▶ フェニックス イーグル カンパニー ピーティーワイ リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-27
(54)【発明の名称】組成物及び製造の方法
(51)【国際特許分類】
A61K 38/48 20060101AFI20230317BHJP
A61K 36/185 20060101ALI20230317BHJP
A61K 8/66 20060101ALI20230317BHJP
A61K 8/9789 20170101ALI20230317BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20230317BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20230317BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20230317BHJP
【ＦＩ】
A61K38/48 100
A61K36/185
A61K8/66
A61K8/9789
A61P17/02
A61Q19/00
A61P17/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2022539183
(86)(22)【出願日】2020-12-22
(85)【翻訳文提出日】2022-08-22
(86)【国際出願番号】 IB2020062349
(87)【国際公開番号】W WO2021130675
(87)【国際公開日】2021-07-01
(31)【優先権主張番号】1919385.3
(32)【優先日】2019-12-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】505018315
【氏名又は名称】フェニックス イーグル カンパニー ピーティーワイ リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100123995
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 雅一
(72)【発明者】
【氏名】リチャードソン， マーク
(72)【発明者】
【氏名】ブロックルハースト， キース
(72)【発明者】
【氏名】トリジャンテ， ジュゼッペ
【テーマコード（参考）】
4C083
4C084
4C088
【Ｆターム（参考）】
4C083AA111
4C083AA112
4C083AD471
4C083AD472
4C083CC02
4C083EE11
4C083EE13
4C084AA02
4C084BA01
4C084CA13
4C084DC03
4C084DC07
4C084MA02
4C084MA63
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZA89
4C088AB12
4C088AC04
4C088BA09
4C088BA16
4C088CA05
4C088CA14
4C088MA01
4C088MA63
4C088NA05
4C088NA14
4C088ZA89
(57)【要約】
本発明は、カリカ・パパイヤ由来セリンプロテアーゼを含む組成物、果実供給源からプロテアーゼを抽出する方法、並びにその美容的及び治療的使用、並びに関連キットに関する。
【選択図】 なし
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
カリカ・パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）植物の熟した果実から抽出された１種又は複数の活性セリンプロテアーゼを含む、組成物。
【請求項2】
配列番号１のアミノ酸１１８～７６３と少なくとも９５％の相同性を有する連続アミノ酸配列を有する活性セリンプロテアーゼを含む、組成物。
【請求項3】
配列番号１のアミノ酸１４２～６１８と少なくとも９５％の相同性を有する連続アミノ酸配列を有する活性セリンプロテアーゼを含む、組成物。
【請求項4】
カリカ・パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）植物の熟した果実から抽出された１種又は複数の活性セリンプロテアーゼ及び１種又は複数の活性システインプロテアーゼとの混合物を含む、組成物。
【請求項5】
カリカ・パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）植物の熟した果実パルプを、加熱ステップに供することなく、アルカリで処理するステップを含む、活性セリンプロテアーゼを含む組成物を調製するための方法。
【請求項6】
前記アルカリが弱アルカリである、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記弱アルカリが１１未満のｐＫａを有する、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記弱アルカリが炭酸水素ナトリウムである、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記組成物が活性システインプロテアーゼをさらに含む、請求項５～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
可溶性プロテアーゼが、前記アルカリ処理後に不溶性植物材料から分離される、請求項５～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記組成物が、前記プロテアーゼの濃度を増加させるためにさらに処理される、請求項５～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
請求項５～１１のいずれか一項に記載の方法によって取得可能な活性セリンプロテアーゼを含む、組成物。
【請求項13】
活性カリカ・パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）セリンプロテアーゼを、薬学的に許容できる担体又は希釈剤とともに含む、医薬組成物。
【請求項14】
請求項１～４及び１２のいずれか一項に記載の組成物を、薬学的に許容できる担体又は希釈剤とともに含む、医薬組成物。
【請求項15】
活性カリカ・パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）セリンプロテアーゼを、化粧品として許容できる担体又は希釈剤とともに含む、化粧品組成物。
【請求項16】
請求項１～４及び１２のいずれか一項に記載の組成物を、化粧品として許容できる担体又は希釈剤とともに含む、化粧品組成物。
【請求項17】
創傷デブリードマンにおける使用のための、請求項１３又は１４に記載の医薬組成物。
【請求項18】
皮膚エクスフォリエーション（ｅｘｏｆｏｌｉａｔｉｏｎ）における、請求項１５又は１６に記載の組成物の使用。
【請求項19】
請求項１～４及び１２～１６のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与するステップを含む、皮膚病状を予防する、治療する、低下させる、又は改善する方法。
【請求項20】
請求項１～４及び１２～１６のいずれか一項に記載の組成物、並びに使用のための使用説明書を含む、皮膚病状を予防する、治療する、低下させる、又は改善することにおける使用のための又は使用される場合のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、カリカ・パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）植物において同定された少なくとも１種のプロテアーゼを含む組成物、カリカ・パパイヤ植物から組成物を産生するための方法、前述の方法によって取得される又は取得可能な少なくとも１種のプロテアーゼを含む組成物、医薬及び化粧品の製造におけるそのような組成物の使用、創傷を含めた疾患及び障害の治療におけるそのような組成物の使用、美容的適用におけるそのような組成物の使用、並びに本発明の方法又は使用を行うための関連キットに関する。
【背景技術】
【0002】
糖尿病性足潰瘍、褥瘡、静脈性潰瘍、及び動脈性潰瘍を含むがそれらに限定されない、多くのタイプの慢性創傷の有効な管理は、依然として課題のままである。そのような創傷は、治癒するのに著しい量の時間を要することがある又は決して本当には治癒せず、医療専門家からの著しい援助を要する。アスコルビン酸、Ｉ型コラーゲン、及びアルファ－トコフェロールアセテートを含有する、デンプンの加水分解によって取得されるＤ－グルコース多糖の包帯等、創傷治癒を支援する数々の製品がこれまでに開発されている（米国特許第６，１８７，７４３号）。
【0003】
創傷デブリードマン（ｄｅｂｒｉｄｅｍｅｎｔ）のためのパパイン及びブロメライン等のプロテアーゼの使用にもこれまでに関心が集まっている。
【発明の概要】
【0004】
本発明者らは、熟したパパイヤ（カリカ・パパイヤ）の果肉をアルカリで処理することによって取得される濾液において、その果実において活性プロテアーゼとしてこれまでに同定されていないプロテアーゼの存在を同定した。本発明者らは、このプロテアーゼがセリンプロテアーゼであること、並びに濾液がセリンプロテアーゼ及びシステインプロテアーゼ活性の両方を含有することを確認した。薬用蛆虫からの分泌物において同定されたセリンプロテアーゼ（ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｌａｓら、２０１４、ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９（３）：ｅ９２０９６）は、プラスミノーゲンを分解することによってプラスミノーゲン活性化因子誘導性線維素溶解を増強することがこれまでに示されており、このセリンプロテアーゼは、壊死組織の創傷をデブリードする薬用蛆虫の能力に寄与することができることが示唆された。
【0005】
したがって、第１の態様において、本発明は、アルカリ処理された、パルプ化した（pulped）熟したカリカ・パパイヤ果実（pulped ripe Carica papaya fruit；熟したカリカ・パパイヤ果実パルプ）から抽出された活性セリンプロテアーゼ等、カリカ・パパイヤ植物の熟した果実から抽出された活性セリンプロテアーゼを含む組成物を提供する。
【0006】
１つの実施形態において、活性セリンプロテアーゼは、不溶性カリカ・パパイヤ由来材料を実質的に含んでいない。
【0007】
第２の実施形態において、セリンプロテアーゼは、配列番号１のアミノ酸１１３～７７１と少なくとも９５、９６、９７、９８、又は９９％の相同性（との配列同一性等）を有する連続アミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、セリンプロテアーゼは、６５～７５ｋＤａ、例えば約７０ｋＤａの分子量を有する。
【0008】
第３の実施形態において、セリンプロテアーゼは、４５～５５ｋＤａの分子量を有し、配列番号１のアミノ酸１４２～６１８と少なくとも９５％の相同性を有する連続アミノ酸配列を含む。ゆえに、本発明は、４５～５５ｋＤａの分子量を有し、配列番号１のアミノ酸１４２～６１８と少なくとも９５％の相同性を有する連続アミノ酸配列を含む、単離された活性セリンプロテアーゼを含む組成物を提供する。
【0009】
本発明は、不溶性カリカ・パパイヤ由来材料を実質的に含んでいない単離された活性セリンプロテアーゼを含む組成物であって、セリンプロテアーゼは、４５～５５ｋＤａの分子量を有し、配列番号１のアミノ酸１４２～６１８と少なくとも９５％の相同性を有する連続アミノ酸配列を含む、組成物も提供する。
【0010】
第２の態様において、本発明は、カリカ・パパイヤに由来する又はそれから導き出せる１種又は複数の活性セリンプロテアーゼと、カリカ・パパイヤに由来する又はそれから導き出せる１種又は複数の活性システインプロテアーゼとの混合物を含む組成物を提供する。１つの実施形態において、１種又は複数の活性プロテアーゼは、熟したカリカ・パパイヤから抽出される。別の実施形態において、１種又は複数の活性プロテアーゼは、組み換え発現システムを使用して産生される。
【0011】
本発明は、熟したカリカ・パパイヤからプロテアーゼを抽出することによって、少なくとも１種の活性セリンプロテアーゼを含む組成物を調製する方法にも関する。したがって、第３の態様において、本発明は、活性セリンプロテアーゼを含む組成物を調製するための方法であって、方法は、パルプを加熱ステップに供することなく、熟したカリカ・パパイヤ果実パルプをアルカリで処理するステップを含む、方法を提供する。１つの実施形態において、アルカリは、弱アルカリ、好ましくは炭酸水素ナトリウムである。
【0012】
この方法によって作製される組成物は、カリカ・パパイヤに由来する又はそれから導き出せる１種又は複数のシステインプロテアーゼをさらに含んでもよい。
【0013】
１つの実施形態において、少なくとも１種の可溶性プロテアーゼは、アルカリ処理後に不溶性植物材料から分離される。
【0014】
組成物は、例えば凍結乾燥、透析、サイズ排除クロマトグラフィー、又はその組み合わせを使用して、１種又は複数のプロテアーゼの濃度を増加させるためにさらに処理されてもよい。
【0015】
第４の態様において、本発明は、本発明の方法によって取得される又は取得可能なセリンプロテアーゼを含む組成物をさらに提供する。
【0016】
組成物は、薬学的又は美容的適用により適しているように製剤化されてもよい。したがって、第５の態様において、本発明は、薬学的に許容できる担体又は希釈剤とともに活性カリカ・パパイヤセリンプロテアーゼを含む医薬組成物、並びに化粧品として許容できる担体又は希釈剤とともに活性カリカ・パパイヤセリンプロテアーゼを含む化粧品組成物を提供する。関連する態様において、本発明は、薬学的に許容できる担体又は希釈剤との本発明の第１、第２、又は第４の態様のいずれかの組成物、並びに化粧品として許容できる担体又は希釈剤とともに本発明の第１、第２、又は第４の態様のいずれかの組成物を含む化粧品組成物を提供する。
【0017】
本発明の組成物は、薬学的及び美容的適用の範囲において使用されることができる。したがって、第６の態様において、本発明は、皮膚病状に罹患している患者を治療する方法であって、方法は、患者の病変エリアに本発明の組成物を投与するステップを含む、方法も提供する。一部の実施形態において、組成物は、創傷を含めた疾患及び障害の治療に使用される。一部の実施形態において、組成物はデブリードマンに使用される。一部の実施形態において、組成物は、火傷を治療するために使用される。一部の実施形態において、組成物は、潰瘍を治療するために使用される。一部の実施形態において、組成物は、壊疽を治療するために使用される。一部の実施形態において、組成物は局所的に適用される。
【0018】
本発明は、第７の態様において、個体の表皮を滑らかにすること及び再生等の所望の美容的成果を達成する方法であって、方法は、患者の病変エリアに本発明の組成物を適用するステップを含む、方法をさらに提供する。本発明は、本発明の組成物を使用した美容的方法も提供する。一部の実施形態において、組成物は、エクスフォリエーションに、皮膚を明るくするために、又はシワ、皮膚のシミ、そばかす、吹き出物、ニキビ、酒さ、黒点（ｓｕｎ ｓｐｏｔ）、傷痕、若しくは静脈瘤に適用するために、又は乾燥した、老化した、若しくは損傷を受けた皮膚に適用するために使用される。
【0019】
第８の態様において、本発明は、医薬の製造における、第１、第２、第４、又は第５の態様の組成物の使用を提供する。一部の実施形態において、医薬は、創傷を含めた疾患及び障害の治療のためのものである。一部の実施形態において、医薬はデブリードマンのためのものである。一部の実施形態において、医薬は、火傷を治療するためのものである。一部の実施形態において、医薬は、潰瘍を治療するためのものである。一部の実施形態において、医薬は、壊疽を治療するためのものである。
【0020】
第９の態様において、本発明は、化粧品の製造における、第１、第２、第４、又は第５の態様の組成物の使用を提供する。一部の実施形態において、化粧品はエクスフォリエーションのためのものである。
【0021】
第１０の態様において、本発明は、創傷を含めた疾患及び障害の治療における使用のための、第１、第２、第４、又は第５の態様の組成物を提供する。一部の実施形態において、治療はデブリードマンである。一部の実施形態において、治療は潰瘍に対するものである。一部の実施形態において、組成物は局所的に適用される。
【0022】
第１１の態様において、本発明は、エクスフォリエーションにおける使用のための、第１、第２、第４、又は第５の態様の組成物を提供する。
【0023】
第１２の態様において、本発明は、第１、第２、第４、又は第５の態様の組成物を含むキットを提供する。１つの実施形態において、キットは、本発明の方法を実施するために使用される。
【0024】
