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2023-512392組織再生の促進に有用なＨＭＧＢ１に関連するポリペプチド、それを含む組成物、及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-27
(54)【発明の名称】組織再生の促進に有用なＨＭＧＢ１に関連するポリペプチド、それを含む組成物、及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20230317BHJP
C07K 14/435 20060101ALI20230317BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20230317BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20230317BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20230317BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20230317BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20230317BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20230317BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20230317BHJP
A61P 9/04 20060101ALI20230317BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20230317BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20230317BHJP
A61P 19/00 20060101ALI20230317BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230317BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20230317BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20230317BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20230317BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20230317BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20230317BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00
C07K14/435 ZNA
A61K38/17
A61P1/04
A61P1/16
A61P1/18
A61P7/00
A61P9/00
A61P9/10
A61P9/04
A61P13/12
A61P17/02
A61P19/00
A61P25/00
A61P25/16
A61P25/28
A61P3/10
C12N15/12
C12N15/62 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022528186
(86)(22)【出願日】2020-11-12
(85)【翻訳文提出日】2022-07-05
(86)【国際出願番号】 IB2020060674
(87)【国際公開番号】W WO2021094983
(87)【国際公開日】2021-05-20
(31)【優先権主張番号】62/934,299
(32)【優先日】2019-11-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518000017
【氏名又は名称】オックスフォード ユニバーシティ イノベーション リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110003708
【氏名又は名称】弁理士法人鈴榮特許綜合事務所
(74)【代理人】
【識別番号】100108855
【弁理士】
【氏名又は名称】蔵田 昌俊
(74)【代理人】
【識別番号】100179062
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 正
(74)【代理人】
【識別番号】100199565
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 茂
(74)【代理人】
【識別番号】100212705
【弁理士】
【氏名又は名称】矢頭 尚之
(74)【代理人】
【識別番号】100219542
【弁理士】
【氏名又は名称】大宅 郁治
(74)【代理人】
【識別番号】100153051
【弁理士】
【氏名又は名称】河野 直樹
(74)【代理人】
【識別番号】100162570
【弁理士】
【氏名又は名称】金子 早苗
(72)【発明者】
【氏名】ナンチャハル、ジャグディープ
(72)【発明者】
【氏名】ビナルス・ギタルト、アルバロ
(72)【発明者】
【氏名】ユエ、ワイアット
(72)【発明者】
【氏名】バージェス－ブラウン、ニコラ
(72)【発明者】
【氏名】リー、ツォン・ユエン
(72)【発明者】
【氏名】エスピリト・サント、アナ・イザベル
【テーマコード（参考）】
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA23
4C084BA44
4C084CA18
4C084NA14
4C084ZA01
4C084ZA36
4C084ZA51
4C084ZA66
4C084ZA75
4C084ZA81
4C084ZA89
4C084ZA94
4C084ZA96
4C084ZC35
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA41
4H045CA40
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、以下の式：Ｈ２Ｎ－Ａ－Ｘ－Ｂ－Ａ－Ｘ－Ｂ－ＨＯＯＣ
（式中、Ａは連続するアミノ酸であり、その配列は、（１）野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸９０～９３の配列と同一の配列を含み、（２）そのアミノ末端側に、配列が野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸９０の前の対応する１～６個のアミノ酸の配列と同一である、１～６個の連続するアミノ酸、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、又は６個のアミノ酸を有し、場合によっては、（３）アミノ末端はメチオニンであり、Ｘは連続するアミノ酸であり、その配列は、野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸９４～１６２の配列と同一であり、Ｂは連続するアミノ酸であり、その配列は、（１）野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸１６３～１６８の配列と同一の配列を含み、（２）そのカルボキシ末端側に、配列が野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸１６８の後の対応する１～６個のアミノ酸の配列と同一である、１～６個の連続するアミノ酸、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、又は６個のアミノ酸を有し、それぞれの－は、ＡとＸ、ＸとＢ、ＢとＡ、ＡとＸ、及びＸとＢのそれぞれの間のペプチド結合を表す）
で表されるポリペプチドを提供する。
（式中、Ａは連続するアミノ酸であり、その配列は、（１）野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸９０～９３の配列と同一の配列を含み、（２）そのアミノ末端側に、配列が野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸９０の前の対応する１～６個のアミノ酸の配列と同一である、１～６個の連続するアミノ酸、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、又は６個のアミノ酸を有し、場合によっては、（３）アミノ末端はメチオニンであり、Ｘは連続するアミノ酸であり、その配列は、野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸９４～１６２の配列と同一であり、Ｂは連続するアミノ酸であり、その配列は、（１）野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸１６３～１６８の配列と同一の配列を含み、（２）そのカルボキシ末端側に、配列が野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸１６８の後の対応する１～６個のアミノ酸の配列と同一である、１～６個の連続するアミノ酸、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、又は６個のアミノ酸を有し、それぞれの－は、ＡとＸ、ＸとＢ、ＢとＡ、ＡとＸ、及びＸとＢのそれぞれの間のペプチド結合を表す）
で表されるポリペプチドを提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の式：Ｈ２Ｎ－Ａ－Ｘ－Ｂ－Ａ－Ｘ－Ｂ－ＨＯＯＣ
（式中、Ａは連続するアミノ酸であり、その配列は、（１）野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸９０～９３の配列と同一の配列を含み、（２）そのアミノ末端側に、配列が野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸９０の前の対応する１～６個のアミノ酸の配列と同一である１～６個の連続するアミノ酸を有し、場合によっては、（３）アミノ末端はメチオニンであり、
Ｘは連続するアミノ酸であり、その配列は、野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸９４～１６２の配列と同一であり、
Ｂは連続するアミノ酸であり、その配列は、（１）野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸１６３～１６８の配列と同一の配列を含み、（２）そのカルボキシ末端側に、配列が野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸１６８の後の対応する１～６個のアミノ酸の配列と同一である１～６個の連続するアミノ酸を有し、
－は、ＡとＸ、ＸとＢ、ＢとＡ、ＡとＸ及びＸとＢの間のペプチド結合を表す）
で表されるポリペプチド。
【請求項2】
アミノ末端はメチオニンである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項3】
Ａは、そのアミノ末端側に、野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸８９に対応する１つのアミノ酸を有する、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項4】
Ｂは、そのカルボキシ末端側に、野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸１６９～１７４に対応する６つのアミノ酸を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチドと担体を含む組成物。
【請求項6】
前記ポリペプチドが治療又は予防有効量で存在し、前記担体が薬学的に許容される担体である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項7】
修復をＣＸＣＲ４＋細胞に依存する組織又は細胞の再生を促進することによって緩和される状態を患う、又はそのような状態になる危険性を有する対象を治療する方法であって、前記対象に、前記組織の再生を促進するのに有効な量の請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項６に記載の医薬組成物の治療若しくは予防用量を投与することを含む、方法。
【請求項8】
前記状態が心筋梗塞であり、前記組織が心臓組織／心筋である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記ポリペプチドが前記心筋梗塞から５時間以内に投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記状態が骨折であり、前記組織が骨である、請求項７に記載の方法。
【請求項11】
前記状態が肝臓損傷に関係し、前記組織が肝臓組織である、請求項７に記載の方法。
【請求項12】
前記状態が、脳又は神経系の損傷に関係し、卒中、パーキンソン病、及び認知症を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項13】
前記状態が肺の損傷に関係する、請求項７に記載の方法。
【請求項14】
前記状態が、消化管に関係し、外科手術及び炎症性腸疾患を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項15】
前記状態が、皮膚の損傷に関係し、外科手技、熱傷、及び潰瘍を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項16】
前記状態が１型糖尿病を含む膵臓に関係し、前記細胞が膵島細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項17】
前記状態が、例えば化学療法後の好中球減少症であり、前記組織が骨髄である、請求項７に記載の方法。
【請求項18】
前記状態が腎不全であり、前記組織が腎臓組織である、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、2019年11月12日に出願された米国仮出願第62/934,299号の利益を主張し、その内容はこの明細書に組み込まれる。
【0002】
本出願全体を通じて、括弧内で参照されるものを含め、様々な刊行物が参照される。本出願において言及されるすべての刊行物の開示は、その全体が、本発明が属する技術分野及び本発明により用いることができる技術分野における特徴に関する説明を提供するために、本出願に組み込まれる。
【0003】
配列表の参照
本出願は、ファイル名「201112_91203-A-PCT_Sequence_Listing_AWG.txt」のヌクレオチド配列を組み込み、これは、サイズが７８キロバイトであり、ＩＢＭ－ＰＣ機形式で2020年11月12日に作成されており、MS-Windows（登録商標）とのオペレーティングシステム適合性を有し、本出願の一部として2020年11月12日に提出されたテキストファイルに含まれる。
本出願は、ファイル名「201112_91203-A-PCT_Sequence_Listing_AWG.txt」のヌクレオチド配列を組み込み、これは、サイズが７８キロバイトであり、ＩＢＭ－ＰＣ機形式で2020年11月12日に作成されており、MS-Windows（登録商標）とのオペレーティングシステム適合性を有し、本出願の一部として2020年11月12日に提出されたテキストファイルに含まれる。
【0004】
技術分野
本開示は、有害な炎症を伴うことなく組織再生を促進するＨＭＧＢ１に関連する操作されたポリペプチド、及び操作されたポリペプチドをそれを必要とする対象に投与することによって急性組織傷害を治療する方法に関する。
本開示は、有害な炎症を伴うことなく組織再生を促進するＨＭＧＢ１に関連する操作されたポリペプチド、及び操作されたポリペプチドをそれを必要とする対象に投与することによって急性組織傷害を治療する方法に関する。
【背景技術】
【0005】
常在する幹細胞及び前駆細胞は、恒常性を維持すること及び傷害後に多数の組織の修復を実行することにおいて、重要な役割を果たす[1]。しかしながら、成体におけるほとんどの組織は、瘢痕化によって治癒する。骨髄移植の成功後[2]、固体器官の再生を促進するための外因性幹細胞療法に相当な関心が存在していたが、成功は眼[3]及び皮膚[4]などの一部の器官に限定されていた。組織傷害後の炎症性の環境は、幹細胞生着にはつながらず、その後の瘢痕化は、幹細胞ニッチを破壊する[5]。したがって、内因性修復機序を刺激することによる組織再生の促進に焦点がシフトした[6]。成功する治療薬の開発は、これらの経路を促進する可溶性媒介因子の特定に依存する。本発明者らは、以前に、骨、血液、及び骨格筋を含む、複数の組織における修復の重要な媒介因子として、高移動度群ボックス１（ＨＭＧＢ１）を特定した[7]。
【0006】
ＨＭＧＢ１は、プロトタイプのアラーミンであり[8, 9]、生理学的条件下では、転写において重要な役割を有する[10, 11]。それは、細胞傷害時に、損傷細胞及び壊死細胞から細胞外及び循環中に受動的に放出され、幹細胞及び前駆細胞に対して、それらをＧ０とＧ１との間の中間状態[12]であるＧＡｌｅｒｔ[7]へ移行させるように作用する。適切な活性化因子に曝露されると、ＧＡｌｅｒｔにある細胞は急速にＧ１に入り、組織修復を実行できる。必要とされない場合、ＧＡｌｅｒｔにある幹細胞は、およそ３週間後にＧ０に戻り[12]、それによって、確実にそれらが疲弊せず、ニッチが枯渇されないようになる。
【0007】
ＨＭＢＧ１は、２つのＬ字型ボックスドメインＡ及びＢを含み、それぞれ、ＬＰＳ（ボックスＡのＮ末端及び隣接するＣ末端リンカー領域）[13]又はＲＡＧＥ（ボックスＢのＣ末端）[14]の結合に関与する可動性の領域によって接続された３つのα－ヘリックス（Ｉ～ＩＩＩ）を含む。タンパク質のＣ末端は、本質的に秩序がなく、酸性テールを構成するカルボン酸残基（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）を高い比率で含む。これは、ＨＭＧボックスに結合して、ＴＬＲ２[10, 15, 16]及び可能性としてさらにはＲＡＧＥ[15]との相互作用を含む、活性を調節する（図１Ａ～１Ｂ）。ＨＭＧＢ１システイン残基（ボックスＡにおけるＣｙｓ２２、Ｃｙｓ４４、及びボックスＢにおけるＣｙｓ１０５）の酸化状態は、ＨＭＧＢ１の細胞外活性の重要な決定因子であり、これが、放出の機序に依存する。３つの異なる酸化還元形態が、in vivoで説明されている[17]。傷害又は細胞壊死後に核から受動的に放出されるＨＭＧＢ１は、完全還元型の形態（ＦＲ－ＨＭＧＢ１）である。それは、ＣＸＣＬ１２に結合し、ヘテロ複合体が、細胞表面受容体ＣＸＣＲ４を介して、幹細胞及び前駆細胞をＧＡｌｅｒｔに移行させるようにシグナル伝達する[7]。局所的炎症環境における部分的酸化は、ジスルフィドＨＭＧＢ１（ＤＳ－ＨＭＧＢ１）の形成をもたらし[18, 19]、これは、Ｃｙｓ２２とＣｙｓ４４との間にジスルフィド結合を有する。これはまた、アセチル化[20]及びＮ－グリコシル化[21]後に免疫細胞によって能動的に分泌される形態である。終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）を介したＤＳ－ＨＭＧＢ１シグナル伝達は、血小板を活性化させ、血栓症の重要な媒介因子である[22, 23]。ＤＳ－ＨＭＧＢ１は、ＴＬＲ４及びＴＬＲ２を介して作用し、ＴＮＦ及びＩＬ－６を含む炎症促進性サイトカインの放出ももたらす[24]。３つすべての受容体を介した細胞内シグナル伝達が収束して、ＭｙＤ８８依存性の様式で[26, 27]ＮＦ－κβ活性[25]を誘導する。細胞外反応性酸素種の作用による３つのシステイン残基の酸化は、スルホニル－ＨＭＧＢ１（ＳＯ３）をもたらし、これは、生物学的に不活性である[17, 28]。
【0008】
ＤＳ－ＨＭＧＢ１のボックスＡにおけるジスルフィド架橋（Ｃｙｓ２２－Ｃｙｓ４４）は、ＴＬＲ４シグナル伝達に必須であり（図１Ａ～１Ｂ）、ＴＬＲ４への結合を開始させるが、解離速度も比較的高い。次いで、ＭＤ－２は、親和性は低いものの非常に低い解離速度でボックスＢに結合し、相互作用を安定化させ[29]、ボックスＢにおけるＰｈｅ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ（ＦＣＳＥ、１０４～１０７）ペプチドは、この相互作用に必須である[30]。ＤＳ－ＨＭＧＢ１がＴＬＲ４を介してシグナル伝達する能力は、２２位、４４位、及び１０５位におけるシステインを、セリンに置換し、３Ｓ－ＨＭＧＢ１[17]として記載される操作された形態をもたらすことによって弱められた。Tirone Mらは、３Ｓ－ＨＭＧＢ１が、ＦＲ－ＨＭＧＢ１と比較して増強された再生特性を有することを主張していたが[31]、本発明者らは、骨、血液、及び骨格筋の傷害では、それがＦＲ－ＨＭＧＢ１と同等であったことを見いだした。興味深いことに、３Ｓ－ＨＭＧＢ１は、心筋梗塞後に局所的に投与した場合、有害であるのに対して、ＦＲ－ＨＭＧＢ１は、４週間にわたる評価で、梗塞が小さくなり、心臓機能の増強をもたらした[32]。ＴＬＲ２又はＲＡＧＥシグナル伝達に対する３Ｓ置換の作用に関して、公開されているデータは存在しない。
【0009】
ＴＬＲ２相互作用の部位は、明確に定義されていないが、グリチルリチンが、この相互作用を阻害することは公知である[33]。これは、少なくとも一方、及び可能性としては両方のＨＭＧボックスドメイン及び酸性テールが関与していることを示唆する[10]。酸性テールは、ＨＭＧＢ１を負に調整し、ＨＭＧＢ１の酸性テールをボックスドメインから転置してＴＬＲ２を介したシグナル伝達を可能にするためには、共リガンド[34]が必要であることが報告されている[35]。しかしながら、いくつかの刊行物は、ＨＭＧＢ１単独でのＴＬＲ２依存性炎症促進性シグナル伝達を報告しており[24, 36]、共リガンドの要件は、細胞型及び状況に依存する可能性がある。ＴＬＲ２シグナル伝達に関するＨＭＧＢ１の酸化還元状態の役割は、ジスルフィド形態[22]及び完全還元型形態[34]の両者が、ＴＬＲ２を通じてシグナル伝達することが提示されているため、不明瞭なままである。ＲＡＧＥ相互作用は、主として、ＨＭＧボックスＢ（残基１４９～１８２）内のペプチドにマッピングされており[14]（図１Ａ～１Ｂ）、この配列に由来するペプチドは、ＨＭＧＢ１－ＲＡＧＥシグナル伝達を効果的に阻害できる[37]。加えて、ボックスＡ内には第２のカスパーゼ依存性部位も存在する。より最近では、第２のＲＡＧＥ結合部位が、ＨＭＧボックスＡで特定されており[38]、カスパーゼ１１によるタンパク質分解後にのみアクセス可能である[38]。しかしながら、ＲＡＧＥシグナル伝達に対するそれぞれの部位の相対的な寄与は、不明なままである。ＲＡＧＥによって媒介される血栓形成促進性シグナル伝達が、ＨＭＧＢ１のジスルフィド形態を必要とすることも認識されており、ボックスＡが関与していることが示される[22]。ＨＭＧＢ１の酸性テールは、ＲＡＧＥ結合ペプチド内の残基に結合するため、ＴＬＲ２と類似の様式でＲＡＧＥシグナル伝達を負に調節する可能性がある[10, 15, 39]。
【0010】
ＦＲ－ＨＭＧＢ１の再生活性を医薬に移行することの成功は、ＣＸＣＬ１２結合及びＣＸＣＲ４を介したシグナル伝達を維持しながら、ＲＡＧＥ、ＴＬＲ２、及びＴＬＲ４を介したすべての可能性のある有害なシグナル伝達を排除することに依存する。ここでは、ＣＸＣＬ１２との結合に重要であるＨＭＧＢ１内の残基を特定し、再生活性を維持しながら、ＲＡＧＥ結合並びにＴＬＲ２及びＴＬＲ４シグナル伝達を排除する、ＨＭＧＢ１バリアントについて説明する。
【発明の開示】
【0011】
本発明は、以下の式：
