸着、ディップコーティング、ダンクコーティング、スピンコーティング、スプレーコーティング、液滴分配、超音波スプレーコーティング、ドクターブレードコーティング、エアロゾル印刷、スクリーン印刷、マイクロコンタクト印刷などを含む。好適なパターニング技術としては、フォトリソグラフィ、ナノインプリントリソグラフィ（nanoimprint lithography：ＮＩＬ）、スタンピング技術、エンボス技術、成形技術、マイクロエッチング技術、印刷技術などが挙げられる。好適な樹脂のいくつかの例としては、多面体オリゴマーシルセスキオキサン樹脂ベースの樹脂、非多面体オリゴマーシルセスキオキサンエポキシ樹脂、ポリ（エチレングリコール）樹脂、ポリエーテル樹脂（例えば、開環エポキシ）、アクリル樹脂、アクリレート樹脂、メタクリレート樹脂、アモルファスフルオロポリマー樹脂（例えば、ＢｅｌｌｅｘからのＣＹＴＯＰ（登録商標））、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【0139】
本明細書で使用される場合、「多面体オリゴマーシルセスキオキサン」（Ｈｙｂｒｉｄ Ｐｌａｓｔｉｃｓから商標名ＰＯＳＳ（登録商標）として市販）という用語は、シリカ（ＳｉＯ２）とシリコーン（Ｒ２ＳｉＯ）とのハイブリッド中間体（例えば、ＲＳｉＯ１．５）である化学組成物を指す。多面体オリゴマーシルセスキオキサンの例は、Ｋｅｈａｇｉａｓら、「Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」第８６巻（２００９年）第７７６～７７８頁に記載されているものであり得、これは、参照によりその全体が組み込まれる。一例では、組成物は、化学式［ＲＳｉＯ３／２］ｎを有する有機シリコン化合物であり、Ｒ基は同じであっても異なってもよい。多面体オリゴマーシルセスキオキサンの例示的なＲ基としては、エポキシ、アジド（azide）／アジド（azido）、チオール、ポリ（エチレングリコール）、ノルボルネン、テトラジン、アクリレート、及び／又はメタクリレート、あるいは、更に、例えば、アルキル、アリール、アルコキシ、及び／又はハロアルキル基を含む。本明細書に開示される樹脂組成物は、モノマーユニットとして１つ以上の異なるケージ又はコア構造を含み得る。平均ケージ含有量は、合成期間に調整され得、及び／又は精製方法によって制御され得、モノマーユニットのケージサイズの分布は本明細書に開示される実施例で使用され得る。
【0140】
図３Ｃに示すように、パターン化された材料３６、３６’は、それぞれそこに画定されたくぼみ４８、４８’、及び隣接するくぼみ４８、４８’を分離する隙間領域４６、４６’を含む。規則的、繰り返し、及び非規則的なパターンを含む、くぼみ４８、４８’の多くの異なるレイアウトが想定され得る。一例では、くぼみ４８、４８’は、密なパッキング及び改善された密度のために六角形グリッドに配置される。他のレイアウトは、例えば、直線的な（長方形）レイアウト、三角形のレイアウトなどを含み得る。いくつかの例では、レイアウト又はパターンは、行及び列をなしているくぼみ４８、４８’のｘ－ｙ形式であり得る。他のいくつかの例では、レイアウト又はパターンは、くぼみ４８、４８’及び／又は隙間領域４６、４６’の繰り返し配置であり得る。更に他の例では、レイアウト又はパターンは、くぼみ４８、４８’及び／又は隙間領域４６、４６’のランダムな配置であり得る。パターンは、ストライプ、渦巻き、線、三角形、長方形、円、円弧、照合印、格子縞、対角線、矢印、正方形、及び／又は斜交平行を含んでもよい。
【0141】
くぼみ４８、４８’のレイアウト又はパターンは、画定された領域におけるくぼみ４８、４８’の密度（例えば、くぼみ４８、４８’の数）により特徴付けられ得る。例えば、くぼみ４８、４８’は、１ｍｍ２当たり約２００万の密度で存在し得る。例えば、１ｍｍ２当たり約１００、１ｍｍ２当たり約１，０００、１ｍｍ２当たり約１０万、１ｍｍ２当たり約１００万、１ｍｍ２当たり約２００万、１ｍｍ２当たり約５００万、１ｍｍ２当たり約１０００万、１ｍｍ２当たり約５０００万、又はそれ超又はそれ未満の密度を含む、異なる密度に調整され得る。パターン化された材料３６、３６’のくぼみ４８、４８’の密度は、上記の範囲から選択された低い値の１つと高い値の１つとの間にあり得ることを更に理解すべきである。例として、高密度アレイは、約１００ｎｍ未満で分離されたくぼみ４８、４８’を有するものとして特徴付けられ得、中密度アレイは、約４００ｎｍから約１μｍ分離されたくぼみ４８、４８’を有するものとして特徴付けられ得、低密度アレイは、約１μｍを超えて分離されたくぼみ４８、４８’を有するものとして特徴付けられ得る。密度の例が提供されるが、任意の好適な密度を使用することができることを理解すべきである。くぼみ４８、４８’の密度は、くぼみ４８、４８’の深さに部分的に依存してもよい。いくつかの事例では、くぼみ４８、４８’間の間隔が、本明細書に記載された例よりも更に大きいことが望ましい場合がある。
【0142】
くぼみ４８、４８’のレイアウト又はパターンは、更に又は代替として、平均ピッチ、又はくぼみ４８、４８’の中心から隣接するくぼみ４８、４８’の中心までの間隔（中心間間隔）若しくは１つのくぼみ４８、４８’の端部から隣接するくぼみ４８、４８’の端部までの間隔（端から端までの間隔）に関して、特徴付けてもよい。パターンは、平均ピッチ周辺の変動係数が小さくなるように規則的である場合もあれば、パターンが不規則である場合もあり、その場合、変動係数は比較的大きくなる可能性がある。いずれの場合も、平均ピッチは、例えば、おおよそ約５０ｎｍ、約０．１μｍ、約０．５μｍ、約１μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、又は約１００μｍであってもよい。くぼみ４８、４８’の特定のパターンの平均ピッチは、上記の範囲から選択された低い値の１つと高い値の１つとの間であり得る。一例では、くぼみ４８、４８’は、約１．５μｍのピッチ（中心間の間隔）を有する。平均ピッチ値の例が提供されるが、他の平均ピッチ値も使用され得ることを理解すべきである。
【0143】
各くぼみ４８、４８’のサイズは、その体積、開口面積、深さ、及び／又は直径によって特徴付けられ得る。
【0144】
各くぼみ４８、４８’は、フローセル２４に導入される少なくともいくらかの流体を隔離する（confining）ことができる任意の容積を有し得る。最小又は最大の容量は、例えば、フローセル２４の下流での使用に期待されるスループット（例えば、多重度）、解像度、ヌクレオチド、又は分析物の反応性に対応するように選択され得る。例えば、体積は、少なくとも約１×１０－３μｍ３、少なくとも約１×１０－２μｍ３、少なくとも約０．１μｍ３、少なくとも約１μｍ３、少なくとも約１０μｍ３、少なくとも約１００μｍ３、又はそれ超であり得る。代替的又は更に、体積は、最大で約１×１０４μｍ３、最大で約１×１０３μｍ３、最大で約１００μｍ３、最大で約１０μｍ３、最大で約１μｍ３、最大で約０．１μｍ３、又はそれ未満であり得る。
