特表 2023-512460 ノカルディア・ルブラの細胞壁骨格の再生医学における用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-27

(54)【発明の名称】ノカルディア・ルブラの細胞壁骨格の再生医学における用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0775 20100101AFI20230317BHJP

   C12N 5/074 20100101ALI20230317BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230317BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20230317BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20230317BHJP

   A61K 36/06 20060101ALI20230317BHJP

   C12R 1/365 20060101ALN20230317BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0775

C12N5/074

C12N5/10

C12N1/20 C

C12N1/20 Z

C12N1/20 E

A61K35/28

A61K36/06

C12R1:365

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022542990

(86)(22)【出願日】2021-01-20

(85)【翻訳文提出日】2022-09-13

(86)【国際出願番号】 CN2021072874

(87)【国際公開番号】W WO2021147900

(87)【国際公開日】2021-07-29

(31)【優先権主張番号】202010068070.6

(32)【優先日】2020-01-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521299927

【氏名又は名称】▲遼▼▲寧▼格瑞仕特生物制▲藥▼有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】盖 波

(72)【発明者】

【氏名】▲竇▼ 春▲艷▼

(72)【発明者】

【氏名】金 培生

(72)【発明者】

【氏名】▲張▼ ▲軼▼

(72)【発明者】

【氏名】▲張▼ 国英

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA38X

4B065AA93X

4B065AC20

4B065BA30

4B065BB18

4B065BB40

4B065CA44

4B065CA46

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB63

4C087BC16

4C087NA20

(57)【要約】

本開示は、ノカルディア・ルブラの細胞壁骨格の再生医学における用途に関する。具体的には、ノカルディア・ルブラ（特に細胞壁骨格）の、幹細胞の増殖の促進、幹細胞の成長の促進、幹細胞の分化の促進、幹細胞の遊走の促進、幹細胞の生存率の向上における用途に関し、前記幹細胞は、成体幹細胞、ｉＰＳＣ、間葉系幹細胞から選択される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

幹細胞を調節する方法であって、
幹細胞をノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物に接触させるステップを含み、
幹細胞の数／ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物の比率は、１～１００個の幹細胞／１ｎｇのノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物であり、好ましくは、５～５０個の幹細胞／１ｎｇのノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物であり、
前記調節とは、幹細胞の増殖の促進、幹細胞の成長の促進、幹細胞の分化の促進、幹細胞の遊走の促進、幹細胞の生存率の向上から選択される１つ又はそれらの組み合わせを指し、
前記幹細胞は、成体幹細胞、ｉＰＳＣ、間葉系幹細胞から選択され、
好ましくは、前記幹細胞は、間葉系幹細胞であり、
前記間葉系幹細胞は、骨髄間葉系幹細胞、脂肪間葉系幹細胞、滑膜間葉系幹細胞、臍帯間葉系幹細胞、臍帯血間葉系幹細胞、胎盤間葉系幹細胞、羊膜間葉系幹細胞、肝臓間葉系幹細胞、筋肉間葉系幹細胞、肺間葉系幹細胞、膵臓間葉系幹細胞、歯髄間葉系幹細胞から選択され、
好ましくは、前記間葉系幹細胞は、脂肪間葉系幹細胞であり、
好ましくは、前記成体幹細胞は、上皮成体幹細胞である、方法。

【請求項2】

前記ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物は、ノカルディア・ルブラの細胞壁又はその組成成分である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物は、
１）ノカルディア・ルブラを用意するステップと、
２）前記ノカルディア・ルブラを粉砕し、粉砕生成物を得るステップと、
３．１）必要に応じて、前記粉砕生成物に脂質除去操作を行うステップと、
３．２）必要に応じて、前記粉砕生成物に核酸除去操作を行うステップと、
３．３）必要に応じて、前記粉砕生成物にタンパク質除去操作を行うステップと、
３．４）ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物を得るステップと、
４）必要に応じて、前記ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物中の水を除去し、好ましくは前記ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物を凍結乾燥させるステップと、
５）必要に応じて、個包装するステップと、を含む方法により得られ、
ステップ３．１）、３．２）、３．３）については、順序を入れ替えてもよく、同時に行ってもよく、ステップ４）とステップ５）については、順序を入れ替えてもよい、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物の、試薬の製造における用途であって、
前記試薬は、幹細胞の増殖の促進、幹細胞の成長の促進、幹細胞の分化の促進、幹細胞の遊走の促進、幹細胞の生存率の向上から選択される１つ又はそれらの組み合わせに用いられ、
前記幹細胞は、成体幹細胞、ｉＰＳＣ、間葉系幹細胞から選択され、
好ましくは、前記幹細胞は、間葉系幹細胞であり、
前記間葉系幹細胞は、骨髄間葉系幹細胞、脂肪間葉系幹細胞、滑膜間葉系幹細胞、臍帯間葉系幹細胞、臍帯血間葉系幹細胞、胎盤間葉系幹細胞、羊膜間葉系幹細胞、肝臓間葉系幹細胞、筋肉間葉系幹細胞、肺間葉系幹細胞、膵臓間葉系幹細胞、歯髄間葉系幹細胞から選択され、
好ましくは、前記間葉系幹細胞は、脂肪間葉系幹細胞であり、
好ましくは、前記成体幹細胞は、上皮成体幹細胞である、用途。

【請求項5】

前記ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物は、ノカルディア・ルブラの細胞壁又はその組成成分である、請求項４に記載の用途。

【請求項6】

前記ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物は、
１）ノカルディア・ルブラを用意するステップと、
２）前記ノカルディア・ルブラを粉砕し、粉砕生成物を得るステップと、
３．１）必要に応じて、前記粉砕生成物に脂質除去操作を行うステップと、
３．２）必要に応じて、前記粉砕生成物に核酸除去操作を行うステップと、
３．３）必要に応じて、前記粉砕生成物にタンパク質除去操作を行うステップと、
３．４）ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物を得るステップと、
４）必要に応じて、前記ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物中の水を除去し、好ましくは前記ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物を凍結乾燥させるステップと、
５）必要に応じて、個包装するステップと、を含む方法により得られ、
ステップ３．１）、３．２）、３．３）については、順序を入れ替えてもよく、同時に行ってもよく、ステップ４）とステップ５）については、順序を入れ替えてもよい、請求項４又は５に記載の用途。

【請求項7】

幹細胞培養媒体であって、
ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物を含み、
前記幹細胞は、成体幹細胞、ｉＰＳＣ、間葉系幹細胞から選択され、
好ましくは、前記幹細胞は、間葉系幹細胞であり、
前記間葉系幹細胞は、骨髄間葉系幹細胞、脂肪間葉系幹細胞、滑膜間葉系幹細胞、臍帯間葉系幹細胞、臍帯血間葉系幹細胞、胎盤間葉系幹細胞、羊膜間葉系幹細胞、肝臓間葉系幹細胞、筋肉間葉系幹細胞、肺間葉系幹細胞、膵臓間葉系幹細胞、歯髄間葉系幹細胞から選択され、
好ましくは、前記間葉系幹細胞は、脂肪間葉系幹細胞であり、
好ましくは、前記成体幹細胞は、上皮成体幹細胞であり、
前記ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物は、ノカルディア・ルブラの細胞壁又はその組成成分である、幹細胞培養媒体。

【請求項8】

前記ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物は、
１）ノカルディア・ルブラを用意するステップと、
２）前記ノカルディア・ルブラを粉砕し、粉砕生成物を得るステップと、
３．１）必要に応じて、前記粉砕生成物に脂質除去操作を行うステップと、
３．２）必要に応じて、前記粉砕生成物に核酸除去操作を行うステップと、
３．３）必要に応じて、前記粉砕生成物にタンパク質除去操作を行うステップと、
３．４）ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物を得るステップと、
４）必要に応じて、前記ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物中の水を除去し、好ましくは前記ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物を凍結乾燥させるステップと、
５）必要に応じて、個包装するステップと、を含む方法により得られ、
ステップ３．１）、３．２）、３．３）については、順序を入れ替えてもよく、同時に行ってもよく、ステップ４）とステップ５）については、順序を入れ替えてもよい、請求項７に記載の幹細胞培養媒体。

【請求項9】

創面癒合を促進する方法であって、
被験対象の創面を治療有効量の幹細胞及びノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物に接触させるステップを含み、
前記幹細胞は、成体幹細胞、ｉＰＳＣ、間葉系幹細胞から選択され、
幹細胞の数／ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物の比率は、１～１００個の幹細胞／１ｎｇのノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物であり、好ましくは、５～５０個の幹細胞／１ｎｇのノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物であり、
前記間葉系幹細胞は、骨髄間葉系幹細胞、脂肪間葉系幹細胞、滑膜間葉系幹細胞、臍帯間葉系幹細胞、臍帯血間葉系幹細胞、胎盤間葉系幹細胞、羊膜間葉系幹細胞、肝臓間葉系幹細胞、筋肉間葉系幹細胞、肺間葉系幹細胞、膵臓間葉系幹細胞、歯髄間葉系幹細胞から選択され、
好ましくは、前記間葉系幹細胞は、脂肪間葉系幹細胞であり、
好ましくは、前記成体幹細胞は、上皮成体幹細胞であり、
好ましくは、前記創面は、糖尿病に関連する創面である、方法。

【請求項10】

－幹細胞と、
－ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物とを含み、
前記幹細胞は、成体幹細胞、ｉＰＳＣ、間葉系幹細胞から選択され、
幹細胞の数／ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物の比率は、１～１００個の幹細胞／１ｎｇのノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物であり、好ましくは、５～５０個の幹細胞／１ｎｇのノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物であり、
前記間葉系幹細胞は、骨髄間葉系幹細胞、脂肪間葉系幹細胞、滑膜間葉系幹細胞、臍帯間葉系幹細胞、臍帯血間葉系幹細胞、胎盤間葉系幹細胞、羊膜間葉系幹細胞、肝臓間葉系幹細胞、筋肉間葉系幹細胞、肺間葉系幹細胞、膵臓間葉系幹細胞、歯髄間葉系幹細胞から選択され、
好ましくは、前記成体幹細胞は、上皮成体幹細胞である、医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、２０２０年１月２１日に提出した中国特許出願第２０２０１００６８０７０．６号の優先権を主張するものである。

