特表 2023-512469 癌療法におけるＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変Ｔ細胞及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-27

(54)【発明の名称】癌療法におけるＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変Ｔ細胞及びその使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/17 20150101AFI20230317BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20230317BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230317BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230317BHJP

   A61K 31/675 20060101ALI20230317BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20230317BHJP

   A61K 47/20 20060101ALI20230317BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20230317BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230317BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20230317BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230317BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20230317BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20230317BHJP

【ＦＩ】

A61K35/17 Z

A61K45/00

A61P43/00 121

A61P35/00

A61K31/675

A61K9/10

A61K47/20

C12N15/13 ZNA

C12N15/12

C12N15/62 Z

C12N5/10

C12N5/0783

C12N15/09 110

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022543108

(86)(22)【出願日】2021-01-15

(85)【翻訳文提出日】2022-09-06

(86)【国際出願番号】 IB2021050305

(87)【国際公開番号】W WO2021144759

(87)【国際公開日】2021-07-22

(31)【優先権主張番号】62/962,315

(32)【優先日】2020-01-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/013,587

(32)【優先日】2020-04-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/129,973

(32)【優先日】2020-12-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518370079

【氏名又は名称】クリスパー セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100134784

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 和美

(72)【発明者】

【氏名】ジョナサン アレクサンダー テレット

(72)【発明者】

【氏名】エベリナ モラワ

(72)【発明者】

【氏名】ジェイソン サガート

(72)【発明者】

【氏名】アニー ヤン ウィーバー

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AA94Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C076AA22

4C076BB13

4C076CC27

4C076DD55

4C076FF67

4C084AA19

4C084MA66

4C084NA05

4C084ZB212

4C084ZB261

4C084ZC751

4C084ZC752

4C086AA01

4C086AA02

4C086DA38

4C086MA03

4C086MA04

4C086MA05

4C086MA66

4C086NA05

4C086ZB26

4C086ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB37

4C087CA04

4C087MA02

4C087MA05

4C087MA23

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZC75

(57)【要約】

多発性骨髄腫、例えば、難治性及び／又は再発性多発性骨髄腫を治療するための、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変Ｔ細胞、及びその使用。遺伝子改変Ｔ細胞は、破壊された内在性ＴＲＡＣ遺伝子及び／又は破壊された内在性β２Ｍ遺伝子を含み得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

多発性骨髄腫（ＭＭ）を治療するための方法であって、
（ｉ）有効量の１つ以上のリンパ球除去化学療法剤を、それを必要とする対象に投与すること、及び
（ｉｉ）工程（ｉ）の後、有効量の遺伝子改変Ｔ細胞の集団を前記対象に投与することを含み、
前記遺伝子改変Ｔ細胞の集団が、ＢＣＭＡに結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、及び破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む核酸を含むＴ細胞を含み、前記ＣＡＲをコードする前記核酸が、前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子に挿入される方法。

【請求項2】

ＢＣＭＡに結合する前記ＣＡＲが、
（ｉ）抗ＢＣＭＡの単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む外部ドメイン、
（ｉｉ）ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、並びに
（ｉｉｉ）４－１ＢＢ及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン由来の共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖが、配列番号４２を含む重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）及び配列番号４３を含む軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖが、配列番号４１を含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

ＢＣＭＡに結合する前記ＣＡＲが、配列番号４０のアミノ酸配列を含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。

【請求項6】

前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードする前記核酸が、配列番号３３のヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号４のスペーサー配列を含むガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集システムによって生成される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号１０を含む欠失を有し、任意選択により前記欠失を置換する配列番号３０のヌクレオチド配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記破壊されたβ２Ｍ遺伝子が、配列番号８のスペーサー配列を含むガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集システムによって生成される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記破壊されたβ２Ｍ遺伝子が、配列番号２１～２６の少なくとも１つを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記遺伝子改変Ｔ細胞の集団において、前記遺伝子改変Ｔ細胞の≧３０％がＣＡＲ^＋であり、前記遺伝子改変Ｔ細胞の≦０．４％がＴＣＲ^＋であり、及び／又は前記遺伝子改変Ｔ細胞の≦３０％がＢ２Ｍ^＋である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記遺伝子改変Ｔ細胞の集団が、１人以上の健康なヒトドナーに由来するものである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記遺伝子改変Ｔ細胞の集団が、凍結保存溶液中に懸濁されている、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記有効量の前記遺伝子改変Ｔ細胞の集団が、約５．０×１０^７～約７．５×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞の範囲であり、任意選択により、約５．０×１０^７～約１．５×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞、約１．５×１０^８～約４．５×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞、約４．５×１０^８～約６．０×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞、又は約６．０×１０^８～約７．５×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞の範囲である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記有効量の前記遺伝子改変Ｔ細胞の集団が、約５．０×１０^７個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞、約１．５×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞、約４．５×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞、約６．０×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞、又は約７．５×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞である、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記遺伝子改変Ｔ細胞の集団が、静脈内注入によって投与される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

工程（ｉ）が、前記対象に１日当たり約３０ｍｇ／ｍ^２のフルダラビン及び約３００ｍｇ／ｍ^２のシクロホスファミドを３日間にわたって静脈内に同時投与することを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

工程（ｉ）が、前記対象に１日当たり約３０ｍｇ／ｍ^２のフルダラビン及び約５００ｍｇ／ｍ^２のシクロホスファミドを３日間にわたって静脈内に同時投与することを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

工程（ｉｉ）が、工程（ｉ）の２～７日後に実施される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

工程（ｉ）の前に、前記ヒト患者は、以下の特徴：
（ａ）臨床状態の著しい悪化、
（ｂ）約９１％超の飽和レベルを維持するために酸素補給を必要とすること、
（ｃ）コントロール不良な心不整脈、
（ｄ）血管収縮薬のサポートを必要とする低血圧、
（ｅ）活動性感染症、及び
（ｆ）免疫エフェクター細胞関連神経毒性症候群（ＩＣＡＮＳ）のリスクを増大させる神経毒性の１つ以上を示さない、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

工程（ｉｉ）の前及び工程（ｉ）の後に、前記ヒト患者は、以下の特徴：
（ａ）活動性のコントロール不良な感染症、
（ｂ）工程（ｉ）の前の臨床状態と比較した前記臨床状態の悪化、及び
（ｃ）免疫エフェクター細胞関連神経毒性症候群（ＩＣＡＮＳ）のリスクを増大させる神経毒性の１つ以上を示さない、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の後の急性毒性の発症について前記ヒト患者を観察することを更に含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

急性毒性が、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、神経毒性、腫瘍崩壊症候群、血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）、血球減少症、ＧｖＨＤ、低血圧、腎不全、ウイルス性脳炎、好中球減少症、血小板減少症、又はこれらの組み合わせを含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記対象が、毒性の発症が観察される場合に毒性管理を受ける、請求項２２又は請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記対象が、任意選択により１８歳以上のヒト患者である、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記対象が、再発性及び／又は難治性ＭＭを有する、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記対象が、少なくとも２種のＭＭの前治療を受けている、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記少なくとも２種の前治療が、免疫調節剤、プロテアソーム阻害剤、抗ＣＤ３８抗体、又はこれらの組み合わせを含む、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記対象が、免疫調節剤及びプロテアソーム阻害剤を含む前治療に対して難治性である、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記対象が、免疫調節剤、プロテアソーム阻害剤、及び抗ＣＤ３８抗体を含む前治療に対して難治性である、請求項２８に記載の方法。

【請求項31】

前記対象が、自家幹細胞移植（ＳＣＴ）の後に再発し、任意選択により前記再発が前記ＳＣＴ後の１２ヵ月以内に生じる、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記対象が、以下の特徴：
（ａ）測定可能な疾患、
（ｂ）米国東海岸癌臨床試験グループの一般状態が０又は１であること、
（ｃ）十分な臓器機能、
（ｄ）以前に同種幹細胞移植（ＳＣＴ）を受けていないこと、
（ｅ）工程（ｉ）の前の６０日以内に自家ＳＣＴを受けていないこと、
（ｆ）形質細胞性白血病、非分泌型ＭＭ、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ＰＯＥＭ症候群、並びに／又は終末器官の病変及び損傷を伴うアミロイドーシスがないこと、
（ｇ）シクロホスファミド及び／又はフルダラビンに対する禁忌がないこと、
（ｈ）工程（ｉ）の前の１４日以内に、遺伝子療法、抗ＢＣＭＡ療法、及び非緩和的放射線療法を以前に受けていないこと、
（ｉ）ＭＭによる中枢神経系の病変がないこと、
（ｊ）臨床的に意義のあるＣＮＳ病変、脳血管虚血及び／又は出血症状、認知症、小脳疾患、ＣＮＳ病変を伴う自己免疫疾患の病歴又は存在がないこと、
（ｋ）工程（ｉ）の前の６ヵ月以内に不安定狭心症、不整脈、及び／又は心筋梗塞がないこと、
（ｌ）任意選択により感染症がＨＩＶ、ＨＢＶ、又はＨＣＶによって引き起こされる、コントロール不良な前記感染症がないこと、
（ｍ）悪性腫瘍が、基底細胞癌若しくは扁平細胞皮膚癌、十分に切除された子宮頸部の上皮内癌、又は完全に切除され、≧５年間寛解期にある過去の悪性腫瘍でないことを条件に、過去又は同時進行の前記悪性腫瘍がないこと、
（ｎ）工程（ｉ）の前の２８日以内に生ワクチンを投与していないこと、
（ｏ）工程（ｉ）の前の１４日以内に全身的な抗腫瘍療法を受けていないこと、並びに
（ｐ）免疫抑制療法を必要とする原発性免疫不全疾患又は自己免疫疾患がないことの１つ以上を有するヒト患者である、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記有効量の前記遺伝子改変Ｔ細胞の集団が、
（ａ）前記対象の軟部組織の形質細胞腫のサイズ（ＳＰＤ）を少なくとも５０％減少させること、
（ｂ）前記対象の血清Ｍタンパク質レベルを少なくとも２５％、任意選択により５０％減少させること、
（ｃ）前記対象の２４時間の尿中Ｍタンパク質レベルを少なくとも５０％、任意選択により９０％減少させること、
（ｄ）前記対象の関連する遊離軽鎖（ＦＬＣ）レベルと関連しない遊離軽鎖レベルの差を少なくとも５０％減少させること、
（ｅ）前記対象の形質細胞数を少なくとも５０％減少させること、
（ｆ）κ軽鎖を生成する骨髄腫細胞を有する前記対象のκ軽鎖とλ軽鎖の比（κ／λ比）を４：１以下に減少させること、
（ｇ）λ軽鎖を生成する骨髄腫細胞を有する前記対象のκ軽鎖とλ軽鎖の比（κ／λ比）を１：２以上に増加させることの１つ以上を達成するのに十分である、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記有効量の前記遺伝子改変Ｔ細胞の集団が、前記対象の血清Ｍタンパク質レベルを少なくとも９０％減少させ、且つ２４時間の尿中Ｍタンパク質レベルを１００ｍｇ未満まで減少させるのに十分であり、及び／又は前記有効量の前記遺伝子改変Ｔ細胞の集団が、前記対象の血清Ｍタンパク質、尿中Ｍタンパク質、及び軟部組織の形質細胞腫を検出不可能なレベルにまで減少させ、且つ形質細胞数を骨髄（ＢＭ）吸引液の５％未満まで減少させるのに十分である、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記有効量の前記遺伝子改変Ｔ細胞の集団が、厳格な完全奏効（ｓＣＲ）、完全奏効（ＣＲ）、最良部分奏効（ＶＧＰＲ）、部分奏効（ＰＲ）、最小奏効（ＭＲ）、又は安定疾患（ＳＤ）を達成するのに十分である、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

遺伝子改変Ｔ細胞の集団であって、ＢＣＭＡに結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、及び破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む核酸を含むＴ細胞を含み、前記ＣＡＲをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子に挿入され、
前記遺伝子改変Ｔ細胞の集団において、前記遺伝子改変Ｔ細胞の≧３０％がＣＡＲ^＋であり、前記遺伝子改変Ｔ細胞の≦０．４％がＴＣＲ^＋であり、及び／又は前記遺伝子改変Ｔ細胞の≦３０％がＢ２Ｍ^＋である、遺伝子改変Ｔ細胞の集団。

【請求項37】

ＢＣＭＡに結合する前記ＣＡＲが、
（ｉ）抗ＢＣＭＡの単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む外部ドメイン、
（ｉｉ）ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、並びに
（ｉｉｉ）４－１ＢＢ及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン由来の共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む、請求項３６に記載の遺伝子改変Ｔ細胞の集団。

【請求項38】

前記抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖが、配列番号４２を含む重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）及び配列番号４３を含む軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含む、請求項３７に記載の遺伝子改変Ｔ細胞の集団。

【請求項39】

前記抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖが、配列番号４１を含む、請求項３７に記載の遺伝子改変Ｔ細胞の集団。

【請求項40】

ＢＣＭＡに結合する前記ＣＡＲが、配列番号４０のアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載の遺伝子改変Ｔ細胞の集団。

【請求項41】

前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードする前記核酸が、配列番号３３のヌクレオチド配列を含む、請求項４０に記載の遺伝子改変Ｔ細胞の集団。

【請求項42】

前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号４のスペーサー配列を含むガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集システムによって生成される、請求項３６～４１のいずれか一項に記載の遺伝子改変Ｔ細胞の集団。

【請求項43】

前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号１０の欠失を有し、任意選択により前記欠失を置換する配列番号３０のヌクレオチド配列を含む、請求項３４～４０のいずれか一項に記載の遺伝子改変Ｔ細胞の集団。

【請求項44】

前記破壊されたβ２Ｍ遺伝子が、配列番号８のスペーサー配列を含むガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集システムによって生成される、請求項３６～４３のいずれか一項に記載の遺伝子改変Ｔ細胞の集団。

【請求項45】

前記破壊されたβ２Ｍ遺伝子が、配列番号２１～２６の少なくとも１つを含む、請求項３６～４３のいずれか一項に記載の遺伝子改変Ｔ細胞の集団。

【請求項46】

前記遺伝子改変Ｔ細胞の集団が、１人以上の健康なヒトドナーに由来するものである、請求項３６～４４のいずれか一項に記載の遺伝子改変Ｔ細胞の集団。

【請求項47】

請求項３６～４５のいずれか一項に記載の遺伝子改変Ｔ細胞の集団、及び前記遺伝子改変Ｔ細胞の集団が懸濁される凍結保存溶液を含む組成物。

【請求項48】

前記凍結保存溶液が、約２～１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、任意選択により約５％のＤＭＳＯを含み、任意選択により実質的に血清を含まない、請求項４６に記載の組成物。

【請求項49】

前記組成物が保存バイアルに入れられ、各保存バイアルが、約２５～８５×１０^６細胞／ｍｌを含有する、請求項４６又は請求項４７に記載の組成物。

【請求項50】

前記組成物が、請求項４６～４８のいずれか一項に記載されている、多発性骨髄腫を治療するのに使用される組成物。

【請求項51】

前記組成物が、請求項４６～４９のいずれか一項に記載されている、多発性骨髄腫を治療するのに使用される薬剤を製造するための組成物の使用。

【請求項52】

多発性骨髄腫を治療するのに使用されるキットであって、（ａ）請求項３４～４４のいずれか一項に記載の遺伝子改変Ｔ細胞の集団、又は請求項４６～４９のいずれか一項に記載の組成物、及び（ｂ）前記遺伝子改変Ｔ細胞の集団又は前記組成物が入ったバイアルを含むキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１月１７日出願の米国仮特許出願第６２／９６２，３１５号明細書、２０２０年４月２２日出願の米国仮特許出願第６３／０１３，５８７号明細書、及び２０２０年１２月２３日出願の米国仮特許出願第６３／１２９，９７３号明細書に対する優先権の利益を主張する。先行出願の各々の内容全体が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

多発性骨髄腫（ＭＭ）は、骨髄内で最終分化した形質細胞の悪性腫瘍である。ＭＭは、モノクローナル免疫グロブリンタンパク質（Ｍタンパク質、即ちモノクローナルタンパク質としても知られている）又は異常形質細胞によるモノクローナル遊離軽鎖の分泌から生じるものであり、特徴的な骨髄生検の所見、並びに形質細胞増殖に関係する終末器官障害に起因する症状（高カルシウム血症、腎不全、貧血症、骨折）により、形質細胞異常増殖症の範囲において区別される（Ｋｕｍａｒ ２０１７ａ）。ＭＭは、全ての造血器腫瘍の約１０％に現れ、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）後に２番目に最も多く見られる造血器腫瘍である（Ｋｕｍａｒ ２０１７ａ，Ｒａｊｋｕｍａｒ ａｎｄ Ｋｕｍａｒ ２０１６）。ほとんどの患者の場合、ＭＭは最終的に死亡に至る不治の疾患である。ＭＭ、特に再発性／難治性ＭＭを治療するための、効果的な療法に対する要求は満たされていない。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0003】

本開示は、破壊された内在性ＴＲＡＣ遺伝子及びβ２Ｍ遺伝子を含む同種Ｔ細胞を含み、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）標的化Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を発現する免疫細胞療法の開発に少なくとも部分的に基づく。異種移植マウスモデルで観察されるように、同種抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞により、（ＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞を有する）ヒト多発性骨髄腫の腫瘍が根絶される結果となった。重要なことに、同種抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の投与によって腫瘍負荷が減少し、腫瘍細胞による再チャレンジから動物が保護されることが観察されている。更に、同種抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞はＢＣＭＡ^＋細胞に対して高い選択性を示し、望ましくない発癌性形質転換を生じなかった。加えて、動物モデルからのデータにより、同種抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）又は宿主対移植片病（ＨｖＧＤ）を誘導しなかったことが示された。まとめると、抗ＢＣＭＡ同種ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ヒト対象の治療用途（例えば、癌治療）に極めて効果的且つ安全であることが期待される。

【0004】

従って、本開示は、破壊された内在性ＴＲＡＣ遺伝子及びβ２Ｍ遺伝子を有し、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変Ｔ細胞を含む組成物、並びに癌（例えば、ＭＭ）を治療するための同種抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を提供する。遺伝子改変Ｔ細胞は、１人以上の健康なドナー（例えば、健康なヒトドナー）に由来し得る。

【0005】

いくつかの態様では、本開示は、ＢＣＭＡに結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、及び破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む核酸を含むＴ細胞を含む、遺伝子改変Ｔ細胞の集団を提供する。破壊されたＴＲＡＣ遺伝子に、ＣＡＲコード配列を含む核酸を挿入することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、≧３０％（例えば、約３５～７０％）の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ^＋Ｔ細胞、≦０．４％のＴＣＲ^＋Ｔ細胞、及び／又は≦３０％（例えば、約１５～３０％）のＢ２Ｍ^＋Ｔ細胞を含み得る。いくつかの実施例では、Ｔ細胞集団内のＴ細胞の約３５～６５％が、ＣＡＲ^＋／ＴＣＲ^－／Ｂ２Ｍ^－である。

【0006】

いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、（ｉ）抗ＢＣＭＡ単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む外部ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）４－１ＢＢ及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン由来の共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。例えば、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖは、配列番号４２を含む重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）及び配列番号４３を含む軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含み得る。いくつかの実施例では、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖは、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。

【0007】

いくつかの実施形態では、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号３又は配列番号４のスペーサー配列を含むガイドＲＮＡを含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集システムによって生成することができる。いくつかの実施例では、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号１０の欠失を有する。代わりに又は加えて、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードする配列番号３０のヌクレオチド配列をＴＲＡＣ遺伝子に挿入し、例えば、配列番号１０を含む欠失させたフラグメントと置き換える。

【0008】

いくつかの実施形態では、破壊されたβ２Ｍ遺伝子は、配列番号７又は配列番号８のスペーサー配列を含むガイドＲＮＡを含み得るＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集システムによって生成することができる。いくつかの実施例では、破壊されたβ２Ｍ遺伝子は、少なくとも１つの配列番号２１～２６を含み得る。

【0009】

更に、本開示は、本明細書に記載される遺伝子改変Ｔ細胞の集団のいずれか、及び遺伝子改変Ｔ細胞の集団が懸濁される凍結保存溶液を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、凍結保存溶液は、約２～１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、任意選択により約５％のＤＭＳＯを含み得、実質的に血清を含まない。いくつかの実施形態では、組成物は、保存バイアル内に入れることができる。いくつかの実施例では、各保存バイアルは、約２５～８５×１０^６細胞／ｍｌを含有する。

【0010】

別の態様では、本明細書で開示される遺伝子改変Ｔ細胞集団のいずれか、又は同様に本明細書で開示されるようなものを含む組成物のいずれかを使用して、多発性骨髄腫（ＭＭ）を治療するための方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、以下を含み得る：（ｉ）有効量の１つ以上のリンパ球除去化学療法剤を、それを必要とする対象に投与すること、及び（ｉｉ）工程（ｉ）の後、本明細書で開示されるような有効量の遺伝子改変Ｔ細胞の集団のいずれかを対象に投与すること。

【0011】

いくつかの実施形態では、ヒト患者などの対象に与えられる有効量の遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、以下の１つ以上を達成するのに十分なものである：（ａ）対象の軟部組織の形質細胞腫のサイズ（ＳＰＤ）を少なくとも５０％減少させ、（ｂ）対象の血清Ｍタンパク質レベルを少なくとも２５％、任意選択により５０％減少させ、（ｃ）対象の２４時間の尿中Ｍタンパク質レベルを少なくとも５０％、任意選択により９０％減少させ、（ｄ）対象の関連する遊離軽鎖（ＦＬＣ）レベルと関連しない遊離軽鎖レベル間の差を少なくとも５０％減少させ、（ｅ）対象の形質細胞数を少なくとも５０％減少させ、（ｆ）κ軽鎖を生成する骨髄腫細胞を有する対象のκ軽鎖とλ軽鎖の比（κ／λ比）を４：１以下に減少させ、及び（ｇ）λ軽鎖を生成する骨髄腫細胞を有する対象のκ軽鎖とλ軽鎖の比（κ／λ比）を１：２以上に増加させる。いくつかの実施例では、対象に与えられる有効量の遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、対象の血清Ｍタンパク質レベルを少なくとも９０％減少させ、２４時間の尿中Ｍタンパク質レベルを１００ｍｇ未満まで減少させるのに十分であり、及び／又は有効量の遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、対象の血清Ｍタンパク質、尿中Ｍタンパク質、及び軟部組織の形質細胞腫を検出不可能なレベルにまで減少させ、且つ形質細胞数を骨髄（ＢＭ）吸引液の５％未満まで減少させるのに十分である。

【0012】

いくつかの実施例では、有効量の遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、約２．５×１０^７～約７．５×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞（例えば、約５．０×１０^７～約７．５×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞）の範囲である。例えば、工程（ｉｉ）における有効量の遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、約５．０×１０^７～約１．５×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞、約１．５×１０^８～約４．５×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞、約４．５×１０^８～約６．０×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞、又は約６．０×１０^８～約７．５×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞の範囲である。

【0013】

いくつかの実施例では、有効量の遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、約２．５×１０^７個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞である。いくつかの実施例では、有効量の遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、約５×１０^７個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞である。いくつかの実施例では、有効量の遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、約１．５×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞である。いくつかの実施例では、有効量の遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、約４．５×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞である。いくつかの実施例では、有効量の遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、約６×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞である。いくつかの実施例では、有効量の遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、約７．５×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞である。好ましくは、有効量の遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、少なくとも１．５×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞、少なくとも４．５×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞、又は少なくとも６．０×１０^８個のＣＡＲ＋Ｔ細胞である。

【0014】

いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法のいずれかの工程（ｉ）は、対象に１日当たり約３０ｍｇ／ｍ^２のフルダラビン及び約３００ｍｇ／ｍ^２のシクロホスファミドを３日間にわたって静脈内に同時投与することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法のいずれかの工程（ｉ）は、対象に１日当たり約３０ｍｇ／ｍ^２のフルダラビン及び約５００ｍｇ／ｍ^２のシクロホスファミドを３日間にわたって静脈内に同時投与することを含む。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉ）は、工程（ｉ）の約２～７日後に実施する。

【0015】

本明細書で開示される方法のいずれかにおいて、ヒト患者は工程（ｉ）の前に以下の特徴の１つ以上を示さない：（ａ）臨床状態の著しい悪化、（ｂ）約９１％超の飽和レベルを維持するために酸素補給を必要とすること、（ｃ）コントロール不良な心不整脈、（ｄ）血管収縮薬のサポートを必要とする低血圧、（ｅ）活動性感染症、及び（ｆ）免疫エフェクター細胞関連神経毒性症候群（ＩＣＡＮＳ）のリスクを増大させる神経毒性。代わりに又は加えて、ヒト患者は、工程（ｉｉ）の前及び工程（ｉ）の後に、以下の特徴の１つ以上を示さない：（ａ）活動性のコントロール不良な感染症、（ｂ）工程（ｉ）の前の臨床状態と比較した臨床状態の悪化、及び（ｃ）免疫エフェクター細胞関連神経毒性症候群（ＩＣＡＮＳ）のリスクを増大させる神経毒性。

【0016】

本明細書で開示される方法のいずれもが、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）後の急性毒性の発症についてヒト患者を観察することを更に含み得る。いくつかの実施形態では、急性毒性は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、神経毒性、腫瘍崩壊症候群、血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）、血球減少症、ＧｖＨＤ、低血圧、腎不全、ウイルス性脳炎、好中球減少症、血小板減少症、又はこれらの組み合わせを含む。同種抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の間に毒性が発症したとき、対象は、毒性の発症が観察される場合に毒性管理を受ける。

【0017】

本明細書で開示されるような同種抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法に好適な対象は、任意選択により１８歳以上のヒト患者であり得る。ヒト患者は、以下の特徴：（１）十分な臓器機能、（２）以前に同種幹細胞移植（ＳＣＴ）を受けていないこと、（３）工程（ｉ）の前の６０日以内に自家ＳＣＴを受けていないこと、（４）形質細胞性白血病、非分泌型ＭＭ、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ＰＯＥＭ症候群、並びに／又は終末器官の病変及び損傷を伴うアミロイドーシスがないこと、（５）工程（ｉ）の前の１４日以内に、遺伝子療法、抗ＢＣＭＡ療法、及び非緩和的放射線療法を以前に受けていないこと、（６）ＭＭによる中枢神経系の病変がないこと、（７）臨床的に意義のあるＣＮＳ病変、脳血管虚血及び／又は出血症状、認知症、小脳疾患、ＣＮＳ病変を伴う自己免疫疾患の病歴又は存在がないこと、（８）工程（ｉ）の前の６ヵ月以内に不安定狭心症、不整脈、及び／又は心筋梗塞がないこと、（９）任意選択により感染症がＨＩＶ、ＨＢＶ、又はＨＣＶによって引き起こされた、コントロール不良な感染症がないこと、（１０）悪性腫瘍が、基底細胞癌若しくは扁平細胞皮膚癌、十分に切除された子宮頸部の上皮内癌、又は完全に切除され、≧５年間寛解している過去の悪性腫瘍でないことを条件に、過去又は同時進行の悪性腫瘍がないこと、（１１）工程（ｉ）の前の２８日以内に生ワクチンを投与していないこと、（１２）工程（ｉ）の前の１４日以内に全身的な抗腫瘍療法を受けていないこと、並びに（１３）免疫抑制療法を必要とする原発性免疫不全疾患又は自己免疫疾患がないことの１つ以上を有し得る。代わりに又は加えて、対象は、測定可能な疾患を有し、及び／又は米国東海岸癌臨床試験グループの一般状態が０若しくは１である。

【0018】

いくつかの実施形態では、対象は再発性及び／又は難治性ＭＭを有し得る。いくつかの実施形態では、対象は、少なくとも２種のＭＭの前治療を受けていてもよく、前治療には、免疫調節剤、プロテアソーム阻害剤、抗ＣＤ３８抗体、又はこれらの組み合わせが含まれ得る。いくつかの実施例では、対象は、免疫調節剤及びプロテアソーム阻害剤を含む前治療に対して二重難治性である。他の実施例では、対象は、免疫調節剤、プロテアソーム阻害剤、及び抗ＣＤ３８抗体を含む前治療に対して三重難治性である。他の実施例では、対象は自家幹細胞移植（ＳＣＴ）の後に再発し、この再発はＳＣＴ後の１２ヵ月以内に生じ得る。更に他の実施例では、対象は、プロテアソーム阻害剤、免疫調節剤、及び抗ＣＤ３８抗体に対して三重難治性の患者であり得る。

【0019】

更に、本開示は、いくつかの態様では、多発性骨髄腫（例えば、難治性及び／又は再発性ＭＭ）を治療するのに使用されるキットを特徴とする。キットは、（ａ）本明細書で開示される遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団又は同様に本明細書で開示されるようなものを含む組成物、及び（ｂ）遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団又は組成物が入ったバイアルを含む。

【0020】

また、本明細書で開示されるような遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞のいずれかを含む、難治性及び／若しくは再発性ＭＭなどの多発性骨髄腫（ＭＭ）を治療するのに使用される組成物、又は多発性骨髄腫を治療するのに使用される薬剤を製造するための組成物の使用も本開示の範囲内である。

【0021】

本発明の１つ以上の実施形態の詳細を以下の説明に記載する。本発明の他の特徴又は利点は、以下の図面及びいくつかの実施形態の詳細な説明、並びに添付の特許請求の範囲からも明らかになるであろう。

【0022】

前述のことは、同一の参照符号が異なる図を通して同じ部分を指す添付図面に図示される、以下のより詳細な例示的な実施形態の説明から明らかになるであろう。図面は必ずしも縮尺通りではなく、その代わり、実施形態を図示する際に強調されている。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】破壊されたＴＲＡＣ遺伝子及び破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含み、図示されているようなキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する、例示的な同種Ｔ細胞を表す模式図である。Ｔ細胞は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現するが、機能的ＴＣＲ又はＭＨＣ Ｉ複合体を発現しない。

【図2】フローサイトメトリーによって測定された、遺伝子改変Ｔ細胞（ＣＴＸ１２０細胞）の集団におけるＴＣＲ^－、β２Ｍ^－、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ^＋、及びＴＣＲ^－／β２Ｍ^－／抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ^＋細胞の割合を表す図である。

【図3A-3B】フローサイトメトリーによって測定された、遺伝子改変細胞（ＣＴＸ１２０細胞）又は未編集の細胞の集団内のＣＤ４^＋Ｔ細胞（図３Ａ）又はＣＤ８^＋Ｔ細胞（図３Ｂ）の割合を表す図を含む。

【図4】０日目の未処置又はＣＴＸ１２０細胞で処置した免疫不全マウスにおける、経時的に測定された皮下ＢＣＭＡ発現ヒトＭＭ腫瘍（ＭＭ．１Ｓ腫瘍）容積を表す図である。丸は、処置又は未処置動物の右側腹部に接種された原発腫瘍の増殖を示しており、全ての未処置動物は腫瘍負荷により安楽死を必要とし、全ての処置動物は原発腫瘍を拒絶した。生存する処置動物を、左側腹部に腫瘍細胞で接種することで、２９日目に腫瘍細胞で再チャレンジした。白三角は、処置動物における再チャレンジした腫瘍の増殖を表すが、黒三角は新たなコホートの未処置動物の左側腹部に播種した腫瘍の増殖を表す。

【図5】１日目の未処置又はＣＴＸ１２０細胞で処置した免疫不全マウスにおける、経時的に測定された皮下ＢＣＭＡ発現ヒトＭＭ腫瘍（ＲＰＭＩ－８２２６腫瘍）容積を表す図である。

【図6A-6B】ＢＣＭＡの表面発現が陽性の腫瘍細胞（ＭＭ．１Ｓ及びＪｅｋｏ－１）、又はＢＣＭＡの発現が陰性の腫瘍細胞（Ｋ５６２）とインビトロで共培養した後の、エフェクターＣＴＸ１２０細胞によるインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮγ）（図６Ａ）又はインターロイキン－２（ＩＬ－２）（図６Ｂ）の産生を表すグラフを含む。

【図7A-7C】異なるＴ細胞と標的細胞の比率で未編集の細胞又は編集されたＣＴＸ１２０細胞とインビトロで共培養した後の、フローサイトメトリーによって死滅／瀕死であると特性評価された標的細胞の割合を表す図を含む。標的細胞は、高ＢＣＭＡ発現ＭＭ．１Ｓ細胞（図７Ａ）、低ＢＣＭＡ発現Ｊｅｋｏ－１細胞（図７Ｂ）、又はＢＣＭＡ陰性Ｋ５６２細胞（図７Ｃ）であった。

【図8A-8B】陽性対照としてのＢＣＭＡ発現Ｊｅｋｏ－１細胞と比較した、ＢＣＭＡ発現細胞を含有するＢ細胞を含む、ヒト組織に由来する初代細胞とインビトロで共培養した後の、エフェクターＣＴＸ１２０細胞によるＩＦＮγ（図８Ａ）又はＩＬ－２（図８Ｂ）の産生を表すグラフを含む。

【図9】完全培地（血清＋サイトカイン）、血清を含む培地（サイトカインを含まない）、又は血清及びサイトカインを含まない培地中で増殖させたときの細胞数によって測定される、編集されたＣＴＸ１２０細胞のエクスビボの培養の経時的な生存能を表す図である。

