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特表2023-512475三環式ＰＤＥ３／ＰＤＥ４二重阻害剤化合物の医薬組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-27
(54)【発明の名称】三環式ＰＤＥ３／ＰＤＥ４二重阻害剤化合物の医薬組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 31/519 20060101AFI20230317BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230317BHJP
C07D 471/04 20060101ALI20230317BHJP
A61K 47/10 20170101ALI20230317BHJP
A61K 47/14 20170101ALI20230317BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20230317BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20230317BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20230317BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20230317BHJP
A61K 47/12 20060101ALI20230317BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20230317BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20230317BHJP
【ＦＩ】
A61K31/519
A61P43/00 111
C07D471/04 117A
A61K47/10
A61K47/14
A61K47/18
A61K47/34
A61K47/26
A61K47/02
A61K47/12
A61P11/06
A61P11/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022543589
(86)(22)【出願日】2021-01-15
(85)【翻訳文提出日】2022-07-15
(86)【国際出願番号】 CN2021072145
(87)【国際公開番号】W WO2021143841
(87)【国際公開日】2021-07-22
(31)【優先権主張番号】202010042865.X
(32)【優先日】2020-01-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＢＲＩＪ
(71)【出願人】
【識別番号】516089784
【氏名又は名称】チア タイ ティエンチン ファーマシューティカル グループ カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｃｈｉａ Ｔａｉ Ｔｉａｎｑｉｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．３６９ Ｙｕｚｈｏｕ Ｓｏｕｔｈ Ｒｄ．，Ｌｉａｎｙｕｎｇａｎｇ，Ｊｉａｎｇｓｕ ２２２０６２ Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ヤン，ミャオ
(72)【発明者】
【氏名】スン，ユェンユェン
(72)【発明者】
【氏名】リー，ワンジン
(72)【発明者】
【氏名】シュ，ジョン
(72)【発明者】
【氏名】バオ，ポンユェ
(72)【発明者】
【氏名】ガオ，ジン
(72)【発明者】
【氏名】ドン，ピン
(72)【発明者】
【氏名】フゥイ，フゥイ
(72)【発明者】
【氏名】ジー，ションフォン
(72)【発明者】
【氏名】ルオ，ユンフー
【テーマコード（参考）】
4C065
4C076
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C065AA03
4C065BB10
4C065CC09
4C065DD02
4C065EE02
4C065HH01
4C065JJ01
4C065KK04
4C065KK06
4C065LL01
4C065PP03
4C065PP09
4C065QQ02
4C076CC15
4C076DD01
4C076DD22
4C076DD37
4C076DD38
4C076DD41
4C076DD42
4C076DD46
4C076DD49
4C076EE23
4C086AA01
4C086AA02
4C086CB10
4C086MA02
4C086MA03
4C086MA05
4C086NA14
4C086ZA59
4C086ZC41
(57)【要約】
三環式ＰＤＥ３／ＰＤＥ４二重阻害剤化合物の医薬組成物及びその製造方法であって、具体的には、式（Ｉ）化合物又は薬学的に許容されるその塩の医薬組成物、その製造方法及びその用途に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容されるその塩と、界面活性剤とを含む医薬組成物。【化1】
【請求項2】
金属キレート剤をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
緩衝剤をさらに含む、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項4】
浸透圧調節剤をさらに含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項5】
希釈剤をさらに含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項6】
式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容されるその塩と、界面活性剤と、緩衝剤、浸透圧調節剤、金属キレート剤及び希釈剤の少なくとも１つとを含む請求項１～５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、又は、前記界面活性剤がエチレングリコールポリオキシエチレンエーテル、ポリプロピレングリコールアルキルエーテル、アルキルポリグルコシド、オクチルフェノールポリオキシエチレンエーテル、アルキルフェノールポリオキシエチレンエーテル、グリセリンアルキルエステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタンアルキルエステル、ソルビタン脂肪酸エステル、コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ、ドデシルジメチルアミンオキシド、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体、獣脂アルキルアミンのエトキシ化物から１つ又は複数選ばれる、
又は、前記界面活性剤がポリソルベート系、スパン系から１つ又は複数選ばれる、
又は、前記界面活性剤がポリソルベート２０、ポリソルベート８０、スパン２０から１つ又は複数選ばれる、
又は、前記界面活性剤の濃度が約０．０１～約８ｍｇ／ｍＬである、請求項１～６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記緩衝剤が硫酸、塩酸、水酸化ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム、酢酸、酢酸ナトリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、酒石酸、酒石酸ナトリウム、グリシン、ホウ酸、フタル酸から１つ又は複数選ばれる、又は、前記緩衝剤がクエン酸、クエン酸塩、酒石酸、酒石酸塩、リン酸、リン酸塩から選ばれる、
又は、前記緩衝剤がクエン酸塩、酒石酸塩、リン酸塩から選ばれる、
又は、前記緩衝剤の濃度が約０．０１～約５０ｍｇ／ｍＬである、
又は、前記緩衝剤が前記医薬組成物のｐＨを約３．０～約８．５に調整するために用いられる、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項9】
前記浸透圧調節剤が塩化ナトリウム、塩化カリウム、グルコース、マンニトール、キシリトールから１つ又は複数選ばれる、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記金属キレート剤がエデト酸、エデト酸二ナトリウム、エデト酸カルシウム二ナトリウムから１つ又は複数選ばれる、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項11】
前記希釈剤が水、エタノール、グリセロールから１つ又は複数選ばれる、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項12】
式（Ｉ）の化合物と、界面活性剤と、緩衝剤と、浸透圧調節剤と、金属キレート剤と、希釈剤とを含み、式（Ｉ）の化合物の濃度が０．００２～５０ｍｇ／ｍＬであり、界面活性剤の濃度が０．０２～３ｍｇ／ｍＬであり、緩衝剤の濃度が０．１～約２５ｍｇ／ｍＬであり、浸透圧調節剤の濃度が５～９ｍｇ／ｍＬであり、金属キレート剤の濃度が０．０１～約５ｍｇ／ｍＬである、請求項１～１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項13】
式（Ｉ）の化合物と、ポリソルベート８０と、リン酸二水素ナトリウム又はその一水和物と、リン酸水素二ナトリウムと、塩化ナトリウムと、エデト酸二ナトリウムと、水とを含み、任意選択で、式（Ｉ）の化合物の濃度が０．００２～５０ｍｇ／ｍＬであり、ポリソルベート８０の濃度が０．０２～３ｍｇ／ｍＬであり、リン酸二水素ナトリウムとリン酸水素二ナトリウムの濃度が０．１～２５ｍｇ／ｍＬであり、塩化ナトリウムの濃度が５～９ｍｇ／ｍＬであり、エデト酸二ナトリウムの濃度が０．０１～約５ｍｇ／ｍＬである、請求項１～１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項14】
式（Ｉ）の化合物が式（Ｉ）の化合物の結晶であり、Ｃｕ Ｋα線を用いる当該結晶のＸ線粉末回折パターンが、５．８１±０．２°、８．３８±０．２°、１１．１６±０．２°、１３．９６±０．２°、１４．４７±０．２°、１５．０１±０．２°、１６．７６±０．２°、１７．９５±０．２°、２０．８３±０．２°、２４．７３±０．２°、２６．１３±０．２°から選ばれる２θ角度での５個、６個、７個、８個、９個、１０個又は１１個の回折ピークを含む、又は、Ｃｕ Ｋα線を用いるＸ線粉末回折パターンが、２θ角度５．８１±０．２°、１３．９６±０．２°、１５．０１±０．２°、１７．９５±０．２°、２４．７３±０．２°に回折ピークを有する、又は、２θ角度５．８１±０．２°、８．３８±０．２°、１１．１６±０．２°、１３．９６±０．２°、１４．４７±０．２°、１５．０１±０．２°、１６．７６±０．２°、１７．９５±０．２°、２０．８３±０．２°、２４．７３±０．２°、２６．１３±０．２°に回折ピークを有する、請求項１～１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項15】
前記式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容されるその塩の粒度がＸ５０≦１０μｍである、又は、前記式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容されるその塩の粒度がＸ５０≦５μｍ且つＸ９０≦１０μｍである、請求項１～１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項16】
前記式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容されるその塩と前記界面活性剤の質量比が約１：２００～１００：１であり、好ましくは約１：１５０～５０：１であり、より好ましくは約１：５０～２５：１であり、さらに好ましくは約１：１～１５：１である（前記式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容されるその塩の質量は式（Ｉ）の化合物に基づき計算される）、請求項１～１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項17】
前記医薬組成物が懸濁液の形態である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項18】
