知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-27
(54)【発明の名称】脂質マーカーの検出
(51)【国際特許分類】
G01N 27/62 20210101AFI20230317BHJP
G01N 27/623 20210101ALI20230317BHJP
G01N 33/92 20060101ALI20230317BHJP
C12Q 1/02 20060101ALN20230317BHJP
【ＦＩ】
G01N27/62 V
G01N27/623
G01N27/62 X
G01N27/62 G
G01N33/92 Z
C12Q1/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022544427
(86)(22)【出願日】2021-02-05
(85)【翻訳文提出日】2022-09-16
(86)【国際出願番号】 GB2021050270
(87)【国際公開番号】W WO2021156638
(87)【国際公開日】2021-08-12
(31)【優先権主張番号】2001571.5
(32)【優先日】2020-02-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】314000752
【氏名又は名称】ザ・ユニバーシティ・オブ・マンチェスター
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＭＡＮＣＨＥＳＴＥＲ
(74)【代理人】
【識別番号】100120891
【弁理士】
【氏名又は名称】林 一好
(74)【代理人】
【識別番号】100165157
【弁理士】
【氏名又は名称】芝 哲央
(74)【代理人】
【識別番号】100126000
【弁理士】
【氏名又は名称】岩池 満
(72)【発明者】
【氏名】バラン ペルディタ
(72)【発明者】
【氏名】サーカー デパンジャン
(72)【発明者】
【氏名】トリヴェディ ドルパッド
(72)【発明者】
【氏名】シンクレア エラノア
(72)【発明者】
【氏名】シルヴァーデール モンティ
(72)【発明者】
【氏名】ミルネ ジョイ
【テーマコード（参考）】
2G041
2G045
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G041CA01
2G041CA02
2G041DA05
2G041EA04
2G041EA06
2G041FA10
2G041GA09
2G041HA03
2G041JA17
2G041LA08
2G045AA25
2G045CB10
2G045DA60
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ70
4B063QX04
(57)【要約】
本発明は、試料中の高分子量脂質を特定する方法に関する。このような高分子量脂質は、疾患の特定のためのバイオマーカーとして有用である可能性がある。
【選択図】図１６
【選択図】図１６
【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料中の１種以上の脂質を特定する方法であって、前記試料に対してアンビエントイオン化質量分析及びイオンモビリティ質量分析を実施する工程を含む方法。
【請求項2】
実施される前記アンビエントイオン化質量分析技術がペーパースプレーイオン化質量分析である請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記１種以上の脂質が約７００Ｄａ以上の分子量を有する請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記１種以上の脂質が約１０００Ｄａ以上の分子量を有する請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記１種以上の脂質が約１２００Ｄａ以上の分子量を有する請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記試料が生物学的試料である請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記試料が皮脂である請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記方法は疾患の診断に使用される請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記疾患が、パーキンソン病、癌又は結核である請求項８に記載の方法。
【請求項10】
試料中の１種以上の脂質を特定するための装置であって、（ａ）１種以上の脂質を含む試料を受容するための手段と、
（ｂ）アンビエントイオン化質量分析を実施するための手段と、
（ｃ）イオンモビリティ質量分析を実施するための手段と
を含む装置。
【請求項11】
実施される前記アンビエントイオン化質量分析技術がペーパースプレーイオン化質量分析である請求項１０に記載の装置。
【請求項12】
試料中の１種以上の脂質を特定するためのキットであって、（ａ）１種以上の脂質を含む試料を得るための手段と、
（ｂ）アンビエントイオン化質量分析を実施するための手段と、
（ｃ）イオンモビリティ質量分析を実施するための手段と
を含むキット。
【請求項13】
実施される前記アンビエントイオン化質量分析技術がペーパースプレーイオン化質量分析である請求項１２に記載のキット。
【請求項14】
対象における１種以上の疾患又は医学的状態の有無を検出する方法であって、液体クロマトグラフィー質量分析を使用して、前記対象由来の生体試料中の１種以上の脂質を特定する工程を含む方法。
【請求項15】
前記生体試料が皮脂である請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記１種以上の疾患又は医学的状態が、感染、細菌感染、ウイルス感染、コロナウイルス感染、ＣＯＶＩＤ－１９感染、高血圧、２型糖尿病、高コレステロール及び／又は虚血性心疾患を含む請求項１４又は請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記１種以上の脂質が約７００Ｄａ以上の分子量を有する請求項１４から請求項１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
前記１種以上の脂質が約１０００Ｄａ以上の分子量を有する請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記１種以上の脂質が約１２００Ｄａ以上の分子量を有する請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、試料中のバイオマーカー、特に高分子量脂質を特定する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
パーキンソン病（ＰＤ）は、進行性の神経変性疾患であり、その診断は、現在、臨床症状の観察及び測定によって知らされている。ＰＤの最も重要な臨床症状は、運動の速度及び振幅の低下である。硬直及び振戦を含む他の症状も一般的である［１、特許文献１］。そのような臨床症状は、黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの６０％超が失われる段階まで疾患が進行した時点ではじめて主に観察可能であるため［２、特許文献２］、そのような臨床症状の顕在化の前にＰＤを検出する緊急の必要性がある。
【0003】
４０人に１人を超える人が、生涯のある時点でパーキンソン病（ＰＤ）を発症する。ＰＤの症状は、疾患が進行するにつれて悪化し、これらの症状の大部分は、神経変性プロセスが既にかなり進行した時点でのみ検出されるため、早期介入の機会はほとんどない。これは、ＰＤの初期段階で生じる徴候及び症状の臨床的変動と相まって、ＰＤの原因の分子レベルでの理解が限られていることにも起因する［４、特許文献３］。
【0004】
「スーパースメラー（Ｓｕｐｅｒ Ｓｍｅｌｌｅｒ）」を用いた初期のパイロット研究は、明確な麝香（ジャコウ）臭がＰＤ被験者由来の皮脂と関連することを示した［３、特許文献４］。このスーパースメラーは、臭いによってＰＤを検出する独特の能力を示した［２、特許文献２］。スーパースメラーは、においの感覚が極めて鋭敏であり、これにより、スーパースメラーは、平均的な嗅覚能力を有するものによって通常は検出されない臭いを検出及び識別することができる。Ｔシャツ及び医療用ガーゼを用いた予備試験は、高い皮脂産生の領域、すなわち、上背部及び額に臭いが存在し、ヒトの臭いとより一般的に関連する腋窩には存在しないことを示した［２、特許文献２］。皮脂の過剰産生、脂漏症は、ＰＤの既知の非運動症状であり［５、特許文献５］、パーキンソン病の皮膚は、ＰＤの分子的特徴であるリン酸化α－シヌクレインを含有することが最近示されている［６、特許文献６］。この特有のＰＤ臭に関連する代謝産物の特定及び定量化は、ＰＤの迅速な早期スクリーニングを可能にするだけでなく、疾患発症時に生じる分子変化への洞察を提供し、将来の疾患の層別化を可能にすることができよう。ＰＤ以外の他の状態も、検出されて疾患の有無（存在又は不存在）の指標として使用することができる臭いを生じると考えられる。
【0005】
揮発性有機化合物（ＶＯＣ）は、概して、特徴的な臭いと関連するが、いくつかの揮発性物質は無臭である可能性もある［７、特許文献７］。質量分析を使用するボラチローム（揮発性代謝産物）分析は、医学的診断［８～１２、特許文献８～１２］、並びに油及び蜂蜜等の食品［１３～１５、特許文献１３～１５］、飲料［１６、特許文献１６］の品質の分析、並びに健康及び美容産業［１７、特許文献１７］に使用されている。ＴＤ－ＧＣ－ＭＳは、人工呼吸器関連肺炎に関与する細菌の検出［１１、特許文献１１］、ヒトの分解と動物の分解との区別［１８、特許文献１８］、活性炭の消耗プロファイルの特徴付け［１９、特許文献１９］、並びに電子たばこからのエアロゾル検出［２０、特許文献２０］のためのボラチローム分析プラットフォームとして使用されている。
【0006】
高分子量脂質は、パーキンソン病の診断のための重要なバイオマーカーであることができよう。それゆえ、当該技術分野では、例えば、パーキンソン病の罹患者由来の生体試料中の高分子量脂質を特定する方法が必要とされている。
【0007】
一方で、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）及びマトリクス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）は、質量分析を、物理学者のツールから、現代の科学のすべての分野にとって、とりわけ生物学的研究にとって必須の技術に転換した［２４、２５、特許文献２１、２２］。それにもかかわらず、それらは、いくつかの欠点、すなわち、スループット及び試料調製工程の必要性という欠点を有し、この試料調製工程はしばしば非常に特定的であり、試料成分の分解につながりうる。液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）はしばしばＥＳＩと統合され（ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ）、この技術はメタボロミクスにおける支配的な分析方法である。しかしながら、典型的には、長い試料調製及びＬＣ分離工程が必要とされる。質量分析の分野における最近の革新であるアンビエントイオン化は、試料調製を最小限にするか又は全く行わずに、未変性（天然）環境における通常の試料を分析する能力を提供する［２６、特許文献２３］。質量分析のこの新しい領域は、脱離エレクトロスプレーイオン化（ＤＥＳＩ）［２７、特許文献２４］及びリアルタイム直接分析（ＤＡＲＴ）［２８、特許文献２５］からそれぞれ２００４年後期及び２００５年初期に開始した。これらの技術は、天然の形態での新しいサンプリング方法を示したものであって、イオン化プロセスは、開放空気及び室温で機器の外側で起こる。その後数年間で、２０１０年のペーパースプレーイオン化質量分析（ＰＳＩ ＭＳ）を含めて、多くのアンビエントイオン化技術が導入された［２６、２９～３１、特許文献２３、２６～２８］。それ以来、ＰＳＩ ＭＳは、最も普及しているアンビエントイオン化技術の１つとして成熟した。ＰＳＩ ＭＳは、リアルタイム直接分析による血液、尿、及びＣＳＦ等の生体液中に存在する小分子（５０～８００Ｄａ）の検出においてその利点を示す［３２～３４、特許文献２９～３１］。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】ＤｅＭａａｇｄ，Ｇ．及びＡ．Ｐｈｉｌｉｐ、Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２０１５． ４０（８）：５０４－５３２頁
【非特許文献2】Ｃｈｅｎｇ，Ｈ．－Ｃ．、Ｃ．Ｍ．Ｕｌａｎｅ、及びＲ．Ｅ．Ｂｕｒｋｅ、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、２０１０． ６７（６）：７１５－７２５頁
【非特許文献3】Ｗｏｏｄ－Ｋａｃｚｍａｒ，Ａ．、Ｓ．Ｇａｎｄｈｉ、及びＮ．Ｗｏｏｄ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００６． １２（１１）：５２１－５２８頁
【非特許文献4】Ｍｏｒｇａｎ，Ｊ．、Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ． １５（２）：１３８－１３９頁
【非特許文献5】Ｋｒｅｓｔｉｎ，Ｄ．、ＱＪＭ：Ａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９２７． ｏｓ－２１（８１）：１７７－１８６頁
【非特許文献6】Ｄｏｎａｄｉｏ，Ｖ．ら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、２０１４． ８２（１５）：１３６２－９頁
【非特許文献7】Ｓｈｉｒａｓｕ，Ｍ．及びＫ．Ｔｏｕｈａｒａ、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１１． １５０（３）：２５７－２６６頁
【非特許文献8】Ｐｉｚｚｉｎｉ，Ａ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｒｅａｔｈ ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１８
【非特許文献9】Ｉｓｈｉｂｅ，Ａ．ら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ、２０１８
【非特許文献10】Ｃｈａｎｇ，Ｊ．－Ｅ．ら、Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ｂ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ、２０１８． ２５５：８００－８０７頁
【非特許文献11】Ｌａｗａｌ，Ｏ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｒｅａｔｈ ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１８． １２（２）：０２６００２頁
【非特許文献12】Ｒａｔｔｒａｙ，Ｎ．Ｊ．Ｗ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１４． ３２（１０）：５３８－５４８頁
【非特許文献13】Ｘｉｅ，Ｊ．ら、Ｆｏｏｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１８． ２４３：２６９－２７６頁
【非特許文献14】Ｇａｔｚｉａｓ，Ｉ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、２０１８
【非特許文献15】Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｎ．ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１８
【非特許文献16】Ｌｉｕ，Ｔ．ら、Ａｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｎｏｓｅ Ｂａｓｅｄ Ｂｅｖｅｒａｇｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａｎ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｆｉｓｈｅｒ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｍｅｔｈｏｄ
【非特許文献17】Ａｂｅｄｉ，Ｇ．、Ｚ．Ｔａｌｅｂｐｏｕｒ、及びＦ．Ｊａｍｅｃｈｅｎａｒｂｏｏ、ＴｒＡＣ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１８
【非特許文献18】Ｒｏｓｉｅｒ，Ｅ．ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１４． ４０６（１５）：３６１１－３６１９頁
【非特許文献19】Ｓａｒｉｏｌ，Ｈ．Ｃ．ら、Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｔｏｄａｙ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２０１７． １１：１－１０頁
【非特許文献20】Ｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．及びＣ．Ｍｙｅｒｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ、２０１５． １４１８：１９２－１９９頁
【非特許文献21】Ｆｅｎｎ，Ｊ．Ｂ．；Ｍａｎｎ，Ｍ．；Ｍｅｎｇ，Ｃ．Ｋ．；Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｆ．；Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ，Ｃ．Ｍ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１８８３－） １９８９、２４６（４９２６）、６４－７１
【非特許文献22】Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ，Ｆ．；Ｋａｒａｓ，Ｍ．；Ｂｅａｖｉｓ，Ｒ．Ｃ．；Ｃｈａｉｔ，Ｂ．Ｔ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ． １９９１、６３（２４）、１１９３Ａ－１２０３Ａ
【非特許文献23】Ｃｏｏｋｓ，Ｒ．Ｇ．；Ｏｕｙａｎｇ，Ｚ．；Ｔａｋａｔｓ，Ｚ．；Ｗｉｓｅｍａｎ，Ｊ．Ｍ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，Ｕ．Ｓ．） ２００６、３１１（５７６７）、１５６６－１５７０
【非特許文献24】Ｔａｋａｔｓ，Ｚ．；Ｗｉｓｅｍａｎ，Ｊ．Ｍ．；Ｇｏｌｏｇａｎ，Ｂ．；Ｃｏｏｋｓ，Ｒ．Ｇ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，Ｕ．Ｓ．） ２００４、３０６（５６９５）、４７１－４７３
【非特許文献25】Ｃｏｄｙ，Ｒ．Ｂ．；Ｌａｒａｍｅｅ，Ｊ．Ａ．；Ｄｕｒｓｔ，Ｈ．Ｄ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ． ２００５、７７（８）、２２９７－２３０２
【非特許文献26】Ｈａｒｒｉｓ，Ｇ．Ａ．；Ｇａｌｈｅｎａ，Ａ．Ｓ．；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｆ．Ｍ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，Ｕ．Ｓ．） ２０１１、８３（１２）、４５０８－４５３８
【非特許文献27】Ｌｉｕ，Ｊ．；Ｗａｎｇ，Ｈ．；Ｍａｎｉｃｋｅ，Ｎ．Ｅ．；Ｌｉｎ，Ｊ．－Ｍ．；Ｃｏｏｋｓ，Ｒ．Ｇ．；Ｏｕｙａｎｇ，Ｚ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，Ｕ．Ｓ．） ２０１０、８２（６）、２４６３－２４７１
【非特許文献28】Ｗａｎｇ，Ｈ．；Ｌｉｕ，Ｊ．；Ｃｏｏｋｓ，Ｒ．Ｇ．；Ｏｕｙａｎｇ，Ｚ．、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ． ２０１０、４９（５）、８７７－８８０、Ｓ８７７／１－Ｓ８７７／７
【非特許文献29】Ｄａｍｏｎ，Ｄ．Ｅ．；Ｄａｖｉｓ，Ｋ．Ｍ．；Ｍｏｒｅｉｒａ，Ｃ．Ｒ．；Ｃａｐｏｎｅ，Ｐ．；Ｃｒｕｔｔｅｎｄｅｎ，Ｒ．；Ｂａｄｕ－Ｔａｗｉａｈ，Ａ．Ｋ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，Ｕ．Ｓ．） ２０１６、８８（３）、１８７８－１８８４
【非特許文献30】Ｅｓｐｙ，Ｒ．Ｄ．；Ｔｅｕｎｉｓｓｅｎ，Ｓ．Ｆ．；Ｍａｎｉｃｋｅ，Ｎ．Ｅ．；Ｒｅｎ，Ｙ．；Ｏｕｙａｎｇ，Ｚ．；ｖａｎ Ａｓｔｅｎ，Ａ．；Ｃｏｏｋｓ，Ｒ．Ｇ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，Ｕ．Ｓ．） ２０１４、８６（１５）、７７１２－７７１８
【非特許文献31】Ｍｉｃｈｅｌｙ，Ｊ．Ａ．；Ｍｅｙｅｒ，Ｍ．Ｒ．；Ｍａｕｒｅｒ，Ｈ．Ｈ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，Ｕ．Ｓ．） ２０１７、８９（２１）、１１７７９－１１７８６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明の目的は、１種以上の疾患状態の特定のために使用できる信頼性の高い診断検査を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明の第１の態様によれば、試料中の１種以上の脂質を特定する方法であって、試料に対してアンビエントイオン化質量分析及びイオンモビリティ質量分析を実施する工程を含む方法が提供される。
【0011】
実施されるアンビエントイオン化質量分析技術は、ペーパースプレーイオン化質量分析であってもよい。
【0012】
好ましくは、上記１種以上の脂質は、約７００Ｄａ以上の分子量（分子質量）を有する。より好ましくは、１種以上の脂質は、約１０００Ｄａ以上の分子量を有する。最も好ましくは、１種以上の脂質は、約１２００Ｄａ以上の分子量を有する。
【0013】
上記試料は、皮脂等の生物学的試料であってもよい。
【0014】
当該方法は、限定されないがパーキンソン病、癌又は結核等の疾患の診断において使用されてもよい。
【0015】
イオンモビリティ（イオン移動度）は、イオンのサイズ、形状及び電荷に基づいてイオンを分離する気相分析技術である。測定はドリフト時間（クロマトグラフィーにおける保持時間に類似する）の形態で行われ、ドリフト時間はイオンが弱電界の影響下でガス充填モビリティセルを横断するのにかかる時間に対応する［３５］。ＭＳと結合したＩＭは、複雑な混合物中に存在する分子の分離、同定、及び構造的特徴付けのための強力な分析ツールである。従って、これは分析科学の分野で広く使用されている技術である。アンビエントイオン化質量分析をＩＭと組み合わせることは、様々な用途のための現代の分析研究にも進出している［３６～３９］。かなり新しい研究領域として、メタボロミクス並びに健康及び疾患研究におけるその有用性を特定するためには、より多くの探索を必要とする。ここで、本明細書において、本発明者らは１つのそのような可能性を提示した。
【0016】
本発明者らは、アンビエントイオン化質量分析とイオンモビリティ質量分析との組み合わせが、試料中の脂質を特定するための強力なツールであることを見出した。
【0017】
本明細書で、ＰＤ患者のメタボローム内の変化を測定するための生体液としての皮脂を評価するためのＰＳＩ ＭＳの新規使用が実証される。従来のＭＳ方法を用いた他の方法では分解（分離）できない異性体種又は同重体種の存在の可能性を調べるために、ＩＭがＰＳＩ ＭＳに組み込まれる。正確な質量測定と組み合わせたタンデムＭＳ実験を用いて、ＰＤ及び対照試料を区別する脂質種が特定される。本研究は、現在存在しない迅速な臨床診断検査に発展することができるＰＤのバイオマーカー発見における予備研究に加えて、生体液皮脂の分析におけるＰＳＩ ＭＳの初めての応用を報告する。
【0018】
皮膚の非滅菌環境、及び存在して試験結果に影響を及ぼす可能性がある潜在的汚染物質（石鹸等）に起因して、診断のための生体液として皮脂を使用することに対する一般的な先入観が当該技術分野において存在する。しかしながら、本発明者らは、有利かつ予想外にも、皮膚表面に存在する分子を使用して、パーキンソン病を有する個体を対照対象から区別することができることを見出した。個体のパーキンソン病状態を評価するために皮脂試料を使用することは、多くの理由から有利である。第１に、皮脂を採取することは、非侵襲的方法である。第２に、皮脂から代謝産物を調製及び抽出することを行わずに皮脂を直接サンプリング及び分析することが可能であるはずであり、それゆえ、パーキンソン病の迅速なスクリーニング／診断検査を開発する機会を提供することが可能であるはずである。そのような検査は、個体においてパーキンソン病の発症を遅延させるか、又はその進行を弱めるために、神経保護剤による治療と並行してコンパニオン診断として利用することができよう。パーキンソン病は、加齢集団に全体的に影響を及ぼし、非侵襲的である診断検査は、世界中の多数の公的及び私的な医療提供者によって良好に受け容れられるであろう。
【0019】
特定の好ましい実施形態では、当該方法は、１つ以上の揮発性化合物が対照皮脂値に対して上昇又は低下していることの特定を含む。対照皮脂値は、典型的には、健康な個体又はパーキンソン病等の疾患に罹患していないとみなされる個体における値であることが当業者には明らかであろう。あるいは、対照皮脂値は、治療に応答しているときの個体の値であってもよい。というのも、個体は、最初に治療によく応答することが多いが、その後、疾患が進行するにつれて、その用量を増加させるか、又はその療法を経時的に異なる療法に切り替える必要があるからである。
【0020】
皮脂中に存在する１つ以上の区別される化合物は、少なくとも１種以上の脂質、カルジオリピン、リン脂質、グリセロリン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質、セラミド、スフィンゴミエリン、脂肪酸、ワックス状エステルを含んでもよい。
【0021】
１種以上の揮発性化合物は、以下から選択される１種以上を含んでもよい：ドデカン、エイコサン、オクタコサン、馬尿酸、オクタデカナール、アルテミシン酸、ペリルアルデヒド（ｐｅｒｉｌｌｉｃ ａｌｄｅｈｙｄｅ）（ペリルアルデヒド（Ｐｅｒｉｌｌａｌｄｅｈｙｄｅ）又はペリラアルデヒド（ｐｅｒｉｌｌａ ａｌｄｅｈｙｄｅ）としても知られる）、ジグリセロール、酢酸ヘキシル、３－ヒドロキシテトラデカン酸及び／又はオクタナール。
【0022】
特定の好ましい実施形態では、当該方法は、以下のもののうちの１つ以上が生じたことの特定を含む：ペリルアルデヒドが減少する；馬尿酸が上昇する；エイコサンが上昇する；及び／又はオクタデカナールが上昇する。
【0023】
用語「揮発性化合物」は、単離されかつ／又は質量分析に供されると蒸気又はガスになりやすい化合物を意味することが意図される。
【0024】
当該方法は、個体が、評価が非常に困難であることが多い早期発症パーキンソン病（ＰＤ）を有するかどうかを評価するために使用されてもよい。当該方法は、パーキンソン病を発症する遺伝的及び／又は環境的リスクを有する個体を評価する（又は継続的に評価する）ためにも使用されてもよい。
【0025】
予想外にも、本発明者らは、すべての典型的な溶媒が皮脂からの揮発性化合物の抽出に適しているわけではないことを見出した。皮脂中の揮発性化合物はメタノールを用いて最もよく抽出されることが確認されている。
【0026】
皮脂ベースの化合物を特定及び／又は定量するいくつかの方法が用いられてもよいことは当業者には明らかであろう。
【0027】
一般に、質量分析（ＭＳ）は、通常は複合技術の一部として、例えば液体クロマトグラフィー（ＬＣ）－ＭＳ又はガスクロマトグラフィー（ＧＣ）－ＭＳとして、生体試料等の複雑なマトリクス中の分析物（揮発性化合物等）を検出、特定及び／又は定量するために使用されてもよい。従って、それぞれエレクトロスプレー（ＥＳ）及び化学イオン化（ＣＩ）等の従来のＭＳイオン化源が好適である。他のイオン化源も公知である。
【0028】
皮脂ベースの化合物を特定及び／又は定量するためにＭＳが使用される場合、好ましくは、ＭＳは、約８００ｍ／ｚ超、約１０００ｍ／ｚ超、又は約１２００ｍ／ｚ超の有意により高い分子量領域において化合物を特定するために使用される。通常、生体液（血液及び尿等）は、約１０００ｍ／ｚ以下の低分子量領域における化合物を評価する。本発明者らは、驚くべきことに、皮脂がＰＳＩ－ＭＳのためのサンプリング生体液として使用できること、及びそれが、約８００ｍ／ｚ超の有意により高い分子量を有する皮膚表面分子の検出を可能にすることを初めて示した。イオンモビリティ質量分析（ＩＭ－ＭＳ）も、本発明者らによって、これらの高分子量代謝産物をさらに評価するために使用され、ヒト皮脂の質量スペクトルは、驚くべきことに、１価の荷電ピークからなるより高い質量領域（ｍ／ｚ約８００～約２５００）における４つのエンベロープの存在を示した。
【0029】
日常的な臨床検査室及び診療治療現場用途では、例えば、試料の前処理を減らし、かつ／又は分析及び／若しくはデータ解釈を単純化することが望ましい。従って、大気圧イオン化源は、例えば脱離エレクトロスプレーイオン化（ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、ＤＥＳＩ）、リアルタイム直接分析（ｄｉｒｅｃｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ、ＤＡＲＴ）、大気圧固体試料分析プローブ（ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ｓｏｌｉｄｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｐｒｏｂｅ、ＡＳＡＰ）及びペーパースプレー（ｐａｐｅｒ ｓｐｒａｙ、ＰＳ）が好ましい場合がある。
【0030】
ペーパースプレーは、複雑な混合物を含む、質量分析のための直接サンプリングイオン化法である。試料、例えば０．４μＬが三角形の紙片に載せられ、溶媒、例えば１０μＬのメタノール：水で湿らされる。試料からのイオンは、紙に高電圧、例えば３～５ｋＶのＤＣ又は４～６ｋＶのＤＣを印加することによって生成される。紙の頂点で生成されたイオンを質量分析計の入口に向けることによって、その質量分析が行われてもよい。
【0031】
