特表2023-512499変異型ＬｙｓＥを含む微生物、およびこれを利用したＬ－アミノ酸生産方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-27
(54)【発明の名称】変異型ＬｙｓＥを含む微生物、およびこれを利用したＬ－アミノ酸生産方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/31 20060101AFI20230317BHJP
C12N 15/10 20060101ALI20230317BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230317BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230317BHJP
C12P 13/04 20060101ALI20230317BHJP
C12P 13/08 20060101ALI20230317BHJP
C12P 13/10 20060101ALI20230317BHJP
C07K 14/34 20060101ALI20230317BHJP
【ＦＩ】
C12N15/31 ZNA
C12N15/10 200Z
C12N15/63 Z
C12N1/21
C12P13/04
C12P13/08 A
C12P13/10 B
C07K14/34
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022543765
(86)(22)【出願日】2021-02-10
(85)【翻訳文提出日】2022-07-19
(86)【国際出願番号】 KR2021001793
(87)【国際公開番号】W WO2021162459
(87)【国際公開日】2021-08-19
(31)【優先権主張番号】10-2020-0017559
(32)【優先日】2020-02-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507406611
【氏名又は名称】シージェイ チェルジェダン コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】110001818
【氏名又は名称】弁理士法人Ｒ＆Ｃ
(72)【発明者】
【氏名】ジャン，ジェウォン
(72)【発明者】
【氏名】シム，ジヒュン
(72)【発明者】
【氏名】パク，サン・ミン
(72)【発明者】
【氏名】ベ，ヒュン・ウォン
(72)【発明者】
【氏名】ビュン，ヒョ・ジョン
(72)【発明者】
【氏名】シン，ヨン・ウク
(72)【発明者】
【氏名】イ，ハン・ヒョン
(72)【発明者】
【氏名】イム，ボラム
(72)【発明者】
【氏名】ジュン，ム・ヨン
(72)【発明者】
【氏名】チョイ，ユン・ジュン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AE24
4B064AE25
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA11
4B065AA24X
4B065AA24Y
4B065AA26X
4B065AA26Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065CA17
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA11
4H045DA50
4H045EA60
4H045FA74
(57)【要約】
変異型ＬｙｓＥを含む微生物、およびこれを利用したＬ－アミノ酸生産方法が提供される。前記変異型ＬｙｓＥは、野生型と比較してＬ－アミノ酸排出能および／または生産能を向上させるものであり得る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１のアミノ酸配列でＮ－末端から６５番目アミノ酸であるアスパラギンが他のアミノ酸で置換された、ポリペプチド。
【請求項2】
前記６５番目アミノ酸であるアスパラギンがグルタミン酸、アルギニン、バリン、リジン、ヒスチジン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、イソロイシン、トリプトファン、プロリン、システイン、チロシン、セリン、スレオニン、メチオニン、グルタミン、またはグリシンで置換された、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項3】
Ｌ－アミノ酸排出体の機能を有する、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項4】
請求項１または２に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項5】
配列番号４の核酸配列で表現される、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項6】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む、組換えベクター。
【請求項7】
請求項１に記載のポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを含む、Ｌ－アミノ酸生産微生物。
【請求項8】
前記ポリペプチドは、Ｌ－アミノ酸排出体の機能を有するものである、請求項７に記載のＬ－アミノ酸生産微生物。
【請求項9】
前記ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、前記微生物と同種微生物に由来のものである、請求項７に記載のＬ－アミノ酸生産微生物。
【請求項10】
前記微生物は、コリネバクテリウム属またはエシェリキア属微生物である、請求項７に記載のＬ－アミノ酸生産微生物。
【請求項11】
前記微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカムまたは大腸菌である、請求項７に記載のＬ－アミノ酸生産微生物。
【請求項12】
非変形の微生物と比較してＬ－アミノ酸排出能または生産能が増加した、請求項７～１１のいずれか一項に記載のＬ－アミノ酸生産微生物。
【請求項13】
前記Ｌ－アミノ酸は、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、またはこれらの組み合わせである、請求項８に記載のＬ－アミノ酸生産微生物。
【請求項14】
請求項７～１１のいずれか一項に記載のＬ－アミノ酸生産微生物を培地で培養する段階、を含む、Ｌ－アミノ酸の生産方法。
【請求項15】
前記培養する段階の後に、前記培養された微生物、培地、またはこれらの全てからＬ－アミノ酸を回収する段階、を追加的に含む、請求項１４に記載のＬ－アミノ酸の生産方法。
【請求項16】
前記Ｌ－アミノ酸は、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、またはこれらの組み合わせである、請求項１４に記載のＬ－アミノ酸の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願らとの相互引用
本出願は、２０２０年２月１３日付大韓民国特許出願第１０－２０２０－００１７５５９号に基づいた優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示された全ての内容は本明細書の一部として含まれる。
本出願は、２０２０年２月１３日付大韓民国特許出願第１０－２０２０－００１７５５９号に基づいた優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示された全ての内容は本明細書の一部として含まれる。
【0002】
変異型ＬｙｓＥを含む微生物、およびこれを利用したＬ－アミノ酸生産方法が提供される。前記変異型ＬｙｓＥは、野生型と比較してＬ－アミノ酸排出能および／または生産能を向上させるものであり得る。
【背景技術】
【0003】
コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属微生物は、Ｌ－アミノ酸の生産に多く利用されているグラム陽性の微生物である。Ｌ－アミノ酸、特にＬ－リジンは、動物飼料、ヒトの医薬品および化粧品産業に使用されており、主にコリネバクテリウム菌株を利用した発酵により生成されている。
【0004】
コリネバクテリウム属菌株を利用したＬ－アミノ酸の製造方法を改善するために、多くの試みが行われている。その中で組換えＤＮＡ技術を利用して特定の遺伝子を破壊させたり減衰発現させることによってＬ－アミノ酸を生産するコリネバクテリウム菌株を改良しようとする研究がなされている。また、それぞれのＬ－アミノ酸生合成に関する遺伝子を増幅させてＬ－アミノ酸生成に及ぼす効果を分析してＬ－アミノ酸生産のコリネバクテリウム菌株を改良するための研究が行われてきている。また、他のバクテリア由来の外来遺伝子を導入する試みもある。
【0005】
このような努力にも拘らず、Ｌ－アミノ酸のような有用物質の生産能を向上させる技術の開発は依然として要求されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
一例は、変異型リジン排出体を提供する。例えば、前記変異型リジン排出体は、配列番号１のアミノ酸配列でＮ－末端から６５番目アミノ酸であるアスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）が他のアミノ酸で置換されたポリペプチドであり得る。前記ポリペプチドは、Ｌ－アミノ酸（例、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、これらの組み合わせなど）排出体の機能を有するものであり得る。
【0007】
他の例は、前記ポリペプチド（変異型リジン排出体）をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【0008】
他の例は、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。
【0009】
他の例は、前記ポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを含む、組換え微生物を提供する。前記組換え微生物は、Ｌ－アミノ酸排出能および／または生産能を有するか、または非変形の微生物と比較して増加したＬ－アミノ酸排出能および／または生産能を有するものであり得る。
【0010】
他の例は、前記組換え微生物またはＬ－アミノ酸生産微生物を培養する段階を含む、Ｌ－アミノ酸生産方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本明細書で提供される一例は、コリネバクテリウム属微生物のリジン生産能に対する遺伝子変異の影響を確認し、これを利用した菌株改良と関連した技術を提供する。一般的にリジン生産能の増加のためには、菌株が有するリジン生産収率を向上させるか、または時間当たりリジン生産量（生産性）を増加させる方法がある。その一環で、生合成を経て生成されたリジンを排出する機能を有する膜蛋白質であるＬ－リジン排出体蛋白質を改良してリジン生産収率および／または生産性を向上させ得ることを提案する。本明細書で提供される一例は、前記Ｌ－リジン排出体蛋白質および／またはこれをコードするｌｙｓＥ遺伝子を改良してＬ－アミノ酸（例、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、これらの組み合わせなど）の排出能が向上した菌株を開発することと関連した技術を提供する。