【図10】放射線量に暴露し、且つ溶媒のみ（Ｔ細胞を含まない）、未編集のＴ細胞、又は編集されたＣＴＸ１２０細胞で処置した後の、経時的なマウスの生存を表す図である。

【図11】同一のドナーに由来する末梢血単核球（ＰＢＭＣ）（自家ＰＢＭＣ）又は異なるドナーに由来する末梢血単核球（ＰＢＭＣ）（同種ＰＢＭＣ）とインビトロで共培養した後の、未編集のＴ細胞又は編集されたＴＲＡＣ^－／Ｂ２Ｍ^－Ｔ細胞の増殖を表すグラフである。陽性対照として、Ｔ細胞をフィトヘムアグルチニン－Ｌ（ＰＨＡ）で刺激して増殖を誘導した。

【図12】ヒトＭＭを治療するための同種ＣＴＸ１２０細胞の安全性及び有効性を評価するための、臨床試験デザインを表す図である。３０ｍｇ／ｍ^２のフルダラビン及び３００ｍｇ／ｍ^２のシクロホスファミドを３日間にわたって毎日ＩＶで同時投与することによって、又は３０ｍｇ／ｍ^２のフルダラビン及び５００ｍｇ／ｍ^２のシクロホスファミドを３日間にわたって毎日ＩＶで同時投与することによって、リンパ球除去化学療法を実施する。Ｄ：日；ＤＬＴ：用量制限毒性；ＩＶ：静注；Ｍ：月。

【図13】ＣＴＸ１２０細胞などの抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の生成物を表す模式図である。

【発明を実施するための形態】

【0024】

腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１７（ＴＮＦＲＳＦ１７）としても知られているＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、成熟Ｂ細胞に発現する抗原決定基である。しかしながら、ＢＣＭＡは特定の種類の造血器腫瘍に異なる形で発現しており、ＢＣＭＡの発現は、健康な細胞よりも悪性腫瘍細胞に多い。例えば、ＢＣＭＡは、多発性骨髄腫（ＭＭ）の形質細胞及び分化形質細胞の表面に選択的に発現するが、記憶Ｂ細胞、ナイーブＢ細胞、ＣＤ３４^＋造血幹細胞、及び他の正常組織細胞の表面には発現しない（Ｃｈｏ，ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏ ９：１８２１）。理論に束縛されるものではないが、ＢＣＭＡはＭＭ細胞の増殖及び生存を促進するだけでなく、ＭＭ細胞を免疫検出から保護する免疫抑制的な骨髄微小環境を促進するものと考えられている。

【0025】

本開示は、破壊された内在性ＴＲＡＣ遺伝子及びβ２Ｍ遺伝子を有し、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現する遺伝子改変Ｔ細胞を含む同種Ｔ細胞療法の開発に少なくとも部分的に基づく。遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与すると、動物モデルで観察されるように、ＢＣＭＡを発現するヒトＭＭ腫瘍が正常に根絶される。重要なことに、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与すると腫瘍負荷が減少し、腫瘍細胞による再チャレンジから動物が保護されたことが観察される。更に、破壊された内在性ＴＲＡＣ遺伝子及びβ２Ｍ遺伝子を有する遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、動物モデルにおいて移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）又は宿主対移植片病（ＨｖＧＤ）を誘導しなかった。従って、本明細書で開示される同種抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ療法は、ヒト患者におけるＭＭなどの癌の治療に極めて効果的且つ安全であることが期待される。

【0026】

Ｉ．遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞
いくつかの態様では、本開示は、ＢＣＭＡに特異的に結合するＣＡＲ（抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ又は抗ＢＭＣＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞）を発現する遺伝子改変Ｔ細胞の集団を提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞の少なくとも一部は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードする核酸、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に関連する破壊された遺伝子、及び／又は宿主対移植片（ＨｖＧ）反応に関連する破壊された遺伝子を含む。抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を生成及び使用する方法は、国際公開第２０１９／０９７３０５号パンフレット及び国際公開第２０１９／２１５５００号パンフレットに記載されており、その各々の関連する開示が、本明細書で言及される目的及び主題のために本明細書に参照により組み込まれる。

【0027】

（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）標的化ＢＣＭＡ（抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ）
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とは、望ましくない細胞、例えば癌細胞などの疾患細胞で発現した抗原を認識して結合するように改変された人工の免疫細胞受容体を指す。ＣＡＲポリペプチドを発現するＴ細胞は、ＣＡＲ Ｔ細胞と称される。ＣＡＲは、ＭＨＣに制限されない様式で、選択された標的に対しＴ細胞の特異性及び反応性を再誘導する能力を有する。ＭＨＣに制限されない抗原認識は、抗原プロセシングに非依存的な抗原を認識する能力をＣＡＲ－Ｔ細胞に与え、それにより腫瘍エスケープの主要な機構をバイパスする。更に、ＣＡＲは、Ｔ細胞に発現する場合、有利なことに、内在性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖及びベータ鎖と二量体化しない。

【0028】

本明細書で開示される抗ＢＣＭＡ ＣＡＲとは、ＢＣＭＡ分子、好ましくは細胞表面に発現するＢＣＭＡ分子に結合可能なＣＡＲを指す。ＢＣＭＡのヒト及びマウスのアミノ酸配列及び核酸配列は、公的データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ、又はＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ）において見出すことができる。例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ０２２２３（ヒトＢＣＭＡ）及びＯ８８４７２（マウスＢＣＭＡ）を参照されたい。一般に、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、ＢＣＭＡを認識する細胞外ドメイン（外部ドメイン）（例えば、抗体の単鎖フラグメント（ｓｃＦｖ）又は他の抗体フラグメント）と、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体（例えば、ＣＤ３ζ）のシグナル伝達ドメインを含み、ほとんどの場合共刺激ドメインである細胞内ドメイン（内部ドメイン）とを含む融合ポリペプチドである。（Ｅｎｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１５；２６（８）：４９８－５０５）。本明細書で開示される抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは更に、細胞外ドメインと細胞内ドメインとの間にヒンジ及び膜貫通ドメインを含み得、且つ表面に発現するためにＮ末端にシグナルペプチドを含み得る。シグナルペプチドの例としては、ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ（配列番号５４）及びＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号５５）が挙げられる。他のシグナルペプチドを使用してもよい。いくつかの実施例では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは更に、ＧＳＴタグ又はＦＬＡＧタグなどのエピトープタグを含み得る。

【0029】

（ａ）抗原結合細胞外ドメイン
抗原結合細胞外ドメインとは、ＣＡＲが細胞表面に発現すると細胞外液にさらされるＣＡＲポリペプチドの領域のことである。場合によっては、細胞表面発現を促進するために、シグナルペプチドがＮ末端に位置していてもよい。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であってよく、抗体重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）及び抗体軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を（いずれかの方向に）含み得る。場合によっては、Ｖ_Ｈフラグメント及びＶ_Ｌフラグメントが、ペプチドリンカーを介して連結されていてもよい。リンカーとしては、いくつかの実施形態では、可動性のために一続きのグリシン及びセリン、並びに可溶性を付与するために一続きのグルタミン酸塩及びリシンを含む親水性残基が挙げられる。リンカーペプチドは、約１０～約２５個のアミノ酸であり得る。特定の実施例では、リンカーペプチドは、配列番号５３（表５）に記載される配列を含む。ｓｃＦｖフラグメントは、ｓｃＦｖフラグメントに由来する親抗体の抗原結合特異性を保持する。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、ヒト化Ｖ_Ｈドメイン及び／又はＶ_Ｌドメインを含み得る。他の実施形態では、ｓｃＦｖのＶ_Ｈドメイン及び／又はＶ_Ｌドメインは、完全ヒト型である。

【0030】

本明細書で開示される抗ＢＣＭＡ ＣＡＲの抗原結合細胞外ドメインは、ＢＣＭＡ分子、好ましくは細胞表面に発現するＢＣＭＡ分子に結合可能である。抗原結合細胞外ドメインは、ＢＣＭＡに特異的な抗体であってもよく、又はこれらの抗原結合フラグメントであってもよい。いくつかの実施形態では、抗原結合細胞外ドメイン（ＢＣＭＡ結合ドメイン）は、好適な抗体、例えば、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒト抗体、又はキメラ抗体に由来し得る単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。場合によっては、ｓｃＦｖは、ヒト抗ＢＣＭＡ抗体に由来するものである。他の場合では、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖはヒト型（例えば、完全ヒト型）である。例えば、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖはヒト型であり、非ヒト種、例えば、マウス、ラット、又はウサギ由来の相補的決定領域（ＣＤＲ）に由来する１つ以上の残基を含む。

【0031】

いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖは、抗体重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）及び抗体軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を（いずれかの方向に）含み、これらは配列番号４２のＶ_Ｈと同一の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び配列番号４３のＶ_Ｌと同一の軽鎖ＣＤＲを含む。同一のＶ_Ｈ ＣＤＲ及び／又はＶ_Ｌ ＣＤＲを有する２つの抗体は、同一の手法（当技術分野において公知のような、例えばＫａｂａｔ手法、Ｃｈｏｔｈｉａ手法、ＡｂＭ手法、Ｃｏｎｔａｃｔ手法又はＩＭＧＴ手法であり、例えば、ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／を参照されたい）によって決定したときに、それらのＣＤＲが同一であることを意味する。例えば、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖは、Ｋａｂａｔ手法に従って、下記の表５に示す重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み得る。代替として、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖは、Ｃｈｏｔｈｉａ手法に従って、下記の表５に示す重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み得る。

【0032】

他の実施例では、本明細書で開示される抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物のいずれかに使用される抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖは、配列番号４１のアミノ酸配列（例示的な抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ）を含む抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖの機能的変異体であり得る。そのような機能的変異体は、例示的な抗体に構造的にも機能的にも実質的に類似するものである。機能的変異体は、例示的な抗ＢＣＭＡ抗体と実質的に同一のＶ_Ｈ ＣＤＲ及びＶ_Ｌ ＣＤＲを含む。例えば、機能的変異体は、例示的な抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖの全てのＣＤＲ領域に最大で８個（例えば８、７、６、５、４、３、２、又は１個）だけのアミノ酸残基の変異を含み得、実質的に類似した親和性を有する（例えば、同じオーダーのＫ_Ｄ値を有する）ＢＣＭＡの同一のエピトープに結合する。

【0033】

例えば、本明細書で開示される抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖは、ａ）配列番号４４、若しくは配列番号４４に対して１～３個のアミノ酸置換を有する配列を含むＶ_Ｌ ＣＤＲ１、ｂ）配列番号４５、若しくは配列番号４５に対して１個のアミノ酸置換を有する配列を含むＶ_Ｌ ＣＤＲ２、ｃ）配列番号４６、若しくは配列番号４６に対して１～２個のアミノ酸置換を有する配列を含むＶ_Ｌ ＣＤＲ３、及び／又はｄ）配列番号４７、若しくは配列番号４７に対して１個のアミノ酸置換を有する配列を含むＶ_Ｈ ＣＤＲ１、ｅ）配列番号４８、若しくは配列番号４８に対して１～３個のアミノ酸置換を有する配列を含むＶ_Ｈ ＣＤＲ２、ｆ）配列番号４９、若しくは配列番号４９に対して１～２個のアミノ酸置換を有する配列を含むＶ_Ｈ ＣＤＲ３、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。表５を参照されたい。いくつかの実施例では、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖは、配列番号４４を含むＶ_Ｌ ＣＤＲ１、配列番号４５を含むＶ_Ｌ ＣＤＲ２、配列番号４６を含むＶ_Ｌ ＣＤＲ３、配列番号４７を含むＶ_Ｈ ＣＤＲ１、配列番号４８を含むＶ_Ｈ ＣＤＲ２、及び配列番号４９を含むＶ_Ｈ ＣＤＲ３を含む。

【0034】

他の実施例では、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖは、ａ）配列番号４４、若しくは配列番号４４に対して１～３個のアミノ酸置換を有する配列を含むＶ_Ｌ ＣＤＲ１、ｂ）配列番号４５、若しくは配列番号４５に対して１個のアミノ酸置換を有する配列を含むＶ_Ｌ ＣＤＲ２、ｃ）配列番号４６、若しくは配列番号４６に対して１～２個のアミノ酸置換を有する配列を含むＶ_Ｌ ＣＤＲ３、及び／又はｄ）配列番号５０、若しくは配列番号５０に対して１個のアミノ酸置換を有する配列を含むＶ_Ｈ ＣＤＲ１、ｅ）配列番号５１、若しくは配列番号５１に対して１個のアミノ酸置換を有する配列を含むＶ_Ｈ ＣＤＲ２、ｆ）配列番号５２、若しくは配列番号５２に対して１～２個のアミノ酸置換を有する配列を含むＶ_Ｈ ＣＤＲ３、又はそれらの任意の組み合わせ（表５）を含み得る。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖは、配列番号４４を含むＶ_Ｌ ＣＤＲ１、配列番号４５を含むＶ_Ｌ ＣＤＲ２、配列番号４６を含むＶ_Ｌ ＣＤＲ３、配列番号５０を含むＶ_Ｈ ＣＤＲ１、配列番号５１を含むＶ_Ｈ ＣＤＲ２、及び配列番号５２を含むＶ_Ｈ ＣＤＲ３を含む。

【0035】

場合によっては、本明細書で開示されるＣＤＲの１つ以上のアミノ酸残基の変異又は置換は、保存的アミノ酸残基置換であってよい。本明細書で使用する場合、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸置換が行われるタンパク質の相対的な電荷又はサイズ特性が変化しないアミノ酸置換を指す。変異体は、そのような方法をまとめた参考文献、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９、又はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見出されるような、当業者に公知のポリペプチド配列を改変するための方法に従って調製することができる。アミノ酸の保存的置換としては、下記の群内のアミノ酸の中で行われる置換が挙げられる：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ、（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ、（ｄ）Ａ、Ｇ、（ｅ）Ｓ、Ｔ、（ｆ）Ｑ、Ｎ、及び（ｇ）Ｅ、Ｄ。

【0036】

いくつかの実施形態では、本明細書で開示される抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖは、配列番号４１の例示的な抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖのＶ_Ｈ ＣＤＲと比較して、個々に又は集合的に少なくとも８０％（例えば８５％、９０％、９５％、又は９８％）配列同一性である重鎖ＣＤＲを含み得る。代わりに又は加えて、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖは、例示的な抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖとしてのＶ_Ｌ ＣＤＲと比較して、個々に又は集合的に少なくとも８０％（例えば８５％、９０％、９５％、又は９８％）配列同一性である軽鎖ＣＤＲを含み得る。本明細書で使用する場合、「個々に」とは、１つの抗体のＣＤＲが、対応する例示的な抗体のＣＤＲに対して、示された配列同一性を共有することを意味する。「集合的に」とは、組み合わせた３つの抗体のＶ_Ｈ ＣＤＲ又はＶ_Ｌ ＣＤＲが、対応する組み合わせた３つの例示的な抗体のＶ_Ｈ ＣＤＲ又はＶ_Ｌ ＣＤＲに対して、示された配列同一性を共有することを意味する。

【0037】

いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖは、配列番号４２（表５）に記載される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈドメインを含み得る。代わりに又は加えて、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖは、配列番号４３（表５）に記載される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌドメインを含み得る。いくつかの実施例では、リンカーペプチドにより、抗ＢＣＭＡのＶ_ＨのＮ末端が抗ＢＣＭＡのＶ_ＬのＣ末端に連結される。代わりに、リンカーペプチドにより、抗ＢＣＭＡのＶ_ＨのＣ末端が抗ＢＣＭＡのＶ_ＬのＮ末端に連結される。

【0038】

いくつかの実施例では、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖは、配列番号４１に記載される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み得る。

【0039】

２つのアミノ酸配列の「同一性パーセント」は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－６８，１９９０のアルゴリズムであって、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－７７，１９９３にて変更されたアルゴリズムを用いて決定する。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施して、目的のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。２つの配列間にギャップが存在する場合、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９－３４０２，１９９７に記載されるように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを用いることができる。

【0040】

（ｂ）膜貫通ドメイン
本明細書で開示されるＣＡＲポリペプチドは、膜貫通ドメインを含有してもよく、この膜貫通ドメインは、膜にまたがる疎水性αヘリックスであり得る。本明細書で使用する場合、「膜貫通ドメイン」とは、細胞膜、好ましくは真核細胞膜内で熱力学的に安定な任意のタンパク質構造体を指す。膜貫通ドメインは、それ自体を含有するＣＡＲの安定性をもたらし得る。

【0041】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインであり得る。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインであり得る。更に他の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８及びＣＤ２８膜貫通ドメインのキメラである。本明細書に提供されるような他の膜貫通ドメインを使用してもよい。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧ ＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲ（配列番号６０）又はＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹ（配列番号５６）の配列を含有するＣＤ８ａ膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、ＣＤ８ａ膜貫通ドメインは、配列番号５６に記載される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み得る。他の膜貫通ドメインを使用してもよい。

【0042】

（ｃ）ヒンジドメイン
いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲはヒンジドメインを更に含み、ヒンジドメインは、ＣＡＲの細胞外ドメイン（抗原結合ドメインを含む）と膜貫通ドメインとの間に位置してもよく、又はＣＡＲの細胞質ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置し得る。ヒンジドメインは、ポリペプチド鎖において膜貫通ドメインを細胞外ドメイン及び／又は細胞質ドメインに連結するように機能する任意のオリゴペプチド又はポリペプチドであり得る。ヒンジドメインは、ＣＡＲ若しくはそのドメインに可動性をもたらすか、又はＣＡＲ若しくはそのドメインの立体障害を防ぐように機能し得る。

【0043】

いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、最大で３００個のアミノ酸（例えば、１０～１００個のアミノ酸、又は５～２０個のアミノ酸）を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの他の領域に１つ以上のヒンジドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８ヒンジドメインであり得る。他のヒンジドメインを使用してもよい。

【0044】

いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、約５～約３００個のアミノ酸、例えば、約５～約２５０個、約１０～約２５０個、約１０～約２００個、約１５～約２００個、約１５～約１５０個、約２０～約１５０個、約２０～約１００個、約２５～約１００個、約２５～約７５個、又は約３０～約７５０個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡヒンジドメインは、ＣＤ８ａヒンジドメイン、及び任意選択により追加の１～１０個のアミノ酸（例えば、４個のアミノ酸）をヒンジドメインのＮ末端に含む延長部を含む。いくつかの実施例では、延長部はアミノ酸配列ＳＡＡＡを含む。

【0045】

（ｄ）細胞内シグナル伝達ドメイン
ＣＡＲ構築物のいずれもが、受容体の機能的末端である１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ、及び任意選択により１つ以上の共刺激ドメイン）を含む。抗原認識後、受容体がクラスター化してシグナルが細胞に伝達される。

【0046】

ＣＤ３ζは、Ｔ細胞受容体複合体の細胞質シグナル伝達ドメインである。ＣＤ３ζは、Ｔ細胞が同種抗原と会合した後にＴ細胞に活性化シグナルを伝達する３つの免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。多くの場合、ＣＤ３ζは、一次Ｔ細胞の活性化シグナルを提供するが、十分に適格な活性化シグナルではなく、共刺激シグナル伝達を必要とする。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、配列番号５９（表５）に記載される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。

【0047】

いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるＣＡＲポリペプチドは、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを更に含み得る。例えば、ＣＤ３ζによって媒介される一次シグナル伝達と共に、ＣＤ２８及び／又は４－１ＢＢ共刺激ドメインを使用して、十分な増殖／生存シグナルを伝達することができる。いくつかの実施例では、本明細書に開示されるＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激分子を含む。他の実施例では、本明細書に開示されるＣＡＲは、４－１ＢＢ共刺激分子を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン及びＣＤ２８共刺激ドメインを含む。他の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン及び４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。更に他の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、及び４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。

【0048】

いくつかの実施例では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。４－１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号５７（表５）に記載される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み得る。

【0049】

いくつかの実施例では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含む。ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号５８（表５）に記載される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み得る。

【0050】

（ｅ）例示的な抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ
いくつかの実施例では、本明細書で開示される抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端に、ＣＤ８シグナル伝達ペプチド（例えば、配列番号５５）、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ（例えば、配列番号４１）、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン（例えば、配列番号５６）、４－１ＢＢ共刺激ドメイン（例えば、配列番号５７）、及びＣＤ３ｚシグナル伝達ドメイン（例えば、配列番号５９）を含む。このような抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、配列番号４０（表５）に記載される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み得る。抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、配列番号３３（表４）に記載される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一の配列を含む核酸によってコードされ得る。

【0051】

特定の実施例では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、配列番号４０（表５）のアミノ酸配列を含むＣＴＸ－１６６ｂである。

【0052】

本明細書に記載される方法は、ＣＡＲを発現する遺伝子改変Ｔ細胞、例えば、当技術分野において公知の、又は本明細書で開示される遺伝子改変Ｔ細胞を生成するために使用することができる、２つ以上の好適なＣＡＲを包含するということが理解されよう。実施例は、本明細書で言及される目的及び主題のためにその各々の関連する開示が参照により組み込まれる国際公開第２０１９／０９７３０５号パンフレット及び国際公開第２０１９／２１５５００号パンフレットに見出すことができる。

【0053】

抗ＢＣＭＡ ＣＡＲのいずれか（例えば、ＣＴＸ－１６６ｂ）の発現は、組み込み部位の内在性プロモーターによって誘発することができる。代わりに、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲの発現は、外来性プロモーターによって誘発することができる。例えば、外来性ＥＦ１αプロモーター（例えば、配列番号３８のヌクレオチド配列を含む；表４を参照されたい）が、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードする核酸配列の上流に直接位置してもよい。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現カセットは、外来性エンハンサー、インスレーター、配列内リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列、３’ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル、又はこれらの組み合わせを更に含み得る。特定の実施例では、３’ポリＡシグナルは、配列番号３９（表４）に記載されるヌクレオチド配列を含む。

【0054】

（ｉｉ）ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ内在性遺伝子の遺伝子改変
抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＧｖＨＤに関連する内在性遺伝子（例えば、ＴＲＡＣ遺伝子などのＴＣＲ構成要素をコードする遺伝子）、ＨｖＧＤに関連する内在性遺伝子（例えば、β２Ｍ遺伝子）を破壊するように、更に遺伝子改変してもよい。

【0055】

遺伝子破壊は、遺伝子編集（例えば、１つ以上のヌクレオチドを挿入又は欠失させるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集を使用する）を介した遺伝子改変を包含することが理解されよう。本明細書で使用する場合、「破壊された遺伝子」という用語は、コードされている遺伝子産物の活性を実質的に減少させるか又は完全に排除するように、野生型の対応物に対して１つ以上の変異（例えば、挿入、欠失、又はヌクレオチド置換など）を含む遺伝子を指す。１つ以上の変異が、非コード領域、例えば、プロモーター領域、転写若しくは翻訳を調節する調節領域、又はイントロン領域に位置し得る。代わりに、１つ以上の変異が、コード領域に（例えば、エクソンに）位置し得る。場合により、破壊された遺伝子は、コード化タンパク質を発現しないか、又は実質的に減少したレベルのコード化タンパク質を発現する。他の場合、破壊された遺伝子は、変異形態でコード化タンパク質を発現し、そのいずれもが機能しないか、又は活性が実質的に減少している。いくつかの実施形態では、破壊された遺伝子は、機能性タンパク質をコードしない遺伝子である。いくつかの実施形態では、破壊された遺伝子を含む細胞は、遺伝子によってコードされる、（例えば抗体によって、例えばフローサイトメトリーによって）検出可能なレベルのタンパク質を（例えば、細胞表面に）発現しない。検出可能なレベルのタンパク質を発現しない細胞は、ノックアウト細胞と称し得る。例えば、β２Ｍ遺伝子編集を有する細胞が、β２Ｍタンパク質に特異的に結合する抗体によって細胞表面でβ２Ｍタンパク質を検出することができない場合、β２Ｍノックアウト細胞と見なされ得る。

【0056】

破壊されたＴＲＡＣ遺伝子
ＧｖＨＤは、同種幹細胞移植（ＳＣＴ）の場面で一般的に見られるものである。免疫適格性のドナーのＴ細胞（移植片）は、レシピエント（宿主）を異物として認識し、「外来抗原を保持する」宿主細胞を排除するために、活性化してレシピエントを攻撃する。臨床的には、ＧｖＨＤは、臨床症状と、同種ドナー細胞の投与に対する発症時期とに基づいて、急性、慢性、及びオーバーラップ症候群に分類される。急性ＧｖＨＤ（ａＧｖＨＤ）の症状としては、斑状丘疹状皮疹；小胆管の損傷に起因して胆汁鬱滞をもたらす黄疸を伴う高ビリルビン血症；悪心、嘔吐、及び食欲不振；並びに水様性又は出血性の下痢、及び痙性腹痛が挙げられ得る（Ｚｅｉｓｅｒ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７７：２１６７－７９）。ａＧｖＨＤの重篤度は臨床症状に基づいており、例えば、表１１で定義されるような広く受け入れられている等級パラメータを用いて当業者によって容易に評価される。

【0057】

いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞をレシピエントに投与したときに、ＧｖＨＤのリスクを減少させるか、又はＧｖＨＤを排除するために、ＧｖＨＤに関連する破壊された内在性遺伝子、例えば内在性ＴＲＡＣ遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、欠失、ヌクレオチド残基の置換、挿入、又はこれらの組み合わせを含み得る。破壊されたＴＲＡＣ遺伝子の構造は、内在性ＴＲＡＣ遺伝子を破壊するのに用いられる遺伝子編集方法に依存する。例えば、ＴＲＡＣ遺伝子は、好適なガイドＲＮＡ（例えば、本明細書で開示されるガイドＲＮＡ。下記の表１及び実施例１を参照されたい）を用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによって破壊され得る。このような遺伝子編集手法により、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に標的化される遺伝子座の近傍に欠失、挿入、及び／又はヌクレオチド置換が生じ得る。

【0058】

いくつかの実施形態では、遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、挿入及び／又は欠失を含む、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子を含む。いくつかの実施例では、挿入及び／又は欠失がエクソン１内にある。特定の実施例では、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号１０を含むフラグメントの欠失を有する。いくつかの実施例では、配列番号１０を含むフラグメントは、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードする核酸、例えば、配列番号３０によって置換され得る。代わりに又は加えて、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸の挿入を含み得る。いくつかの実施例では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードする配列は、左側の相同性アームと右側の相同性アームとに挟まれていてもよく、これらの相同性アームは、Ｔ細胞のＴＲＡＣ遺伝子を破壊するのに用いられる遺伝子編集方法によって標的化される領域に隣接する相同配列を含む。場合によっては、左側の相同性アーム及び右側の相同性アームはそれぞれ、相同組み換えによって、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードする核酸が、破壊されたＴＲＡＣ座位に挿入されるように、配列番号１０の領域の近傍の５’末端及び３’末端部位に相同な配列を含む。特定の実施例では、配列番号３３のヌクレオチド配列を含む外来核酸（配列番号４０のアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードする）を、ＴＲＡＣ遺伝子に、例えば、配列番号１０の領域又はその近傍に挿入することができる。外来核酸は、本明細書で開示されるような遺伝子改変Ｔ細胞に抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現を誘導するために、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲのコード配列に動作可能に連結されたプロモーターを更に含み得る。いくつかの実施例では、プロモーターは、ＥＦ－１ａプロモーターであってよく、配列番号３８のヌクレオチド配列を含み得る。代わりに又は加えて、外来核酸は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲコード配列の下流にポリＡ配列を更に含み得る。

【0059】

破壊されたＢ２Ｍ遺伝子
ＨｖＧＤとは、レシピエントの免疫系による、ドナー細胞、例えば腫瘍標的化ＣＡＲ Ｔ細胞の免疫拒絶を指す。腫瘍標的化ＣＡＲ Ｔ細胞療法による腫瘍再発のリスクは、一部には、投与後の対象におけるＣＡＲ Ｔ細胞の存続性が限定的であることに起因すると考えられている（Ｍａｕｄｅ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３７１：１５０７－１７；Ｔｕｒｔｌｅ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１２６：２１２３－３８）。移植前にＣＡＲ Ｔ細胞から同種抗原を除去することで、宿主拒絶（例えば、ＨｖＧ反応）のリスクを排除するか又は減少させ、それにより投与後の持続性を増大させることができる。

【0060】

いくつかの実施形態では、遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＨｖＧＤに関連する遺伝子における遺伝子破壊を単独で、又はＧｖＨＤに関連する遺伝子（例えば、本明細書で開示されるＴＲＡＣ遺伝子）の破壊と組み合わせて含み得る。いくつかの実施形態では、ＨｖＧＤに関連する遺伝子は、主要組織適合（ＭＨＣ）クラスＩ分子の成分、例えば、β２Ｍ遺伝子をコードする。ＨｖＧＤに関連する遺伝子の破壊、例えばβ２Ｍ遺伝子の破壊によってＨｖＧＤのリスクが最小限に抑えられる。代わりに又は加えて、β２Ｍ遺伝子の破壊によってＣＡＲ Ｔ細胞の持続性が改善される。

【0061】

いくつかの実施形態では、遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、欠失、挿入、ヌクレオチド残基の置換、又はこれらの組み合わせであり得る遺伝子改変を含む、破壊されたβ２Ｍ遺伝子を単独で、又は破壊されたＴＲＡＣ遺伝子と組み合わせて含む。破壊されたβ２Ｍ遺伝子の構造は、内在性β２Ｍ遺伝子を破壊するのに用いられる遺伝子編集方法に依存する。例えば、β２Ｍ遺伝子は、好適なガイドＲＮＡ（例えば、本明細書で開示されるガイドＲＮＡ。下記の表１及び実施例１を参照されたい）を用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによって破壊され得る。このような遺伝子編集手法により、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に標的化される遺伝子座の近傍に欠失、挿入、及び／又はヌクレオチド置換が生じ得る。

【0062】

いくつかの実施例では、破壊されたβ２Ｍ遺伝子は、配列番号１２（表１）に欠失、挿入、置換、又はこれらの組み合わせを含む。実施例では、破壊されたβ２Ｍ遺伝子は、配列番号２１～２６（表３）のいずれか１つの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。

【0063】

（ｉｉｉ）抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団
本開示はまた、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現し、破壊された内在性ＴＲＡＣ遺伝子、内在性β２Ｍ遺伝子、又はその両方を有する、本明細書で開示される遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団を提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団は異種であり、即ち、本明細書で開示されるような異なる組み合わせの遺伝子改変（即ち、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲの発現、破壊された内在性ＴＲＡＣ遺伝子、及び破壊された内在性β２Ｍ遺伝子）を有する遺伝子改変Ｔ細胞を含む。例えば、遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、本明細書で開示されるように抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現し、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子を有するＴ細胞の第１の群と、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ及び破壊されたβ２Ｍ遺伝子を発現するＴ細胞の第２の群とを含み得る。Ｔ細胞の第１の群及び第２の群は重複していてもよい。いくつかの実施例では、本明細書で開示されるＴ細胞集団の一部は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲの発現、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、及び破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む、３つの全ての遺伝子改変を含む。

【0064】

いくつかの実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞の集団の一部は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現し、挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを含み得る、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子の破壊によって、遺伝子改変Ｔ細胞におけるＴＣＲの発現を排除するか、又は減少させる。いくつかの実施例では、Ｔ細胞の５０％以下、例えば、４５％以下、４０％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、０．９％以下、０．８％以下、０．７％以下、０．６％以下、０．５％以下、０．４％以下、０．３％以下、０．２％以下、又は０．１％以下が、ＴＣＲを発現する（ＴＣＲ^＋）。いくつかの実施例では、遺伝子改変Ｔ細胞の０．０５％～５０％の遺伝子改変Ｔ細胞がＴＣＲを発現し、例えば、１０％～５０％、２０％～５０％、３０％～５０％、４０％～５０％、０．０５％～４０％、１０％～４０％、２０％～４０％、３０％～４０％、０．０５％～３０％、１０％～３０％、２０％～３０％、０．０５％～２０％、１０％～２０％、又は０．０５％～１０％が、ＴＣＲを発現する。いくつかの実施例では、遺伝子改変Ｔ細胞の０．４％以下が、ＴＣＲを発現する。

【0065】

いくつかの実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、対象にＧＶＨＤ反応の臨床症状を誘発しない。例えば、遺伝子改変Ｔ細胞は、対象にａＧｖＨＤ（例えば、ステロイド難治性ａＧｖＨＤ）の臨床症状を誘発しない。いくつかの実施例では、遺伝子改変Ｔ細胞は、対象に臨床的に重大な（例えば、グレード２～４の）ａＧｖＨＤを誘発しない。いくつかの実施例では、遺伝子改変Ｔ細胞は、対象に軽度なａＧｖＨＤ反応（例えば、臨床グレード２、１、又は０未満）しか誘発しない。いくつかの実施例では、遺伝子改変Ｔ細胞は、臨床的に重大な（例えば、グレード２～４の）ａＧｖＨＤ（例えば、ステロイド難治性ａＧｖＨＤ）を、対象の１８％未満、例えば、１６％未満、１４％未満、１２％未満、１０％未満、８％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、又は１％未満に誘発する。

【0066】

いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるような遺伝子改変Ｔ細胞の集団によって誘導されるＧｖＨＤ（例えば、臨床的に重大なａＧｖＨＤ）のリスクは、Ｔ細胞の少なくとも５０％、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％がＴＣＲを発現するＴ細胞集団と比較して減少する。いくつかの実施例では、臨床的に重大なａＧｖＨＤ（例えば、グレード２～４）の減少は、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％である。