【0002】

技術領域
本開示は、再生医学の分野に関する。具体的には、ノカルディア・ルブラ（特に細胞壁骨格）の、幹細胞の増殖及び分化の促進における用途に関する。

【背景技術】

【0003】

幹細胞は、自己複製能及び多系列分化能を有する始原細胞である。特定の条件下で、増殖し、かつ異なる機能細胞に指向性分化することができる。したがって、幹細胞の研究は、生命体の各組織及び器官の再生及び損傷修復に対して、非常に重要な役割を果たし、多くの治癒できない疾患、特に細胞及び組織の欠失又は損傷による疾患の治療の希望となる。

【0004】

幹細胞は、胚性幹細胞及び成体幹細胞を含む。胚性幹細胞は、倫理的問題のため、その応用が大幅に限定され、成体幹細胞は、機能細胞及び組織に分化できるため、幹細胞の広い応用に基礎を提供し、多くの疾患の細胞置換療法に新たな細胞供給源を提供する。したがって、成体幹細胞は、研究の重点となっている。

【0005】

しかしながら、正常な成体哺乳動物の幹細胞は、数が少なく、分化が様々な固有メカニズム及び微環境要因による影響を受け、インビトロでの長期間の大量培養、特に無血清増殖培養が困難であり、実際の治療に応用することができない。

【0006】

多くの疾患は、機能細胞の欠失又は損傷に起因することができ、細胞置換療法は、これらの疾患を治療する効果的な方法である。幹細胞医薬は、生体内の幹細胞の増殖及び分化を調節することにより、細胞の欠失又は損傷による疾患を予防治療することができる。幹細胞医薬を用いて自己幹細胞の増殖及び指向性分化能を調節することにより、損傷した機能細胞を再生し、その生物学的機能を回復させる。

【0007】

脂肪由来間葉系幹細胞（Ａｄ－ＭＳＣ）は、脂肪組織基質から誘導された成体幹細胞であり、非常に高い自己複製能を有し、様々なタイプの機能細胞に分化することができる。Ａｄ－ＭＳＣが幹細胞に基づく慢性傷口治療において大きな潜在力を有することが証明された証拠は存在する［非特許文献１、２］。しかしながら、潜在的な細胞療法におけるＡｄ－ＭＳＣの成功的な応用に対する１つの重大な障害は、移植後の細胞の生存率である［非特許文献３］。細胞を損傷された皮膚組織に移植する場合、それらが酸素欠乏、炎症、酸化ストレス又は他の不利な条件を経験するため、移植後の種細胞の生存率が不可避に低下し、Ａｄ－ＭＳＣの治療効果が妨害される［非特許文献４］。

【0008】

ノカルディア・ルブラ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｒｕｂｒａ）はノカルディア属の１種である。ノカルディア・ルブラの菌体に対して発酵、細胞破砕、プロテアーゼ分解を行った後にノカルディア・ルブラの細胞壁骨格（Ｎｒ－ＣＷＳと略称される）を製造することができる。Ｎｒ－ＣＷＳの主な成分は、ノカルディア酸、アラビノガラクタン及びペプチドグリカン［非特許文献５、６］である。

【0009】

従来技術において、ノカルディア・ルブラの細胞壁骨格は、例えば遼寧格瑞仕特生物制薬有限公司により製造された商品（商品名「納可佳」）のような市販品であってもよい。ノカルディア・ルブラの細胞壁骨格は、子宮頸部びらん、子宮頸癌前癌病変（特許文献１）、抗ヒトパピローマウイルス（特許文献２）、皮膚損傷（特許文献３）、皮膚病変（湿疹、神経性皮膚炎、非特異性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、乾癬）（特許文献４）、ニキビ（特許文献５）、真菌感染、単純疱疹、帯状疱疹（特許文献６）の治療に用いられている。いくつかの研究によると、Ｎｒ－ＣＷＳは抗腫瘍及び免疫刺激特性を有し、かつＩＬ－１、ＩＬ－６、ＴＮＦ－１及びＩＦＮのようなサイトカインの産生を増強する可能性がある［非特許文献７］。Ｎｒ－ＣＷＳの局所治療は、既に浸潤性膀胱癌［非特許文献８］、ヒトパピローマウイルス［非特許文献９］及び悪性胸水［非特許文献１０］などに用いられている。しかしながら、Ｎｒ－ＣＷＳの詳細な免疫調節機能は、まだ不明確である。

【0010】

したがって、成体幹細胞の増殖及び分化を特異的に調節する活性成分を見つけることは、幹細胞医薬の研究ホットスポットである。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】中国特許出願第１０１０７３５８３号明細書

【特許文献2】中国特許出願第１９３５２６２号明細書

【特許文献3】中国特許出願第１０１２０９２６７号明細書

【特許文献4】中国特許出願第１０８９３８６７４号明細書

【特許文献5】中国特許出願第１０８２９５０９５号明細書

【特許文献6】中国特許出願第１８７９６６１号明細書

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】張広亮ら，脂肪幹細胞局所注射による糖尿病慢性創面治療の臨床治療効果，臨床と病理雑誌，２０１９，３９（９）：１９４０－１９４５

【非特許文献2】「自己脂肪由来幹細胞と無菌生体創傷被覆材との組み合わせの慢性創面癒合に対する影響への分析」，

【数1】

ら，飲食保健，２０１９，６（１５）：４９－５０

【非特許文献3】Ｎｕｓｃｈｋｅ Ａ，Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｆｏｒ ｃｈｒｏｎｉｃ ｓｋｉｎ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ，Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，２０１４，１０：２９－３７

【非特許文献4】Ｄａｓ Ｒら，Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｈｙｐｏｘｉａ ｉｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ，Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｐａｒｔ Ｂ Ｒｅｖ，２０１０，１６：１５９－１６８

【非特許文献5】Ｓ．Ｉｚｕｍｉら，Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｎｏｃａｒｄｉａ ｒｕｂｒａ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｓｋｅｌｅｔｏｎ ｏｎ ｓｙｎｇｅｎｅｉｃａｌｌｙ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ Ｐ３８８ ｔｕｍｏｒｓ，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ，１９９１，５１（１５）：４０３８－４０４４

【非特許文献6】Ｊ．Ｚｈａｏら，Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｎｏｃａｒｄｉａ ｒｕｂｒａ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｓｋｅｌｅｔｏｎ（Ｎｒ－ＣＷＳ）ｏｎ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ＴＣ－１ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ｐａ－ｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｎｒ－ＣＷＳ ｉｎ ｌｏｗｅｒ ｇｅｎｉｔａｌ ｔｒａｃｔ ｏｆ ｗｏｍｅｎ，Ｚｈｏｎｇｈｕａ Ｓｈｉ Ｙａｎ Ｈｅ Ｌｉｎ Ｃｈｕａｎｇ Ｂｉｎｇ Ｄｕ Ｘｕｅ Ｚａ Ｚｈｉ，２００７，２１（４）：３４０－３４２

【非特許文献7】鄒華ら，４３８例の肺癌悪性胸水の診療及び予後因子分析，重慶医学，２０１５，４４（２７）：３７９４－３７９７、３８０２

【非特許文献8】于順利ら，ノカルディア・ルブラの細胞壁骨格の膀胱灌流による筋層非浸潤性膀胱癌の術後再発への予防の治療効果及び安全性，中華泌尿器科雑誌，２０１９，４０（７）：５２１－５２５

【非特許文献9】霍泳賢，子宮頸部局所外用のノカルディア・ルブラの細胞壁骨格製剤による子宮頸部ヒトパピローマウイルス無症状感染への治療の治療効果の観察，現代診断と治療，２０１９，３０（１６）：２８６５－２８６６

【非特許文献10】斉利ら，ノカルディア・ルブラの細胞壁骨格の胸腔内注射による悪性胸水治療の臨床効果，中華実用医学雑誌，２０１９，４６（２０）：１０４－１０６

【非特許文献11】Ｒａｔｈｕｒ ＨＭら，Ｔｈｅ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｆｏｏｔ，ＣｌｉｎＤｅｒｍａｔｏｌ，２００７，２５（１）：１０９－１２０

【非特許文献12】Ｇｕｏ ＷＹら，Ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｗｏｏｄ ｈｅａｌｉｎｇ ｂｙ ｌｏｗ－ｄｏｓｅ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，Ｒａｄｉａｔ Ｒｅｓ，２０１０，１７４（４）：４６７－４７９

【非特許文献13】Ｆｉｏｒｉｎａ Ｐら，Ｔｈｅ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２０１０，１９（１１）：１３６９－１３８１

【非特許文献14】謝平ら，子宮頸部上皮内腫瘍組織におけるＨＰＶの検出及び表現型結果の分析，現代診断と治療，２０１６，２７（１３）：２３８１－２３８２

【非特許文献15】Ｋａｉｓａｎｇ Ｌｉｎら，Ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｓｅｅｄｅｄ ｉｎ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－１２７ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１７，２１７：６３－７４

【非特許文献16】ＧｏｎｇＪＨら，Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ＡＧＥｓ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｏｎ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ，ａｎｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，Ｉｎｔ Ｊ Ｌｏｗ Ｅｘｔｒｅｍ Ｗｏｕｎｄｓ，２０１７，１６（２）：９４－１０３

【非特許文献17】Ｋａｔｏ Ｙら，Ｃｒｅａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ（ＡＳＣ）ｓｈｅｅｔｉｎ ａ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｗｏｕｎｄ－ｈｅａｌｉｎｇ ｍｏｄｅｌ，Ｊｏｖｅ－Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ，２０１７，１２（６）：１－１０

【非特許文献18】Ｒｅｈｍａｎ Ｊら，Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ａｎｄ ａｎｔｉ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ ｂｙ ｈｕｍａｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００４，１０９：１２９２－８

【非特許文献19】Ｅｂｒａｈｉｍｉａｎ ＴＧら，Ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ，２００９，２９（４）：５０３－５１０

【非特許文献20】Ｋｉｍ ＷＳら，Ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｓｃｉ，２００７，４８：１５－２４

【非特許文献21】Ｕｎｎｉｋｒｉｓｈｎａｎ Ｓら，Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｉｎ－ｂａｓｅｄ ｎｉｃｈｅ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ，Ｂｉｏｒｅｓ Ｏｐｅｎ Ａｃｃｅｓｓ，２０１４，３（６）：３３９－３４７

【非特許文献22】Ｌｉ Ｑら，ｍｉＲ－５５９１－５ｐ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＡＤＳＣｓ ｉｎ ｒｅｐａｉｒｉｎｇ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｗｏｕｎｄ ｖｉａ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＡＧＥｓ／ＡＧＥＲ／ＪＮＫ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｘｉｓ，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ，２０１８，９：５６６