本発明の組成物は、例えばカプセル、錠剤、クリーム、軟膏、溶液、ペースト、液滴、スプレー、エアロゾル、蒸気、ワイプ、パッチ、ガーゼ、ゲル、又は液体として製剤化され得る。したがって、１つの実施形態において、本発明の組成物は、カプセル、錠剤、クリーム、軟膏、溶液、ペースト、液滴、スプレー、エアロゾル、蒸気、ワイプ、パッチ、ガーゼ、ゲル、又は液体として提供され又はパッケージされ、使用前に再構成される必要はない。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】重ね合わせザイモグラフィーの概略的表示である。重ね合わせザイモグラフィープロセス、及び、その後の酵素活性スポットからのバンドの後続の切り出し、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルへのプロセス。
【図2】フランツ型セル拡散システムを使用したデブリードアッセイの表示である（Ｓｈｉ、Ｅｒｍｉｓら、２００９）。
【図3】ＯＰＡＬ Ａ及びＯＰＡＬ Ｂ濾液のＬ－ＢＡｐＮＡタンパク質分解活性の棒グラフプロットである。時間経過の傾きによって測定される、Ｌ－ＢＡｐＮＡに対するＯＰＡＬ Ａ及びＯＰＡＬ Ｂ濾液。ＯＰＡＬ Ｂ濾液は、ＯＰＡＬ Ａ濾液と比較して、ほぼ８倍大きな触媒活性を有する。結果は、ｎ＝８の実験に対する平均±Ｓ．Ｄとして表されている。スチューデントＴ検定を使用して、構造分析を行った（＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図4】ＯＰＡＬ Ｂ濾液による及びＥ－６４の添加を有する、Ｌ－ＢＡｐＮＡの酵素的加水分解の分光光度プロットである。代表的なプロットは、ＯＰＡＬ Ｂ濾液による基質Ｌ－ＢＡＰＮＡの酵素的加水分解、及びシステインプロテアーゼ阻害剤Ｅ－６４による部分的活性阻害を示し、システインプロテアーゼに加えて他のプロテアーゼの存在を示唆する。
【図5】ＯＰＡＬ Ｂ濾液のタンパク質分解活性に対するプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＰＩＣ）の効果についての分光光度プロットである。代表的なトレース図は、ＯＰＡＬ Ｂ濾液による基質Ｌ－ＢＡＰＮＡの酵素的加水分解、及びＰＩＣによる酵素的加水分解の完全な阻害を示す。
【図6】ＯＰＡＬ Ｂ濾液のタンパク質分解活性に対する種々のプロテアーゼ阻害剤クラスの効果についての棒グラフプロットである。
【図7】ＯＰＡＬ Ｂ濾液のタンパク質分解活性に対するＥ－６４＋ＡＥＢＳＦの効果についての分光光度プロットである。代表的なトレース図は、システインプロテアーゼ阻害剤Ｅ－６４及びセリンプロテアーゼ阻害剤ＡＥＢＳＦの組み合わせによる、ＯＰＡＬ Ｂ濾液におけるＬ－ＢＡＰＮＡ活性の完全な阻害を示す。
【図8】ＯＰＡＬ Ｂ濾液の重ね合わせザイモグラフィー分析の図である。
【図9】ＯＰＡＬ Ｂ濾液の重ね合わせザイモグラフィー分析、及び阻害剤を使用することに対する効果を示した図である。ＯＰＡＬ ＢサンプルにおけるネイティブＰＡＧＥゲルバンドを取得し、その後、タンパク質バンドをゲルからニトロセルロース膜に移した。ザイモグラフィー分析は、対照における２種の酵素活性、並びにシステインプロテアーゼ阻害剤Ｅ－６４を用いた上方バンドの完全な阻害（－－－）、及びセリンプロテアーゼ阻害剤ＡＥＢＳＦを用いた下方バンドの阻害（－－－）を示す。
【図10】溶出２～１０を用いて流したＳＤＳ ＰＡＧＥゲルの銀染色の図である。８０ｋＤａにおいて第６画分に存在する高強度のバンド、並びに５０ｋＤａ及び３０ｋＤａにおけるバンドを、ＬＣ／ＭＳ分析を使用して分析し、サブチラーゼとして明らかにした。
【図11】様々な処理を使用してセリンプロテアーゼプローブで処理されたＯＰＡＬ Ｂ濾液のＳＤＳ ＰＡＧＥウェスタンブロッティング分析の図である。ｔｒｉｓ－ＨＣｌを有しない（レーン２）、及び５ｍｇ／ｍｌ ｔｒｉｓ－ＨＣｌを有する（レーン４）、１０ｍｇ／ｍｌ ｔｒｉｓ－ＨＣＬを有する（レーン６）、並びにそれぞれＡＥＢＳＦを有する（レーン３、５、及び７）、１μｌプローブ（１００μｌあたり）で処理されたＯＰＡＬ Ｂ濾液のＳＤＳ ＰＡＧＥウェスタンブロッティング分析。Ｅ－６４とともに（レーン６）並びにＥ－６４及びＡＥＢＳＦとともに（レーン７）、１μｌプローブ及び１０ｍｇ／ｍＬ ｔｒｉｓ－ＨＣｌを用いたＯＰＡＬ Ｂ濾液は、バックグラウンドの乱れを示さない。
【図12】ＯＰＡＬ Ａは、コラーゲン及びフィブリンを消化することにおいてより優れており、一方で対照ラテックスパパインは、エラスチンを消化することにおいてより優れていることを示した、ラテックス－パパインと比較した、ＯＰＡＬ Ａ濾液によるＡＷＥ基質の差示的消化（活性パーセンテージ）を示した図である。結果は、ｎ＝３の実験に対する平均±ＳＤとして表されている。スチューデントＴ検定を使用して、構造分析を行った（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図13】天然ＯＰＡＬ Ａ濾液と比較した、透析されたＯＰＡＬ Ａ及びＯＰＡＬ Ａ＋１０％尿素によるＡＷＥ基質の差示的消化（活性パーセンテージ）を示した図である。透析されたＯＰＡＬ Ａは、フィブリン及びエラスチンの両方に対する増強したデブリード活性を有したが、コラーゲンに対しては有せず、このことは、コラーゲンに対するＯＰＡＬ Ａのより低い活性と相関する。尿素のＯＰＡＬ Ａ添加は、ＡＷＥアッセイにおいて、フィブリン及びエラスチンに対する酵素の活性を阻害した。結果は、ｎ＝３の実験に対する平均±Ｓ．Ｄとして表されている。スチューデントＴ検定を使用して、構造分析を行った（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図14】ＯＰＡＬ Ｂを用いた重度の褥瘡の管理に関するインビボ事例研究、Ｏｐａｌ Ｂを用いた治療の開始前の図である。壊死の中央エリア。偏菱形の（ｒｏｍｂｏｉｄ）皮弁を用いて潰瘍のサイズを低下させようとする試みの失敗。浅黒い皮弁の遠位部分。注意－グラフィック画像。
【図15】ＯＰＡＬ Ｂを用いた重度の褥瘡の管理に関するインビボ事例研究、治療２日目の図である。生存可能となるものから壊死になるエリアの描写。ピンク色の創傷の縁、及び皮膚皮弁への良好な血流。注意－グラフィック画像。
【図16】ＯＰＡＬ Ｂを用いた重度の褥瘡の管理に関するインビボ事例研究、治療４日目の図である。生存組織と生存不能組織との間のはっきりとした境界。生存組織は、綺麗で且つピンク色に見える。皮膚皮弁は十分に生存可能に見える。注意－グラフィック画像。
【図17】ＯＰＡＬ Ｂを用いた重度の褥ｄ瘡の管理に関するインビボ事例研究、治療１６日目の図である。創傷を外科的にデブリードし、縫合糸を除去し、皮弁を切除した。綺麗な創傷表面の早期肉芽形成が明瞭である。創傷の縁はピンク色であり、新たな皮膚成長の示唆である（これまでの画像の皮膚の色に合致するように調整された曝露）。注意－グラフィック画像。
【図18】ＯＰＡＬ Ｂを用いた重度の褥瘡の管理に関するインビボ事例研究、治療１９日目の図である。皮膚及び創傷の色、特に創傷の縁は浅黒くなる。創傷は綺麗なままである（より早期の画像の皮膚の色に合致するように調整された曝露）。注意－グラフィック画像。
【発明を実施するための形態】
【0026】
定義
別様に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって共通に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様の又は等価の任意の方法及び材料が、本発明の実践又は試験において使用されることができるものの、好ましい方法及び材料が記載される。本発明の目的上、以下の用語が下で定義される。
別様に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって共通に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様の又は等価の任意の方法及び材料が、本発明の実践又は試験において使用されることができるものの、好ましい方法及び材料が記載される。本発明の目的上、以下の用語が下で定義される。
【0027】
「約」によって、参照の分量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さと２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１％ほど変動する、分量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さを意味する。
【0028】
「活性プロテアーゼ」によって、タンパク質分解的に活性（proteolyticactivity）であるプロテアーゼを意味する。
【0029】
本明細書を通じて、文脈上別様に要されない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、明記されるステップ若しくは要素又はステップ若しくは要素の群の内包を意味するが、任意の他のステップ若しくは要素又はステップ若しくは要素の群の除外を意味するわけではないと理解されるであろう。ゆえに、「含むこと」等の用語の使用は、列挙されるステップ又は要素は要される又は必須であるが、他のステップ又は要素は任意選択であり、存在してもしなくてもよいことを示す。
【0030】
「からなる」によって、「からなる」という語句の後に続くものは何でも含み且つそれに限定されることを意味する。ゆえに、「からなる」という語句は、列挙される要素は要され又は必須であり、他の要素は存在することができないことを示す。「から本質的になる」によって、該語句の後に列挙される任意の要素を含み、列挙される要素に対する開示において指定される活性又は作用を妨害しない又は寄与しない他の要素に限定されることを意味する。ゆえに、「から本質的になる」という語句は、列挙される要素は要される又は必須であるが、他の要素は任意選択であり、それら他の要素が、列挙される要素の活性又は作用に影響を及ぼすか否かに応じて存在してもしなくてもよいことを示す。
【0031】
「デブリードマン」という用語は、創傷からの死んだ及び損傷を受けた組織の除去を指す。
【0032】
「導き出せる」という用語は、「取得可能な」という用語と互換可能に使用されてもよい。
【0033】
「由来する」という用語は、「取得される」という用語と互換可能に使用されてもよい。
【0034】
「単離された」によって、材料の天然状態において通常では材料に伴う構成要素の一部又はすべてを実質的に又は本質的に含んでいない材料を意味する。例えば、本明細書において使用される「単離されたプロテアーゼ」とは、ペプチド又はポリペプチドプロテアーゼ分子の天然の細胞環境からの、及び細胞の構成要素の一部又はすべてとの結び付きからの、ペプチド又はポリペプチドプロテアーゼ分子のインビトロ単離及び／又は部分的精製を指す。
【0035】
「取得可能な」という用語は、本発明のタンパク質又は組成物との関連で使用される場合、特定の指定される方法によって産生されるタンパク質又は組成物だけでなく、しかしながら、例えば果実若しくは野菜由来のプロテアーゼを供給することによって、又は例えば組み換え発現システムを使用することによる組み換えＤＮＡ技術若しくは他の遺伝子操作法によって産生される同じタンパク質又は組成物も含む。
【0036】
「患者」、「対象」、及び「個体」という用語は互換可能に使用され、ヒト又は他の動物の患者、対象、及び個体を指し、本発明を使用して疾患、障害、又は病状を治療する、予防する、改善する、又はその重症度を低下させることが望まれる任意のものを含む。しかしながら、「患者」とは、症状が存在することを暗示するわけではないことが理解されるであろう。本発明の範囲に入る哺乳類等の適切な動物は、霊長類（例えば、ヒト、チンパンジー）、家畜動物（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、実験室試験動物（例えば、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター）、伴侶動物（例えば、ネコ、イヌ）、及び捕獲野生動物（例えば、キツネ、シカ、ディンゴ）を含むが、それらに制限されるわけではない。
【0037】
「野生型」及び「天然に存在する」という用語は、天然に存在する供給源から単離された場合に、そのタンパク質の特徴を有するタンパク質を指すために互換可能に使用される。野生型タンパク質（例えば、ポリペプチド）とは、集団において最も高頻度に観察され、ゆえに任意に、当該タンパク質の「通常の」又は「野生型」形態と呼ばれるものである。
【0038】
「創傷」という用語は、皮膚が切れている又は分断されている、生体組織への傷害を意味し、ヒフ潰瘍及び火傷を含む。ヒフ潰瘍は、糖尿病性潰瘍、褥瘡、静脈性（又は静脈瘤）潰瘍、及び動脈性潰瘍を含んでもよい。
【0039】
本明細書における任意の先行技術への参照は、先行技術が、当業者の共通の一般知識の一部を形成するという承認又は任意の形態の示唆ではなく、承認又は任意の形態の示唆として受け取られるべきではない。
【0040】
本明細書において挙げられるすべての刊行物、特許、特許出願、及び他の資料の全内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【発明の詳細な説明】
【0041】
セリンプロテアーゼを含む組成物
本発明は、カリカ・パパイヤ植物の熟した果実を、炭酸水素ナトリウム等のアルカリでパルプ化する（ｐｕｌｐ）処理後等、カリカ・パパイヤ植物の熟した果実から抽出され得る又は別様に由来し得る少なくとも１種の活性セリンプロテアーゼを含む組成物に関する。
本発明は、カリカ・パパイヤ植物の熟した果実を、炭酸水素ナトリウム等のアルカリでパルプ化する（ｐｕｌｐ）処理後等、カリカ・パパイヤ植物の熟した果実から抽出され得る又は別様に由来し得る少なくとも１種の活性セリンプロテアーゼを含む組成物に関する。
【0042】
「活性セリンプロテアーゼ（ｐｒｏｅｔｅａｓｅ）」という用語は、１種又は１種を上回る活性セリンプロテアーゼを指すと理解されるべきである。
【0043】
１つの実施形態において、活性セリンプロテアーゼは、配列番号２～５に示される配列の１種若しくは複数の配列、例えば配列番号２、３、及び４に示される配列、又は配列番号２、３、４、及び５にそれぞれ示される４種すべての配列を含むアミノ酸配列を有する。
【0044】
少なくとも１種の活性セリンプロテアーゼは、主要な触媒三残基Ａｓｐ、Ｈｉｓ、及びＳｅｒ（それぞれ、配列番号１において残基１５１、２２１、及び５５８に示される）、並びに残基３２６における保存された基質結合部位Ａｓｎを含有する当該タンパク質の触媒ドメインである、配列番号１のアミノ酸１４２～６１８と少なくとも９５％の配列相同性（好ましくは配列同一性）、例えば９６、９７、９８、又は９９％の配列相同性（好ましくは配列同一性）を有する連続配列を典型的に含む。
【0045】
配列番号１（太字で示される、Ｈｉｓ２２１及び配列番号２～１９のペプチド）
アミノ酸１～２５は推定シグナル配列であり、アミノ酸２６～１１２は、切断されて成熟タンパク質を形成する推定プロ領域である。
アミノ酸１～２５は推定シグナル配列であり、アミノ酸２６～１１２は、切断されて成熟タンパク質を形成する推定プロ領域である。
【0046】
配列番号２～配列番号５は、それぞれ配列番号７、配列番号１２、配列番号１４、及び配列番号１５のペプチドフラグメントである。
【0047】
１つの実施形態において、本発明の少なくとも１種の活性セリンプロテアーゼは、当該タンパク質がセリンプロテアーゼ活性を保持するという条件で、最高３又は５個等の最高１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個、又はそれを上回る数のアミノ酸改変（欠失、挿入、及び／又は置換）を有する、配列番号１のアミノ酸１１８～７６３由来のアミノ酸配列を含む。
【0048】
ポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、切り取り、及び挿入を含めた様々な手段で改変されることができる。そのような操作のための方法は、当技術分野において一般的に知られている。
【0049】
本発明のセリンプロテアーゼは、それらの活性形態である、すなわち不活性酵素前駆体としてではない。
【0050】
１つの実施形態において、本明細書における実験結果は、カリカ・パパイヤから単離され且つ５０ｋＤａの見かけの分子量を有するタンパク質が、活性セリンプロテアーゼとして存在したことを示唆する。したがって、１つの実施形態において、本発明の少なくとも１種の活性セリンプロテアーゼは、４５～５５ｋＤａ、例えば４８～５２ｋＤａ、例えば約５０ｋＤａの分子量を有してもよい。本発明の少なくとも１種のプロテアーゼの分子量は、約４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、又は５５ｋＤａであってもよい。分子量はＳＤＳ ＰＡＧＥによって査定されることができ、ゆえに、プロテアーゼは、４８～５２ｋＤａ、例えば約５０ｋＤａ等の４５～５５ｋＤａの、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって測定される平均分子量を有する。代替的に、分子量は、一次アミノ酸配列に基づいて算出され得る。
【0051】