【0067】

いくつかの実施形態では、ａＧｖＨＤの症状は、本明細書で開示される遺伝子改変Ｔ細胞の集団を投与した後に、最大で３６日間、例えば、最大で２１日間、最大で２４日間、最大で２８日間、最大で３０日間、又は最大で３５日間観察される。いくつかの実施例では、ａＧｖＨＤの症状は、Ｔ細胞集団を投与した後に、約２０～約５０日間、約２５～約７０日間、又は約２８～約１００日間観察される。

【0068】

代わりに又は加えて、遺伝子改変Ｔ細胞の一部は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現し、挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを含み得る、破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、β２Ｍ遺伝子の破壊によってβ２ミクログロブリンの発現が排除されるか又は減少し、ＭＨＣ Ｉ複合体の機能の喪失がもたらされる。いくつかの実施例では、遺伝子改変Ｔ細胞集団の５０％以下、例えば、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、又は５％以下が、β２ミクログロブリンを発現する。いくつかの実施例では、Ｔ細胞集団内の遺伝子改変Ｔ細胞の約５％～約５０％、例えば、約１０％～５０％、１０％～４５％、１５％～４５％、１５％～４０％、２０％～４０％、２０％～３５％、又は２５％～３５％が、β２ミクログロブリンを発現する。いくつかの実施例では、遺伝子改変Ｔ細胞の３０％以下が、β２ミクログロブリンを発現する。

【0069】

いくつかの実施形態では、ＨｖＧに関連する遺伝子（例えば、β２Ｍ遺伝子）の遺伝子破壊によって、ＨｖＧＤ反応のリスクが排除されるか又は減少する。代わりに又は加えて、ＨｖＧＤに関連する遺伝子（例えば、β２Ｍ遺伝子）の遺伝子破壊によって、対象の同種Ｔ細胞の持続性が増大する。いくつかの実施例では、本明細書で開示される遺伝子改変Ｔ細胞集団を受けた対象は、ＨｖＧＤ反応の臨床症状がない。いくつかの実施例では、遺伝子改変Ｔ細胞は、投与して少なくとも１日後、例えば、少なくとも２、４、５、７、１０、１４、１５、２０、２１、２５、２８、３０、又は３５日後に対象の組織（例えば、末梢血中）で検出可能となる。組織は、末梢血、脳脊髄液、腫瘍、皮膚、骨、骨髄、乳房、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、脾臓、胃腸管、扁桃腺、胸腺、前立腺、又はこれらの組み合わせから得られ得る。

【0070】

検出可能性は、分析方法の検出限界の観点から定義される。持続性は、検出可能な量の同種Ｔ細胞が測定される、投与後の期間である。目的の組織内のＴ細胞を検出又は定量化するための方法は、当業者に公知である。このような方法としては、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、競合的ＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護アッセイ（ＲＰＡ）、定量的免疫蛍光法（ＱＩＦ）、フローサイトメトリー、ノーザンブロット法、ＤＮＡを用いた核酸マイクロアレイ、ウエスタンブロット法、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、組織免疫染色法、免疫沈降アッセイ、補体結合アッセイ、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）、質量分析法、電磁ビーズ－抗体免疫沈降法、又はタンパク質チップが挙げられるが、これらに限定されない。

【0071】

特定の実施例では、遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団は、ＣＴＸ１２０細胞であり（下記の実施例１も参照されたい）、標的遺伝子（ＴＲＡＣ及びβ２Ｍ）を破壊するためのＣＲＩＳＰＲ技術、及び配列番号４０のＣＡＲ構築物を送達するためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）形質導入を用いて生成される。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介遺伝子編集には、２つのガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）：ＴＲＡＣ座位を標的化するＴＡ－１ ｓｇＲＮＡ（配列番号１）と、β２Ｍ座位を標的化するＢ２Ｍ－１ ｓｇＲＮＡ（配列番号５）とが関与する。ＣＴＸ１２０細胞の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、ＢＣＭＡに特異的な抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）、続いてＣＤ８ヒンジ、並びに４－１ＢＢの細胞内共シグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに融合した膜貫通ドメインで構成されている。抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖは、配列番号４１のアミノ酸配列を含み、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。抗ＢＣＭＡ ＣＡＲの他の構成要素の配列を下記の表４及び５に示す。

【0072】

ＣＴＸ１２０細胞の少なくとも一部は、配列番号１０のフラグメントが欠失した、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子を有する、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現するＴ細胞を含む。抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現するように構成された外来核酸を、ＴＲＡＣ遺伝子に挿入してもよい。外来核酸は、プロモーター配列（例えば、配列番号３８のヌクレオチド配列を含み得るＥＦ－１ａプロモーター）、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号４０のアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードする配列番号３３）、及びコード配列の下流のポリＡ配列（例えば、配列番号３９）を含む。プロモーター配列は、ＣＴＸ１２０細胞に抗ＢＣＭＡ ＣＡＲの発現を誘導するように、コード配列と動作可能に連結されている。ＣＴＸ１２０細胞の少なくとも一部は、配列番号２１～２６のヌクレオチド配列の１つ以上を含み得る、破壊されたβ２Ｍ遺伝子の集団を集合的に含む。図１及び下記の実施例１も参照されたい。

【0073】

更に、ＣＴＸ１２０細胞集団内のＴ細胞の少なくとも３０％が、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ（ＣＡＲ^＋細胞）を発現する。いくつかの実施例では、ＣＴＸ１２０細胞集団内のＴ細胞の約４０％～約８０％（例えば、約４０％～７５％、約４５％～７５％、約５０％～７０％、又は約５０％～６０％）が、ＣＡＲ^＋である。加えて、ＣＴＸ１２０細胞集団内のＴ細胞の３５％未満（例えば、≦３０％）が、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現する。例えば、ＣＴＸ１２０細胞集団内のＴ細胞の約７０％～約８５％が、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現しない。更に、ＣＴＸ１２０細胞集団内のＴ細胞の約１％未満（例えば、約０．８％未満、０．５％未満、又は４％未満）が、機能的ＴＣＲを発現する。

【0074】

少なくとも一部（例えば、少なくとも３５％）のＣＴＸ１２０ Ｔ細胞は、三重改変ＣＡＲ Ｔ細胞であり、例えば、上記に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９手法及びＣＡＲ構築物のＡＡＶ媒介送達によって生成される、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現し、且つ破壊された内在性ＴＲＡＣ遺伝子及び内在性β２Ｍ遺伝子を有する遺伝子改変Ｔ細胞を指す。いくつかの実施例では、ＣＴＸ１２０細胞集団内のＴ細胞の約３５％～約７０％（例えば、約４０％～約７０％又は約５０％～約６５％）が、三重改変ＣＡＲ Ｔ細胞である。

【0075】

（ｉｖ）医薬組成物
いくつかの態様では、本開示は、本明細書で開示されるような遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のいずれか、例えば、ＣＴＸ１２０細胞を含む医薬組成物、及び薬学的に許容されるキャリアを提供する。このような医薬組成物はヒト患者の癌治療に使用することができ、これも本明細書で開示される。

【0076】

本明細書で使用する場合、「薬学的に許容可能な」という用語は、妥当なリスク／ベネフィット比に見合った、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症を伴わない、対象の組織、臓器、及び／又は体液と接触させて使用するのに好適な、健全な医学的判断の範囲内にある化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を指す。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容されるキャリア」という用語は、生理学的に適合性のある溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤、抗カビ剤、等張剤及び吸収遅延剤などを指す。組成物としては、薬学的に許容される塩、例えば、酸付加塩又は塩基付加塩を挙げることができる。例えば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，（１９７７）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ６６：１－１９を参照されたい。

【0077】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される塩を更に含む。薬学的に許容される塩の非限定的な例としては、酸付加塩が挙げられる（無機酸（例えば、塩酸若しくはリン酸）、又は酢酸、酒石酸、マンデル酸などといった有機酸を含むポリペプチドの遊離アミノ基から形成される）。いくつかの実施形態では、遊離カルボキシル基で形成される塩は、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、若しくは水酸化第二鉄）、又は有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導される。

【0078】

いくつかの実施形態では、本明細書で開示される医薬組成物は、凍結保存溶液（例えば、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）Ｃ５５）中に懸濁させた遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１２０細胞）の集団を含む。場合によっては、凍結保存溶液は、約２～１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有し得る。例えば、凍結保存溶液は、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、又は約１０％のＤＭＳＯを含有し得る。特定の実施例では、凍結保存溶液は、約５％のＤＭＳＯを含有し得る。

【0079】

ＤＭＳＯに加えて、本開示に使用するための凍結保存溶液は、アデノシン、デキストロース、デキストラン４０、ラクトビオン酸、スクロース、マンニトール、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）などの緩衝剤、１種以上の塩（例えば、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、重炭酸カリウム、リン酸カリウムなど）、１種以上の塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなど）、又はこれらの組み合わせも含み得る。凍結保存溶液の成分を、滅菌水（注射品質）に溶解させてもよい。凍結保存溶液は、いずれも血清を実質的に含まない（常法では検出できない）ものであり得る。

【0080】

場合によっては、凍結保存溶液（例えば、約５％のＤＭＳＯを含み、任意選択により血清を実質的に含まない）中に懸濁させた、ＣＴＸ１２０細胞などの遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団を含む医薬組成物を、保存バイアルに入れてもよい。いくつかの実施例では、各保存バイアルは、約２５～８５×１０^６細胞／ｍｌのＴ細胞（例えば、ＣＴＸ１２０）を含有し得る。いくつかの実施例では、各保存バイアルは、約５０×１０^６細胞／ｍｌを含有し得る。保存バイアル内の細胞中、≧３０％がＣＡＲ^＋Ｔ細胞であり、≦０．４％がＴＣＲ^＋Ｔ細胞であり、≦３０％がＢ２Ｍ^＋Ｔ細胞である。

【0081】

凍結保存溶液（例えば、約５％のＤＭＳＯを含み、任意選択により血清を実質的に含まない）中に任意選択により懸濁され得る、本明細書で更に開示されるような遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１２０細胞）の集団を含む、本明細書で開示される医薬組成物はいずれも、将来使用するために、Ｔ細胞の生存及び生理活性に実質的に影響を及ぼさない環境で、例えば、細胞及び組織を保存するのに一般的に適用される条件下で保存され得る。いくつかの実施例では、医薬組成物は、≦－１３５℃の気相の液体窒素中で保存され得る。細胞をしばらくの間このような条件下で保存した後に、外観、細胞数、生存率、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の割合、ＴＣＲ^＋Ｔ細胞の割合、及びＢ２Ｍ^＋Ｔ細胞の割合に関する著しい変化は観察されなかった。

【0082】

ＩＩ．遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製
本明細書で開示される遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を作製するために、当技術分野において公知の任意の好適な遺伝子編集方法、例えば、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又はＲＮＡ誘導型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９；クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート関連９）を使用したヌクレアーゼ依存性標的化編集を使用することができる。

【0083】

（ａ）Ｔ細胞の供給源
いくつかの実施形態では、遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、１人以上のドナーから単離した一次Ｔ細胞を使用して作製され得る。例えば、一次Ｔ細胞は、１つ以上の健康なヒトドナーの好適な組織、例えば、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、又はこれらの組み合わせから単離され得る。いくつかの実施形態では、ＴＣＲαβ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７ ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１２２、ＣＤ９５、ＣＤ１９７、ＣＣＲ７、ＫＬＲＧ１、ＭＨＣ－Ｉタンパク質、ＭＨＣ－ＩＩタンパク質、又はこれらの組み合わせを発現する一次Ｔ細胞の亜集団は、当技術分野において公知の正の選択又は負の選択の技法を用いて更に濃縮され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞亜集団は、ＴＣＲαβ、ＣＤ４、ＣＤ８、又はこれらの組み合わせを発現する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞亜集団は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、又はこれらの組み合わせを発現する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される遺伝子編集を行うのに使用するための一次Ｔ細胞は、少なくとも４０％、少なくとも５０％、又は少なくとも６０％のＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＯ－Ｔ細胞を含み得る。

【0084】

いくつかの実施形態では、遺伝子改変ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、一次Ｔ細胞供給源に由来するＴ細胞のいずれか）を作製するのに使用するための親Ｔ細胞は、１回以上の刺激、活性化、増殖、又はこれらの組み合わせを受けてもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子編集の前にインビトロで増殖させるために、親Ｔ細胞を活性化及び刺激する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞を、遺伝子編集の前後に活性化、増殖、又はその両方が行われる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞を、ゲノム編集と同時に活性化及び増殖させる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞を、約１～４日間、例えば、約１～３日間、約１～２日間、約２～３日間、約２～４日間、約３～４日間、約１日間、約２日間、約３日間、又は約４日間で活性化及び増殖させる。いくつかの実施形態では、同種Ｔ細胞を、約４時間、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約６０時間、又は約７２時間で活性化及び増殖させる。Ｔ細胞を活性化及び／又は増殖させるための方法の非限定的な例は、米国特許第６，３５２，６９４号明細書；同第６，５３４，０５５号明細書；同第６，９０５，６８０号明細書；同第６，６９２，９６４号明細書；同第５，８５８，３５８号明細書；同第６，８８７，４６６号明細書；同第６，９０５，６８１号明細書；同第７，１４４，５７５号明細書；同第７，０６７，３１８号明細書；同第７，１７２，８６９号明細書；同第７，２３２，５６６号明細書；同第７，１７５，８４３号明細書；同第５，８８３，２２３号明細書；同第６，９０５，８７４号明細書；同第６，７９７，５１４号明細書；及び同第６，８６７，０４１号明細書に記載されている。

【0085】

（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介遺伝子編集システム
本明細書で開示される遺伝子編集事象を導入するために、即ち、内在性ＴＲＡＣ遺伝子を破壊し、内在性β２Ｍ遺伝子を破壊し、及び／又は本明細書で開示されるような抗ＢＣＭＡ ＣＡＲのいずれかをコードする核酸を導入するために、親Ｔ細胞のいずれかを１つ以上の遺伝子編集／改変工程に供し得る。遺伝子編集手法（例えば、本明細書で開示されるもの）などの、従来の遺伝子改変手法を使用してもよい。いくつかの実施例では、Ｔ細胞の遺伝子改変は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介遺伝子編集システムによって実施することができる。

【0086】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、遺伝子編集に使用されるＲＮＡ誘導型ＤＮＡ標的化プラットフォームとして転用されている、原核生物に天然に存在する防御機構である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、ＤＮＡヌクレアーゼであるＣａｓ９と、２つの非コードＲＮＡであるｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とに依拠するものであり、ＤＮＡを切断することを目的としている。ＣＲＩＳＰＲは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートの略称であり、例えば原核生物を感染又は攻撃したウイルスによってこれまでに細胞に暴露された外来ＤＮＡと類似性を有するＤＮＡのフラグメント（スペーサーＤＮＡ）を含有する、細菌及び古細菌のゲノムに見られるＤＮＡ配列のファミリーである。例えば、その後の攻撃時に類似したウイルスが再導入すると、原核生物によってこれらのＤＮＡのフラグメントが用いられ、類似した外来ＤＮＡを検出及び破壊する。ＣＲＩＳＰＲ座位の転写によってスペーサー配列を含むＲＮＡ分子の形成がもたらされるが、このＲＮＡ分子は、異物の外来性ＤＮＡを認識して切断することができるＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質と結合し、標的となる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの多数の種類及びクラスが記載されている（例えば、Ｋｏｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３７：６７－７８を参照されたい）。

【0087】

ｃｒＲＮＡは、典型的には、標的ＤＮＡ内の２０個のヌクレオチド（ｎｔ）配列とワトソン－クリック塩基対を形成することによって、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体の配列認識及び特異性を促進する。ｃｒＲＮＡ内の５’ ２０ｎｔの配列を変更することにより、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体を特定の遺伝子座に標的化することが可能になる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体は、標的配列がプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称する特定の短いＤＮＡモチーフ（配列ＮＧＧを有する）の後にある場合、ｃｒＲＮＡの最初の２０ｎｔと一致する配列を含むＤＮＡ配列のみに結合する。

【0088】

ＴｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの３’末端とハイブリダイズしてＲＮＡ二重鎖構造を形成し、これにＣａｓ９エンドヌクレアーゼが結合して触媒活性のあるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体が形成され、続いてこのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体によって標的ＤＮＡを切断することができる。

【0089】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体が標的部位でＤＮＡに結合すると、Ｃａｓ９酵素内の２つの独立したヌクレアーゼドメインが、それぞれＰＡＭ部位の上流でＤＮＡ鎖の一方を切断し、ＤＮＡの両鎖が塩基対で終端する（平滑末端）二本鎖切断（ＤＳＢ）を残す。

【0090】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体が特定の標的部位でＤＮＡに結合し、部位特異的なＤＳＢが形成された後、次の重要な工程は、ＤＳＢの修復である。細胞は、ＤＳＢを修復するために、２つの主要なＤＮＡ修復経路、非相同末端連結（ＮＨＥＪ）及び相同組み換え修復（ＨＤＲ）を使用する。

【0091】

ＮＨＥＪは、非分裂細胞を含む大部分の細胞型において高度に活性であるように見える頑健な修復機構である。ＮＨＥＪは、誤りがちであり、多くの場合、ＤＳＢの部位で１～数百個のヌクレオチドの除去又は付加が生じる可能性があるが、このような改変は、典型的には＜２０ｎｔである。結果として生じた挿入及び欠失（インデル）は、遺伝子のコード領域又は非コード領域を破壊する可能性がある。代わりに、ＨＤＲでは、内在的又は外来的に提供される長い一続きの相同性ドナーＤＮＡを使用して、高い忠実度でＤＳＢを修復する。ＨＤＲは、分裂細胞においてのみ活性であり、大部分の細胞型においては相対的に低い頻度で生じる。本開示の多くの実施形態では、修復オペラントとしてＮＨＥＪを利用する。

【0092】

（ａ）Ｃａｓ９
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）エンドヌクレアーゼは、本明細書に開示されるような遺伝子改変Ｔ細胞を製作するために、ＣＲＩＳＰＲ法で使用される。Ｃａｓ９酵素は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するものであり得るが、他のＣａｓ９相同体も使用することができる。本明細書で提供されるように、野生型Ｃａｓ９を使用してもよく、又はＣａｓ９の改変バージョン（例えば、Ｃａｓ９の発展バージョン、又はＣａｓ９オルソログ若しくは変異体）を使用してもよいことが理解されよう。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｃ末端及びＮ末端にＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔ抗原の核局在配列（ＮＬＳ）を含むように改変されているストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質を含む。得られたＣａｓ９ヌクレアーゼ（ｓＮＬＳ－ｓｐＣａｓ９－ｓＮＬＳ）は、組み換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の発酵によって生成され、クロマトグラフィーによって精製された１６２ｋＤａのタンパク質である。ｓｐＣａｓ９のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｑ９９ＺＷ２として見出すことができ、本明細書では配列番号６１として示される。

【0093】

Ｃａｓ９ヌクレアーゼのアミノ酸配列（配列番号６１）：

【化1】

【0094】

（ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
本明細書で記載されるようなＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介遺伝子編集は、ガイドＲＮＡ、即ちｇＲＮＡを使用することを含む。本明細書で使用する場合、「ｇＲＮＡ」とは、特定の標的配列で遺伝子を編集するために、Ｃａｓ９をＴＲＡＣ遺伝子又はβ２Ｍ遺伝子内の特定の標的配列に誘導することができるゲノム標的化核酸を指す。ガイドＲＮＡは、編集のために標的遺伝子内の標的核酸配列とＣＲＩＳＰＲ反復配列とにハイブリダイズする少なくとも１つのスペーサー配列を含む。

【0095】

ＴＲＡＣ遺伝子を標的化する例示的なｇＲＮＡは、配列番号１～４のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含み得る。本明細書で言及される主題及び目的のためにその関連する開示が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１９／０９７３０５Ａ２号パンフレットを参照されたい。他のｇＲＮＡ配列は、１４番染色体上に位置するＴＲＡＣ遺伝子配列を使用して設計され得る（ＧＲＣｈ３８：１４番染色体：２２，５４７，５０６～２２，５５２，１５４；Ｅｎｓｅｍｂｌ；ＥＮＳＧ０００００２７７７３４）。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣゲノム領域を標的化するｇＲＮＡ及びＣａｓ９は、ＴＲＡＣゲノム領域に切断を生じさせてＴＲＡＣ遺伝子にインデルをもたらし、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を阻害する。

【0096】

β２Ｍ遺伝子を標的化する例示的なｇＲＮＡは、配列番号５～８のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含み得る。本明細書で言及される目的及び主題のためにその関連する開示が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１９／０９７３０５Ａ２号パンフレットも参照されたい。他のｇＲＮＡ配列は、１５番染色体上に位置するβ２Ｍ遺伝子配列を使用して設計され得る（ＧＲＣｈ３８の座標：１５番染色体：４４，７１１，４７７～４４，７１８，８７７；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１６６７１０）。いくつかの実施形態では、β２Ｍゲノム領域を標的化するｇＲＮＡ及びＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、β２Ｍゲノム領域に切断を生じさせてβ２Ｍ遺伝子にインデルをもたらし、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を阻害する。

【0097】

ＩＩ型システムでは、ｇＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡも含む。ＩＩ型のｇＲＮＡでは、ＣＲＩＳＰＲ反復配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列が互いにハイブリダイズして二重鎖を形成する。Ｖ型のｇＲＮＡでは、ｃｒＲＮＡが二重鎖を形成する。両方のシステムにおいて、二重鎖は部位特異的ポリペプチドに結合し、その結果ガイドＲＮＡと部位特異的ポリペプチドとが複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、その部位特異的ポリペプチドとの会合により、複合体に標的特異性をもたらす。従って、ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドの活性を誘導する。

【0098】

当業者に理解されるように、各ガイドＲＮＡは、そのゲノム標的配列に相補的なスペーサー配列を含むように設計される。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７，８１６－８２１（２０１２）及びＤｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４７１，６０２－６０７（２０１１）を参照されたい。

【0099】

いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸（例えば、ｇＲＮＡ）は、二重分子ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸（例えば、ｇＲＮＡ）は、単一分子ガイドＲＮＡである。

【0100】

二重分子ガイドＲＮＡは、２つの鎖のＲＮＡ分子を含む。第１の鎖は、５’から３’の方向に、任意選択のスペーサー延長配列、スペーサー配列及び最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列を含む。第２の鎖は、（最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列に相補的な）最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列を含む。

【0101】

ＩＩ型システムにおける単一分子ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」と称する）は、５’から３’方向に、任意選択のスペーサー延長配列、スペーサー配列、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列、単一分子ガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列を含む。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長部は、ガイドＲＮＡに更なる機能性（例えば、安定性）を付与するエレメントを含み得る。単一分子ガイドリンカーは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列と最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とを連結して、ヘアピン構造を形成する。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長部は、１つ以上のヘアピンを含む。Ｖ型システムにおける単一分子ガイドＲＮＡは、５’から３’方向に、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列及びスペーサー配列を含む。

【0102】

「標的配列」とは、ＰＡＭ配列に隣接している標的遺伝子のことであり、Ｃａｓ９によって改変される配列のことである。「標的配列」は、ＰＡＭ鎖及び相補的な非ＰＡＭ鎖を含有する二本鎖分子である「標的核酸」内のいわゆるＰＡＭ鎖上にある。当業者は、ｇＲＮＡスペーサー配列が、目的の標的核酸の非ＰＡＭ鎖に位置する相補的配列にハイブリダイズすることを認識している。そのため、ｇＲＮＡスペーサー配列は、標的配列のＲＮＡ均等物である。

【0103】

例えば、ＴＲＡＣ標的配列が５’－ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ－３’（配列番号１０）である場合、ｇＲＮＡスペーサー配列は、５’－ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＵＧＣＵＧＵＧＧＣＣ－３’（配列番号４）である。なお別の例では、β２Ｍ標的配列が５’－ＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣ－３’（配列番号１２）である場合、ｇＲＮＡスペーサー配列は、５’－ＧＣＵＡＣＵＣＵＣＵＣＵＵＵＣＵＧＧＣＣ－３’である（配列番号８）。ｇＲＮＡのスペーサーは、ハイブリダイゼーション（即ち塩基対形成）を介して配列特異的な様式で目的の標的核酸と相互作用する。そのため、スペーサーのヌクレオチド配列は、目的の標的核酸の標的配列に応じて変化する。

【0104】

本明細書のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、スペーサー配列は、このシステムで使用されるＣａｓ９酵素によって認識可能なＰＡＭの５’に位置する標的核酸の領域にハイブリダイズするように設計されている。スペーサーは、標的配列と完全に一致し得るか、又はミスマッチを有し得る。各Ｃａｓ９酵素は、標的ＤＮＡ内で認識される特定のＰＡＭ配列を有する。例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）は、標的核酸において、配列５’－ＮＲＧ－３’（ここで、Ｒは、Ａ又はＧのいずれかを含み、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｎは、スペーサー配列により標的化される標的核酸配列の３’の直近にある）を含むＰＡＭを認識する。

【0105】

いくつかの実施形態では、標的核酸配列は、２０個の長さのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、２０個未満の長さのヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、２０個超の長さのヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０個又はそれ以上の長さのヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、最大で５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０個又はそれ以上の長さのヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸配列は、ＰＡＭの最初のヌクレオチドの５’の直近に２０個の塩基を有する。例えば、

【化2】

を含む配列では、標的核酸は、Ｎ（ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドであってよく、下線が引かれたＮＲＧ配列は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＰＡＭである）に対応する配列であってよい。

【0106】

ｇＲＮＡ内のスペーサー配列は、目的の標的遺伝子の標的配列（例えば、ゲノム標的配列などのＤＮＡ標的配列）を画定する配列（例えば、２０個のヌクレオチド配列）である。ＴＲＡＣ遺伝子を標的化する例示的なｇＲＮＡのスペーサー配列を、配列番号４に示す。β２Ｍ遺伝子を標的化する例示的なｇＲＮＡのスペーサー配列を、配列番号８に示す。

【0107】

本明細書で開示されるガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ内のスペーサー配列によって目的の任意の配列を標的化し得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー配列と標的遺伝子内の標的配列との間の相補性の程度は、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％であり得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー配列及び標的遺伝子内の標的配列は、１００％相補的である。他の実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー配列と標的遺伝子内の標的配列は、最大で１０個のミスマッチ、例えば最大で９個、最大で８個、最大で７個、最大で６個、最大で５個、最大で４個、最大で３個、最大で２個又は最大で１個のミスマッチを含み得る。

【0108】

本明細書で提供されるように使用され得るｇＲＮＡの非限定的な例は、本明細書で言及される目的及び主題のために先行出願の各々の関連する開示が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１９／０９７３０５Ａ２号パンフレット、及び国際公開第２０１９／２１５５００号パンフレットに示されている。本明細書で提供されるｇＲＮＡ配列のいずれかに関して、修飾を明確に示していないものは、未修飾の配列と任意の好適な修飾を有する配列との両方を包含することを意味する。

【0109】

本明細書で開示されるｇＲＮＡのいずれかにおけるスペーサー配列の長さは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、及び更に本明細書で開示される標的遺伝子のいずれかを編集するために使用される構成要素に依存し得る。例えば、異なる細菌種に由来する異なるＣａｓ９タンパク質は、様々な最適なスペーサー配列長を有する。従って、スペーサー配列は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０又は５０個超の長さのヌクレオチドを有し得る。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、１８～２４個の長さのヌクレオチドを有し得る。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１９～２１個の長さのヌクレオチドを有し得る。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、２０個の長さのヌクレオチドを含み得る。

【0110】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡはｓｇＲＮＡであってよく、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０個のヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０個未満のヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０超のヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に１７～３０個のヌクレオチドを有する可変長のスペーサー配列を含む。

【0111】

いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端にウラシルを含まない。他の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１つ以上のウラシルを含み得る。例えば、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１～８個のウラシル残基、例えば、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１、２、３、４、５、６、７又は８個のウラシル残基を含むことができる。

【0112】

ｓｇＲＮＡのいずれかを含む、本明細書に開示されるｇＲＮＡのいずれもが、未修飾であり得る。代わりに、１つ以上の修飾ヌクレオチド及び／又は修飾主鎖を含み得る。例えば、ｓｇＲＮＡなどの修飾ｇＲＮＡは、５’末端、３’末端のいずれか又は両方に位置し得る１つ以上の２’－Ｏ－メチルホスホロチオエートヌクレオチドを含むことができる。

【0113】

特定の実施形態では、２つ以上のガイドＲＮＡをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムと共に使用することができる。各ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが２つ以上の標的核酸を切断するように、異なる標的化配列を含有し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体内における活性又は安定性などの同じ又は異なる特性を有し得る。２つ以上のガイドＲＮＡが使用される場合、各ガイドＲＮＡは、同じ又は異なるベクター上にコードされ得る。２つ以上のガイドＲＮＡの発現を駆動するために使用されるプロモーターは、同じであるか又は異なる。

【0114】

２つ以上の好適なＣａｓ９及び２つ以上の好適なｇＲＮＡを、本明細書に記載される方法、例えば当技術分野において公知の又は本明細書で開示される方法に使用することができることが理解されよう。いくつかの実施形態では、方法は、当技術分野において公知のＣａｓ９酵素及び／又はｇＲＮＡを含む。実施例は、例えば、本明細書で言及される目的及び主題のために先行出願の各々の関連する開示が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１９／０９７３０５Ａ２号パンフレット、及び国際公開第２０１９／２１５５００号パンフレットに見出すことができる。

【0115】

（ｉｉｉ）ＣＡＲ構築物をＴ細胞に送達するためのＡＡＶベクター
抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物のいずれかをコードする核酸は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して細胞に送達することができる。ＡＡＶは、宿主ゲノムに部位特異的に組み込まれ、これによってＣＡＲなどの導入遺伝子を送達することができる小型のウイルスである。逆方向末端反復（ＩＴＲ）は、ＡＡＶゲノム及び／又は目的の導入遺伝子に隣接して存在し、複製開始点として機能する。また、ＡＡＶゲノムには、転写されるとＡＡＶゲノムをカプセル化して標的細胞に送達するためのカプシドを形成するｒｅｐタンパク質及びｃａｐタンパク質も存在する。これらのカプシド上の表面受容体によってＡＡＶの血清型が付与され、カプシドがどの標的臓器に最初に結合するか、従っていずれの細胞にＡＡＶが最も効率的に感染するかが決定される。現在知られているヒトＡＡＶの血清型は、１２種類である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸を送達するのに使用するためのＡＡＶは、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）である。

【0116】

アデノ随伴ウイルスは、いくつかの理由のために遺伝子療法に最も頻繁に使用されるウイルスの１つである。第一に、ＡＡＶは、ヒトを含む哺乳動物への投与時に免疫応答を誘発しない。第二に、ＡＡＶは、特に適切なＡＡＶ血清型を選択することを考慮する場合、標的細胞に効率的に送達される。最後に、ＡＡＶは、ゲノムが組み込みを伴わずに宿主細胞において存続し得ることから、分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染する能力を有する。この特質により、ＡＡＶは、遺伝子療法の理想的な候補となる。

【0117】

抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードする核酸は、宿主Ｔ細胞内の目的のゲノム部位に挿入するように設計することができる。いくつかの実施形態では、標的ゲノム部位は、セーフハーバー遺伝子座内に存在し得る。

【0118】

いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードする核酸は、（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターによって運ぶことが可能なドナー鋳型を介して）遺伝子改変Ｔ細胞内のＴＲＡＣ遺伝子を破壊してＣＡＲポリペプチドを発現させるために、ＴＲＡＣ遺伝子内の位置に挿入することができるように設計することができる。ＴＲＡＣの破壊は、内在性ＴＣＲの機能喪失をもたらす。例えば、本明細書に記載されるようなエンドヌクレアーゼ及び１つ以上のＴＲＡＣゲノム領域を標的化する１つ以上のｇＲＮＡにより、ＴＲＡＣ遺伝子の破壊を生じさせることができる。この目的のために、ＴＲＡＣ遺伝子及び標的部位に特異的なｇＲＮＡのいずれか、例えば本明細書で開示されるものを使用することができる。

【0119】

いくつかの実施例では、相同組み換え修復、即ちＨＤＲ（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターの一部であり得るドナー鋳型を使用した）により、ＴＲＡＣ遺伝子内のゲノム欠失と、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするセグメントによる置換とを生じさせることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるようなエンドヌクレアーゼ及び１つ以上のＴＲＡＣゲノム領域を標的化する１つ以上のｇＲＮＡにより、且つＣＡＲをコードするセグメントをＴＲＡＣ遺伝子に挿入することにより、ＴＲＡＣ遺伝子の破壊を生じさせることができる。