【非特許文献23】Ｌｉ Ｑら，Ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ－１ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｈｕｍａｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ，Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ Ｍｅｄ，２０１６，１２：４５－５０。

【発明の概要】

【0013】

本開示は、幹細胞を調節するための活性成分及びその応用を提供する。

【0014】

本開示のいくつかの実施形態において、単離されたノカルディア・ルブラ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｒｕｂｒａ）を提供する。

【0015】

本開示のいくつかの実施形態において、ノカルディア・ルブラ及びその誘導生成物を提供する。前記誘導生成物は、ノカルディア・ルブラ由来で、ノカルディア・ルブラの組成成分（例えば、タンパク質、核酸、脂質、細胞壁及びその組成成分、炭水化物、代謝物）を含む。

【0016】

具体的な実施形態において、単離されたノカルディア・ルブラの細胞壁を提供する。

【0017】

具体的な実施形態において、ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物を提供する。

【0018】

具体的な実施形態において、単離されたノカルディア・ルブラの細胞壁骨格を提供する。

【0019】

本開示のいくつかの実施形態において、本開示に係るノカルディア・ルブラの細胞壁又はノカルディア・ルブラの細胞壁骨格を含む医薬組成物を提供する。

【0020】

本開示のいくつかの実施形態において、ノカルディア・ルブラを粉砕して得られた生成物を含む、ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物を提供する。

【0021】

本開示の別のいくつかの実施形態において、ノカルディア・ルブラを粉砕してから精製（脂質除去、核酸除去、タンパク質除去）して得られた生成物を含む、ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物を提供する。

【0022】

本開示の別のいくつかの実施形態において、ノカルディア・ルブラの細胞壁を含む、ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物を提供する。

【0023】

本開示の別のいくつかの実施形態において、ノカルディア・ルブラの細胞壁骨格を含む、ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物を提供する。

【0024】

本開示のいくつかの実施形態において、ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物を含む医薬組成物又は医療装置を提供する。

【0025】

本開示の別のいくつかの実施形態において、ノカルディア・ルブラを粉砕してから精製（脂質除去、及び／又は核酸除去、及び／又はタンパク質除去）して得られた生成物を含む医薬組成物又は医療装置を提供する。

【0026】

本開示の別のいくつかの実施形態において、ノカルディア・ルブラの細胞壁を含む医薬組成物又は医療装置を提供する。

【0027】

本開示の別のいくつかの実施形態において、ノカルディア・ルブラの細胞壁骨格を含む医薬組成物又は医療装置を提供する。

【0028】

本開示の別のいくつかの実施形態において、上記ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物を含む医薬組成物又は医療装置を提供する。

【0029】

具体的な実施形態において、医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。

【0030】

いくつかの実施形態において、医薬組成物中の前記ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物は、１重量部であり、薬学的に許容される賦形剤は、５０～５０００重量部（例えば、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００及び任意の２つの数値範囲内の任意の値）である。

【0031】

別のいくつかの実施形態において、医薬組成物中のノカルディア・ルブラの細胞壁は、１重量部であり、前記薬学的に許容される賦形剤は、５０～５０００重量部（例えば、５０、１００、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、５００、６００、７００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００及び任意の２つの数値範囲内の任意の値）である。

【0032】

さらにいくつかの実施形態において、医薬組成物中のノカルディア・ルブラの細胞壁骨格は、１重量部であり、前記薬学的に許容される賦形剤は、５０～５０００重量部（例えば、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００及び任意の２つの数値範囲内の任意の値）である。

【0033】

いくつかの実施形態において、医薬組成物は、液体（液体製剤）として製造されてもよい。

【0034】

別のいくつかの実施形態において、医薬組成物は、固体（乾燥粉末製剤又は凍結乾燥粉末製剤）として製造されてもよい。

【0035】

当業者は、本開示の医薬組成物について、液体製剤と乾燥粉末製剤（又は凍結乾燥粉末製剤）の両者が相互に変換でき、含水量のみで相違するということを理解することができる。液体製剤中のほとんど又は全ての水を除去して、乾燥粉末製剤（又は凍結乾燥粉末製剤）を得る。乾燥粉末製剤（又は凍結乾燥粉末製剤）を溶解（又は再溶解）させた後に、液体製剤を得る。

【0036】

いくつかの実施形態において、医薬又は医薬組成物は、膏剤、クリーム剤、乳液、懸濁剤、ペースト剤、ゲル剤、洗浄剤、チンキ剤、オイル剤、錠剤、エアロゾル剤、噴霧剤、リニメント剤、粉剤から選択される剤形として製造され、前記膏剤は、軟膏剤、硬膏剤、クリーム剤から選択される。

【0037】

いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容される賦形剤は、充填剤、安定剤、矯味剤、崩壊剤、接着剤、潤滑剤であるが、これらに限定されない。

【0038】

いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容される賦形剤には、例えば、デキストラン、ラクトース、微結晶性セルロース、トレハロース、グリシン、キシリトール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エリスリトール、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、噴射剤、保湿剤、溶媒、可溶化剤、乳化剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、防腐剤であるが、これらに限定されない。具体的には、非限定的な例には、白色ワセリン、カルボマー、ヒプロメロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、キトサン、スクラルファートキトサン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ヒアルロン酸ナトリウム、ジメチルエーテル、テトラフルオロエタン、ヒドロフルオロアルカン、グリセリン、プロピレングリコール、脱イオン水、注射用水、蒸留水、エタノール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ｐ－アミノ安息香酸、アセトアミド、イソプロパノール、ツイーン、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ステアリン酸、グリセロールモノステアレート、トリグリセロールモノステアレート、ショ糖脂肪酸エステル、ショ糖エステル、イソ酪酸酢酸スクロース、ソルビタントリステアレート、ミリスチン酸イソプロピル、コレステロール、スクアレン、スクワラン、ｎ－ブタノール、エチレングリコール、エタノール、プロピレングリコール、ポリグリセリンエステル、亜硫酸塩、システイン、ジ－ｔｅｒｔ－ブチルヒドロキシトルエン、ソルビン酸カリウム、リン酸緩衝液、トリエタノールアミン、水酸化ナトリウム、エチレンジアミン、ラウリルアミン、炭化水素ナトリウム、塩酸、パラベン、チメロサール、クロロクレゾール、クロロブタノール、安息香酸及びそのナトリウム塩がさらに含まれる。

【0039】

本開示のいくつかの実施形態において、
１）ノカルディア・ルブラを用意するステップと、
２）必要に応じて、前記ノカルディア・ルブラを培養するステップと、
３）必要に応じて、培養したノカルディア・ルブラを収集するステップと、
４）前記培養したノカルディア・ルブラを粉砕し、粉砕生成物を得るステップと、
５．１）必要に応じて、前記粉砕生成物に対して脂質除去操作を行うステップと、
５．２）必要に応じて、前記粉砕生成物に対して核酸除去操作を行うステップと、
５．３）必要に応じて、前記粉砕生成物に対してタンパク質除去操作を行うステップと、
５．４）精製生成物を得るステップと、
６）必要に応じて、前記精製生成物中の水を除去し、好ましくは凍結乾燥により前記精製生成物中の水を除去するステップと、
７）必要に応じて、個包装するステップと、
８）前記ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物を得るステップと、を含むか又はそれらのステップで構成される、ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物の製造方法を提供する。

【0040】

ステップ５．１）、５．２）、５．３）については、順序を入れ替えてもよく、同時に行ってもよく、ステップ６）とステップ７）については、順序を入れ替えてもよい。

【0041】

必要に応じて、ステップ５）は、（例えば非イオン性界面活性剤で）細胞膜を除去するステップを含んでもよい。

【0042】

ノカルディア・ルブラの培養は、具体的な培地及び培養パラメータに限定されなく、当業者は、公知の適切な方式で培養を行うことができ、製造規模に応じてシャーレ、培養フラスコ、発酵タンクを採用することができる。

【0043】

ノカルディア・ルブラに対する粉砕は、細胞内の物質を除去することを目的とするため、超音波破砕、リゾチームなどの技術を採用することができる。当業者は、グラム陽性菌を破砕することに適用される任意の既知又は将来的な方法が、いずれも本開示の技術手段に適用するということを理解することができる。

【0044】

当業者は、活性成分（細胞壁及びその組成成分）の後続の応用（例えば内服、注射、外用など）に応じて、培養、破砕、単離、収集、不純物除去、個包装の具体的なパラメータ及び機器を調整することで、後続の応用に影響を与える要因が製造ステップに導入されないようにする能力がある。

【0045】

いくつかの実施形態において、破砕した生成物中の脂質を有機溶媒で除去する。いくつかの実施形態において、破砕した生成物中のＤＮＡ及びＲＮＡをヌクレアーゼで除去する。いくつかの実施形態において、破砕した生成物中のタンパク質をヒドロラーゼで分解する。いくつかの実施形態において、破砕した生成物中の細胞膜を界面活性剤で除去する。

【0046】

いくつかの実施形態において、粉砕後の平均粒径は、１０ｎｍ～１０００ｎｍであり、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０ｎｍ±１０ｎｍ及び上記任意の２つの数値の間の範囲であってもよい。本分野の公知の粒径測定方法は、本願の技術手段に用いることができる。。

【0047】

いくつかの具体的な実施形態において、粉砕後の平均粒径は、１０ｎｍ～８００ｎｍである。

【0048】

別のいくつかの具体的な実施形態において、粉砕後の平均粒径は、１０ｎｍ～５００ｎｍである。

【0049】

いくつかの実施形態において、前記個包装とは、容器に個包装するか又は固体支持体に置くことを指す。前記容器は、ボトル、チューブ、パック、袋、プレート、アンプル、注射装置、アルミ箔包装、ドレッシング材、カプセルから選択される。

【0050】

例えば、具体的な実施形態において、前記個包装とは、ボトル／アンプルに個包装することを指す。応用前に、ボトル／アンプルに溶媒を添加する。

【0051】

本開示のいくつかの実施形態において、本開示に係る方法により製造されるノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物を提供する。

【0052】

本開示のいくつかの実施形態において、本開示に係る方法により製造されるノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物を含む医薬組成物又は医療装置を提供する。