界面活性剤と、式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容されるその塩と、金属キレート剤、緩衝剤、希釈剤及び浸透圧調節剤から選ばれる少なくとも１つとを混合することを含む請求項６に記載の医薬組成物の製造方法。
【請求項19】
哺乳動物におけるＰＤＥ３及び／又はＰＤＥ４関連の疾患を予防又は治療する方法であって、当該予防又は治療を必要とする哺乳動物、好ましくはヒトに治療有効量の請求項１～１７のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含み、任意選択で、前記ＰＤＥ３及び／又はＰＤＥ４関連の疾患は喘息、慢性閉塞性肺疾患から選ばれる前記方法。
【請求項20】
ＰＤＥ３及び／又はＰＤＥ４関連の疾患を予防又は治療するための薬物の製造における請求項１～１７のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用であって、任意選択で、前記ＰＤＥ３及び／又はＰＤＥ４関連の疾患は喘息、慢性閉塞性肺疾患から選ばれる前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願では、２０２０年１月１５日に中国国家知識産権局に提出された中国発明特許出願第２０２０１００４２８６５．Ｘ号の優先権が主張され、それが全体として援用により本明細書に組み込まれる。
本願では、２０２０年１月１５日に中国国家知識産権局に提出された中国発明特許出願第２０２０１００４２８６５．Ｘ号の優先権が主張され、それが全体として援用により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本願は、医薬品分野に属し、三環式ＰＤＥ３／ＰＤＥ４二重阻害剤化合物の医薬組成物、その製造方法及び用途に関し、具体的には、式（Ｉ）化合物又は薬学的に許容されるその塩の医薬組成物、その製造方法及びその用途に関する。
【背景技術】
【0003】
ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）は１１のファミリーを含むスーパーファミリー酵素群であり、各ファミリーは異なるシグナル伝達に関与し、異なる生理学的プロセスを調節する。そのうち、ＰＤＥ３はヒト気道平滑筋（ＡＳＭ）における主なホスホジエステラーゼで、ＰＤＥ３を阻害すると細胞内ｃＡＭＰの濃度が上昇し、気管支平滑筋が弛緩する。ＰＤＥ４は炎症誘発性メディエーター及び抗炎症性メディエーターの発現で主な調節作用を果たし、ＰＤＥ４阻害剤は炎症性細胞の有害なメディエーターの放出を阻害することができる。したがって、ＰＤＥ３とＰＤＥ４の両方に阻害効果を有する阻害剤ならβ－アドレナリン受容体アゴニストの気管支拡張効果（ｂｒｏｎｃｈｏｄｉｌａｔｉｏｎ）及びグルココルチコイドの吸入による抗炎症効果（ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｃｔｉｏｎ）を有する。二重標的の機能上の相互補完は理論的に単一の標的よりも大きな効果を有し、従来併用投与でしか得られない治療効果を単一の薬剤で実現し、併用投与の成分薬物の物理的及び化学的特性が完全には適合できないという欠点を解消し、投与方式が一層容易になり、一定用量での投与に有利である。
【0004】
Ｖｉｃｔｏｒｉａ Ｂｏｓｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏ．Ｅｘｐｅｒｉ．Ｔｈｅｒａｐ．２００６，３１８，８４０－８４８、ＷＯ２００００５８３０には化合物ＲＰＬ５５４、ＲＰＬ５６５が報告され、長期的な気管支拡張及び抗炎症効果を有し、溶解度が悪く、血漿クリアランスが高いなどの物理的及び化学的特性を有するため、吸入投与に適するのに対し、ＰＤＥ４に対するその阻害活性が満足できず、抗炎症効果が芳しくないことがデータから判明したため、良好なＰＤＥ３／４阻害活性を併せ持つ化合物の開発が必要である。
【化1】
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】国際公開第ＷＯ２００００５８３０号
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｖｉｃｔｏｒｉａ Ｂｏｓｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏ．Ｅｘｐｅｒｉ．Ｔｈｅｒａｐ．２００６，３１８，８４０－８４８．
【発明の概要】
【0007】
本願の一態様では、式（Ｉ）化合物又は薬学的に許容されるその塩と、界面活性剤とを含む医薬組成物が提供される。
【化2】
【0008】
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は金属キレート剤（金属錯化剤ともいう）をさらに含む。
【0009】
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は緩衝剤をさらに含む。
【0010】
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は希釈剤をさらに含む。
【0011】
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は浸透圧調節剤をさらに含む。
【0012】
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、式（Ｉ）化合物又は薬学的に許容されるその塩と、界面活性剤と、緩衝剤とを含む。
【0013】
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、式（Ｉ）化合物又は薬学的に許容されるその塩と、界面活性剤と、緩衝剤と、浸透圧調節剤とを含む。
【0014】
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、式（Ｉ）化合物又は薬学的に許容されるその塩と、界面活性剤と、緩衝剤と、金属キレート剤とを含む。
【0015】
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、式（Ｉ）化合物又は薬学的に許容されるその塩と、界面活性剤と、緩衝剤と、浸透圧調節剤と、金属キレート剤とを含む。
【0016】
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、式（Ｉ）化合物又は薬学的に許容されるその塩と、界面活性剤と、緩衝剤と、浸透圧調節剤と、金属キレート剤と、希釈剤とを含む。
【0017】
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、式（Ｉ）化合物又は薬学的に許容されるその塩と、界面活性剤と、緩衝剤、浸透圧調節剤、金属キレート剤及び希釈剤の少なくとも１つとを含む。
【0018】
いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容される塩はマレイン酸塩、硫酸塩、メシル酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩から選ばれる。
【0019】
いくつかの実施形態において、前記式（Ｉ）化合物の薬学的に許容される塩は、式（Ｉ）化合物と、薬学的に許容される塩を形成する酸イオンのモル比が（１：１）～（１：２
）であってもよく、例えば、１：１、１：２である。
）であってもよく、例えば、１：１、１：２である。
【0020】
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物で、前記「式（Ｉ）化合物又は薬学的に許容されるその塩」が「式（Ｉ）化合物」と置き換えられてもよい。
【0021】
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、式（Ｉ）化合物と、界面活性剤と、緩衝剤と、浸透圧調節剤と、金属キレート剤と、希釈剤とを含む。
【0022】
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物で、式（Ｉ）化合物又は薬学的に許容されるその塩の濃度は式（Ｉ）化合物で計算すると約０．００１～約８０ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは０．００２～５０ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは０．１～２０ｍｇ／ｍＬから選ばれる。
【0023】
本願の界面活性剤は薬学的に許容される界面活性剤であり、例えば、湿潤剤である。前記界面活性剤は非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性イオン性界面活性剤であってもよい。好ましくは、前記１つ又は複数の界面活性剤は非イオン性界面活性剤である。
【0024】
いくつかの実施形態において、前記界面活性剤はエチレングリコールポリオキシエチレンエーテル、ポリプロピレングリコールアルキルエーテル、アルキルポリグルコシド、オクチルフェノールポリオキシエチレンエーテル、アルキルフェノールポリオキシエチレンエーテル、グリセリンアルキルエステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート）、ソルビタンアルキルエステル、ソルビタン脂肪酸エステル、コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ、ドデシルジメチルアミンオキシド、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体（ポロキサマー）、獣脂アルキルアミンのエトキシ化物（ＰＯＥＡ）から１つ又は複数選ばれる。
【0025】
好ましくは、前記界面活性剤はポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリソルベート系）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、スパン系）から１つ又は複数選ばれる。
【0026】
いくつかの実施形態において、前記ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルはポリソルベート２０（ポリオキシエチレンソルビタンラウレート、トゥイーン２０）、ポリソルベート４０（ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート）、ポリソルベート６０（ポリオキシエチレンソルビタンステアレート）、ポリソルベート８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、トゥイーン８０）から１つ又は複数選ばれる。
【0027】
いくつかの実施形態において、前記ソルビタン脂肪酸エステルはソルビタンモノラウレート（スパン２０）、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノオレエートから１つ又は複数選ばれる。
【0028】
より好ましくは、前記界面活性剤はポリソルベート系、スパン系から１つ又は複数選ばれる。
【0029】
いくつかの特定の実施形態において、前記界面活性剤はポリソルベート２０、ポリソルベート８０、スパン２０から１つ又は複数選ばれる。
【0030】
いくつかの実施形態において、前記界面活性剤の濃度は約０．０１～約８ｍｇ／ｍＬである。典型的には、当該医薬組成物における界面活性剤の濃度は約０．０１～５ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは約０．０２～３ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは約０．０５～２
ｍｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは約０．１～１ｍｇ／ｍＬである。
ｍｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは約０．１～１ｍｇ／ｍＬである。
【0031】
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物で、前記式（Ｉ）化合物又は薬学的に許容されるその塩（式（Ｉ）化合物で計算する）と前記界面活性剤の質量比は約１：２００～１００：１であり、好ましくは約１：１５０～５０：１であり、より好ましくは約１：５０～２５：１であり、さらに好ましくは約１：１～１５：１であり、例えば、約１０：１である。
【0032】