１つの例では、質量分析は、以下からなる群から選択されるイオン源を含む質量分析計を使用して行われる：（ｉ）エレクトロスプレーイオン化（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ、「ＥＳＩ」）イオン源；（ｉｉ）大気圧光イオン化（Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｐｈｏｔｏ Ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ、「ＡＰＰＩ」）イオン源；（ｉｉｉ）大気圧化学イオン化（Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ、「ＡＰＣＩ」）イオン源；（ｉｖ）マトリクス支援レーザー脱離イオン化（Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ、「ＭＡＬＤＩ」）イオン源；（ｖ）レーザー脱離イオン化（Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ、「ＬＤＩ」）イオン源；（ｖｉ）大気圧イオン化（Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ、「ＡＰＩ」）イオン源；（ｖｉｉ）シリコン上脱離イオン化（Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ ｏｎ Ｓｉｌｉｃｏｎ、「ＤＩＯＳ」）イオン源；（ｖｉｉｉ）電子衝撃（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｉｍｐａｃｔ、「ＥＩ」）イオン源；（ｉｘ）化学イオン化（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ、「ＣＩ」）イオン源；（ｘ）電界イオン化（フィールドイオン化、Ｆｉｅｌｄ Ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ、「ＦＩ」）イオン源；（ｘｉ）電界脱離（Ｆｉｅｌｄ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ、「ＦＤ」）イオン源；（ｘｉｉ）誘導結合プラズマ（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｐｌａｓｍａ、「ＩＣＰ」）イオン源；（ｘｉｉｉ）高速原子衝撃（Ｆａｓｔ Ａｔｏｍ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ、「ＦＡＢ」）イオン源；（ｘｉｖ）液体二次イオン質量分析（Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、「ＬＳＩＭＳ」）イオン源；（ｘｖ）脱離エレクトロスプレーイオン化（「ＤＥＳＩ」）イオン源；（ｘｖｉ）ニッケル６３放射性イオン源；（ｘｖｉｉ）大気圧マトリクス支援レーザー脱離イオン化イオン源；（ｘｖｉｉｉ）サーモスプレーイオン源；（ｘｉｘ）大気圧サンプリンググロー放電イオン化（Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ｓａｍｐｌｉｎｇ Ｇｌｏｗ Ｄｉｓｃｈａｒｇｅ Ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ、「ＡＳＧＤＩ」）イオン源；（ｘｘ）グロー放電（Ｇｌｏｗ Ｄｉｓｃｈａｒｇｅ、「ＧＤ」）イオン源；（ｘｘｉ）インパクタ（Ｉｍｐａｃｔｏｒ）イオン源；（ｘｘｉｉ）リアルタイム直接（「ＤＡＲＴ」）イオン源；（ｘｘｉｉｉ）レーザースプレーイオン化（Ｌａｓｅｒｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ、「ＬＳＩ」）イオン源；（ｘｘｉｖ）ソニックスプレーイオン化（Ｓｏｎｉｃｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ、「ＳＳＩ」）イオン源；（ｘｘｖ）マトリクス支援インレットイオン化（Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｉｎｌｅｔ Ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ、「ＭＡＩＩ」）イオン源；（ｘｘｖｉ）溶媒支援インレットイオン化（Ｓｏｌｖｅｎｔ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｉｎｌｅｔ Ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ、「ＳＡＩＩ」）イオン源；（ｘｘｖｉｉ）大気圧固体試料分析プローブ（Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ｓｏｌｉｄｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｏｂｅ、「ＡＳＡＰ」）イオン源；（ｘｘｖｉｉｉ）レーザーアブレーションエレクトロスプレーイオン化（Ｌａｓｅｒ Ａｂｌａｔｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ、「ＬＡＥＳＩ」）イオン源；（ｘｘｉｘ）大気圧光イオン化脱離（Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｐｈｏｔｏｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、「ＤＡＰＰＩ」）イオン源；（ｘｘｘ）ペーパースプレー（「ＰＳ」）。ペーパースプレーが好ましい。
【0032】
本発明者らは、揮発性化合物を研究するためのツールとしての昇温脱離ガスクロマトグラフィー質量分析（ＴＤ－ＧＣ－ＭＳ）の汎用性、及び皮脂中のＰＤの明確なにおいの原因となる代謝産物の特定へのその適用可能性を有利に実証した。
【0033】
皮脂は、いくつかの方法で採取及び保存されてもよい。例えば、皮脂は、医療用ガーゼ、吸収紙又は脱脂綿で個体の背中を拭くことによって採取されてもよい。あるいは、皮脂は、スパチュラ等の剛性器具を使用して個体の背中から掻き取られ、次いで、採取管又は他の装置内に保管されてもよい。一般的に言えば、皮脂は周囲温度で比較的安定であるため、揮発性化合物の抽出前に皮脂のさらなる処理は必要ない。しかしながら、所望であれば、皮脂は、抽出前に好適な保存剤又は緩衝液と混合されてもよい。
【0034】
ある特定の実施形態では、皮脂試料を非侵襲的に採取するために使用することができ、検査室に戻すことができるスマート紙封筒であって、到着後、検査室は、非常に少量の抽出溶媒を使用して紙から試料を外して直接分析し、その後すぐに結果を提供することができるスマート紙封筒が提供される。
【0035】
当該方法は、混合物を乾燥させることをさらに含んでもよい。混合物は、ＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮器等の真空濃縮器を用いて乾燥されてもよい。
【0036】
皮脂は、任意の数の異なる基材上にあってもよく、そのようなものとしては、任意の織物セルロース媒体又は布地又は人工表面が挙げられる。好ましくは、皮脂は、綿棒、ガーゼ、木材又はセルロース系紙の上にあってもよい。
【0037】
標的分析物は、１種以上の揮発性化合物、例えば、以下から選択される１つ以上を含んでもよい：ドデカン、エイコサン、オクタコサン、馬尿酸、オクタデカナール又はドデカン、アルテミシン酸、ペリルアルデヒド又はジグリセロール、酢酸ヘキシル又はドデカン、及び３－ヒドロキシテトラデカン酸又はオクタナール。又は脂質、カルジオリピン、リン脂質、グリセロリン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質、セラミド、スフィンゴミエリン、脂肪酸、ワックス状エステル又はホスファチジルコリンから選択される１種以上を含む皮脂に見出される化合物のクラスのものである。
【0038】
当該方法は、個体がパーキンソン病（ＰＤ）、癌又は結核等の疾患を有するかどうかを評価するために使用されることが好ましい。
【0039】
抽出された標的分析物は、質量分析によるその後の分析のためのものであってもよい。
【0040】
本発明の別の態様では、試料中の１種以上の脂質を特定するための装置であって、
（ａ）１種以上の脂質を含む試料を受容するための手段と、
（ｂ）アンビエントイオン化質量分析を実施するための手段と、
（ｃ）イオンモビリティ質量分析を実施するための手段と
を含む装置が提供される。
（ａ）１種以上の脂質を含む試料を受容するための手段と、
（ｂ）アンビエントイオン化質量分析を実施するための手段と、
（ｃ）イオンモビリティ質量分析を実施するための手段と
を含む装置が提供される。
【0041】
実施されるアンビエントイオン化質量分析技術は、ペーパースプレーイオン化質量分析であってもよい。
【0042】
本発明のなおさらなる態様では、試料中の１種以上の脂質を特定するためのキットであって、
（ａ）１種以上の脂質を含む試料を得るための手段と、
（ｂ）アンビエントイオン化質量分析を実施するための手段と、
（ｃ）イオンモビリティ質量分析を実施するための手段と
を含むキットが提供される。
（ａ）１種以上の脂質を含む試料を得るための手段と、
（ｂ）アンビエントイオン化質量分析を実施するための手段と、
（ｃ）イオンモビリティ質量分析を実施するための手段と
を含むキットが提供される。
【0043】
実施されるアンビエントイオン化質量分析技術は、ペーパースプレーイオン化質量分析であってもよい。
【0044】
本発明の特定の態様、実施形態又は実施例と併せて記載される特徴、整数、特性、化合物、方法、アッセイ及び装置は、特段の記載がない限り、本明細書中に記載されるいずれの他の態様、実施形態又は実施例に対しても適用可能であると理解されたい。本明細書（添付のいずれの特許請求の範囲、要約書及び図面を含む）中に開示される特徴のすべて、及び／又はそのように開示されたあらゆる方法又はプロセスの工程のすべては、そのような特徴及び／又は工程の少なくともいくつかが相互に排他的である組み合わせを除いて、いずれの組み合わせで組み合わされてもよい。本発明は、いずれの上述の実施形態の細部にも制限されない。本発明は、本明細書（いずれの添付の特許請求の範囲、要約書及び図面を含む）中に開示される特徴のいずれの新規な１つのもの、若しくはいずれの新規な組み合わせに、又はそのように開示されたいずれの方法若しくはプロセスの工程のいずれの新規な１つ、若しくはいずれの新規な組み合わせにも及ぶ。
【図面の簡単な説明】
【0045】
次に、添付の図面を参照して、本発明の態様及び実施形態を例として説明する。さらなる態様及び実施形態は、当業者には明らかであろう。本明細書で言及されるすべての文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0046】
【図1B】図１は、ＰＬＳ－ＤＡ分類モデルを示す。（Ｂ．）ＰＬＳ－ＤＡモデリングは、並べ替え検定（順列検定、ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ）（出力分類は無作為化された；ｎ＝２６）を使用してさらに検定され、結果が、並べ替えモデル（順列モデル、ｐｅｒｍｕｔａｔｅｄ ｍｏｄｅｌ）について０．４～０．９の範囲のＣＣＲをもたらす正しい分類率（ＣＣＲ）の頻度分布を示すヒストグラムとしてプロットされている。観察されたモデルは、並べ替えモデルのほとんどよりも有意に良好であった（ｐ＜０．１）。矢印で示す。
【図2A(1)】図２は、関心のある分析物についてのＲＯＣ曲線、箱ひげ図及びＡＵＣ比較を示す。（Ａ．）両方の実験に共通するペリルアルデヒドについての発見コホート（ｉ）及び検証コホート（ｉｉ）についてのＲＯＣ曲線。括弧内の数字は、２０００の階層化されたブートストラップ反復で計算された算出された信頼区間であり、灰色の線はランダム推測を表す。
【図2A(2)】図２は、関心のある分析物についてのＲＯＣ曲線、箱ひげ図及びＡＵＣ比較を示す。（Ａ．）両方の実験に共通するエイコサンについての発見コホート（ｉｉｉ）及び検証コホート（ｉｖ）についてのＲＯＣ曲線。括弧内の数字は、２０００の階層化されたブートストラップ反復で計算された算出された信頼区間であり、灰色の線はランダム推測を表す。
【図2A(3)】図２は、関心のある分析物についてのＲＯＣ曲線、箱ひげ図及びＡＵＣ比較を示す。（Ａ．）両方の実験に共通する馬尿酸についての発見コホート（ｖ）及び検証コホート（ｖｉ）についてのＲＯＣ曲線。括弧内の数字は、２０００の階層化されたブートストラップ反復で計算された算出された信頼区間であり、灰色の線はランダム推測を表す。
【図2A(4)】図２は、関心のある分析物についてのＲＯＣ曲線、箱ひげ図及びＡＵＣ比較を示す。（Ａ．）両方の実験に共通するオクタデカナールについての発見コホート（ｖｉｉ）及び検証コホート（ｖｉｉｉ）についてのＲＯＣ曲線。括弧内の数字は、２０００の階層化されたブートストラップ反復で計算された算出された信頼区間であり、灰色の線はランダム推測を表す。
【図2B】図２は、関心のある分析物についてのＲＯＣ曲線、箱ひげ図及びＡＵＣ比較を示す。（Ｂ．）４つの分析物について共通の発見コホート及び検証コホートの両方についての箱ひげ図であり、これらの分析物の対数スケーリングされたピーク面積の平均を比較する。
【図3】図３は、３人の薬物ナイーブのパーキンソン被験者からの対照ガーゼ及びＰＤガーゼのＧＣ－ＭＳクロマトグラムからのオルファクトグラムを示し、赤色の陰影領域で重ね合わされたブランクガーゼは、リアルタイムＧＣ－ＭＳ分析と臭気ポートを用いたにおいとの間の重複を示す。図は、１０分～２１分の間の保持時間を示し、スーパースメラーは、様々なピークに関連した臭いを記載した。１９．２分～２１分の間の強調された領域（右に拡大）は、４つの化合物のうちの３つが臭気ポートの結果と重複するので特に興味深く、この領域で、スーパースメラーは、ＰＤの匂いが非常に強いと記述した。各クロマトグラムにおいて最高ピークに対する正規化された相対ピーク強度によって示される場合には、上記ピークは、同じ時間窓ではブランクガーゼに見られない。
【図4A】図４は、ＲＯＣプロットを示す。（Ａ．）両方のコホートと、対照とＰＤとの間で共通及び差異的であった５つすべての代謝産物とに由来する組み合わせ試料を用いて生成されたＲＯＣプロット。陰影領域は、複数の反復を伴う平衡サブサンプリング（ｂａｌａｎｃｅｄ ｓｕｂ－ｓａｍｐｌｉｎｇ）を使用するモンテカルロ交差検証（Ｍｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏ Ｃｒｏｓｓ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ、ＭＣＣＶ）によって計算された９５％信頼区間を示す。
【図4B】図４は、ＲＯＣプロットを示す。（Ｂ．）２つのコホート間で共通した（しかし、必ずしもスチューデントのｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ）を使用して差異的ではないか、又はコホート間で同じ方向に表されるわけではない）９つの代謝産物すべてを使用して生成されたＲＯＣプロット。各モデルは、すべての変数をランク付けするためにＰＬＳ－ＤＡを用いて構築され、上位２つの重要な変数が開始のために選択された。次いで、各後続のモデルにおいて、ランク別のさらなる変数が加えられ、ＲＯＣ曲線が作成された。信頼区間は、複数の反復を伴う平衡サブサンプリングを使用して、モンテカルロ交差検証（ＭＣＣＶ）によって計算された。
【図15】図１５は、実施例３における抽出プロトコル最適化の結果を示すバイアルの写真を示す。（Ａ．）トルエン：メタノール（２０：８０）再構成と対になったトルエンを使用するガーゼ抽出は、固体残渣の形成を示し、クロロホルムの添加に続く遠心分離（×２工程）は、透明な上清を得ることを可能にした。（Ｂ．）トルエンガーゼ抽出に続くトルエン：メタノール（５０：５０）再構成は、固体物質が形成されたことを示す。（Ｃ．）ガーゼスワブのＦｏｌｃｈ（ホルチ）抽出（メタノール：水：クロロホルム）及びその後の分離されたクロロホルム層の再構成は、濁った溶液が形成されたことを示し、この濁った溶液は、水：メタノール（８０：２０）で再構成せず、－ クロロホルム添加の段階に続く超音波処理及び遠心分離は、再構成結果を改善したが、あまりに多くの試料がこのプロセスにおいて失われた。
【図18(1)】図１８は、（Ａ）異なる診断イオンの到着時間分布を示すヒト皮脂から記録された全イオンクロマトグラム、（Ｂ）異性体構造の存在を示す単一イオンの到着時間分布、及び（Ｃ）ドリフト時間対ｍ／ｚプロットを示す。赤色の点は等しいｍ／ｚ値を表す。拡大画像挿入図は、同じ質量を有するが、異なるドリフト時間を有する種の存在を示す。
【図18(2)】図１８は、（Ａ）異なる診断イオンの到着時間分布を示すヒト皮脂から記録された全イオンクロマトグラム、（Ｂ）異性体構造の存在を示す単一イオンの到着時間分布、及び（Ｃ）ドリフト時間対ｍ／ｚプロットを示す。赤色の点は等しいｍ／ｚ値を表す。拡大画像挿入図は、同じ質量を有するが、異なるドリフト時間を有する種の存在を示す。
【図21】図２１：Ｘ軸＝ＤＦ１、Ｙ軸＝ＤＦ２。主成分判別因子分析（ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ ｆａｃｔｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ、ＰＣ－ＤＦＡ）スコアプロットは、ＴＤ－ＧＣ－ＭＳを用いて検出されたｍ／ｚ値に基づく３つの別個のクラスターを示す。前駆参加者は、ＤＦ１にわたる明確なクラスターであるが、ＰＤと対照との間にＤＦ２にわたる小さな差異が現れる。サポートベクターマシンを使用して、これらのデータから機械学習を実行し、一個抜き（リーブワンアウト）アプローチによって分類を生成した。モデルはアウトオブバッグサンプル（学習データとして扱われなかったデータ）に対して試験された。
【図22】図２２は、Ａ）タッチアンドロール移動（ｔｏｕｃｈ ａｎｄ ｒｏｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ）及びＢ）１００％ＥｔＯＨ中での迅速抽出を使用して皮脂から収集された質量スペクトルを示し、タッチアンドロール移動の場合におけるより高い質量の分子（ｍ／ｚ１２００～２０００の間）の存在を明確に示す。
【図24(1)】図２４は、各クラスの人々によって産生された皮脂の分子組成の有意差を示す、ＰＤ、対照、及び前駆の試料についての三次元ＤＴ対ｍ／ｚプロットを示す。赤色矢印は、ＰＤ試料及び前駆試料の場合に特定の分子種が観察された特定のドリフト時間を示すが、これは対照参加者の場合に存在しなかった。
【図25】Ａ）選択されたイオン（ｍ／ｚ８４３．７０７４）についての抽出された到着時間分布、Ｂ及びＣ）１０．４３及び６．６７ｍｓにおけるドリフト時間ピークからの対応する平均質量スペクトル。Ｄ）２価に荷電したピークがダイマー種に対応することを示す拡大された質量スペクトル。
【図26(1)】図２６は、標準脂質Ａ）Ｌ－α－ホスファチジルコリン、Ｂ）Ｌ－α－ホスファチジルセリン（ナトリウム塩）、及びＣ）１８：１カルジオリピンのタンデム質量分析データを示し、特定のためのフィンガープリントとして頭部基のフラグメント化を示す。
【図26(2)】図２６のＤ～Ｆ）は、皮脂試料からの選択されたｍ／ｚ値（それぞれ７６０．００、８３９．７５、８６５．７７）のＭＳＭＳを示す。これらの選択されたイオンはすべて、ｍ／ｚ２０２．２３にフラグメント化する。Ｇ）皮脂のＭＳＭＳスペクトルを示す。この際、ソースパラメータは、親イオンからｍ／ｚ２０２．２３フラグメントを作り出すためのソース内フラグメント化に続く、さらなるフラグメント化のために娘イオンの単離を得るように設定された。Ｄの挿入図は、皮脂から収集された拡大質量スペクトルを示し、化学式Ｃ４２Ｏ８Ｈ８３ＰＮを有するホスファチジルコリンとの正確な質量マッチを示す。
【図28(1)】図２８は、ＰＤ試料（Ａ及びＢ）及び対照試料（Ｃ及びＤ）についての三次元ＤＴ対ｍ／ｚプロットを示し、パーキンソン病を有する人々によって産生される皮脂の分子組成の有意差を示す。赤色矢印は、ＰＤ試料の場合に特定の分子種が観察された特定のドリフト時間を示すが、これは対照には存在しなかった。
【図28(2)】Ｅ）及びＦ）低ドリフト時間ピーク及び高ドリフト時間ピークにそれぞれ対応する質量スペクトル。エンベロープにおけるピークは、１４Ｄａ（Ｆにおいて）及び７Ｄａ（Ｅにおいて。２価に荷電している）である。ラベルａ、ｂ、ｃ、及びｄは、エンベロープにおけるそれぞれの一連のピークを表す。
【実施例】
【0047】
実施例１ － パーキンソン病についての揮発性バイオマーカーの存在について皮脂を評価する実験
研究参加者
本研究の参加者は、２５の異なるＮＨＳクリニックで行われた全国的な動員プロセスの一部であった。これらのサイトから参加者を無作為に選択した。本研究は３段階で行った。最初の２つの段階（発見及び検証）は、３０試料（下記表１に示す、対照、投薬（薬物療法）を受けているＰＤ参加者及び薬物ナイーブＰＤ被験者の混合体）からなった。
研究参加者
本研究の参加者は、２５の異なるＮＨＳクリニックで行われた全国的な動員プロセスの一部であった。これらのサイトから参加者を無作為に選択した。本研究は３段階で行った。最初の２つの段階（発見及び検証）は、３０試料（下記表１に示す、対照、投薬（薬物療法）を受けているＰＤ参加者及び薬物ナイーブＰＤ被験者の混合体）からなった。
【0048】
【表1(1)】
【表1(2)】
【0049】
第１のコホートをボラチローム発見のために使用し、第２のコホートを、第１のコホートにおいて発見された有意な特徴を検証するために使用した。３人の薬物ナイーブＰＤ参加者からなる第３のコホートを、スーパースメラーからのにおい分析のために使用した。これらの参加者のメタデータ解析を下記表２に示す。
【0050】
【表2】
【0051】
研究デザインは、図４にも概説されている。
【0052】
試料採取
サンプリングは、各被験者を医療用ガーゼで上背部を拭くことによって行った。参加者の上背部の皮脂試料を含むガーゼをバックグラウンド不活性プラスチックバッグに密封し、中央施設に輸送し、そこで分析日まで－８０℃で保存した。
サンプリングは、各被験者を医療用ガーゼで上背部を拭くことによって行った。参加者の上背部の皮脂試料を含むガーゼをバックグラウンド不活性プラスチックバッグに密封し、中央施設に輸送し、そこで分析日まで－８０℃で保存した。
【0053】
ＴＤ－ＧＣ－ＭＳ分析
本技術の説明
ダイナミックヘッドスペース（ＤＨＳ）ＧＣ－ＭＳ法は、ＰＤ罹患個体の皮膚を拭い取る（スワイプする）ために使用されるガーゼの分析のために開発された。ＤＨＳは、ゲステル（ＧＥＲＳＴＥＬ）多目的サンプラー（ＭｕｌｔｉＰｕｒｐｏｓｅ Ｓａｍｐｌｅｒ、ＭＰＳ）を使用する後続のＧＣ適用のための試料調製機能である。ＤＨＳは、液体又は固体の試料からＶＯＣを抽出し濃縮する。試料は、ヘッドスペースが吸着剤管を通る不活性ガスの制御された流れでパージされている間にインキュベートされる。抽出及び予備濃縮が完了すると、吸着剤管は、ゲステル昇温脱離ユニット（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｕｎｉｔ、ＴＤＵ）を使用して自動的に脱離される。次いで、分析物はゲステル冷却注入システム（Ｃｏｏｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、ＣＩＳ）ＰＴＶ注入器に凍結集束された後、分析のためにＧＣに移される。
本技術の説明
ダイナミックヘッドスペース（ＤＨＳ）ＧＣ－ＭＳ法は、ＰＤ罹患個体の皮膚を拭い取る（スワイプする）ために使用されるガーゼの分析のために開発された。ＤＨＳは、ゲステル（ＧＥＲＳＴＥＬ）多目的サンプラー（ＭｕｌｔｉＰｕｒｐｏｓｅ Ｓａｍｐｌｅｒ、ＭＰＳ）を使用する後続のＧＣ適用のための試料調製機能である。ＤＨＳは、液体又は固体の試料からＶＯＣを抽出し濃縮する。試料は、ヘッドスペースが吸着剤管を通る不活性ガスの制御された流れでパージされている間にインキュベートされる。抽出及び予備濃縮が完了すると、吸着剤管は、ゲステル昇温脱離ユニット（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｕｎｉｔ、ＴＤＵ）を使用して自動的に脱離される。次いで、分析物はゲステル冷却注入システム（Ｃｏｏｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、ＣＩＳ）ＰＴＶ注入器に凍結集束された後、分析のためにＧＣに移される。
【0054】
ＰＤ分子シグネチャーをＰＤのにおいに相関させるために、同じ設定をゲステル嗅覚検出ポート（Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｐｏｒｔ、ＯＤＰ）と組み合わせて使用した。ＯＤＰは、臭いのある化合物がにおいによってＧＣから溶出するので、臭いのある化合物の検出を可能にする。実際、ガス流は、選択した検出器（本研究の場合ＭＳ）とＯＤＰとの間でカラムを出る際に分割され、２つの分析ツール上で同時検出を可能にする。次いで、追加のにおいプロファイル情報を取得することができる。音声認識ソフトウェア及び強度登録は、クロマトグラムの直接注釈を可能にする。
【0055】
方法の詳細
ガーゼを２０ｍＬのヘッドスペースバイアルに移し、次いでＤＨＳ－ＴＤＵ－ＧＣ－ＭＳによって分析した。ＤＨＳ予備濃縮工程については、試料を６０℃で５分間インキュベートした後、捕捉工程を進めた。捕捉は、４０℃に保ったＴｅｎａｘ（登録商標）ＴＡ吸着剤管（ゲステル、ドイツ）を通して５００ｍＬの試料ヘッドスペースを５０ｍＬ．ｍｉｎ－１でパージして行った。窒素をパージガスとして使用した。分析物を放出するために、吸着剤トラップをスプリットレスモードでＴＤＵにおいて脱離させた。ＴＤＵを３０℃で１分間保持し、次いで７２０℃．ｍｉｎ－１で２５０℃まで上昇させ、５分間保持した。脱離した分析物を、ＣＩＳ注入器内で凍結集束させた。８０ｍＬ．ｍｉｎ－１の通気流を使用し、１０のスプリット比を適用して、溶媒ベントモードでＣＩＳを操作した。初期温度を１０℃で２分間保持し、次いで１２℃．ｓ－１で２５０℃まで上昇させ、１０分間保持した。ＧＣ分析は、ＥＩモードで動作する高効率ソース（ＨＥＳ）を備えたアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ） ＭＳＤ ５９７７Ｂに連結されたアジレントＧＣ ７８９０Ｂで実施した。分離は、アジレントＨＰ－５ＭＳ Ｕｌｔｒａ不活性３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍカラムで行った。カラム流量を１ｍＬ．ｍｉｎ－１に維持した。オーブンランプを以下のようにプログラムした：４０℃で５分間保持し、１０℃．ｍｉｎ－１で１７０℃まで、８℃．ｍｉｎ－１で２５０℃まで、１０℃．ｍｉｎ－１で２６０℃まで昇温し、２６０℃で２分間保持し、合計実行時間は３１分間であった。ＭＳへの移送ラインは３００℃に保った。ＨＥＳ源を２３０℃に保ち、四重極を１５０℃に保った。３０～８００ｍ／ｚの質量範囲についてスキャンモードでＭＳＤを操作した。オルファクトメトリー（嗅覚検査）アプローチについては、クロマトグラフィーフローを、アジレントテクノロジー・キャピラリフロー・テクノロジー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｆｌｏｗ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（メイクアップガスを備えた三方スプリッタプレート）を用いて質量分析計とゲステルＯｌｆａｃｔｏｒｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｐｏｒｔ（ＯＤＰ３）との間で分割した。ＯＤＰ３移送ラインは１００℃に保ち、ノーズコーンの湿度を一定に維持した。
ガーゼを２０ｍＬのヘッドスペースバイアルに移し、次いでＤＨＳ－ＴＤＵ－ＧＣ－ＭＳによって分析した。ＤＨＳ予備濃縮工程については、試料を６０℃で５分間インキュベートした後、捕捉工程を進めた。捕捉は、４０℃に保ったＴｅｎａｘ（登録商標）ＴＡ吸着剤管（ゲステル、ドイツ）を通して５００ｍＬの試料ヘッドスペースを５０ｍＬ．ｍｉｎ－１でパージして行った。窒素をパージガスとして使用した。分析物を放出するために、吸着剤トラップをスプリットレスモードでＴＤＵにおいて脱離させた。ＴＤＵを３０℃で１分間保持し、次いで７２０℃．ｍｉｎ－１で２５０℃まで上昇させ、５分間保持した。脱離した分析物を、ＣＩＳ注入器内で凍結集束させた。８０ｍＬ．ｍｉｎ－１の通気流を使用し、１０のスプリット比を適用して、溶媒ベントモードでＣＩＳを操作した。初期温度を１０℃で２分間保持し、次いで１２℃．ｓ－１で２５０℃まで上昇させ、１０分間保持した。ＧＣ分析は、ＥＩモードで動作する高効率ソース（ＨＥＳ）を備えたアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ） ＭＳＤ ５９７７Ｂに連結されたアジレントＧＣ ７８９０Ｂで実施した。分離は、アジレントＨＰ－５ＭＳ Ｕｌｔｒａ不活性３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍカラムで行った。カラム流量を１ｍＬ．ｍｉｎ－１に維持した。オーブンランプを以下のようにプログラムした：４０℃で５分間保持し、１０℃．ｍｉｎ－１で１７０℃まで、８℃．ｍｉｎ－１で２５０℃まで、１０℃．ｍｉｎ－１で２６０℃まで昇温し、２６０℃で２分間保持し、合計実行時間は３１分間であった。ＭＳへの移送ラインは３００℃に保った。ＨＥＳ源を２３０℃に保ち、四重極を１５０℃に保った。３０～８００ｍ／ｚの質量範囲についてスキャンモードでＭＳＤを操作した。オルファクトメトリー（嗅覚検査）アプローチについては、クロマトグラフィーフローを、アジレントテクノロジー・キャピラリフロー・テクノロジー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｆｌｏｗ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（メイクアップガスを備えた三方スプリッタプレート）を用いて質量分析計とゲステルＯｌｆａｃｔｏｒｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｐｏｒｔ（ＯＤＰ３）との間で分割した。ＯＤＰ３移送ラインは１００℃に保ち、ノーズコーンの湿度を一定に維持した。
【0056】
データ前処理及び逆畳み込み
ＴＤ－ＧＣ－ＭＳデータを、ＰｒｏｔｅｏＷｉｚａｒｄを使用してオープンソースｍｚＸＭＬフォーマットに変換した。各コホートデータを、Ｒで書かれた組織内ＸＣＭＳスクリプトを用いて別々に逆畳み込みした。フラグメントスペクトルを、Ｇｏｌｍデータベース、ＮＩＳＴライブラリー及びＦｉｅｈｎ ＧＣＭＳライブラリーに存在する化合物スペクトルと照合することにより、逆畳み込みした分析物に推定特定を割り当てた。各コホートについて得られたマトリクス（行列）は、各試料についての変数及びそれらのそれぞれのピーク下面積からなっていた。交絡変数を考慮するために、すべてのデータを年齢及び総イオン数について正規化した（表２参照）。ウィルコクソン－マン－ホイットニー（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ－Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ）分析、ＰＬＳ－ＤＡ、及び記載されるＲＯＣ曲線の生成の前に、データを対数スケーリングし、パレート（Ｐａｒｅｔｏ）スケーリングした。