【0012】
一例は、変異型リジン排出体を提供する。例えば、前記変異型リジン排出体は、配列番号１のアミノ酸配列でＮ－末端から６５番目アミノ酸であるアスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）が他のアミノ酸で置換されたポリペプチドであり得る。前記ポリペプチドは、Ｌ－アミノ酸（例、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、これらの組み合わせなど）排出体機能を有するものであり得る。
【0013】
他の例は、前記ポリペプチド（変異型リジン排出体）をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【0014】
他の例は、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。前記組換えベクターは発現ベクターとして使用することができる。
【0015】
他の例は、前記ポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを含む、組換え微生物を提供する。前記組換え微生物は、Ｌ－アミノ酸排出能および／または生産能を有するか、または非変形の微生物と比較して増加したＬ－アミノ酸排出能および／または生産能を有するものであり得る。
【0016】
他の例は、前記組換え微生物またはＬ－アミノ酸生産微生物を培養する段階を含む、Ｌ－アミノ酸生産方法を提供する。
【0017】
前記Ｌ－アミノ酸は、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、またはこれらの組み合わせであり得る。
【0018】
前記微生物は、コリネバクテリウム属またはエシェリキア属微生物であり得る。
【0019】
以下、より詳しく説明する。
【0020】
本明細書において、リジン排出体（Ｌｙｓｉｎｅ ｅｘｐｏｒｔｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＬｙｓＥ）は、膜透過蛋白質のうちの一つで、細胞内で生合成された産物、例えば、Ｌ－リジンのようなＬ－アミノ酸を細胞外に排出する作用をする蛋白質を意味し得る。一例において、前記リジン排出体蛋白質は、コリネバクテリウム属菌株、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムに由来するものであり得る。一具体例において、前記リジン排出体蛋白質は、配列番号１で表現されるものであり得る。
【0021】
前記変異型リジン排出体は、前述したリジン排出体にアミノ酸置換突然変異が誘導されたポリペプチドであり得る。一例において、前記変異型リジン排出体は、配列番号１のアミノ酸配列でＮ－末端から６５番目アミノ酸であるアスパラギン（Ｎ）が他のアミノ酸で置換されたもの（ｅ．ｇ．, 配列番号１のアミノ酸配列でＮ－末端から６５番目アミノ酸であるアスパラギンが他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列で表現されるもの）であり得る。より具体的に、前記変異型リジン排出体は、配列番号１のアミノ酸配列でＮ－末端から６５番目アミノ酸であるアスパラギン（Ｎ）がグルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、システイン（Ｃ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、またはアルギニン（Ｒ）で置換されたものであり得る。一具体例において、前記変異型リジン排出体は、配列番号３で表現されるポリペプチド（６５番目アミノ酸であるアスパラギン（Ｎ）がグルタミン酸（Ｅ）で置換）であり得るが、これに制限されるのではない。このように変異が誘導されたポリペプチドは、Ｌ－アミノ酸（例、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、これらの組み合わせなど）排出体機能を有するものであり得る。
【0022】
本明細書において、用語「Ｌ－アミノ酸生産微生物」は、Ｌ－アミノ酸排出能および／または生産能を有する微生物に前述したようなリジン排出体変異が導入されることによって前記微生物が増加したＬ－アミノ酸排出能および／または生産能を有する場合および／またはＬ－アミノ酸排出能および／または生産能を有していない微生物に前記リジン排出体変異が導入されることによって前記微生物がＬ－アミノ酸排出能および／または生産能を有するようになる場合を意味するために使用され得る。本明細書で「微生物」は、単細胞バクテリアを含むもので、「細胞」と混用され得る。
【0023】
前記Ｌ－アミノ酸は、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、またはこれらの組み合わせであり得る。
【0024】
一例において、前記微生物は、Ｌ－アミノ酸（例えば、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、またはこれらの組み合わせ）排出能および／または生産能を有する全ての微生物から選択されたものであり得る。一例において、前記微生物は、自然にＬ－アミノ酸排出能および／または生産能を有する微生物またはＬ－アミノ酸排出能および／または生産能がないかまたは顕著に少ない親株に変異が導入されてＬ－アミノ酸排出能および／または生産能を有する微生物であり得る。
【0025】
一具体例において、前記微生物は、自然にＬ－アミノ酸排出能および／または生産能を有する微生物またはＬ－アミノ酸排出能および／または生産能がないかまたは顕著に少ない親株に変異が導入されてＬ－アミノ酸排出能および／または生産能を有する全てのコリネバクテリウム属（ｇｅｎｕｓ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）微生物、エシェリキア属微生物の中で選択された１種以上であり得る。前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アムモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）などを含むことができるが、必ずしもこれに限定されるのではない。より具体的には、前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）であり得る。前記エシェリキア属菌株は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であり得る。
【0026】
一例において、リジン排出体の変異が導入されたＬ－アミノ酸生産微生物は、同種の非変形の微生物と比較して、Ｌ－アミノ酸排出能および／または生産能が増加したものであり得る。前記非変形の微生物は、リジン排出体変異が導入されていない同種の微生物または導入される前の微生物を意味し得る。
【0027】
本明細書において、リジン排出体変異が導入される前の微生物を前記リジン排出体変異が導入されてＬ－アミノ酸排出能および／または生産能が増加したり、Ｌ－アミノ酸排出能および／または生産能が付与された「Ｌ－アミノ酸生産微生物」と区別するために、前記リジン排出体変異が導入される前の微生物を宿主微生物または親株と表現することができる。
【0028】
本明細書において、「リジン排出体変異の導入」は、宿主微生物に前述の変異型リジン排出体が導入される全ての操作を意味し得る。
【0029】
前記「リジン排出体変異が導入されたＬ－アミノ酸生産微生物」は、（１）前述した変異型リジン排出体、例えば、配列番号１のアミノ酸配列でＮ－末端から６５番目アミノ酸であるアスパラギン（Ｎ）が他のアミノ酸で置換されたポリペプチド、（２）これをコードするポリヌクレオチド、または（３）前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを含んで、Ｌ－アミノ酸排出能および／または生産能が増加したり、Ｌ－アミノ酸排出能および／または生産能が付与された微生物であり得る。
【0030】
前記変異型リジン排出体、例えば、配列番号１のアミノ酸配列でＮ－末端から６５番目アミノ酸であるアスパラギン（Ｎ）が他のアミノ酸で置換されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはこれを含む組換えベクターを含む微生物は、
（ｉ）自己の遺伝体（ｇｅｎｏｍｅ）に加えて、前記ポリヌクレオチドまたは前記組換えベクターを追加的に含むか、および／または
（ｉｉ）内在のリジン排出体コード遺伝子（例えば、ＬｙｓＥ遺伝子）であって、前記ポリヌクレオチドを含むものを意味し得る。
（ｉ）自己の遺伝体（ｇｅｎｏｍｅ）に加えて、前記ポリヌクレオチドまたは前記組換えベクターを追加的に含むか、および／または
（ｉｉ）内在のリジン排出体コード遺伝子（例えば、ＬｙｓＥ遺伝子）であって、前記ポリヌクレオチドを含むものを意味し得る。
【0031】
前記（ｉｉ）「内在のリジン排出体コード遺伝子（例えば、ＬｙｓＥ遺伝子）であって、前記ポリヌクレオチドを含む」とは、（ａ）前記ポリヌクレオチドが内在のリジン排出体コード遺伝子（例えば、ＬｙｓＥ遺伝子）を代替して含まれる（挿入される）か、および／または（ｂ）内在のリジン排出体暗号化遺伝子（例えば、ＬｙｓＥ遺伝子）が遺伝子編集（ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）技術により前記ポリヌクレオチドの核酸配列（つまり、変異型リジン排出体のコード核酸配列）を有するように変移されることを意味するものであり得る。
【0032】
一例において、前記リジン排出体またはこれをコードする遺伝子は。宿主微生物由来（内在）のものまたはこれと異なる微生物由来（外来）のものであり得る。
【0033】
一具体例において、前記Ｌ－アミノ酸生産微生物は、配列番号１のアミノ酸配列でＮ－末端から６５番目アミノ酸であるアスパラギン（Ｎ）がグルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、システイン（Ｃ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、およびアルギニン（Ｒ）からなる群より選択されたアミノ酸で置換されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドおよび／またはこれを含む組換えベクターを含む微生物であり得る。より具体的に、前記Ｌ－アミノ酸生産微生物は、配列番号１のアミノ酸配列でＮ－末端から６５番目アミノ酸であるアスパラギン（Ｎ）がグルタミン酸（Ｅ）で置換されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドおよび／またはこれを含む組換えベクターを含むものであり得、より具体的に、配列番号３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドおよび／またはこれを含む組換えベクターを含むコリネバクテリウム属微生物、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）であり得る。例えば、前記Ｌ－アミノ酸生産微生物は、寄託番号ＫＣＣＭ１２６４１Ｐであるものであり得る。