Ｈ２Ｎ－Ａ－Ｘ－Ｂ－Ａ－Ｘ－Ｂ－ＨＯＯＣ
（式中、Ａは連続するアミノ酸であり、その配列は、（１）野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸９０～９３の配列と同一の配列を含み、（２）そのアミノ末端側に、配列が野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸９０の前の対応する１～６個のアミノ酸の配列と同一である、１～６個の連続するアミノ酸、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、又は６個のアミノ酸を有し、場合によっては、（３）アミノ末端はメチオニンであり、
Ｘは連続するアミノ酸であり、その配列は、野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸９４～１６２の配列と同一であり、
Ｂは連続するアミノ酸であり、その配列は、（１）野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸１６３～１６８の配列と同一の配列を含み、（２）そのカルボキシ末端側に、配列が野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸１６８の後の対応する１～６個のアミノ酸の配列と同一である、１～６個の連続するアミノ酸、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、又は６個のアミノ酸を有し、
それぞれの－は、ＡとＸ、ＸとＢ、ＢとＡ、ＡとＸ、及びＸとＢのそれぞれの間のペプチド結合を表す）
で表されるポリペプチドを提供する。
Ｈ２Ｎ－Ａ－Ｘ－Ｂ－Ａ－Ｘ－Ｂ－ＨＯＯＣ
（式中、Ａは連続するアミノ酸であり、その配列は、（１）野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸９０～９３の配列と同一の配列を含み、（２）そのアミノ末端側に、配列が野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸９０の前の対応する１～６個のアミノ酸の配列と同一である、１～６個の連続するアミノ酸、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、又は６個のアミノ酸を有し、場合によっては、（３）アミノ末端はメチオニンであり、
Ｘは連続するアミノ酸であり、その配列は、野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸９４～１６２の配列と同一であり、
Ｂは連続するアミノ酸であり、その配列は、（１）野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸１６３～１６８の配列と同一の配列を含み、（２）そのカルボキシ末端側に、配列が野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸１６８の後の対応する１～６個のアミノ酸の配列と同一である、１～６個の連続するアミノ酸、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、又は６個のアミノ酸を有し、
それぞれの－は、ＡとＸ、ＸとＢ、ＢとＡ、ＡとＸ、及びＸとＢのそれぞれの間のペプチド結合を表す）
で表されるポリペプチドを提供する。
【0012】
本発明はまた、本発明によるポリペプチドと担体を含む、組成物、並びに修復をＣＸＣＲ４＋細胞に依存する組織又は細胞の再生を促進することによって緩和される状態を患う、又はそのような状態になる危険性を有する対象を治療する方法であって、対象に、組織又は細胞の再生を促進するのに有効な量の本発明のポリペプチド、又は本発明の医薬組成物の治療若しくは予防用量を投与することを含む、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1A】図１Ａ～１Ｂは、ＨＭＧＢ１の構造の概略図及び判明している免疫原性活性の位置を示す。図１Ａ：ＨＭＧＢ１の構造（ＰＤＢ ２ＹＲＱ、立体構造異性体１）。ＬＰＳ、ＴＬＲ４、又はＲＡＧＥとの公知の相互作用に応じてＰｙＭｏｌで色付け。転写モジュレーション及び殺細菌活性に関与する酸性テールは示していない。
【図1B】図１Ｂ：結合部位の概略表示。ボックスＡ－青色、ボックスＢ－緑色、ピンク色：グリチルリチン結合に関与する残基を示す。赤色：ボックスＡ又はボックスＢに隣接するＮ末端側の可動性領域、オレンジ色：システイン残基、白色：ＨＭＧボックス間のリンカー領域、明るい黄緑色：ＲＡＧＥ結合領域（黄色の酸性テール内に延在するため不完全）。
【図2A】図２Ａ～２Ｆは、ＣＸＣＬ１２結合に重要であり、Ｎ末端側のＤ－Ｐ－Ｘ－Ｘ四量体を含む、それぞれのＨＭＧボックスドメイン内の保存された残基を示す。図２Ａ：１μＭのＣＸＣＬ１２－Ｈｉｓ６とともにインキュベートし、抗Ｈｉｓ５－ＨＲＰ抗体で検出した、ＨＭＧＢ１の１５量体のペプチドアレイ（１１×１０）。スポットの強度は、ペプチドに結合したＣＸＣＬ１２の量に対応し、アレイにおける最初の２つ及び最後の２つのスポットは、１０－Ｈｉｓ陽性対照を含んでいた。
【図2B】図２Ｂ：１０－ｈｉｓ対照に対して正規化した図２Ａにおけるスポット強度の定量化（２回の実験）。アラニンスキャニング実験に使用したペプチドを強調表示。酸性テール内のペプチドは、その高い負電荷に起因してＣＸＣＬ１２などのカチオン性分子に非特異的に結合する可能性があるため含めなかった。グラフ内のペプチドは、左から右へ、配列番号８～１０４で表される。
【図2C】図２Ｃ：図２Ａ～２Ｂで特定したペプチド内の単一の位置におけるアラニン変異誘発のペプチドアレイ。それぞれの列における最初のスポットは、陽性対照に対応し、２番目のスポットは、未改変のペプチドに対応する。示したペプチドは、配列番号１０５～１１１で表される。
【図2D】図２Ｄ：未改変のペプチドに対して正規化した図２Ｃのペプチド（配列番号１０５～１１１）のアレイの強度の定量化。ＣＸＣＬ１２シグナルにおいて、アラニン残基において見られる観察される変動（Ａｌａ－＞Ａｌａ、同義変異、灰色）よりも高い変動を示した残基を赤色で示す。
【図2E】図２Ｅ：ＣＸＣＬ１２に結合するビオチン化ＨＭＧＢ１コンストラクト［全長ＦＲ赤色／３Ｓ黒色、最小ボックスＡ ８～７８（紫色）及びボックスＢ ９４～１６２（褐色）、拡張型ボックスＡ １～８８（ピンク色）及びボックスＢ ８９～１７４（灰色）］のミカエリス・メンテン飽和当てはめ。
【図2F】図２Ｆ：図２Ｅから導出された動態パラメーターの概要。両者の当てはめから得られた親和性（Ｋｄ）定数は、同じ関係性に従い、ＨＭＧＢ１ ９４～１６２については大幅に減少しており、当てはめたデータから１方向ブラウン・フォーサイスＡＮＯＶＡによって分析した。一対比較（カラム因子）において有意差が見られなかったため、Ｋｄ値を、事後２方向ＡＮＯＶＡによって比較し、両者の値を平均した。加工前のインターフェログラムを図９に示す。
【図3A】図３Ａ～３Ｂは、ＣＸＣＬ１２結合に関与する残基のＮＭＲ検証を示す。図３Ａ：ＣＸＣＬ１２（０．４２、０．８４、及び１．４２モル当量）で滴定した後、最終濃度点の後に測定したＣＸＣＬ１２なしの並列対照（ＣＳＰドリフト対照）を含む複数のＨＳＱＣスペクトルにわたって計算した、ヘリックスのみのビオチン化ボックスＢ（９４～１６２、ＨＭＧＢ１Ａ－ｃ０２８）又は完全なボックスＢ（８９～１７４、ＨＭＧＢ１Ａ－ｃ０３８）の累積ＣＳＰ。グラフ内の緑色の強度は相対ＣＳＰを示す。それぞれのＨＭＧＢ１コンストラクトの配列を、残基番号とともにオーバーレイしてあり、空のカラム（番号なし）は、並列３Ｄ １Ｈ－１５Ｎ ＨＳＱＣ／ＮＯＥ／ＴＯＣＳＹ実験でマッピングできなかった残基を表す。それぞれのＨＭＧボックスに対応する残基の配列は、以下のように示す：水色、文献でＣＸＣＬ１２結合に関与することがこれまでに報告されている残基；赤色、ペプチドアレイで弱く関与していた残基；紫色、公開されている文献及びペプチドアレイの両者で関与していた残基。灰色、ペプチドアレイで評価できなかったＣＸＣＬ１２結合ペプチド（下線）内のアラニン残基。示した配列は、配列番号５で表される。
【図3B】図３Ｂ：図３Ａの累積ピーク高さ変化、ＮＭＲ変化のヒートマップ。赤色は、すべての残基の１標準誤差を上回るＩ／Ｉ０変化を示し、青色は、－１標準誤差を上回る減少を示す。示した配列は、配列番号５で表される。
【図4A】図４Ａ～４Ｃは、ｄＢＢ１２Ｌコンストラクトの設計を示す。図４Ａ：ボックスＡ＋リンカー（１～８８）（配列番号３）の、ボックスＢ＋リンカー（８９～１７４）（配列番号４）とのアライメントであり、値は、ＮＭＲ命名法に対応する（Ｎ末端メチオニンを除く）。垂直方向の線は、厳密に保存されている位置を示し、二重の点は、類似の置換を示す。下線：第１のペプチドアレイから得られたＣＸＣＬ１２に結合するペプチド領域。赤色：ＮＭＲで検証できなかった、アラニンスキャンでＣＸＣＬ１２結合に関与するとしてフラグ付けされた残基。オレンジ色：アラニンスキャンでフラグ付けされ、ＣＳＰ又はＮＭＲによるピーク体積変化のいずれかを示す残基。シアン：本発明者らのＮＭＲにおいてもペプチドアレイ実験においてもフラグ付けされなかったが、ＮＭＲ文献[44]でＣＸＣＬ１２結合に寄与すると記載されている残基。紫色：ペプチドアレイ実験でフラグ付けされ、公開されているか又は本発明者らのＮＭＲデータによって確認された残基。緑色：ＣＸＣＬ１２に直接的に結合し得るか、又は近傍の残基への結合によって影響を受け得るのいずれか、ＮＭＲ実験でのみフラグ付けされた残基。ピンク色：本発明者らのＮＭＲ実験及び公開されているデータの両者によってフラグ付けされた残基。
【図4B】図４Ｂ：ＦＲ－ＨＭＧＢ１ １～１６６（２ＹＲＱ）の構造。残基は図４Ａと同じ色に従って色付けされている。すべての色付けされた残基の側鎖が示されている。破線の円は、それぞれのＨＭＧボックスにおけるグリチルリチン結合領域を示す。
【図4C】図４Ｃ：ｄＢＢ１２Ｌコンストラクト設計の概要。開始コドンＭｅｔ１は、切断されたペプチドでは部分的に失われているため、ここではＭｅｔ０として番号付けする。したがって、ＨＭＧＢ１ Ｍｅｔ１－Ｇｌｙ２…Ｇｌｕ２１５は、Ｍｅｔ０－Ｇｌｙ１…Ｇｌｕ２１４となる。ＦＲ－ＨＭＧＢ１（上部、配列番号１）及びｄＢＢ１２Ｌコンストラクト（下部、配列番号２）のドメイン組成及び配列。ｄＢＢ１２Ｌコンストラクトは、次のように設計した：１．酸性テール及びＲＡＧＥ結合ドメインの一部（１７５～２１４）が欠失されており、２．残基１～８８（ボックスＡ）が、残基８９～１７４と置換され、結果として２つのＨＭＧボックスＢドメインが生じ、３．ボックスＢのＣ末端側の残基１６３～１７４が、天然のＨＭＧＢ１におけるボックスＡに対してＣ末端側にある天然の可動性リンカー（７９～８８）と置きかえられている。ＣＸＣＬ１２結合ペプチドを赤色の文字で示す。ボックスＢの繰り返し単位は、図内で黒色の破線によって分離されている。
【図5A】図５Ａ～５Ｄは、ｄＢＢ１２Ｌが、ＦＲ－ＨＭＧＢ１ １～２１４／１～１６４に類似する安定性及び表面荷電構造を有することを示す。図５Ａ：全長及び１～１６４ ＦＲ－ＨＭＧＢ１、並びにｄＢＢ１２Ｌの計算されたＴｍ５０値（℃単位）。個々のＴｍ５０値の濃淡は、すべてのコンストラクトのグローバルデータセット内の最も高い（緑色）及び最も低い（赤色）値を示す。Ｎ／Ａ：曲線が当てはめられない。
【図5B】図５Ｂ：５０ｍＭ、又は０．２Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ６．５のＨＭＧＢ１コンストラクトのネイティブＥＳＩ／ＭＳ。３つすべてのＨＭＧＢ１コンストラクトは、類似のネイティブＭ／Ｚプロファイルを有し、ｄＢＢ１２Ｌが、２つのＨＭＧボックスが互いに離れており、還元型ＨＭＧＢ１コンストラクトに近似している。連続した線；コンパクト型モノマー。破線；拡張型モノマー（ＨＭＧボックスが互いに遠位である）。酸性テールの除去（青色の曲線のＦＲ ＨＭＧＢ１ １～１６４を、赤色の曲線のＦＲ－ＨＭＧＢ１と比較）及びより高いイオン強度（５０ｍＭ、又は２００ｍＭの酢酸アンモニウムにおける同じコンストラクトのスペクトルの比較）は、より高いＭ／Ｚ状態（部分的なアンフォールディング）の存在度を増加させる。
【図5D】図５Ｄ：０．２Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ６．５において室温で１８０日間（Ｄ０～Ｄ１８０）保管した後のＨＭＧＢ１コンストラクトの変性ＥＳＩ／ＭＳデコンボリューション、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及びＳＥＣプロファイル。
【図6A】図６Ａ～６Ｆは、ｄＢＢ１２Ｌが、ＲＡＧＥに対して低減された結合を有し、ＴＬＲ２又はＴＬＲ４を通じてシグナル伝達しないことを示す。図６Ａ：酸化状態に関係なく、ｄＢＢ１２ＬコンストラクトによるＲＡＧＥ結合の不在を示す、ハイブリッドＥＬＩＳＡ（濃度当たりｎ＝４、グローバル当てはめ）により得られたミカエリス・メンテン飽和当てはめ。ＤＳ－ＨＭＧＢ１は、ＦＲ－ＨＭＧＢ１と比較してより強くＲＡＧＥに結合する。データは、ＤＳ－ＨＭＧＢ１対照に対して正規化している。
【図6B】図６Ｂ：バイオレイヤーインターフェロメトリー（０～２５μＭのＨＭＧＢ１、６回の実験）により得られたミカエリス・メンテン飽和当てはめ。結合速度及び解離速度は、加工前のインターフェログラムのデータのみから計算。動態パラメーター及び色凡例を図６Ｃに要約し、無効な当てはめは、Ｒ２＜０．６（結合不良）を表す。ＥＬＩＳＡから得られたデータは、実験の性質に起因して、結合定数によってよりも、解離定数によって比例的により影響を受ける。それぞれの動態パラメーターについて、緑色は、最も高い親和性、最も速い結合（ｋｏｎ）、又は最も遅い解離（ｋＯｆｆ）を有するコンストラクトを示し、中間点を黄色で示し、最も低いものは赤色で示す。
【図6D】図６Ｄ：ＤＳ－ＨＭＧＢ１が、ヒトＴＬＲ２及びＣＤ１４を発現するレポーターＨＥＫ－Ｄｕａｌ細胞において、ＮＦ－κβ活性を促進したことを示す。ＤｂＢ－ＨＭＧＢ１は、ＮＦ－κβシグナル伝達を促進しなかったが、一方でＦＲ－ＨＭＧＢ１は、両者の細胞株においてわずかなＮＦ－κβ活性を誘導するのみであり、これは、アッセイ中の部分的な酸化に起因する可能性がある。値を、対照（培地単独）と比較した平均±標準誤差の倍率変化として示す。
【図6E】図６Ｅ：ＤＳ－ＨＭＧＢ１が、マウスＴＬＲ４、ＭＤ－２及びＣＤ１４を発現するレポーターＨＥＫ－Ｄｕａｌ細胞において、ＮＦ－κβ活性を促進したことを示す。ＤｂＢ－ＨＭＧＢ１は、ＮＦ－κβシグナル伝達を促進しなかったが、一方でＦＲ－ＨＭＧＢ１は、両者の細胞株においてわずかなＮＦ－κβ活性を誘導するのみであり、これは、アッセイ中の部分的な酸化に起因する可能性がある。値を、対照（培地単独）と比較した平均±標準誤差の倍率変化として示す。
【図6F】図６Ｆ：ジスルフィドＨＭＧＢ１（ＤＳ－ＨＭＧＢ１）は、単球においてＴＮＦ産生を増加させ、これは、準最適量のＬＴＡの存在によって、さらに増強されたが、ＬＰＳでは増強されなかった。ＦＲ－ＨＭＧＢ１及びＤｂＢ－ＨＭＧＢ１のいずれも、ＬＰＳ又はＬＴＡとともに２４時間事前インキュベートした場合であっても、ＴＮＦ分泌を誘起しなかった。これらのコンストラクトとともに事前インキュベートしたＬＰＳに対する応答もまた、それぞれ３つの技術的複製物を用いたｎ＝３人のドナーで、有意に低減された。
【図7A】図７Ａ～７Ｊは、最適用量のｄＢＢ－ＨＭＧＢ１及びＦＲ－ＨＭＧＢ１の再生作用が、活性化傷害のものと同一であることを示す。図７Ａ：傷害後又はＨＭＧＢ１がＧＡｌｅｒｔを誘導した後の、筋肉幹細胞において差次的に発現する遺伝子を倍率変化で示す、ボルケーノプロット。積分は、反対側の下肢の傷害又は静脈内（ｉｖ）ＨＭＧＢ１によって誘導されるＧＡｌｅｒｔにあるコア遺伝子の上方（褐色の点）及び下方（青色の点）調節の保存を示す。
【図7C】図７Ｃ：再生を線維の断面積によって定量した、ＢａＣｌ２骨格筋傷害モデルにおけるＦＲ－ＨＭＧＢ１の用量応答。最適用量は、０．７５ｍｇ／ｋｇ（２８．７５ｎｍｏｌ／ｋｇ）であり、これを後続のアッセイにおいて使用した。値は、ホルム・シダック補正を用いたネステッドＡＮＯＶＡにおける平均±標準誤差として示す（事後検定についての値を示す）。
【図7D】図７Ｄ：動物に、ＦＲ－ＨＭＧＢ１（最適用量）を、ＢａＣｌ２の注入後の様々な時点で投薬して、傷害後のＦＲ－ＨＭＧＢ１での処置が有効である間隔を評価した。値は、ホルム・シダック補正を用いたネステッドＡＮＯＶＡにおける平均±標準誤差として示す（事後検定についての値を示す）。
【図7I】図７Ｉ：ＭＩ後１週間及び５週間における心臓周期の拡張終期及び収縮終期における代表的な心房中央の短軸ｃｉｎｅＭＲＩ画像。心室内の血液は明るく見える。ＦＲ－ＨＭＧＢ１群は、心臓機能の保存及び壁部厚さの維持（黄色の矢印）を示し、収縮期における右及び左心室の分離を見ることができる（赤色の矢印）。対照的に、ＰＢＳ処理群において、有意な左心室拡張（白色の矢印）があり、拡張期と収縮期との間の収縮は非常に限定されている。１群当たり１０匹。すべてのＭＲＩスキャンは、盲検観測者が行い、評価した。
【図7J】図７Ｊ：ＢａＣｌ２により筋肉が傷害を受けた動物を、ＰＢＳ（黒色）、２８．７５ｎＭ／ｋｇのＦＲ－ＨＭＧＢ１Ａ－ｃ００１（赤色）、又はｄＢＢ１２Ｌ（緑色）で処置した後の所与の時点においてプロットした平均筋肉断面積。１群及び時点当たり５匹。ネステッドＡＮＯＶＡ（ホルム・シダック事後補正）。それぞれの時点における代表的な画像を図１２に示す。
【図8A】図８Ａ～８Ｂは、ＨＭＧＢ１と相互作用するＣＸＣＬ１２ペプチドのペプチドアレイの結果を示す。図８Ａ：全長ＣＸＣＬ１２のペプチドアレイ。「＋」の位置は、陽性対照１０－Ｈｉｓペプチドに対応し、残りのペプチドは、連続した２つの残基をＣ末端の方にシフトさせたＣＸＣＬ１２の１５量体を含む。膜を、１ｕＭのＨＭＧＢ１（ＦＲ又は３Ｓ）－Ｈｉｓ６（１～２１４）、ボックスＡ－Ｈｉｓ６（８～７８）、及びボックスＢ－Ｈｉｓ６（９４～１６２）に、２４時間曝露した。結合したタンパク質を、抗Ｈｉｓ－ＨＲＰコンジュゲートの化学発光によって検出した。全長ＨＭＧＢ１と相互作用するＣＸＣＬ１２のペプチドは、ボックスＡ又はボックスＢのいずれか単独とは相互作用することができず、それぞれのボックスドメインのＮ末端側のセグメント（特に、ボックスＡにおけるＤ４／ボックスＢにおけるＤ９０）の必要性を確認し、一般的なＣＸＣＬ１２ペプチドに関与するスポットの強度はまた、ボックスドメイン単独への結合の場合にはＦＬ－ＨＭＧＢ１と比較して著しく減少する。３Ｓへの結合は、ＦＲに対するものよりも高い強度であると見られ、これは、アッセイ中のタンパク質の酸化に起因する可能性が高いが、これは、使用された低いタンパク質濃度がＥＳＩ／ＴＯＦ ＭＳに好適ではないことに起因して、定量化されなかった。ＢＬＩデータは、しかしながら、ＦＲ－ＨＭＧＢ１からよりも低い、３ＳからのＣＸＣＬ１２の解離速度を示す。
【図9】図９は、固定化されたＨＭＧＢ１コンストラクトに結合するＣＸＣＬ１２のＢＬＩにおけるインターフェログラムを示す。ビオチン化ＨＭＧＢ１コンストラクトを、ストレプトアビジンをコーティングしたOctetバイオセンサーに固定化し、漸増濃度のＣＸＣＬ１２に浸漬させた。インターフェログラムは、ＣＸＣＬ１２の濃度に応じて色付けられている（凡例を右上に示す）。所与のセンサーの３つの複製物のそれぞれのセット（サイクル）は、コンストラクトに応じて色付けしたオーバーレイによって囲まれている。ＦＲ ＦＬ－ＨＭＧＢ１（ｃ０１１）、黒色：３Ｓ－ＦＬ ＨＭＧＢ１（ｃ０２２）、紫色：ＦＲ－ＨＭＧＢ１ボックスＡ ８～７８（ｃ０２７）、褐色：ＦＲ－ＨＭＧＢ１ボックスＢ ９４～１６２（ｃ０２８）、ピンク色：ＦＲ－ＨＭＧＢ１ボックスＡ １～８８（ｃ０３７）、灰色：ＦＲ－ＨＭＧＢ１ボックスＢ ９０～１６２（ｃ０３８）。
【図10A】図１０Ａ～１０Ｄは、ＣＸＣＬ１２結合に関与する残基のＮＭＲ検証を示す（図３の続き）。図１０Ａ：１：２モル当量のＣＸＣＬ１２を一工程で添加した際のＨＭＧＢ１ ３Ｓ １～１８４（ＨＭＧＢ１Ａ－ｃ００７）の累積ＣＳＰ（１：１のＨＭＧボックス対ＣＸＣＬ１２の比）。ボックスＡ及びボックスＢの残基は、中央値ＣＳＰ計算の目的で、別個の分子と考えている。棒グラフにおける緑色の強度は、より高い相対ＣＳＰを示す。それぞれのＨＭＧＢ１コンストラクトの配列に、残基番号をオーバーレイしてあり、空のカラム（番号なし）は、並列３Ｄ １Ｈ－１５Ｎ ＨＳＱＣ／ＮＯＥ／ＴＯＣＳＹ実験でマッピングできなかった残基を表す。それぞれのボックスに対応する残基の配列は、以下に従って色付けし、それぞれの条件の真ん中に示す：水色、文献においてＣＸＣＬ１２結合に関与することがこれまでに報告されている残基；赤色、ペプチドアレイにおいて弱く関与していた残基；紫色、公開されている文献及びペプチドアレイの両者で関与していた残基。示した配列は、配列番号６及び７で表される。
【図10C】図１０Ｃ：ＨＭＧＢ１Ａ ９４～１６２（２日間の実験）。１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５緩衝液における１５Ｎ ＨＳＱＣ－ＨＱＭＣピークスペクトルを示す。タンパク質濃度をスペクトルオーバーレイで示す。
【図10D】図１０Ｄ：ＨＭＧＢ１Ａ ８９～１７４（６日間の実験、軽微な分解が４日目以降に生じる）。１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５緩衝液における１５Ｎ ＨＳＱＣ－ＨＱＭＣピークスペクトルを示す。タンパク質濃度をスペクトルオーバーレイで示す。
【図11】図１１は、固定化されたＦｃ－ＲＡＧＥに結合するＨＭＧＢ１コンストラクトのＢＬＩにおけるインターフェログラムを示す。ＲＡＧＥ－Ｆｃを、ＡＨＣセンサーの表面に固定化し、漸増濃度の異なるＨＭＧＢ１コンストラクトに浸漬させた。２回の実験を、異なる濃度範囲で行った：左側の３つのグラフの列は、９段階にわたって０～２２．２２μＭのＨＭＧＢ１であり、右側は、７段階にわたって０～２５μＭであった。いずれも、濃度で色付けしている（上部）。色は、特定のコンストラクト濃度を示す。それぞれのグラフは、単一のセンサー（複製物）に対応する。赤色の長方形で囲まれたインターフェログラムは、品質不良（例えば、ドリフト）に起因して排除したデータ点を有していた。
【発明を実施するための最良の形態】
【0014】
用語
本発明の理解を促進するために、別途本明細書に明示的に提供されている場合を除き、以下の用語のそれぞれは、以下に説明する意味を有する。
本発明の理解を促進するために、別途本明細書に明示的に提供されている場合を除き、以下の用語のそれぞれは、以下に説明する意味を有する。
【0015】
本明細書では、「操作された」とは、天然に存在する化合物を変化させることに基づいて作製された非天然の化合物を意味する。操作された化合物、例えば、ポリペプチドは、改変又は再配列されている天然に存在する化合物の一部分を含んでもよい。そのような操作されたポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドの「アナログ」又は「誘導体」とも称される。
【0016】
本明細書では、「幹細胞」は、造血幹細胞を含むがこれには限定されない、体内において多数の異なる細胞型に発達する可能性を有する、任意の特化されていない細胞を意味する。
【0017】
本明細書では、「有効量」という用語は、所望の結果を達成すること、例えば、状態又はそれと関連する症状、例えば、この明細書に記載の急性組織傷害を緩和できる化合物の量を意味する。本発明に従って投与される化合物の具体的な用量は、当然ながら、状態と関連する特定の作用、例えば、投与の経路、対象の生理学的状態、及び治療する状態の重症度によって決定される。例えば、対象に投与される操作されたＨＭＧＢ１タンパク質は、好ましくは、治療有効量の操作されたＨＭＧＢ１タンパク質を含む組成物の形態である。
【0018】