【0145】
各くぼみの開口部が占有する面積は、上記の体積と同様の基準に基づいて選択され得る。例えば、各くぼみ開口部の面積は、少なくとも約１×１０－３μｍ２、少なくとも約１×１０－２μｍ２、少なくとも約０．１μｍ２、少なくとも約１μｍ２、少なくとも約１０μｍ２、少なくとも約１００μｍ２、又はそれ超であり得る。代替的又は更に、面積は、最大で約１×１０３μｍ２、最大で約１００μｍ２、最大で約１０μｍ２、最大で約１μｍ２、最大で約０．１μｍ２、最大で約１×１０－２μｍ２、又はそれ未満であり得る。各くぼみの開口部が占有する面積は、上記の値よりも大きい、小さい、又はそれらの間であり得る。
【0146】
各くぼみ４８、４８’の深さは、高分子ヒドロゲル４０、４０’の一部を収容するのに十分な大きさであり得る。一例では、深さは、少なくとも約０．１μｍ、少なくとも約０．５μｍ、少なくとも約１μｍ、少なくとも約１０μｍ、少なくとも約１００μｍ、又はそれ超であり得る。代替的又は更に、深さは、最大で約１×１０３μｍ、最大で約１００μｍ、最大で約１０μｍ、又はそれ未満であり得る。いくつかの例では、深さは約０．４μｍである。各くぼみ４８、４８’の深さは、上で示された値よりも大きいか、それよりも小さいか、又はそれらの間であり得る。
【0147】
いくつかの事例では、各くぼみ４８、４８’の直径又は長さ及び幅は、少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約０．１μｍ、少なくとも約０．５μｍ、少なくとも約１μｍ、少なくとも約１０μｍ、少なくとも約１００μｍ、又はそれ超であり得る。代替的又は更に、直径又は長さ及び幅は、最大で約１×１０３μｍ、最大で約１００μｍ、最大で約１０μｍ、最大で約１μｍ、最大で約０．５μｍ、最大で約０．１μｍ、又はそれ未満（例えば、約５０ｎｍ）であり得る。いくつかの例では、直径又は長さ及び幅は約０．４μｍである。各くぼみ４８、４８’の直径又は長さ及び幅は、上で指定された値よりも大きい、小さい、又はそれらの間であり得る。
【0148】
この例では、配列決定表面３２、３２’の構成要素のうちの少なくともいくつかは、くぼみ４８、４８’に導入され得る。配列決定表面３２、３２’の構成要素によって占有されていないくぼみ４８、４８’内のあらゆる空間は、フローチャネル２８の一部であると見なされ得ることを理解すべきである。
【0149】
図３Ｃに示す例では、高分子ヒドロゲル４０、４０’は、くぼみ４８、４８’の各々の中に配置される。高分子ヒドロゲル４０、４０’は、図３Ｂを参照して説明されるように適用されてもよく、その結果、高分子ヒドロゲル４０、４０’は、くぼみ４８、４８’に存在し、周囲の隙間領域４６、４６’には存在しない。
【0150】
図３Ｃに示す例では、プライマー４２、４２’は、各くぼみ４８、４８’内の高分子ヒドロゲル４０、４０’にグラフトされてもよい。プライマー４２、４２’は、図３Ｂを参照して説明されるように適用されてもよく、したがって、周囲の隙間領域４６、４６’ではなく、高分子ヒドロゲル４０、４０’にグラフトされる。
【0151】
図３Ｃに示す例では、化学的捕捉部位４４、４４’は、隙間領域４６、４６’のうちの少なくともいくつかに適用される化学的捕捉剤である。例えば、化学的捕捉剤は、マイクロコンタクト印刷、エアロゾル印刷などを使用して隙間領域４６、４６’のうちの少なくともいくつかに堆積され、化学的捕捉部位４４、４４’が形成され得る。更に別の例では、マスク（例えば、フォトレジスト）は、化学的捕捉剤が堆積され、したがって化学的捕捉部位４４、４４’が形成される空間／場所を画定することに使用され得る。次に、（例えば、リフトオフ、溶解、又は別の好適な技術を介して）化学的捕捉剤が堆積され得、マスクが除去される。
【0152】
他の例では、化学的捕捉部位４４、４４’は、高分子ヒドロゲル４０、４０’の遊離官能基（例えば、プライマー４２、４２’に結合されないもの）に付着された化学的捕捉剤である。更に他の例では、化学的捕捉部位４４、４４’は、増幅プライマー４２、４２’のいくつかにハイブリダイズされるプライマーに付着された化学的捕捉剤である。これらの例では、化学的捕捉部位４４、４４’はくぼみ４８、４８’に存在し、隙間領域４６、４６’に存在しない。
【0153】
本明細書に開示される化学的捕捉剤の任意の例は、図３Ｃに示す例において使用されてもよい。化学的捕捉剤は、部分的に固体支持体１２がどのように官能化されるかに応じて、ビオチン又は結合対の別のメンバーであってもよい。
【0154】
【0155】
基材２６Ａと２６Ａ’又は２６Ｂと２６Ｂ’は、隙間領域４６、４６’のいくつか又は全てで互いに結合され得る。基材２６Ａと２６Ａ’又は２６Ｂと２６Ｂ’との間に形成される結合は、化学的結合、又は機械的結合（例えば、留め具を使用するなど）であり得る。
【0156】
レーザー結合、拡散結合、陽極結合、共晶結合、プラズマ活性化結合、ガラスフリット結合、又は当技術分野で知られている他の方法などの任意の好適な技術を使用し、基材２６Ａ及び２６Ａ’又は２６Ｂ及び２６Ｂ’を共に結合し得る。一例では、スペーサ層（例えば、材料５０）を使用し、基板２６Ａ及び２６Ａ’又は２６Ｂ及び２６Ｂ’を結合し得る。スペーサ層は、基板２６Ａと２６Ａ’又は２６Ｂと２６Ｂ’の少なくともある部分を共にシールする任意の材料５０であり得る。いくつかの例では、スペーサ層は、結合を助ける放射線吸収材料であり得る。
【0157】
示されていないが、フローセルが１つの配列決定表面を有するように、蓋が基材２６Ａ’又は２６Ｂ’のうちの１つに結合されてもよいことを理解されたい。
【0158】
ビオチン－ストレプトアビジン結合を有する標的材料を含む方法及びキット
【0159】
切断組成物の第１の例を利用する方法の例は、概して、ライブラリ断片１４、１４’、１４’’をフローセル２４に導入することであって、ライブラリ断片１４、１４’、１４’’がストレプトアビジンコーティング固体支持体１２に付着している、導入することと、ビオチン－ストレプトアビジン切断組成物をフローセル２４に導入することであって、ビオチン－ストレプトアビジン切断組成物が、約１０体積％～約５０体積％のホルムアミド試薬と、残部として塩緩衝液と、を含む、導入することと、ビオチン－ストレプトアビジン切断組成物を約６０℃～約７０℃の範囲の温度でフローセル内でインキュベートすることを許容し、それにより、ライブラリ断片１４、１４’、１４’’のうちの少なくともいくつかを固体支持体１２から放出させ、フローセル２４の表面上の増幅プライマー４２、４２’に播種させることと、を含む。