いくつかの実施形態において、前記緩衝剤は薬学的に許容される緩衝剤である。当該緩衝剤は、吸入用液体医薬組成物への使用に適する任意の緩衝液であってもよい。緩衝剤は一般に硫酸、塩酸、水酸化ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム、酢酸、酢酸ナトリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、酒石酸、酒石酸ナトリウム、グリシン、ホウ酸、フタル酸から１つ又は複数選ばれる。好ましくは緩衝剤の種類が２つ又はそれ以上であり、タイプはクエン酸塩緩衝液又はリン酸塩緩衝液であり、より好ましくは両者のナトリウム塩である。クエン酸塩緩衝液はクエン酸、クエン酸ナトリウム、それらの混合物を含む。リン酸塩緩衝液はリン酸、リン酸一ナトリウム（即ちリン酸二水素ナトリウム）、リン酸水素二ナトリウム、それらの混合物を含む。
【0033】
いくつかの実施形態において、前記緩衝剤はクエン酸、クエン酸塩（例えば、クエン酸ナトリウム）、酒石酸、酒石酸塩（例えば、酒石酸ナトリウム）、リン酸、リン酸塩（例えば、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム）から選ばれる。
【0034】
いくつかの実施形態において、前記緩衝剤はクエン酸塩（例えば、クエン酸ナトリウム）、酒石酸塩（例えば、酒石酸ナトリウム）、リン酸塩（例えば、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム）から選ばれる。
【0035】
いくつかの実施形態において、前記緩衝剤の濃度は約０．０１～約５０ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは約０．０５～約４０ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは０．１～約２５ｍｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは０．５～約６ｍｇ／ｍＬである。
【0036】
いくつかの実施形態において、前記緩衝剤は前記医薬組成物のｐＨを約３．０～約８．５、好ましくは約５～約７に調整するために用いられる。
【0037】
いくつかの実施形態において、前記浸透圧調節剤は一般に、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの単純な非毒性塩、又は、グルコース、マンニトール、キシリトールなどの糖類から１つ又は複数選ばれる。いくつかの実施形態において、前記浸透圧調節剤は塩化ナトリウムである。
【0038】
前記浸透圧調節剤の濃度は等張性を得るのに必要な量、例えば、血漿又は肺液との等張性から決定される。浸透圧調節剤の濃度は一般に約０．０１～約１０ｍｇ／ｍＬであり、より一般には約５～９ｍｇ／ｍＬである。
【0039】
いくつかの実施形態において、前記金属キレート剤はエデト酸、エデト酸二ナトリウム、エデト酸カルシウム二ナトリウムなどのエデト酸塩から１つ又は複数選ばれる。好ましくはエデト酸塩（例えば、カルシウム塩、ナトリウム塩）であり、特に好ましくはエデト酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ－２Ｎａ）である。
【0040】
金属キレート剤の濃度は前記医薬組成物の製造で導入できる金属イオンの量から決定され、一般に約０．０１～約４０ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは約０．０１～約２０ｍｇ／
ｍＬであり、より好ましくは約０．０１～約５ｍｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは約０．０１～約２ｍｇ／ｍＬである。
ｍＬであり、より好ましくは約０．０１～約５ｍｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは約０．０１～約２ｍｇ／ｍＬである。
【0041】
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物で、希釈剤は薬学的に許容される任意の希釈剤であってもよい。当該希釈剤は吸入投与に適する。一般に、希釈剤は水、エタノール、グリセロールから１つ又は複数選ばれる。希釈剤として好ましくは水であり、希釈剤としてより好ましくは滅菌水である。
【0042】
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物で、希釈剤の使用量は、前記医薬組成物における式（Ｉ）化合物若しくは薬学的に許容されるその塩又は添加物の濃度が所定の範囲にあるような適量であってもよい。
【0043】
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、式（Ｉ）化合物と、ポリソルベート系又はスパン系とを含み、さらに、前記ポリソルベート系又はスパン系はポリソルベート２０、ポリソルベート８０、スパン２０から１つ又は複数選ばれる。
【0044】
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物はリン酸塩をさらに含み、さらに、前記リン酸塩はリン酸二水素ナトリウム又はその一水和物、リン酸水素二ナトリウムから選ばれてもよい。いくつかの実施形態において、前記医薬組成物はクエン酸ナトリウム又は酒石酸ナトリウムをさらに含む。
【0045】
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、式（Ｉ）化合物と、スパン系とポリソルベート系の混合（例えば、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、スパン２０）と、水とを含む。
【0046】
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、式（Ｉ）化合物と、スパン系とポリソルベート系の混合（例えば、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、スパン２０）と、クエン酸ナトリウム又は酒石酸ナトリウムと、水とを含む。
【0047】
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、式（Ｉ）化合物と、ポリソルベート系（例えば、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０）と、リン酸二水素ナトリウム又はその一水和物と、リン酸水素二ナトリウムと、エデト酸二ナトリウムと、水とを含む。
【0048】
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、式（Ｉ）化合物と、ポリソルベート系（例えば、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０）と、リン酸二水素ナトリウム又はその一水和物と、リン酸水素二ナトリウムと、塩化ナトリウムと、エデト酸二ナトリウムと、水とを含む。
【0049】
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、式（Ｉ）化合物と、ポリソルベート系（例えば、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０）と、クエン酸ナトリウム又は酒石酸ナトリウムと、塩化ナトリウムと、水とを含む。
【0050】
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、式（Ｉ）化合物と、スパン系とポリソルベート系の混合（例えば、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、スパン２０）と、クエン酸ナトリウム又は酒石酸ナトリウムと、塩化ナトリウムと、水とを含む。
【0051】
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、式（Ｉ）化合物と、界面活性剤と、緩衝剤と、浸透圧調節剤と、金属キレート剤と、希釈剤とを含み、式（Ｉ）化合物の濃度は０．００２～５０ｍｇ／ｍＬであり、界面活性剤の濃度は０．０２～３ｍｇ／ｍＬであり、緩衝剤の濃度は０．１～約２５ｍｇ／ｍＬであり、浸透圧調節剤の濃度は５～９ｍｇ
／ｍＬであり、金属キレート剤の濃度は０．０１～約５ｍｇ／ｍＬである。
／ｍＬであり、金属キレート剤の濃度は０．０１～約５ｍｇ／ｍＬである。
【0052】
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物で、前記界面活性剤、緩衝剤、浸透圧調節剤、金属キレート剤、希釈剤はそれぞれ上記で定義したとおりである。
【0053】
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、式（Ｉ）化合物と、界面活性剤と、緩衝剤と、浸透圧調節剤と、金属キレート剤と、希釈剤とを含み、式（Ｉ）化合物の濃度は０．００２～５０ｍｇ／ｍＬであり、界面活性剤の濃度は０．０２～３ｍｇ／ｍＬであり、緩衝剤の濃度は０．１～約２５ｍｇ／ｍＬであり、浸透圧調節剤の濃度は５～９ｍｇ／ｍＬであり、金属キレート剤の濃度は０．０１～約５ｍｇ／ｍＬである。前記界面活性剤はポリソルベート２０、ポリソルベート８０、スパン２０の１つ又は複数であり、前記緩衝剤はリン酸二水素ナトリウム又はその一水和物、リン酸水素二ナトリウム、酒石酸、クエン酸の１つ又は複数であり、前記浸透圧調節剤は塩化ナトリウムであり、前記金属キレート剤はエデト酸二ナトリウム、エデト酸カルシウム二ナトリウムの１つ又は複数であり、前記希釈剤は水である。
【0054】
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、式（Ｉ）化合物と、ポリソルベート８０と、リン酸二水素ナトリウム又はその一水和物と、リン酸水素二ナトリウムと、塩化ナトリウムと、エデト酸二ナトリウムと、水とを含み、式（Ｉ）化合物の濃度は０．００２～５０ｍｇ／ｍＬであり、ポリソルベート８０の濃度は０．０２～３ｍｇ／ｍＬであり、リン酸二水素ナトリウムとリン酸水素二ナトリウムの濃度は０．１～２５ｍｇ／ｍＬであり、塩化ナトリウムの濃度は５～９ｍｇ／ｍＬであり、エデト酸二ナトリウムの濃度は０．０１～約５ｍｇ／ｍＬである。
【0055】
いくつかの実施形態において、前記式（Ｉ）化合物又は薬学的に許容されるその塩の医薬組成物は、式（Ｉ）化合物が固体形態である。いくつかの実施形態において、前記式（Ｉ）化合物は式（Ｉ）化合物の結晶である。
【0056】
いくつかの実施形態において、前記式（Ｉ）化合物又は薬学的に許容されるその塩の医薬組成物は、前記式（Ｉ）化合物は式（Ｉ）化合物の結晶の粒度制御をして得た生成物である。
【0057】
いくつかの実施形態において、前記式（Ｉ）化合物の結晶は、Ｃｕ Ｋα線を用いるＸ線粉末回折パターンが２θ角度５．８１±０．２°、１３．９６±０．２°、１５．０１±０．２°、１７．９５±０．２°、２４．７３±０．２°に回折ピークを有する。
【0058】
本願のいくつかの実施形態において、前記式（Ｉ）化合物の結晶は、Ｃｕ Ｋα線を用いるＸ線粉末回折パターンが２θ角度５．８１±０．２°、８．３８±０．２°、１１．１６±０．２°、１３．９６±０．２°、１４．４７±０．２°、１５．０１±０．２°、１７．９５±０．２°、２４．７３±０．２°、２６．１３±０．２°に回折ピークを有する。
【0059】
いくつかの実施形態において、前記式（Ｉ）化合物の結晶は、Ｃｕ Ｋα線を用いるＸ線粉末回折パターンが２θ角度５．８１±０．２°、８．３８±０．２°、１１．１６±０．２°、１３．９６±０．２°、１４．４７±０．２°、１５．０１±０．２°、１６．７６±０．２°、１７．９５±０．２°、２０．８３±０．２°、２４．７３±０．２°、２６．１３±０．２°に回折ピークを有する。
【0060】
いくつかの実施形態において、前記式（Ｉ）化合物の結晶は、Ｃｕ Ｋα線を用いるＸ線粉末回折パターンが２θ角度５．８１±０．２°、８．３８±０．２°、９．１３±０
．２°、１１．１６±０．２°、１１．６０±０．２°、１２．８２±０．２°、１３．９６±０．２°、１４．４７±０．２°、１５．０１±０．２°、１６．７６±０．２°、１７．９５±０．２°、１８．９１±０．２°、２０．８３±０．２°、２４．３６±０．２°、２４．７３±０．２°、２５．７８±０．２°、２６．１３±０．２°に回折ピークを有する。
．２°、１１．１６±０．２°、１１．６０±０．２°、１２．８２±０．２°、１３．９６±０．２°、１４．４７±０．２°、１５．０１±０．２°、１６．７６±０．２°、１７．９５±０．２°、１８．９１±０．２°、２０．８３±０．２°、２４．３６±０．２°、２４．７３±０．２°、２５．７８±０．２°、２６．１３±０．２°に回折ピークを有する。