ＴＤ－ＧＣ－ＭＳデータを、ＰｒｏｔｅｏＷｉｚａｒｄを使用してオープンソースｍｚＸＭＬフォーマットに変換した。各コホートデータを、Ｒで書かれた組織内ＸＣＭＳスクリプトを用いて別々に逆畳み込みした。フラグメントスペクトルを、Ｇｏｌｍデータベース、ＮＩＳＴライブラリー及びＦｉｅｈｎ ＧＣＭＳライブラリーに存在する化合物スペクトルと照合することにより、逆畳み込みした分析物に推定特定を割り当てた。各コホートについて得られたマトリクス（行列）は、各試料についての変数及びそれらのそれぞれのピーク下面積からなっていた。交絡変数を考慮するために、すべてのデータを年齢及び総イオン数について正規化した（表２参照）。ウィルコクソン－マン－ホイットニー（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ－Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ）分析、ＰＬＳ－ＤＡ、及び記載されるＲＯＣ曲線の生成の前に、データを対数スケーリングし、パレート（Ｐａｒｅｔｏ）スケーリングした。
【0057】
結果
本研究では、試料ヘッドスペースからのＶＯＣを２つのコホートで測定した：それぞれが３０人の被験者からなる（属性については表２を参照のこと）、メタボロミクスを用いたバイオマーカー発見について示唆されるような［２１］「発見」コホート及び「検証」コホート。３人の薬物ナイーブＰＤ参加者からなる第３のコホートを、臭気ポートを介した人間のスーパースメラーと併せた質量分析に使用した。この主な研究の証拠は、パーキンソン病における皮膚ボラチロームの初めての説明を提供する。
本研究では、試料ヘッドスペースからのＶＯＣを２つのコホートで測定した：それぞれが３０人の被験者からなる（属性については表２を参照のこと）、メタボロミクスを用いたバイオマーカー発見について示唆されるような［２１］「発見」コホート及び「検証」コホート。３人の薬物ナイーブＰＤ参加者からなる第３のコホートを、臭気ポートを介した人間のスーパースメラーと併せた質量分析に使用した。この主な研究の証拠は、パーキンソン病における皮膚ボラチロームの初めての説明を提供する。
【0058】
上記のように質量分析データを収集し、逆畳み込みし、前処理した。部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ－ＤＡ）モデルを、発見コホートデータを用いて構築した（図１）。このモデリングは、５分割交差検証（８６％の平均の正しい分類率（ＣＣＲ））並びに２６の並べ替え検定（６８％の平均並べ替えＣＣＲ、８３％の平均ＣＣＲ、ｐ値＜０．１）で検証した。分類に寄与する変数（ｎ＝１７）を、射影における変数重要度（ｖａｒｉａｂｌｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｉｎ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ、ＶＩＰ）スコア（ＶＩＰ＞１）を使用して選択した。（発見段階とは異なる集団からの）検証コホートデータにおいて測定されたボラチロームを、これらの発見されたバイオマーカーの存在又は非存在について標的とした。１７種の代謝産物のうちの９個が、検証コホートデータにおいても見出された（下記表３）。
【0059】
【表3】
【0060】
これらの９種の共通のバイオマーカーを、さらなる分析及び統計学的検定のために選択した。本研究の発見及び検証コホートデータからのこれらの共通のバイオマーカーの性能を評価するために、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析を、発見コホート及び検証コホートの両方からのデータを用いて行った。ＲＯＣ曲線及びウィルコクソン－マン－ホイットニー検定並びに個々の代謝産物についての倍率変化計算は、これらの９種の共通代謝産物のうちの４種が、発見コホートと検証コホートとの間でＰＤにおいて類似の発現を有し、それらの性能も、発見コホートと検証コホートとの間でＡＵＣによって測定すると類似していたことを示す（下記表４及び図２を参照）。
【0061】
【表4】
【0062】
目的の特徴への同一性の帰属は、データ解析のためのＭＳＩ（Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（国際メタボロミクス学会標準化委員会））ガイドラインに準拠した［２２］。本発明者らが特定した特徴はすべてＭＳＩレベル２であった［２２］。ペリルアルデヒド及びエイコサンは、両方のコホートにおいてＰＤと対照との間で有意に異なっていた（ｐ値＜０．０５）。ペリルアルデヒドはＰＤ試料においてより低いことが観察されたが、エイコサンは有意により高いレベルで観察された。馬尿酸及びオクタデカナールは有意に異ならなかったが（ｐ＞０．０５）、２つのコホート間のＡＵＣ（図２ａ）及び箱ひげ図（図２ｂ）は同等であり、同様の傾向を示した。
【0063】
両方のコホートからの試料を組み合わせ、従って、バイオマーカーのこのパネルの性能を評価しながら、試料サイズを増加させ、より良好な検定力を提供した。ＲＯＣ曲線は、平衡サブサンプリングを用いてモンテカルロ交差検証（ＭＣＣＶ）により作成した。ＭＣＣＶのそれぞれにおいて、試料の３分の２を使用して、特徴の重要度を評価した。次いで、上位２つ、３つ、５つ、７つ及び９つの重要な特徴を使用して分類モデルを構築し、試料の残りの３分の１を使用してこれらを検証した。このプロセスを５００回繰り返して、各モデルの平均性能及び信頼区間を計算した。分類及び特徴ランキングは、２つの潜在変数を用いるＰＬＳ－ＤＡアルゴリズムを用いて行った（図４）。組み合わせたデータからの結果は、データにおける信頼度（表１のｐ値及び図１の信頼区間）の増加を示す。臭気ポートから得られたオルファクトグラムを全イオンクロマトグラムに重ね合わせると（図３）、多くの関心領域（ＲＯＩ）が特定された。エキソソーム及びエンドソームの両方において、被験体間で個体差があるため、知覚されるにおいは参加者間でばらつきがあると予想される。しかしながら、いくつかのＲＯＩは、試料間で一貫して類似しており、ＰＤ個体間の類似性をさらに示した。クロマトグラフィー実行の１９分から２１分の間のＲＯＩは特に興味深い。というのも、その保持ウィンドウの間の分析物の混合物に関連するにおいが「非常に強い」及び「麝香臭がする」 － ＰＤの匂い － と記載されたためである。これは、２つのコホートの間の４種の共通揮発性物質のうち３種、すなわち馬尿酸、エイコサン及びオクタデカナールが検出された領域と同じ領域である。これらの揮発性物質の３つすべてがＰＤ被験者において上方制御されたことにも留意すべきである。これは、これらの化合物の１つ以上の存在がＰＤの匂いと関連しうることを示す可能性がある。
【0064】
他者から分ける１つの基礎因子（すなわちＰＤ）を有している異なる人々に由来する３つの独立したデータセットから得られたこれらの結果から、いくつかの揮発性特徴物が対照とＰＤ参加者との間で有意に異なることが判明したということ明らかになった。投薬を受けているＰＤ参加者と薬物ナイーブＰＤ参加者との間に有意差は観察されず、これは、分析されたボラチロームの大部分が薬物代謝産物を含有しない可能性があるか、又はＰＤ投薬と関連しうる高濃度の薬物代謝産物を皮脂が欠いている可能性があることを示す。ペリルアルデヒド及びオクタデカナールは、通常、植物代謝産物又は食品添加物として観察される。不規則な皮脂分泌により、これらの脂質様疎水性代謝産物はＰＤ被験者の皮膚上で変化する可能性があると仮定することができる。そのような効果は、皮脂中のエイコサン等の摂食由来代謝産物の排泄の調節不全をもたらす代謝の直接的な変化に起因する可能性があり、又は馬尿酸等の代謝産物の産生の変化を引き起こす皮膚微生物叢に影響を及ぼす可能性がある［２３］ＰＤ皮膚の代謝変化に起因する可能性がある。これらの観察された効果は、ＰＤの生理学的症状に対する間接的又は二次的な観察であってもよい。本研究は、ＰＤ患者からの皮脂の包括的分析の可能性を強調し、個体がその匂いに基づいて非侵襲的にスクリーニングされることができるという可能性を高める。
【0065】
実施例２ － ガーゼ － メタボロミクスのための抽出プロトコルの最適化
ガーゼ含浸試料の抽出プロトコルを最適化及び評価するために実験を行った。
ガーゼ含浸試料の抽出プロトコルを最適化及び評価するために実験を行った。
【0066】
抽出手順
抽出のために、９ｍＬのトルエンを添加し、ファルコンチューブを１時間振盪し、ガーゼを金属ワイヤー上に掛け、１０分間（１５００ｒｐｍ）遠心分離し、乾燥ガーゼを除去した。各抽出のために、溶媒を２×エッペンドルフ（１×ＬＣ、１×ＧＣ）に分割し、ｓｐｅｅｄｖａｃを用いて乾燥させた。
抽出のために、９ｍＬのトルエンを添加し、ファルコンチューブを１時間振盪し、ガーゼを金属ワイヤー上に掛け、１０分間（１５００ｒｐｍ）遠心分離し、乾燥ガーゼを除去した。各抽出のために、溶媒を２×エッペンドルフ（１×ＬＣ、１×ＧＣ）に分割し、ｓｐｅｅｄｖａｃを用いて乾燥させた。
【0067】
比較
以下の比較を評価した。
・ブランクガーゼ対Ｈ２Ｏ：ＡＣＮ（５０：５０）で再構成された試料
・ブランクガーゼ対Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨ（５０：５０）で再構成された試料
・ブランクのガーゼ対１日目の試料対２日目の試料（同じ被験者）
・ブランク対試料（再懸濁法によらない）
以下の比較を評価した。
・ブランクガーゼ対Ｈ２Ｏ：ＡＣＮ（５０：５０）で再構成された試料
・ブランクガーゼ対Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨ（５０：５０）で再構成された試料
・ブランクのガーゼ対１日目の試料対２日目の試料（同じ被験者）
・ブランク対試料（再懸濁法によらない）
【0068】
合計４つの試料及び２つのブランクを試験した。抽出比較実験の詳細を下記表５に示す。
【0069】
【表5】
【0070】
図５～図１４は、比較実験の結果を示す。特に、図１３は、ＰＥＧバックグラウンドがシグナルを妨害している場合、ここでははるかに多くの代謝産物が見られると予想されることを示す。というのも、本発明者らは、このグラフにおいて２倍高い、すなわち、非常に高いノイズとみなされる任意のピークをプロットしているからである。シグナルは、高いＰＥＧが疑われる同じＲＴ領域においてより高いようである。これは、あらゆるガーゼ関連のバックグラウンド問題を安全に排除できることを示す。
【0071】
図１４は、およそ１０個の特徴がＰＥＧによってマスキングされているとすると、マスキングされていない特徴が約１００個あり、すなわち、シグナル対ノイズ比ははるかに高く、ガーゼから脱落しうる任意のＰＥＧ様汚染は、この抽出によって回避することができるということを示す。
【0072】
実施例３ － 抽出プロトコルの最適化
異なる溶媒を用いて抽出プロトコルを最適化するために実験を行った。
異なる溶媒を用いて抽出プロトコルを最適化するために実験を行った。
【0073】
トルエン抽出
トルエンは、ガーゼ残渣の除去のためのフィルターと適合しないものであることが明確であった。トルエンは、とりわけそのような高容量において、ｓｐｅｅｄｖａｃで除去することができない。トルエンは、検査室における一般のｓｐｅｅｄｖａｃにおいてシールを損傷することが判明した。
トルエンは、ガーゼ残渣の除去のためのフィルターと適合しないものであることが明確であった。トルエンは、とりわけそのような高容量において、ｓｐｅｅｄｖａｃで除去することができない。トルエンは、検査室における一般のｓｐｅｅｄｖａｃにおいてシールを損傷することが判明した。
【0074】
とりわけ、手順を高い試料数に合わせるするために、ヒュームフードにおける蒸発は実現可能ではなく、共用の検査室において長期間にわたってエッペンドルフを（蓋をせずに）放置することは良好な実務ではない。溶媒の除去を加速するためにヒートブロックを使用することが評価されたが、これは、より低い温度で妥当な速度まで蒸発を加速せず、高温は、試料の完全性に有害である可能性があった。
【0075】
これらの問題により、再構成組成物は最適化が困難であり、試料間で一貫していなかった。
【0076】
図１５Ａは、トルエン：メタノール（２０：８０）における再構成中に固体残渣が生成したことを示す。クロロホルムの添加に続く遠心分離（×２工程）により、透明な上清が得られた。
【0077】
図１５Ｂは、トルエン：メタノール（５０：５０）中での再構成時に固体物質が生成したことを示す。
【0078】
Ｆｏｌｃｈ抽出
この溶媒の組み合わせは、ガーゼ残渣を除去するためのフィルターと適合しないことが評価された。ＬＣ－ＭＳ用のクロロホルム層は水：メタノール（８０：２０）に再構成せず、濁った溶液を形成した。
この溶媒の組み合わせは、ガーゼ残渣を除去するためのフィルターと適合しないことが評価された。ＬＣ－ＭＳ用のクロロホルム層は水：メタノール（８０：２０）に再構成せず、濁った溶液を形成した。
【0079】
再構成中のクロロホルムの添加を評価したが、あまりに多い体積が必要であるため実行可能ではなく、遠心分離サイクルの回数を掛けると、あまりに多くの試料が失われた。
【0080】
メタノール抽出
この抽出プロトコルにおいて、９ｍＬ、１５ｍＬ及び２０ｍＬの溶媒抽出体積を試験した。より少ない溶媒が最高のシグナルをもたらし、ガーゼサイズに起因して最低９ｍＬがガーゼが吸収する溶媒の体積として必要であることが確立された。
この抽出プロトコルにおいて、９ｍＬ、１５ｍＬ及び２０ｍＬの溶媒抽出体積を試験した。より少ない溶媒が最高のシグナルをもたらし、ガーゼサイズに起因して最低９ｍＬがガーゼが吸収する溶媒の体積として必要であることが確立された。
【0081】
通常、有機溶媒中で抽出された試料は、有機溶媒に戻して再構成することができる。例えば、メタノール中で抽出され、次いで乾燥されてペレットを形成した試料は、通常、メタノール中で、及びエタノール、アセトニトリル又はイソプロパノール中でも再構成されるはずである。しかしながら、本発明者らは、本発明者らのプロトコルによって抽出された脂質及び脂質様分子が、長期間のうちにメタノール下で不安定化する傾向があることを発見した。メタボロミクス又はＬＣ－ＭＳ分析において、標準は、抽出物を水及びメタノールの様々な組み合わせ（％）で再構成することである。しかしながら、これは本研究の分析物を不安定化し、短時間後に上記写真に示される固体残渣が形成した。これは、試料を周囲温度で冷たいトレイ上に保存した場合でも再現された。有機溶媒の混合物を評価したところ、メタノール及びエタノール（５０：５０ｖ／ｖ）が再構成された皮脂を安定化する。これは、皮脂から抽出された分子が非定型的であり、溶液中に留まるために有機－水性混合物又は単一の有機溶媒とは対照的に有機溶媒の組み合わせを必要とすることを示す。
【0082】
実施例４ － 好ましい抽出プロトコル
それゆえ、以下の抽出プロトコルが最良の性能を有することが確立された。
それゆえ、以下の抽出プロトコルが最良の性能を有することが確立された。
【0083】
Ｑ－Ｔｉｐ抽出
１． ＱＴｉｐの木材ステムを２ｍＬのエッペンドルフにスナップ嵌めする
２． １ｍＬのＭｅＯＨを加える
３． １０秒間ボルテックスする
４． １０分間超音波処理する
５． ＱＴＩＰを除去する
６． ５分間遠心分離する
７． ８００μＬをピペットで新しいエッペンドルフに入れる（２つの画分を必要とする場合は半分に分割する）
８． ｓｐｅｅｄｖａｃ濃縮器中で約６時間乾燥させる
９． －８０℃の冷凍庫で保存する
１． ＱＴｉｐの木材ステムを２ｍＬのエッペンドルフにスナップ嵌めする
２． １ｍＬのＭｅＯＨを加える
３． １０秒間ボルテックスする
４． １０分間超音波処理する
５． ＱＴＩＰを除去する
６． ５分間遠心分離する
７． ８００μＬをピペットで新しいエッペンドルフに入れる（２つの画分を必要とする場合は半分に分割する）
８． ｓｐｅｅｄｖａｃ濃縮器中で約６時間乾燥させる
９． －８０℃の冷凍庫で保存する
【0084】
ガーゼ抽出
１）ピンセットを使用して、ガーゼを５０ｍＬのファルコンチューブに入れる
２）９ｍＬのメタノールを添加し、ガーゼがチューブの底に着くまで振盪する
３）１０秒間ボルテックスする
４）３０分間超音波処理する
５）ガーゼチューブからメタノールをピペットで抽出した
６）シリンジ及びフィルターを使用して抽出溶媒を新しいチューブに入れる － 回収約７ｍＬ
７）これをエッペンドルフ中で３×２ｍＬの画分に分ける
８）ｓｐｅｅｄｖａｃ濃縮器を使用して約１０／１２時間乾燥させる
８）－８０℃で保存する
１）ピンセットを使用して、ガーゼを５０ｍＬのファルコンチューブに入れる
２）９ｍＬのメタノールを添加し、ガーゼがチューブの底に着くまで振盪する
３）１０秒間ボルテックスする
４）３０分間超音波処理する
５）ガーゼチューブからメタノールをピペットで抽出した
６）シリンジ及びフィルターを使用して抽出溶媒を新しいチューブに入れる － 回収約７ｍＬ
７）これをエッペンドルフ中で３×２ｍＬの画分に分ける
８）ｓｐｅｅｄｖａｃ濃縮器を使用して約１０／１２時間乾燥させる
８）－８０℃で保存する
【0085】
実施例５ － パーキンソン病診断のためのヒト皮脂のペーパースプレーイオン化質量分析
研究参加者
皮脂を用いたペーパースプレーイオン化質量分析（ＰＳＩ－ＭＳ）の最初の方法開発のために、健常対照由来の試料を使用した。ヒト皮脂から収集した質量スペクトルの満足のいく再現性を達成した後、当該方法を、パーキンソン病の参加者からの試料を使用してさらに試験した。この研究の参加者は、英国全体にわたって２８の異なるＮＨＳクリニックで行われた動員プロセスの一部であった。（パーキンソン病研究にも関与する）地域の診療所から収集した、より大きい動員ドライブからのサブセットをこの研究に使用した（ＰＤ試料６５個及び対照試料５２個）。
研究参加者
皮脂を用いたペーパースプレーイオン化質量分析（ＰＳＩ－ＭＳ）の最初の方法開発のために、健常対照由来の試料を使用した。ヒト皮脂から収集した質量スペクトルの満足のいく再現性を達成した後、当該方法を、パーキンソン病の参加者からの試料を使用してさらに試験した。この研究の参加者は、英国全体にわたって２８の異なるＮＨＳクリニックで行われた動員プロセスの一部であった。（パーキンソン病研究にも関与する）地域の診療所から収集した、より大きい動員ドライブからのサブセットをこの研究に使用した（ＰＤ試料６５個及び対照試料５２個）。
【0086】
試料採取
皮脂試料を、医療用Ｑ－ｔｉｐスワブを用いて参加者の上背部／腰部から非侵襲的にスワブした。次いで、皮脂試料を伴うＱ－ｔｉｐスワブをそれらの個々のキャップ内に固定し、密封エンベロープ内でマンチェスター大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ）の中央施設に輸送し、そこで分析日まで－８０℃で保存した。
皮脂試料を、医療用Ｑ－ｔｉｐスワブを用いて参加者の上背部／腰部から非侵襲的にスワブした。次いで、皮脂試料を伴うＱ－ｔｉｐスワブをそれらの個々のキャップ内に固定し、密封エンベロープ内でマンチェスター大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ）の中央施設に輸送し、そこで分析日まで－８０℃で保存した。
【0087】
方法：ペーパースプレーイオン化質量分析（ＰＳＩ－ＭＳ）
すべてのＰＳＩ－ＭＳ実験について、市販のＷｈａｔｍａｎ濾紙（グレード１及び４２）を紙基材として使用した。皮脂試料を、穏やかな摩擦によってＱ－ｔｉｐスワブから紙基材に移した。試料移動後、紙を三角形に切断した（底辺５ｍｍ、高さ１０ｍｍ）。次いで、ピンセットを使用して、この三角形の紙を銅製のアリゲータークリップに慎重にクリップ留めした。紙の注意深い取り扱いは、汚染を回避するために重要であった。使用前にアセトン中で超音波処理することによって銅クリップを洗浄した。各試料について、新しいクリップ及びピンセットを使用して、試料間の交差汚染を回避した。次いで、クリップを、ＰＳＩ－ＭＳ測定のために既存の質量分析計に適合させた自作のペーパースプレーホルダーに接続し、その後、調節可能なステージを使用してホルダーをＭＳ注入口の前に配置した。ホルダーは、紙の先端がＭＳ注入口から５～７ｍｍの距離にあるように調整した。三角形の紙を所望の位置に置いた後、クリップを通して２．５～３ｋＶの範囲の高電圧をそれに印加した。高電位に保持した紙を極性溶媒で溶出すると、紙の先端にテイラー（Ｔａｙｌｏｒ）コーン形成が観察され、それに直ちに機器ソフトウェアで観察可能なｍ／ｚシグナルが続いた。質量スペクトルはすべて５０～２０００ｍ／ｚの範囲で記録した。各ＰＳＩ－ＭＳ実験の主要な機器パラメータは、キャピラリ電圧３ｋＶ、ソース温度１００℃、サンプリングコーン３０Ｖ及びソースオフセット４０Ｖとして設定した。脱溶媒又はコーンガスは使用しなかった。
すべてのＰＳＩ－ＭＳ実験について、市販のＷｈａｔｍａｎ濾紙（グレード１及び４２）を紙基材として使用した。皮脂試料を、穏やかな摩擦によってＱ－ｔｉｐスワブから紙基材に移した。試料移動後、紙を三角形に切断した（底辺５ｍｍ、高さ１０ｍｍ）。次いで、ピンセットを使用して、この三角形の紙を銅製のアリゲータークリップに慎重にクリップ留めした。紙の注意深い取り扱いは、汚染を回避するために重要であった。使用前にアセトン中で超音波処理することによって銅クリップを洗浄した。各試料について、新しいクリップ及びピンセットを使用して、試料間の交差汚染を回避した。次いで、クリップを、ＰＳＩ－ＭＳ測定のために既存の質量分析計に適合させた自作のペーパースプレーホルダーに接続し、その後、調節可能なステージを使用してホルダーをＭＳ注入口の前に配置した。ホルダーは、紙の先端がＭＳ注入口から５～７ｍｍの距離にあるように調整した。三角形の紙を所望の位置に置いた後、クリップを通して２．５～３ｋＶの範囲の高電圧をそれに印加した。高電位に保持した紙を極性溶媒で溶出すると、紙の先端にテイラー（Ｔａｙｌｏｒ）コーン形成が観察され、それに直ちに機器ソフトウェアで観察可能なｍ／ｚシグナルが続いた。質量スペクトルはすべて５０～２０００ｍ／ｚの範囲で記録した。各ＰＳＩ－ＭＳ実験の主要な機器パラメータは、キャピラリ電圧３ｋＶ、ソース温度１００℃、サンプリングコーン３０Ｖ及びソースオフセット４０Ｖとして設定した。脱溶媒又はコーンガスは使用しなかった。
【0088】
内部標準の使用
異なる試料間のペーパースプレーの再現性をチェックするために、内部標準を使用した。これらの実験のために、３．５μＬの内部標準溶液を三角形の紙の上にスポットし、周囲環境で空気乾燥させた。乾燥した三角形の紙を、前の段落に記載したのと同じ方法に従って皮脂試料のＰＳＩ－ＭＳ測定に使用した。
異なる試料間のペーパースプレーの再現性をチェックするために、内部標準を使用した。これらの実験のために、３．５μＬの内部標準溶液を三角形の紙の上にスポットし、周囲環境で空気乾燥させた。乾燥した三角形の紙を、前の段落に記載したのと同じ方法に従って皮脂試料のＰＳＩ－ＭＳ測定に使用した。
【0089】
データ処理
データはウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）専用フォーマットで記録した。試料当たりの総分析時間は、２分で１２０回のスキャンであった。これらの１２０スキャンを単一の結合スペクトルとして集約した。結合されたスペクトルは、各行が測定されたｍ／ｚ値及び絶対イオンカウントを有するように、各試料について表形式で記録した。これらのデータは、実験におけるすべてのファイルについて生成した。次いで、データを、各ファイルについて個別に．ｃｓｖフォーマットで保存した。
データはウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）専用フォーマットで記録した。試料当たりの総分析時間は、２分で１２０回のスキャンであった。これらの１２０スキャンを単一の結合スペクトルとして集約した。結合されたスペクトルは、各行が測定されたｍ／ｚ値及び絶対イオンカウントを有するように、各試料について表形式で記録した。これらのデータは、実験におけるすべてのファイルについて生成した。次いで、データを、各ファイルについて個別に．ｃｓｖフォーマットで保存した。
【0090】
オープンソース統計ソフトウェアＲを用いてさらなるデータ処理を行った。組織内スクリプトは、．ｃｓｖファイルをデータフレームとしてＲにインポートするために書かれた。各ｍ／ｚは、２つの工程を使用してビニングし（ｂｉｎ）、まず、ｍ／ｚが試料においてユニークである場合、それは保存し、ｍ／ｚが以前の試料においてすでに検出された場合、それは組み合わせた。得られたデータフレームは、データセット全体にわたって検出されたすべての可能なｍ／ｚ値を有していた。次の工程において、ｍ／ｚ値を、機器測定値の最も正確な表現、すなわちダルトン質量の小数点以下４位までに丸めた。最後に、連続するｍ／ｚ値は、それらが同一である場合、同じイオンを表わすと考え、それらのピーク面積を合計した。得られたデータを、各行がｍ／ｚ値及び総イオン数を示し、各列が試料を表す単一のマトリクスに組み合わせた。
【0091】
データ解析
データ再現性及び品質は、ペーパースプレーの内部標準ピーク強度を用いて評価した。内部標準参照ピークは、すべての試料において検出された。データ品質は、内部標準ピーク比の分散係数によって決定した。一元配置ｔ検定を使用して、対照試料及びＰＤ試料についての各変数の平均間の有意差を決定した。ｐ＜０．０５のあらゆる変数を有意とみなし、推定特定のために進めた。ｍ／ｚ値をオンラインデータベース － ２０ｐｐｍの質量精度でＨｕｍａｎ Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ヒトメタボロームデータベース、ＨＭＤＢ）及びＬｉｐｉｄＭａｐ中の値と照合することによって、推定特定を行った。
データ再現性及び品質は、ペーパースプレーの内部標準ピーク強度を用いて評価した。内部標準参照ピークは、すべての試料において検出された。データ品質は、内部標準ピーク比の分散係数によって決定した。一元配置ｔ検定を使用して、対照試料及びＰＤ試料についての各変数の平均間の有意差を決定した。ｐ＜０．０５のあらゆる変数を有意とみなし、推定特定のために進めた。ｍ／ｚ値をオンラインデータベース － ２０ｐｐｍの質量精度でＨｕｍａｎ Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ヒトメタボロームデータベース、ＨＭＤＢ）及びＬｉｐｉｄＭａｐ中の値と照合することによって、推定特定を行った。
【0092】
結果及び考察
図１６は、ＰＳＩ－ＭＳ技術を用いてヒト皮脂試料を分析するための実験ワークフローの概略図を示す。Ｗｈａｔｍａｎグレード１及び４２をＰＳＩ－ＭＳ分析に使用し、両方の紙が同じ結果を示した（図１７）。安定かつ再現可能なスプレーを生成するために、異なる溶媒及び溶媒混合物を試験した。かなりの数の試験の後、４：１のＨ２Ｏ／ＥｔＯＨを、この特定の研究における最良の結果のための最適化された溶媒系として選択した。紙の先端とＭＳ注入口との間の距離も試行錯誤によって最適化した。ＭＳ注入口から最適な距離に紙の先端を置いた後、４．５μＬの溶媒で溶出した。質量スペクトルを、２秒／スキャンのスキャン速度で２分間記録した。合計６０回のスキャンをさらなるデータ解析に使用した。図１６の挿入図は、ヒト皮脂から収集した代表的な質量スペクトルを示す。ヒト皮脂の質量スペクトルは、１価の荷電ピークからなるより高い質量領域（ｍ／ｚ１２００～１８００）における３つのエンベロープの存在を示す。ＰＳＩ－ＭＳは、血液、尿等の生体液中に存在する小分子を検出するために使用されてきた。この研究は、初めて、皮脂がＰＳＩ－ＭＳのためのサンプリング生体液として使用できること、及びＰＳＩ－ＭＳが＜１２００ｍ／ｚの有意に高い分子量を有する皮膚表面分子の検出を可能にすることを示す。イオンモビリティ質量分析（ＩＭ－ＭＳ）も、これらの高分子量代謝産物をさらに評価するために、具体的には、低分子量脂質について以前に報告されている（ＮＡＴＵＲＥ ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ｜（２０１９）１０：９８５｜ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１４６７－０１９－０８８９７－５）ような立体配座異性体及び同重体構造異性体を分割するために用いた。図１８は、イオンモビリティと質量分析の組み合わせから見出すことができる向上した分離及び診断の特徴（より高い及びより低い質量領域の両方）の例を示す。
図１６は、ＰＳＩ－ＭＳ技術を用いてヒト皮脂試料を分析するための実験ワークフローの概略図を示す。Ｗｈａｔｍａｎグレード１及び４２をＰＳＩ－ＭＳ分析に使用し、両方の紙が同じ結果を示した（図１７）。安定かつ再現可能なスプレーを生成するために、異なる溶媒及び溶媒混合物を試験した。かなりの数の試験の後、４：１のＨ２Ｏ／ＥｔＯＨを、この特定の研究における最良の結果のための最適化された溶媒系として選択した。紙の先端とＭＳ注入口との間の距離も試行錯誤によって最適化した。ＭＳ注入口から最適な距離に紙の先端を置いた後、４．５μＬの溶媒で溶出した。質量スペクトルを、２秒／スキャンのスキャン速度で２分間記録した。合計６０回のスキャンをさらなるデータ解析に使用した。図１６の挿入図は、ヒト皮脂から収集した代表的な質量スペクトルを示す。ヒト皮脂の質量スペクトルは、１価の荷電ピークからなるより高い質量領域（ｍ／ｚ１２００～１８００）における３つのエンベロープの存在を示す。ＰＳＩ－ＭＳは、血液、尿等の生体液中に存在する小分子を検出するために使用されてきた。この研究は、初めて、皮脂がＰＳＩ－ＭＳのためのサンプリング生体液として使用できること、及びＰＳＩ－ＭＳが＜１２００ｍ／ｚの有意に高い分子量を有する皮膚表面分子の検出を可能にすることを示す。イオンモビリティ質量分析（ＩＭ－ＭＳ）も、これらの高分子量代謝産物をさらに評価するために、具体的には、低分子量脂質について以前に報告されている（ＮＡＴＵＲＥ ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ｜（２０１９）１０：９８５｜ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１４６７－０１９－０８８９７－５）ような立体配座異性体及び同重体構造異性体を分割するために用いた。図１８は、イオンモビリティと質量分析の組み合わせから見出すことができる向上した分離及び診断の特徴（より高い及びより低い質量領域の両方）の例を示す。
【0093】
図１８Ａは、異なるイオンの到着時間分布に関する全イオンクロマトグラムを示す。矢印は、ドリフト時間に対する生成されたイオン（脂質として特定される）の明確な分離を示す。図１８Ｂは、単一イオン（ｍ／ｚ６８９．１）の到達時間分布を示す。単一のｍ／ｚ値に対するドリフト時間スケール上の２つのピークの存在は、異性体種の存在の可能性を示す。図１８Ｃは、ドリフト時間対ｍ／ｚプロットを示し、ドットはｍ／ｚ値を表す。挿入図中の（それぞれ１及び２と標識されたボックス中の）ドットは、ドリフト時間スケールで分離されたｍ／ｚ６８９．１（ボックス１で強調表示）及びｍ／ｚ１３９４．８（ボックス２で強調表示）の拡大図を示す。このデータは、ＰＳＩ－ＭＳと組み合わせたＩＭが、ヒト皮脂試料から生成された気相イオンを分離するために使用することができることを示す。