【0034】
本明細書において、ポリヌクレオチド（「遺伝子」と混用され得る）またはポリペプチド（「蛋白質」と混用され得る）が「特定の核酸配列またはアミノ酸配列を含む、または特定の核酸配列またはアミノ酸配列で表現される」とは、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列からなるか、これを必須で含むことを意味し得、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの本来の機能および／または目的とする機能を維持する範囲で前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列に変異（欠失、置換、変形、および／または付加）が加えられた「実質的に同等な配列」を含むもの（または前記変異を排除しないもの）と解釈され得る。
【0035】
一例において、本明細書で提供される核酸配列またはアミノ酸配列は、これらの本来の機能または目的とする機能を維持する範囲で通常の突然変異誘発法、例えば指向性進化法（ｄｉｒｅｃｔ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）および／または部位特異突然変異法（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）などにより変形されたものを含むことができる。一例において、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが「特定の核酸配列またはアミノ酸配列を含む、前記配列からなる、または表現される」とは、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが（ｉ）前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列からなるか、またはこれを必須で含むか、または（ｉｉ）前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるか、これを必須で含み、本来の機能および／または目的とする機能を維持することを意味し得る。本明細書において、前記本来の機能は、リジン排出体機能（アミノ酸配列の場合）、または前記リジン排出体機能を有する蛋白質をコードする機能（核酸配列の場合）であり得、前記目的とする機能は、微生物のＬ－アミノ酸（例えば、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、またはこれらの組み合わせ）排出能および／または生産能を増加させたり付与した機能を意味し得る。
【0036】
本明細書に記載された核酸配列は、コドンの縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）により前記蛋白質（リジン排出体）を発現させようとする微生物で好まれるコドンを考慮して、コーディング領域から発現する蛋白質のアミノ酸配列および／または機能を変化させない範囲内でコーディング領域に多様な変形が行われ得る。
【0037】
本出願で用語、「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」または「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、二つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列間の関連した程度を意味し、百分率で表示され得る。相同性および同一性の用語は、時々相互交換的に利用され得る。
【0038】
保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準配列アルゴリズムにより決定され、使用されるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に利用され得る。実質的に、相同性を有するか（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）または同一な（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）配列は、一般的に配列全体または全体－長さの少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％により中間またはストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）でハイブリダイズすることができる。ハイブリダイズは、ポリヌクレオチドで一般コドンまたはコドン縮退性を考慮したコドンを含有するポリヌクレオチドも含まれることが自明である。
【0039】
任意の二つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が相同性、類似性または同一性を有するか否かは、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ （１９８８）［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５］ ２４４４でのようなデフォルトパラメータを利用して「ＦＡＳＴＡ」プログラムのような公知のコンピュータアルゴリズムを利用して決定され得る。または、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ， Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １６： ２７６－２７７）（バージョン５．０．０または以降のバージョン）で行われるような、ニードルマン－ブンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３－４５３）が使用されて決定され得る（ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２： ３８７ （１９８４））， ＢＬＡＳＴＰ， ＢＬＡＳＴＮ， ＦＡＳＴＡ （Ａｔｓｃｈｕｌ， ［Ｓ．］ ［Ｆ．，］ ［ＥＴ ＡＬ， Ｊ ＭＯＬＥＣ ＢＩＯＬ ２１５］： ４０３ （１９９０）； Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ， Ｍａｒｔｉｎ Ｊ． Ｂｉｓｈｏｐ， ［ＥＤ．，］ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９４，および［ＣＡＲＩＬＬＯ ＥＴＡ／．］（１９８８） ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８： １０７３を含む）。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴ、またはＣｌｕｓｔａｌＷを利用して相同性、類似性または同一性を決定することができる。
【0040】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性、類似性または同一性は、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ （１９８１） ２：４８２に公知されたとおり、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９７０）， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ４８：４４３のようなＧＡＰコンピュータプログラムを利用して配列情報を比較することによって決定され得る。要約すれば、ＧＡＰプログラムは、二つの配列のうち、より短いものにおける記号の全体数で、類似の配列された記号（つまり、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を割った値で定義することができる。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは（１）２進法比較マトリックス（同一性のために１、そして非同一性のために０の値を含有する）およびＳｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ， ｅｄｓ．， Ａｔｌａｓ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， ｐｐ． ３５３－３５８ （１９７９）により開示されたとおり、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ（１９８６） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４： ６７４５の加重された比較マトリックス（またはＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）；（２）各ギャップのための３．０のペナルティおよび各ギャップで各記号のための追加の０．１０ペナルティ（またはギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５；および３末端ギャップのための無ペナルティを含むことができる。
【0041】
また、任意の二つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が相同性、類似性または同一性を有するか否かは定義されたストリンジェントな条件下でサザンハイブリダイゼーション実験により配列を比較することによって確認することができ、定義される適切なハイブリダイゼーション条件は当該技術範囲内であり、当業者によく知られた方法（例えば、Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９； Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）で決定され得る。
【0042】