【0061】
いくつかの実施形態において、前記式（Ｉ）化合物の結晶は、Ｃｕ Ｋα線を用いるＸ線粉末回折パターンが、５．８１±０．２°、８．３８±０．２°、９．１３±０．２°、１１．１６±０．２°、１１．６０±０．２°、１２．８２±０．２°、１３．９６±０．２°、１４．４７±０．２°、１５．０１±０．２°、１６．７６±０．２°、１７．９５±０．２°、１８．９１±０．２°、２０．８３±０．２°、２４．３６±０．２°、２４．７３±０．２°、２５．７８±０．２°、２６．１３±０．２°から選ばれる２θ角度での５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個又はそれ以上の回折ピークを含む。
【0062】
いくつかの実施形態において、前記式（Ｉ）化合物の結晶は、Ｃｕ Ｋα線を用いるＸ線粉末回折パターンが、５．８１±０．２°、８．３８±０．２°、１１．１６±０．２°、１３．９６±０．２°、１４．４７±０．２°、１５．０１±０．２°、１６．７６±０．２°、１７．９５±０．２°、２０．８３±０．２°、２４．７３±０．２°、２６．１３±０．２°から選ばれる２θ角度での５個、６個、７個、８個、９個、１０個又は１１個の回折ピークを含む。
【0063】
いくつかの実施形態において、前記式（Ｉ）化合物の結晶は、Ｃｕ Ｋα線を用いるＸ線粉末回折パターンが、５．８１±０．２°、８．３８±０．２°、１１．１６±０．２°、１３．９６±０．２°、１４．４７±０．２°、１５．０１±０．２°、１７．９５±０．２°、２４．７３±０．２°、２６．１３±０．２°から選ばれる２θ角度での５個、６個、７個、８個又は９個の回折ピークを含む。
【0064】
いくつかの実施形態において、前記式（Ｉ）化合物の結晶は、Ｃｕ Ｋα線を用いるＸＲＰＤパターンにおける回折ピークのピーク位置及び相対強度が次の表１に示すとおりである。
【表1】
【0065】
いくつかの実施形態において、前記式（Ｉ）化合物の結晶は、Ｃｕ Ｋα線を用いるＸＲＰＤパターンが図１に示すとおりである。
【0066】
いくつかの実施形態において、前記式（Ｉ）化合物の結晶は、示差走査熱量測定曲線が２４７．７０℃±２℃で発熱ピークを有する。
【0067】
いくつかの実施形態において、前記式（Ｉ）化合物の結晶は、示差走査熱量測定曲線が図２に示すとおりである。
【0068】
いくつかの実施形態において、前記式（Ｉ）化合物の結晶の熱重量分析曲線は１５５．７５±２℃で重量損失が０．４８７０％であり、１５５．７５±２℃～２６２．１８±２℃で重量損失が７．２８７％である。
【0069】
いくつかの実施形態において、前記式（Ｉ）化合物の結晶は、熱重量分析曲線が図３に示すとおりである。
【0070】
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物で、式（Ｉ）化合物又は薬学的に許容されるその塩の粒度はＸ５０≦１０μｍであり、好ましくは０．１～８μｍである。
【0071】
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物で、式（Ｉ）化合物又は薬学的に許容されるその塩の粒度はＸ５０≦５μｍ且つＸ９０≦１０μｍである。
【0072】
本願の前記医薬組成物は経口又は吸入でヒトに投与するのに適するように形成されるさまざまな形態の製剤であってもよく、例えば、溶液などである。
【0073】
いくつかの実施形態において、本願の医薬組成物は吸入で投与される。
【0074】
いくつかの実施形態において、本願の医薬組成物は口腔又は鼻腔吸入で投与される。
【0075】
いくつかの実施形態において、本願の医薬組成物は吸入用溶液である。
【0076】
いくつかの実施形態において、本願の医薬組成物は懸濁液の形態である。
【0077】
いくつかの実施形態において、本願の医薬組成物は吸入用懸濁液の形態である。
【0078】
本願の別の態様では、界面活性剤と式（Ｉ）化合物又は薬学的に許容されるその塩を混合するプロセスを含む前記医薬組成物の製造方法が提供される。好ましくは、前記製造方法は界面活性剤と、式（Ｉ）化合物又は薬学的に許容されるその塩と、金属キレート剤、緩衝剤、希釈剤及び浸透圧調節剤から選ばれる少なくとも１つとを混合することを含む。より好ましくは、本願では、湿潤剤と、緩衝剤と、浸透圧調節剤と、金属キレート剤と、式（Ｉ）化合物又は薬学的に許容されるその塩と、希釈剤とを混合する工程を含む前記医薬組成物の製造方法が提供される。
【0079】
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物の製造方法は、
１）湿潤剤と、緩衝剤と、浸透圧調節剤と、金属キレート剤と、希釈剤とを混合して溶液を生成する工程と、
２）式（Ｉ）化合物又は薬学的に許容されるその塩とステップ１）の溶液とを混合する工程を含む。
１）湿潤剤と、緩衝剤と、浸透圧調節剤と、金属キレート剤と、希釈剤とを混合して溶液を生成する工程と、
２）式（Ｉ）化合物又は薬学的に許容されるその塩とステップ１）の溶液とを混合する工程を含む。
【0080】
いくつかの実施形態において、前記製造プロセスは、ステップ２）の生成物を均質化するステップ３）をさらに含む。
【0081】
いくつかの実施形態において、前記均質化工程後に、式（Ｉ）化合物又は薬学的に許容されるその塩の粒度はＸ５０≦５μｍ且つＸ９０≦１０μｍである。
【0082】
いくつかの実施形態において、前記製造プロセスは充填ステップをさらに含む。
【0083】
本願の別の態様では、さらに、予防又は治療を必要とする哺乳動物、好ましくはヒトに治療有効量の前記医薬組成物を投与することを含む、哺乳動物におけるＰＤＥ３及び／又はＰＤＥ４関連の疾患を予防又は治療する方法が提供される。
【0084】
本願の別の態様では、さらに、ＰＤＥ３及び／又はＰＤＥ４関連の疾患を予防又は治療するための薬物の製造における前記医薬組成物の使用が提供される。
【0085】
本願の別の態様では、さらに、前記医薬組成物のＰＤＥ３及び／又はＰＤＥ４関連の疾患を予防又は治療するための用途が提供される。
【0086】
本願の別の態様では、さらに、ＰＤＥ３及び／又はＰＤＥ４関連の疾患を予防又は治療するための前記医薬組成物が提供される。
【0087】
本願のいくつかの実施形態において、前記ＰＤＥ３及び／又はＰＤＥ４関連の疾患は喘
息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）から選ばれる。
息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）から選ばれる。
【発明の効果】
【0088】
本願の式（Ｉ）化合物及びその医薬組成物はＰＤＥ３及びＰＤＥ４に明らかな二重の阻害効果を有し、ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）中のＴＮＦ－αにも明らかな阻害効果を有する。リポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、略称ＬＰＳ）誘発ラット急性肺損傷モデルにおいて優れた抗炎症効果を示している。インビボ血漿クリアランスが高く、経口投与では血漿中曝露量及び生物学的利用能が低く、局所経路投与では安全性が高い。ヒト肝ミクロソーム由来シトクロムＰ４５０の５つのアイソエンザイム（ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ４）に対する阻害効果が低く、薬物相互作用のリスクはない。ＢＡＬＦの白血球総数を減らすなど、明らかな抗炎症効果があり、最小有効量が低い。気道抵抗指標Ｐｅｎｈを低減できる。
【0089】
本願の式（Ｉ）化合物の結晶及び薬学的に許容されるその塩の結晶は薬物活性、薬物動態、生物学的利用能、吸湿性、融点、安定性、溶解性、純度、製造しやすさなどにおいて利点を有するため、薬物の製造、保管、輸送及び製剤などに関する要件が満たされる。式（Ｉ）化合物の結晶形は吸湿性が弱いため、吸入した薬物の吸収に有利である。
【0090】
本願の式（Ｉ）化合物の医薬組成物は、良好な安定性を有し、不純物は増えず、薬学的に許容される程度である。良好な分散性を有し、また、粒子の明らかな沈降がなく、粒度が増加せず、吸入製品の効果的な送達に必要な範囲内にあるなど、薬物動態が安定している。また、当該組成物は粒子サイズが均一でほどよく、吸収速度が早い。優れた送達速度と正確な用量を有し、吸入可能なエアロゾル粒子の割合が高く、微粒子形態での用量が高い。
【0091】
「用語の説明」
本願で指定のない限り、明細書全体と添付した特許請求の範囲において、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、類似の用語及び英語の同等な表現、例えば、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」又は同等なものは、「…を含むが、それらに限定されない」と開放的で包括的な意味で理解され、列挙されている要素、成分又はステップの他に、明記していない要素、成分又はステップを含んでもよいことを意味する。
本願で指定のない限り、明細書全体と添付した特許請求の範囲において、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、類似の用語及び英語の同等な表現、例えば、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」又は同等なものは、「…を含むが、それらに限定されない」と開放的で包括的な意味で理解され、列挙されている要素、成分又はステップの他に、明記していない要素、成分又はステップを含んでもよいことを意味する。
【0092】
明細書全体を通して使用される「一実施形態」「実施形態」「別の実施形態において」又は「いくつかの実施形態において」とは、少なくとも１つの実施形態が当該実施形態に記載の関連する特定の参照要素、構造又は特徴を含むことを意味する。したがって、明細書全体の異なる箇所で出現する表現「一実施形態において」「実施形態において」「別の実施形態において」又は「いくつかの実施形態において」は必ずしも同じ実施形態を対象とするとは限らない。また、特定の要素、構造又は特徴を任意の適切な方式で１つ又は複数の実施形態において組み合わせることができる。
【0093】
なお、本願の明細書と添付した特許請求の範囲で使用される単数形の限定語「一」（英語の「ａ」「ａｎ」「ｔｈｅ」に対応する）は、明確な規定がない限り、複数の対象の場合を含む。言い換えれば、本明細書において、単数形の用語は用語の複数形を含み、逆の場合も同様である。したがって、例えば、「触媒」を含む反応とは、１つの触媒、又は２つ若しくはそれ以上の触媒を含むものである。なお、用語「又は」は、明確な規定がない限り、一般に「及び／又は」の意味を含んで使用される。
【0094】
用語「治療」とは、疾患又は前記疾患に関連する１つ又は複数の症状を改善又は解消するために、本願に記載の化合物又は製剤を投与することを意味し、且つ以下の事項を含む。
（ｉ）疾患又は疾患の状態を阻害し、即ちその進行を抑えること、
（ｉｉ）疾患又は疾患の状態を緩和し、即ち当該疾患又は疾患の状態を解消させること。
（ｉ）疾患又は疾患の状態を阻害し、即ちその進行を抑えること、
（ｉｉ）疾患又は疾患の状態を緩和し、即ち当該疾患又は疾患の状態を解消させること。
【0095】
用語「予防」とは、疾患又は前記疾患に関連する１つ又は複数の症状を予防するために、本願に記載の化合物又は製剤を投与することを意味し、哺乳動物における疾患又は疾患の状態の出現を予防すること、特に当該疾患の状態になりやすい哺乳動物が、当該疾患の状態と診断されていない時の予防を含む。
【0096】
用語「治療有効量」とは、（ｉ）特定の疾患、症状若しくは障害を治療又は予防すること、（ｉｉ）特定の疾患、症状又は障害の１つ若しくは複数の症状を軽減、改善若しくは解消すること、又は（ｉｉｉ）本明細書に記載の特定の疾患、症状若しくは障害の１つ若しくは複数の症状の発生を予防若しくは遅延させる、本願の化合物の用量を指す。本願の化合物に係る「治療有効量」は、当該化合物、疾患の状態とその重症度、投与方式及び被治療哺乳動物の年齢によって変わるものであるが、当業者がその知識と本開示の内容に基づいて決定することができる。
【0097】
一般に、粒子の粒度は、レーザー回折により特徴的な等価な球の直径（球相当直径という）を測定することにより定量化され、例えば、レーザー粒度測定計で測定する。
【0098】
本願では球相当直径（ＶＤ）で粒度分布（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を表す。
【0099】