【0053】

本開示のいくつかの実施形態において、幹細胞を調節するための、単離されたノカルディア・ルブラの細胞壁を提供する。前記調節とは、幹細胞の増殖の促進、幹細胞の成長の促進、幹細胞の分化の促進、幹細胞の遊走の促進から選択される１つ又はそれらの組み合わせを指し、前記幹細胞は、成体幹細胞、ｉＰＳＣ、間葉系幹細胞から選択される。いくつかの実施形態において、前記間葉系幹細胞は、骨髄間葉系幹細胞、脂肪間葉系幹細胞、滑膜間葉系幹細胞、臍帯間葉系幹細胞、臍帯血間葉系幹細胞、胎盤間葉系幹細胞、羊膜間葉系幹細胞、肝臓間葉系幹細胞、筋肉間葉系幹細胞、肺間葉系幹細胞、膵臓間葉系幹細胞、歯髄間葉系幹細胞から選択される。

【0054】

本開示のいくつかの実施形態において、幹細胞を調節するための、ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物を提供する。

【0055】

本開示のいくつかの実施形態において、幹細胞を調節するための医薬組成物又は医療装置を提供する。

【0056】

本開示のいくつかの実施形態において、本開示に係るノカルディア・ルブラの細胞壁の、幹細胞の調節における用途を提供する。

【0057】

本開示におけるノカルディア・ルブラの細胞壁の、幹細胞を調節するための医薬／医療装置の製造における用途をさらに提供する。

【0058】

本開示のいくつかの実施形態において、本開示に係るノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物の、幹細胞の調節における用途を提供し、本開示におけるノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物の、幹細胞を調節するための医薬／医療装置の製造における用途をさらに提供する。

【0059】

本開示のいくつかの実施形態において、本開示に係る医薬組成物の、幹細胞の調節における用途を提供し、本開示における医薬組成物の、幹細胞を調節するための医薬／医療装置の製造における用途をさらに提供する。

【0060】

本開示のいくつかの実施形態において、
－本開示に係るノカルディア・ルブラ、
－本開示に係る単離されたノカルディア・ルブラの細胞壁、
－本開示に係るノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物、
－本開示に係る医薬組成物、から選択されるいずれか１つの、医薬（又は医療装置）の製造における用途を提供する。

【0061】

いくつかの具体的な実施形態において、前記医薬は、幹細胞を調節する。

【0062】

いくつかの具体的な実施形態において、前記医療装置（例えば、ドレッシング材、貼付剤、包帯、フィルム、貼付剤など）は、幹細胞を調節する。

【0063】

本開示のいくつかの実施形態において、被験対象を、
－本開示に係る単離されたノカルディア・ルブラの細胞壁、
－本開示に係るノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物、
－本開示に係る医薬組成物、
－本開示に係る医療装置から選択される治療有効量（又は予防有効量）のいずれか１つに接触させること、を含む、幹細胞を調節する方法をさらに提供する。

【0064】

いくつかの具体的な実施形態において、幹細胞の数／ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物の比率は、１～１０００個の幹細胞／１ｎｇのノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物であり、好ましくは、５～５０個の幹細胞／１ｎｇのノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物である。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００個の幹細胞／１ｎｇのノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物、及びそれらの間の任意の範囲であるが、これらに限定されない。

【0065】

いくつかの具体的な実施形態において、病巣の面積及び深さの違いに応じて、医薬（又は医療装置）を病巣に投与する。例えば、
－ノカルディア・ルブラの細胞壁骨格を含む医薬を塗るか、又は、
－ノカルディア・ルブラの細胞壁骨格を浸漬した貼付剤（フィルム又はガーゼ）を病巣に被覆するか、又は
－ノカルディア・ルブラの細胞壁骨格を含む凍結乾燥粉末を病巣に直接的に投与するか、又は
－ノカルディア・ルブラの細胞壁骨格を含む膏体／クリームを病巣に投与するが、これらに限定されない。

【0066】

いくつかの具体的な実施形態において、接触させるサイクルは、２日間～２ヶ月間又はそれ以上である。具体的には、例えば、２、４、６、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０日間であり、また例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間又はそれ以上であってもよい。具体的な実施形態において、被験対象に３～４週間にわたって活性成分を投与する。

【0067】

いくつかの実施形態において、１日に１～３回、２日に１～６回、３日に１～９回、１週間に１～１４回、１ヶ月に１～６０回の頻度で投与する。いくつかの実施形態において、１日に２回、又は１日に１回、又は２日に１回投与する。

【0068】

１回あたりの投与量は、被験対象の具体的な状況に応じて異なる投与量を採用し、一般的に１μｇ～１０００μｇ／単位投与量／１回で投与し、具体的には、例えば、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００μｇ／単位投与量／１回及び前述の任意の２つの数値の間の範囲で投与する。

【0069】

いくつかの具体的な実施形態において、接触は、例えば、内服、粘膜投与、経皮投与、腹腔内投与、穿刺、点鼻、点眼、坐剤、舌下投与の方式で実現されるが、これらに限定されない。

【0070】

いくつかの具体的な実施形態において、被験対象は、ヒト以外の動物であり、例えば、農場の動物、愛玩動物、使役動物、観賞動物、産業動物である。

【0071】

具体的な実施形態において、被験対象は、ヒトである。

【0072】

いくつかの具体的な実施形態において、被験対象は、目標疾患又はその症状を有すると疑われるか、有すると診断されるか、すでに有しているか、又は罹患しやすい対象である。

【0073】

いくつかの実施形態において、
－本開示に係るノカルディア・ルブラ、
－本開示に係る単離されたノカルディア・ルブラの細胞壁、
－本開示に係るノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物、
－本開示に係る医薬組成物、から選択される１つ又はそれらの組み合わせを含む細胞培養媒体を提供する。

【0074】

いくつかの具体的な実施形態において、幹細胞（特に間葉系幹細胞）を培養することに適用される本分野の公知の他の成分をさらに含む細胞培養媒体を提供する。ヒトに応用される場合、より安全な細胞を提供するために、培養過程において異種動物成分を含まないもの、例えば、無血清培養媒体が推奨される。

【0075】

いくつかの具体的な実施形態において、当業者は、必要（例えば、乾燥性の維持又は分化の促進）に応じて、細胞培養媒体にサイトカイン、例えば、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ－β、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ、インスリン、インスリン様成長因子のうちの１種又はそれらの組み合わせを添加することができる。

【0076】

いくつかの具体的な実施形態において、ＦＧＦの含有量（最終濃度で計算する）は、好ましくは０．１～１００ｎｇ／ｍｌである。ＦＧＦとは、線維芽細胞成長因子ファミリーに属する成長因子を指し、好ましくはＦＧＦ－１、ＦＧＦ－２（ｂＦＧＦ）である。

【0077】

いくつかの具体的な実施形態において、ＰＤＧＦの含有量（最終濃度で計算する）は、好ましくは０．５～１００ｎｇ／ｍｌである。ＰＤＧＦとは、血小板由来成長因子ファミリーに属する成長因子を指し、好ましくはＰＤＧＦ－ＢＢ又はＰＤＧＦ－ＡＢである。

【0078】

いくつかの具体的な実施形態において、ＴＧＦ－βの含有量（最終濃度で計算する）は、好ましくは０．５～１００ｎｇ／ｍｌである。ＴＧＦ－βとは、形質転換成長因子－βファミリーに属する成長因子を指し、好ましくはＴＧＦ－β３である。

【0079】

いくつかの具体的な実施形態において、ＨＧＦの含有量（最終濃度で計算する）は、好ましくは０．１～５０ｎｇ／ｍｌである。

【0080】

いくつかの具体的な実施形態において、ＥＧＦの含有量（最終濃度で計算する）は、好ましくは０．５～２００ｎｇ／ｍｌである。

【0081】

いくつかの具体的な実施形態において、少なくとも１種のリン脂質及び／又は少なくとも１種の脂肪酸をさらに含む細胞培養媒体を提供する。

【0082】

リン脂質としては、例えば、ホスファチジン酸、リゾホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルグリセロールが挙げられる。リン脂質の総含有量（最終濃度で計算する）は、好ましくは０．１～３０μｇ／ｍｌである。

【0083】

脂肪酸としては、例えば、リノール酸、オレイン酸、リノレン酸、アラキドン酸、テトラデカン酸、パルミトレイン酸、パルミチン酸及びステアリン酸などが挙げられる。脂肪酸の総含有量は、好ましくは培地の１／１０００～１／１０である。

【0084】

いくつかの具体的な実施形態において、コレステロールをさらに含む細胞培養媒体を提供する。

【0085】

いくつかの具体的な実施形態において、アスコルビン酸をさらに含む細胞培養媒体を提供する。

【0086】

いくつかの具体的な実施形態において、酸化防止剤をさらに含む細胞培養媒体を提供する。酸化防止剤としては、例えば、ＤＬ－α－トコフェロール酢酸エステル（ビタミンＥ）が挙げられる。

【0087】

いくつかの具体的な実施形態において、トランスフェリンをさらに含む細胞培養媒体を提供する。

【0088】

いくつかの具体的な実施形態において、セレン酸塩をさらに含む細胞培養媒体を提供する。

【0089】

いくつかの具体的な実施形態において、細胞を維持するために必要なアミノ酸、ヌクレオチド及び微量元素をさらに含む細胞培養媒体を提供する。

【0090】

具体的な実施例において、既知の市販されている間葉系幹細胞培養媒体に本願の組成物を添加し、市販されている間葉系幹細胞培養媒体は、例えば、ＭｅｓｅｎＰＲＯ ＲＳ^ＴＭ、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ＭＳＣ ＳＦＭ、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ＭＳＣ ＳＦＭ ＸｅｎｏＦｅｅ、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ヒト脂肪由来幹細胞培地から選択される。

【0091】

本開示の文脈において、医薬又は医療装置における唯一の治療性（又は予防性）活性成分はノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物であり、特にノカルディア・ルブラの組成成分（例えば、タンパク質、核酸、脂質、細胞壁及びその組成成分、炭水化物、代謝物）を含む製品であり、具体的にはノカルディア・ルブラの細胞壁（より好ましくはノカルディア・ルブラの細胞壁骨格又はその組成成分）を含む製品である。

【0092】

いくつかの実施形態において、被験対象の創面を治療有効量の間葉系幹細胞及びノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物に接触させるステップを含む、創面癒合を促進する方法を提供する。いくつかの実施形態において、間葉系幹細胞の数／ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物の比率は、１～１００個の幹細胞／１ｎｇのノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物であり、好ましくは、５～５０個の幹細胞／１ｎｇのノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物である。いくつかの具体的な実施形態において、前記創面は、糖尿病に関連する創面である。