【0160】
本方法を行う前に、ライブラリ断片１４、１４’、１４’’を調製し、固体支持体１２に付着させてもよい。一例では、複合体１０Ａ又は１０Ｂは、核酸試料と、複数の固体支持体１２を含むライブラリ調製流体とを使用して調製されてもよい。
【0161】
いくつかの例では、図１Ａを参照して説明するように、ライブラリ調製流体中の固体支持体１２の各々は、例えば、そこに付着したアダプター（アダプター１８など）を有してもよい。タグ付け及びライブラリ調製は、複合体１０Ａを形成するために、図１Ａに定義されるように行われ得る。核酸試料７０、固体支持体１２、部分的なＹアダプター、及びトランスポサーゼ酵素は、複合体１０Ａを形成することが望まれるまで、別々の流体に含有されてもよい。
【0162】
他の例では、ライブラリ調製流体中の固体支持体１２の各々は、例えば、支持体に付着したオリゴヌクレオチドを有してもよい。いくつかの例では、ＰＣＲを含まないヌクレオチドライブラリ調製は、固体支持体１２とは別に行われてもよく、次に、調製したライブラリ断片は、固体支持体１２の表面でビオチン２０を介して付着したオリゴヌクレオチド（プライマー）にハイブリダイズされ得、この一例は図１Ｂを参照して説明される。ビオチン２０を介して固体支持体１２上に結合したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる前に、断片が一本鎖断片に変性される限り、ライブラリ調製のその他の例（例えば、ＰＣＲを含む）も使用されてもよい。
【0163】
固体支持体１２（この例では、複合体１０Ａ、１０Ｂ）に付着したライブラリ断片１４、１４’、１４’’は、流体に添加されてもよい。流体は、任意の緩衝水溶液であってもよい（例えば、弱酸及びその塩のうちの１つ（共役塩基）又は弱塩基及びその塩のうちの１つ（共役酸）。緩衝水溶液中の塩濃度は、複合体１０Ａ、１０Ｂが望ましい配列決定表面に流れることができるように調整されてもよい。固体支持体１２と流体との間の密度差が大きいほど、複合体１０Ａ、１０Ｂの沈降時間はより速くなる。例として、流体は、トリス－ＨＣｌ緩衝液又は０．５×生理食塩水クエン酸ナトリウム（saline sodium citrate：ＳＳＣ）緩衝液であってもよい。
【0164】
次いで、複合体１０Ａ、１０Ｂを含有する流体をフローセル２４に導入してもよい。フローセル２４に導入されると、複合体１０Ａ、１０Ｂ及び捕捉部位４４、４４’は各々結合対のメンバーを含むため、複合体１０Ａ、１０Ｂは、捕捉部位４４、４４’に付着することができる。いくつかの例では、結合対は、ビオチン－ストレプトアビジンである。捕捉部位４４及び／又は４４’は、複合体１０Ａ、１０Ｂのうちの少なくともいくつかを固定化する。
【0165】
流体中のいくつかの複合体１０Ａ、１０Ｂは捕捉されなくてもよく、これらの複合体１０Ａ、１０Ｂは、更なる処理の前にフローセル２４から除去されることを理解されたい。フローセル２４から流体及び任意の非固定化複合体１０Ａ、１０Ｂを除去する前に、所定の時間を経過させてもよい。一例では、所望の数の固定化された複合体１０Ａ、１０Ｂを得るために、所定の時間は、約５分間～約３０分間の範囲であってもよい。より長いインキュベーション時間も使用され得る。
【0166】
次いで、この方法の例は、フローセル２４から、流体及び捕捉されていない複合体１０Ａ、１０Ｂを洗浄することを含む。洗浄は、洗浄流体をフローセル２４に導入するステップを含み得る。フローは、沈降せず、配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’で固定化された任意の複合体１０Ａ、１０Ｂ（又は他の標的材料）を、フローセル２４の出口ポートを通して押し出してもよい。複合体１０Ａ、１０Ｂ（又は他の標的材料）と配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’の捕捉部位４４、４４’との間の固定化機構（例えば、結合対、ハイブリダイゼーション、共有結合など）は、沈降及び固定化された任意の複合体１０Ａ、１０Ｂ（又は他の標的材料）が出口フローの一部になることを防止してもよい。
【0167】
この方法は、切断組成物の第１の例をフローセル２４に導入することを含む。本明細書に開示される切断組成物の第１の例のいずれの例を使用してもよい。
【0168】
切断組成物の第１の例は、約６０℃～約７０℃の範囲の温度でフローセル２４内でインキュベートされることが許容される。一例では、温度は、約６５℃である。一例では、切断組成物の第１の例は、約２分間～約５分間の範囲の時間にわたってフローセル２４内でインキュベートされることが許容される。一例では、この時間は、約５分間である。
【0169】
インキュベーション中、切断組成物の第１の例は、ライブラリ断片１４、１４’、１４’’を固体支持体１２に保持するビオチン－ストレプトアビジン結合を、効率的に破壊する。したがって、切断組成物の第１の例は、ライブラリ断片１４、１４’、１４’’のうちの少なくともいくつかを、固体支持体１２から放出させる。インキュベーション温度では、放出ライブラリ断片１４、１４’、１４’’もまた、フローセル２４の配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’上で増幅プライマー４２、４２’に播種することができる。したがって、ライブラリ断片１４、１４’、１４’’放出及び播種は、単一の試薬で達成されてもよい。
【0170】
フローセル２４のそれぞれの配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’のプライマー４２、４２’は、放出された断片１４、１４’、又は１４’を播種し得る。播種は、断片１４、１４’、又は１４’’のアダプター１８又は２２の第１又は第２の配列と、それぞれの配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’のプライマー４２、４２’の相補的配列との間のハイブリダイゼーションによって達成される。播種は、切断組成物インキュベーション温度で行ってもよい。
【0171】
フローセル２４内の１４、１４’、又は１４’’の播種が位置する場所は、部分的に、プライマー４２、４２’がどのように付着するかに応じて異なる。パターン化されていない配列決定表面３０、３０’を有するフローセル２４の例では、放出された配列決定可能な核酸断片１４、１４’、又は１４’’を、凹状領域３８、３８’の高分子ヒドロゲル４０、４０’にわたって播種する。パターン化された配列決定表面３２、３２’を有するフローセル２４の例では、放出された配列決定可能な核酸断片１４、１４’、又は１４’’を、くぼみ４８、４８’の各々の中の高分子ヒドロゲル４０、４０’にわたって播種する。
