特表2023-512547ＣＤ７１を用いた自己癌抗原反応性ＣＤ８Ｔ細胞分離方法およびその応用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-27
(54)【発明の名称】ＣＤ７１を用いた自己癌抗原反応性ＣＤ８Ｔ細胞分離方法およびその応用
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0783 20100101AFI20230317BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230317BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20230317BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20230317BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0783 ZNA
A61P35/00
A61K35/17
A61P35/02
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022547768
(86)(22)【出願日】2021-02-02
(85)【翻訳文提出日】2022-08-03
(86)【国際出願番号】 KR2021001346
(87)【国際公開番号】W WO2021157993
(87)【国際公開日】2021-08-12
(31)【優先権主張番号】10-2020-0012409
(32)【優先日】2020-02-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522310993
【氏名又は名称】サムダ バイオテック カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＳＡＭＤＡ ＢＩＯＴＥＣ ＣＯ．， ＬＴＤ
【住所又は居所原語表記】（Ｍａｄｕ－ｄｏｎｇ） ４Ｆ， Ｒｏｏｍ ９， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ３２３， Ｉｌｓａｎ－ｒｏ， Ｉｌｓａｎｄｏｎｇ－ｇｕ， Ｇｏｙａｎｇ－ｓｉ， Ｇｙｅｏｎｇｇｉ－ｄｏ １０４０８， Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】100125450
【弁理士】
【氏名又は名称】河野 広明
(72)【発明者】
【氏名】チェ、ボムギュ
(72)【発明者】
【氏名】キム、ソンヒ
(72)【発明者】
【氏名】イ、ウンソク
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AC12
4B065AC20
4B065BA30
4B065BB19
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA04
4C087BB63
4C087NA14
4C087ZB26
4C087ZB27
(57)【要約】
本発明は、ＣＤ７１を用いて自己癌抗原反応性ＣＤ８Ｔ細胞を単離する方法およびその応用に関する。本発明の分離方法を用いて自己癌抗原反応性ＣＤ８Ｔ細胞を分離する場合、自己癌抗原に特異的なＣＤ８Ｔ細胞以外に様々な癌抗原に反応するＣＤ８Ｔ細胞も一緒に分離されるので、より少ない血液でも大量にＣＤ８Ｔ細胞数を増幅して有意な抗癌効果を提供することができる。したがって、養子細胞の治療など、治療のために一時的な免疫不全を誘導する免疫治療などに効果的に使用することができる。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ）癌患者の血液由来ＰＢＭＣに自己癌抗原由来ペプチドを添加および培養した後、自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖を誘導する工程；ｂ）上記工程ａ）における自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖レベルが高い自己癌抗原由来ペプチドを選択する工程；
ｃ）前記工程ｂ）で選択された自己癌抗原由来ペプチドを、前記工程ａ）の癌患者と同一の癌患者の血液由来ＰＢＭＣに添加して培養する工程；及び
ｄ）前記工程ｃ）の培養ＰＢＭＣからＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離する工程；を含む、
自己癌抗原反応性ＣＤ８Ｔ細胞単離方法。
【請求項2】
前記工程ａ）の癌が、胃癌、肺癌、膵臓癌、黒色腫、脳腫瘍、白血病、卵巣癌および肉腫からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の自己癌抗原反応性ＣＤ８Ｔ細胞分離方法。
【請求項3】
前記工程ａ）の自己癌抗原が、ｈＴＥＲＴ、ＷＴ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－１およびＭＡＧＥ－３からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の自己癌抗原反応性ＣＤ８Ｔ細胞分離方法。
【請求項4】
前記工程ｂ）の選択が、４－１ＢＢを発現する自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞を高発現する自己癌抗原由来ペプチドを選択することを特徴とする、請求項１に記載の自己癌抗原反応性ＣＤ８Ｔ細胞分離方法。
【請求項5】
前記工程ｃ）の癌患者の血液が１０～１００ｍｌである、請求項１に記載の自己癌抗原反応性ＣＤ８Ｔ細胞分離方法。
【請求項6】
前記工程ｃ）の培養が１２日～１７日間行われることを特徴とする、請求項１に記載の自己癌抗原反応性ＣＤ８Ｔ細胞分離方法。
【請求項7】
請求項１に記載の方法で単離された自己癌抗原反応性ＣＤ８Ｔ細胞。
【請求項8】
請求項７に記載の自己癌抗原反応性ＣＤ８Ｔ細胞を含む癌予防または治療用医薬組成物。
【請求項9】
癌患者に、請求項７に記載の自己癌抗原反応性ＣＤ８Ｔ細胞を含む組成物を投与することを含む、癌の改善または治療方法。
【請求項10】
ａ）癌患者の血液由来ＰＢＭＣに自己癌抗原由来ペプチドを添加および培養した後、自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖を誘導する工程；ｂ）上記工程ａ）における自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖レベルが高い自己癌抗原由来ペプチドを選択する工程；
ｃ）前記工程ｂ）で選択された自己癌抗原由来ペプチドを、前記工程ａ）の癌患者と同一の癌患者の血液由来ＰＢＭＣに添加して培養する工程；
ｄ）前記工程ｃ）の培養ＰＢＭＣからＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離する工程；及び
ｅ）前記工程ｄ）で単離されたＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を増幅する工程；を含む、
抗癌細胞治療剤用組成物の製造方法。
【請求項11】
前記工程ｄ）の分離は、ＰＢＭＣにおけるＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が１～２５％である場合に行われることを特徴とする、請求項１０に記載の抗癌細胞治療剤用組成物の製造方法。
【請求項12】
前記工程ｅ）の増幅が、１２日～１７日間行われ、ＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞が１０９～１０１１個となるように増幅することを特徴とする、請求項１０に記載の抗癌細胞治療剤用組成物の製造方法。
【請求項13】
請求項１０に記載の製造方法で製造された抗癌細胞治療剤用組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０２０年０２月０３日に出願された大韓民国特許出願第１０－２０２０－００１２４０９号を優先権として主張し、上記明細書全体は本出願の参考文献である。
【0002】
本発明は、ＣＤ７１を用いて自己癌抗原反応性ＣＤ８Ｔ細胞を単離する方法およびその応用に関する。
【背景技術】
【0003】
養子縁組Ｔ細胞療法（Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ）は、癌抗原特異的Ｔ細胞を単離および大量培養して癌患者に投与することによって癌を治療する方法である。初期研究では、がんに対する特異性なしにがん患者の血液やがん組織のＴ細胞を大量増殖させ、ＣＩＫ（ｃｙｔｏｋｉｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ）、ＬＡＫ（ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ）またはＴＩＬ（ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）を生産した後、癌患者に投与することによって安全性と有効性を評価した。しかし、ほとんどが癌患者で安全性は確認されたが、有効性はなかったが、臨床試験に使用されたＣＩＫ、ＬＡＫおよびＴＩＬ細胞のがんに対する特異性が低いことがその原因と判断された。がん抗原特異的Ｔ細胞を単離および大量培養するための培養方法が適用されたＴ細胞治療剤の臨床試験が順次進行され、がん細胞に対する特異性が付与されると抗がん効果は増加することが報告された。しかし、がん細胞特異的Ｔ細胞を用いても再発したがん患者を治癒させる割合は極めて低いことが分かった。 Ｔ細胞治療剤の低い効力問題を解決するための方法として、化学抗がん剤の事前投与を通じて一時的免疫不全を誘導した後にＴ細胞治療剤を投与する方法が用いられている。
【0004】