用語「Ｘ１０」とは、積算分布のパーセントが１０％になっている時の対応の粒径を指し、物理的には粒径がそれ未満の粒子が総体積の１０％を占めることを意味する。
【0100】
用語「Ｘ５０」とは、体積累積中位径（ｖｏｌｕｍ ｍｅｄｉａｎ ｄｉａｍｅｔｅｒ）と呼ばれ、積算分布のパーセントが５０％になっている時の対応の粒径を指す。物理的には粒径がそれ未満の粒子が総体積の５０％を占めることを意味する。
【0101】
用語「Ｘ９０」とは、積算分布のパーセントが９０％になっている時の対応の粒径を指し、物理的には粒径がそれ未満の粒子が総体積の９０％を占めることを意味する。
【0102】
本明細書において、特に説明のない限り、各パラメータの値（２θ角度、反応条件を含む）はいずれも、測定などによる値の誤差を含むように、用語「約」で修飾されたものと見なされ、例えば、記載された値に対し、±５％の誤差がある。
【0103】
本明細書では説明と開示のために、特許、特許出願又は既存の刊行物が援用により全体として組み込まれる。これらの刊行物は本願の出願日前に発表されているため提供できる。これらの書類の開示日に関する声明又はその内容の記載は出願人が知り得た情報に基づくもので、これらの書類の開示日又はその内容が正しいと承諾するものではない。しかも全ての対象国において、本明細書へのこれらの刊行物の援用で、当該刊行物が本分野の周知の常識になると認めるものではない。
【図面の簡単な説明】
【0104】
【発明を実施するための形態】
【0105】
以下の特定の実施例は、当業者が本願を明瞭に理解して実施できるよう提供される。本願の範囲に対する限定ではなく、本願の例示的な説明と典型的な例と見なされるべきである。
【実施例】
【0106】
中間体ＢＢ－１の合成
【化3】
【化4】
【0107】
ステップ１：化合物ＢＢ－１－２の合成
窒素雰囲気下で、化合物ＢＢ－１－１（２１．１０ｇ）とシアノ酢酸エチル（１１．００ｇ、１０．３８ｍＬ）の混合物を１００℃下で１６時間攪拌した。反応終了後、混合物を７０℃に冷却して、ゆっくりとエタノール（３０ｍＬ）を滴加すると、大量の固形物が析出した。濾過し、ケーキを減圧下で乾燥して生成物ＢＢ－１－２を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ＝８．２６（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．７９（ｂｒ ｓ，１Ｈ），６．７１（ｄ，８．０Ｈｚ，１Ｈ），４．００（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），３．７２（ｓ，３Ｈ），３．５９（ｓ，２Ｈ），３．３１～３．２３（ｍ，２Ｈ），２．６４（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．３２（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）。
ＭＳ－ＥＳＩ ｍ／ｚ：２６３．１［Ｍ＋Ｈ］＋。
窒素雰囲気下で、化合物ＢＢ－１－１（２１．１０ｇ）とシアノ酢酸エチル（１１．００ｇ、１０．３８ｍＬ）の混合物を１００℃下で１６時間攪拌した。反応終了後、混合物を７０℃に冷却して、ゆっくりとエタノール（３０ｍＬ）を滴加すると、大量の固形物が析出した。濾過し、ケーキを減圧下で乾燥して生成物ＢＢ－１－２を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ＝８．２６（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．７９（ｂｒ ｓ，１Ｈ），６．７１（ｄ，８．０Ｈｚ，１Ｈ），４．００（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），３．７２（ｓ，３Ｈ），３．５９（ｓ，２Ｈ），３．３１～３．２３（ｍ，２Ｈ），２．６４（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．３２（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）。
ＭＳ－ＥＳＩ ｍ／ｚ：２６３．１［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0108】
ステップ２：化合物ＢＢ－１－３の合成
窒素雰囲気下で、三塩化ホスホリル（３７９．５０ｇ、２３０．００ｍＬ）を８５℃に上げ、数回に分けて化合物ＢＢ－１－２（２６．００ｇ）を加えた。反応混合物を８５℃下で攪拌しながら２時間反応させた。反応終了後、減圧下蒸留で三塩化ホスホリルの大半を除去した。残留物にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、水（１００ｍＬ×２）で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、濾過して乾燥剤を除去し、減圧下で
濃縮した。粗生成物を得て酢酸エチル（２０ｍＬ）でパルプ化し精製して、化合物ＢＢ－１－３を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ＝７．１６（ｓ，１Ｈ），６．８３（ｓ，１Ｈ），４．６２（ｓ，１Ｈ），４．１２（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），３．３５（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），２．８４（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），１．４４（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）。
ＭＳ－ＥＳＩ ｍ／ｚ：２４５．１［Ｍ＋Ｈ］＋。
窒素雰囲気下で、三塩化ホスホリル（３７９．５０ｇ、２３０．００ｍＬ）を８５℃に上げ、数回に分けて化合物ＢＢ－１－２（２６．００ｇ）を加えた。反応混合物を８５℃下で攪拌しながら２時間反応させた。反応終了後、減圧下蒸留で三塩化ホスホリルの大半を除去した。残留物にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、水（１００ｍＬ×２）で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、濾過して乾燥剤を除去し、減圧下で
濃縮した。粗生成物を得て酢酸エチル（２０ｍＬ）でパルプ化し精製して、化合物ＢＢ－１－３を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ＝７．１６（ｓ，１Ｈ），６．８３（ｓ，１Ｈ），４．６２（ｓ，１Ｈ），４．１２（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），３．３５（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），２．８４（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），１．４４（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）。
ＭＳ－ＥＳＩ ｍ／ｚ：２４５．１［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0109】
ステップ３：化合物ＢＢ－１－４の合成
０℃下で、９８％濃硫酸（１２．８８ｇ、１２８．６９ｍｍｏｌ、７．００ｍＬ）に数回に分けて化合物ＢＢ－１－３（１．００ｇ）を加えた。反応混合物を２７℃下で３時間攪拌した。反応終了後、混合物を冷水（１５ｍＬ）に加え、その後、水酸化ナトリウム水溶液（４ｍｏｌ／Ｌ、３２ｍＬ）を滴加してｐＨを中性に調整し、酢酸エチル（１００ｍＬ×３）で抽出した。有機相を合わせて、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過して乾燥剤を除去し、減圧下で濃縮して、化合物ＢＢ－１－４を得た。
ＭＳ－ＥＳＩ ｍ／ｚ：２６３．１［Ｍ＋Ｈ］＋。
０℃下で、９８％濃硫酸（１２．８８ｇ、１２８．６９ｍｍｏｌ、７．００ｍＬ）に数回に分けて化合物ＢＢ－１－３（１．００ｇ）を加えた。反応混合物を２７℃下で３時間攪拌した。反応終了後、混合物を冷水（１５ｍＬ）に加え、その後、水酸化ナトリウム水溶液（４ｍｏｌ／Ｌ、３２ｍＬ）を滴加してｐＨを中性に調整し、酢酸エチル（１００ｍＬ×３）で抽出した。有機相を合わせて、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過して乾燥剤を除去し、減圧下で濃縮して、化合物ＢＢ－１－４を得た。
ＭＳ－ＥＳＩ ｍ／ｚ：２６３．１［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0110】
ステップ４：化合物ＢＢ－１－５の合成
０℃下で、ナトリウム（２．４２ｇ）を数回に分けてエタノール（８０ｍＬ）に加えた。混合物を２８℃下で３０分間攪拌した後、溶液に数回に分けて化合物ＢＢ－１－４（６．９０ｇ）を加え、８０℃下で３０分間攪拌した。続いて、一度に炭酸ジエチル（９．３２ｇ、９．５１ｍＬ）を加え、当該混合物を引き続き８０℃下で５時間攪拌した。反応終了後、混合物を室温に冷却し、ゆっくりと氷水（３０ｍＬ）を加え、その後、希塩酸（２ｍｏｌ／Ｌ、５３ｍＬ）でｐＨを中性に調整して大量の固形物が析出し、濾過し、ケーキを得てエタノール（１０ｍＬ）でパルプ化し精製して化合物ＢＢ－１－５を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ＝１１．２２（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．３５（ｓ，１Ｈ），６．９５（ｓ，１Ｈ），６．２２（ｓ，１Ｈ），４．０９（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），３．９０（ｂｒ ｓ，２Ｈ），３．８３（ｓ，３Ｈ），２．８９（ｂｒ ｓ，２Ｈ），１．３５（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）。
ＭＳ－ＥＳＩ ｍ／ｚ：２８９．１［Ｍ＋Ｈ］＋。
０℃下で、ナトリウム（２．４２ｇ）を数回に分けてエタノール（８０ｍＬ）に加えた。混合物を２８℃下で３０分間攪拌した後、溶液に数回に分けて化合物ＢＢ－１－４（６．９０ｇ）を加え、８０℃下で３０分間攪拌した。続いて、一度に炭酸ジエチル（９．３２ｇ、９．５１ｍＬ）を加え、当該混合物を引き続き８０℃下で５時間攪拌した。反応終了後、混合物を室温に冷却し、ゆっくりと氷水（３０ｍＬ）を加え、その後、希塩酸（２ｍｏｌ／Ｌ、５３ｍＬ）でｐＨを中性に調整して大量の固形物が析出し、濾過し、ケーキを得てエタノール（１０ｍＬ）でパルプ化し精製して化合物ＢＢ－１－５を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ＝１１．２２（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．３５（ｓ，１Ｈ），６．９５（ｓ，１Ｈ），６．２２（ｓ，１Ｈ），４．０９（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），３．９０（ｂｒ ｓ，２Ｈ），３．８３（ｓ，３Ｈ），２．８９（ｂｒ ｓ，２Ｈ），１．３５（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）。
ＭＳ－ＥＳＩ ｍ／ｚ：２８９．１［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0111】
ステップ５：化合物ＢＢ－１－６の合成
室温下で化合物ＢＢ－１－５（５．００ｇ）を三塩化ホスホリル（３０ｍＬ）に溶解した。窒素雰囲気下で、反応混合物を１００℃下で１６時間攪拌した。反応終了後、減圧下蒸留で溶媒の大半を除去した。水（１００ｍＬ）を加え、ジクロロメタン（１５０ｍＬ×２）で抽出した。有機相を合わせて、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過して乾燥剤を除去し、減圧下で濃縮して、化合物ＢＢ－１－６を得た。
ＭＳ－ＥＳＩ ｍ／ｚ：３０６．９［Ｍ＋Ｈ］＋。
室温下で化合物ＢＢ－１－５（５．００ｇ）を三塩化ホスホリル（３０ｍＬ）に溶解した。窒素雰囲気下で、反応混合物を１００℃下で１６時間攪拌した。反応終了後、減圧下蒸留で溶媒の大半を除去した。水（１００ｍＬ）を加え、ジクロロメタン（１５０ｍＬ×２）で抽出した。有機相を合わせて、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過して乾燥剤を除去し、減圧下で濃縮して、化合物ＢＢ－１－６を得た。
