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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-27
(54)【発明の名称】組織再生パッチ
(51)【国際特許分類】
A61L 27/22 20060101AFI20230317BHJP
A61L 27/54 20060101ALI20230317BHJP
A61L 27/58 20060101ALI20230317BHJP
A61L 27/50 20060101ALI20230317BHJP
A61L 27/16 20060101ALI20230317BHJP
A61L 27/18 20060101ALI20230317BHJP
A61L 27/24 20060101ALI20230317BHJP
A61L 27/38 20060101ALI20230317BHJP
A61L 27/20 20060101ALI20230317BHJP
【ＦＩ】
A61L27/22
A61L27/54
A61L27/58
A61L27/50
A61L27/16
A61L27/18
A61L27/24
A61L27/38 300
A61L27/38 111
A61L27/20
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022548141
(86)(22)【出願日】2021-02-08
(85)【翻訳文提出日】2022-09-28
(86)【国際出願番号】 EP2021052989
(87)【国際公開番号】W WO2021156519
(87)【国際公開日】2021-08-12
(31)【優先権主張番号】2001692.9
(32)【優先日】2020-02-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】2006583.5
(32)【優先日】2020-05-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】500532757
【氏名又は名称】キングス カレッジ ロンドン
【氏名又は名称原語表記】ＫＩＮＧＳ ＣＯＬＬＥＧＥ ＬＯＮＤＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522313938
【氏名又は名称】ユニヴァーシティー オブ キール
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＫＥＥＬＥ
(74)【代理人】
【識別番号】100107984
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 雅紀
(74)【代理人】
【識別番号】100182305
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 鉄平
(74)【代理人】
【識別番号】100096482
【弁理士】
【氏名又は名称】東海 裕作
(74)【代理人】
【識別番号】100131093
【弁理士】
【氏名又は名称】堀内 真
(74)【代理人】
【識別番号】100150902
【弁理士】
【氏名又は名称】山内 正子
(74)【代理人】
【識別番号】100141391
【弁理士】
【氏名又は名称】園元 修一
(74)【代理人】
【識別番号】100221958
【弁理士】
【氏名又は名称】篠田 真希恵
(74)【代理人】
【識別番号】100192441
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 仁
(72)【発明者】
【氏名】ハビブ シュクリ ジェームズ
(72)【発明者】
【氏名】エル ハジ アリシア ジェニファー
【テーマコード（参考）】
4C081
【Ｆターム（参考）】
4C081AA02
4C081AB02
4C081AC03
4C081BA12
4C081BB09
4C081CA051
4C081CA061
4C081CA161
4C081CA171
4C081CA191
4C081CA231
4C081CD041
4C081CD111
4C081CD121
4C081CD34
4C081CE02
4C081DA01
4C081DA02
(57)【要約】
組織再生及び／又は修復のためのパッチ又はバンデージが、開示される。バンデージは、ｉ）Ｗｎｔファミリー由来の１つ若しくは２つ以上のタンパク質又はＷｎｔシグナル伝達経路のアゴニストと、ii）スキャフォールドとを含み、１つ若しくは２つ以上のＷｎｔタンパク質又はＷｎｔアゴニストがスキャフォールドに固定化されており、スキャフォールドは、官能基化された生体適合性ポリマーから形成される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
生物学的組織再生パッチであって、ｉ）Ｗｎｔファミリー由来の１つ若しくは２つ以上のタンパク質又はＷｎｔシグナル伝達経路のアゴニストと、
ｉｉ）スキャフォールドと
を含み、前記１つ若しくは２つ以上のＷｎｔタンパク質又はＷｎｔアゴニストが、前記スキャフォールドに固定化されており、前記スキャフォールドが、官能基化された生体適合性ポリマーから形成される、
前記パッチ。
【請求項2】
１つ又は２つ以上のＷｎｔタンパク質が、Ｗｎｔ３であり、Ｗｎｔ３ａであってもよい、請求項１に記載のパッチ。
【請求項3】
１つ若しくは２つ以上のＷｎｔタンパク質又はＷｎｔアゴニストが、共有結合によってスキャフォールドに固定化されている、請求項１又は２に記載のパッチ。
【請求項4】
１つ若しくは２つ以上のＷｎｔタンパク質又はＷｎｔアゴニストが、一級アミン官能基を介してスキャフォールドに固定化されている、請求項１～３のいずれかに記載のパッチ。
【請求項5】
生体適合性ポリマーが、生分解性である、請求項１～４のいずれかに記載のパッチ。
【請求項6】
生体適合性ポリマーが、フィルムとして形成される、請求項１～５のいずれかに記載のパッチ。
【請求項7】
生体適合性ポリマーが、ポリ（ε－カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポロキサマー、ポビドン、ポリジオキサノン（ＰＤＳ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（グリコリド－コ－カプロラクトン）（ＰＧＣＬ）、ポリ（ｌ－ラクチド－コ－ε－カプロラクトン）ＰＬＣＬ、ポリ－Ｌ／Ｄ－乳酸（ＰＬＤＬＡ）、又はアルギネートである、請求項１～６のいずれかに記載のパッチ。
【請求項8】
生体適合性ポリマーが、一級アミン基で官能基化されている、請求項１～７のいずれかに記載のパッチ。
【請求項9】
生体適合性ポリマー上で培養された幹細胞をさらに含む、請求項１～８のいずれかに記載のパッチ。
【請求項10】
幹細胞が、単層として培養される、請求項９に記載のパッチ。
【請求項11】
幹細胞が、細胞外タンパク質で覆われている、請求項９又は１０に記載のパッチ。
【請求項12】
細胞外タンパク質が、コラーゲンであり、１型コラーゲンであってもよい、請求項１１に記載のパッチ。
【請求項13】
幹細胞が、ヒト骨格系幹細胞（ｈＳＳＣ）である、請求項９～１２のいずれかに記載のパッチ。
【請求項14】
骨の再生及び／又は修復のための骨形成パッチである、請求項１～１３のいずれかに記載のパッチ。
【請求項15】
生物学的軟部組織、結合組織、又は骨の内在性再生及び／又は修復の促進における使用のための、請求項１～１４のいずれかに記載のパッチ。
【請求項16】
生物学的軟部組織、結合組織、又は骨における欠損、孔、間隙、断裂、又は破砕の内在性再生における使用のための、請求項１～１４のいずれかに記載のパッチ。
【請求項17】
生物学的軟部組織、結合組織、又は骨における欠損、孔、間隙、断裂、又は破砕の処置における使用のための、請求項１～１４のいずれかに記載のパッチ。
【請求項18】
生物学的軟部組織、結合組織、又は骨の内在性再生を促進及び／又は調節する治療的に有効な薬剤を特定するためのスクリーニング及び／又は毒性研究における使用のための、請求項１～１４のいずれかに記載のパッチ。
【請求項19】
対象において生物学的軟部組織、結合組織、又は骨における欠損、孔、間隙、断裂、又は破砕を処置する方法であって、請求項１～１４のいずれかに記載のパッチを、前記欠損、孔、間隙、断裂、又は破砕に適用するステップを含む、前記方法。
【請求項20】
請求項１～１４のいずれかに記載の生物学的組織再生パッチを製造する方法であって、ｉ）生体適合性ポリマーから、フィルムを調製するステップと、
ｉｉ）前記ポリマーの表面を官能基化するステップと、
ｉｉｉ）Ｗｎｔファミリー由来の１つ若しくは２つ以上のタンパク質又はＷｎｔシグナル伝達経路のアゴニストを、前記ポリマー表面にコンジュゲートするステップと
を含む、前記方法。
【請求項21】
ポリマーの表面が、一級アミン官能基を提供するように官能基化されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
ポリマーの表面が、酸素プラズマ及びアミノプロピル－トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）での処理によって官能基化されている、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項23】
Ｗｎｔ又はそのアゴニストを官能基化されたポリマー表面にコンジュゲートした後に、幹細胞を培養するステップをさらに含む、請求項２０～２２のいずれかに記載の方法。
【請求項24】
幹細胞を、単層として培養する、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
幹細胞を、３Ｄ構造体を生成するように、５～１０日間培養する、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項26】
コラーゲンの層を幹細胞上に重ねるステップをさらに含む、請求項２３～２５のいずれかに記載の方法。
【請求項27】
請求項１～１４のいずれかに記載のパッチを、欠損、孔、間隙、断裂、又は破砕全体にわたって又はその上にインプラントするステップを含む、生物学的組織再生方法。
【請求項28】
欠損、孔、間隙、断裂、又は破砕が、骨折である、請求項２６に記載の生物学的組織再生方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物学的組織の修復及び再生の分野に関する。具体的には、本発明は、スキャフォールドに固定化されたＷｎｔを使用する、重大な骨折を含む組織の修復及び再生に関する。
【背景技術】
【0002】