現在開発中または開発中の抗癌Ｔ細胞治療薬は、癌抗原特異的Ｔ細胞の単離および大量培養の概念を本質的に含む。全てのＴ細胞治療剤が癌細胞特異的Ｔ細胞の単離及び投与という同じ目標を有するが、Ｔ細胞の単離及び大量培養過程、並びに培養されたＴ細胞の特性は全て異なる。血液やがん組織内のがん抗原特異的Ｔ細胞の割合が極めて低いため、一般的にがん抗原特異的Ｔ細胞の分離前に、これらの細胞の比率を高めるための増幅過程をほとんど必要とする。癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞を単離するための最も代表的な方法は、ＭＨＣ Ｉ／ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｕｌｔｉｍｅｒを用いて単離する方法であるが、利用可能なＭＨＣ Ｉ／ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｕｌｔｉｍｅｒが限定的であり、多様な患者に適用できない。この限界を克服するために、活性化されたＴ細胞でのみ選択的に発現する４－１ＢＢの特性を用いた抗原特異的Ｔ細胞分離工程が開発された（韓国登録特許第１０－１５０３３４１号）。
【0005】
４－１ＢＢを使用する方法は、理論的にはあらゆる種類の癌抗原に適用できるという利点を有する。しかしながら、養子性Ｔ細胞治療のための一時的な免疫不全を誘発する場合、約１０１１個以上のリンパ球が除去されるが、この方法では、１つの癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞を１０９個の規模で提供するのにとどまる。これは、がん細胞の免疫回避の可能性から免疫不全による副作用が発生する可能性を高めることができ、これに対する解決策が求められる実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
そこで、本発明者らは、自己がん抗原に反応するＣＤ８Ｔ細胞を少量の血液から分離して短期間内に細胞治療剤に適用できる程度の有意なレベルで増幅する方法を提供しようと努力した結果、自己がん抗原で末梢血液単核球（ＰＢＭＣ）を刺激する場合、自己がん抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞以外に様々ながん抗原に反応することができるＣＤ８Ｔ細胞が一緒に増殖し、これをＣＤ７１を利用して分離する場合に有意な抗がん効果を提供可能なＣＤ８Ｔ細胞を単離および増殖できることを確認し、本発明を完成した。
【0007】
したがって、本発明の目的は、ＣＤ７１を用いて自己癌抗原反応性ＣＤ８Ｔ細胞を単離する方法およびその応用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明は、ａ）癌患者の血液由来ＰＢＭＣに自己癌抗原由来ペプチドを添加および培養した後、自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖を誘導することを含む工程；ｂ）上記工程ａ）における自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖レベルが高い自己癌抗原由来ペプチドを選択する工程；ｃ）前記工程ｂ）で選択された自己癌抗原由来ペプチドを、前記工程ａ）の癌患者と同一の癌患者の血液由来ＰＢＭＣに添加して培養する工程；及びｄ）前記工程ｃ）の培養ＰＢＭＣからＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離する工程；を含む自己癌抗原反応性ＣＤ８Ｔ細胞単離方法および前記方法で分離された自己癌抗原反応性ＣＤ８Ｔ細胞を提供する。
【0009】
本発明の好ましい一実施形態によれば、上記工程ａ）の癌は、胃癌、肺癌、膵臓癌、黒色腫、脳腫瘍、白血病、卵巣癌および肉腫からなる群から選択される少なくとも１つである。
【0010】
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記工程ａ）の自己癌抗原は、ｈＴＥＲＴ、ＷＴ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－１およびＭＡＧＥ－３からなる群から選択されるいずれか１つ以上である。
【0011】
本発明の好ましい一実施形態によれば、工程ｂ）の選択は、４－１ＢＢを発現する自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞を高発現する自己癌抗原由来ペプチドを選択することである。
【0012】
本発明の好ましい一実施形態によれば、ステップｃ）の癌患者の血液は１０～１００ｍｌである。
【0013】
本発明の好ましい一実施形態によれば、工程ｃ）の培養は１２日から１７日間行われる。
【0014】
本発明はまた、単離された自己癌抗原反応性ＣＤ８Ｔ細胞を含む癌予防または治療用医薬組成物を提供する。
【0015】
本発明はまた、癌患者に、単離された自己癌抗原反応性ＣＤ８Ｔ細胞を含む組成物を投与することを含む、癌の改善または治療方法を提供する。
【0016】
本発明はまた、ａ）癌患者の血液由来ＰＢＭＣに自己癌抗原由来ペプチドを添加および培養した後、自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖を誘導することを含む工程；ｂ）上記工程ａ）における自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖レベルが高い自己癌抗原由来ペプチドを選択する工程；ｃ）前記工程ｂ）で選択された自己癌抗原由来ペプチドを、前記工程ａ）の癌患者と同一の癌患者の血液由来ＰＢＭＣに添加して培養する工程；ｄ）前記工程ｃ）の培養ＰＢＭＣからＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離する工程；及びｅ）上記工程ｄ）で単離されたＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を増幅する工程；を含む抗癌細胞治療剤用組成物の製造方法および上記方法で製造された抗癌細胞治療剤用組成物を提供する。
【0017】
本発明の好ましい一実施形態によれば、工程ｄ）の単離は、ＰＢＭＣ中のＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が１～２５％である場合に行われるものである。
【0018】
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記ステップｅ）の増幅は、１２日から１７日間実施してＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞が１０９～１０１１個になるように増幅するものである。
【0019】
本発明の「自己癌抗原反応性ＣＤ８Ｔ細胞」は、自己癌抗原を含む様々な癌抗原に反応することができるＣＤ８Ｔ細胞を意味する。
【0020】
本発明の「傍観者活性化（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」は、特定の抗原に対する免疫反応中に他の抗原に特異的なＴ細胞が活性化されることを意味する。
【0021】
本発明の「細胞治療剤」は、個体から分離、培養または特殊な操作により製造された細胞および組織であり、治療、診断または予防の目的に使用される医薬品であって、細胞もしくは組織の機能を回復させるために生きている者、同種または異種細胞をインビトロで増殖選択する、または他の方法で細胞の生物学的特性を変化させるなどの一連の行為を通じて、これらの細胞が疾患の治療、診断または予防の目的に使用される医薬品を意味する。
【0022】
上記のように、既存の細胞治療に使用されるＣＤ８Ｔ細胞増幅方法は、細胞治療のために誘導された免疫不全を回復するには増幅されるＣＤ８Ｔ細胞の量が不足し、１つのがん抗原のみに特異的に反応する。場合が多く、有意な抗がん効果を得るには不足していた。
【0023】
本発明の自己癌抗原反応性ＣＤ８Ｔ細胞分離方法を用いる場合、５０～１００ｍｌの癌患者血液から約２５日間の培養過程を通じて＞１０１０個の抗癌ＣＤ８Ｔ細胞を培養することができるので、ＣＤ８Ｔ細胞の抗がん効果を高めるために、抗がん剤投与を通じてｇｒａｄｅ３－４レベルのリンパ球減少症（ｌｙｍｐｈｏｐｅｎｉａ）が発生し、大量のリンパ球が除去されてもそれを補完できるレベルで投与可能な抗がんＣＤ８Ｔ細胞を産生することができる。
【0024】
ｈＴＥＲＴおよびＷＴ１は代表的な自己がん抗原で健康な人の体内では極めて低い割合で存在して増殖が難しいが、がん患者はｈＴＥＲＴを含む様々ながん抗原に対するＣＤ８Ｔ細胞反応が活性化されており、健康な人とは異なりｈＴＥＲＴと同じ自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖および単離が可能である。ただし、自己癌抗原に由来するペプチドを用いて抗癌ＣＤ８Ｔ細胞を培養する過程は、癌患者の体内にこれらの細胞が十分に高い割合で存在する場合にのみ培養が可能である。
【0025】
本発明は、ＣＤ７１＋ＣＤ８Ｔ細胞単離により、ＣＤ８Ｔ細胞増殖に用いたｈＴＥＲＴまたはＷＴ１ペプチド特異的ＣＤ８Ｔ細胞だけでなく、がん患者自らがん細胞の増殖に対応して持続的に高めてきた自己がん抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞のいくつかは、傍観者活性化を介して増殖および単離することができる。したがって、最終培養抗癌ＣＤ８Ｔ細胞は、ｈＴＥＲＴまたはＷＴ１と組み合わせて癌患者が自己増殖させた別の癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞を含むので、非常に優れた抗癌効果を引き起こす可能性がある。
【0026】
したがって、本発明は、ａ）癌患者の血液由来ＰＢＭＣに自己癌抗原由来ペプチドを添加および培養した後、自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖を誘導することを含む工程；
ｂ）上記工程ａ）における自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖レベルが高い自己癌抗原由来ペプチドを選択する工程；
ｃ）前記工程ｂ）で選択された自己癌抗原由来ペプチドを、前記工程ａ）の癌患者と同一の癌患者の血液由来ＰＢＭＣに添加して培養する工程；及び
ｄ）前記工程ｃ）の培養ＰＢＭＣからＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離する工程；を含む自己癌抗原反応性ＣＤ８Ｔ細胞分離方法および前記分離方法で分離された自己癌抗原反応性ＣＤ８Ｔ細胞を提供することができる。