「薬学的に許容される」という語句は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激作用、アレルギー応答、又は他の問題若しくは合併症を伴わない、妥当なリスク／ベネフィット比に相応の、ヒト及び動物の組織と接触して使用するのに好適な化合物、材料、組成物、又は剤形を指す。本明細書では、「薬学的に許容される担体」という語句は、薬学的に許容される材料、組成物、又はビヒクル、例えば、液体又は固体フィラー、希釈剤、賦形剤、又は溶媒封入材料を意味する。任意の具体的な薬学的に許容される担体の選択は、十分に当業者の知識の範囲内である。したがって、広範な好適な担体が利用可能であり、医薬組成物において日常的に使用されている。
【0019】
本明細書では、「１つの（a）」及び「１つの（an）」という用語は、列挙された成分の「１つ以上」を指すことを理解されたい。
【0020】
本明細書では、提供されるすべての数値範囲は、端点、及び文脈と一致して、範囲の端点間に含まれるすべての数字を明示的に含めることを意図する。
【0021】
発明の態様
本発明は、以下の式：
Ｈ２Ｎ－Ａ－Ｘ－Ｂ－Ａ－Ｘ－Ｂ－ＨＯＯＣ
（式中、Ａは連続するアミノ酸であり、その配列は、（１）野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸９０～９３の配列と同一の配列を含み、（２）そのアミノ末端側に、配列が野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸９０の前の対応する１～６個のアミノ酸の配列と同一である、１～６個の連続するアミノ酸を有し、場合によっては、（３）アミノ末端はメチオニンであり、
Ｘは連続するアミノ酸であり、その配列は、野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸９４～１６２の配列と同一であり、
Ｂは連続するアミノ酸であり、その配列は、（１）野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸１６３～１６８の配列と同一の配列を含み、（２）そのカルボキシ末端側に、配列が野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸１６８の後の対応する１～６個のアミノ酸の配列と同一である、１～６個の連続するアミノ酸、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、又は６個のアミノ酸を有し、
それぞれの－は、ＡとＸ、ＸとＢ、ＢとＡ、ＡとＸ、及びＸとＢのそれぞれの間のペプチド結合を表す）
で表されるポリペプチドを提供する。
本発明は、以下の式：
Ｈ２Ｎ－Ａ－Ｘ－Ｂ－Ａ－Ｘ－Ｂ－ＨＯＯＣ
（式中、Ａは連続するアミノ酸であり、その配列は、（１）野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸９０～９３の配列と同一の配列を含み、（２）そのアミノ末端側に、配列が野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸９０の前の対応する１～６個のアミノ酸の配列と同一である、１～６個の連続するアミノ酸を有し、場合によっては、（３）アミノ末端はメチオニンであり、
Ｘは連続するアミノ酸であり、その配列は、野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸９４～１６２の配列と同一であり、
Ｂは連続するアミノ酸であり、その配列は、（１）野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸１６３～１６８の配列と同一の配列を含み、（２）そのカルボキシ末端側に、配列が野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸１６８の後の対応する１～６個のアミノ酸の配列と同一である、１～６個の連続するアミノ酸、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、又は６個のアミノ酸を有し、
それぞれの－は、ＡとＸ、ＸとＢ、ＢとＡ、ＡとＸ、及びＸとＢのそれぞれの間のペプチド結合を表す）
で表されるポリペプチドを提供する。
【0022】
いくつかの態様において、メチオニンが、ポリペプチドのアミノ末端に存在する。
【0023】
他の態様において、Ａは、そのアミノ末端側に、野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸８９に対応する１つのアミノ酸を有する。
【0024】
いくつかの態様において、Ｂは、そのカルボキシ末端側に、配列が野生型ＨＭＧＢ１のアミノ酸１６９～１７４の配列に対応する６つのアミノ酸を有する。
【0025】
本発明はまた、提供される態様のうちのいずれか１つに記載のポリペプチドと、担体を含む、組成物も提供する。
【0026】
いくつかの態様において、ポリペプチドは、治療又は予防有効量で存在し、担体は、薬学的に許容される担体である。
【0027】
本発明はまた、修復をＣＸＣＲ４＋細胞に依存する組織又は細胞の再生を促進することによって緩和される状態を患う、又はそのような状態になる危険性を有する対象を治療する方法であって、対象に、組織又は細胞の再生を促進するのに有効な量の提供される態様のいずれか１つに記載のポリペプチド、すなわち、治療又は予防有効用量の本発明の医薬組成物を投与することを含む、方法も提供する。
【0028】
ある特定の態様において、状態は、心筋梗塞であり、組織は、心臓組織、特に、心筋である。
【0029】
現在好ましい態様において、ポリペプチドは、心筋梗塞から５時間以内、好ましくは、４時間以内、より好ましくは、３時間以内、さらにより好ましくは、２時間以内、及び最も好ましくは、１時間以内に投与される。
【0030】
いくつかの態様において、状態は、骨折であり、組織は、骨である。
【0031】
他の態様において、状態は、肝臓損傷に関係し、組織は、肝臓組織である。
【0032】
なおもさらなる態様において、状態は、脳又は神経系に対する損傷に関係し、卒中、パーキンソン病、及び認知症を含む。
【0033】
いくつかの態様において、状態は、肺に対する損傷に関係する。
【0034】
なおもさらなる態様において、状態は、消化管に関係し、外科手術及び炎症性腸疾患を含む。
【0035】
いくつかの態様において、状態は、皮膚に対する損傷に関係し、外科手技、熱傷、及び潰瘍を含む。
【0036】
追加の態様において、状態は、１型糖尿病を含む、膵臓に関係し、細胞は、膵島細胞である。
【0037】
さらなる態様において、状態は、好中球減少症、例えば、化学療法後の好中球減少症であり、組織は、骨髄である。
【0038】
いくつかの態様において、状態は、腎不全であり、組織は、腎臓組織である。
【0039】
さらなる非限定的な詳細は、本発明の理解を補助するために記載されているが、決して開示される本発明の範囲を制限することを意図するものでもそのように解釈されるものでもない、以下の実験の詳細の節に記載されている。
【実施例】
【0040】
結果
ＣＸＣＬ１２結合に関与するＨＭＧＢ１内のアミノ酸及びモチーフの特定
炎症促進性シグナル伝達を排除するために、ＦＲ－ＨＭＧＢ１のどの残基を変異できるかについて考察する前に、ＣＸＣＬ１２との結合に関与するアミノ酸及びモチーフをマッピングすることが不可欠である。ペプチドＳＰＯＴアレイを使用し[40]、標的タンパク質（ＨＭＧＢ１）のうちの１つの配列をカバーする重複ペプチドを、ＣＸＣＬ１２に結合するそれらの能力に関して免疫ブロッティングすることによって評価して、結合に関与する重要な配列を特定した。ｈｉｓタグ化ＣＸＣＬ１２に結合するヒトＨＭＧＢ１ペプチドを用いた粗いペプチドアレイにより、ボックスＡとボックスＢとの間で、ＣＸＣＬ１２に結合する同種配列の具体的なパターンが強調表示された。ＨＭＧＢ１配列に対するＣＸＣＬ１２結合ペプチドのクラスタリングによって、２つの主要な結合部位を特定した（図２Ａ及び図２Ｂ）。第１のものは、グリチルリチン結合部位と重なる、ＨＭＧボックスの最初の１．５個のα－ヘリックスを包含していた[41]。第２のものは、第３のα－ヘリックスのＣ末端側の半分に位置していた。それぞれのＨＭＧボックスにおいて、第１のＣＸＣＬ１２結合ペプチド（ヘリックスＩ及びＩＩ）は、このセグメントに由来するペプチドとＣＸＣＬ１２の結合の強度が、はるかに高かったため、ＣＸＣＬ１２結合に最も関与しているように見えた。ボックスＢのペプチドとＣＸＣＬ１２の結合は、免疫ブロットの強度に基づいて、ボックスＡと比較してわずかに弱いように見えた。
ＣＸＣＬ１２結合に関与するＨＭＧＢ１内のアミノ酸及びモチーフの特定
炎症促進性シグナル伝達を排除するために、ＦＲ－ＨＭＧＢ１のどの残基を変異できるかについて考察する前に、ＣＸＣＬ１２との結合に関与するアミノ酸及びモチーフをマッピングすることが不可欠である。ペプチドＳＰＯＴアレイを使用し[40]、標的タンパク質（ＨＭＧＢ１）のうちの１つの配列をカバーする重複ペプチドを、ＣＸＣＬ１２に結合するそれらの能力に関して免疫ブロッティングすることによって評価して、結合に関与する重要な配列を特定した。ｈｉｓタグ化ＣＸＣＬ１２に結合するヒトＨＭＧＢ１ペプチドを用いた粗いペプチドアレイにより、ボックスＡとボックスＢとの間で、ＣＸＣＬ１２に結合する同種配列の具体的なパターンが強調表示された。ＨＭＧＢ１配列に対するＣＸＣＬ１２結合ペプチドのクラスタリングによって、２つの主要な結合部位を特定した（図２Ａ及び図２Ｂ）。第１のものは、グリチルリチン結合部位と重なる、ＨＭＧボックスの最初の１．５個のα－ヘリックスを包含していた[41]。第２のものは、第３のα－ヘリックスのＣ末端側の半分に位置していた。それぞれのＨＭＧボックスにおいて、第１のＣＸＣＬ１２結合ペプチド（ヘリックスＩ及びＩＩ）は、このセグメントに由来するペプチドとＣＸＣＬ１２の結合の強度が、はるかに高かったため、ＣＸＣＬ１２結合に最も関与しているように見えた。ボックスＢのペプチドとＣＸＣＬ１２の結合は、免疫ブロットの強度に基づいて、ボックスＡと比較してわずかに弱いように見えた。
【0041】
個々の残基の重要性をさらに説明するために、ＣＸＣＬ１２結合ペプチド内のそれぞれのアミノ酸をアラニンに置換した第２のペプチドアレイを生成し、それらのＣＸＣＬ１２結合に対する作用を評価した。目的は、ＣＸＣＬ１２相互作用に直接的に寄与するペプチド上のアミノ酸を指摘することであった。これにより、いくつかの残基のアラニンへの置換は、ＣＸＣＬ１２との結合の強度を、その他の点では相同なペプチドから変化させたため（図２Ｃ及び図２Ｄ）、これらの残基は、ＣＸＣＬ１２との結合に重要であることが確認された。ＣＸＣＬ１２との相互作用は、ＨＭＧボックスのヘリックスセグメントが関与することのみが示された公開されているデータとは対照的に[42～44]、本発明者らは、それぞれのボックスの可動性Ｎ末端の隣接領域の一部（Ｄ－４－Ｐ－Ｘ－Ｘ－１）、並びにＣ末端の残基（ボックスＡについてはＩｌｅ７８～Ｐｒｏ８０及びボックスＢについてはＡｌａ１６３～Ａｓｐ１６８）が、ＣＸＣＬ１２との相互作用に関与することを見いだした（図２Ｅ）。これは、ＣＸＣＬ１２ペプチドの逆ペプチドアレイ（図９）で確認された。全長ＦＲ及び３Ｓ－ＨＭＧＢ１は、ＣＸＣＬ１２のβシート全体をカバーする配列を含むペプチドに結合し、一方、隣接する可動性領域を含まないＨＭＧＢ１ボックスコンストラクト単独（８～７８ボックスＡ）又は（９４～１６２ボックスＢ）[45]が、βシートのＮ末端鎖をカバーするペプチドとのみ相互作用した。
【0042】
本発明者らは、ＨＭＧボックスに隣接するこれらの可動性領域がＣＸＣＬ１２結合に関与するなら、それらの不在は、ＨＭＧＢ１とＣＸＣＬ１２の相互作用を顕著に変化させるという仮説を立てた。バイオレイヤーインターフェロメトリー（ＢＬＩ）を使用して、本発明者らは、ＨＭＧボックスのそれぞれを、可動性隣接残基有り（完全なＨＭＧボックスコンストラクト、ボックスＡについてはＨＭＧＢ１ １～８８、ボックスＢについてはＨＭＧＢ１ ８９～１７４）[46]、又は無し（ヘリックスのみのＨＭＧボックスコンストラクト、ＨＭＧＢ１ ９～７８、ＨＭＧＢ１ ９４～１６２）で含む、ＨＭＧＢ１コンストラクト、全長ＦＲ－ＨＭＧＢ１、及び非酸化性（３Ｓ）－ＨＭＧＢ１とＣＸＣＬ１２の結合を評価したが、これらは、野生型タンパク質のＣＸＣＬ１２結合特性が共通している[17]。予測のとおり、ＨＭＧＢ１とＣＸＣＬ１２の結合は、これらの可動性領域の存在によって大きな影響を受けた（図２Ｅ及び図２Ｆ）。隣接領域なしのヘリックスのみのコンストラクトの解離速度（ｋｏｆｆ）の増加によって明らかなように、ヘリックスのみのコンストラクトは、インタクトな隣接領域を有する完全ＨＭＧボックスコンストラクトと比較して、ＣＸＣＬ１２親和性及び結合能力が減少した。対照的に、全長ＨＭＧＢ１（ＦＲ又は３Ｓ）及び完全ＨＭＧボックスコンストラクトに対するＣＸＣＬ１２の親和性は、互いに同程度であり、ヘリックスのみのコンストラクトよりも高かった。
【0043】
本発明者らのペプチドアレイは、ＣＸＣＬ１２結合に関与する残基が、１つはαヘリックスＩ及びＩＩのＮ末端側の半分とにまたがり、２つ目はαヘリックスＩＩＩのＣ末端にわたる、２つのペプチドにクラスター化されていたことを示した。両者のペプチドが、それぞれのＨＭＧボックスのＮ末端及びＣ末端に可動性隣接領域を含んでいた。これらのパターンは、ＨＭＧ Ａ及びＢボックス全体に反映されていた（図２Ｂ、図２Ｄ、図２Ｅ）。ＢＬＩ動態データにより、単一のＨＭＧボックスドメインにおける隣接領域の不在が、動員されるＣＸＣＬ１２の脱安定化をもたらし、ヘリックスのみのコンストラクトには結合したままとならなかったことが確認された（図２Ｆ）。
【0044】
ＣＸＣＬ１２は、ペプチドアレイ及びＮＭＲによって示されるように、それぞれのＨＭＧボックスの下側の凹部ポケットに結合する
次に、ＮＭＲを使用して、構造上の観点から、ＣＸＣＬ１２結合に関与するＨＭＧＢ１内のアミノ酸残基を確認した。ＣＸＣＬ１２結合に関与する残基は、複合体の形成時にＮＭＲシグナルの変化をもたらす。本発明者らは、隣接領域あり及びなしのＨＭＧボックスを表すＦＲ－ＨＭＧＢ１ ９４～１６２及び８９～１７４、並びに３Ｓ ＨＭＧＢ１ １～１８４を使用した。７５０ＭＨｚにおいて３Ｄスペクトルの完全なセット（１５Ｎ ＨＳＱＣ－ＴＯＣＳＹ／ＮＯＥＳＹ及び関連する１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトル）を取得するのに必要とされる時間は、ＦＲ－ＨＭＧＢ１の酸化をもたらし、ピーク共鳴及びＣＸＣＬ１２との相互作用を変化させることになるため、非酸化性３Ｓ－ＨＭＧＢ１を、本発明者らの全長コンストラクトとして使用した。
次に、ＮＭＲを使用して、構造上の観点から、ＣＸＣＬ１２結合に関与するＨＭＧＢ１内のアミノ酸残基を確認した。ＣＸＣＬ１２結合に関与する残基は、複合体の形成時にＮＭＲシグナルの変化をもたらす。本発明者らは、隣接領域あり及びなしのＨＭＧボックスを表すＦＲ－ＨＭＧＢ１ ９４～１６２及び８９～１７４、並びに３Ｓ ＨＭＧＢ１ １～１８４を使用した。７５０ＭＨｚにおいて３Ｄスペクトルの完全なセット（１５Ｎ ＨＳＱＣ－ＴＯＣＳＹ／ＮＯＥＳＹ及び関連する１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトル）を取得するのに必要とされる時間は、ＦＲ－ＨＭＧＢ１の酸化をもたらし、ピーク共鳴及びＣＸＣＬ１２との相互作用を変化させることになるため、非酸化性３Ｓ－ＨＭＧＢ１を、本発明者らの全長コンストラクトとして使用した。
【0045】
ＨＭＧＢ１ボックスＢ ９４～１６２のＣＸＣＬ１２滴定（図３Ａ）は、ペプチドアレイにおいて特定されたＣ末端及びＮ末端の結合領域において、複数の残基の、累積化学シフト摂動（ＣＳＰ）又はピーク高さの変化（Ｉ／Ｉ０）のいずれかのＮＭＲシグナルの変化をもたらした。しかしながら、本発明者らのペプチドアレイにおいて特定され、文献にも記録[43, 44]されているいくつかの残基（Ａ１００、Ｉ１１２、Ｌ１１９、Ａ１３６、Ｙ１５４、Ｄ１５７、Ｉ１５８）は、ＣＳＰの変化も体積の変化も示さなかった。隣接領域を含むボックスＢのコンストラクトについては、中央値ＣＳＰ及び平均体積変化の両者が、有意に高かった。これらの隣接領域におけるいくつかの残基（Ｄ９０、Ｇ１６５、Ｋ１６６）は、本発明者らのペプチドアレイデータに従って、ＣＸＣＬ１２結合に関与することが見いだされていた。ヘリックスのみ（９４～１６２）のコンストラクトにおけるＣＸＣＬ１２結合による影響を受けない残基、例えば、Ｙ１５４、Ｄ１５７、及びＩ１５８、並びにペプチドアレイにおいてＣＸＣＬ１２結合に関与しているとして特定されたものは、完全ＨＭＧボックスコンストラクトにおいて有意なＣＳＰを示し、隣接領域が存在する場合に、改善された結合を示した。加えて、本発明者らは、隣接領域を有するコンストラクトにおいて、ペプチドアレイでは特定されていなかった残基についてＣＳＰ変化を観察した（Ａ１４７、Ｍ１３１、Ａ１６９、Ｋ１７２、Ｇ１７３）。これまでに特定されていなかったが、ペプチドアレイにおいて可能性として重要であるとしてフラグ付けされた他の残基は、ＣＸＣＬ１２の添加時にＣＳＰ変化又は体積変化を示さなかった（Ｃ１０５、Ｅ１０７、Ｙ１０８）。これらの群の残基は、したがって、ＣＸＣＬ１２にとって重要ではないとして再分類した。
【0046】
ＮＭＲ実験を、３Ｓ－ＨＭＧＢ１ １～１８４を用いて繰り返すと、ＣＸＣＬ１２添加により、シグナル対ノイズ比に起因して検出の閾値を下回るＣＳＰの変化が生じた。驚くべきことに、公開されているデータ[47]とは対照的に、３Ｓ－ＨＭＧＢ１ １～１８４のボックスＢ内の残基Ａ１００、Ｉ１１２、Ｌ１１９、及びＡ１３６は、有意なＣＳＰ変化も体積変化ももたらすことができなかったが、これらのうちのいくつかに非常に近い残基（Ｓ９９、Ｋ１１３）は、影響を受けた。このコンストラクト内で、ＨＭＧボックスＢに対応する残基は、ボックスＡにおけるものと比較して、ＣＸＣＬ１２との相互作用に関与する残基について、弱いＣＳＰ変化を示した。これは、ボックスＢの高い結合及び解離速度によって示唆されるように、ＣＸＣＬ１２結合のさらなる流体平衡を表す可能性がある（図２Ｇ）。これにより、本発明者らはまた、残基、Ｈ３０、Ｄ３２、又はＳ３４を、ペプチドアレイからの偽陽性として示すことが可能となった（図１１）。ボックスＢ ８９～１７４におけるＫ８９は高いＣＳＰを示したが、これは、Ｎ末端から３番目の残基（ＴＥＶ切断後の残りのＮ末端残基、Ｓｅｒ－Ｍｅｔ）である。３Ｓ ＨＭＧＢ１ １～１８４を用いた実験では、可動性リンカーの中央部にある場合、ＣＳＰは増加しなかった。したがって、ボックスＢ単独においてこの残基と関連する変化は、高い立体構造的可動性を許容する可能性のあるＮ末端の位置に関連する可能性が高い。
【0047】
ＣＸＣＬ１２結合を保持し、同時に炎症促進性シグナル伝達を排除する、二重ボックスＢ ＨＭＧＢ１コンストラクトの設計
本発明者らは、ペプチドアレイ、アラニン置換、及びＮＭＲから得られたデータを組み合わせ、それらをＨＭＧＢ１のＮＭＲ構造にマッピングして（図３Ａ、ＰＤＢ ２ＹＲＱ）、ＣＸＣＬ１２との結合に関与する残基を特定した。本発明者らは、ＣＸＣＬ１２結合残基が、ＨＭＧボックスドメインの凹部側を占有し、それぞれのＨＭＧボックスの下側に、ＣＸＣＬ１２結合ポケットを形成することを見いだした。これらの２つのポケット（それぞれのＨＭＧボックスに１つ）には、それぞれのボックスのヘリックスＩとＩＩとの間の、ＨＭＧＢ１－ＣＸＣＬ１２結合の競合的阻害剤であるグリチルリチンの結合部位も含まれる[41]。ＨＭＧボックスＡ及びＢは、それぞれ、同等な親和性で１つのＣＸＣＬ１２モノマーに結合できる。本発明者らは、それぞれのＨＭＧボックス内のＣＸＣＬ１２と相互作用するペプチドの分布が、両者のＨＭＧボックスの間で類似であり、ほぼ同一な結合ポケットを形成することも認識している（図４Ａ）。
本発明者らは、ペプチドアレイ、アラニン置換、及びＮＭＲから得られたデータを組み合わせ、それらをＨＭＧＢ１のＮＭＲ構造にマッピングして（図３Ａ、ＰＤＢ ２ＹＲＱ）、ＣＸＣＬ１２との結合に関与する残基を特定した。本発明者らは、ＣＸＣＬ１２結合残基が、ＨＭＧボックスドメインの凹部側を占有し、それぞれのＨＭＧボックスの下側に、ＣＸＣＬ１２結合ポケットを形成することを見いだした。これらの２つのポケット（それぞれのＨＭＧボックスに１つ）には、それぞれのボックスのヘリックスＩとＩＩとの間の、ＨＭＧＢ１－ＣＸＣＬ１２結合の競合的阻害剤であるグリチルリチンの結合部位も含まれる[41]。ＨＭＧボックスＡ及びＢは、それぞれ、同等な親和性で１つのＣＸＣＬ１２モノマーに結合できる。本発明者らは、それぞれのＨＭＧボックス内のＣＸＣＬ１２と相互作用するペプチドの分布が、両者のＨＭＧボックスの間で類似であり、ほぼ同一な結合ポケットを形成することも認識している（図４Ａ）。
【0048】
ＣＸＣＬ１２との結合の配列を特定した後、本発明者らは、次に、これらの相互作用表面を有するが、炎症促進性シグナル伝達を減少するように配列を改変した、ＨＭＧＢ１コンストラクトを設計した。それぞれのＨＭＧボックスがＣＸＣＬ１２モノマーに独立して結合できるという事実、並びにＴＬＲ４[48]並びに可能性としては血栓形成促進性ＲＡＧＥ[14, 22]及びＴＬＲ２[22, 33]シグナル伝達活性に、ボックスＡ（酸化型）及びボックスＢの両者が必要であることに基づいて、本発明者らは、ボックスＡを別のボックスＢに置換した（すなわち、１～８８を８９～１７４に置き換えた）ＨＭＧＢ１コンストラクトが、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、又はＲＡＧＥを介してシグナル伝達しないという仮説を立てた。加えて、本発明者らは、ボックスＢにおけるＲＡＧＥ結合配列の一部（１７５～１８４）を欠失させて、この受容体に対する親和性をさらに減少させた。ボックスＡ配列をボックスＢと置きかえることは、ＬＰＳグリカン結合ペプチドを、ＬＰＳ脂質Ａ結合ペプチドのコピーと置きかえることでもあり[13]、これは、ＬＢＰと類似の様式で、ＨＭＧＢ１の炎症促進性活性[49]及びＬＰＳのＴＬＲ４／ＭＤ－２への伝達をさらに妨害する可能性がある。この操作されたコンストラクトｄＢＢ１２Ｌ（図４Ｂ）は、天然のＨＭＧＢ１タンパク質の以下のセグメントから構成されていた：可動性Ｎ末端側領域（ＨＭＧＢ１ ８９～９３に由来）、第１のボックスＢ（ＨＭＧＢ１ ９４～１６２に由来）、天然のボックスＢのＣ末端側の１２個の残基のリンカー（ＨＭＧＢ１ １６３～１７４に由来）、及び第２のボックスＢ（ＨＭＧＢ１ ９４～１６２に由来）。このｄＢＢ１２Ｌにおける１２個の残基の長さのリンカーは、天然のＨＭＧＢ１のリンカーにおける１０個のアミノ酸に類似である。リンカーの長さのこのわずかな増加は、本発明者らがＣＸＣＬ１２結合においてＣＳＰの変化を示した残基１７２及び１７３を保存したことに起因する。
【0049】
本発明者らは、動的走査蛍光測定法（Dynamic Scanning Fluorimetry、ＤＳＦ）及び溶媒接触可能表面積（ＳＡＳＡ）を使用して、ネイティブ質量分析法（ネイティブＥＳＩ／ＭＳ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって、ｄＢＢ１２Ｌ及び野生型ＨＭＧＢ１の熱安定性を比較した。ｄＢＢ１２Ｌは、同様に２つのＨＭＧボックスドメインを含み、Ｃ末端側酸性テールを含まない、ＦＲ－ＨＭＧＢ１ １～１６４と類似の安定性及び表面荷電プロファイルを有していた。熱安定性の傾向は、すべてのコンストラクトで同様であり（図５Ａ）、等電点（ｄＢＢ１２Ｌ又は１－１６４のテールなしコンストラクトについては９．９、及びＦＬ－ＨＭＧＢ１については６）付近のｐＨではＴｍ５０が低くなり、臨床診療に関連する条件（ＰＢＳ、精製緩衝液、及び生理食塩水溶液）において、すべてが同等に安定しており、Ｔｍ５０は約５０℃であった。しかしながら、本発明者らは、ＦＲ－ＨＭＧＢ１／ＦＲ－ＨＭＧＢ１ １～１６４について、ｄＢＢ１２Ｌと比較して、異なる最適なイオン強度範囲を観察した。ネイティブＥＳＩ／ＭＳにおいて、３つすべてのＨＭＧＢ１コンストラクトは、同様の荷電状態分布を有し、主要な種としてのコンパクト型モノマー、及びより高いＳＡＳＡの拡張型モノマーを有していた（図５Ｂ及び図５Ｃ）。拡張型モノマーは、テールなしコンストラクト又はより高いイオン強度で、より多く存在した。ネイティブＥＳＩ／ＭＳにおいて観察された平均モノマーＳＡＳＡ値は、ＳＥＣ又は公開されているＮＭＲ構造（ＰＤＢ ２ＹＲＱ、ＨＭＧＢ１ １～１６４）に由来するものと整合性があった。コンパクト型ＦＬ－ＨＭＧＢ１モノマーＳＡＳＡは、水中のＦＬ－ＨＭＧＢ１の計算モデルと一致した[44]。最大１８０日間の保管は、ＳＥＣプロファイル（等しいＲＶにおいて常に単分散性）、分解、又は凝集（図５Ｄ）に影響を及ぼさなかった。これは、ＥＳＩ／ＭＳにおいて観察された立体構造が、ＨＭＧＢ１コンストラクトを表すか又はその天然のフォールディングであること、並びにｄＢＢ１２Ｌが、２つのＨＭＧボックスを単独で有するＨＭＧＢ１コンストラクトと有意差がないことを示唆する。