ＭＳ－ＥＳＩ ｍ／ｚ：３０６．９［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0112】
ステップ６：化合物ＢＢ－１の合成
室温下で化合物ＢＢ－１－６（９２５．６７ｍｇ）をイソプロパノール（８ｍＬ）に溶解し、２，４，６－トリメチルアニリン（２．１０ｇ）を加えた。窒素雰囲気下で、反応混合物を９０℃下で１５時間攪拌した。反応終了後、混合物を室温に下げて、減圧下で濃縮し、残留物を得てエタノール（６ｍＬ）でパルプ化し精製して化合物ＢＢ－１を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ＝８．８５（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．２７（ｓ，１Ｈ），６．９７（ｓ，１Ｈ），６．９０（ｓ，２Ｈ），６．４５（ｓ，１Ｈ），４．１０（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），３．９０（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），２．８７（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．４５（ｓ，３Ｈ），２．１１（ｓ，６Ｈ），１．３７（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）。
ＭＳ－ＥＳＩ ｍ／ｚ：４０６．２［Ｍ＋Ｈ］＋。
室温下で化合物ＢＢ－１－６（９２５．６７ｍｇ）をイソプロパノール（８ｍＬ）に溶解し、２，４，６－トリメチルアニリン（２．１０ｇ）を加えた。窒素雰囲気下で、反応混合物を９０℃下で１５時間攪拌した。反応終了後、混合物を室温に下げて、減圧下で濃縮し、残留物を得てエタノール（６ｍＬ）でパルプ化し精製して化合物ＢＢ－１を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ＝８．８５（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．２７（ｓ，１Ｈ），６．９７（ｓ，１Ｈ），６．９０（ｓ，２Ｈ），６．４５（ｓ，１Ｈ），４．１０（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），３．９０（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），２．８７（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．４５（ｓ，３Ｈ），２．１１（ｓ，６Ｈ），１．３７（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）。
ＭＳ－ＥＳＩ ｍ／ｚ：４０６．２［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0113】
化合物ＢＢ－４の合成
【化5】
【化6】
【0114】
ステップ１：化合物ＢＢ－４－１の合成
室温下で化合物ＢＢ－１（１．００ｇ）を２－ブタノン（３５ｍＬ）に溶解し、２－（２－ブロモエチル）イソインドリン－１，３－ジオン（３．７６ｇ）、炭酸カリウム（３．０７ｇ）、ヨウ化ナトリウム（２．２２ｇ）をこの順に加えた。窒素雰囲気下で、反応混合物を８５℃下で７２時間攪拌した。反応終了後、混合物を濃縮して有機溶媒の大半を除去し、水（３０ｍＬ）を加えて、酢酸エチル（２５ｍＬ×３）で抽出した。有機相を合わせて、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過して乾燥剤を除去し、減圧下で濃縮し、残留物を得てフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離剤は石油エーテル：酢酸エチル＝１５：１～３：１）で精製して化合物ＢＢ－４－１を得た。
ＭＳ－ＥＳＩ ｍ／ｚ：５７９．３［Ｍ＋Ｈ］＋。
室温下で化合物ＢＢ－１（１．００ｇ）を２－ブタノン（３５ｍＬ）に溶解し、２－（２－ブロモエチル）イソインドリン－１，３－ジオン（３．７６ｇ）、炭酸カリウム（３．０７ｇ）、ヨウ化ナトリウム（２．２２ｇ）をこの順に加えた。窒素雰囲気下で、反応混合物を８５℃下で７２時間攪拌した。反応終了後、混合物を濃縮して有機溶媒の大半を除去し、水（３０ｍＬ）を加えて、酢酸エチル（２５ｍＬ×３）で抽出した。有機相を合わせて、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過して乾燥剤を除去し、減圧下で濃縮し、残留物を得てフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離剤は石油エーテル：酢酸エチル＝１５：１～３：１）で精製して化合物ＢＢ－４－１を得た。
ＭＳ－ＥＳＩ ｍ／ｚ：５７９．３［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0115】
ステップ２：化合物ＢＢ－４の合成
室温下で化合物ＢＢ－４－１（５００．００ｍｇ）をクロロホルム（３ｍＬ）とエタノール（３ｍＬ）に溶解し、抱水ヒドラジン（１５２．６７ｍｇ、純度８５％）を加えた。窒素雰囲気下で、混合物を２８℃下で１６時間攪拌した。反応終了後、混合物を濃縮して有機溶媒の大半を除去し、水（１５ｍＬ）を加えて、ジクロロメタン（１５ｍＬ×３）で抽出した。有機相を合わせて、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過して乾燥剤を除去し、減圧下で濃縮して化合物ＢＢ－４を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ＝６．９５（ｓ，１Ｈ），６．８５（ｂｒ ｓ，２Ｈ），６．６６（ｓ，１Ｈ），５．３１（ｓ，１Ｈ），４．１４（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），４．０５（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），３．９１（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），３．６２（ｓ，３Ｈ），２．９０～２．８６（ｍ，４Ｈ），２．２２（ｓ，３Ｈ），１．９５（ｂｒ ｓ，６Ｈ），１．３３（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）。
ＭＳ－ＥＳＩ ｍ／ｚ：４４９．２［Ｍ＋Ｈ］＋。
室温下で化合物ＢＢ－４－１（５００．００ｍｇ）をクロロホルム（３ｍＬ）とエタノール（３ｍＬ）に溶解し、抱水ヒドラジン（１５２．６７ｍｇ、純度８５％）を加えた。窒素雰囲気下で、混合物を２８℃下で１６時間攪拌した。反応終了後、混合物を濃縮して有機溶媒の大半を除去し、水（１５ｍＬ）を加えて、ジクロロメタン（１５ｍＬ×３）で抽出した。有機相を合わせて、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過して乾燥剤を除去し、減圧下で濃縮して化合物ＢＢ－４を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ＝６．９５（ｓ，１Ｈ），６．８５（ｂｒ ｓ，２Ｈ），６．６６（ｓ，１Ｈ），５．３１（ｓ，１Ｈ），４．１４（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），４．０５（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），３．９１（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），３．６２（ｓ，３Ｈ），２．９０～２．８６（ｍ，４Ｈ），２．２２（ｓ，３Ｈ），１．９５（ｂｒ ｓ，６Ｈ），１．３３（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）。
ＭＳ－ＥＳＩ ｍ／ｚ：４４９．２［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0116】
実施例１：式（Ｉ）化合物の製造
２０℃下で５－ヒドロキシ－３－メチル－１，２，３－トリアゾール－４－カルボン酸（１８．５０ｍｇ）をＤＣＭ（１ｍＬ）に溶解し、ＨＡＴＵ（８．８０ｍｇ）、トリエチルアミン（５７．４０μＬ）を加えて２時間攪拌し、続いて、化合物ＢＢ－４（５０ｍｇ
）を加えて、当該温度を維持しながら引き続き１６時間攪拌した。混合物をＤＣＭで１０ｍＬに希釈して水（３０ｍＬ×３）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過して乾燥剤を除去し、濾液を減圧下で濃縮して溶媒を蒸発させて除去して粗生成物を得た。粗生成物をｐｒｅｐ－ＨＰＬＣで精製して黄色の固体の式（Ｉ）の目的化合物を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ＝６．９４（ｓ，２Ｈ），６．８７（ｓ，１Ｈ），６．７７（ｓ，１Ｈ），５．５２（ｓ，１Ｈ），４．４８（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），４．１５（ｓ，３Ｈ），４．１２～４．０８（ｍ，２Ｈ），４．０１（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．８７（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．６９（ｓ，３Ｈ），２．９４（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．２９（ｓ，３Ｈ），２．０６（ｓ，６Ｈ），１．４１（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）。
ＭＳ ｍ／ｚ：５７４．１［Ｍ＋Ｈ］＋。
２０℃下で５－ヒドロキシ－３－メチル－１，２，３－トリアゾール－４－カルボン酸（１８．５０ｍｇ）をＤＣＭ（１ｍＬ）に溶解し、ＨＡＴＵ（８．８０ｍｇ）、トリエチルアミン（５７．４０μＬ）を加えて２時間攪拌し、続いて、化合物ＢＢ－４（５０ｍｇ
）を加えて、当該温度を維持しながら引き続き１６時間攪拌した。混合物をＤＣＭで１０ｍＬに希釈して水（３０ｍＬ×３）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過して乾燥剤を除去し、濾液を減圧下で濃縮して溶媒を蒸発させて除去して粗生成物を得た。粗生成物をｐｒｅｐ－ＨＰＬＣで精製して黄色の固体の式（Ｉ）の目的化合物を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ＝６．９４（ｓ，２Ｈ），６．８７（ｓ，１Ｈ），６．７７（ｓ，１Ｈ），５．５２（ｓ，１Ｈ），４．４８（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），４．１５（ｓ，３Ｈ），４．１２～４．０８（ｍ，２Ｈ），４．０１（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．８７（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．６９（ｓ，３Ｈ），２．９４（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．２９（ｓ，３Ｈ），２．０６（ｓ，６Ｈ），１．４１（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）。
ＭＳ ｍ／ｚ：５７４．１［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0117】
実施例２：式（Ｉ）化合物の結晶の製造
５０ｍｇの式（Ｉ）化合物を４ｍＬガラス瓶に加え、１ｍＬの無水エタノール、０．２ｍＬの水を加えて温度を４０℃に上げて４８時間攪拌した。自然冷却で室温に下げ、遠心分離して固体を得、真空乾燥して４６ｍｇの固体結晶を得た。ＸＲＰＤパターン、ＤＳＣ曲線、ＴＧＡ曲線は、それぞれ図１、図２、図３に示すとおりである。
５０ｍｇの式（Ｉ）化合物を４ｍＬガラス瓶に加え、１ｍＬの無水エタノール、０．２ｍＬの水を加えて温度を４０℃に上げて４８時間攪拌した。自然冷却で室温に下げ、遠心分離して固体を得、真空乾燥して４６ｍｇの固体結晶を得た。ＸＲＰＤパターン、ＤＳＣ曲線、ＴＧＡ曲線は、それぞれ図１、図２、図３に示すとおりである。