ｂ）上記工程ａ）における自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖レベルが高い自己癌抗原由来ペプチドを選択する工程；
ｃ）前記工程ｂ）で選択された自己癌抗原由来ペプチドを、前記工程ａ）の癌患者と同一の癌患者の血液由来ＰＢＭＣに添加して培養する工程；及び
ｄ）前記工程ｃ）の培養ＰＢＭＣからＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離する工程；を含む自己癌抗原反応性ＣＤ８Ｔ細胞分離方法および前記分離方法で分離された自己癌抗原反応性ＣＤ８Ｔ細胞を提供することができる。
【0027】
本発明の好ましい一実施形態によれば、工程ａ）の癌は、胃癌、肺癌、膵臓癌、黒色腫、脳腫瘍、白血病、卵巣癌および肉腫からなる群から選択されるいずれか１つ以上であり得る。
【0028】
本発明の好ましい一実施形態によれば、上記工程ａ）の自己癌抗原は、ｈＴＥＲＴ、ＷＴ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－１およびＭＡＧＥ－３からなる群から選択されるいずれか１つ以上であり得、より好ましくは、ｈＴＥＲＴおよびＷＴ－１からなる群から選択されるいずれか一つであることができる。
【0029】
上記自己癌抗原由来ペプチドは、ｈＴＥＲＴ、ＷＴ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－１およびＭＡＧＥ－ ３からなる群から選択される任意の１つ以上の自己癌抗原に由来するペプチドであり得るが、好ましくはｈＴＥＲＴまたはＷＴ－１で由来のペプチドであってもよく、より好ましくは配列番号２～配列番号５９のペプチドであってもよい。
【0030】
本発明の好ましい一実施形態によれば、工程ｂ）の選択は、４－１ＢＢを発現する自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞を高発現する自己癌抗原由来ペプチドを選択することであり得る。具体的には、全ＣＤ８Ｔ細胞のうち４－１ＢＢを発現するＣＤ８Ｔ細胞の割合が１０％以上である自己癌抗原由来ペプチドを選別するものであってもよい。
【0031】
本発明の好ましい一実施形態によれば、ステップｃ）の癌患者の血液は１０～１００ｍｌであり得る。好ましくは、癌患者の血液は２０～８０ｍｌであることが好ましく、より好ましくは３０～５０ｍｌであることができる。
【0032】
本発明の好ましい一実施形態によれば、工程ｃ）の培養は、１２日から１７日間実施することができる。好ましくは１３日～１６日間実施することができ、より好ましくは１４日～１５日間実施することができる。
【0033】
本発明はまた、単離された自己癌抗原反応性ＣＤ８Ｔ細胞を含む癌予防または治療用医薬組成物を提供することができる。
【0034】
本発明の医薬組成物は、非経口のいくつかの製剤であり得る。非経口投与用の製剤には、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁溶剤、乳剤、凍結乾燥製剤または坐剤などが含まれる。非水性溶剤および懸濁溶剤としてプロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、エチルオレートなどの注射可能なエステルなどを使用することができる。坐剤の基剤としては、ウィテプソール、マクロゴール、ツイン６１、カカオジ、ラウリンジ、グリセロール、ゼラチンなどを用いることができる。
【0035】
本発明の医薬組成物は、非経口で投与することができ、非経口 投与時 皮膚外用；腹腔内、直腸、静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内に注射する注射剤の形態で当技術分野で公知の方法に従って製剤化することができる。
【0036】
注射剤の場合は、必ず滅菌し、必ず滅菌し、細菌や真菌などの微生物の汚染から保護する必要があります。注射剤のための適切な担体の例は、これらに限定されないが、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、それらの混合物および／または植物油を含む溶媒または分散媒体である。できる。より好ましくは、適切な担体としては、ハンクス溶液、リンガー溶液、トリエタノールアミンを含むリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）または注射用滅菌水、１０％エタノール、４０％プロピレングリコールおよび５％デキストロースなどの等張溶液などが使用できる。注射剤を微生物汚染から保護するためには、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどのような様々な抗菌剤および抗真菌剤をさらに含むことができる。さらに、注射剤は、ほとんどの場合、糖または塩化ナトリウムなどの等張化剤をさらに含み得る。
【0037】
本発明の医薬組成物は、薬学的に有効な量で投与される。薬学的に有効な量は、医学的治療に適用可能な合理的な受益／リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量レベルは、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する感受性、投与時間、投与経路および排出率、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素、および他の医学分野で周知の要素に応じて決定することができる。本発明の医薬組成物は、個々の治療剤として投与することも、他の治療剤と併用して投与することもでき、従来の治療剤とは順次または同時に投与することができ、単回または複数投与することができる。すなわち、本発明の医薬組成物の総有効量は、単一投与量で患者に投与することができ、複数投与量で長期間投与される分割治療方法によって投与される。できる。上記のすべての要素を考慮して、副作用なしに最小限の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは当業者によって容易に決定され得る。
【0038】
本発明の組成物は、単独で、または手術、放射線療法、ホルモン療法、化学療法および生物学的反応調節剤を使用する方法と組み合わせて使用することができる。
【0039】
本発明はまた、癌患者に、単離された自己癌抗原反応性ＣＤ８Ｔ細胞を含む組成物を投与することを含む癌改善または治療方法を提供することができる。
【0040】
本発明の上記組成物は、医学的治療に適用可能な合理的な受益／リスク比で疾患を治療するのに十分な量で投与され、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する感度、投与時間、投与経路排出率、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素、および他の医療分野でよく知られている要素に応じて決定することができる。本発明の組成物は、個々の治療剤として投与するか、または他の治療剤と組み合わせて投与することができ、従来の治療剤と順次または同時に投与することができ、単回または複数回投与することができる。すなわち、本発明の組成物の総有効量は、単一投与量で患者に投与することができ、複数投与量で長期間投与される分割治療方法によって投与することができる。上記のすべての要素を考慮して、副作用なしに最小限の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは当業者によって容易に決定され得る。
【0041】
本発明はさらに、ａ）癌患者の血液由来ＰＢＭＣに自己癌抗原由来ペプチドを添加および培養した後、自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖を誘導することを含む工程；
ｂ）上記工程ａ）において、自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖レベルが高い自己癌抗原由来ペプチドを選択する工程；
ｃ）工程ｂ）で選択された自己癌抗原由来ペプチドを、工程ａ）の癌患者と同一の癌患者の血液由来ＰＢＭＣに添加および培養する工程；
ｄ）前記工程ｃ）の培養ＰＢＭＣからＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離する工程；及び
ｅ）上記工程ｄ）で単離されたＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を増幅する工程；を含む抗癌細胞治療剤用組成物の製造方法および上記方法で製造された抗癌細胞治療剤用組成物を提供することができる。
ｂ）上記工程ａ）において、自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖レベルが高い自己癌抗原由来ペプチドを選択する工程；
ｃ）工程ｂ）で選択された自己癌抗原由来ペプチドを、工程ａ）の癌患者と同一の癌患者の血液由来ＰＢＭＣに添加および培養する工程；
ｄ）前記工程ｃ）の培養ＰＢＭＣからＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離する工程；及び
ｅ）上記工程ｄ）で単離されたＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を増幅する工程；を含む抗癌細胞治療剤用組成物の製造方法および上記方法で製造された抗癌細胞治療剤用組成物を提供することができる。
【0042】
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記工程ｄ）の分離は、ＰＢＭＣにおけるＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が１～２５％である場合に行うことができ、好ましくは割合が４～２５％であることが好ましい。そして、より好ましくは１０～２５％であることが好ましい。ＰＢＭＣ中のＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が１０％を超える場合、ＰＢＭＣから単離されるＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の純度と同様のレベルの回収率を安定的に得ることができる（実施例６）。