【0050】
ｄＢＢ１２Ｌコンストラクトは、ＲＡＧＥに対する親和性が大幅に低減し、ＴＬＲ２又はＴＬＲ４を介してシグナル伝達できない
本発明者らは、次いで、ｄＢＢ１２Ｌが、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４シグナル伝達、及びＲＡＧＥ結合を減少させ、同時にＨＭＧＢ１に媒介される再生を保存するかどうかを評価した。ＲＡＧＥのための確立されたシグナル伝達アッセイが欠如していることに起因して、本発明者らは、リアルタイム動態（ＢＬＩ）及びエンドポイントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、ＨＭＧＢ１へのＲＡＧＥの結合を評価した。ＥＬＩＳＡに基づく親和性の測定（図６Ａ）は、平衡時の３Ｓ－、ＦＲ－、及びＤＳ－ＨＭＧＢ１が、同様の量のＲＡＧＥに結合し、ＤＳ－ＨＭＧＢ１及び３Ｓ－ＨＭＧＢ１が、ＦＲ－ＨＭＧＢ１よりも有意に高い見かけの親和性を有することを示した。対照的に、ｄＢＢ１２Ｌは、このアッセイではＲＡＧＥに結合しなかった。インタクトなＲＡＧＥ結合ペプチド及び酸化型ボックスＡを有するが、酸性テールを有さず、したがって、ＲＡＧＥ結合のすべての必要条件を有する、ＤＳ－ＨＭＧＢ１ １～１８４、ＲＡＧＥ結合ペプチドの相当な部分が欠如しているが、酸化型ボックスＡを保持する、ＤＳ－ＨＭＧＢ１ １～１６４、及びＤＳ－ボックスＡ単独を含む、３つの追加のＨＭＧＢ１コンストラクトを試験した。本発明者らは、ＤＳ－ＨＭＧＢ１ １～１８４が、ＲＡＧＥに結合したが、全長ＤＳ－ＨＭＧＢ１と比較して能力及び親和性の低減を有したことを見いだした。比較によると、ＤＳ－ＨＭＧＢ１ １～１６４は、全長ＤＳ－ＨＭＧＢ１と比較してＲＡＧＥ結合能力が大幅に減少したが、依然としてｄＢＢ１２Ｌよりは高く、一方でＤＳボックスＡ １～８８（隣接領域を有する完全ＨＭＧボックスコンストラクト）は、ＲＡＧＥに結合できなかった。
本発明者らは、次いで、ｄＢＢ１２Ｌが、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４シグナル伝達、及びＲＡＧＥ結合を減少させ、同時にＨＭＧＢ１に媒介される再生を保存するかどうかを評価した。ＲＡＧＥのための確立されたシグナル伝達アッセイが欠如していることに起因して、本発明者らは、リアルタイム動態（ＢＬＩ）及びエンドポイントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、ＨＭＧＢ１へのＲＡＧＥの結合を評価した。ＥＬＩＳＡに基づく親和性の測定（図６Ａ）は、平衡時の３Ｓ－、ＦＲ－、及びＤＳ－ＨＭＧＢ１が、同様の量のＲＡＧＥに結合し、ＤＳ－ＨＭＧＢ１及び３Ｓ－ＨＭＧＢ１が、ＦＲ－ＨＭＧＢ１よりも有意に高い見かけの親和性を有することを示した。対照的に、ｄＢＢ１２Ｌは、このアッセイではＲＡＧＥに結合しなかった。インタクトなＲＡＧＥ結合ペプチド及び酸化型ボックスＡを有するが、酸性テールを有さず、したがって、ＲＡＧＥ結合のすべての必要条件を有する、ＤＳ－ＨＭＧＢ１ １～１８４、ＲＡＧＥ結合ペプチドの相当な部分が欠如しているが、酸化型ボックスＡを保持する、ＤＳ－ＨＭＧＢ１ １～１６４、及びＤＳ－ボックスＡ単独を含む、３つの追加のＨＭＧＢ１コンストラクトを試験した。本発明者らは、ＤＳ－ＨＭＧＢ１ １～１８４が、ＲＡＧＥに結合したが、全長ＤＳ－ＨＭＧＢ１と比較して能力及び親和性の低減を有したことを見いだした。比較によると、ＤＳ－ＨＭＧＢ１ １～１６４は、全長ＤＳ－ＨＭＧＢ１と比較してＲＡＧＥ結合能力が大幅に減少したが、依然としてｄＢＢ１２Ｌよりは高く、一方でＤＳボックスＡ １～８８（隣接領域を有する完全ＨＭＧボックスコンストラクト）は、ＲＡＧＥに結合できなかった。
【0051】
ＢＬＩを使用した動態分析により、ＥＬＩＳＡの結果を確認したが（図６Ｂ）、２つの例外があった。ＢＬＩ（図６Ｃ）において、ＤＳ－ＨＭＧＢ１ １～１８４は、ＤＳ－ＨＭＧＢ１よりも低い親和性を有していたＥＬＩＳＡと比較して、わずかに速い解離速度も有したが、すべての他のコンストラクトよりもはるかに高いＲＡＧＥ結合親和性を有した。３Ｓ－ＨＭＧＢ１は、ＤＳ－又はＦＲ－ＨＭＧＢ１と同等の量のＲＡＧＥに結合し、親和性はＦＲ－ＨＭＧＢ１に類似であったが、全体的な動態速度ははるかに遅く、一方でＥＬＩＳＡでは、ＤＳ－ＨＭＧＢ１と同等のＲＡＧＥに対する親和性及び結合能力を有した。ＢＬＩにおけるＲＡＧＥへのすべての他のＨＭＧＢ１コンストラクトの結合は、ＥＬＩＳＡにより得られた結果を再現した。両者のアッセイにおける、ＦＲと比較して高い、ＲＡＧＥに対するＤＳ－ＨＭＧＢ１の親和性は、より高速な結合速度（ｋｏｎ）に起因していたが、一方で解離速度（ｋｏｆｆ）は、これらの２つの酸化還元形態でほぼ同一であった。対照的に、ＤＳ－ＨＭＧＢ１に近い結合速度を有したｄＢＢ１２Ｌは、非常に不安定な結合を示し、非常に高い解離速度を呈した。ＤＳ－ＨＭＧＢ１ １～１６４はまた、全長ＤＳ－ＨＭＧＢ１よりも全体的に低い結合親和性であるがｄＢＢ１２Ｌ－ＨＭＧＢ１よりも高い親和性で、より高速なＲＡＧＥ結合平衡を有し、ｄＢＢ１２ＬにおけるボックスＢ内の最後の１０個の残基（１７５～１８４）及びボックスＡ内のジスルフィド架橋（それをボックスＢと置換することによる）の欠失により、ＲＡＧＥの不安定な結合が生じた。
【0052】
ＨＭＧＢ１は、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、及びＲＡＧＥに結合し、すべての受容体からのシグナル伝達は、ＮＦ－κβ経路に収束する[25]。結果として、下流の炎症促進性サイトカイン産生を所与の受容体に帰属させることは困難である。したがって、本発明者らは、まず、ＴＬＲ２又はＴＬＲ４の発現、及びそれらの共受容体の発現をさせるように操作されたＮＦ－κβレポーター細胞系を使用して、ＴＬＲ特異的シグナル伝達を評価した。ジスルフィドＨＭＧＢ１は、ＴＬＲ２（図６Ｄ）及びＴＬＲ４（図６Ｅ）を介してＮＦ－ｋＢシグナル伝達を促進した。対照的に、ｄＢＢ１２Ｌは、いずれの細胞型においてもシグナル伝達できなかった。次に、本発明者らは、初代ヒト単球に対する様々なＨＭＧＢ１コンストラクトの作用を確認した。ＤＳ－ＨＭＧＢ１は、ＴＬＲ２リガンド、例えば、ＬＴＡと相乗作用して炎症促進性シグナル伝達を促進することが報告されている[34]。本発明者らは、ＤＳ－ＨＭＧＢ１が、ＬＴＡと相乗作用して、ＬＴＡ又はＤＳ－ＨＭＧＢ１単独よりも高いＴＮＦ産生を促進したことを確認した。対照的に、ｄＢＢ１２Ｌ又はＦＲ－ＨＭＧＢ１は、この相乗作用を示さず、単独で、培地単独よりも高いＴＮＦ分泌を誘起できなかった（図６Ｆ）。ＤＳ－ＨＭＧＢ１及びＴＬＲ４リガンドＬＰＳを用いた相乗応答については、説明されていない。ＬＰＳと組み合わせた場合、ＤＳ－ＨＭＧＢ１は、ＬＰＳ単独と同程度に、初代ヒト単球によるＴＮＦ発現を促進した。対照的に、ＦＲ－ＨＭＧＢ１又はｄＢＢ１２Ｌは、単独で、ＴＮＦ産生を促進しなかった。しかしながら、ＬＰＳと組み合わせた場合、ＦＲ－ＨＭＧＢ１又はｄＢＢ１２Ｌは、ＬＰＳ単独と比較して、ＴＮＦ発現を低減させた。
【0053】
まとめると、これらのデータは、ｄＢＢ１２Ｌが、同種リガンドの存在下においてさえも、ＴＬＲ２又はＴＬＲ４を介してシグナル伝達せず、ＲＡＧＥに対した大幅に減少した親和性を有することを示す。
【0054】
ｄＢＢ１２Ｌコンストラクトは、ＦＲ－ＨＭＧＢ１のものに匹敵する再生促進活性を有する
遠位傷害は、幹細胞をＧＡｌｅｒｔに移行させることが、これまでに示されている[12]。したがって、本発明者らは、まず、対側肢への傷害に対するＦＲ－ＨＭＧＢ１の骨格筋幹細胞のトランスクリプトーム応答を比較した。ＦＲ－ＨＭＧＢ１又は遠位傷害によって上方及び下方調節される遺伝子は、非常に類似しており（図７Ａ）、上方調節される主要な経路は、ミトコンドリア代謝、酸化的リン酸化、及び細胞周期（図７Ｂ）を含む、ＧＡｌｅｒｔと関連するものであった[7, 12]。興味深いことに、ＣＸＣＲ４は、最も高度に調節された遺伝子のうちの１つであった。
遠位傷害は、幹細胞をＧＡｌｅｒｔに移行させることが、これまでに示されている[12]。したがって、本発明者らは、まず、対側肢への傷害に対するＦＲ－ＨＭＧＢ１の骨格筋幹細胞のトランスクリプトーム応答を比較した。ＦＲ－ＨＭＧＢ１又は遠位傷害によって上方及び下方調節される遺伝子は、非常に類似しており（図７Ａ）、上方調節される主要な経路は、ミトコンドリア代謝、酸化的リン酸化、及び細胞周期（図７Ｂ）を含む、ＧＡｌｅｒｔと関連するものであった[7, 12]。興味深いことに、ＣＸＣＲ４は、最も高度に調節された遺伝子のうちの１つであった。
【0055】
次に、本発明者らは、骨格筋傷害の検証済みのマウスモデルを使用して、ＦＲ－ＨＭＧＢ１の最適なin vivo治療用量を判定した[7, 12]。本発明者らは、０．７５ｍｇ／ｋｇ（２９ｎｍｏｌ／ｋｇ）が、最大の応答をもたらし、より高い用量で再生活性にさらなる改善がなかったことを見いだした（図７Ｃ）。本発明者らはまた、傷害後のin vivo投与の最適な時間も評価した。ＦＲ－ＨＭＧＢ１は、最大で傷害５時間後までに注入された場合、修復を促進するのに有効であることが見いだされた（図７Ｄ）。その後は、改善はなかった。本発明者らは、次いで、静脈内投与後の循環中のＦＲ－ＨＭＧＢ１の半減期について調べた。本発明者らは、初期の急速なクリアランス（ｔ１／２約１１分）、続いて後続のより緩徐なクリアランス速度（ｔ１／２約１２０分）があったことを見いだした（図７Ｅ）。これは、ヒトにおける２５分の半減期と一致し[50]、このタンパク質は、ハプトグロビンに結合することによってクリアランスされる[51, 52]。
【0056】
本発明者らは、ＦＲ－ＨＭＧＢ１が、傷害後に、幹細胞及び前駆細胞のＧＡｌｅｒｔへの移行を促進することによって、骨格筋、骨、及び血液の再生を加速させることを、これまでに示している[7]。哺乳動物の心臓には有意な幹細胞は存在せず、傷害後の新しい心筋細胞の大半は、既存の心筋細胞に由来する[53]。したがって、本発明者らは、ＦＲ－ＨＭＧＢ１の投与が、心臓再生を促進するかどうかを評価した。本発明者らは、心筋梗塞時における静脈内注入が、生存率の増強をもたらしたことを見いだした（ＰＢＳ対照における５２％と比較して、ＦＲ－ＨＭＧＢ１で治療したマウスでは８３％）（図７Ｆ）。ＦＲ－ＨＭＧＢ１は、５週間にわたって連続的ＭＲＩスキャンによって評価される梗塞サイズにおよそ６０％の低減をもたらし（図７Ｈ）、全体的な左室駆出分画に１６％の改善をもたらした（図７Ｇ）。
【0057】
最後に、本発明者らは、in vivoでの骨格筋再生の促進におけるｄＢＢ１２Ｌの有効性を、ＦＲ－ＨＭＧＢ１と比較して評価した。最適用量（２９ｎＭ／ｋｇ）のＦＲ－ＨＭＧＢ１又はｄＢＢ１２Ｌを注入したマウスは、中心核を有する再生している筋線維の平均断面積の増加によって判定した場合に、傷害後に同等に再生の加速を示した（図７Ｊ）[7, 12]。これは、ＦＲ－ＨＭＧＢ１について以前に説明されたように、１４日目に最も顕著であった[7]。
【0058】
考察
ＨＭＧＢ１は、組織修復治療薬として使用するためには、改変する必要がある
固体器官の修復を促進するための外因性幹細胞の投与に基づく治療法は、当初の見込みを果たすことができておらず[6, 54]、殺滅細胞は、免疫応答をトリガーすることで同じように効果を発揮する[55]。代替的で、可能性としてより有意義なアプローチは、常在する幹細胞及び前駆細胞を含む内因性再生修復過程を標的とすることである[56, 57]。プロスタグランジンデヒドロゲナーゼの阻害は、有望なアプローチであるが[58]、臨床移行までの進行には時間がかかっている[59]。成長因子の投与もまた、説明されているが[60, 61]、in vivoでのタンパク質分解によって制限される[62]。現時点では、複数の組織の再生を促進し、修復を加速させるための承認された治療薬は存在しない。
ＨＭＧＢ１は、組織修復治療薬として使用するためには、改変する必要がある
固体器官の修復を促進するための外因性幹細胞の投与に基づく治療法は、当初の見込みを果たすことができておらず[6, 54]、殺滅細胞は、免疫応答をトリガーすることで同じように効果を発揮する[55]。代替的で、可能性としてより有意義なアプローチは、常在する幹細胞及び前駆細胞を含む内因性再生修復過程を標的とすることである[56, 57]。プロスタグランジンデヒドロゲナーゼの阻害は、有望なアプローチであるが[58]、臨床移行までの進行には時間がかかっている[59]。成長因子の投与もまた、説明されているが[60, 61]、in vivoでのタンパク質分解によって制限される[62]。現時点では、複数の組織の再生を促進し、修復を加速させるための承認された治療薬は存在しない。
【0059】
本発明者らは、これまでに、ＦＲ－ＨＭＧＢ１の外因性投与が、常在する幹細胞及び前駆細胞を、組織傷害時に修復を実行するために放出される適切な活性化因子に容易に応答できるＧＡｌｅｒｔに移行させることによって、骨、骨格筋、及び血液の再生を加速させるのに有効であることを示している[7]。外傷後に患者において検出される全身性ＤＳ－ＨＭＧＢ１の大半は、第２の放出事象において分泌されるが[50]、in vivoで傷害の部位において局所的なＦＲ－ＨＭＧＢ１からＤＳ－ＨＭＧＢ１への変換を裏付ける証拠が集まっている[18, 19]。したがって、有害な炎症促進性シグナル伝達の可能性により、天然のＦＲ－ＨＭＧＢ１を治療薬として使用することは排除される。
【0060】
ジスルフィドＨＭＧＢ１は、ＴＬＲ４[24, 30]、ＴＬＲ２[24, 34, 35]、又はＲＡＧＥ[14, 63]を通じてシグナル伝達して、炎症促進性サイトカインの発現を誘導し得る。ＤＳ－ＨＭＧＢ１によるＴＬＲ４シグナル伝達は、ＴＮＦ[28]を含むいくつかの炎症促進性サイトカインの産生をもたらすが、ＴＬＲ２シグナル伝達は、血栓症及び再灌流傷害[64]、並びに自己免疫障害[33]を含む、複数の過程において有害であることが示されている。ＲＡＧＥを介したＤＳ－ＨＭＧＢ１シグナル伝達は、血小板活性化及び血栓の形成を促進する好中球によるＮＥＴ形成において重要な役割を果たす[23, 64～66]。３つすべての受容体は、最終的に、ＮＦ－κβに収束し[25, 67]、３つすべての受容体を介して炎症促進性サイトカインの相乗的発現をもたらす[68, 69]。したがって、治療薬としてのＨＭＧＢ１の開発は、３つすべての受容体を介したシグナル伝達を排除するように分子を操作することに大きく依存する。
【0061】
ボックスＡ及びボックスＢは、共通のペプチドパターンに起因して、独立してＣＸＣＬ１２に結合する
ＦＲ－ＨＭＧＢ１の再生活性は、ＣＸＣＬ１２とのヘテロ複合体の形成及びＣＸＣＲ４を介したシグナル伝達に大きく依存する。ＣＸＣＬ１２は、ＨＭＧボックスに結合することが公知であるが[42, 70]、関与する構造モチーフは不明なままであり、提案されている残基がほとんどない[47, 71]。このシグナル伝達が、造血幹細胞の休止を強制することを含め、ＣＸＣＲ４軸を介したＣＸＣＬ１２のホモ二量体に関与するか、又は走化性を促進するＣＸＣＬ１２モノマーに関与するかについても、不明である[72～74]。
ＦＲ－ＨＭＧＢ１の再生活性は、ＣＸＣＬ１２とのヘテロ複合体の形成及びＣＸＣＲ４を介したシグナル伝達に大きく依存する。ＣＸＣＬ１２は、ＨＭＧボックスに結合することが公知であるが[42, 70]、関与する構造モチーフは不明なままであり、提案されている残基がほとんどない[47, 71]。このシグナル伝達が、造血幹細胞の休止を強制することを含め、ＣＸＣＲ４軸を介したＣＸＣＬ１２のホモ二量体に関与するか、又は走化性を促進するＣＸＣＬ１２モノマーに関与するかについても、不明である[72～74]。
【0062】
ペプチドアレイにより、本発明者らがＨＭＧＢ１－ＣＸＣＬ１２相互作用に関与する残基[75]を特定することが可能となった。本発明者らは、ボックスＡ及びボックスＢに存在するＣＸＣＬ１２に対する２つのペプチド結合領域の一般的なパターンを特定した。それぞれのＨＭＧボックスにおいて、第１のペプチド領域は、Ｎ末端の可動性セグメントからヘリックスＩＩの半分に延在し、グリチルリチン結合部位とオーバーラップし[41]、第２のものはヘリックスＩＩＩのＣ末端側部分にある。本発明者らは、アラニン変異を使用してこれらの残基の重要性を確認し、ＢＬＩによって隣接可動性領域の重要性も確認し、それらの除去がＣＸＣＬ１２の解離速度の劇的な増加をもたらすことを確認した。また、ＢＬＩにより、それぞれのボックスが、ボックス間の協同性を伴わずに、類似の親和性で、独立して、ＣＸＣＬ１２モノマーに結合し得ることも確認した。さらに、ＨＥＰＥＳ緩衝液の使用により、ＣＸＣＬ１２二量体化を防止したことで[76]、本発明者らは、それぞれのボックスが、モノマーのＣＸＣＬ１２に結合でき、ＣＸＣＬ１２の二量体化は、複合体の形成の必要条件ではないと結論付けることができた。このモデルは、ＣＸＣＲ４を介したＨＭＧＢ１－ＣＸＣＬ１２ヘテロ複合体の提案されていたシグナル伝達機序と一致する[72]。
【0063】
本発明者らは、次いで、ＮＭＲを使用して、可動性隣接領域を含め、その不在が、完全又はヘリックスのみのＨＭＧボックスＢコンストラクトのいずれかに結合したときにＣＸＣＬ１２により誘導される変化の減少をもたらした、ペプチドアレイによって特定されたペプチド領域の重要な役割を確認した。これは、ヘリックスのみのＨＭＧボックスＢコンストラクトについてＢＬＩにおいて観察された、隣接領域を含むものと比較して速い解離速度と一致する。本発明者らはまた、ＢＬＩにおいて全長ボックスＢについてボックスＡと比較してより高速な交換結合平衡が観察されること、及びさらにはペプチドアレイにおけるボックスＢのＣＸＣＬ１２結合配列についてより弱いシグナルを裏付ける、ボックスＡと比較して弱いシグナル（ピーク広がり）をボックスＢについて観察した。一部の残基は、ペプチドアレイにおいてフラグ付けされていなかったにもかかわらず、ＮＭＲにおいてシフト変化を呈した。これらは、配列とは独立した結合への寄与、例えば、主鎖相互作用又はＣＸＣＬ１２に結合し、付近の位置に影響を及ぼす他の残基の中継作用を表し得る。
【0064】
本発明者が、ＮＭＲ及びペプチドアレイで判定したＣＸＣＬ１２結合に関与する残基を、ＨＭＧＢ１ １～１６４（ＰＤＢ ２ＹＲＱ）の構造に重ね合わせると、それぞれのボックスドメイン内にポケットが特定されたが、残基の側鎖がすべてそのポケットの中心に整列していた。アラニンスキャン及びＮＭＲで特定された残基は、グリチルリチン結合部位も含むボックスＢに凹部表面を形成する（図３Ｂ、破線の円形）。対照的に、ＮＭＲにおける変化のみを示す残基のうちのいくつかは、側鎖がこのポケットから外側に向いており、配列とは独立したＣＸＣＬ１２への結合（主鎖に媒介される）、又は、それらがＣＸＣＬ１２結合時のＨＭＧボックスの他の部分における間接的な化学環境の変化によって影響を受けることが示唆される。
【0065】
このＣＸＣＬ１２結合の詳細な理解により、本発明者らは、ＴＬＲ４、ＴＬＲ２、及びＲＡＧＥを介した炎症促進性シグナル伝達を排除するようにコンストラクトを設計することができた。このコンストラクトは、野生型ＨＭＧＢ１のものに類似の長さのリンカーによって分離されたタンデムの２つのＨＭＧボックスＢドメインからなり（ｄＢＢ１２Ｌ）、これは、ボックスＡがボックスＢで置きかえられているため、酸化されないが、２つのＨＭＧボックスが存在するため依然としてＣＸＣＬ１２に結合するはずである。ｄＢＢ１２Ｌは、１～１６４ ＦＲ－ＨＭＧＢ１又は全長ＦＲ－ＨＭＧＢ１程度に安定であり、臨床的に関連する緩衝液条件（ＰＢＳ、生理食塩水溶液）中で同等に熱安定性であり、長期間の保管時に凝集も分解も伴わなかった。ｄＢＢ１２Ｌの表面積及び荷電プロファイルもまた、ＨＭＧＢ１ １～１６４のものと同様であり、ＳＥＣにおける単分散性プロファイル及びネイティブＥＳＩ／ＭＳにおける分布電荷を有した。この類似性は、ｄＢＢ１２Ｌと、２つのＨＭＧボックス及びリンカー領域（ＦＲ－ＨＭＧＢ１ １～１６４）を有するが酸性テールを有さない野生型ＨＭＧＢ１コンストラクトとの間の溶液中での類似の立体構造を反映している。
【0066】
操作されたｄＢＢ１２Ｌコンストラクトは、ＴＬＲ２若しくはＴＬＲ４を介してシグナル伝達せず、ＲＡＧＥに結合することもないが、完全な再生促進特性を保持する
ＴＬＲ４／ＭＤ－２へのＨＭＧＢ１の結合は、十分に説明されている[29]。酸化型ボックスＡは、ＴＬＲ４と相互作用することによってＤＳ－ＨＭＧＢ１の結合を開始し、ボックスＢは、ＭＤ－２に結合することによってこの相互作用を安定化し、ボックスＢ内のＦＣＳＥモチーフは、シグナル伝達に必須であることが示されている[30]。ＤＳ－ＨＭＧＢ１は、ＴＬＲ４／ＭＤ－２を介してそれ自体でシグナル伝達できるが、それはまた、ＬＰＳに結合し、ＴＬＲ４／ＭＤ－２への伝達及び認識を促進するＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）と置換することによって、ＬＰＳを介したシグナル伝達を促進することもできる[13]。本発明者らのｄＢＢ１２ＬコンストラクトにおけるボックスＡの欠失は、ＴＬＲ４を介したシグナル伝達を効果的に排除する。興味深いことに、本発明者らは、ＦＲ－ＨＭＧＢ１及びｄＢＢ１２Ｌが、ＬＰＳに応答して、単球によるＴＮＦ発現を減少させることを観察した。これは、これらのタンパク質がＬＰＳに結合することに起因する可能性があるが、培養培地の血清中に存在する[77]ＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）と効果的に置換できる[13]ＤＳ－ＨＭＧＢ１とは異なり、酸化型ボックスＡの欠如に起因して、それをＴＬＲ４／ＭＤ２に伝達できないためであるかもしれない。
ＴＬＲ４／ＭＤ－２へのＨＭＧＢ１の結合は、十分に説明されている[29]。酸化型ボックスＡは、ＴＬＲ４と相互作用することによってＤＳ－ＨＭＧＢ１の結合を開始し、ボックスＢは、ＭＤ－２に結合することによってこの相互作用を安定化し、ボックスＢ内のＦＣＳＥモチーフは、シグナル伝達に必須であることが示されている[30]。ＤＳ－ＨＭＧＢ１は、ＴＬＲ４／ＭＤ－２を介してそれ自体でシグナル伝達できるが、それはまた、ＬＰＳに結合し、ＴＬＲ４／ＭＤ－２への伝達及び認識を促進するＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）と置換することによって、ＬＰＳを介したシグナル伝達を促進することもできる[13]。本発明者らのｄＢＢ１２ＬコンストラクトにおけるボックスＡの欠失は、ＴＬＲ４を介したシグナル伝達を効果的に排除する。興味深いことに、本発明者らは、ＦＲ－ＨＭＧＢ１及びｄＢＢ１２Ｌが、ＬＰＳに応答して、単球によるＴＮＦ発現を減少させることを観察した。これは、これらのタンパク質がＬＰＳに結合することに起因する可能性があるが、培養培地の血清中に存在する[77]ＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）と効果的に置換できる[13]ＤＳ－ＨＭＧＢ１とは異なり、酸化型ボックスＡの欠如に起因して、それをＴＬＲ４／ＭＤ２に伝達できないためであるかもしれない。
【0067】