【0093】

いくつかの実施形態において、
－間葉系幹細胞と、
－ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物と、を含む治療組成物を提供する。

【0094】

いくつかの治療組成物の実施形態において、間葉系幹細胞の数／ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物の比率は、１～１００個の幹細胞／１ｎｇのノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物であり、好ましくは、５～５０個の幹細胞／１ｎｇのノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物である。

【0095】

いくつかの治療組成物の実施形態において、間葉系幹細胞は、骨髄間葉系幹細胞、脂肪間葉系幹細胞、滑膜間葉系幹細胞、臍帯間葉系幹細胞、臍帯血間葉系幹細胞、胎盤間葉系幹細胞、羊膜間葉系幹細胞、肝臓間葉系幹細胞、筋肉間葉系幹細胞、肺間葉系幹細胞、膵臓間葉系幹細胞、歯髄間葉系幹細胞から選択される。

【0096】

いくつかの実施形態において、幹細胞を有効量の上記ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物に接触させるステップを含む、幹細胞のアポトーシスを改善する方法を提供する。

【0097】

いくつかの実施形態において、幹細胞を有効量の上記ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物に接触させるステップを含む、幹細胞の生存率を向上させる方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0098】

【図1A】ヒト脂肪組織から消化単離して得られたＡｄ－ＭＳＣは光学顕微鏡で紡錘状を呈する。

【図1B】脂肪生成誘導結果は、明らかな赤色の脂肪滴が存在することを示す。

【図1C】骨形成誘導結果は、明らかな赤色のカルシウム堆積物が存在することを示す。

【図1D】フローサイトメトリーによる検出結果は、ＣＤ１０５（９５．６％）、ＣＤ９０（９６．９％）及びＣＤ４４（７８．６％）が陽性を呈し、ＣＤ３１（４．６８％）、ＣＤ３４（２．１３％）及びＣＤ１０６（９．５８％）が陰性を呈することを示す。

【図2A】１０μｇ／ｍｌの本願の組成物１をＡｄ－ＭＳＣに作用し、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、９６ｈ後にＣＣＫ－８を用いてＡｄ－ＭＳＣを検出し、４５０ｎｍの波長下で酵素結合免疫検出装置を用いて吸光度値（ＯＤ）を測定する。

【図2B】各群の細胞生存率を統計し分析する。

【図2C】１０μｇ／ｍｌ、５０μｌの本願の組成物１をＡｄ－ＭＳＣに作用し、７２ｈ、９６ｈ後にＥＤＵキットを用いてＥｄＵ取り込み分析を行い、蛍光顕微鏡で陽性細胞を観察する。

【図2D】各群の細胞の増殖率を統計し分析し、実験を３回繰り返し、データについてエラーバーグラフで平均値±ＳＤを示す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、ｖｓ．対照）。

【図3A】フローサイトメーターを用いて４８ｈ、７２ｈのブランク対照群、高グルコース群、本願の組成物で処理された群の幹細胞のアポトーシス率を検出する。

【図3B】フローサイトメーターを用いて４８ｈ、７２ｈのブランク対照群、高グルコース群、本願の組成物で処理された群の幹細胞のアポトーシス率を検出する。

【図3C】各群の細胞アポトーシス率を統計し分析する。実験を３回繰り返し、データについてエラーバーグラフで平均値±ＳＤを示す（^＊＊Ｐ＜０．０１、ｖｓ．高グルコース）。

【図3D】各群の細胞アポトーシス率を統計し分析する。実験を３回繰り返し、データについてエラーバーグラフで平均値±ＳＤを示す（^＊＊Ｐ＜０．０１、ｖｓ．高グルコース）。

【図4A】ＴＵＮＥＬ染色法で染色した後の蛍光結果図であり、４８ｈ、７２ｈブランク対照群、高グルコース群、本願の組成物で処理された群の幹細胞のアポトーシス率を検出する。

【図4B】ＴＵＮＥＬ陽性染色百分率を定量分析する。実験を３回繰り返し、データについてエラーバーグラフで平均値±ＳＤを示す（^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｖｓ．高グルコース）。

【図5A】細胞に高グルコースを添加して細胞アポトーシスを誘導し、Ｗｅｓｔｅｒｎブロット実験を行い、ｃ－カスパーゼ－３、Ｂａｘのタンパク質発現レベルを検出する。

【図5B】細胞に高グルコースを添加して細胞アポトーシスを誘導し、Ｗｅｓｔｅｒｎブロット実験を行い、ｃ－カスパーゼ－３、Ｂａｘのタンパク質発現レベルを検出する。

【図5C】タンパク質発現量のグレースケール解析である。実験を３回繰り返し、データについてエラーバーグラフで平均値±ＳＤを示す（^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｖｓ．高グルコース）。

【図5D】タンパク質発現量のグレースケール解析である。実験を３回繰り返し、データについてエラーバーグラフで平均値±ＳＤを示す（^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｖｓ．高グルコース）。

【図6A】細胞を糖尿病マウスの創面に接種した後、０、２、７日目に蛍光色素ＣＭ－Ｄｉｌで標識された細胞に基づいてＡｄ－ＭＳＣの各群における生存率を観察する。

【図6B】ＣＭ－Ｄｉｌで標識された細胞の蛍光束結果を統計し分析する。

【図6C】各群のモデリング直後、７日目、１４日目の創面癒合状況である。ブランク対照群及びＡｄ－ＭＳＣ群と比較して、本願の組成物で処理された群は、創面癒合がよりよい。

【図6D】各群の創面癒合率を測定し計算する（^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊＜０．０１、ｖｓブランク）。

【図7A】ＨＥ染色は糖尿病性創面の再生状況を示し、染色結果はコラーゲンレベルを示す。

【図7B】図中の赤色の小胞様構造のＣＤ３１陽性免疫蛍光染色は、血管再生を提示し、緑色の陽性蛍光はＴＮＦ－αレベルを代表する。

【発明を実施するための形態】

【0099】

「単離」とは、本開示のノカルディア・ルブラを当初の成長環境から脱離させることを指す。

【0100】

当業者にとって、グラム陽性菌とグラム陰性菌の細胞壁の構造が異なることは既知である。具体的には、グラム陽性菌は、細胞壁が厚く（一般的に２０ｎｍ～８０ｎｍである）、約９０％のペプチドグリカン及び約１０％のタイコ酸（アルコール分子とリン酸分子で形成されるポリマーであり、一般的に糖エステル又はアミノ酸エステルの形態で存在する）を含む。ペプチドグリカン層は、緻密で、多い場合は２０層に達する。しかしながら、グラム陰性菌の細胞壁は、グラム陽性菌の細胞壁よりはるかに薄く、構造が複雑で、外膜（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ）とペプチドグリカン層（一般的に２ｎｍ～３ｎｍである）に分けられる。

【0101】

ペプチドグリカン層は、細菌の細胞壁中の特有の成分であり、ヘテロ多糖の誘導体である。各ペプチドグリカンのモノマーは、糖ユニット（例えば、少なくとも２種の糖分子がグリコシド結合で接続されて、ペプチドグリカンの骨組み構造を構成するもの）、ペプチド末端（複数のアミノ酸で接続されて構成された短ペプチド鎖であり、Ｎ－アセチルムラミン酸分子に接続されるもの）、及びペプチドブリッジ（隣接する「ペプチド末端」を架橋して高強度のネットワーク構造を形成するもの）という３つの部分を含む。細菌が異なれば、ペプチドブリッジ、ペプチド末端、架橋方式も異なる。

【0102】

単離されたノカルディア・ルブラの細胞壁
本開示では、「単離されたノカルディア・ルブラの細胞壁」は、完全な細胞壁として理解されてもよく、不完全な細胞壁（例えば、破砕された、又は部分的に分解された細胞壁）として理解されてもよい。本開示の教示の下で、当業者に理解されるように、所望の活性を示す成分はノカルディア・ルブラの細胞壁（例えば、細胞壁自体又はその組成成分）に由来する。したがって、臨床での応用において完全な細胞壁、破砕された細胞壁、細胞壁の不完全な分解生成物、細胞壁の組成成分、細胞壁の抽出物などの様々な形態を用いることができ、これらは、いずれも本開示の範囲に含まれる。

【0103】

細胞壁骨格
細胞壁の主な構造を構成する組成成分であるが、細胞壁における実体的な架橋ネットワークのみを表すとは理解すべきではなく、当業者は、実体的な架橋ネットワークに吸着、結合、保持される他の細胞壁成分が排除されないと理解することができる。

【0104】

ノカルディア・ルブラの同定
既知又は未知の微生物同定技術によれば、当業者は、１株の細菌に分類学的同定を行うことができ、例えば、利用可能な同定技術は、形態学的特徴、生理生化学的特徴、１６Ｓ ｒＲＮＡなどを含む。当業者は、科学技術の発展に伴い、同定技術が様々な手段に関連し、早い段階で主に形態学的同定方式及び生化学的同定方式を用いたが、これらの方法の信頼性が低いことを理解することができる。配列決定技術が出現した後、当業者は、信頼性がより高い方式で菌株を同定することができる。例えば、１６Ｓ ｒＲＮＡのＤＮＡ配列が９７％以上の相同性を有すると同定された場合、２つの菌が同じ種に属すると判定される。ノカルディア・ルブラについては、国際（又は国立）菌種保存センターに寄託された既知の菌株をモデル菌株として、比較する。

【0105】

剤形
本開示の医薬又は医薬組成物又は活性成分又は製品は、軟膏剤、クリーム剤、硬膏剤、ゲル剤、洗浄剤、チンキ剤、リニメント剤、オイル剤、ペースト剤、凍結乾燥粉末、エアロゾル剤、坐剤、貼付剤、懸濁液、内服液、トローチ剤、スキンケア用品（洗顔料、化粧水、美容液、乳液、フェイスクリーム、フェイスマスク）の形態であってもよいが、これらに限定されない。

【0106】

製剤ユニット
本開示の医薬又は医薬組成物又は活性成分又は製品は、単位製剤（ユニット製剤）の形態で製造されてもよい。

【0107】

いくつかの実施形態において、上記医薬（又は製剤、又は治療薬、又は医療装置）中の単位投与量には、
－１μｇ～１０００μｇの上記ノカルディア・ルブラの細胞壁由来の生成物、又は
－１μｇ～１０００μｇの上記ノカルディア・ルブラの細胞壁、又は
－１μｇ～１０００μｇの上記ノカルディア・ルブラの細胞壁骨格が含まれる。

