ホーム > 特許ランキング > フェデラル ステート バジェタリー インスティテューション“ナショナル リサーチ センター フォー エピデミオロジー アンド マイクロバイオロジー ネームド アフター ザ オナラリー アカデミシャン エヌ．エフ．ガマレヤ”オブ ザ ミニストリー オブ ヘルス オブ ザ ロシアン フェデレーション
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特表2023-512381小児において重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２に対する特異的免疫を誘導するための薬剤の利用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-27
(54)【発明の名称】小児において重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２に対する特異的免疫を誘導するための薬剤の利用
(51)【国際特許分類】
A61K 39/215 20060101AFI20230317BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20230317BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230317BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230317BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20230317BHJP
A61K 9/19 20060101ALI20230317BHJP
A61K 47/10 20170101ALI20230317BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20230317BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20230317BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20230317BHJP
A61K 35/761 20150101ALI20230317BHJP
C12N 15/50 20060101ALI20230317BHJP
C12N 15/861 20060101ALI20230317BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20230317BHJP
C07K 14/165 20060101ALN20230317BHJP
【ＦＩ】
A61K39/215
A61P11/00
A61P31/14
A61P37/04
A61K9/08
A61K9/19
A61K47/10
A61K47/02
A61K47/18
A61K47/26
A61K35/761
C12N15/50 ZNA
C12N15/861 Z
C12N7/01
C07K14/165
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022520203
(86)(22)【出願日】2022-02-18
(85)【翻訳文提出日】2022-06-27
(86)【国際出願番号】 RU2022000047
(87)【国際公開番号】W WO2022197209
(87)【国際公開日】2022-09-22
(31)【優先権主張番号】2021134724
(32)【優先日】2021-11-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】RU
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522075140
【氏名又は名称】フェデラル ステート バジェタリー インスティテューション“ナショナル リサーチ センター フォー エピデミオロジー アンド マイクロバイオロジー ネームド アフター ザ オナラリー アカデミシャン エヌ．エフ．ガマレヤ”オブ ザ ミニストリー オブ ヘルス オブ ザ ロシアン フェデレーション
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】ズブコワ，オルガ ヴァディモヴナ
(72)【発明者】
【氏名】オザロフスカイア，タチアナ アンドレーヴナ
(72)【発明者】
【氏名】ドルジコワ，インナ ヴァディモヴナ
(72)【発明者】
【氏名】ポポーワ，オルガ
(72)【発明者】
【氏名】シチェブリアコフ，ドミトリー ウィークトロヴィチ
(72)【発明者】
【氏名】グロウソワ，ダリア ミハイロヴナ
(72)【発明者】
【氏名】ザルラエワ，アリーナ シャミロヴナ
(72)【発明者】
【氏名】ツカバツリン，アミール イルダロビヴィチ
(72)【発明者】
【氏名】ツカバツリーナ，ナタリア ミハイロヴナ
(72)【発明者】
【氏名】シシェルビニン，ドミトリー ニコラエヴィチ
(72)【発明者】
【氏名】エスマガムベトフ，イリアス ブラトビッチ
(72)【発明者】
【氏名】トカルスカヤ，エリザヴェータ アレクサンドロヴナ
(72)【発明者】
【氏名】ボティコフ，アンドレイ ジェンナデビッチ
(72)【発明者】
【氏名】エロコワ，アリーナ セルゲーヴナ
(72)【発明者】
【氏名】イザエヴァ，ファティマ マゴメドヴナ
(72)【発明者】
【氏名】ニキテンコ，ナタリア アナトレヴナ
(72)【発明者】
【氏名】ルベネッツ，ナデジダ レオニドヴナ
(72)【発明者】
【氏名】セミキン，アレクサンドル セルゲーヴィチ
(72)【発明者】
【氏名】ナロディツキー，ボリス サベリエビッチ
(72)【発明者】
【氏名】ログノフ，デニス ユーリエヴィチ
(72)【発明者】
【氏名】ギンツブルク，アレクサンドル レオニドヴィチ
(72)【発明者】
【氏名】ボリセヴィチ，セルゲイ ウラジーミロヴィチ
(72)【発明者】
【氏名】チェルネツォフ，ウラジーミル アレクサンドロヴィチ
(72)【発明者】
【氏名】クリュコフ，エフゲニー ウラジーミロヴィチ
(72)【発明者】
【氏名】バビラ，ウラジーミル フェドロヴィチ
(72)【発明者】
【氏名】キタエフ，ドミトリー アナトレヴィチ
(72)【発明者】
【氏名】ロギノヴァ，スヴェトラーナ ヤコヴレヴァ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA95X
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA45
4C076AA12
4C076AA29
4C076BB15
4C076BB25
4C076CC06
4C076CC35
4C076DD09
4C076DD23
4C076DD37
4C076DD49
4C076DD50Z
4C076DD67
4C076EE23
4C076GG06
4C076GG41
4C085AA03
4C085BA71
4C085DD84
4C085GG03
4C085GG10
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA12
4C087MA17
4C087MA44
4C087MA66
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZA59
4C087ZB09
4C087ZB33
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA01
4H045EA29
4H045EA31
4H045FA74
(57)【要約】
本発明群はバイオテクノロジー、免疫学及びウイルス学に関し、特に、生後１か月以上の小児において重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる疾患を予防するための薬剤に関する。このために、Ｅ１及びＥ３部位が欠失され、そしてＯＲＦ６－Ａｄ２６部位がＯＲＦ６－Ａｄ５により置換された組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムに基づき、配列番号１、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターの形態の構成成分１、及び／又はＥ１及びＥ３部位が欠失された組換えヒトアデノウイルス血清型５のゲノムに基づき、配列番号１、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターの形態の構成成分２、及び／又はＥ１及びＥ３部位が欠失された組換えサルアデノウイルス血清型２５のゲノムに基づき、配列番号４、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターの形態の構成成分３を含む薬剤の利用の６つの変異型が開発された。特許請求される構成成分は、個別でも組み合わせても使用される。本発明群は、生後１か月以上の小児においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する液性及び細胞性免疫応答の反応の発生を可能にする、安全で有効な薬剤の作製を提供する。また、本薬剤は成人の免疫応答に相当する液性免疫応答を誘導すると共に、呼吸器において増強された粘膜応答を誘導する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｅ１及びＥ３部位が欠失され、そしてＯＲＦ６－Ａｄ２６部位がＯＲＦ６－Ａｄ５により置換された組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムに基づき、配列番号１、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターの形態の構成成分を含む薬剤の、生後１か月以上の小児において重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫を誘導するための使用。
【請求項2】
Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えヒトアデノウイルス血清型５のゲノムに基づき、配列番号１、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターの形態の構成成分を含む薬剤の、生後１か月以上の小児において重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫を誘導するための使用。
【請求項3】
Ｅ１及びＥ３部位が欠失され、そしてＯＲＦ６－Ａｄ２６部位がＯＲＦ６－Ａｄ５により置換された組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムに基づき、配列番号１、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターの形態の構成成分１と、Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えヒトアデノウイルス血清型５のゲノムに基づき、配列番号１、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターの形態の構成成分２とを表す組合せを含む薬剤の、生後１か月以上の小児において重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫を誘導するための使用。
【請求項4】
Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えサルアデノウイルス血清型２５のゲノムに基づき、配列番号４、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターの形態の構成成分を含む薬剤の、生後１か月以上の小児において重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫を誘導するための使用。
【請求項5】
Ｅ１及びＥ３部位が欠失され、そしてＯＲＦ６－Ａｄ２６部位がＯＲＦ６－Ａｄ５により置換された組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムに基づき、配列番号１、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターの形態の構成成分１と、Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えサルアデノウイルス血清型２５のゲノムに基づき、配列番号４、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターの形態の構成成分２とを表す組合せを含む薬剤の、生後１か月以上の小児において重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫を誘導するための使用。
【請求項6】
Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えサルアデノウイルス血清型２５のゲノムに基づき、配列番号４、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターの形態の構成成分１と、Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えヒトアデノウイルス血清型５のゲノムに基づき、配列番号１、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターの形態の構成成分２とを表す組合せを含む薬剤の、生後１か月以上の小児において重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫を誘導するための使用。
【請求項7】
前記薬剤が呼吸器の粘膜における粘膜免疫応答の誘導を可能にする、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項8】
前記薬剤が液体形態又は凍結乾燥形態で調製される、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項9】
前記薬剤の液体形態が、重量％で：トリス ０．１８３１．．．０．３４３２
塩化ナトリウム ０．３３１３．．．０．６２１２
スクロース ３．７８２１．．７．０９１５
塩化マグネシウム六水和物 ０．０１５４．．．０．０２８９
ＥＤＴＡ ０．００２９．．．０．００５４
ポリソルベート－８０ ０．０３７８．．．０．０７０９
エタノール ９５％ ０．０００４．．．０．０００７
水 残り
の緩衝液を含有する、請求項８に記載の使用。
【請求項10】
前記薬剤の減圧凍結乾燥形態が、重量％で：トリス ０．０１８０．．．０．０３３８
塩化ナトリウム ０．１０４４．．．０．１９５７
スクロース ５．４６８８．．．１０．２５３９
塩化マグネシウム六水和物 ０．００１５．．．０．００２８
ＥＤＴＡ ０．０００３．．．０．０００５
ポリソルベート－８０ ０．００３７．．．０．００７０
水 残り
の緩衝液を含有する、請求項８に記載の使用。
【請求項11】
前記薬剤の構成成分（単数及び／又は複数）が鼻腔内及び／又は筋肉内投与を対象とする、請求項１～１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項12】
前記薬剤が、５×１０９～５×１０１０ウイルス粒子の用量での投与を対象とする、請求項１～１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項13】
前記薬剤の構成成分が１週間を超える間隔での連続投与を対象とする、請求項３、５、６、９、１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項14】
前記薬剤の構成成分が同時投与を対象とする、請求項３、５、６、９、１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項15】
前記構成成分が異なるパッケージ内にある、請求項３、５、６、９、１０のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、バイオテクノロジー、免疫学及びウイルス学に関する。特許請求される薬剤は、重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる疾患を予防するために使用することができる。
本発明は、バイオテクノロジー、免疫学及びウイルス学に関する。特許請求される薬剤は、重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる疾患を予防するために使用することができる。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
２０１９年１２月に、中華人民共和国の湖北（Hubei）省において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と命名された人獣共通感染症由来の新規のコロナウイルスが蔓延した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２により引き起こされる伝染病はコロナウイルス疾患－１９と呼ばれ、ＣＯＶＩＤ－１９と略される。所与の疾患は、無症状及び軽症型と、敗血症及び多臓器系不全を伴うこともある重症型との両方で進行し得る。数か月以内に疾患は世界中に広がり、２００を超える国に影響を与えた。２０２０年１月に、世界保健機関はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２関連の大流行が国際的に懸念される公衆衛生上の緊急事態であると宣言し、３月にはこの疾患の蔓延をパンデミックであると表現した。２０２１年７月２８日までに１９５百万を超える症例が確認され、４百万の人々が死亡した。
２０１９年１２月に、中華人民共和国の湖北（Hubei）省において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と命名された人獣共通感染症由来の新規のコロナウイルスが蔓延した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２により引き起こされる伝染病はコロナウイルス疾患－１９と呼ばれ、ＣＯＶＩＤ－１９と略される。所与の疾患は、無症状及び軽症型と、敗血症及び多臓器系不全を伴うこともある重症型との両方で進行し得る。数か月以内に疾患は世界中に広がり、２００を超える国に影響を与えた。２０２０年１月に、世界保健機関はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２関連の大流行が国際的に懸念される公衆衛生上の緊急事態であると宣言し、３月にはこの疾患の蔓延をパンデミックであると表現した。２０２１年７月２８日までに１９５百万を超える症例が確認され、４百万の人々が死亡した。
【0003】
ＣＯＶＩＤ－１９の持続的な大流行は、公衆衛生の究極の脅威を引き起こす。現在、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する安全で有効なワクチンの開発は、最も重要な世界的優先事項である。
【0004】
パンデミック開始の翌年内に、種々の製薬会社がＣＯＶＩＤ－１９に対するその候補ワクチンの変異型を提供した。
【0005】
製薬会社Pfizerは、バイオテクノロジー企業BioNTechと共同して、ＢＮＴ１６２ｂ２ワクチン（トジナメラン）を開発した。所与のワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質突然変異型をコードする修飾ｍＲＮＡが封入された脂質ナノ粒子を表す。現時点で、このワクチンは成人及び１２歳以上の小児に対して使用することが認められている（F.P. Polacketal. Safety and Efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 Vaccine. N Engl J Med 2020; 383: 2603-2615; www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/vaccines/recommendations/adolescents.html）。
【0006】
製薬会社Modernaは、National Institute of Health（ＵＳＡ）と共同して、ｍＲＮＡ－１２７３ワクチンを開発した。このワクチンの活性成分は、脂質コーティングで包囲された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質をコードするｍＲＮＡである。現在、このワクチンの緊急使用は、１８歳以上の成人に対して認められている。また、Modernaは１２～１７歳の小児に対して研究を実行しており、現在審査中である。現時点で、ＫｉｄＣＯＶＥと呼ばれる６か月～１２歳の小児を免疫化する研究が進行中である（L. A. Jackson etal. An mRNA Vaccine against SARS-CoV-2 - Preliminary Report. N Engl J Med 2020; 383:1920-1931;https://penntoday.upenn.edu/news/covid-vaccine-kids; https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04796896）。
【0007】
University of Oxfordは、製薬会社AstraZenecaと共同して、ＣｈＡｄＯｘ１ ｎＣｏＶ－１９ベクターワクチン（ＡＺＤ１２２２）を開発した。このワクチンの活性成分は、組織プラスミノーゲン活性化因子リーダー配列を伴うＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの全長Ｓタンパク質のコドン最適化コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＭＮ９０８９４７）を含むチンパンジーアデノウイルスＣｈＡｄＯｘ１である。ワクチン接種プロトコルは、２８日間隔の２回免疫化を含む（M. Voysey et al. Safety and efficacy of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine (AZD1222) against SARS-CoV-2: an interim analysis of four randomised controlled trials in Brazil, South Africa, and the UK. TheLancet. Vol. 397, Issue 10269, P99-111, 2021）。