【0120】

本明細書で開示されるようなドナー鋳型は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲのコード配列を含有し得る。いくつかの実施例では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードする配列は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集技術を使用して、目的の遺伝子位置、例えばＴＲＡＣ遺伝子において効率的なＨＤＲを行うことができるように、２つの相同性領域に隣接し得る。この場合、標的遺伝子座に特異的なｇＲＮＡによって誘導されたＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９酵素により、ＤＮＡの両方の鎖を標的遺伝子座で切断することができる。続いて、ＨＤＲが発生して二本鎖切断（ＤＳＢ）を修復し、ＣＡＲをコードするドナーＤＮＡを挿入する。これを正しく発生させるために、ドナー配列は、ＴＲＡＣ遺伝子などの標的遺伝子のＤＳＢ部位を取り囲む配列に相補的な隣接残基（以下では「相同性アーム」）を有するように設計されている。これらの相同性アームは、ＤＳＢ修復のための鋳型として機能し、ＨＤＲを本質的に誤りのない機構とすることを可能にする。相同組み換え修復（ＨＤＲ）の割合は、変異部位と切断部位との間の距離の関数であり、そのため、重複しているか又は近傍の標的部位を選択することが重要である。鋳型は、相同領域に隣接した余分な配列を含むことができるか、又はゲノム配列と異なる配列を含むことができ、これによって配列編集が可能になる。隣接する相同配列を含むドナー鋳型の例を下記の表４に示す。

【0121】

代わりに、ドナー鋳型は、ＤＮＡの標的化された位置と相同性のある領域がなくてもよく、標的部位で切断された後にＮＨＥＪ依存的末端連結により組み込まれ得る。

【0122】

ドナー鋳型は、一本鎖及び／又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡであってよく、直鎖状又は環状形態で細胞に導入することができる。直鎖状形態で導入される場合、ドナー配列の末端は、当業者に公知の方法により（例えば、エキソヌクレアーゼによる分解から）保護することができる。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基を直鎖状分子の３’末端に付加し、且つ／又は自己相補的オリゴヌクレオチドを一方若しくは両方の末端に連結する。例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：４９５９－４９６３；Ｎｅｈｌｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：８８６－８８９を参照されたい。外来性のポリヌクレオチドを分解から保護するための更なる方法としては、末端アミノ基の付加、並びに、例えばホスホロチオエート、ホスホロアミデート、及びＯ－メチルリボース又はデオキシリボース残基などの修飾ヌクレオチド間結合の使用が挙げられるが、これらに限定されない。

【0123】

ドナー鋳型は、例えば、複製開始点、プロモーター及び抗生物質耐性をコードする遺伝子などの追加の配列を有するベクター分子の一部として細胞に導入することができる。更に、ドナー鋳型は、裸の核酸として、リポソーム若しくはポロキサマーなどの薬剤と複合体を形成した核酸として細胞に導入することができるか、又はウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス及びインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））により送達することができる。

【0124】

いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、その発現が内在性プロモーターによって駆動することができるように、内在性プロモーターの近傍の部位（例えば、下流又は上流）に挿入することができる。他の実施形態では、ドナー鋳型は、ＣＡＲ遺伝子の発現を制御するために、外来性プロモーター及び／又はエンハンサー、例えば、構成的プロモーター、誘導性プロモーター又は組織特異的プロモーターを含み得る。いくつかの実施形態では、外来性プロモーターは、ＥＦ１αプロモーターである。他のプロモーターを使用してもよい。

【0125】

更に、外来性配列は、転写又は翻訳制御配列、例えばプロモーター、エンハンサー、インスレーター、配列内リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列及び／又はポリアデニル化シグナルも含み得る。

【0126】

抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現し、且つ破壊されたＴＲＡＣ遺伝子及び／又はβ２Ｍ遺伝子を有する、結果として得られたＴ細胞は、インビトロで収集され、増殖され得る。いくつかの実施例では、所望の遺伝子改変を有する細胞を濃縮するために、得られたＴ細胞を更に精製に供する。例えば、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を正に選択することができ、ＴＣＲ^＋Ｔ細胞及び／又はＢ２Ｍ^＋Ｔ細胞を排除することができる。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ^＋Ｔ細胞が除去される。除去方法の非限定的な例としては、細胞選別法（例えば、蛍光活性化細胞選別法）、免疫磁気分離法、クロマトグラフィー、又はマイクロ流体細胞選別法が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ^＋細胞が、免疫磁気分離法を使用して除去される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ^＋細胞が、ＴＣＲを標的化するビオチン化抗体を使用して標識され、抗ビオチン磁気ビーズを使用して除去される。

【0127】

（ｉｖ）遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の特性評価
本明細書で開示される方法又は一般的な手法によって調製される遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、目的の表面タンパク質（例えば、ＴＣＲ、β２Ｍ、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ、又はこれらの組み合わせ）のレベル、細胞生存率、細胞生物活性、不純物などの特徴について、慣用的な手法によって特性評価することができる。

【0128】

いくつかの実施形態では、目的の表面タンパク質を、例えば、抗体及び蛍光タグなどのタグで標識することができる。表面マーカー発現のレベルを定量化し、表面マーカーを発現するＴ細胞の分画を定量化し、又はこれらの組み合わせを行うために、フローサイトメトリーを使用して目的の表面タンパク質の存在を検出することができる。

【0129】

いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子への抗ＢＣＭＡ ＣＡＲの挿入は、デジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を使用して評価する。デジタルＰＣＲは、試料中のＤＮＡ濃度を定量化するものであり、ａ）ＰＣＲ反応物を分画すること、ｂ）分画をＰＣＲ増幅すること、及びｃ）分画のＰＣＲ増幅を分析することを含み、プローブ及び標的分子を含む分画では増幅産物が得られ、ＰＣＲプローブを含まない分画では増幅産物が得られない。増幅産物を含む分画をポアソン分布に適合させて、未分画試料の所与の体積当たりの標的ＤＮＡ分子の絶対コピー数（即ち、試料１マイクロリットル当たりのコピー）を決定する（Ｈｉｎｄｓｏｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．８３：８６０４－１０を参照されたい）。デジタルドロップレットＰＣＲは、試料中のＤＮＡの絶対定量を提供し、コピー数の変動を分析し、及び／又は遺伝子編集の効率を評価するために使用することができる、デジタルＰＣＲの変形形態である。水中油型エマルジョンを用いて核酸試料を液滴へと分画し、ＰＣＲ増幅を液滴で集合的に実施し、流体システムを使用して液滴を分離して、それぞれの個々の液滴の分析を提供する。いくつかの実施形態では、ｄｄＰＣＲを使用して、試料組成物当たりの抗ＢＣＭＡ ＣＡＲコピーの絶対定量を決定する。いくつかの実施形態では、ｄｄＰＣＲを使用して、ＴＲＡＣ遺伝子への抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ配列の挿入のＨＤＲ効率を評価する。

【0130】

いくつかの実施形態では、遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、サイトカイン依存性増殖について評価することができる。Ｔ細胞は、刺激性サイトカインの存在下でのみ増殖することが予想されており、刺激性サイトカインの不在下における増殖は腫瘍形成能を示唆する。Ｔ細胞は、刺激性サイトカインの存在下で少なくとも１日間、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０日間培養され得、従来の手法によってＴ細胞の増殖を測定することができる。いくつかの実施例では、刺激性サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、又はその両方を含む。Ｔ細胞増殖は、培養期間の終了時に評価され得る。代わりに、Ｔ細胞増殖は、培養期間中、例えば、培養期間の１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、又は６日目に評価され得る。いくつかの実施例では、Ｔ細胞増殖は、約１日毎、約２日毎、約３日毎、約４日毎、約５日毎、約６日毎、約７日毎、又は約８日毎に評価することができる。

【0131】

いくつかの実施形態では、生存Ｔ細胞は、従来の方法、例えば、フローサイトメトリー、顕微鏡、光学密度、代謝活性、又はこれらの組み合わせを使用して計数することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、刺激性サイトカイン又はこれらの組み合わせのいずれかの不在下で増殖しない（且つ、腫瘍形成能を欠如するものとして定義される）。増殖しないとは、培養期間の終了時の生存Ｔ細胞の数が、培養期間の開始時の生存Ｔ細胞の数の１５０％未満、例えば、１４０％未満、１３０％未満、１２０％未満、１１０％未満、１００％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、又は１０％未満であるものとして定義することができる。

【0132】

いくつかの実施形態では、本明細書で開示される遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団は、培養から１０日後、１１日後、１２日後、１３日後、１４日後、１５日後、１６日後、１７日後、１８日後、１９日後、又は２０日後に評価したときに、１種以上の刺激性サイトカインの不在下では増殖しないことを示し得る。いくつかの実施例では、Ｔ細胞は、サイトカイン、増殖因子、抗原、又はこれらの組み合わせの不在下では増殖しない。

【0133】

ＩＩＩ．同種抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法
本明細書で開示される遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞のいずれかは、治療目的、例えば、ＢＣＭＡ^＋癌を治療するのに使用され得る。従って、治療を必要とする対象に、有効量の本明細書で開示される遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１２０細胞）の集団を投与することを含む、癌（例えば、ＢＣＭＡ^＋癌細胞に関連する造血器腫瘍）を治療する方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、癌は、難治性及び／又は再発性ＭＭを含むＭＭである。ＭＭは、骨髄内で最終分化した形質細胞の悪性腫瘍である。ＭＭは、異常な形質細胞によってモノクローナル免疫グロブリンタンパク質（例えば、Ｍタンパク質、即ちモノクローナルタンパク質）、又はモノクローナル遊離軽鎖が分泌されて生じたものである。ＭＭは、形質細胞異常増殖症の範囲に存在し、前癌性の意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）が、くすぶり型（無症候性）ＭＭ、症候性ＭＭに段階的に進行した結果として生じる。活動性ＭＭの症状としては、疲労、低血小板数、頻発する感染症、及び／又は発熱、骨の損傷、痛み、腎機能不全が挙げられる。

【0134】

（ｉ）患者集団
本明細書で開示される同種Ｔ細胞療法によって治療される対象は、哺乳動物、例えば、１８歳以上であり得るヒト患者であってよい。いくつかの実施例では、対象は、ＢＣＭＡ^＋癌細胞に関連する癌を有するヒト患者である。例えば、対象は、症候性ＭＭ及び無症候性ＭＭを含む、ＭＭを有するヒト患者であり得る。特定の実施例では、ヒト患者は、難治性ＭＭを有する。他の特定の実施例では、ヒト患者は、再発性ＭＭを有する。他の実施例では、対象は、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＵＧＳ）又は無症候性くすぶり型ＭＭを有し得る。代わりに、対象は、ＭＭ、例えば、症候性ＭＭなどの本明細書で開示されるサブタイプを発症するリスクが高いと診断されたヒト患者であり得る。

【0135】

ＭＭを有する対象は、慣用的な医療行為によって診断され得る。ＭＭを診断する方法は、当技術分野において公知である。非限定的な例としては、骨髄生検の分析、形質細胞増殖に関係する終末器官障害（例えば、高カルシウム血症、腎不全、貧血、破壊性骨病変）の分析、又はその両方が挙げられる。例えば、Ｋｕｍａｒ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｌｅｕｋｅｍｉａ ３１：２４４３－４８；Ｋｕｍａｒ，ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ １７；ｅ３２８－４６；及びＮＣＣＮ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｖ．２．２０１９（２０１８）Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａを参照されたい。いくつかの実施形態では、対象は、ＭＧＵＳを有する。

【0136】

いくつかの実施形態では、対象（例えば、ヒト患者）は、高レベルのＢＣＭＡを発現するＭＭ細胞を有する。細胞又は組織内のＢＣＭＡのｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を定量化する方法は、当技術分野において公知である。例えば、ＢＣＭＡのｍＲＮＡの発現は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、マルチプレックスＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、及び／又は全トランスクリプトームショットガンシーケンシングを使用して測定することができ、ＢＣＭＡタンパク質の発現は、質量分析法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、タンパク質免疫沈降法、免疫電気泳動法、ウエスタンブロット法、及び／又はフローサイトメトリー若しくは顕微鏡による分析を伴う免疫染色法（例えば、免疫蛍光染色法、免疫組織化学染色法）を使用して測定することができる。

【0137】

いくつかの実施形態では、対象（例えば、ヒト患者）は、以前のＭＭ療法から再発したか、又は以前のＭＭ療法に対して難治性である。本明細書で使用する場合、「難治性」とは、治療に対して反応を示さないか又は抵抗性となるＭＭを指す。本明細書で使用する場合、「再発性」又は「再発する」とは、治療による好転（例えば、部分奏効又は完全奏効）の期間の後に再発又は進行するＭＭを指す。いくつかの実施形態では、治療中に再発が起こる。いくつかの実施形態では、治療後に再発が起こる。反応性の欠如は、例えば、血清Ｍタンパク質レベル、尿中Ｍタンパク質レベル、骨髄形質細胞数、骨病変のサイズ、骨病変数、又はこれらの組み合わせにおける変化の欠如として測定され得る。ＭＭの再発又は進行は、例えば、血清クレアチニンレベル、血清Ｍタンパク質レベル、尿中Ｍタンパク質レベル、骨髄形質細胞数、骨髄形質細胞腫のサイズ、骨髄形質細胞腫数、骨病変のサイズ、骨病変数、他の条件によって解明されないカルシウムレベル、赤血球数、臓器障害、又はこれらの組み合わせにおける増加として測定され得る。

【0138】

いくつかの実施形態では、以前のＭＭ療法は、ステロイド、化学療法、プロテアソーム阻害剤（ＰＩ）、免疫調節薬（ＩＭｉＤ）、モノクローナル抗体、自家幹細胞移植（ＳＣＴ）、又はこれらの組み合わせを含む（例えば、ＮＣＣＮ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｖ．２．２０１９（２０１８）Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａを参照されたい）。ステロイドの非限定的な例としては、デキサメタゾン及びプレドニゾンが挙げられる。化学療法の非限定的な例としては、ベンダムスチン、シスプラチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン塩酸塩、ドキソルビシン塩酸塩リポソーム、エトポシド、及びメルファランが挙げられる。ＰＩの非限定的な例としては、ボルテゾミブ、イキサゾミブ、及びカルフィルゾミブが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＰＩは、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、又はその両方を含む。ＩＭｉＤの非限定的な例としては、レナリドミド、ポマリドミド、及びサリドマイドが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＩＭｉＤ療法は、レナリドミド、ポマリドミド、又はその両方を含む。モノクローナル抗体の非限定的な例としては、ＣＤ３８指向性モノクローナル抗体（例えば、ダラツムマブ、及びイサツキシマブ）、並びにエロツズマブ（ＣＤ３１９に結合する）が挙げられる。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、ダラツムマブなどのＣＤ３８指向性モノクローナル抗体を含む。

【0139】

いくつかの実施形態では、以前のＭＭ療法は、１種より多くの系統の療法を含む。いくつかの実施形態では、以前のＭＭ療法は、２種以上の系統の療法、例えば、３系統の前治療、４系統の前治療などを含む。いくつかの実施形態では、２種以上の系統の治療が個別に施される。いくつかの実施形態では、２種以上の系統の療法を組み合わせて施される。いくつかの実施形態では、以前のＭＭ療法は、ＩＭｉＤ、ＰＩ、ＣＤ３８指向性モノクローナル抗体、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、以前のＭＭ療法は、ＩＭｉＤ及びＰＩを含む。いくつかの実施形態では、ＩＭｉＤがＰＩの前に投与される。いくつかの実施形態では、ＩＭｉＤがＰＩの後に投与される。

【0140】

いくつかの実施例では、以前のＭＭ療法は、２系統の療法、例えば、ＩＭｉＤ及びＰＩを含む。２種の以前のＭＭ療法に対して難治性のＭＭ患者は、「二重難治性」と称し得る。いくつかの実施形態では、二重難治性ＭＭ患者は、２系統の療法による治療の６０日目、又は６０日以内に疾患が進行する。場合によっては、２系統の療法は、同一の治療計画の一部であり得る。他の場合、２系統の療法は、異なる治療計画の一部であり得る。二重難治性ＭＭ患者は、最後の治療計画の６０日目、又は６０日以内に疾患が進行し得る。

【0141】

いくつかの実施形態では、以前のＭＭ療法は、３系統の療法、例えば、ＩＭｉＤ、ＰＩ、及びＣＤ３８指向性モノクローナル抗体を含む。３種の以前のＭＭ療法に対して難治性のＭＭ患者は、「三重難治性」と称し得る。いくつかの実施形態では、三重難治性ＭＭ患者は、３系統の療法による治療の６０日目、又は６０日以内に疾患が進行する。場合によっては、３系統の療法は、同一の治療計画の一部であり得る。他の場合、３系統の療法は、異なる治療計画の一部であり得る。三重難治性ＭＭ患者は、最後の治療計画の６０日目、又は６０日以内に疾患が進行し得る。

【0142】

いくつかの実施形態では、再発性又は難治性ＭＭは、以前のＭＭ療法後の少なくとも１０日、少なくとも２０日、少なくとも３０日、少なくとも２ヵ月、少なくとも４ヵ月、少なくとも６ヵ月、少なくとも８ヵ月、少なくとも１０ヵ月、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも３年、少なくとも４年、又は少なくとも５年で検出される。いくつかの実施形態では、再発性又は難治性ＭＭは、以前のＭＭ療法後の１０～１００日以内、例えば、１０～９０日、２０～９０日、２０～８０日、３０～８０日、３０～７０日、４０～７０日、４０～６０日、又は５０～６０日以内に検出される。いくつかの実施形態では、再発性又は難治性ＭＭは、以前のＭＭ療法後の約１００日以内、例えば、以前のＭＭ療法後の約９０日以内、約８０日以内、約７０日以内、約６０日以内、約５０日以内、約４０日以内、約３０日以内、約２０日以内、又は約１０日以内に検出される。

【0143】

いくつかの実施形態では、再発性ＭＭは、自家ＳＣＴの間に対象で検出される。いくつかの実施形態では、再発性ＭＭは、自家ＳＣＴ後に対象で検出される。いくつかの実施形態では、再発性又は難治性ＭＭは、自家ＳＣＴ後の少なくとも１０日、少なくとも２０日、少なくとも３０日、少なくとも２ヵ月、少なくとも４ヵ月、少なくとも６ヵ月、少なくとも８ヵ月、少なくとも１０ヵ月、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも２年、少なくとも３年、少なくとも４年、又は少なくとも５年で検出される。いくつかの実施形態では、再発性又は難治性ＭＭは、自家ＳＣＴ後の約１８ヵ月以内、例えば、自家ＳＣＴ後の約１７ヵ月以内、約１６ヵ月以内、約１５ヵ月以内、約１４ヵ月以内、約１３ヵ月以内、約１２ヵ月以内、約１１ヵ月以内、約１０ヵ月以内、約９ヵ月以内、約８ヵ月以内、約７ヵ月以内、約６ヵ月以内、約５ヵ月以内、約４ヵ月以内、約３ヵ月以内、約２ヵ月以内、又は約１ヵ月以内で検出される。いくつかの実施形態では、再発性又は難治性ＭＭは、自家ＳＣＴ後の約１～１８ヵ月、例えば、自家ＳＣＴ後の約２～１８ヵ月、約２～１６ヵ月、約３～１６ヵ月、約３～１４ヵ月、約４～１４ヵ月、約４～１２ヵ月、約５～１２ヵ月、約５～１０ヵ月、約６～１０ヵ月、又は約６～８ヵ月で検出される。

【0144】

いくつかの実施形態では、対象は以下の特徴：十分な臓器機能、以前に同種幹細胞移植（ＳＣＴ）を受けていないこと、本明細書で開示される同種Ｔ細胞療法に組み入れる前の６０日以内に自家ＳＣＴを受けていないこと、形質細胞性白血病、非分泌型ＭＭ、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ＰＯＥＭ症候群、並びに／又は終末器官の病変及び損傷を伴うアミロイドーシスがないこと、同種Ｔ細胞療法に組み入れる前の１４日以内に、遺伝子療法、抗ＢＣＭＡ療法、及び非緩和的放射線療法を以前に受けていないこと、ＭＭによる中枢神経系の病変がないこと、臨床的に意義のあるＣＮＳ病変、脳血管虚血及び／又は出血症状、認知症、小脳疾患、ＣＮＳ病変を伴う自己免疫疾患の病歴又は存在がないこと、同種Ｔ細胞療法に組み入れる前の６ヵ月以内に不安定狭心症、不整脈、及び／又は心筋梗塞がないこと、（例えば、感染症がＨＩＶ、ＨＢＶ、又はＨＣＶによって引き起こされた）コントロール不良な感染症がないこと、悪性腫瘍が、基底細胞癌若しくは扁平細胞皮膚癌、十分に切除された子宮頸部の上皮内癌、又は完全に切除され、≧５年間寛解期にある過去の悪性腫瘍でないことを条件に、過去又は同時進行の悪性腫瘍がないこと、同種Ｔ細胞療法に組み入れる前の２８日以内に生ワクチンを投与していないこと、同種Ｔ細胞療法に組み入れる前の１４日以内に全身的な抗腫瘍療法を受けていないこと、並びに免疫抑制療法を必要とする原発性免疫不全疾患又は自己免疫疾患がないことの１つ以上を有するヒトＭＭ患者である。いくつかの実施形態では、対象は、０又は１の米国東海岸癌臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）の一般状態を有するヒト患者である。ヒト患者は、シクロホスファミド及び／又はフルダラビンなどのリンパ球除去剤の禁忌を有し得ない。

【0145】

いくつかの実施例では、対象は、下記の実施例６に開示される組み入れ基準及び／又は除外基準の１つ以上を満たすヒト患者である。いくつかの実施例では、対象は、下記の実施例６に開示される組み入れ基準及び／又は除外基準の全てを満たし得る。

【0146】

（ｉｉ）移植前処置（リンパ球除去療法）
本明細書で開示されるような同種抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法に好適な任意のヒト患者は、対象の内在性リンパ球を減少又は除去するために、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の注入前にリンパ球除去療法を受けてもよい。

【0147】

リンパ球除去（ＬＤ）とは、内在性リンパ球及び／又はＴ細胞を破壊することを指し、一般に免疫移植療法及び免疫療法の前に使用される。リンパ球除去は、放射線照射及び／又は化学療法によって達成することができる。「リンパ球除去剤」とは、対象に投与したときに、内在性リンパ球及び／又はＴ細胞を減少、除去又は排除することが可能な任意の分子であり得る。いくつかの実施形態では、リンパ球除去剤は、薬剤を投与する前のリンパ球の数と比較して、リンパ球の数を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％だけ減少させるのに有効な量で投与される。いくつかの実施形態では、リンパ球除去剤は、対象のリンパ球の数が検出限界以下となるような、リンパ球の数を減少させるのに有効な量で投与される。いくつかの実施形態では、対象は、少なくとも１種の（例えば、２、３、４、５種又はそれ以上の）リンパ球除去剤が投与される。

【0148】

いくつかの実施形態では、リンパ球除去剤は、特異的にリンパ球を死滅させる細胞傷害性薬物である。リンパ球除去剤の例としては、フルダラビン、シクロホスファミド、ベンダムスチン、５－フルオロウラシル、ゲムシタビン、メトトレキサート、ダカルバジン、メルファラン、ドキソルビシン、ビンブラスチン、シスプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、イリノテカン、リン酸エトポシド、ミトキサントロン、クラドリビン、デニロイキンジフチトクス又はＤＡＢ－ＩＬ２が挙げられるが、これらに限定されない。場合により、リンパ球除去剤は、低線量の放射線照射と併用され得る。移植前処置のリンパ球除去効果は、通常の診療によって観察することができる。

【0149】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、１種以上のリンパ球除去剤、例えば、フルダラビン及びシクロホスファミドを含む移植前処置に関する。本明細書に記載される方法によって治療を受けるヒト患者は、複数用量の１種以上のリンパ球除去剤を移植前段階の適切な期間（例えば、１～５日間）に受けてもよい。患者は、リンパ球除去期間中、リンパ球除去剤の１種以上を１日当たり１回受けてもよい。一実施例では、ヒト患者は、１日当たり約２０～５０ｍｇ／ｍ^２（例えば、３０ｍｇ／ｍ^２）のフルダラビンを２～４日間（例えば、３日間）にわたって受け、且つ１日当たり約３００～６００ｍｇ／ｍ^２（例えば、５００ｍｇ／ｍ^２）のシクロホスファミドを２～４日間（例えば、３日間）にわたって受ける。

【0150】

一実施例では、ヒト患者は、１日当たり約３０ｍｇ／ｍ^２のフルダラビンを３日間にわたって受け、且つ１日当たり約３００ｍｇ／ｍ^２のシクロホスファミドを３日間にわたって受ける。他の実施例では、ヒト患者は、１日当たり約３０ｍｇ／ｍ^２のフルダラビンを３日間にわたって受け、且つ１日当たり約５００ｍｇ／ｍ^２のシクロホスファミドを３日間にわたって受ける。

【0151】

いくつかの実施形態では、ＬＤ化学療法は、対象におけるＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＩＬ－１０、ＩＬ－５、ＩＬ－８、ＭＣＰ－１、ＰＬＧＦ、ＣＲＰ、ｓＩＣＡＭ－１、ｓＶＣＡＭ－１、又はこれらの組み合わせの血清レベルを増大させる。いくつかの実施形態では、ＬＤ化学療法は、対象におけるパーフォリン、ＭＩＰ－１ｂ、又はその両方の血清レベルを低下させる。いくつかの実施形態では、ＬＤ化学療法は、対象におけるリンパ球減少症に関連する。いくつかの実施形態では、ＬＤ化学療法は、対象における制御性Ｔ細胞の減少に関連する。

【0152】

ＬＤ化学療法の前に、ＬＤ化学療法の延期を示唆し得る症状について対象を検査してもよい。例示的な症状としては、臨床状態の著しい悪化、約９０％超の飽和レベルを維持するために酸素補給を必要とすること、コントロール不良な心不整脈、血管収縮薬のサポートを必要とする低血圧、活動性感染症、及び／又はグレード≧２の急性神経毒性が挙げられる。症状の１つ以上が発生する場合は、症状が好転するまで対象に対するＬＣ化学療法を延期すべきである。

【0153】

（ｉｉｉ）同種抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法
同種ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を受けるように対象を調整した（例えば、ＬＤ化学療法を受けた）後、有効量の遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１２０細胞）の集団、又は本明細書で開示されるようなものを含む（例えば、約５％のＤＭＳＯを含み得る凍結保存溶液中に懸濁させたＣＴＸ１２０細胞を含む）医薬組成物が、好適な経路及びスケジュールによって対象（例えば、ヒトＭＭ患者）に与えられ得る。いくつかの実施例では、Ｔ細胞は、静脈内注入によって投与される。「同種Ｔ細胞療法」とは、レシピエントに与えられるＴ細胞が、レシピエント由来でなく、１つ以上の種のドナーに由来することを意味する。本明細書で開示される同種細胞療法では、遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１２０細胞）は、１人以上の健康なヒトドナーに由来するものであってよく、ヒトＭＭ患者に与えられ得る。

【0154】

いくつかの実施形態では、遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１２０細胞）は、対象（例えば、ヒトＭＭ患者）がＬＤ化学療法を受けた後、少なくとも２４時間（１日）で対象に投与することができる。例えば、遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１２０細胞）の投与は、ＬＤ化学療法の２～７日後であり得る。いくつかの実施形態では、同種Ｔ細胞は、ＬＤ化学療法の投与後の１０日以下、例えば、９日以下、８日以下、７日以下、６日以下、５日以下、４日以下、３日以下、２日以下、又は１日以下に投与される。いくつかの実施形態では、同種Ｔ細胞は、ＬＤ化学療法の投与後の２４時間～１０日、２４時間～９日、３０時間～９日、３０時間～８日、３６時間～８日、３６時間～７日、又は４８時間～７日以内に投与される。いくつかの実施形態では、同種Ｔ細胞は、ＬＤ化学療法の投与後の４８時間～７日以内に投与される。

【0155】

ＬＤ化学療法の後、及び遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の投与前に、同種Ｔ細胞の投与の延期を示唆し得る症状について対象（例えば、ヒトＭＭ患者）を検査してもよい。例示的な症状としては、活動性のコントロール不良な感染症、ＬＤ化学療法前の臨床状態と比較した臨床状態の悪化、及び／又はグレード≧２の急性神経毒性が挙げられる。このような症状の１つ以上が発生する場合は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の投与を、好転が観察されるまで延期すべきである。ＬＤ化学療法の後に一定の期間を超えて延期が延長される場合（例えば、ＬＤ化学療法後の少なくとも１０日、少なくとも１２日、少なくとも１５日、又は少なくとも２１日）、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の投与前にＬＤ化学療法を繰り返してもよい。

【0156】

同種Ｔ細胞療法を実施するために、有効量の本明細書で開示されるような遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団、例えば、ＣＴＸ１２０細胞を、本明細書で開示される必要要件を満たす好適な対象（例えば、ヒトＭＭ患者）に投与することができる。遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１２０細胞）は、約２～１０％のＤＭＳＯ（例えば、約５％のＤＭＳＯ）を含み得、任意選択により血清を実質的に含まない凍結保存溶液中に懸濁され得る。本明細書で使用する場合、「有効量」という用語は、ＭＭの治療に望ましい効果を提供するのに十分な量を指す。望ましい効果の非限定的な例としては、対象においてＭＭの発症を防止すること、ＭＭの発症の可能性を低下させること、ＭＭの進行を遅延、延期、抑止、若しくは反転させること、ＭＭの症状を阻害、低下、寛解、若しくは軽減させること、又はこれらの組み合わせが挙げられる。所与の場合の有効量は、通常の実験によって、例えば、入院又は他の医学的介入が必要となる、関連する目標レベルにおける変化（例えば、少なくとも１０％）を評価することによって、当業者により決定することができる。

【0157】

いくつかの実施形態では、約２．５×１０^７個～約７．５×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞を含む、ＣＴＸ１２０細胞などの遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団が、静脈内注入によってヒトＭＭ患者（例えば、本明細書で開示される患者）に投与される。例えば、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現する約５×１０^７個～約７．５×１０^８個の遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１２０）が、静脈内注入によって患者に投与され得る。本明細書で開示される同種Ｔ細胞療法に使用するための例示的な有効量のＣＡＲ^＋Ｔ細胞としては、約３×１０^７個、約４×１０^７個、約５×１０^７個、約６×１０^７個、約７×１０^７個、約８×１０^７個、約９×１０^７個、約１×１０^８個、約２×１０^８個、約３×１０^８個、約４×１０^８個、約５×１０^８個、約６×１０^８個、又は約７×１０^８個が挙げられる。いくつかの実施例では、約２．５×１０^７個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞を含むＣＴＸ１２０細胞などの遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団が、静脈内注入によって患者に投与される。

【0158】

いくつかの実施例では、約５×１０^７個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞を含むＣＴＸ１２０細胞などの遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団が、静脈内注入によって患者に投与される。いくつかの実施例では、約１．５×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞を含むＣＴＸ１２０細胞などの遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団が、静脈内注入によって患者に投与される。いくつかの実施例では、約４．５×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞を含むＣＴＸ１２０細胞などの遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団が、静脈内注入によって患者に投与される。いくつかの実施例では、約６×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞を含むＣＴＸ１２０細胞などの遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団が、静脈内注入によって患者に投与される。いくつかの実施例では、約７．５×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞を含むＣＴＸ１２０細胞などの遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団が、静脈内注入によって患者に投与される。

【0159】

いくつかの実施形態では、有効量の本明細書で開示されるような遺伝子改変Ｔ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１２０細胞）は、約１．５×１０^８個～約７．５×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞、例えば、約１．５×１０^８個～約４．５×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞、又は約４．５×１０^８個～約７．５×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、有効量の本明細書で開示されるような遺伝子改変Ｔ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１２０細胞）は、約４．５×１０^８個～約６×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞、又は約６×１０^８個～約７．５×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞の範囲であり得る。

【0160】

いくつかの実施形態では、ＣＴＸ１２０細胞などの本明細書で開示される有効量の遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、血清Ｍタンパク質レベルを、対象において少なくとも２５％、例えば、対象において少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％減少させるのに十分である。

【0161】

いくつかの実施形態では、ＣＴＸ１２０細胞などの本明細書で開示される有効量の遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、２４時間の尿中Ｍタンパク質レベルを、対象において少なくとも５０％、例えば、対象において少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％減少させるのに十分である。いくつかの実施形態では、有効用量は、対象における血清Ｍタンパク質レベルを少なくとも２５％、２４時間の尿中Ｍタンパク質レベルを少なくとも５０％、又はその両方を減少させるのに十分である。いくつかの実施形態では、有効用量は、対象における血清Ｍタンパク質レベルを少なくとも２５％、且つ２４時間の尿中Ｍタンパク質レベルを少なくとも５０％減少させるのに十分である。いくつかの実施形態では、有効用量は、対象における血清Ｍタンパク質レベルを少なくとも５０％、２４時間の尿中Ｍタンパク質レベルを少なくとも９０％、又はその両方を減少させるのに十分である。いくつかの実施形態では、有効用量は、対象における血清Ｍタンパク質レベルを少なくとも５０％、且つ２４時間の尿中Ｍタンパク質レベルを少なくとも９０％減少させるのに十分である。