ＨＭＧＢ１とＴＬＲ２との間の相互作用は、あまり詳細に説明されておらず、ＨＭＧＢ１がそれ自体でＴＬＲ２シグナル伝達を誘導できるか[24, 36]、又は活性を誘導するために共リガンドを必要とするかに関して、及びこの応答がタンパク質の酸化還元状態に依存するかどうかについても[34, 35]、いくらかの論議が存在する。ＨＭＧＢ１単独ではＴＬＲ２応答を誘導できなかった公開されているデータは、血清の不在下[35]、又は低いＨＭＧＢ１濃度[34]のいずれかで行われたものであり、ＨＭＧＢ１単独は、ＴＬＲ２を通じたシグナル伝達能力をいくらか保持するが、より高いレベルの応答を誘導するためには共リガンドが必要であることが示唆される。結合が、少なくとも１つのＨＭＧボックスに関与するはずであること[33]、及び、酸性テールがＴＬＲ２との結合を負に調節すること[35]が、公知である。本発明者らは、ＤＳ－ＨＭＧＢ１が、単独で、ＴＬＲ２を介してシグナル伝達でき、その作用が血清含有培地中のＬＴＡの存在によって増強されたことを見いだした。しかしながら、ＬＴＡと相乗作用しないＦＲ－ＨＭＧＢ１に対してもｄＢＢ１２Ｌに対しても、応答は存在しなかった。これは、ＴＬＲ４と同様に、ＴＬＲ２に媒介される応答にはジスルフィド架橋を有する酸化型ボックスＡが必要であること、及びＴＬＲ２共リガンドが、可能性としては酸性テールを転置させてＴＬＲ２相互作用を促進することによって、ＤＳ－ＨＭＧＢ１と相乗作用することを示唆する。
【0068】
ＨＭＧＢ１内のＲＡＧＥ結合部位（残基１５０～１８３）は、これまでに説明されている[14]。同様のモチーフは、他のＲＡＧＥリガンド、例えば、Ｓ１００タンパク質にも存在し、これらの配列に相同なペプチドは、ＨＭＧＢ１に媒介されるＲＡＧＥシグナル伝達の有効なアンタゴニストである[37, 78]。ＨＭＧＢ１の酸性テールは、ＲＡＧＥ結合ペプチドと残基が共通しており[15]、ＴＬＲ２結合におけるその役割と類似して、ＲＡＧＥ相互作用の調節因子として提案されている。しかしながら、ＨＭＧＢ１のジスルフィド形態のみが、ＲＡＧＥを介した血栓形成促進活性に特異的に関連付けられている[22]。本発明者らは、ｄＢＢ１２Ｌを含め、ＲＡＧＥ結合ペプチドが欠如しているコンストラクトが、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＲＡＧＥに結合できないことを見いだした。ＤＳ－ＨＭＧＢ１とは対照的に、また興味深いことには、３Ｓ－ＨＭＧＢ１も、ＦＲ－ＨＭＧＢ１よりも良好にＲＡＧＥに結合できた。本発明者らが、ＢＬＩを使用して相互作用の動態を分析したとき、本発明者らのＥＬＩＳＡデータと一致して、ｄＢＢ１２Ｌが、ＲＡＧＥに対して、ＦＲ－ＨＭＧＢ１及びＤＳ－ＨＭＧＢ１と比較して、低い親和性を有することを見いだした。ｄＢＢ１２Ｌは、可能性としてはこのコンストラクトにおける２つの部分的なＲＡＧＥ結合ドメインの存在に起因して、ＦＲ－ＨＭＧＢ１よりも３倍高い会合速度を有したが、解離速度は、５倍高く、これは全体として不安定で弱い結合を示した。ＥＬＩＳＡに付随する広範な洗浄は、それぞれのアッセイにおいて異なるＨＭＧＢ１コンストラクトの挙動をもたらす解離速度の作用を強調し、平衡時の結合状態を表す。例えば、ＢＬＩにおいてＦＲ－ＨＭＧＢ１に類似するＲＡＧＥに対する親和性を有する３Ｓ－ＨＭＧＢ１は、その解離速度がＦＲ－ＨＭＧＢ１又はＤＳ－ＨＭＧＢ１のものよりもはるかに低く、結果としてＲＡＧＥが結合したままとなることに起因して、ＥＬＩＳＡにおいてははるかに高い見かけの親和性を示す。このＲＡＧＥ結合の増加は、部分的に、心筋梗塞のマウスモデルにおいて見られる対照と比較した線維症の増加を説明し得るが、一方で、ＦＲ－ＨＭＧＢ１は、再生を促進させ、機能を向上させた[32]。ＳＰＲを使用して、３Ｓ－ＨＭＧＢ１が、非常に高い親和性でＲＡＧＥに結合する可能性が高いことも示されているが、ＦＲ－ＨＭＧＢ１との比較は行われていなかった[64]。本発明者らは、ＢＬＩを使用したＤＳ－ＨＭＧＢ１のＲＡＧＥに対する親和性（Ｋｄ＝０．２～１．３μＭ）が、ＳＰＲを使用してこれまでに報告されていたものに類似であったことを見いだした（０．１[79]～０．６５μＭ[22]）。本発明者らのＢＬＩデータはまた、酸性テールの消失が、ＨＭＧＢ１のＲＡＧＥに対する親和性を増加させるが高い解離速度に起因して安定性の低い結合をもたらし、一方でＲＡＧＥ結合ペプチドの短縮又はボックスＡの還元は、解離速度を大幅に増加させ、不安定な結合をもたらすことを示す。興味深いことに、酸化型ボックスＡ単独では、ＲＡＧＥに結合することが不可能であり、相互作用が、ＲＡＧＥ結合ペプチドによって開始される可能性が高いことが示唆される。ｄＢＢ１２ＬにおけるＲＡＧＥ結合ペプチドの短縮とともに、ボックスＡの不在は、ＲＡＧＥ親和性の大幅な低減、及びＦＲ－又はＤＳ－ＨＭＧＢ１のいずれかと比較してもより高速な解離速度に起因して、一旦結合したＲＡＧＥを保持する能力の低減をもたらす。
【0069】
本発明者らは、骨格筋幹細胞においてＦＲ－ＨＭＧＢ１によって誘導されるトランスクリプトームの変化が、遠位傷害によって誘導されるものに非常に類似しており、ミトコンドリア代謝、酸化的リン酸化、及び細胞周期ＧＡｌｅｒｔの経路の上方調節と一致する[80, 81]ことを見いだした。ＨＭＢＧ１によるＣＸＣＲ４発現の上方調節は、その作用を増強させる可能性がある。ＦＲ－ＨＭＧＢ１が傷害から５時間以内に投与された場合にのみ有効であることを示す本発明者らのデータは、それが幹細胞をＧＡｌｅｒｔに移行させることによって作用することと一致する。これよりも後の時点では、幹細胞は、活性化されており、したがって、ＧＡｌｅｒｔに入ることができない。筋肉幹細胞は、傷害の５～６時間後にその部位に遊走し、およそ１２時間で活性に分化を開始することが示されている[82]。本発明者らは、ｄＢＢ１２Ｌが、ＦＲ－ＨＭＧＢ１と同等にin vivoで再生活性を保持することを確認した。重要なことに、本発明者らは、心筋梗塞の際に静脈内投与されたＦＲ－ＨＭＧＢ１が、生存率の改善、梗塞サイズの低減、左室駆出分画の改善をもたらしたことを見いだした。これらのデータに基づいて、本発明者らは、ｄＢＢ１２Ｌの投与が、修復を幹細胞に依存する組織、例えば、骨、骨格筋、及び血液、並びに再生が主として成熟細胞集団、例えば、心臓における心筋細胞に依存している組織の再生も促進すると予測する。本発明者らはまた、ｄＢＢ１２Ｌが、傷害後５時間以内に投与された場合に、有効である可能性が高いと予測する。これは、米国においてＭＩ後に病院に収容されるまでの中央値時間が３時間であるため、重要である[83]。米国においておよそ８００，０００人が、毎年心筋梗塞を患っており[83]、およそ２０～３０％が、心不全を発症する。２０１２年の米国における心不全の医療費が３００億ドルを上回り、２０３０年までに７００億ドルに増加する見込みであるにもかかわらず、５年生存率は約６０％にすぎず、これは、ほとんどのがんよりも悪い[83]。本発明者らのデータに基づいて、本発明者らは、事象から５時間以内のｄＢＢ１２Ｌの投与が、心筋梗塞、特に、ＳＴ上昇型心筋梗塞を経験する患者の生存率を高め、梗塞サイズの低減及び駆出分画の保存を通じて、心不全の発生率及び重症度を低減すると予測する。マウス[32, 84, 85]及びヒツジ[86]モデルにおいて、梗塞の４時間後に梗塞周囲の領域において心筋にＦＲ－ＨＭＧＢ１を直接注入することが、心臓修復を促進するのに有効であることを示しているものがある。静脈内投与の有効性を示している本発明者らのデータは、この経路が、臨床用途に容易に適用可能であるため、重要である。
【0070】
結論として、ＣＸＣＬ１２結合に重要なＨＭＧＢ１の部位をマッピングし、ＴＬＲ２又はＴＬＲ４を介してシグナル伝達せず、ＲＡＧＥに効果的に結合できないコンストラクト（ｄＢＢ１２Ｌ）を設計した。ＦＲ－ＨＭＧＢ１は、短い半減期にかかわらず、遠位傷害に類似の様式で、幹細胞をＧＡｌｅｒｔに移行させ、傷害後５時間以内に投与した場合に有効である。さらに、ｄＢＢ１２Ｌは、ＦＲ－ＨＭＧＢ１と同程度に有効にin vivoで組織再生を促進する。したがって、ｄＢＢ１２Ｌは、臨床への移行のために開発できる。
【0071】
概要
還元型高移動度群ボックス１（ＨＭＧＢ１）タンパク質は、ＣＸＣリガンド１２（ＣＸＣＬ１２）に結合し、ＣＸＣ受容体４（ＣＸＣＲ４）を通じて、組織及び再生を促進するようにシグナル伝達し、幹細胞及び前駆細胞をＧＡｌｅｒｔに移行させることによって、修復を加速させる。しかしながら、ＦＲ－ＨＭＧＢ１のジスルフィド形態（ＤＳ－ＨＭＧＢ１）への局所的な変換は、Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）及び４（ＴＬＲ４）並びに終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）を介したシグナル伝達を通じて有害な炎症をもたらし得る。したがって、臨床診療において組織再生を促進するためにＨＭＧＢ１を投与することを考慮する前に、これらの有害となる可能性のある炎症促進性作用を排除するように分子を操作することが重要である。
還元型高移動度群ボックス１（ＨＭＧＢ１）タンパク質は、ＣＸＣリガンド１２（ＣＸＣＬ１２）に結合し、ＣＸＣ受容体４（ＣＸＣＲ４）を通じて、組織及び再生を促進するようにシグナル伝達し、幹細胞及び前駆細胞をＧＡｌｅｒｔに移行させることによって、修復を加速させる。しかしながら、ＦＲ－ＨＭＧＢ１のジスルフィド形態（ＤＳ－ＨＭＧＢ１）への局所的な変換は、Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）及び４（ＴＬＲ４）並びに終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）を介したシグナル伝達を通じて有害な炎症をもたらし得る。したがって、臨床診療において組織再生を促進するためにＨＭＧＢ１を投与することを考慮する前に、これらの有害となる可能性のある炎症促進性作用を排除するように分子を操作することが重要である。
【0072】
本発明者らは、ペプチドアレイ、バイオレイヤーインターフェロメトリー、及び核磁気共鳴の組合せを使用して、ＨＭＧＢ１－ＣＸＣＬ１２ヘテロ複合体の形成に関与する残基を特定した。これらのデータを、炎症促進性受容体との相互作用の部位に関する入手可能な文献と組み合わせることで、本発明者らは、２つのＨＭＧ Ｂボックスをタンデムで含むコンストラクト（ｄＢＢ１２Ｌ）を設計し、これは、Ｃ末端酸性テールを有さない野生型の完全還元型ＨＭＧＢ１コンストラクトのものに類似の安定性及び立体構造を有する。明細書に示されるように、ｄＢＢ１２Ｌは、それらの共リガンドの存在下においてさえも、ＴＬＲ２又はＴＬＲ４を通じてシグナル伝達を行わず、大幅に減少したＲＡＧＥ結合を有する。さらに、ｄＢＢ１２Ｌコンストラクトは、in vivoにおいてＦＲ－ＨＭＧＢ１と同等の再生活性を保持する。
【0073】
パテントランドスケープ及び科学文献の包括的な考察により、ＴＬＲ４のシグナル伝達を防止するためにシステインをセリンと置換することについて記載している米国特許出願公開第2015/0203551号が特定されたが、しかしながら、このコンストラクトは、心筋梗塞後に過剰な心臓線維症をもたらすことが示されている(17)。さらに、このコンストラクトは、ＲＡＧＥについてはＦＲ－ＨＭＧＢ１と比較してより緩徐な解離を有し、その結果、ここで図６Ｂに示されるように、平衡後にＲＡＧＥがより長く結合したまま残ることになり）、したがって、これらの置換は、本発明者らのコンストラクトでは回避された。米国特許出願公開第2009/0069227号（Ａ９）は、幹細胞遊走及び増殖を促進するＨＭＧＢ１コンストラクトが、アミノ酸１～１８７（本発明者らのデータでは０～１８６、０がＮ末端のＭｅｔ）を含む必要があることを明記しており、米国特許第9,623,078号は、心臓再生に関してアミノ酸１～４４（本発明者らのデータでは０～４３）に限定されるペプチドに言及している。米国特許出願公開第2009/0202500号は、組織修復のための方法を開示しているが、全長（１～２１５）野生型ＨＭＧＢ１（本発明者らのデータでは０～２１４）にしか言及していない。明細書に提示されるｄＢＢ１２Ｌコンストラクトは、ＲＡＧＥ結合もＴＬＲ４／２シグナル伝達も有さず、１１７個のアミノ酸の長さであり、これまでに説明されていなかったアミノ酸置換を含む。したがって、明細書に提示されるコンストラクトは、先行技術の範囲内には含まれない。
【0074】
臨床適用
本発明は、内因性再生過程を利用して組織修復を増強させるポリペプチド及び方法を提供する。本ポリペプチドは、２つのＣＸＣＬ１２分子とヘテロ複合体を形成し、それが、ＣＸＣＲ４、おそらくは細胞表面上の２つの隣接するＣＸＣＲ４受容体を介してシグナル伝達することによって、組織再生を促進する、完全還元型の野生型ＨＭＧＢ１と同様に機能する。
本発明は、内因性再生過程を利用して組織修復を増強させるポリペプチド及び方法を提供する。本ポリペプチドは、２つのＣＸＣＬ１２分子とヘテロ複合体を形成し、それが、ＣＸＣＲ４、おそらくは細胞表面上の２つの隣接するＣＸＣＲ４受容体を介してシグナル伝達することによって、組織再生を促進する、完全還元型の野生型ＨＭＧＢ１と同様に機能する。
【0075】
本発明者らのデータは、本発明のポリペプチド（ｄＢＢ１２Ｌ）が、類似の様式で作用することを示す。したがって、ｄＢＢ１２Ｌが、修復に関してＣＸＣＲ４＋細胞に依存する組織の再生を促進することが期待される。そのような組織としては、修復が主として幹細胞及び前駆細胞に依存する組織、例えば、骨格筋及び造血系、並びに修復が大部分を既存の成熟細胞、例えば、成体哺乳動物の心臓における心筋細胞に依存する組織が挙げられる。
【0076】
可能性のある臨床適応症：
心筋梗塞後の心臓
この適応症は、臨床試験に適している。世界的に見て、虚血性心疾患は、１億５３００万人が罹患しており(101)、２０１７年には１０５，０００，０００を上回る障害調整年齢が失われている(102)。毎年、英国では２０５，０００人(103)及び米国では８０５，０００人が、心筋梗塞（ＭＩ）に罹患し、そのうち３８％が、ＳＴ上昇型ＭＩ（ＳＴＥＭＩ）を経験している(101)。ＭＩ後に、個体のうちのおよそ３０～４０％が、心不全を発症し、世界中で３８００万人が罹患している。２０１２年の米国における心不全の医療費が３００億ドルを上回り、２０３０年までに７００億ドルに増加する見込みであるにもかかわらず、５年生存率は約６０％にすぎず、これは、ほとんどのがんよりも悪い(101)。主要な標的集団は、ＭＩ後の患者、特に、心不全を発症する危険性にあるものである(104)。心臓損傷を制限し、ＭＩ後の再生を促進し、心不全の発症を予防する新規な治療薬は、罹患率及び死亡率を劇的に低減させ、医療費の負担を著しく低減させる。確実に心筋細胞壊死をもたらす確立されている(105～108)恒久的な結紮マウスＭＩモデル(109)を使用した決定的なデータは、傷害時のＦＲ－ＨＭＧＢ１の単回静脈内投薬が、生存率の増強［ＰＢＳ（プラセボで治療した群における５２％と比較して、ＦＲ－ＨＭＧＢ１で治療した動物では８３％］、並びに対照と比較して、絶対心臓駆出分画の約１６％の改善、及び５週間にわたってＰＢＳ対照と比較して梗塞サイズにおける約６０％の低減をもたらすことを示す（図７Ｆ）。
心筋梗塞後の心臓
この適応症は、臨床試験に適している。世界的に見て、虚血性心疾患は、１億５３００万人が罹患しており(101)、２０１７年には１０５，０００，０００を上回る障害調整年齢が失われている(102)。毎年、英国では２０５，０００人(103)及び米国では８０５，０００人が、心筋梗塞（ＭＩ）に罹患し、そのうち３８％が、ＳＴ上昇型ＭＩ（ＳＴＥＭＩ）を経験している(101)。ＭＩ後に、個体のうちのおよそ３０～４０％が、心不全を発症し、世界中で３８００万人が罹患している。２０１２年の米国における心不全の医療費が３００億ドルを上回り、２０３０年までに７００億ドルに増加する見込みであるにもかかわらず、５年生存率は約６０％にすぎず、これは、ほとんどのがんよりも悪い(101)。主要な標的集団は、ＭＩ後の患者、特に、心不全を発症する危険性にあるものである(104)。心臓損傷を制限し、ＭＩ後の再生を促進し、心不全の発症を予防する新規な治療薬は、罹患率及び死亡率を劇的に低減させ、医療費の負担を著しく低減させる。確実に心筋細胞壊死をもたらす確立されている(105～108)恒久的な結紮マウスＭＩモデル(109)を使用した決定的なデータは、傷害時のＦＲ－ＨＭＧＢ１の単回静脈内投薬が、生存率の増強［ＰＢＳ（プラセボで治療した群における５２％と比較して、ＦＲ－ＨＭＧＢ１で治療した動物では８３％］、並びに対照と比較して、絶対心臓駆出分画の約１６％の改善、及び５週間にわたってＰＢＳ対照と比較して梗塞サイズにおける約６０％の低減をもたらすことを示す（図７Ｆ）。
【0077】
骨格傷害モデルにおいて、ＦＲ－ＨＭＧＢ１の最適な用量は、０．７５ｍｇ／ｋｇ（図７Ｃ）であり、非常に短い半減期にも関わらず（図７Ｅ）、傷害の最大５時間後に静脈内投与された場合でさえも有効である(109)（図７Ｄ）。心筋梗塞後、虚血心筋の再灌流は、可能な限り早く達成されるべきである。例えば、ＳＴＥＭＩ後の患者は、経皮的介入を受けるはずである。データは、可能な限り早く、かつ最大で傷害後５時間以内でのＨＭＧＢ１の投与が、損傷した心筋を保存し、再生を促進することを示す。
【0078】
天然のＦＲ－ＨＭＧＢ１は、ＭＩ後に機能的回復を促進するが（図７Ｆ～７Ｉ）、ジスルフィド形態への局所的な変換により、血栓形成、並びにＲＡＧＥ、ＴＬＲ２、及びＴＬＲ４を介した伝達が促進される(110)。他者により報告されているコンストラクト、例えば、ＲＡＧＥ結合を保持する３Ｓ－ＨＭＧＢ１（図６Ｂ）は、ＭＩ後の過剰な線維症及び機能障害をもたらす(111)。ＦＲ－ＨＭＧＢ１もまた、ＤＳ－ＨＭＧＢ１よりも低い程度ではあるがＲＡＧＥに結合し、したがって、臨床使用に好適ではない。ＴＬＲ２を介したＨＭＧＢ１のシグナル伝達は、心筋梗塞後の虚血再灌流傷害(112)及び血栓症(110)において重要な役割を果たし、本発明者らは、ヒトアテローム性動脈硬化症(113)におけるＴＬＲ２の重要な役割を示している。ＴＬＲ４シグナル伝達もまた、心筋再灌流傷害において重要である(114)。心筋梗塞後の損傷した心臓の虚血性及び炎症した微小循環における酸化還元条件は、ＦＲ－ＨＭＧＢ１のジスルフィド形態（ＤＳ－ＨＭＧＢ１）への変換を促進させ、この形態は、血栓症の中心的な媒介因子である(110)。ＭＩ後に心臓再生を促進するための承認された治療法は存在しない。造血幹細胞の再生作用を示すと主張している報告は、否定されており(115)、殺滅細胞は、免疫応答をトリガーすることで同程度に有効である(116)。多能性幹細胞を含む他の細胞型を用いたとしても、不整脈原性、免疫抑制、拡張可能性、バッチ変動性、送達、長期実現性、及び有効性を含む相当な課題が残っている(115, 117)。細胞に基づく治療法の大規模な臨床研究は、機能の有意な改善を示さず、不整脈が患者において報告されている(118～120)。
【0079】
成体心臓における有意な幹細胞集団の不在(121)及び限定的な心外膜前駆細胞(122)は、傷害後の新しい心筋細胞の大半が既存の心筋細胞に由来しているという理解とともに、内因性経路を操作することによって再生を促進することに焦点をシフトさせた(121)。これには、複数の転写因子のアデノウイルス形質導入(105, 108)、発生経路、例えば、Hippo(106)若しくはMeis1(123)の操作、成長因子、例えば、ニューレグリン(124)、ＩＧＦ／ＨＧＦ(125)、若しくはＦＳＴＬ１(126)の付加、又はｍｉＲＮＡの操作(127)が含まれる。これらのアプローチは、重大な欠点を有する：アデノウイルス形質導入及び成長因子（ＩＦＧＦ１／ＨＧＦ）は、心臓内注入又は局所パッチ適用を必要とし（ＦＳＴＬ１）、発生経路の操作は、発癌の危険性を有し(128)、ブタにおけるｍｉＲＮＡ１９９－ａのウイルス形質導入は、致命的な不整脈をもたらした(127)。免疫細胞のクリアランスを促進することによって、心臓再生を刺激するための代替的な戦略は、ＶＥＧＦ－Ｃの反復注入を必要とする(129)。ＭＡＰ４Ｋ４の阻害は、心筋の生存を促進し、梗塞サイズを制限するが、再生作用はなかった(130)。現時点では、これらの戦略はいずれも、臨床試験には進んでいない。
【0080】
本発明は、心筋細胞の生存及び複数の組織の再生を促進するために内因性過程を標的とする固有の解決策を提供する。それは、抗線維性ＣＡＲ-Ｔ細胞(131)を含む、細胞療法と関連する多数の障害物、例えば、法外な費用(132、133)を打開する。ＦＲ－ＨＭＧＢ１は、細胞表面受容体ＣＸＣＲ４を介して作用するため、例えば、転写因子又はｍｉＲＮＡのアデノウイルス形質導入による、細胞内過程を標的とすることに関連する標的外作用を有することは予測されない。ＨＭＧＢ１阻害は、虚血再灌流傷害後の梗塞サイズを増加させ(134)、一方でＦＲ－ＨＭＧＢ１の局所的な上方調節(135、136)又は心筋内注入は、マウス(111, 137, 138)及びヒツジ(139)の両者で有効であることが示されているが、本発明者らのデータは、静脈内投与が、有効であり、すべての標的細胞に到達する可能性がより高いことを示している。有害な炎症促進性シグナル伝達を回避する本発明の操作された二重ボックスＢコンストラクトは、安全なはずである。
【0081】
ミラノのグループは、ＴＬＲ４シグナル伝達を無効にするために３つのシステインがセリンと置きかえられたＨＭＧＢ１アナログ（３Ｓ－ＨＭＧＢ１）について記載している(140)。彼らは、３Ｓ－ＨＭＧＢ１が、組織再生の促進においてＦＲ－ＨＭＧＢ１よりも優れていると主張しているが(141)、本発明者らは、これが当てはまることを見いだしていない(142)。重要なことに、３Ｓ－ＨＭＧＢ１は、マウスＭＩモデルにおいて線維症を促進させ、心臓機能の悪化を伴い、一方で、ＦＲ－ＨＭＧＢ１は、組織再生を促進させ、左室駆出分画を改善した(111)。本発明者らは、３Ｓ－ＨＭＧＢ１が、ＤＳ－ＨＭＧＢ１又はＦＲ－ＨＭＧＢ１のいずれかよりも長くＲＡＧＥに結合したままとなることを見いだしている（図５Ａ）。したがって、ＦＲ－ＨＭＧＢ１、３Ｓ－ＨＭＧＢ１、及びＤＳ－ＨＭＧＢ１は、平衡時に同等の量のＲＡＧＥに結合するが、時間とともに、３Ｓ－ＨＭＧＢ１によって結合されるＲＡＧＥのレベルは、炎症促進性ジスルフィドＨＭＧＢ１（ＤＳ－ＨＭＧＢ１）に匹敵し、ＦＲ－ＨＭＧＢ１よりも高くなる。本発明者らの二重ボックスＢコンストラクトは、望ましくない炎症促進性シグナル伝達を排除しながら、ＦＲ－ＨＭＧＢ１と同等の再生活性を保持する。
【0082】
追加の適用：
骨折
骨折は、傷害後に生じる。しかしながら、最も一般的な骨格の「傷害」の１つは、関節置換術又は関節形成術である。本発明者らは、ｄＢＢ１２を使用して、骨折又は関節形成術後の治癒を促進し、それによって、合併症の可能性、例えば、コンポーネントの緩みの危険性を低減できることを提案する。
骨折
骨折は、傷害後に生じる。しかしながら、最も一般的な骨格の「傷害」の１つは、関節置換術又は関節形成術である。本発明者らは、ｄＢＢ１２を使用して、骨折又は関節形成術後の治癒を促進し、それによって、合併症の可能性、例えば、コンポーネントの緩みの危険性を低減できることを提案する。
【0083】
脳及び神経系
ｄＢＢ１２Ｌは、卒中後の患者の予後を改善するために使用してもよい。他の可能性のある適応症としては、パーキンソン病及び認知症が挙げられる。
ｄＢＢ１２Ｌは、卒中後の患者の予後を改善するために使用してもよい。他の可能性のある適応症としては、パーキンソン病及び認知症が挙げられる。
【0084】
肺
ｄＢＢ１２Ｌは、肺傷害後、例えば、新型コロナウイルス感染後、又は特発性肺線維症を有する患者において、予後を改善することが企図される。
ｄＢＢ１２Ｌは、肺傷害後、例えば、新型コロナウイルス感染後、又は特発性肺線維症を有する患者において、予後を改善することが企図される。
【0085】
肝臓
米国の人口のうちの３０％が、非アルコール性肝疾患に罹患していると推定される。これらのうちの６０％は、非アルコール性脂肪性肝炎を発症し、それらのうちの２０％は、肝硬変を発症する。これらの状態による肝臓損傷を制限し、予防するための治療が、開発されている。本発明者らは、ｄＢＢ１２Ｌを、これらの治療と組み合わせて使用して、肝臓再生を促進することを提案する。
米国の人口のうちの３０％が、非アルコール性肝疾患に罹患していると推定される。これらのうちの６０％は、非アルコール性脂肪性肝炎を発症し、それらのうちの２０％は、肝硬変を発症する。これらの状態による肝臓損傷を制限し、予防するための治療が、開発されている。本発明者らは、ｄＢＢ１２Ｌを、これらの治療と組み合わせて使用して、肝臓再生を促進することを提案する。
【0086】
消化管
ｄＢＢ１２Ｌは、消化管、例えば、外科手術後、又は炎症性腸疾患、例えば、潰瘍性大腸炎を有する患者の治癒を促進するために、炎症を制御するための治療と組み合わせて使用してもよい。