【0094】
同じ条件下ですべての参加者試料からの質量スペクトルを記録した後、データを処理し、先に概説したように統計解析を行った。表６は、本研究のデータ内の統計的に重要な分子の可能性のある分子種とともにｍ／ｚ値を示す。興味深いことに、統計的に重要な分子のリストにおいて優勢であるカルジオリピン（表６においてＣＬとして表される）として知られる一群の分子を特定することが可能であった。
【0095】
【表6(1)】
【表6(2)】
【表6(3)】
【表6(4)】
【0096】
これらの分子を考慮して、ＰＤ試料と対照試料との間で比較研究を行った。これらの分子はＰＤ皮脂において下方制御されることが観察された。図１９は、ＰＤ試料と対照試料との間のｍ／ｚ１６６８及び１５２０（推定上カルジオリピンとして特定される）並びにｍ／ｚ１４５２及び１４５４（推定上ガングリオシドとして特定される）の比較を示す。
【0097】
ＩＭ－ＭＳデータを詳細に見ると、ＰＤ試料において上方制御されたいくつかの種を特定することができた。表７は、これらの種のｍ／ｚ値及びそれぞれのドリフト時間を示す。
【0098】
【表7】
【0099】
図２０は、上記イオンについてのｍ／ｚ対ドリフト時間プロット（データは、３４個のＰＤ試料及び３０個の対照試料にわたって平均した）を示す。矢印は、ＰＤ試料（対照では存在しない）において同じｍ／ｚ値を有するが、異なるドリフト時間を有するイオンを示す。このデータは、パーキンソン病診断のためのイオンモビリティと組み合わせたＰＳＩ－ＭＳの可能性を示す。
【0100】
実施例６ － 昇温脱離ガスクロマトグラフィー質量分析（ＴＤ－ＧＣ－ＭＳ）
計測
ガーゼスワブ（ＨｙｐａＣｏｖｅｒ）を２０ｍＬヘッドスペースバイアルに移し、ニトリルグローブを着用しながらＧｉｌｓｏｎピペットチップを用いて押し下げた。Ｇｅｒｔａｌ ＭｕｌｔｉＰｕｒｐｏｓｅ Ｓａｍｐｌｅｒ（ＭＰＳ）を揮発性化合物の濃縮に使用した。アームは、試料をトレイからダイナミックヘッドスペース（ＤＨＳ）ポートに輸送し、そこで試料をインキュベートし、ヘッドスペースを通して不活性ガスをパージして揮発性化合物を捕集する。Ｔｅｎａｘ吸着剤管（ゲステル、ドイツ）をバイアルの上方に置き、パージガスを通過させて揮発性分析物を捕捉する。次いで、Ｔｅｎａｘを、昇温脱離ユニット（ＴＤＵ）が位置するＧＣ注入口に輸送する。吸着剤管は加熱によって脱離され、揮発性化合物は冷却注入システム（ＣＩＳ）に入り、このシステムは迅速に加熱して分析物がＧＣカラムに均一に注入されることを可能にする。本研究のＱＣは、匂い付き分子の混合物であり、その５μＬをヘッドスペースバイアルにピペットで入れた。本発明者らは、試料をプールすることができなかったので、ＱＣを使用して機器の安定性をチェックした。
計測
ガーゼスワブ（ＨｙｐａＣｏｖｅｒ）を２０ｍＬヘッドスペースバイアルに移し、ニトリルグローブを着用しながらＧｉｌｓｏｎピペットチップを用いて押し下げた。Ｇｅｒｔａｌ ＭｕｌｔｉＰｕｒｐｏｓｅ Ｓａｍｐｌｅｒ（ＭＰＳ）を揮発性化合物の濃縮に使用した。アームは、試料をトレイからダイナミックヘッドスペース（ＤＨＳ）ポートに輸送し、そこで試料をインキュベートし、ヘッドスペースを通して不活性ガスをパージして揮発性化合物を捕集する。Ｔｅｎａｘ吸着剤管（ゲステル、ドイツ）をバイアルの上方に置き、パージガスを通過させて揮発性分析物を捕捉する。次いで、Ｔｅｎａｘを、昇温脱離ユニット（ＴＤＵ）が位置するＧＣ注入口に輸送する。吸着剤管は加熱によって脱離され、揮発性化合物は冷却注入システム（ＣＩＳ）に入り、このシステムは迅速に加熱して分析物がＧＣカラムに均一に注入されることを可能にする。本研究のＱＣは、匂い付き分子の混合物であり、その５μＬをヘッドスペースバイアルにピペットで入れた。本発明者らは、試料をプールすることができなかったので、ＱＣを使用して機器の安定性をチェックした。
【0101】
方法の詳細
ＤＨＳにおいて、試料をインキュベートし、揮発性化合物を濃縮した。バイアルを８０℃で１０分間加熱した。その後、流量７０ｍＬ／分で１０００ｍＬの窒素ガスでパージした。Ｔｅｎａｘ吸着剤管を４０℃に保った。次いで、Ｔｅｎａｘを、スプリットレスモードにあるＴＤＵに輸送した。分析物は、３０℃で１分間、次いで７２０℃／分の速度で２８０℃の温度まで昇温しこの温度で５分間保持する温度プログラムで脱離されてＣＩＳに放出された。ＣＩＳを、８０ｍＬ／分の流量及び１０のスプリット比を使用して溶媒ベントモードで操作した。ＣＩＳの温度は、１０℃で０．０１分間であり、１２℃／秒で２８０℃まで上昇させ、５分間保持した。
ＤＨＳにおいて、試料をインキュベートし、揮発性化合物を濃縮した。バイアルを８０℃で１０分間加熱した。その後、流量７０ｍＬ／分で１０００ｍＬの窒素ガスでパージした。Ｔｅｎａｘ吸着剤管を４０℃に保った。次いで、Ｔｅｎａｘを、スプリットレスモードにあるＴＤＵに輸送した。分析物は、３０℃で１分間、次いで７２０℃／分の速度で２８０℃の温度まで昇温しこの温度で５分間保持する温度プログラムで脱離されてＣＩＳに放出された。ＣＩＳを、８０ｍＬ／分の流量及び１０のスプリット比を使用して溶媒ベントモードで操作した。ＣＩＳの温度は、１０℃で０．０１分間であり、１２℃／秒で２８０℃まで上昇させ、５分間保持した。
【0102】
分析に用いたＧＣは、ＶＦ－５ＭＳカラム（３０ｍ×２５０μｍ×０．２５μｍ）及びキャリアガスとしてヘリウムを用いるアジレント７８９０Ａであった。カラム流量は１ｍｌ／分であり、オーブンプログラムは、４０℃で１分間、２５℃／分で１８０℃まで、８℃／分で２４０℃まで昇温し、この温度で１分間保持し、２０℃／分で３００℃まで昇温し、この温度で２．９分間保持した。総ランタイム（実行時間）は２１分であった。ＧＣを、ＥＩモードで作動するアジレント５９７５ ＭＳに連結した。移送ラインを３００℃に保ち、ソースを２３０℃に、四重極を１５０℃に保った。スキャンした質量範囲は３０～８００ｍ／ｚであった。本研究のＱＣは、可能な限り短い方法で実行しながら、シグナル及び分離を最適化するための変更された方法で実行した。ＤＨＳを８０℃で２分間インキュベートし、２５０ｍＬのガスを５０ｍＬ／分で用いてパージした。ＴＤＵでは、温度プログラムは、３０℃で１分間、次いで６００℃／分で２５０℃まで上昇させ、この温度で３分間保持するというものであった。ＣＩＳは６０ｍＬ／分の流量及び２０のスプリット比を有し、温度は、１０℃で０．１分間、１０℃／秒で２４０℃まで上昇し、この温度で２分間保持した。オーブンプログラムは、４０℃で１．５分間、２４℃／分で２８０℃まで昇温し、２分間保持した（合計１３．５分間）。スキャンした質量範囲は３０～５５０ｍ／ｚであり、移送ラインは２８０℃に保持した。
【0103】
データ処理
ＴＤ－ＧＣ－ＭＳデータを、ＰｒｏｔｅｏＷｉｚａｒｄを使用してオープンソースｍｚＭＬフォーマットに変換した。データセットを、ＲのｅＲａｈパッケージを用いた組織内スクリプトを使用して逆畳み込みしたところ、検出されたピークに帰属された２０６個の特徴が得られた。Ｇｏｌｍデータベースを用いてフラグメントスペクトルを化合物スペクトルと照合することにより、逆畳み込みした分析物に推定特定を帰属させた。得られたマトリクスは、試料当たりの変数及びそれらの対応するピーク面積を含んでいた。すべての試料の５％超に存在しなかった特徴を除去した。得られたデータを総イオンカウントに対して正規化し、対数変換したあとで統計解析を行った。
ＴＤ－ＧＣ－ＭＳデータを、ＰｒｏｔｅｏＷｉｚａｒｄを使用してオープンソースｍｚＭＬフォーマットに変換した。データセットを、ＲのｅＲａｈパッケージを用いた組織内スクリプトを使用して逆畳み込みしたところ、検出されたピークに帰属された２０６個の特徴が得られた。Ｇｏｌｍデータベースを用いてフラグメントスペクトルを化合物スペクトルと照合することにより、逆畳み込みした分析物に推定特定を帰属させた。得られたマトリクスは、試料当たりの変数及びそれらの対応するピーク面積を含んでいた。すべての試料の５％超に存在しなかった特徴を除去した。得られたデータを総イオンカウントに対して正規化し、対数変換したあとで統計解析を行った。
【0104】
結果
ＴＤ－ＧＣ－ＭＳを使用して生成されたすべてのデータを使用して、各ｍ／ｚを別々のイオン種として扱い、クラスタリング技術を使用して、群内の根底にある類似性及び群間の相違性を特定した。教師あり多変量アプローチである主成分判別因子分析を使用した。このアプローチでは、まず主成分を計算してデータの次元を縮小し、続いてこれらの成分の判別分析を行う。これは、分散を維持しながら次元削減をもたらし、識別力は、因子分析を使用してチェックされる。図２１は、観察される３つの異なる表現型の３つの別個のクラスターを示す。これは、ＴＤ－ＧＣ－ＭＳを用いて測定された代謝産物／脂質が、前駆、対照及びＰＤの表現型において異なる特性（強度又は存在／不存在）を有することを示す。これらのデータを用いて機械学習モデル、すなわちサポートベクターマシン（Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｍａｃｈｉｎｅｓ、ＳＶＭ）を作成した。目的は、参加者の皮脂試料のクラスを決定する際に、これらの測定されたｍ／ｚの分類精度を決定することであった。表から、この測定量は７１％及び７４％の正しい分類率で、前駆試料と対照試料及び前駆試料とＰＤ試料とを区別できることが明らかである。これは、前駆症状を有するがＰＤを有さない参加者を皮膚スワブによって明確に区別できることを示す。なお、表現型によって明確に異なる図２２及び２３に示される主に高いｍ／ｚ種があった。
ＴＤ－ＧＣ－ＭＳを使用して生成されたすべてのデータを使用して、各ｍ／ｚを別々のイオン種として扱い、クラスタリング技術を使用して、群内の根底にある類似性及び群間の相違性を特定した。教師あり多変量アプローチである主成分判別因子分析を使用した。このアプローチでは、まず主成分を計算してデータの次元を縮小し、続いてこれらの成分の判別分析を行う。これは、分散を維持しながら次元削減をもたらし、識別力は、因子分析を使用してチェックされる。図２１は、観察される３つの異なる表現型の３つの別個のクラスターを示す。これは、ＴＤ－ＧＣ－ＭＳを用いて測定された代謝産物／脂質が、前駆、対照及びＰＤの表現型において異なる特性（強度又は存在／不存在）を有することを示す。これらのデータを用いて機械学習モデル、すなわちサポートベクターマシン（Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｍａｃｈｉｎｅｓ、ＳＶＭ）を作成した。目的は、参加者の皮脂試料のクラスを決定する際に、これらの測定されたｍ／ｚの分類精度を決定することであった。表から、この測定量は７１％及び７４％の正しい分類率で、前駆試料と対照試料及び前駆試料とＰＤ試料とを区別できることが明らかである。これは、前駆症状を有するがＰＤを有さない参加者を皮膚スワブによって明確に区別できることを示す。なお、表現型によって明確に異なる図２２及び２３に示される主に高いｍ／ｚ種があった。
【0105】
実施例７ － ペーパースプレーイオン化及びイオンモビリティ質量分析（ＰＳＩ－ＩＭ－ＭＳ）
研究参加者
最初に、健常対照由来の皮脂試料を使用して、ペーパースプレーイオン化－イオンモビリティ質量分析（ＰＳＩ－ＩＭ－ＭＳ）のための方法を開発した。このプロジェクト（ＩＲＡＳプロジェクトＩＤ１９１９１７）の倫理的承認は、ＮＨＳ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ（医療研究機構）（ＲＥＣ参照番号：１５／ＳＷ／０３５４）によって得られた。臨床試験データセットについては、皮脂試料をＰＤ（１５）、対照（１４）から収集し、前駆症状参加者（１５）をＩｎｎｓｂｒｕｃｋ（インスブルック）の収集サイトで集めた。
研究参加者
最初に、健常対照由来の皮脂試料を使用して、ペーパースプレーイオン化－イオンモビリティ質量分析（ＰＳＩ－ＩＭ－ＭＳ）のための方法を開発した。このプロジェクト（ＩＲＡＳプロジェクトＩＤ１９１９１７）の倫理的承認は、ＮＨＳ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ（医療研究機構）（ＲＥＣ参照番号：１５／ＳＷ／０３５４）によって得られた。臨床試験データセットについては、皮脂試料をＰＤ（１５）、対照（１４）から収集し、前駆症状参加者（１５）をＩｎｎｓｂｒｕｃｋ（インスブルック）の収集サイトで集めた。
【0106】
試料採取
皮脂試料を、参加者の上背部から医療用Ｑ－ｔｉｐ及びガーゼスワブで採取した。次いで、試料を含むスワブをその個々のキャップ／ジップロック（登録商標）バッグ（ガーゼの場合）内に固定し、密封された封筒内でマンチェスター大学の中央施設に輸送し、そこで分析日まで－８０℃で保存した。
皮脂試料を、参加者の上背部から医療用Ｑ－ｔｉｐ及びガーゼスワブで採取した。次いで、試料を含むスワブをその個々のキャップ／ジップロック（登録商標）バッグ（ガーゼの場合）内に固定し、密封された封筒内でマンチェスター大学の中央施設に輸送し、そこで分析日まで－８０℃で保存した。
【0107】
機器設定
ＰＳＩ ＭＳ測定のために、皮脂試料をＱ－ｔｉｐスワブから三角形の紙の上に穏やかに触れることによって移し、続いてピンセットを使用して銅製のアリゲータークリップに慎重にクリップ留めした。紙の注意深い取り扱いは、汚染を回避するために必須であった。ＰＳＩ ＭＳは、可動ステージに載置した自作のペーパースプレー源を用いて行った。三角形の紙を所望の位置に配置した後、２．５～３ｋＶの範囲の高電圧をそれに印加した。その上昇した電位で極性溶媒で溶出すると、小さな荷電液滴の噴霧プルームが紙の先端で観察され、これを機器ソフトウェアにおいてｍ／ｚシグナルとして記録した。質量スペクトルはすべて、ｍ／ｚ５０～２０００の範囲で記録した。各ＰＳＩ ＭＳ実験の主要な機器パラメータは、キャピラリ電圧３ｋＶ、ソース温度１００℃、サンプリングコーン３０Ｖ及びソースオフセット４０Ｖとして設定した。脱溶媒又はコーンガスは使用しなかった。質量スペクトルを、２秒／スキャンのスキャン速度で２分間記録した。合計６０回のスキャンをさらなるデータ解析に使用した。
ＰＳＩ ＭＳ測定のために、皮脂試料をＱ－ｔｉｐスワブから三角形の紙の上に穏やかに触れることによって移し、続いてピンセットを使用して銅製のアリゲータークリップに慎重にクリップ留めした。紙の注意深い取り扱いは、汚染を回避するために必須であった。ＰＳＩ ＭＳは、可動ステージに載置した自作のペーパースプレー源を用いて行った。三角形の紙を所望の位置に配置した後、２．５～３ｋＶの範囲の高電圧をそれに印加した。その上昇した電位で極性溶媒で溶出すると、小さな荷電液滴の噴霧プルームが紙の先端で観察され、これを機器ソフトウェアにおいてｍ／ｚシグナルとして記録した。質量スペクトルはすべて、ｍ／ｚ５０～２０００の範囲で記録した。各ＰＳＩ ＭＳ実験の主要な機器パラメータは、キャピラリ電圧３ｋＶ、ソース温度１００℃、サンプリングコーン３０Ｖ及びソースオフセット４０Ｖとして設定した。脱溶媒又はコーンガスは使用しなかった。質量スペクトルを、２秒／スキャンのスキャン速度で２分間記録した。合計６０回のスキャンをさらなるデータ解析に使用した。
【0108】
データ処理
同じ条件下ですべての参加者試料からのＩＭ ＭＳデータを記録した後に、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ＱＩ（ウォーターズ、英国、ウィルムスロー（Ｗｉｌｍｓｌｏｗ））を用いて生データを逆畳み込みした。ピークピッキング、アラインメント、及び面積正規化を、パラメータのセットによって選択された、データセット内の最良の候補試料を参照して行った。ピークピッキング限界は、シグナル対ノイズ比とのバランスを保つために、デフォルトノイズレベルで自動に設定した。クロマトグラフィーピークの幅はこの直接注入データに適用しなかったが、しかしながら、注入の０．１分前及び注入の１．４分後のイオンは、再現性のあるシグナルのみを保持するために処理中に無視した。これらのパラメータを使用して、合計４１５０の特徴が見出された。生データから抽出された特徴は、Ｈｕｍａｎ Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＨＭＤＢ）及びＬｉｐｉｄＭａｐｓを用いた質量マッチを用いて注釈を付けた。
同じ条件下ですべての参加者試料からのＩＭ ＭＳデータを記録した後に、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ＱＩ（ウォーターズ、英国、ウィルムスロー（Ｗｉｌｍｓｌｏｗ））を用いて生データを逆畳み込みした。ピークピッキング、アラインメント、及び面積正規化を、パラメータのセットによって選択された、データセット内の最良の候補試料を参照して行った。ピークピッキング限界は、シグナル対ノイズ比とのバランスを保つために、デフォルトノイズレベルで自動に設定した。クロマトグラフィーピークの幅はこの直接注入データに適用しなかったが、しかしながら、注入の０．１分前及び注入の１．４分後のイオンは、再現性のあるシグナルのみを保持するために処理中に無視した。これらのパラメータを使用して、合計４１５０の特徴が見出された。生データから抽出された特徴は、Ｈｕｍａｎ Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＨＭＤＢ）及びＬｉｐｉｄＭａｐｓを用いた質量マッチを用いて注釈を付けた。
【0109】
方法
ＰＳＩ ＭＳを用いて皮脂試料の質量スペクトルを測定する再現性のある方法を、経験的アプローチを用いて開発した。方法開発の重要な部分は、Ｑ－ｔｉｐから紙基材への試料移動であった。２つの方法を試験した。まず、「タッチアンドロール」アプローチで三角形の紙に直接移動し、続いてそこからＰＳＩ ＭＳを記録し、あるいはサンプリングしたＱ－ｔｉｐをエタノール（８００μＬ）中で５秒間ボルテックス混合することによる急速溶媒抽出を行った。第２の場合において、ＰＳＩ ＭＳを、抽出した溶液から測定した。図２１は、これらの２つのアプローチを使用して収集した質量スペクトルを示し、これは、タッチアンドロール移動質量スペクトルにおけるより高い質量分子（ｍ／ｚ１２００～２０００の間）の存在を明確に示す（図２２Ｂ）。他方、これらの高質量分子は、溶媒抽出物に対応する質量スペクトルには存在しなかった（図２２Ａ）。これには以下の２つの理由が推測できる。抽出時間は、存在するすべての代謝産物を完全に抽出するには短すぎたか、又はこれらのより大きい分子のより小さなフラグメントへの分解のためであった。従って、タッチアンドロールアプローチを、ＰＳＩ ＭＳを用いたすべてのさらなる皮脂分析のために選択した。
ＰＳＩ ＭＳを用いて皮脂試料の質量スペクトルを測定する再現性のある方法を、経験的アプローチを用いて開発した。方法開発の重要な部分は、Ｑ－ｔｉｐから紙基材への試料移動であった。２つの方法を試験した。まず、「タッチアンドロール」アプローチで三角形の紙に直接移動し、続いてそこからＰＳＩ ＭＳを記録し、あるいはサンプリングしたＱ－ｔｉｐをエタノール（８００μＬ）中で５秒間ボルテックス混合することによる急速溶媒抽出を行った。第２の場合において、ＰＳＩ ＭＳを、抽出した溶液から測定した。図２１は、これらの２つのアプローチを使用して収集した質量スペクトルを示し、これは、タッチアンドロール移動質量スペクトルにおけるより高い質量分子（ｍ／ｚ１２００～２０００の間）の存在を明確に示す（図２２Ｂ）。他方、これらの高質量分子は、溶媒抽出物に対応する質量スペクトルには存在しなかった（図２２Ａ）。これには以下の２つの理由が推測できる。抽出時間は、存在するすべての代謝産物を完全に抽出するには短すぎたか、又はこれらのより大きい分子のより小さなフラグメントへの分解のためであった。従って、タッチアンドロールアプローチを、ＰＳＩ ＭＳを用いたすべてのさらなる皮脂分析のために選択した。
【0110】
ヒト皮脂の質量スペクトルは、より高い質量領域（ｍ／ｚ７００～１８００）における１価の荷電種の３つのエンベロープの存在を示す。これらのエンベロープは、１４Ｄａだけ異なる一連のピークであった。ｍ／ｚ領域８００～１０００における拡大質量スペクトルを図２３に示す。
【0111】
イオンモビリティ質量分析（ＩＭ ＭＳ）を用いて、これらの高分子量代謝産物をさらに評価し、具体的には、低分子量脂質について以前に報告されているような立体配座異性体及び同重体構造異性体を分割した。興味深いことに、本発明者らは、（ＰＤ、対照、及び前駆のコホートの間で（ｐ＜０．０５））統計的に重要な分子のリストにおいて脂質として公知である一群の分子が優勢であることを特定することができた。これらは、合計４１５０個の逆畳み込みされた特徴のうちの５００個の特徴であった。統計的に重要な分子についてのドリフト時間対ｍ／ｚ（ＤＴ対ｍ／ｚ）プロットを分析しているうちに、ＰＤ、対照、及び前駆の試料の間の有意差が、ある群の分子（脂質として特定された。これを支持するデータは、後の部分で論じられる）について観察された。
【0112】
上記の分析から、統計的に重要な特徴（ｐ＜０．０５）のサブセットは、ＰＤ試料及び前駆試料にのみ存在し、対照には存在しない特定のｍ／ｚ値でドリフト時間ピークを有することが特定された。図２４は、ＰＤ（青色ボックス）及び対照（マゼンタボックス）、並びに前駆（オレンジボックス）の試料についてのｍ／ｚ７００～９００領域における三次元ＤＴ対ｍ／ｚプロットのいくつかの例を示す。赤色矢印は、特定の分子種がＰＤ試料及び前駆試料において観察されたが、対照試料には存在しなかった特定のドリフト時間（６．６７ｍｓ）を示す。図２４のピークのクラスターは、単一イオンの同位体分布を表す。より高いドリフト時間（１０．４３ｍｓ）におけるピークは、１価の荷電モノマー種の同位体分布を表し、ＰＤ試料及び前駆試料の場合のより低いドリフト時間（６．６７ｍｓ）におけるトレースは、２＋電荷を有するダイマー種の付加物に対応する。イオンの荷電状態はイオンモビリティ分離における主要な因子であるので、より短いＤＴ種が二量体であるにもかかわらず、それはドリフト管を通ってより迅速に移動し、より低いドリフト時間で現れる。図２５は、ｍ／ｚ８４３．７０７４における種について抽出された到着時間分布プロットを対応する質量スペクトルと共に示す。拡大した質量スペクトル（図２５Ｄ）は、６．６７ｍｓのドリフト時間を有する２価の荷電イオンが、１０．４２ｍｓのドリフト時間を有する１価の荷電イオンの二量体種であることを証明するために提示される。３つのクラスの間のこの強力な視覚的差異は、パーキンソン病の迅速な診断のためのツールとしてのＩＭと組み合わせたＰＳＩ ＭＳの可能性を意味する。
【0113】
統計的に重要な特徴についてのｍ／ｚ値を公開されたデータベースに対して照合して、主にホスファチジルコリン及びカルジオリピンの群に属する複数の群の脂質の推定特定を明らかにした。それゆえ、タンデム質量分析研究を実施して、これらの推定注釈における信頼を高めた。これらの実験のために、Ｌ－α－ホスファチジルコリン（脳、ブタ）（ＰＣ）、Ｌ－α－ホスファチジルセリン（脳、ブタ）（ナトリウム塩）（ＰＳ）、１４：１カルジオリピン、及び１８：１カルジオリピン（ＣＬ）を含む様々な市販の天然脂質を購入した。ＰＳＩ ＭＳを使用して、これらの脂質のＭＳ／ＭＳスペクトルを記録した。ＣＨＩ３／ＭｅＯＨ中のＰＣの１ｍＭ溶液、ＣＨＣｌ３中のＰＳ、及びＭｅＯＨ中のＣＬをタンデム質量分析測定に使用した。図２６Ａ～Ｃは、それぞれＰＣ、ＰＳ及びＣＬのＭＳ２スペクトルを示す。すべての場合において、それぞれの脂質クラスについて極性頭部基の質量に対応するフラグメントイオンが観察された（図２６Ａ～Ｃでは赤色で強調されている）。これは、タンデム質量分析を用いた特定のための脂質クラスのフィンガープリントとみなすことができる。
【0114】
異なる脂質のフラグメント化パターンを理解した後、ＭＳ２スペクトルを、皮脂試料について記録し、ｍ／ｚ７００～９００領域において異なるイオンを選択した。図２６Ｄ～Ｆは、分離され、続いて衝突誘起解離（ＣＩＤ）を使用してフラグメント化されたｍ／ｚ７６０．００、８３９．７５、及び８６５．７７における種の３つの例を示す。これらのすべての場合において、ＭＳ２スペクトルにおいてｍ／ｚ２０２．２３のフラグメントイオンが観察され、これはｍ／ｚ１８４．０８（ＰＣのコリン頭部基）の水性付加物に対応する可能性があった。従って、この推測を証明するために、ｍ／ｚ２０２．２３のさらなる検討が必要であった。本発明者らは、Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２－Ｓｉ機器でＭＳ３実験を行うことができないので、ソース内フラグメント化アプローチを実施して、ｍ／ｚ２０２．２３の種のさらなるフラグメントを生成した。この実験では、皮脂中に存在する代謝産物のソース内フラグメント化を促進するために、温度及びコーン電圧を上昇させた（過酷な条件）。ｍ／ｚ２０２．２３の種がこれらの条件下で存在することを確認し、次いでこの種を質量分離し、ＣＩＤを使用してフラグメント化した。これを図２６Ｇに示す。ｍ／ｚ１８４．１１におけるピークの存在は、ＰＣ脂質の頭部基の喪失に対応する１８Ｄａの喪失に等しい。このデータは、ｍ／ｚ２０２．２３で観察されたフラグメントイオンがＰＣのコリン頭部基の水性付加物であり、皮脂のＰＳＩ ＭＳ中にｍ／ｚ７００～９００領域で観察された脂質分子がホスファチジルコリン脂質クラスに属することを証明している。正確な質量測定も、上記の記述を支持する。正確な質量測定の前に、１ｐｐｍの質量誤差閾値を用いて機器を較正した。図２６Ｄの挿入図は、化学式Ｃ４２Ｏ８Ｈ８３ＰＮを有するホスファチジルコリン分子に対応するｍ／ｚ７６０．５９９０におけるピークの拡大図を示す。より高い分子量ピークに対するＭＳ２も行った。図２７は、ｍ／ｚ１５００～１７００領域における選択したイオンのＭＳ２スペクトルを示す（脂質様特徴を有するピークの別のエンベロープ）。タンデム質量スペクトルは、標品ＣＬ（１８：１カルジオリピン）のフラグメント化パターン（図２６Ｃ）と一致するｍ／ｚ７５０～９００領域の範囲内のフラグメントイオンピークを示す。これら２つの間の唯一の違いは、皮脂の場合であり、その領域におけるフラグメントピークのアレイが見られる。この観察は、皮脂が異なる分子の複雑な混合物であるという事実に起因しうる。皮脂が、観察されるフラグメントイオンのアレイに寄与する密接に関連する化学構造を有する複数のＣＬを含有しうるという機会がある。皮脂の場合、極性頭部基の質量（図２６Ｃのｍ／ｚ２９６．９）に似たフラグメントイオンは見えなかったが、それは異なるｍ／ｚ値で付加物として存在しうる可能性が高い。例えば、ｍ／ｚ３６５．２９で観察されたフラグメントイオンは、［ＣＬ＋Ｎａ＋Ｋ＋３Ｈ２Ｏの頭部基］＋であることが可能である。フラグメントイオンのより良好な特定には、注意深いＭＳｎ実験が必要である。しかし、ＣＬ標品に一致するこれらのより高質量の分子のフラグメントパターン及びオンラインデータベース検索報告から、それらがＣＬであると推測する。上記のデータから、及びオンラインデータベース検索レポートから、本発明者らは、それらをＣＬであると推測される。上記のデータから、ＰＣ及びＣＬが、ＰＳＩ ＩＭ ＭＳを使用して特定することができる皮脂の重要な成分であり、パーキンソン症状を有する参加者の場合において対照的であることが明らかであった。従って、ＩＭと組み合わせたＰＳＩ ＭＳは、非常に早期のパーキンソン病の迅速な診断のための効率的なツールとして使用することができる。
【0115】
実施例８ － 皮膚からの迅速なサンプリングを介して観察されたＣＯＶＩＤ－１９感染時の皮脂リピドームの変化
緒言
新規なコロナウイルスであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）によって、２０１９年後半に中国の武漢（Ｗｕｈａｎ）市に端を発するものとして特定され［４０～４１］、新型コロナウイルス感染症（Ｃｏｒｏｎａ Ｖｉｒｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９、ＣＯＶＩＤ－１９）を引き起こした。アウトブレイク（突発的発生）を防ぎ、入院を減らすために、集団検査は、世界保健機関によって、ＣＯＶＩＤ－１９に対する格闘における鍵となる武器として特定されている［４２］。検査への現在のアプローチは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して上気道から採取したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＲＮＡの検出を必要とする。これらのタイプの検査は容易に展開可能であり、ウイルスに対して高度に選択的であるが、有意な割合の偽陰性事象の問題も抱える。加えて、試薬の不足は、必要とされる検査の規模にとって問題となりうる。さらには、現在展開されているアプローチは、予後情報を持たない。
緒言
新規なコロナウイルスであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）によって、２０１９年後半に中国の武漢（Ｗｕｈａｎ）市に端を発するものとして特定され［４０～４１］、新型コロナウイルス感染症（Ｃｏｒｏｎａ Ｖｉｒｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９、ＣＯＶＩＤ－１９）を引き起こした。アウトブレイク（突発的発生）を防ぎ、入院を減らすために、集団検査は、世界保健機関によって、ＣＯＶＩＤ－１９に対する格闘における鍵となる武器として特定されている［４２］。検査への現在のアプローチは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して上気道から採取したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＲＮＡの検出を必要とする。これらのタイプの検査は容易に展開可能であり、ウイルスに対して高度に選択的であるが、有意な割合の偽陰性事象の問題も抱える。加えて、試薬の不足は、必要とされる検査の規模にとって問題となりうる。さらには、現在展開されているアプローチは、予後情報を持たない。
【0116】
（ウイルス自体の直接測定とは対照的に）宿主に対するウイルスの効果を測定するアプローチは、臨床又は集団検査の場面において補完的解決策を提供する可能性がある。例えば、ある実現可能性調査（フィジビリティスタディ）は、ＣＯＶＩＤ－１９患者における呼気生化学の乱れを最近特定した［４３］。コロナウイルスは繁殖のために脂質を必要とするので、ＣＯＶＩＤ－１９はリピドームを破壊すると予想することができる［４４］。リピドームの調節不全の証拠は、血漿の分析を介してＣＯＶＩＤ－１９を有する患者において観察されている［４５～４８］。皮膚の調節不全は、イヌがＣＯＶＩＤ－１９陽性及び陰性をにおいによって区別する能力とも一致する［４９］。それゆえ、リピドミクスは、ＣＯＶＩＤ－１９をよりよく理解するため、及び潜在的にＣＯＶＩＤ－１９の診断のための有望な経路を提供する。皮脂は、皮脂腺によって分泌される生体液であり、脂質が豊富である。試料は、皮脂が豊富な皮膚領域（例えば、顔面、首又は背中）の穏やかなスワブ（拭き取り）を介して、容易にかつ非侵襲的に収集することができる。特徴的な特徴は、パーキンソン病及び１型糖尿病等の限られた数の疾患の皮脂から以前に特定されている［５０～５２］。加えて、バリア機能における皮脂の役割のメカニズムは完全には記載されていないが、皮脂脂質は直接的に、また共生細菌相互作用を介してもバリア機能する。脂質調節不全は、皮膚の健康に関与する［５３］。本研究において、本発明者らは、検査のための非侵襲的サンプリング媒体としての皮脂の将来的な使用を調査すること、並びにサンプリングマトリクスとしての皮脂の理解を拡大することを目的として、ＣＯＶＩＤ－１９を有する患者及び有さない患者についての皮脂脂質プロファイルの差異を調査した。