【0162】

いくつかの実施形態では、ＣＴＸ１２０細胞などの本明細書で開示される有効量の遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、２４時間の尿中Ｍタンパク質レベルを、対象において２００ｍｇ未満まで、例えば、対象において１９０ｍｇ未満まで、１８０ｍｇ未満まで、１７０ｍｇ未満まで、１６０ｍｇ未満まで、１５０ｍｇ未満まで、１４０ｍｇ未満まで、１３０ｍｇ未満まで、１２０ｍｇ未満まで、１１０ｍｇ未満まで、１００ｍｇ未満まで、９０ｍｇ未満まで、８０ｍｇ未満まで、７０ｍｇ未満まで、６０ｍｇ未満まで、又は５０ｍｇ未満まで減少させるのに十分である。いくつかの実施形態では、有効用量は、対象における血清Ｍタンパク質レベルを少なくとも９０％、２４時間の尿中Ｍタンパク質レベルを１００ｍｇ未満まで、又はその両方を減少させるのに十分である。いくつかの実施形態では、有効用量は、対象における血清Ｍタンパク質レベルを少なくとも９０％、且つ２４時間の尿中Ｍタンパク質レベルを１００ｍｇ未満まで減少させるのに十分である。

【0163】

いくつかの実施形態では、ＣＴＸ１２０細胞などの本明細書で開示される有効量の遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、軟部組織の形質細胞腫のサイズ（ＳＰＤ）を、対象において少なくとも３０％、例えば、対象において少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％減少させるのに十分である。いくつかの実施形態では、有効用量は、対象における軟部組織の形質細胞腫のサイズ（ＳＰＤ）を少なくとも５０％減少させるのに十分である。いくつかの実施形態では、有効用量は、軟部組織の形質細胞腫を検出不可能なレベルまで減少させるのに十分である。

【0164】

いくつかの実施形態では、ＣＴＸ１２０細胞などの本明細書で開示される有効量の遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、形質細胞数を、対象において少なくとも２０％、例えば、対象において少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％減少させるのに十分である。いくつかの実施形態では、有効用量は、対象における形質細胞数を少なくとも５０％減少させるのに十分である。

【0165】

いくつかの実施形態では、ＣＴＸ１２０細胞などの本明細書で開示される有効量の遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、対象における形質細胞数を骨髄（ＢＭ）吸引液の１０％未満、例えば、対象のＢＭ吸引液の９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、又は３％未満まで減少させるのに十分である。いくつかの実施形態では、有効用量は、対象における形質細胞数をＢＭ吸引液の５％未満まで減少させるのに十分である。いくつかの実施形態では、有効用量は、対象における血清Ｍタンパク質、尿中Ｍタンパク質、及び軟部組織の形質細胞腫を検出不可能なレベルまで、且つ形質細胞数をＢＭ吸引液の５％未満まで減少させるのに十分である。

【0166】

いくつかの実施形態では、ＣＴＸ１２０細胞などの本明細書で開示される有効量の遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、関連する遊離軽鎖（ＦＬＣ）レベルと関連しない遊離軽鎖レベル間の差を、対象において少なくとも２０％、例えば、対象において少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％減少させるのに十分である。いくつかの実施形態では、有効用量は、対象における関連する遊離軽鎖レベルと関連しない遊離軽鎖レベル間の差を少なくとも５０％減少させるのに十分である。

【0167】

いくつかの実施形態では、対象は、カッパ（κ）軽鎖を生成する骨髄腫細胞を有し、有効用量は、κ軽鎖とλ軽鎖の比（κ／λ比）を６：１以下、例えば、１１：２以下、１１：２以下、５：１以下、９：２以下、４：１以下、７：２以下、３：１以下、５：２以下、２：１以下、３：２以下、又は１：１以下まで減少させるのに十分である。いくつかの実施形態では、対象は、κ軽鎖を生成する骨髄腫細胞を有し、有効用量は、κ／λ比を４：１以下まで減少させるのに十分である。

【0168】

いくつかの実施形態では、対象は、ラムダ（λ）軽鎖を生成する骨髄腫細胞を有し、有効用量は、κ軽鎖とλ軽鎖の比（κ／λ比）を１：４以上、例えば、２：７以上、１：３以上、２：５以上、１：２以上、１：１以上、３：２以上、又は２：１以上まで増加させるのに十分である。いくつかの実施形態では、対象は、λ軽鎖を生成する骨髄腫細胞を有し、有効用量は、κ／λ比を１：２以上まで増加させるのに十分である。

【0169】

いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるような病状の指標のいずれか、例えば、軟部組織の形質細胞腫のサイズ（ＳＰＤ）、血清Ｍタンパク質レベル、尿中Ｍタンパク質レベル、遊離軽鎖（ＦＬＣ）レベル、形質細胞数、κ軽鎖とλ軽鎖の比、又はこれらの組み合わせを測定するために、１つ以上のアッセイが、本明細書で開示される抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１２０細胞）による治療の前及び／又は後に対象に実施され得る。慣用的な臨床検査を使用して、このような指標を測定することができる。いくつかの実施例では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞治療の前、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞治療の後、又はその両方の時点の血清及び／若しくは尿モノクローナルタンパク質（Ｍタンパク質）のレベルについて対象を検査してもよい。代わりに又は加えて、ＣＡＲ－Ｔ細胞治療の前及び／又は後の遊離軽鎖（ＦＬＣ）レベルについて対象を検査してもよい。代わりに又は加えて、ＣＡＲ－Ｔ細胞治療の前及び／又は後の骨髄形質細胞数について対象を検査してもよい。

【0170】

いくつかの実施形態では、ＣＴＸ１２０細胞などの本明細書で開示される有効量の遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、１×１０^６個以下のＴＣＲ^＋Ｔ細胞／ｋｇ（対象）、例えば、８×１０^５個以下、６×１０^５個以下、４×１０^５個以下、２×１０^５個以下、１×１０^５個以下、８×１０^４個以下、６×１０^４個以下、４×１０^４個以下、２×１０^４個以下、又は１×１０^４個以下のＴＣＲ^＋Ｔ細胞／ｋｇ（対象）を含む。いくつかの実施形態では、有効用量は、約１×１０^４個～約１×１０^６個のＴＣＲ^＋Ｔ細胞／ｋｇ（対象）、例えば、約１×１０^４個～約１×１０^６個、約２×１０^４個～約１×１０^６個、約２×１０^４個～約８×１０^５個、約４×１０^４個～約８×１０^５個、約４×１０^４個～約６×１０^５個、約６×１０^４個～約６×１０^５個、約６×１０^４個～約４×１０^５個、約８×１０^４個～約４×１０^５個、又は約１×１０^５個～約２×１０^５個のＴＣＲ^＋Ｔ細胞／ｋｇ（対象）を含む。いくつかの実施形態では、有効用量は、１×１０^５個以下のＴＣＲ^＋Ｔ細胞／ｋｇ（対象）を含む。いくつかの実施形態では、有効用量は、７×１０^４個以下のＴＣＲ^＋Ｔ細胞／ｋｇ（対象）を含む。

【0171】

いくつかの実施形態では、ＣＴＸ１２０細胞のＴ細胞などの本明細書で開示される遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、注射、例えば静脈内注入される。投与経路の非限定的な例としては、静脈内、髄腔内、腹腔内、脊髄内、脳内、脊髄、及び胸骨内注入が挙げられる。いくつかの実施形態では、経路は、静脈内である。いくつかの実施形態では、ＣＴＸ１２０細胞などの本明細書で開示される遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、標的部位、組織、又は臓器に直接投与される。いくつかの実施形態では、ＣＴＸ１２０細胞などの本明細書で開示される遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、全身投与される（例えば、対象の循環系に）。いくつかの実施形態では、全身経路は、腹腔内投与、静脈内投与、又はその両方を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＸ１２０細胞などの本明細書で開示される遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、単回の静脈内注入として投与される。いくつかの実施形態では、同種Ｔ細胞は、２回以上の静脈内注入として投与される。

【0172】

本明細書で開示される同種Ｔ細胞療法の後に、対象を、急性毒性、例えば、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、神経毒性、腫瘍崩壊症候群、血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）、血球減少症、ＧｖＨＤ、低血圧、腎不全、ウイルス性脳炎、好中球減少症、血小板減少症、又はこれらの組み合わせの発症について観察しなければならない。ＣＴＸ１２０細胞などの遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の投与後に毒性が観察される場合は、これらの医師に公知の毒性管理を対象に実施するものとする。毒性管理に関する更なる詳細については、実施例６を参照されたい。

【0173】

場合によっては、投与後のヒトレシピエントにおけるＣＴＸ１２０細胞などの遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の薬物動態（ＰＫ）プロファイルを検査してもよい。ＰＫプロファイルにより、ヒトＭＭ患者における同種Ｔ細胞療法の有効性を評価することができる。

【0174】

遺伝子改変ＣＡＲ－Ｔ細胞は、対象に投与した後に増殖期を経てもよい。増殖は、抗原認識及び信号活性化に対する応答である（Ｓａｖｏｌｄｏ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１２１：１８２２；ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｔｅｇｅｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．１４：４９９－５０９）。増殖後、遺伝子改変ＣＡＲ－Ｔ細胞は、短命のエフェクターＣＡＲ－Ｔ細胞が排除され、長命のメモリーＣＡＲ－Ｔ細胞が残存する収縮期を経る。持続期の期間によって、増殖及び収縮後のＣＡＲ－Ｔ細胞の寿命の指標がもたらされる。

【0175】

いくつかの実施形態では、ＰＫプロファイルは、組織内の遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の量を経時的に含む。この分析に好適な例示的な組織としては、末梢血が挙げられる。組織試料は、毎日又は毎週採取され得る。代わりに又は加えて、組織試料は、Ｔ細胞の投与後の１日目、２日目、３日目、又は４日目から採取され得る。組織試料の採取は、Ｔ細胞の投与後の５日以降、例えば、Ｔ細胞の投与後の８日目以降、１０日目以降、１５日目以降、又は２０日目以降に終了してもよい。いくつかの実施形態では、組織試料の採取は、Ｔ細胞の投与後に１週間につき少なくとも１回、例えば、Ｔ細胞の投与後に１週間につき少なくとも２回、又は少なくとも３回実施される。いくつかの実施形態では、組織試料の採取は、Ｔ細胞の投与後に最大で１６週目、例えば、最大で１５週目、最大で１２週目、最大で１０週目、最大で８週目、又は最大で６週目に実施される。

【0176】

いくつかの実施形態では、ＰＫプロファイルの評価は、ベースライン測定値を得ることを含み、ベースライン測定値は、遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の投与前、例えば、Ｔ細胞の投与前の１５日以下、例えば、Ｔ細胞の投与前の１０日以下、５日以下、１日以下に得てもよい。いくつかの実施形態では、ベースライン測定値は、Ｔ細胞の投与前の０．２５～４８時間以内、例えば、０．５～２４時間以内、１～３６時間以内、１～１２時間以内、又は２～１２時間以内に得られる。

【0177】

いくつかの実施形態では、組織内の遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の量の時間経過は、曲線下面積（ＡＵＣ）によって測定する。ＡＵＣの計算方法は、当業者には公知であり、ＡＵＣを一連の台形によって近似させること、台形の面積を計算すること、及び台形の面積を合計してＡＵＣを決定することからなる。いくつかの実施形態では、ＰＫプロファイルに関してＡＵＣが定義され、所与の組織タイプに関して遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の量が経時的に測定される。いくつかの実施形態では、ＰＫプロファイルに関してある指定された時点から別の指定された時点までのＡＵＣが定義される（即ち、ＡＵＣ１０～８０は、投与後１０日目～８０日目の量を示す量－時間曲線下総面積を指す）。いくつかの実施形態では、投与時間（例えば、１日目）から１日の終了時間までにわたる予め選択された期間、即ち、投与後１～７、１０～２０日、１５～４５日、２０～７０日、２５～１００日、又は４０～１８０日に対してＡＵＣが決定される。いくつかの実施形態では、レシピエントにおけるＰＫプロファイルのために測定されたＡＵＣは、レシピエントの奏効（例えば、ＣＲ又はＰＲ）を示す。いくつかの実施形態では、レシピエントにおけるＰＫプロファイルのために測定されたＡＵＣは、レシピエントの再発のリスクを示す。

【0178】

いくつかの実施形態では、遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、対象の非癌細胞に毒性を誘導しない。或いは、遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、補体媒介溶解を引き起こさず、又は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を刺激しない。

【0179】

いくつかの実施形態では、同種抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、１種以上の抗癌療法、例えば、多発性骨髄腫に一般的に適用される療法と組み合わされ得る。

【0180】

ＩＶ．同種抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法のためのキット
本開示はまた、難治性及び／又は再発性多発性骨髄腫などの多発性骨髄腫を治療するための方法における、本明細書で記載されるようなＣＴＸ１２０ Ｔ細胞などの抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の集団を使用するためのキットを提供する。このようなキットは、遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の集団のいずれか（例えば、ＣＴＸ１２０細胞などの本明細書に記載されるもの）、及び薬学的に許容されるキャリアを含む、第１の医薬組成物を含む第１の容器を含み得る。抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、本明細書で開示されるような凍結保存溶液中に懸濁され得る。任意選択により、キットは、１種以上のリンパ球除去剤を含む第２の医薬組成物を含む、第２の容器を更に含み得る。

【0181】

いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載される方法のいずれかにおいて使用するための指示を含み得る。添付される指示は、ヒトＭＭ患者に意図する活性を獲得させるために、第１及び／又は第２の医薬組成物を対象に投与することに関する説明を含み得る。キットは、ヒト患者が治療を必要としているか否かを特定することに基づいて、治療に好適なヒトＭＭ患者を選択することに関する説明を更に含み得る。いくつかの実施形態では、指示は、治療が必要なヒト患者に第１及び第２の医薬組成物を投与することに関する説明を含む。

【0182】

本明細書に記載されるＣＴＸ１２０ Ｔ細胞などの抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団の使用に関する指示には、一般に、意図する治療に関する投与量、投与スケジュール、及び投与経路などの情報が含まれる。容器は、単位用量、バルク包装（例えば、マルチドーズ包装）、又はサブユニット用量であり得る。本開示のキットで提供される指示は、典型的には、ラベル又は添付文書に記載された指示である。ラベル又は添付文書は、対象のＭＭの症状を治療し、発症を遅らせ、且つ／又は軽減させるために、遺伝子改変Ｔ細胞の集団を使用することを指示する。

【0183】

本明細書で提供されるキットは、好適に包装されている。好適な包装としては、バイアル、ボトル、ジャー、フレキシブル包装などが挙げられるが、これらに限定されない。吸入器、鼻腔投与器具又は注入器具などの特定の器具と組み合わせて使用するための包装も考えられる。キットは、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針が貫通可能なストッパーのある静脈内溶液バッグ又はバイアルであり得る）。容器は、滅菌アクセスポートも有し得る。医薬組成物中の少なくとも１種の活性剤は、本明細書で開示されるようなＣＴＸ１２０ Ｔ細胞などの抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団である。

【0184】

キットは、任意選択により、緩衝剤及び解説情報などの追加の構成要素を提供し得る。通常、キットは、容器と、容器上の又は容器に付随したラベル又は添付文書とを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、上記に記載したキットの内容物を含む製造物品を提供する。

【0185】

一般的技術
本開示の実施には、特に指示しない限り、当技術分野の範囲内の分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来技術が採用される。このような技術は、例えば下記の文献で十分に説明されている：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）；Ｉｎｔｒｏｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４≫；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ｌＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６；及びＢ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）。

【0186】

当業者であれば、更に詳細に述べることなく、上記の説明に基づいて本発明を最大限に利用することができると考えられる。従って、以下の特定の実施形態は、単なる例示として解釈すべきであり、決して以下の本開示を限定するものではない。本明細書で引用する全ての刊行物は、本明細書で言及される目的又は主題のために参照により組み込まれる。

【実施例】

【0187】

実施例１：抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の調製
ＢＣＭＡ抗原に特異的なＣＡＲを発現する遺伝子改変Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１２０細胞）は、本明細書で言及される目的及び主題のためにその各々の関連する開示が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１９／０９７３０５号パンフレット及び国際公開第２０１９／２１５５００号パンフレットに記載されるような標準的な白血球アフェレーシス手順によって得られた健康なドナーのＰＢＭＣから調製した。

【0188】

要約すると、Ｔ細胞のために単核細胞を濃縮して、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体をコートしたビーズで活性化した。濃縮され、活性化されたＴ細胞を、続いてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて遺伝子改変し、ヒトＭＭ細胞によって発現されるＢＣＭＡに特異的なＣＡＲを同時に挿入することによって、ＴＲＡＣ遺伝子及びβ２Ｍ遺伝子のコード配列を破壊した（例えば、遺伝子ノックアウトを生じさせた）。ＣＡＲの挿入は、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡによって生成したＤＮＡのＤＳＢのＨＤＲによって発生させた。ＣＡＲは、ＴＲＡＣ遺伝子に特異的な、左側及び右側に隣接する相同性アームを含むドナーＤＮＡによってコードされており、これによってＣＡＲをＴＲＡＣ遺伝子において生成されたＤＮＡのＤＳＢに挿入することが可能となる。ＣＡＲ相同ドナーＤＮＡは、ｒＡＡＶ６を用いて投与した。ＴＲＡＣ遺伝子を破壊することによって、ＴＣＲの機能喪失が生じ、遺伝子編集Ｔ細胞を非アロ反応性にし、且つＧｖＨＤのリスクを最小限に抑えることによって同種移植に好適なものとする一方で、β２Ｍ遺伝子を破壊することによって、ＭＨＣ Ｉの発現の喪失が生じ、ＨＶＧ反応に対する遺伝子編集Ｔ細胞の感受性が阻害される。抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをＴＲＡＣ遺伝子に挿入することによって、ＢＣＭＡ表面抗原を発現するＭＭ腫瘍細胞に反応性のＴ細胞が提供される。

【0189】

遺伝子編集を実施するため、最初に、初代ヒトＴ細胞を、ＴＲＡＣ遺伝子及びβ２Ｍ遺伝子を標的化するＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体と共に電気穿孔した。Ｃａｓ９ヌクレアーゼを、ＴＡ－１ ｓｇＲＮＡ（配列番号１、ＴＣＲを標的化する）、及びＢ２Ｍ－１ ｓｇＲＮＡ（配列番号５、β２Ｍを標的化する）と別々の微小遠心管内で混合した。それぞれの溶液を室温で１０分以上インキュベートし、それぞれのリボ核タンパク質複合体を形成した。２つのＣａｓ９／ｇＲＮＡ混合物を混ぜ合わせ、細胞と混合し、Ｃａｓ９、ＴＡ－１、及びＢ２Ｍ－１をそれぞれ０．３ｍｇ／ｍＬ、０．０８ｍｇ／ｍＬ及び０．２ｍｇ／ｍＬの終濃度とした。細胞をＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ ＲＮＰと共に電気穿孔した。電気穿孔後、ＴＲＡＣ座位に特異的な、隣接する左側及び右側に８００ｂｐの相同性アームを含む、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするｒＡＡＶ６で細胞を処理した。コードされたＣＡＲを、プロモーターとして機能するように、５’伸長因子であるＥＦ－１αに作動可能に連結し、ｍＲＮＡ転写の安定性を促進するように、３’ポリアデニル化配列に作動可能に連結した。ＣＡＲは、ヒトＢＣＭＡに特異的なマウス抗体由来のヒト化ｓｃＦｖと、ヒンジ領域及び膜貫通ドメインと、ＣＤ３－ζを含むシグナル伝達ドメインと、４－１ＢＢ共刺激ドメインとを含んでいた。

【0190】

標的遺伝子配列、及びｓｇＲＮＡ、及びｓｇＲＮＡによってコードされるスペーサー配列を表１に示す。

【0191】

【表1】

【0192】

上記の表１のＴＲＡＣ ｓｇＲＮＡによって生成された破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、下記の表２に示される編集されたＴＲＡＣ遺伝子配列のうちの１つを含み得る（“－”は欠失を示し、太字の残基は突然変異又は挿入を示す）。

【0193】

【表2】

【0194】

遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の一部は、編集されたＴＲＡＣ遺伝子、左側及び右側の相同性アームに対応する領域における相同組み換えによって抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列で置換され得るフラグメントを含み得る（下記の表４を参照されたい）。そのため、本明細書で開示される遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１２０細胞）の一部は、少なくともＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ（配列番号１０）のフラグメントの欠失を有する破壊されたＴＲＡＣ遺伝子を含み得る。抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号３３であり、下記の表４を参照されたい）を含む核酸は、ＴＲＡＣ遺伝子座に挿入され得る。ＣＡＲコード配列は、配列番号３８などのＥＦ－１ａプロモーターに動作可能に連結されている。ポリＡ配列（例えば、配列番号３９）は、コード配列の下流に位置し得る。下記の表４を参照されたい。

【0195】

更に、遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１２０細胞）の一部は、複数の破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含み、下記の表３に列挙される編集されたβ２Ｍ遺伝子配列の１つ以上を集合的に含み得る（”－”は欠失を示し、太字の残基は突然変異又は挿入を示す）。

【0196】

【表3】

【0197】

ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を含む、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするｒＡＡＶの構成要素を、それぞれ表４及び表５に示す。

【0198】

【表4】

【0199】

【表5】

【0200】

【表6】

【0201】

【表7】

【0202】

【表8】

【0203】

【表9】

【0204】

【表10】

【0205】

得られた遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１２０細胞）の少なくとも一部は、少なくとも配列番号１０の配列の欠失を有する破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含み、且つ抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ（例えば、配列番号４０）を発現し得る。更に、ＣＴＸ１２０細胞集団内の細胞の一部は、配列番号２１～２６の配列の１つ以上が集合的に含まれ得る、複数の破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含み得る。更に、遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施例では、ＣＡＲコード配列は、ＴＲＡＣ遺伝子座（例えば、配列番号４０の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードする配列番号３３）に挿入され得る。抗ＢＣＭＡ ＣＡＲコード配列は、配列番号３８のヌクレオチド配列を含み得る、ＥＦ－１ａプロモーターに動作可能に連結される。更に、ポリＡ配列（例えば、配列番号３９）は、コード配列の下流に位置する。

【0206】

得られた遺伝子改変Ｔ細胞を、所望の遺伝子編集の組み込み、つまりＴＣＲの喪失、ＭＨＣ Ｉ発現の喪失、及び抗ＢＣＭＡ ＣＡＲの発現について特性評価した。遺伝子編集の約１週間後、フローサイトメトリーを使用して、ＴＣＲ、β２Ｍ、及び抗ＢＣＭＡ ＣＡＲの表面発現について同種Ｔ細胞を評価した。同種細胞をビオチン化組み換えヒトＢＣＭＡ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｔ：＃ＢＣ７－Ｈ８２Ｆ０）で染色し、蛍光ストレプトアビジン及び細胞表面マーカーを標的化する蛍光抗体でタグ付けした。ＴＣＲ^－、β２Ｍ^－、及び抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ^＋であった細胞の割合を求めた。ＣＴＸ１２０細胞の９つのロットを、８人の健康なドナーから調製した。

【0207】

図２に図示されるように、ＴＣＲの発現における減少は、ほぼ定量的であり（９６～９９％の細胞がＴＣＲ^－）、β２Ｍの発現における減少も高く（７２～８６％の細胞がβ２Ｍ^－）、及び抗ＢＣＭＡ ＣＡＲの組み込みは４６～７９％の範囲であった。三重遺伝子編集（ＴＣＲ^－、β２Ｍ^－、及び抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ^＋）を含むＣＴＸ１２０細胞の割合は、３８％～６７％であった。

【0208】

ＣＤ４^＋又はＣＤ８^＋であったＣＴＸ１２０細胞の割合もフローサイトメトリーによって求めた。図３Ａ～３Ｂに図示されるように、ＣＤ４^＋Ｔ細胞（図３Ａ）又はＣＤ８^＋Ｔ細胞（図３Ｂ）の割合は、遺伝子編集プロセス後に変化しないままで維持された。

【0209】

実施例２：抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＭＭ．１Ｓ腫瘍モデルにおいて腫瘍容積を減少させ、且つ再チャレンジから保護する
ヒトＢＣＭＡ発現ＭＭ腫瘍の増殖を抑制するＣＴＸ１２０細胞の能力を、免疫不全マウスにおいて評価した。ＮＯＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｓｕｇ}／ＪｉｃＴａｃ）において、皮下ＭＭ．１Ｓ腫瘍異種移植モデルに対するＣＴＸ１２０細胞の有効性を評価した。簡潔に言えば、５～８週齢の雌ＮＯＧマウスを、換気されたマイクロアイソレーターケージ内で個別に収容し、無菌条件下で維持した。動物はそれぞれ右側腹部に５０％マトリゲル中５×１０^６個のＭＭ．１Ｓ細胞の皮下接種を受けた。平均腫瘍容積が１００ｍｍ^３（約７５～１２５ｍｍ^３）に達したとき、マウスを各群５匹のマウスを含む２つの群に無作為化した。１つの群には処置をせず、一方で２つめの群には８×１０^６個のＣＴＸ１２０ ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を静脈注射によって投与した。

【0210】

腫瘍容積及び体重を週に２回測定し、個々のマウスを、それらの腫瘍容積が≧２０００ｍｍ^３に達したときに安楽死させた。１５日目までに、ＣＴＸ１２０細胞で処置した動物は、最初の容積から腫瘍退縮を示したが、対照群における動物は、平均して１０００ｍｍ^３より大きい腫瘍を有していた。２９日目までに、対照群における全ての動物は、≧２０００ｍｍ^３の腫瘍容積の評価項目に達したが、全ての処置動物は、原発腫瘍負荷を拒絶した（図４）。

【0211】

２９日目に、ＣＴＸ１２０の処置を受けた群の全てのマウスに、２回目のＭＭ．１Ｓ腫瘍細胞の接種を更に施した（例えば、腫瘍再チャレンジ）。マウスは、左側腹部に５０％マトリゲル中５×１０^６個のＭＭ．１Ｓ細胞の２回目の皮下接種を受けた。最初の未処置群を腫瘍負荷のために死亡させたことを踏まえ、腫瘍のない動物の第２のコホートに、陽性対照として左側腹部に再チャレンジの接種を施した。

【0212】

全てのマウスを、最初の右側腹部の腫瘍及び左側腹部における再チャレンジ腫瘍の両方の腫瘍増殖について観察した。ＣＴＸ１２０細胞で処置した動物は、試験期間にわたって、最初の右側腹部の腫瘍と再チャレンジした左側腹部の腫瘍の両方において腫瘍増殖を正常に排除したが、未処置動物は、右側腹部又は左側腹部のいずれかの腫瘍細胞の接種を受けると、腫瘍負荷のために死亡した（表４）。

【0213】

実施例３：抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の処置によるＲＰＭＩ－８２２６腫瘍の根絶
ＮＯＧマウスにおけるＲＰＭＩ－８２２６腫瘍異種移植モデルによって、ＢＣＭＡ発現ヒトＭＭの第２のモデルでＣＴＸ１２０の有効性を更に評価した。簡潔に言えば、５～８週齢の雌ＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩ１２ｒｇ^{ｔｍ１Ｓｕｇ}／ＪｉｃＴａｃ）マウスを、換気されたマイクロアイソレーターケージ内で個別に収容し、無菌条件下で維持した。処置の１０日前に、マウスは、右側腹部に１０×１０^６個のＲＰＭＩ－８２２６細胞／マウスの皮下接種を受けた。１日目に、マウスを群（各群ｎ＝５マウス）に無作為化し、未処置としたか、又は０．８×１０^６個のＣＡＲ発現ＣＴＸ１２０細胞を静脈注射によって投与した。

【0214】

腫瘍容積を週に２回測定した。ＣＴＸ１２０細胞で処置した動物は、腫瘍負荷を完全に根絶したことを示したが、未処置動物の腫瘍は、試験期間の終了時までに１５００ｍｍ^３を上回る腫瘍容積に達した（図５）。

【0215】

実施例４：抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の安全性及び忍容性の評価
ＢＣＭＡ発現細胞及び組織に応答して活性化するＣＴＸ１２０細胞の選択性を評価した。そのために、ＣＴＸ１２０ ＣＡＲのｓｃＦｖ部分に由来するヒト化マウス抗体を、ヒト組織に対する交差反応性について評価した。要約すると、標準的な３２個のヒト組織のパネル（副腎、膀胱、血液細胞、骨髄、乳房、脳の小脳、脳の大脳皮質、結腸、内皮血管、目、卵管、胃腸：管：胃、胃腸管：小腸、心臓、腎臓の糸球体、腎尿細管、肝臓、肺、リンパ節、末梢神経、卵巣、膵臓、副甲状腺、耳下腺（唾液）腺、下垂体、胎盤、前立腺、皮膚、脊髄、脾臓、横紋筋、精巣、胸腺、甲状腺、扁桃腺、尿管、子宮頸部、子宮内膜）を、２つの濃度：最適濃度（５．０μｇ／ｍＬ）及び高濃度（５０．０μｇ／ｍＬ）の抗体に暴露した後の抗体の結合について評価した。病理医によって組織染色を評価し、陽性染色が組織に対する抗体の反応性を示す、免疫組織化学ベースのアッセイによって結合を評価した。陽性対照として、組織スライドに吸着させた精製ＢＣＭＡタンパク質に対して、染色を評価した。抗体結合を検査する各組織について、異なる３人のヒトドナー由来の組織切片を評価した。精製ＢＣＭＡタンパク質に対しては強い染色が観察されたが、ヒト組織のいずれにも陽性染色が観察されなかった。従って、抗原結合性の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲのｓｃＦｖは、ＢＣＭＡを発現する組織に対して高い選択性がある。

【0216】

ＢＣＭＡ発現細胞株に応答して活性化するＣＴＸ１２０細胞の選択性をインビトロで評価した。そのために、ＣＴＸ１２０細胞を、ＢＣＭＡ発現の高い（ＭＭ．１Ｓ細胞）、ＢＣＭＡ発現の低い（Ｊｅｋｏ－１細胞）、又はＢＣＭＡを発現しない（Ｋ５６２細胞）５０，０００個の標的細胞と、ＣＡＲ Ｔ細胞と標的細胞が２：１の比率で２４時間共培養した。共培養液上清中の活性化抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞によって産生されたＩＦＮγ及びＩＬ－２のレベルを、Ｌｕｍｉｎｅｘベースのアッセイ（Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して測定した。標的細胞との共培養に応答するサイトカイン産生を、４人の個々のドナーに由来するＣＴＸ１２０細胞について、図６Ａ～６Ｂに図示される平均±標準誤差で評価した。図示されるように、ＣＴＸ１２０細胞をＢＣＭＡ発現が欠如したＫ５６２細胞と共培養した場合に、サイトカインの発現は測定されなかった。対照的に、ＢＣＭＡ発現ＭＭ．１Ｓ細胞又はＪｅＫｏ－１細胞と共培養したＣＴＸ１２０細胞の共培養液中では、ＩＦＮγ及びＩＬ－２の両方で有意なレベルが測定された（図６Ａ～６Ｂ）。

【0217】

更に、ＢＣＭＡ発現細胞株の標的細胞死を誘導するＣＴＸ１２０細胞の選択性をインビトロで評価した。そのために、ＣＴＸ１２０細胞又は未編集のＴ細胞を、５０，０００個の標的細胞（例えば、ＭＭ．１Ｓ細胞、ＪｅＫｏ－１細胞、又はＫ５６２細胞）と、Ｔ細胞と標的細胞が８：１、４：１、２：１、１：１、又は０．５：１の比率で２４時間共培養した。共培養の前に、標的細胞を５μＭのｅｆｌｕｏｒ６７０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識化した。共培養後、細胞を洗浄し、死滅／瀕死細胞を計数するために、１：５００希釈の４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を含有する２００μＬの培地中に懸濁した。２５μＬのＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を各試料に加えた。細胞をフローサイトメトリーによって標識について評価し、細胞溶解のために死滅した標的細胞の割合を以下の計算によって求めた。
細胞／ｍＬ＝（（生存標的細胞イベントの数）／（ビーズイベントの数））×（（ロットの割り当てられたビーズカウント（ビーズ／５０μＬ））／（試料の体積））

【0218】

合計の標的細胞を、細胞／μＬに細胞の総体積を掛けることによって計算した。続いて、細胞溶解の割合を、以下の式：
％細胞溶解＝（１－（（試験試料中の標的細胞の総数）／（対照試料中の標的細胞の総数））×１００
により計算した。

【0219】

細胞死は、異なる４人のドナーに由来する未編集のＴ細胞及び編集されたＴ細胞について、図７Ａ～７Ｃに図示される平均％細胞溶解±標準偏差で評価した。ＢＣＭＡを発現する細胞（図７ＡのＭＭ．１Ｓ及び図７ＢのＪｅＫｏ－１）の場合、編集されたＣＴＸ１２０細胞によって誘導された細胞溶解は、Ｔ細胞と標的細胞の比率が低い場合であっても、未編集のＴ細胞によって誘導された細胞溶解よりも有意に高かった。対照的に、ＢＣＭＡ発現が欠如したＫ５６２細胞の場合は、未編集のＴ細胞と編集されたＴ細胞との間に細胞溶解における差異が観察されなかった（図７Ｃ）。従って、ＣＴＸ１２０細胞によって誘導される細胞毒性は、標的細胞によるＢＣＭＡの発現に依存する。

【0220】

初代非腫瘍ヒト細胞がＣＴＸ１２０細胞を活性化する可能性を更に評価した。初代ヒト細胞のうち、Ｂ細胞のみがＢＣＭＡ発現細胞を含むことが予想されている。下記の表６に列挙した初代ヒト細胞と共培養した後に、ＩＦＮγ及びＩＬ－２のレベルを定量化することによって、ＣＴＸ１２０細胞の活性化を測定した。