世界的な高齢化の進むなか、それに対応した骨折及び骨格疾患の罹患率の増加は、医療システムに対する実質的な負担を意味する（Burge, R. T. et al (2008) J. Medical Economics 4: 51-62; Steiner, C. et al (2002) Eff. Clin. Pract. 5: 143-151）。加えて、がん腫瘍切除及び傷害、例えば、頭蓋顔面の外傷後の再建手術は、相当量のドナー骨組織を必要とし得ることが多い（Hold, P. M. & Prowse, S. J. B. (2011) J. Plast. Reconstr. Aesthet. Surg. 64: 834-835）。自家骨移植などのアプローチは、ドナー部位の病的状態に関する問題によって制限される（Shenaq, S. M. (1988) Microsurgery 9: 154-158）。脱灰骨基質又は無機無生物材料を含む同種骨代用素材は、機械的破損及び感染症のおそれがある（Lee, K. et al (2005) The Spine Journal 5(6 Suppl): 217S-223S）。一方で、細胞に基づく治療法は、局所環境に応答し、傷害部位に正常な機能を回復させることができる幹細胞／骨前駆体を送達することを目的としている（Wozniak, P. & El Haj, A. J. (2007) Tissue Engineering using Ceramics and Polymers. Boccacani, A. R. & Gough J. E. (Eds.) Cambridge; Sharma, P. et al (2005) Applications of Cell Immobilization Biotechnology. Nedovic, V. & Willaert, R. (Eds.) Kluwer Academic Publishers）。このアプローチにおける主な弱点は、それが、細胞分化カスケードの範囲又は移植後に組織を再生及び回復させ続けることができる複能性前駆体の供給源を維持していないことである。
【0003】
骨髄のニッチに存在している骨格系幹細胞（ＳＳＣ、Skeletal stem cell）は、自己再生し、様々な特化した細胞型、例えば、骨細胞に分化する能力を有する（Bianco, P. & Robey, P. G. (2015) Development 142: 1023-1027）。幹細胞の自己再生は、外部シグナルに依存し、鍵となるシグナルは、Ｗｎｔファミリーのタンパク質である（Garcin, C. L. & Habib, S. J. A. (2017) Results Probl. Cell Differ. 61: 323-350）。ニッチシグナルの特徴は、それらの限定的な作用距離である。実際に、脂質改変から生じるそれらの疎水性に起因して、Ｗｎｔタンパク質は、局所的に分泌され、応答性細胞の片側に提示されることが多い（Mills, K. M. et al (2017) Open Biology 7: 170140）。Ｗｎｔタンパク質が、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ及びＬｒｐ５／６という２つの受容体に結合すると、古典的なカノニカルＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達が、活性化される。この経路は、他のタンパク質の中でも、グリコーゲンシンターゼキナーゼ－３（glycogen synthase kinase-3、ＧＳＫ－３）及び腺腫性結腸ポリープ症（adenomatous polyposis coli、ＡＰＣ）を含む、分解複合体によって調節される、β－カテニンの蓄積又は分解を中心としている。β－カテニンは、次いで、核内に転位し、ＴＣＦ／ＬＥＦファミリーの転写因子のメンバーと相互作用して、標的遺伝子の転写に影響を及ぼす。重要なことに、Ｗｎｔリガンドは、他の受容体を有し、非カノニカル経路を通じてシグナル伝達することができる（Garcin & Habib、上記）。
【0004】
強力な遺伝子ツールを使用して、Ｗｎｔシグナル伝達を操作することができるが、疎水性Ｗｎｔタンパク質に関する研究は、精製の技術的課題及びそれらの局在化された作用によって妨げられている。結果として、Ｗｎｔタンパク質は、主として、薬物開発の標的として使用されている。これらの課題に取り組む１つの手段は、生物学的に活性なＷｎｔタンパク質を、合成表面に共有結合で固定化することであり、これにより、局所シグナルを細胞に送達し、それによってインビトロで細胞ニッチを模倣することができる（Lowndes, M. et al (2017) Nat. Protoc. 12(7): 1498-1512; Loundes, M. et al (2016) Stem Cell Reports 7: 126-130）。加えて、この技法の性質により、細胞及び組織の任意の所与の側へのＷｎｔタンパク質の特定の空間標的化が可能となる。この技術は、Ｗｎｔシグナル伝達を理解するためのツールにおける大きな打開策を示す。マイクロビーズに共有結合でつながれたＷｎｔ３ａ（Ｗｎｔ３ａ－ビーズ）リガンドは、単一マウス胚性幹細胞（Embryonic Stem Cells、ＥＳＣ）の配向された非対称細胞分裂を誘導することができることが示されている（Habib, S. J. et al (2013) Science 339: 1445-1448）。結果として、Ｗｎｔ３ａの近位側の娘細胞は、高いレベルの核β－カテニン及び多能性遺伝子を発現し、一方で遠位側の娘細胞は、外胚葉幹細胞運命への分化の特徴を獲得する。したがって、局在化されたＷｎｔは、組織形成及び再生に必須のプロセスである、非対称細胞分裂を制御することによって、インビトロで単一哺乳動物幹細胞における細胞運命決定に影響を及ぼすことができることが、示されている。近年では、Ｗｎｔ３ａは、アルデヒドガラス－プラットフォーム（Ｗｎｔ３ａ－プラットフォーム）に共有結合で結合されている（Lowndes, M. et al (2016) Stem Cell Reports 7: 126-137）。Ｗｎｔ３ａ－プラットフォームは、幹細胞においてＷｎｔ／β－カテニンを活性化することができ、外因性Ｗｎｔ３ａタンパク質の付加を伴うことなく、長期の自己再生を促進することができる、安定な供給源であることが、示されている。Ｗｎｔ３ａ－プラットフォームはさらに、ヒト骨ニッチを再形成する初期３Ｄモデルに展開されている。成体ヒト骨髄から単離されたｈＳＳＣは、発展中の細胞療法業界内でスケーラブルな単離及び増大プロトコールの利点を有するため、エキソビボで自家骨移植片を操作するための明確な選択肢である（Pittenger, M. F. et al. (1999) Science 284: 143-147; Chippendale, T. et al (2016) Comprehensive Biotechnology 2e, Moo-Young, M. (Ed.), Elsevier; Rafiq, Q. A. et al (2013) Biotechnol. Lett. 35: 1233-1245; Heathman, T. R. J. et al. (2015) Biotechnol. Bioeng. 112: 1696-1707; Ankrum, J. A., et al (2014) Nat. Biotechnol. 32: 252-260）。生物学的インプラント内で幹細胞集団、前駆体、及び成熟骨細胞の分化カスケードを維持する３ＤニッチにおいてｈＳＳＣを使用することには、課題が残っている。
【0005】
近年の研究は、３Ｄ培養環境において、Ｗｎｔ３ａ－プラットフォーム上でｈＳＳＣを培養することに成功している（Lowndes, M., et al (2016)、上記）３Ｄ環境を、骨内でもっとも豊富なコラーゲンである１型コラーゲンの薄層の添加により生成し（Nimni, M. W. et al (1987) J. Biomed. Mater. Res. 21: 741-771）、増殖細胞が、プラットフォームからゲル内に遊走することを可能にした。この技術により、組織化された３ＤＷｎｔ誘導型ヒト骨形成組織モデル（Wnt-Induced human Osteogenic Tissue Model、ＷＩＯＴＭ）が生成された。ＷＩＯＴＭは、１週間以内に形成され、Ｗｎｔ３ａ源の近位側におけるＳｔｒｏ１＋ｈＳＳＣ、並びに細胞がＷｎｔ３ａ供給源から遠ざかって遊走すると、Ｓｔｒｏ１の下方調節及び骨形成タンパク質であるオステオカルシンの上方調節を示す多層の分化細胞をからなる。石灰化した小結節もまた、ＷＩＯＴＭのゲルの上部で観察されており、ＷＩＯＴＭが、３Ｄ生理学的ヒト骨ニッチをインビトロで再現することができることを示した。
【0006】
生体材料に基づく再生療法は、治癒しない組織を修復する／置き換える可能性を提供する。国際公開第２０１９／０９４６１７号パンフレットは、ポリカプロラクトンなどのスキャフォールドと、特に高密度骨再生幹細胞（dense bone regenerating stem cell、ＤＢＲ－ＳＣ）、海綿骨再生幹細胞（spongy bone regenerating stem cell、ＳＢＲ－ＳＣ）、又はそれらの混合物を含む間葉幹細胞製剤とを含む、骨再生生成物を開示しており、ここで、この生成物は、Ｗｎｔ「リガンド」などの成長因子をさらに含み得る。スキャフォールドは、骨欠損部に、又はその全体にわたって、インプラントされる。結果として、スキャフォールドは、そのインプラントの荷重負荷条件、例えば、スキャフォールドがインプラントされる身体の運動（例えば、歩行）の間及び／又は体重に対処するのに十分な機械的強度を有する必要がある。
【0007】
国際公開第２００９／１３１７５２号パンフレットは、インプラントの生物学的及び生理学的耐容性の悪さに取り組んでおり、層状に積み重ねたナノテクスチャ処理した生体適合性ポリマー、例えば、ポリカプロラクトンを含む、生物学的コンストラクトを開示している。具体的には、インプラントは、特定の組織の天然の治癒プロセスを模倣する、治療剤の一時的な定性的かつ定性的な溶出を行うことができる、ナノ相表面テクスチャを含む。コンストラクトの機能は、機能的組織を再生させ、器官に解剖学的及び生理学的完全性を回復させるために、治療剤を制御し、治療剤を組織の管腔及び反管腔表面への差示的物質／薬物送達を行うことである。治癒プロセスは、組織特異的な生物学的に操作された細胞シートの付加によって、増進させることができ、このシートは、その細胞外マトリックスとともにデバイス上に重ねられてもよい。幹細胞は、好適であることが記載されている。それぞれのポリマー層は、創傷治癒及び組織リモデリングの異なる段階に対応している。Ｗｎｔ阻害剤は、傷害と関連する炎症性応答を補助するために含まれ得る。
【0008】
国際公開第２０１６／１１２１１１号パンフレットは、骨格系幹細胞の有効用量をマトリックスで投与する、軟骨又は骨を再生させる方法を開示している。具体的には、幹細胞は、損傷した軟骨又は骨の再生のために幹細胞の分化を刺激する因子と一緒に投与される。例えば、幹細胞は、細胞において骨形成運命を誘導するために、Ｗｎｔアゴニスト、例えば、Ｗｎｔ３ａとともに投与され得る。マトリックス（又は格子）は、生分解性ポリマー、例えば、ポリカプロラクトンであり得る。ここでも、傷害部位に直接的に移植され得るのはマトリックス自体であるため、新しく形成された組織が、機械的負荷を受けることができるようになるまで、身体内である程度の構造的完全性を有する必要性がある。注射可能なペースト及び形成可能なパテが、開示されている。
【0009】