【0043】
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記工程ｅ）の増幅は、１２日から１７日間実施してＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞が１０９～１０１１個になるように増幅するものである。工程ｅ）の増幅は、好ましくは１３日～１６日間実施することができ、より好ましくは１４日～１５日間実施することができる。前記ＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞が好ましくは１０９～１０１０個となるように増幅するものであってもよい。
【発明の効果】
【0044】
本発明の分離方法を用いて自己癌抗原反応性ＣＤ８Ｔ細胞を分離する場合、自己癌抗原に特異的なＣＤ８Ｔ細胞以外に様々な癌抗原に反応するＣＤ８Ｔ細胞も一緒に分離されるので、より少ない血液でも大量にＣＤ８Ｔ細胞数を増幅して有意な抗癌効果を提供することができる。したがって、養子細胞の治療など、治療のために一時的な免疫不全を誘導する免疫治療などに効果的に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0045】
図１は、増殖するＭｅｌａｎ－Ａ特異的および傍観者活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞における４－１ＢＢおよびＣＤ７１発現を示す。
【0046】
図２は、Ｍｅｌａｎ－Ａペプチドの存在下で傍観者活性化によって増殖したＣＤ８＋Ｔ細胞がヒト腫瘍反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞を含むことを示す。（Ａ）インキュベートしたＰＢＭＣをＰＥ－コンジュゲートＭｅｌａｎ－Ａペプチド／ＭＨＣクラスＩマルチマー（ｐＭｅｌａｎ）および抗ＣＤ８－ＰＥ－Ｃｙ５で染色した。ゲートされたＣＤ８＋細胞をＣＦＳＥ対ｐＭｅｌａｎでプロットし、示されたＣＤ８＋Ｔ細胞をフローサイトメトリーした結果を示す。（Ｂ～Ｃ）ｐＭｅｌａｎ＋ＣＤ８Ｔ（Ｒ１）、ＣＦＳＥ－ｐＭｅｌａｎ－ＣＤ８Ｔ（Ｒ２）およびＣＦＳＥ ＋ ＣＤ８Ｔ（Ｒ３）細胞の３つの異なるＣＤ８＋Ｔ細胞を、急速な拡張方法（ｒａｐｉｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を用いて増幅することによって、抗ＣＤ８－ＰＥ－Ｃｙ５およびａｎｔｉ－ＣＤ２５－ＰＥで染色した後、フローサイトメトリーの結果を示す。
【0047】
図３は、拡張ＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＭｅｌａｎ－Ａ＋およびＭｅｌａｎ－Ａ－黒色腫細胞の死を示す。
【0048】
図４は、ｈＴＥＲＴペプチドによって活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞における４－１ＢＢおよびＣＤ７１の発現を示す。赤い点線ボックスは、より高いパーセントの４－１ＢＢ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含むＰＢＭＣを意味し、ＰＢＭＣは最終的にＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を分類するために使用された。
【0049】
図５は、分類されたＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の拡張およびその表現型を示す。（Ａ）選択したＰＢＭＣをプールし、ＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をフローサイトメトリーした結果を示す。（Ｂ）分類されたＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をラピッドエクスパンション法を用いて増殖させ、５×１０５細胞は１３日以内に＞１×１０９細胞となった。（Ｃ）拡張ＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ８－ＰＥ－Ｃｙ５と組み合わせたＰＥ結合抗ＣＤ４５ＲＡ、ａｎｔｉ－ＣＤ４５ＲＯ、ａｎｔｉ－ＣＤ５７またはａｎｔｉ－ＰＤ－１で染色した。（Ｄ）拡張ＣＤ８Ｔ細胞をアネキシンＶ－ＦＩＴＣおよびＰＩで染色してその生存率を確認した結果を示す。
【0050】
図６は、ＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞がＷＴ１ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を含むことを示す。
【0051】
図７の（Ａ）ＨＬＡ－Ａ＊０２０１対立遺伝子を有する健康なボランティアのＰＢＭＣから、Ｍｅｌａｎ－Ａ ＣＴＬペプチドを用いて、Ｍｅｌａｎ－Ａ－陽性または陰性ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。（Ｂ）拡張ｐＭｅｌａｎ＋およびｐＭｅｌａｎ－ＣＤ８＋Ｔ細胞を異なる割合で混合し、ｐＭｅｌａｎ－ＣＤ８＋Ｔ細胞を自動細胞分類器（Ｔｙｔｏ）を用いて５×１０６個の細胞混合物から分類および計数してフローサイトメトリーした。（Ｃ）（Ｂ）の結果からｐＭｅｌａｎ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の純度及び回収率（ｒｅｃｏｖｅｒｙｒａｔｅ）を計算した結果を示す。
【0052】
図８は、癌患者の血液からｈＴＥＲＴ特異的ＣＤ８Ｔ細胞を含む腫瘍反応性ＣＤ８Ｔ細胞を産生するためのワークフローを示す。
【発明を実施するための形態】
【0053】
［実施例１］
ＣＤ８Ｔ細胞におけるＣＤ７１発現の測定
ＣＤ８Ｔ細胞におけるＣＤ７１発現の測定
【0054】
自己抗原であるＭｅｌａｎ－Ａ特異的ＣＤ８Ｔ細胞を用いて、ＣＤ８Ｔ細胞増殖用ペプチドによって増殖するＣＤ８Ｔ細胞がＣＤ７１を発現するかどうかを証明することを目的とした。すべての血液サンプルはＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）を有し、ＨＬＡ－Ａ０２０１／Ｍｅｌａｎ－Ａ２６－３５（配列番号１：ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）マルチマー（ペンタマー）陽性ＣＤ８Ｔ細胞を有する健康なボランティアからの研究大韓西面洞の後に提供を受けた。
【0055】
具体的には、Ｍｅｌａｎ－Ａ２６－３５特異的ＣＤ８Ｔ細胞は、Ｍｅｌａｎ－Ａ抗原の細胞毒性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｙｃｔｅ、ＣＴＬ）エピトープであるＭｅｌａｎ－Ａ２６－３５（配列番号１：ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）ペプチドを用いて増殖誘導もした。健康なボランティア（Ｄｏｎｏｒ＃１および＃２）の血液を１０ｍｌのＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ Ｈｅｐａｒｉｎ Ｔｕｂｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に採血した。採血した血液から末梢血液単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）を分離するために１５ｍｌコニカルチューブに５ｍｌ Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）添加した後、採血した血液１０ｍｌをＦｉｃｏｌｌ溶液上層にゆっくり分注した。８００×ｇ、ｎｏ ｂｒａｋｅ、２０分間遠心分離した後、最上層の血漿を回収し、０．２μＭシリンジフィルターで濾過し、自己血漿として使用し、ＰＢＭＣを回収してＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄して培養に使用した。
【0056】
分離したＰＢＭＣを１０μＭ ＣＦＳＥ（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で５分間染色した。ＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣは、３％の自己血漿を含むＲＰＭＩ１６４０培地に１×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で懸濁し、１４ｍｌの丸い遠心管（ｒｏｕｎｄ ｔｕｂｅ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に１ｍｌずつ分注した。各チューブに２μｇ／ｍｌの濃度で前記Ｍｅｌａｎ－Ａ２６－３５ペプチドを２μｇ／ｍｌの濃度で添加した後、ＣＯ２インキュベーターで培養した。培養２日目に、１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２および３％自己血漿を含むＲＰＭＩ１６４０培地を１ｍｌずつ各チューブに添加した。培養７、９、１１または１３日目に各チューブから１ｍｌ培地を除去した後、１００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２と３％自己血漿を含む新しいＲＰＭＩ１６４０培地を１ｍｌ添加して１４日間培養した。培養７、９、１１または１４日目にチューブのＰＢＭＣを回収し、ＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄した後、抗ＣＤ８－ＰＥ－Ｃｙ５と共にｐＭｅｌａｎ－ＰＥ、抗－４－１ＢＢ－ＰＥ、または抗ＣＤ７１－ＰＥ抗体で染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でフローサイトメトリーを分析した。
【0057】