【0221】

【表11】

【0222】

そのために、初代ヒト細胞を、９６ウェル平底プレートに、１ウェル当たり２５，０００個の細胞で好ましい培地中に播種し、一晩インキュベートした。２４時間後、初代細胞培地を除去し、５０，０００個のＣＴＸ１２０細胞をＴ細胞増殖培地に添加した。共培養液を２４時間インキュベートし、Ｌｕｍｉｎｅｘベースのアッセイ（Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して、ＩＦＮγ及びＩＬ－２の産生についてアッセイした。陽性対照として、ＢＣＭＡ発現の低い細胞（例えば、Ｊｅｋｏ－１細胞）に応答するＣＴＸ１２０細胞の活性化を評価した。ＩＦＮγ及びＩＬ－２の平均±標準偏差の産生を、図８Ａ及び図８Ｂにそれぞれ図示する。白抜きのバーは、値が定量化の限界を下回っていたことを示した。図８Ａに図示されるように、初代ヒト細胞とＣＴＸ１２０細胞との間での共培養により、Ｊｅｋｏ－１陽性対照細胞株と比較した場合に、ＣＤ１９^＋／ＢＣＭＡ^＋細胞を含むことが知られている一次Ｂ細胞と共培養した場合を除き、ＩＦＮγの著しい分泌が生じなかった。図８Ｂに図示されるように、無培養は、Ｊｅｋｏ－１陽性対照と比較して著しいＩＬ－２産生をもたらした。この結果に基づくと、ＣＴＸ１２０細胞は、通常のＢＣＭＡを発現しないヒト細胞の存在下で活性化しない。

【0223】

形質転換細胞は、サイトカインに依存しない方法で増殖する。従って、遺伝子編集が発癌性形質転換をもたらすか否かを判断するために、サイトカインの不在下で増殖する能力についてＣＴＸ１２０細胞を評価した。そのために、エクスビボでの培養におけるＣＴＸ１２０細胞の増殖を、血清並びにサイトカインＩＬ－２及びＩＬ－７を含む完全培地、血清を含むがサイトカインを含まない（例えば、ＩＬ－２若しくはＩＬ－７を含まない）培地、又は血清もサイトカインも含まない（例えば、血清、ＩＬ－２、若しくはＩＬ－７を含まない）培地中で、２７日にわたって評価した。遺伝子編集（０日目）の約２週間後に、５×１０^６個のＣＴＸ１２０細胞を蒔いた。様々な時点で、フローサイトメトリーを使用して生存ＣＴＸ１２０細胞の数を計数した。図９に図示されるように、Ｔ細胞の増殖は、完全培地中で培養した場合に定常に達したが、生存Ｔ細胞の数は、サイトカインを含まない培地（血清の有無にかかわらず）中で増殖させた場合では、時間の経過と共に減少した。異なる４人のドナーに由来するＣＴＸ１２０細胞の生存細胞の平均数±標準誤差が図示される。従って、ＣＴＸ１２０細胞を生成するために使用される遺伝子編集手法は、望ましくない発癌性形質転換をもたらさない。

【0224】

実施例５：抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の投与による免疫反応の分析
未編集のＴ細胞及び編集されたＣＴＸ１２０細胞が単回用量後にＧｖＨＤを引き起こす可能性を、マウスで評価した。編集されたＣＴＸ１２０細胞は、実施例１に記載したように調製した。ＣＴＸ１２０の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、マウスＢＣＭＡを認識しない。しかしながら、未編集のＴ細胞又は編集されたＴ細胞による処置に応答する、マウスにおけるＧｖＨＤの症状（例えば、体重減少、生存率の低下、及び／又は罹病率の増大）の評価は、Ｔ細胞のオフターゲットの反応性によって誘導される（例えば、アロ抗原に対するＴＣＲ反応による）ＧｖＨＤ毒性を示すものである。陽性対照として、マウス組織抗原とのＴＣＲの反応性によってＧｖＨＤ毒性を引き起こす未編集の同種Ｔ細胞でマウスを処置した。ＴＣＲの発現が極めて低い同種ＣＴＸ１２０細胞で処置することによって、ＧｖＨＤ毒性の誘導を評価した。

【0225】

ＧｖＨＤ反応を評価するために、表７に示すように、最初にＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪ）を全身照射に暴露し（２００ｃＧｙの総照射線量）、続いて溶媒のみ（例えば、Ｔ細胞を含まない）、未編集のＴ細胞、又は編集されたＣＴＸ１２０細胞（例えば、ＴＣＲ^－ β２Ｍ^－ ＣＡＲ^＋Ｔ細胞）で処置した。１日目の放射線照射の約６時間後に、Ｔ細胞を２５０μＬ容積のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で静脈内低速ボーラス注射によって投与した。放射線照射は、１６０ｃＧｙ／分の速度で送達した。

【0226】

【表12】

【0227】

治療後、放射線照射後の最大で８４日にわたって、生存率、ＧｖＨＤ症状の出現、及び体重について動物を評価した。ＧｖＨＤ症状は、皮膚に対する変化（例えば、蒼白及び／又は発赤）、活動性の低下、円背姿勢、軽度から中程度のるい痩、及び呼吸数の上昇として定義した。

【0228】

未処置動物、又は放射線照射単独、若しくはＣＴＸ１２０細胞の投薬を併用した放射線照射に暴露した動物では、死亡は観察されなかった。しかしながら、図１０に図示されるように、未編集のＴ細胞の投薬を併用した放射線照射を受けた動物に関しては、有意な死亡率が観察された。加えて、未編集のＴ細胞で処置した数匹の動物に体重減少が観察されたが、溶媒又はＣＴＸ１２０細胞で処置した動物では観察されなかった。加えて、ＣＴＸ１２０細胞で処置した動物には、ＧｖＨＤ症状が観察されなかった。従って、これらの結果により、ＴＣＲ発現細胞を排除するように編集されたＣＴＸ１２０細胞は、ＧｖＨＤ反応をもたらすオフターゲットの反応性を誘導しないことが確認された。

【0229】

未編集のＴ細胞と、実施例１に記載した遺伝子編集方法に従ってＴＣＲ陰性且つβ２Ｍ陰性となるように編集されたＴ細胞とで、ヒト細胞に対するアロ反応性を比較した。具体的には、ＴＲＡＣ遺伝子座及びβ２Ｍ遺伝子座を標的化するＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体と共に、初代ヒトＴ細胞を電気穿孔した。しかしながら、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするｒＡＶＶで細胞を処置せず、これによってアロ反応性におけるＴＣＲノックアウトの効果を評価するのに使用するための、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子及びβ２Ｍ遺伝子を有するＴ細胞（ＴＲＡＣ^－／β２Ｍ^－Ｔ細胞）を含む細胞の集団を得た。

【0230】

アロ反応性を評価するために、未編集のＴ細胞又は編集されたＴ細胞を同一のドナーに由来するＰＢＭＣ（例えば、自家ＰＢＭＣ若しくは適合ＰＢＭＣ）、又は異なるドナーに由来するＰＢＭＣ（例えば、同種ＰＢＭＣ若しくは不適合ＰＢＭＣ）とインキュベートし、製造元のプロトコルに従って、５－エチニル－２’－デオキシウリジン（ＥｄＵ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の組み込みを測定するフローサイトメトリーベースのアッセイを使用してＴ細胞の増殖を測定することにより、活性を評価した。陽性対照として、ＴＣＲを架橋し、Ｔ細胞活性化を誘導するように機能するフィトヘムアグルチニン－Ｌ（ＰＨＡ）でＴ細胞を処置した。ＰＨＡによる処置により、未編集のＴ細胞では激しく増殖する結果となったが、予想通り、ＴＣＲ発現のない編集されたＴ細胞ではそのような結果とならなかった（図１１）。また、予想通り、編集されたＴ細胞と未編集のＴ細胞とのどちらもが、自家ＰＢＭＣの存在下では増殖しなかった。しかしながら、編集されたＴ細胞は、同種ＰＢＭＣの存在下で増殖しており、不適合のヒト細胞に対するアロ反応性を示している。対照的に、編集されたＴ細胞は、同種ＰＢＭＣに応答した増殖を示さなかった（図１１）。従って、編集されたＴ細胞におけるＴＣＲ発現の喪失は、不適合のヒト細胞に応答する活性化の欠如と一致するものである。

【0231】

実施例６：再発性又は難治性多発性骨髄腫を有する対象における抗ＢＣＭＡ同種ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９改変Ｔ細胞（ＣＴＸ１２０）の安全性及び有効性に関する第Ｉ相用量漸増試験及びコホート拡大試験
本試験は、再発性又は難治性多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する対象における、ＣＴＸ１２０、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を対象とする同種キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法の安全性、有効性、薬物動態、及び薬力学的効果を評価するものである。

【0232】

ＭＭは、全ての造血器腫瘍の約１０％に現れ、非ホジキンリンパ腫後に２番目に最も多く見られる造血器腫瘍である、骨髄で最終分化した形質細胞の悪性腫瘍である（Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ３１，２４４３－２４４８；Ｒａｊｋｕｍａｒ ａｎｄ Ｋｕｍａｒ，２０１６，Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ Ｐｒｏｃ ９１，１０１－１１９）。

【0233】

ＣＴＸ１２０は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集構成要素（ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９ヌクレアーゼ）を使用して、エクスビボで遺伝子改変された同種Ｔ細胞で構成される、ＢＣＭＡ指向性Ｔ細胞免疫療法である。改変には、Ｔ細胞受容体アルファ定常（ＴＲＡＣ）座位及びβ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）座位の破壊、並びに抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ導入遺伝子のＴＲＡＣ座位への同時挿入が含まれる。ＣＡＲは、ＢＣＭＡに特異的なヒト化ｓｃＦｖ、続いてＣＤ８ヒンジ及びＣＤ１３７（４－１ＢＢ）及びＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインに融合した膜貫通領域で構成されている。遺伝子ノックアウトにより、ＧｖＨＤの確率を低下させ、改変Ｔ細胞をＢＣＭＡ発現腫瘍細胞に再誘導し、同種細胞の持続性を増大させることが意図される。

【0234】

標準的な白血球アフェレーシス手順によって得られた健康なドナーの末梢血単核球からＣＴＸ１２０を調製した。単核細胞をＴ細胞のために濃縮して、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体をコートしたビーズで活性化し、続いてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９リボヌクレオタンパク質複合体と共に電気穿孔して、ＣＡＲ遺伝子を含有する組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターで形質導入する。改変Ｔ細胞を細胞培養液中で増殖させ、精製し、懸濁液中に配合して凍結保存する。生成物をその場で保存し、投与の直前に解凍する。ＣＴＸ１２０生成物は、図１３にまとめられている。

【0235】

ＣＴＸ１２０の特異性及び抗腫瘍細胞毒性を、インビトロ及びインビボでの薬理学試験によって評価した。ＣＴＸ１２０細胞は、腫瘍細胞死をもたらすＢＣＭＡ^＋腫瘍細胞とインビトロで共培養した場合に、エフェクターサイトカインを放出した。ＣＴＸ１２０は、ヒト腫瘍異種移植マウスモデルにおいて、インビボで腫瘍増殖を阻害した。免疫反応性及び腫瘍形成のリスクを評価するために、インビトロ及びインビボでの安全性評価を実施した。オフターゲットの編集は同定されなかった。安全性試験により、ＣＴＸ１２０がマウスにおいて任意の臨床的又は組織病理学的なＧｖＨＤを引き起こさなかったことが示され、ＣＴＸ１２０細胞が遺伝子編集後にサイトカインの不在下で増殖しなかったことが確認された。

【0236】

再発性／難治性多発性骨髄腫を有する対象における、本ヒト初回投与試験は、このＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９改変同種ＣＡＲ Ｔ細胞手法の安全性及び有効性を評価するものである。

【0237】

１．試験目的
主目的、パートＡ（用量漸増）：最大耐量（ＭＴＤ）及び／又はコホート拡大に推奨される用量を決定するために、再発性又は難治性多発性骨髄腫を有する対象において、様々なリンパ球除去剤及び免疫調節剤を併用したＣＴＸ１２０の漸増用量の安全性を評価する。
主目的、パートＢ（コホート拡大）：国際骨髄腫ワーキンググループ（ＩＭＧＷ）奏効基準（Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）に従ったＯＲＲによって測定される、再発性又は難治性多発性骨髄腫を有する対象におけるＣＴＸ１２０の有効性を評価する。副次的目的では、ＣＴＸ１２０の有効性、安全性及び薬物動態を更に特性解明する。探索的目的では、臨床反応、抵抗性、安全性、疾患、又は薬力学的活性を提示又は予測することができる、ＣＴＸ１２０に関連するゲノム、代謝及び／又はプロテオミクスバイオマーカーを同定する。
副次的目的（パートＡ及びＢ）：ＣＴＸ１２０の有効性、安全性及び薬物動態を更に特性解明する。
探索的目的（パートＡ及びＢ）：臨床反応、抵抗性、安全性、疾患、又は薬力学的活性を提示又は予測することができる、ＣＴＸ１２０に関連するゲノム、代謝及び／又はプロテオミクスバイオマーカーを同定する。

【0238】

２．対象の適格性
２．１ 組み入れ基準
本試験に参加するのに適格であると見なされるためには、対象は以下に列挙される組み入れ基準の全てを満たさなければならない：
１．年齢が≧１８歳であること。
２．プロトコルに必要とされる試験手順を理解して遵守することができ、自発的に書面のインフォームドコンセント文書に署名することができること。
３．ＩＭＷＧ奏効基準（下記の表２２）、及び以下の少なくとも１つによって定義されるような、再発性又は難治性疾患を伴う多発性骨髄腫と診断されていること：
ａ）ＩＭｉＤ（例えば、レナリドミド、ポマリドミド）、ＰＩ（例えば、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ）、及びＣＤ３８指向性モノクローナル抗体（例えば、ダラツムマブ；国／地域で承認され、入手できる場合）を含む、少なくとも２系統の治療を以前に受けている。
ｂ）同一の若しくは異なる治療計画の一部として、ＰＩ、ＩＭｉＤ、及び抗ＣＤ３８抗体による治療の６０日目若しくは６０日以内における進行として定義される、三重難治性の多発性骨髄腫；又は同一の若しくは異なる治療計画の一部として、ＰＩ及びＩＭｉＤに対して二重難治性の多発性骨髄腫である。
ｃ）多発性骨髄腫が自家ＳＣＴ後の１２ヵ月以内に再発している。
ｄ）上記の基準（３ａ、ｂ、又はｃ）の少なくとも１つであり、且つ以前にＣＤ３８指向性モノクローナル抗体を受けている。
４．以下の基準の少なくとも１つを含む、測定可能な疾患であること：
・血清Ｍタンパク質が≧０．５ｇ／ｄＬであること。
・尿中Ｍタンパク質が≧２００ｍｇ／２４時間であること。
・血清遊離軽鎖（ＦＬＣ）アッセイが、以下の通りであること：血清ＦＬＣ比が異常であることを条件として、関連するＦＬＣレベルが≧１０ｍｇ／ｄＬ（１００ｍｇ／Ｌ）であること。
５．米国東海岸癌臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）の一般状態が０又は１であること（付録Ｂ）。
６．ＬＤ化学療法及びＣＡＲ Ｔ細胞注入を受ける基準を満たしていること。
７．以下の臓器機能が十分であること：
・腎臓：推定糸球体濾過率が＞５０ｍＬ／分／１．７３ｍ２であること。
・肝臓：アスパラギン酸トランスアミナーゼ又はアラニントランスアミナーゼが＜３×正常上限（ＵＬＮ）であり、総ビリルビンが＜２×ＵＬＮであること。
・心臓：血行動態的に安定しており、心エコー図による左室駆出分画率が≧４５％であること。
・肺：パルスオキシメトリーによる室温での酸素飽和レベルが＞９１％であること。
８．妊娠可能な女性対象（閉経後１年未満の正常な子宮と少なくとも１つの卵巣とを有する初潮後の女性）は、ＣＴＸ１２０注入後の少なくとも１２ヵ月にわたって、組み入れ時より許容可能な避妊方法を使用することに同意しなければならない。
９．男性対象は、ＣＴＸ１２０注入後の少なくとも１２ヵ月にわたって、組み入れ時より有効な避妊方法を使用することに同意しなければならない。

【0239】

２．２ 除外基準
本試験に参加するのに適格となるためには、対象は以下に列挙される除外基準のいずれも満たさないことが必要となる。
１．以前に同種ＳＣＴを受けていること。
２．スクリーニング時点で自家ＳＣＴから６０日未満であり、未解明の重篤な病変があること。
３．形質細胞性白血病（標準差異による＞２．０×１０９個／Ｌの循環血液中の形質細胞）、又は非分泌型ＭＭ、又はワルデンシュトレームマクログロブリン血症又はＰＯＥＭＳ（多発ニューロパチー、臓器肥大、内分泌障害、モノクローナルタンパク質、及び皮膚病変）症候群、又は終末器官の病変及び損傷を伴うアミロイドーシスであること。
４．以下の療法のいずれかによる前治療を受けていること：
・ＣＡＲ Ｔ細胞又はナチュラルキラー細胞を含む任意の遺伝子療法又は遺伝子改変細胞治療。
・ＢＣＭＡ指向性抗体、二重特異性Ｔ細胞誘導、又は抗体薬物複合体を含む、ＢＣＭＡ指向性療法による前治療。
・組み入れて１４日以内の放射線治療。症状管理のための緩和的放射線療法は容認される。
５．シクロホスファミド、フルダラビン又はＣＴＸ１２０生成物の賦形剤のいずれかに対して既知の禁忌があること。
６．多発性骨髄腫による直接的な中枢神経系（ＣＮＳ）障害のエビデンスがあること。
７．発作性疾患、脳血管虚血／出血、認知症、小脳疾患、ＣＮＳ病変を伴う任意の自己免疫疾患、又はＣＡＲ Ｔ細胞に関係する毒性を増大させる可能性のある別の症状などの臨床的に意義のあるＣＮＳ病変の病歴がある、又はそれらが存在すること。
８．組み入れの６ヵ月以内に不安定狭心症、臨床的に重大な不整脈、又は心筋梗塞があること。
９．コントロール不良であるか、又はＩＶ抗感染薬を必要とする細菌感染症、ウイルス感染症、又は真菌感染症が存在すること。
１０．ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１型若しくは２型、又は活動性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）若しくはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の感染の存在が陽性であること。ウイルス負荷が検出不可（定量的ポリメラーゼ連鎖反応［ＰＣＲ］又は核酸試験による）と記録されている、ＨＢＶ又はＨＢＣ感染の既往歴のある対象は容認される。インフォームドコンセント用紙（ＩＣＦ）に署名して３０日以内に実施する感染症疾患検査（ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＨＣＶ抗体及びＰＣＲ、ＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶ表面抗体、ＨＢＶコア抗体）により、対象の適格性を考慮してもよい。
１１．基底細胞癌若しくは扁平細胞皮膚癌、十分に切除された子宮頸部の上皮内癌又は完全に切除され、≧５年間寛解している過去の悪性腫瘍を除く、過去又は同時進行の悪性腫瘍であること。
１２．組み入れて２８日以内に生ワクチンを受けていること。
１３．組み入れ前の１４日以内に全身性抗腫瘍療法又は治験薬を使用していること。臨床的に必要であれば、以前にステロイド剤を使用している患者に、生理学的用量のステロイド（例えば、≦１０ｍｇ／日のプレドニゾン又は等価物）を使用することが容認される。
１４．ステロイド及び／又は他の免疫抑制療法を必要とする原発性免疫不全疾患又は活動性自己免疫疾患であること。
１５．対象が試験に参加する能力を阻害する可能性がある、重大な精神疾患又は他の医学的状態が診断されること。
１６．妊娠している、又は授乳中の女性であること。

【0240】

３．試験デザイン
３．１ 治験計画
本試験は、再発性又は難治性多発性骨髄腫を有する対象における、様々なＬＤ及び免疫調節剤を併用したＣＴＸ１２０の漸増用量の安全性及び有効性を評価する非盲検多施設第１相試験である（下記の表８）。試験は、用量漸増（パートＡ）、その後のコホート拡大（パートＢ）の２つのパートに分かれている。治療スケジュールの概要図を図１２に示す。

【0241】

パートＡでは、以下の１つを有する成人対象において用量漸増を開始する：ＩＭｉＤ、ＰＩ、及びＣＤ３８指向性モノクローナル抗体を含む、少なくとも２系統の前治療後における再発性若しくは難治性ＭＭ；ＰＩ、ＩＭｉＤ及び抗ＣＤ３８抗体に対して三重難治性の進行性ＭＭ；又は自家ＳＣＴ後の１２ヵ月以内に再発したＭＭ。用量漸増は、下記に概略する基準に従って実施する。

【0242】

パートＢでは、ＣＴＸ１２０の安全性及び有効性を更に評価するために、最適なサイモンの２段階デザインを使用して、拡大コホートを開始する。第１の段階では、最大で２７人の対象が組み入れられ、パートＢのコホート拡大に推奨される用量（パートＡで決定したＭＴＤ以下）のＣＴＸ１２０で処置される。

【0243】

３．１．１ 試験デザイン
用量漸増（パートＡ）、その後のコホート拡大（パートＢ）の両方の期間において、試験は以下のような３つの主な段階から構成される。
段階１：処置に対する適格性を判断するためのスクリーニング（１～２週間）。
段階２：処置（段階２Ａ及び段階２Ｂ）；コホートによる処置に関しては表２を参照されたい（１～２週間）
段階３：全てのコホートに対する追跡調査（５年間）
パートＡでは、複数の独立したコホートにおいてＣＴＸ１２０の漸増用量を検査する。これらのコホートでは、以下の表８にまとめたように、異なるＬＤ及び免疫調節剤と共に使用した場合のＣＴＸ１２０の安全性及び薬物動態学を、予備的に評価することができる。

【0244】

【表13】

【0245】

注：ＬＤ化学療法の開始及びＣＴＸ１２０の注入の両方を行う前に、対象は、本明細書に規定された基準を満たさなくてはならない。ＣＴＸ１２０注入は、コホートＡではＤＬ１で開始してもよく、評価後のコホートＢではＤＬ２又はＤＬ３で開始してもよい。

【0246】

ＣＴＸ１２０注入後の期間に、ＣＳＲ、神経毒性、ＧｖＨＤ、及び他の有害事象（ＡＥ）を含む急性毒性について対象を観察する。毒性管理ガイドラインを下記に示す。パートＡ（用量漸増）の間に、ＣＴＸ１２０注入後の最初の７日間、全ての対象を観察のために入院させる。パートＡ及びＢにおいて、観察のための入院の期間は、地域の規制又は現地の慣行によって必要とされる場合に延長することができる。パートＡ及びＢのいずれの場合も、対象はＣＴＸ１２０注入後の２８日間、調査現場の近辺の範囲内（即ち、１時間の移動時間）に留まる必要がある。

【0247】

３．１．２ 試験対象
パートＡ（用量漸増）では、約６～６０人の対象が処置される。パートＢ（コホート拡大）では、約７０人の対象が処置される。

【0248】

３．１．３ 試験期間
対象は、本試験に５年間参加する。本試験の完了後、長期安全性及び生存期間を評価するために、全ての対象は更に１０年間、別の長期追跡調査試験に参加することが必要となる。

【0249】

３．２ ＣＴＸ１２０の用量漸増
本明細書で定義されるように、ＤＬＴの発症に応じて３～６人の対象を各用量レベルで組み入れる、標準的な３＋３デザインを使用して用量漸増を実施する。ＤＬＴ評価期間をＣＴＸ１２０注入時に開始し、２８日間継続する。

【0250】

表９は、本試験で評価され得るＣＡＲ＋ Ｔ細胞の合計数に基づき、ＣＴＸ１２０のＣＡＲ＋ Ｔ細胞の用量を列挙したものであり、コホートＡの場合はＤＬ１で開始される。コホートＢの用量レベルは、対応するコホートＡの用量レベル（例えば、ＤＬ２又はＤＬ３）が全ての対象のＤＬＴ評価期間を完了した後に開始され得る。ＤＬ４の３人の対象のうちの１人がＤＬＴを示す場合、処置は、ＤＬ４の更に３人の対象を処置するように拡大してもよく、又は６×１０^８個のＣＡＲ＋ Ｔ細胞からなる低用量レベルに漸減してもよい。加えて、ＣＴＸ１２０の用量は、ＤＬ３のデータを評価した後に、６×１０^８個のＣＡＲ＋ Ｔ細胞を含む用量レベル、又はＤＬ４に漸増してもよい。第１の対象がＤＬＴ評価期間を完了したときに、各用量レベルで第２の対象のみがＣＴＸ１２０を受けるように、開始用量レベル及び／又は後続の用量レベルにおける各コホート内の第１の対象及び第２の対象間で投与をずらして行うことができる。

【0251】

【表14】

【0252】

ＤＬ１（及び必要であればＤＬ－１）では、前回の対象がＤＬＴ評価期間を完了した時点で、２番目及び３番目の対象のみがＣＴＸ１２０を受けるように、ずらした様式で対象を処置する。ＤＬ１又は－１が３人の対象の後で拡大される場合、コホート内の追加の３人の対象が組み入れられ、同時に投与され得る。ＤＬ１でＤＬＴが発生しなかった場合、用量漸増は後続のレベルに進む。後続の用量レベル２、３、及び４の場合、第１の対象及び第２の対象間の投与は、各用量レベルに対して２８日ずらして行う。

【0253】

用量漸増は、下記の規則に従って実施する：
・３人の対象のうちの０人がＤＬＴを示す場合、次の用量レベルに漸増する。
・３人の対象のうちの１人がＤＬＴを示す場合、現在の用量レベルを６人の対象に拡大する。
○６人の対象のうちの１人がＤＬＴを示す場合、次の用量レベルに漸増する。
○６人の対象のうちの≧２人がＤＬＴを示す場合：
－ＤＬ－１である場合は、代替の投与スキーマを評価するか、又はパートＢのコホート拡大に推奨される用量を決定することが不可能であると宣言する。
－ＤＬ１である場合は、ＤＬ－１に漸減する。
－ＤＬ２、ＤＬ３、又はＤＬ４である場合は、前回の用量レベルをＭＴＤと宣言する。
・３人の対象のうちの≧２人がＤＬＴを示す場合：
○ＤＬ－１である場合は、代替の投与スキーマを評価するか、又はパートＢのコホート拡大に推奨される用量を決定することが不可能であると宣言する。
○ＤＬ１である場合は、ＤＬ－１に減少させる。
○ＤＬ２、ＤＬ３、又はＤＬ４である場合は、前回の用量レベルをＭＴＤとして宣言する。
・上記の表９に列挙した最高用量を超える用量漸増がない。

【0254】

パートＢのコホート拡大に推奨される用量が宣言される前に、少なくとも６人の対象にＣＴＸ１２０を投与する。

【0255】

３．２．１ 最大耐量の定義
ＭＴＤは、対象の３３％未満にＤＬＴが観察される場合の最高用量である。ＭＴＤは、本試験で測定されないことがある。パートＢの拡大コホートへの移行は、用量が本試験のパートＡで試験された最大用量以下であれば、ＭＴＤなしで決定を行ってもよい。

【0256】

３．２．２ ＤＬＴの定義
毒性は、以下を除き、米国国立がん研究所の有害事象共通用語規準（ＣＴＣＡＥ）第５版に従ってグレード分類され、記録される。
・ＣＲＳ：
○パートＡ：Ｌｅｅ基準（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｂｌｏｏｄ １２４，１８８－１９５）
○パートＢ：米国移植細胞療法学会（ＡＳＴＣＴ）基準（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ２５，６２５－６３８）
・神経毒性、パートＡ及びＢ：
○ＣＴＣＡＥ ｖ５．０
○免疫エフェクター細胞関連神経毒性症候群（ＩＣＡＮＳ）基準（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１９）
・ＧｖＨＤ、パートＡ及びＢ：
○Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ Ａｃｕｔｅ ＧＶＨＤ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＭＡＧＩＣ）基準（Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ２２，４－１０）

【0257】

ＣＴＸ１２０と妥当な因果関係のないＡＥは、ＤＬＴであると見なされる。

【0258】

ＤＬＴは、（発症時期に対して）特定の期間を超えて持続する、ＤＬＴ評価期間中に発生した、以下のＣＴＸ１２０に関係する事象のいずれかとして定義される。
Ａ．グレード４のＣＲＳ。
Ｂ．グレード３又は４の神経毒性（ＩＣＡＮＳ基準に基づく）。
Ｃ．ステロイド抵抗性のグレード≧２のＧｖＨＤ（例えば、ステロイド治療［例えば、１ｍｇ／ｋｇ／日］の３日後の進行性疾患、又は治療の７日後に反応がない）。
Ｄ．ＤＬＴ期間中の死亡（疾患進行に起因するものを除く）。
Ｅ．任意のＣＴＸ１２０に関係するグレードが≧３の、任意の期間の重要な臓器毒性（例えば、肺、心臓）であり、以下に列挙されるものを除く。

【0259】

以下のものはＤＬＴであると見なさない。
１．７２時間以内にグレード≦２まで改善するグレード３のＣＲＳ。
２．＜７日継続するグレード≦３の腫瘍崩壊症候群。
３．グレード３又は４の発熱。
４．支持療法を開始して４８時間以内にグレード≦２まで改善する、グレード≧３のアレルギー反応。
５．＜７日継続するグレード３の疲労。
６．血小板減少症（血小板数が＜５０×１０９個／Ｌ）の状態における出血、好中球減少症（好中球絶対数［ＡＮＣ］が＜１０００／ｍｍ３）の状態における確認された細菌感染症又は発熱。
７．グレード３又は４の低ガンマグロブリン症。
８．７日以内にグレード≦２まで改善するグレード３又は４の肝機能検査。
９．７日以内にグレード≦２まで改善するグレード３又は４の腎不全。
１０．４８時間以内にグレード≦２まで改善するグレード３又は４の心不整脈。
１１．７２日以内にグレード≦２まで回復するグレード３又は４の肺毒性。個別の、ＣＴＸ１２０に関係する、且つＣＲＳの一部としての支持療法に続発しないグレード３又は４の事象は、ＤＬＴと見なされる。
１２．後ろ向きに評価されるグレード３又は４の血小板減症少又は好中球減少症。少なくとも６人の対象に注入した後、対象の≧５０％に長期間の血球減少がある（即ち、注入後２８日超継続している）場合は、用量漸増を中断すべきである。ＬＤ化学療法の開始時点に存在していたグレード≧３の血球減少は、ＤＬＴと見なされないことがある。別の病因が同定され得る。

【0260】

４．試験処置
４．１ リンパ球除去（ＬＤ）化学療法
全ての対象は、ＣＴＸ１２０の注入前にＬＤ化学療法を受ける。ＬＤ化学療法は、以下からなる：（１）フルダラビン３０ｍｇ／ｍ^２をＩＶで毎日３用量、及び（２）シクロホスファミド３００ｍｇ／ｍ^２をＩＶで毎日３用量。

【0261】

どちらの剤も同じ日に開始し、全てのコホートに対して３日連続で投与する。対象は、試験組み入れの７日以内にＬＤ化学療法を開始しなければならない。中程度の腎機能障害（クレアチニンクリアランス［ＣｒＣｌ］３０～７０ｍＬ／分／１．７３ｍ２）を有する成人対象は、フルダラビンの用量を２０％減少させ、適用可能な処方情報に従って注意深く観察しなければならない。

【0262】

どちらのＬＤ化学療法剤も同じ日に開始し、３日連続で投与する。対象は、試験組み入れの７日以内にＬＤ化学療法を開始しなければならない。

【0263】

ＬＤ化学療法に関連する保存、調製、投与、支持療法の指示、及び毒性管理に関するガイダンスに関しては、フルダラビン及びシクロホスファミドに関する地域の処方情報を参照されたい。

【0264】

ＬＤ化学療法は、次の徴候又は症状のいずれかが存在する場合に延期され得る：
・ＬＤ化学療法に関連するＡＥの潜在的リスクを増大させる、臨床状態の著しい悪化があること。
・飽和レベル＞９１％を維持するために、酸素補給を必要とすること。
・新たなコントロール不良な心不整脈があること。
・血管収縮薬のサポートを必要とする低血圧があること。
・以下の活動性感染症があること：処置に反応しない細菌、真菌又はウイルスに対して陽性の血液培養。
・ＩＣＡＮＳ（例えば、発作、脳卒中、精神状態における変化）のリスクを増大させることが知られている神経毒性があること。４８時間未満継続し、可逆的と見なされる良性由来の神経毒性（例えば、頭痛）は許容され得る。

【0265】

４．２ ＣＴＸ１２０の投与
ＣＴＸ１２０は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によって改変された同種Ｔ細胞からなり、凍結保存溶液（ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ－５）中に再懸濁され、６ｍＬの注入バイアル中で提供される。ＣＴＸ１２０の固定用量（ＣＡＲ＋ Ｔ細胞の数に基づく）を、単回ＩＶ注入として投与する。複数のバイアル中に総用量が含まれていてもよい。注入は、好ましくは中心静脈カテーテルを通じて行うべきである。白血球フィルターを使用する必要はない。

【0266】

ＣＴＸ１２０注入を開始する前に、現場の薬局は、処置されたそれぞれの特定の対象のために２用量のトシリズマブ及び非常設備が利用可能であることを確認する。ＣＴＸ１２０注入の約３０～６０分前に、現場の実施基準に従って、アセトアミノフェン（即ち、パラセタモール又は現場の処方書に従った等価物）をＰＯで、及び塩化ジフェンヒドラミン（又は現場の処方書に従った別のＨ１－抗ヒスタミン剤）をＩＶ又はＰＯで対象に前投与する。ＣＴＸ１２０の活性と干渉する可能性があるため、予防的な全身性副腎皮質ステロイドを投与しない。