国際公開第２０１７／０２１４６１３号パンフレットは、軟骨及び骨を含む、骨格組織の再生を促進する無細胞医療デバイスを開示している。このデバイスは、多層状のスキャフォールドと、幹細胞のデバイスへのホーミングを促進する生体活性剤とを有し、次いで、そこで幹細胞が分化し、デノボ組織形成が促進される。生物学的因子は、不飽和アミン及びアニオン性オリゴ糖を介して、スキャフォールド材料に吸着又はコーティングされる。
【0010】
Chen T. et al (Scientific Reports (2018) 8: 119)は、加齢が自家骨移植の骨形成能力に具体的にどのように影響を及ぼすかを評価した。この研究は、Ｗｎｔシグナル伝達が、加齢関連の自家骨移植の有効性の低下において中枢的な役割を果たすこと、及び自家移植の有効性が、Ｗｎｔタンパク質治療薬を使用したエキソビボ処理によって回復され得ることを、示している。具体的には、骨移植片材料（細胞髄及び石灰化骨チップ画分）を、マウスから取得し、Ｗｎｔ３ａのリポソーム製剤とともにインキュベートした。骨移植片を、次いで、腎被膜下（sub-renal capsule、ＳＲＣ）に１０日間移植した。エキソビボでのＷｎｔ３ａ処理は、移植片において、対照と比較して増加した骨形成をもたらした。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0011】
【特許文献1】国際公開第２０１９／０９４６１７号パンフレット
【特許文献2】国際公開第２００９／１３１７５２号パンフレット
【特許文献3】国際公開第２０１６／１１２１１１号パンフレット
【特許文献4】国際公開第２０１７／０２１４６１３号パンフレット
【非特許文献】
【0012】
【非特許文献1】Burge, R. T. et al (2008) J. Medical Economics 4: 51-62
【非特許文献2】Steiner, C. et al (2002) Eff. Clin. Pract. 5: 143-151
【非特許文献3】Hold, P. M. & Prowse, S. J. B. (2011) J. Plast. Reconstr. Aesthet. Surg. 64: 834-835
【非特許文献4】Shenaq, S. M. (1988) Microsurgery 9: 154-158
【非特許文献5】Lee, K. et al (2005) The Spine Journal 5(6 Suppl): 217S-223S
【非特許文献6】Wozniak, P. & El Haj, A. J. (2007) Tissue Engineering using Ceramics and Polymers. Boccacani, A. R. & Gough J. E. (Eds.) Cambridge
【非特許文献7】Sharma, P. et al (2005) Applications of Cell Immobilization Biotechnology. Nedovic, V. & Willaert, R. (Eds.) Kluwer Academic Publishers
【非特許文献8】Bianco, P. & Robey, P. G. (2015) Development 142: 1023-1027
【非特許文献9】Garcin, C. L. & Habib, S. J. A. (2017) Results Probl. Cell Differ. 61: 323-350
【非特許文献10】Mills, K. M. et al (2017) Open Biology 7: 170140
【非特許文献11】Lowndes, M. et al (2017) Nat. Protoc. 12(7): 1498-1512
【非特許文献12】Loundes, M. et al (2016) Stem Cell Reports 7: 126-130
【非特許文献13】Habib, S. J. et al (2013) Science 339: 1445-1448
【非特許文献14】Lowndes, M. et al (2016) Stem Cell Reports 7: 126-137
【非特許文献15】Pittenger, M. F. et al. (1999) Science 284: 143-147
【非特許文献16】Chippendale, T. et al (2016) Comprehensive Biotechnology 2e, Moo-Young, M. (Ed.), Elsevier
【非特許文献17】Rafiq, Q. A. et al (2013) Biotechnol. Lett. 35: 1233-1245
【非特許文献18】Heathman, T. R. J. et al. (2015) Biotechnol. Bioeng. 112: 1696-1707
【非特許文献19】Ankrum, J. A., et al (2014) Nat. Biotechnol. 32: 252-260
【非特許文献20】Nimni, M. W. et al (1987) J. Biomed. Mater. Res. 21: 741-771
【非特許文献21】Chen T. et al (Scientific Reports (2018) 8: 119)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
組織再生に関してインビボでのスキャフォールド及び幹細胞の使用が知られているが、局在化されたＷｎｔシグナル伝達の重要性と合わせると、効率的かつ有効な骨再生を促進するデバイスに対する必要性が依然として存在しており、この背景に対して、本発明が考案された。
【課題を解決するための手段】
【0014】
本発明は、生物学的組織再生パッチであって、ｉ）Ｗｎｔファミリー由来の１つ若しくは２つ以上のタンパク質又はＷｎｔシグナル伝達カスケードのアゴニストと、ii）スキャフォールドとを含み、１つ若しくは２つ以上のＷｎｔタンパク質又はＷｎｔアゴニストがスキャフォールドに固定化されており、スキャフォールドが、官能基化された生体適合性ポリマーから形成される、パッチを包含する。
【0015】
１つ又は２つ以上のＷｎｔタンパク質は、Ｗｎｔ３であり得、好ましくはＷｎｔ３ａであり得る。
【0016】
好ましくは、１つ若しくは２つ以上のＷｎｔタンパク質又はＷｎｔアゴニストは、共有結合によってスキャフォールドに固定化されていてもよい。１つの例において、固定化は、一級アミン官能基を介している。
【0017】
一実施形態において、生体適合性ポリマーは、生分解性であってもよい。
【0018】
別の実施形態において、生体適合性ポリマーは、フィルムとして形成されてもよい。
【0019】
生体適合性ポリマーの例としては、ポリ（ε－カプロラクトン）（ＰＣＬ、poly (ε-caprolactone)）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ、poly (lactic-co-glycolic acid)）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ、poly (lactide acid)）、ポロキサマー、ポビドン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、polyethylene glycol）、又はポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ、poly(vinyl alcohol)）が挙げられる。
【0020】
別の実施形態において、生体適合性ポリマーは、一級アミン基で官能基化されていてもよい。代替的には、生体適合性ポリマーは、カルボン酸基で官能基化されていてもよい。
【0021】
本発明はまた、生体適合性ポリマー上で培養された幹細胞をさらに含む、パッチを包含する。理想的には、幹細胞は、単層として培養される。
【0022】
一実施形態において、幹細胞は、細胞外マトリックスタンパク質で覆われていてもよい。例えば、コラーゲン、例えば、１型コラーゲン、及びラミニンが、好適であり得る。
【0023】
一実施形態において、幹細胞は、ヒト間葉又は骨格系幹細胞（ｈＳＳＣ）であり得る。そのため、パッチは、骨の再生及び／又は修復のための骨形成パッチである。
【0024】
本発明はまた、生物学的軟部組織、結合組織、又は骨の内在性再生及び／又は修復の促進のためのパッチの使用も包含する。組織又は骨は、欠損、孔、間隙、断裂、又は破砕を有し得る。別様に表す場合、本発明は、生物学的組織の内在性再生方法であって、本明細書全体を通じて記載されるパッチを、軟部組織、結合組織、又は骨における孔、欠損、間隙、断裂、又は破砕全体にわたって、その上又はその周辺にインプラントするステップを含む、方法を包含する。
【0025】
特定の例において、孔、欠損、間隙、断裂、又は破砕は、骨折であり得る。別の例において、孔は、頭蓋顔面欠損であってもよく、及び／又は骨がん腫瘍除去に起因するものであってもよい。別の例は、脳外科手術又は脳卒中リハビリテーション後の１つ又は２つ以上の頭蓋の孔の修復のための使用であり得る。本発明の方法及びパッチはまた、新しい骨を成長させるため、例えば、脚を伸長させるため又は骨の一部が除去された後に骨を再成長させるためにも使用され得る。
【0026】
本発明のパッチの特定の整形外科学的使用の具体的な例としては、経椎間孔腰椎椎体間固定（Transforaminal Lumbar Interbody Fusion、ＴＬＩＦ）脊椎固定術、単椎間関節固定術、分節系骨欠損、及び高位脛骨切断術が挙げられる。
【0027】
また、生物学的軟部組織、結合組織、又は骨の内在性修復を促進する方法であって、本明細書に記載される生物学的組織修復パッチを、組織又は骨における欠損、孔、間隙、断裂、又は破砕に適用するステップを含む、方法も提供される。
【0028】
一実施形態において、生物学的組織修復パッチは、バンデージを含むか、又はバンデージである。
【0029】
一実施形態において、生物学的組織修復パッチは、骨膜に適用される。生物学的組織修復パッチを、組織又は骨における欠損、孔、間隙、断裂、又は破砕に適用する場合、骨膜は、損傷しているか又は非連続的であり得る。この状況において、生物学的組織修復パッチは、その少なくとも一部が、骨膜の少なくとも一部と接触するように適用される。これは、内在性幹細胞が、適用の部位において、治療的に有効な構造を再構成するのを促進する利点を有する。
【0030】
一実施形態において、生物学的組織修復パッチを適用する前又はそれと同時に、コラーゲン、好適には、１型コラーゲンが、組織又は骨における欠損、孔、間隙、断裂、又は破砕に適用される。好適には、コラーゲン、例えば、１型コラーゲンは、注射によって適用されるか、又は重合したゲルとして創傷部位に適用される。これは、内在性幹細胞が、適用の部位において、治療的に有効な構造を再構成するのを促進する利点を有する。
【0031】
別の実施形態において、本発明は、生物学的軟部組織、結合組織、又は骨における欠損、孔、間隙、断裂、又は破砕の処置において使用するための、上述のパッチに関する。
【0032】
別の実施形態において、本発明は、対象において生物学的軟部組織、結合組織、又は骨における欠損、孔、間隙、断裂、又は破砕を処置する方法であって、上述のパッチを、前記欠損、孔、間隙、断裂、又は破砕に適用するステップを含む、方法に関する。