【0118】
実施例３～３６：
製造プロセス：
１）調製タンクに各添加物を加え、攪拌して清澄化させ、添加物溶液を得た。
２）上記で調製した添加物溶液に式（Ｉ）化合物を加え、攪拌して均一な懸濁液を得た。
３）高圧ホモジナイザー、マイクロジェット又はサンドミルなどの装置で、製剤における式（Ｉ）化合物の粒度をＸ５０≦５μｍ且つＸ９０≦１０μｍに調整した。
４）製品を得た。
製造プロセス：
１）調製タンクに各添加物を加え、攪拌して清澄化させ、添加物溶液を得た。
２）上記で調製した添加物溶液に式（Ｉ）化合物を加え、攪拌して均一な懸濁液を得た。
３）高圧ホモジナイザー、マイクロジェット又はサンドミルなどの装置で、製剤における式（Ｉ）化合物の粒度をＸ５０≦５μｍ且つＸ９０≦１０μｍに調整した。
４）製品を得た。
【0119】
各添加物の用量及び製品は次の表２に示すとおりである。
【表2-1】
【表2-2】
【0120】
実験例１：式（Ｉ）化合物の結晶の固体の安定性に関する研究
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）：
ＨＰＬＣ法の構成については次を参照する。
カラム：Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ Ｃ－１８，４．６ｍｍ×１５０ｍｍ，５μｍ（ＰＤＳ－ＨＰＬＣ－００７）。
移動相Ａ：水中０．１％ＴＦＡ。
移動相Ｂ：１００％ＡＣＮ。
サンプル調製：アセトニトリルと水の混合溶媒（アセトニトリル：水＝５０：５０（Ｖ：Ｖ））でサンプルを溶解した。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）：
ＨＰＬＣ法の構成については次を参照する。
カラム：Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ Ｃ－１８，４．６ｍｍ×１５０ｍｍ，５μｍ（ＰＤＳ－ＨＰＬＣ－００７）。
移動相Ａ：水中０．１％ＴＦＡ。
移動相Ｂ：１００％ＡＣＮ。
サンプル調製：アセトニトリルと水の混合溶媒（アセトニトリル：水＝５０：５０（Ｖ：Ｖ））でサンプルを溶解した。
【0121】
固体の安定性を検討するための静置方法：
化合物を次の条件下で静置する場合の安定性を検討し、異なる時点でサンプルを採取して含有量を測定した。実施例２で製造した式（Ｉ）化合物の結晶約５ｍｇを正確に秤量して、乾燥した清潔なガラス瓶に入れ、２連サンプルとして、薄く敷き詰めたものを正式な試験サンプルとし、影響因子試験条件下（（６０℃）、（相対湿度９２．５％）、光（総照度１．２×１０６Ｌｕｘ・ｈｒ／近紫外域２００Ｗ・ｈｒ／ｍ２）、（４０℃、相対湿度７５％）、（６０℃、相対湿度７５％））で静置し、サンプルが完全に曝露するように静置し、アルミニウム箔をかけて、小さな穴を開けた。５日、１０日、１か月、２か月、３か月でサンプルを採取して分析した。光（可視光１２０００００Ｌｕｘ、紫外２００Ｗ）条件下で静置したサンプルは室温下で完全に曝露していた。実験結果は表３を参照する。
化合物を次の条件下で静置する場合の安定性を検討し、異なる時点でサンプルを採取して含有量を測定した。実施例２で製造した式（Ｉ）化合物の結晶約５ｍｇを正確に秤量して、乾燥した清潔なガラス瓶に入れ、２連サンプルとして、薄く敷き詰めたものを正式な試験サンプルとし、影響因子試験条件下（（６０℃）、（相対湿度９２．５％）、光（総照度１．２×１０６Ｌｕｘ・ｈｒ／近紫外域２００Ｗ・ｈｒ／ｍ２）、（４０℃、相対湿度７５％）、（６０℃、相対湿度７５％））で静置し、サンプルが完全に曝露するように静置し、アルミニウム箔をかけて、小さな穴を開けた。５日、１０日、１か月、２か月、３か月でサンプルを採取して分析した。光（可視光１２０００００Ｌｕｘ、紫外２００Ｗ）条件下で静置したサンプルは室温下で完全に曝露していた。実験結果は表３を参照する。
【表3】
【0122】
以上から分かるように、本願の式（Ｉ）化合物の結晶は高温、高湿度又は光条件下でいずれも良好な安定性を有し、試験中に不純物が増えなかった。
【0123】
実験例２：式（Ｉ）化合物の結晶の吸湿性に関する研究
装置モデル：ＳＭＳ ＤＶＳ Ａｄｖａｎｔａｇｅ動的水蒸気吸着測定装置
測定条件：サンプル（１０～２０ｍｇ、実施例３で製造した結晶）をＤＶＳサンプルトレイに置いて測定した。
装置モデル：ＳＭＳ ＤＶＳ Ａｄｖａｎｔａｇｅ動的水蒸気吸着測定装置
測定条件：サンプル（１０～２０ｍｇ、実施例３で製造した結晶）をＤＶＳサンプルトレイに置いて測定した。
【0124】
詳細なＤＶＳパラメータは次のとおりである。
温度：２５℃。
平衡：ｄｍ／ｄｔ＝０．０１％／分（最小１０分、最大１８０分）。
乾燥：０％ＲＨ下で１２０分間乾燥。
ＲＨ（％）測定ステップ：１０％。
ＲＨ（％）測定ステップ範囲：０％－９０％－０％。最終的な動的水蒸気収着（ＤＶＳ）曲線は図４に示すとおりである。
温度：２５℃。
平衡：ｄｍ／ｄｔ＝０．０１％／分（最小１０分、最大１８０分）。
乾燥：０％ＲＨ下で１２０分間乾燥。
ＲＨ（％）測定ステップ：１０％。
ＲＨ（％）測定ステップ範囲：０％－９０％－０％。最終的な動的水蒸気収着（ＤＶＳ）曲線は図４に示すとおりである。
【0125】
図４から分かるように、本願の式（Ｉ）化合物の結晶は低吸湿性である。
【0126】
実験例３：ＰＤＥ３Ａ酵素に対する化合物の阻害活性のインビトロ測定
実験目的：蛍光の偏光によりＡＭＰ／ＧＭＰの発現を測定し、つまりＡＭＰ／ＧＭＰ抗体の結合を追跡して酵素活性を示す。
実験目的：蛍光の偏光によりＡＭＰ／ＧＭＰの発現を測定し、つまりＡＭＰ／ＧＭＰ抗体の結合を追跡して酵素活性を示す。
【0127】
試薬：
実験緩衝溶液：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０
．０１％Ｂｒｉｊ ３５、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１％ＤＭＳＯ。
実験緩衝溶液：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０
．０１％Ｂｒｉｊ ３５、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１％ＤＭＳＯ。
【0128】
酵素：Ｓｆ９昆虫細胞のバキュロウイルスにおいてＮ末端ＧＳＴタグで組換えヒトＰＤＥ３Ａ（遺伝子アクセッション番号ＮＭ＿０００９２１、アミノ酸６６９末端）を発現し、分子量は８４ｋＤａであった。
【0129】
基質：１μＭ ｃＡＭＰ。
測定：Ｔｒａｎｓｃｒｅｅｎｅｒ（登録商標）ＡＭＰ２／ＧＭＰ２抗体及びＡＭＰ２／ＧＭＰ２ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３を追跡した。
測定：Ｔｒａｎｓｃｒｅｅｎｅｒ（登録商標）ＡＭＰ２／ＧＭＰ２抗体及びＡＭＰ２／ＧＭＰ２ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３を追跡した。
【0130】
手順：
１．組換えヒトＰＤＥ３Ａ酵素、基質（１μＭ ｃＡＭＰ）をそれぞれ新たに調製した実験緩衝液に溶解した。
２．前記ＰＤＥ３Ａ酵素緩衝溶液を反応ウェルに移した。
３．音響学的手法（ｅｃｈｏ ５５０、精度ナノリットル）を利用して、ＰＤＥ３Ａ酵素緩衝溶液を含む反応ウェルに１００％ＤＭＳＯに溶解した化合物を加え、室温下で１０分間インキュベートした。
４．基質緩衝溶液を前記反応ウェルに加えて反応を開始させた。
５．室温下で１時間インキュベートした。
６．測定混合物（Ｔｒａｎｓｃｒｅｅｎｅｒ（登録商標）ＡＭＰ２／ＧＭＰ２抗体及びＡＭＰ２／ＧＭＰ２ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３追跡）を加えて反応を停止させ、ゆっくりと混合しながら９０分間インキュベートした。蛍光の偏光の測定範囲はＥｘ／Ｅｍ＝６２０／６８８であった。
１．組換えヒトＰＤＥ３Ａ酵素、基質（１μＭ ｃＡＭＰ）をそれぞれ新たに調製した実験緩衝液に溶解した。
２．前記ＰＤＥ３Ａ酵素緩衝溶液を反応ウェルに移した。
３．音響学的手法（ｅｃｈｏ ５５０、精度ナノリットル）を利用して、ＰＤＥ３Ａ酵素緩衝溶液を含む反応ウェルに１００％ＤＭＳＯに溶解した化合物を加え、室温下で１０分間インキュベートした。
４．基質緩衝溶液を前記反応ウェルに加えて反応を開始させた。
５．室温下で１時間インキュベートした。
６．測定混合物（Ｔｒａｎｓｃｒｅｅｎｅｒ（登録商標）ＡＭＰ２／ＧＭＰ２抗体及びＡＭＰ２／ＧＭＰ２ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３追跡）を加えて反応を停止させ、ゆっくりと混合しながら９０分間インキュベートした。蛍光の偏光の測定範囲はＥｘ／Ｅｍ＝６２０／６８８であった。
【0131】
データ解析：ＡＭＰ／ＧＭＰ標準曲線に基づいて、ソフトウェアＥｘｃｅｌを用いて蛍光の偏光信号からＤＭＳＯ対照に対する酵素活性のパーセントを計算し、ｎＭに換算した。曲線当てはめはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（医学グラフ作成用）を用いた。実験結果は表４を参照する。
【0132】
実験例４：ＰＤＥ４Ｂ酵素に対する化合物の阻害活性のインビトロ測定
実験目的：蛍光の偏光によりＡＭＰ／ＧＭＰの発現を測定し、つまりＡＭＰ／ＧＭＰ抗体の結合を追跡して酵素活性を示す。
実験目的：蛍光の偏光によりＡＭＰ／ＧＭＰの発現を測定し、つまりＡＭＰ／ＧＭＰ抗体の結合を追跡して酵素活性を示す。
【0133】
試薬：
実験緩衝溶液：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％Ｂｒｉｊ ３５、１ｍＭ ＤＴＴ、１％ＤＭＳＯ。
実験緩衝溶液：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％Ｂｒｉｊ ３５、１ｍＭ ＤＴＴ、１％ＤＭＳＯ。
【0134】
酵素：Ｓｆ９昆虫細胞のバキュロウイルスにおいてＮ末端ＧＳＴタグで組換えヒトＰＤＥ４Ｂ（遺伝子アクセッション番号ＮＭ＿００２６００、アミノ酸３０５末端）を発現し、分子量は７８ｋＤａであった。
【0135】
基質：１μＭ ｃＡＭＰ。
測定：Ｔｒａｎｓｃｒｅｅｎｅｒ（登録商標）ＡＭＰ２／ＧＭＰ２抗体及びＡＭＰ２／ＧＭＰ２ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３を追跡した。
測定：Ｔｒａｎｓｃｒｅｅｎｅｒ（登録商標）ＡＭＰ２／ＧＭＰ２抗体及びＡＭＰ２／ＧＭＰ２ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３を追跡した。
【0136】
手順：
１．組換えヒトＰＤＥ４Ｂ酵素、基質（１μＭ ｃＡＭＰ）をそれぞれ新たに調製した実験緩衝液に溶解した。
２．前記ＰＤＥ４Ｂ酵素緩衝溶液を反応ウェルに移した。
３．音響学的手法（ｅｃｈｏ ５５０、精度ナノリットル）を利用して、ＰＤＥ４Ｂ酵
素緩衝溶液を含む反応ウェルに１００％ＤＭＳＯに溶解した化合物を加え、室温下で１０分間インキュベートした。
４．基質緩衝溶液を前記反応ウェルに加えて反応を開始させた。
５．室温下で１時間インキュベートした。
６．測定混合物（Ｔｒａｎｓｃｒｅｅｎｅｒ（登録商標）ＡＭＰ２／ＧＭＰ２抗体及びＡＭＰ２／ＧＭＰ２ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３追跡）を加えて反応を停止させ、ゆっくりと混合しながら９０分間インキュベートした。蛍光の偏光の測定範囲はＥｘ／Ｅｍ＝６２０／６８８であった。
１．組換えヒトＰＤＥ４Ｂ酵素、基質（１μＭ ｃＡＭＰ）をそれぞれ新たに調製した実験緩衝液に溶解した。
２．前記ＰＤＥ４Ｂ酵素緩衝溶液を反応ウェルに移した。
３．音響学的手法（ｅｃｈｏ ５５０、精度ナノリットル）を利用して、ＰＤＥ４Ｂ酵
素緩衝溶液を含む反応ウェルに１００％ＤＭＳＯに溶解した化合物を加え、室温下で１０分間インキュベートした。
４．基質緩衝溶液を前記反応ウェルに加えて反応を開始させた。
５．室温下で１時間インキュベートした。
６．測定混合物（Ｔｒａｎｓｃｒｅｅｎｅｒ（登録商標）ＡＭＰ２／ＧＭＰ２抗体及びＡＭＰ２／ＧＭＰ２ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３追跡）を加えて反応を停止させ、ゆっくりと混合しながら９０分間インキュベートした。蛍光の偏光の測定範囲はＥｘ／Ｅｍ＝６２０／６８８であった。
【0137】
データ解析：ＡＭＰ／ＧＭＰ標準曲線に基づいて、ソフトウェアＥｘｃｅｌを用いて蛍光の偏光信号からＤＭＳＯ対照に対する酵素活性のパーセントを計算し、ｎＭに換算した。曲線当てはめはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（医学グラフ作成用）を用いた。