【0267】

７×１０^４ＴＣＲ^＋細胞／ｋｇの用量制限が存在し、全ての用量レベルに対してこの用量制限がかけられる。投与されるＣＴＸ１２０ロット中のＣＡＲ^＋細胞の割合に基づいて、より高い用量レベル（例えば、ＤＬ４）での組み入れは、ＴＣＲ^＋細胞の制限を超えないことを確実にするために、最小体重を有する対象に制限することができる。ＣＴＸ１２０注入の前に中断しなければならない薬剤については、下記を参照されたい。

【0268】

ＣＴＸ１２０の注入は、次の徴候又は症状のいずれかが存在する場合に延期され得る：
・新たな活動性のコントロール不良な感染症。
・毒性のリスクの増大した状況に対象が置かれるような、ＬＤ化学療法開始前と比較した臨床状態の悪化。
・ＩＣＡＮＳ（例えば、発作、脳卒中、精神状態における変化）のリスクを増大させることが知られている神経毒性があること。４８時間を超えない間継続し、可逆的と見なされる良性由来の神経毒性（例えば、頭痛）は許容される。

【0269】

ＣＴＸ１２０細胞は、ＬＤ化学療法が完了した後の少なくとも４８時間（ただし７日間以下）に投与する。１０日を超えてＣＴＸ１２０の注入を延期する場合は、ＬＤ化学療法を繰り返す必要がある。

【0270】

ＣＴＸ１２０の調製、保存、取り扱い、及び投与における詳細な指示に関しては、注入マニュアルを参照されたい。

【0271】

４．２．１ ＣＴＸ１２０注入後のモニタリング
ＣＴＸ１２０を注入した後、注入して２時間後、又はあらゆる潜在的な臨床症状が回復するまで、３０分毎に対象のバイタルを観察しなければならない。

【0272】

パートＡの対象を、ＣＴＸ１２０注入後の最低でも７日間、観察のために入院させる。パートＢにおける注入後の入院については、用量漸増期間に得られた安全性情報に基づいて考慮され、実行され得る。パートＢでは、観察のための入院が考慮され得る。パートＡ及びＢにおいて、観察のための入院の期間は、地域の規制又は現地の慣行によって必要とされる場合に延長することができる。パート及びパートＢのいずれの場合も、対象はＣＴＸ１２０の注入後の少なくとも２８日間、調査現場の近辺（即ち、１時間の移動時間）内に留まる必要がある。急性のＣＴＸ１２０に関係する毒性の管理は、試験現場のみで行うべきである。

【0273】

評価スケジュール（下記の表１８及び表１９）に従って、ＣＲＳ、腫瘍崩壊症候群（ＴＬＳ）、神経毒性、ＧｖＨＤ、及び他のＡＥの徴候について対象を観察する。ＣＡＲ Ｔ細胞に関係する毒性の管理に関するガイドラインを、本明細書に記載する。対象は、ＣＴＸ１２０に関係する非血液学的毒性（例えば、発熱、低血圧、低酸素、進行中の神経毒性）がグレード１に回復するまで、入院を継続しなければならない。対象は、更に長期間にわたって入院を継続してもよい。

【0274】

４．３ 既存及び併用薬
４．３．１ 許容される薬剤
以下に列挙される禁止された薬剤を除く、感染症を治療するためのＩＶ抗生物質、成長因子、血液成分、及び骨指向性療法（ゾレドロン酸又はデノスマブを含む）を含む、最適な医療に必要となる支持手段が、試験全体を通して得ることができる。

【0275】

処方薬及び非処方薬、並びに医療処置を含む全ての併用療法は、署名されたインフォームドコンセントの日付からＣＴＸ１２０の注入後３ヵ月まで記録しなければならない。ＣＴＸ１２０の注入後３ヵ月からは、以下の選択された併用薬：ＩＶ免疫グロブリン、ワクチン接種、抗癌治療（例えば、化学療法、放射線照射、免疫療法）、免疫抑制剤（ステロイドを含む）、骨指向性療法、及び任意の治験薬のみが収集され得る。

【0276】

４．３．２ 禁止される薬剤
下記に指定するように、試験の一定期間の間、以下の薬剤が禁止される：
・薬理学的用量（＞１０ｍｇ／日のプレドニゾン又は他の副腎皮質ステロイドの等価用量）での副腎皮質ステロイド療法、及び他の免疫抑制薬は、新たな毒性又はＣＲＳ若しくは本明細書で記載されるようなＣＴＸ１２０に関連する神経毒性の管理の一部として治療するように医学的に指示されない限り、ＣＴＸ１２０を投与した後は避けるべきである。
・ＣＲＳの症状を悪化させる可能性があるため、ＣＴＸ１２０注入後の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）。
・ＣＴＸ１２０後のＧ－ＣＳＦの投与には注意を払うべきである。
・組み入れの２８日以内～ＣＴＸ１２０の注入後３ヵ月の生ワクチン。
・あらゆる抗癌療法（例えば、化学療法、免疫療法、標的療法、放射線照射、若しくは他の治験薬）、又は疾患が進行する前のＬＤ化学療法。程度、線量、部位に応じた、症状管理のための緩和的放射線療法は許容される。部位、線量、及び程度は、判断のためメディカルモニターによって規定され、報告される必要がある。

【0277】

５．毒性管理
５．１ 一般的ガイダンス
ＬＤ化学療法の前に、易感染性状態のＭＭ患者に対する施設の標準治療に従って、感染症予防（例えば、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤）に着手しなければならない。

【0278】

ＣＴＸ１２０注入後、少なくとも２８日間は対象を注意深く観察しなければならない。重大な毒性が、自家ＣＡＲ Ｔ細胞療法で報告されている。これはヒト初回試験であり、ＣＴＸ１２０の臨床上の安全性は説明されていないが、以下の一般的な推奨事項が示される：
・発熱はＣＲＳの最も一般的な初期症状である。しかしながら、対象は最初の症状として脱力感、低血圧又は錯乱を示す場合もある。
・ＣＲＳの診断は、臨床検査値ではなく臨床症状に基づいて行われるべきである。
・ＣＲＳに特有の管理に反応しない対象では、常に敗血症及び抵抗性感染症を考慮する。抵抗性又は緊急を要する細菌感染症と同様に、真菌又はウイルス感染症について対象を継続的に評価しなければならない。
・ＣＡＲ Ｔ細胞注入後、ＣＲＳ、ＨＬＨ、及びＴＬＳが同時に発生する可能性がある。全ての状態の徴候及び症状について対象を一貫して観察し、適切に管理しなければならない。
・神経毒性は、ＣＲＳの発症時、ＣＲＳの回復時又はＣＲＳの回復後に発生する可能性がある。神経毒性のグレード分類及び管理は、ＣＲＳと別に実施してもよい。
・トシリズマブは指示を受けたときから２時間以内に投与しなければならない。

【0279】

加えて、ＣＴＸ１２０の同種異系の性質により、ＧｖＨＤの徴候を注意深く観察すべきである（下記の説明を参照されたい）。

【0280】

５．２ 毒性特異的ガイダンス
５．２．１ 注入反応
注入反応が発生した場合、アセトアミノフェン（パラセタモール）及び塩化ジフェンヒドラミン（又は別のＨ１－抗ヒスタミン剤）をＣＴＸ１２０注入後の６時間毎に繰り返し与えてもよい。

【0281】

対象にアセトアミノフェンで緩和されない発熱が続く場合、必要に応じて非ステロイド系抗炎症薬を処方してもよい。全身性ステロイドは、この介入によってＣＡＲ Ｔ細胞に有害な影響を及ぼす可能性があるため、生命を脅かす緊急事態の場合を除いて投与すべきではない。

【0282】

５．２．２ 発熱反応及び感染症予防
易感染性状態のＭＭ患者に対する施設の標準治療に従って、感染症予防を行わなければならない。

【0283】

発熱反応がある場合、感染症の評価を開始し、治療する医師が医学的に指示し、決定された通りの抗生物質、輸液及び他の支持療法によって対象を適切に管理しなければならない。発熱が持続する場合、対象の医学的管理の全体を通してウイルス及び真菌の感染を考慮すべきである。ＣＴＸ１２０注入後に対象が敗血症又は全身性菌血症を発症した場合、適切な培養及び医学的管理を開始しなければならない。更に、ＣＴＸ１２０注入後の３０日以内に発熱したいずれの場合にもＣＲＳを考慮に入れるべきである。

【0284】

ＣＴＸ１２０を受けた後に神経認知的症状を示す対象の鑑別診断に、ウイルス性脳炎（例えば、ヒトヘルペスウイルス［ＨＨＶ］－６脳炎）を考慮に入れなければならない。腰椎穿刺（ＬＰ）は、グレード３又はそれ以上の神経認知毒性に必要とされ、グレード１及びグレード２の事象に強く推奨されている。腰椎穿刺を実施する場合は必ず、感染症疾患パネルは（少なくとも）以下の評価からのデータを精査する：ＨＳＶ１及び２、エンテロウイルス、ヒトパレコウイルス、ＶＺＶ、ＣＭＶ、並びにＨＨＶ－６の定量検査。腰椎穿刺は、症状の発症の４８時間以内に実施しなければならず、且つ、対象を適切に管理するために、ＬＰの４日以内に感染症疾患パネルからの結果が得られるようにしなければならない。

【0285】

５．２．３ 腫瘍崩壊症候群
ＣＡＲ Ｔ細胞療法を受けている対象は、ＴＬＳのリスクが高い可能性がある。ＬＤ化学療法の開始からＣＴＸ１２０注入後２８日までは、臨床検査評価及び症状によりＴＬＳについて対象を注意深く観察する必要がある。

【0286】

スクリーニング中及びＬＤ化学療法の開始前に、ＴＬＳのリスクの高い対象に予防的にアロプリノール（又はフェブキソスタットなどのアロプリノールでない代替薬）を受けさせ、経口／ＩＶでの水分補給を増やす必要がある。ＣＴＸ１２０注入後の２８日後又はＴＬＳのリスクが過ぎ去った時点で、予防を中止することができる。

【0287】

部位を観察し、ＴＬＳをそれらの施設の標準治療に従って、又は公表されたガイドラインに従って治療しなければならない（Ｃａｉｒｏ ａｎｄ Ｂｉｓｈｏｐ，２００４，Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ １２７，３－１１）。ラスブリカーゼの投与を含むＴＬＳの管理は、臨床的に必要である場合、直ちに開始すべきである。

【0288】

５．２．４ サイトカイン放出症候群
ＣＲＳは、ＣＡＲが標的抗原に結合したことに反応して免疫系が過剰に活性化するために生じるものであり、急激なＴ細胞の刺激及び増殖によりマルチサイトカインの上昇がもたらされる（Ｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｂｌｏｏｄ １２４，２２９６；Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４ａ，Ｃａｎｃｅｒ Ｊ ２０，１１９－１２２）。サイトカインが放出されると、心臓、胃腸（ＧＩ）、神経、呼吸器（呼吸困難、低酸素）、皮膚、心血管（低血圧、頻脈）並びに全身症状（発熱、硬直、発汗、食欲不振、頭痛、倦怠感、疲労、関節痛、悪心及び嘔吐）、並びに検査所見の異常（凝固、腎臓及び肝臓）を含む、ＣＲＳに関連した様々な臨床徴候及び症状が生じ得る。

【0289】

ＣＲＳの管理の目標は、ＣＴＸ１２０の抗腫瘍効果の可能性を維持しながら、生命を脅かす後遺症を防止することである。症状は通常、自家ＣＡＲ Ｔ細胞療法の１～１４日後に発症するが、同種ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞については、症状の発症するタイミングが完全には定義されていない。

【0290】

ＣＲＳは、臨床検査でのサイトカイン測定値ではなく、臨床症状に基づいて特定し、治療すべきである。ＣＲＳが疑われる場合は、以下のようにグレード分類及び管理を実施しなければならない：
・パートＡでは、グレード分類及び管理は、ＣＲＳグレード分類のために２０１４年のＬｅｅ基準から適用される、下記の表１０及び１２内の推奨事項に従って実施しなければならない（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
・パートＢでは、グレード分類は、２０１９年のＡＳＴＣＴ（以前は米国造血細胞移植学会として知られている）コンセンサスの推奨事項に従って適用しなければならず（下記の表１１）（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１９）、管理は、公表されたガイドライン（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１９）から適用される表１０及び１２内の推奨事項に従って実施しなければならない。

【0291】

元来のプロトコルのバージョン（Ｖ１．０）の時点では、ＣＲＳのグレード分類のために確立された２０１４年のＬｅｅ基準が適用された（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。しかしながら、この基準は、ＣＲＳのグレード分類の世界的標準となったＡＳＴＣＴ基準（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１９）に更新されている。従って、治験のパートＢ（コホート拡大）の期間では、ＡＳＴＣＴ基準が使用されることになる。公開されたＣＲＳグレード分類基準の両方（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１９）が、今後のＣＲＳの報告に使用されることになる。

【0292】

神経毒性は、本明細書内に記載されるようにグレード分類され、管理される。ＣＲＳの管理の文脈における終末器官毒性（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１９）は、肝臓及び腎臓系のみを指す（Ｐｅｎｎ Ｇｒａｄｉｎｇ ｃｒｉｔｅｒｉａ）（Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１８）の通り）。

【0293】

【表15】

【0294】

【表16】

【0295】

【表17】

【0296】

【表18】

【0297】

５．２．５ 免疫エフェクター細胞関連神経毒性症候群（ＩＣＡＮＳ）
神経毒性は、ＣＲＳの発症時、ＣＲＳの回復時又はＣＲＳの回復後に発生する可能性があり、その病態生理は不明である。近年のＡＳＴＣＴのコンセンサスの推奨事項では、ＣＲＳに関連する神経毒性を、内在性の又は注入されたＴ細胞及び／又は他の免疫エフェクター細胞の活性化又は会合をもたらす任意の免疫療法後のＣＮＳに関与する病理過程を特徴とする障害であるＩＣＡＮＳであると更に定義している（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。

【0298】

徴候及び症状は進行性である可能性があり、失語症、意識レベルの変化、認知技能の機能障害、運動麻痺、発作及び脳浮腫を含み得る。ＩＣＡＮＳのグレード分類（表１５）は、ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌ－ｔｈｅｒａｐｙ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＴＯＸｉｃｉｔｙ（ＣＡＲＴＯＸ）ワーキンググループの基準に基づいて開発されており、以前は自家ＣＡＲ Ｔ細胞の臨床試験で使用されていた（Ｎｅｅｌａｐｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。ＩＣＡＮＳでは、ＩＣＥ（免疫エフェクター細胞関連脳症）評価ツールと呼ばれる修正された評価ツールを使用することにより、意識レベル、発作の有無、運動所見、脳浮腫の有無の評価及び神経性領域の全体的な評価を組み入れている（本明細書の開示及び表２１を参照されたい）。

【0299】

任意の新たに発症した神経毒性の評価には、神経学的検査（ＩＣＥ評価ツール、表２１を含む）、脳磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、及び臨床的に必要であればＣＳＦの検査（腰椎穿刺による）が含まれていなければならない。感染性の病因は、可能な限り、（特にグレード３又は４のＩＣＡＮＳを有する対象に）腰椎穿刺を実施することによって除外する必要がある。脳ＭＲＩが実行できない場合は、全ての対象に非造影ＣＴスキャンを受けさせて、脳内出血を除外する必要がある。臨床的に必要であれば、脳波も考慮に入れる必要がある。重症例では、気道保護のために気管内挿管が必要になる場合がある。

【0300】

ＣＴＸ１２０注入後の少なくとも２１日間、又は神経学的症状が回復した時点で、特に発作の病歴を有する対象に非鎮静性型の抗発作予防（例えば、レベチラセタム）を考慮すべきである（抗発作薬が有害な症状の要因となっていると見なされる場合を除く）。グレードが≧２のＩＣＡＮＳを示す対象は、継続的な心電図遠隔測定及びパルスオキシメトリーによって観察する必要がある。重度又は生命を脅かす神経毒性に対しては、集中治療の支持療法を施すべきである。神経内科の受診を常に考慮すべきである。血小板及び凝固障害の徴候について観察し、脳内出血のリスクを低減させるために血液製剤を適切に輸液すること。表１４に神経毒性のグレード分類を示し、表１５に管理ガイダンスを示す。

【0301】

積極的なステロイド処置を３日超受ける対象には、長期間のステロイドの使用による重症感染のリスクを軽減するために、抗真菌及び抗ウイルス予防が推奨されている。抗微生物の予防も考慮に入れる必要がある。

【0302】

【表19】

【0303】

【表20】

【0304】

６．２．６ 血球貪食性リンパ組織球症
血球貪食性リンパ組織球症は、活性化Ｔ細胞からのサイトカインの産生によって過剰なマクロファージの活性化をもたらす、ＣＡＲ Ｔ細胞注入後の炎症反応の結果として生じる臨床症候群である。ＨＬＨの徴候及び症状には、発熱、血球減少症、肝脾腫、高ビリルビン血症を伴う肝障害、フィブリノーゲンが著しく低下する凝固障害並びにフェリチン及びＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の顕著な上昇が含まれ得る。

【0305】

ＣＲＳ及びＨＬＨは、臨床的特徴及び病態生理が重複した、類似する臨床症候群を有し得る。ＨＬＨは、ＣＲＳの発症時又はＣＲＳが回復しているときに発生する可能性が高い場合がある。他のＣＲＳのエビデンスの有無にかかわらず、原因不明の肝機能検査値の上昇又は血球減少がある場合、ＨＬＨを考慮すべきである。ＣＲＰ及びフェリチンを観察することによって、診断を支援し、臨床経過を明確にすることができる。

【0306】

ＨＬＨが疑われる場合、
・フィブリノーゲンを含む凝固パラメータを頻繁に観察する。これらの試験は、評価スケジュールで指示されたものよりも頻繁に行われる可能性があり、臨床検査所見に基づいて頻度を促進する必要がある。
・出血のリスクを低減するため、フィブリノーゲンは≧１００ｍｇ／ｄＬに維持しなければならない。
・血液製剤によって凝固障害を是正しなければならない。
・ＣＲＳとの重複を考慮して、パートＡの表１０及びパートＢの表１２内のＣＲＳの治療ガイダンスに従って対象を同様に管理するべきである。

【0307】

５．２．７ 血球減少症
ＣＴＸ１２０を受ける対象は、好中球減少症（例えば、グレード３）及び／又は血小板減少症について観察され、適切なサポートを受ける。血小板及び凝固障害の徴候について観察し、出血のリスクを低減させるために血液製剤を適切に輸液すること。長期間の好中球減少症の任意の対象には、抗微生物及び抗真菌予防を考慮しなければならない。

【0308】

用量漸増の期間中、ＣＴＸ１２０注入後のグレード３又は４の好中球減少症の場合に、Ｇ－ＣＳＦが考慮され得る。用量拡大の期間中に、Ｇ－ＣＳＦが投与され得る。

【0309】

５．２．８ 移植片対宿主病
ＧｖＨＤは同種ＳＣＴの状態において見られるものであり、免疫適格性のドナーのＴ細胞（移植片）がレシピエント（宿主）を異物と認識した結果として生じるものである。その後の免疫反応では、ドナーのＴ細胞が活性化し、異物である抗原保有細胞を排除するためにレシピエントを攻撃する。ＧｖＨＤは、同種ＳＣＴからの時間及び臨床症状の両方に基づいて、急性症候群、慢性症候群及びオーバーラップ症候群に分けられる。急性ＧｖＨＤの徴候には、斑状丘疹状皮疹；胆汁鬱滞をもたらす小胆管の損傷に起因する黄疸を伴う高ビリルビン血症；悪心、嘔吐及び食欲不振；並びに水様性下痢又は血性下痢及び痙性腹痛を挙げることができる（Ｚｅｉｓｅｒ ａｎｄ Ｂｌａｚａｒ，２０１７；Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７７，２１６７－２１７９）。提唱されている臨床試験を裏付けるために、マウス当たり４×１０^７個のＣＴＸ１２０細胞（約１．６×１０^９細胞／ｋｇ）の単回ＩＶ用量によって処置した細胞免疫不全マウスにおいて、１２週間の非臨床の優良試験所基準に準拠したＧｖＨＤ及び忍容性試験を実施した。この用量レベルは、体重に標準化した場合、提唱されている最も高い臨床用量を１００倍超上回るものである。ＣＴＸ１２０は、１２週間の試験過程の間に、易感染性の（ＮＳＧ）マウスにおいて臨床的なＧｖＨＤを誘導しなかった。

【0310】

更に、ＴＲＡＣ座位でＣＡＲを挿入するという特異性により、Ｔ細胞がＣＡＲ＋及びＴＣＲ＋の両方である可能性は極めて低い。残りのＴＣＲ＋細胞を、製造過程中に抗ＴＣＲ抗体カラムのイムノアフィニティークロマトグラフィーにより除去し、最終生成物中＜０．５％のＴＣＲ＋細胞を得た。全ての用量レベルには、７×１０^４ＴＣＲ＋細胞／ｋｇの用量制限が課せられ得る。この制限値は、ハプロタイプ一致ドナーによるＳＣＴ中に重篤なＧｖＨＤを引き起こす可能性のある同種細胞の数に関して公表された報告書に基づいた１×１０^５ＴＣＲ＋細胞／ｋｇの制限値よりも低い（Ｂｅｒｔａｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｂｌｏｏｄ １２４，８２２－８２６）。ＣＴＸ１２０の注入後は、急性ＧｖＨＤの徴候について対象を注意深く観察する必要がある。

【0311】

ＧｖＨＤの診断及びグレード分類は、下記の表１６に概説するように、公表されているＭＡＧＩＣ基準（Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６）に基づくものでなければならない。

【0312】

【表21】

【0313】

全体的なＧｖＨＤのグレードは、最も重篤な標的臓器障害に基づいて決定され得る。
・グレード０：段階１～４の臓器がまったくない。
・グレード１：肝臓、上部ＧＩ又は下部ＧＩ障害を伴わない段階１～２の皮膚。
・グレード２：段階３の発疹及び／又は段階１の肝臓及び／又は段階１の上部ＧＩ及び／又は段階１の下部ＧＩ。
・グレード３：段階０～３の皮膚及び／又は段階０～１の上部ＧＩを伴う段階２～３の肝臓及び／又は段階２～３の下部ＧＩ。
・グレード４：段階０～１の上部ＧＩを伴う段階４の皮膚、肝臓又は下部ＧＩ障害。

【0314】

感染症及び薬剤に対する反応性などの、ＧｖＨＤを模倣する可能性のある潜在的な交絡因子を除外しなければならない。確認のため、治療を開始する前又は治療を開始した直後に皮膚生検及び／又はＧＩ生検を入手する必要がある。肝臓障害がある場合、臨床的に実行可能であれば、肝生検を試みるべきである。また、病理評価のために、全ての生検試料を中央検査機関に送付してもよい。試料の調製及び発送の詳細は、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌに収録されている。

【0315】

急性ＧｖＨＤの処置に関する推奨事項を下記の表１７で概説する。試験終了時に対象間の比較ができるように、これらの推奨事項に従わなければならないが、これらに従うことによって対象を危険にさらす恐れのある特定の臨床シナリオを除く。

【0316】

【表22】

【0317】

より重度のＧｖＨＤの対象に対して、二次治療を開始するという判断を直ちに下さなければならない。例えば、ＧｖＨＤの症状が進行して３日後、グレード３のＧｖＨＤが持続して１週間後又はグレード２のＧｖＨＤが持続して２週間後に二次治療が指示され得る。高用量のグルココルチコイド治療に忍容性を示さない可能性のある対象には、より早期に二次全身療法が指示され得る（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ １８，１１５０－１１６３）。二次治療の選択及び開始時期は、医師の判断に基づく。

【0318】

難治性の急性ＧｖＨＤ又は慢性ＧｖＨＤの処置は、施設のガイドラインに従う。免疫抑制剤（ステロイドを含む）によって対象を治療する場合、地域のガイドラインに従って抗感染症予防対策を導入する必要がある。

【0319】

５．２．９ 低血圧及び腎不全
ＣＴＸ１２０細胞を受けた対象において低血圧及び腎不全を観察すべきであり、施設の診療ガイドラインに従い、生理食塩水をＩＶでボーラス投与することによって処置する必要がある。適切であれば、透析を考慮する必要がある。

【0320】

６．試験手順
試験の用量漸増パート及び拡大パートは共に、以下の３つの個々の段階：（１）スクリーニング及び適格性確認、（２）種々のＬＤ／免疫調節剤による処置、及びＣＴＸ１２０の注入、並びに（３）追跡調査で構成される。

【0321】

スクリーニング期間中に、上記で概説した適格性基準に従って対象を評価する。組み入れ後、対象は、種々の治療計画のＬＤ／免疫調節剤、その後ＣＴＸ１２０の注入を受ける。処置期間が完了した後に、ＭＭ反応性、疾患進行、及び生存について対象を評価する。全ての試験期間の全体にわたって、対象を安全性について定期的に観察する。

【0322】

完全な評価スケジュールを下記の表１８及び表１９に示す。本項では、全ての必要となる試験手順についての説明が示される。プロトコルに定められた評価に加えて、対象は、施設のガイドラインに従わなければならず、臨床的に必要であれば、スケジュール外の評価を実施しなければならない。

【0323】

８日目以降の来院に関する特定の評価は、在宅訪問又は代替場所での訪問として実施してもよい。評価には、病院利用、健康状態の変化及び／又は処方の変更、身体システムの評価、生命徴候、体重、ＰＲＯ質問票の配布、並びに地域及び中央検査機関の評価のための血液試料の採取が含まれる。

【0324】

本プロトコルの目的上、０日目は存在しない。全ての来院日及び来院枠は、ＣＴＸ１２０を注入した日付として、１日目によって計算されることになる。

【0325】

【表23】

【0326】

【表24】

【0327】

【表25】

【0328】

【表26】

【0329】

【表27】

【0330】

６．１ 対象のスクリーニング及び組み入れ
スクリーニング期間は、対象がＩＣＦに署名した日に開始し、適格性確認から試験への組み入れまで継続する。インフォームドコンセントを入手した時点で、評価スケジュール（表ＸＸＸ）に概説されるように、対象をスクリーニングして試験の適格性を確認することができる。スクリーニングの評価は、対象がインフォームドコンセントに署名して１４日以内に完了しなければならない。

【0331】

対象は、単回の再度のスクリーニングが許容され、最初の同意の３ヵ月以内に行われ得る。

【0332】

６．２ 試験評価
必要となる処置のタイミングについては、評価スケジュール（表１８及び表１９）を参照されたい。年齢、性別、人種、及び民族性を含む人口統計学的データを収集する。対象の疾患の全病歴、これまでの癌治療、及び診断データからの治療に対する反応を含む病歴を入手する。心臓の病歴、神経系の病歴、及び手術歴を入手する。試験に参加する場合、全ての対象が全ての組み入れ基準を満たし、且つ本明細書で記載されるような除外基準がないことが必要となる。

【0333】

６．２．１ 身体検査
主要な身体システム、例えば、一般的外見、皮膚、首、頭、目、耳、鼻、喉、心臓、肺、腹、リンパ節、四肢、及び神経系の検査を含む身体的検査を、試験来院毎に実施し、その結果を記録する。スクリーニング時に実施した検査から認められる変化をＡＥとして記録する。

【0334】

座位血圧、心拍数、呼吸数、パルスオキシメトリー、及び体温を含む生命徴候を試験来院毎に記録する。表１８のスケジュールに従って体重を取得し、身長はスクリーニング時のみ取得する。

【0335】

６．２．２ ＥＣＯＧ一般状態
一般状態をスクリーニング時、ＣＴＸ１２０注入時（１日目、注入前）、２８日目、及び３ヵ月目の来院時にＥＣＯＧ尺度を使用して評価し、対象の一般的な健康及び日常生活の活動を行うための能力を測定する（下記の表２０）。

【0336】

【表28】

【0337】

６．２．３ 心エコー図
適格性を確認するために、スクリーニング時に（左室駆出分画を評価するための）経胸壁心エコー図を実施し、訓練された医療関係者によって読み取ってもよい。

【0338】

グレード３又は４のＣＲＳの間に、低血圧のために＞１回の輸液ボーラスを必要とする全ての対象、血行動態管理のために集中治療室に移された全ての対象、又は低血圧のために任意の用量の血管収縮薬を必要とする全ての対象に更なる心臓の評価を実施するべきである（Ｂｒｕｄｎｏ ａｎｄ Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ，２０１６，Ｂｌｏｏｄ １２７，３３２１－３３３０）。

【0339】

６．２．４ 心電図
スクリーニング中、治療初日のＬＤ化学療法の前、１日目、及び２８日目のＣＴＸ１２０を投与する前に、１２誘導心電図（ＥＣＧ）を入手する。ＥＣＧからＱＴｃ間隔及びＱＲＳ間隔を決定する。更なるＥＣＧを入手してもよい。

【0340】

６．２．５ 免疫エフェクター細胞関連脳症の評価
神経認知評価は、ＩＣＥ評価を用いて実施することができる。ＩＣＥ評価ツールは、ＣＡＲＴＯＸ－１０スクリーニングツールをわずかに修正したバージョンであり、現在では受容性失語症の検査が含まれている（Ｎｅｅｌａｐｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７７，２５３１－２５４４）。ＩＣＥ評価は、様々な領域の認知的機能：見当識、呼称、指示の追従、筆記、及び注意を検査するものである（表２１）。

【0341】

【表29】

【0342】

ＩＣＥ評価は、スクリーニング時、１日目、及び２日目、３日目、５日目、８日目、及び２８日目のＣＴＸ１２０投与前に実施し得る。対象がＣＮＳの症状を示す場合、症状がグレード１又はベースラインに回復するまでＩＣＥ評価を約２日毎に継続して実施する必要がある。変動性を最小限に抑えるために、可能な限り、ＩＣＥ評価ツールの実施に精通しているか又は訓練を受けた同一の研究職員によって評価を実施するべきである。

【0343】

６．２．６ 患者報告アウトカム
表１８及び表１９のスケジュールに従って、３種の患者報告アウトカム（ＰＲＯ）調査、欧州癌研究治療機関（ＥＯＲＴＣ）ＱＬＱ－Ｃ３０、ＥＯＲＴＣ ＱＬＱ－ＭＹ２０、及びＥｕｒｏＱｏｌ ＥＱ－５Ｄ－５Ｌ質問票を実施する。質問票は、臨床評価を実施する前に完了しなければならない（対象が最も精通している言語で自己記入する）。

【0344】

ＥＯＲＴＣ ＱＬＱ－Ｃ３０は、癌患者の肉体的、心理的、及び社会的機能を測定するためにデザインされた質問票である。５つの多項目尺度（肉体的、役割的、社会的、感情的、及び認知的機能）、並びに９つの単一項目（痛み、疲労、経済的影響、食欲の喪失、悪心／嘔吐、下痢、便秘、睡眠障害、及び生活の質）で構成されている。ＥＯＲＴＣ ＱＬＱ－Ｃ３０は、有効性が確認されており、多発性骨髄腫患者を含む癌患者の間で広く使用されている（Ｗｉｓｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ ９２，６０４－６１３；及びＷｉｓｌｏｆｆ ａｎｄ Ｈｊｏｒｔｈ，１９９７，Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ ９７，２９－３７）。

【0345】

ＱＬＱ－ＭＹ２０質問票は、ＥＯＲＴＣ ＱＬＱ－Ｃ３０の骨髄腫に特化したモジュールであり、ＭＭ患者のために、症状及び治療の副作用、並びに毎日の生活に及ぼす影響を評価するようにデザインされている。モジュールは２０個の質問から構成され、骨髄腫において重要な生活の質の４つの領域：痛み、治療の副作用、社会的サポート及び将来的な見通し、疾患特異的症状及び毎日の生活に及ぼす影響、治療の副作用、社会的サポート、及び将来的な見通しに対処している（Ｃｏｃｋｓ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ４３，１６７０－１６７８）。

【0346】

ＥＱ－５Ｄ－５Ｌは、健康状態を一般的に測定するものであり、運動性、身の回りの世話、日常活動能力、痛み／不快感、及び不安／抑うつ、加えて視覚的アナログスケールを含む５つの領域を評価する質問票を含む。ＥＱ－５Ｄ－５Ｌは、ＱＬＱ－Ｃ３０及びＱＬＱ－ＭＹ２０と共に、ＭＭにおいて使用されてきた（Ｍｏｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ３３，２９３４－２９４６）。

【0347】

６．２．７ ＭＭ疾患及び奏効評価
疾患評価は、多発性骨髄腫における奏効及び微小残存病変（ＭＲＤ）を評価するためのＩＭＷＧ基準（下記の表２２）（Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）に従った評価に基づくものであってよく、これが評価される。試験の適格性の判断並びに対象の管理及び疾患進行に関する決定が行われる。有効性分析について、疾患のアウトカムを下記の表２２に示すＩＭＷＧ奏効基準を用いてグレード分類する。ＭＭ疾患及び奏効評価は、表１２及び表１３のスケジュールに従って実施すべきであり、下記に記載した評価が含まれ得る。全ての奏効カテゴリー（進行を含む）は、連続した２回の評価が必要であり、任意の新たな療法を開始する前の任意の時点で少なくとも１週間の間隔を空けて行われる。