【0008】
CanSino社は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２全長Ｓ糖タンパク質を発現する組換えヒトアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）に基づいた、ＣＯＶＩＤ－１９に対するベクターワクチンを開発した。現在、ワクチンは、１８歳以上の成人における緊急使用を対象としている（ＧｅｎＢａｎｋＹＰ＿００９７２４３９０）（Feng-Cai Zhu et al. Immunogenicity and safety of a recombinant adenovirus type-5-vectored COVID-19 vaccine in healthy adults aged 18 years or older: a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2 trial. The Lancet. Vol. 369, Issue 10249, P479-488, 2020）。
【0009】
Johnson and Johnson及びJanssen Pharmaceutical Researchグループは、Beth Israel Deaconess Medical Centerと共同し、JanssenAdVac（登録商標）技術を実行して、いくつかの候補ワクチンを作製した。安全性及び有効性研究の実行後、候補ワクチンＡｄ２６．ＣＯＶ２．Ｓ（Ａｄ２６ＣＯＶＳ１）を選択した。このワクチンの活性成分は、フューリン切断部位の突然変異及び２つのプロリン安定化突然変異を伴うＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質遺伝子を含む、Ｅ１及びＥ３領域の欠失を有する組換えアデノウイルスベクター血清型２６である。ワクチンは、１８歳以上の成人に対して緊急状態で利用され得る。現在、ティーンエイジャー及び出生直後からの小児におけるワクチン利用の研究が進行中である（J. Sadoff et al. Interim Results of a Phase 1-2a Trial of Ad26.COV2.S Covid-19 Vaccine. N Engl J Med, 2021 Jan 13.DOI: 10.1056 / NEJMoa2034201; https://www.janssenmd.com/janssen-covid19-vaccine/special-populations/pediatrics/use-of-janssen-covid19-vaccine-in-pediatric-participants）。
【0010】
Beijing Institute of Biological Products Co.では、ＣＯＶＩＤ－１９に対する不活化ワクチンが開発された。このワクチンの緊急使用は、１８歳以上の成人において認められている。また、３～６歳、７～１２歳、１３～１７歳の年齢グループの小児に対するこのワクチンの臨床研究に関する情報が公開されている。現在、研究は進行中である（https://www.who.int/news/item/07-05-2021-who-lists-additional-covid-19-vaccine-for-emergency-use-and-issues-interim-policy-recommendations; https://clinicaltrials.gov /ct2/show/NCT04917523?cond=covid-19+vaccine&age_v=5&draw=2&rank=10）。
【0011】
したがって、現在、ＣＯＶＩＤ－１９に対して１つのｍＲＮＡ系ワクチン（Pfizer）だけが小児における使用のために承認されている。しかしながら、医師らにより、ＣＯＶＩＤ－１９診断で入院する若年患者の数は増加していることが気付かれている。若年集団の間の死亡率も上昇しており（https://www.paho.org/en/news/5-5-2021-hospitalizations-and-deaths-younger-people-soar-due-covid-19-paho-director-reports）、小児におけるＣＯＶＩＤ－１９の予防のためのワクチンの必要性がもたらされる。
【0012】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスに対する防御免疫は、いくつかの一連の免疫系を活性化する。ＣＯＶＩＤ－１９に対する有効なワクチンは、液性免疫応答及び細胞性免疫応答の両方を誘導するであろうと思われる。その上、防御免疫の重要な要素は、ウイルス侵入ゲートである上咽頭における粘膜免疫（例えば、ＩｇＡ抗体の発現により実行されるもの）の活性化であろう。
【0013】
したがって、本発明の背景では、主要な感染ゲートである呼吸器の粘膜を含む、小児においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答を誘導することができる新規の薬剤の開発が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0014】
発明の実行
特許請求される発明群の技術的課題は、生後１か月以上の小児においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する免疫応答（粘膜免疫応答を含む）を効果的に誘導するための薬剤の作製である。
特許請求される発明群の技術的課題は、生後１か月以上の小児においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する免疫応答（粘膜免疫応答を含む）を効果的に誘導するための薬剤の作製である。
【課題を解決するための手段】
【0015】
技術的結果は、生後１か月以上の小児においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する液性及び細胞性免疫応答の反応の発生を可能にする、安全で有効な薬剤の作製にある。
【0016】
小児は未成熟の先天性及び適応免疫系を持って生まれ、これは小児の成長と共に発達し、記憶を獲得する。ヒトの誕生から思春期まで、免疫系は、その発達においていくつかの段階を経る。
【0017】
新生児の免疫系は抑制状態にある。食作用系は発達していない。非共有抗原の影響が母体の同種抗原によって大きく制限される場合、新生児のＴ細胞は成人の細胞とは大きく異なり、これは、母体内の生命の結果である。したがって、かなり早期の適応Ｔ細胞性免疫は、疫寛容原性の反応性、同種抗原認識の低下、及び非共有抗原に対する応答の弱さを特徴とする。新生児のＢ細胞も成人のＢ細胞とは大きく異なる。新生児のＢ細胞は、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ及びＢＡＦＦ－Ｒ発現の低下、並びにＣＤ４０Ｌ及びＩＬ－１０に応答するＩｇＧ及びＩｇＡ産生の低下を有することが知られている（Kaur K, Chowdhury S, Greenspan NS, Schreiber JR. Decreased expression of tumor necrosis factor family receptors involved in humoral immune responses in preterm neonates. Blood. 2007 Oct 15;110(8):2948-54. doi: 10.1182/blood-2007-01-069245. Epub 2007 Jul 18. PMID: 17634409）。まとめると、これらの特性は、免疫グロブリンの種類の不完全な切換えと共に、液性免疫応答の抑制の一因となる。新生児及び２か月未満の乳児のＢ細胞は、成人と比較して、抗体の親和性成熟を制限する体細胞超変異の低下を実証する。また、早期生命段階における骨髄の間質細胞は、形質芽細胞の長期生存及び血漿細胞への分化を支援することができず、したがって、より年上の小児及び成人とは対照的に、免疫化後に産生されるＩｇＧ抗体はどれも急速に減少する（Pihlgren M, Friedli M, Tougne C, Rochat AF, Lambert PH, Siegrist CA. Reduced ability of neonatal and early-life bone marrow stromal cells to support plasmablast survival. J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):165-72. doi: 10.4049/jimmunol.176.1.165. PMID: 16365407）。結果として、Ｔ細胞依存性抗原への初期応答に関する適応免疫系の有効性は、より年上の小児及び成人と比較して新生児でははるかに低い（A.K. Simon, G.A. Hollander, A. McMichael.Evolution of the immune system in humans from infancy to old age. Proc Biol Sci. 2015 Dec 22; 282(1821): 20143085. doi: 10.1098/rspb.2014.3085, PMCID: PMC4707740, PMID: 26702035）。
【0018】
乳児期において、免疫系は徐々に成熟する。母親が以前に回復した多数の感染症に対する非常に重要な初期防御は、母親から胎盤を介して、そして乳によって移行された受動ＩｇＧ抗体によって提供される。
【0019】
次の発達段階は、母体抗体の破壊によって提供される。感染侵入への一次免疫応答はクラスＭ免疫グロブリンの合成によって発生し、免疫記憶を残さない。このようなタイプの免疫応答は感染症に対するワクチン接種の場合にも起こり、ワクチン再接種のみが、ＩｇＧクラス抗体の産生により二次免疫応答を形成する。
【0020】
小児は成長と共に外界との接触が増加する。徐々に、免疫反応はＩｇＧクラス抗体の形成に切り換わる。しかしながら、多数の抗原に対する一次免疫応答は残存する（ＩｇＭ合成）。局所免疫系は、依然として未成熟なままである。徐々に、ＩｇＧ及びＩｇＭの平均血中濃度は増大し、成人に相当するレベルに到達するが、ＩｇＡの血中レベルは依然として目標値に到達しない。
【0021】
免疫系の最後の発達段階は思春期である。性ステロイドの分泌の増大を背景として、リンパ系器官の容積が減少する。性ホルモンの分泌は、細胞性免疫連鎖の抑制を引き起こす（Shcheplyagina, L.A., Kruglova, I.V. Age peculiarities of immunity in children, Russian Medical Journal No. 23 of 11.11.2009, p. 1564）。
【0022】
したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する液性及び細胞性免疫応答の反応の発生を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する免疫応答を効果的に誘導するために小児に対して利用するための薬剤の開発は、複雑な科学的課題である。
【0023】
小児がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に直面すると、ウイルスは最初に呼吸器の粘膜に影響を与える。これは、ウイルスと免疫系との間の相互作用が、最初に主に呼吸器及び口腔の粘膜において起こることを意味する。したがって、粘膜免疫の誘導は、医薬品の防御特性に影響を与える重要な因子である。
【0024】
技術のレベルに基づいて、成人対象ワクチンの小児への投与は、小児の免疫系が未成熟であるために、その有効性を低減し得ると提言することができる。しかしながら、行われた研究により、成人用量の１０分の１の開発薬剤を小児へ投与すると、成人の免疫応答に相当する液性免疫応答が誘導されることが示された。この場合、これは予想外の結果である。
【0025】
また、若い動物において、開発薬剤の投与は、呼吸器の粘膜上のＩｇＧ抗体のレベルの上昇を引き起こすことが実証された。その上、免疫化プロトコルに薬剤の鼻腔内投与法を導入すると、これにより、粘膜上のＩｇＧ抗体の分泌がもたらされる。したがって、実行された研究の結果として、呼吸器において増強された粘膜応答を誘導する薬剤投与パターンが開発された。
【0026】
所与の技術的結果は、特許請求の範囲によって達成される：
【0027】
Ｅ１及びＥ３部位が欠失され、そしてＯＲＦ６－Ａｄ２６部位がＯＲＦ６－Ａｄ５により置換された組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムに基づき、配列番号１、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターの形態の構成成分を含む薬剤の、生後１か月以上の小児において重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫を誘導するための利用。
【0028】
Ｅ１及びＥ３部位の欠失を有する組換えヒトアデノウイルス血清型５のゲノムに基づき、配列番号１、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターの形態の構成成分を含む薬剤の、生後１か月以上の小児において重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫を誘導するための利用。
【0029】
Ｅ１及びＥ３部位が欠失され、そしてＯＲＦ６－Ａｄ２６部位がＯＲＦ６－Ａｄ５により置換された組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムに基づき、配列番号１、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターの形態の構成成分１と、Ｅ１及びＥ３部位の欠失を有する組換えヒトアデノウイルス血清型５のゲノムに基づき、配列番号１、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターの形態の構成成分２とを表す組合せを含む薬剤の、生後１か月以上の小児において重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫を誘導するための利用。
【0030】
Ｅ１及びＥ３部位の欠失を有する組換えサルアデノウイルス血清型２５のゲノムに基づき、配列番号４、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターの形態の構成成分を含む薬剤の、生後１か月以上の小児において重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫を誘導するための利用。
【0031】
Ｅ１及びＥ３部位が欠失され、そしてＯＲＦ６－Ａｄ２６部位がＯＲＦ６－Ａｄ５により置換された組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムに基づき、配列番号１、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターの形態の構成成分１と、Ｅ１及びＥ３部位の欠失を有する組換えサルアデノウイルス血清型２５のゲノムに基づき、配列番号４、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターの形態の構成成分２とを表す組合せを含む薬剤の、生後１か月以上の小児において重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫を誘導するための利用。
【0032】
Ｅ１及びＥ３部位の欠失を有する組換えサルアデノウイルス血清型２５のゲノムに基づき、配列番号４、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターの形態の構成成分１と、Ｅ１及びＥ３部位の欠失を有する組換えヒトアデノウイルス血清型５のゲノムに基づき、配列番号１、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターの形態の構成成分２とを表す組合せを含む薬剤の、生後１か月以上の小児において重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫を誘導するための利用。
【0033】
特定の実施形態において：
本薬剤は、呼吸器の粘膜における粘膜免疫応答を誘導する。
本薬剤は、呼吸器の粘膜における粘膜免疫応答を誘導する。
【0034】
本薬剤は、液体形態又は凍結乾燥形態で調製される。
【0035】
そこにおいて、薬剤の液体形態は、以下の緩衝液（重量％）を含む：
トリス ０．１８３１．．．０．３４３２
塩化ナトリウム ０．３３１３．．．０．６２１２
スクロース ３．７８２１．．．７．０９１５
塩化マグネシウム六水和物 ０．０１５４．．．０．０２８９
ＥＤＴＡ ０．００２９．．．０．００５４
ポリソルベート－８０ ０．０３７８．．．０．０７０９
エタノール ９５％ ０．０００４．．．０．０００７
水 残り
トリス ０．１８３１．．．０．３４３２
塩化ナトリウム ０．３３１３．．．０．６２１２
スクロース ３．７８２１．．．７．０９１５
塩化マグネシウム六水和物 ０．０１５４．．．０．０２８９
ＥＤＴＡ ０．００２９．．．０．００５４
ポリソルベート－８０ ０．０３７８．．．０．０７０９
エタノール ９５％ ０．０００４．．．０．０００７
水 残り
【0036】
そこにおいて、薬剤の減圧凍結乾燥（reduced lyophilized）形態は、以下の緩衝液（重量％）を含む：
トリス ０．０１８０．．．０．０３３８
塩化ナトリウム ０．１０４４．．．０．１９５７
スクロース ５．４６８８．．．１０．２５３９
塩化マグネシウム六水和物 ０．００１５．．．０．００２８
ＥＤＴＡ ０．０００３．．．０．０００５
ポリソルベート－８０ ０．００３７．．．０．００７０
水 残り
トリス ０．０１８０．．．０．０３３８
塩化ナトリウム ０．１０４４．．．０．１９５７
スクロース ５．４６８８．．．１０．２５３９
塩化マグネシウム六水和物 ０．００１５．．．０．００２８
ＥＤＴＡ ０．０００３．．．０．０００５
ポリソルベート－８０ ０．００３７．．．０．００７０
水 残り
【0037】
特定の実施形態において、薬剤の構成成分（単数及び／又は複数）は、鼻腔内及び／又は筋肉内投与を対象とする。
【0038】
特定の実施形態において、薬剤は、５＊１０９～５＊１０１０ウイルス粒子の用量での投与を対象とする。
【0039】
特定の実施形態において、薬剤の構成成分は、１週間を超える間隔での連続投与を対象とするか、又は同時投与を対象とする。
【0040】
そこにおいて、薬剤の構成成分は、個々のパッケージ内にあることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【0041】
図面の簡単な説明
【図1】開発医薬品Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２によりマウスを免疫化した後、免疫化の前（１日目）及び研究の１４日目の増殖性ＣＤ４＋（А）及びＣＤ８＋（Б）Ｔリンパ球の百分率を説明する。ドットは、研究に参加している各動物についての値を示す。中央値は、各データ群について黒色線で示される。偏差は９５％信頼区間を示す。記号＊＊は、１日目及び１４日目の値の間の統計的有意差を示す（ｐ＜０．０１、マンホイットニー検定）。Ｙ軸 － 増殖性細胞の数（％） Ｘ軸 － 時間（日）
【図2】開発医薬品Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２によりマウスを免疫化した後、免疫化の前（１日目）及び研究の１４日目の増殖性ＣＤ４＋（А）及びＣＤ８＋（Б）Ｔリンパ球の百分率を説明する。ドットは、研究に参加している各動物についての値を示す。中央値は、各データ群について黒色線で示される。偏差は９５％信頼区間を示す。記号＊（ｐ＜０．０５）及び＊＊（ｐ＜０．０１）は、１日目及び１４日目の値の間の統計的有意差を示す（マンホイットニー検定）。Ｙ軸 － 増殖性細胞の数（％） Ｘ軸 － 時間（日）
【図3】１ｘ１０１０ウイルス粒子の用量で開発医薬品によりボランティアを免疫化した後、ワクチン接種の前（１日目）並びに研究の２１、２８及び４２日目のＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２ウイルスＳタンパク質のＲＢＤドメインに特異的なＩｇＧ抗体の力価を説明する。ドットは、研究に参加している各ボランティアについての値を示す。抗体力価の幾何平均値は、各データ群について黒色線で表される。偏差は９５％信頼区間を示す。２１、２８及び４２日目の値の間の統計的有意差は括弧で示され、その上に、値ｐ（ウィルコクソンの順位和検定）が示される（♯♯♯♯－ｐ＜０．０００１）。ＵＣは、所与のデータサンプル間の不確定の差異を意味する。ワクチン接種の前（１日目）の値と比較した２１、２８及び４２日目の値の間の統計的有意差は、ウィルコクソンの順位和検定によって決定した（＊＊＊＊－ｐ＜０．０００１）。Ｙ軸 － 抗原特異的ＩｇＧ抗体の力価； Ｘ軸 － 時間（日）。
【図4】２ｘ１０１０ウイルス粒子の用量で開発医薬品によりボランティアを免疫化した後、ワクチン接種の前（１日目）並びに研究の２１、２８及び４２日目のＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２ウイルスＳタンパク質のＲＢＤドメインに特異的なＩｇＧ抗体の力価を説明する。ドットは、研究に参加している各ボランティアについての値を示す。抗体力価の幾何平均値は、各データ群について黒色線で表される。偏差は９５％信頼区間を示す。２１、２８及び４２日目の値の間の統計的有意差は括弧で示され、その上に、値ｐ（ウィルコクソンの順位和検定）が示される（♯♯♯♯－ｐ＜０．０００１）。ＵＣは、所与のデータサンプル間の不確定の差異を意味する。ワクチン接種の前（１日目）の値と比較した２１、２８及び４２日目の値の間の統計的有意差は、ウィルコクソンの順位和検定によって決定した（＊＊＊＊－ｐ＜０．０００１）。Ｙ軸 － 抗原特異的ＩｇＧ抗体の力価； Ｘ軸 － 時間（日）。
【図5】１ｘ１０１０ウイルス粒子の用量で開発医薬品によりボランティアを免疫化した後、免疫化の前（１日目）及び研究の２８日目の増殖性ＣＤ４＋（Ａ）及びＣＤ８＋（Б）Ｔリンパ球の百分率を説明する。ドットは、研究に参加している各ボランティアについての値を示す。中央値は、各データ群について黒色線で示される。偏差は９５％信頼区間を示す。記号＊＊＊＊は、１日目及び２８日目の値の間の統計的有意差を示す（ｐ＜０．０００１、ウィルコクソンの順位和検定に従う）。Ｙ軸 － 増殖性細胞の数（％） Ｘ軸 － 時間（日）