活性セリンプロテアーゼ（複数可）は、典型的に、実質的に単離された形態にある。実質的に単離された形態にあるということは、活性セリンプロテアーゼが、活性セリンプロテアーゼのカリカ・パパイヤ供給源材料から少なくとも部分的に精製されている、又は組み換えで産生されていることを意味する。１つの実施形態において、単離された活性セリンプロテアーゼは、セルロース、リグニン等の不溶性植物材料を実質的に含んでいない。不溶性植物材料を実質的に含んでいないということは、典型的に、不溶性材料を除去して、溶液に可溶性活性セリンプロテアーゼを残す１つ又は複数の精製ステップの結果としてのものであろう。この精製ステップは、下でさらに記載されるであろう。「不溶性植物材料を実質的に含んでいない」とは、組成物の２％ｗ／ｗ未満、例えば１％ｗ／ｗ又は０．５％ｗ／ｗ未満が、プロテアーゼのための供給源材料に由来する不溶性植物材料を含有することを意味する。
【0052】
セリンプロテアーゼとシステインプロテアーゼとの混合物を含む組成物
チオールプロテアーゼ及びシステインエンドペプチダーゼとしても知られるシステインプロテアーゼ（ＥＣ ３．４．２２）は、タンパク質を分解する酵素である。システインプロテアーゼは、触媒三残基又は二残基に求核性システインチオールを伴う共通の触媒メカニズムを共有する。システインプロテアーゼは多様な生物に存在する。特に、システインプロテアーゼは、パパイヤ（カリカ・パパイヤ及びヴァスコンセレア・クンディアンマルセンサス（Ｖａｓｃｏｎｃｅｌｌｅａ ｃｕｎｄｉａｎｍａｒｃｅｎｓｕｓ））、パイナップル（アナナス・コモサス（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ））、イチジク（フィカス・カリカ（Ｆｉｃｕｓ ｃａｒｉｃａ））、及びキウイフルーツ（オニマタタビ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ））を含めた果実によく見出される。１つの実施形態において、システインプロテアーゼは果実に由来する。ゆえに、システインプロテアーゼは、パパイン（ＥＣ ３．４．２２．２）、キモパパイン（ＥＣ ３．４．２２．６）、ブロメライン（茎ブロメライン－ＥＣ ３．４．２２．３２及び果実ブロメライン－ＥＣ ３．４．２２．３３）、フィカイン（ＥＣ ３．４．２２．３）、及びアクチニダイン（ＥＣ ３．４．２２．１４）を含む。
チオールプロテアーゼ及びシステインエンドペプチダーゼとしても知られるシステインプロテアーゼ（ＥＣ ３．４．２２）は、タンパク質を分解する酵素である。システインプロテアーゼは、触媒三残基又は二残基に求核性システインチオールを伴う共通の触媒メカニズムを共有する。システインプロテアーゼは多様な生物に存在する。特に、システインプロテアーゼは、パパイヤ（カリカ・パパイヤ及びヴァスコンセレア・クンディアンマルセンサス（Ｖａｓｃｏｎｃｅｌｌｅａ ｃｕｎｄｉａｎｍａｒｃｅｎｓｕｓ））、パイナップル（アナナス・コモサス（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ））、イチジク（フィカス・カリカ（Ｆｉｃｕｓ ｃａｒｉｃａ））、及びキウイフルーツ（オニマタタビ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ））を含めた果実によく見出される。１つの実施形態において、システインプロテアーゼは果実に由来する。ゆえに、システインプロテアーゼは、パパイン（ＥＣ ３．４．２２．２）、キモパパイン（ＥＣ ３．４．２２．６）、ブロメライン（茎ブロメライン－ＥＣ ３．４．２２．３２及び果実ブロメライン－ＥＣ ３．４．２２．３３）、フィカイン（ＥＣ ３．４．２２．３）、及びアクチニダイン（ＥＣ ３．４．２２．１４）を含む。
【0053】
「活性システインプロテアーゼ」という用語は、１種又は１種を上回る活性システインプロテアーゼを指すと理解されるべきである。
【0054】
カリカ・パパイヤに由来する（抽出による又は組み換えで産生される）１種又は複数の活性セリンプロテアーゼは、カリカ・パパイヤに由来する上で言及されるシステインプロテアーゼの１種又は複数等、１種又は複数の活性システインプロテアーゼを含有する混合物に存在することがある。下でさらに記載される本発明の方法は、１種のそのような混合物をもたらす。
【0055】
ゆえに、活性システインプロテアーゼの１つの供給源は、活性セリンプロテアーゼに対するものと同じ、すなわちカリカ・パパイヤ植物の果実であり得る。好ましくは、パパイヤは熟している。熟していないパパイヤ（パパインの現在の商業的供給源である）の代わりに供給源材料としての熟したパパイヤの１つの利点は、システインプロテアーゼを含む結果として生じる組成物が、パパインの典型的な商業的供給源よりもはるかに低いレベルのラテックスを有することである。ラテックスはアレルギー反応を引き起こし得る。
【0056】
活性システインプロテアーゼは、活性セリンプロテアーゼに関して上で記載されるように、典型的には実質的に単離された形態にある。実質的に単離された形態にあるということは、活性システインプロテアーゼが、カリカ・パパイヤ等、活性システインプロテアーゼの生物学的供給源材料から少なくとも部分的に精製されている、又は組み換えで産生されていることを意味する。１つの実施形態において、単離されたシステインプロテアーゼは、セルロース、リグニン等の不溶性植物材料を実質的に含んでいない。不溶性植物材料を実質的に含んでいないということは、典型的に、不溶性材料を除去して、溶液に可溶性活性プロテアーゼを残す１つ又は複数の精製ステップの結果としてのものであろう。
【0057】
セリンプロテアーゼ及びシステインプロテアーゼを取得するための方法
本発明の方法を使用して、熟したパパイヤ果実から本発明の少なくとも１種の活性セリンプロテアーゼを単離し得る。熟したパパイヤ果実は、典型的に、果実の外側のほとんどが黄色である。熟していないパパイヤ（その皮からラテックスを収穫してパパインを産生する）は緑色である。熟したパパイヤは、圧搾された際に硬くないはずであるが、わずかに圧痕を与え且つわずかな圧痕を保持するはずである。圧搾された際にパパイヤが非常に柔らかい場合には、パパイヤは熟し過ぎである。１つの実施形態において、パパイヤ果肉を、皮及び種子から分離する。別の実施形態において、皮及び種子を含めた果実全体を使用する。果肉等の果実を、次いで、機械的に引き裂いてパルプを形成する（例えば、滑らかなパルプが取得されるまでブレンダーにおいて）。
本発明の方法を使用して、熟したパパイヤ果実から本発明の少なくとも１種の活性セリンプロテアーゼを単離し得る。熟したパパイヤ果実は、典型的に、果実の外側のほとんどが黄色である。熟していないパパイヤ（その皮からラテックスを収穫してパパインを産生する）は緑色である。熟したパパイヤは、圧搾された際に硬くないはずであるが、わずかに圧痕を与え且つわずかな圧痕を保持するはずである。圧搾された際にパパイヤが非常に柔らかい場合には、パパイヤは熟し過ぎである。１つの実施形態において、パパイヤ果肉を、皮及び種子から分離する。別の実施形態において、皮及び種子を含めた果実全体を使用する。果肉等の果実を、次いで、機械的に引き裂いてパルプを形成する（例えば、滑らかなパルプが取得されるまでブレンダーにおいて）。
【0058】
結果として生じるパルプを、次いでアルカリで処理する。適切なアルカリは、ＮａＯＨ等の強塩基及び炭酸水素ナトリウム等の弱塩基を含む。アルカリは、乾燥粉末として又は水溶液で添加され得る。１つの実施形態において、アルカリは炭酸水素ナトリウムであり、典型的に、少なくとも３％ｗ／ｗ、例えば少なくとも５％ｗ／ｗの量で粉末として添加される。量は、典型的に、１５％ｗ／ｗ未満、例えば１２％ｗ／ｗ未満である。特定の実施形態において、添加される量は５～１２％ｗ／ｗである。
【0059】
１つの実施形態において、アルカリは１１未満のｐＫａを有してもよい。一部の実施形態において、アルカリは、重炭酸塩若しくは炭酸塩、又はその組み合わせであってもよい。一部の実施形態において、アルカリは、水溶性アルカリ金属重炭酸塩若しくは水溶性アルカリ金属炭酸塩、又はその組み合わせであってもよい。一部の実施形態において、添加されるアルカリの量は、約１％ｗ／ｗ～約４０％ｗ／ｗ、約１％ｗ／ｗ～約３５％ｗ／ｗ、約１％ｗ／ｗ～約３０％ｗ／ｗ、約１％ｗ／ｗ～約２５％ｗ／ｗ、約１％ｗ／ｗ～約２０％ｗ／ｗ、約１％ｗ／ｗ～約１５％ｗ／ｗ、約１％ｗ／ｗ～約１０％ｗ／ｗ、約２％ｗ／ｗ～約４０％ｗ／ｗ、約２％ｗ／ｗ～約３５％ｗ／ｗ、約２％ｗ／ｗ～約３０％ｗ／ｗ、約２％ｗ／ｗ～約２５％ｗ／ｗ、約２％ｗ／ｗ～約２０％ｗ／ｗ、約２％ｗ／ｗ～約１５％ｗ／ｗ、約２％ｗ／ｗ～約１０％ｗ／ｗ、約３％ｗ／ｗ～約４０％ｗ／ｗ、約３％ｗ／ｗ～約３５％ｗ／ｗ、約３％ｗ／ｗ～約３０％ｗ／ｗ、約３％ｗ／ｗ～約２５％ｗ／ｗ、約３％ｗ／ｗ～約２０％ｗ／ｗ、約３％ｗ／ｗ～約１５％ｗ／ｗ、約３％ｗ／ｗ～約１０％ｗ／ｗ、約４％ｗ／ｗ～約４０％ｗ／ｗ、約４％ｗ／ｗ～約３５％ｗ／ｗ、約４％ｗ／ｗ～約３０％ｗ／ｗ、約４％ｗ／ｗ～約２５％ｗ／ｗ、約４％ｗ／ｗ～約２０％ｗ／ｗ、約４％ｗ／ｗ～約１５％ｗ／ｗ、約４％ｗ／ｗ～約１０％ｗ／ｗ、約５％ｗ／ｗ～約４０％ｗ／ｗ、約５％ｗ／ｗ～約３５％ｗ／ｗ、約５％ｗ／ｗ～約３０％ｗ／ｗ、約５％ｗ／ｗ～約２５％ｗ／ｗ、約５％ｗ／ｗ～約２０％ｗ／ｗ、約５％ｗ／ｗ～約１５％ｗ／ｗ、又は約５％ｗ／ｗ～約１０％ｗ／ｗであってもよい。１つの実施形態において、添加されるアルカリの量は、約１％ｗ／ｗ～約２０％ｗ／ｗであってもよい。好ましい実施形態において、添加されるアルカリの量は、約１％ｗ／ｗ～約１５％ｗ／ｗであってもよい。特に好ましい実施形態において、添加されるアルカリの量は、約４％ｗ／ｗ～約１５％ｗ／ｗであってもよい。
【0060】
１つの実施形態において、アルカリは、アルカリがパルプと反応した後の組成物の最終ｐＨが、少なくとも７．５、例えばｐＨ７．５～ｐＨ１１．５であるような量で添加される。一部の実施形態において、組成物は、約７．０～約１４．０、約７．０～約１３．５、約７．０～約１３．０、約７．０～約１２．５、約７．０～約１２．０、約７．０～約１１．５、約７．０～約１１．０、約７．０～約１０．５、約７．０～約１０．０、約７．０～約９．５、約７．０～約９．０、約７．０～約８．５、約７．０～約８．０、約７．０～約７．５、約７．１～約１４．０、約７．１～約１３．５、約７．１～約１３．０、約７．１～約１２．５、約７．１～約１２．０、約７．１～約１１．５、約７．１～約１１．０、約７．１～約１０．５、約７．１～約１０．０、約７．１～約９．５、約７．１～約９．０、約７．１～約８．５、約７．１～約８．０、約７．１～約７．５、約７．２～約１４．０、約７．２～約１３．５、約７．２～約１３．０、約７．２～約１２．５、約７．２～約１２．０、約７．２～約１１．５、約７．２～約１１．０、約７．２～約１０．５、約７．２～約１０．０、約７．２～約９．５、約７．２～約９．０、約７．２～約８．５、約７．２～約８．０、約７．２～約７．５、約７．３～約１４．０、約７．３～約１３．５、約７．３～約１３．０、約７．３～約１２．５、約７．３～約１２．０、約７．３～約１１．５、約７．３～約１１．０、約７．３～約１０．５、約７．３～約１０．０、約７．３～約９．５、約７．３～約９．０、約７．３～約８．５、約７．３～約８．０、約７．３～約７．５、約７．４～約１４．０、約７．４～約１３．５、約７．４～約１３．０、約７．４～約１２．５、約７．４～約１２．０、約７．４～約１１．５、約７．４～約１１．０、約７．４～約１０．５、約７．４～約１０．０、約７．４～約９．５、約７．４～約９．０、約７．４～約８．５、約７．４～約８．０、約７．４～約７．５、約７．５～約１４．０、約７．５～約１３．５、約７．５～約１３．０、約７．５～約１２．５、約７．５～約１２．０、約７．５～約１１．５、約７．５～約１１．０、約７．５～約１０．５、約７．５～約１０．０、約７．５～約９．５、約７．５～約９．０、約７．５～約８．５、又は約７．５～約８．０の域にある最終ｐＨを有してもよい。特に好ましい実施形態において、組成物は、約７．５～約９．５の域にある最終ｐＨを有してもよい。
【0061】
反応は、好ましくはパルプをいかなる加熱ステップにも供することなく、３０℃又はそれ未満の温度でパルプを用いて実施される。それゆえ、反応は、例えば、標準的な室温及び圧力等、室温で実施されてもよい。反応は、約４℃等、より低い温度でも行われ得る。したがって、一部の実施形態において、反応は、約４℃～約２５℃、又は約４℃～約２２℃、又は約４℃～約２０℃の域で実施される。
【0062】
アルカリがパルプと反応する十分な時間を有したら、処理されたパルプを次いで分離ステップに供して、不溶性植物材料を除去する（炭酸水素ナトリウムの場合、処理されたパルプがもはや気泡を発しなくなったら、分離ステップが実施され得る）。例えば、処理されたパルプを、遠心分離及び／又は濾過し得る。遠心分離は、例えば約６０００～１８０００ｇで実施され得る。１つの実施形態において、処理されたパルプを遠心分離し、得られた上清を、次いで０．２２μｍフィルターを通して濾過する。
【0063】
得られた組成物を１つ又は複数の精製ステップに供して、本発明のプロテアーゼを濃縮し及び／又は他の細胞構成要素からさらに分離し得る。適切な技法は、（ｉ）実施例に記載される、例えばＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００を使用して、分子量に基づいてタンパク質を特異的に分離するゲル濾過（サイズ排除）クロマトグラフィー；（ｉｉ）イオン交換クロマトグラフィー；（ｉｉｉ）透析；（ｉｖ）酢酸アンモニウム沈殿；及び／又は（ｖ）凍結乾燥、を含む。クロマトグラフィーから得られる組成物／画分を試験して、例えば実施例に記載されるアッセイ（Ｌ－ＢａｐＮＡ、場合により、プロテアーゼ活性がセリンプロテアーゼ又はシステインプロテアーゼ活性に起因することを判定するために、アッセイの間に添加されるセリンプロテアーゼ阻害剤又はシステインプロテアーゼ阻害剤とともに用いる）を使用して、プロテアーゼ活性の継続的存在を確認し得る。本発明の少なくとも１種のセリンプロテアーゼの公知の分子量を使用しても、例えばＳＤＳ－ＰＡＧＥによって、少なくとも１種のセリンプロテアーゼの存在及び量を確認し得る。
【0064】
精製プロセスを好都合に使用して、医薬製品又は美容製品への組成物の製剤化に適切なレベルにｐＨ及び／又は塩濃度を調整することもできる。
【0065】
別の実施形態において、方法は、アルカリの添加後に混合物を叩くステップをさらに含んでもよい。さらなる実施形態において、方法は、混合物を濾過して濾液を取得するステップをさらに含んでもよい。さらなる実施形態において、方法は、混合物を濾過して残留物を取得するステップをさらに含んでもよい。さらなる実施形態において、方法は、組成物を凍結し且つ融解するステップをさらに含んでもよい。取得された混合物は、濾過の前に凍結され得且つ融解されてもよい。
【0066】
最終組成物は、好ましくは不溶性植物材料を実質的に含んでいない、例えば約２％、１％、０．５％、又は０．１％ｗ／ｗ未満の不溶性材料を含有する。１つの実施形態において、総タンパク質についてのプロテアーゼの重量パーセンテージは、約０．０１％～５％の域にある。最終組成物は、約１～１００ＩＵ／ｍｌのセリンプロテアーゼ活性を含んでもよい。一部の実施形態において、最終組成物は、約１～約１０ＩＵ／ｍｌ、約１～約２０ＩＵ／ｍｌ、約１～約３０ＩＵ／ｍｌ、約１～約４０ＩＵ／ｍｌ、約１～約５０ＩＵ／ｍｌ、約１～約６０ＩＵ／ｍｌ、約１～約７０ＩＵ／ｍｌ、約１～約８０ＩＵ／ｍｌ、約１～約９０ＩＵ／ｍｌ、約１０～約１００ＩＵ／ｍｌ、約２０～約１００ＩＵ／ｍｌ、約３０～約１００ＩＵ／ｍｌ、約４０～約１００ＩＵ／ｍｌ、約５０～約１００ＩＵ／ｍｌ、約６０～約１００ＩＵ／ｍｌ、約７０～約１００ＩＵ／ｍｌ、約８０～約１００ＩＵ／ｍｌ、約９０～約１００ＩＵ／ｍｌ、約１～約９０ＩＵ／ｍｌ、約１０～約９０ＩＵ／ｍｌ、約２０～約９０ＩＵ／ｍｌ、約３０～約９０ＩＵ／ｍｌ、約４０～約９０ＩＵ／ｍｌ、約５０～約９０ＩＵ／ｍｌ、約６０～約９０ＩＵ／ｍｌ、約７０～約９０ＩＵ／ｍｌ、約８０～約９０ＩＵ／ｍｌ、約１～約８０ＩＵ／ｍｌ、約１０～約８０ＩＵ／ｍｌ、約２０～約８０ＩＵ／ｍｌ、約３０～約８０ＩＵ／ｍｌ、約４０～約８０ＩＵ／ｍｌ、約５０～約８０ＩＵ／ｍｌ、約６０～約８０ＩＵ／ｍｌ、約７０～約８０ＩＵ／ｍｌ、約１～約７０ＩＵ／ｍｌ、約１０～約７０ＩＵ／ｍｌ、約２０～約７０ＩＵ／ｍｌ、約３０～約７０ＩＵ／ｍｌ、約４０～約７０ＩＵ／ｍｌ、約５０～約７０ＩＵ／ｍｌ、約６０～約７０ＩＵ／ｍｌ、約１～約６０ＩＵ／ｍｌ、約１０～約６０ＩＵ／ｍｌ、約２０～約６０ＩＵ／ｍｌ、約３０～約６０ＩＵ／ｍｌ、約４０～約６０ＩＵ／ｍｌ、約５０～約６０ＩＵ／ｍｌ、約１～約５０ＩＵ／ｍｌ、約１０～約５０ＩＵ／ｍｌ、約２０～約５０ＩＵ／ｍｌ、約３０～約５０ＩＵ／ｍｌ、約４０～約５０ＩＵ／ｍｌ、約１～約４０ＩＵ／ｍｌ、約１０～約４０ＩＵ／ｍｌ、約２０～約４０ＩＵ／ｍｌ、約３０～約４０ＩＵ／ｍｌ、約１～約３０ＩＵ／ｍｌ、約１０～約３０ＩＵ／ｍｌ、約２０～約３０ＩＵ／ｍｌ、約１～約２０ＩＵ／ｍｌ、又は約１０～約２０ＩＵ／ｍｌのセリンプロテアーゼ活性を含んでもよい。
【0067】
医薬組成物の製剤化
カリカ・パパイヤに由来する又はそれから導き出せるプロテアーゼ等、本発明の少なくとも１種のセリンプロテアーゼ、及び任意選択でシステインプロテアーゼを含む組成物と、薬学的に許容できる担体又は希釈剤とを組み合わせて医薬組成物を形成し得る。本明細書において使用するとき、本発明の医薬組成物は、典型的に水を含有するであろうが、「薬学的に許容できる担体又は希釈剤」という用語は水を除外する。