ｄＢＢ１２Ｌは、消化管、例えば、外科手術後、又は炎症性腸疾患、例えば、潰瘍性大腸炎を有する患者の治癒を促進するために、炎症を制御するための治療と組み合わせて使用してもよい。
【0087】
腎臓
ｄＢＢ１２Ｌは、腎臓の再生を促進し、それによって、可能性としては透析又は腎臓移植の必要性を回避するために使用してもよい。
ｄＢＢ１２Ｌは、腎臓の再生を促進し、それによって、可能性としては透析又は腎臓移植の必要性を回避するために使用してもよい。
【0088】
皮膚
ｄＢＢ１２Ｌは、例えば、外科手術後、熱傷、又は潰瘍、例えば、糖尿病性潰瘍を有する患者の創傷治癒を促進するために使用してもよい。
ｄＢＢ１２Ｌは、例えば、外科手術後、熱傷、又は潰瘍、例えば、糖尿病性潰瘍を有する患者の創傷治癒を促進するために使用してもよい。
【0089】
膵臓
ｄＢＢ１２Ｌは、１型真性糖尿病を有する患者において、膵島細胞の再生を促進することによって、予後を改善するために使用してもよい。
ｄＢＢ１２Ｌは、１型真性糖尿病を有する患者において、膵島細胞の再生を促進することによって、予後を改善するために使用してもよい。
【0090】
骨髄
ｄＢＢ１２Ｌは、例えば、化学療法後に、造血系の再生を促進し、それによって、重度の生命を脅かす危険性にある好中球減少症を予防してもよい。
ｄＢＢ１２Ｌは、例えば、化学療法後に、造血系の再生を促進し、それによって、重度の生命を脅かす危険性にある好中球減少症を予防してもよい。
【0091】
本発明者らは、ＦＲ－ＨＭＧＢ１が、傷害の最大２週間前に投与された場合でさえも有効であることを、これまでに示している(142)。ｄＢＢ１２Ｌは、ＦＲ－ＨＭＧＢ１と同等に有効であるため（図７Ｊ）、このポリペプチドを、予防的に、例えば、軍によって、若しくは競技上の傷害のために、又は待機的手術若しくは化学療法の前に、使用してもよい。
【0092】
材料及び方法
大腸菌株
Ｍａｃｈ－１ Ｔ１Ｒ細胞（Invitrogen、抗生物質耐性も誘導もなし、ＢＬ２１（ＤＥ３）－Ｒ３－ｐＲＡＲＥ２（社内ＢＬ２１誘導体、クロラムフェニコール耐性３６μｇ／ｍＬ、Ｔ７－ポリメラーゼｌａｃ誘導[87]）、及びＢＬ２１（ＤＥ３）－Ｒ３－ｐＲＡＲＥ２－ＢｉｒＡ（上記のin vivoビオチン化誘導体、追加のスペクチノマイシン耐性、５０μｇ／ｍＬ）を、社内で作製した化学的に適合性のあるストックから得た。
大腸菌株
Ｍａｃｈ－１ Ｔ１Ｒ細胞（Invitrogen、抗生物質耐性も誘導もなし、ＢＬ２１（ＤＥ３）－Ｒ３－ｐＲＡＲＥ２（社内ＢＬ２１誘導体、クロラムフェニコール耐性３６μｇ／ｍＬ、Ｔ７－ポリメラーゼｌａｃ誘導[87]）、及びＢＬ２１（ＤＥ３）－Ｒ３－ｐＲＡＲＥ２－ＢｉｒＡ（上記のin vivoビオチン化誘導体、追加のスペクチノマイシン耐性、５０μｇ／ｍＬ）を、社内で作製した化学的に適合性のあるストックから得た。
【0093】
細菌培養培地
ＳＯＣ：２０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、０．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．１８６２ｇ／ＬのＫＣｌを、オートクレーブし、４．１３２ｇ／ＬのＭｇＣｌ２及び２０ｍＭのグルコースを補充した。
ＳＯＣ：２０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、０．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．１８６２ｇ／ＬのＫＣｌを、オートクレーブし、４．１３２ｇ／ＬのＭｇＣｌ２及び２０ｍＭのグルコースを補充した。
【0094】
ＬＢ（Luria Bertani）：１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ、ｐＨ７．２、オートクレーブ滅菌。２w/v％の寒天粉末を添加して、ＬＢ寒天プレートを作製した。
【0095】
ＴＢ（Terrific Broth）：１２ｇ／Ｌのトリプトン、２４ｇ／Ｌの酵母抽出物、４ｇ／Ｌのグリセロール、１２．５ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、２．３５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、オートクレーブ滅菌。
【0096】
ＴＢ補充物質：１．６w/v％のグリセロール、１％のグルコース、２５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、１０Ｘ微量金属、０．２２μＭで滅菌濾過。
【0097】
微量金属溶液：５０ｍＭのＦｅＣｌ３（１３．５ｇ／Ｌ）、２０ｍＭのＣａＣｌ２（２．９４ｇ／Ｌ）、１０ｍＭのＭｎＣｌ２（１．９６ｇ／Ｌ）、１０ｍＭのＺｎＳＯ４（２．８８ｇ／Ｌ）、２ｍＭのＣｏＣｌ２（０．４８ｇ／Ｌ）、２ｍＭのＣｕＣｌ２（０．３４ｇ／Ｌ）、及び２ｍＭのＮｉＣｌ２（０．４８ｇ／Ｌ）、０．１Ｍ ＨＣｌ中、０．２２μＭで滅菌濾過。
【0098】
Ｍ９最少培地：１６ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４、４ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１ｇ／ＬのＮａＣｌ、ｐＨ７．２～７．３、及び２．５ｇ／ＬのＦｅＳＯ４、０．２５ｍｇ／ＬのＺｎＣｌ２、０．０５ｍｇ／ＬのＣｕＳＯ４、０．２５ｇ／ＬのＥＤＴＡ、１ｍＭのＭｇＳＯ４を、オートクレーブし、４ｇ／Ｌのグルコース、１ｇ／ＬのＵ－９９％ １５ＮＨ４Ｃｌ（Cambridge Isotopes）、０．３ｍＭのＣａＣｌ２、１．５ｍｇ／ＬのＤ－ビオチン、及び１．５ｍｇ／Ｌのチアミン－ＨＣＬを、滅菌濾過したストックから補充した。
【0099】
プラスミド
プラスミドは、ＳＧＣライブラリーから得た[87]。すべてのプラスミドは、ＴＥＶ－切断部位を有する６×Ｈｉｓタグを含み、ｐＮＩＣ－Ｂｉｏ３及びｐＤｓｂＣ－ＨＴ－ＣＢｉｏはまた、Ｃ末端ビオチン化エピトープ（終止コドンで除去できる）を有する。プラスミドＤＮＡを、制限酵素消化：ｐＮＩＣ－ＣＴＨＦについてはＢｆｕＡ１（３時間、６０℃）、又はＢｓａＩ（２時間、３７℃）によって線形化した。切断したベクターＤＮＡを、PureLink PCRキットで精製し、製造業者のプロトコールに従って０．２５ｍＭのｄＧＴＰ（ｐＮＩＣ－ＣＴＨＦ）又はｄＣＴＰの存在下において、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（NEB M0203）で処理した。
プラスミドは、ＳＧＣライブラリーから得た[87]。すべてのプラスミドは、ＴＥＶ－切断部位を有する６×Ｈｉｓタグを含み、ｐＮＩＣ－Ｂｉｏ３及びｐＤｓｂＣ－ＨＴ－ＣＢｉｏはまた、Ｃ末端ビオチン化エピトープ（終止コドンで除去できる）を有する。プラスミドＤＮＡを、制限酵素消化：ｐＮＩＣ－ＣＴＨＦについてはＢｆｕＡ１（３時間、６０℃）、又はＢｓａＩ（２時間、３７℃）によって線形化した。切断したベクターＤＮＡを、PureLink PCRキットで精製し、製造業者のプロトコールに従って０．２５ｍＭのｄＧＴＰ（ｐＮＩＣ－ＣＴＨＦ）又はｄＣＴＰの存在下において、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（NEB M0203）で処理した。
【0100】
クローニング
ＨＭＧＢ１コンストラクトを、哺乳動物遺伝子コレクションから得た（抗生物質を有するＬＢ培地において一晩増殖させたＭａｃｈ１細胞からプラスミドとして精製）。コンストラクトを、ＰＣＲによって増幅させた：９５℃／１０分、２５回（９５℃／３０秒、５２℃／１分、６８℃で０．５～１．５分間）、６８℃／１０分のプログラムを使用した。反応は、２５μＬの最終体積で、５μＬのヘラクレスＩＩ緩衝液、１μＭのそれぞれのプライマー、６μｇ／ｍＬのプラスミド鋳型、１μＭのｄＮＴＰ混合物、及び１単位のヘラクレスＩＩポリメラーゼ（Agilent 600679、緩衝液及び１００μＭのｄＮＴＰストックとともに供給）からなっていた。ＰＣＲ産物を、さらなる使用の前に精製した（PureLinkキット、ThermoFisher K310001）。
ＨＭＧＢ１コンストラクトを、哺乳動物遺伝子コレクションから得た（抗生物質を有するＬＢ培地において一晩増殖させたＭａｃｈ１細胞からプラスミドとして精製）。コンストラクトを、ＰＣＲによって増幅させた：９５℃／１０分、２５回（９５℃／３０秒、５２℃／１分、６８℃で０．５～１．５分間）、６８℃／１０分のプログラムを使用した。反応は、２５μＬの最終体積で、５μＬのヘラクレスＩＩ緩衝液、１μＭのそれぞれのプライマー、６μｇ／ｍＬのプラスミド鋳型、１μＭのｄＮＴＰ混合物、及び１単位のヘラクレスＩＩポリメラーゼ（Agilent 600679、緩衝液及び１００μＭのｄＮＴＰストックとともに供給）からなっていた。ＰＣＲ産物を、さらなる使用の前に精製した（PureLinkキット、ThermoFisher K310001）。
【0101】
増幅させたコーディング配列（対立遺伝子）を、ライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）によって目的のベクターにクローニングした。インサートを、ベクターに使用したものと同種のヌクレオチド（１０μＬの反応体積）の存在下において、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理し、２μＬを、１μＬの処理済みベクターと混合し、３０分間アニーリングした。４０μＬの氷冷Ｍａｃｈ－１細胞（保管のため）又は２０μＬのＢＬ２１（ＤＥ３）－Ｒ３－ｐＲＡＲＥ２／ＢＬ２１（ＤＥ３）－Ｒ３－ｐＲＡＲＥ２－ＢｉｒＡ細胞（発現のため）を添加し、４２℃で４５秒間、熱ショックを与えた後、氷中で冷却した。５％スクロース及び抗生物質を有する選択培地に播種する前に、３７℃で２時間、ＳＯＣ培地において回収を行った。２４時間後に、陽性クローンを採取し、製造業者のプロトコールに従って正しい分子量のバンドに特異的なシーケンシングプライマー対を用いて、ＭｙＴａｑポリメラーゼでスクリーニングした。陽性形質転換体を、抗生物質を有する１ｍＬの２× ＬＢ（２倍濃度のＬＢ）において一晩増殖させ、－８０℃において１２v/v％グリセロールでストックした。
【0102】
３Ｓ－ＨＭＧＢ１変異体配列を、類似の様式で生成した。ＰＣＲを、別個に行って、Ｓ２３－Ｓ４５及びＳ１０６フラグメントを生成し、これらを、ＰＣＲによってアニーリングし、５μＬのそれぞれの精製されたＰＣＲ産物を、この反応におけるプライマー及び鋳型の代替として用いた。この過程を、図１４に要約する。
【0103】
ＣＸＣＬ１２コンストラクトを、成熟タンパク質のＮ末端側のインフレームＳＵＭＯプロテアーゼ部位を用いてクローニングして、ｐＤｓｂＣ－ＨＴ－ＣＢｉｏベクター（ＤｓｂＣ－ＳＵＭＯ－ＣＸＣＬ１２）におけるＮ末端融合タンパク質の周辺質分泌を可能にし、その活性に影響を及ぼし得るタンパク質へのＮ末端残基の付加を回避しながら[88, 89]、ＤｓｂＣ融合タンパク質系を介してフォールディングされた酸化型ＣＸＣＬ１２を得た[90]。すべての変異体を、シーケンシングによって検証した（SourceBioscience）。ＨＭＧＢ１－ｄＢＢの配列は、大腸菌ＢＬ２１－ＤＥ３ゲノム（アセンブリＡＳＭ９５６ｖ１）に従って、ボックスＢ ８９～１７４の配列をコドン最適化し、天然のＨＭＧＢ１ボックスＢ配列の後に配置することによってインシリコで設計し、Twist Bioscience（San Francisco, USA）によってin vitroで合成し、ｐＮＩＣ－ＣＴＨＦにクローニングした。
【0104】
組換えタンパク質の発現
新しい寒天プレートの画線から増殖させたＨＭＧＢ１発現株の形質転換体の一晩培養物２０ｍＬを、補充物質を有する１ＬのＴＢ（又はＭ９）培地に植え付け、０．４５ＲＣＦ回転振盪で３７℃において最大ＯＤ２．０（Ｍ９培地についてはＯＤ０．６）まで増殖させた。１５Ｎ標識したＨＭＧＢ１の産生に使用した予備培養物は、まず、１０００ＲＣＦで５分間回転沈降させ、Ｍ９培地において洗浄した。これを、標的ＯＤに達するまで増殖させ、１８℃に冷却した後、０．５ｍＭ又は０．２５ｍＭのＩＰＴＧ（それぞれ、ＨＭＧＢ１及びＣＸＣＬ１２タンパク質について）を添加し、１６時間増殖させた後、４０００ＲＣＦで採取した。ビオチン化タンパク質については、ＰＢＳ中の１０ｍＭのＤ－ビオチンを添加した後、誘導し、さらに１時間後に細胞採取した。
新しい寒天プレートの画線から増殖させたＨＭＧＢ１発現株の形質転換体の一晩培養物２０ｍＬを、補充物質を有する１ＬのＴＢ（又はＭ９）培地に植え付け、０．４５ＲＣＦ回転振盪で３７℃において最大ＯＤ２．０（Ｍ９培地についてはＯＤ０．６）まで増殖させた。１５Ｎ標識したＨＭＧＢ１の産生に使用した予備培養物は、まず、１０００ＲＣＦで５分間回転沈降させ、Ｍ９培地において洗浄した。これを、標的ＯＤに達するまで増殖させ、１８℃に冷却した後、０．５ｍＭ又は０．２５ｍＭのＩＰＴＧ（それぞれ、ＨＭＧＢ１及びＣＸＣＬ１２タンパク質について）を添加し、１６時間増殖させた後、４０００ＲＣＦで採取した。ビオチン化タンパク質については、ＰＢＳ中の１０ｍＭのＤ－ビオチンを添加した後、誘導し、さらに１時間後に細胞採取した。
【0105】
組換えＨＭＧＢ１の精製
誘導したＨＭＧＢ１発現細胞のペレットを、１：１０００のプロテアーゼ阻害剤（Calbiochem Set III, Merck 539134）、３μｇ／ｍＬのベンゾナーゼ－ＭＢＰ、１ｍＭのＭｇＳＯ４、０．５ｍｇ／Ｌのリゾチーム（Sigma L6876）、及び０．５v/v％のTriton（登録商標）X100を補充した１ＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１０ｍＭのイミダゾール（緩衝液Ａ）中に、１４ｇ／Ｌで再懸濁させた後、－８０℃で凍結させ、この時点以降、すべての工程は、４℃で行った。解凍したペレットを、６７８０ＲＣＦで４５分間回転沈降させ、上清を、事前平衡処理したニッケル－His GraviTrap（GE Healthcare）の１ｍＬのカラムにロードした。滴下後に、カラムを、１０ＣＶの１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、並びに１．５ＣＶの０．４Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、及び３μｇ／ｍＬベンゾナーゼ－ＭＢＰ溶液で洗浄して、残りのＤＮＡを３０分間消化させた。混入物を、３０ｍＭのイミダゾールを補充した１５ＣＶの０．５Ｍ ＮａＣｌ、５％グリセロール、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５（緩衝液Ｂ）で洗浄した後、２．５ｍＬの緩衝液Ｂ＋５００ｍＭイミダゾールを用いてＰＤ－１０カラム（GE Healthcare、緩衝液Ｂ＋２０ｍＭイミダゾールにおいて平衡処理）に直接的に溶出させた。タンパク質を、３．５ｍＬの緩衝液Ｂ＋２０ｍＭイミダゾールを用いてカラムから溶出させた後、１：２０ＯＤのＴＥＶ－ＧＳＴプロテアーゼを用いて１６時間にわたってタグを除去した。
誘導したＨＭＧＢ１発現細胞のペレットを、１：１０００のプロテアーゼ阻害剤（Calbiochem Set III, Merck 539134）、３μｇ／ｍＬのベンゾナーゼ－ＭＢＰ、１ｍＭのＭｇＳＯ４、０．５ｍｇ／Ｌのリゾチーム（Sigma L6876）、及び０．５v/v％のTriton（登録商標）X100を補充した１ＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１０ｍＭのイミダゾール（緩衝液Ａ）中に、１４ｇ／Ｌで再懸濁させた後、－８０℃で凍結させ、この時点以降、すべての工程は、４℃で行った。解凍したペレットを、６７８０ＲＣＦで４５分間回転沈降させ、上清を、事前平衡処理したニッケル－His GraviTrap（GE Healthcare）の１ｍＬのカラムにロードした。滴下後に、カラムを、１０ＣＶの１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、並びに１．５ＣＶの０．４Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、及び３μｇ／ｍＬベンゾナーゼ－ＭＢＰ溶液で洗浄して、残りのＤＮＡを３０分間消化させた。混入物を、３０ｍＭのイミダゾールを補充した１５ＣＶの０．５Ｍ ＮａＣｌ、５％グリセロール、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５（緩衝液Ｂ）で洗浄した後、２．５ｍＬの緩衝液Ｂ＋５００ｍＭイミダゾールを用いてＰＤ－１０カラム（GE Healthcare、緩衝液Ｂ＋２０ｍＭイミダゾールにおいて平衡処理）に直接的に溶出させた。タンパク質を、３．５ｍＬの緩衝液Ｂ＋２０ｍＭイミダゾールを用いてカラムから溶出させた後、１：２０ＯＤのＴＥＶ－ＧＳＴプロテアーゼを用いて１６時間にわたってタグを除去した。
【0106】
プロテアーゼ及びさらなる混入物は、最初に精製するのに使用した同じGraviTrapカラム（緩衝液Ｂ＋２０ｍＭイミダゾールにおいて平衡処理）にタンパク質溶液を再循環させることによって、除去した。ビオチン化タンパク質については、ストレプトアビジン－ＸＴ樹脂を、代わりに使用してビオチン化分子のみを選択し、樹脂における３０分間のインキュベーションの後、試料を、滴下させ、３０ＣＶの緩衝液Ａ及び１ＣＶの緩衝液Ｂ＋１００ｍＭ Ｄ－ビオチンで洗浄し、３ＣＶの同じ緩衝液における２時間インキュベーションによって、溶出させた。タンパク質を、生物物理学的研究用には１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ、又は細胞及び動物の研究用には細胞培養グレードのＰＢＳで、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（Superdex S75 10/300－０．３５ｍＬ／分又は１６／６００－１．２ｍＬ／分の流速）によってさらに精製した。組換えタンパク質は、還元型ＨＭＧＢ１タンパク質の場合には１ｍＭのＴＣＥＰを添加して、保管のために瞬間凍結させた。
【0107】
組換えＣＸＣＬ１２の精製
ＤｓｂＣ－ＳＵＭＯ－ＣＸＣＬ１２を発現する細胞の外膜を、浸透圧ショックによって溶解させた[91]。ペレットを、１Ｍスクロース、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍＬリゾチーム、２×cOmpleteプロテアーゼ阻害剤セット（COEDTAF-RO, Roche）、５０ｍＭイミダゾール、及び３μｇ／ｍＬベンゾナーゼ中に、４０ｇ／Ｌで再懸濁させた。これを、室温で４５分間撹拌した後、４体積の氷冷１８．２ｍΩ水を添加し、さらに１０分間混合した後、１ｍＭ ＭｇＳＯ４を添加した。これを、１６０００ＲＣＦ、４℃で１時間遠心分離し、上清を、１０ｍＬ／分で、Aekta Xpress FPLCシステムのNi-NTA Superflowカラム（Qiagen, 30761）にロードし、細胞６Ｌごとに１つのカラムを使用した。タンパク質を、緩衝液Ｂにおいてイミダゾール勾配（１０ＣＶにわたって１０～２５ｍＭ、及び８ＣＶにわたって２５～５００ｍＭ）によって溶出させ、１：１０のＯＤのＵｌｐ－１プロテアーゼを添加した後、１００体積の０．２Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０（緩衝液Ａｃ）中で一晩透析した。翌日、タンパク質を、ＣａｐｔｏＳカラム（CaptoS ImpAct, GE 17-3717-47）に２．３ｍＬ／分でロードし、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０中０．２～１．５Ｍ ＮａＣｌの勾配において溶出させて、切断されたＣＸＣＬ１２をＤｓｂＣ及びＵｌｐ－１から分離した。タンパク質を、ＨＭＧＢ１と同じ様式でＳＥＣによってさらに精製し、保管のために瞬間凍結させた。
ＤｓｂＣ－ＳＵＭＯ－ＣＸＣＬ１２を発現する細胞の外膜を、浸透圧ショックによって溶解させた[91]。ペレットを、１Ｍスクロース、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍＬリゾチーム、２×cOmpleteプロテアーゼ阻害剤セット（COEDTAF-RO, Roche）、５０ｍＭイミダゾール、及び３μｇ／ｍＬベンゾナーゼ中に、４０ｇ／Ｌで再懸濁させた。これを、室温で４５分間撹拌した後、４体積の氷冷１８．２ｍΩ水を添加し、さらに１０分間混合した後、１ｍＭ ＭｇＳＯ４を添加した。これを、１６０００ＲＣＦ、４℃で１時間遠心分離し、上清を、１０ｍＬ／分で、Aekta Xpress FPLCシステムのNi-NTA Superflowカラム（Qiagen, 30761）にロードし、細胞６Ｌごとに１つのカラムを使用した。タンパク質を、緩衝液Ｂにおいてイミダゾール勾配（１０ＣＶにわたって１０～２５ｍＭ、及び８ＣＶにわたって２５～５００ｍＭ）によって溶出させ、１：１０のＯＤのＵｌｐ－１プロテアーゼを添加した後、１００体積の０．２Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０（緩衝液Ａｃ）中で一晩透析した。翌日、タンパク質を、ＣａｐｔｏＳカラム（CaptoS ImpAct, GE 17-3717-47）に２．３ｍＬ／分でロードし、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０中０．２～１．５Ｍ ＮａＣｌの勾配において溶出させて、切断されたＣＸＣＬ１２をＤｓｂＣ及びＵｌｐ－１から分離した。タンパク質を、ＨＭＧＢ１と同じ様式でＳＥＣによってさらに精製し、保管のために瞬間凍結させた。
【0108】
内毒素の除去
内毒素は、すべての事例において、Triton（登録商標）Tx-114を用いた相分離によって、サイズ排除クロマトグラフィーの前に除去した[92]。２v/v％のTX-114を、組換えタンパク質溶液に添加し、４℃で２０００ＲＣＦにおいて回転振盪させながら２０分間ホモジナイズし、３７℃で５分間分離した後、界面活性剤相を２５℃で８０００ＲＣＦにおいて１０分間ペレット化した。上清を、５w/v％のＳＭ－２バイオビーズ（BioRad, 152-8920）と混合し、２％のTX-114で２時間清浄し、３０ＣＶのメタノール、３０ＣＶの内毒素不含１８．２ｍΩ水、及び３０ＣＶの内毒素不含ＰＢＳで再生させた。これを、室温で４時間インキュベートして、残りのTriton（登録商標）及びＰＥＧを吸着させた後[93]、滅菌したＳＥＣ系に注入し（１２時間にわたって０．５Ｍ ＮａＯＨと接触させ、続いて６時間にわたって０．２Ｍ酢酸／２０％エタノールと接触させ、細胞培養グレードのＰＢＳ中で平衡処理）、残留ポリマー混入物を完全に除去しながら、サイズ排除を行った。Triton（登録商標）及びＰＥＧの不在を、ＥＳＩ／ＱＴＯＦ－ＭＳ質量分析法においてそれらのそれぞれの荷電状態種の欠如によって検証した[94]。組換えタンパク質のＬＰＳ含量を、ＬＡＬ方法（GenScript ToxinSensor L000350）によって評価した。試料は、含有するＬＰＳがタンパク質１ｍｇ当たり４ＥＵ未満である場合に、細胞及び動物への使用が承認された。
内毒素は、すべての事例において、Triton（登録商標）Tx-114を用いた相分離によって、サイズ排除クロマトグラフィーの前に除去した[92]。２v/v％のTX-114を、組換えタンパク質溶液に添加し、４℃で２０００ＲＣＦにおいて回転振盪させながら２０分間ホモジナイズし、３７℃で５分間分離した後、界面活性剤相を２５℃で８０００ＲＣＦにおいて１０分間ペレット化した。上清を、５w/v％のＳＭ－２バイオビーズ（BioRad, 152-8920）と混合し、２％のTX-114で２時間清浄し、３０ＣＶのメタノール、３０ＣＶの内毒素不含１８．２ｍΩ水、及び３０ＣＶの内毒素不含ＰＢＳで再生させた。これを、室温で４時間インキュベートして、残りのTriton（登録商標）及びＰＥＧを吸着させた後[93]、滅菌したＳＥＣ系に注入し（１２時間にわたって０．５Ｍ ＮａＯＨと接触させ、続いて６時間にわたって０．２Ｍ酢酸／２０％エタノールと接触させ、細胞培養グレードのＰＢＳ中で平衡処理）、残留ポリマー混入物を完全に除去しながら、サイズ排除を行った。Triton（登録商標）及びＰＥＧの不在を、ＥＳＩ／ＱＴＯＦ－ＭＳ質量分析法においてそれらのそれぞれの荷電状態種の欠如によって検証した[94]。組換えタンパク質のＬＰＳ含量を、ＬＡＬ方法（GenScript ToxinSensor L000350）によって評価した。試料は、含有するＬＰＳがタンパク質１ｍｇ当たり４ＥＵ未満である場合に、細胞及び動物への使用が承認された。