その結果、図１に示すように、培養７日目のほとんどのｐＭｅｌａｎ＋ＣＤ８Ｔ細胞は９回以上の細胞分裂が発生してＣＦＳＥ－ｎｅｇａｔｉｖｅ状態となり、同時に傍観者活性化（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）されたＣＦＳＥ－ｐＭｅｌａｎ－ＣＤ８Ｔ細胞も高い割合で発見された。Ｄｏｎｏｒ＃１はｐＭｅｌａｎ＋ＣＤ８Ｔ細胞の割合が高く検出されたボランティアであり、ＣＤ８Ｔ細胞の増殖率も高いことが示され、Ｄｏｎｏｒ＃２はｐＭｅｌａｎ＋ＣＤ８Ｔ細胞の割合が低く検出されたボランティアでｐＭｅｌａｎ＋ＣＤ８Ｔ細胞の増殖率が低くなった。培養１１日までｐＭｅｌａｎ＋ＣＤ８Ｔ細胞の割合は着実に増加したが、培養１４日には部分的に減少することが確認された（図１の左）。培養７日目に、増殖中のＣＦＳＥ－ＣＤ８Ｔ細胞の一部において４－１ＢＢの発現が検出されたが、９日後には検出されなかった（図１の中央）。ＣＤ８Ｔ細胞の増殖が進行し、ＣＦＳＥ蛍光値が減少するほどＣＤ７１の発現が増加することが示され、培養１４日目９～１０回以上増殖したＣＤ８Ｔ細胞の大部分がＣＤ７１を発現していることが確認された（図１の右）。
【0058】
上記の結果は、Ｍｅｌａｎ－Ａペプチド特異的および非特異的に増殖したＣＤ８Ｔ細胞の大部分がＣＤ７１を発現していることを意味すると判断した。
【0059】
［実施例２］
Ｍｅｌａｎ－Ａ由来ＣＴＬペプチドによるＣＤ８Ｔ細胞活性化
Ｍｅｌａｎ－Ａ由来ＣＴＬペプチドによるＣＤ８Ｔ細胞活性化
【0060】
上記＜実施例１＞で確認された傍観者活性化（Ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）を通じて増殖したＣＤ８Ｔ細胞が黒色腫を認識できるかどうかを確認しようとした。
【0061】
具体的には、上記＜実施例１＞の培養ＰＢＭＣの全てを収集し、ｐＭｅｌａｎ－ＰＥと抗－ＣＤ８－ＰＥ－Ｃｙ５で染色した後、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、ｇａｔｅｄ ＣＤ８Ｔ細胞中のｐＭｅｌａｎ＋ＣＤ８Ｔ（Ｒ１）、ＣＦＳＥ－ｐＭｅｌａｎ－ＣＤ８Ｔ（Ｒ２）およびＣＦＳＥ＋ＣＤ８Ｔ（Ｒ３）細胞をそれぞれ単離した。単離された３種類のＣＤ８Ｔ細胞は、ラピッドエクスパンション法を用いて１４日間培養し、＞１０９ レベルに大量増殖させた。５０ｍｌ ＡＬｙＳ５０５Ｎ（ＣＳＴＩ，Ｊａｐａｎ）培地に最終単離されたＣＤ８Ｔ細胞５×１０５個、１×１０８ ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ＰＢＭＣｓ、４０ｎｇ／ｍｌ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ３ｍＡｂ、１，０００ ＩＵ／ｍｌ ｒｈＩＬ－２、および３％自己血漿を混合した後、培養４日目に５０ｍｌ、７日目に１００ｍｌ、培養９日目に３００ｍｌ、１１日に５００ｍｌ添加し、１Ｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｂａｇ（Ｎｉｐｒｏ，Ｊａｐａｎ）に注入して１４日間培養した。最終培養ＣＤ８Ｔ細胞２×１０６個とヒト黒色腫細胞株であるＳＫ－Ｍｅｌ－５ ２×１０５個（１０：１）を２４ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅに分注した後、１００ＩＵ／ｍｌ ｒｈＩＬ－２と３％自己血漿を含む状態で２４時間培養し、陰性対照群ではＳＫ－Ｍｅｌ－５なしでＣＤ８Ｔ細胞のみを培養した。培養後、細胞を回収し、ａｎｔｉ－ＣＤ８－ＰＥ－Ｃｙ５およびａｎｔｉ－ＣＤ２５－ＰＥ抗体で染色およびＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で分析し、ＳＫ－Ｍｅｌ－５によって活性化されたＣＤ８Ｔ細胞の割合を決定した。
【0062】
その結果、図２に示されるように、ｐＭｅｌａｎ＋ＣＤ８Ｔ細胞の増殖とともに、一部のｐＭｅｌａｎ－ＣＤ８Ｔ細胞が傍観者活性化を通じて一緒に増殖することが確認できた（図２のＡ）。ｐＭｅｌａｎ＋ＣＤ８Ｔ（Ｒ１）、ＣＦＳＥ－ｐＭｅｌａｎ－ＣＤ８Ｔ（Ｒ２）およびＣＦＳＥ＋ＣＤ８Ｔ（Ｒ３）細胞のみを２４時間培養した場合、活性マーカーであるＣＤ２５の発現は３～５％と低いレベルを維持した。しかし、ＨＬＡ－Ａ＊０２＋ ＳＫ－Ｍｅｌ－５細胞とＣＤ８Ｔ細胞を１日間共培養した場合、ｐＭｅｌａｎ＋ＣＤ８Ｔ細胞は急速に活性化され、ＣＤ２５を発現する細胞の割合が６０％レベルであった。したがって、ＨＬＡ－Ａ＊０２＋ ＳＫ－Ｍｅｌ－５細胞は、正常にＭｅｌａｎ－ＡペプチドをＭＨＣクラスＩに搭載して細胞表面に列挙することにより、ＣＤ８Ｔ細胞の活性を誘導できると判断した。同時に、Ｒ２およびＲ３に相当するＣＤ８Ｔ細胞においてもＳＫ－Ｍｅｌ－５との共培養後のＣＤ２５発現が増加し、非ｄｉｖｉｄｉｎｇ ＣＤ８Ｔ細胞であるＣＦＳＥ＋ＣＤ８Ｔ細胞よりもＣＦＳＥ－ｐＭｅｌａｎ－ＣＤ８Ｔ細胞におけるＳＫ－Ｍｅｌ－５に反応する細胞の割合が高いことが確認できた（図２のＣ）。
【0063】
以上の結果は、Ｍｅｌａｎ－Ａペプチドの傍観者活性化効果により増殖したＣＤ８Ｔ細胞には、がん抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞が高い割合で含まれていることを意味すると判断した。
【0064】
［実施例３］
ＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のがん細胞除去能力の確認
ＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のがん細胞除去能力の確認
【0065】
ＨＬＡ－Ａ＊０２０１－制限Ｍｅｌａｎ－Ａ－特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を有する健康なボランティアのＰＢＭＣにＭｅｌａｎ－Ａ ＣＴＬペプチドを添加して１４日間培養した後、ＣＤ７１＋ＣＤ８＋および４－１ＢＢ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を分離して大量培養した後、Ｍｅｌａｎ－Ａ－陽性のＳＫ－Ｍｅｌ－５細胞株とＭｅｌａｎ－Ａ－陰性のＡ３７５細胞株と共培養して癌細胞除去能力を比較しようとした。
【0066】
具体的には、上記＜実施例１＞で培養したＰＢＭＣで、培養１４日目にＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をセルソーター（ＦＡＣＳＡｒｉａ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で分離した。４－１ＢＢ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の場合、培養１４日目に細胞を回収し、ＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄した後、２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌでＣＴＬ ｍｅｄｉａに細胞懸濁し、１２ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅに分注し、同じＭｅｌａｎ－Ａ ＣＴＬペプチドを５μｇ／ｍｌの濃度で添加し、１日間再刺激して４－１ＢＢ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。単離された４－１ＢＢ＋ＣＤ８＋ ＴおよびＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、急速な拡張方法を介して１４日間大量培養した。
【0067】
ＨＬＡ－Ａ＊０２０１対立遺伝子を有し、Ｍｅｌａｎ－Ａ－陽性ＳＫ－Ｍｅｌ－５細胞株またはＭｅｌａｎ－Ａ－陰性Ａ３７５細胞株を１０μＭ ＣＦＳＥで５分間染色して蛍光標識した後、ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄して標的細胞を準備した。１×１０５個の蛍光標識ＳＫ－Ｍｅｌ－５またはＡ３７５細胞株と最終培養４－１ＢＢ＋ＣＤ８＋ ＴおよびＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を０、０．１、０．２、０．５、１または５倍の割合で混合し、１００ＩＵ／ｍｌ ｒｈＩＬ－２と３％自己血漿を含むＣＴＬ培地で６時間３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。培養完了後、細胞をアネキシン－ＰＥで染色し、フローサイトメトリーにより死滅する細胞の割合を分析した。
【0068】
その結果、［図３］に示すように、Ｍｅｌａｎ－Ａ－特異的ＣＤ８Ｔ細胞のみを含む４－１ＢＢ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｍｅｌａｎ－Ａ＋ＳＫ－Ｍｅｌ－５細胞株のみを選択的に除去し、Ｍｅｌａｎ－Ａ－特異的ＣＤ８Ｔ細胞とともに、傍観者活性化されたＣＤ８Ｔ細胞を含むＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の場合、Ｍｅｌａｎ－Ａ＋ＳＫ－Ｍｅｌ－５細胞株だけでなく、Ｍｅｌａｎ－Ａ－Ａ３７５細胞株を全て除去することが確認できた。
【0069】
［実施例４］
ｈＴＥＲＴ由来ＣＴＬペプチドによるＣＤ８Ｔ細胞の活性化
ｈＴＥＲＴ由来ＣＴＬペプチドによるＣＤ８Ｔ細胞の活性化
【0070】
癌患者のＰＢＭＣにおいても、ｈＴＥＲＴ由来のＣＴＬペプチドを用いて、ｈＴＥＲＴ特異的および傍観者活性化されたＣＤ８Ｔ細胞を増殖できるかどうかを調べた。
【0071】
［表１］
【0072】
具体的には、標準治療に不応で再発した肺がん患者の３０ｍｌ血液から前記＜実施例１＞と同様の方法で分離したＰＢＭＣを上記［表１］の３８種類のｈＴＥＲＴ由来のＣＴＬペプチドとともに１４日間培養した。培養１４日目に同じペプチドで１日間再刺激し、培養１５日目に各チューブのＰＢＭＣの一部をａｎｔｉ－４－１ＢＢ－ＰＥまたはａｎｔｉ－ＣＤ７１－ＰＥおよびａｎｔｉ－ＣＤ８－ＰＥ－Ｃｙ５で染色した。フローサイトメトリーを介して４－１ＢＢ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、同時にＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が高いように見えるｈＴＥＲＴペプチドを選択した。選択したチューブのＰＢＭＣをプールした後、ＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をＦＡＣＳＡｒｉａを用いて単離し、単離したＣＤ８Ｔ細胞をラピッドエクスパンション法を用いて１４日間大量培養し、最終培養ＣＤ８Ｔ細胞は、ａｎｉ－ＣＤ４５ＲＡ、ａｎｔｉ－ＣＤ４５ＲＯ、ａｎｔｉ－ＣＤ５７またはａｎｔｉ－ＰＤ－１抗体を用いて表現型を分析した。