【図6】２ｘ１０１０ウイルス粒子の用量で開発医薬品によりボランティアを免疫化した後、免疫化の前（１日目）及び研究の２８日目の増殖性ＣＤ４＋（Ａ）及びＣＤ８＋（Б）Ｔリンパ球の百分率を説明する。ドットは、研究に参加している各ボランティアについての値を示す。中央値は、各データ群について黒色線で示される。偏差は９５％信頼区間を示す。記号＊＊＊＊は、１日目及び２８日目の値の間の統計的有意差を示す（ｐ＜０．０００１、ウィルコクソンの順位和検定に従う）。Ｙ軸 － 増殖性細胞の数（％） Ｘ軸 － 時間（日）
【発明を実施するための形態】
【0042】
発明の実施形態
重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫生物学的薬剤の開発の第１段階は、ワクチン抗原の選択であった。このプロセスの一部として文献調査を実施し、コロナウイルスＳタンパク質は、候補ワクチンを作製するために最も有望な抗原であることが実証された。これは、ウイルス粒子の細胞への結合、融合及び侵入に関与する１型膜貫通糖タンパク質である。実証されるように、これは中和抗体の誘導因子である（Liang M et al, SARS patients-derived human recombinant antibodies to S and M proteins efficiently neutralize SARS-coronavirus infectivity. BiomedEnvironSci. 2005 Dec;18(6):363-74）。
重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫生物学的薬剤の開発の第１段階は、ワクチン抗原の選択であった。このプロセスの一部として文献調査を実施し、コロナウイルスＳタンパク質は、候補ワクチンを作製するために最も有望な抗原であることが実証された。これは、ウイルス粒子の細胞への結合、融合及び侵入に関与する１型膜貫通糖タンパク質である。実証されるように、これは中和抗体の誘導因子である（Liang M et al, SARS patients-derived human recombinant antibodies to S and M proteins efficiently neutralize SARS-coronavirus infectivity. BiomedEnvironSci. 2005 Dec;18(6):363-74）。
【0043】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質に対する免疫反応の最も効果的な誘導を達成するために、著者らは、発現カセットの複数の変異型を開発した。
【0044】
発現カセット配列番号１は、ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルからなる。ＣＭＶプロモーターは、多数の細胞型における構成的な発現を可能にする初期サイトメガロウイルス遺伝子のプロモーターである。しかしながら、ＣＭＶプロモーターにより管理される標的遺伝子発現の力は、細胞型に応じて異なる。さらには、ＣＭＶプロモーターの制御下での導入遺伝子発現レベルは、ＤＮＡメチル化に関連する遺伝子発現の抑制のために細胞培養時間の増加と共に低下することが示された［Wang W., Jia YL., Li YC., Jing CQ., Guo X., Shang XF., Zhao CP., Wang TY. Impact of different promoters, promoter mutation, and an enhancer on recombinant protein expression in CHO cells. // Scientific Reports - 2017. - Vol. 8. - P. 10416］。
【0045】
発現カセット配列番号２は、ＣＡＧプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルからなる。ＣＡＧプロモーターは、ＣＭＶプロモーターの初期エンハンサー、ニワトリβ－アクチンプロモーター及びキメライントロン（ニワトリβ－アクチン及びウサギβ－グロビン）を含む合成プロモーターである。実験的に、ＣＡＧプロモーターの転写活性はＣＭＶプロモーターよりも高いことが示された［Yang C.Q., Li X.Y., Li Q., Fu S.L., Li H., Guo Z.K., Lin J.T., Zhao S.T. Evaluation of three different promoters driving gene expression in developing chicken embryo by using in vivo electroporation. // Genet. Mol. Res. - 2014. - Vol. 13. - P. 1270-1277］。
【0046】
発現カセット配列番号３は、ＥＦ１プロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルからなる。ＥＦ１プロモーターは、ヒト真核生物翻訳伸長因子１β（ＥＦ－１α）のプロモーターである。このプロモーターは、広範な細胞型において構成的に活性である［PMID: 28557288. The EF‐1αpromoter maintains high‐level transgene expression from episomal vectors in transfected CHO‐K1 cells］。ＥＦ－１α遺伝子は、真核細胞において最も広範囲に広がるタンパク質の１つである伸長因子－１αをコードし、哺乳類細胞の全ての型において発現される。このＥＦ－１αプロモーターは、多くの場合、ウイルスプロモーターが制御された遺伝子を発現することができない細胞において、そしてウイルスプロモーターが徐々に抑制される細胞において活性である。
【0047】
発現カセット配列番号４は、ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルからなる。
【0048】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスＳタンパク質遺伝子を人体に効果的に送達するために、アデノウイルス科に基づくベクター系を選択した。アデノウイルスベクターはあらゆる利点を有する：これらはヒト細胞において増殖することができず、これらは増殖性及び非増殖性細胞の両方に侵入し、これらは細胞性及び液性免疫応答を誘導することができ、これらは高レベルの標的抗原の発現を保証する。
【0049】
著者らは、種々の血清型のアデノウイルス科に基づいて、２つの構成成分を含む薬剤の変異型と、１つの構成成分を含む変異型とを開発した。したがって、薬剤の第１の構成成分又は一成分薬剤の投与後に起こり得るアデノウイルスベクター部分への免疫応答は先になって増大されることなく、二成分薬剤の利用の場合、又は一成分薬剤の反復投与が必要な場合（後者の場合、別のアデノウイルスに基づく薬剤が投与され得るので）に、ワクチン抗原に対する抗原特異的免疫応答の発生に影響を与えない。
【0050】
その上、開発薬剤は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスに対する免疫応答の誘導のための薬剤の範囲を広げ、これは、集団の一部においてアデノウイルス科の一部の血清型に対する既存免疫（pre-immunity）の存在の問題に関する困難の克服を可能にすることになる。
【0051】
したがって、実行した研究の結果として、以下の技術的解決策が開発された。
【0052】
Ｅ１及びＥ３部位が欠失され、そしてＯＲＦ６－Ａｄ２６部位がＯＲＦ６－Ａｄ５により置換された組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムに基づき、配列番号１、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターの形態の構成成分を含む薬剤の、生後１か月以上の小児において重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫を誘導するための利用。
【0053】
Ｅ１及びＥ３部位の欠失を有する組換えヒトアデノウイルス血清型５のゲノムに基づき、配列番号１、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターの形態の構成成分を含む薬剤の、生後１か月以上の小児において重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫を誘導するための利用。
【0054】
Ｅ１及びＥ３部位が欠失され、そしてＯＲＦ６－Ａｄ２６部位がＯＲＦ６－Ａｄ５により置換された組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムに基づき、配列番号１、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターの形態の構成成分１と、Ｅ１及びＥ３部位の欠失を有する組換えヒトアデノウイルス血清型５のゲノムに基づき、配列番号１、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターの形態の構成成分２とを表す組合せを含む薬剤の、生後１か月以上の小児において重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫を誘導するための利用。
【0055】
Ｅ１及びＥ３部位の欠失を有する組換えサルアデノウイルス血清型２５のゲノムに基づき、配列番号４、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターの形態の構成成分を含む薬剤の、生後１か月以上の小児において重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫を誘導するための利用。
【0056】
Ｅ１及びＥ３部位が欠失され、そしてＯＲＦ６－Ａｄ２６部位がＯＲＦ６－Ａｄ５により置換された組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムに基づき、配列番号１、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターの形態の構成成分１と、Ｅ１及びＥ３部位の欠失を有する組換えサルアデノウイルス血清型２５のゲノムに基づき、配列番号４、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターの形態の構成成分２とを表す組合せを含む薬剤の、生後１か月以上の小児において重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫を誘導するための利用。
【0057】
Ｅ１及びＥ３部位の欠失を有する組換えサルアデノウイルス血清型２５のゲノムに基づき、配列番号４、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターの形態の構成成分１と、Ｅ１及びＥ３部位の欠失を有する組換えヒトアデノウイルス血清型５のゲノムに基づき、配列番号１、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターの形態の構成成分２とを表す組合せを含む薬剤の、生後１か月以上の小児において重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫を誘導するための利用。
【0058】
特定の実施形態において：
本薬剤は、呼吸器の粘膜における粘膜免疫応答を誘導する。
本薬剤は、呼吸器の粘膜における粘膜免疫応答を誘導する。
【0059】
本薬剤は、液体形態又は凍結乾燥形態で調製される。
【0060】
そこにおいて、薬剤の液体形態は、以下の緩衝液（重量％）を含む：
トリス ０．１８３１．．．０．３４３２
塩化ナトリウム ０．３３１３．．．０．６２１２
スクロース ３．７８２１．．．７．０９１５
塩化マグネシウム六水和物 ０．０１５４．．．０．０２８９
ＥＤＴＡ ０．００２９．．．０．００５４
ポリソルベート－８０ ０．０３７８．．．０．０７０９
エタノール ９５％ ０．０００４．．．０．０００７
水 残り
トリス ０．１８３１．．．０．３４３２
塩化ナトリウム ０．３３１３．．．０．６２１２
スクロース ３．７８２１．．．７．０９１５
塩化マグネシウム六水和物 ０．０１５４．．．０．０２８９
ＥＤＴＡ ０．００２９．．．０．００５４
ポリソルベート－８０ ０．０３７８．．．０．０７０９
エタノール ９５％ ０．０００４．．．０．０００７
水 残り
【0061】
そこにおいて、薬剤の減圧凍結乾燥形態は、以下の緩衝液（重量％）を含む：
トリス ０．０１８０．．．０．０３３８
塩化ナトリウム ０．１０４４．．．０．１９５７
スクロース ５．４６８８．．．１０．２５３９
塩化マグネシウム六水和物 ０．００１５．．．０．００２８
ＥＤＴＡ ０．０００３．．．０．０００５
ポリソルベート－８０ ０．００３７．．．０．００７０
水 残り
トリス ０．０１８０．．．０．０３３８
塩化ナトリウム ０．１０４４．．．０．１９５７
スクロース ５．４６８８．．．１０．２５３９
塩化マグネシウム六水和物 ０．００１５．．．０．００２８
ＥＤＴＡ ０．０００３．．．０．０００５
ポリソルベート－８０ ０．００３７．．．０．００７０
水 残り
【0062】
特定の実施形態において、薬剤の構成成分（単数及び／又は複数）は、鼻腔内及び／又は筋肉内投与を対象とする。
【0063】
特定の実施形態において、薬剤は、５＊１０９～５＊１０１０ウイルス粒子の用量での投与を対象とする。
【0064】
特定の実施形態において、薬剤の構成成分は、１週間を超える間隔での連続投与を対象とするか、又は同時投与を対象とする。
【0065】
そこにおいて、薬剤の構成成分は、個々のパッケージ内にあることが可能である。
【0066】
さらに、著者らは、－１８℃よりも低い温度における凍結形態の貯蔵、及び＋２℃～＋８℃の温度における凍結乾燥物形態の貯蔵の両方を可能にする緩衝液の変異型を開発した。
【0067】
また、有効量で生物に投与することにより、生後１か月以上の小児において重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫を誘導するための薬剤の利用を開発した。
【0068】
開発薬剤は、呼吸器の粘膜において粘膜免疫応答を誘導することが示された。
【0069】
さらに、同様に１つの構成成分からなる薬剤を１回使用することもできる。
【0070】
ワクチン再接種は、ワクチン接種に使用された薬剤に関係なく、特許請求される薬剤のいずれかを用いて実施することができる。
【0071】
本発明の実施形態は、以下の実施例によって支持される。
【実施例】
【0072】
実施例１
組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムを含む発現ベクターの取得。
研究の第１段階では、ヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムと相同の２つの部位（２つの相同性アーム）、及びアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミド構築物ｐＡｄ２６－Ｅｎｄｓの設計。１つの相同性アームは、ヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムの開始（左側逆位末端反復配列からＥ１部位まで）、及びｐＩＸタンパク質を含むウイルスゲノムの配列である。第２の相同性アームは、ＯＲＦ３ Ｅ４部位の後からゲノム末端までのヌクレオチド配列を含む。ｐＡｄ２６－Ｅｎｄｓ構築物は、CJSC「Evrogen」（Moscow）によって合成された。
組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムを含む発現ベクターの取得。
研究の第１段階では、ヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムと相同の２つの部位（２つの相同性アーム）、及びアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミド構築物ｐＡｄ２６－Ｅｎｄｓの設計。１つの相同性アームは、ヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムの開始（左側逆位末端反復配列からＥ１部位まで）、及びｐＩＸタンパク質を含むウイルスゲノムの配列である。第２の相同性アームは、ＯＲＦ３ Ｅ４部位の後からゲノム末端までのヌクレオチド配列を含む。ｐＡｄ２６－Ｅｎｄｓ構築物は、CJSC「Evrogen」（Moscow）によって合成された。
【0073】
ウイルス粒子から単離されたヒトアデノウイルス血清型２６のＤＮＡをｐＡｄ２６－Ｅｎｄｓと混合した。ｐＡｄ２６－ＥｎｄｓとウイルスＤＮＡとの間の相同組換えの結果として、Ｅ１部位が欠失されたヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムを含むｐＡｄ２６－ｄｌＥ１プラスミドが得られた。
【0074】
次に、得られたｐＡｄ２６－ｄｌＥ１プラスミドにおいて、標準的なクローニング法を用いて、ヒトアデノウイルス血清型２６がＨＥＫ２９３細胞培養物において効果的に増殖できるように、オープンリーディングフレーム６を含む配列（ＯＲＦ６－Ａｄ２６）をヒトアデノウイルス血清型５のゲノムからの類似配列で置換した。結果として、ｐＡｄ２６－ｄｌＥ１－ＯＲＦ６－Ａｄ５プラスミドが得られた。
【0075】
次に、構築プラスミドｐＡｄ２６－ｄｌＥ１－ＯＲＦ６－Ａｄ５において標準的な遺伝子操作法を使用して、アデノウイルスゲノムのＥ３部位（遺伝子ｐＶＩＩＩとＵ－エクソンの間の約３３２１ｂ．ｐ．）を欠失させて、ベクターのパッキング能力を高めた。結果として、ヒトアデノウイルス血清型５のオープンリーディングフレームＯＲＦ６を有し、且つＥ１及びＥ３部位の欠失を有するヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムに基づいた組換えベクターｐＡｄ２６－ｏｎｌｙ－ｎｕｌｌが得られた。
【0076】
さらに、著者らは、いくつかの発現カセット設計を開発した：
－ 発現カセット配列番号１は、ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルからなり；
－ 発現カセット配列番号２は、ＣＡＧプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルからなり；
－ 発現カセット配列番号３は、ＥＦ１プロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルからなる。
－ 発現カセット配列番号１は、ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルからなり；
－ 発現カセット配列番号２は、ＣＡＧプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルからなり；
－ 発現カセット配列番号３は、ＥＦ１プロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルからなる。
【0077】
プラスミド構築物ｐＡｄ２６－Ｅｎｄｓに基づき、遺伝子操作法を用いて、発現カセット配列番号１、配列番号２又は配列番号３をそれぞれ含むと共に、アデノウイルス血清型２６ゲノムの相同性アームも含む構築物ｐＡｒｍｓ－２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｒｍｓ－２６－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｒｍｓ－２６－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２を得た。その後、構築物ｐＡｒｍｓ－２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｒｍｓ－２６－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｒｍｓ－２６－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２を相同性アーム間の唯一の加水分解部位で直線化し、各プラスミドを組換えベクターｐＡｄ２６－ｏｎｌｙ－ｎｕｌｌと混合した。相同組換えの結果として、ヒトアデノウイルス血清型５のオープンリーディングフレームＯＲＦ６を有し、且つＥ１及びＥ３部位の欠失を有する組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムを含み、発現カセット配列番号１、配列番号２又は配列番号３をそれぞれ有する、ｐＡｄ２６－ｏｎｌｙ－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｄ２６－ｏｎｌｙ－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｄ２６－ｏｎｌｙ－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２プラスミドが得られた。
【0078】
第４段階では、ｐＡｄ２６－ｏｎｌｙ－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｄ２６－ｏｎｌｙ－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｄ２６－ｏｎｌｙ－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２プラスミドを特定の制限エンドヌクレアーゼで加水分解して、ベクター部分を除去した。得られたＤＮＡ調製物を使用して、ＨＥＫ２９３培養細胞をトランスフェクトした。
【0079】
したがって、Ｅ１及びＥ３部位が欠失され、そしてＯＲＦ６－Ａｄ２６領域がＯＲＦ６－Ａｄ５により置換された組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムを含み、配列番号１、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターが得られた。
【0080】
実施例２