【0172】
ビオチン－ストレプトアビジン結合対を、複合体１０Ａ、１０Ｂを捕捉部位４４、４４’に捕捉するためにも使用した場合、切断組成物の第１の例は、捕捉部位４４、４４’から固体支持体１２を放出することもできる。
【0173】
したがって、方法のいくつかの例では、ストレプトアビジンコーティング固体支持体１２のうちの少なくともいくつかは、フローセル２４の表面上のビオチン捕捉部位４４、４４’に結合するようになり、ビオチン－ストレプトアビジン切断組成物（切断組成物の第１の例）をフローセル２４内でインキュベートすることを許容することが、同様に、結合したストレプトアビジンコーティング固体支持体１２のうちの少なくともいくつかをビオチン捕捉部位４４、４４’から放出させる。断片１４、１４’、１４’’が播種された後の固体支持体１２の除去は、下流のクラスタリング及び配列決定のための清潔な表面にとって望ましい。
【0174】
複合体１０Ａ、１０Ｂを捕捉部位４４、４４’に捕捉するために異なる結合対が使用される場合、別個の放出組成物をフローセル２４に導入して、捕捉部位４４、４４’から固体支持体１２を除去してもよい。
【0175】
次いで、この方法の例は、インキュベーション後にビオチン－ストレプトアビジン切断組成物（切断組成物の第１の例）をフローセル２４からすすぎ、それにより、ストレプトアビジンコーティング固体支持体１２及びあらゆる未播種ライブラリ断片１４、１４’、１４’’を除去することを含んでもよい。フローは、あらゆる放出された固体支持体１２及びあらゆる未播種ライブラリ断片１４、１４’、１４’’を、フローセル２４の出口ポートを通して押し出してもよい。配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’の断片１４、１４’、１４’’と増幅プライマー４２、４２’との間の固定化機構（例えば、ハイブリダイゼーション）は、任意の断片１４、１４’、１４’’が出口フローの一部になることを防止してもよい。
【0176】
本明細書に記載の方法のこの例を行うためのキットは、ストレプトアビジンコーティング固体支持体と、一方の末端にビオチンを付着させたアダプター配列であって、ビオチンがストレプトアビジンコーティング固体支持体に付着するようになる、アダプター配列と、断片化されてアダプター配列に付着するようになるゲノム配列を含む試料流体と、約１０体積％～約５０体積％のホルムアミド試薬及び残部として塩緩衝液を含むビオチン－ストレプトアビジン切断組成物（切断組成物の第１の例）と、を含んでもよい。キットはまた、部分的なＹアダプター、トランスポサーゼ酵素などの他のライブラリ調製構成要素を含んでもよく、それらの各々は、複合体１０Ａ、１０Ｂなどのいずれかの例を形成することが望まれるまで、別個の流体に含有されてもよい。キットのいくつかの例はまた、フローセル２４を含んでもよい。
【0177】
デスチオビオチン化ストレプトアビジン結合を有する標的材料を含む方法及びキット
【0178】
切断組成物の第２の例を利用する方法の例は、概して、デスチオビオチン化ライブラリ断片をフローセル２４に導入することであって、デスチオビオチン化ライブラリ断片がストレプトアビジンコーティング固体支持体１２に付着している、導入することと、切断組成物をフローセル２４に導入することであって、切断組成物が約１８℃～約３０℃の範囲の温度であり、切断組成物が遊離ビオチン及び塩緩衝液を含む、導入することと、切断組成物の温度を約６０℃～約７０℃まで上昇させ、それにより、ライブラリ断片１４、１４’、１４’’のうちの少なくともいくつかを固体支持体１２から放出させ、フローセル２４の表面上の増幅プライマー４２、４２’に播種させることと、を含む。
【0179】
【0180】
固体支持体１２（すなわち、この例では複合体１０Ａ、１０Ｂ）に付着したライブラリ断片１４、１４’、１４’’は、流体に添加されてもよい。流体は、任意の緩衝水溶液であってもよい（例えば、弱酸及びその塩のうちの１つ（共役塩基）又は弱塩基及びその塩のうちの１つ（共役酸）。
【0181】
複合体１０Ａ、１０Ｂを含有する流体をフローセル２４に導入してもよい。フローセル２４に導入されると、複合体１０Ａ、１０Ｂ及び捕捉部位４４、４４’は各々結合対のメンバーを含むため、複合体１０Ａ、１０Ｂは、捕捉部位４４、４４’に付着することができる。いくつかの例では、結合対は、デスチオビオチン－ストレプトアビジンである。捕捉部位４４及び／又は４４’は、複合体１０Ａ、１０Ｂのうちの少なくともいくつかを固定化する。
【0182】
流体中のいくつかの複合体１０Ａ、１０Ｂは捕捉されなくてもよく、これらの複合体１０Ａ、１０Ｂは、更なる処理の前にフローセル２４から除去されることを理解されたい。フローセル２４から流体及び任意の非固定化複合体１０Ａ、１０Ｂを除去する前に、所定の時間を経過させてもよい。一例では、所望の数の固定化された複合体１０Ａ、１０Ｂを得るために、所定の時間は、約５分間～約３０分間の範囲であってもよい。より長いインキュベーション時間も使用され得る。
【0183】
次いで、この方法の例は、フローセル２４から、流体及び捕捉されていない複合体１０Ａ、１０Ｂを洗浄することを含む。洗浄は、洗浄流体をフローセル２４に導入するステップを含み得る。フローは、沈降せず、配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’で固定化された任意の複合体１０Ａ、１０Ｂを、フローセル２４の出口ポートを通して押し出してもよい。複合体１０Ａ、１０Ｂ（又は他の標的材料）と配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’の捕捉部位４４、４４’との間の固定化機構は、沈降及び固定化された任意の複合体１０Ａ、１０Ｂが出口フローの一部になることを防止してもよい。
【0184】
この方法は、切断組成物の第２の例をフローセル２４に導入することを含む。本明細書に開示される切断組成物の第２の例のうちいずれかの例を使用してもよい。
【0185】
切断組成物の第２の例は、約１８℃～約３０℃の範囲の温度で導入される。この温度で、かつ切断組成物の第２の例における塩の存在下で、デスチオビオチンは安定化され、固体支持体１２からのその解離は、遊離ビオチンがまた存在しても低減又は防止される。導入された切断組成物は、流体フロー及び／又は混合が少なくとも実質的に停止するように沈降させられる。