カリカ・パパイヤに由来する又はそれから導き出せるプロテアーゼ等、本発明の少なくとも１種のセリンプロテアーゼ、及び任意選択でシステインプロテアーゼを含む組成物と、薬学的に許容できる担体又は希釈剤とを組み合わせて医薬組成物を形成し得る。本明細書において使用するとき、本発明の医薬組成物は、典型的に水を含有するであろうが、「薬学的に許容できる担体又は希釈剤」という用語は水を除外する。
【0068】
化粧品組成物に関する以下の節に記載される担体及び希釈剤は、典型的に、医薬組成物にも使用され得る。そのような組成物は、例えば、クリーム；ローション；セラム；軟膏；又はゲルの形態にあり得る。組成物は、創傷用包帯、例えばガーゼパッド等の固体形態にも適用され得る／含浸され得る。
【0069】
化粧品組成物の製剤化
カリカ・パパイヤに由来する又はそれから導き出せるプロテアーゼ等、本発明の少なくとも１種のセリンプロテアーゼを含み、及び任意選択でシステインプロテアーゼも含む組成物と、化粧品として許容できる担体又は希釈剤とを組み合わせて化粧品組成物も形成し得る。本明細書において使用するとき、本発明の化粧品組成物は、典型的に水を含有するであろうが、「化粧品として許容できる担体又は希釈剤」という用語は水を除外する。
カリカ・パパイヤに由来する又はそれから導き出せるプロテアーゼ等、本発明の少なくとも１種のセリンプロテアーゼを含み、及び任意選択でシステインプロテアーゼも含む組成物と、化粧品として許容できる担体又は希釈剤とを組み合わせて化粧品組成物も形成し得る。本明細書において使用するとき、本発明の化粧品組成物は、典型的に水を含有するであろうが、「化粧品として許容できる担体又は希釈剤」という用語は水を除外する。
【0070】
本発明に従った化粧品組成物は、そのような製剤化に対して従来的に公知のすべての活性材料及び適当な構成要素を適切に含み得る。そのような構成要素は、例えば、ゲル化剤、アニオン性ポリマー、増粘剤、界面活性剤、水和剤、皮膚軟化剤、キレート剤、抗酸化物質、防腐剤、緩衝化合物、香料、充填剤、着色料、揮発性物質又は非揮発性物質、変性又は非変性シリコーン、及び還元剤を含む。種々の構成要素の相対的比率は、適切には、従来的な美容製剤において使用されるものである。当業者であれば、任意選択で存在する材料を当然ながら選択し、望む酵素活性と関連した有利な特性が著しく改変されない又は取り除かれないような手段で、本発明に従った組成物にこれらの材料を組み入れるであろうことが想定される。ある特定の構成要素は、１つを上回る基準を満たすことができることがさらに想定され、例えばグリセリンは、溶媒及び保湿剤の両方として作用することが公知である。
【0071】
上で触れられるように、多様な構成要素が本発明の組成物に存在してもよく；これらの構成要素の真っ先に挙げられるものは、おそらく溶媒としての水である。水の量は、組成物についての約２５重量％～約９０重量％等の約１重量％～約９５重量％に及んでもよい。他の適切な溶媒は、グリセリン及びベンジルアルコールを含む。
【0072】
本発明の化粧品組成物は、例えば組成物がローション、クリーム、ゲル、又はセラムの形態にある場合、１種又は複数の乳化剤を含んでもよい。本発明において使用され得る適切な乳化剤は、例えば１種若しくは複数のアルコキシル化脂肪アルコール、Ｃ１４－２２アルコール、アルキルポリグリコシド、Ｃ１４－２０アルキルグルコシド、鹸化剤、アルキルサルフェート、モノアルキル及びジアルキルホスフェート、アルキルスルホネート、アシルイセチオネート（ｉｓｏｔｈｉｏｎａｔｅ）、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ソルビタン、ステアリン酸、ステアリン酸グリセリル、又はその任意の組み合わせを含む。
【0073】
本発明のある特定の水中油型エマルジョンベース組成物は、エマルジョンを安定させる１種又は複数の安定剤も含んでもよい。適切な安定剤は、例えばアルコール、アルコキシル化アルコール、脂肪アルコール、ステアリン酸グリセリル等のグリセリルエステル、ゴム、石鹸、合成ポリマー、ワックス、又はその任意の組み合わせを含む。特に適切なエマルジョン安定剤は、ステアリルアルコール又はステアリン酸グリセリルを含む。
【0074】
本発明の組成物は、皮膚を柔らかくし且つ滑らかにする１種又は複数の皮膚軟化剤をさらに含んでもよい。適切な皮膚軟化剤は、例えば植物油、ヒマシ油、ヤシ油、及びココアバター、シアバター等の１種若しくは複数の脂肪及び油（水素化又は非水素化）、並びにクエン酸トリカプリル（ｔｒｉｃａｐｒｙｌ ｃｉｔｒａｔｅ）及びイソノナン酸イソノニル（ｉｓｏｎｏｎｙｌ ｉｓｏｎａｎｏａｔｅ）等のエステル、又はその任意の組み合わせを含む。
【0075】
本発明の組成物は、１種又は複数の保湿剤を含んでもよい。保湿剤とは、水分を吸収する又は保持する構成要素である。本組成物において使用され得る適切な保湿剤は、例えば尿素、ピログルタミン酸、アミノ酸（例えば、グルタミン酸）、吸湿特性を有するポリオール若しくは他の化合物、又はその任意の組み合わせを含む。典型的に、保湿剤は、ソルビトール等のポリオールである。セラムの形態にある本発明の組成物において、存在する主な保湿剤は、メチル－グルセス－２０及びプロピレングリコールを含む。
【0076】
本発明の組成物における使用のための適切な防腐剤は、例えばフェノキシエタノール等の１種若しくは複数のアルカノール、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）塩、ＥＤＴＡ脂肪酸コンジュゲート、イソチアゾリノン、メチルパラベン及びプロピルパラベン等のパラベン、プロピレングリコール、ソルベート、ジアゾリジニル尿素及びイミダゾリジニル尿素等の尿素誘導体、第四級アンモニウム塩、又はその任意の組み合わせを含む。
【0077】
本発明の組成物に含めるための適切なキレート剤としては、例えばＥＤＴＡ誘導体、又はその任意の組み合わせを挙げ得る。
【0078】
組成物は、組成物のｐＨを調整し且つ維持する働きをする１種又は複数の緩衝化合物を含んでもよい。適切な緩衝剤は、例えば１種若しくは複数のアジピン酸、グリシン、クエン酸、水酸化カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、トリエタノールアミン、又はその任意の組み合わせを含む。
【0079】
存在する場合、緩衝剤は、組成物の通常の貯蔵寿命及び使用の期間にわたって組成物における安定なｐＨを確保するのに適切なレベルで存在するべきである。
【0080】
化粧品組成物は、１種又は複数の界面活性剤も含んでもよい。界面活性剤は、石鹸又は洗顔料等、皮膚洗浄の目的のためのものである本発明の組成物において特に重要である。適切な界面活性剤としては、例えばアニオン性、非イオン性、カチオン性、両性、又はその任意の組み合わせを挙げ得る。好ましくは、１種又は複数の界面活性剤は非イオン性界面活性剤である。適切な非イオン性界面活性剤としては、例えば１種若しくは複数のアルコキシル化アルコール、エトキシ化アルコール、プロポキシ化（ｐｒｏｐｏｘｙｌａｔｅｄ）アルコール、内部分散した（ｉｎｔｅｒ－ｄｉｓｐｅｒｓｅｄ）エトキシ化－プロポキシ化アルコール、共重合体、脂肪酸、アルキルフェノール、ポリグリコシド、ポリグルコシド、ｎ－アルキルピロリドン、ブロック共重合体、又はその任意の組み合わせを挙げ得る。
【0081】
典型的に、本発明の化粧品組成物は、クリーム；ローション；セラム；洗顔料；シャンプー；泡；皮膚洗浄剤；皮膚トニック；軟膏；又はゲルの形態にある。しかしながら、当業者であれば、表皮に本発明の活性酵素を投与するのに適切な任意の組成物が使用され得ることを解するであろう。
【0082】
本発明の組成物は、約０．１ＩＵ／ｍｌ～約１００ＩＵ／ｍｌの総セリンプロテアーゼ活性が服用ごとに皮膚に適用されるのを可能にする十分なタンパク質分解活性を含有するべきであり、服用は、約２ｍｌ～約１０ｍｌの量の製品であることが想定される。一部の実施形態において、本発明の組成物は、約１～約１０ＩＵ／ｍｌ、約１～約２０ＩＵ／ｍｌ、約１～約３０ＩＵ／ｍｌ、約１～約４０ＩＵ／ｍｌ、約１～約５０ＩＵ／ｍｌ、約１～約６０ＩＵ／ｍｌ、約１～約７０ＩＵ／ｍｌ、約１～約８０ＩＵ／ｍｌ、約１～約９０ＩＵ／ｍｌ、約１０～約１００ＩＵ／ｍｌ、約２０～約１００ＩＵ／ｍｌ、約３０～約１００ＩＵ／ｍｌ、約４０～約１００ＩＵ／ｍｌ、約５０～約１００ＩＵ／ｍｌ、約６０～約１００ＩＵ／ｍｌ、約７０～約１００ＩＵ／ｍｌ、約８０～約１００ＩＵ／ｍｌ、約９０～約１００ＩＵ／ｍｌ、約１～約９０ＩＵ／ｍｌ、約１０～約９０ＩＵ／ｍｌ、約２０～約９０ＩＵ／ｍｌ、約３０～約９０ＩＵ／ｍｌ、約４０～約９０ＩＵ／ｍｌ、約５０～約９０ＩＵ／ｍｌ、約６０～約９０ＩＵ／ｍｌ、約７０～約９０ＩＵ／ｍｌ、約８０～約９０ＩＵ／ｍｌ、約１～約８０ＩＵ／ｍｌ、約１０～約８０ＩＵ／ｍｌ、約２０～約８０ＩＵ／ｍｌ、約３０～約８０ＩＵ／ｍｌ、約４０～約８０ＩＵ／ｍｌ、約５０～約８０ＩＵ／ｍｌ、約６０～約８０ＩＵ／ｍｌ、約７０～約８０ＩＵ／ｍｌ、約１～約７０ＩＵ／ｍｌ、約１０～約７０ＩＵ／ｍｌ、約２０～約７０ＩＵ／ｍｌ、約３０～約７０ＩＵ／ｍｌ、約４０～約７０ＩＵ／ｍｌ、約５０～約７０ＩＵ／ｍｌ、約６０～約７０ＩＵ／ｍｌ、約１～約６０ＩＵ／ｍｌ、約１０～約６０ＩＵ／ｍｌ、約２０～約６０ＩＵ／ｍｌ、約３０～約６０ＩＵ／ｍｌ、約４０～約６０ＩＵ／ｍｌ、約５０～約６０ＩＵ／ｍｌ、約１～約５０ＩＵ／ｍｌ、約１０～約５０ＩＵ／ｍｌ、約２０～約５０ＩＵ／ｍｌ、約３０～約５０ＩＵ／ｍｌ、約４０～約５０ＩＵ／ｍｌ、約１～約４０ＩＵ／ｍｌ、約１０～約４０ＩＵ／ｍｌ、約２０～約４０ＩＵ／ｍｌ、約３０～約４０ＩＵ／ｍｌ、約１～約３０ＩＵ／ｍｌ、約１０～約３０ＩＵ／ｍｌ、約２０～約３０ＩＵ／ｍｌ、約１～約２０ＩＵ／ｍｌ、又は約１０～約２０ＩＵ／ｍｌの総セリンプロテアーゼ活性が服用ごとに皮膚に適用されるのを可能にする十分なタンパク質分解活性を含有するべきであり、服用は、約２ｍｌ～約３ｍｌ、約２ｍｌ～約４ｍｌ、約２ｍｌ～約５ｍｌ、約２ｍｌ～約６ｍｌ、約２ｍｌ～約７ｍｌ、約２ｍｌ～約８ｍｌ、約２ｍｌ～約９ｍｌ、約３ｍｌ～約４ｍｌ、約３ｍｌ～約５ｍｌ、約３ｍｌ～約６ｍｌ、約３ｍｌ～約７ｍｌ、約３ｍｌ～約８ｍｌ、約３ｍｌ～約９ｍｌ、約３ｍｌ～約１０ｍｌ、約４ｍｌ～約５ｍｌ、約４ｍｌ～約６ｍｌ、約４ｍｌ～約７ｍｌ、約４ｍｌ～約８ｍｌ、約４ｍｌ～約９ｍｌ、約４ｍｌ～約１０ｍｌ、約５ｍｌ～約６ｍｌ、約５ｍｌ～約７ｍｌ、約５ｍｌ～約８ｍｌ、約５ｍｌ～約９ｍｌ、約５ｍｌ～約１０ｍｌ、約６ｍｌ～約７ｍｌ、約６ｍｌ～約８ｍｌ、約６ｍｌ～約９ｍｌ、約６ｍｌ～約１０ｍｌ、約７ｍｌ～約８ｍｌ、約７ｍｌ～約９ｍｌ、約７ｍｌ～約１０ｍｌ、約８ｍｌ～約９ｍｌ、約８ｍｌ～約１０ｍｌ、又は約９ｍｌ～約１０ｍｌの量の製品である。
【0083】
セリンプロテアーゼ活性は、セリンプロテアーゼ構成要素を判定するアッセイの間にセリンプロテアーゼ阻害剤の使用を伴う実施例に記載されるＬ－ＢＡｐＮＡアッセイによって測定され得る。代替的に、英国特許第２，４４０，１１７号に記載されるベンゾイル－Ｌ－アルギニンエチルエステル（ＢＡＥＥ）アッセイが使用されてもよい。１つの実施形態において、セリンプロテアーゼ活性は、適用用量あたり約５単位～約６０単位の域にある。
【0084】
本発明の組成物は、同様のレベルのシステインプロテアーゼ活性も含有してもよい。システインプロテアーゼ活性は、システインプロテアーゼ構成要素を判定するアッセイの間にシステインプロテアーゼ阻害剤の使用を伴う実施例に記載されるＬ－ＢＡｐＮＡアッセイによって測定され得る。
【0085】
美容セラムの形態における、アスペルギルス・メレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓ）由来のセリンプロテアーゼと、システインプロテアーゼとの組み合わせは、４０人の女性のボランティア群において、皮膚表面マイクロトポグラフィーの測定を使用して判定される、１４～２８日間の期間にわたって皮膚の滑らかさを向上させ、シワを減少させることがこれまでに示されている（英国特許第２，４４０，１１７号）。本発明の組成物は、個体の表皮を滑らかにすること及び再生を促進するための美容的方法等、様々な美容的適用においても使用され得る。
【0086】
組成物の使用
通常、本発明の化粧品組成物は、顔、手、及び首に適用されるが、しかしながら他の皮膚表面が美容的処理に供されてもよい。唯一の禁忌は、炎症を起こした皮膚又は目に近い皮膚等、皮膚の特に敏感なエリアは避けられるべきであることである。本発明の組成物は、通常、従来のようにユーザーによって手で皮膚表面に直接適用される。
通常、本発明の化粧品組成物は、顔、手、及び首に適用されるが、しかしながら他の皮膚表面が美容的処理に供されてもよい。唯一の禁忌は、炎症を起こした皮膚又は目に近い皮膚等、皮膚の特に敏感なエリアは避けられるべきであることである。本発明の組成物は、通常、従来のようにユーザーによって手で皮膚表面に直接適用される。
【0087】
それゆえ、本発明の方法は、個体の表皮に本発明の化粧品組成物を適用するステップを含む。
【0088】
本発明の医薬組成物は、皮膚病状及び創傷を含めた疾患、障害、及び病状の治療に関連した多様な薬学的適用において使用され得る。本発明の組成物は、多様な美容的適用においても使用され得る。
【0089】
したがって、本発明は、本発明の組成物の局所的適用を含む、創傷のデブリードマンの方法、創傷を治療する方法における使用のための本発明の組成物、火傷に罹患している個体を治療する方法であって、方法は、本発明の調製物を個体の病変エリアに局所的に又は投与の他の経路によって投与するステップを含む方法、創傷を治療する方法における使用のための又は使用される場合の本発明の組成物、本発明の組成物を創傷に局所的に又は投与の他の経路によって投与するステップを含む、創傷治癒を増強する方法、本発明の化粧品組成物を皮膚に適用するステップを含む、皮膚をエクスフォリエーションする又は明るくする方法、皮膚をエクスフォリエーションする又は明るくするための本発明の化粧品組成物の使用、本発明の化粧品組成物を皮膚に適用するステップを含む、乾燥した、老化した、又は損傷を受けた皮膚を治療する方法、及び乾燥した、老化した、又は損傷を受けた皮膚を治療するための本発明の化粧品組成物の使用、をさらに提供する。
【0090】
本発明のプロテアーゼ組成物は、糖尿病性潰瘍、褥瘡、静脈性潰瘍、及び動脈性潰瘍等の慢性創傷を含めた創傷、並びに湿疹、乾癬、ニキビ、酒さ、魚鱗癬、白斑、蕁麻疹、脂漏性皮膚炎を含むがそれらに限定されない他の皮膚病状を含めた、多様な皮膚病状を予防する、治療する、低下させる、又は改善するために特に使用されることができる。
【0091】
１つの好ましい実施形態において、医薬組成物は、創傷をデブリードするために使用され得る。そのような創傷は、典型的に壊死組織を含有し、糖尿病性潰瘍、褥瘡、静脈性潰瘍、動脈性潰瘍等を含む。ゆえに、そのような創傷は慢性創傷であってもよい。使用において、組成物（又は、組成物を含浸させた包帯等）は病変エリアに適用される。適用は、典型的に、１日に少なくとも１回、例えば１日２回行われるであろう。組成物の量及び適用の頻度は、医師によって決定され得る。
【0092】
本発明の組成物は、治療的に又は美容的に投与されてもよい。そのような適用において、組成物は、病状及び任意の合併症を治癒する又は少なくとも部分的に食い止めるのに十分な量で、病状にすでに罹患している対象に投与されてもよい。組成物の分量は、患者を有効に治療するのに十分であるべきである。
【0093】
組成物は、リポソームの形態でも投与されてもよい。リポソームは、リン脂質又は他の脂質物質に由来することができ、水性媒体に分散した単層又は多層の水和液晶によって形成されることができる。リポソームを形成し得る任意の非毒性の生理学的に許容でき且つ代謝可能な脂質が使用されてもよい。リポソーム形態にある組成物は、安定化剤、防腐剤、及び賦形剤を含有してもよい。好ましい脂質としては、天然でも合成でも、リン脂質及びホスファチジルコリン（レシチン）が挙げられる。リポソームを産生するための方法は当技術分野において公知であり、この方法に関して、具体的な参照が、Ｐｒｅｓｃｏｔｔ編、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＸＩＶ巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９７６）、３３ページ、以下参照に対してなされ、文献の内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【0094】
本発明の組成物は、対象の皮膚病状を予防する、治療する、低下させる、又は改善するための医薬の製造において使用されてもよい。
【0095】
本発明の組成物は、対象の皮膚病状を予防する、治療する、低下させる、又は改善するための化粧品の製造においても使用されてもよい。
【0096】
投薬量