【0117】
２０２０年５月に、いくつかの英国の団体は、資源をプールし、ＣＯＶＩＤ－１９国際質量分析（ＭＳ）連携（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ （ＭＳ） Ｃｏａｌｉｔｉｏｎ）を形成する意向を公表した［５４］。このコンソーシアムは、感染したヒトにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に関する分子レベルの情報を提供するという近位の目標と、ＣＯＶＩＤ－１９感染症の症例をより良好に診断及び処置するための代謝経路に対する新型コロナウイルスの影響を理解するという遠位の目標とを有する。この作業は、ＣＯＶＩＤ－１９ ＭＳ連携（Ｃｏａｌｉｔｉｏｎ）の一部として行われ、すべてのデータは、ＭＳ連携オープンリポジトリに格納され、完全にアクセス可能である。
【0118】
方法
参加者の動員及び倫理
このプロジェクト（ＩＲＡＳプロジェクトＩＤ１５５９２１）の倫理的承認は、ＮＨＳ医療研究機構（ＲＥＣ参照番号：１４／ＬＯ／１２２１）を介して得た。この研究に含まれる参加者は、ＮＨＳフリムリー・パークＮＨＳ基幹病院（ＮＨＳ Ｆｒｉｍｌｅｙ Ｐａｒｋ ＮＨＳ Ｔｒｕｓｔ）で募集され、合計６７人の参加者があった。試料の収集は、サリー大学・フリムリー・パークＮＨＳ基幹病院（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｕｒｒｅｙ ａｔ Ｆｒｉｍｌｅｙ Ｐａｒｋ ＮＨＳ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｔｒｕｓｔ ｈｏｓｐｉｔａｌｓ）からの研究者によって行われた。参加者は、臨床スタッフによって特定されて、彼らが研究に同意する能力を有することが確認され、インフォームドコンセントフォームに署名するように依頼された。この能力を有さないものはサンプリングしなかった。同意する参加者は、病院によって、「クエリーＣＯＶＩＤ」（ＣＯＶＩＤ－１９感染の臨床的疑いがあったことを意味する）又は「ＣＯＶＩＤ陽性」（陽性のＣＯＶＩＤ検査結果が入院中に記録されたことを意味する）のいずれかに分類された。すべての参加者は、研究の目標を説明する患者情報シート（Ｐａｔｉｅｎｔ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｈｅｅｔ）を提供された。
参加者の動員及び倫理
このプロジェクト（ＩＲＡＳプロジェクトＩＤ１５５９２１）の倫理的承認は、ＮＨＳ医療研究機構（ＲＥＣ参照番号：１４／ＬＯ／１２２１）を介して得た。この研究に含まれる参加者は、ＮＨＳフリムリー・パークＮＨＳ基幹病院（ＮＨＳ Ｆｒｉｍｌｅｙ Ｐａｒｋ ＮＨＳ Ｔｒｕｓｔ）で募集され、合計６７人の参加者があった。試料の収集は、サリー大学・フリムリー・パークＮＨＳ基幹病院（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｕｒｒｅｙ ａｔ Ｆｒｉｍｌｅｙ Ｐａｒｋ ＮＨＳ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｔｒｕｓｔ ｈｏｓｐｉｔａｌｓ）からの研究者によって行われた。参加者は、臨床スタッフによって特定されて、彼らが研究に同意する能力を有することが確認され、インフォームドコンセントフォームに署名するように依頼された。この能力を有さないものはサンプリングしなかった。同意する参加者は、病院によって、「クエリーＣＯＶＩＤ」（ＣＯＶＩＤ－１９感染の臨床的疑いがあったことを意味する）又は「ＣＯＶＩＤ陽性」（陽性のＣＯＶＩＤ検査結果が入院中に記録されたことを意味する）のいずれかに分類された。すべての参加者は、研究の目標を説明する患者情報シート（Ｐａｔｉｅｎｔ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｈｅｅｔ）を提供された。
【0119】
試料採取、不活化及び抽出
患者は、研究に動員された直後にサンプリングされた。これは、症状の発症と皮脂サンプリングとの間の時間の範囲が１日から１ヶ月超の範囲にあり、これは、パンデミック状況において試料を収集することの不可避的な結果であることを意味する。各参加者は、４プライのスワブを作成するために各々が２回折り畳まれた１５ｃｍ×７．５ｃｍのガーゼを使用して、背上部の右側でスワブされた。サンプリングの表面積は約５ｃｍ×５ｃｍであり、スワブを上背部にわたって１０秒間移動させながら圧力を均一に加えた。このガーゼをＳｔｅｒｉｌｉｎポリスチレン３０ｍＬユニバーサル容器に入れた。
患者は、研究に動員された直後にサンプリングされた。これは、症状の発症と皮脂サンプリングとの間の時間の範囲が１日から１ヶ月超の範囲にあり、これは、パンデミック状況において試料を収集することの不可避的な結果であることを意味する。各参加者は、４プライのスワブを作成するために各々が２回折り畳まれた１５ｃｍ×７．５ｃｍのガーゼを使用して、背上部の右側でスワブされた。サンプリングの表面積は約５ｃｍ×５ｃｍであり、スワブを上背部にわたって１０秒間移動させながら圧力を均一に加えた。このガーゼをＳｔｅｒｉｌｉｎポリスチレン３０ｍＬユニバーサル容器に入れた。
【0120】
試料を採取の４時間以内に宅配便業者によって病院からサリー大学に移し、その後、試料を室温で７日間隔離してウイルス不活化を可能にした。最後に、バイアルを、必要になるまで－８０℃の保存場所に移した。皮脂採取に加えて、とりわけ、性別、年齢、併存疾患（参加者が治療を受けたかどうかに基づく）、ＣＯＶＩＤ ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）検査の結果及び日付、両側胸部Ｘ線変化、喫煙状態、並びに参加者がＣＯＶＩＤ－１９の臨床症状を呈したかどうかを網羅する、すべての参加者のメタデータも収集した。リンパ球、ＣＲＰ及び好酸球の値も取り込み、本研究では入院期間中の最も極端な値を記録した。これらは、皮脂試料と同時には収集されなかった。
【0121】
得られた試料の抽出、保存及び再構成は、Ｓｉｎｃｌａｉｒ Ｅ、Ｔｒｉｖｅｄｉ Ｄ、Ｓａｒｋａｒ Ｄら［５５］に従った。試料を５日間にわたって分析した。各日は、溶媒ブランク注入（ｎ＝５）、プールされたＱＣ注入（ｎ＝３）、続いて、６回の注入毎に１回のプールされたＱＣ注入を伴う１６の参加者試料（各々の３回の注入）を組み込むランからなった。各日のランは、プールされたＱＣ注入（ｎ＝２）及び溶媒ブランク（ｎ＝３）で完了した。フィールドブランクの三連注入も得た。
【0122】
機器及びソフトウェア
試料の分析は、サリー大学のイオンビームセンター（Ｉｏｎ Ｂｅａｍ Ｃｅｎｔｒｅ）のＯｒｂｉｔｒａｐ Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ質量分析計（サーモフィッシャーサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、英国）に連結された、バイナリー溶媒マネージャー、カラムコンパートメント及びオートサンプラーを備えたＤｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＨＰＬＣモジュールを用いて行った。クロマトグラフィー分離は、５５℃で操作したウォーターズＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（１．７μｍ、２．１ｍｍ×１００ｍｍ）で流量０．３ｍｌ・ｍｉｎ－１で行った。
試料の分析は、サリー大学のイオンビームセンター（Ｉｏｎ Ｂｅａｍ Ｃｅｎｔｒｅ）のＯｒｂｉｔｒａｐ Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ質量分析計（サーモフィッシャーサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、英国）に連結された、バイナリー溶媒マネージャー、カラムコンパートメント及びオートサンプラーを備えたＤｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＨＰＬＣモジュールを用いて行った。クロマトグラフィー分離は、５５℃で操作したウォーターズＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（１．７μｍ、２．１ｍｍ×１００ｍｍ）で流量０．３ｍｌ・ｍｉｎ－１で行った。
【0123】
移動相は以下の通りであった。移動相Ａは、０．１％ギ酸を含むアセトニトリル：水（ｖ／ｖ６０：４０）であり、移動相Ｂは、０．１％ギ酸（ｖ／ｖ）を含む２－プロパノール：アセトニトリル（ｖ／ｖ、９０：１０）であった。５μＬの注入量を使用した。最初の溶媒混合物は４０％Ｂであり、１分かけて５０％Ｂに増加し、次いで３．６分で６９％Ｂに増加し、１２分で８８％Ｂに最終上昇した。勾配を４０％Ｂに戻し、２分間保持してカラム平衡化させた。Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ質量分析計での分析は、１５０ｍ／ｚ～２０００ｍ／ｚの全スキャン範囲及び５ｐｐｍの質量精度で分割スキャンモードで実施した。特定された特徴の数を最大にしながら、ｍ／ｚ範囲を１５０～２０００ｍ／ｚに拡張するために、スプリットスキャンを選択した［５６～５７］。データ依存取得モードを使用して、プールしたＱＣ試料に対して特徴のＭＳ／ＭＳ検証を行った。動作条件を図３８に要約する。
【0124】
材料及び化学物質
この研究で利用した材料及び溶媒は以下の通りであった。ガーゼスワブ（リライアンス・メディカル（Ｒｅｌｉａｎｃｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）、英国）、３０ｍＬ Ｓｔｅｒｉｌｉｎ（商標）チューブ（サーモサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、英国）、１０ｍＬシリンジ（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、スペイン）、２ｍＬ微量遠心チューブ（エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、英国）、０．２μｍシリンジフィルター（コーニング・インコーポレーテッド（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、米国）、２００μＬマイクロピペットチップ（スターラボ（Ｓｔａｒｌａｂ）、英国）及びＱｓｅｒｔ（商標）透明ガラスインサートＬＣバイアル（スペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）、英国）。Ｏｐｔｉｍａ（商標）（ＬＣ－ＭＳ）グレードのメタノールを抽出溶媒として使用し、Ｏｐｔｉｍａ（商標）（ＬＣ－ＭＳ）グレードのメタノール、エタノール、アセトニトリル及び２－プロパノールを使用して注入溶媒及び移動相を調製した。ギ酸を移動相溶媒に０．１％（ｖ／ｖ）で添加した。溶媒はフィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、英国から購入した。
この研究で利用した材料及び溶媒は以下の通りであった。ガーゼスワブ（リライアンス・メディカル（Ｒｅｌｉａｎｃｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）、英国）、３０ｍＬ Ｓｔｅｒｉｌｉｎ（商標）チューブ（サーモサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、英国）、１０ｍＬシリンジ（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、スペイン）、２ｍＬ微量遠心チューブ（エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、英国）、０．２μｍシリンジフィルター（コーニング・インコーポレーテッド（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、米国）、２００μＬマイクロピペットチップ（スターラボ（Ｓｔａｒｌａｂ）、英国）及びＱｓｅｒｔ（商標）透明ガラスインサートＬＣバイアル（スペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）、英国）。Ｏｐｔｉｍａ（商標）（ＬＣ－ＭＳ）グレードのメタノールを抽出溶媒として使用し、Ｏｐｔｉｍａ（商標）（ＬＣ－ＭＳ）グレードのメタノール、エタノール、アセトニトリル及び２－プロパノールを使用して注入溶媒及び移動相を調製した。ギ酸を移動相溶媒に０．１％（ｖ／ｖ）で添加した。溶媒はフィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、英国から購入した。
【0125】
データ処理
ＬＣ－ＭＳデータのための非プラットフォーム依存的な小分子発見分析ソフトウェアであるＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ＱＩ（Ｎｏｎ－Ｌｉｎｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、ウォーターズ、ウィルムスロー、英国）を使用して、アライメント、正規化及びピーク特定のためにＬＣ－ＭＳ出力（．ｒａｗファイル）を前処理した。ピークピッキング（質量許容差±５ｐｐｍ）、アラインメント（ＲＴウィンドウ±１５秒）及び面積正規化を、プールしたＱＣ試料に対して行った。ＭＳにおいて特定された特徴には、最初に、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ＱＩのＬｉｐｉｄ Ｂｌａｓｔとの正確な質量マッチを使用して注釈を付けたが、検証は、ＬｉｐｉｄＳｅａｒｃｈ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、英国）及びＣｏｍｐｏｕｎｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、英国）を使用するデータ依存的ＭＳ／ＭＳ分析を使用して実施した。このプロセスは、１４，１６０の特徴を有する初期ピーク表をもたらした。すべてのプールされたＱＣにわたる分散係数が２０％を超えるすべての特徴を除去し、プールされたＱＣ注入の少なくとも９０％に存在しなかったものも同様にした。次いで、これらの特徴をフィールドブランク調整した。３×未満のシグナル対ノイズ比を有するすべての特徴も除外した。残りの９９８個の特徴のセットは、ロバストであり、再現可能であり、フィールドブランクに見られるものとは適切に異なるとみなした。
ＬＣ－ＭＳデータのための非プラットフォーム依存的な小分子発見分析ソフトウェアであるＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ＱＩ（Ｎｏｎ－Ｌｉｎｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、ウォーターズ、ウィルムスロー、英国）を使用して、アライメント、正規化及びピーク特定のためにＬＣ－ＭＳ出力（．ｒａｗファイル）を前処理した。ピークピッキング（質量許容差±５ｐｐｍ）、アラインメント（ＲＴウィンドウ±１５秒）及び面積正規化を、プールしたＱＣ試料に対して行った。ＭＳにおいて特定された特徴には、最初に、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ＱＩのＬｉｐｉｄ Ｂｌａｓｔとの正確な質量マッチを使用して注釈を付けたが、検証は、ＬｉｐｉｄＳｅａｒｃｈ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、英国）及びＣｏｍｐｏｕｎｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、英国）を使用するデータ依存的ＭＳ／ＭＳ分析を使用して実施した。このプロセスは、１４，１６０の特徴を有する初期ピーク表をもたらした。すべてのプールされたＱＣにわたる分散係数が２０％を超えるすべての特徴を除去し、プールされたＱＣ注入の少なくとも９０％に存在しなかったものも同様にした。次いで、これらの特徴をフィールドブランク調整した。３×未満のシグナル対ノイズ比を有するすべての特徴も除外した。残りの９９８個の特徴のセットは、ロバストであり、再現可能であり、フィールドブランクに見られるものとは適切に異なるとみなした。
【0126】
組入れ基準を参加者データにも適用し、メタデータの完全な完了、及びＰＣＲ ＣＯＶＩＤ－１９検査の結果（Ｙ／Ｎ）とＣＯＶＩＤ－１９の臨床診断（Ｙ／Ｎ）との間の一致の両方を必要とした。これらの組入れ基準は参加者の総数をｎ＝８７からｎ＝６７に減少させたが、これは、統計モデルの開発を混乱させる誤診の可能性を考えると価値があると考えられた。
【0127】
統計解析
パレートスケーリングしたピーク：面積マトリクスのデータ処理及び解析は、統計的プログラミング言語Ｒ［５９］でユーザによって書き込まれたスクリプトによって補足されたＲパッケージｍｉｘＯｍｉｃｓ［５８］の組み合わせによって行った。ＰＬＳ－ＤＡをデータの分類及び予測に使用した。分離及び分類は観察間のマハラノビス距離に基づいた。一個抜き交差検証をＰＬＳ－ＤＡモデル検証に使用して、精度、感度及び特異度を検定した。射影における変数重要度（ＶＩＰ）スコアを使用して特徴の有意性を評価した。
パレートスケーリングしたピーク：面積マトリクスのデータ処理及び解析は、統計的プログラミング言語Ｒ［５９］でユーザによって書き込まれたスクリプトによって補足されたＲパッケージｍｉｘＯｍｉｃｓ［５８］の組み合わせによって行った。ＰＬＳ－ＤＡをデータの分類及び予測に使用した。分離及び分類は観察間のマハラノビス距離に基づいた。一個抜き交差検証をＰＬＳ－ＤＡモデル検証に使用して、精度、感度及び特異度を検定した。射影における変数重要度（ＶＩＰ）スコアを使用して特徴の有意性を評価した。
【0128】
結果
集団メタデータ概観
この研究において分析した研究集団は、６７人の参加者を含んでおり、内訳は、ＣＯＶＩＤ－１９臨床症状（及び関連する陽性ＣＯＶＩＤ－１９ ＲＴ－ＰＣＲ検査）を呈する３０人の参加者及びそれを呈しない３７人の参加者であった。メタデータの概要を図２９に示す。
集団メタデータ概観
この研究において分析した研究集団は、６７人の参加者を含んでおり、内訳は、ＣＯＶＩＤ－１９臨床症状（及び関連する陽性ＣＯＶＩＤ－１９ ＲＴ－ＰＣＲ検査）を呈する３０人の参加者及びそれを呈しない３７人の参加者であった。メタデータの概要を図２９に示す。
【0129】
ＣＯＶＩＤ－１９陽性群（Ｍ：Ｆ比０．５７）において、参加者集団全体（Ｍ：Ｆ比０．５２）と比較して、男性参加者がより多かった。病院環境において動員が行われたことをふまえると、これは男性間の重症度の増加を反映している可能性がある［６０］。ＣＯＶＩＤ－１９陽性コホート及び陰性コホートの年齢分布はほぼ同一であった（平均年齢はそれぞれ６４．７歳及び６５．０歳である）。併存疾患は、入院及びＣＯＶＩＤ－１９感染のより重篤な転帰の両方に関連するが、参加者のメタボロームも変化させ、原因因子及び交絡因子の両方を表す。これらの併存疾患の分類精度に対する影響は、分離が改善したかどうかを調べるために、参加者データを併存疾患によって層別化することによって検定した。このプロセスは、以下の節で説明する。このパイロット研究において、併存疾患は、ＣＯＶＩＤ－１９陰性参加者のコホートよりもＣＯＶＩＤ－１９陽性参加者のコホートにおいてあまりよく表れなかった。
【0130】
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）のレベルはＣＯＶＩＤ－１９参加者で有意に高かったが、リンパ球及び好酸球レベルは低かった。ＣＲＰ指標に対する両側マン－ホイットニーＵ検定は、０．０３１のｐ値を提供し、リンパ球に対して０．００４のｐ値を提供した。効果量（ｅｆｆｅｃｔ ｓｉｚｅ）（コーエン（Ｃｏｈｅｎ）のＤにより計算）は、それぞれ０．５６及び０．８５であった。ＣＯＶＩＤ－１９陽性参加者は、両側胸部Ｘ線変化を呈する可能性も高かった（３０人のＣＯＶＩＤ－１９陽性患者のうち２１人に対して、３７人のＣＯＶＩＤ－１９陰性患者のうち２人）。ＣＯＶＩＤ－１９陽性参加者は、より高い酸素／ＣＰＡＰ必要率、より高い漸増率、及びより低い生存率を経験した。これらの観察結果は、ＣＯＶＩＤ－１９の症状及び進行の文献記載［６１］と一致していた。
【0131】
液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）によって特定された特徴の概要
９９８個の特徴は、ＬＣ－ＭＳによって再現性よく特定され（プールされたＱＣ ＬＣ－ＭＳ注入の９０％超において存在し、プールされたＱＣにわたって２０％未満の分散係数、３超のシグナル対ノイズ比）、これらは、この研究における分析の基礎を形成した。ＣＯＶＩＤ－１９陽性及び陰性の参加者間の差異は、脂質及び代謝産物の範囲にわたって観察され、最も一貫した差異が、脂質レベル、とりわけトリグリセリドの減少において見られた（図３０）。
９９８個の特徴は、ＬＣ－ＭＳによって再現性よく特定され（プールされたＱＣ ＬＣ－ＭＳ注入の９０％超において存在し、プールされたＱＣにわたって２０％未満の分散係数、３超のシグナル対ノイズ比）、これらは、この研究における分析の基礎を形成した。ＣＯＶＩＤ－１９陽性及び陰性の参加者間の差異は、脂質及び代謝産物の範囲にわたって観察され、最も一貫した差異が、脂質レベル、とりわけトリグリセリドの減少において見られた（図３０）。
【0132】
ＭＳ／ＭＳによって特定されたトリグリセリドの総計（集団）レベルは、ＣＯＶＩＤ－１９陽性参加者については低下し、セラミドについても低下したが、後者のクラスの脂質で特定され検証されたものはより少なかった。クラスによる集約した脂質イオンカウントの自然対数の分布は、シャピロ－ウィルク（Ｓｈａｐｉｒｏ－Ｗｉｌｋ）正常性検定［６２］によって正常として特徴付けられなかった。両側マン－ホイットニーＵ検定を実施して、これらの脂質クラスの総計レベルの有意性を検定した。これらは、トリグリセリド及びセラミドについてそれぞれ０．０２２及び０．０１５のｐ値をもたらし、効果量（コーエンのＤによって計算した）は０．４４及び０．５７であり、中程度の効果量を示した。これらの結果は、ＣＯＶＩＤ－１９による角質層内の脂質異常症を示唆する。陽性コホートと陰性コホートとの間のトリグリセリドのレベルの変化は、ＣＯＶＩＤ－１９状態の指標としてのＣＲＰ又はリンパ球の変化に匹敵する（図３１）。
【0133】
他の研究は、ＣＯＶＩＤ－１９陽性患者由来の血漿における脂質異常症の証拠を見出した［４６、４５、４８］が、これらの脂質クラスについて上方調節が優性であるか又は下方調節が優性であるかの証拠は混在している。血漿トリグリセリド（ＴＡＧ）レベルは、ＣＯＶＩＤ－１９の軽症例について血漿中で上昇することが見出されているが、ＣＯＶＩＤ－１９の重症度が高まるにつれて、血漿中のＴＡＧレベルも低下する可能性がある［６３］。
【0134】
しかしながら、皮膚の主要な役割はバリア機能であり、角質層における脂質発現は新規脂肪酸合成（脂質新生、体内での合成）に依存し、実際、血漿等の非皮膚供給源は皮脂脂質にわずかな寄与しか提供せず［６４］、これはこの生体液に対するより広い経路分析の関連性を制限することを思い出されたい。ウイルスがそれ自体の繁殖のために脂質を隔離する範囲において、これが皮脂脂質の発現の欠損を引き起こす可能性がある。
【0135】
集団レベルクラスタリング分析
クラスタリングは、主成分分析（ＰＣＡ）によって、すなわち教師なし分析によって全集団レベルで特定可能ではなかった。同じデータセットに対して行った部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ－ＤＡ）は、限定された分離を示し（図３３）、２つの成分にわたる受信者動作曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）は０．８８であった。ＡＵＲＯＣは、単一の訓練データセット上でのみ使用するとき誇張される可能性があり、従って、混同行列は、一個抜きアプローチを使用して構築した。このようにして精度を検証すること（図３２）により、わずか５７％の感度及び６８％の特異度が示された。広範囲の併存疾患を考慮すると、これは予想外ではない。
クラスタリングは、主成分分析（ＰＣＡ）によって、すなわち教師なし分析によって全集団レベルで特定可能ではなかった。同じデータセットに対して行った部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ－ＤＡ）は、限定された分離を示し（図３３）、２つの成分にわたる受信者動作曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）は０．８８であった。ＡＵＲＯＣは、単一の訓練データセット上でのみ使用するとき誇張される可能性があり、従って、混同行列は、一個抜きアプローチを使用して構築した。このようにして精度を検証すること（図３２）により、わずか５７％の感度及び６８％の特異度が示された。広範囲の併存疾患を考慮すると、これは予想外ではない。
【0136】
交絡因子の検討
年齢及び診断指標（ＣＲＰ、リンパ球及び好酸球）の影響を検定するために、これらの変数をパレートスケーリングし、ＰＬＳ－ＤＡモデリングのためのマトリクスに含めた。リンパ球、ＣＲＰ、及び好酸球の射影における変数重要度（ＶＩＰ）スコアは、それぞれ２．４７、１．７７、及び０．７２であり、１，００２の総特徴のうち１、９０、及び４６５にランク付けされた。単一の特徴として、低下したリンパ球レベルはＣＯＶＩＤ－１９陽性状態と高い相関を示し、リンパ球数が診断及び予後バイオマーカーの両方である［６５］ことと整合する。ベクターとしての年齢は、わずか０．０５のＶＩＰスコア（合計１，００２の特徴のうちの９５８にランク付けされる）を有し、年齢が他の因子よりも小さい角質層脂質の影響因子であることを示す。
年齢及び診断指標（ＣＲＰ、リンパ球及び好酸球）の影響を検定するために、これらの変数をパレートスケーリングし、ＰＬＳ－ＤＡモデリングのためのマトリクスに含めた。リンパ球、ＣＲＰ、及び好酸球の射影における変数重要度（ＶＩＰ）スコアは、それぞれ２．４７、１．７７、及び０．７２であり、１，００２の総特徴のうち１、９０、及び４６５にランク付けされた。単一の特徴として、低下したリンパ球レベルはＣＯＶＩＤ－１９陽性状態と高い相関を示し、リンパ球数が診断及び予後バイオマーカーの両方である［６５］ことと整合する。ベクターとしての年齢は、わずか０．０５のＶＩＰスコア（合計１，００２の特徴のうちの９５８にランク付けされる）を有し、年齢が他の因子よりも小さい角質層脂質の影響因子であることを示す。
【0137】
全体として、ＰＬＳ－ＤＡ分離は、リンパ球及びＣＲＰ指標の追加によって改善され、これらの２つの変数が特徴マトリクスに含まれる場合、わずかなモデル精度の上昇があった（例えば、集団全体について精度は６２％から６４％へ）。しかしながら、この研究が皮脂サンプリングに焦点を当てていることをふまえて、以下の分析では、皮脂から得られる特徴のみを含め、すなわち、他の診断指標からの情報は分類モデルから除外する。
【0138】
皮脂のみに基づく分離がより小さい／より均質な群において改善するかどうかを検定するために、別々のＰＬＳ－ＤＡモデルを、併存疾患による集団の各分割について構築した。（予測力－Ｑ２Ｙ－並びに一個抜き交差検証による感度及び特異度によって測定して）モデル性能が改善された場合には、これは、層別化され適合されたデータセットに基づいてモデルが構築された場合、皮脂脂質プロファイリングがより良好に機能することを示すことができる。表は、異なるモデル化されたサブセットにわたるこれらのメトリック（測定基準）の結果を示す。
【0139】
データはより細かくグループ化され、モデル化された予測力は改善されたので、分離は概して改善された。これらのサブセットの加重平均に基づいて、感度は７５％に改善され、特異度は８１％に改善された。例えば、高血圧の投薬を受けている参加者のサブセットのＰＬＳ－ＤＡモデリング（図３６）は、良好な分離並びに良好な感度及び特異度の両方を示した（図３５）。これらのデータは、併存疾患が皮膚リピドミクスにおける交絡因子であることを示唆している。
【0140】
同様に、高コレステロールの投薬を受けている参加者のサブセットのＰＬＳ－ＤＡモデリングは、良好な分離を示し（図４０）、感度は１００％であり、特異度は８０％であった。このサブグループは脂質低下剤、具体的にはスタチンで治療されていた。虚血性心疾患（ＩＨＤ）の処置を受けている参加者を含むサブグループも、はるかに良好な分離を示し（図４２）、全体的な精度はより良好であり、感度及び特異度はそれぞれ５０％及び８６％であった。このサブグループは様々な投薬を受けていたが、ＩＨＤを呈する参加者はスタチンも処方されていた。最後に、Ｔ２ＤＭの投薬を受けている参加者のサブセット（図３６）も、良好な分離並びに良好な感度及び特異度（それぞれ７１％及び７５％）の両方を示した。このサブグループは、典型的には、経口血糖降下薬、例えばメトホルミンで、場合によってはインスリンで、場合によっては食事制限のみで治療されていた。
【0141】
モデル性能（図４６）も、スタチンを服用している参加者に基づく層別化データセットのベース集団に対して改善した（５５％の感度及び９０％の特異度）。スタチンがコレステロール及び脂質のレベルを制御することを考慮すると、これは、ＣＯＶＩＤ－１９によるリピドームにおける摂動を測定するための、より類似した「ベースライン」を提供しうる。スタチンを服用している患者は、高コレステロールで治療された参加者と、糖尿病コントロール不良であるか又は虚血性心疾患の病歴を有する参加者との両方を含み、このような患者では、スタチンは、長期転帰を改善するために予防的に日常的に添加される。
【0142】
モデル全体を見ると、ＣＯＶＩＤ－１９陽性と陰性との区別において有意であると特定された特徴には共通性があった。多くの特徴は、２を超えるＶＩＰスコアを有するすべてのサブセットにおいて特徴付けられたが（図３７の濃い灰色）、他のものはそうではなく、これは、層別化される場合、より小さい群による過剰適合を示す可能性があった。特徴間に重複が生じる場合、これは、サブセット集団間の自然な重複を反映している可能性があり、例えば、虚血性心疾患を呈する参加者及び高コレステロールを呈する参加者のサブセットは、たいていの場合、スタチンによる処置を受ける参加者のサブセットである。
【0143】