【0186】
次いで、切断組成物の温度を、約６０℃～約７０℃の範囲の温度まで上昇させる。一例では、切断組成物の温度は、約６５℃まで上昇する。この温度で、かつ遊離ビオチンの存在下で、デスチオビオチンは不安定化され、固体支持体１２から解離される。これはライブラリ断片１４、１４’、１４’’を放出する。これらの温度では、放出ライブラリ断片１４、１４’、１４’’もまた、フローセル２４の配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’上で増幅プライマー４２、４２’に播種することができる。ライブラリ断片１４、１４’、１４’’が放出される場合、流体フロー及び／又は混合は行われないため、放出ライブラリ断片１４、１４’、１４’’は、それらが放出される固体支持体で１２の又はその近くで、フローセル表面上に拡散及び播種することができる。したがって、ライブラリ断片１４、１４’、１４’’放出及び拡散依存性空間播種は、単一の試薬で達成されてもよい。
【0187】
デスチオビオチン－ストレプトアビジン結合対を、複合体１０Ａ、１０Ｂを捕捉部位４４、４４’に捕捉するためにも使用した場合、切断組成物の第２の例は、捕捉部位４４、４４’から固体支持体１２を放出することもできる。
【0188】
したがって、方法のいくつかの例では、ストレプトアビジンコーティング固体支持体１２のうちの少なくともいくつかは、フローセル２４の表面上のビオチン捕捉部位４４、４４’に結合し、既に導入されたデスチオビオチン－ストレプトアビジン切断組成物（切断組成物の第２の例）の温度上昇は、結合したストレプトアビジンコーティング固体支持体１２のうちの少なくともいくつかをデスチオビオチン捕捉部位４４、４４’から放出させる。断片１４、１４’、１４’’が播種された後の固体支持体１２の除去は、下流のクラスタリング及び配列決定のための清潔な表面にとって望ましい。
【0189】
複合体１０Ａ、１０Ｂを捕捉部位４４、４４’に捕捉するために異なる結合対が使用される場合、別個の放出組成物をフローセル２４に導入して、捕捉部位４４、４４’から固体支持体１２を除去してもよい。
【0190】
次いで、この方法の例は、播種後にデスチオビオチン－ストレプトアビジン切断組成物（切断組成物の第２の例）をフローセル２４からすすぎ、それにより、ストレプトアビジンコーティング固体支持体１２及びあらゆる未播種ライブラリ断片１４、１４’、１４’’を除去することを含んでもよい。フローは、あらゆる放出された固体支持体１２及びあらゆる未播種ライブラリ断片１４、１４’、１４’’を、フローセル２４の出口ポートを通して押し出してもよい。配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’の断片１４、１４’、１４’’と増幅プライマー４２、４２’との間の固定化機構（例えば、ハイブリダイゼーション）は、任意の断片１４、１４’、１４’’が出口フローの一部になることを防止してもよい。
【0191】
本明細書に記載の方法のこの例を行うためのキットは、ストレプトアビジンコーティング固体支持体１２と、一方の末端にデスチオビオチンを付着させたアダプター配列であって、デスチオビオチンがストレプトアビジンコーティング固体支持体に付着するようになる、アダプター配列と、断片化されてアダプター配列に付着するようになるゲノム配列を含む試料流体と、遊離ビオチン及び塩緩衝液を含むデスチオビオチン－ストレプトアビジン切断組成物（切断組成物の第２の例）と、を含んでもよい。キットはまた、部分的なＹアダプター、トランスポサーゼ酵素などの他のライブラリ調製構成要素を含んでもよく、それらの各々は、複合体１０Ａ、１０Ｂなどのいずれかの例を形成することが望まれるまで、別個の流体に含有されてもよい。キットのいくつかの例はまた、フローセル２４を含んでもよい。
【0192】
２段階放出を含む方法及びキット
【0193】
上述のように、本明細書に開示されるいくつかの例は、ライブラリ調製ビーズ１１から配列決定可能なライブラリ断片１４、１４’を放出するための二重放出機構を利用する。二重放出機構は、切断部位６４及びスプリント６８を利用する。図４を参照してより詳細に説明されるように、好適な切断剤を使用して切断部位６４を除去し、熱を使用してスプリント６８を除去してもよい。切断条件が２つの直交プロセス（一方のプロセスが他方のプロセスを開始しない、それに影響を及ぼさない、又はそれを別様に妨害しない）を含むため、この例は、ライブラリ断片１４、１４’の制御放出を可能にする。
【0194】
二重機構放出は、フローセル２４の配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’で行われてもよく、又は試験管などの別の反応容器内で行われてもよい。
【0195】
この方法の例は、図４に概略的に示されており、概して、複数の調製済ライブラリ調製ビーズ１１’を反応容器（図示せず）に導入することであって、調製済ライブラリ調製ビーズ１１’の各々が、固体支持体１２と、固体支持体１２に付着した複数の架橋分子７２、７２’と、を含み、架橋分子７２、７２’の各々が、二本鎖ＤＮＡ断片１６及び１６’と、転移鎖５８、５８’であって、その５’末端で二本鎖ＤＮＡ断片の各鎖１６、１６’にそれぞれ付着しており、各転移鎖５８、５８’が、３’トランスポゾン末端配列６２Ａ、６２Ａ’、第１のアダプター配列１８、１８’、切断部位６４、６４’、及び５’連結末端配列６６、６６’を含み、第１のアダプター配列１８、１８’及び５’連結末端配列６６、６６’が切断部位６４、６４’に隣接している、転移鎖５８、５８’と、第２のアダプター２２、２２’であって、その３’末端で二本鎖ＤＮＡ断片の各鎖１６、１６’にそれぞれ付着している、第２のアダプター２２、２２’と、切断部位６４、６４’をスプリントするように、第１のアダプター配列１８、１８’の少なくとも一部分及び５’連結配列６６、６６’の少なくとも一部分にハイブリダイズされたスプリント配列６８、６８’と、を含む、導入することと、調製済ライブラリ調製ビーズ１１’を切断剤７４に曝露して切断部位６４、６４’を除去することであって、これにより、複数の架橋分子７２、７２’がスプリント６８、６８’を介して固体支持体１２に付着したままになる、除去することと、反応容器をスプリント６８、６８’及び二本鎖ＤＮＡ断片１６、１６’の解離温度まで加熱することと、を含む。
【0196】
調製済ライブラリ調製ビーズ１１’を図４の左側に示す。調製済ライブラリ調製ビーズ１１’は、図２Ａ～図２Ｃを参照して説明した方法を使用して調製されてもよい。したがって、架橋分子７２、７２’の各々は、配列決定可能な核酸断片１４、１４’（断片１６、１６’、５’末端近傍の３’トランスポゾン末端配列６２Ａ、６２Ａ’、及び対向する末端のそれぞれのアダプター１８、２２又は１８’、２２’’）、並びに切断部位６４、６４’、５’連結末端配列６６、６６’、及びスプリント６８、６８’を含む。