Ｅ１及びＥ３部位が欠失され、そしてＯＲＦ６－Ａｄ２６部位がＯＲＦ６－Ａｄ５により置換された組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムに基づき、配列番号１、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた、発現ベクターの形態の薬剤の取得。
所与の研究段階では、アニオン交換及び排除クロマトグラフィ方法により、実施例１で得られた発現ベクターを精製した。準備のできた懸濁液は、薬剤の液体形態のための緩衝液中又は薬剤の凍結乾燥形態のための緩衝液中にアデノウイルス粒子を含有した。
Ｅ１及びＥ３部位が欠失され、そしてＯＲＦ６－Ａｄ２６部位がＯＲＦ６－Ａｄ５により置換された組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムに基づき、配列番号１、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた、発現ベクターの形態の薬剤の取得。
所与の研究段階では、アニオン交換及び排除クロマトグラフィ方法により、実施例１で得られた発現ベクターを精製した。準備のできた懸濁液は、薬剤の液体形態のための緩衝液中又は薬剤の凍結乾燥形態のための緩衝液中にアデノウイルス粒子を含有した。
【0081】
したがって、Ｅ１及びＥ３部位が欠失され、そしてＯＲＦ６－Ａｄ２６部位がＯＲＦ６－Ａｄ５により置換された組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムに基づいた以下の免疫生物学的薬剤が得られた：
１．Ｅ１及びＥ３部位が欠失され、そしてＯＲＦ６－Ａｄ２６部位がＯＲＦ６－Ａｄ５により置換された組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムに基づき、ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号１を含む、薬剤の液体形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２）。
２．Ｅ１及びＥ３部位が欠失され、そしてＯＲＦ６－Ａｄ２６部位がＯＲＦ６－Ａｄ５により置換された組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムに基づき、ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号１を含む、薬剤の凍結乾燥形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２）。
３．Ｅ１及びＥ３部位が欠失され、そしてＯＲＦ６－Ａｄ２６部位がＯＲＦ６－Ａｄ５により置換された組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムに基づき、ＣＡＧプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号２を含む、薬剤の液体形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（Ａｄ２６－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２）。
４．Ｅ１及びＥ３部位が欠失され、そしてＯＲＦ６－Ａｄ２６部位がＯＲＦ６－Ａｄ５により置換された組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムに基づき、ＣＡＧプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号２を含む、薬剤の凍結乾燥形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（Ａｄ２６－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２）。
５．Ｅ１及びＥ３部位が欠失され、そしてＯＲＦ６－Ａｄ２６部位がＯＲＦ６－Ａｄ５により置換された組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムに基づき、ＥＦ１プロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号３を含む、薬剤の液体形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（Ａｄ２６－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２）。
６．Ｅ１及びＥ３部位が欠失され、そしてＯＲＦ６－Ａｄ２６部位がＯＲＦ６－Ａｄ５により置換された組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムに基づき、ＥＦ１プロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号３を含む、薬剤の凍結乾燥形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（Ａｄ２６－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２）。
１．Ｅ１及びＥ３部位が欠失され、そしてＯＲＦ６－Ａｄ２６部位がＯＲＦ６－Ａｄ５により置換された組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムに基づき、ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号１を含む、薬剤の液体形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２）。
２．Ｅ１及びＥ３部位が欠失され、そしてＯＲＦ６－Ａｄ２６部位がＯＲＦ６－Ａｄ５により置換された組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムに基づき、ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号１を含む、薬剤の凍結乾燥形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２）。
３．Ｅ１及びＥ３部位が欠失され、そしてＯＲＦ６－Ａｄ２６部位がＯＲＦ６－Ａｄ５により置換された組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムに基づき、ＣＡＧプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号２を含む、薬剤の液体形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（Ａｄ２６－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２）。
４．Ｅ１及びＥ３部位が欠失され、そしてＯＲＦ６－Ａｄ２６部位がＯＲＦ６－Ａｄ５により置換された組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムに基づき、ＣＡＧプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号２を含む、薬剤の凍結乾燥形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（Ａｄ２６－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２）。
５．Ｅ１及びＥ３部位が欠失され、そしてＯＲＦ６－Ａｄ２６部位がＯＲＦ６－Ａｄ５により置換された組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムに基づき、ＥＦ１プロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号３を含む、薬剤の液体形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（Ａｄ２６－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２）。
６．Ｅ１及びＥ３部位が欠失され、そしてＯＲＦ６－Ａｄ２６部位がＯＲＦ６－Ａｄ５により置換された組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムに基づき、ＥＦ１プロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号３を含む、薬剤の凍結乾燥形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（Ａｄ２６－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２）。
【0082】
得られた免疫生物学的薬剤のそれぞれは、開発薬剤の変異型１及び変異型２の構成成分１である。
【0083】
実施例３
組換えサルアデノウイルス血清型２５のゲノムを含む発現ベクターの取得。
研究の第１段階では、サルアデノウイルス血清型２５のゲノムと相同の２つの領域（２つの相同性アーム）を含むｐＳｉｍ２５－Ｅｎｄｓプラスミド構築物の設計が開発された。１つの相同性アームは、サルアデノウイルス血清型２５のゲノムの開始（左側逆位末端反復配列からＥ１部位まで）及びＥ１部位の末端からｐＩＶａ２タンパク質までの配列である。第２の相同性アームは、右側逆位末端反復配列を含むアデノウイルスゲノムの末端の配列を含む。ｐＳｉｍ２５－Ｅｎｄｓ構築物は、CJSC「Evrogen」（Moscow）によって合成された。
組換えサルアデノウイルス血清型２５のゲノムを含む発現ベクターの取得。
研究の第１段階では、サルアデノウイルス血清型２５のゲノムと相同の２つの領域（２つの相同性アーム）を含むｐＳｉｍ２５－Ｅｎｄｓプラスミド構築物の設計が開発された。１つの相同性アームは、サルアデノウイルス血清型２５のゲノムの開始（左側逆位末端反復配列からＥ１部位まで）及びＥ１部位の末端からｐＩＶａ２タンパク質までの配列である。第２の相同性アームは、右側逆位末端反復配列を含むアデノウイルスゲノムの末端の配列を含む。ｐＳｉｍ２５－Ｅｎｄｓ構築物は、CJSC「Evrogen」（Moscow）によって合成された。
【0084】
ウイルス粒子から単離されたサルアデノウイルス血清型２５のＤＮＡをｐＳｉｍ２５－Ｅｎｄｓと混合した。ｐＳｉｍ２５－ＥｎｄｓとウイルスＤＮＡとの間の相同組換えの結果として、Ｅ１部位が欠失されたサルアデノウイルス血清型２５のゲノムを含むｐＳｉｍ２５－ｄｌＥ１プラスミドが得られた。
【0085】
次に、構築ｐＳｉｍ２５－ｄｌＥ１プラスミドにおいて標準的な遺伝子操作法を使用して、アデノウイルスゲノムのＥ３部位（遺伝子１２，５Ｋの開始から遺伝子１４，７Ｋまでの３９２１ｂ．ｐ．）を欠失させて、ベクターのパッキング能力を高めた。結果として、Ｅ１及びＥ３部位が欠失されたサルアデノウイルス血清型２５の全ゲノムをコードするｐＳｉｍ２５－ｎｕｌｌプラスミド構築物が得られた。
【0086】
さらに、著者らは、いくつかの発現カセット設計を開発した：
－ 発現カセット配列番号４は、ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルからなり；
－ 発現カセット配列番号２は、ＣＡＧプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルからなり；
－ 発現カセット配列番号３は、ＥＦ１プロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルからなる。
－ 発現カセット配列番号４は、ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルからなり；
－ 発現カセット配列番号２は、ＣＡＧプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルからなり；
－ 発現カセット配列番号３は、ＥＦ１プロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルからなる。
【0087】
次に、プラスミド構築物ｐＳｉｍ２５－Ｅｎｄｓに基づいて遺伝子操作法を用いて、発現カセット配列番号４、配列番号２又は配列番号３をそれぞれ含むと共に、サルアデノウイルス血清型２５の相同性アームも含む構築物ｐＡｒｍｓ－Ｓｉｍ２５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｒｍｓ－Ｓｉｍ２５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｒｍｓ－Ｓｉｍ２５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２を得た。その後、構築物ｐＡｒｍｓ－Ｓｉｍ２５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｒｍｓ－Ｓｉｍ２５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｒｍｓ－Ｓｉｍ２５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２を相同性アーム間の唯一の加水分解部位で直線化し、各プラスミドを組換えベクターｐＳｉｍ２５－ｎｕｌｌと混合した。相同組換えの結果として、Ｅ１及びＥ３部位が欠失されたサルアデノウイルス血清型２５の全ゲノムと、それぞれ発現カセット配列番号４、配列番号２又は配列番号３とを含む組換えプラスミドベクターｐＳｉｍ２５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＳｉｍ２５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＳｉｍ２５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２が得られた。
【0088】
第３段階では、ｐＳｉｍ２５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＳｉｍ２５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＳｉｍ２５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２プラスミドを特定の制限エンドヌクレアーゼにより加水分解して、ベクター部分を除去した。得られたＤＮＡ調製物を使用して、ＨＥＫ２９３培養細胞をトランスフェクトした。得られた材料を使用して、予備的な量の組換えアデノウイルス科を蓄積した。
【0089】
結果として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子を含む組換えヒトアデノウイルス科血清型２５が得られた：ｓｉｍＡｄ２５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２（発現カセット配列番号４を含む）、ｓｉｍＡｄ２５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２（発現カセット配列番号２を含む）、ｓｉｍＡｄ２５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２（発現カセット配列番号３を含む）。
【0090】
したがって、Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えサルアデノウイルス血清型２５のゲノムを含み、配列番号４、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターが得られた。
【0091】
実施例４
Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えサルアデノウイルス血清型２５のゲノムに基づき、配列番号４、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターの形態の薬剤の取得。
所与の研究段階では、アニオン交換及び排除クロマトグラフィ法を用いて、実施例３で得られた発現ベクターを精製した。準備のできた懸濁液は、薬剤の液体形態のための緩衝液中又は薬剤の凍結乾燥形態のための緩衝液中にアデノウイルス粒子を包含した。
Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えサルアデノウイルス血清型２５のゲノムに基づき、配列番号４、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターの形態の薬剤の取得。
所与の研究段階では、アニオン交換及び排除クロマトグラフィ法を用いて、実施例３で得られた発現ベクターを精製した。準備のできた懸濁液は、薬剤の液体形態のための緩衝液中又は薬剤の凍結乾燥形態のための緩衝液中にアデノウイルス粒子を包含した。
【0092】
したがって、Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えサルアデノウイルス血清型２５のゲノムに基づいた以下の免疫生物学的薬剤が得られた：
１．Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えサルアデノウイルス血清型２５のゲノムに基づき、ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号４を含む、薬剤の液体形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（ｓｉｍＡｄ２５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２）。
２．Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えサルアデノウイルス血清型２５のゲノムに基づき、ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号４を含む、薬剤の凍結乾燥形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２）。
３．Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えサルアデノウイルス血清型２５のゲノムに基づき、ＣＡＧプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号４を含む、薬剤の液体形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（ｓｉｍＡｄ２５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２）。
４．Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えサルアデノウイルス血清型２５のゲノムに基づき、ＣＡＧプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号２を含む、薬剤の凍結乾燥形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（ｓｉｍＡｄ２５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２）。
５．Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えサルアデノウイルス血清型２５のゲノムに基づき、ＥＦ１プロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号３を含む、薬剤の液体形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（ｓｉｍＡｄ２５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２）。
６．Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えサルアデノウイルス血清型２５のゲノムに基づき、ＥＦ１プロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号３を含む、薬剤の凍結乾燥形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（ｓｉｍＡｄ２５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２）。
１．Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えサルアデノウイルス血清型２５のゲノムに基づき、ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号４を含む、薬剤の液体形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（ｓｉｍＡｄ２５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２）。
２．Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えサルアデノウイルス血清型２５のゲノムに基づき、ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号４を含む、薬剤の凍結乾燥形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２）。
３．Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えサルアデノウイルス血清型２５のゲノムに基づき、ＣＡＧプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号４を含む、薬剤の液体形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（ｓｉｍＡｄ２５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２）。
４．Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えサルアデノウイルス血清型２５のゲノムに基づき、ＣＡＧプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号２を含む、薬剤の凍結乾燥形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（ｓｉｍＡｄ２５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２）。