最も高い共通ＶＩＰスコアを有する特徴のうち、上位２つはトリグリセリド、ＴＧ（１６．１／２１．０／２２．６）及びＴＧ（１７．０／２２．１／２２．６）であり、上位２０のうち８つも同様であり、脂質、とりわけトリグリセリドの調節不全が皮膚に対するＣＯＶＩＤ－１９の影響の顕著な特徴であるという以前の観察と一致した。
【0144】
考察
総計レベルでは、本研究における参加者のメタデータの分析は、パンデミック中に良好に設計されたサンプルセットを構築することに関与する課題を示す。参加者の年齢範囲は大きく、広範囲の併存疾患が存在し、多くの交絡因子をもたらした。投薬又は併存疾患によって厳密に層別化するには少なすぎるデータポイントしか利用可能でなかったことを考えると、このパイロット研究では決定的な分離は可能であるとは証明されなかった。それにもかかわらず、総計レベルでは、陽性の臨床的ＣＯＶＩＤ－１９診断を有する参加者は、低下した脂質レベル（特にトリグリセリド及びセラミド）を呈し、バリア機能及び皮膚の健康の低下の可能性を伴っていた。さらには、これらの知見は、参加者のより良好な層別化ができれば、リピドームプロファイルによって陽性及び陰性ＣＯＶＩＤ－１９参加者のより明確な分離ができうることを示唆する。７９％の層別化群における全体的な精度は、８１％の呼気生化学を使用して最近報告されたもの［４３］に匹敵するが、過剰適合は、小さいｎを有するパイロット研究のいずれにおいてもリスクである。このリスクは、データのより大きい訓練セットと、ＭＳ連携の研究等の結束力のある努力によって可能にされるその後の将来の検証セットに対するモデルの検定との両方によってのみ低減することができる。
総計レベルでは、本研究における参加者のメタデータの分析は、パンデミック中に良好に設計されたサンプルセットを構築することに関与する課題を示す。参加者の年齢範囲は大きく、広範囲の併存疾患が存在し、多くの交絡因子をもたらした。投薬又は併存疾患によって厳密に層別化するには少なすぎるデータポイントしか利用可能でなかったことを考えると、このパイロット研究では決定的な分離は可能であるとは証明されなかった。それにもかかわらず、総計レベルでは、陽性の臨床的ＣＯＶＩＤ－１９診断を有する参加者は、低下した脂質レベル（特にトリグリセリド及びセラミド）を呈し、バリア機能及び皮膚の健康の低下の可能性を伴っていた。さらには、これらの知見は、参加者のより良好な層別化ができれば、リピドームプロファイルによって陽性及び陰性ＣＯＶＩＤ－１９参加者のより明確な分離ができうることを示唆する。７９％の層別化群における全体的な精度は、８１％の呼気生化学を使用して最近報告されたもの［４３］に匹敵するが、過剰適合は、小さいｎを有するパイロット研究のいずれにおいてもリスクである。このリスクは、データのより大きい訓練セットと、ＭＳ連携の研究等の結束力のある努力によって可能にされるその後の将来の検証セットに対するモデルの検定との両方によってのみ低減することができる。
【0145】
注目すべき別の点は、季節性呼吸器ウイルスからの参加者集団における交絡因子の欠如の可能性である。ＣＯＶＩＤ陰性患者は、呼吸器疾患（例えば、ＣＯＰＤ、喘息）及びＣＯＶＩＤ様症状を有する患者を含んでいたが、試料は、呼吸器ウイルスの発生率が概して低い５月から７月の間に採取した。感冒及びインフルエンザの両方は、ＣＯＶＩＤ－１９と重複するいくつかの症状を有し、ＣＯＶＩＤ－１９感染に関連する特徴の特定を妨害しうる脂質代謝の変化をもたらしうる可能性がある。英国内のこのようなウイルスは、秋及び冬においてより蔓延している［６６］。季節性呼吸器ウイルスがこの研究において主要な交絡因子である可能性は低いようであるが、これは将来の研究において考慮される必要がある因子であり、他の呼吸器ウイルスに関して皮脂の選択性及び特異度を試験する機会も可能にしうる。
【0146】
結論として、本発明者らは、ＣＯＶＩＤ－１９感染が角質層における脂質異常症をもたらすという証拠を提供する。本発明者らはさらに、ＣＯＶＩＤ陽性患者及びＣＯＶＩＤ陰性患者の皮脂プロファイルを多変量解析法ＰＬＳ－ＤＡを用いて分離することができ、患者を特定の併存疾患に従ってセグメント化すると分離が改善することを見出した。皮脂試料が迅速かつ無痛で提供されることが可能であることを考慮すると、皮脂はＣＯＶＩＤ－１９感染の臨床的サンプリングのための将来の検討に価値があると結論付けられる。
【0147】
追加のデータ
直交部分最小二乗判別分析（ＯＰＬＳ－ＤＡ）を実施したところ、分離が明らかになった。訓練モデルを確立するためにペアワイズノックアウトアプローチを用いて混同行列を構築した。これらのモデルを除外された参加者にまで投影して精度を試験すると、わずか６３％の感度及び７０％の特異度を示した。広範囲の併存疾患及び年齢適合の欠如を考慮すると、これは予想外ではない（図４７）。
直交部分最小二乗判別分析（ＯＰＬＳ－ＤＡ）を実施したところ、分離が明らかになった。訓練モデルを確立するためにペアワイズノックアウトアプローチを用いて混同行列を構築した。これらのモデルを除外された参加者にまで投影して精度を試験すると、わずか６３％の感度及び７０％の特異度を示した。広範囲の併存疾患及び年齢適合の欠如を考慮すると、これは予想外ではない（図４７）。
【0148】
虚血性心疾患（ＩＨＤ）の治療を受けている参加者を含むサブグループも、はるかに良好な分離を示した（１．００のＲ２Ｙ、この場合も、それぞれ７５％及び８６％のより良好な感度及び特異度）。このサブグループは様々な投薬を受けていたが、ＩＨＤを呈する参加者はスタチンも処方されていた（図４８）。
【0149】
データがより細かくグループ分けされるにつれて、分離は概して改善したが、ほとんどの亜集団について、モデル化された予測力の改善はなかった。しかしながら、４つのサブセットは、モデル性能のより興味深い改善を示した。これらは、薬物療法によって治療されている特定の併存疾患（高コレステロール、Ｔ２ＤＭ及びＩＨＤ）を有するサブセット並びにスタチンによる処置を受けているサブセットであった。高コレステロールの投薬を受けている参加者のサブセットのＯＰＬＳ－ＤＡモデリングは、両方とも良好な分離（１．００のＲ２Ｙ）を示した。このサブグループは、脂質低下剤、具体的にはスタチンで治療されていた（図４９）。
【0150】
２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）の投薬を受けている参加者のサブセットのＯＰＬＳ－ＤＡモデリングは、７８％の感度及び７５％の特異度で良好な分離を示した。このサブグループは、典型的には、経口血糖降下薬、例えばメトホルミンで、場合によってはインスリンで、場合によっては食事制限のみで治療されていた（図５０）。
【0151】
スタチンがコレステロール及び脂質のレベルを制御することを考慮すると、これは、ＣＯＶＩＤ－１９によるリピドームにおける摂動を測定するための、より類似した「ベースライン」を提供しうる。スタチンを服用しているすべての患者（高コレステロールで治療された参加者と、糖尿病コントロール不良であるか又は虚血性心疾患の病歴を有する参加者の両方を含み、このような患者では、スタチンは、長期転帰を改善するために予防的に日常的に添加される）を分析することは、ＯＰＬＳ－ＤＡモデリングによる改善された分離を示し、０．７４のＲ２Ｙ、７１％の感度及び７６％の特異度であった（図５１）。
【0152】
モデルを横断して見ると、ＣＯＶＩＤ－１９陽性と陰性との区別において有意であると特定された特徴における共通性は限定的であった。いくつかの特徴は、すべてのサブグループにおいて高いＶＩＰスコアを有したが、多くはそうではなく、これは、層別化される場合、より小さい群による過剰適合を示す可能性があった。特徴間に重複が生じる場合、これは、サブセット集団間の自然な重複を反映している可能性があり、例えば、虚血性心疾患を呈する参加者及び高コレステロールを呈する参加者のサブセットは、たいていの場合、スタチンによる処置を受ける参加者のサブセットである（図５２）。
【0153】
上述の実施形態は、特許請求の範囲によって与えられる保護の範囲を限定することを意図するものではなく、むしろ、本発明がどのように実施されてもよいかの例を説明することを意図するものである。
【0154】
参考文献
１． ＤｅＭａａｇｄ，Ｇ．及びＡ．Ｐｈｉｌｉｐ、Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ：Ｐａｒｔ １：Ｄｉｓｅａｓｅ Ｅｎｔｉｔｙ，Ｒｉｓｋ Ｆａｃｔｏｒｓ，Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ． Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２０１５． ４０（８）：５０４－５３２頁．
２． Ｃｈｅｎｇ，Ｈ．－Ｃ．、Ｃ．Ｍ．Ｕｌａｎｅ、及びＲ．Ｅ．Ｂｕｒｋｅ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｘｏｎｓ． Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、２０１０． ６７（６）：７１５－７２５頁．
３． Ｍｏｒｇａｎ，Ｊ．、Ｊｏｙ ｏｆ ｓｕｐｅｒ ｓｍｅｌｌｅｒ：ｓｅｂｕｍ ｃｌｕｅｓ ｆｏｒ ＰＤ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ． Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ． １５（２）：１３８－１３９頁．
４． Ｗｏｏｄ－Ｋａｃｚｍａｒ，Ａ．、Ｓ．Ｇａｎｄｈｉ、及びＮ．Ｗｏｏｄ、Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃａｕｓｅｓ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００６． １２（１１）：５２１－５２８頁．
５． Ｋｒｅｓｔｉｎ，Ｄ．、Ｔｈｅ Ｓｅｂｏｒｒｈｏｅｉｃ Ｆａｃｉｅｓ ａｓ ａ Ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｓｔ－Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｃ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ ａｎｄ Ａｌｌｉｅｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ． ＱＪＭ：Ａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９２７． ｏｓ－２１（８１）：１７７－１８６頁．
６． Ｄｏｎａｄｉｏ，Ｖ．ら、Ｓｋｉｎ ｎｅｒｖｅ ａｌｐｈａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｄｅｐｏｓｉｔｓ：ａ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、２０１４． ８２（１５）：１３６２－９頁．
７． Ｓｈｉｒａｓｕ，Ｍ．及びＫ．Ｔｏｕｈａｒａ、Ｔｈｅ ｓｃｅｎｔ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ：ｖｏｌａｔｉｌｅ ｏｒｇａｎｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｂｏｄｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｄｉｓｏｒｄｅｒ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１１． １５０（３）：２５７－２６６頁．
８． Ｐｉｚｚｉｎｉ，Ａ．ら、Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｏｒｇａｎｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒｅａｔｈ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｔａｂｌｅ ｏｒ ａｃｕｔｅ ｅｘａｃｅｒｂａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｒｅａｔｈ ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１８．
９． Ｉｓｈｉｂｅ，Ａ．ら、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｓ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ． Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ、２０１８．
１０． Ｃｈａｎｇ，Ｊ．－Ｅ．ら、Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｏｒｇａｎｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｉｎ ｅｘｈａｌｅｄ ｂｒｅａｔｈ ｆｏｒ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｅｎｓｏｒ ｓｙｓｔｅｍ． Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ｂ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ、２０１８． ２５５：８００－８０７頁．
１１． Ｌａｗａｌ，Ｏ．ら、Ｈｅａｄｓｐａｃｅ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｏｒｇａｎｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｒｏｍ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ ｉｎ ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ａｎａｌｙｓｅｄ ｂｙ ＴＤ－ＧＣ／ＭＳ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｒｅａｔｈ ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１８． １２（２）：０２６００２頁．
１２． Ｒａｔｔｒａｙ，Ｎ．Ｊ．Ｗ．ら、Ｔａｋｉｎｇ ｙｏｕｒ ｂｒｅａｔｈ ａｗａｙ：ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ ｂｒｅａｔｈｅｓ ｌｉｆｅ ｉｎ ｔｏ ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ． Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１４． ３２（１０）：５３８－５４８頁．
１３． Ｘｉｅ，Ｊ．ら、Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｅｒｐｅｎｏｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｏｌｅｏｃｅｌｌｏｓｉｓ ｐｅｅｌ． Ｆｏｏｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１８． ２４３：２６９－２７６頁．
１４． Ｇａｔｚｉａｓ，Ｉ．ら、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｈｅｅｐ’ｓ ｍｉｌｋ ｆｒｏｍ Ｇｒｅｅｋ ｂｒｅｅｄｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ，ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｐｒｏｆｉｌｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、２０１８．
１５． Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｎ．ら、Ｖｏｌａｔｉｌｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ｂｙ Ｈｅａｄｓｐａｃｅ Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－Ｉｏｎ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＨＳ－ＧＣ－ＩＭＳ） ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃｉｔｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｏｎｅｙ ａｓ Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｏ １Ｈ－ＮＭＲ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１８．
１６． Ｌｉｕ，Ｔ．ら、Ａｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｎｏｓｅ Ｂａｓｅｄ Ｂｅｖｅｒａｇｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａｎ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｆｉｓｈｅｒ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｍｅｔｈｏｄ．
１７． Ａｂｅｄｉ，Ｇ．、Ｚ．Ｔａｌｅｂｐｏｕｒ、及びＦ．Ｊａｍｅｃｈｅｎａｒｂｏｏ、Ｔｈｅ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｆｒａｇｒａｎｃｅｓ ｉｎ ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｐｅｒｓｏｎａｌ ｃａｒｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ． ＴｒＡＣ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１８．
１８． Ｒｏｓｉｅｒ，Ｅ．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ ＴＤ－ＧＣ／ＭＳ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ａｎｉｍａｌ ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１４． ４０６（１５）：３６１１－３６１９頁．
１９． Ｓａｒｉｏｌ，Ｈ．Ｃ．ら、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃａｒｂｏｎ ｉｎ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｒｕｍ “ｆｉｌｔｅｒｓ” ｂａｓｅｄ ｏｎ ＴＧＡ，ＴＤ－ＧＣ／ＭＳ，ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ ａｎｄ ＮＭＲ ｒｅｌａｘｏｍｅｔｒｙ． Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｔｏｄａｙ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２０１７． １１：１－１０頁．
２０． Ｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．及びＣ．Ｍｙｅｒｓ、Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｃｉｇａｒｅｔｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔａｎｔ ａｅｒｏｓｏｌ ｐｒｏｆｉｌｅｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ、２０１５． １４１８：１９２－１９９頁．
２１． Ｄｕｎｎ，Ｗ．Ｂ．ら、Ｓｙｓｔｅｍｓ ｌｅｖｅｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅｓ：ｔｈｅ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ． Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｒｅｖ、２０１１． ４０（１）：３８７－４２６頁．
２２． Ｇｏｏｄａｃｒｅ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｐｏｓｅｄ ｍｉｎｉｍｕｍ ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ． Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ、２００７． ３（３）：２３１－２４１頁．
２３． Ｗｉｋｏｆｆ，Ｗ．Ｒ．ら、Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｌａｒｇｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ ｏｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｂｌｏｏｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２００９． １０６（１０）：３６９８－３７０３頁．
２４． Ｆｅｎｎ，Ｊ．Ｂ．；Ｍａｎｎ，Ｍ．；Ｍｅｎｇ，Ｃ．Ｋ．；Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｆ．；Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ，Ｃ．Ｍ．、Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１８８３－） １９８９、２４６（４９２６）、６４－７１．
２５． Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ，Ｆ．；Ｋａｒａｓ，Ｍ．；Ｂｅａｖｉｓ，Ｒ．Ｃ．；Ｃｈａｉｔ，Ｂ．Ｔ．、Ｍａｔｒｉｘ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ． Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ． １９９１、６３（２４）、１１９３Ａ－１２０３Ａ．
２６． Ｃｏｏｋｓ，Ｒ．Ｇ．；Ｏｕｙａｎｇ，Ｚ．；Ｔａｋａｔｓ，Ｚ．；Ｗｉｓｅｍａｎ，Ｊ．Ｍ．、Ａｍｂｉｅｎｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，Ｕ．Ｓ．） ２００６、３１１（５７６７）、１５６６－１５７０．
２７． Ｔａｋａｔｓ，Ｚ．；Ｗｉｓｅｍａｎ，Ｊ．Ｍ．；Ｇｏｌｏｇａｎ，Ｂ．；Ｃｏｏｋｓ，Ｒ．Ｇ．、Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｓａｍｐｌｉｎｇ Ｕｎｄｅｒ Ａｍｂｉｅｎｔ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，Ｕ．Ｓ．） ２００４、３０６（５６９５）、４７１－４７３．
２８． Ｃｏｄｙ，Ｒ．Ｂ．；Ｌａｒａｍｅｅ，Ｊ．Ａ．；Ｄｕｒｓｔ，Ｈ．Ｄ．、Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｎｅｗ ｉｏｎ ｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｉｎ ｏｐｅｎ ａｉｒ ｕｎｄｅｒ ａｍｂｉｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ． ２００５、７７（８）、２２９７－２３０２．
２９． Ｈａｒｒｉｓ，Ｇ．Ａ．；Ｇａｌｈｅｎａ，Ａ．Ｓ．；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｆ．Ｍ．、Ａｍｂｉｅｎｔ Ｓａｍｐｌｉｎｇ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｒｅｎｄｓ． Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，Ｕ．Ｓ．） ２０１１、８３（１２）、４５０８－４５３８．
３０． Ｌｉｕ，Ｊ．；Ｗａｎｇ，Ｈ．；Ｍａｎｉｃｋｅ，Ｎ．Ｅ．；Ｌｉｎ，Ｊ．－Ｍ．；Ｃｏｏｋｓ，Ｒ．Ｇ．；Ｏｕｙａｎｇ，Ｚ．、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｐｅｒ Ｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ． Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，Ｕ．Ｓ．） ２０１０、８２（６）、２４６３－２４７１．
３１． Ｗａｎｇ，Ｈ．；Ｌｉｕ，Ｊ．；Ｃｏｏｋｓ，Ｒ．Ｇ．；Ｏｕｙａｎｇ，Ｚ．、Ｐａｐｅｒ Ｓｐｒａｙ ｆｏｒ Ｄｉｒｅｃｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｍｉｘｔｕｒｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ． ２０１０、４９（５）、８７７－８８０、Ｓ８７７／１－Ｓ８７７／７．
３２． Ｄａｍｏｎ，Ｄ．Ｅ．；Ｄａｖｉｓ，Ｋ．Ｍ．；Ｍｏｒｅｉｒａ，Ｃ．Ｒ．；Ｃａｐｏｎｅ，Ｐ．；Ｃｒｕｔｔｅｎｄｅｎ，Ｒ．；Ｂａｄｕ－Ｔａｗｉａｈ，Ａ．Ｋ．、Ｄｉｒｅｃｔ Ｂｉｏｆｌｕｉｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｕｓｉｎｇ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ Ｐａｐｅｒ Ｓｐｒａｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，Ｕ．Ｓ．） ２０１６、８８（３）、１８７８－１８８４．
３３． Ｅｓｐｙ，Ｒ．Ｄ．；Ｔｅｕｎｉｓｓｅｎ，Ｓ．Ｆ．；Ｍａｎｉｃｋｅ，Ｎ．Ｅ．；Ｒｅｎ，Ｙ．；Ｏｕｙａｎｇ，Ｚ．；ｖａｎ Ａｓｔｅｎ，Ａ．；Ｃｏｏｋｓ，Ｒ．Ｇ．、Ｐａｐｅｒ Ｓｐｒａｙ ａｎｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｐｒａｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｉｒｅｃｔ ａｎｄ Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｉｇｈｔ Ｄｒｕｇｓ ｏｆ Ａｂｕｓｅ ｉｎ Ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ． Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，Ｕ．Ｓ．） ２０１４、８６（１５）、７７１２－７７１８．
３４． Ｍｉｃｈｅｌｙ，Ｊ．Ａ．；Ｍｅｙｅｒ，Ｍ．Ｒ．；Ｍａｕｒｅｒ，Ｈ．Ｈ．、Ｐａｐｅｒ Ｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｏ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｔａｎｄｅｍ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｆｏｒ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｕｒｉｎｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｉｎ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｏ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｆｔｅｒ Ｕｒｉｎｅ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｏｒ Ｄｒｉｅｄ Ｕｒｉｎｅ Ｓｐｏｔ Ｗｏｒｋｕｐ． Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，Ｕ．Ｓ．） ２０１７、８９（２１）、１１７７９－１１７８６．
３５． Ｇａｂｅｌｉｃａ，Ｖ．；Ｓｈｖａｒｔｓｂｕｒｇ，Ａ．Ａ．；Ａｆｏｎｓｏ，Ｃ．；Ｂａｒｒａｎ，Ｐ．；Ｂｅｎｅｓｃｈ，Ｊ．Ｌ．Ｐ．；Ｂｌｅｉｈｏｌｄｅｒ，Ｃ．；Ｂｏｗｅｒｓ，Ｍ．Ｔ．；Ｂｉｌｂａｏ，Ａ．；Ｂｕｓｈ，Ｍ．Ｆ．；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｊ．Ｌ．；Ｃａｍｐｕｚａｎｏ，Ｉ．Ｄ．Ｇ．；Ｃａｕｓｏｎ，Ｔ．；Ｃｌｏｗｅｒｓ，Ｂ．Ｈ．；Ｃｒｅａｓｅｒ，Ｃ．Ｓ．；Ｄｅ Ｐａｕｗ，Ｅ．；Ｆａｒ，Ｊ．；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｌｉｍａ，Ｆ．；Ｆｊｅｌｄｓｔｅｄ，Ｊ．Ｃ．；Ｇｉｌｅｓ，Ｋ．；Ｇｒｏｅｓｓｌ，Ｍ．；Ｈｏｇａｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｊｒ．；Ｈａｎｎ，Ｓ．；Ｋｉｍ，Ｈ．Ｉ．；Ｋｕｒｕｌｕｇａｍａ，Ｒ．Ｔ．；Ｍａｙ，Ｊ．Ｃ．；ＭｃＬｅａｎ，Ｊ．Ａ．；Ｐａｇｅｌ，Ｋ．；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｋ．；Ｒｉｄｇｅｗａｙ，Ｍ．Ｅ．；Ｒｏｓｕ，Ｆ．；Ｓｏｂｏｔｔ，Ｆ．；Ｔｈａｌａｓｓｉｎｏｓ，Ｋ．；Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ，Ｓ．Ｊ．；Ｗｙｔｔｅｎｂａｃｈ，Ｔ．、Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ ｉｏｎ ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．Ｒｅｖ． ２０１９、３８（３）、２９１－３２０．
３６． Ｙａｎ，Ｃ．；Ｐａｒｍｅｇｇｉａｎｉ，Ｆ．；Ｊｏｎｅｓ，Ｅ．Ａ．；Ｃｌａｕｄｅ，Ｅ．；Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｓ．Ａ．；Ｔｕｒｎｅｒ，Ｎ．Ｊ．；Ｆｌｉｔｓｃｈ，Ｓ．Ｌ．；Ｂａｒｒａｎ，Ｐ．Ｅ．、Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ ｉｎ Ｌｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｏｌｏｎｉｅｓ． Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． ２０１７、１３９（４）、１４０８－１４１１．