【0197】
一組の架橋分子７２、７２’が図４の固体支持体１２上に示されているが、単一の固体支持体１２は、複数組の架橋分子７２、７２’を含んでもよいことを理解されたい。
【0198】
架橋分子７２、７２’及び固体支持体１２から配列決定可能な核酸断片１４、１４’の放出を開始するために、本方法は、調製済ライブラリ調製ビーズ１１’を切断剤７４に曝露することを最初に含む。使用される切断剤７４は、転移鎖５８、５８’の切断部位６４、６４’に依存するであろう。切断部位６４、６４’が化学的切断部位である場合、調製済ライブラリ調製ビーズ１１’を切断剤７４に曝露することは、化学的切断剤を反応容器に導入することを含む。一例として、過ヨウ素酸塩を使用して、１，２－ジオール化学的切断部位を切断してもよい。切断部位６４、６４’が酵素的切断部位である場合、調製済ライブラリ調製ビーズ１１’を切断剤に曝露することは、酵素的切断剤を反応容器に導入することを含む。例として、ＵＳＥＲ酵素を使用してデオキシウラシルヌクレオチドを切断し、ＲＮａｓｅを使用してリボヌクレオチドを切断してもよい。切断部位６４、６４’が光切断可能な切断部位である場合、調製済ライブラリ調製ビーズ１１’を切断剤７４に曝露することは、切断を活性化する波長の光を反応容器に照射することを含む。一例として、ニトロベンジルリンカは、３６５ｎｍの紫外線光に曝露されてもよい。
【0199】
化学的若しくは酵素的切断剤のインキュベーション又は光曝露は、切断部位６４、６４’を切断するのに十分な時間にわたって行われてもよい。インキュベーション時間は、部分的に、化学的又は酵素的切断剤の反応性に依存してもよく、光曝露時間は、光源（例えば、その強度）に依存してもよい。一例では、インキュベーション時間は、約３０分間～約３時間の範囲である。別の例では、光曝露は、約３０秒間～約２分間の範囲であってもよい。次いで、化学的又は酵素的切断剤を反応容器から除去してもよく、又は光照射を停止してもよい。次いで、調製済ライブラリ調製ビーズ１１’を洗浄して（例えば、水、緩衝液などで）、切断された切断部位６４、６４’、いくつかの事例では、化学的又は酵素的切断剤を除去してもよい。
【0200】
図４の中心に示されるように、切断部位６４、６４’の切断後、配列決定可能な断片１４、１４’は、固体支持体１２に付着したままである。スプリント６８、６８’は切断剤７４の影響を受けず、したがって、配列決定可能な断片１４、１４’は、架橋され、固体支持体１２に付着したままである。
【0201】
架橋分子７２、７２’及び固体支持体１２から配列決定可能な核酸断片１４、１４’の放出を完了するために、本方法は、次いで、調製済ライブラリ調製ビーズ１１’を熱に曝露することを含む。選択された温度は、アダプター１８、１８’及び５’連結末端配列６６、６６’からスプリント６８、６８’を解離することができ、並びに配列決定可能な断片１４、１４’の任意の二本鎖部分を解離することができる。一例では、加熱のための温度は、約６０℃～約７０℃の範囲である。
【0202】
調製済ライブラリ調製ビーズ１１’からの配列決定可能なライブラリ断片１４、１４’の二重機構放出がフローセル２４上で発生する場合、複数の調製済ライブラリ調製ビーズ１１’のうちの少なくともいくつかは、フローセル２４の表面に（例えば、フローセル２４に導入された場合、捕捉部位４４、４４’を介して）固定化され、本方法は、調製済ライブラリ調製ビーズ１１’を切断剤７４に曝露する前に、非固定化ライブラリ調製ビーズ１１’をフローセルから除去することを更に含む。
【0203】
加えて、調製済ライブラリ調製ビーズ１１’からの配列決定可能なライブラリ断片１４、１４’の二重機構放出がフローセル２４上で発生する場合、断片１４、１４’の空間的放出が達成される。最終的な放出機構は熱であるため、流体フロー及び／又は慣性混合は存在しないか又は最小限で存在し、したがって、放出された断片１４、１４’は、断片１４、１４’が放出される固体支持体１２の近傍にあるプライマー４２、４２’に播種され得る。
【0204】
配列決定
【0205】
フローセル２４上で断片１４、１４’、１４’’放出が発生する場合、断片１４、１４’、１４’’は、フローセル配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’上においてプライマー４２、４２’に播種されてもよい。断片１４、１４’、１４’’放出が別の反応容器中で発生する場合、放出された断片１４、１４’、１４’’は、固体支持体１２（図４の右手側に示されるように、それに付着した５’連結末端配列６６を有する）から分離されてもよく、ライブラリ断片１４、１４’、１４’’は、プライマー４２、４２’に播種するためにフローセル２４に導入されてもよい。
【0206】
断片１４、１４’、１４’’が放出され、播種されると、フローセル２４は、下流分析の準備が整う。
【0207】
播種されたライブラリ断片１４、１４’、１４’’は、クラスタ生成を使用して増幅することができる。
【0208】
クラスタ生成の一例では、断片１４、１４’、又は１４’’は、高性能再現性ＤＮＡポリメラーゼを使用して３’伸長によって、ハイブリダイズされたプライマー４２、４２’からコピーされる。元の断片１４、１４’、又は１４’’は変性され、コピーは配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’に固定化されて残る。固定化されたコピーを増幅するために、等温ブリッジ増幅又は何らかの他の形態の増幅が使用され得る。例えば、コピーされた鋳型はループオーバーして隣接する相補的プライマー４２、４２’にハイブリダイズし、ポリメラーゼはコピーされた鋳型をコピーして二本鎖架橋を形成し、構造は変性して２本の一本鎖を形成する。これらの２本の鎖は、ループオーバーして隣接する相補的プライマー４２、４２’にハイブリダイズし、再度伸長して、２つの新しい二本鎖ループを形成する。このプロセスを、等温変性及び増幅のサイクルによって各鋳型コピーに対して繰り返して、密集したクローンクラスタを作り出す。二本鎖架橋の各クラスタが変性される。一例では、逆方向鎖は、特異的な塩基切断によって除去され、順方向鋳型ポリヌクレオチド鎖を残す。クラスタ化により、配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’に沿っていくつかの鋳型ポリヌクレオチド鎖が形成される。このクラスタ化の例はブリッジ増幅であり、行われ得る増幅の一例である。排除増幅（Ｅｘａｍｐ）ワークフロー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）などの他の増幅技術が使用され得ることを理解すべきである。