前記ポリヌクレオチドまたはベクター導入は、公知の形質転換方法を当業者が適切に選択して行われ得る。本明細書において、用語「形質転換」は、標的蛋白質（リジン排出体）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主微生物内に導入して宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードする蛋白質が発現することができるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主微生物内で発現さえできれば、宿主微生物の染色体内に挿入されて位置するかまたは染色体外に位置するかに関係なしにこれら全てを含むことができる。また、前記ポリヌクレオチドは、標的蛋白質をコーディングするＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主微生物内に導入されて発現できるものであれば、その導入される形態は制限がない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、独自的に発現するのに必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）の形態で宿主微生物に導入され得る。前記発現カセットは、通常前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終結信号、リボソーム結合部位および／または翻訳終結信号などの発現調節要素を含むことができる。前記発現カセットは、自己複製が可能な発現ベクターの形態であり得る。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入されて宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよい。前記で用語「作動可能に連結」されたものとは、発現調節要素が目的蛋白質（リジン排出体）をコードするポリヌクレオチドの転写調節（例、転写開始）を行うことができるように発現調節要素（例、プロモーター）とポリヌクレオチドが機能的に連結されていることを意味し得る。作動可能な連結は、当業界の公知の遺伝子組換え技術を利用して行うことができ、例えば、通常の部位－特異的ＤＮＡ切断および連結により行われ得るが、これに制限されない。
【0043】
前記ポリヌクレオチドを宿主微生物に形質転換する方法は、核酸を細胞（微生物）内に導入する如何なる方法でも遂行可能であり、宿主微生物により当該分野で公知の形質転換技術を適切に選択して行うことができる。前記公知の形質転換方法としと電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈澱法、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈澱法、マイクロインジェクション法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈澱法（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｕｐｔａｋｅ）、ＤＥＡＥ－デキストラン法、陽イオンリポソーム法、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法などを例示することができるが、これに制限されるのではない。
【0044】
前記ポリヌクレオチドの宿主細胞遺伝体（染色体）内挿入または宿主細胞内在遺伝子（例えば、ＬｙｓＥ遺伝子）が変異型リジン排出体をコードするようにする変異導入は、公知の方法を当業者が適切に選択して行うことができ、例えば、ＲＮＡ－ガイドエンドヌクレアーゼシステム（ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ；例えば、（ａ）ＲＮＡ－ガイドエンドヌクレアーゼ（例、Ｃａｓ９蛋白質など）、そのコード遺伝子、または前記遺伝子を含むベクター；および（ｂ）ガイドＲＮＡ（例、ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）など）、そのコードＤＮＡ、または前記ＤＮＡを含むベクターを含む混合物（例えば、ＲＮＡ－ガイドエンドヌクレアーゼ蛋白質とガイドＲＮＡの混合物など）、複合体（例えば、リボ核酸融合蛋白質（ＲＮＰ）、組換えベクター（例えば、ＲＮＡ－ガイドエンドヌクレアーゼコード遺伝子およびガイドＲＮＡコードＤＮＡを共に含むベクターなど）などからなる群より選択された一つ以上）を使用して行うことができるが、これに制限されるのではない。
【0045】
他の例は、変異型リジン排出体、例えば、配列番号１のアミノ酸配列でＮ－末端から６５番目アミノ酸であるアスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）が他のアミノ酸で置換されたポリペプチド、そのコードポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを微生物に導入（形質転換）させる段階を含む、前記微生物のＬ－アミノ酸排出能および／または生産能増加方法または前記微生物にＬ－アミノ酸排出能および／または生産能付与方法を提供する。
【0046】
前記変形リジン排出体、ポリヌクレオチド、および微生物は前述したとおりである。
【0047】
本明細書において、用語「ベクター」は、適した宿主内で目的蛋白質を発現させることができるように適した調節配列に作動可能に連結された前記目的蛋白質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始できるプロモーター、転写を調節するための任意のオペレーター配列、適したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、および／または転写および／または解読の終結を調節する配列を含むことができる。ベクターは、適当な宿主微生物内に形質転換された後、宿主微生物のゲノム（遺伝体）と関係なく発現したり、宿主微生物のゲノム内に統合され得る。
【0048】
本明細書で使用可能なベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されず、通常使用される全てのベクターの中で選択され得る。通常使用されるベクターの例としては、天然状態または組換えられた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージなどが挙げられる。例えば、前記ベクターとして、ファージベクターまたはコスミドベクターとしてｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、およびＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを使用することができ、プラスミドベクターとしてｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系およびｐＥＴ系などを使用することができる。具体的には、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを例示することができるが、これに制限されない。
【0049】
本明細書で使用可能なベクターは、公知の発現ベクターおよび／またはポリヌクレオチドの宿主細胞染色体内挿入用ベクターであり得る。前記ポリヌクレオチドの宿主細胞染色体内挿入は、当業界に知られた任意の方法、例えば、相同組換えにより行われ得るが、これに限定されない。前記ベクターは、前記染色体内挿入の有無を確認するための選別マーカ（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）を追加的に含むことができる。前記選別マーカは、ベクターに形質転換された細胞を選別、つまり、前記ポリヌクレオチドの挿入有無を確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面蛋白質の発現のような選択可能表現型を付与した遺伝子の中で選択して使用することができる。選択剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）が処理された環境では選別マーカを発現する細胞だけが生存したり他の表現形質を示すため、形質転換された細胞を選別することができる。
【0050】
他の例は、前記Ｌ－アミノ酸生産微生物を培地で培養する段階を含む、Ｌ－アミノ酸の生産方法を提供する。前記方法は、前記培養する段階の後に、前記培養した微生物、培地、またはこれらの全てからＬ－アミノ酸を回収する段階を追加的に含むことができる。
【0051】
前記方法において、前記微生物を培養する段階は、特にこれに制限されないが、公知の回分式培養方法、連続式培養方法、流加格式培養方法などにより行うことができる。この時、培養条件は、特にこれに制限されないが、塩基性化合物（例：水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例：リン酸または硫酸）を使用して適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５～９、具体的にはｐＨ６～８、最も具体的にはｐＨ６．８）を調節することができ、酸素または酸素－含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持することができる。培養温度は２０～４５℃、または２５～４０℃を維持することができ、約１０～１６０時間培養することができるが、これに制限されるのではない。前記培養により生産されたＬ－アミノ酸（例、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、またはこれらの組み合わせ）は培地中に分泌されたり細胞内に残留することができる。
【0052】
前記培養に使用可能な培地は、微生物培養に通常使用される培地の中で選択され得る。一例において、前記培地は、炭素供給源として糖および炭水化物（例：グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラセス、デンプンおよびセルロース）、油脂および脂肪（例：大豆油、ヒマワリ種子油、ピーナッツ油およびココナッツ油）、脂肪酸（例：パルミチン酸、ステアリン酸およびリノレン酸）、アルコール（例：グリセロールおよびエタノール）、有機酸（例：酢酸）などからなる群より選択された１種以上を個別的に使用したりまたは２種以上を混合して使用することができるが、これに制限されない。窒素供給源としては、窒素－含有有機化合物（例：ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、とうもろこし浸漬液、 大豆粕粉およびウレア）、無機化合物（例：硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウム）などからなる群より選択された１種以上を個別的に使用したりまたは２種以上を混合して使用することができるが、これに制限されない。リン供給源としてリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相応するナトリウム含有塩などからなる群より選択された１種以上を個別的に使用したりまたは２種以上を混合して使用することができるが、これに制限されない。また、前記培地は、その他金属塩（例：硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）、アミノ酸、および／またはビタミンなどのような必須成長－促進物質を含むことができる。
【0053】
前記Ｌ－アミノ酸（例、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、またはこれらの組み合わせ）を回収する段階は、培養方法により当該分野に公知の適した方法を利用して培地、培養液、または微生物から目的とするアミノ酸を収集するものであり得る。例えば、前記回収する段階は、遠心分離、ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化、ＨＰＬＣなどから選択された一つ以上の方法で行うことができる。前記方法は、前記回収する段階の前、同時、または後に、精製段階を追加的に含むことができる。
【発明の効果】
【0054】