【0108】

単位投与量の具体例は、１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６５、６６、６７、６８、６９、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００ｍｇ±１０％及び上記任意の２つの数値の間の範囲である。

【0109】

「投与」、「与え」、「提供」、「処理」という用語は、動物、ヒト、細胞、組織、器官又は生物サンプルに用いられる場合、医薬又は医療装置が動物、ヒト、細胞、組織、器官又は生物サンプルに接触することを指す。

【0110】

「治療」とは、被験対象に内服又は外用医薬（治療薬、活性成分又は組成物）（例えば、本開示に係るノカルディア・ルブラの細胞壁又はその医薬組成物）又は医療装置を与え、治療される被験対象（又は集団）の１つ以上の疾患症状を、臨床で測定可能な程度まで緩和（軽減、遅延、改善、治癒）することを指し、上記被験対象は、１つ以上の疾患又はその症状をすでに有しているか、有すると疑われるか、又は罹患しやすい対象である。

【0111】

任意の疾患の症状を効果的に緩和する医薬（治療薬、活性成分又は組成物）の量は、治療有効量という。複数種の要因、例えば、被験対象の疾患状態、年齢、体重に応じて変化することができる。理解すべきことは、単一の被験対象の目標疾患又はその症状を緩和する場合、医薬（治療薬、活性成分又は組成物）が無効である可能性があるが、本分野で既知の任意の統計学的検定方法（例えばＳｔｕｄｅｎｔ Ｔ検定、カイ二乗検定、Ｍａｎｎ及びＷｈｉｔｎｅｙに基づくＵ検定）に基づいて、医薬（治療薬、活性成分又は組成物）が統計学的意味で目標疾患又はその症状に対して有効であると確定することである。

【0112】

「必要に応じて」とは、後文に記載の事項が発生する可能性があるが、必ずしも発生する必要がなく、状況に応じて決定する必要があるということを意味する。例えば、「必要に応じて、個包装する」とは、製品を個包装することが許容されるが、必ずしも個包装する必要がなく、個包装するか否かが、技術的効果の達成に影響を与えないということを意味する。

【0113】

「１つ」、「一」、「単一」、「該」は、明確な説明がなければ、複数の形態を含む。

【0114】

以下、実施例、製造例及び試験例を組み合わせて、本開示をさらに説明する。しかしながら、これらの実施例、製造例及び試験例は、本開示の範囲を限定するものではない。具体的な条件が明記されない場合、一般的な条件と、原料供給業者が提案する条件に従って操作する。具体的な供給源が明記されない試薬は、市場で購入した一般的な試薬である。

【0115】

実施例
実施例１、市販されているノカルディア・ルブラの細胞壁骨格
ノカルディア・ルブラの細胞壁骨格（商品名：「納可佳」）は遼寧格瑞仕特生物制薬有限公司から購入され、承認番号が国薬準字Ｓ２００３０００９（２ｍｌ／アンプル、凍結乾燥粉末）であり、６０μｇの活性成分及び１５ｍｇのデキストラン４０を含む。

【0116】

製造例
製造例１．培養方法
市販されているノカルディア・ルブラの細胞壁骨格を用いる以外に、自分で製造してもよい。例えば、１～５のとおりである。

【0117】

１．一般的な微生物生産方法によりノカルディア・ルブラを培養することができる。

【0118】

２．培養方法は、固体培養であってもよく、液体培養であってもよい。

【0119】

３．培地中の栄養源に対して特に規定はなく、微生物培養に一般的に用いられる炭素源、窒素源及び他の栄養源を培地中に含んでもよい。
－炭素源は、ノカルディア・ルブラが利用できる任意の炭素源、例えば、フルクトース、グルコースなどである。
－窒素源は、肉エキス、ペプトン、アンモニウム塩、硝酸塩及び他の有機又は無機窒素含有化合物であってもよい。
－他の栄養源として、いくつかの無機塩類、例えば、ＮａＣｌ、リン酸塩類を適切に添加することができる。

【0120】

４．培養条件（温度、時間など）に対して厳格な限定はなく、当業者は、予備的な小規模のパイロットデータに基づいて、生産量を最も多くする条件を自ら選択することができる。

【0121】

５．一例として、（１）～（２）の培養条件でノカルディア・ルブラを発酵させた。
（１）培地組成は、ペプトン、牛肉エキス、塩化ナトリウム、リン酸塩、グリセロール（及び固体培養の場合、必要に応じて寒天）を含む。
（２）培養の方法パラメータ：
作業用菌種を再生した後、固体培養媒体に移して３～５日間維持し、次に液体に移して培養し（３０～３７℃で、３～５日間維持する）、補助材料半連続バッチ供給モードを用いてもよく、バッチ供給モードを用いてもよい。培養期間にｐＨ、細菌密度、溶存酸素、炭素源の消費をモニタリングした。

【0122】

製造例２．菌体の破砕
製造例１で得られた菌を収集し、細胞を粉砕した（例えば、超音波により破砕するが、それに限定されない）。本分野で任意の適切な公知の方法、例えば、ＣＮ１０１２５０４９０Ａ又はＣＮ１０１３２３８６５Ａにおける方法により菌体を破砕してもよい。

【0123】

顕微鏡下で粉砕の状況をチェックし、視野ごとの形状を保った菌の数が５個を超えてはならず、複数（１０～３０個）の視野をチェックしていずれもこの基準を満たしていれば、合格とする。

【0124】

製造例３．核酸除去、脂質除去、複合タンパク質除去、細胞膜除去
１．核酸除去：
破砕後の上澄液を遠心分離し、得られた沈殿物にＤＮＡ分解酵素及びＲＮＡ分解酵素を添加し、酵素の供給業者が提案する操作に従って核酸を除去した。

【0125】

２．タンパク質除去：
沈殿物に一般的なプロテアーゼ（例えば、トリプシン）を添加し、酵素の供給業者が提案する操作に従ってタンパク質を除去した。

【0126】

３．脂質除去：
沈殿物に有機試薬（例えば、アセトン、エーテル、エタノールのうちの１つ又はそれらの組み合わせであるが、それらに限定されない）を添加し、本分野の一般的な操作に従って脂質を除去した。

【0127】

４．細胞膜除去：
沈殿物にＴｒｉｔｏｎＸ－１００を添加し、本分野の一般的な操作に従って、遠心分離して沈殿物を収集し、ＰＢＳで洗浄した。

【0128】

理解すべきことは、不純物を除去する上記ステップの間で、当業者は、ステップの間に互換性を持たせるように、順序を調整することができることである。

【0129】

細胞壁以外の成分を除去した後に、沈殿物を注射用水に再溶解し、使用に備えた。必要に応じて、１１５℃で２０～３０分間滅菌し、細胞壁骨格の原液（主に細胞壁骨格及びその組成成分を含む）とすることができる。

【0130】

製造例４．医薬組成物の製造方法
１．液体組成物
製造例３で得られた生成物に賦形剤（例えば、デキストラン４０、マンニトール又はトレハロース）を添加した。容器に充填した後、医薬組成物を得た。

【0131】

表１．医薬組成物を複数種の形態に調製してもよい

【表1】

【0132】

２．凍結乾燥粉末組成物
第１項の医薬組成物を凍結乾燥させることで、凍結乾燥粉末（番号がそれぞれ凍結乾燥粉末組成物１～７である）を得た。

【0133】

３．品質検定（凍結乾燥粉末組成物１を例とする）

【0134】

表２．品質検定項目

【表2】

【0135】

材料及び方法
１．ヒトＡｄ－ＭＳＣの単離培養及び継代
被験対象の脂肪吸引物（年齢範囲３０～４５歳）から脂肪組織サンプルを取得し、かつＡｄ－ＭＳＣを単離培養した。被験対象は、徐州医科大学付属病院の整形外科手術を受けた患者であり、倫理委員会により承認され、患者のインフォームドコンセントを得た。

【0136】

得られた新鮮な脂肪組織抽出液を０．２５％のパンクレアチン－ＥＤＴＡで消化し、濾過し、遠心分離して細胞沈殿層を保留し、１０％のＦＢＳウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地に添加し、細胞培養シャーレを３７℃で、５％ＣＯ_２を含むインキュベーターに入れて培養した。その後に、細胞が８０％に成長して継代するまで、２～３日ごとにＰＢＳで洗浄した後に抽出液を交換した。

【0137】

２．細胞活性の測定
対数成長期のＡｄ－ＭＳＣを４×１０^３／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、ＤＭＥＭ＋１０％のウシ胎児血清＋１％のペニシリン／ストレプトマイシンで共培養し、本願の組成物（組成物１又は実施例１の市販されている組成物）をＰＢＳ液で溶解し、１０μｇ／ｍｌに希釈した。Ａｄ－ＭＳＣが接着した後、組成物１を添加し、対照、２５μｌ、５０μｌ、７５μｌの４つの実験群に分けた。それぞれ２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、９６ｈ後に各ウェルに１０μＬのＣＣＫ－８試薬を添加し、続いて２ｈインキュベートした後に４５０ｎｍの波長下で、酵素結合免疫検出装置を用いて各ウェルの吸光度を測定した。培養時間を横軸とし、細胞数（吸光度）を縦軸として、細胞成長曲線を描画した。

【0138】

３．ＥｄＵ取り込み実験
Ｃｅｌｌ－Ｌｉｇｈｔ ＥｄＵ ５６７インビトロイメージングキット（ＲｉｂｏＢｉｏ）を用いてＥｄＵ取り込み分析を行った。対数成長期のＡｄ－ＭＳＣを４×１０^３／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、１０μｇ／ｍｌ、５０μｌの本願の組成物をＡｄ－ＭＳＣに作用し、７２ｈ、９６ｈ後に各ウェルに１００μｌのＥＤＵ培地を添加し、２時間インキュベートし、ＰＢＳで１～２回洗浄した。各ウェルに４％のパラホルムアルデヒド固定液を添加し、室温で３０ｍｉｎインキュベートした。次に２ｍｇ／ｍｌのグリシン溶液を添加し、５分間振とうした。ＰＢＳで洗浄した後、浸透剤を添加し、１０ｍｉｎ振とうし、ＰＢＳで洗浄した。Ａｐｏｌｌｏ染色反応液を添加し、暗所で室温で３０分間インキュベートした。染色反応溶液を除去し、浸透剤（０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００のＰＢＳ）を添加し、２～３回振とうし、毎回１０分間であり、浸透剤を除去した。ＰＢＳで再び洗浄し、Ｈｏｅｃｈｅｓｔ ３３３４２反応液を添加し、暗所で室温で３０分間インキュベートし、反応液を除去した。ＰＢＳで１～３回洗浄した後、蛍光顕微鏡で陽性細胞を観察した。