任意の特定の患者に対する「治療有効」用量レベルは、当技術分野において周知の他の関連因子とともに、治療されている病状及び病状の重症度、採用された組成物の活性、患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別、及び食生活、投与の時間、投与の経路、治療の持続期間、並びに治療と組み合わせて又は同時に使用される任意の薬物を含めた多様な因子に依存するであろう。それゆえ、当業者であれば、ルーチン的実験によって、適用可能な病状を治療するために要されるであろう組成物の有効な非毒性の量を判定し得るであろう。
任意の特定の患者に対する「治療有効」用量レベルは、当技術分野において周知の他の関連因子とともに、治療されている病状及び病状の重症度、採用された組成物の活性、患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別、及び食生活、投与の時間、投与の経路、治療の持続期間、並びに治療と組み合わせて又は同時に使用される任意の薬物を含めた多様な因子に依存するであろう。それゆえ、当業者であれば、ルーチン的実験によって、適用可能な病状を治療するために要されるであろう組成物の有効な非毒性の量を判定し得るであろう。
【0097】
さらに、組成物の個々の投薬の最適な分量及び間隔は、治療されている病状の性質及び程度、投与の形態、経路、及び部位、並びに治療されている特定の個体の性質によって判定されるであろうことは当業者に明白であろう。また、そのような最適な条件は、従来的技法によって判定され得る。
【0098】
既定の日数の間の１日あたり与えられる組成物の服用の回数等、治療の最適なコースは、治療判定試験の従来的コースを使用して当業者によって突き止められ得ることも当業者に明白であろう。
【0099】
投与の経路
本発明の組成物は標準的経路によって投与され得る。概して、組成物は局所的経路によって投与されてもよい。典型的に、本発明の組成物は、個体の病変エリアに局所的に投与される。
本発明の組成物は標準的経路によって投与され得る。概して、組成物は局所的経路によって投与されてもよい。典型的に、本発明の組成物は、個体の病変エリアに局所的に投与される。
【0100】
他の実施形態において、組成物は、直腸、舌下、若しくは唇下等の他の経腸／腸内経路によって、又は硬膜外、脳内、若しくは脳室内経路を通じて等の中枢神経系を介して投与されてもよい。投与の他の位置としては、皮膚上、経皮、皮内、経鼻、動脈内、心臓内、骨内（ｉｎｔｒａｏｓｓｅｕｓ）、髄腔内、腹腔内、膀胱内、硝子体内、陰茎海綿体内、膣内、又は子宮内経路を介したものを挙げ得る。
【0101】
療法のタイミング
典型的に、治療的適用において、治療は、疾患状態の持続期間に対するものであろう。
典型的に、治療的適用において、治療は、疾患状態の持続期間に対するものであろう。
【0102】
当業者であれば、本明細書に開示される組成物は、診断時に又はその後に続いて、例えば、そのような治療に対する現在利用可能な療法を補完するもの（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）としての経過観察治療又はコンソリデーション療法として、単剤として又は本明細書に開示される方法との組み合わせ療法手法の一部として投与されてもよいことを解するであろう。本明細書に開示される組成物は、そのような疾患を遺伝的に又は環境的に発症しやすい対象に対する予防的療法としても使用されてもよい。
【0103】
組成物は、病状の向上が見られるまで等、必要とされる限りの間定期的に投与されてもよい。それゆえ、組成物は、１時間に１回、１日に複数回、毎日、１週間に複数回、１週間に１回、１カ月に１回、又は適当であると考えられるどんな頻度でも投与されてもよい。
【0104】
キット
本発明のキットは、本発明の方法の採用及び使用を容易にする。典型的に、本発明の方法又は使用を行うためのキットは、方法を行うために必要な試薬及び手段のすべてを含有する。例えば、１つの実施形態において、キットは、本発明の組成物、及び任意選択で、臨床現場での方法のためのデバイス等、組成物を投与するための手段を含んでもよい。
本発明のキットは、本発明の方法の採用及び使用を容易にする。典型的に、本発明の方法又は使用を行うためのキットは、方法を行うために必要な試薬及び手段のすべてを含有する。例えば、１つの実施形態において、キットは、本発明の組成物、及び任意選択で、臨床現場での方法のためのデバイス等、組成物を投与するための手段を含んでもよい。
【0105】
典型的に、本明細書に記載されるキットは、１つ又は複数の容器も含むであろう。本発明の文脈において、区分化されたキットは、組成物が別個の容器に含有されている任意のキットを含み、小さなガラス容器、プラスチック容器、又はプラスチック若しくは紙の細長い切れを含んでもよい。そのような容器は、組成物の交差夾雑を回避しながらの、一方の区分からもう一方の区分への組成物の効率的な移動、及び一方の区分からもう一方への定量的な形での各容器の作用物質又は溶液の添加を可能にすることができる。
【0106】
典型的に、本発明のキットは、適当な方法及び使用を実施するために、キットを使用するための使用説明書も含むであろう。
【0107】
本発明の方法、使用、組成物、及びキットは、ヒトを含めた、例えば非ヒト霊長類、馬、牛、羊、山羊、兎、鳥類、猫、及び犬の種を含めた、任意の動物に等しく適用可能である。したがって、異なる種への適用に関して、本発明の単一のキットが適用可能であることがある、又は代替的に、例えば各個々の種に特異的な組成物を含有する異なるキットが要されることがある。
【0108】
当業者であれば、本明細書に開示される種々の特質を組み合わせて、本発明の範囲内にある特質の組み合わせを形成することができることを理解し且つ解するであろう。
【0109】
本発明は、例示的であり且つ非限定的である以下の実施例をさらに参照して、ここで記載されるであろう。実施例は、以下の図を参照する。
【実施例】
【0110】
ＯＰＡＬ Ａ及びＯＰＡＬ Ｂの調製
ＯＰＡＬ Ａ濾液の製造プロセスを滅菌条件において実施した。カリカ・パパイヤ植物の熟した果実の末端を切って整え、皮を剥いた。果実の果肉を４等分し、次いで種子を切除した。パパイヤ片を、滑らかなパルプが取得されるまでブレンダー中で混合した。パルプを、８０℃に設定された水槽の内側にあるビーカーに置き、パルプの温度が５５℃であるまで（ガラス温度計を使用して測定された）継続的に撹拌した。１０重量％の炭酸水素ナトリウムをビーカーに添加した。次いで、ビーカーを水槽に置き、５５℃に設定し、５分間ゆっくりと撹拌した。炭酸水素ナトリウムを含有するパルプを１２０００×ｇで３０分間遠心分離した後、上清を収集し、０．２２μｍフィルター（ＦＤＲ－０５０－０７１Ｎ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して濾過することによって、滅菌ユニバーサルチューブに移した。加熱ステップを省略するという点において製造プロセスにおける１つのステップ変化を有して、ＯＰＡＬ Ｂ濾液を調製した。
ＯＰＡＬ Ａ濾液の製造プロセスを滅菌条件において実施した。カリカ・パパイヤ植物の熟した果実の末端を切って整え、皮を剥いた。果実の果肉を４等分し、次いで種子を切除した。パパイヤ片を、滑らかなパルプが取得されるまでブレンダー中で混合した。パルプを、８０℃に設定された水槽の内側にあるビーカーに置き、パルプの温度が５５℃であるまで（ガラス温度計を使用して測定された）継続的に撹拌した。１０重量％の炭酸水素ナトリウムをビーカーに添加した。次いで、ビーカーを水槽に置き、５５℃に設定し、５分間ゆっくりと撹拌した。炭酸水素ナトリウムを含有するパルプを１２０００×ｇで３０分間遠心分離した後、上清を収集し、０．２２μｍフィルター（ＦＤＲ－０５０－０７１Ｎ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して濾過することによって、滅菌ユニバーサルチューブに移した。加熱ステップを省略するという点において製造プロセスにおける１つのステップ変化を有して、ＯＰＡＬ Ｂ濾液を調製した。
【0111】
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅを使用したゲル濾過クロマトグラフィー
ゲル濾過クロマトグラフィーを使用して、分子量に基づいてタンパク質を特異的に分離した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００（Ｇ１００５０－Ｓｉｇｍａ）（４ｋＤａ～１５０ｋＤａ間の分離）を有する１４ｍＬの長さのクロマトグラフィーカラム（Ｃ３９１９－１ＥＡ－ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を詰め、０．１５Ｍ ＮａＣｌを有するｐＨ８の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌで一晩洗浄した。１ｍＬの要されるサンプルをカラムに別個に通して、分子量に基づいてタンパク質を分離した。要される数の０．５ｍＬ画分を収集し、Ａ２８０を測定した。次いで、５０μＬの各画分を９６ウェルプレートに置き、５０μＬの１．５ｍＭ Ｌ－ＢＡｐＮＡバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．５バッファーで作製された）を添加した。次いで、Ａ４１０におけるＬ－ＢＡｐＮＡ活性を、Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴマイクロプレートリーダー（カタログ１２９２６５２７、Ｂｉｏ－Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＫ）を使用して、即時及びその後２時間後の両方に測定した。値の差をプロットし、より高いＬ－ＢＡｐＮＡ活性を有する画分をＳＤＳ ＰＡＧＥゲルを通じてランし、次いでゲルをクマシー又は銀染色を使用して染色した。
ゲル濾過クロマトグラフィーを使用して、分子量に基づいてタンパク質を特異的に分離した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００（Ｇ１００５０－Ｓｉｇｍａ）（４ｋＤａ～１５０ｋＤａ間の分離）を有する１４ｍＬの長さのクロマトグラフィーカラム（Ｃ３９１９－１ＥＡ－ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を詰め、０．１５Ｍ ＮａＣｌを有するｐＨ８の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌで一晩洗浄した。１ｍＬの要されるサンプルをカラムに別個に通して、分子量に基づいてタンパク質を分離した。要される数の０．５ｍＬ画分を収集し、Ａ２８０を測定した。次いで、５０μＬの各画分を９６ウェルプレートに置き、５０μＬの１．５ｍＭ Ｌ－ＢＡｐＮＡバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．５バッファーで作製された）を添加した。次いで、Ａ４１０におけるＬ－ＢＡｐＮＡ活性を、Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴマイクロプレートリーダー（カタログ１２９２６５２７、Ｂｉｏ－Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＫ）を使用して、即時及びその後２時間後の両方に測定した。値の差をプロットし、より高いＬ－ＢＡｐＮＡ活性を有する画分をＳＤＳ ＰＡＧＥゲルを通じてランし、次いでゲルをクマシー又は銀染色を使用して染色した。
【0112】
Ｌ－ＢＡｐＮＡ（Ｎ－ベンゾイル－Ｌ－アルギニン４－ニトロアニリド塩酸塩）アッセイ
１．５ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に６３ｍｇのＬ－ＢＡｐＮＡを溶解し、次いで水で１００ｍｌにすることによって、Ｌ－ＢＡｐＮＡ（Ｂ－３１３３ ｓｉｇｍａ）の１．５ｍＭストック溶液を調製した。アルギニンとｐ－ニトロアニリン部分との間の結合におけるＬ－ＢＡｐＮＡの加水分解は、発色団ｐ－ニトロアニリンを放出し、ｐ－ニトロアニリンは国際単位（ＩＵ）で４１０ｎｍの吸光度にて分光法によって検出され得る。ＩＵは、過剰な基質条件下で０．０１単位／分の吸光度の増加を引き起こす酵素の量として定義される（ゼロ次反応速度論（ｚｅｒｏ ｏｒｄｅｒ ｋｉｎｅｔｉｃｓ））。固体の特異的活性はＩＵ／ｍｇで表現され、一方で液体製剤の場合、活性はＩＵ／ｍＬで表現される。
１．５ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に６３ｍｇのＬ－ＢＡｐＮＡを溶解し、次いで水で１００ｍｌにすることによって、Ｌ－ＢＡｐＮＡ（Ｂ－３１３３ ｓｉｇｍａ）の１．５ｍＭストック溶液を調製した。アルギニンとｐ－ニトロアニリン部分との間の結合におけるＬ－ＢＡｐＮＡの加水分解は、発色団ｐ－ニトロアニリンを放出し、ｐ－ニトロアニリンは国際単位（ＩＵ）で４１０ｎｍの吸光度にて分光法によって検出され得る。ＩＵは、過剰な基質条件下で０．０１単位／分の吸光度の増加を引き起こす酵素の量として定義される（ゼロ次反応速度論（ｚｅｒｏ ｏｒｄｅｒ ｋｉｎｅｔｉｃｓ））。固体の特異的活性はＩＵ／ｍｇで表現され、一方で液体製剤の場合、活性はＩＵ／ｍＬで表現される。
【0113】
実験を通じてゼロ次反応速度論を維持する最適な基質濃度を判定するために、ある域の基質濃度を用いて、一連の滴定ランを行った。このようにして見出された最小濃度は０．２ｍＭ又は１：６希釈のストック１．５ｍＭ溶液である。表１は、すべての速度論的実験に使用された試薬用量を示している。リン酸塩バッファーは他のバッファーと比較して最も高い酵素活性読み出しを与えるため、ｐＨ６のリン酸塩バッファーをＬ－ＢＡｐＮＡアッセイにおいて使用した。
【表1】
【0114】
基質純度を検証するために、アルカリによって触媒される制御された全加水分解を、以下の条件下で行った。
ゆえに、
結果は、メーカーによって明記される基質の９９％純度を裏付けた。
【表2】
ゆえに、
結果は、メーカーによって明記される基質の９９％純度を裏付けた。
【0115】
阻害剤
Ｅ－６４（ＩＵＰＡＣ名：（１Ｓ，２Ｓ）－２－（（（Ｓ）－１－（（４－グアニジノブチル）アミノ）－４－メチル－１－オキソペンタン－２－イル）カルバモイル）シクロプロパンカルボン酸）は、システインプロテアーゼの強く且つ不可逆的な特異的阻害剤である。Ｅ－６４のｔｒａｎｓ－エポキシスクシニル基（活性部分）は、システインプロテアーゼの活性チオール基に不可逆的に結合し、それによってシステインプロテアーゼを阻害する。Ｅ－６４は、非プロテアーゼ酵素と反応せず、セリンプロテアーゼを阻害しない。
Ｅ－６４（ＩＵＰＡＣ名：（１Ｓ，２Ｓ）－２－（（（Ｓ）－１－（（４－グアニジノブチル）アミノ）－４－メチル－１－オキソペンタン－２－イル）カルバモイル）シクロプロパンカルボン酸）は、システインプロテアーゼの強く且つ不可逆的な特異的阻害剤である。Ｅ－６４のｔｒａｎｓ－エポキシスクシニル基（活性部分）は、システインプロテアーゼの活性チオール基に不可逆的に結合し、それによってシステインプロテアーゼを阻害する。Ｅ－６４は、非プロテアーゼ酵素と反応せず、セリンプロテアーゼを阻害しない。
【0116】
２，２’－ジピリジルジスルフィド（２ＤＰＳ）を、パパイン、ブロメライン、及びフィシンを含めたシステインプロテアーゼに対するチオール特異的可逆的阻害剤として使用する。
【0117】
プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＰＩＣ）を、表３に示されるように製剤化した。
【表3】
【0118】
重ね合わせザイモグラフィー
一部の改変を有して、Ｖｉｎｏｋｕｒｏｖら（２００５）における手順に従って、重ね合わせザイモグラフィーを行った（図１）。簡潔には、ニトロセルロース膜を、水中１．２ｍｇ／ｍＬ Ｌ－ＢＡｐＮＡ溶液に浸した。その後、膜を放置して５分間空気乾燥させ、次いで、サンプルをランした後のネイティブＰＡＧＥゲルの上部に重ね、膜を、サンプルそれぞれのランニングバッファーにわずかに浸した。膜を、１０ｍＭ ＤＴＴ又は２５ｍＭシステインのいずれかを有する３５Ｍ β－アラニン、０．１４Ｍ酢酸、ｐＨ４．３に浸す２つの付加的な実験を行った。次いで、すべてのザイモグラフィーを、３７℃で３０～６０分間密閉チャンバーにおいてインキュベートした。膜を取り出し、再度放置して５分間乾燥させ、ｐ－ニトロアニリンをジアゾ化によって可視化した。
一部の改変を有して、Ｖｉｎｏｋｕｒｏｖら（２００５）における手順に従って、重ね合わせザイモグラフィーを行った（図１）。簡潔には、ニトロセルロース膜を、水中１．２ｍｇ／ｍＬ Ｌ－ＢＡｐＮＡ溶液に浸した。その後、膜を放置して５分間空気乾燥させ、次いで、サンプルをランした後のネイティブＰＡＧＥゲルの上部に重ね、膜を、サンプルそれぞれのランニングバッファーにわずかに浸した。膜を、１０ｍＭ ＤＴＴ又は２５ｍＭシステインのいずれかを有する３５Ｍ β－アラニン、０．１４Ｍ酢酸、ｐＨ４．３に浸す２つの付加的な実験を行った。次いで、すべてのザイモグラフィーを、３７℃で３０～６０分間密閉チャンバーにおいてインキュベートした。膜を取り出し、再度放置して５分間乾燥させ、ｐ－ニトロアニリンをジアゾ化によって可視化した。
【0119】