５．Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えサルアデノウイルス血清型２５のゲノムに基づき、ＥＦ１プロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号３を含む、薬剤の液体形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（ｓｉｍＡｄ２５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２）。
６．Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えサルアデノウイルス血清型２５のゲノムに基づき、ＥＦ１プロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号３を含む、薬剤の凍結乾燥形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（ｓｉｍＡｄ２５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２）。
【0093】
得られた免疫生物学的薬剤のそれぞれは、開発薬剤の変異型１の構成成分２及び開発薬剤の変異型３の構成成分１である。
【0094】
実施例５
組換えヒトアデノウイルス血清型５のゲノムを含む発現ベクターの取得。
研究の第１段階では、ヒトアデノウイルス血清型５のゲノムと相同の２つの領域（２つの相同性アーム）を含むｐＡｄ５－Ｅｎｄｓプラスミド構築物の設計が開発された。１つの相同性アームは、ヒトアデノウイルス血清型５のゲノムの開始（左側逆位末端反復配列からＥ１部位まで）及びｐＩＸタンパク質を含むウイルスゲノムの配列である。第２の相同性アームは、ＯＲＦ３ Ｅ４部位の後からゲノム末端までのヌクレオチド配列を含む。ｐＡｄ５－Ｅｎｄｓ構築物は、CJSC「Evrogen」（Moscow）によって合成された。
組換えヒトアデノウイルス血清型５のゲノムを含む発現ベクターの取得。
研究の第１段階では、ヒトアデノウイルス血清型５のゲノムと相同の２つの領域（２つの相同性アーム）を含むｐＡｄ５－Ｅｎｄｓプラスミド構築物の設計が開発された。１つの相同性アームは、ヒトアデノウイルス血清型５のゲノムの開始（左側逆位末端反復配列からＥ１部位まで）及びｐＩＸタンパク質を含むウイルスゲノムの配列である。第２の相同性アームは、ＯＲＦ３ Ｅ４部位の後からゲノム末端までのヌクレオチド配列を含む。ｐＡｄ５－Ｅｎｄｓ構築物は、CJSC「Evrogen」（Moscow）によって合成された。
【0095】
ウイルス粒子から単離されたヒトアデノウイルス血清型５のＤＮＡをｐＡｄ５－Ｅｎｄｓと混合した。ｐＡｄ５－ＥｎｄｓとウイルスＤＮＡとの間の相同組換えの結果として、Ｅ１部位が欠失されたヒトアデノウイルス血清型５のゲノムを含むｐＡｄ５－ｄｌＥ１プラスミドが得られた。
【0096】
次に、構築ｐＡｄ５－ｄｌＥ１プラスミドにおいて標準的な遺伝子操作法を使用して、アデノウイルスゲノムのＥ３部位（遺伝子１２，５Ｋの末端から配列Ｕ－エクソンの開始までの２６８５ｂ．ｐ．）を欠失させて、ベクターのパッキング能力を高めた。結果として、ゲノムのＥ１及びＥ３部位の欠失を有するヒトアデノウイルス血清型５のゲノムに基づいた組換えプラスミドベクターｐＡｄ５－ｔｏｏ－ｎｕｌｌが得られた。さらに、著者らは、いくつかの発現カセット設計を開発した：
－ 発現カセット配列番号１は、ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルからなり；
－ 発現カセット配列番号２は、ＣＡＧプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルからなり；
－ 発現カセット配列番号３は、ＥＦ１プロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルからなる。
－ 発現カセット配列番号１は、ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルからなり；
－ 発現カセット配列番号２は、ＣＡＧプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルからなり；
－ 発現カセット配列番号３は、ＥＦ１プロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルからなる。
【0097】
次に、プラスミド構築物ｐＡｄ５－Ｅｎｄｓに基づき、遺伝子操作法を用いて、発現カセット配列番号１、配列番号２又は配列番号３をそれぞれ含むと共に、アデノウイルス血清型５のゲノムの相同性アームも含む構築物ｐＡｒｍｓ－Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｒｍｓ－Ａｄ５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｒｍｓ－Ａｄ５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２を得た。
【0098】
その後、構築物ｐＡｒｍｓ－Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｒｍｓ－Ａｄ５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｒｍｓ－Ａｄ５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２を相同性アーム間の唯一の加水分解部位で直線化し、各プラスミドを組換えベクターｐＡｄ５－ｔｏｏ－ｎｕｌｌと混合した。相同組換えの結果として、Ｅ１及びＥ３部位の欠失を有する組換えヒトアデノウイルス血清型５のゲノムを含み、発現カセット配列番号１、配列番号２又は配列番号３をそれぞれ有するｐＡｄ５－ｔｏｏ－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｄ５－ｔｏｏ－ＧＡＣ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｄ５－ｔｏｏ－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２プラスミドが得られた。
【0099】
第４段階では、ｐＡｄ５－ｔｏｏ－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｄ５－ｔｏｏ－ＧＡＣ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｄ５－ｔｏｏ－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２プラスミドを特定の制限エンドヌクレアーゼで加水分解して、ベクター部分を除去した。得られたＤＮＡ調製物を使用して、ＨＥＫ２９３培養細胞をトランスフェクトした。得られた材料を使用して、予備的な量の組換えアデノウイルスを蓄積した。
【0100】
結果として、Ｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子を含む組換えヒトアデノウイルス科血清型５が得られた：Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２（発現カセット配列番号１を含む）、Ａｄ５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２（発現カセット配列番号２を含む）、Ａｄ５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２（発現カセット配列番号３を含む）。
【0101】
したがって、Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えヒトアデノウイルス血清型５のゲノムを含み、配列番号１、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターが得られた。
【0102】
実施例６
Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えヒトアデノウイルス血清型５のゲノムに基づき、配列番号１、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターの形態の薬剤の取得。
所与の研究段階では、アニオン交換及び排除クロマトグラフィ法を用いて、実施例５で得られた発現ベクターを精製した。準備のできた懸濁液は、薬剤の液体形態のための緩衝液中又は薬剤の凍結乾燥形態のための緩衝液中にアデノウイルス粒子を包含した。
Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えヒトアデノウイルス血清型５のゲノムに基づき、配列番号１、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターの形態の薬剤の取得。
所与の研究段階では、アニオン交換及び排除クロマトグラフィ法を用いて、実施例５で得られた発現ベクターを精製した。準備のできた懸濁液は、薬剤の液体形態のための緩衝液中又は薬剤の凍結乾燥形態のための緩衝液中にアデノウイルス粒子を包含した。
【0103】
したがって、Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えヒトアデノウイルス血清型５のゲノムに基づいた以下の免疫生物学的薬剤が得られた：
１．Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えヒトアデノウイルス血清型５のゲノムに基づき、ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号１を含む、薬剤の液体形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２）。
２．Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えヒトアデノウイルス血清型５のゲノムに基づき、ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号１を含む、薬剤の凍結乾燥形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２）。
３．Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えヒトアデノウイルス血清型５のゲノムに基づき、ＣＡＧプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号２を含む、薬剤の液体形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（Ａｄ５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２）。
４．Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えヒトアデノウイルス血清型５のゲノムに基づき、ＣＡＧプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号２を含む、薬剤の凍結乾燥形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（Ａｄ５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２）。
５．Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えヒトアデノウイルス血清型５のゲノムに基づき、ＥＦ１プロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号３を含む、薬剤の液体形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（Ａｄ５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２）。
６．Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えヒトアデノウイルス血清型５のゲノムに基づき、ＥＦ１プロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号３を含む、薬剤の凍結乾燥形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（Ａｄ５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２）。
１．Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えヒトアデノウイルス血清型５のゲノムに基づき、ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号１を含む、薬剤の液体形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２）。
２．Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えヒトアデノウイルス血清型５のゲノムに基づき、ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号１を含む、薬剤の凍結乾燥形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２）。
３．Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えヒトアデノウイルス血清型５のゲノムに基づき、ＣＡＧプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号２を含む、薬剤の液体形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（Ａｄ５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２）。
４．Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えヒトアデノウイルス血清型５のゲノムに基づき、ＣＡＧプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号２を含む、薬剤の凍結乾燥形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（Ａｄ５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２）。
５．Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えヒトアデノウイルス血清型５のゲノムに基づき、ＥＦ１プロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号３を含む、薬剤の液体形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（Ａｄ５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２）。
６．Ｅ１及びＥ３部位が欠失された組換えヒトアデノウイルス血清型５のゲノムに基づき、ＥＦ１プロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセット配列番号３を含む、薬剤の凍結乾燥形態のための緩衝液中の免疫生物学的薬剤（Ａｄ５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２）。
【0104】
得られた免疫生物学的薬剤のそれぞれは、開発薬剤の変異型１及び変異型３の構成成分２である。
【0105】
実施例７
緩衝液の取得。
開発薬剤の各構成成分は、緩衝液中の発現カセットを含む組換えアデノウイルスに基づいた薬剤である。
緩衝液の取得。
開発薬剤の各構成成分は、緩衝液中の発現カセットを含む組換えアデノウイルスに基づいた薬剤である。
【0106】
本発明の著者らは、組換えアデノウイルス粒子の安定性を保証する緩衝液組成物を開発した。所与の溶液は、以下を含む：
１．溶液のｐＨを維持するために必要とされるトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）。
２．必要とされるイオン強度及びモル浸透圧濃度を得るために添加される塩化ナトリウム。
３．凍結保護剤として使用されるスクロース。
４．二価カチオン源として必要とされる塩化マグネシウム六水和物。
５．フリーラジカル酸化の阻害剤として使用されるEDTA。
６．界面活性剤として使用されるポリソルベート－８０。
７．フリーラジカル酸化の阻害剤として使用されるエタノール９５％。
８．溶媒として使用される水。
１．溶液のｐＨを維持するために必要とされるトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）。
２．必要とされるイオン強度及びモル浸透圧濃度を得るために添加される塩化ナトリウム。
３．凍結保護剤として使用されるスクロース。
４．二価カチオン源として必要とされる塩化マグネシウム六水和物。
５．フリーラジカル酸化の阻害剤として使用されるEDTA。
６．界面活性剤として使用されるポリソルベート－８０。
７．フリーラジカル酸化の阻害剤として使用されるエタノール９５％。
８．溶媒として使用される水。
【0107】
本発明の著者らは、薬剤の液体形態のため及び医薬品の凍結乾燥形態のための、２つの緩衝液変異型を開発した。
【0108】
薬剤の液体形態のための緩衝液中に含まれる物質の濃度を決定するために、実験群のいくつかの変異型を得た（表１）。得られた緩衝液のそれぞれに薬剤の構成成分の１つを添加した：
１．ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセットを有する組換えヒトアデノウイルス血清型２６に基づく免疫生物学的薬剤、１＊１０１０ウイルス粒子。
２．ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセットを有する組換えヒトアデノウイルス血清型５に基づく免疫生物学的薬剤、１＊１０１０ウイルス粒子。
３．ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセットを有する組換えサルアデノウイルス血清型２５に基づく免疫生物学的薬剤、１＊１０１０ウイルス粒子。
１．ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセットを有する組換えヒトアデノウイルス血清型２６に基づく免疫生物学的薬剤、１＊１０１０ウイルス粒子。
２．ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセットを有する組換えヒトアデノウイルス血清型５に基づく免疫生物学的薬剤、１＊１０１０ウイルス粒子。
３．ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセットを有する組換えサルアデノウイルス血清型２５に基づく免疫生物学的薬剤、１＊１０１０ウイルス粒子。
【0109】
したがって、薬剤中に含まれるアデノウイルス科の血清型のそれぞれの安定性を試験した。得られた薬剤を－１８℃及び－７０℃の温度で３か月間貯蔵してから、解凍し、組換えアデノウイルス科の力価の変化を分析した。
【0110】
【表1】
【0111】
実行された実験の結果は、組換えアデノウイルス科の力価が、－１８℃及び－７０℃の温度で３か月間、薬剤の液体形態のための緩衝液中で貯蔵した後に変化しないことを実証した。
【0112】
したがって、薬剤の液体形態のために開発された緩衝液は、以下の活性成分の範囲（重量％）において開発薬剤の全ての構成成分の安定性を保証する：
トリス：０．１８３１重量％．．．０．３４３２重量％；
塩化ナトリウム：０．３３１３重量％．．．０．６２１２重量％；
スクロース：３．７８２１重量％．．．７．０９１５重量％；
塩化マグネシウム六水和物：０．０１５４重量％．．．０．０２８９重量％；
ＥＤＴＡ：０．００２９重量％．．．０．００５４重量％；
ポリソルベート－８０：０．０３７８重量％．．．０．０７０９重量％；
エタノール９５％：０．０００４重量％．．．０．０００７重量％；
溶媒：残り
トリス：０．１８３１重量％．．．０．３４３２重量％；
塩化ナトリウム：０．３３１３重量％．．．０．６２１２重量％；
スクロース：３．７８２１重量％．．．７．０９１５重量％；
塩化マグネシウム六水和物：０．０１５４重量％．．．０．０２８９重量％；
ＥＤＴＡ：０．００２９重量％．．．０．００５４重量％；
ポリソルベート－８０：０．０３７８重量％．．．０．０７０９重量％；
エタノール９５％：０．０００４重量％．．．０．０００７重量％；
溶媒：残り
【0113】
薬剤の凍結乾燥形態のための緩衝液中に含まれる物質の濃度を決定するために、実験群のいくつかの変異型を得た（表２）。得られた緩衝液のそれぞれに薬剤の構成成分の１つを添加した：
１．ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセットを有する組換えヒトアデノウイルス血清型２６に基づく免疫生物学的薬剤、１＊１０１０ウイルス粒子。
２．ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセットを有する組換えヒトアデノウイルス血清型５に基づく免疫生物学的薬剤、１＊１０１０ウイルス粒子。
３．ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセットを有する組換えサルアデノウイルス血清型２５に基づく免疫生物学的薬剤、１＊１０１０ウイルス粒子。
１．ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセットを有する組換えヒトアデノウイルス血清型２６に基づく免疫生物学的薬剤、１＊１０１０ウイルス粒子。
２．ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセットを有する組換えヒトアデノウイルス血清型５に基づく免疫生物学的薬剤、１＊１０１０ウイルス粒子。
３．ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質の遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む発現カセットを有する組換えサルアデノウイルス血清型２５に基づく免疫生物学的薬剤、１＊１０１０ウイルス粒子。