【0033】
パッチはまた、生物学的軟部組織、結合組織、又は骨の内在性再生を促進及び／又は調節する治療的に有効な薬剤を特定するためのスクリーニング及び／又は毒性研究における使用も見出される。
【0034】
本明細書に記載される生物学的組織再生パッチを製造する方法であって、ｉ）生体適合性ポリマーから、フィルムを調製するステップと、ii）ポリマーの表面を官能基化するステップと、iii）Ｗｎｔファミリー由来の１つ若しくは２つ以上のタンパク質又はＷｎｔシグナル伝達経路のアゴニストを、ポリマー表面にコンジュゲートするステップとを含む、方法も、開示される。
【0035】
好ましくは、ポリマーの表面は、一級アミン官能基を提供するように官能基化されていてもよい。そのような官能基化は、酸素プラズマ及びアミノプロピル－トリエトキシシラン（aminopropyl-triethoxysilane、ＡＰＴＥＳ）での処理によって達成され得る。代替的には、官能基化は、ＥＤＣ／ＮＨＳ反応によるカルボン酸の活性化によって、達成され得る。
【0036】
特定の実施形態において、本方法は、Ｗｎｔ又はそのアゴニストを官能基化されたポリマー表面にコンジュゲートした後に、幹細胞を培養するステップをさらに含む。
【0037】
理想的には、幹細胞は、単層として培養され、５～１０日間、好ましくは、７～８日間培養され得る。
【0038】
別の実施形態において、本方法は、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、コラーゲン、例えば、１型コラーゲンの層を、幹細胞上に重ねるステップをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【0039】
【図1-1】固定化されたＷｎｔ３ａタンパク質は、３Ｄ培養モデルにおいて、有糸分裂面をアライメントし、骨髄由来ヒト骨格系幹細胞（ｈＳＳＣ）のＷｎｔ／β－カテニン経路構成成分の非対称分布を誘導する。図１Ａ：３Ｄ Ｗｎｔ誘導型ヒト骨形成組織モデル（ＷＩＯＴＭ）において上方に遊走するｈＳＳＣの代表的な断面図である。核は、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ、黄色）で染色されている。Ｚ＝１２５μｍ。図１Ｂ：ＷＩＯＴＭにおける分裂の配向及び骨形成分化プロセスの概略図である。図１Ｃ：Ｗｎｔ３ａ又は不活性Ｗｎｔ３ａ－ＷＩＯＴＭにおいて垂直方向の細胞分裂を受けるｈＳＳＣのパーセンテージの定量化である。プロットされたデータは、平均±標準偏差である。ｎ＝３回の反復、Ｎ≧１５個の細胞。星印は、両側スチューデントｔ検定によって計算された、以下の統計学的有意性を示す：＊、ｐ＜０．０５。Ｗｎｔ３ａ表面に対して垂直方向（図１Ｄ～１Ｇ）又は平行方向（図１Ｈ～１Ｋ）の細胞分裂を受けるｈＳＳＣの代表的な共焦点Ｚプレーン（図１Ｄ及び図１Ｈ）、３Ｄ再構成（図１Ｅ及び１Ｉ）、又は断面図（図１Ｆ及び図１Ｊ）である。細胞は、ＡＰＣに対する抗体（シアン）及びβ－カテニンに対する抗体（マゼンタ）で染色されている。核は、ＤＡＰＩ（黄色）で染色されている。スケールバー、２０μｍ。
【図1-2】図１Ｇ及び図１Ｋ：平均蛍光強度（任意単位）として表される、Ｚ軸（軸方向分解）にわたるＡＰＣ、β－カテニン、及びＤＡＰＩの蛍光強度分析である。図１Ｌ：概略図の右側に示されるカテゴリーに従った、Ｗｎｔ３ａ表面に対して垂直方向又は平行方向に分裂する細胞におけるＡＰＣ及びβ－カテニンの分布の定量化である。データは、平均±標準偏差である。ｎ＝３回の反復、Ｎ≧１５個の細胞。
【図2-1】図２：固定化されたＷｎｔ３ａタンパク質は、分裂細胞及びＷＩＯＴＭにおいて、カドヘリン－１３（ＣＤＨ１３、Cadherin-13）及びオステオポンチンの非対称分布を誘導する。図２Ａ：断面図の画像（ｚ＝１５０μｍ）、並びに図２Ｂ：ＷＩＯＴＭの底部（細胞がＷｎｔ３ａ表面と直接接触している）、中央部（表面から１０～５０μｍ）、及び上部（表面から５０～１００μｍ）からの代表的な共焦点Ｚプレーンである。細胞は、ＣＤＨ１３に対する抗体（シアン）及びＤＡＰＩに対する抗体（黄色）で染色されている。スケールバー、１００μｍ。図２Ｃ：ＷＩＯＴＭにおける３つの異なるｚレベルでの骨形成及び幹細胞マーカーの発現の定量化である。ｎ＝３回の反復、Ｎ＞９０個の細胞。
【図2-2】図２Ｄ及び図２Ｅ：図２Ｄは垂直方向及び図２Ｅは平行方向に分裂する細胞における分裂中期のＣＤＨ１３（シアン）及びＯＰＮ（マゼンタ）の発現を示す、一連のｚプレーンの代表的な共焦点画像である。スケールバー、２０μｍ。図２Ｆ：図９Ａに記載されるように計算した、垂直方向（Ｐｅｒｐ）及び平行方向（Ｐａｒａ）に分裂する細胞におけるＯＰＮ及びＣＤＨ１３の分布の定量化である。単一細胞がプロットされており、バーは、平均±標準偏差であり、Ｎ≧１８個の細胞である。星印は、両側スチューデントｔ検定によって計算された、以下の統計学的有意性を示す：＊＊、ｐ＜０．０１。
【図2-3】細胞分裂後の娘細胞の共焦点画像の代表的な３Ｄ再構成（図２Ｇ）及び２Ｄ側面図（図２Ｈ）である。Ｔ：上部（Ｗｎｔ３ａ遠位側）細胞、Ｂ：底部（Ｗｎｔ３ａ近位側）。スケールバー、２０μｍ。平行方向の細胞分裂後の娘細胞の共焦点画像の代表的な３Ｄ再構成（図２Ｉ）及び２Ｄ側面図（図２Ｊ）である。Ｔ：上部（Ｗｎｔ遠位側）細胞、Ｂ：底部（Ｗｎｔ３ａ近位側）。Ｌ：左側の細胞、Ｒ：右側の細胞。図２Ｋ：図９Ａに記載されるように計算した、垂直方向（Ｐｅｒｐ）及び平行方向（Ｐａｒａ）の分裂後の細胞におけるＯＰＮ及びＣＤＨ１３の分布の定量化である。細胞ペアがプロットされており、バーは、平均±標準偏差であり、Ｎ≧１７個の細胞ペアである。星印は、両側スチューデントｔ検定によって計算された、以下の統計学的有意性を示す：＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。
【図3】図３：Ｗｎｔ３ａバンデージのインビトロでの機能性の特徴付けである。図３Ａ：２０ｎｇ（左）又は６０ｎｇ（右）のＷｎｔ３ａのＰＣＬフィルムへの固定化プロセスの代表的なαＷＮＴ３Ａイムノブロットである（Ｗｎｔ３ａバンデージ）。それぞれのイムノブロットにおいて、Ｗｎｔ３ａインプット（２０ｎｇ又は６０ｎｇ）、それぞれのフィルム上の表面のインキュベーション及び３回のＰＢＳ洗浄（Ｗ１、Ｗ２、及びＷ３）後に回収した未結合Ｗｎｔ３ａを、ブロッティングした。０．１％ ＢＳＡ単独もまた、対照としてゲルにロードした。図３Ｂ：７ｘＴＣＦ－ルシフェラーゼレポーター細胞系（ＬＳ／Ｌ）アッセイによって測定した、ＰＣＬフィルムに固定化されたＷｎｔ３ａのＷｎｔ活性である。星印は、チューキーの検定によって計算した統計学的有意性を示す：＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。図３Ｃ：２０ｎｇ又は６０ｎｇのＷｎｔ３ａをコンジュゲートしたＰＣＬバンデージにおける７ｘＴＣＦ－ｅＧＦＰ／ＳＶ４０－ｍＣｈｅｒｒｙ ｈＳＳＣのＷｎｔに誘導されるｅＧＦＰ発現及びｍＣｈｅｒｒｙ発現である。ＢＳＡバンデージ及び不活性化Ｗｎｔバンデージは、陰性対照として使用した。スケールバー、１００μｍ。図３Ｄ：図３ＣにおけるＷｎｔに誘導されるｅＧＦＰ発現の定量化である。それぞれのバーは、それぞれの条件下におけるｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞間のｅＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを示す（平均±標準偏差、ｎ＝５回の反復、Ｎ＞５５５個の細胞）。星印は、一方向ＡＮＯＶＡ検定によって計算した、以下の統計学的有意性を示す：＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。
【図4-1】図４：マウス頭蓋冠骨の臨界サイズ欠損部の修復におけるＷｎｔ３ａバンデージ及びＷＩＯＴＭバンデージのインビボでの機能の評価である。図４Ａ：その後の外科手技の概略図である。簡単に述べると、：４ｍｍの欠損部を、頭頂骨の片側又は両側に作製し、官能基化されたバンデージインプラントを重ね、固定した（又は欠損のみの対照についてはインプラントなし）。図４Ｂ及び図４Ｃ：インプラントを移植していないマウス（欠損のみ）、並びに不活性化Ｗｎｔ３ａ（ｉＷｎｔ）バンデージ、ｈＳＳＣを培養し１型コラーゲンで覆われた不活性化Ｗｎｔ３ａバンデージ（ｉＷｎｔ－ｈＳＳＣ）、活性Ｗｎｔ３ａ（Ｗｎｔ）バンデージ、及びＷＩＯＴＭバンデージ（図４Ｃ）を移植したマウスにおける、移植の８週間後の頭蓋冠欠損部の代表的なμＣＴスキャン画像である。図４Ｄ：μＣＴスキャニングによってイメージングした、欠損部位に対する新しい骨のカバレッジの定量化である（平均±標準偏差、ｎ≧９匹の動物）。星印は、一方向ＡＮＯＶＡ検定によって計算した、以下の統計学的有意性を示す：ｎｓ、有意性なし；＊、＜０．０５；＊＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、ｐ＜０．００１。
【図4-2】再生された新しい骨（new bone、ＮＢ）、宿主及び新しい骨の融合、宿主骨（host bone、ＨＢ）、並びに結合／間質組織（connective/stromal tissue、ＣＳＴ）を示す、切片のヘマトキシリン及びエオシン（図４Ｅ）並びにモバットのペンタクローム（図４Ｆ）染色である。スケールバー、１００μｍ（図４Ｅ）及び５００μｍ（図４Ｆ）。ＢＶ：血管、ＢＴ：脳組織。
【図5-1】図５：ＷＩＯＴＭ、Ｗｎｔ３ａ、及びｉＷｎｔ３ａ－ｈＳＳＣバンデージによる、インプラント８週間後の頭蓋冠骨の臨界サイズ欠損部における新しい骨の形成のインビボでの特徴付けである。図５Ａ：新しい骨及び宿主骨の面積における総スクレロスチン（ＳＯＳＴ、Sclerostin）陽性細胞の密度の定量化（図１６Ａにおける方法）である。平均±標準偏差、Ｎ≧３匹の動物から１２５個の細胞。全カラム間の対応のないｔ検定によって判定した、統計学的有意性：ｎｓ、ｐ＞０．０５。図５Ｂ：ヒトマーカー（ｍＣｈｅｒｒｙ／ｈＢＭＧ２）及びＳＯＳＴの共発現によって判定される、ＷＩＯＴＭバンデージ及びｉＷｎｔ３ａバンデージ＋ｈＳＳＣにおける、ヒト起源の新しい骨における総ＳＯＳＴ＋細胞のパーセンテージの定量化である。注意：（Ｂ）と同じ試料を使用。平均±標準偏差、ｎ＝３匹の動物、Ｎ≧３８個の細胞。対応のないｔ検定によって判定した、統計学的有意性：＊、ｐ＜０．０５。図５Ｃ：欠損部位における新しい骨（ＮＢ）のマイクロ－ＣＴ（μＣＴ）及び明視野画像である。ＲＯＩ１は、中央部における新しい骨であり、ＲＯＩ２は、宿主骨（ＨＢ）の近傍の欠損部の縁部における新しい骨である。スケールバー、２５０μｍ。アスタリスクは、封入のアーチファクトを示す。
【図5-2】～
【図5-3】図５Ｄ、図５Ｅ、及び図５Ｆ：欠損部位切片の代表的な免疫蛍光画像である：（Ｄ）７ｘＴＣＦ－ｅＧＦＰ／／ＳＶ４０－ｍＣｈｅｒｒｙレポーターを発現する細胞を有するＷＩＯＴＭバンデージがインプラントされている、（Ｅ）Ｗｎｔ３ａバンデージ単独、及び（Ｆ）ｈＳＳＣを有し、１型コラーゲンで覆われた不活性Ｗｎｔ３ａバンデージ（ｉＷｎｔ３ａバンデージ＋ｈＳＳＣ）。切片は、ＤＡＰＩ（黄色）、スクレロスチンに対する抗体（シアン）、及びヒトマーカー（Ｄ）ｍＣｈｅｒｒｙ（赤色）、（Ｆ）ｈＢＭＧ２（赤色）で染色されている。実線の白色の枠は、ヒトマーカー＋細胞を示し、破線の枠は、ヒトマーカー－を示す。アスタリスクは、非細胞アーチファクトを示す。スケールバー、２０μｍ。