【0073】
また、これとは別に最終選別した８本のチューブのＰＢＭＣをプールし、ＦＡＣＳＡｒｉａを用いてＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞分離してアネキシンＶ－ＦＩＴＣとＰＩで染色して細胞の生存率を決定した（図５のＡ）。
【0074】
その結果、［図４］に示すように、様々なｈＴＥＲＴペプチド刺激により４－１ＢＢ＋ＣＤ８Ｔ細胞が増加することが確認できた。
【0075】
４－１ＢＢ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、添加されたペプチドに対して特異的に活性化されたＣＤ８Ｔ細胞であることを既存の研究によって決定しました。発現しており、添加されたｈＴＥＲＴペプチド特異的及び傍観者活性化されたＣＤ８Ｔ細胞を含んでいると判断した。
【0076】
また、［図５］のＢに示すように単離されたＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ラピッドエクスパンション方式を用いて１４日間大量増殖させた場合、１４日以内に５×１０５細胞が１－３×１０９細胞に増殖した。最終増殖させたＣＤ８Ｔ細胞はＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋でメモリタイプの細胞であり、ＣＤ５７を発現する老化細胞の割合は１５％以内であり、ＰＤ－１を発現する枯渇性（ｅｘｈａｕｓｔｅｄ）ＣＤ８Ｔ細胞の割合は１０％以内であることを確認した（図５Ｃ）。アネキシンＶおよびＰＩ染色により細胞生存率を測定したところ、死滅した細胞の割合は５％以内であることが確認された（図５のＤ）。
【0077】
以上の結果は、癌患者の血液中に存在するＰＢＭＣ内にｈＴＥＲＴ特異的ＣＤ８Ｔ細胞が存在する場合、それらの増殖とともに傍観者活性化ＣＤ８Ｔ細胞が増加し、ＣＤ７１を用いてｈＴＥＲＴ特異的ＣＤ８Ｔ細胞とともにｈＴＥＲＴペプチドによって傍観者活性化されたＣＤ８Ｔ細胞を単離および大量培養することが可能であることを意味すると判断した。
【0078】
［実施例５］
ＷＴ１由来ＣＴＬペプチドによるＣＤ８Ｔ細胞活性化
ＷＴ１由来ＣＴＬペプチドによるＣＤ８Ｔ細胞活性化
【0079】
ｈＴＥＲＴの場合と同様に、ＷＴ１癌抗原由来のＣＴＬペプチドを用いて、癌患者のＰＢＭＣからＷＴ１特異的および傍観者活性化されたＣＤ８Ｔ細胞を増殖させることができるかどうかを調べた。
【0080】
［表２］
【0081】
具体的には、前記＜実施例４＞と同様の方法で研究に書面に同意した卵巣癌患者の血液から分離したＰＢＭＣを、上記［表２］のＷＴ１アミノ酸配列に由来する２０種類のＣＴＬペプチドと共に１４日間培養し、培養１４日目に同じペプチドで一日再刺激した。培養１５日目、各チューブのＰＢＭＣをａｎｔｉ－４－１ＢＢ－ＰＥまたはａｎｔｉ－ＣＤ７１－ＰＥとａｎｔｉ－ＣＤ８－ＰＥ－Ｃｙ５で染色し、フローサイトメトリーにより４－１ＢＢ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含んでおり、同時にＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を分析した。
【0082】
その結果、［図６］に示すように、様々なＷＴ１ペプチド刺激により４－１ＢＢ＋ＣＤ８Ｔ細胞が増加することが確認できた。
【0083】
また、培養１５日目にＣＤ８Ｔ細胞のみをｇａｔｉｎｇしてＣＤ７１および４－１ＢＢの発現をフローサイトメトリーの結果、４－１ＢＢとＣＤ７１の発現が比例的な４－１ＢＢ＋ＣＤ７１＋ＣＤ８Ｔ細胞がほとんどの場合（ｒｅｄ）、４－１ＢＢ＋ＣＤ７１＋ＣＤ８Ｔ細胞を含む傍観者活性化４－１ＢＢ－ＣＤ７１＋ＣＤ８Ｔ細胞が比較的多数含まれている場合（ｙｅｌｌｏｗ）、傍観者活性化４－１ＢＢ－ＣＤ７１＋ＣＤ８Ｔ細胞がほとんどの場合（青）が観察されることにより、卵巣癌患者の状態とＷＴ１ペプチドの種類によってＷＴ１ペプチド特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖とともに傍観者活性化されたＣＤ８Ｔ細胞の増殖が異なるように発生することが確認できた。
【0084】
［実施例６］
自動細胞分離器を用いた抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞分離
自動細胞分離器を用いた抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞分離
【0085】
抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を無菌状態から高純度に分離するために、自動細胞分離器を用いた分離プロセスを確立しようとした。
【0086】
具体的には、上記＜実施例１＞と同様の方法で自己抗原であるＭｅｌａｎ－Ａ特異的ＣＤ８Ｔ細胞を有するＨＬＡ－Ａ＊０２０１陽性ボランティアから血液を採血してＰＢＭＣを分離した後、メラン－Ａ ＣＴＬペプチドを添加して１４日間ペプチド特異的ＣＤ８Ｔ細胞で一次増殖させた。一次培養ＰＢＭＣをＰＥ－コンジュゲートＭｅｌａｎ－Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ／ＭＨＣクラスＩマルチマー（ｐＭｅｌａｎ）および抗ＣＤ８－ＰＥ－Ｃｙ５で染色し、Ｍｅｌａｎ－Ａ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ（ｐＭｅｌａｎ＋）およびＭｅｌａｎ－Ａ－ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ（ｐＭｅｌａｎ－）ＣＤ８＋Ｔ細胞をセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＦＡＣＳＡｒｉａ）を用いて単離した。単離されたｐＭｅｌａｎ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞およびｐＭｅｌａｎ－ＣＤ８＋Ｔ細胞は、それぞれラピッドエクスパンション法によって１４日間大量増殖させた（図７のＡ）。最終培養したｐＭｅｌａｎ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞とｐＭｅｌａｎ－ＣＤ８＋Ｔ細胞を様々な割合で混合してｐＭｅｌａｎ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を調節し、これらを無菌状態で自動細胞分離が可能なＴｙｔｏ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてｐＭｅｌａｎ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離することによって、ｐＭｅｌａｎ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合に従って最終的に単離されたｐＭｅｌａｎ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の純度回復率を決定した。
【0087】
その結果、図７のＢに示すように、最終培養したｐＭｅｌａｎ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞およびｐＭｅｌａｎ－ＣＤ８＋Ｔ細胞はそれぞれ６３％および３％レベルであることが確認された。
【0088】
また、ｐＭｅｌａｎ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞とｐＭｅｌａｎ－ＣＤ８＋Ｔ細胞を様々な割合で混合してｐＭｅｌａｎ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が３～２０％になるようにした後、Ｔｙｔｏを用いて分離されたｐＭｅｌａｎ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の純度を再確認した結果、ｐＭｅｌａｎ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が高いサンプルほど、単離された細胞内ｐＭｅｌａｎ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が高くなることが確認できた。また、５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ条件でｐＭｅｌａｎ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を分離した後、ソーティング前サンプルに含まれたｐＭｅｌａｎ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の数と最終分離されたｐＭｅｌａｎ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の総数とを比較してｒｅｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅを決定した。分析結果ソーティング前のサンプル中のｐＭｅｌａｎ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が４％以上の場合、安定して４０％以上の細胞が細胞分離後に回収されることが示された（図７のＣ）。
【0089】
総合的に、＞６５％の純度、＞４０％の回復率を標的細胞単離のための最小基準として考えると、細胞分離前のＣＤ７１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は約４％以上でなければならないと判断した。
【産業上の利用可能性】
【0090】