【0114】
したがって、薬剤中に含まれるアデノウイルス科の血清型のそれぞれの安定性を試験した。得られた薬剤を＋２及び＋８℃の温度で３か月間貯蔵してから、解凍し、組換えアデノウイルス科の力価の変化を分析した。
【0115】
【表2】
【0116】
実行された実験の結果は、組換えアデノウイルス科の力価が、＋２℃及び＋８℃の温度で３か月間、薬剤の凍結乾燥形態のための緩衝液中で貯蔵した後に変化しないことを実証した。
【0117】
したがって、薬剤の凍結乾燥形態のために開発された緩衝液は、以下の活性成分の範囲において開発薬剤の全ての構成成分の安定性を保証する：
トリス：０．０１８０重量％．．．０．０３３８重量％；
塩化ナトリウム：０．１０４４重量％．．．０．１９５７重量％；
スクロース：５．４６８８重量％．．．１０．２５３９重量％；
塩化マグネシウム六水和物：０．００１５重量％．．．０．００２８重量％；
ＥＤＴＡ：０．０００３重量％．．．０．０００５重量％；
ポリソルベート－８０：０．００３７重量％．．．０．００７０重量％；
溶媒：残り
トリス：０．０１８０重量％．．．０．０３３８重量％；
塩化ナトリウム：０．１０４４重量％．．．０．１９５７重量％；
スクロース：５．４６８８重量％．．．１０．２５３９重量％；
塩化マグネシウム六水和物：０．００１５重量％．．．０．００２８重量％；
ＥＤＴＡ：０．０００３重量％．．．０．０００５重量％；
ポリソルベート－８０：０．００３７重量％．．．０．００７０重量％；
溶媒：残り
【0118】
実施例８
筋肉内投与の際に粘膜免疫応答を誘導する開発薬剤の能力の評価。
この研究のために、ＢＡＬＢ／ｃ系統の若いマウス（２１～２８日齢）を使用した。動物を１０個の群に分配し、以下の薬剤を投与した：
１）Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、筋肉内（ｉ／ｍ）、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ；２１日後に、Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、筋肉内（ｉ／ｍ）、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ。
２）Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｍ、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ；２１日後に、Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｍ、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ。
３）ｓｉｍＡｄ２５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｍ、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ；２１日後に、ｓｉｍＡｄ２５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｍ、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ
４）Ａｄ２６－ｎｕｌｌ、ｉ／ｍ、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ；２１日後に、Ａｄ２６－ｎｕｌｌ、ｉ／ｍ、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ
５）Ａｄ５－ｎｕｌｌ、ｉ／ｍ、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ；２１日後に、Ａｄ５－ｎｕｌｌ、ｉ／ｍ、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ
６）ｓｉｍＡｄ２５－ｎｕｌｌ、ｉ／ｍ、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ；２１日後に、ｓｉｍＡｄ２５－ｎｕｌｌ、ｉ／ｍ、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ
７）Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、鼻腔内（ｉ／ｎ）、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ；２１日後に、Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２ ｉ／ｎ、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ。
８）Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｎ、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ；２１日後に、Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｎ、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ。
９）Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｍ、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ；２１日後に、Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２ ｉ／ｎ、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ。
１０）Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｍ、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ；２１日後に、Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｎ、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ。
１１）緩衝液
筋肉内投与の際に粘膜免疫応答を誘導する開発薬剤の能力の評価。
この研究のために、ＢＡＬＢ／ｃ系統の若いマウス（２１～２８日齢）を使用した。動物を１０個の群に分配し、以下の薬剤を投与した：
１）Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、筋肉内（ｉ／ｍ）、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ；２１日後に、Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、筋肉内（ｉ／ｍ）、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ。
２）Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｍ、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ；２１日後に、Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｍ、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ。
３）ｓｉｍＡｄ２５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｍ、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ；２１日後に、ｓｉｍＡｄ２５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｍ、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ
４）Ａｄ２６－ｎｕｌｌ、ｉ／ｍ、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ；２１日後に、Ａｄ２６－ｎｕｌｌ、ｉ／ｍ、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ
５）Ａｄ５－ｎｕｌｌ、ｉ／ｍ、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ；２１日後に、Ａｄ５－ｎｕｌｌ、ｉ／ｍ、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ
６）ｓｉｍＡｄ２５－ｎｕｌｌ、ｉ／ｍ、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ；２１日後に、ｓｉｍＡｄ２５－ｎｕｌｌ、ｉ／ｍ、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ
７）Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、鼻腔内（ｉ／ｎ）、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ；２１日後に、Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２ ｉ／ｎ、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ。
８）Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｎ、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ；２１日後に、Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｎ、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ。
９）Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｍ、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ；２１日後に、Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２ ｉ／ｎ、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ。
１０）Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｍ、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ；２１日後に、Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｎ、用量５ｘ１０９ｖ．ｐ．／１００ｕｌ。
１１）緩衝液
【0119】
最後の免疫化から１４日後に、実験動物の気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）において、ＥＬＩＳＡ法によりＩｇＧ及びＩｇＡ抗体の力価を決定した。
【0120】
そうするために：
１）ＥＬＩＳＡのための９６ウェルプレートのウェルに抗原（組換えＲＢＤ）を＋４℃で１６時間吸着させた。
２）非特異的結合を除去するために、ＴＰＢＳ中５％の乳を１００ｕｌ／ウェルでプレートウェルに添加した。それを３７℃の振とう機において１時間インキュベートした。
３）ＢＡＬサンプルを２５倍に希釈してから、２倍希釈法により希釈した。
４）５０ｕｌの各希釈血清サンプルをプレートウェルに添加した。
５）次に、サンプルを３７℃で１時間インキュベートした。
６）インキュベーションの後に、ウェルをリン酸緩衝液で３回洗浄した。
７）西洋わさびペルオキシダーゼと結合されたマウス免疫グロブリンに対する二次抗体を添加した。
８）次に、サンプルを３７℃で１時間インキュベートした。
９）インキュベーションの後に、ウェルをリン酸緩衝液で３回洗浄した。
１０）次に、西洋わさびペルオキシダーゼの基質であり、反応の結果として着色化合物に変化するテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加した。硫酸の添加により１５分後に反応を停止させた。次に、分光光度計を用いて、各ウェルにおいて４５０ｎｍの波長で溶液の光学濃度（ＯＤ）を測定した。
１）ＥＬＩＳＡのための９６ウェルプレートのウェルに抗原（組換えＲＢＤ）を＋４℃で１６時間吸着させた。
２）非特異的結合を除去するために、ＴＰＢＳ中５％の乳を１００ｕｌ／ウェルでプレートウェルに添加した。それを３７℃の振とう機において１時間インキュベートした。
３）ＢＡＬサンプルを２５倍に希釈してから、２倍希釈法により希釈した。
４）５０ｕｌの各希釈血清サンプルをプレートウェルに添加した。
５）次に、サンプルを３７℃で１時間インキュベートした。
６）インキュベーションの後に、ウェルをリン酸緩衝液で３回洗浄した。
７）西洋わさびペルオキシダーゼと結合されたマウス免疫グロブリンに対する二次抗体を添加した。
８）次に、サンプルを３７℃で１時間インキュベートした。
９）インキュベーションの後に、ウェルをリン酸緩衝液で３回洗浄した。
１０）次に、西洋わさびペルオキシダーゼの基質であり、反応の結果として着色化合物に変化するテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加した。硫酸の添加により１５分後に反応を停止させた。次に、分光光度計を用いて、各ウェルにおいて４５０ｎｍの波長で溶液の光学濃度（ＯＤ）を測定した。
【0121】
抗体の力価は、溶液の光学濃度が負の対照群よりも確実に高い最後の希釈度として決定した。得られた結果（幾何平均値）は、表３に示される。
【0122】
【表3】
【0123】
得られた結果によると、開発薬剤の全ての変異型は、呼吸器の粘膜表面においてＩｇＧ抗体の力価の上昇を引き起こす。ＩｇＡ抗体の発現は、薬剤の投与方法に依存する。動物が筋肉内、そして次に鼻腔内で順次免疫化されると、ＩｇＡ抗体の最大力価が誘導される。
【0124】
したがって、実行された研究の結果として、小児の呼吸器の粘膜においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対して粘膜免疫応答を誘導することができる免疫生物学的薬剤と、粘膜免疫応答の増強をもたらすこの薬剤の投与パターンとが開発された。
【0125】
実施例９
種々の齢の哺乳類において免疫応答を誘導する開発薬剤の能力の評価。
この研究のために、種々の齢のＢＡＬＢ／ｃの若いマウスを使用した。動物を５つの群に分配した：
１）１５～１８日齢のマウス
２）２８～３５日齢のマウス
３）５０～６０日齢のマウス
種々の齢の哺乳類において免疫応答を誘導する開発薬剤の能力の評価。
この研究のために、種々の齢のＢＡＬＢ／ｃの若いマウスを使用した。動物を５つの群に分配した：
１）１５～１８日齢のマウス
２）２８～３５日齢のマウス
３）５０～６０日齢のマウス
【0126】
ヒトアデノウイルス血清型５に基づいて開発された免疫生物学的薬剤（Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２）により、１０８ｖ．ｐ．／５０ｕｌの用量で全ての動物を１回免疫化した。免疫化後２１日目に、動物の血清中のＩｇＧ抗体の力価を測定した。そうするために：
１）ＥＬＩＳＡのための９６ウェルプレートのウェルに抗原（組換えＲＢＤ）を＋４℃で１６時間吸着させた。
２）非特異的結合を除去するために、ＴＰＢＳ中５％の乳を１００ｕｌ／ウェルでプレートウェルに添加した。それを３７℃の振とう機において１時間インキュベートした。
３）血清サンプルを５０倍に希釈してから、２倍希釈法により希釈した。
４）５０ｕｌの各希釈血清サンプルをプレートウェルに添加した。
５）次に、サンプルを３７℃で１時間インキュベートした。
６）インキュベーションの後に、ウェルをリン酸緩衝液で３回洗浄した。
７）西洋わさびペルオキシダーゼと結合されたマウス免疫グロブリンに対する二次抗体を添加した。
８）次に、サンプルを３７℃で１時間インキュベートした。
９）インキュベーションの後に、ウェルをリン酸緩衝液で３回洗浄した。
１０）次に、西洋わさびペルオキシダーゼの基質であり、反応の結果として着色化合物に変化するテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加した。硫酸の添加により１５分後に反応を停止させた。次に、分光光度計を用いて、各ウェルにおいて４５０ｎｍの波長で溶液の光学濃度（ＯＤ）を測定した。
１）ＥＬＩＳＡのための９６ウェルプレートのウェルに抗原（組換えＲＢＤ）を＋４℃で１６時間吸着させた。
２）非特異的結合を除去するために、ＴＰＢＳ中５％の乳を１００ｕｌ／ウェルでプレートウェルに添加した。それを３７℃の振とう機において１時間インキュベートした。
３）血清サンプルを５０倍に希釈してから、２倍希釈法により希釈した。
４）５０ｕｌの各希釈血清サンプルをプレートウェルに添加した。
５）次に、サンプルを３７℃で１時間インキュベートした。
６）インキュベーションの後に、ウェルをリン酸緩衝液で３回洗浄した。
７）西洋わさびペルオキシダーゼと結合されたマウス免疫グロブリンに対する二次抗体を添加した。
８）次に、サンプルを３７℃で１時間インキュベートした。
９）インキュベーションの後に、ウェルをリン酸緩衝液で３回洗浄した。
１０）次に、西洋わさびペルオキシダーゼの基質であり、反応の結果として着色化合物に変化するテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加した。硫酸の添加により１５分後に反応を停止させた。次に、分光光度計を用いて、各ウェルにおいて４５０ｎｍの波長で溶液の光学濃度（ＯＤ）を測定した。
【0127】
抗体の力価は、溶液の光学濃度が負の対照群よりも確実に高い最後の希釈度として決定した。得られた結果（幾何平均値）は、表４に示される。
【0128】
【表4】
【0129】
したがって、提供されたデータから示されるように、開発された免疫生物学的薬剤は、種々の齢の成熟動物及び若い動物の両方において液性免疫応答の発生を誘導する。これにより、薬剤が種々の年齢区分の人々における利用に効果的であり得ると提言することが可能になる。
【0130】
実施例１０
単回ワクチン接種後の細胞性免疫応答の評価のための、若いマウスにおける開発薬剤の免疫原性の研究。
免疫原性研究のために若いＢＡＬＢ／ｃマウス（２１～２８日齢）を使用した。動物を５つの群に分配し、以下の薬剤を１回投与した：
１．Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、筋肉内（ｉ／ｍ）、用量１０１０ｖｐ／１００ｕｌ；
２．Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、筋肉内（ｉ／ｍ）、用量１０１０ｖｐ／１００ｕｌ
単回ワクチン接種後の細胞性免疫応答の評価のための、若いマウスにおける開発薬剤の免疫原性の研究。
免疫原性研究のために若いＢＡＬＢ／ｃマウス（２１～２８日齢）を使用した。動物を５つの群に分配し、以下の薬剤を１回投与した：
１．Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、筋肉内（ｉ／ｍ）、用量１０１０ｖｐ／１００ｕｌ；
２．Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、筋肉内（ｉ／ｍ）、用量１０１０ｖｐ／１００ｕｌ
【0131】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の組換えＳタンパク質による細胞の反復再刺激後に、インビトロで培養中のマウス脾臓から単離された増殖性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋リンパ球の量を評価することにより、細胞性免疫レベルを決定した。免疫化の前及び１４日後に動物の脾臓を回収し、ficoll溶液密度勾配（１．０９ｇ／ｍＬ；PanEco）における遠心分離により、そこから単核細胞を単離した。次に、単離した細胞を蛍光染料ＣＦＳＥ（Invivogen、ＵＳＡ）で着色し、９６ウェルプレートのウェルに播種した（２＊１０５細胞／ウェル）。コロナウイルスＳタンパク質を培地に添加する（最終タンパク質濃度１μｇ／ｍｌ）ことにより、インビトロ条件下でリンパ球の反復刺激を実行した。抗原が添加されないインタクト細胞を負の対照として使用した。
【0132】
増殖性細胞の％を決定するために、これらを、Ｔリンパ球ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８のマーカー分子に対する抗体（BDBioscienses、ＵＳＡ）で染色した。フローサイトフルオロメーターBD FACS AriaIII（BD Biosciences、ＵＳＡ）を使用して、細胞混合物中の増殖性（より少量の細胞着色剤ＣＦＳＥを有する）ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球を決定した。コロナウイルスＳタンパク質抗原で再刺激された細胞の分析中に得られた結果から、インタクト細胞の分析中に得られた結果を差し引くことにより、各サンプルにおいて得られた増殖性細胞の百分率を決定した。
【0133】
研究の１日目（免疫化前）及び１４日目の、増殖性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球の百分率の決定の結果（統計処理が行われる）は、図１（Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２）及び図２（Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２）に示される。
【0134】
得られたデータは、免疫化後１４日目の抗原再刺激の後、開発薬剤によるマウスの単回免疫化により、増殖性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球の百分率の確実な増大が可能になることを示した。
【0135】
したがって、開発された免疫生物学的薬剤によるマウスの単回免疫化は、高レベルのワクチン接種後細胞性免疫の形成を引き起こすことができるという結論を下すことができる。
【0136】
実施例１１
種々の投与方法による若いマウスにおける開発薬剤の免疫原性の研究。