【0209】
鋳型ポリヌクレオチド鎖上の相補的配列にハイブリダイズする配列決定プライマーを導入してもよい。この配列決定プライマーは、鋳型ポリヌクレオチド鎖を配列決定の準備ができた状態にする。鋳型の３’末端及び任意のフローセル結合プライマー２０（コピーに付着しない）は、配列決定反応との干渉を防止するために、特に、望ましくないプライミングを防止するために、ブロックされてもよい。
【0210】
配列決定を開始するために、組込み（incorporation）混合物がフローセル２４に加えられ得る。一例では、組込み混合物は、液体キャリア、ポリメラーゼ、及び蛍光標識したヌクレオチドを含む。蛍光標識したヌクレオチドは、３’ＯＨブロッキング基を含み得る。組込み混合物がフローセル２４に導入されると、流体はフローチャネル２８に入り、いくつかの例では、くぼみ４８、４８’（鋳型ポリヌクレオチド鎖が存在する）に入る。
【0211】
蛍光標識したヌクレオチドが鋳型に依存する方法で配列決定プライマーに追加され（それにより、配列決定プライマーを伸長し）、配列決定プライマーに追加されたヌクレオチドの順序及びタイプの検出が、鋳型の配列決定に使用され得る。より具体的には、ヌクレオチドのうちの１つは、それぞれのポリメラーゼにより、配列決定プライマーを伸長し鋳型ポリヌクレオチド鎖に相補的な新生鎖に組み込まれる。言い換えれば、フローセル２４にわたる鋳型ポリヌクレオチド鎖のうちの少なくともいくつかにおいて、それぞれのポリメラーゼは、組込み混合物中のヌクレオチドのうちの１つによってハイブリダイズされた配列決定プライマーを伸長する。
【0212】
ヌクレオチドの組込みは、画像化イベントを通じて検出され得る。画像化イベント中に、照明システム（図示せず）が、それぞれの配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’に励起光を提供してもよい。
【0213】
いくつかの例では、ヌクレオチドは、ヌクレオチドが配列決定プライマーに加えられると、更なるプライマー伸長を終結させる可逆的終結特性（例えば、３’ＯＨブロッキング基）を更に含み得る。例えば、可逆的末端部分を有するヌクレオチド類似体が配列決定プライマーに加えられ、その結果、デブロッキング剤が送達されてこの部分を除去するまで、その後の伸長は起こり得ない。したがって、可逆的終端を使用する例の場合、検出が行われた後、デブロッキング試薬はフローセル２４に送達され得る。
【0214】
洗浄は、様々な流体送達ステップの間で行ってもよい。次に、ＳＢＳサイクルをｎ回繰り返し、配列決定プライマーをｎヌクレオチドによって伸長し、それにより、長さｎの配列を検出することができる。
【0215】
いくつかの例では、順方向鎖が、配列決定され、除去され、次に、逆方向鎖が、本明細書に記載されるように構築され、配列決定されてもよい。
【0216】
ＳＢＳが詳細に説明されるが、本明細書に記載のフローセル２４は、遺伝子型決定のために、又は他の化学的及び／又は生物学的用途において、他の配列決定プロトコルと共に利用され得ることを理解すべきである。いくつかの事例では、フローセル２４のプライマー４２、４２’は、同時ペアエンド配列決定を可能にするように選択されてもよく、この場合、順方向鎖と逆方向鎖の両方が高分子ヒドロゲル４０、４０’上に存在し、各読み取りの同時塩基呼び出しを可能にする。順次及び同時ペアエンド配列決定により、ゲノム再配列及び反復配列要素、並びに遺伝子融合及び新規転写物の検出が容易になる。別の例では、本明細書に開示されるフローセル２４は、オンセルライブラリ生成に使用されてもよい。
【0217】
本開示を更に説明するために、本明細書に例を示す。これらの例は、例示の目的で提供され、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないことを理解すべきである。
非限定的な実施例
非限定的な実施例
【実施例1】
【0218】
図１Ａに示したものと同様の複合体を、平均直径３μｍで調製した。複合体の固体支持体は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標）Ｍ－２８０ストレプトアビジンビーズであった。特定のビーズ上の断片は、同じ長いＤＮＡ分子（ヒトゲノムから）由来のものであった。ライブラリ断片は、ビオチンオリゴ（biotin oligo）を介して固体支持体に付着した。ライブラリ断片は、インデックス配列と共にＰ５’及びＰ７配列を含み、読み取り１及び読み取り２配列を含んだ。
【0219】
複合体は、ドデシル硫酸ナトリウムにより生理食塩水クエン酸ナトリウム緩衝液に組み込まれ、この流体は、非パターン化配列決定表面（Ｐ５及びＰ７プライマーを含む）及び蓋を含むフローセルにロードされた。非パターン化配列決定表面はまた、ビオチン捕捉部位を含んでいた。
【0220】
次に、フローセルは洗浄液で洗浄された。
【0221】
本明細書に開示される切断組成物の第１の実施例は、ホルムアミド及びクエン酸三ナトリウムを含む約４０体積％のホルムアミド試薬と、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、及び生体適合性界面活性剤を含む約６０体積％の塩緩衝液と、を含むように調製された。切断溶液をフローセル中に導入し、８０℃で約２０秒間インキュベートさせた。次いで、フローセルを２０℃まで冷却し、その温度で約３分間維持した。
【0222】
次いで、フローセルを洗浄溶液で洗浄して、固体支持体及びあらゆる未播種放出ライブラリ断片を除去した。
【0223】
放出され播種されたライブラリ断片を、サイクル増幅によりクラスタへと増殖させた。次いで、クラスタをＳｙｔｏｘ ｇｒｅｅｎで染色する。得られた画像（本明細書では再現しない）は、播種されたライブラリ断片が複合体の近傍で増幅されたことを示した。
【0224】
次に、配列決定をフローセル上で行った。配列決定結果は、長いＤＮＡ分子カバレッジが４０％に近かったことを示した。これは、本明細書に開示される切断組成物の第１の実施例が、固体支持体からのライブラリ断片の効率的な放出をもたらしたことを示した。
【実施例2】
【0225】
本明細書に開示される第１の実施例に係るいくつかの異なる切断組成物は、ホルムアミド試薬（ホルムアミド及びクエン酸三ナトリウムを含む）及び塩緩衝液（塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、及び生体適合性界面活性剤を含む）を含むように調製された。各切断組成物における試薬及び緩衝液の割合を表１に示す。