３７． Ｍｙｕｎｇ，Ｓ．；Ｗｉｓｅｍａｎ，Ｊ．Ｍ．；Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ，Ｓ．Ｊ．；Ｔａｋａｔｓ，Ｚ．；Ｃｏｏｋｓ，Ｒ．Ｇ．；Ｃｌｅｍｍｅｒ，Ｄ．Ｅ．、Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｉｏｎ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ／Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｌｄｅｄ ａｎｄ Ｄｅｎａｔｕｒｅｄ Ｓｔａｔｅｓ． Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ ２００６、１１０（１０）、５０４５－５０５１．
３８． Ｊａｃｋｓｏｎ，Ａ．Ｔ．；Ｓｃｒｉｖｅｎｓ，Ｊ．Ｈ．；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．Ｐ．；Ｂａｋｅｒ，Ｅ．Ｓ．；Ｇｉｄｄｅｎ，Ｊ．；Ｂｏｗｅｒｓ，Ｍ．Ｔ．、Ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙｅｔｈｅｒ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ． Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ． ２００４、２３８（３）、２８７－２９７．
３９． Ｍａｎｉｃｋｅ，Ｎ．Ｅ．；Ｂｅｌｆｏｒｄ，Ｍ．、Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｐｉａｔｅ Ｉｓｏｍｅｒｓ Ｕｓｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐａｐｅｒ Ｓｐｒａｙ Ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｏ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｅｌｄ Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｗａｖｅｆｏｒｍ Ｉｏｎ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ． ２０１５、２６（５）、７０１－７０５．
４０． ＷＨＯ． ＷＨＯ ａｄｖｉｃｅ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｔｒａｖｅｌ ａｎｄ ｔｒａｄｅ ｉｎ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｏｆ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ａ ｎｅｗ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｃｈｉｎａ． ２０１９． ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｎｅｗｓ－ｒｏｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅｓ－ｄｅｔａｉｌ／ｗｈｏ－ａｄｖｉｃｅ－ｆｏｒ－ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ－ｔｒａｖｅｌ－ａｎｄ－ｔｒａｄｅ－ｉｎ－ｒｅｌａｔｉｏｎ－ｔｏ－ｔｈｅ－ｏｕｔｂｒｅａｋ－ｏｆ－ｐｎｅｕｍｏｎｉａ－ｃａｕｓｅｄ－ｂｙ－ａ－ｎｅｗ－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ－ｉｎ－ｃｈｉｎａ （２０２０年７月２７日にアクセス）．
４１． ＷＨＯ． Ｎｏｖｅｌ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ － Ｃｈｉｎａ． ２０２０． ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｃｓｒ／ｄｏｎ／１２－ｊａｎｕａｒｙ－２０２０－ｎｏｖｅｌ－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ－ｃｈｉｎａ／ｅｎ／ （２０２０年７月２７日にアクセス）．
４２． Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ． Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＣＯＶＩＤ－１９ ｔｅｓｔｉｎｇ ｒａｔｅｓ ｏｎ ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚａｔｉｏｎｓ． ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｂｕｌｌｅｔｉｎ／ｖｏｌｕｍｅｓ／９８／５／２０－２５８１８６／ｅｎ／（２０２０年９月２９日にアクセス）．
４３． Ｒｕｓｚｋｉｅｗｉｃｚ ＤＭ、Ｓａｎｄｅｒｓ Ｄ、Ｏ’Ｂｒｉｅｎ Ｒら、Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ＣＯＶＩＤ－１９ ｂｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｒｅａｔｈ ｗｉｔｈ ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｉｏｎ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ － ａ ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ ｓｔｕｄｙ． ＥＣｌｉｎｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ ２０２０． ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｅｃｌｉｎｍ．２０２０．１００６０９．
４４． Ａｂｕ－Ｆａｒｈａ Ｍ、Ｔｈａｎａｒａｊ ＴＡ、Ｑａｄｄｏｕｍｉ ＭＧ、Ｈａｓｈｅｍ Ａ、Ａｂｕｂａｋｅｒ Ｊ、Ａｌ－Ｍｕｌｌａ Ｆ． Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ＣＯＶＩＤ－１９ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｓ ａ ｄｒｕｇ ｔａｒｇｅｔ． Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ ２０２０；２１． ＤＯＩ：１０．３３９０／ｉｊｍｓ２１１０３５４４．
４５． Ｏｖｅｒｍｙｅｒ ＫＡ、Ｓｈｉｓｈｋｏｖａ Ｅ、Ｍｉｌｌｅｒ ＩＪら、Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ Ｍｕｌｔｉ－ｏｍｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＣＯＶＩＤ－１９ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ． Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔ ２０２０；：１－１８．
４６． Ｓｏｎｇ ＪＷ、Ｌａｍ ＳＭ、Ｆａｎ Ｘら、Ｏｍｉｃｓ－Ｄｒｉｖｅｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ＣＯＶＩＤ－１９ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ ２０２０；３２：１８８－２０２．ｅ５．
４７． Ｄｅ Ｓｉｌｖａ ＩＷ、Ｎａｙｅｋ Ｓ、Ｓｉｎｇｈ Ｖ、Ｒｅｄｄｙ Ｊ、Ｇｒａｎｇｅｒ ＪＫ、Ｖｅｒｂｅｃｋ ＧＦ． Ｐａｐｅｒ ｓｐｒａｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ Ｔｅｓｌｉｎ（Ｒ） ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ＣＯＶＩＤ－１９ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ａｎａｌｙｓｔ ２０２０；１４５． ＤＯＩ：１０．１０３９／ｄ０ａｎ０１０７４ｊ．
４８． Ｗｕ Ｄ、Ｓｈｕ Ｔ、Ｙａｎｇ Ｘら、Ｐｌａｓｍａ ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ ａｎｄ ｌｉｐｉｄｏｍｉｃ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＣＯＶＩＤ－１９． Ｎａｔｌ Ｓｃｉ Ｒｅｖ ２０２０；７：１１５７－６８．
４９． Ｊｅｎｄｒｎｙ Ｐ、Ｓｃｈｕｌｚ Ｃ、Ｔｗｅｌｅ Ｆら、Ｓｃｅｎｔ ｄｏｇ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ ＣＯＶＩＤ－１９ ｐａｔｉｅｎｔｓ － Ａ ｐｉｌｏｔ ｓｔｕｄｙ． ＢＭＣ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２０２０；２０：１－７．
５０． Ｓｉｎｃｌａｉｒ Ｅ、Ｔｒｉｖｅｄｉ Ｄ、Ｓａｒｋａｒ Ｄら、Ｓｅｂｕｍ：Ａ Ｗｉｎｄｏｗ ｉｎｔｏ Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ． ２０２０． ＤＯＩ：１０．２６４３４／ｃｈｅｍｒｘｉｖ．１１６０３６１３．
５１． Ｓｈｅｔａｇｅ ＳＳ、Ｔｒａｙｎｏｒ ＭＪ、Ｂｒｏｗｎ ＭＢ、Ｇａｌｌｉｆｏｒｄ ＴＭ、Ｃｈｉｌｃｏｔｔ ＲＰ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｂｏｍｉｃｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｓｋｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｔｙｐｅ－１ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２０１７；７：１－８．
５２． Ｂａｒｒａｎ、Ｐｅｒｄｉｔａ；Ｓａｒｋａｒ，Ｄｅｐａｎｊａｎ；Ｔｒｉｖｅｄｉ，ｄｒｕｐａｄ；Ｔｉｌｏ，Ｋｕｎａｔｈ；Ｍｉｌｎｅ，ｊｏｙ；ｓｉｎｃｌａｉｒ Ｅ． Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｏｆ． ２０１９．
５３． Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｔ、Ｖｏｉｓｉｎ Ｂ、Ｋｉｍ ＤＹら、Ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｃ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｓｅｂａｃｅｏｕｓ Ｇｌａｎｄｓ ｂｙ Ｉｎｎａｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｃｅｌｌｓ Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｃｏｍｍｅｎｓａｌ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ． Ｃｅｌｌ ２０１９；１７６：９８２－９９７．ｅ１６．
５４． Ｓｔｒｕｗｅ Ｗ、Ｅｍｍｏｔｔ Ｅ、Ｂａｉｌｅｙ Ｍら、Ｔｈｅ ＣＯＶＩＤ－１９ ＭＳ Ｃｏａｌｉｔｉｏｎ－ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｓ，ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ． Ｌａｎｃｅｔ ２０２０；３９５：１７６１－２．
５５． Ｓｉｎｃｌａｉｒ Ｅ、Ｔｒｉｖｅｄｉ Ｄ、Ｓａｒｋａｒ Ｄら、Ｓｅｂｕｍ：Ａ Ｗｉｎｄｏｗ ｉｎｔｏ Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ． ２０２０． ＤＯＩ：１０．２６４３４／ｃｈｅｍｒｘｉｖ．１１６０３６１３．
５６． Ｆａｌｌ Ｆ、Ｌｅｎｕｚｚａ Ｎ、Ｌａｍｙ Ｅら、Ａ ｓｐｌｉｔ－ｒａｎｇｅ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ ｗｉｔｈ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ － ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ２０１９；１１２８：１２１７８０．
５７． Ｒａｎｎｉｎｇｅｒ Ｃ、Ｓｃｈｍｉｄｔ ＬＥ、Ｒｕｒｉｋ Ｍら、Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｇｌｏｂａｌ ｆｅａｔｕｒｅ ｄｅｔｅｃｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｃａｎ ｒａｎｇｅ ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ ｆｏｒ ｕｎｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ ｂｙ ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ａｎａｌ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ ２０１６；９３０：１３－２２．
５８． Ｒｏｈａｒｔ Ｆ、Ｇａｕｔｉｅｒ Ｂ、Ｓｉｎｇｈ Ａ、Ｌｅ Ｃａｏ ＫＡ． ｍｉｘＯｍｉｃｓ：Ａｎ Ｒ ｐａｃｋａｇｅ ｆｏｒ ‘ｏｍｉｃｓ ｆｅａｔｕｒｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄａｔａ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ． ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ ２０１７；１３． ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｃｂｉ．１００５７５２．
５９． Ｒ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ． Ｒ：Ａ Ｌａｎｇｕａｇｅ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ． ２０２０．
６０． Ｗｅｎｈａｍ Ｃ、Ｓｍｉｔｈ Ｊ、Ｍｏｒｇａｎ Ｒ． ＣＯＶＩＤ－１９：ｔｈｅ ｇｅｎｄｅｒｅｄ ｉｍｐａｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｏｕｔｂｒｅａｋ． Ｌａｎｃｅｔ ２０２０；３９５：８４６－８．
６１． Ｋｎｉｇｈｔ ＳＲ、Ｈｏ Ａ、Ｐｉｕｓ Ｒら、Ｒｉｓｋ ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｄｍｉｔｔｅｄ ｔｏ ｈｏｓｐｉｔａｌ ｗｉｔｈ ｃｏｖｉｄ－１９ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＩＳＡＲＩＣ ＷＨＯ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ４Ｃ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ Ｓｃｏｒｅ． ＢＭＪ ２０２０；３７０：ｍ３３３９．
６２． Ｙａｐ ＢＷ、Ｓｉｍ ＣＨ． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｎｏｒｍａｌｉｔｙ ｔｅｓｔｓ． Ｊ Ｓｔａｔ Ｃｏｍｐｕｔ Ｓｉｍｕｌ ２０１１；８１：２１４１－５５．
６３． Ｗｅｉ Ｘ、Ｚｅｎｇ Ｗ、Ｓｕ Ｊら、Ｈｙｐｏｌｉｐｉｄｅｍｉａ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｏｆ ＣＯＶＩＤ－１９． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌｉｐｉｄｏｌ ２０２０；１４：２９７－３０４．
６４． Ｅｓｌｅｒ ＷＰ、Ｔｅｓｚ ＧＪ、Ｈｅｌｌｅｒｓｔｅｉｎ ＭＫら、Ｈｕｍａｎ ｓｅｂｕｍ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｄｅ ｎｏｖｏ ｌｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ａｃｎｅ ｖｕｌｇａｒｉｓ ａｎｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ． Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１９；１１：１－１４．
６５． Ｗａｇｎｅｒ Ｊ、ＤｕＰｏｎｔ Ａ、Ｌａｒｓｏｎ Ｓ、Ｃａｓｈ Ｂ、Ｆａｒｏｏｑ Ａ． Ａｂｓｏｌｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｃｏｕｎｔ ｉｓ ａ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ ｉｎ Ｃｏｖｉｄ－１９：Ａ ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｃｏｈｏｒｔ ｒｅｖｉｅｗ． Ｉｎｔ Ｊ Ｌａｂ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０２０；ｎ／ａ． ＤＯＩ：１０．１１１１／ｉｊｌｈ．１３２８８．
６６． Ｅｙｒｅ ＭＴ、Ｂｕｒｎｓ Ｒ、Ｋｉｒｋｂｙ Ｖら、Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｂａｓｅｌｉｎｅ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｃｏｕｇｈ ａｎｄ ｆｅｖｅｒ ｏｎ ＵＫ ＣＯＶＩＤ－１９ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｔｅｓｔｉｎｇ ｒａｔｅｓ：ｅｓｔｉｍａｔｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｂｕｇ Ｗａｔｃｈ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｃｏｈｏｒｔ ｓｔｕｄｙ． ｍｅｄＲｘｉｖ ２０２０；：２０２０．０９．０３．２０１８７３７７．
１． ＤｅＭａａｇｄ，Ｇ．及びＡ．Ｐｈｉｌｉｐ、Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ：Ｐａｒｔ １：Ｄｉｓｅａｓｅ Ｅｎｔｉｔｙ，Ｒｉｓｋ Ｆａｃｔｏｒｓ，Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ． Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２０１５． ４０（８）：５０４－５３２頁．
２． Ｃｈｅｎｇ，Ｈ．－Ｃ．、Ｃ．Ｍ．Ｕｌａｎｅ、及びＲ．Ｅ．Ｂｕｒｋｅ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｘｏｎｓ． Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、２０１０． ６７（６）：７１５－７２５頁．
３． Ｍｏｒｇａｎ，Ｊ．、Ｊｏｙ ｏｆ ｓｕｐｅｒ ｓｍｅｌｌｅｒ：ｓｅｂｕｍ ｃｌｕｅｓ ｆｏｒ ＰＤ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ． Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ． １５（２）：１３８－１３９頁．
４． Ｗｏｏｄ－Ｋａｃｚｍａｒ，Ａ．、Ｓ．Ｇａｎｄｈｉ、及びＮ．Ｗｏｏｄ、Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃａｕｓｅｓ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００６． １２（１１）：５２１－５２８頁．
５． Ｋｒｅｓｔｉｎ，Ｄ．、Ｔｈｅ Ｓｅｂｏｒｒｈｏｅｉｃ Ｆａｃｉｅｓ ａｓ ａ Ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｓｔ－Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｃ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ ａｎｄ Ａｌｌｉｅｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ． ＱＪＭ：Ａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９２７． ｏｓ－２１（８１）：１７７－１８６頁．
６． Ｄｏｎａｄｉｏ，Ｖ．ら、Ｓｋｉｎ ｎｅｒｖｅ ａｌｐｈａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｄｅｐｏｓｉｔｓ：ａ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、２０１４． ８２（１５）：１３６２－９頁．
７． Ｓｈｉｒａｓｕ，Ｍ．及びＫ．Ｔｏｕｈａｒａ、Ｔｈｅ ｓｃｅｎｔ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ：ｖｏｌａｔｉｌｅ ｏｒｇａｎｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｂｏｄｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｄｉｓｏｒｄｅｒ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１１． １５０（３）：２５７－２６６頁．
８． Ｐｉｚｚｉｎｉ，Ａ．ら、Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｏｒｇａｎｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒｅａｔｈ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｔａｂｌｅ ｏｒ ａｃｕｔｅ ｅｘａｃｅｒｂａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｒｅａｔｈ ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１８．
９． Ｉｓｈｉｂｅ，Ａ．ら、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｓ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ． Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ、２０１８．
１０． Ｃｈａｎｇ，Ｊ．－Ｅ．ら、Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｏｒｇａｎｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｉｎ ｅｘｈａｌｅｄ ｂｒｅａｔｈ ｆｏｒ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｅｎｓｏｒ ｓｙｓｔｅｍ． Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ｂ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ、２０１８． ２５５：８００－８０７頁．
１１． Ｌａｗａｌ，Ｏ．ら、Ｈｅａｄｓｐａｃｅ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｏｒｇａｎｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｒｏｍ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ ｉｎ ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ａｎａｌｙｓｅｄ ｂｙ ＴＤ－ＧＣ／ＭＳ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｒｅａｔｈ ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１８． １２（２）：０２６００２頁．
１２． Ｒａｔｔｒａｙ，Ｎ．Ｊ．Ｗ．ら、Ｔａｋｉｎｇ ｙｏｕｒ ｂｒｅａｔｈ ａｗａｙ：ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ ｂｒｅａｔｈｅｓ ｌｉｆｅ ｉｎ ｔｏ ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ． Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１４． ３２（１０）：５３８－５４８頁．
１３． Ｘｉｅ，Ｊ．ら、Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｅｒｐｅｎｏｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｏｌｅｏｃｅｌｌｏｓｉｓ ｐｅｅｌ． Ｆｏｏｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１８． ２４３：２６９－２７６頁．
１４． Ｇａｔｚｉａｓ，Ｉ．ら、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｈｅｅｐ’ｓ ｍｉｌｋ ｆｒｏｍ Ｇｒｅｅｋ ｂｒｅｅｄｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ，ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｐｒｏｆｉｌｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、２０１８．
１５． Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｎ．ら、Ｖｏｌａｔｉｌｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ｂｙ Ｈｅａｄｓｐａｃｅ Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－Ｉｏｎ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＨＳ－ＧＣ－ＩＭＳ） ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃｉｔｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｏｎｅｙ ａｓ Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｏ １Ｈ－ＮＭＲ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１８．
１６． Ｌｉｕ，Ｔ．ら、Ａｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｎｏｓｅ Ｂａｓｅｄ Ｂｅｖｅｒａｇｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａｎ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｆｉｓｈｅｒ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｍｅｔｈｏｄ．
１７． Ａｂｅｄｉ，Ｇ．、Ｚ．Ｔａｌｅｂｐｏｕｒ、及びＦ．Ｊａｍｅｃｈｅｎａｒｂｏｏ、Ｔｈｅ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｆｒａｇｒａｎｃｅｓ ｉｎ ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｐｅｒｓｏｎａｌ ｃａｒｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ． ＴｒＡＣ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１８．
１８． Ｒｏｓｉｅｒ，Ｅ．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ ＴＤ－ＧＣ／ＭＳ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ａｎｉｍａｌ ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１４． ４０６（１５）：３６１１－３６１９頁．
１９． Ｓａｒｉｏｌ，Ｈ．Ｃ．ら、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃａｒｂｏｎ ｉｎ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｒｕｍ “ｆｉｌｔｅｒｓ” ｂａｓｅｄ ｏｎ ＴＧＡ，ＴＤ－ＧＣ／ＭＳ，ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ ａｎｄ ＮＭＲ ｒｅｌａｘｏｍｅｔｒｙ． Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｔｏｄａｙ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２０１７． １１：１－１０頁．