リジン生産菌株の内在的ｌｙｓＥ遺伝子に変異を導入することによって、前記リジン生産菌株のＬ－アミノ酸（例、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、またはこれらの組み合わせ）生産能を向上させることができる。
【発明を実施するための形態】
【0055】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これは例示的なものに過ぎず、本発明の範囲を制限しようとすることでない。下記に記載された実施例は、発明の本質的な要旨を逸脱しない範囲で変形可能であることは当業者に自明である。
【0056】
実施例１：ｌｙｓＥ遺伝子ＯＲＦ内変異導入用ベクターライブラリーの作製
Ｌ－リジン排出体の排出能が向上した酵素を探索するために、ｌｙｓＥ変異型遺伝子を獲得するための目的で下記の方法でライブラリーを作製した。
Ｌ－リジン排出体の排出能が向上した酵素を探索するために、ｌｙｓＥ変異型遺伝子を獲得するための目的で下記の方法でライブラリーを作製した。
【0057】
ＧｅｎｅｍｏｒｐｈＩＩ Ｒａｎｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用し、ｌｙｓＥ遺伝子（７１１ ｂｐ；配列番号２）を含むＤＮＡ断片のｋｂ当たり０－４．５個の変異を導入した。コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２（ＷＴ）の遺伝体ＤＮＡを鋳型とし、下記表１の配列番号５および６のプライマーを利用してＥｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ ＰＣＲを行った。ＷＴ菌株（ＡＴＣＣ１３０３２）の遺伝体ＤＮＡ（５００ｎｇ）、プライマー（それぞれ１２５ｎｇ）、Ｍｕｔａｚｙｍｅ ＩＩ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（１×）、ｄＮＴＰ ｍｉｘ（４０ｍＭ）、およびＭｕｔａｚｙｍｅ ＩＩ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５Ｕ）を含む反応液を９４℃で２分間変性後、９４℃で１分変性、５６℃で１分アニーリング、７２℃で３０秒重合を３０回繰り返した後、７２℃で１０分間重合反応を行った。このような過程で確保された遺伝子断片を、制限酵素ＢａｍＨＩ－ＨＦ（ＮＥＢ）を３７℃で１時間反応および３７℃でＣＩＰ（ＮＥＢ）酵素３０分処理後に取得したｐＥＣＣＧ１１７ベクター（大韓民国登録特許第００５７６８４号）と連結し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換してカナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）が含まれているＬＢ固体培地に塗抹した。
【0058】
形質転換されたコロニー２０種を選別した後、プラスミドを獲得し、塩基配列を分析した結果、０．５ｍｕｔａｔｉｏｎｓ／ｋｂ頻度で互いに異なる位置に変異が導入されたことを確認した。最終的に約１０，０００個の形質転換された大腸菌コロニーを取ってｐｌａｓｍｉｄｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を利用してプラスミドを抽出し、これをｐ１１７－ｌｙｓＥ（ｍｔ）ライブラリーと命名した。またスクリーニングで対照区として使用するためにｐＥＣＣＧ１１７ベクターに野生型ｌｙｓＥが導入されたベクターを作製した。配列番号５および６を使用してＰＣＲを行って野生型ｌｙｓＥ遺伝子断片を準備し、前記のような方法でｐ１１７－ｌｙｓＥ（ＷＴ）ベクターを作製した。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間変性後、９４℃で１分変性、５６℃で１分アニーリング、７２℃で３０秒重合を３０回繰り返した後、７２℃で１０分間重合反応を行った。
【0059】
前記使用されたプライマーの核酸配列を下記の表１に整理した。
【0060】
【表1】
【0061】
実施例２：ベクターライブラリー導入菌株の作製およびスクリーニング
野生型のコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２でｌｙｓＥ遺伝子が欠損された菌株を作製するために、ｌｙｓＥ遺伝子を欠損するためのベクターを作製した。具体的に、ｌｙｓＥ遺伝子の５’および３’末端に位置したＤＮＡ断片（各６００ｂｐ）がｐＤＺベクター（ＵＳ ９１０９２４２ Ｂ２）に連結された形態の組換えベクターを作製した。ｌｙｓＥ遺伝子の塩基配列（配列番号２）に基づいてプライマー配列番号７および８およびこれらからそれぞれ６００ｂｐ離れた位置でプライマー配列番号９および１０をそれぞれ合成した（表２参照）。
野生型のコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２でｌｙｓＥ遺伝子が欠損された菌株を作製するために、ｌｙｓＥ遺伝子を欠損するためのベクターを作製した。具体的に、ｌｙｓＥ遺伝子の５’および３’末端に位置したＤＮＡ断片（各６００ｂｐ）がｐＤＺベクター（ＵＳ ９１０９２４２ Ｂ２）に連結された形態の組換えベクターを作製した。ｌｙｓＥ遺伝子の塩基配列（配列番号２）に基づいてプライマー配列番号７および８およびこれらからそれぞれ６００ｂｐ離れた位置でプライマー配列番号９および１０をそれぞれ合成した（表２参照）。
【0062】
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の遺伝体ＤＮＡを鋳型として配列番号７および９のプライマーを使用してＰＣＲを行い、ｌｙｓＥ遺伝子の５’末端遺伝子断片を準備した。同様な方法で、配列番号８および１０のプライマーを利用してＰＣＲを行い、ｌｙｓＥ遺伝子の３’末端に位置した遺伝子断片を準備した。前記ＰＣＲは９４℃で２分間変性後、９４℃で１分変性、５６℃で１分アニーリング、７２℃で３０秒重合を３０回繰り返した後、７２℃で１０分間重合反応を行って進行した。増幅されたＤＮＡ断片をＱｕｉａｇｅｎ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを使用して精製した後、ベクター作製のための挿入ＤＮＡ断片として使用した。
【0063】
一方、制限酵素ＸｂａＩで処理した後、６５℃で２０分間熱処理したｐＤＺベクター（ＵＳ９１０９２４２ Ｂ２）と前記ＰＣＲを通じて増幅して準備された挿入ＤＮＡ断片をＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用して連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）が含まれているＬＢ固体培地に塗抹した。プライマー配列番号７および８を利用したＰＣＲを通じて目的とする遺伝子が挿入されたベクターに形質転換されたコロニーを選別した後、通常知られたプラスミド抽出法を利用してプラスミドを獲得し、これをｐＤＺ－ΔｌｙｓＥと命名した。
【0064】
前記使用されたプライマーの核酸配列を下記の表２に整理した。
【0065】
【表2】
【0066】
前記作製されたベクターｐＤＺ－ΔｌｙｓＥをコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に電気パルス法（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ． ５２：５４１－５４５， １９９９）で形質転換して相同染色体の組換えによりｌｙｓＥ遺伝子が欠損された菌株を作製した。このようにｌｙｓＥ遺伝子が欠損された菌株をコリネバクテリウム・グルタミカム１３０３２：：ΔｌｙｓＥと命名した。
【0067】
前記１３０３２：：ΔｌｙｓＥを対象として実施例１で作製されたｐ１１７－ｌｙｓＥ（ｍｔ）ライブラリーを電気パルス法で形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）が含まれている複合平板培地に塗抹して約１０００個のコロニーを確保した。対照区を作製するために１３０３２：：ΔｌｙｓＥにｐ１１７－ｌｙｓＥ（ＷＴ）ベクターを同じ方法で形質転換してコロニーを確保した。
【0068】
＜複合平板培地（ｐＨ７．０）＞
ブトウ糖１０ｇ、ペプトン１０ｇ、牛肉エキス（Ｂｅｅｆ ｅｘｔｒａｃｔ） ５ｇ、酵母抽出物５ｇ、ブレインハートインフュージョン（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ） １８．５ｇ、ＮａＣｌ ２．５ｇ、尿素２ｇ、Ｓｏｒｂｉｔｏｌ ９１ｇ、寒天２０ｇ（蒸溜水１リットル基準）
ブトウ糖１０ｇ、ペプトン１０ｇ、牛肉エキス（Ｂｅｅｆ ｅｘｔｒａｃｔ） ５ｇ、酵母抽出物５ｇ、ブレインハートインフュージョン（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ） １８．５ｇ、ＮａＣｌ ２．５ｇ、尿素２ｇ、Ｓｏｒｂｉｔｏｌ ９１ｇ、寒天２０ｇ（蒸溜水１リットル基準）
【0069】
前記確保された対照区である１３０３２：：ΔｌｙｓＥ＿ｐ１１７（ｌｙｓＥ（ＷＴ））と１３０３２：：ΔｌｙｓＥ＿ｐ１１７（ｌｙｓＥ（ｍｔ））ライブラリーをそれぞれ４００ｕｌ種培地が含まれている９６－Ｄｅｅｐ Ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅ－Ｄｏｍｅ（Ｂｉｏｎｅｅｒ）に接種し、ｐｌａｔｅ ｓｈａｋｉｎｇ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（ＴＡＩＴＥＣ）で３２℃、１２０００ｒｐｍ条件で約１２ｈｒ培養した。
【0070】
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
ブトウ糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ１０００μｇ、カルシウム－パントテン酸２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ（蒸溜水１リットル基準）
ブトウ糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ１０００μｇ、カルシウム－パントテン酸２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ（蒸溜水１リットル基準）
【0071】
培養された約１０００個のコロニーをＬ－リジン塩酸塩１００ｇ／Ｌが含まれている複合平板培地に連続希釈してＭＩＣ（ｍｉｎｉｍｕｍ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）試験した時、比較対象菌株に比べて有意にＭＩＣ値が高くなった９個のコロニーを獲得することができた。各コロニーを２次スクリーニングした。各コロニーを４００ｕｌ種培地が含まれている９６－Ｄｅｅｐ Ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅ－Ｄｏｍｅ（Ｂｉｏｎｅｅｒ）に接種し、ｐｌａｔｅ ｓｈａｋｉｎｇ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（ＴＡＩＴＥＣ）で３２℃、１２０００ｒｐｍ条件で約１２ｈｒ培養した。また２次スクリーニング段階では最終的に培養したコロニーの初期ＯＤ（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）値を同一に合わせてＬ－リジン塩酸塩１００ｇ／Ｌが含まれている複合平板培地に連続希釈してＭＩＣ試験を進行した。これによって野生型ｌｙｓＥ遺伝子が導入された比較対象菌株に比べて顕著にＭＩＣ値が高くなった１種に対して１３０３２：：ｌｙｓＥ（ｍｔ）と命名して追加実験を進行した。