免疫原性研究のために若いＢＡＬＢ／ｃマウス（２１～２８日齢）を使用した。動物を５つの群に分配し、以下の薬剤を投与した：
３．Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、筋肉内（ｉ／ｍ）、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
４．Ａｄ２６－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２、筋肉内、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
５．Ａｄ２６－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２、筋肉内、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
６．Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、筋肉内、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
７．Ａｄ５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２、筋肉内、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
８．Ａｄ５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２、筋肉内、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
９．ｓｉｍＡｄ２５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、筋肉内、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
１０．ｓｉｍＡｄ２５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２、筋肉内、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
１１．ｓｉｍＡｄ２５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２、筋肉内、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
１２．Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、鼻腔内（ｉ／ｎ）、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
１３．Ａｄ２６－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２、鼻腔内（ｉ／ｎ）、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
１４．Ａｄ２６－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２、鼻腔内（ｉ／ｎ）、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
１５．Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、鼻腔内（ｉ／ｎ）、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
１６．Ａｄ５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２、鼻腔内（ｉ／ｎ）、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
１７．Ａｄ５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２、鼻腔内（ｉ／ｎ）、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
１８．ｓｉｍＡｄ２５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、鼻腔内（ｉ／ｎ）、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
１９．ｓｉｍＡｄ２５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２、鼻腔内（ｉ／ｎ）、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
２０．ｓｉｍＡｄ２５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２、鼻腔内（ｉ／ｎ）、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
種々の投与方法による若いマウスにおける開発薬剤の免疫原性の研究。
免疫原性研究のために若いＢＡＬＢ／ｃマウス（２１～２８日齢）を使用した。動物を５つの群に分配し、以下の薬剤を投与した：
３．Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、筋肉内（ｉ／ｍ）、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
４．Ａｄ２６－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２、筋肉内、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
５．Ａｄ２６－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２、筋肉内、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
６．Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、筋肉内、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
７．Ａｄ５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２、筋肉内、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
８．Ａｄ５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２、筋肉内、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
９．ｓｉｍＡｄ２５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、筋肉内、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
１０．ｓｉｍＡｄ２５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２、筋肉内、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
１１．ｓｉｍＡｄ２５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２、筋肉内、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
１２．Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、鼻腔内（ｉ／ｎ）、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
１３．Ａｄ２６－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２、鼻腔内（ｉ／ｎ）、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
１４．Ａｄ２６－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２、鼻腔内（ｉ／ｎ）、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
１５．Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、鼻腔内（ｉ／ｎ）、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
１６．Ａｄ５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２、鼻腔内（ｉ／ｎ）、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
１７．Ａｄ５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２、鼻腔内（ｉ／ｎ）、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
１８．ｓｉｍＡｄ２５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、鼻腔内（ｉ／ｎ）、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
１９．ｓｉｍＡｄ２５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２、鼻腔内（ｉ／ｎ）、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
２０．ｓｉｍＡｄ２５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２、鼻腔内（ｉ／ｎ）、用量１０９ｖｐ／１００ｕｌ
【0137】
２１日後に動物の血液を採取し、血清を単離し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのＳタンパク質に対するＩｇＧ抗体の力価をＥＬＩＳＡ法により決定した。そうするために：
１．ＥＬＩＳＡのための９６ウェルプレートのウェルに抗原を＋４℃で１６時間吸着させた。
２．非特異的結合を除去するために、ＴＰＢＳ中５％の乳を１００ｕｌ／ウェルでプレートウェルに添加した。それを３７℃の振とう機において１時間インキュベートした。
３．免疫化マウスの血清サンプルを２倍希釈法により希釈した。全体として、各サンプルの１２個の希釈物を調製した。
４．５０ｕｌの各希釈血清サンプルをプレートウェルに添加した。
５．次に、サンプルを３７℃で１時間インキュベートした。
６．インキュベーションの後に、ウェルをリン酸緩衝液で３回洗浄した。
７．西洋わさびペルオキシダーゼと結合されたマウス免疫グロブリンに対する二次抗体を添加した。
８．次に、サンプルを３７℃で１時間インキュベートした。
９．インキュベーションの後に、ウェルをリン酸緩衝液で３回洗浄した。
１０．次に、西洋わさびペルオキシダーゼの基質であり、反応の結果として着色化合物に変化するテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加した。硫酸の添加により１５分後に反応を停止させた。次に、分光光度計を用いて、各ウェルにおいて４５０ｎｍの波長で溶液の光学濃度（ＯＤ）を測定した。
１．ＥＬＩＳＡのための９６ウェルプレートのウェルに抗原を＋４℃で１６時間吸着させた。
２．非特異的結合を除去するために、ＴＰＢＳ中５％の乳を１００ｕｌ／ウェルでプレートウェルに添加した。それを３７℃の振とう機において１時間インキュベートした。
３．免疫化マウスの血清サンプルを２倍希釈法により希釈した。全体として、各サンプルの１２個の希釈物を調製した。
４．５０ｕｌの各希釈血清サンプルをプレートウェルに添加した。
５．次に、サンプルを３７℃で１時間インキュベートした。
６．インキュベーションの後に、ウェルをリン酸緩衝液で３回洗浄した。
７．西洋わさびペルオキシダーゼと結合されたマウス免疫グロブリンに対する二次抗体を添加した。
８．次に、サンプルを３７℃で１時間インキュベートした。
９．インキュベーションの後に、ウェルをリン酸緩衝液で３回洗浄した。
１０．次に、西洋わさびペルオキシダーゼの基質であり、反応の結果として着色化合物に変化するテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加した。硫酸の添加により１５分後に反応を停止させた。次に、分光光度計を用いて、各ウェルにおいて４５０ｎｍの波長で溶液の光学濃度（ＯＤ）を測定した。
【0138】
ＩｇＧ抗体の力価は、溶液の光学濃度が負の対照群よりも確実に高い最後の希釈度として決定した。得られた結果（幾何平均値）は、表５に示される。
【0139】
【表5】
【0140】
得られたデータに基づいて、開発薬剤により単回免疫化は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２糖タンパク質に対する液性免疫応答を誘導する。
【0141】
実施例１２
種々の用量で若い動物に投与したときの開発薬剤の免疫原性の研究。
所与の研究の目的は、開発薬剤を種々の用量で若い動物に投与して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質に対する液性免疫応答を評価することであった。
種々の用量で若い動物に投与したときの開発薬剤の免疫原性の研究。
所与の研究の目的は、開発薬剤を種々の用量で若い動物に投与して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質に対する液性免疫応答を評価することであった。
【0142】
開発薬剤の免疫原性を研究するために、Ｃ５７／Ｂｌ６系統の若いマウス（３～４週齢）を使用した。動物を５つの群に分配し、以下の薬剤を２８日の間隔で２回筋肉内に投与した。
１）Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、５＊１０９ｖｐ／１００ｕｌ、
２）Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、１０１０ｖｐ／１００ｕｌ、
３）Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、５＊１０１０ｖｐ／１００ｕｌ。
１）Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、５＊１０９ｖｐ／１００ｕｌ、
２）Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、１０１０ｖｐ／１００ｕｌ、
３）Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、５＊１０１０ｖｐ／１００ｕｌ。
【0143】
２１日後に動物の血液を採取し、血清を単離し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのＳタンパク質に対するＩｇＧ抗体の力価をＥＬＩＳＡ法により決定した。そうするために：
１．ＥＬＩＳＡのための９６ウェルプレートのウェルに抗原を＋４℃で１６時間吸着させた。
２．非特異的結合を除去するために、ＴＰＢＳ中５％の乳を１００ｕｌ／ウェルでプレートウェルに添加した。それを３７℃の振とう機において１時間インキュベートした。
３．免疫化マウスの血清サンプルを１００倍に希釈してから、２倍希釈法により希釈した。全体として、各サンプルの１２個の希釈物を調製した。
４．５０ｕｌの各希釈血清サンプルをプレートウェルに添加した。
５．次に、サンプルを３７℃で１時間インキュベートした。
６．インキュベーションの後に、ウェルをリン酸緩衝液で３回洗浄した。
７．西洋わさびペルオキシダーゼと結合されたマウス免疫グロブリンに対する二次抗体を添加した。
８．次に、サンプルを３７℃で１時間インキュベートした。
９．インキュベーションの後に、ウェルをリン酸緩衝液で３回洗浄した。
１０．次に、西洋わさびペルオキシダーゼの基質であり、反応の結果として着色化合物に変化するテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加した。硫酸の添加により１５分後に反応を停止させた。次に、分光光度計を用いて、各ウェルにおいて４５０ｎｍの波長で溶液の光学濃度（ＯＤ）を測定した。
１．ＥＬＩＳＡのための９６ウェルプレートのウェルに抗原を＋４℃で１６時間吸着させた。
２．非特異的結合を除去するために、ＴＰＢＳ中５％の乳を１００ｕｌ／ウェルでプレートウェルに添加した。それを３７℃の振とう機において１時間インキュベートした。
３．免疫化マウスの血清サンプルを１００倍に希釈してから、２倍希釈法により希釈した。全体として、各サンプルの１２個の希釈物を調製した。
４．５０ｕｌの各希釈血清サンプルをプレートウェルに添加した。
５．次に、サンプルを３７℃で１時間インキュベートした。
６．インキュベーションの後に、ウェルをリン酸緩衝液で３回洗浄した。
７．西洋わさびペルオキシダーゼと結合されたマウス免疫グロブリンに対する二次抗体を添加した。
８．次に、サンプルを３７℃で１時間インキュベートした。
９．インキュベーションの後に、ウェルをリン酸緩衝液で３回洗浄した。
１０．次に、西洋わさびペルオキシダーゼの基質であり、反応の結果として着色化合物に変化するテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加した。硫酸の添加により１５分後に反応を停止させた。次に、分光光度計を用いて、各ウェルにおいて４５０ｎｍの波長で溶液の光学濃度（ＯＤ）を測定した。
【0144】
抗体の力価は、溶液の光学濃度が負の対照群よりも確実に高い最後の希釈度として決定した。得られた結果（幾何平均値）は、表６に示される。
【0145】
【表6】
【0146】
得られたデータに基づいて、開発薬剤は、選択された用量の全範囲内で免疫原性を実証する。
【0147】
実施例１３
種々の投与プロトコルによる若いマウスにおける開発薬剤の免疫原性の研究。
開発薬剤の免疫原性を研究するために、Ｃ５７／Ｂｌ６系統の若いマウス（３～４週齢）を使用した。動物を５つの群に分配し、以下の薬剤を投与した：
１）Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；３週間後に、Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２ ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；
２）Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；３週間後に、Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２ ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；
３）Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｎ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；３週間後に、Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２ ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；
４）Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；３週間後に、ｓｉｍＡｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２ ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；
５）Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；３週間後に、Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２ ｉ／ｍ、１０８ｖｐ／１００ｕｌ；
６）Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；３週間後に、Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２ ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；
７）Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｎ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；３週間後に、Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２ ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；
８）Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；３週間後に、ｓｉｍＡｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２ ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；
９）ｓｉｍＡｄ２５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；３週間後に、ｓｉｍＡｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２ ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；
１０）ｓｉｍＡｄ２５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；３週間後に、Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２ ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；
１１）ｓｉｍＡｄ２５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；３週間後に、Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ。