【表1】
【0226】
フローセル表面Ｐ５及びＰ７プライマーを、ＴＥＴ ＱＣプライマー（例えば、蛍光色素で標識された相補的Ｐ５及びＰ７（ｃＰ５及びｃＰ７）プライマー）にハイブリダイズさせた。この実施例では、蛍光標識を、変性イベントのレポータとして使用した。試薬が変性を引き起こした場合、蛍光標識プライマーは表面を離れ、より低い蛍光強度が得られた。切断組成物で使用される、ＴＥＴ強度（蛍光）とホルムアミド試薬と割合とを図５に示す。図示されるように、ホルムアミド試薬が６０体積％まで増加した場合、蛍光シグナルは減少した。これは、播種されたライブラリ断片が変性したことを示した。ホルムアミド試薬を７０体積％まで増加させた場合、ビオチン－ストレプトアビジン結合を切断することができたが、表面Ｐ５／Ｐ７プライマーのハイブリダイゼーションは、室温でさえも安定ではなかったことが見出された。したがって、開示される実施例におけるホルムアミド試薬：塩緩衝液の体積比は、結合切断及び望ましい播種条件の両方を確実にするために、１：９～約１：１の範囲にわたる。
【実施例3】
【0227】
ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標）Ｍ－２８０ストレプトアビジンビーズは、ドデシル硫酸ナトリウムにより生理食塩水クエン酸ナトリウム緩衝液に組み込まれ、この流体は、非パターン化配列決定表面（Ｐ５及びＰ７プライマーを含む）及び蓋を含むフローセルにロードされた。非パターン化配列決定表面はまた、ビオチン捕捉部位を含んでいた。したがって、Ｍ－２８０ビーズは、ビオチン－ストレプトアビジン結合を介して表面上に固定化された。
【0228】
非パターン化配列決定表面を画像化し、表面上の固定化ビーズを、顕微鏡画像を使用して計数した。
【0229】
フローセルを、次いで、比較用切断剤（ホルムアミド及びクエン酸三ナトリウムを含むホルムアミド試薬）で洗浄した。比較用切断剤を６５℃で２分間インキュベートさせた。非パターン化配列決定表面を画像化し、表面上の固定化ビーズを、顕微鏡画像を使用して計数した。
【0230】
フローセルは、次いで、ホルムアミド及びクエン酸三ナトリウムを含む約５０体積％のホルムアミド試薬と、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、及び生体適合性界面活性剤を含む約５０体積％の塩緩衝液と、を含む、本明細書に開示される切断組成物（切断剤例と称する）の第１の実施例により洗浄された。切断剤例を６５℃で２分間インキュベートさせた。非パターン化配列決定表面を画像化し、表面上の固定化ビーズを、顕微鏡画像を使用して計数した。
【0231】
フローセルを切断剤例で再び洗浄し、画像化した。切断剤例を６５℃で２分間再びインキュベートさせた。切断剤実施での第２の洗浄後、表面上の固定化ビーズを、顕微鏡画像を使用して計数した。
【0232】
洗浄前、比較用切断剤での洗浄後、切断剤例での第１の洗浄後、切断剤例での第２の洗浄後に、フローセル表面上で計数されたビーズの数を、図６に示す。
【0233】
予備洗浄では、溶液中のビーズの１００％が、フローセル表面上に固定化された。比較用切断剤で洗浄した後、ビーズの１５％未満が除去された。切断剤例での第１の洗浄後、ビーズの約８５％が除去された。切断剤例での第２の洗浄後、ビーズの約９０％が除去された。これらの結果は、本明細書に開示される切断混合物例が、ストレプトアビジン－ビオチン結合を破壊するのに有効であることを示している。
【実施例4】
【0234】
ＤＮＡ断片を、デスチオビオチンを使用してＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標）Ｍ－２８０ストレプトアビジンビーズに付着させた。デスチオビオチン化ＤＮＡの熱放出を、異なる温度で、かつ異なる条件下で（例えば、遊離ビオチン又は遊離デスチオビオチンの存在下で）試験した。
【0235】
遊離ビオチンと遊離デスチオビオチンとの混合物を、８２５ｍＭのナトリウム塩水溶液中で調製した。第１の混合物は１００μＭのデスチオビオチンを含有し、第２の混合物は２．５μＭのビオチンを含有し、第３の混合物は１０μＭのビオチンを含有した。
【0236】
対照試料を、いずれの混合物も用いずに２５℃又は６０℃のいずれかに曝露させた。試料例を、第１の混合物（１００μＭのデスチオビオチン）、第２の混合物（２．５μＭのビオチン）、又は第３の混合物（１０μＭのビオチン）の存在下で、２５℃又は６０℃のいずれかに曝露させた。それぞれの処理後にビーズから放出されたＤＮＡの割合を、定量的ＰＣＲによって決定した。結果を図７に示す。
【0237】
図７に示すように、デスチオビオチン化ＤＮＡ断片の大半が、２５℃及び６０℃（対照）のいずれかの遊離ビオチン又は遊離デスチオビオチンの不在下でビーズから放出されなかった。同様に、デスチオビオチン化ＤＮＡ断片の大半が、２５℃の遊離デスチオビオチン又は遊離ビオチン（濃度関係なし）の存在下でビーズから放出されなかった。２５℃にて第３の混合物（１０μＭの遊離ビオチン）へ曝露したビーズは、デスチオビオチン化ＤＮＡ断片の約１．５％しか放出されず、最も低いＤＮＡ断片放出を呈した。対照的に、デスチオビオチン化ＤＮＡ断片の約９０％が、６０℃で遊離デスチオビオチンの存在下でビーズから放出され（混合物１）、デスチオビオチン化ＤＮＡ断片の９５％超が、６０℃で遊離ビオチンの存在下でビーズから放出された（濃度関係なし、混合物２及び３の結果を参照のこと）。より高いＤＮＡ断片放出が、６０℃の遊離ビオチンの存在下で、２５℃の遊離ビオチンの存在下よりもはるかに低い濃度で観察された。
【0238】
追記事項
【0239】
以下により詳細に考察される、前述の概念及び更なる概念の全ての組み合わせが、（かかる概念が相互に矛盾しなければ）本明細書に開示される発明の主題の一部であると企図されることを理解されたい。具体的には、本開示の終わりに現れる特許請求される主題の全ての組み合わせは、本明細書に開示される発明の主題の一部であると企図される。本明細書で明示的に用いられ、また参照により組み込まれる任意の開示においても出現し得る用語は、本明細書で開示される特定の概念と最も一致する意味が与えられるべきであることも理解すべきである。
【0240】
いくつかの実施例を詳細に説明してきたが、開示された例は修正され得ることを理解すべきである。したがって、これまでの説明は非限定的なものであると考えるべきである。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【国際調査報告】