【図6-1】図６：ＷＩＯＴＭ、Ｗｎｔ３ａ、及びｉＷｎｔ３ａ－ｈＳＳＣバンデージで処置した頭蓋冠骨の臨界サイズ欠損部において形成された新しい骨の周囲の結合／間質様組織の、インプラント８週間後のインビボでの特徴付けである。図６Ａ：近位側（Ｐｒｏｘ、＜２０μｍ）、Ｍ（中央）：組織の残りの厚みの５０％、Ｄ（遠位側）：組織の残りの厚みのもう５０％において見出された、総細胞に対するＧＦＰ＋ヒト細胞及びＧＦＰ－ヒト細胞のパーセンテージの定量化である。平均±標準偏差、ｎ≧３、Ｎ≧３匹の動物から３１８個の細胞、パーセンテージはグラフに示されている。図６Ｂ：７ｘＴＣＦ－ｅＧＦＰ／／ＳＶ４０－ｍＣｈｅｒｒｙを発現する細胞を有するＷＩＯＴＭバンデージをインプラントした欠損部位及び宿主組織の代表的な免疫蛍光画像である。切片は、ＤＡＰＩ（白色）、並びにｍＣｈｅｒｒｙに対する抗体（赤色）及びＧＦＰに対する抗体（緑色）で染色されている。矢印：青色：ｍＣｈ－／ＧＦＰ－、マゼンタ：ｍＣｈ＋／ＧＦＰ－、白色：ｍＣｈ－／ＧＦＰ－。スケールバー、５０μｍ。ＨＢ：宿主骨、Ｐｅｒｉ：骨膜。スケールバー、５０μｍ。図６Ｃ及び図６Ｄ：欠損部位及び宿主組織の代表的な免疫蛍光画像：図６Ｃ：７ｘＴＣＦ－ｅＧＦＰ／／ＳＶ４０－ｍＣｈｅｒｒｙレポーターを発現する細胞を有するＷＩＯＴＭバンデージをインプラントした欠損部位の代表的な免疫蛍光画像である。
【図6-2】図６Ｄ：Ｗｎｔ３ａバンデージ単独及びｈＳＳＣに１型コラーゲンで覆われた不活性Ｗｎｔ３ａバンデージ（ｉＷｎｔ３ａバンデージ＋ｈＳＳＣ）である。切片は、ＤＡＰＩ（黄色）、ＣＤＨ１３に対する抗体（シアン）で染色されており、（Ｃ）においては、ヒトマーカーｍＣｈｅｒｒｙに対する抗体（赤色）で染色されている。矢印：白色：ｍＣｈ＋／ＣＤＨ１３＋、青色：ｍＣｈ－／ＣＤＨ１３＋、マゼンタ：ｍＣｈ＋／ＣＤＨ１３－、黄色：ｍＣｈ－／ＣＤＨ１３－。スケールバー、５０μｍ。Ｐ：骨膜、Ｓ：縫合線、ＨＢ：宿主骨、Ｐｅｒｉ：骨膜、ＮＢ：新しい骨。図６Ｅ～６Ｇ：（図６Ｅ）７ｘＴＣＦ－ｅＧＦＰ／／ＳＶ４０－ｍＣｈｅｒｒｙレポーターを発現する細胞を有するＷＩＯＴＭバンデージ（ＷＩＯＴＭバンデージ）、（図６Ｆ）Ｗｎｔ３ａバンデージ単独、及び（図６Ｇ）ｈＳＳＣを有し１型コラーゲンで覆われた不活性Ｗｎｔ３ａバンデージ（ｉＷｎｔ３ａバンデージ＋ｈＳＳＣ）の欠損部位、並びに宿主組織における、総細胞に対するパーセンテージとしての、欠損部位における細胞部分集団の定量化である。バンデージ表面に対して近位側、＜２０μｍ）、中央部：組織の残りの厚みの５０％、遠位側：組織の残りの厚みのもう５０％。平均±標準偏差、ｎ≧３、Ｎ≧３匹の動物から２５個の細胞、パーセンテージはグラフに示されている。Ｐ：骨膜、Ｓ：縫合線、ＨＢ：宿主骨。Ｐｅｒｉ：骨膜、ＮＢ：新しい骨。
【図7】図７：ウエスタンブロットによって示されるＰＬＧＡバンデージへのＷｎｔの固定化、及びＷｎｔレポーター細胞系におけるＷｎｔ／ベータ－カテニン経路の活性化である。図７Ａ：１３週齢の雌性重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ、severe combined immunodeficient）マウスにおける、８週間後の、直径４ｍｍの臨界サイズの片側頭蓋冠骨欠損部の骨修復の面積パーセンテージの定量化である。孔を開けた欠損部は、コラーゲンで覆われた。欠損のみ（ｎ＝１４匹）には、さらなる処置を与えなかった。ＰＬＧＡ－ＷＩＯＴＭ条件（ｎ＝１０匹）においては、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）Ｗｎｔ３ａバンデージに、ｈＳＳＣを播種し、移植の前にインビトロで３Ｄ骨形成マトリックスにおいて７日間培養し、Ｗｎｔ誘導型ヒト骨形成組織モデル（ＷＩＯＴＭ）を形成した。統計学的有意性は、対応のない両側Ｔ検定によって計算した。図７Ｂ：外科手術の８週間後における頭蓋冠骨欠損のマイクロコンピュータ断層撮影法（マイクロＣＴ）スキャンの代表的な画像である。黄色破線の楕円は、もともとの直径４ｍｍの欠損サイズを表す。スケールバーは、２ｍｍである。図７Ｃ：ＰＬＧＡバンデージ又は組織培養プラスチックに播種した、７ｘＴＣＦ－ルシフェラーゼコンストラクトを有するＷｎｔ／β－カテニンレポーターＬＳＬ細胞によって測定される、ルシフェラーゼ活性の変化倍数である。条件：Ｗｎｔ３ａ－ＰＬＧＡ（６０ｎｇのインプットＷｎｔ３ａをＰＬＧＡに固定化）、培地対照（組織培養プラスチック及び標準的な培養培地）、並びに可溶性Ｗｎｔ３ａ（組織培養プラスチック、及び４５ｎｇの可溶性Ｗｎｔ３ａを補充した培地）での読み取りを、ＢＳＡ－ＰＬＧＡ（ＰＬＧＡに固定化したウシ血清アルブミン）に対して正規化した。ｎ＝９、３回の独立した実験からプール。統計学的有意性は、対応のない両側Ｔ検定によって計算した。図７Ｄ：６０ｎｇのＷｎｔ３ａ（固定化ステップでインプットした量と同等）、未結合Ｗｎｔ３ａ（固定化後に回収）、洗浄液１～３、及びＢＳＡのみ（ウシ血清アルブミン）を示す代表的なウエスタンブロットである。分子量ラダーは、キロダルトン（ｋＤ）単位である。
【図8-1】図８：３Ｄ培養物におけるｈＳＳＣの有糸分裂の軸、並びにａＰＫＣ ｚ及びＮｕｍｂの細胞分布である。図８Ａ及び図８Ｂ：セントロソームマーカーであるセントリン１に対する抗体（マゼンタ）又はＤＡＰＩ（黄色）で染色した、Ｗｎｔ表面に対して平行方向（Ａ）又は垂直方向（Ｂ）に分裂するｈＳＳＣの代表的な画像である。差し込み図は、白色枠の拡大図である。矢印は、セントロソームを示す。スケールバー、５０μｍ。図８Ｃ：図１Ｌのように分類される、Ｗｎｔ３ａ表面に対して垂直方向又は平行方向に分裂する細胞におけるａＰＫＣζの分布の定量化である。Ｎ≧１５個の細胞。
【図8-2】図８Ｄ及び図８Ｅ：垂直方向（図８Ｄ）又は平行方向（図８Ｅ）の細胞分裂を受けるｈＳＳＣの代表的な共焦点Ｚプレーン及び３Ｄ再構成である。細胞は、α－チューブリンに対する抗体（シアン）、ａＰＫＣζに対する抗体（マゼンタ）、及びＤＡＰＩ（黄色）で染色されている。スケールバー、２０μｍ。
【図8-3】図８Ｆ及び図８Ｇ：垂直方向（図８Ｆ）又は平行方向（図８Ｇ）の細胞分裂を受けるｈＳＳＣの代表的な共焦点Ｚプレーンである。細胞は、ＤＡＰＩ（黄色）及び抗体ＮＵＭＢ（赤色）で染色されている。スケールバー、２０μｍ。図８Ｈ及び図８Ｉ：垂直方向及び平行方向の分裂細胞の３Ｄ再構成及び２Ｄ図である。図８Ｆ及び図８Ｈにおける細胞は、共染色により、図１０Ｄ～１０Ｆにも示されていることに留意されたい。図８Ｊ：図９Ａに示されるように、垂直方向（Ｐｅｒｐ）又は平行方向（Ｐａｒａ）の分裂細胞におけるＮＵＭＢ分布の定量化である（単一細胞がプロットされており、バーは、平均±標準偏差であり、Ｎ≧１０個の細胞である）。
【図9-1】図９：細胞分裂中の細胞運命マーカーの分布及び培養ｈＳＳＣの複能性である。図９Ａ：垂直方向又は平行方向の分裂細胞の定量化プロトコールの概略図である。簡単に述べると、ＤＡＰＩ染色を、中央部の参照として使用し、マーカー１及びマーカー２の平均蛍光強度を、細胞のＤＡＰＩ正中線から底部及び上部（垂直方向の分裂細胞）又は細胞のＤＡＰＩ正中線から右側部分及び左側部分（平行方向の分裂細胞）について測定した。マーカー１と２との間の比を、それぞれの細胞の半分について計算し、比の間の差異倍数をプロットした。
【図9-2】図９Ｂ及び図９Ｃ：ＣＤＨ１３に対する抗体（シアン）及びＯＰＮに対する抗体（マゼンタ）、並びにＤＡＰＩ（黄色）で染色した、分裂終期における垂直方向（図９Ｂ）又は平行方向（図９Ｃ）の分裂細胞の代表的な共焦点Ｚプレーンである。スケールバー、２０μｍ。図９Ｄ：脂肪生成、軟骨形成、及び骨形成培地における培養の１４日目におけるｈＳＳＣ（継代５）のインビトロでの分化である。上の段：それぞれ３つの系統のマーカー（赤色）（ＦＡＢＰ４、アグリカン、及びオステオカルシン（ＯＣＮ、Osteocalcin）、並びにＤＡＰＩ（青色）の免疫蛍光染色である。下の段：特異性を示すために一次抗体なしで染色した細胞。スケールバー、１５０μｍ。
【図10-1】図１０：ＷＩＯＴＭ及びｈＳＳＣ分裂中の細胞運命マーカーの分布である。図１０Ａ：断面画像の図（ｚ＝１２０μｍ）、及び図１０Ｂ：ＷＩＯＴＭの底部（細胞がＷｎｔ３ａ表面と直接接触している）、中央部（表面から１０～５０μｍ）、及び上部（表面から５０～１００μｍ）からの代表的な共焦点Ｚプレーンである。細胞は、ＰＬＸＮＡ２に対する抗体（シアン）及びＯＰＮに対する抗体（マゼンタ）、並びにＤＡＰＩ（黄色）で染色されている。スケールバー、１００μｍ。図１０Ｃ：ＷＩＯＴＭにおける３つの異なるｚレベルでの骨形成及び幹細胞マーカーの発現の定量化である。データは、平均±標準偏差であり、ｎ＝３回の反復、Ｎ≧２６２個の細胞。
【図10-2】図１０Ｄ：垂直方向の細胞分裂を受けるｈＳＳＣの代表的な共焦点Ｚプレーンであり、ＰＬＸＮＡ２に対する抗体（シアン）、ＯＰＮに対する抗体（マゼンタ）、及びＤＡＰＩ（黄色）で染色されている。この細胞はまた、図８Ｆ及び８Ｈにも示されていることに留意されたい。スケールバー、２０μｍ。
【図10-3】図１０Ｅ：図１０Ｄに示される細胞の３Ｄ再構成である。図１０Ｆ：図１０Ｅの上面図における３Ｄ再構成したＤＡＰＩシグナルの拡大図である。図１０Ｇ：図９Ａに記載されるように計算した、垂直方向（Ｐｅｒｐ）及び平行方向（Ｐａｒａ）に分裂する細胞におけるＯＰＮ及びＰＬＸＮＡ２の分布の定量化である。単一細胞がプロットされており、バーは、平均±標準偏差であり、Ｎ≧１７個の細胞である。星印は、両側スチューデントｔ検定によって計算した、統計学的有意性を示す、＊＊、ｐ＜０．０１。
【図11-1】図１１：ｈＳＳＣ分裂中の細胞運命マーカーの分布である。垂直方向（Ｔ：上部、Ｂ：底部）（図１１Ａ）及び平行方向の分裂（Ｌ：左側、Ｒ：右側）（図１１Ｂ）の代表的な有糸分裂後の細胞の３Ｄ再構成である。細胞は、ＤＡＰＩ（黄色）及びＰＬＸＮＡ２（シアン）で染色されている。
【図11-2】図１１Ｃ：図９Ａに記載されるように計算した、垂直方向及び平行方向に分裂した有糸分裂後の細胞におけるＯＰＮ及びＰＬＸＮＡ２の分布の定量化である。細胞ペアがプロットされており、バーは、平均±標準偏差であり、Ｎ≧１７個の細胞である。星印は、両側スチューデントｔ検定によって計算した、以下の統計学的有意性を示す：＊＊＊、ｐ＜０．００１。
【図12-1】図１２：ＷＩＯＴＭ及びｈＳＳＣ分裂中の細胞運命マーカーの分布である。図１２Ａ：上方に遊走する細胞におけるタンパク質発現の変化を示す、ＷＩＯＴＭの底部（ｚ＝０～１０μｍ）又は上部（ｚ＝５０～６０μｍ）の共焦点画像の代表的な最大強度Ｚ図である。細胞は、ＯＣＮに対する抗体（シアン）、ＳＴＲＯ１に対する抗体（マゼンタ）、及びＤＡＰＩ（黄色）で染色されている。スケールバー、５０μｍ。
【図12-2】図１２Ｂ及び図１２Ｃ：垂直方向（図１２Ｂ）又は平行方向（図１２Ｃ）の細胞分裂を受けるｈＳＳＣの代表的な共焦点Ｚプレーンである。細胞は、ＯＣＮに対する抗体（シアン）、Ｓｔｒｏ１に対する抗体（マゼンタ）、及びＤＡＰＩ（黄色）で染色されている。スケールバー、２０μｍ。