【0139】

４．細胞アポトーシス検出
４．１ フローサイトメトリー：
Ａｄ－ＭＳＣが８０％に成長し融合した場合、１×１０^４／ウェルの密度で６ウェルプレートに接種した。実験を４群に分け、細胞が接着した後、各実験群に１００μｌの５０％ショ糖を添加してＡｄ－ＭＳＣの細胞アポトーシスを誘導し、そのうちの２つの実験群にそれぞれ１００μｌ、２５０μｌの１０μｇ／ｍｌの本願の組成物を添加し、４８ｈ、７２ｈ後に各群の細胞の上澄液をフローサイトメトリーチューブに収集し、接着細胞をＥＤＴＡを含まないパンクレアチンで消化して同じ群のフローサイトメトリーチューブに収集し、２０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、振動して均一に混合し、各チューブに５００μｌの結合緩衝液（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣ細胞アポトーシス検出キット、上海碧雲天生物技術有限公司）、５μｌのＦＩＴＣ、５μｌのＰＩを順に添加し、振動して均一にし、暗所で４℃で５～１５ｍｉｎインキュベートし、フローサイトメーターで検出し（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、結果を分析した。

【0140】

４．２ ＴＵＮＥＬ法：
数枚の１８ｍｍ×１８ｍｍのカバーガラスを７５％エタノールで浸漬して消毒し、使用時にカバーガラスを６ウェルプレート内に置き、エタノール残留液が完全に除去されるまでＰＢＳ緩衝液で数回繰り返して洗浄し、Ａｄ－ＭＳＣを６ウェルプレートに培養し、各ウェルの細胞密度が１×１０^４個であり、フローサイトメトリーと同様に実験の群分けを行い、細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで室温で３０ｍｉｎ固定し、細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、０．１％ＴｒｉｔｉｏｎＸ－１００で２℃～８℃の条件下で１０ｍｉｎインキュベートし、細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、５００μｌのＴＵＮＥＬ反応液（ＴＵＮＥＬアポトーシスキット、ロシュ社）を調製し、５０μｌの酵素溶液及び４５０μｌの標識溶液を試薬Ａとして混合し、陰性対照群に５０μｌの試薬Ａを添加し、３７℃のインキュベーターに置いて暗所で６０ｍｉｎインキュベートし、陽性対照群にＤＮＡ分解酵素Ｉを添加し、室温で１０ｍｉｎインキュベートし、細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、ＴＵＮＥＬ反応混合液を５０μｌ／ウェルで添加し、インキュベーターにおいて暗所で３７℃で６０ｍｉｎインキュベートし、細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、ＤＡＰＩ染色液を５０μｌ／ウェルで添加し、室温で３ｍｉｎインキュベートし、サンプルを蛍光顕微鏡下に置いて撮影して分析し、検出用光波長の範囲を５７０～６２０ｎｍ（最大波長５８０ｎｍ）にした。

【0141】

５．Ｗｅｓｔｅｒｎブロット分析
処理済みの細胞を取り出し、３００μｌの細胞溶解混合液（氷上に溶解するＰＩＰＡ細胞溶解液であり、１００：１の比率でＰＭＳＦを添加する）を添加し、次に氷上に置いて十分に溶解した後、接着細胞を掻き取り、Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ－５８１０Ｒ凍結高速遠心機を用いて４℃の条件下で、１２０００ｒｐｍで２０ｍｉｎ遠心分離し、上澄液を収集した。

【0142】

ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルで細胞抽出物を単離し、次にタンパク質をニトロセルロースフィルムに移し、かつウサギ抗ヒトカスパーゼ－３モノクローナル抗体（１：４００、米国ＣＳＴ社）、ウサギ抗ヒトＢａｘモノクローナル抗体（１：４００、米国ＣＳＴ社）と共にインキュベートし、一次抗体インキュベートが終了した後、５ｍｉｎ×３回洗浄し、次に希釈された二次抗体（１：１００００）を添加し、暗所で室温で２ｈインキュベートし、二次抗体を除去して、５ｍｉｎ×３回洗浄し、それぞれＥＣＬ発光液のＡ液とＢ液を等量で吸引して均一に混合して、ＥＣＬ作業液として調製した。フィルムにＥＣＬ作業液を均一に滴下し、ＴＡＮＯＮゲルイメージング装置に入れて露光現像を行い、撮影し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアで分析した。

【0143】

６．糖尿病性創面を有する動物モデルの確立
実験動物は、４週齢のＢＡＬＢ／ｃ無胸腺ヌードマウスであり、ＳＰＦレベルである。全ての動物研究は、いずれも動物保護及び使用委員会により承認された。実験マウスは、ＳＰＦレベルの動物飼育室で飼育する。モデル作成前に、マウスを１２ｈ絶食させ、体重を称量し、かつ記録し、２％のＳＴＺ（Ｓｉｇｍａ）を１５０ｍｇ／ｋｇの投与量で腹腔内注射して、糖尿病マウスを誘導した。

【0144】

注射した後の７日目に血糖を測定し、尾静脈から採血し、血糖計でマウスの血糖濃度を測定し、かつ記録した。７日目からマウスの血糖濃度が１６．７ｍｍｏｌ／Ｌより大きく、かつ「多飲、多食、多尿、体重減少」という糖尿病の典型的な症状が現れ、モデル作成が成功したと見なされた。

【0145】

実験動物を、
－ブランク対照群と、
－Ａｄ－ＭＳＣ群と、
－本願の組成物＋Ａｄ－ＭＳＣ群と、の３群（各群に５匹ある）に分けた。

【0146】

糖尿病マウスのモデルの確立が成功した後、マウスを麻酔し、直径が１．５ｃｍの創面を作り、前処理されたＡｄ－ＭＳＣを複数の部位で皮内注射方式で各群のマウスの皮膚に注入し、各創面に６つの部位を選択し、各部位に０．１ｍｌの細胞を注射した。表面を無菌ガーゼで覆い、飼育し続けて観察し、ＬＢ９８３生体イメージングシステムを用いて、創面細胞の生存状況及びマウス皮膚の癒合状況を観察した。

【0147】

７．ＣＭ－Ｄｉｌ活細胞染色剤による染色
注射前にＣＭ－ＤｉｌでＡｄ－ＭＳＣを標識した。供給業者が提案する方法に従って、ＣＭ－Ｄｉｌ活細胞染色剤を添加し、３０分間インキュベートし、遠心分離した後に上澄液を除去して、ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、最後に適量のＰＢＳを添加し、均一に混合し、標識されたＡｄ－ＭＳＣをアイスボックスに置いて使用に備えた。

【0148】

８．ＨＥ染色
術後１４日目に、頚椎脱臼法により各群のマウスを犠牲にし、皮膚創面の外側から３ｍｍの直径で全層の皮膚を切り取り、筋肉層に深く達し、標本をホルムアルデヒド固定液に貯蔵した。４８ｈ後、脱水－透明にすること－パラフィン浸漬－包埋－切片のステップ処理を行った。切片を脱パラフィンした後、ヘマトキシリンで１０ｍｉｎ染色し、流水で洗浄し、１％の塩酸で数秒分化した後に洗浄し、０．２％のアンモニア水で青色化した後に洗浄し、その後にエオシンで５ｍｉｎ染色し、洗浄した後にさらにエタノールで脱水し、最後にキシレンで透明にし、中性ガムで封止した。顕微鏡で各群の創面の新生組織の厚さ、コラーゲン結合組織の配列及び炎症細胞の浸潤状況を観察し、かつ撮影して分析した。

【0149】

９．Ｍａｓｓｏｎ染色
パラフィン切片を水に脱パラフィンした。蒸留水で洗浄し、ヘマトキシリン染色液で核を１０ｍｉｎ染色し、蒸留水で十分に洗浄し、次に塩酸及びアルコールで分化し、Ｍａｓｓｏｎポンソー酸性赤化液を５～１０ｍｉｎ使用し、２％氷酢酸水溶液で洗浄し、さらに１％リンモリブデン酸水溶液で３～５ｍｉｎ分化し、次にアニリンブルー又はライトグリーン溶液を直接的に使用し５ｍｉｎ染色し、０．２％氷酢酸水溶液で洗浄し、最後に、９５％アルコール、無水アルコールで脱水し、十分に透明であるまでキシレンに浸漬し、中性ガムで封止して乾燥した後に顕微鏡で観察した。

【0150】

１０．組織免疫蛍光染色
組織のパラフィン切片に対して脱パラフィンを行い、３％Ｈ_２Ｏ_２で室温で５～１０ｍｉｎインキュベートして、内因性ペルオキシダーゼの活性を除去した。切片を蒸留水で洗浄し、ＰＢＳで５ｍｉｎ／回で２回浸漬し、１０％の正常なヤギ血清（ＰＢＳで希釈される）で室温で１０ｍｉｎ密封し、密封液を除去し、洗浄しなかった。ＣＤ３１一次抗体（希釈比率１：３００）作業液を滴下し、一晩越した。切片をＰＢＳで５ｍｉｎ／回で３回洗浄した。ビオチンで標識された蛍光二次抗体作業液（希釈比率１：４００）（暗所）を適量滴下し、暗所で３７で１ｈインキュベートした後、ＰＢＳで５ｍｉｎ／回で３回洗浄し、ＤＡＰＩ染色液を適量滴下し、暗所で室温で３ｍｉｎインキュベートし、ＰＢＳで５ｍｉｎ／回で３回洗浄した。最後に各切片に蛍光消光防止封入液を滴下し、カバーガラスをカバーした後、固定し、暗所で保存した。

【0151】

１１．統計分析
ＳＰＳＳソフトウェア（ＳＰＳＳ１６．０）を用いて統計分析を行い、実験結果を平均値±ＳＤで示し、２群の間の比較は、独立サンプルｔ検定を用い、複数群の平均値の比較は、一元配置分散分析（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を用いた。α＝０．０５を有意水準とし、Ｐ＜０．０５を、統計的有意差があったと見なす。