種々の投与プロトコルによる若いマウスにおける開発薬剤の免疫原性の研究。
開発薬剤の免疫原性を研究するために、Ｃ５７／Ｂｌ６系統の若いマウス（３～４週齢）を使用した。動物を５つの群に分配し、以下の薬剤を投与した：
１）Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；３週間後に、Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２ ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；
２）Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；３週間後に、Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２ ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；
３）Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｎ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；３週間後に、Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２ ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；
４）Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；３週間後に、ｓｉｍＡｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２ ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；
５）Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；３週間後に、Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２ ｉ／ｍ、１０８ｖｐ／１００ｕｌ；
６）Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；３週間後に、Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２ ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；
７）Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｎ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；３週間後に、Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２ ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；
８）Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；３週間後に、ｓｉｍＡｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２ ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；
９）ｓｉｍＡｄ２５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；３週間後に、ｓｉｍＡｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２ ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；
１０）ｓｉｍＡｄ２５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；３週間後に、Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２ ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；
１１）ｓｉｍＡｄ２５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ；３週間後に、Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｉ／ｍ、１０９ｖｐ／１００ｕｌ。
【0148】
２１日後に動物の血液を採取し、血清を単離し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのＳタンパク質に対するＩｇＧ抗体の力価をＥＬＩＳＡ法により決定した。そうするために：
１．ＥＬＩＳＡのための９６ウェルプレートのウェルに抗原を＋４℃で１６時間吸着させた。
２．非特異的結合を除去するために、ＴＰＢＳ中５％の乳を１００ｕｌ／ウェルでプレートウェルに添加した。それを３７℃の振とう機において１時間インキュベートした。
３．免疫化マウスの血清サンプルを２倍希釈法により希釈した。全体として、各サンプルの１２個の希釈物を調製した。
４．５０ｕｌの各希釈血清サンプルをプレートウェルに添加した。
５．次に、サンプルを３７℃で１時間インキュベートした。
６．インキュベーションの後に、ウェルをリン酸緩衝液で３回洗浄した。
７．西洋わさびペルオキシダーゼと結合されたマウス免疫グロブリンに対する二次抗体を添加した。
８．次に、サンプルを３７℃で１時間インキュベートした。
９．インキュベーションの後に、ウェルをリン酸緩衝液で３回洗浄した。
１０．次に、西洋わさびペルオキシダーゼの基質であり、反応の結果として着色化合物に変化するテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加した。
１１．硫酸の添加により１５分後に反応を停止させた。次に、分光光度計を用いて、各ウェルにおいて４５０ｎｍの波長で溶液の光学濃度（ＯＤ）を測定した。
１．ＥＬＩＳＡのための９６ウェルプレートのウェルに抗原を＋４℃で１６時間吸着させた。
２．非特異的結合を除去するために、ＴＰＢＳ中５％の乳を１００ｕｌ／ウェルでプレートウェルに添加した。それを３７℃の振とう機において１時間インキュベートした。
３．免疫化マウスの血清サンプルを２倍希釈法により希釈した。全体として、各サンプルの１２個の希釈物を調製した。
４．５０ｕｌの各希釈血清サンプルをプレートウェルに添加した。
５．次に、サンプルを３７℃で１時間インキュベートした。
６．インキュベーションの後に、ウェルをリン酸緩衝液で３回洗浄した。
７．西洋わさびペルオキシダーゼと結合されたマウス免疫グロブリンに対する二次抗体を添加した。
８．次に、サンプルを３７℃で１時間インキュベートした。
９．インキュベーションの後に、ウェルをリン酸緩衝液で３回洗浄した。
１０．次に、西洋わさびペルオキシダーゼの基質であり、反応の結果として着色化合物に変化するテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加した。
１１．硫酸の添加により１５分後に反応を停止させた。次に、分光光度計を用いて、各ウェルにおいて４５０ｎｍの波長で溶液の光学濃度（ＯＤ）を測定した。
【0149】
抗体の力価は、溶液の光学濃度が負の対照群よりも確実に高い最後の希釈度として決定した。得られた結果（幾何平均値）は、表７に示される。
【0150】
【表7】
【0151】
得られた結果は、種々の投与プロトコルにより開発薬剤が若い動物においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する液性免疫応答の発生を提供することを実証する。
【0152】
実施例１４
小児のために重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫を誘導するための開発薬剤の利用の研究。
１２～１７歳の１００人のボランティアが所与の研究に参加した。提言される免疫化プロトコルは、変異型１に従う医薬品の構成成分１及び構成成分２（Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２）の連続筋肉内投与を包含した。１人のボランティアは、新たに高血圧症と診断されたために構成成分１の投与の前に参加を中止し、それに応じて９９人のボランティアが研究中の治療を開始した。１人は欠席のため、１人は有害事象（白血球減少）のため、１人は未知の病因の腸管感染（エンテロウイルス型）のため、１人は構成成分の投与の５日後に化膿性フルンケル（purulent furunculus）による入院のため、１人は入院（腸管感染）のため、そして１人はＣＯＶＩＤのために構成成分２が投与されず、２人は参加を拒否した。それに応じて、９１人のボランティアが両方のワクチン構成成分を受けた。
小児のために重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫を誘導するための開発薬剤の利用の研究。
１２～１７歳の１００人のボランティアが所与の研究に参加した。提言される免疫化プロトコルは、変異型１に従う医薬品の構成成分１及び構成成分２（Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２）の連続筋肉内投与を包含した。１人のボランティアは、新たに高血圧症と診断されたために構成成分１の投与の前に参加を中止し、それに応じて９９人のボランティアが研究中の治療を開始した。１人は欠席のため、１人は有害事象（白血球減少）のため、１人は未知の病因の腸管感染（エンテロウイルス型）のため、１人は構成成分の投与の５日後に化膿性フルンケル（purulent furunculus）による入院のため、１人は入院（腸管感染）のため、そして１人はＣＯＶＩＤのために構成成分２が投与されず、２人は参加を拒否した。それに応じて、９１人のボランティアが両方のワクチン構成成分を受けた。
【0153】
ワクチン投与後に７３人のボランティア（７３．０％）において発生した２０５のＡＥを記録した。表８は、ＭｅｄＤＲＡ辞書に従う器官別大分類（ＳＯＣ）及び基本語（ＰＴ）によって、そして研究中の調製物及び重症度との関連によって、各群においてＡＥが存在したボランティアの数（占有率）を含む。χ２検定を用いて、そして必要に応じて、セルのいずれかの期待度数が５より低ければ、フィッシャーの正確確率検定を用いて、ＡＥ発生頻度の群間比較を行った。分析では、群間の個々のＡＥの頻度による統計的有意差は明らかにならなかった。
【0154】
【表8】
【0155】
【表9】
【0156】
【表10】
【0157】
研究の間、以下のカテゴリーの有害事象（ＡＥ）が観察された：
１）全身の障害及び投与部位状態 － ７６ＡＥ：
用量の１／１０：３５症例
用量の１／５：２２症例
２）全身反応 － ５４ＡＥ
用量の１／１０：２９症例
用量の１／５：２５症例
３）検査逸脱（Laboratory deviation） － ７６ＡＥ
用量の１／１０：４４症例
用量の１／５：３２症例
１）全身の障害及び投与部位状態 － ７６ＡＥ：
用量の１／１０：３５症例
用量の１／５：２２症例
２）全身反応 － ５４ＡＥ
用量の１／１０：２９症例
用量の１／５：２５症例
３）検査逸脱（Laboratory deviation） － ７６ＡＥ
用量の１／１０：４４症例
用量の１／５：３２症例
【0158】
以下のＡＥは、研究中の調製物と関連があった（関連性評価が「可能な（possible）」、「ほぼ確実（probable）」又は「確実（certain）」であるように）：注射箇所の圧痛、インフルエンザ様症候群、疲労、亜熱性温度（subfebrile temperature）、ほてり、ワクチン注射直後に起こる鼻づまり、頭痛、咽頭炎、咳、関節痛、全身の脱力感、胃痛、パニック発作、好中球の減少、ビリルビンレベルの上昇。
【0159】
他のＡＥについては、関連性は「疑わしい（doubtful）」又は「関連性なし（no connection）」と決定された。研究中の調製物に対するアレルギー反応は観察されなかった。
【0160】
全体として、研究中に明らかになった有害事象は、ほとんどのワクチン薬に特徴的であると言うことができる。生命にかかわる有害事象の発生の症例は記録されなかった。
【0161】
実施例１６
液性免疫レベルの評価に基づいた、開発医薬品による小児の免疫化の有効性の決定。
１２～１８歳の９５人の小児が所与の研究に参加した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳタンパク質のＲＢＤドメインに特異的なＩｇＧ抗体の力価を評価することにより、液性免疫レベルを決定した。研究の参加者を２つの群に分けた：
１）１ｘ１０１０ウイルス粒子／１ｍｌの用量の、変異型１による医薬品の構成成分１及び構成成分２（Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２）の連続筋肉内投与（４７人）。
２）２ｘ１０１０ウイルス粒子／１ｍｌの用量の、変異型１による医薬品の構成成分１及び構成成分２（Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２）の連続筋肉内投与（４８人）。
液性免疫レベルの評価に基づいた、開発医薬品による小児の免疫化の有効性の決定。
１２～１８歳の９５人の小児が所与の研究に参加した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳタンパク質のＲＢＤドメインに特異的なＩｇＧ抗体の力価を評価することにより、液性免疫レベルを決定した。研究の参加者を２つの群に分けた：
１）１ｘ１０１０ウイルス粒子／１ｍｌの用量の、変異型１による医薬品の構成成分１及び構成成分２（Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２）の連続筋肉内投与（４７人）。
２）２ｘ１０１０ウイルス粒子／１ｍｌの用量の、変異型１による医薬品の構成成分１及び構成成分２（Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２）の連続筋肉内投与（４８人）。
【0162】
ワクチン接種前に研究の１日目に採取した同じボランティアのサンプルをリファレンスとして使用した。
【0163】
第１の群の抗原特異的ＩｇＧの力価を研究の２１日目、２８日目及び４２日目に評価し、第２の群については研究の２１日目及び２８日目に評価した。
【0164】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳ抗原のＲＢＤドメインに対するＩｇＧの力価の決定を可能にするＥＬＩＳＡのための検査システムを用いて、抗体の力価を決定した。
【0165】
ＲＢＤ（１００ｎｇ／ウェル）が予め吸着されたプレートを洗浄緩衝液で５回洗浄した。次に、１００ｕｌの正の対照及び１００ｕｌの負の対照をプレートウェルにデュプリケートで添加した。研究サンプルの一連の２倍希釈物を他のウェルに添加した（各サンプルにつき２回の繰返し）。プレートをフィルムで密封し、３００ｒｐｍの速度で混合しながら＋３７℃で１時間インキュベートした。次に、ウェルを洗浄緩衝液の作用溶液で洗浄した。次に、モノクローナル抗体の結合体の１００ｕｌの作用溶液を各ウェルに添加し、プレートを接着剤フィルムで密封し、３００ｒｐｍの速度で混合しながら＋３７℃で１時間インキュベートした。次に、ウェルを洗浄緩衝液の作用溶液で洗浄した。次に、１００ｕｌのクロモゲン基質溶液を各ウェルに添加し、暗所において＋２０℃からの温度で１５分間インキュベートした。その後、５０ｕｌの停止試薬を各ウェルに添加する（１Ｍ硫酸溶液）ことによって反応を停止させた。分光光度計において４５０ｎｍの波長で光学濃度を測定することにより、反応停止後の１０分間に結果を決定した。
【0166】
免疫化した参加者のＯＤ４５０血清値が対照血清値（免疫化前の参加者の血清）の２倍を超える最大血清希釈率として、ＩｇＧの力価を決定した。
【0167】
第１の群（１ｘ１０１０ウイルス粒子／用量）におけるＲＢＤ特異的ＩｇＧ抗体の力価の決定の結果は図３に示される。提供されたデータによると、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２ウイルスのＳタンパク質のＲＢＤドメインに特異的な抗体の力価はワクチン接種後に徐々に増大し、４２日目に最大値に達する。所与の点の対数幾何平均値（reciprocal mean geometrical value）は１３１９２である。研究の４２日目までに、所与の群を構成する４７人のボランティア全てにおいて抗体陽転が観察された。
【0168】
第２の群（２ｘ１０１０ウイルス粒子／用量）におけるＲＢＤ特異的ＩｇＧ抗体の力価の決定の結果は図４に示される。提供されたデータから分かるように、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２ウイルスのＳタンパク質のＲＢＤドメインに特異的な抗体の力価は、成人用ワクチンの全治療用量の１／５によるワクチン接種後に徐々に増大し、４２日目に最大値に達する。所与の点の対数幾何平均値は１９２９２である。研究の４２日目までに、所与の群を構成する４９人のボランティア全てにおいて抗体陽転が観察された。
【0169】
したがって、実行された研究の結果により、開発された免疫生物学的薬剤による小児のワクチン接種は、高レベルのワクチン接種後液性免疫の形成を誘導することができると示された。
【0170】
実施例１５
細胞性免疫レベルの評価に基づいた、開発医薬品による小児の免疫化の有効性の決定。
１２～１８歳の９５人の小児が所与の研究に参加した。研究の参加者を２つの群に分けた：
１）１ｘ１０１０ウイルス粒子／１ｍｌの用量の、変異型１による医薬品の構成成分１及び構成成分２（Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２）の連続筋肉内投与（４７人）。
２）２ｘ１０１０ウイルス粒子／１ｍｌの用量の、変異型１による医薬品の構成成分１及び構成成分２（Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２）の連続筋肉内投与（４８人）。
細胞性免疫レベルの評価に基づいた、開発医薬品による小児の免疫化の有効性の決定。
１２～１８歳の９５人の小児が所与の研究に参加した。研究の参加者を２つの群に分けた：
１）１ｘ１０１０ウイルス粒子／１ｍｌの用量の、変異型１による医薬品の構成成分１及び構成成分２（Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２）の連続筋肉内投与（４７人）。
２）２ｘ１０１０ウイルス粒子／１ｍｌの用量の、変異型１による医薬品の構成成分１及び構成成分２（Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２）の連続筋肉内投与（４８人）。
【0171】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の組換えＳタンパク質による細胞の反復再刺激後に、インビトロ培養中のボランティアの末梢血の増殖性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋リンパ球の量を評価することにより、細胞性免疫レベルを決定した。免疫化の前及び２８日後に患者の血液サンプルを採取し、ficoll溶液密度勾配（１．０７７ｇ／ｍＬ；PanEco）における遠心分離により、そこから単核細胞を単離した。次に、単離した細胞を蛍光染料ＣＦＳＥ（Invivogen、ＵＳＡ）で着色し、９６ウェルプレートのウェルに播種した（２＊１０５細胞／ウェル）。コロナウイルスＳタンパク質を培地に添加する（最終タンパク質濃度１μｇ／ｍｌ）ことにより、インビトロ条件下でリンパ球の反復刺激を実行した。抗原が添加されないインタクト細胞を負の対照として使用した。抗原添加の７２時間後に増殖性細胞の％を測定し、ガンマインターフェロン量を測定するために培地（cultural medium）を採取した。
【0172】
増殖性細胞の％を決定するために、これらを、Ｔリンパ球ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８（抗ＣＤ３ Ｐｅ－Ｃｙ７（BDBiosciences、ＳＫ７クローン）、抗ＣＤ４ ＡＰＣ（BDBiosciences、ＳＫ３クローン）、抗ＣＤ８ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（BDBiosciences、ＳＫ１クローン））のマーカー分子に対する抗体で染色した。フローサイトフルオロメーターBD FACS AriaIII（BD Biosciences、ＵＳＡ）を使用して、細胞混合物中の増殖性（より少量の細胞着色剤ＣＦＳＥを有する）ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球を決定した。コロナウイルスＳタンパク質抗原で再刺激された細胞の分析中に得られた結果から、インタクト細胞の分析中に得られた結果を差し引くことにより、各サンプルにおいて得られた増殖性細胞の百分率を決定した。
【0173】
【0174】
得られたデータは、免疫化後２８日目の抗原再刺激の後、選択された両方の用量での開発薬剤による小児の免疫化により、増殖性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球の百分率の確実な増大が可能になることを示した。
【0175】
得られたデータに基づいて、開発された免疫学的薬剤による小児の２回ワクチン接種は、高レベルのワクチン接種後細胞性免疫の形成を誘導することができるという結論を下すことができる。
【0176】
したがって、提供された実施例は、実行された研究の結果として、生後１か月以上の小児においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する液性及び細胞性免疫応答の反応の発生を誘導する安全で有効な薬剤が作製されたことを確認する。
【0177】
産業上の利用可能性
提供された実施例は全て、生後１か月以上の小児においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する免疫応答を効果的に誘導する開発薬剤の有効性及び産業上の利用可能性を支持する。
提供された実施例は全て、生後１か月以上の小児においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する免疫応答を効果的に誘導する開発薬剤の有効性及び産業上の利用可能性を支持する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】
【国際調査報告】