【0348】

【表30】

【0349】

【表31】

【0350】

【表32】

【0351】

【表33】

【0352】

血清及び尿中のモノクローナルタンパク質の測定
Ｍタンパク質を測定するための血液及び２４時間の尿試料を、表１８及び表１９のスケジュールに従って、且つ臨床的に必要である場合、中央検査機関に送付して分析してもよく、有効性を分析するためにＩＲＣによって精査してもよい。血清及び２４時間の尿試料は、各時点、及び中央検査機関によって実施される以下の試験で採取され得る：
・電気泳動による血清Ｍタンパク質定量化（ＳＰＥＰ）
・血清免疫固定法
・血清遊離軽鎖アッセイ（ＦＬＣ、κ及びλ）
・電気泳動による２４時間の尿中Ｍタンパク質定量化（ＵＰＥＰ）。注：スクリーニングの場合、インフォームドコンセントの前日に２４時間の尿の採取を開始してもよい。
・尿免疫固定法
・必要であれば、定量的免疫グロブリン（Ｉｇ）（例えば、ＩｇＡ又はＩｇＤ骨髄腫）
中央検査機関の試験に加えて、血清及び尿中Ｍタンパク質評価を地域で実施してもよく、これを試験の適格性の判断及び患者ケアに関する臨床判断に使用してもよい。スクリーニングの場合、スクリーニングの２週間以内に地域で得られた前回の検査機関値（ＭＭの血清及び尿の結果）を、それらが前回の抗癌治療と関連しないのであれば（抗癌療法の最終投与から又は療法の間に疾患が進行した時点から少なくとも２週間で）使用することができる。

【0353】

全身ＰＥＴ／ＣＴエックス線疾患評価
ベースラインの全身（頭頂からつま先までの）ＰＥＴ／ＣＴを、スクリーニング時（即ち、ＣＴＸ１２０注入前の２８日以内）、及びＣＲが疑われた時点で実施すべきである。髄外疾患（例えば、髄外性形質細胞腫又は軟部組織病変を伴う骨髄腫病変）のエビデンスのある対象の場合、表１８及び表１９の評価スケジュールに従って、ＩＭＷＧ奏効基準（付録Ａ）に従って、及び臨床的に必要である場合に、注入後のスキャンを実施してもよい。髄外疾患を有する対象では、ＰＥＴ／ＣＴのＣＴ部分は、腫瘍のサイズを測定するのに十分な診断品質（例えば、ＩＶ造影剤を使用するＣＴ）である必要がある。ＣＴが臨床的に禁忌である場合、又は地域の規制により必要とされる場合は、造影剤を使用したＭＲＩがＣＴ部分に使用され得る。

【0354】

スクリーニングの必要要件を満たすために、対象を組み入れる前の４週間以内に標準治療の一部として得られるＰＥＴ／ＣＴ（ＩＶ造影剤を使用する）が使用され得る。

【0355】

スキャンの取得、加工、及び転送に関する必要要件については、Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍａｎｕａｌに概説されている。可能な限り、エックス線疾患評価に使用する画像様式、機械、及びスキャンパラメータは、試験の間に一様に保つ必要がある。有効性分析の場合、ＩＭＷＧ奏効基準に従い、ＩＲＣによってエックス線疾患評価を実施してもよい。

【0356】

骨髄吸引液及び生検
表１８及び表１９の評価スケジュールに従って、且つ臨床的に必要であれば、骨髄吸引液及び生検を実施する。１４日目の骨髄吸引液／生検は任意選択であり、特別な同意が必要となる。スクリーニング時の骨髄試料採取（吸引液及び生検）は、１４日のスクリーニング期間中に実施しなければならない。メディカルモニターからの療法指導及び同意があれば、スクリーニングの必要要件を満たすために、対象を組み入れる前の４週間以内に標準治療の一部として得られた骨髄生検を使用してもよい。全ての他の骨髄試料採取は、来院日の±５日に実施しなければならない。骨髄生検のための標準的な施設のガイドラインに従わなければならない。

【0357】

形質細胞の割合は、中央検査機関によって骨髄吸引液及び生検試料に基づいて評価され、ＩＲＣによってＩＭＷＧ奏効基準に従い疾患奏効評価の一部として精査される。ＣＲが疑われる対象には、免疫組織化学的検査及び（骨髄吸引液における）ＭＲＤ評価による奏効評価を確認するための骨髄生検が、中央検査機関によって実施され得る。骨髄採取が実施される任意の時点で、ＣＴＸ１２０の測定及び／又は他の探索的解析のために、吸引液試料も中央検査機関に送付しなければならない。

【0358】

髄外性形質細胞腫の生検
進行時に、疾患の確認（地域での試験）及びバイオマーカー分析（中央での試験）のために、存在する場合は髄外性形質細胞腫の生検を採取しなければならない（医学的に実現可能である場合）。髄外疾患を有する対象の場合、スクリーニング時及び少なくとも１回のＣＴＸ１２０注入後の時点における腫瘍生検も推奨される。

【0359】

β－２ミクログロブリン及び細胞遺伝学検査
スクリーニング時にＢ２Ｍレベルを評価するための血清試料を入手し、これを分析のために地域の検査機関に送付する。細胞遺伝学検査（核型分析及び蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）を評価するための骨髄試料は、スクリーニング時のみ実施すべきであり、地域で評価すべきである（表１８）。

【0360】

６．２．８ 研究機関試験
評価スケジュール（表１８及び表１９）に従って、検査機関試料が採取及び分析され得る。臨床実験改善修正法の必要要件を満たす地域の調査機関を利用して、標準的な施設の手順に従って表２５に列挙される全ての試験を分析することができる。

【0361】

【表34】

【0362】

６．３ バイオマーカー
臨床反応、抵抗性、安全性、疾患、薬力学的活性、又はＣＴＸ１２０の作用機序を示す可能性のあるゲノム、代謝、及び／又はプロテオミクスバイオマーカーを特定するために、血液、骨髄、ＣＳＦ試料（治療下で発現した神経毒性を有する対象のみ）、及び適用可能である場合は髄外性形質細胞腫の腫瘍生検を採取する。試料は、中央検査機関における試験のために採取され、発送され得る。

【0363】

６．３．１ ＣＴＸ１２０レベルの分析
形質導入したＢＣＭＡ指向性ＣＡＲ＋Ｔ細胞のレベルの分析を、表１８及び表１９に記載されているスケジュールに従って採取された血液試料について実施する。血中のＣＴＸ１２０の時間経過の傾向は、ＤＮＡμｇ当たりのＣＡＲ構築物のコピーを測定するＰＣＲアッセイを使用して説明することができる。細胞表面上のＣＡＲタンパク質の存在を確認するために、フローサイトメトリーを使用した相補的な分析も実施され得る。

【0364】

ＣＴＸ１２０レベルを分析するための試料は、ＣＴＸ１２０注入後に実施される任意の血液、骨髄、ＣＳＦ、又は髄外性形質細胞腫の生検に由来するものを中央検査機関に送付しなければならない。ＣＲＳを発症した場合、ＣＴＸ１２０レベルを評価するための試料を、予定されている来院の間の４８時間毎にＣＲＳが回復するまで採取しなければならない。プロトコルに指定された試料採取に従って採取されたこれらの試料のいずれかにおいて、骨髄、ＣＳＦ、又は髄外性形質細胞腫の組織内のＣＴＸ１２０のトラフィッキングを評価することができる。

【0365】

６．３．２ サイトカイン
ＩＬ－１β、可溶性ＩＬ－１受容体α（ｓＩＬ－１Ｒα）、ＩＬ－２、ｓＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７ａ、インターフェロンγ、腫瘍壊死因子α、及びＧＭ－ＣＳＦを含むサイトカインが分析される。近年の再調査でまとめられているように（Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｈａｎ，２０１８）、これまでの複数のＣＡＲ Ｔ細胞の臨床試験で実施された相関解析により、重度のＣＲＳ及び／又は神経毒性の潜在的な予測マーカーとして、これらのサイトカインなどが特定されている。表１８に記載されているような特定の時点で、サイトカイン用の血液を採取する。ＣＲＳの徴候又は症状を示す対象では、回復するまで毎日更なる試料を取る必要がある。

【0366】

６．３．３ 抗ＣＴＸ１２０抗体
ＣＡＲ構築物は、ヒト化ｓｃＦｖで構成されている。潜在的な免疫原性を評価するために、表１８及び表１９に従い、試験全体を通して血液が採取される。

【0367】

６．３．４ 探索的調査バイオマーカー
臨床反応、抵抗性、安全性、疾患、薬力学的活性、及び／又は治療の作用機序を示す若しくは予測する可能性のある分子（ゲノム、代謝、及び／又はプロテオミクス）バイオマーカー及び免疫表現型を特定するために、探索的調査が実施され得る。表１８のスケジュールに従って、試料が採取され得る。探索的バイオマーカー用の試料も同様に、ＣＴＸ１２０注入後に実施される任意の腰椎穿刺又はＢＭ試料採取（吸引液／生検）に由来するものを、分析のために送付しなければならない。ＣＲＳの場合、探索的バイオマーカーを評価するための試料は、予定されている来院の間の４８時間毎にＣＲＳが回復するまで採取され得る。探索的調査を裏付けるための血液、骨髄、髄外性形質細胞腫、及びＣＳＦ試料の採取における指示については、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌを参照されたい。

【0368】

７．安全性及び有害事象
質問に応答し、現場職員によって観察され、又は対象によって自発的に報告されたＡＥが記録される。全てのＡＥは、満足な結果に至るまで追跡される。

【0369】

７．１ 有害事象
ＡＥは、治験医薬品が投与された臨床試験の対象における任意の有害な医学上の出来事又は既に存在する医学的状態の悪化であり、必ずしも本治療との因果関係があるものではない。臨床試験では、ＡＥには、試験治療が施されていない場合であっても、ベースライン又はウォッシュアウト期間を含む任意の時点で発生する、望ましくない医学的状態が含まれ得る。

【0370】

ＡＥの例は、性質、重篤度、頻度、又は既に存在する症状の期間における、臨床的に重大な悪化である。

【0371】

エックス線像又は他の方法における悪性病変の測定によって評価する場合、「疾患進行」という用語は、試験下における悪性腫瘍の進行が、疾患の通常の経過から、その性質、症状、又は重篤度において非定型であると見なされない限り、ＡＥとして報告すべきではない。試験下における悪性腫瘍の徴候及び症状の悪化は、症例報告書（ＣＲＦ）の適切な項にＡＥとして報告すべきである。

【0372】

治療前の症状への介入（待機手術など）、又は試験に参加する前に計画された医療処置は、ＡＥと見なされない。試験治療の注入のための入院又は施設の方針に従った予防対策（ＣＴＸ１２０注入後の観察のための入院を含む）は、ＡＥ又はＳＡＥと見なされない。更に、対象がＣＴＸ１２０注入後に計画された入院をした場合、観察のためだけにその入院を延長することは、他のＳＡＥ基準を満たす医学的に重大な事象と関連しない限り、ＳＡＥとして報告すべきではない。

【0373】

新たな又は悪化する臨床的続発症をもたらし、治療が必要となるか、又は現在の治療に調整が必要となる異常な臨床検査所見はＡＥと見なされ、ＣＴＣＡＥ ｖ５．０に従ってグレード分類し、報告されなければならない。適用可能な場合、（臨床検査値異常ではない）臨床的続発症は、ＡＥとして記録されることになる。

【0374】

７．２ 重篤な有害事象
任意の有害な医学的結果のＡＥは、以下の基準のいずれかを満たす場合、重篤な有害事象として分類しなければならない：
・死に至る。
・生命が脅かされている（即ち、対象が直ちに死のリスクにある状態に置かれるＡＥ）。
・入院患者の入院を必要とする、又は既存の入院を延長する（予定された医学的若しくは外科的処置のための入院、又は予定された観察及び処置を実施するための入院は、これらの基準を満たさない）。
・持続的な又は重大な身体障害又は無能力に至る。
・新生児に先天異常又は先天性欠損症が生じる。
・ＡＥは、対象を危険にさらす（即ち、対象をリスクのある状態にする）可能性のある事象であると見なされ、上記のアウトカムのうちの１つを防止するための医学的又は外科的介入（治療）と必要とし得る。

【0375】

７．３ 特に注目すべき有害事象
報告された自家ＣＡＲ Ｔ細胞の臨床経験に基づいて、特に注目すべき有害事象（ＡＥＳＩ）を特定することができる。ＡＥＳＩは、ＣＴＸ１２０注入後の任意の時点で報告されるべきであり、以下を含む：
・ＣＴＸ１２０注入反応
・グレード≧３の日和見感染／侵襲的感染
・グレード≧３の腫瘍崩壊症候群
・サイトカイン放出症候群
・ＩＣＡＮＳ
・血球貪食性リンパ組織球症
・移植片対宿主病
・二次性悪性腫瘍
・コントロール不良なＴ細胞増殖

【0376】

上記に列挙したＡＥＳＩに加えて、ＣＴＸ１２０に場合により関係する又はＣＴＸ１２０に関係すると判断される任意の新たな血液疾患又は自己免疫性障害は、ＣＴＸ１２０注入後の任意の時点で報告しなければならない。

【0377】

７．４ 有害事象の重篤度
ＡＥは、本明細書に提供される基準に従ってグレード分類される、ＣＲＳ、神経毒性、及びＧｖＨＤを除き、ＣＴＣＡＥ ｖ５．０に従ってグレード分類される。

【0378】

ＣＴＣＡＥグレード又はプロトコルに指定された基準が利用できない場合、表２６の毒性グレード分類を用いることができる。

【0379】

【表35】

【0380】

７．５ 有害事象の因果関係
各ＡＥ及びＣＴＸ１２０、ＬＤ化学療法との間の関係を評価し、任意のプロトコルに定められた試験手順を評価する（全て個別に評価される）。関係の評価を行う。
関係する：試験治療又は処置とＡＥとの間に、明確な因果関係がある。
場合により関係する：試験治療又は処置とＡＥとの間に因果関係を示唆するいくつかのエビデンスが存在するが、代わりとなる潜在的原因も存在する。
関係しない：試験治療又は処置とＡＥとの間に因果関係を示唆するエビデンスがない。

【0381】

評価において以下が考慮され得る：（１）事象のタイミングと治療又は処置の投与のタイミングの間における時間的関連性、（２）妥当な生物学的メカニズム、及び（３）それらの因果関係を評価するときの、事象の他の潜在的原因（例えば、併用治療、基礎疾患）。

【0382】

ＳＡＥが試験介入のいずれにも関係しないと評価される場合、代替となる病因をＣＲＦに示す必要がある。ＡＥ／ＳＡＥと治験薬との間の関係が「可能性がある」と判断される場合、規制報告を優先する目的で、事象は治験薬と関係するものと見なし得る。

【0383】

７．６ アウトカム
ＡＥ又はＳＡＥのアウトカムは、以下のように分類され、報告される：
・致命的
・回復しない／解消しない
・回復した／解消した
・続発症を伴って回復した／解消した
・回復中／解消中
・不明

【0384】

７．７ 有害事象の収集期間
本試験に組み入れられた全ての対象の安全性は、ＩＣＦに署名した時点から試験が終了するまで記録される。しかしながら、試験中の異なる期間に異なる報告要件が存在する。表２７は、試験の各期間において報告すべきＡＥについて記載している。以下の定義に基づいている。

【0385】

【表36】

【0386】

８．終了規則
以下の事象の１つ以上が発生した場合、治療を終了しなければならない。
・管理不能且つ予想外の、ＣＴＸ１２０に起因する生命を脅かす（グレード４の）毒性。
・注入の３０日以内のＣＴＸ１２０に関係する死亡。
・グレード≧３のＧｖＨ、例えば、
〇７日以内にグレード≦２に回復することのない、＞３５％のグレード３又は４の神経毒性。
〇ステロイド難治性である、＞２０％のグレード≧２のＧｖＨＤ。
〇＞３０％のグレード４のＣＲＳ。
〇２８日以内に回復することのない、＞５０％のグレード４の好中球減少症（ベースラインで好中球減少症を有する対象を除く）。
〇＞３０％のグレード４の感染症。
・新たな悪性腫瘍（以前治療した悪性腫瘍の再発／進行とは区別される）。
・用量拡大における１５人の対象が３ヵ月目のＣＴＸ１２０後の評価をした後、２以下の奏効（ＰＲ＋ＶＧＰＲ＋ＣＲ＋厳格な完全奏効［ｓＣＲ］を含む）として定義される、有効性の欠如。

【0387】

９．統計解析
パートＡの主目的は、ＭＴＤ及び／又はパートＢのコホート拡大に推奨される用量を決定するために、再発性又は難治性多発性骨髄腫を有する対象において、ＣＴＸ１２０の漸増用量の安全性を評価することである。

【0388】

パートＢの主目的は、ＩＭＷＧ奏効基準に従ってＯＲＲにより測定された、再発性又は難治性多発性骨髄腫を有する対象におけるＣＴＸ１２０の有効性を評価することである。

【0389】

９．１ 試験評価項目
９．１．１ 主要評価項目
パートＡ（用量漸増）：用量制限毒性として定義される有害事象の発生率、及びパートＢのコホート拡大に推奨される用量の定義。
パートＢ（コホート拡大）：ＩＭＷＧ奏効基準に従った客観的奏効率（ｓＣＲ＋ＣＲ＋ＶＧＰＲ＋ＰＲ）。

【0390】

９．１．２ パートＡ及びパートＢの副次的評価項目
有効性：
・ＩＭＷＧ奏効基準（表２２）に従った、厳格な完全奏効の対象の割合。
・ＩＭＷＧ奏効基準（表２２）に従った、完全奏効の対象の割合。
・ＩＭＷＧ奏効基準（表２２）に従った、最良部分奏効の対象の割合。
・ｓＣＲ／ＣＲ／ＶＧＰＲ／ＰＲ事象のあった対象にのみ、奏効期間（ＤＯＲ）が記録され得る。この期間は、最初のｓＣＲ／ＣＲ／ＶＧＰＲ／ＰＲの客観的奏効と、ＩＭＷＧ奏効基準により疾患が進行した日又は何らかの原因により死亡した日との間の時間として計算され得る。
・無増悪生存期間（ＰＦＳ）は、ＣＴＸ１２０を注入した日と、疾患が進行した日又は何らかの原因により死亡した日との間の差として計算され得る。進行せず、データカットオフ日においてもなお試験に参加している対象は、最後のＭＭ疾患評価日をもって打ち切りとしてもよい。
・全生存期間（ＯＳ）は、ＣＴＸ１２０を注入した日と、何らかの原因により死亡した日との間の時間として計算され得る。データカットオフ日に生存している対象は、生存が確認された最後の日をもって打ち切りとしてもよい。

【0391】

安全性
有害事象の発生率及び重篤度、並びに臨床的に重大な臨床検査値異常は、パートＡではＬｅｅ基準（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、及びパートＢではＡＳＴＣＴ基準（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１９）に従ってグレード分類され得るＣＲＳ、ＩＣＡＮＳ（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１９）及びＣＴＣＡＥ ｖ５．０に従ってグレード分類され得る神経毒性、ＭＡＧＩＣ基準（Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６）に従ってグレード分類され得るＧｖＨＤを除き、ＣＴＣＡＥ ｖ５．０に従ってまとめられ、報告され得る。

【0392】

薬物動態
ＤＮＡμｇ当たりのＣＡＲ構築物のコピーを測定するＰＣＲアッセイを使用して、血中及び他の組織中のＣＴＸ１２０のレベルを経時的に評価することができる。細胞表面上にＣＡＲタンパク質の存在を確認するために、フローサイトメトリーを使用した相補的な分析も実施され得る。

【0393】

プロトコルに指定された試料採取に従って採取されたこれらの試料のいずれかにおいて、骨髄、ＣＳＦ、又は髄外性形質細胞腫の組織内のＣＴＸ１２０のトラフィッキングが評価され得る。

【0394】

９．１．３ パートＡ及びパートＢの探索的評価項目
・血中及び他の組織中のサイトカインのレベル。
・抗ＣＴＸ１２０抗体の発現率。
・ＣＴＸ１２０の増殖、ＣＲＳ、及び疾患奏効に及ぼす抗サイトカイン療法の影響。
・ＣＴＸ１２０の注入日から最初に記録される奏効（ｓＣＲ／ＣＲ／ＶＧＰＲ／ＰＲ）までの間の時間として定義される、奏効までの時間。
・ＣＴＸ１２０を注入した日から最初に記録されたＣＲまでの間の時間として定義される、ＣＲまでの時間。
・ＣＴＸ１２０を注入日した日から最初の疾患進行のエビデンスまでの間の時間として定義される、疾患進行までの時間。
・ＭＲＤ陰性である対象の割合。
・ＣＴＸ１２０療法後の自家又は同種ＳＣＴの発生率。
・後続の抗癌療法の頻度及び種類。
・ＥＯＲＴＣ ＱＬＱ－３０及びＱＬＱ－ＭＹ２０、並びにＥＱ－５Ｄ－５Ｌ質問票によって測定されるような、対象によって報告される健康状態におけるベースラインからの変化。
・ＣＴＸ１２０を注入した日と、最初の後続治療又は何らかの原因により死亡した日との間の時間として定義される、最初の後続治療のない生存期間。
・他の探索的ゲノム、プロテオミクス、代謝、又は薬力学的評価項目。

【0395】

９．２ 解析方法
全ての解析（無益性解析及び主要解析）に関するＯＲＲの主要評価項目は、ＦＡＳにおける本明細書に提供されるＭＭ疾患評価の中央審査に基づく。また、ＯＲＲの感度分析も実施される。適切な人口統計、ベースライン、有効性、及び安全性パラメータに関する集計を行うべきである。ＯＲＲは、正確な９５％信頼区間による割合として集計してもよく、正確な２項検定を使用して、観察された奏効率を３０％の過去の奏効率と比較してもよい。ＤＯＲ、ＰＦＳ、及びＯＳなどの事象までの経過時間の変数については、カプランマイヤー法を用いて９５％信頼区間の中央値を計算してもよい。

【0396】

ＣＴＸ１２０を受ける全ての対象は、ＳＡＳに含まれる。ＡＥは、ＣＲＳ（パートＡではＬｅｅ基準、パートＢではＡＳＴＣＴ基準）、神経毒性（ＩＣＡＮＳ及びＣＴＣＡＥ ｖ５．０）、並びにＧｖＨＤ（ＭＡＧＩＣ基準）を除き、ＣＴＣＡＥ ｖ５．０に従ってグレード分類される。ＡＥ、ＳＡＥ、及びＡＥＳＩは、用量コホートによって集計され、以下の間隔に従って報告される：
・注入後３ヵ月目までのＩＣＦの署名：全てのＡＥ
・３ヵ月目の来院後から６０ヵ月目の来院まで：全てのＳＡＥ及びＡＥＳＩ
・３ヵ月目の試験来院後、及び対象が新たな抗癌療法を開始：ＣＴＸ１２０に関係するＳＡＥ及びＣＴＸ１２０に関係するＡＥＳＩ

【0397】

血中のＣＴＸ１２０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞のレベル、抗ＣＴＸ１２０抗体の発現率、及び血清中のサイトカインのレベルが集計され得る。追加のバイオマーカーの調査には、血液成分（血清、血漿、及び細胞）、他の組織由来の細胞、髄外性形質細胞腫組織、及び他の対象由来の組織の評価が含まれ得る。これらの評価により、それらの組織に由来するＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、及び他の生体分子を評価することができる。このような評価によって、対象の疾患、ＣＴＸ１２０に対する反応、及び治験薬の作用機序に関係する因子の理解を知らしめることができる。

【0398】

結果
これまでに本試験に参加した全ての対象が、１６日以内に段階１（適格性のスクリーニング）を完了しており、対象の大部分が１０日未満でこの段階を完了している。適格性確認（即ち、組み入れ）のときに、全ての適格な対象は、７日以内にリンパ球除去（ＬＤ）化学療法を開始させており、これらの対象の７５％超が２日以内にＬＤ化学療法を開始させている。加えて、全ての適格な対象が１４日未満にＣＴＸ１２０を受けており、その大多数が組み入れの８日以内にＣＴＸ１２０を受けている。ＬＤ化学療法を受けた全ての対象が、ＬＤ化学療法が完了してから２～７日以内にＣＴＸ１２０を受けるまで進んでおり、１人の対象以外の全員がＬＤ化学療法を完了して４日以内にＣＴＸ１２０を受けた。組み入れられた対象は、再発性及び／又は難治性多発性骨髄腫を有する。

【0399】

組み入れられた２人の対象は、スクリーニングの時点で好中球絶対数（ＡＮＣ）が１０００細胞／ｍｍ^３未満であり、また、これらの対象のうち１人が２８，０００細胞／ｍｍ^３の血小板数を有していた。これらの血球数は、通常では血液学的な適格性基準（例えば、ＡＮＣ≧１０００細胞／ｍｍ^３；血小板≧５０，０００細胞／ｍｍ^３）が課せられる自家ＣＡＲ Ｔ療法から恐らく排除されるだろう。

【0400】

治療を受けた患者は、ＤＬＴをまったく示さなかった。ＣＴＸ１２０は、ＣＡＲ Ｔ生成物で治療した全ての対象で検出された。同種ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、注入後にＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖及び持続性を含む所望の薬物動態特性を、治療を受けたヒト対象において示した。ＣＴＸ１２０の増殖及び持続性の両方で用量依存効果が観察されている。ＣＴＸ１２０細胞は、試験された最も遅い時点（ＣＡＲ－Ｔを投与した後の２８日）まで末梢血で検出され、ピークの増殖が投与後の１～２週間検出された。投与後の増殖は用量依存的であると思われ、最大の増殖が最低値の０ＣＡＲコピー／μｇから観察され、ピーク時で３００ＣＡＲコピー／μｇ超まで観察された。

【0401】

用量依存的な反応が観察された。例えば、ＤＬ２では、抗腫瘍反応のエビデンスが２人の対象で観察された。これらの対象では、血清／尿中モノクローナルタンパク質、血清遊離軽鎖、及び／又は骨髄形質細胞の減少が示された。

【0402】

他の実施形態
本明細書に開示される特徴は、全て任意の組み合わせで組み合わせが可能である。本明細書で開示されたそれぞれの特徴は、同一の、均等な又は類似の目的を果たす代替的な特徴によって置き換えられ得る。従って、明示的に別途指示されない限り、開示されるそれぞれの特徴は、一般的な一連の均等な又は類似の特徴の一例に過ぎない。

【0403】

上記の説明より、当業者は、それらの趣旨及び範囲を逸脱することなく、本発明の本質的な特徴を容易に把握することが可能であり、これを様々な使用法及び状況に適用させるように本発明に対する様々な変更形態及び修正形態をなし得る。従って、他の実施形態も特許請求の範囲の範疇にある。

【0404】

均等物
本明細書でいくつかの本発明の実施形態を説明及び図示してきたが、当業者であれば、本明細書で説明される機能を実施し、且つ／又は結果及び／若しくは１つ以上の利点を得るための様々な他の手段及び／又は構造を容易に想定し、このような変形形態及び／又は修正形態のそれぞれは、本明細書で説明される本発明の実施形態の範囲内にあるものと見なされる。より広義には、当業者であれば、本明細書に記載される全てのパラメータ、寸法、材料及び構成が代表的なものであり、実際のパラメータ、寸法、材料及び／又は構成が、特定の用途又は本発明の教示が使用される用途に依存することを意味することが容易に理解されるであろう。当業者であれば、通常の実験を行うのみで、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識又は把握することができる。従って、上述の実施形態は、単に例として提示されており、また添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内において、本発明の実施形態は、具体的に説明及び特許請求される以外の別の方法で実践され得ることを理解されたい。本開示の本発明の実施形態は、本明細書で説明される各個別の特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法を対象とする。加えて、２つ以上のそのような特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法の任意の組み合わせは、そのような特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法が互いに矛盾しない場合、本開示の本発明の範囲内に含まれる。

【0405】

本明細書で定義され使用されるような全ての定義は、辞書的定義、参考として組み込まれる文献内の定義、及び／又は定義された用語の通常の意味に対して優先するものと理解されるべきである。

【0406】

本明細書で開示される全ての参考文献、特許及び特許出願は、そのそれぞれが引用されている主題に対して参照として組み込まれており、場合により文献全体を包含し得る。

【0407】

不定冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、本明細書及び特許請求の範囲において使用される場合、反対に明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味するものと理解されるべきである。

【0408】

本明細書で使用する場合、本明細書及び特許請求の範囲における「及び／又は」という語句は、そのように結合された要素、即ちある場合には接続して存在する、別の場合には離れて存在する要素の「一方又は両方」を意味するものと理解されるべきである。「及び／又は」を使用して列挙された複数の要素は、同様の方法で解釈されるべきであり、即ちそのように結合された要素の「１つ以上」と解釈されるべきである。具体的に特定されるそれらの要素に関係するか否かにかかわらず、「及び／又は」という節によって具体的に特定される要素以外の他の要素が任意選択により存在し得る。従って、非限定的な例として、「Ａ及び／又はＢ」の言及は、「含む」などのオープンエンド形式の語と共に使用する場合、一実施形態では、Ａのみ（任意選択によりＢ以外の要素を含む）を指すことができ、他の実施形態では、Ｂのみ（任意選択によりＡ以外の要素を含む）を指すことができ、更に別の実施形態では、ＡとＢとの両方（任意選択により他の要素を含む）を指すなどであり得る。

【0409】

本明細書で使用する場合、本明細書及び特許請求の範囲における「又は」とは、上記で定義したような「及び／又は」と同様の意味を有するものと理解されるべきである。例えば、列挙内の項目を区切る場合、「又は」又は「及び／又は」は、包含的なものと解釈されるべきであり、即ち要素の数又は列挙の少なくとも１つを含むが、２つ以上も含むものであり、任意選択により追加の列挙されていない項目を含むものと解釈すべきである。「～の１つのみ」若しくは「～の正確に１つ」又は特許請求の範囲で使用する場合の「～からなる」など、反対に明確に指示される用語のみが、要素の数又は列挙の正確に１つの要素を含むことを指す。一般に、本明細書で使用する場合、「又は」という用語は、「いずれか」、「～の１つ」、「～の１つのみ」又は「～の正確に１つ」などの排他的な用語の前に置かれた場合、排他的代替物を示すに過ぎない（即ち「一方又は他方、ただし両方ではない」）ものと解釈するべきである。特許請求の範囲で使用する場合、「～から本質的になる」とは、特許法の分野で使用されるような通常の意味を有するものとする。

【0410】

本明細書で使用する場合、本明細書及び特許請求の範囲における、１つ以上の要素の列挙に関する「少なくとも１つ」という語句は、要素の列挙内の要素の任意の１つ以上から選択される少なくとも１つの要素であるが、要素の列挙内に具体的に列挙されたあらゆる要素の少なくとも１つを必ずしも含まず、且つ要素の列挙内の要素の任意の組み合わせを必ずしも除外しないことを意味するものと理解すべきである。この定義はまた、具体的に特定された要素に関連する又は関連しないにかかわらず、「少なくとも１つ」という語句を指す、要素のリスト内で具体的に特定された要素以外の要素が任意選択的に存在し得ることを許容する。従って、非限定的な例として、「Ａ及びＢの少なくとも１つ」（換言すると「Ａ又はＢの少なくとも１つ」、換言すると「Ａ及び／又はＢの少なくとも１つ」は、一実施形態では、任意選択により２つ以上のＡを含み、Ｂが存在しない（及び任意選択によりＢ以外の要素を含む）少なくとも１つを指すことができ、別の実施形態では、任意選択により２つ以上のＢを含み、Ａが存在しない（及び任意選択によりＡ以外の要素を含む）少なくとも１つを指すことができ、更に別の実施形態では、任意選択により２つ以上のＡを含む少なくとも１つ、且つ任意選択により２つ以上のＢを含む少なくとも１つ（及び任意選択により他の要素を含む）を指すなどであり得る。

【0411】

本明細書で使用する場合、用語「約」又は「およそ」は、当業者によって決定される特定の値の許容誤差範囲内にあることを意味し、その値が測定又は決定される方法、即ち測定系の限界に部分的に依存する。例えば、「約」は、当技術分野の慣習による許容標準偏差内にあることを意味し得る。代わりに、「約」は、所与の値の最大で±２０％、好ましくは最大で±１０％、より好ましくは最大で±５％、更により好ましくは最大で±１％の範囲を意味し得る。代わりに、特に生体系又は生体プロセスに関しては、この用語は、値の一桁以内、好ましくは２倍以内を意味し得る。本出願及び特許請求の範囲に特定の値が記載されている場合、特に指示のない限り、用語「約」は、黙示的であり、これに関連して特定の値が許容誤差範囲内にあることを意味する。

【0412】

同様に、反対に明確に示されない限り、２つ以上の工程又は行為を含む、本明細書で特許請求される任意の方法において、この方法の工程又は行為の順序は、必ずしもこの方法の工程又は行為が列挙される順序に限定されないことも理解されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3A-3B】

【図4】

【図5】

【図6A-6B】

【図7A-7C】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

2023512469000001.app

【国際調査報告】