【図12-3】図１２Ｄ及び図１２Ｅ：図９Ａに記載されるように計算した、垂直方向及び平行方向に配向された分裂中（図１２Ｄ）及び有糸分裂後（図１２Ｅ）の細胞におけるＯＰＮ及びＰＬＸＮＡ２の分布の定量化である。単一細胞（Ｄ）又は細胞ペア（Ｅ）がプロットされており、バーは、平均±標準偏差であり、それぞれ、Ｎ≧１７及び１８個の細胞／細胞ペアである。星印は、両側スチューデントｔ検定によって計算された、以下の統計学的有意性を示す：＊＊、ｐ＜０．０１。代表的な垂直方向の有糸分裂後の細胞ペアの３Ｄ再構成（図１２Ｆ）及び２Ｄ図（図１２Ｇ）である。Ｔ：上部細胞、Ｂ：底部細胞。
【図13-1】図１３：Ｗｎｔ固定化のためのＰＣＬフィルムの官能基化である。図１３Ａ：Ｏ２プラズマ処理を使用したＰＣＬ表面の酸化、及び（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）のラジカルヒドロキシル基との二次共有結合でのコンジュゲーションによる安定な一級アミンの提供を示す概略図である。図１３Ｂ：８週間にわたる培養で、一級アミン官能基化の有効性及びＰＣＬの安定な物理的完全性を特徴付けるためのフルオレセインイソチオシアネートＦＩＴＣコンジュゲーションの定量化である。ＰＣＬを、Ｗｎｔ固定化の前に、ヘキサメチルジアミン（ＨＭＤＡ、hexamethyldiamine）、Ｏ２プラズマ又は空気で処理した。結果は、平均±標準偏差であり、任意単位で表されている。星印は、一方向ＡＮＯＶＡを用いて計算した、以下の統計学的有意性を示す：＊＊＊＊、ｐ＜０．００１；ｎｓ、有意性なし。図１３Ｄ：結合ＦＩＴＣ吸光度（図１３Ｂ）から同等な分解ＦＩＴＣ吸光度（図１３Ｃ）への外挿による、ＰＣＬ上のアミン部位の数の推定である。
【図14】図１４：宿主及びＷＩＯＴＭバンデージで処置した頭蓋冠骨欠損部位における結合／間質様組織の免疫組織化学である。図１４Ａ：新しい骨（ＮＢ）及び宿主骨（ＨＢ）のマイクロ－ＣＴ（μＣＴ）スキャン、並びにＳＴＲＯ１に対する抗体（図１４Ｂ）及びＣＤＨ１３に対する抗体（図１４Ｃ）での免疫組織化学染色である。拡大図は、宿主骨及び骨膜（１）、孔を開けた欠損縁部の付近に形成された新しい骨（２）、並びに欠損部の中心に形成された新しい骨（３）の範囲を示す。黒色の矢印は、孔を開けた欠損部のもともとの縁部を示す。Ｃは、結合／間質様組織であり、Ｐは、骨膜であり、Ｓは、縫合線である。核は、ヘマトキシリンで対比染色されている。
【図15-1】図１５：頭蓋冠骨の免疫組織化学である。図１５Ａ：ＷＩＯＴＭバンデージで処置した欠損部における新しい骨（ＮＢ）、及び同じ試料に由来する宿主骨（ＨＢ）のＯＣＮ、ＯＰＮ、及びＰＬＸＮＡ２の範囲の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色である。Ｃ：結合組織、Ｐ：骨膜。スケールバー、５０μｍ。図１５Ｂ：Ｗｎｔ３ａバンデージで処置した欠損部における新しい骨（ＮＢ）、及び同じ試料に由来する宿主骨（ＨＢ）の範囲のＯＣＮ、ＯＰＮ、及びＣＤＨ１３の免疫組織化学的染色、免疫組織化学的染色である。Ｃ：結合組織、Ｐ：骨膜。スケールバー、５０μｍ。
【図15-2】図１５Ｃ：ＯＣＮ、ＯＰＮ、ＰＬＸＮＡ２、ＳＴＲＯ１、及びＣＤＨ１３に対する抗体での矢状縫合線（Ｓ）の免疫組織化学的染色である。黒色の点線は、宿主縫合線の概要である。ＨＢ：宿主骨。スケールバー、５０μｍ。図１５Ｄ：ＩＨＣの陰性対照である。上の段：標準的なプロトコールに従って染色されているが、一次抗体なしの組織の領域である。下の段：図１５Ａ～１５Ｃ及び図１４Ｂ～１４Ｃにおいて使用した抗体の、以下のアイソタイプ対照である：マウスＩｇＧ１（ＯＰＮアイソタイプ）、ウサギＩｇＧ（ＣＤＨ１３、ＯＣＮ、ＰＬＸＮＡ２アイソタイプ）、及びマウスＩｇＭ（Ｓｔｒｏ１アイソタイプ）。Ｓ：縫合線、ＨＢ：宿主骨、ＮＢ：新しい骨、Ｃ：結合組織。スケールバー、５０μｍ。
【図16-1】図１６：免疫蛍光による定量方法の概要である。図１６Ａ：骨細胞の定量化のためのものである。（Ｉ）染色した宿主組織（すなわち、宿主骨）の範囲を選択し、目的のマーカーのもっとも高い強度の細胞シグナルを、判定する（II）。（III）この強度を使用して、試料組織（例えば、新しい骨）を閾値処理し、すべての残りのシグナルが、対照組織よりも高い強度のものとなるようにする（IV）。次いで、陽性細胞を、定量することができる。
【図16-2】図１６Ｂ：結合組織における細胞の定量化のためである（Ｉ）。（II）染色した宿主組織（すなわち、宿主骨膜）の範囲を選択し、目的のマーカーのもっとも高い細胞シグナルを、判定する。（III）この強度を使用して、試料組織（例えば、欠損部における結合組織）を閾値処理し、すべての残りのシグナルが、対照組織よりも高い強度のものとなるようにする（IV）。次いで、陽性細胞を、定量することができる。バンデージ処置下にある範囲の分析については、領域を以下のように判定する：Ｐ（近位側）：バンデージ表面から２０μｍ未満；Ｍ（中央部）：組織の残りの厚みの５０％；Ｄ（遠位側）：組織の残りの厚みのもう５０％。
【図16-3】図１６Ｃ：シグナルの有意な共局在がある、ＤＡＰＩ（黄色）、並びにヒトマーカーｍＣｈｅｒｒｙに対する抗体（赤色）及びｈＢＭＧ２に対する抗体（シアン）で染色した、７ｘＴＣＦ－ｅＧＦＰ／／ＳＶ４０－ｍＣｈｅｒｒｙ細胞を含有するＷＩＯＴＭバンデージで処置した組織及び宿主組織の代表的な免疫蛍光画像。白色の矢印は、ｍＣｈｅｒｒｙ＋／ｈＢＭＧ２＋細胞を示す。スケールバー、５０μｍ。
【図17-1】図１７：ＷＩＯＴＭバンデージ、Ｗｎｔ３ａバンデージ、及びｉＷｎｔ３ａバンデージ＋ｈＳＳＣで処置した頭蓋冠骨の臨界サイズの欠損部において形成された新しい骨の周囲の結合／間質様組織のインプラント８週間後のインビボでの特徴付けである。図１７Ａ：バンデージで処置した欠損部位（Ｎ≧４４個の細胞）及び宿主組織（Ｎ≧１２個の細胞）における総（ＤＡＰＩ）及びＣＤＨ１３陽性細胞の密度の定量化（図１６Ｂ）である。平均±標準偏差、すべてｎ≧３、３匹の動物から。全カラム間で対応のないｔ検定によって判定された、統計学的有意性：ｐ＞０．０５；ｎｓ、ｐ＞０．０５。
【図17-2】図１７Ｂ：７ｘＴＣＦ－ｅＧＦＰ／／ＳＶ４０－ｍＣｈｅｒｒｙレポーターを発現する細胞を有するＷＩＯＴＭバンデージの欠損部位及び宿主組織における総細胞に対するパーセンテージとしての欠損部位における細胞部分集団の定量化である。バンデージ表面から近位側（Ｐｒｏｘ、＜２０μｍ）、中央部（Ｍｉｄ）及び遠位側（Ｄｉｓｔ）（それぞれ、残りの組織の厚みの５０％）。平均±標準偏差、ｎ≧３、Ｎ≧３匹の動物から１６個の細胞、パーセンテージはグラフに示されている。図１７Ｄ：バンデージで処置した欠損部位における総（ＤＡＰＩ）及びＳｔｒｏｌ陽性細胞の密度の定量化である（Ｎ≧３６個の細胞）。平均±標準偏差、すべてｎ＝３匹の動物。全カラム間で対応のないｔ検定によって判定された、統計学的有意性：ｐ＞０．０５；ｎｓ、ｐ＞０．０５。
【発明を実施するための形態】
【0040】
骨再生を統制することにおけるＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の役割は、様々なモデルにおいて十分に文書化されている（Doro, D.H. et al (2017) Front Physiol. 8: 956、Zhao, H. et al (2015) Nat. Cell Biol. 17: 386-396; Maruyama, T. et al (2016) Nat. Commun. 7: 10526、Wilk, K. et al (2017) Stem Cell Reports 8: 933-946; Zhou, H. & Lee, J. (2011) Acta Biomater. 7: 2769-2781; Tan, S. H. et al (2014) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 111: E5262-71); Krause, U. et al (2010) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 107: 4147-4152; Baron, R. & Kneissel, M. (2013) Nat. Med. 19: 179-195; Li, S. et al (2015) PLoS ONE 10: e0138059; Minear, S. et al (2012) Sci. Transl. Med. 2: 29ra30）。Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の重要な負の調節因子としての機能を果たす、Ａｘｉｎ２発現における異常は、マウスモデルにおいて前駆細胞の増殖及び早期分化を加速させることが見出されている（Tan, S. H. et al (2014)、上記; Li, S. et al (2015) PLoS ONE 10: e0138059）。マウスモデルにおける系統追跡により、さらに、傷害時のＷｎｔ誘導型骨形成再生が説明され、ここでは、縫合線間葉に存在するＷｎｔ応答性幹細胞集団が、増大及び分化を作動させることにおける鍵となるＳＳＣであることが見出された（Zhao, H. et al (2015)、上記; Maruyama, T. et al (2016)、上記）。
【0041】
骨再生を促進することにおけるＷｎｔタンパク質の治療的有効性を調べるための薬理学的研究が、開発されている。リポソーム小胞によって送達されるＷｎｔ３ａは、骨格前駆細胞の増殖を刺激することが特定され、したがって、骨成長の鍵である骨芽細胞分化を加速させた（Minear, S. et al (2010) Sci. Transl. Med. 2(29): 29ra30）。しかしながら、このタンパク質に基づくアプローチは、骨成長を促進／増強させるであろうＷｎｔ応答性細胞への到達を、傷害部位におけるリポソームの非標的化拡散に依存する。したがって、有望な骨成長が特定されたとはいえ、再生率は、間隙充填ツールとしての機能を果たす従来的な骨伝導性インプラントよりも低かった。他の小分子アプローチは、グリコーゲン－シンセターゼ－キナーゼ－３β（ＧＳＫ３β）を阻害することによって骨形成に有利になるようにＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路を調節することを目的としており、ペルオキシソーム増殖因子－活性化受容体－γ（ＰＰＡＲγ、peroxisome proliferator-activated receptor-γ）が、骨誘導療法において有効であることが見出されている（Krause, U. et al (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107: 4147-4152; Zeitouni, S. et al (2012) Sci. Transl. Med. 4(132): 132ra55）。有望な候補ではあるが、小分子は、非特異的であることが多く、他のシグナル伝達経路を活性化／阻害する可能性がある（Lowndes, M. et al (2017)、上記）。さらに、ＧＳＫ３βは、Ｗｎｔリガンドの制御下ではない多数の細胞プロセス及びシグナル伝達経路に関与している（Beurel, E. et al (2015) Pharmacol. Ther. 148: 114-131）。