【0138】
実験結果は表４を参照する。
【表4】
【0139】
本願の医薬組成物の有効成分はＰＤＥ３及びＰＤＥ４に明らかな二重の阻害効果を有する。
【0140】
実験例５：ビーグル犬による薬物動態試験
本研究では試験動物として雄のビーグル犬を用い、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法でビーグル犬への式（Ｉ）化合物の静脈注射又は強制経口投与後の異なる時点での血漿中薬物濃度を定量的に測定することにより、式（Ｉ）化合物のビーグル犬におけるインビボ薬物動態特性を評価した。
本研究では試験動物として雄のビーグル犬を用い、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法でビーグル犬への式（Ｉ）化合物の静脈注射又は強制経口投与後の異なる時点での血漿中薬物濃度を定量的に測定することにより、式（Ｉ）化合物のビーグル犬におけるインビボ薬物動態特性を評価した。
【0141】
式（Ｉ）化合物の清澄溶液を頭静脈又は大伏在静脈より１０～１２ｋｇのビーグル犬２匹の体内に注射し、式（Ｉ）化合物の清澄溶液を１０～１２ｋｇのビーグル犬２匹（一晩絶食）に強制経口投与した。全ての動物は、投与後０．０３３３時間、０．０８３３時間、０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、２４時間で末梢静脈から約５００μＬ採血して０．８５～１．１５ｍｇのＫ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏを含む抗凝固遠心管に移し、４℃下で、３０００ｇで１０分間遠心分離して血漿を採取した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法で血中薬物濃度を測定し、薬物動態ソフトウェアＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（商標）Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．３（カリフォルニア州マウンテンビュー市、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社）を用いて、ノンコンパートメントモデル×線形台数法で関連の薬物動態パラメータを計算した。
【表5】
【0142】
本願の医薬組成物の有効成分はインビボ血漿クリアランスが高く、経口投与では血漿中曝露量及び生物学的利用能が低い。
【0143】
実験例６：ヒト肝ミクロソーム由来シトクロムＰ４５０のアイソエンザイム（ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ４）に対する活性阻害効果
ＣＹＰの５つのアイソエンザイムの５つの特異的なプローブ基質であるフェナセチン（Ｐｈｅｎａｃｅｔｉｎ、ＣＹＰ１Ａ２）、ジクロフェナク（Ｄｉｃｌｏｆｅｎａｃ、ＣＹＰ２Ｃ９）、（Ｓ）－メフェニトイン（（Ｓ）－Ｍｅｐｈｅｎｙｔｏｉｎ、ＣＹＰ２Ｃ１９）、デキストロメトルファン（Ｄｅｘｔｒｏｍｅｔｈｏｒｐｈａｎ、ＣＹＰ２Ｄ６）、ミダゾラム（Ｍｉｄａｚｏｌａｍ、ＣＹＰ３Ａ４）をそれぞれヒト肝ミクロソーム及び式（Ｉ）化合物と共インキュベートし、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（ＮＡＤＰＨ）を加えて反応を開始させ、反応終了後にサンプルを処理し液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）法で、特異的な基質が生成した５つの代謝生成物であるアセトアミノフェン（Ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ）、４’－ヒドロキシジクロフェナク（４’－Ｈｙｄｒｏｘｙｄｉｃｌｏｆｅｎａｃ）、４’－ヒドロキシメフェニトイン（４’－Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｐｈｅｎｙｔｏｉｎ）、デキストロルファン（Ｄｅｘｔｒｏｒｐｈａｎ）、１’－ヒドロキシミダゾラム（１’－Ｈｙｄｒｏｘｙｍｉｄａｚｏｌａｍ）の濃度を定量的に測定して、対応の半数阻害濃度（ＩＣ５０）を計算した。
ＣＹＰの５つのアイソエンザイムの５つの特異的なプローブ基質であるフェナセチン（Ｐｈｅｎａｃｅｔｉｎ、ＣＹＰ１Ａ２）、ジクロフェナク（Ｄｉｃｌｏｆｅｎａｃ、ＣＹＰ２Ｃ９）、（Ｓ）－メフェニトイン（（Ｓ）－Ｍｅｐｈｅｎｙｔｏｉｎ、ＣＹＰ２Ｃ１９）、デキストロメトルファン（Ｄｅｘｔｒｏｍｅｔｈｏｒｐｈａｎ、ＣＹＰ２Ｄ６）、ミダゾラム（Ｍｉｄａｚｏｌａｍ、ＣＹＰ３Ａ４）をそれぞれヒト肝ミクロソーム及び式（Ｉ）化合物と共インキュベートし、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（ＮＡＤＰＨ）を加えて反応を開始させ、反応終了後にサンプルを処理し液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）法で、特異的な基質が生成した５つの代謝生成物であるアセトアミノフェン（Ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ）、４’－ヒドロキシジクロフェナク（４’－Ｈｙｄｒｏｘｙｄｉｃｌｏｆｅｎａｃ）、４’－ヒドロキシメフェニトイン（４’－Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｐｈｅｎｙｔｏｉｎ）、デキストロルファン（Ｄｅｘｔｒｏｒｐｈａｎ）、１’－ヒドロキシミダゾラム（１’－Ｈｙｄｒｏｘｙｍｉｄａｚｏｌａｍ）の濃度を定量的に測定して、対応の半数阻害濃度（ＩＣ５０）を計算した。
【表6】
【0144】
本願の医薬組成物の有効成分はヒト肝ミクロソーム由来シトクロムＰ４５０の５つのアイソエンザイム（ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ４）に対する阻害効果が低い。
【0145】
実験例７：受動喫煙誘発ラット急性肺損傷モデルにおける薬力学研究
実験動物：
雄のＳＰＦ基準Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（上海斯莱克実験動物有限公司提供）を用い、体重は約２００ｇであった。
実験動物：
雄のＳＰＦ基準Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（上海斯莱克実験動物有限公司提供）を用い、体重は約２００ｇであった。
【0146】
実験手順：
１．動物は施設に受け入れた後、環境に適応するよう１週間飼育してから、体重によってランダムに６群に分けた。
２．実験１～３日目に、各群では対象化合物を３０分間霧化投与し、その後、モデル群及び各化合物処理群の動物を１時間受動喫煙に曝露させ、４時間の間隔で、再び１時間受動喫煙に曝露させた。毎日２回で、３日間連続してタバコの煙に曝露させた。対照群動物は室内で空気に曝露させた。
３．実験４日目に、各群では対象化合物を３０分間霧化投与し、モデル群及び各化合物処理群の動物は霧化吸入により１５０μｇ／ｍＬのＬＰＳに１５分間曝露させ、霧化投与開始から３時間後、１時間受動喫煙に曝露させて、動物肺機能（Ｐｅｎｈ、Ｆ）を測定し、ＣＯ２で動物を安楽死させた後に細胞計数のために肺胞洗浄液を収集した。
１．動物は施設に受け入れた後、環境に適応するよう１週間飼育してから、体重によってランダムに６群に分けた。
２．実験１～３日目に、各群では対象化合物を３０分間霧化投与し、その後、モデル群及び各化合物処理群の動物を１時間受動喫煙に曝露させ、４時間の間隔で、再び１時間受動喫煙に曝露させた。毎日２回で、３日間連続してタバコの煙に曝露させた。対照群動物は室内で空気に曝露させた。
３．実験４日目に、各群では対象化合物を３０分間霧化投与し、モデル群及び各化合物処理群の動物は霧化吸入により１５０μｇ／ｍＬのＬＰＳに１５分間曝露させ、霧化投与開始から３時間後、１時間受動喫煙に曝露させて、動物肺機能（Ｐｅｎｈ、Ｆ）を測定し、ＣＯ２で動物を安楽死させた後に細胞計数のために肺胞洗浄液を収集した。
【0147】
４．投与処理
投与方式：全身曝露用霧化投与装置を用いて、最大霧化率（約１２ｍＬ）で３０分間被験化合物及び参照化合物を霧化投与した。
投与方式：全身曝露用霧化投与装置を用いて、最大霧化率（約１２ｍＬ）で３０分間被験化合物及び参照化合物を霧化投与した。
【0148】
投与頻度：毎朝受動喫煙前に３０分間霧化投与し又は溶媒を投与し、４日目にＬＰＳ霧化吸入前に投与した。
【0149】
５．薬力学的エンドポイントの測定
（１）ＢＡＬＦ（肺胞洗浄液）の白血球総数。
（２）メタコリン（Ｍｃｈ）誘発下の肺機能測定（気道抵抗指標Ｐｅｎｈ）。
（１）ＢＡＬＦ（肺胞洗浄液）の白血球総数。
（２）メタコリン（Ｍｃｈ）誘発下の肺機能測定（気道抵抗指標Ｐｅｎｈ）。
【表7】
【0150】
【0151】
【0152】
実験例８：ヒト末梢血単核細胞中のＴＮＦ－αに対する化合物の阻害活性のインビトロ測定
実験目的：ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）中のＴＮＦ－αのレベルで、被験化合物の細胞レベルの抗炎症活性を示す。
実験目的：ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）中のＴＮＦ－αのレベルで、被験化合物の細胞レベルの抗炎症活性を示す。
【0153】
手順：
１．健常者から全血を採取し、ＥＤＴＡ抗凝固管で抗凝固処理を行った。
２．Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心法でＰＢＭＣを分離して、計数し、細胞濃度を２×１０６／ｍＬに調整した。
３． Ｕ底９６ウェルプレートの各ウェルに２×１０５の細胞、１ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを加え、式（Ｉ）化合物をそれぞれ濃度１００μＭ、１０μＭ、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭのＤＭＳＯ溶液に調製し、各ウェルは２００μＬの反応系とした。
４． ２４時間培養して、上清を収集した。
５．ＥＬＩＳＡ法で上清中のＴＮＦ－αレベルを測定し、ソフトウェアＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍで阻害曲線を当てはめしてＩＣ５０を計算した。
１．健常者から全血を採取し、ＥＤＴＡ抗凝固管で抗凝固処理を行った。
２．Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心法でＰＢＭＣを分離して、計数し、細胞濃度を２×１０６／ｍＬに調整した。
３． Ｕ底９６ウェルプレートの各ウェルに２×１０５の細胞、１ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを加え、式（Ｉ）化合物をそれぞれ濃度１００μＭ、１０μＭ、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭのＤＭＳＯ溶液に調製し、各ウェルは２００μＬの反応系とした。
４． ２４時間培養して、上清を収集した。
５．ＥＬＩＳＡ法で上清中のＴＮＦ－αレベルを測定し、ソフトウェアＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍで阻害曲線を当てはめしてＩＣ５０を計算した。
【0154】
実験結果は表８を参照する。
【表8】
【0155】
したがって、本願の医薬組成物の有効成分は効果的な抗炎症活性を表すことができ、ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）中のＴＮＦ－αに明らかな阻害効果を有する。
【0156】
実験例９：安定性試験
実施例２８で得た製品を加速条件（４０℃±２℃／ＲＨ ２５％±５％）、長期条件（３０℃±２℃／ＲＨ ６５％±５％）下で６か月静置し、結果は表１０を参照する。
実施例２８で得た製品を加速条件（４０℃±２℃／ＲＨ ２５％±５％）、長期条件（３０℃±２℃／ＲＨ ６５％±５％）下で６か月静置し、結果は表１０を参照する。
【表9】
【0157】
以上から分かるように、本願の医薬組成物は加速条件と長期条件下で良好な安定性を示しており、不純物の明らかな増加はなく、粒度が増加しなかった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【国際調査報告】