【0072】
実施例３：変異型lｙｓＥ遺伝子の塩基配列の確認
実施例２で選別された菌株１３０３２：：ｌｙｓＥ（ｍｔ）に挿入された遺伝子の配列を確認するために、表３の配列番号１１と１２のプライマーを利用してＰＣＲを行って遺伝子断片を増幅した。ＰＣＲ条件は実施例１と同様に進行し、増幅されたＤＮＡ断片をＧｅｎｅＡｌｌ Ｅｘｐｉｎ ＧＥＬ ＳＶ ｋｉｔ（Ｓｅｏｕｌ、ＫＯＲＥＡ）を利用して獲得し、塩基配列分析を進行した。
実施例２で選別された菌株１３０３２：：ｌｙｓＥ（ｍｔ）に挿入された遺伝子の配列を確認するために、表３の配列番号１１と１２のプライマーを利用してＰＣＲを行って遺伝子断片を増幅した。ＰＣＲ条件は実施例１と同様に進行し、増幅されたＤＮＡ断片をＧｅｎｅＡｌｌ Ｅｘｐｉｎ ＧＥＬ ＳＶ ｋｉｔ（Ｓｅｏｕｌ、ＫＯＲＥＡ）を利用して獲得し、塩基配列分析を進行した。
【0073】
前記使用されたプライマーの核酸配列を下記の表３に整理した。
【0074】
【表3】
【0075】
増幅された遺伝子の塩基配列を分析した結果、１３０３２：：ｌｙｓＥ（ｍｔ）菌株は、ｌｙｓＥ遺伝子ＯＲＦ開始コドンから下位１９３～１９５番目塩基配列が既存のＡＡＴからＧＡＡに変わり、野生型アミノ酸配列（配列番号１）のＮ末端から６５番目アミノ酸であるアスパラギンがグルタメートで置換された形態のＬ－リジン排出体変異体をコードする変異型ｌｙｓＥ遺伝子を含むことを確認した。
【0076】
実施例４：変異型ＬｙｓＥ遺伝子導入ベクターの作製および菌株の作製
実施例３で確認した変異であるＮ６５Ｅを導入するために組換えベクターを次のような方法で作製した。まず、ＷＴ菌株（ＡＴＣＣ１３０３２）から抽出した遺伝体ＤＮＡを鋳型としてｌｙｓＥ遺伝子（配列番号２）の１９３～１９５番目位置で前後に（ｕｐｓｔｒｅａｍ ａｎｄ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）それぞれ約６００ｂｐ離れた位置の５’断片および３’断片に制限酵素ＸｂａＩ認識部位を挿入した表４の配列番号１３および１４のプライマーを合成した。またこれらからそれぞれ６００ｂｐ離れた位置で塩基置換変異を導入するためのプライマー配列番号１５および１６を合成した。
実施例３で確認した変異であるＮ６５Ｅを導入するために組換えベクターを次のような方法で作製した。まず、ＷＴ菌株（ＡＴＣＣ１３０３２）から抽出した遺伝体ＤＮＡを鋳型としてｌｙｓＥ遺伝子（配列番号２）の１９３～１９５番目位置で前後に（ｕｐｓｔｒｅａｍ ａｎｄ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）それぞれ約６００ｂｐ離れた位置の５’断片および３’断片に制限酵素ＸｂａＩ認識部位を挿入した表４の配列番号１３および１４のプライマーを合成した。またこれらからそれぞれ６００ｂｐ離れた位置で塩基置換変異を導入するためのプライマー配列番号１５および１６を合成した。
【0077】
前記使用されたプライマーの核酸配列を下記の表４に整理した。
【0078】
【表4】
【0079】
具体的に、ｌｙｓＥ遺伝子の５’および３’末端に位置したＤＮＡ断片が（各６００ｂｐ）ｐＤＺベクター（ＵＳ ９１０９２４２ Ｂ２）に連結された形態の組換えベクターを作製した。ＷＴ菌株の遺伝体ＤＮＡを鋳型としてプライマー配列番号１３および１５を利用してＰＣＲを行い、ｌｙｓＥ遺伝子の５’末端遺伝子断片（ｌｙｓＥ遺伝子の５’末端に位置）を準備した。ＰＣＲは９４℃で２分間変性後、９４℃で１分変性、５６℃で１分アニーリング、７２℃で３０秒重合を３０回繰り返した後、７２℃で１０分間重合反応を行って進行した。同様な方法で配列番号１４および１６を利用してＰＣＲを行ってｌｙｓＥ遺伝子の３’末端遺伝子断片（ｌｙｓＥ遺伝子の３’末端に位置）を準備した。増幅されたＤＮＡ断片をＱｕｉａｇｅｎ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを使用して精製した後、ベクター作製のための挿入ＤＮＡ断片として使用した。
【0080】
一方、制限酵素ＸｂａＩで処理した後、６５℃で２０分間熱処理したｐＤＺベクターと前記ＰＣＲを通じて増幅した挿入ＤＮＡ断片をＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用して連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。前記菌株をカナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）が含まれているＬＢ固体培地に塗抹した。プライマー配列番号１３および１４を利用したＰＣＲを通じて目的とした遺伝子が挿入されたベクターに形質転換されたコロニーを選別した後、通常知られたプラスミド抽出法を利用してプラスミドを獲得した。前記プラスミドはｐＤＺ－ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｅ）と命名した。
【0081】
作製されたベクターｐＤＺ－ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｅ）をリジンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株（大韓民国登録特許第１０－０１５９８１２号）に電気パルス法で形質転換した。このようにｌｙｓＥ遺伝子に異種性塩基置換変異が導入された菌株をＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｅ）と命名した。
【0082】
実施例５：ＬｙｓＥ（Ｎ６５Ｅ）変異株に対するＬ－リジン生産能の分析
前記実施例４で作製された菌株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｅ）と親株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ（Ｎ６５）を次のような方法で培養してＯＤ（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）、Ｌ－リジン生産収率および糖消耗速度を測定した。まず、種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃で２０時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。その後、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種して３２℃で７２時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。前記種培地と生産培地の組成はそれぞれ下記のとおりであり、培養結果は表５のとおりである。
前記実施例４で作製された菌株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｅ）と親株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ（Ｎ６５）を次のような方法で培養してＯＤ（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）、Ｌ－リジン生産収率および糖消耗速度を測定した。まず、種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃で２０時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。その後、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種して３２℃で７２時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。前記種培地と生産培地の組成はそれぞれ下記のとおりであり、培養結果は表５のとおりである。
【0083】
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
ブトウ糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ１０００μｇ、カルシウム－パントテン酸２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ（蒸溜水１リットル基準）
ブトウ糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ１０００μｇ、カルシウム－パントテン酸２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ（蒸溜水１リットル基準）
【0084】
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
ブトウ糖９０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ３０ｇ、大豆蛋白質２０ｇ、サトウダイコン由来糖蜜２０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １．１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．２ｇ、ビオチン２ｍｇ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ、カルシウム－パントテン酸１０ｍｇ、ニコチンアミド３０ｍｇ、ＭｎＳＯ４ ２０ｍｇ、ＦｅＳＯ４ ２０ｍｇ、ＺｎＳＯ４ １ｍｇ、ＣｕＳＯ４ １ｍｇ、ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸溜水１リットル基準）。
ブトウ糖９０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ３０ｇ、大豆蛋白質２０ｇ、サトウダイコン由来糖蜜２０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １．１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．２ｇ、ビオチン２ｍｇ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ、カルシウム－パントテン酸１０ｍｇ、ニコチンアミド３０ｍｇ、ＭｎＳＯ４ ２０ｍｇ、ＦｅＳＯ４ ２０ｍｇ、ＺｎＳＯ４ １ｍｇ、ＣｕＳＯ４ １ｍｇ、ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸溜水１リットル基準）。
【0085】
【表5】
【0086】