２０． Ｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．及びＣ．Ｍｙｅｒｓ、Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｃｉｇａｒｅｔｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔａｎｔ ａｅｒｏｓｏｌ ｐｒｏｆｉｌｅｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ、２０１５． １４１８：１９２－１９９頁．
２１． Ｄｕｎｎ，Ｗ．Ｂ．ら、Ｓｙｓｔｅｍｓ ｌｅｖｅｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅｓ：ｔｈｅ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ． Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｒｅｖ、２０１１． ４０（１）：３８７－４２６頁．
２２． Ｇｏｏｄａｃｒｅ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｐｏｓｅｄ ｍｉｎｉｍｕｍ ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ． Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ、２００７． ３（３）：２３１－２４１頁．
２３． Ｗｉｋｏｆｆ，Ｗ．Ｒ．ら、Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｌａｒｇｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ ｏｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｂｌｏｏｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２００９． １０６（１０）：３６９８－３７０３頁．
２４． Ｆｅｎｎ，Ｊ．Ｂ．；Ｍａｎｎ，Ｍ．；Ｍｅｎｇ，Ｃ．Ｋ．；Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｆ．；Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ，Ｃ．Ｍ．、Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１８８３－） １９８９、２４６（４９２６）、６４－７１．
２５． Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ，Ｆ．；Ｋａｒａｓ，Ｍ．；Ｂｅａｖｉｓ，Ｒ．Ｃ．；Ｃｈａｉｔ，Ｂ．Ｔ．、Ｍａｔｒｉｘ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ． Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ． １９９１、６３（２４）、１１９３Ａ－１２０３Ａ．
２６． Ｃｏｏｋｓ，Ｒ．Ｇ．；Ｏｕｙａｎｇ，Ｚ．；Ｔａｋａｔｓ，Ｚ．；Ｗｉｓｅｍａｎ，Ｊ．Ｍ．、Ａｍｂｉｅｎｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，Ｕ．Ｓ．） ２００６、３１１（５７６７）、１５６６－１５７０．
２７． Ｔａｋａｔｓ，Ｚ．；Ｗｉｓｅｍａｎ，Ｊ．Ｍ．；Ｇｏｌｏｇａｎ，Ｂ．；Ｃｏｏｋｓ，Ｒ．Ｇ．、Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｓａｍｐｌｉｎｇ Ｕｎｄｅｒ Ａｍｂｉｅｎｔ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，Ｕ．Ｓ．） ２００４、３０６（５６９５）、４７１－４７３．
２８． Ｃｏｄｙ，Ｒ．Ｂ．；Ｌａｒａｍｅｅ，Ｊ．Ａ．；Ｄｕｒｓｔ，Ｈ．Ｄ．、Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｎｅｗ ｉｏｎ ｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｉｎ ｏｐｅｎ ａｉｒ ｕｎｄｅｒ ａｍｂｉｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ． ２００５、７７（８）、２２９７－２３０２．
２９． Ｈａｒｒｉｓ，Ｇ．Ａ．；Ｇａｌｈｅｎａ，Ａ．Ｓ．；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｆ．Ｍ．、Ａｍｂｉｅｎｔ Ｓａｍｐｌｉｎｇ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｒｅｎｄｓ． Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，Ｕ．Ｓ．） ２０１１、８３（１２）、４５０８－４５３８．
３０． Ｌｉｕ，Ｊ．；Ｗａｎｇ，Ｈ．；Ｍａｎｉｃｋｅ，Ｎ．Ｅ．；Ｌｉｎ，Ｊ．－Ｍ．；Ｃｏｏｋｓ，Ｒ．Ｇ．；Ｏｕｙａｎｇ，Ｚ．、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｐｅｒ Ｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ． Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，Ｕ．Ｓ．） ２０１０、８２（６）、２４６３－２４７１．
３１． Ｗａｎｇ，Ｈ．；Ｌｉｕ，Ｊ．；Ｃｏｏｋｓ，Ｒ．Ｇ．；Ｏｕｙａｎｇ，Ｚ．、Ｐａｐｅｒ Ｓｐｒａｙ ｆｏｒ Ｄｉｒｅｃｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｍｉｘｔｕｒｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ． ２０１０、４９（５）、８７７－８８０、Ｓ８７７／１－Ｓ８７７／７．
３２． Ｄａｍｏｎ，Ｄ．Ｅ．；Ｄａｖｉｓ，Ｋ．Ｍ．；Ｍｏｒｅｉｒａ，Ｃ．Ｒ．；Ｃａｐｏｎｅ，Ｐ．；Ｃｒｕｔｔｅｎｄｅｎ，Ｒ．；Ｂａｄｕ－Ｔａｗｉａｈ，Ａ．Ｋ．、Ｄｉｒｅｃｔ Ｂｉｏｆｌｕｉｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｕｓｉｎｇ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ Ｐａｐｅｒ Ｓｐｒａｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，Ｕ．Ｓ．） ２０１６、８８（３）、１８７８－１８８４．
３３． Ｅｓｐｙ，Ｒ．Ｄ．；Ｔｅｕｎｉｓｓｅｎ，Ｓ．Ｆ．；Ｍａｎｉｃｋｅ，Ｎ．Ｅ．；Ｒｅｎ，Ｙ．；Ｏｕｙａｎｇ，Ｚ．；ｖａｎ Ａｓｔｅｎ，Ａ．；Ｃｏｏｋｓ，Ｒ．Ｇ．、Ｐａｐｅｒ Ｓｐｒａｙ ａｎｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｐｒａｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｉｒｅｃｔ ａｎｄ Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｉｇｈｔ Ｄｒｕｇｓ ｏｆ Ａｂｕｓｅ ｉｎ Ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ． Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，Ｕ．Ｓ．） ２０１４、８６（１５）、７７１２－７７１８．
３４． Ｍｉｃｈｅｌｙ，Ｊ．Ａ．；Ｍｅｙｅｒ，Ｍ．Ｒ．；Ｍａｕｒｅｒ，Ｈ．Ｈ．、Ｐａｐｅｒ Ｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｏ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｔａｎｄｅｍ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｆｏｒ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｕｒｉｎｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｉｎ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｏ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｆｔｅｒ Ｕｒｉｎｅ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｏｒ Ｄｒｉｅｄ Ｕｒｉｎｅ Ｓｐｏｔ Ｗｏｒｋｕｐ． Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，Ｕ．Ｓ．） ２０１７、８９（２１）、１１７７９－１１７８６．
３５． Ｇａｂｅｌｉｃａ，Ｖ．；Ｓｈｖａｒｔｓｂｕｒｇ，Ａ．Ａ．；Ａｆｏｎｓｏ，Ｃ．；Ｂａｒｒａｎ，Ｐ．；Ｂｅｎｅｓｃｈ，Ｊ．Ｌ．Ｐ．；Ｂｌｅｉｈｏｌｄｅｒ，Ｃ．；Ｂｏｗｅｒｓ，Ｍ．Ｔ．；Ｂｉｌｂａｏ，Ａ．；Ｂｕｓｈ，Ｍ．Ｆ．；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｊ．Ｌ．；Ｃａｍｐｕｚａｎｏ，Ｉ．Ｄ．Ｇ．；Ｃａｕｓｏｎ，Ｔ．；Ｃｌｏｗｅｒｓ，Ｂ．Ｈ．；Ｃｒｅａｓｅｒ，Ｃ．Ｓ．；Ｄｅ Ｐａｕｗ，Ｅ．；Ｆａｒ，Ｊ．；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｌｉｍａ，Ｆ．；Ｆｊｅｌｄｓｔｅｄ，Ｊ．Ｃ．；Ｇｉｌｅｓ，Ｋ．；Ｇｒｏｅｓｓｌ，Ｍ．；Ｈｏｇａｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｊｒ．；Ｈａｎｎ，Ｓ．；Ｋｉｍ，Ｈ．Ｉ．；Ｋｕｒｕｌｕｇａｍａ，Ｒ．Ｔ．；Ｍａｙ，Ｊ．Ｃ．；ＭｃＬｅａｎ，Ｊ．Ａ．；Ｐａｇｅｌ，Ｋ．；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｋ．；Ｒｉｄｇｅｗａｙ，Ｍ．Ｅ．；Ｒｏｓｕ，Ｆ．；Ｓｏｂｏｔｔ，Ｆ．；Ｔｈａｌａｓｓｉｎｏｓ，Ｋ．；Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ，Ｓ．Ｊ．；Ｗｙｔｔｅｎｂａｃｈ，Ｔ．、Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ ｉｏｎ ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．Ｒｅｖ． ２０１９、３８（３）、２９１－３２０．
３６． Ｙａｎ，Ｃ．；Ｐａｒｍｅｇｇｉａｎｉ，Ｆ．；Ｊｏｎｅｓ，Ｅ．Ａ．；Ｃｌａｕｄｅ，Ｅ．；Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｓ．Ａ．；Ｔｕｒｎｅｒ，Ｎ．Ｊ．；Ｆｌｉｔｓｃｈ，Ｓ．Ｌ．；Ｂａｒｒａｎ，Ｐ．Ｅ．、Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ ｉｎ Ｌｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｏｌｏｎｉｅｓ． Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． ２０１７、１３９（４）、１４０８－１４１１．
３７． Ｍｙｕｎｇ，Ｓ．；Ｗｉｓｅｍａｎ，Ｊ．Ｍ．；Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ，Ｓ．Ｊ．；Ｔａｋａｔｓ，Ｚ．；Ｃｏｏｋｓ，Ｒ．Ｇ．；Ｃｌｅｍｍｅｒ，Ｄ．Ｅ．、Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｉｏｎ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ／Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｌｄｅｄ ａｎｄ Ｄｅｎａｔｕｒｅｄ Ｓｔａｔｅｓ． Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ ２００６、１１０（１０）、５０４５－５０５１．
３８． Ｊａｃｋｓｏｎ，Ａ．Ｔ．；Ｓｃｒｉｖｅｎｓ，Ｊ．Ｈ．；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．Ｐ．；Ｂａｋｅｒ，Ｅ．Ｓ．；Ｇｉｄｄｅｎ，Ｊ．；Ｂｏｗｅｒｓ，Ｍ．Ｔ．、Ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙｅｔｈｅｒ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ． Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ． ２００４、２３８（３）、２８７－２９７．
３９． Ｍａｎｉｃｋｅ，Ｎ．Ｅ．；Ｂｅｌｆｏｒｄ，Ｍ．、Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｐｉａｔｅ Ｉｓｏｍｅｒｓ Ｕｓｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐａｐｅｒ Ｓｐｒａｙ Ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｏ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｅｌｄ Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｗａｖｅｆｏｒｍ Ｉｏｎ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ． ２０１５、２６（５）、７０１－７０５．
４０． ＷＨＯ． ＷＨＯ ａｄｖｉｃｅ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｔｒａｖｅｌ ａｎｄ ｔｒａｄｅ ｉｎ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｏｆ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ａ ｎｅｗ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｃｈｉｎａ． ２０１９． ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｎｅｗｓ－ｒｏｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅｓ－ｄｅｔａｉｌ／ｗｈｏ－ａｄｖｉｃｅ－ｆｏｒ－ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ－ｔｒａｖｅｌ－ａｎｄ－ｔｒａｄｅ－ｉｎ－ｒｅｌａｔｉｏｎ－ｔｏ－ｔｈｅ－ｏｕｔｂｒｅａｋ－ｏｆ－ｐｎｅｕｍｏｎｉａ－ｃａｕｓｅｄ－ｂｙ－ａ－ｎｅｗ－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ－ｉｎ－ｃｈｉｎａ （２０２０年７月２７日にアクセス）．
４１． ＷＨＯ． Ｎｏｖｅｌ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ － Ｃｈｉｎａ． ２０２０． ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｃｓｒ／ｄｏｎ／１２－ｊａｎｕａｒｙ－２０２０－ｎｏｖｅｌ－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ－ｃｈｉｎａ／ｅｎ／ （２０２０年７月２７日にアクセス）．
４２． Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ． Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＣＯＶＩＤ－１９ ｔｅｓｔｉｎｇ ｒａｔｅｓ ｏｎ ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚａｔｉｏｎｓ． ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｂｕｌｌｅｔｉｎ／ｖｏｌｕｍｅｓ／９８／５／２０－２５８１８６／ｅｎ／（２０２０年９月２９日にアクセス）．
４３． Ｒｕｓｚｋｉｅｗｉｃｚ ＤＭ、Ｓａｎｄｅｒｓ Ｄ、Ｏ’Ｂｒｉｅｎ Ｒら、Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ＣＯＶＩＤ－１９ ｂｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｒｅａｔｈ ｗｉｔｈ ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｉｏｎ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ － ａ ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ ｓｔｕｄｙ． ＥＣｌｉｎｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ ２０２０． ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｅｃｌｉｎｍ．２０２０．１００６０９．
４４． Ａｂｕ－Ｆａｒｈａ Ｍ、Ｔｈａｎａｒａｊ ＴＡ、Ｑａｄｄｏｕｍｉ ＭＧ、Ｈａｓｈｅｍ Ａ、Ａｂｕｂａｋｅｒ Ｊ、Ａｌ－Ｍｕｌｌａ Ｆ． Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ＣＯＶＩＤ－１９ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｓ ａ ｄｒｕｇ ｔａｒｇｅｔ． Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ ２０２０；２１． ＤＯＩ：１０．３３９０／ｉｊｍｓ２１１０３５４４．
４５． Ｏｖｅｒｍｙｅｒ ＫＡ、Ｓｈｉｓｈｋｏｖａ Ｅ、Ｍｉｌｌｅｒ ＩＪら、Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ Ｍｕｌｔｉ－ｏｍｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＣＯＶＩＤ－１９ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ． Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔ ２０２０；：１－１８．
４６． Ｓｏｎｇ ＪＷ、Ｌａｍ ＳＭ、Ｆａｎ Ｘら、Ｏｍｉｃｓ－Ｄｒｉｖｅｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ＣＯＶＩＤ－１９ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ ２０２０；３２：１８８－２０２．ｅ５．
４７． Ｄｅ Ｓｉｌｖａ ＩＷ、Ｎａｙｅｋ Ｓ、Ｓｉｎｇｈ Ｖ、Ｒｅｄｄｙ Ｊ、Ｇｒａｎｇｅｒ ＪＫ、Ｖｅｒｂｅｃｋ ＧＦ． Ｐａｐｅｒ ｓｐｒａｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ Ｔｅｓｌｉｎ（Ｒ） ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ＣＯＶＩＤ－１９ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ａｎａｌｙｓｔ ２０２０；１４５． ＤＯＩ：１０．１０３９／ｄ０ａｎ０１０７４ｊ．
４８． Ｗｕ Ｄ、Ｓｈｕ Ｔ、Ｙａｎｇ Ｘら、Ｐｌａｓｍａ ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ ａｎｄ ｌｉｐｉｄｏｍｉｃ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＣＯＶＩＤ－１９． Ｎａｔｌ Ｓｃｉ Ｒｅｖ ２０２０；７：１１５７－６８．
４９． Ｊｅｎｄｒｎｙ Ｐ、Ｓｃｈｕｌｚ Ｃ、Ｔｗｅｌｅ Ｆら、Ｓｃｅｎｔ ｄｏｇ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ ＣＯＶＩＤ－１９ ｐａｔｉｅｎｔｓ － Ａ ｐｉｌｏｔ ｓｔｕｄｙ． ＢＭＣ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２０２０；２０：１－７．
５０． Ｓｉｎｃｌａｉｒ Ｅ、Ｔｒｉｖｅｄｉ Ｄ、Ｓａｒｋａｒ Ｄら、Ｓｅｂｕｍ：Ａ Ｗｉｎｄｏｗ ｉｎｔｏ Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ． ２０２０． ＤＯＩ：１０．２６４３４／ｃｈｅｍｒｘｉｖ．１１６０３６１３．
５１． Ｓｈｅｔａｇｅ ＳＳ、Ｔｒａｙｎｏｒ ＭＪ、Ｂｒｏｗｎ ＭＢ、Ｇａｌｌｉｆｏｒｄ ＴＭ、Ｃｈｉｌｃｏｔｔ ＲＰ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｂｏｍｉｃｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｓｋｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｔｙｐｅ－１ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２０１７；７：１－８．
５２． Ｂａｒｒａｎ、Ｐｅｒｄｉｔａ；Ｓａｒｋａｒ，Ｄｅｐａｎｊａｎ；Ｔｒｉｖｅｄｉ，ｄｒｕｐａｄ；Ｔｉｌｏ，Ｋｕｎａｔｈ；Ｍｉｌｎｅ，ｊｏｙ；ｓｉｎｃｌａｉｒ Ｅ． Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｏｆ． ２０１９．
５３． Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｔ、Ｖｏｉｓｉｎ Ｂ、Ｋｉｍ ＤＹら、Ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｃ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｓｅｂａｃｅｏｕｓ Ｇｌａｎｄｓ ｂｙ Ｉｎｎａｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｃｅｌｌｓ Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｃｏｍｍｅｎｓａｌ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ． Ｃｅｌｌ ２０１９；１７６：９８２－９９７．ｅ１６．
５４． Ｓｔｒｕｗｅ Ｗ、Ｅｍｍｏｔｔ Ｅ、Ｂａｉｌｅｙ Ｍら、Ｔｈｅ ＣＯＶＩＤ－１９ ＭＳ Ｃｏａｌｉｔｉｏｎ－ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｓ，ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ． Ｌａｎｃｅｔ ２０２０；３９５：１７６１－２．
５５． Ｓｉｎｃｌａｉｒ Ｅ、Ｔｒｉｖｅｄｉ Ｄ、Ｓａｒｋａｒ Ｄら、Ｓｅｂｕｍ：Ａ Ｗｉｎｄｏｗ ｉｎｔｏ Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ． ２０２０． ＤＯＩ：１０．２６４３４／ｃｈｅｍｒｘｉｖ．１１６０３６１３．
５６． Ｆａｌｌ Ｆ、Ｌｅｎｕｚｚａ Ｎ、Ｌａｍｙ Ｅら、Ａ ｓｐｌｉｔ－ｒａｎｇｅ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ ｗｉｔｈ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ － ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ２０１９；１１２８：１２１７８０．
５７． Ｒａｎｎｉｎｇｅｒ Ｃ、Ｓｃｈｍｉｄｔ ＬＥ、Ｒｕｒｉｋ Ｍら、Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｇｌｏｂａｌ ｆｅａｔｕｒｅ ｄｅｔｅｃｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｃａｎ ｒａｎｇｅ ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ ｆｏｒ ｕｎｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ ｂｙ ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ａｎａｌ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ ２０１６；９３０：１３－２２．
５８． Ｒｏｈａｒｔ Ｆ、Ｇａｕｔｉｅｒ Ｂ、Ｓｉｎｇｈ Ａ、Ｌｅ Ｃａｏ ＫＡ． ｍｉｘＯｍｉｃｓ：Ａｎ Ｒ ｐａｃｋａｇｅ ｆｏｒ ‘ｏｍｉｃｓ ｆｅａｔｕｒｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄａｔａ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ． ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ ２０１７；１３． ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｃｂｉ．１００５７５２．
５９． Ｒ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ． Ｒ：Ａ Ｌａｎｇｕａｇｅ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ． ２０２０．
６０． Ｗｅｎｈａｍ Ｃ、Ｓｍｉｔｈ Ｊ、Ｍｏｒｇａｎ Ｒ． ＣＯＶＩＤ－１９：ｔｈｅ ｇｅｎｄｅｒｅｄ ｉｍｐａｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｏｕｔｂｒｅａｋ． Ｌａｎｃｅｔ ２０２０；３９５：８４６－８．
６１． Ｋｎｉｇｈｔ ＳＲ、Ｈｏ Ａ、Ｐｉｕｓ Ｒら、Ｒｉｓｋ ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｄｍｉｔｔｅｄ ｔｏ ｈｏｓｐｉｔａｌ ｗｉｔｈ ｃｏｖｉｄ－１９ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＩＳＡＲＩＣ ＷＨＯ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ４Ｃ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ Ｓｃｏｒｅ． ＢＭＪ ２０２０；３７０：ｍ３３３９．
６２． Ｙａｐ ＢＷ、Ｓｉｍ ＣＨ． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｎｏｒｍａｌｉｔｙ ｔｅｓｔｓ． Ｊ Ｓｔａｔ Ｃｏｍｐｕｔ Ｓｉｍｕｌ ２０１１；８１：２１４１－５５．
６３． Ｗｅｉ Ｘ、Ｚｅｎｇ Ｗ、Ｓｕ Ｊら、Ｈｙｐｏｌｉｐｉｄｅｍｉａ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｏｆ ＣＯＶＩＤ－１９． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌｉｐｉｄｏｌ ２０２０；１４：２９７－３０４．
６４． Ｅｓｌｅｒ ＷＰ、Ｔｅｓｚ ＧＪ、Ｈｅｌｌｅｒｓｔｅｉｎ ＭＫら、Ｈｕｍａｎ ｓｅｂｕｍ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｄｅ ｎｏｖｏ ｌｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ａｃｎｅ ｖｕｌｇａｒｉｓ ａｎｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ． Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１９；１１：１－１４．
６５． Ｗａｇｎｅｒ Ｊ、ＤｕＰｏｎｔ Ａ、Ｌａｒｓｏｎ Ｓ、Ｃａｓｈ Ｂ、Ｆａｒｏｏｑ Ａ． Ａｂｓｏｌｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｃｏｕｎｔ ｉｓ ａ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ ｉｎ Ｃｏｖｉｄ－１９：Ａ ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｃｏｈｏｒｔ ｒｅｖｉｅｗ． Ｉｎｔ Ｊ Ｌａｂ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０２０；ｎ／ａ． ＤＯＩ：１０．１１１１／ｉｊｌｈ．１３２８８．
６６． Ｅｙｒｅ ＭＴ、Ｂｕｒｎｓ Ｒ、Ｋｉｒｋｂｙ Ｖら、Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｂａｓｅｌｉｎｅ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｃｏｕｇｈ ａｎｄ ｆｅｖｅｒ ｏｎ ＵＫ ＣＯＶＩＤ－１９ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｔｅｓｔｉｎｇ ｒａｔｅｓ：ｅｓｔｉｍａｔｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｂｕｇ Ｗａｔｃｈ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｃｏｈｏｒｔ ｓｔｕｄｙ． ｍｅｄＲｘｉｖ ２０２０；：２０２０．０９．０３．２０１８７３７７．
【図1A】
【図1B】
【図2A(1)】
【図2A(2)】
【図2A(3)】
【図2A(4)】
【図2B】
【図2C】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18(1)】
【図18(2)】
【図19】
【図20(1)】
【図20(2)】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24(1)】
【図24(2)】
【図25】
【図26(1)】
【図26(2)】
【図27】
【図28(1)】
【図28(2)】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49】
【図50】
【図51】
【図52】
【国際調査報告】