本発明の分離方法を用いて自己癌抗原反応性ＣＤ８Ｔ細胞を分離する場合、自己癌抗原に特異的なＣＤ８Ｔ細胞以外に様々な癌抗原に反応するＣＤ８Ｔ細胞も一緒に分離されるので、より少ない血液でも大量にＣＤ８Ｔ細胞数を増幅して有意な抗癌効果を提供することができる。したがって、養子細胞の治療などの治療のために一時的な免疫不全を誘導する免疫治療などに効果的に使用できるため、産業上利用可能性が大きい。
【0091】
配列リスト Ｆｒｅｅ Ｔｅｘｔ
配列番号１は、ＨＬＡ－Ａ０２０１／Ｍｅｌａｎ－Ａ２６－３５（Ｍｅｌａｎ－Ａ２６－３５）のアミノ酸配列である。
配列番号２は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ１のアミノ酸配列である。
配列番号３は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてｈＴＥＲＴ２のアミノ酸配列である。
配列番号４は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ３のアミノ酸配列である。
配列番号５は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてｈＴＥＲＴ４のアミノ酸配列である。
配列番号６は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてｈＴＥＲＴ５のアミノ酸配列である。
配列番号７は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてｈＴＥＲＴ６のアミノ酸配列である。
配列番号８は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてｈＴＥＲＴ７のアミノ酸配列である。
配列番号９は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてｈＴＥＲＴ８のアミノ酸配列である。
配列番号１０は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ９のアミノ酸配列である。
配列番号１１は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ１０のアミノ酸配列である。
配列番号１２は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ１１のアミノ酸配列である。
配列番号１３は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ１２のアミノ酸配列である。
配列番号１４は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ１３のアミノ酸配列である。
配列番号１５は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ１４のアミノ酸配列である。
配列番号１６は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ１５のアミノ酸配列である。
配列番号１７は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ１６のアミノ酸配列である。
配列番号１８は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ１７のアミノ酸配列である。
配列番号１９は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ１８のアミノ酸配列である。
配列番号２０は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ１９のアミノ酸配列である。
配列番号２１は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてｈＴＥＲＴ２０のアミノ酸配列である。
配列番号２２は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてｈＴＥＲＴ２１のアミノ酸配列である。
配列番号２３は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ２２のアミノ酸配列である。
配列番号２４は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ２３のアミノ酸配列である。
配列番号２５は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ２４のアミノ酸配列である。
配列番号２６は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてｈＴＥＲＴ２５のアミノ酸配列である。
配列番号２７は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ２６のアミノ酸配列である。
配列番号２８は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ２７のアミノ酸配列である。
配列番号２９は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてｈＴＥＲＴ２８のアミノ酸配列である。
配列番号３０は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ２９のアミノ酸配列である。
配列番号３１は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてｈＴＥＲＴ３０のアミノ酸配列である。
配列番号３２は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ３１のアミノ酸配列である。
配列番号３３は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ３２のアミノ酸配列である。
配列番号３４は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ３３のアミノ酸配列である。
配列番号３５は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ３４のアミノ酸配列である。
配列番号３６は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ３５のアミノ酸配列である。
配列番号３７は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ３６のアミノ酸配列である。
配列番号３８は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ３７のアミノ酸配列である。
配列番号３９は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてｈＴＥＲＴ３８のアミノ酸配列である。
配列番号４０は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてのＷＴ１１のアミノ酸配列である。
配列番号４１は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてＷＴ１２のアミノ酸配列である。
配列番号４２は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてＷＴ１３のアミノ酸配列である。
配列番号４３は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてＷＴ１４のアミノ酸配列である。
配列番号４４は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてＷＴ１５のアミノ酸配列である。
配列番号４５は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてＷＴ１６のアミノ酸配列である。
配列番号４６は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてのＷＴ１７のアミノ酸配列である。
配列番号４７は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてＷＴ１８のアミノ酸配列である。
配列番号４８は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてのＷＴ１９のアミノ酸配列である。
配列番号４９は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてＷＴ１ １０のアミノ酸配列である。
配列番号５０は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてのＷＴ１ １１のアミノ酸配列である。
配列番号５１は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてＷＴ１ １２のアミノ酸配列である。
配列番号５２は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてＷＴ１ １３のアミノ酸配列である。
配列番号５３は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてＷＴ１ １４のアミノ酸配列である。
配列番号５４は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてＷＴ１ １５のアミノ酸配列である。
配列番号５５は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてＷＴ１ １６のアミノ酸配列である。
配列番号５６は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてのＷＴ１ １７のアミノ酸配列である。
配列番号５７は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてＷＴ１ １８のアミノ酸配列である。
配列番号５８は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてＷＴ１ １９のアミノ酸配列である。