ｌｙｓＥ変異導入株であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｅ）菌株は、親株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐに比べて糖消耗速度が類似し、ＯＤが小幅減少し、Ｌ－リジン生産収率が約１２．１％増加することを確認することができた。最終的に実施例２で確認されたｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｅ）の変異がＬ－リジン排出体の排出能を向上させる変異と確認された。このようにリジン生産能の増加を示したＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｅ）菌株（「Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＣＭ０３－１０１２」と命名）を２０１９年１２月１３日付で大韓民国ソウル特別市西大門区弘済洞に所在する韓国微生物保存センターに寄託してＫＣＣＭ１２６４１Ｐの寄託番号が付与された。
【0087】
実施例６：ｌｙｓＥ遺伝子が６５番目アミノ酸であるアスパラギンがグルタメート以外の他のアミノ酸で置換された配列をコードする菌株の作製
配列番号１のアミノ酸配列で６５番目アミノ酸の位置の、野生型が有するアスパラギンおよび実施例５でその効果が検証されたグルタメートを除いた他のアミノ酸への置換を試みた。このような１８種の異種性アミノ酸置換変異をコードする塩基置換変異を導入するために、次のような方法でそれぞれの組換えベクターを作製した。
配列番号１のアミノ酸配列で６５番目アミノ酸の位置の、野生型が有するアスパラギンおよび実施例５でその効果が検証されたグルタメートを除いた他のアミノ酸への置換を試みた。このような１８種の異種性アミノ酸置換変異をコードする塩基置換変異を導入するために、次のような方法でそれぞれの組換えベクターを作製した。
【0088】
ＷＴ菌株（ＡＴＣＣ１３０３２）から抽出した遺伝体ＤＮＡを鋳型としてｌｙｓＥ遺伝子の１９３～１９５番目の位置で前後にそれぞれ約６００ｂｐ離れた位置の５’断片および３’断片に塩基置換変異を導入するためのプライマー配列番号１７～５２を合成した（表６）。具体的に、ｌｙｓＥ遺伝子の５’および３’末端に位置したＤＮＡ断片（各６００ｂｐ）がｐＤＺベクター（ＵＳ ９１０９２４２ Ｂ２）に連結された形態の組換えベクターを作製した。ＷＴ菌株の遺伝体ＤＮＡを鋳型として配列番号１３および１７のプライマーを利用してＰＣＲを行い、ｌｙｓＥ遺伝子の５’末端に位置する遺伝子断片を準備した。ＰＣＲは９４℃で２分間変性後、９４℃で１分変性、５６℃で１分アニーリング、７２℃で３０秒重合を３０回繰り返した後、７２℃で１０分間重合反応を行って進行した。同様な方法で配列番号１４および１８を利用してＰＣＲを行い、ｌｙｓＥ遺伝子の３’末端に位置する遺伝子断片を準備した。増幅されたＤＮＡ断片をＱｕｉａｇｅｎ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを使用して精製した後、ベクター作製のための挿入ＤＮＡ断片として使用した。
【0089】
一方、制限酵素ＸｂａＩで処理した後、６５℃で２０分間熱処理したｐＤＺベクターと前記ＰＣＲを通じて増幅した挿入ＤＮＡ断片をＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用して連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。前記菌株をカナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）が含まれているＬＢ固体培地に塗抹した。プライマー配列番号１３および１４を利用したＰＣＲを通じて目的とした遺伝子が挿入されたベクターに形質転換されたコロニーを選別した後、通常知られたプラスミド抽出法を利用してプラスミドを獲得した。前記プラスミドはｐＤＺ－ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｇ）と命名した。同様な方法でプライマー配列番号１３および１９、１４および２０を利用してｐＤＺ－ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ａ）、プライマー配列番号１３および２１、１４および２２を利用してｐＤＺ－ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｖ）、プライマー配列番号１３および２３、１４および２４を利用してｐＤＺ－ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｌ）、プライマー配列番号１３および２５、１４および２６を利用してｐＤＺ－ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｉ）、プライマー配列番号１３および２７、１４および２８を利用してｐＤＺ－ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｆ）、プライマー配列番号１３および２９、１４および３０を利用してｐＤＺ－ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｐ）、プライマー配列番号１３および３１、１４および３２を利用してｐＤＺ－ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｍ）、プライマー配列番号１３および３３、１４および３４を利用してｐＤＺ－ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｗ）、プライマー配列番号１３および３５、１４および３６を利用してｐＤＺ－ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｓ）、プライマー配列番号１３および３７、１４および３８を利用してｐＤＺ－ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｔ）、プライマー配列番号１３および３９、１４および４０を利用してｐＤＺ－ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｑ）プライマー配列番号１３および４１、１４および４２を利用してｐＤＺ－ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｙ）、プライマー配列番号１３および４３、１４および４４を利用してｐＤＺ－ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｃ）、プライマー配列番号１３および４５、１４および４６を利用してｐＤＺ－ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｄ）、プライマー配列番号１３および４７、１４および４８を利用してｐＤＺ－ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｈ）、プライマー配列番号１３および４９、１４および５０を利用してｐＤＺ－ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｋ）、およびプライマー配列番号１３および５１、１４および５２を利用してｐＤＺ－ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｒ）を作製した。
【0090】
前記使用されたプライマーの核酸配列を表６に整理した。
【0091】
【表6】
【0092】
それぞれ作製されたベクターをリジンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株（大韓民国登録特許第１０－０１５９８１２号）に電気パルス法で形質転換した。このようにｌｙｓＥ遺伝子に異種性塩基置換変異が導入された菌株１８種は、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｇ）、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ａ）、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｖ）、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｌ）、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｉ）、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｆ）、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５ＶＰ）、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｍ）、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｗ）、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｓ）、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｔ）、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｑ）、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｙ）、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｃ）、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｄ）、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｈ）、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｋ）、およびＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｒ）とそれぞれ命名した。
【0093】
実施例７：ｌｙｓＥ変異株に対するＬ－リジン生産能の分析
親株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ（Ｎ６５）、実施例４で作製されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｅ）菌株および実施例６で作製された１８種の菌株を実施例５のような方法で培養して、ＯＤ、Ｌ－リジン生産収率および糖消耗速度を測定して、その結果を下記表７に示した。
親株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ（Ｎ６５）、実施例４で作製されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｅ）菌株および実施例６で作製された１８種の菌株を実施例５のような方法で培養して、ＯＤ、Ｌ－リジン生産収率および糖消耗速度を測定して、その結果を下記表７に示した。
【0094】
【表7】
【0095】