【0152】

試験例１．ヒトＡｄ－ＭＳＣの形態学、表面標識及び分化誘導能力の同定
コラゲナーゼ消化法を用いて、脂肪組織抽出液から抽出して得られた初代Ａｄ－ＭＳＣを細胞シャーレに接種し、細胞が８０％に成長し融合して継代し、継代後の細胞は、増殖速度が明らかに速くなり、細胞形態が均一で一致し、紡錘状を呈した（図１Ａ）。Ｐ３世代のよく成長したＡｄ－ＭＳＣをそれぞれ脂肪生成誘導分化及び骨形成誘導分化に用いた。２週間後、オイルレッドで染色し、顕微鏡で観察し、細胞内にサイズが明らかに一致しない赤色の脂肪滴が存在することを示し（図１Ｂ）、アリザリンレッドＳ染色液で染色すると、明らかな赤色のカルシウム結節堆積物を見ることができた（図１Ｃ）。これは、単離して抽出された細胞が幹細胞分化能の特性を有することを示した。

【0153】

フローサイトメーターを用いて６種類の異なる細胞表面標識物を検出した。結果は、ＣＤ１０５（９５．６％）、ＣＤ９０（９６．９％）及びＣＤ４４（７８．６％）が陽性を呈し、ＣＤ３１（４．６８％）、ＣＤ３４（２．１３％）及びＣＤ１０６（９．５８％）が陰性を呈することを示した（図１Ｄ）。Ａｄ－ＭＳＣ免疫表現型の特徴に合致した。

【0154】

試験例２．本願の組成物のＡｄ－ＭＳＣ活性及び増殖に対する影響
本願の組成物のＡｄ－ＭＳＣ活性に対する影響を検出するために、それぞれ本願の組成物１がＡｄ－ＭＳＣに作用した後の２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、９６ｈに、ＣＣＫ－８試薬を用いて幹細胞を検出し、４５０ｎｍの波長下で、酵素結合免疫検出装置を用いて吸光度値を測定した。結果は、濃度が１０μｇ／ｍｌで、体積が５０μｌである本願の組成物が幹細胞に作用する場合、７２ｈ及び９６ｈにＡｄ－ＭＳＣの生存率が顕著に増強されることを示した（図２Ａ、図２Ｂ）。

【0155】

本願の組成物のＡｄ－ＭＳＣの増殖に対する影響を検証するために、１０μｇ／ｍｌ、５０μｌの本願の組成物を幹細胞に作用させた。それぞれ７２ｈ、９６ｈ後にＥＤＵキットを用いてＥｄＵ取り込み分析を行い、蛍光顕微鏡で陽性細胞を観察し、結果は、本願の組成物がＡｄ－ＭＳＣの増殖率を向上させることができることを示した（図２Ｃ、図２Ｄ）。

【0156】

試験例３．本願の組成物の、高グルコースで誘導されるＡｄ－ＭＳＣ細胞のアポトーシスに対する抑制
Ａｄ－ＭＳＣ細胞に高グルコースを添加して細胞アポトーシスを誘導し、異なる濃度の本願の組成物１でそれぞれ４８ｈ、７２ｈ処理した後に、ＦＩＴＣ－ＰＩフローサイトメトリーアポトーシス検出キットを用いて細胞アポトーシス状況を検出した。

【0157】

結果は、本願の組成物が高グルコースで誘導される幹細胞のアポトーシスを抑制することができることを示した（図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ）。結果を検証するために、ＴＵＮＥＬ法を選択して細胞アポトーシスを検出し、ＴＵＮＥＬ蛍光図を定量分析し、フローサイトメトリー法の結果と一致した（図４Ａ、図４Ｂ）。

【0158】

試験例４．アポトーシス標識物のタンパク質発現レベルの検出
細胞に高グルコースを添加して細胞アポトーシスを誘導し、異なる濃度の本願の組成物でそれぞれ４８ｈ、７２ｈ処理し、細胞タンパク質を抽出し、Ｗｅｓｔｅｒｎブロット実験を行うことにより、ｃ－カスパーゼ－３、Ｂａｘ（２種の主なアポトーシス標識物）のタンパク質発現レベルを検出し、β－ａｃｔｉｎを内部標準とした。結果は、本願の組成物で処理された後のｃ－カスパーゼ－３、Ｂａｘのタンパク質発現レベルが低下することを示した（図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ）。

【0159】

試験例５．本願の組成物による、ヌードマウス体内のＡｄ－ＭＳＣの生存率の向上、創面癒合の加速
Ａｄ－ＭＳＣが糖尿病性創面を修復し癒合することに対する本願の組成物の影響をさらに研究するために、糖尿病ヌードマウスの体にヒト皮膚の創面修復メカニズムを模擬する創面モデルを確立した。

【0160】

糖尿病マウスモデルの確立が成功した後、マウスを麻酔し、直径が１．５ｃｍの創面を作り、蛍光色素ＣＭ－Ｄｉｌで標識された前処理された細胞を皮内注射方式で処理群のマウスの創面皮膚に注入し、ＬＢ９８３生体イメージングシステムを用いて、細胞の生存率を検出した。

【0161】

結果は、本願の組成物で処理された処理群のＡｄ－ＭＳＣが、単にＡｄ－ＭＳＣを用いた群よりも高い生存率を有することを示した（図６Ａ、図６Ｂ）。また、糖尿病マウスの傷口をＡｄ－ＭＳＣで１４日間治療する癒合過程を評価した。ブランク群と比較すると、Ａｄ－ＭＳＣで処理されたマウスの創面の癒合状況が良好であり、本願の組成物で処理された処理群の癒合状況がより良好であり、創面の癒合が加速し（図６Ｃ、図６Ｄ）、創面癒合率が向上した（表３）。

【0162】

表３．術後の１４日目の創面癒合状況（平均値±ＳＤ、ｎ＝３）

【表3】

^＊＊Ｐ＜０．０１、ｖｓ．ブランク

【0163】

各群のヌードマウスの１４日間癒合した創面皮膚標本を作成し、直径が約１ｃｍであり、厚さが皮膚全層である。各群の標本に対してＨＥ及びＭａｓｓｏｎ染色を行った（図７Ａ）。結果は、Ａｄ－ＭＳＣ群、Ａｄ－ＭＳＣ＋本願の組成物で処理された群がいずれも糖尿病性創面の再生を促進することができるが、本願の組成物で処理された群においてコラーゲン繊維の成長がより整然とし、縞がより明確であることを示した。組織免疫蛍光ＣＤ３１及びＴＮＦ－α（図７Ｂ）で、皮膚マイクロ血管再生及び炎症因子の状況を検出した。結果は、Ａｄ－ＭＳＣ群より、本願の組成物で処理された群が糖尿病性創面の皮膚再生及び血行再生をよりよく促進することができることを示した。

【0164】

討論：
糖尿病性創面の癒合しにくい原因は多くある。例えば、正常な創面の癒合過程に必要な細胞及び分子信号が欠失する。また、末梢神経障害、末梢循環損傷、プロテアーゼバランスの乱れは、いずれも糖尿病性創面が癒合しにくい要因である［非特許文献１１］。更に、高グルコース環境下で血管の微環境が異常であれば、細胞の成長環境の異常を引き起こし、最終的に創傷の局所的な血管の再生を妨害する可能性がある［非特許文献１２］。また、糖尿病の高グルコース状態で創傷組織中の線維芽細胞の数の減少、糖化タンパク質の増加、異常成長因子の発現、炎症過程の遅延及び終末糖化産物の堆積は、いずれも骨髄由来細胞の遊走及び機能に影響を与える［非特許文献１３］。研究によると、Ｎｒ－ＣＷＳは、インビボＴ細胞、マクロファージ及びナチュラルキラー細胞の活性を増強し、サイトカインの生成を促進することができる。ＩＬ．１、ＩＬ．２、ＩＬ．６、ＴＮＦ、ＩＦＮの様々なサイトカインのレベルを向上させることにより、マクロファージ、キラーＴ細胞、ＬＡＫ細胞、ＮＫ細胞に対する殺傷活性を促進することができる［非特許文献１４］。

【0165】

Ａｄ－ＭＳＣは、脂肪組織から抽出された多系列分化能を有する幹細胞である［非特許文献１５～１７］。Ａｄ－ＭＳＣは、分化能により損傷部位に遊走し、分化された細胞で損傷皮膚を再修復し、様々な成長因子を分泌し［非特許文献１８］、創面血管の生成を加速し、創面の癒合を促進することができる［非特許文献１９］。また、研究者は、Ａｄ－ＭＳＣが線維芽細胞に分化することができ、形態類似性を表現するだけでなく、線維芽細胞表面タンパク質（ビメンチン及びフィブロネクチンを含む）を発現できる能力を有することを発見した［非特許文献２０］。また、Ａｄ－ＭＳＣは、線維芽細胞及びケラチノサイトに直接的に変換して創面を修復することができる［非特許文献２１］。しかしながら、前の研究によると、多くのＡｄ－ＭＳＣが糖尿病マウスの創面に注射された後にアポトーシスが発生し、創面癒合の遅延をもたらすことを発見した。高グルコース環境下で培養されたＡｄ－ＭＳＣ細胞は、アポトーシスが発生し、かつ時間依存性を有する［非特許文献２２、２３］。

【0166】

本試験例において、ＣＣＫ－８、ＥｄＵにより、本願の組成物のＡｄ－ＭＳＣのインビトロ活性、増殖能力に対する影響を検出した。結果は、本願の組成物がＡｄ－ＭＳＣの活性及び増殖能力を向上させることができることを示した。フローサイトメトリー及びＴＵＮＥＬ法で細胞のアポトーシス状況を検出し、本願の組成物が高グルコースで誘導されたＡｄ－ＭＳＣのアポトーシスを抑制し、かつ時間依存性及び濃度依存性を有することを発見した。

【0167】

動物体内で本願の組成物のＡｄ－ＭＳＣの生存率に対する影響を検出し、結果は、本願の組成物で処理された後のＡｄ－ＭＳＣを用いると、単にＡｄ－ＭＳＣを応用する場合より生存率が高く、創面の癒合速度がより速いことを示した。組織免疫蛍光染色の結果に基づいて、血管に生成された内皮細胞接着因子ＣＤ３１が増加し、炎症レベルを反応するＴＮＦ－αが減少したことを証明した。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7A】

【図7B】

【国際調査報告】