配列番号５９は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてＷＴ１ ２０のアミノ酸配列である。
配列番号１は、ＨＬＡ－Ａ０２０１／Ｍｅｌａｎ－Ａ２６－３５（Ｍｅｌａｎ－Ａ２６－３５）のアミノ酸配列である。
配列番号２は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ１のアミノ酸配列である。
配列番号３は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてｈＴＥＲＴ２のアミノ酸配列である。
配列番号４は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ３のアミノ酸配列である。
配列番号５は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてｈＴＥＲＴ４のアミノ酸配列である。
配列番号６は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてｈＴＥＲＴ５のアミノ酸配列である。
配列番号７は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてｈＴＥＲＴ６のアミノ酸配列である。
配列番号８は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてｈＴＥＲＴ７のアミノ酸配列である。
配列番号９は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてｈＴＥＲＴ８のアミノ酸配列である。
配列番号１０は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ９のアミノ酸配列である。
配列番号１１は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ１０のアミノ酸配列である。
配列番号１２は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ１１のアミノ酸配列である。
配列番号１３は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ１２のアミノ酸配列である。
配列番号１４は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ１３のアミノ酸配列である。
配列番号１５は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ１４のアミノ酸配列である。
配列番号１６は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ１５のアミノ酸配列である。
配列番号１７は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ１６のアミノ酸配列である。
配列番号１８は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ１７のアミノ酸配列である。
配列番号１９は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ１８のアミノ酸配列である。
配列番号２０は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ１９のアミノ酸配列である。
配列番号２１は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてｈＴＥＲＴ２０のアミノ酸配列である。
配列番号２２は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてｈＴＥＲＴ２１のアミノ酸配列である。
配列番号２３は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ２２のアミノ酸配列である。
配列番号２４は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ２３のアミノ酸配列である。
配列番号２５は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ２４のアミノ酸配列である。
配列番号２６は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてｈＴＥＲＴ２５のアミノ酸配列である。
配列番号２７は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ２６のアミノ酸配列である。
配列番号２８は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ２７のアミノ酸配列である。
配列番号２９は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてｈＴＥＲＴ２８のアミノ酸配列である。
配列番号３０は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ２９のアミノ酸配列である。
配列番号３１は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてｈＴＥＲＴ３０のアミノ酸配列である。
配列番号３２は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ３１のアミノ酸配列である。
配列番号３３は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ３２のアミノ酸配列である。
配列番号３４は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ３３のアミノ酸配列である。
配列番号３５は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ３４のアミノ酸配列である。
配列番号３６は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ３５のアミノ酸配列である。
配列番号３７は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ３６のアミノ酸配列である。
配列番号３８は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてのｈＴＥＲＴ３７のアミノ酸配列である。
配列番号３９は、ｈＴＥＲＴに由来するＣＴＬペプチドとしてｈＴＥＲＴ３８のアミノ酸配列である。
配列番号４０は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてのＷＴ１１のアミノ酸配列である。
配列番号４１は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてＷＴ１２のアミノ酸配列である。
配列番号４２は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてＷＴ１３のアミノ酸配列である。
配列番号４３は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてＷＴ１４のアミノ酸配列である。
配列番号４４は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてＷＴ１５のアミノ酸配列である。
配列番号４５は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてＷＴ１６のアミノ酸配列である。
配列番号４６は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてのＷＴ１７のアミノ酸配列である。
配列番号４７は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてＷＴ１８のアミノ酸配列である。
配列番号４８は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてのＷＴ１９のアミノ酸配列である。
配列番号４９は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてＷＴ１ １０のアミノ酸配列である。
配列番号５０は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてのＷＴ１ １１のアミノ酸配列である。
配列番号５１は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてＷＴ１ １２のアミノ酸配列である。
配列番号５２は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてＷＴ１ １３のアミノ酸配列である。
配列番号５３は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてＷＴ１ １４のアミノ酸配列である。
配列番号５４は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてＷＴ１ １５のアミノ酸配列である。
配列番号５５は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてＷＴ１ １６のアミノ酸配列である。
配列番号５６は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてのＷＴ１ １７のアミノ酸配列である。
配列番号５７は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてＷＴ１ １８のアミノ酸配列である。
配列番号５８は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてＷＴ１ １９のアミノ酸配列である。
配列番号５９は、ＷＴ１癌抗原に由来するＣＴＬペプチドとしてＷＴ１ ２０のアミノ酸配列である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】