【0109】
酵素産生
ＴＥＶ－ＧＳＴプロテアーゼ（ＧＳＴ融合タンパク質）、ベンゾナーゼ－ＭＢＰ、Ｕｌｐ－１プロテアーゼを、ＳＧＣコレクションにおいて保管中の形質転換体から産生させ[87]、すべては、２００μｇ／ｍＬのアンピシリン耐性を有していた。ＴＥＶ及びＵｌｐ－１を、ＨＭＧＢ１について記載されたプロトコールに従って１回のみのＩＭＡＣ工程で精製し、一方でベンゾナーゼ－ＭＢＰは、ＣＸＣＬ１２で取得した外膜ライセートから精製し、製造業者のプロトコールに従ってアミロース樹脂（NEB, E0821）を使用して単離した。いずれの事例においても、結果として得られるタンパク質を、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０％グリセロール中で１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。ＧＳＴ－ＴＥＶプロテアーゼ及びＵｌｐ－１を、液体窒素で瞬間凍結させ、精製中に０．５ｍＭ ＴＣＥＰを補充し、ベンゾナーゼ－ＭＢＰには、５０％グリセロール及び２ｍＭ ＭｇＣｌ２を補充し、－２０℃で保管した。
ＴＥＶ－ＧＳＴプロテアーゼ（ＧＳＴ融合タンパク質）、ベンゾナーゼ－ＭＢＰ、Ｕｌｐ－１プロテアーゼを、ＳＧＣコレクションにおいて保管中の形質転換体から産生させ[87]、すべては、２００μｇ／ｍＬのアンピシリン耐性を有していた。ＴＥＶ及びＵｌｐ－１を、ＨＭＧＢ１について記載されたプロトコールに従って１回のみのＩＭＡＣ工程で精製し、一方でベンゾナーゼ－ＭＢＰは、ＣＸＣＬ１２で取得した外膜ライセートから精製し、製造業者のプロトコールに従ってアミロース樹脂（NEB, E0821）を使用して単離した。いずれの事例においても、結果として得られるタンパク質を、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０％グリセロール中で１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。ＧＳＴ－ＴＥＶプロテアーゼ及びＵｌｐ－１を、液体窒素で瞬間凍結させ、精製中に０．５ｍＭ ＴＣＥＰを補充し、ベンゾナーゼ－ＭＢＰには、５０％グリセロール及び２ｍＭ ＭｇＣｌ２を補充し、－２０℃で保管した。
【0110】
ペプチドアレイ
ＦＭＯＣに連結したヒトＨＭＧＢ１（Uniprot P09429）の１５量体ペプチド又はＣＸＣＬ１２（Uniprot P48061、分泌シグナルを除外）を有する膜を、要求に応じて、公開されているプロトコールに従ってSarah Picaud博士がＳＧＣにおいてプリントした[40]。膜を、２０～２５℃において、９５％及び７０％エタノールで再水和させ、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ １×＋０．０５％ Tween（登録商標）20、３×）で平衡処理し、１０％ ＢＳＡ／ＰＢＳＴで８時間ブロッキングした。１μＭのパートナーＨｉｓタグ付けタンパク質コンストラクトを添加し（ＰＢＳ中）、４℃で２４時間結合させた。過剰なＢＳＡ及びタンパク質を、ＰＢＳＴ中で３回の洗浄によって除去し、すべての洗浄は、別途示されない限り１分間継続した。結合したタンパク質を検出するために、膜を、１：３０００希釈のQiagen抗ペンタＨｉｓ ＨＲＰコンジュゲート（Qiagen 34460）で処理し、過剰な抗体を、ＰＢＳＴ中で２０分間３回洗浄することによって除去した。結合した抗体を、次いで、化学発光（Pierce ECL基質-32109）によって定量化し、膜を、基質溶液で覆い、２つの透明なプラスチック製シートの間に入れた後、ＬＡＳ－４０００カメラ（化学発光設定）において２分間隔で段階イメージングを行った。それぞれの膜におけるペプチドの強度を、ImageJにおいて測定し、１０－Ｈｉｓ対照に対して正規化した。アラニン変異誘発スキャンを、初期ペプチドアレイの間に特定されたものからなるプリントしたペプチドを用いて、同じ様式で行った。アラニンへの変異が、配列内のアラニン位置で観察されたものよりも高い強度変化をもたらした残基を、ＣＸＣＬ１２結合への有意な寄与因子と考えた。
ＦＭＯＣに連結したヒトＨＭＧＢ１（Uniprot P09429）の１５量体ペプチド又はＣＸＣＬ１２（Uniprot P48061、分泌シグナルを除外）を有する膜を、要求に応じて、公開されているプロトコールに従ってSarah Picaud博士がＳＧＣにおいてプリントした[40]。膜を、２０～２５℃において、９５％及び７０％エタノールで再水和させ、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ １×＋０．０５％ Tween（登録商標）20、３×）で平衡処理し、１０％ ＢＳＡ／ＰＢＳＴで８時間ブロッキングした。１μＭのパートナーＨｉｓタグ付けタンパク質コンストラクトを添加し（ＰＢＳ中）、４℃で２４時間結合させた。過剰なＢＳＡ及びタンパク質を、ＰＢＳＴ中で３回の洗浄によって除去し、すべての洗浄は、別途示されない限り１分間継続した。結合したタンパク質を検出するために、膜を、１：３０００希釈のQiagen抗ペンタＨｉｓ ＨＲＰコンジュゲート（Qiagen 34460）で処理し、過剰な抗体を、ＰＢＳＴ中で２０分間３回洗浄することによって除去した。結合した抗体を、次いで、化学発光（Pierce ECL基質-32109）によって定量化し、膜を、基質溶液で覆い、２つの透明なプラスチック製シートの間に入れた後、ＬＡＳ－４０００カメラ（化学発光設定）において２分間隔で段階イメージングを行った。それぞれの膜におけるペプチドの強度を、ImageJにおいて測定し、１０－Ｈｉｓ対照に対して正規化した。アラニン変異誘発スキャンを、初期ペプチドアレイの間に特定されたものからなるプリントしたペプチドを用いて、同じ様式で行った。アラニンへの変異が、配列内のアラニン位置で観察されたものよりも高い強度変化をもたらした残基を、ＣＸＣＬ１２結合への有意な寄与因子と考えた。
【0111】
バイオレイヤーインターフェロメトリー（ＢＬＩ）
事前水和させたストレプトアビジンOctetバイオセンサー（ForteBio 18-5019）を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（基礎緩衝液－ＢＢ）に０．５ｍＭ ＴＣＥＰを加えたものにおけるビオチン化ＨＭＧＢ１タンパク質の４μＭ溶液でコーティングした（６０秒のベースライン、６０秒の結合）。非特異的結合を、動態アッセイの前に、ＢＢ＋１％ＢＳＡ＋０．０５％Tween（登録商標）20（動態緩衝液、ＫＢ）中で３分間インキュベートすることによって最小化させた。ＣＸＣＬ１２との相互作用を、ＫＢ中の漸増ＣＸＣＬ１２濃度（１：２希釈で０～１５０μＭ）の溶液において、センサーの段階浸漬を行うことによって測定した（６０秒のベースライン、５００秒の結合、４２０秒の解離、ＢＢ＋０．５ｍＭ ＴＣＥＰにおいて１８０秒の還元）。OctetRed 384機器を、これらの実験に使用した。動態データは、DataAnalysis 9.0（ForteBio）を使用して抽出した。平衡時の応答ＲＥｑを、ミカエリス・メンテン飽和プロットにおいて濃度に対してプロットして、ｋＤ／Ｂｍａｘ（ｒＥｑに対する濃度の飽和プロット）を計算した。動態速度（結合速度ｋｏｎ及び解離速度ｋｏｆｆ）を、インターフェログラムにおけるすべての結合及び解離工程から得られるそれぞれのパラメーターの直接測定から導出し、すべての測定にわたって水平線（平均）に当てはめた。それぞれの複製回から得られたデータを、同じ様式でプールして、全体の平均を計算した。ＨＭＧＢ１へのＲＡＧＥ結合動態を測定するために、ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ＋０．０２％Tween（登録商標）20中１５μｇ／ｍＬのＲＡＧＥ－Ｆｃを、抗ＩｇＧバイオセンサー（AHC, 18-5060）の表面上に３０秒間固定化し、連続濃度のそれぞれのＨＭＧＢ１コンストラクト中に浸漬し（６０秒のベースライン、２００秒の結合／解離）、同じ様式で当てはめて動態パラメーターを導出した。
事前水和させたストレプトアビジンOctetバイオセンサー（ForteBio 18-5019）を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（基礎緩衝液－ＢＢ）に０．５ｍＭ ＴＣＥＰを加えたものにおけるビオチン化ＨＭＧＢ１タンパク質の４μＭ溶液でコーティングした（６０秒のベースライン、６０秒の結合）。非特異的結合を、動態アッセイの前に、ＢＢ＋１％ＢＳＡ＋０．０５％Tween（登録商標）20（動態緩衝液、ＫＢ）中で３分間インキュベートすることによって最小化させた。ＣＸＣＬ１２との相互作用を、ＫＢ中の漸増ＣＸＣＬ１２濃度（１：２希釈で０～１５０μＭ）の溶液において、センサーの段階浸漬を行うことによって測定した（６０秒のベースライン、５００秒の結合、４２０秒の解離、ＢＢ＋０．５ｍＭ ＴＣＥＰにおいて１８０秒の還元）。OctetRed 384機器を、これらの実験に使用した。動態データは、DataAnalysis 9.0（ForteBio）を使用して抽出した。平衡時の応答ＲＥｑを、ミカエリス・メンテン飽和プロットにおいて濃度に対してプロットして、ｋＤ／Ｂｍａｘ（ｒＥｑに対する濃度の飽和プロット）を計算した。動態速度（結合速度ｋｏｎ及び解離速度ｋｏｆｆ）を、インターフェログラムにおけるすべての結合及び解離工程から得られるそれぞれのパラメーターの直接測定から導出し、すべての測定にわたって水平線（平均）に当てはめた。それぞれの複製回から得られたデータを、同じ様式でプールして、全体の平均を計算した。ＨＭＧＢ１へのＲＡＧＥ結合動態を測定するために、ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ＋０．０２％Tween（登録商標）20中１５μｇ／ｍＬのＲＡＧＥ－Ｆｃを、抗ＩｇＧバイオセンサー（AHC, 18-5060）の表面上に３０秒間固定化し、連続濃度のそれぞれのＨＭＧＢ１コンストラクト中に浸漬し（６０秒のベースライン、２００秒の結合／解離）、同じ様式で当てはめて動態パラメーターを導出した。
【0112】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）
１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５（ＢＬＩ実験と同一の緩衝液及びイオン強度）中の１５Ｎ標識した組換えＨＭＧＢ１コンストラクトに、５v/v％のＤ２Ｏを補充し、ガラス製パスツールピペットで５ｍｍ Shigeimiチューブにピペッティングし、パラフィンで封止した。最終体積は、３３０μＬを上回った。ＣＸＣＬ１２を、同じ緩衝液に添加し、参照物の改変を回避するように最終体積を調整した。シグナルのロッキング、チューブのシミング、及び核の調整を、Bruker TopSpinソフトウェアによって手動で行った。水のシグナルは、１Ｈスペクトルをパワーレベル１（Ｐ１）＝推定パルスキャリブレーション（pulsecal）で取得することによって抑制した。単一のピークが観察された場合、初期の４倍のＰ１値をベースラインとして使用し、１Ｈスペクトルに対称ピークが観察できるまで調整した。ＮＭＲ実験を、これらのキャリブレーション工程の後に行い（１Ｈ－ＮＭＲ、１５Ｎ－ＨＳＱＣ、１５Ｎ－ＮＯＥＳＹ－ＨＳＱＣ、１５Ｎ－ＴＯＣＳＹ－ＨＳＱＣピークを、１５Ｎ－ＨＳＱＣスペクトルにおいて、ＨＭＧＢ１ １～１８４（BMRB 15418）の公開されているＮＭＲ表に基づいて割り当て、それぞれのコンストラクトについて本発明者ら独自のＮＯＥＳＹ／ＴＯＣＳＹデータを分析した。ＣＸＣＬ１２結合を測定するために、特定されたピークの化学シフト位置及び体積を、CCPNMR 3.0 Analyzeの化学シフト追跡モジュールによって、異なるモル当量のＣＸＣＬ１２（これらは、関連する画像に列挙されている）にわたって追跡した。ピーク強度の変化については、それぞれのセットにおける中央値強度変化を、ベースラインと考えた。完全な化学シフトの表及び実験のパラメーターは、この節の最後に示す。
１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５（ＢＬＩ実験と同一の緩衝液及びイオン強度）中の１５Ｎ標識した組換えＨＭＧＢ１コンストラクトに、５v/v％のＤ２Ｏを補充し、ガラス製パスツールピペットで５ｍｍ Shigeimiチューブにピペッティングし、パラフィンで封止した。最終体積は、３３０μＬを上回った。ＣＸＣＬ１２を、同じ緩衝液に添加し、参照物の改変を回避するように最終体積を調整した。シグナルのロッキング、チューブのシミング、及び核の調整を、Bruker TopSpinソフトウェアによって手動で行った。水のシグナルは、１Ｈスペクトルをパワーレベル１（Ｐ１）＝推定パルスキャリブレーション（pulsecal）で取得することによって抑制した。単一のピークが観察された場合、初期の４倍のＰ１値をベースラインとして使用し、１Ｈスペクトルに対称ピークが観察できるまで調整した。ＮＭＲ実験を、これらのキャリブレーション工程の後に行い（１Ｈ－ＮＭＲ、１５Ｎ－ＨＳＱＣ、１５Ｎ－ＮＯＥＳＹ－ＨＳＱＣ、１５Ｎ－ＴＯＣＳＹ－ＨＳＱＣピークを、１５Ｎ－ＨＳＱＣスペクトルにおいて、ＨＭＧＢ１ １～１８４（BMRB 15418）の公開されているＮＭＲ表に基づいて割り当て、それぞれのコンストラクトについて本発明者ら独自のＮＯＥＳＹ／ＴＯＣＳＹデータを分析した。ＣＸＣＬ１２結合を測定するために、特定されたピークの化学シフト位置及び体積を、CCPNMR 3.0 Analyzeの化学シフト追跡モジュールによって、異なるモル当量のＣＸＣＬ１２（これらは、関連する画像に列挙されている）にわたって追跡した。ピーク強度の変化については、それぞれのセットにおける中央値強度変化を、ベースラインと考えた。完全な化学シフトの表及び実験のパラメーターは、この節の最後に示す。
【0113】
質量分析法
ＭＳ／ＭＳ及びトリプシン消化によるタンパク質の特定のために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルから得られたバンドを、切り取り、ＳＧＣオープンアクセスのＭＳプラットフォームに提出し、Rod Chalk博士、Tiago Moreira博士及びOktawia Borkowskaが、公開されているように分析した[94, 95]。タンパク質の同一性に注釈を付けるためのデータ分析（ペプチドマッピング）を、ＭＡＳＣＯＴ検索エンジンを用いて、Uniprot（参照タンパク質配列）及びＳＧＣ（コンストラクト配列）データベースに対して行った。ネイティブＥＳＩ／ＭＳ実験を、３６０μＬ／時で揮発性緩衝液（５０又は２００ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ６．５）においてＥＳＩ／ＱＴＯＦ機器（Agilent Q-TOF 6545）に手作業で注入することによって行った。全イオンクロマトグラムにおいて安定なイオン流が観察された後に、シグナルを、少なくとも１０カウント（３０秒）取得した。変性実験については、記載されるように、試料を、０．２％ギ酸中に１ｍｇ／ｍＬに希釈し、ＨＰＬＣ（Agilent 1100 HPLC）によって注入し、ギ酸／メタノールの移動相中に溶出させた[94]。荷電状態のそれぞれの連続的な分布を、異なる立体構造と考え、荷電状態（Ｚ）を、ｍＷ＝（ｍＷ／Ｚ－プロトン質量）＊Ｚの式に従って割り当てた。表面積を、文献中に提案されている式から導出し[96, 97]、これにより、ネイティブＭＳについては式ｌｎ（ＳＡＳＡ）＝ｌｎ（Ｍ／Ｚ）＊０．６８９７－４．０６３及び変性試料についてはｌｎ（ＳＡＳＡ）＝ｌｎ（Ｍ／Ｚ）＊０．９０２４－５．９０１３を得た。少なくとも３回の独立した注入を、すべてのＭＳ試料に行った。これらの実験におけるすべての溶液は、ＨＰＬＣ水（電気化学グレード）及び溶媒を用いて作製した。
ＭＳ／ＭＳ及びトリプシン消化によるタンパク質の特定のために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルから得られたバンドを、切り取り、ＳＧＣオープンアクセスのＭＳプラットフォームに提出し、Rod Chalk博士、Tiago Moreira博士及びOktawia Borkowskaが、公開されているように分析した[94, 95]。タンパク質の同一性に注釈を付けるためのデータ分析（ペプチドマッピング）を、ＭＡＳＣＯＴ検索エンジンを用いて、Uniprot（参照タンパク質配列）及びＳＧＣ（コンストラクト配列）データベースに対して行った。ネイティブＥＳＩ／ＭＳ実験を、３６０μＬ／時で揮発性緩衝液（５０又は２００ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ６．５）においてＥＳＩ／ＱＴＯＦ機器（Agilent Q-TOF 6545）に手作業で注入することによって行った。全イオンクロマトグラムにおいて安定なイオン流が観察された後に、シグナルを、少なくとも１０カウント（３０秒）取得した。変性実験については、記載されるように、試料を、０．２％ギ酸中に１ｍｇ／ｍＬに希釈し、ＨＰＬＣ（Agilent 1100 HPLC）によって注入し、ギ酸／メタノールの移動相中に溶出させた[94]。荷電状態のそれぞれの連続的な分布を、異なる立体構造と考え、荷電状態（Ｚ）を、ｍＷ＝（ｍＷ／Ｚ－プロトン質量）＊Ｚの式に従って割り当てた。表面積を、文献中に提案されている式から導出し[96, 97]、これにより、ネイティブＭＳについては式ｌｎ（ＳＡＳＡ）＝ｌｎ（Ｍ／Ｚ）＊０．６８９７－４．０６３及び変性試料についてはｌｎ（ＳＡＳＡ）＝ｌｎ（Ｍ／Ｚ）＊０．９０２４－５．９０１３を得た。少なくとも３回の独立した注入を、すべてのＭＳ試料に行った。これらの実験におけるすべての溶液は、ＨＰＬＣ水（電気化学グレード）及び溶媒を用いて作製した。
【0114】
ＳＥＣ表面積定量
ＳＥＣクロマトグラムを表面積と相関させるために、公知の構造を有する標準セット（BioRad 1511901）を、この実験で使用したSuperdex 75pg、１０／３００カラムに流した。これらに含まれるタンパク質のＳＡＳＡ及びＧＥにより供給されたキャリブレーション曲線標準物は、公開されているＰＤＢ構造（ＢＳＡ、３Ｖ０３；卵白アルブミン、１ＪＴＩ；ミオグロビン、２Ｖ１Ｉ；ＲＮＡｓｅＡ、１Ａ５Ｐ；アプロチニン、１ＮＡＧ；ビタミンＢ１２、３ＢＵＬ）から導出し、非線形最小二乗当てはめによって保持体積と相関させた（ＳＡＳＡ＝３３１．２×ＲＶ２－１．１９ｅ４×ＲＶ＋１．０８ｅ５）。ＨＭＧＢ１試料間で比較したすべての実験は、ネイティブＭＳと同じ緩衝液（２００ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ６．５）において行い、注入は、シグナルの飽和を回避するために１ｍｇ／ｍＬで行い、すべての試料は、０．４ｍＬ／分で溶出させた。
ＳＥＣクロマトグラムを表面積と相関させるために、公知の構造を有する標準セット（BioRad 1511901）を、この実験で使用したSuperdex 75pg、１０／３００カラムに流した。これらに含まれるタンパク質のＳＡＳＡ及びＧＥにより供給されたキャリブレーション曲線標準物は、公開されているＰＤＢ構造（ＢＳＡ、３Ｖ０３；卵白アルブミン、１ＪＴＩ；ミオグロビン、２Ｖ１Ｉ；ＲＮＡｓｅＡ、１Ａ５Ｐ；アプロチニン、１ＮＡＧ；ビタミンＢ１２、３ＢＵＬ）から導出し、非線形最小二乗当てはめによって保持体積と相関させた（ＳＡＳＡ＝３３１．２×ＲＶ２－１．１９ｅ４×ＲＶ＋１．０８ｅ５）。ＨＭＧＢ１試料間で比較したすべての実験は、ネイティブＭＳと同じ緩衝液（２００ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ６．５）において行い、注入は、シグナルの飽和を回避するために１ｍｇ／ｍＬで行い、すべての試料は、０．４ｍＬ／分で溶出させた。
【0115】
ＲＡＧＥ結合ＥＬＩＳＡアッセイ
３８４ウェルのタンパク質結合ＥＬＩＳＡプレート（Santa Cruz Biotechnology, sc-206072）を、それぞれ４つの複製物で、４℃において２４時間、ＦＬ／ＤＳ ＨＭＧＢ１全長対照及びブランクを含め、ＰＢＳ中４０ｎＭのＨＭＧＢ１コンストラクトの溶液５０μＬ（ＦＲ－ＨＭＧＢ１コンストラクトについては＋０．５ｍＭ ＴＣＥＰ）でコーティングした。非特異的結合を、２０～２５℃で２時間、ＰＢＳ中１０％のＢＳＡとともにインキュベートすることによって、遮断した。ある濃度範囲のＲＡＧＥ－Ｆｃキメラタンパク質（BioTechne, 1145-RG、１：４希釈で０～６４０ｎＭ）を、１０％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に添加し、４℃で２時間結合させた。結合したＦＣキメラを、２０～２５℃で２時間、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に１：１００００で希釈した抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ（Agilent Dako P021402-2）とともにインキュベートすることによって検出した。これら３つの工程のそれぞれの間に、プレートを、１００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄した。
３８４ウェルのタンパク質結合ＥＬＩＳＡプレート（Santa Cruz Biotechnology, sc-206072）を、それぞれ４つの複製物で、４℃において２４時間、ＦＬ／ＤＳ ＨＭＧＢ１全長対照及びブランクを含め、ＰＢＳ中４０ｎＭのＨＭＧＢ１コンストラクトの溶液５０μＬ（ＦＲ－ＨＭＧＢ１コンストラクトについては＋０．５ｍＭ ＴＣＥＰ）でコーティングした。非特異的結合を、２０～２５℃で２時間、ＰＢＳ中１０％のＢＳＡとともにインキュベートすることによって、遮断した。ある濃度範囲のＲＡＧＥ－Ｆｃキメラタンパク質（BioTechne, 1145-RG、１：４希釈で０～６４０ｎＭ）を、１０％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に添加し、４℃で２時間結合させた。結合したＦＣキメラを、２０～２５℃で２時間、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に１：１００００で希釈した抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ（Agilent Dako P021402-2）とともにインキュベートすることによって検出した。これら３つの工程のそれぞれの間に、プレートを、１００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄した。
【0116】
結合した抗体を検出するために、２５μＬのＴＭＢ基質（ThermoFisher N301）を、それぞれのウェルに添加し、反応を、ＦＬ－ＤＳ－ＨＭＧＢ１対照が明確な濃度依存性色勾配を発生するまで暗所で顕色させた後、２５μＬの０．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させた。ＯＤ４５０を、読み取り値（FluoStar OMEGA, BMG Labtech）として測定し、２× ＲＡＧＥ－Ｆｃ濃度（キメラは、ＲＡＧＥ二量体であるため）に対する飽和当てはめとしてプロットした。
【0117】
ＴＬＲ４及びＴＬＲ２に媒介されるＮＦ－κＢシグナル伝達レポーターアッセイ