【0042】
可溶性薬物送達を使用した薬理学的アプローチが有意な治療効果を示しているが、これはまた、生物安全性の問題も呈する。可溶性薬物送達アプローチは、所望される作用を達成するために、傷害を受けた部位への複数回の注射を必要とし得、これは、感染の危険性を増加させるであろう。これらの薬剤の特異性及び局在化作用の欠如は、付帯的損傷、例えば、望ましくない細胞集団の応答の活性化／抑制をトリガーする可能性がある。結果として、標的組織のアーキテクチャ及び機能、並びに／又は拡散により薬物を受容し得る隣接する組織は、負の影響を受ける可能性がある。例えば、Ｗｎｔシグナル伝達の過剰活性化は、骨体積の増加、異常な骨密度、及び骨の病理学的肥厚をもたらし得る（Morvan, F. et al (2006) J. Bone Miner. Res. 21: 934-945; Little, R. D. et al (2002) Am. J. Hum. Genet. 70: 11-19. Boyden, L. M. et al (2002) N. Engl. J. Med. 346: 1513-1521; Babij, P. et al (2003) Miner. Res. 18: 960-974）。
【0043】
腫瘍原性もまた、がんを罹患しやすい患者における懸念である。多くのがんにおいて、腫瘍原性細胞は、シグナル伝達カスケードを活性化するＷｎｔ／β－カテニン経路の下流エフェクターにおける変異を有する（Zhan, T. et al (2017) Oncogene 36: 1461-1473）。拡散によってこれらの細胞に到達し得、さらにＷｎｔ／β－カテニン経路を活性化し得る薬剤の投与は、本質的に、腫瘍原性における高い危険性として分類される。したがって、制御され、標的欠損部位に局在化されるＷｎｔ／β－カテニン経路の活性化を引き起こすことができる治療剤の標的化送達が、副作用を制限し、治癒を促進するためには必須である。本発明の生物学的組織再生パッチ及びバンデージは、この基準を満たす。
【0044】
パッチ／バンデージは、Ｗｎｔタンパク質、Ｗｎｔシグナル伝達経路のアゴニスト、又はＲ－スポンジンタンパク質を、スキャフォールドに固定することによって、その治療作用を送達する。Ｒ－スポンジン（Ｒｓｐｏ、R-spondin）タンパク質は、Ｗｎｔタンパク質と相乗的に作用してシグナル伝達レベルを増強させるが、Ｗｎｔタンパク質自体が不在の場合にはシグナル伝達経路を活性化しない。特に、Ｒｓｐｏタンパク質は、受容体のリサイクルを阻害することによって、受容体の利用可能性を増加させると考えられている。本発明の操作設計は、自発的なタンパク質の漏出の可能性、及びそれに続く他のシグナル伝達経路又は望ましくない細胞集団の活性化の副作用、並びに発癌性の危険性を軽減し、それによって、トランスレーショナルな適用の可能性を増加させる。
【0045】
Ｗｎｔシグナル伝達経路は、Ｗｎｔタンパク質リガンドがＦｒｉｚｚｌｅｄファミリー受容体に結合することによって活性化され、これにより、生物学的シグナルが、細胞内のＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質に伝えられる。カノニカルＷｎｔ経路は、遺伝子転写の調節をもたらし、ＳＰＡＴＳ１遺伝子によって部分的に負に調節されると考えられている（Janda, C.Y. et al (2012). Science 337(6090): 59-64）。非カノニカル平面内細胞極性経路は、細胞の形状を担う細胞骨格を調節し、非カノニカルＷｎｔ／カルシウム経路は、細胞内のカルシウムを調節する。
【0046】
Ｗｎｔタンパク質（又はアゴニスト若しくはＲｓｐｏタンパク質）の固定は、理想的には、生体適合性ポリマーの表面上の一級アミン官能基に共有結合で結合するＷｎｔ（又はそのアゴニスト若しくはＲｓｐｏタンパク質）との共有結合によるものである。別様に表すと、生体適合性ポリマーの表面は、一級アミン基を呈するように官能基化されており、この一級アミン基を使用して、共有結合によってＷｎｔ（又はそのアゴニスト若しくはＲｓｐｏタンパク質）に結合する。
【0047】
いくつかの状況において、特に、結合組織において、Ｗｎｔシグナル伝達経路のアンタゴニスト、例えば、ＤＫＫ１の使用が、特定の細胞、例えば、線維芽細胞における経路の活性化を阻害するために、望ましい場合がある。
【0048】
「ポリマー」という用語は、分子が複数の（２つ又は３つ以上の）モノマーの集合から形成された場合を指す。ポリマーは、好ましくは、両親媒性であり得、有機であっても、半合成であっても、合成であってもよい。本発明に関連するポリマーの例としては、機関、例えば、ＵＳ Ｆｅｄｅｒａｌ Ｄｒｕｇ Ａｇｅｎｃｙによって承認されている生物学的に耐容性があり薬学的に許容されるポリマーが挙げられるがこれらに限定されず、これには、ポリカプロラクトン（「ＰＣＬ」）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（「ＰＬＧＡ」）、ポリ（ｌ－乳酸）（「ＰＬＡ」）、ポリ（グリコール酸）（「ＰＧＡ」）、ポロキサマー、ポビドン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリジオキサノン（ＰＤＳ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（エーテルウレタン）、ダクロン、ポリテトラフルオロウレタン（polytetrafluorurethane）、ポリウレタン（「ＰＵ」）、ポリ（グリコリド－コ－カプロラクトン）（ＰＧＣＬ）、ポリ（ｌ－ラクチド－コ－ε－カプロラクトン）ＰＬＣＬ、ポリ－Ｌ／Ｄ－乳酸（ＰＬＤＬＡ）、アルギネート、及び／又はシリコンが挙げられる。
【0049】
また、ポリマーには、天然に存在する材料、例えば、Ｉ型コラーゲン、III型コラーゲン、フィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、セルロースエステル、又はエラスチンも含まれ得る。
【0050】
理想的には、ポリマーは、生分解性であり、これにより、パッチを除去するための追加の外科手術を必要とすることなくパッチをインプラントすることが可能となる。パッチは、単純に内在性修復を促進するのに十分な期間にわたって生分解性であり得るか、又はパッチは、新しく形成された組織に機械的支持を提供するためにより長い期間にわたって生体分解されてもよい。例えば、ＰＣＬのインビボでの分解速度は、緩徐であり、数年間を要する場合があるが（Sun, H. et al (2006) Biomaterials 27: 1735-1740）、一方で、ポリ乳酸－コ－グリコール酸（ＰＬＧＡ）のインビボ分解速度は、１ヶ月程度と短い場合がある（Makadia, H. K. & Siegel, S. J. (2011) Polymers (Basel) 3: 1377-1397）。パッチは、欠損部位上に重ねられているため、修復が完了した後に、ポリマーの副作用の可能性を回避するために容易に除去することができる。
【0051】
ポリマーフィルムは、適切な方法によって形成され得ることが、理解されるであろう。ポリマーがＰＣＬである場合、例えば、フィルムを作製する方法は、周知である。例えば、フィルムは、鋳型成形、３Ｄ印刷、又はエレクトロスピニングによって形成され得る。
【0052】
一実施形態において、ポリマーフィルムは、別のフィルム、例えば、ヒドロゲルフィルムに埋め込まれていてもよく、そうすることで、より大きな（ヒドロゲル）フィルムに、異なるリガンド、例えば、Ｗｎｔ３ａナノ粒子を片側に、及びＤＫＫ１ナノ粒子を反対側にパターン形成して、分化を増加させることが可能となる。
【0053】
Ｗｎｔ（又はそのアゴニスト）をポリマー表面に固定化することを可能にするために、ポリマー表面は、好適な結合基を付加するように官能基化されていてもよい。具体的には、表面は、Ｗｎｔとの共有結合による連結を提供するために、一級アミンで官能基化されていてもよい。代替的な連結としては、スクシンイミドエステルに変換され得るカルボン酸、及びグルタルアルデヒドが挙げられるが、これらに限定されない。Ｗｎｔを特定の位置に維持するため、共有結合による連結が好ましく、これは、Ｗｎｔの再生作用を増強させることが示されている。
【0054】
上記は、無細胞パッチ又はバンデージである。特定の実施形態において、パッチ又はバンデージは、生体適合性ポリマー上で培養された幹細胞をさらに含んでもよく、それによって、３次元（３Ｄ）細胞バンデージ又はパッチが提供される。理想的には、細胞は、官能基化されたポリマー上で単層として培養される。
【0055】
本発明者らは、幹細胞を細胞外タンパク質、例えば、コラーゲンの層で覆うことにより、修復のためにＷｎｔ源から傷害の部位への幹細胞が遊走するのが促進されることを見出している。パッチを、例えば、骨の再生に使用しようとする場合、Ｉ型コラーゲンが、特に適切であるが、これは、このバリアントが骨においてもっとも豊富であるためである。骨形成培地において１週間の後に、Ｗｎｔ誘導型骨形成組織が形成され、ｈＳＳＣがＷｎｔ源の近傍に維持され、分化が進む骨形成細胞のカスケードが、Ｗｎｔ源から３Ｄヒドロゲルへと遊走される。
【0056】
１つの例において、幹細胞は、ヒト骨格系幹細胞（ｈＳＳＣ）であり、バンデージは、骨形成パッチである。初代ヒト骨格系幹細胞（ｈＳＳＣ）は、骨髄、脂肪組織を含む任意の好適な供給源から単離されてもよく、又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ、induced pluripotent stem cell）から作製されてもよいことが、理解されるであろう。
【0057】
細胞バンデージ又はパッチは、生物学的軟部組織、結合組織、又は骨の内在性再生の促進、例えば、生物学的軟部組織、結合組織、又は骨における間隙、断裂、又は破砕の再生及び／又は修復に使用され得ることが理解されるであろう。本発明は、任意の好適な供給源から得られた間葉及び上皮幹細胞を含む、任意のＷｎｔ応答性幹細胞に適用可能であることが理解されるであろう。
【0058】
パッチは、自家若しくは同種幹細胞、又はすべての患者に好適であり得る操作された幹細胞系を使用することによって、それぞれの患者に適合され得る。パッチはまた、可能性として、幹細胞の機能が低下した患者、例えば、老体の患者又は疾患、例えば、骨粗鬆症を罹患している患者などに使用され得る。
【0059】
本明細書に記載されるパッチのいずれも、生物学的軟部組織、結合組織、又は骨の内在性再生及び／又は修復を促進及び／又は調節する治療的に有効な薬剤を特定するためのスクリーニング及び／又は毒性研究のために使用され得る。
【0060】
本発明はまた、本明細書において上述の生物学的組織再生パッチを製造する方法も包含する。本方法は、ｉ）生体適合性ポリマーから、フィルムを調製するステップと、ii）ポリマーの表面を官能基化するステップと、iii）Ｗｎｔファミリー由来の１つ若しくは２つ以上のタンパク質又はＷｎｔシグナル伝達経路のアゴニストを、ポリマー表面にコンジュゲートするステップとを含む。
【0061】