Ｈｏｓｓｅｉｎｉｎａｖｅｈら（２００９）に詳述されるプロトコールに従うことによって、ジアゾ化を実施した。簡潔には、膜を、亜硝酸ナトリウム溶液（１Ｍ ＨＣｌ中１ｍｇ／ｍＬ）に５分間、次いでスルファミン酸アンモニウム溶液（１Ｍ ＨＣｌ中５ｍｇ／ｍＬ）、及び最後に、任意のジアゾ化ｐ－ニトロアニリンが紫色のスメア／バンドとしてはっきりと目に見えるようになるまで約３０秒間～１分間、ＮＮＥＤ溶液（Ｎ－（１－ナフチル）－エチレンジアミン二塩酸塩）（４８％ｖ／ｖエタノール／水中０．５ｍｇ／ｍＬ）に逐次的に浸した。
【0120】
質量分析
コロイドクマシー染色で同定されたタンパク質バンドを、ケンブリッジ大学のＰＮＡＣ Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙにてＭＡＬＤＩ－Ｍａｓｓフィンガープリンティングによって分析した。ゲルバンドを切り出し、以下の処理－ステップあたり３０分間、２０℃、２００μＬの１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム／５０％アセトニトリルにおいて：１）５ｍＭ Ｔｒｉｓ（２－カルボキシエチル）ホスフィンを用いた還元；２）ヨードアセトアミドの添加によるアルキル化（２５ｍＭ最終濃度）；並びに３）液体の除去及びその後の洗浄、に供した。
コロイドクマシー染色で同定されたタンパク質バンドを、ケンブリッジ大学のＰＮＡＣ Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙにてＭＡＬＤＩ－Ｍａｓｓフィンガープリンティングによって分析した。ゲルバンドを切り出し、以下の処理－ステップあたり３０分間、２０℃、２００μＬの１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム／５０％アセトニトリルにおいて：１）５ｍＭ Ｔｒｉｓ（２－カルボキシエチル）ホスフィンを用いた還元；２）ヨードアセトアミドの添加によるアルキル化（２５ｍＭ最終濃度）；並びに３）液体の除去及びその後の洗浄、に供した。
【0121】
洗浄したら、ゲル片を真空にて１０分間乾燥させ、次いで５μｇ／ｍＬ修飾トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含有する２５μｌの１００ｍＭ炭酸水素アンモニウムを添加した。消化を３２℃で１７時間実施した。ペプチドを回収し、μＣ１８ ＺｉｐＴｉｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して脱塩し、５０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸中１～２μＬのアルファ－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸マトリックス（Ｓｉｇｍａ）を使用してｍａｌｄｉターゲットプレートに溶出した。ペプチド質量を、Ｂｒｕｋｅｒ ｕｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ Ｍａｌｄｉ質量分析計をリフレクトロン様態で使用して判定し、ｍｓ／ｍｓフラグメント化をＬＩＦＴ様態で実施した（ｐｅｒｏｆｏｒｍｅｄ）。ＦｌｅｘＡｎａｌｙｓｉｓ、ＢｉｏＴｏｏｌｓ、及びＰｒｏｔｅｉｎＳｃａｐｅソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ）を用いて、データ分析に着手した。組み合わせた質量フィンガープリントデータのデータベース検索を、Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して実施した。要される場合、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒにより、付加的な操縦を実施した。
デブリードアッセイ
ＡＷＥデブリードアッセイとは、Ｈｅａｌｔｈ Ｐｏｉｎｔ（Ｓｈｉ、Ｅｒｍｉｓら、２００９）によって開発された創傷壊死組織タンパク質分解活性のインビトロ代理である。ＡＷＥデブリードアッセイは、インビボ動物データに十分に匹敵することが示されている。ＡＷＥ基質は、それぞれが異なるフルオロフォアでタグ付けされた３種の創傷関連細胞外マトリックスタンパク質（コラーゲン、エラスチン、及びフィブリン）のペレットからなる。このマトリックスの段階的分解は、フランツ型拡散セル設定における蛍光強度の漸進的増加によって測定され得る（図２）。実験に対する最終読み出しを、２４時間の時点で取得する。
デブリードアッセイ
ＡＷＥデブリードアッセイとは、Ｈｅａｌｔｈ Ｐｏｉｎｔ（Ｓｈｉ、Ｅｒｍｉｓら、２００９）によって開発された創傷壊死組織タンパク質分解活性のインビトロ代理である。ＡＷＥデブリードアッセイは、インビボ動物データに十分に匹敵することが示されている。ＡＷＥ基質は、それぞれが異なるフルオロフォアでタグ付けされた３種の創傷関連細胞外マトリックスタンパク質（コラーゲン、エラスチン、及びフィブリン）のペレットからなる。このマトリックスの段階的分解は、フランツ型拡散セル設定における蛍光強度の漸進的増加によって測定され得る（図２）。実験に対する最終読み出しを、２４時間の時点で取得する。
【0122】
デブリードアッセイのための材料は、コラーゲン－フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（ＣＦ３０８）、Ｅｌａｓｔｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｃｏｍｐａｎｙ、ＵＳＡ製のエラスチン－ローダミン（Ｒ１４４）、Ｍｅｒｃｋ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｌｉｍｉｔｅｄ製のトロンビン及びフィブリノゲン（６０５１５７、３４１５７３）、すべてＳｉｇｍａ製の、１００ｍＭ ＮａＣｌ及び１０ｍＭ ＣａＣｌ２とともに５０ｍＭ Ｔｒｉｓを含有するＴｒｉｓバッファー、磁気スターラーバー（Ｚ３２８９３６）、Ｌ－システイン（Ｗ３２６３０５）、エラスチン－牛（Ｅ１６２５）、７－アミノ－４－メチルクマリン（Ａ９８９１）、並びにパパイヤラテックス由来のパパイン（Ｐ３３７５）であった。
【0123】
フィブリン－クマリンの調製：１０ｍｇ／ｍＬの最終フィブリノゲン濃度（Ｔｒｉｓバッファー中）を有して、クマリン溶液（Ｔｒｉｓバッファー中０．０２ｍｇ／ｍＬ）においてフィブリノゲンを混合することによって、フィブリノゲンを７－アミノ－４－メチルクマリンで標識した。混合物を、回転式振とうを用いて室温で１時間インキュベートした。フィブリノゲン－クマリン溶液にトロンビン溶液（２．５単位／ｍＬ）を添加し、２時間凝固させることによって、クマリン標識されたフィブリンを導き出した。
【0124】
形成された凝固物を水で３回洗浄し、蒸留水及びメタノール（１：１）において一晩静置させて、過剰な色素を除去した。次いで、凝固物を、透明の非粘着性濾紙を有するガラス容器に移し、３日間乾燥させた。乾燥したフィブリン－クマリンを、乳棒及び乳鉢を使用して微粉にすりつぶした。
【0125】
人工創傷痂皮（ＡＷＥ）基質の調製
コラーゲン－ＦＩＴＣ、エラスチン－ローダミン、及びフィブリン－クマリンを、表４において言及される組成に従って混合した。フィブリノゲンを除いて、すべての材料を５０ｍＬコニカル遠心分離チューブに計量した。組織分裂器（ｔｅａｒｅｒ）を使用して、１０ｍＬ Ｔｒｉｓバッファーにおいて材料を３～５分間ホモジナイズした。１０ｍＬの１５ｍｇ／ｍＬフィブリノゲン溶液を、別個のチューブにおいてＴｒｉｓバッファーｐＨ６．８中に調製した。２つの溶液を組み合わせ、組織分裂器を使用することによって約２分間徹底的に混合した。トロンビン溶液（５０Ｕ／ｍＬ）を添加し、迅速に混合し、次いで溶液を、９０ｍｍの非反応性膜を含有するペトリディッシュに注ぎ、１時間凝固させた。次いで、凝固した基質を水で３回（それぞれ５分間）リンスしてトロンビンを除去した。洗浄後、ティッシュペーパーを使用することによって過剰な水を除去し、さらなる使用まで４℃で保管した。
コラーゲン－ＦＩＴＣ、エラスチン－ローダミン、及びフィブリン－クマリンを、表４において言及される組成に従って混合した。フィブリノゲンを除いて、すべての材料を５０ｍＬコニカル遠心分離チューブに計量した。組織分裂器（ｔｅａｒｅｒ）を使用して、１０ｍＬ Ｔｒｉｓバッファーにおいて材料を３～５分間ホモジナイズした。１０ｍＬの１５ｍｇ／ｍＬフィブリノゲン溶液を、別個のチューブにおいてＴｒｉｓバッファーｐＨ６．８中に調製した。２つの溶液を組み合わせ、組織分裂器を使用することによって約２分間徹底的に混合した。トロンビン溶液（５０Ｕ／ｍＬ）を添加し、迅速に混合し、次いで溶液を、９０ｍｍの非反応性膜を含有するペトリディッシュに注ぎ、１時間凝固させた。次いで、凝固した基質を水で３回（それぞれ５分間）リンスしてトロンビンを除去した。洗浄後、ティッシュペーパーを使用することによって過剰な水を除去し、さらなる使用まで４℃で保管した。
【0126】
フランツ型拡散セルシステム
膜に依然として付着したＡＷＥ基質を用い、生検トレパン（ｂｉｏｐｓｙ ｐｕｎｃｈ）を使用して９ｍｍ径片の穴を開けた。９ｍｍ ＡＷＥ基質を非反応性ニトロセルロース膜の上部に置き、２つのチャンバー間のフランツ型拡散セルに置き、２つのチャンバーのうちの下方（レセプターセル）を、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン－ストレプトマイシンを含有するＴｒｉｓバッファーで満たした（図２）。サンプルホルダーを上部に置き、アセンブリ全体をレセプターセルにねじ留めを用いて取り付け、３５℃の水槽で取り囲んだ。次いで、サンプルホルダーの上方のチャンバーにサンプルをロードし、通気孔を開けたパラフィルムで覆った。実験を通して５００ｒｐｍで磁気スターラーを使用して、溶液を混合した。ゼロ時点で及び最高２４時間までの一定の間隔で、１００μＬの溶液をレセプターセルからサンプリングした。収集されたサンプルを、蛍光プレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴ ＫＣ４ ｖ３．４）を使用した即時の蛍光測定のために、９６ウェルマイクロプレートにロードした。測定後、１００μＬのサンプルをレセプターセルに戻した。
膜に依然として付着したＡＷＥ基質を用い、生検トレパン（ｂｉｏｐｓｙ ｐｕｎｃｈ）を使用して９ｍｍ径片の穴を開けた。９ｍｍ ＡＷＥ基質を非反応性ニトロセルロース膜の上部に置き、２つのチャンバー間のフランツ型拡散セルに置き、２つのチャンバーのうちの下方（レセプターセル）を、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン－ストレプトマイシンを含有するＴｒｉｓバッファーで満たした（図２）。サンプルホルダーを上部に置き、アセンブリ全体をレセプターセルにねじ留めを用いて取り付け、３５℃の水槽で取り囲んだ。次いで、サンプルホルダーの上方のチャンバーにサンプルをロードし、通気孔を開けたパラフィルムで覆った。実験を通して５００ｒｐｍで磁気スターラーを使用して、溶液を混合した。ゼロ時点で及び最高２４時間までの一定の間隔で、１００μＬの溶液をレセプターセルからサンプリングした。収集されたサンプルを、蛍光プレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴ ＫＣ４ ｖ３．４）を使用した即時の蛍光測定のために、９６ウェルマイクロプレートにロードした。測定後、１００μＬのサンプルをレセプターセルに戻した。
【0127】
以下の方程式を適用して、基質における３種すべてのタンパク質構成要素の総累積消化を判定した。
ＣＤｎ＝Ｉｎ×Ｖセル
式中、ｎ＝時間での時間、ＣＤｎ及びＩｎは、累積消化パラメーター及び時間ｎにおける蛍光強度であり、Ｖセルはセルの体積（５．１ｍＬ）である。
ＣＤｎ＝Ｉｎ×Ｖセル
式中、ｎ＝時間での時間、ＣＤｎ及びＩｎは、累積消化パラメーター及び時間ｎにおける蛍光強度であり、Ｖセルはセルの体積（５．１ｍＬ）である。
【表4】
【0128】
実施例１－ＯＰＡＬ Ｂ濾液－ＯＰＡＬ Ａ濾液のバリアント、及びＯＰＡＬ Ｂ濾液のタンパク質分解活性
カリカ・パパイヤは、パパイヤ科（Ｃａｒｉｃａｃｅａｅ）の小さなファミリーに属し、カリカ・パパイヤの食用果実及びラテックスのために、熱帯及び亜熱帯において栽培される主たる果実の１つである。これらの実施例において使用された果実は、地元のＵＫを拠点とするスーパーマーケットにおいて購入された、ブラジル及びジャマイカから主に取得された熟したパパイヤ果実である。十分に特徴付けされ且つ集中的に研究されたシステインプロテアーゼのほとんどは、パパインファミリーのメンバーである。パパイン、キモパパインＡ及びＢ、キモパパインＭ、並びにカリカインはすべて、カリカ・パパイヤから抽出されているが、熟した果実からは特徴付けされたことがない。
カリカ・パパイヤは、パパイヤ科（Ｃａｒｉｃａｃｅａｅ）の小さなファミリーに属し、カリカ・パパイヤの食用果実及びラテックスのために、熱帯及び亜熱帯において栽培される主たる果実の１つである。これらの実施例において使用された果実は、地元のＵＫを拠点とするスーパーマーケットにおいて購入された、ブラジル及びジャマイカから主に取得された熟したパパイヤ果実である。十分に特徴付けされ且つ集中的に研究されたシステインプロテアーゼのほとんどは、パパインファミリーのメンバーである。パパイン、キモパパインＡ及びＢ、キモパパインＭ、並びにカリカインはすべて、カリカ・パパイヤから抽出されているが、熟した果実からは特徴付けされたことがない。
【0129】
本発明者らは、質量分析の仕事をこれまでに行っており（Ｒｉｃｈａｒｄ Ｊ．Ｌｉｐｓｃｏｍｂｅ－西オーストラリア大学Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、カリカ・パパイヤの熟した果実抽出物由来のＯＰＡＬ Ａ濾液が、システイン（チオール依存的）プロテアーゼを含有することを示した。これらのシステインプロテアーゼは、伝統的には、パパイヤラテックスから又はパパイヤの皮からのみ抽出される（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、パーソナルコミュニケーション）。ＯＰＡＬ Ａ濾液におけるシステインプロテアーゼを機能的に同定するために、分光光度アッセイを実施した。これらの実験は、ＯＰＡＬ Ａ濾液による、発色基質Ｌ－ＢＡｐＮＡ（Ｎα－ベンゾイル－Ｌ－アルギニン４－ニトロアニリド塩酸塩）の触媒的加水分解をモニターすることを伴った。
【0130】
アルギニンとｐ－ニトロアニリン部分との間の結合における、プロテアーゼの存在下でのＬ－ＢＡｐＮＡの加水分解は、発色団ｐ－ニトロアニリンを放出し、次いでｐ－ニトロアニリンは４１０ｎｍの波長で分光法によって検出され得る。Ｌ－ＢＡｐＮＡ活性判定の手順は、上の方法に記載される。採用された最適化条件下で、過剰な基質はゼロ次反応速度論をもたらし、ゼロ次反応速度論は直線として明白であり、直線の傾きは酵素活性に比例する。
【0131】
本発明者らは、ＯＰＡＬ Ａが、システインプロテアーゼを特異的に阻害する阻害剤Ｅ－６４の添加によって本質的に無効になるシステインプロテアーゼ活性を有することをこれまでに立証している（未発表データ）。それゆえ、本発明者らは、ＯＰＡＬ Ａにおけるプロテアーゼ活性は、活性システインプロテアーゼの存在のみに本質的に起因するとこれまでに結論付けた。加熱処理ステップを省略することの効果を判定するために、ＯＰＡＬ Ａ及びＯＰＡＬ Ｂ濾液の両方におけるプロテアーゼ活性を、Ｌ－ＢＡｐＮＡアッセイを使用して試験した。１０分後、Ｅ－６４阻害剤を添加した。
【0132】
ＯＰＡＬ Ｂは、ＯＰＡＬ Ａと比較して、ほぼ８倍増加した触媒活性（経時的なＡ４１０基質放出の直線的増加）を呈するように見えた（図３）。興味深いことに、ＯＰＡＬ Ｂ濾液へのＥ－６４の過剰な添加は、ＯＰＡＬ Ａにおけるような、活性の完全な阻害をもたらさなかった。それゆえ、且つ理論によって拘束されることを望むことなく、基質を用いたＡ４１０値の増加は、非チオール依存的（非システインプロテアーゼ）触媒に起因し得た。システインプロテアーゼ阻害剤Ｅ－６４での処理が、プロテアーゼ活性を完全には無効にしなかったという事実は、図４に示されるように、システイン及び非システインプロテアーゼの両方がＯＰＡＬ Ｂ濾液に存在したことを示唆する。
【0133】
実施例２－酵素反応速度論による、ＯＰＡＬ Ｂ濾液におけるシステイン及びセリンプロテアーゼの同定
ＯＰＡＬ Ｂ濾液における非チオール依存的又は非システインプロテアーゼをより理解するために、すべての必須プロテアーゼ阻害剤を含有する（表３を参照されたい）プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＰＩＣ）（ｓｉｇｍａ Ｐ２７１４）を使用して、酵素アッセイを最初に行った。図５に示されるように、ＯＰＡＬ Ｂ濾液に２０μＬのＰＩＣを添加することにより、プロテアーゼ活性の完全な阻害を達成した。
ＯＰＡＬ Ｂ濾液における非チオール依存的又は非システインプロテアーゼをより理解するために、すべての必須プロテアーゼ阻害剤を含有する（表３を参照されたい）プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＰＩＣ）（ｓｉｇｍａ Ｐ２７１４）を使用して、酵素アッセイを最初に行った。図５に示されるように、ＯＰＡＬ Ｂ濾液に２０μＬのＰＩＣを添加することにより、プロテアーゼ活性の完全な阻害を達成した。