ヒトＴＬＲ２及びＣＤ１４又はマウスＴＬＲ４、ＭＤ－２、及びＣＤ１４を発現するHEK-Dual細胞（Invivogen）を、標準的な組織培養条件（３７℃、５％ＣＯ２）において、１０％ＦＢＳ（Gibco）、１％ Ｌ－グルタミン（Gibco）、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco）を補充したＤＭＥＭ（Gibco）中で維持した。ＦＲ－ＨＭＧＢ１、ＤＳ－ＨＭＧＢ１、及びｄＢＢ１２Ｌが、ＴＬＲ４及びＴＬＲ２シグナル伝達の活性化を誘導するかどうかを判定するために、１０４個のＴＬＲ４及びＴＬＲ２ ＨＥＫ二重細胞を、９６ウェルプレートのウェルに播種（３回の実験）し、ＴＬＲ２については１０μｇ／ｍＬのｌ ＨＭＧＢ１及び（Ｘ濃度）ＦＳＬ－１並びにＴＬＲ４については１０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳで刺激した。刺激から２４時間後に、ＮＦ－κβ活性を、誘導された分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）のレベルを測定することによって判定した。
ヒトＴＬＲ２及びＣＤ１４又はマウスＴＬＲ４、ＭＤ－２、及びＣＤ１４を発現するHEK-Dual細胞（Invivogen）を、標準的な組織培養条件（３７℃、５％ＣＯ２）において、１０％ＦＢＳ（Gibco）、１％ Ｌ－グルタミン（Gibco）、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco）を補充したＤＭＥＭ（Gibco）中で維持した。ＦＲ－ＨＭＧＢ１、ＤＳ－ＨＭＧＢ１、及びｄＢＢ１２Ｌが、ＴＬＲ４及びＴＬＲ２シグナル伝達の活性化を誘導するかどうかを判定するために、１０４個のＴＬＲ４及びＴＬＲ２ ＨＥＫ二重細胞を、９６ウェルプレートのウェルに播種（３回の実験）し、ＴＬＲ２については１０μｇ／ｍＬのｌ ＨＭＧＢ１及び（Ｘ濃度）ＦＳＬ－１並びにＴＬＲ４については１０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳで刺激した。刺激から２４時間後に、ＮＦ－κβ活性を、誘導された分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）のレベルを測定することによって判定した。
【0118】
単球総ＮＦ－κＢ分泌アッセイ
ヒト単球（StemCell Technologies）を、標準的な組織培養条件（３７℃、５％ＣＯ２）において、１０％ＦＢＳ（Gibco）を補充したＤＭＥＭ（Gibco）中で維持した。ＦＲ－ＨＭＧＢ１、ＤＳ－ＨＭＧＢ１、及びｄＢＢ１２Ｌが、炎症促進性サイトカイン産生を誘導するかどうかを判定するために、１０５個のヒト単球を、９６ウェルプレートのウェルに播種し（３回の実験）、１０μｇ／ｍＬのＨＭＧＢ１及び５０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ又は１０ｎｇ／ｍＬのＬＴＡで刺激した。刺激から２４時間後に、ＴＮＦのレベルを、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（Abcam）によって判定した。
ヒト単球（StemCell Technologies）を、標準的な組織培養条件（３７℃、５％ＣＯ２）において、１０％ＦＢＳ（Gibco）を補充したＤＭＥＭ（Gibco）中で維持した。ＦＲ－ＨＭＧＢ１、ＤＳ－ＨＭＧＢ１、及びｄＢＢ１２Ｌが、炎症促進性サイトカイン産生を誘導するかどうかを判定するために、１０５個のヒト単球を、９６ウェルプレートのウェルに播種し（３回の実験）、１０μｇ／ｍＬのＨＭＧＢ１及び５０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ又は１０ｎｇ／ｍＬのＬＴＡで刺激した。刺激から２４時間後に、ＴＮＦのレベルを、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（Abcam）によって判定した。
【0119】
トランスクリプトーム分析
マウスを、５０μＬのＰＢＳビヒクル中３０μｇのＦＲ－ＨＭＧＢ１、又はＰＢＳのみの対照の静脈内注入で、全身処理した。傷害細胞は、以下に記載されるように、ＢａＣｌ２傷害マウスに由来する。Ａｌｅｒｔ細胞は、ＢａＣｌ２傷害マウスの傷害を受けていない反対側に由来する。マウス筋肉幹細胞（ｍＭｕＳＣ）を、これまでに報告されているプロトコールに従って定義し、新たに単離した。筋肉細胞懸濁液を、大腿部の筋肉を切り刻み、コラゲナーゼ８００Ｕ／ｍｌ（Worthington-Biochem）及びジスパーゼ１Ｕ／ｍＬ（Gibco）で酵素消化することによって作製した。その後に、すべての懸濁液を、７０μｍ及び４０μｍのフィルタ（Greiner Bio-One）を通して濾し、それぞれの抗体で染色した。ｍＭｕＳＣ、ＣＤ３１－ＣＤ４５－Ｓｃａ－１－ＶＣＡＭ１＋を、BD FACSAria III機器を使用して蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）によって単離した。新しくＦＡＣＳにより単離したｍＭｕＳＣから抽出したＲＮＡを、Lexogen ３’キットライブラリープレップを使用してＲＮＡ－ｓｅｑ分析に送り、HiSeq400（Illumina）を使用してシーケンシングした。ＦＡＳＴＱファイルを、ＦＡＳＴＱＣを使用して評価し、続いて、kallisto v0.42.4を用いてＴＰＭ値を生成した。ＴＰＭ値を合計して、tximportを使用して遺伝子レベルの発現値を取得し、差次的発現分析を、ＤｅＳＥＱ２で行った。差次的に発現される遺伝子のＧＯ濃縮を、Ｒパッケージ「clusterProfiler」[98]を使用して、ベンジャミニ－ホッホベルグ多重検定調整及び偽発見率のカットオフ０．１を用いて行った。視覚化を、Ｒパッケージの「ggplot2」及び「igraph」を使用して行った。
マウスを、５０μＬのＰＢＳビヒクル中３０μｇのＦＲ－ＨＭＧＢ１、又はＰＢＳのみの対照の静脈内注入で、全身処理した。傷害細胞は、以下に記載されるように、ＢａＣｌ２傷害マウスに由来する。Ａｌｅｒｔ細胞は、ＢａＣｌ２傷害マウスの傷害を受けていない反対側に由来する。マウス筋肉幹細胞（ｍＭｕＳＣ）を、これまでに報告されているプロトコールに従って定義し、新たに単離した。筋肉細胞懸濁液を、大腿部の筋肉を切り刻み、コラゲナーゼ８００Ｕ／ｍｌ（Worthington-Biochem）及びジスパーゼ１Ｕ／ｍＬ（Gibco）で酵素消化することによって作製した。その後に、すべての懸濁液を、７０μｍ及び４０μｍのフィルタ（Greiner Bio-One）を通して濾し、それぞれの抗体で染色した。ｍＭｕＳＣ、ＣＤ３１－ＣＤ４５－Ｓｃａ－１－ＶＣＡＭ１＋を、BD FACSAria III機器を使用して蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）によって単離した。新しくＦＡＣＳにより単離したｍＭｕＳＣから抽出したＲＮＡを、Lexogen ３’キットライブラリープレップを使用してＲＮＡ－ｓｅｑ分析に送り、HiSeq400（Illumina）を使用してシーケンシングした。ＦＡＳＴＱファイルを、ＦＡＳＴＱＣを使用して評価し、続いて、kallisto v0.42.4を用いてＴＰＭ値を生成した。ＴＰＭ値を合計して、tximportを使用して遺伝子レベルの発現値を取得し、差次的発現分析を、ＤｅＳＥＱ２で行った。差次的に発現される遺伝子のＧＯ濃縮を、Ｒパッケージ「clusterProfiler」[98]を使用して、ベンジャミニ－ホッホベルグ多重検定調整及び偽発見率のカットオフ０．１を用いて行った。視覚化を、Ｒパッケージの「ggplot2」及び「igraph」を使用して行った。
【0120】
in vivoマウス筋傷害モデル
１１～１２週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６近親交配マウス株を、Charles River UKから購入し、Kennedy Instituteで地域のBiological Safety Unit（ＢＳＵ）に収容した。順化期間は、１～２週間であった。生きた動物に行ったすべてのプロトコールは、UK Home Office（PPL 30/3330及びPPL P12F5C2AF）によって、並びに地域の動物施設が指名した人物によって承認されており、ＡＳＰＡ規制のもとに適切なプロジェクト及び人物のライセンス下で登録されている。すべての消耗品は、外科手術用に認定されており、組換えタンパク質は、内毒素不含であった。外科手術は、選別施設とは別個の整った環境において行った。すべての動物は、術後６時間、及びその後の３日間は毎日モニタリングし、モニタリングは、その後、ＮＶＳ／ＮＡＣＷＯに移行した。
１１～１２週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６近親交配マウス株を、Charles River UKから購入し、Kennedy Instituteで地域のBiological Safety Unit（ＢＳＵ）に収容した。順化期間は、１～２週間であった。生きた動物に行ったすべてのプロトコールは、UK Home Office（PPL 30/3330及びPPL P12F5C2AF）によって、並びに地域の動物施設が指名した人物によって承認されており、ＡＳＰＡ規制のもとに適切なプロジェクト及び人物のライセンス下で登録されている。すべての消耗品は、外科手術用に認定されており、組換えタンパク質は、内毒素不含であった。外科手術は、選別施設とは別個の整った環境において行った。すべての動物は、術後６時間、及びその後の３日間は毎日モニタリングし、モニタリングは、その後、ＮＶＳ／ＮＡＣＷＯに移行した。
【0121】
外科手術は、これまでに記載されているように行った[7, 12]。動物は、２％イソフルランでエアロゾル麻酔し、痛覚を脱失させ、保温パッドに移し、右下後肢をポビドンヨードで、静脈内注入が行われる場合には尾部を７０％エタノールで、滅菌した。５０μＬの１．２％ＢａＣｌ２（Sigma）を、前脛骨筋（ＴＡ）の長さに沿ってそこに注入し、細胞死を誘導した。マウスを安楽死させ、示されている時間で下肢を摘出し、４％パラホルムアルデヒド（Santa Cruz Biotechnology）中に２４時間固定した。ＴＡ筋を、切開し、さらに２４時間固定した後、パラフィン中に埋込み、切片にした。切片（５μｍ）を、ヘマトキシリン及びエオシンで染色して、中心核を有する線維を特定し、１０倍接眼／４０倍対物レンズを使用してOlympus BX51でイメージングした。マウス１匹当たり少なくとも４枚の画像から得られた線維の断面積（ＣＳＡ）を、ImageJ2ソフトウェア（ＮＩＨ）のＦＩＪＩ分布を使用して手動で測定した。データを、マウスごとにグループ分けした。マウスに、ＨＭＧＢ１コンストラクト（４６ｎＭ／ｋｇ、ＰＢＳ中に再懸濁）又はＰＢＳビヒクル対照を、傷害と同時又は傷害後のＨＭＧＢ１コンストラクトの最適な時間での投与のために傷害後に、筋肉内又は静脈内に注入した。
【0122】
in vivoマウス心臓傷害モデル
１０～１４週齢で２５～３０ｇの体重の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、外科手術に供した。すべてのマウスは、外科手術の直前にＦＲ－ＨＭＧＢ１（４６ｎＭ／ｋｇ、ＰＢＳ中に再懸濁）又はビヒクル対照のいずれかの静脈内注入を受けた。ブプレノルフィン（ブプレノルフィン塩酸塩、Vetergesic）を、鎮痛を提供するために手技の２０分前に０．０１５ｍｇ／ｍｌの溶液として、腹腔内注入によって送達した。マウスに、２．５％イソフルランで麻酔を行い、気管内チューブを介して外的に人工呼吸させた。心臓傷害を、開胸術による左前下行枝冠状動脈（ＬＡＤ）の恒久的な結紮によって誘導した。実験者らは、後続の心臓ｃｉｎｅＭＲＩ及び分析のために処理群に対して盲検とした。マウスを、制御された環境において収容し、維持した。すべての外科手技及び薬理学的手技は、Animals（Scientific Procedures）Act 1986, UKに従って行った。
１０～１４週齢で２５～３０ｇの体重の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、外科手術に供した。すべてのマウスは、外科手術の直前にＦＲ－ＨＭＧＢ１（４６ｎＭ／ｋｇ、ＰＢＳ中に再懸濁）又はビヒクル対照のいずれかの静脈内注入を受けた。ブプレノルフィン（ブプレノルフィン塩酸塩、Vetergesic）を、鎮痛を提供するために手技の２０分前に０．０１５ｍｇ／ｍｌの溶液として、腹腔内注入によって送達した。マウスに、２．５％イソフルランで麻酔を行い、気管内チューブを介して外的に人工呼吸させた。心臓傷害を、開胸術による左前下行枝冠状動脈（ＬＡＤ）の恒久的な結紮によって誘導した。実験者らは、後続の心臓ｃｉｎｅＭＲＩ及び分析のために処理群に対して盲検とした。マウスを、制御された環境において収容し、維持した。すべての外科手技及び薬理学的手技は、Animals（Scientific Procedures）Act 1986, UKに従って行った。
【0123】
心臓ｃｉｎｅＭＲＩ及び分析
心臓ｃｉｎｅＭＲＩを、ＬＡＤ結紮後にVarian DDRシステムを使用して７Ｔで行った。簡単に述べると、マウスに、酸素ガス中２％のイソフルランで麻酔し、恒温制御を有するカスタムの動物取扱システムに仰向けに置いた。前向きにゲーティングしたプロトン心臓画像を、機能的定量化のための２つ及び４つの心房の長軸図及び短軸スタックを得るために（１２８１２８の行列、２５．６ｍｍ＾２ ＦＯＶ、０．２ｍｍの平面分解脳）パーシャルフーリエ加速スポイルド勾配エコーＣＩＮＥ手順（ＴＲ ５．９ミリ秒、ＴＥ ２．２ミリ秒、３０ｋＨｚバンド幅、３０°ＦＡ、およそ２０～３０フレームを４ミリ秒の標識後遅延でＲ波にゲーティング；２０％の部分的取得；４つの平均）によって、７２ｍｍのボリューム送信／４チャネル表面受信コイル（Rapid Biomedical GmbH）で取得した。未取得のパーシャルフーリエデータは、単純なデカルト座標のＤＦＴの前に、凸集合への投影方法によって再構築した。盲検での画像分析を、ImageJ（ＮＩＨ）を使用して行った。左心室の質量、体積、及び駆出分画を、これまでに説明されているように計算した１。相対梗塞サイズを、拡張期に測定されたすべての切片の薄い無動領域の心内膜と心外膜の外周長さの平均から計算し、全心筋表面に対するパーセンテージとして表した[99]。
心臓ｃｉｎｅＭＲＩを、ＬＡＤ結紮後にVarian DDRシステムを使用して７Ｔで行った。簡単に述べると、マウスに、酸素ガス中２％のイソフルランで麻酔し、恒温制御を有するカスタムの動物取扱システムに仰向けに置いた。前向きにゲーティングしたプロトン心臓画像を、機能的定量化のための２つ及び４つの心房の長軸図及び短軸スタックを得るために（１２８１２８の行列、２５．６ｍｍ＾２ ＦＯＶ、０．２ｍｍの平面分解脳）パーシャルフーリエ加速スポイルド勾配エコーＣＩＮＥ手順（ＴＲ ５．９ミリ秒、ＴＥ ２．２ミリ秒、３０ｋＨｚバンド幅、３０°ＦＡ、およそ２０～３０フレームを４ミリ秒の標識後遅延でＲ波にゲーティング；２０％の部分的取得；４つの平均）によって、７２ｍｍのボリューム送信／４チャネル表面受信コイル（Rapid Biomedical GmbH）で取得した。未取得のパーシャルフーリエデータは、単純なデカルト座標のＤＦＴの前に、凸集合への投影方法によって再構築した。盲検での画像分析を、ImageJ（ＮＩＨ）を使用して行った。左心室の質量、体積、及び駆出分画を、これまでに説明されているように計算した１。相対梗塞サイズを、拡張期に測定されたすべての切片の薄い無動領域の心内膜と心外膜の外周長さの平均から計算し、全心筋表面に対するパーセンテージとして表した[99]。
【0124】
統計学的分析
すべての計算は、GraphPad Prism（v.8.41）を用いて行った。動態実験（ＢＬＩ／ＲＡＧＥ ＥＬＩＳＡ）については、すべての当てはめは、非線形最小二乗法によって行った。ＲＡＧＥ ＥＬＩＳＡについては、それぞれのＲＡＧＥ濃度は、ウェルの残りから独立しており、すべてのデータは、１つの動態当てはめと考えたが、しかしながら、ＢＬＩにおいては、それぞれのセンサーは、計算の目的で独立した当てはめと考えた。パラメーター間の比較は、ＡＵＣ法によって行った。マウス筋傷害モデルデータは、ネステッドＡＮＯＶＡとして分析し、ここでは、それぞれのカラムは、所与の動物に関するすべての筋肉ＣＳＡ値を含み、それぞれの群は、生物学的変動を治療効果から分離するために、すべての動物を含む。いずれの事例においても等しい分散仮定を満たすことができなかった場合、データは、クラスカル・ワリス検定によって分析し、ネステッドＡＮＯＶＡについては、それぞれの動物に由来する等しい数のデータを、ランダムに選択して歪みを回避することになる。任意の他のデータは、不等分散性プロット及びＱ／Ｑプロットが等しい分散仮定を裏付けた場合[100]、一方向ＡＮＯＶＡによって分析し、これらはまた、スピアマンの検定によっても検証した。多変量実験（例えば、心臓実験）については、２段階ＡＮＯＶＡを、同じ仮定のもとで使用した（この事例において不等分散性を乱すデータセットはなかった）。事後検定での比較は、ホルム・シダック補正（ＡＮＯＶＡファミリー検定）又はダンズ法（クラスカル・ワリス）によって重み付けした。それぞれの事例において選択された検定は、それぞれの図の凡例の下に記載されている。有意差の凡例：ｎ．ｓ；有意差なし、＊；p<0.033、＊＊；p<0.002、＊＊＊；p<0.0002、＊＊＊＊；p<0.0001。
すべての計算は、GraphPad Prism（v.8.41）を用いて行った。動態実験（ＢＬＩ／ＲＡＧＥ ＥＬＩＳＡ）については、すべての当てはめは、非線形最小二乗法によって行った。ＲＡＧＥ ＥＬＩＳＡについては、それぞれのＲＡＧＥ濃度は、ウェルの残りから独立しており、すべてのデータは、１つの動態当てはめと考えたが、しかしながら、ＢＬＩにおいては、それぞれのセンサーは、計算の目的で独立した当てはめと考えた。パラメーター間の比較は、ＡＵＣ法によって行った。マウス筋傷害モデルデータは、ネステッドＡＮＯＶＡとして分析し、ここでは、それぞれのカラムは、所与の動物に関するすべての筋肉ＣＳＡ値を含み、それぞれの群は、生物学的変動を治療効果から分離するために、すべての動物を含む。いずれの事例においても等しい分散仮定を満たすことができなかった場合、データは、クラスカル・ワリス検定によって分析し、ネステッドＡＮＯＶＡについては、それぞれの動物に由来する等しい数のデータを、ランダムに選択して歪みを回避することになる。任意の他のデータは、不等分散性プロット及びＱ／Ｑプロットが等しい分散仮定を裏付けた場合[100]、一方向ＡＮＯＶＡによって分析し、これらはまた、スピアマンの検定によっても検証した。多変量実験（例えば、心臓実験）については、２段階ＡＮＯＶＡを、同じ仮定のもとで使用した（この事例において不等分散性を乱すデータセットはなかった）。事後検定での比較は、ホルム・シダック補正（ＡＮＯＶＡファミリー検定）又はダンズ法（クラスカル・ワリス）によって重み付けした。それぞれの事例において選択された検定は、それぞれの図の凡例の下に記載されている。有意差の凡例：ｎ．ｓ；有意差なし、＊；p<0.033、＊＊；p<0.002、＊＊＊；p<0.0002、＊＊＊＊；p<0.0001。
【0125】
ＮＭＲ化学シフトの表
０、０．４２、０．８２及び１．４２モル当量のＣＸＣＬ１２Ａ－ｃ０２１で滴定したＨＭＧＢ１－ｃ０２８（９４～１６２、ビオチン化）、図３Ａ及び３Ｂ
タンパク質の量の制限のため、順次、ＨＭＧＢ１試料にＣＸＣＬ１２を添加して滴定を行い、試料を希釈した。ＣＣＰＮＭＲの化学シフト追跡モジュールでの計算はピークに依存しないので、これによって結果は変わらない。中央値の変化は容積の比較で示される。
０、０．４２、０．８２及び１．４２モル当量のＣＸＣＬ１２Ａ－ｃ０２１で滴定したＨＭＧＢ１－ｃ０２８（９４～１６２、ビオチン化）、図３Ａ及び３Ｂ
タンパク質の量の制限のため、順次、ＨＭＧＢ１試料にＣＸＣＬ１２を添加して滴定を行い、試料を希釈した。ＣＣＰＮＭＲの化学シフト追跡モジュールでの計算はピークに依存しないので、これによって結果は変わらない。中央値の変化は容積の比較で示される。
【0126】
【表1】
【0127】
【表2】
【0128】
【表3-1】
【0129】
【表3-2】
【0130】
３Ｄ実験（第１日）
３Ｄ特性のためこれらのスペクトルは示していないが、必要であれば、データは利用可能である。試料はベースライン１のものである。
３Ｄ特性のためこれらのスペクトルは示していないが、必要であれば、データは利用可能である。試料はベースライン１のものである。
【0131】
【表4】
【0132】
【表5-1】
【0133】
【表5-2】
【0134】
【表6】
【0135】
【表7-1】
【0136】
【表7-2】
【0137】
【表8】
【0138】
【表9-1】
【0139】
【表9-2】
【0140】
【表10】
【0141】
【表11-1】
【0142】
【表11-2】
【0143】
０、０．４２、０．８２及び１．４２モル当量のＣＸＣＬ１２Ａ－ｃ０２１で滴定したＨＭＧＢ１－ｃ０３８（８９～１７４、ビオチン化）、図３Ａ及び３Ｂ
タンパク質の量の制限のため、順次、ＨＭＧＢ１試料にＣＸＣＬ１２を添加して滴定を行い、試料を希釈した。ＣＣＰＮＭＲの化学シフト追跡モジュールでの計算はピークに依存しないので、これによって結果は変わらない。中央値の変化は容積の比較で示される。
タンパク質の量の制限のため、順次、ＨＭＧＢ１試料にＣＸＣＬ１２を添加して滴定を行い、試料を希釈した。ＣＣＰＮＭＲの化学シフト追跡モジュールでの計算はピークに依存しないので、これによって結果は変わらない。中央値の変化は容積の比較で示される。
【0144】
【表12】
【0145】
【表13】
【0146】
【表14-1】
【0147】
【表14-2】
【0148】
３Ｄ実験（第１～５日）
３Ｄ特性のためこれらのスペクトルは示していないが、必要であれば、データは利用可能である。試料はベースライン１のものである。
３Ｄ特性のためこれらのスペクトルは示していないが、必要であれば、データは利用可能である。試料はベースライン１のものである。
【0149】
【表15】
【0150】
【表16】
【0151】
【表17-1】
【0152】
【表17-2】
【0153】
【表18】
【0154】
【表19-1】
【0155】
【表19-2】
【0156】
【表20】
【0157】
【表21-1】
【0158】
【表21-2】
【0159】
【表22】
【0160】
【表23-1】
【0161】
【表23-2】
【0162】
１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中の、モル比１：２のＨＭＧＢ１Ａ－ｃ００７（３Ｓ、１～１８４）とＣＸＣＬ１２（１：１ モル比 ＣＸＣＬ１２／ＨＭＧボックス）、図１２
【0163】
【表24】
【0164】
【表25】
【0165】
【表26-1】
【0166】
【表26-2】
【0167】
【表26-3】
【0168】
３Ｄ実験（第１日）
３Ｄ特性のためこれらのスペクトルは示していないが、必要であれば、データは利用可能である。試料はベースライン１のものである。
３Ｄ特性のためこれらのスペクトルは示していないが、必要であれば、データは利用可能である。試料はベースライン１のものである。
【0169】
【表27】
【0170】
【表28】
【0171】
【表29-1】
【0172】
【表29-2】
【0173】
【表29-3】
【0174】
【表30】
【0175】
【表31-1】
【0176】
【表31-2】
【0177】
【表31-3】
【0178】
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【0179】
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【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図7F】
【図7G】
【図7H】
【図7I】
【図7J】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】
【国際調査報告】