実施例５で選別されたｌｙｓＥ変異導入株であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｅ）菌株は、親株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐに比べて糖消耗速度が類似し、ＯＤが小幅減少し、Ｌ－リジン生産収率が約１５．７％増加することを確認することができた。また追加的に評価された実施例６で作製された１８種の菌株は、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐに比べて糖消耗速度が類似し、ＯＤが類似または小幅減少し、Ｌ－リジン生産収率の減少なしに最大約２１．７％増加することを確認することができた。したがって、ｌｙｓＥの６５番目アスパラギンの位置がＬ－リジン排出能の向上に重要な役割を果たすと解釈される。
【0096】
実施例８：選別されたｌｙｓＥ変異株のＬ－リジン生産能の分析
Ｌ－リジンを生産する他の菌株でも前記のｌｙｓＥ遺伝子変異体に対する効果を確認するためにＬ－リジンを生産する他の菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ（Ｎ６５）（ＵＳ ９１０９２４２ Ｂ２）に実施例３で選別されたｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｅ）変異以外にアミノ酸の特性別に３種の変異を追加して、総４種の変異を導入した。実施例４（ｐＤＺ－ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｅ））と実施例６（ｐＤＺ－ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｋ）、ｐＤＺ－ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｑ）、およびｐＤＺ－ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｌ））で作製された総４種のベクターを電気パルス法でコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ菌株に導入してＫＣＣＭ１０７７０Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｅ）、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｋ）、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｑ）、およびＫＣＣＭ１０７７０Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｌ）の総４種の菌株を作製した。これら菌株４種および親株ＫＣＣＭ１０７７０Ｐを実施例５のような方法で培養してＯＤ、Ｌ－リジン生産収率および糖消耗速度を測定して下記表８に示した。
Ｌ－リジンを生産する他の菌株でも前記のｌｙｓＥ遺伝子変異体に対する効果を確認するためにＬ－リジンを生産する他の菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ（Ｎ６５）（ＵＳ ９１０９２４２ Ｂ２）に実施例３で選別されたｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｅ）変異以外にアミノ酸の特性別に３種の変異を追加して、総４種の変異を導入した。実施例４（ｐＤＺ－ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｅ））と実施例６（ｐＤＺ－ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｋ）、ｐＤＺ－ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｑ）、およびｐＤＺ－ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｌ））で作製された総４種のベクターを電気パルス法でコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ菌株に導入してＫＣＣＭ１０７７０Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｅ）、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｋ）、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｑ）、およびＫＣＣＭ１０７７０Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｌ）の総４種の菌株を作製した。これら菌株４種および親株ＫＣＣＭ１０７７０Ｐを実施例５のような方法で培養してＯＤ、Ｌ－リジン生産収率および糖消耗速度を測定して下記表８に示した。
【0097】
【表8】
【0098】
表８の結果のように、リジン生産菌株ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ（親株）から実施例５で選別された配列番号１の６５番目アミノ酸がグルタミン酸で置換された変異を導入した場合、親株に比べて糖消耗速度が類似し、ＯＤが増加しながらＬ－リジン生産収率が約１６０．３％増加することを確認することができた。また追加的に導入した３種の変異も親株に比べて糖消耗速度が類似し、ＯＤが増加しながらＬ－リジン生産収率が約３．８％～１７．９％増加することを確認することができた。親株によりＯＤの変化量とＬ－リジン生産収率の増加幅は異なるが、実施例７で確認したようにｌｙｓＥの６５番目アスパラギンの位置がＬ－リジン排出能の向上に重要な役割を果たすと解釈される。
【0099】
実施例９：選別されたＬｙｓＥ変異株のＬ－アルギニン生産能の分析
前記変異型Ｌ－リジン排出体のＬ－アルギニンに対する排出能を確認するために実施例４で作製されたｐＤＺ－ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｅ）ベクターをＬ－アルギニンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ（Ｎ６５）菌株（ＵＳ ８０３４６０２ Ｂ２）に電気パルス法で形質転換した。このようにｌｙｓＥ遺伝子に異種性塩基置換変異が導入された菌株をＫＣＣＭ１０７４１Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｅ）と命名した。親株ＫＣＣＭ１０７４１Ｐおよび作製されたＫＣＣＭ１０７４１Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｅ）菌株を次のような方法で培養してＯＤ、アルギニン生産収率および糖消耗速度を測定した。まず、種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃で２０時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。その後、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種して３２℃で７２時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。前記種培地と生産培地の組成はそれぞれ下記のとおりであり、培養結果は表９のとおりである。
前記変異型Ｌ－リジン排出体のＬ－アルギニンに対する排出能を確認するために実施例４で作製されたｐＤＺ－ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｅ）ベクターをＬ－アルギニンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ（Ｎ６５）菌株（ＵＳ ８０３４６０２ Ｂ２）に電気パルス法で形質転換した。このようにｌｙｓＥ遺伝子に異種性塩基置換変異が導入された菌株をＫＣＣＭ１０７４１Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｅ）と命名した。親株ＫＣＣＭ１０７４１Ｐおよび作製されたＫＣＣＭ１０７４１Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｅ）菌株を次のような方法で培養してＯＤ、アルギニン生産収率および糖消耗速度を測定した。まず、種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃で２０時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。その後、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種して３２℃で７２時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。前記種培地と生産培地の組成はそれぞれ下記のとおりであり、培養結果は表９のとおりである。
【0100】
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
ブトウ糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ１ｍｇ、カルシウム－パントテン酸２ｍｇ、ニコチンアミド２ｍｇ（蒸溜水１リットル基準）
ブトウ糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ１ｍｇ、カルシウム－パントテン酸２ｍｇ、ニコチンアミド２ｍｇ（蒸溜水１リットル基準）
【0101】
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
ブトウ糖６０ｇ、硫酸アンモニウム３０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２ｇ、ＣＳＬ（とうもろこし浸漬液）１５ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ、酵母抽出物５ｇ、ビオチン１００ｍｇ（蒸溜水１リットル基準）。
ブトウ糖６０ｇ、硫酸アンモニウム３０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２ｇ、ＣＳＬ（とうもろこし浸漬液）１５ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ、酵母抽出物５ｇ、ビオチン１００ｍｇ（蒸溜水１リットル基準）。
【0102】
【表9】
【0103】
表９の結果のように、ｌｙｓＥ変異導入株であるＫＣＣＭ１０７４１Ｐ：：ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｅ）菌株は、親株ＫＣＣＭ１０７４１Ｐに比べてＯＤおよび糖消耗速度が類似し、Ｌ－アルギニン生産能が約１１．８％増加することを確認した。これによって、ｌｙｓＥ（Ｎ６５Ｅ）の変異がＬ－リジンだけでなく、Ｌ－アルギニンの排出能を向上させる変異と確認された。
【0104】
以上、本明細書で開示されるそれぞれの説明および実施形態は、それぞれの異なる説明および実施形態にも適用され得る。本明細書で開示された多様な要素の可能な全ての組み合わせが本明細書で提案される発明の範疇に属する。また、下記に記述する具体的な叙述により本明細書の発明の範疇が制限されるとはいえず、当該技術分野の通常の知識を有する者が本明細書に記載された特定様態に対する多数の等価物を認知したり確認できる限り、このような等価物は本明細書で提案される発明に含まれると意図される。
【配列表】
【国際調査報告】