【0134】
これらのデータに基づき、本発明者らは、次に、ＯＰＡＬ Ｂの増強した活性に関与することがあるＰＩＣの各構成要素を個々に試験することによって、各活性阻害剤の効果を検討した。カクテルに存在するプロテアーゼ阻害剤の構成要素は表３に示されている。
【0135】
ＯＰＡＬ Ｂ濾液を用いてＰＩＣに存在する各阻害剤を試験した後、２種の阻害剤のみがタンパク質分解活性を中断させ得た。これら２種の阻害剤は、図６に示されるように、それぞれシステインプロテアーゼ及びセリンプロテアーゼ阻害剤であるＥ－６４及びＡＥＢＳＦであった。
【0136】
両阻害剤の組み合わせは、図７に示されるように、酵素活性を完全に破棄した。このことは、ＯＰＡＬ Ｂ濾液における酵素活性がシステイン及びセリンプロテアーゼのみからなることを示唆する。
【0137】
実施例３－酵素反応速度論によって判定される、プロテアーゼを機能的に同定するためのザイモグラフィーアッセイ
ＯＰＡＬ Ｂ濾液は、多くのタンパク質の複雑な混合物であるように見える。それゆえ、分光光度アッセイによって検出されたプロテアーゼ活性を個々に可視化するために、本発明者らは、重ね合わせザイモグラフィーと呼ばれる技法を使用した。この技法では、タンパク質を、酵素活性を保つ標準的なネイティブＰＡＧＥゲルでまず分離する。基質溶液（１．２ｍｇ／ｍＬのＬ－ＢＡｐＮＡ）を含有する膜を、次いでゲルの上に重ね合わせ、着色増強剤を使用して現像した。この技法は、活性プロテアーゼが膜で直接可視化されるのを可能にする。
ＯＰＡＬ Ｂ濾液は、多くのタンパク質の複雑な混合物であるように見える。それゆえ、分光光度アッセイによって検出されたプロテアーゼ活性を個々に可視化するために、本発明者らは、重ね合わせザイモグラフィーと呼ばれる技法を使用した。この技法では、タンパク質を、酵素活性を保つ標準的なネイティブＰＡＧＥゲルでまず分離する。基質溶液（１．２ｍｇ／ｍＬのＬ－ＢＡｐＮＡ）を含有する膜を、次いでゲルの上に重ね合わせ、着色増強剤を使用して現像した。この技法は、活性プロテアーゼが膜で直接可視化されるのを可能にする。
【0138】
図８に示されるように、コロイドブルー染色されたネイティブＰＡＧＥゲルは、一方向性（陽極側）の相でのＯＰＡＬ Ｂ濾液におけるバンドを明らかにした。ゲルからニトロセルロース膜へのタンパク質の移動、及び後続のザイモグラフィー分析は、酵素活性（２種の酵素活性を示す）の明確な増加を示した。
【0139】
本発明者らは、観察された２つのシグナル又はバンドが、それぞれシステイン及びセリンプロテアーゼであることを検証するために、図８において取得された２つのザイモグラフィーバンドをさらに特徴付けした。ネイティブＰＡＧＥゲルの上部に膜を置く前に、ニトロセルロース膜に特異的阻害剤（システインプロテアーゼに対するＥ－６４、及びセリンプロテアーゼに対するＡＥＢＳＦ）を含めることによって、方法を改変した。取得されたデータは、バンドが、実際にＯＰＡＬ Ｂ濃縮濾液におけるシステインプロテアーゼ（複数可）及びセリンプロテアーゼ（複数可）であることをはっきりと明らかにした。図９に示されるように、システインプロテアーゼ（複数可）は上方のバンドに相当し、セリンプロテアーゼ（複数可）は下方のバンドに相当する。
【0140】
実施例４－セリンプロテアーゼを同定するためのサイズ排除クロマトグラフィー
セリンプロテアーゼ（複数可）を精製するために、ＯＰＡＬ Ｂを濃縮し、４ｋＤａ～１５０ｋＤａの域にあるタンパク質を分離するｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００カラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。Ｅ－６４で及び１００ｍＭ Ｌ－アルギニンで前処理された（２時間インキュベートされた）透析されたＯＰＡＬ Ｂを、１４ｍＬ ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００カラムを通じてランさせた。２４個の溶出画分を収集し、９６ウェルプレートＬ－ＢＡｐＮＡアッセイを実施した（データ示されず）。最も高いＬ－ＢＡｐＮＡ活性を含む画分をＳＤＳ ＰＡＧＥゲルに選択し、次いでゲルを、図１０に示されるように銀染色した。存在量がＬ－ＢＡｐＮＡ活性と相関する、画分におけるバンドを選択し、ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ分析によって分析した（つまり、８０ｋＤａ、５０ｋＤａ、及び３０ｋＤａのバンドにおいて第６画分に存在する強度のバンド）。これらのバンドは、サブチラーゼとして推定的に同定されていた、配列番号１に示されるカリカ・パパイヤ配列に合致した。
セリンプロテアーゼ（複数可）を精製するために、ＯＰＡＬ Ｂを濃縮し、４ｋＤａ～１５０ｋＤａの域にあるタンパク質を分離するｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００カラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。Ｅ－６４で及び１００ｍＭ Ｌ－アルギニンで前処理された（２時間インキュベートされた）透析されたＯＰＡＬ Ｂを、１４ｍＬ ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００カラムを通じてランさせた。２４個の溶出画分を収集し、９６ウェルプレートＬ－ＢＡｐＮＡアッセイを実施した（データ示されず）。最も高いＬ－ＢＡｐＮＡ活性を含む画分をＳＤＳ ＰＡＧＥゲルに選択し、次いでゲルを、図１０に示されるように銀染色した。存在量がＬ－ＢＡｐＮＡ活性と相関する、画分におけるバンドを選択し、ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ分析によって分析した（つまり、８０ｋＤａ、５０ｋＤａ、及び３０ｋＤａのバンドにおいて第６画分に存在する強度のバンド）。これらのバンドは、サブチラーゼとして推定的に同定されていた、配列番号１に示されるカリカ・パパイヤ配列に合致した。
【0141】
この結果は、以下のように配列番号１内で４つのフラグメントを同定した、完全ＯＰＡＬ Ｂ濾液の分析と一貫している。
【0142】
実施例５－セリンプロテアーゼの活性形態を同定するための反応性プローブ
種々のバンドのうちのどれが、ＯＰＡＬ Ｂ濾液におけるサブチラーゼのタンパク質分解的に活性な形態に相当するのかを立証するために、本発明者らは、ビオチンに連結されたフルオロスルホネート基を介して活性セリンプロテアーゼを特異的に標識する反応性プローブを使用した。次いで、この反応性プローブは、アルカリホスファターゼ等のストレプトアビジンコンジュゲート酵素を使用して、ウェスタンブロッティング技法により普通のＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで可視化され得る。この技法を使用することにより、図１１に示されるように、およそ５０ｋＤａにおける、ＡＥＢＳＦ処理によって阻害される活性セリンプロテアーゼバンドの可視化が可能となった。このバンドは、質量分析によりパパイヤサブチラーゼとして同定されたクロマトグラフィー実験からの観察されたバンドの１つに相当するものの、バンドの分子量は、全長タンパク質又はプロ酵素（それぞれ７０及び８５ｋＤａ）のいずれかの発表値と合致しない。理論によって拘束されることを望むことなく、本発明者らが、同じタンパク質を起源とするいくつかのバンドを観察したという事実は、種々のアイソフォームが存在することがあり、種々のアイソフォームのうちの５０ｋＤａ形態のみがタンパク質分解的に活性であることを示唆する。
種々のバンドのうちのどれが、ＯＰＡＬ Ｂ濾液におけるサブチラーゼのタンパク質分解的に活性な形態に相当するのかを立証するために、本発明者らは、ビオチンに連結されたフルオロスルホネート基を介して活性セリンプロテアーゼを特異的に標識する反応性プローブを使用した。次いで、この反応性プローブは、アルカリホスファターゼ等のストレプトアビジンコンジュゲート酵素を使用して、ウェスタンブロッティング技法により普通のＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで可視化され得る。この技法を使用することにより、図１１に示されるように、およそ５０ｋＤａにおける、ＡＥＢＳＦ処理によって阻害される活性セリンプロテアーゼバンドの可視化が可能となった。このバンドは、質量分析によりパパイヤサブチラーゼとして同定されたクロマトグラフィー実験からの観察されたバンドの１つに相当するものの、バンドの分子量は、全長タンパク質又はプロ酵素（それぞれ７０及び８５ｋＤａ）のいずれかの発表値と合致しない。理論によって拘束されることを望むことなく、本発明者らが、同じタンパク質を起源とするいくつかのバンドを観察したという事実は、種々のアイソフォームが存在することがあり、種々のアイソフォームのうちの５０ｋＤａ形態のみがタンパク質分解的に活性であることを示唆する。
【0143】
全体的結論
本発明者らは、国際公開第２００４／００８８８７号において、熟したパパイヤ（カリカ・パパイヤ）の果肉由来のＯＰＡＬ Ａとして公知の組成物を産生するための方法をこれまでに記載した。この方法は、加熱ステップ、それに続く炭酸水素ナトリウムでの処理、及びその後の濾過ステップを伴う。ＯＰＡＬ Ａについての本発明者らのこれまでの分析は、システインプロテアーゼ活性を同定した。ＯＰＡＬ Ａは、広範な障害を治療することにおいて活性を示している。本発明者らは、ＯＰＡＬ Ｂを産生するために、加熱ステップを省略することによってＯＰＡＬ Ａプロセスを改変した。本発明者らは、ＯＰＡＬ Ｂが、システインプロテアーゼと関連しない付加的なプロテアーゼ活性を含有することを驚くべきことに且つ予想外に見出した。本発明者らは、この付加的なプロテアーゼ活性を、ＯＰＡＬ Ａに存在しない少なくとも１種のセリンプロテアーゼの存在に起因するものとして特徴付けした。このタンパク質は、１種を上回る形態で存在するように見えるが、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって判定される５０ｋＤａの平均分子量を有するタンパク質のみがセリンプロテアーゼ活性を示した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析は、該タンパク質を、サブチラーゼとして推定的に同定されたＣ．パパイヤ配列の配列（Ｏｔｈｍａｎ及びＮｕｒａｚｉｙａｎ、２０１０）と同一の配列を有するものとして示したが、このことは生化学的特徴付けによって確認されなかった。さらに、このサブチラーゼは、組み換えで発現する場合、本発明者らが目下同定している活性セリンプロテアーゼの５０ｋＤａの分子量と比較して、約７０ｋＤａの分子量を有する。
本発明者らは、国際公開第２００４／００８８８７号において、熟したパパイヤ（カリカ・パパイヤ）の果肉由来のＯＰＡＬ Ａとして公知の組成物を産生するための方法をこれまでに記載した。この方法は、加熱ステップ、それに続く炭酸水素ナトリウムでの処理、及びその後の濾過ステップを伴う。ＯＰＡＬ Ａについての本発明者らのこれまでの分析は、システインプロテアーゼ活性を同定した。ＯＰＡＬ Ａは、広範な障害を治療することにおいて活性を示している。本発明者らは、ＯＰＡＬ Ｂを産生するために、加熱ステップを省略することによってＯＰＡＬ Ａプロセスを改変した。本発明者らは、ＯＰＡＬ Ｂが、システインプロテアーゼと関連しない付加的なプロテアーゼ活性を含有することを驚くべきことに且つ予想外に見出した。本発明者らは、この付加的なプロテアーゼ活性を、ＯＰＡＬ Ａに存在しない少なくとも１種のセリンプロテアーゼの存在に起因するものとして特徴付けした。このタンパク質は、１種を上回る形態で存在するように見えるが、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって判定される５０ｋＤａの平均分子量を有するタンパク質のみがセリンプロテアーゼ活性を示した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析は、該タンパク質を、サブチラーゼとして推定的に同定されたＣ．パパイヤ配列の配列（Ｏｔｈｍａｎ及びＮｕｒａｚｉｙａｎ、２０１０）と同一の配列を有するものとして示したが、このことは生化学的特徴付けによって確認されなかった。さらに、このサブチラーゼは、組み換えで発現する場合、本発明者らが目下同定している活性セリンプロテアーゼの５０ｋＤａの分子量と比較して、約７０ｋＤａの分子量を有する。
【0144】
したがって、本発明者らは、ＯＰＡＬ Ｂは、１種又は複数のタンパク質分解的に活性なセリンプロテアーゼ及び１種又は複数のタンパク質分解的に活性なシステインプロテアーゼの両方の混合物を含有し、一方で、カリカ・パパイヤにおいて認識されている現在までのところ唯一の公知の活性プロテアーゼはシステインプロテアーゼであることを示した。
【0145】
実施例６－インビトロでのＯＰＡＬ Ａ及びＯＰＡＬ Ｂ濾液のデブリード効力の定量化
デブリードマンとは、根底にある生存組織を露出するための、創傷からの壊死（死んだ）組織及び外来物質の除去である。このプロセスは、創傷治癒を促進し且つ加速させる。本発明者らは、ＯＰＡＬ Ａ濾液において同定されたシステインプロテアーゼが、人工創傷痂皮（ＡＷＥ）デブリードアッセイを使用して測定されるデブリードマンにおいて活性であろうかどうかを検討した。
デブリードマンとは、根底にある生存組織を露出するための、創傷からの壊死（死んだ）組織及び外来物質の除去である。このプロセスは、創傷治癒を促進し且つ加速させる。本発明者らは、ＯＰＡＬ Ａ濾液において同定されたシステインプロテアーゼが、人工創傷痂皮（ＡＷＥ）デブリードアッセイを使用して測定されるデブリードマンにおいて活性であろうかどうかを検討した。
【0146】
ＡＷＥデブリードアッセイとは、Ｈｅａｌｔｈ Ｐｏｉｎｔ（Ｓｈｉ、Ｅｒｍｉｓら、２００９）によって開発された創傷壊死組織タンパク質分解活性のインビトロ代理である。ＡＷＥデブリードアッセイは、インビボ動物データに十分に匹敵することが示されており、それゆえ、ＯＰＡＬ Ａ濾液製剤のデブリード効能を査定するために使用された。ＡＷＥ基質は、それぞれが異なるフルオロフォアでタグ付けされた３種の創傷関連細胞外マトリックスタンパク質であるコラーゲン、エラスチン、及びフィブリンのペレットからなる。このマトリックスの段階的分解は、フランツ型拡散セル設定における蛍光強度の漸進的増加によって測定され得る。実験に対する最終読み出しを、２４時間の時点で取得する。
【0147】
第１セットの実験において、天然ＯＰＡＬ Ａ濾液（０．７ｍｇ／ｍＬタンパク質等価）のタンパク質分解効能を、フランツ型セル拡散システムを使用して、パパイヤラテックス由来の対照粗パパイン（１０ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）に対して比較した。図１２に示される結果は、コラーゲン及びフィブリンのＯＰＡＬ Ａ濾液サンプル消化が、ラテックスパパイン（１０ｍｇ／ｍＬ）よりも一貫して優れているが、エラスチンに対しては弱いことをはっきりと示す。
【0148】
実施例７－デブリード効能を向上させるための、透析を使用したＯＰＡＬ Ａ濾液活性の濃縮
新しく調製されたＯＰＡＬ Ａ濾液のＬ－ＢＡｐＮＡ活性は、平均して０．６０ＩＵ／ｍＬである。新しいＯＰＡＬ Ａ濾液のタンパク質含有量はおよそ０．７ｍｇ／ｍＬであり、およそ１ＩＵ／ｍｇの特異的固体活性に相当する。およそ１０ＩＵ／ｍｇの純粋なラテックスパパインの活性と比較して、およそ１ＩＵ／ｍｇは、ＯＰＡＬ固体の約９％のパパイン含有量に近い。顕著には、実施例６において実施されたＡＷＥデブリードアッセイは、図１２に示されるように、ＯＰＡＬ Ａの名目上のパパイン含有量から予想されるであろうよりも、ＯＰＡＬ Ａの有意により高い活性を明らかにしている（０．６ＩＵ／ｍＬ対ラテックスパパインに対する３０ＩＵ／ｍＬ）。
新しく調製されたＯＰＡＬ Ａ濾液のＬ－ＢＡｐＮＡ活性は、平均して０．６０ＩＵ／ｍＬである。新しいＯＰＡＬ Ａ濾液のタンパク質含有量はおよそ０．７ｍｇ／ｍＬであり、およそ１ＩＵ／ｍｇの特異的固体活性に相当する。およそ１０ＩＵ／ｍｇの純粋なラテックスパパインの活性と比較して、およそ１ＩＵ／ｍｇは、ＯＰＡＬ固体の約９％のパパイン含有量に近い。顕著には、実施例６において実施されたＡＷＥデブリードアッセイは、図１２に示されるように、ＯＰＡＬ Ａの名目上のパパイン含有量から予想されるであろうよりも、ＯＰＡＬ Ａの有意により高い活性を明らかにしている（０．６ＩＵ／ｍＬ対ラテックスパパインに対する３０ＩＵ／ｍＬ）。
【0149】
ＯＰＡＬ Ａの固体残留物含有量は、抽出物を凍結乾燥することにより測定され、０．２１６±０．００５ｇ／ｍＬのバッチにわたって一貫した値をもたらす。それゆえ、ＯＰＡＬ Ａ濾液固体の圧倒的多数は、天然には潜在的に非タンパク質分解性であることがはっきりしている。それゆえ、抽出物から固体を除去することによって、抽出物の特異的活性を増加させることが可能であることがある。このことを検討するために、本発明者らは、新しいＯＰＡＬ Ａ濾液を、１２ｋＤａ及び２５ｋＤａのカットオフサイズを有する膜を使用した透析に供した。透析を４℃で２４時間行い、透析後に、溶液の残留タンパク質分解活性をＬ－ＢＡｐＮＡアッセイにより測定した。溶液のアリコートも、凍結乾燥させて固体含有量を測定した。処理は、小さな（２０％）浸透圧体積増加を引き起こし、その増加を算出において考慮に入れた。
【0150】
表５における結果は、１２及び２５ｋＤａのカットオフサイズを使用したいずれかの透析に対する、且つおよそ８６％の固体低下と組み合わせた、活性のほぼ完全な保持を示している。
この結果は、カリカ・パパイヤタンパク質分解酵素の一般に受け入れられているサイズ（２３～３０ｋＤａ）、及びＯＰＡＬ Ａ濾液が、透析されると除去される大量の低分子量糖類を含有するという事実と一貫している。固体含有量が１２ｋＤａ～２５ｋＤａの透析によって有意に変化しないという事実は、これら２つの値の間の中間にあるサイズを有する分子の、組成物における非存在を示す。それゆえ、本発明者らは、１２ｋＤａのカットオフ透析膜をさらなる実験に使用した。
【表5】
この結果は、カリカ・パパイヤタンパク質分解酵素の一般に受け入れられているサイズ（２３～３０ｋＤａ）、及びＯＰＡＬ Ａ濾液が、透析されると除去される大量の低分子量糖類を含有するという事実と一貫している。固体含有量が１２ｋＤａ～２５ｋＤａの透析によって有意に変化しないという事実は、これら２つの値の間の中間にあるサイズを有する分子の、組成物における非存在を示す。それゆえ、本発明者らは、１２ｋＤａのカットオフ透析膜をさらなる実験に使用した。
【0151】
ＯＰＡＬ Ａ濾液対天然Ｏｐａｌ Ａのデブリード強度を、実施例６のとおりに測定した。図１３におけるデータは、透析されたＯＰＡＬ Ａが、フィブリン及びエラスチンを消化することにおいて天然ＯＰＡＬ Ａよりも優れているが、コラーゲンに対しては劣ることを示している。
【0152】
要約すると、透析されたＯＰＡＬ Ａ濾液は、天然ＯＰＡＬ Ａ濾液と比較して、タンパク質分解活性の完全な保持、しかし対照よりも８６％少ない固体低下を示した。このことは、ＯＰＡＬ Ａ濾液における固体の大多数が天然には非タンパク質分解性であり、透析により除去され得る低分子量糖類として存在することを立証する。透析されたＯＰＡＬ Ａ濾液は、ラテックスパパイン及び天然ＯＰＡＬ Ａと比較して、フィブリン及びエラスチンの両方に対する増強したデブリード活性を有したが、天然ＯＰＡＬ Ａと比較して、コラーゲンに対するわずかに少ない効果を有した。
【0153】
実施例８－ＯＰＡＬ Ｂを用いた、重度の褥瘡の管理に関するインビボ事例研究
この事例研究は、ＯＰＡＬ Ｂの局所的適用による、高齢患者における組織壊死を伴う重度の潰瘍の早急な治療を開示する。それゆえ、ＯＰＡＬ Ｂは、少なくとも組織再生性で且つ抗壊死／デブリード性の因子を伴う作用の多因子様態を通じて、重度の潰瘍の治癒において治療的有益性を提供するように見える。
この事例研究は、ＯＰＡＬ Ｂの局所的適用による、高齢患者における組織壊死を伴う重度の潰瘍の早急な治療を開示する。それゆえ、ＯＰＡＬ Ｂは、少なくとも組織再生性で且つ抗壊死／デブリード性の因子を伴う作用の多因子様態を通じて、重度の潰瘍の治癒において治療的有益性を提供するように見える。
【0154】
認知症を有する７０代の寝たきり状態の老人ホーム患者は、重度の褥瘡を発症していた。潰瘍は、患者の腰背部の大部分にわたって横方向に広がり、著しい組織壊死を示した。病院に移されると、潰瘍を生じた創傷によってもたらされる過剰な滲出液を一掃しようとする試みで真空包帯（ｖａｃｕｕｍ ｄｒｅｓｓｉｎｇ）が適用された。偏菱形の皮弁を用いて潰瘍のサイズを低下させる付加的な外科的介入も試みられた。病院スタッフによる継続的な治療の努力にもかかわらず、創傷の重症度は持続した（図１４）。
【0155】
患者を治療する外科医の同意を得て、創傷のすぐ周りを取り囲む皮膚への３０％希釈ＯＰＡＬ Ｂ水性クリームの毎日の適用と併せた、創傷表面への直接の新しい非希釈ＯＰＡＬ Ｂの毎日の適用を支持して、真空包帯治療及び他の外科的介入は延期された。
【0156】
Ｏｐａｌ Ｂ治療の２～４日目までに、創傷はより綺麗で且つあまり炎症を起こしていないように見えた（図１５及び１６）。いくらかの壊死組織は依然として観察されたものの、壊死組織は、創傷のより小さなエリアに局在するように見えた。１６～１９日目までに、創傷サイズの低下を伴うさらなる向上が観察された（図１７及び１８）。安定すると、創傷を外科的にデブリードした。今まで極めて重度で且つ治療不可能な潰瘍であったものを治療することにおいてなされた、悪化／壊死及び進行の極めて早い食い止めは驚くべきものであり且つ顕著である。
【0157】
理論によって拘束されることを望むことなく、ＯＰＡＬ Ｂは、いくつかの作用の様態を有することがあると思われる：ＯＰＡＬ Ｂは、生存不能である組織に局在し、周辺虚血を逆転させ、それによって壊死組織の量を低下させるように見えた。ＯＰＡＬ Ｂが、潰瘍におけるスラフをデブリードし始めていたという証拠もある。
【0158】
上の個々の節において言及される本発明の様々な特質及び実施形態は、必要に応じて、他の節に準用される。その結果として、１つの節において指定される特質は、必要に応じて、他の節において指定される特質と組み合わされてもよい。
【0159】
上の明細書において触れられるすべての刊行物は、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書において開示され且つ主張される組成物及び／又は方法のすべては、本開示を踏まえて過度の実験なしで行われ得且つ実行され得る。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態の観点から記載されているものの、本発明の概念、精神、及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される組成物及び／又は方法に、並びに方法のステップにおいて又はステップの配列において変動が適用されてもよいことは当業者に明白であろう。
【0160】
実施例９－ＯＰＡＬ Ｂのプロテオームマッピング
ＵｎｉＰｒｏｔ緑色植物亜界（Ｖｉｒｉｄｐｌａｎｔａｅ）データベースを検索するプロテインパイロット（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｉｌｏｔ）（商標）を使用したＯＰＡＬ Ｂのプロテオームマッピングにおいて、検出されたペプチドフラグメントは、下に太字で示されるものである。
ＵｎｉＰｒｏｔ緑色植物亜界（Ｖｉｒｉｄｐｌａｎｔａｅ）データベースを検索するプロテインパイロット（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｉｌｏｔ）（商標）を使用したＯＰＡＬ Ｂのプロテオームマッピングにおいて、検出されたペプチドフラグメントは、下に太字で示されるものである。
【0161】
配列番号１（太字で示される、触媒三残基、Ａｓｎ３３６、及び配列番号２～５のペプチド）
【0162】
アミノ酸１～２５は推定シグナル配列であり、アミノ酸２６～１１２は、切断されて成熟タンパク質を形成する推定プロ領域（ｐｕｔａｔｉｖｅ ｐｒｏ ｒｅｇｉｏｎ）である。
【0163】
参考文献
Arkin AP, YouvanDC. An algorithm for protein engineering: simulations of recursive ensemblemutagenesis, Proc Natl Acad SciU S A. 1992 Aug 15;89(16):7811-5.
Delagrave S, Goldman ER, Youvan DC.Recursive ensemble mutagenesis. Protein Eng. 1993 Apr;6(3):327-31
Hosseininaveh V, Bandani A, HosseininavehF. Digestive proteolytic activity in the Sunn pest, Eurygaster integriceps. J Insect Sci. 2009;9:1-11.
Kunkel TA. Rapid and efficientsite-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 1985 Jan;82(2):488-92.
Kunkel TA, Roberts JD, Zakour RA. Rapidand efficient site-specific mutagenesiswithout phenotypic selection. Methods Enzymol. 1987;154:367-82.
Othman and Nuraziyan, Fruit-specific expression of papayasubtilase gene. J. Plant Physiology 2010; 167(2):131-137.
Prescott, Ed., Methods in Cell Biology,Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976)
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Shi L, Ermis R, Lam K, Cowart J, Attar P,Aust D. Study on the debridement efficacy of formulated enzymatic wound debriding agents by in vitroassessment using artificialwound eschar and by an in vivo pig model. Wound Repair Regen. 2009 Nov-Dec;17(6):853-62.
van der Plas MJ, Andersen AS, Nazir S,van Tilburg NH, Oestergaard PR, Krogfelt KA, van Dissel JT, Hensbergen PJ, Bertina RM, NibberingPH. A novel serine proteasesecreted by medicinal maggots enhances plasminogen activator-induced fibrinolysis. PLoS One. 2014 Mar 19;9(3):e92096.Erratum in: PLoS One. 2014;9(6).
Vinokurov KS, Oppert B, Elpidina EN. Anoverlay technique for postelectrophoreticanalysis of proteinase spectra in complex mixtures using p-nitroanilide substrates. Anal Biochem.2005 Feb 1;337(1):164-6.
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-03-24
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
カリカ・パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）の熟した果実から抽出された１種又は複数のタンパク質分解的に活性であるセリンプロテアーゼを含む、組成物。
【請求項2】
カリカ・パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）の熟した果実から抽出された１種又は複数の単離されたタンパク質分解的に活性であるセリンプロテアーゼを含む、組成物。
【請求項3】
カリカ・パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）の熟した果実から抽出された１種又は複数のタンパク質分解的に活性であるセリンプロテアーゼ及び１種又は複数の活性システインプロテアーゼとの混合物を含む、組成物。
【請求項4】
カリカ・パパイア（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）の熟した果実から抽出された１種又はは複数の単離されたタンパク質分解的に活性であるセリンプロテアーゼ及び１種又は複数の活性システインプロテアーゼの混合物を含む、組成物。
【請求項5】
カリカ・パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）の熟した果実パルプを、加熱ステップに供することなく、アルカリで処理するステップと、前記アルカリ処理後、不溶性植物材料から可溶性プロテアーゼを分離するステップとを含む、タンパク質分解的に活性であるセリンプロテアーゼを含む組成物を調製するための方法。
【請求項6】
前記アルカリが弱アルカリである、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記弱アルカリが１１未満のｐＫａを有する、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記弱アルカリが炭酸水素ナトリウムである、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記組成物がタンパク質分解的に活性であるシステインプロテアーゼをさらに含む、請求項５～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記組成物が、前記プロテアーゼの濃度を増加させるためにさらに処理される、請求項５～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
請求項５～１０のいずれか一項に記載の方法によって取得可能なタンパク質分解的に活性であるセリンプロテアーゼを含む、組成物。
【請求項12】
請求項５～１０のいずれか一項に記載の方法によって取得されるタンパク質分解的に活性であるセリンプロテアーゼを含む、組成物。
【請求項13】
タンパク質分解的に活性であるカリカ・パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）セリンプロテアーゼを、薬学的に許容できる担体又は希釈剤とともに含み、前記セリンプロテアーゼが、カリカ・パパイヤの熟した果実から抽出される、医薬組成物。
【請求項14】
単離されたタンパク質分解的に活性であるカリカ・パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）セリンプロテアーゼを、薬学的に許容できる担体又は希釈剤とともに含み、前記セリンプロテアーゼが、カリカ・パパイヤの熟した果実から抽出される、医薬組成物。
【請求項15】
請求項１～４、１１及び１２のいずれか一項に記載の組成物を、薬学的に許容できる担体又は希釈剤とともに含む、医薬組成物。
【請求項16】
タンパク質分解的に活性であるカリカ・パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）セリンプロテアーゼを、化粧品として許容できる担体又は希釈剤とともに含み、前記セリンプロテアーゼが、カリカ・パパイヤの熟した果実から抽出される、化粧品組成物。
【請求項17】
単離されたタンパク質分解的に活性であるカリカ・パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）セリンプロテアーゼを、化粧品として許容できる担体又は希釈剤とともに含み、前記セリンプロテアーゼが、カリカ・パパイヤの熟した果実から抽出される、化粧品組成物。
【請求項18】
請求項１～４、１１及び１２のいずれか一項に記載の組成物を、化粧品として許容できる担体又は希釈剤とともに含む、化粧品組成物。
【請求項19】
創傷デブリードマンにおける使用のための、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項20】
創傷デブリードマンのための医薬品の製造における、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項21】
皮膚エクスフォリエーション（ｅｘｏｆｏｌｉａｔｉｏｎ）における使用のための、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の化粧品組成物。
【請求項22】
皮膚エクスフォリエーション（ｅｘｏｆｏｌｉａｔｉｏｎ）における、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の化粧品組成物の使用。
【請求項23】
請求項１～４及び１１～１８のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与するステップを含む、皮膚病状を予防する、治療する、低下させる、又は改善する方法。
【請求項24】
請求項１～４及び１１～１８のいずれか一項に記載の組成物、並びに使用のための使用説明書を含む、皮膚病状を予防する、治療する、低下させる、又は改善することにおける使用のための又は使用される場合のキット。
【国際調査報告】