上述のように、ポリマーの表面は、一級アミン官能基を提供するように官能基化されていてもよい。そのような官能基化の１つの例は、酸素プラズマ及びアミノプロピル－トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）での表面の処理によるが、他の好適な処理が、当業者には周知であり、本開示の範囲内に包含される。
【0062】
本方法は、Ｗｎｔ、そのアゴニスト、又はＲｓｐｏタンパク質を官能基化されたポリマー表面にコンジュゲートした後に、幹細胞を培養するステップをさらに含み得る。理想的には、幹細胞は、単層として培養される。５～１０日間、好ましくは、７～８日間の培養時間が、理想的であることが見出されている。この時間の後に、３Ｄ構造体が形成される。
【0063】
本発明はまた、生物学的組織再生方法であって、本明細書において上述のパッチを、欠損、孔、間隙、断裂、又は破砕全体にわたって又はその上にインプラントするステップを含む、方法も包含する。
【0064】
したがって、本発明のＷｎｔバンデージは、患者の骨、器官、又は組織に対して作用する。破砕又は組織が治癒すると、バンデージは除去されてもよく、又は除去を回避するために、生分解性バンデージが使用されてもよい。
【0065】
本発明のＷｎｔバンデージは、内在性治癒を促進するために使用され得ることが、理解されるであろう。本発明は、骨修復及び骨形成に関連して例証されているが、ほぼすべての幹細胞は、Ｗｎｔ応答性であり、自己再生をＷｎｔに依存しているため、Ｗｎｔバンデージは、他の器官のニッチを操作するために使用されてもよい。これらの組織モデル－バンデージは、損傷した器官の組織を修復する、又は／及び損傷した器官の機能を遂行するために、使用され得る。さらに、組織モデルは、薬物スクリーニング及び毒性研究に使用されてもよい。
【0066】
本明細書で使用される場合、単数形の「１つの（a）」、「１つの（an）」、及び「その（the）」は、文脈により別途明確に示されない限り、単数形及び複数形の両方の参照物を含む。
【0067】
「含む（comprising）」、「含む（comprises）」、及び「から構成される（comprised of）」という用語は、本明細書で使用される場合、「含む（including）」、「含む（includes）」、又は「含む（containing）」、「含む（contains）」、と同義であり、包括的又はオープンエンドであり、追加の言及されていないメンバー、要素、又は方法ステップを除外するものではない。この用語はまた、「からなる（consisting of）」及び「から本質的になる（consisting essentially of）」を包含する。
【0068】
端点による数値範囲の記述は、それぞれの範囲内に含まれるすべての数字及び分数、並びに記載された端点を含む。
【0069】
「約（about）」という用語は、測定可能な値、例えば、パラメーター、量、時間範囲、及びその他に言及して本明細書で使用される場合、指定される値の変動、特に、指定される値の±１０％以下、好ましくは、±５％以下、より好ましくは、±１％以下、なおもさらに好ましくは、±０．１％以下の変動を包含することを、そのような変動が本開示の発明を実行するのに適している範囲で意味する。修飾語「約」が指す値は、それ自体も、具体的かつ好ましく開示されることを理解されたい。
【0070】
「１つ又は２つ以上の」という用語、例えば、メンバーの群のうちの１つ又は２つ以上のメンバーは、さらなる例示によって、本質的に明確であり、この用語は、とりわけ、前記メンバーのうちのいずれか１つ、又は前記メンバーのうちのいずれか２つ若しくは３つ以上、例えば、前記メンバーのうちのいずれか３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、又は７つ以上など、及び最大で前記メンバーすべてへの言及を包含する。
【0071】
Ｗｎｔ３ａ
本明細書における例は、Willert et al 2003の方法によるマウスＷｎｔ３ａの産生、及びそれを含むパッチ（バンデージ）の産生について記載していることが理解されるであろう。
本明細書における例は、Willert et al 2003の方法によるマウスＷｎｔ３ａの産生、及びそれを含むパッチ（バンデージ）の産生について記載していることが理解されるであろう。
【0072】
いくつかの実施形態において、ヒトＷｎｔ３ａを使用すること、及び好適には同じヒトＷｎｔ３ａを含む本明細書に記載されるパッチ（バンデージ）の産生が望ましい場合がある。したがって、好適には、この実施形態において、Ｗｎｔ３ａは、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ５６７０４（配列番号１）などのヒトＷｎｔ３ａアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。
10 20 30 40 50
MAPLGYFLLL CSLKQALGSY PIWWSLAVGP QYSSLGSQPI LCASIPGLVP
60 70 80 90 100
KQLRFCRNYV EIMPSVAEGI KIGIQECQHQ FRGRRWNCTT VHDSLAIFGP
110 120 130 140 150
VLDKATRESA FVHAIASAGV AFAVTRSCAE GTAAICGCSS RHQGSPGKGW
160 170 180 190 200
KWGGCSEDIE FGGMVSREFA DARENRPDAR SAMNRHNNEA GRQAIASHMH
210 220 230 240 250
LKCKCHGLSG SCEVKTCWWS QPDFRAIGDF LKDKYDSASE MVVEKHRESR
260 270 280 290 300
GWVETLRPRY TYFKVPTERD LVYYEASPNF CEPNPETGSF GTRDRTCNVS
310 320 330 340 350
SHGIDGCDLL CCGRGHNARA ERRREKCRCV FHWCCYVSCQ ECTRVYDVHT
10 20 30 40 50
MAPLGYFLLL CSLKQALGSY PIWWSLAVGP QYSSLGSQPI LCASIPGLVP
60 70 80 90 100
KQLRFCRNYV EIMPSVAEGI KIGIQECQHQ FRGRRWNCTT VHDSLAIFGP
110 120 130 140 150
VLDKATRESA FVHAIASAGV AFAVTRSCAE GTAAICGCSS RHQGSPGKGW
160 170 180 190 200
KWGGCSEDIE FGGMVSREFA DARENRPDAR SAMNRHNNEA GRQAIASHMH
210 220 230 240 250
LKCKCHGLSG SCEVKTCWWS QPDFRAIGDF LKDKYDSASE MVVEKHRESR
260 270 280 290 300
GWVETLRPRY TYFKVPTERD LVYYEASPNF CEPNPETGSF GTRDRTCNVS
310 320 330 340 350
SHGIDGCDLL CCGRGHNARA ERRREKCRCV FHWCCYVSCQ ECTRVYDVHT
【0073】
ＣＫ
好適には、ヒトＷｎｔ３ａは、厳密には、マウスＷｎｔ３ａについて記載されるように、当該技術分野において周知のように、Willert et al (Willert et al (2003) Nature 22;423(6938): 448-52)の方法を使用して調製されるが、Ｗｉｌｌｅｒｔらによって使用されるマウス配列の代わりに、ヒトＷｎｔ３ａアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を使用することが、唯一の相違点である。
好適には、ヒトＷｎｔ３ａは、厳密には、マウスＷｎｔ３ａについて記載されるように、当該技術分野において周知のように、Willert et al (Willert et al (2003) Nature 22;423(6938): 448-52)の方法を使用して調製されるが、Ｗｉｌｌｅｒｔらによって使用されるマウス配列の代わりに、ヒトＷｎｔ３ａアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を使用することが、唯一の相違点である。
【0074】
好適な核酸コーディング配列は、ユニバーサル遺伝子コードを使用して、上述のアミノ酸配列から導出することができる。
【0075】
任意のさらなる案内が必要な場合には、例示的なヒトコーディング配列は、以下に提供されている－ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０６０２８４（配列番号２）。
＞ＥＮＡ｜ＡＢ０６０２８４｜ＡＢ０６０２８４．１、ホモ・サピエンス、ＷＮＴ３ＡのｍＲＮＡ、完全なコーディング配列。
CGGCGATGGCCCCACTCGGATACTTCTTACTCCTCTGCAGCCTGAAGCAGGCTCTGGGCA
GCTACCCGATCTGGTGGTCGCTGGCTGTTGGGCCACAGTATTCCTCCCTGGGCTCGCAGC
CCATCCTGTGTGCCAGCATCCCGGGCCTGGTCCCCAAGCAGCTCCGCTTCTGCAGGAACT
ACGTGGAGATCATGCCCAGCGTGGCCGAGGGCATCAAGATTGGCATCCAGGAGTGCCAGC
ACCAGTTCCGCGGCCGCCGGTGGAACTGCACCACCGTCCACGACAGCCTGGCCATCTTCG
GGCCCGTGCTGGACAAAGCTACCAGGGAGTCGGCCTTTGTCCACGCCATTGCCTCAGCCG
GTGTGGCCTTTGCAGTGACACGCTCATGTGCAGAAGGCACGGCCGCCATCTGTGGCTGCA
GCAGCCGCCACCAGGGCTCACCAGGCAAGGGCTGGAAGTGGGGTGGCTGTAGCGAGGACA
TCGAGTTTGGTGGGATGGTGTCTCGGGAGTTCGCCGACGCCCGGGAGAACCGGCCAGATG
CCCGCTCAGCCATGAACCGCCACAACAACGAGGCTGGGCGCCAGGCCATCGCCAGCCACA
TGCACCTCAAGTGCAAGTGCCACGGGCTGTCGGGCAGCTGCGAGGTGAAGACATGCTGGT
GGTCGCAACCCGACTTCCGCGCCATCGGTGACTTCCTCAAGGACAAGTACGACAGCGCCT
CGGAGATGGTGGTGGAGAAGCACCGGGAGTCCCGCGGCTGGGTGGAGACCCTGCGGCCGC
GCTACACCTACTTCAAGGTGCCCACGGAGCGCGACCTGGTCTACTACGAGGCCTCGCCCA
ACTTCTGCGAGCCCAACCCTGAGACGGGCTCCTTCGGCACGCGCGACCGCACCTGCAACG
TCAGCTCGCACGGCATCGACGGCTGCGACCTGCTGTGCTGCGGCCGCGGCCACAACGCGC
GAGCGGAGCGGCGCCGGGAGAAGTGCCGCTGCGTGTTCCACTGGTGCTGCTACGTCAGCT
GCCAGGAGTGCACGCGCGTCTACGACGTGCACACCTGCAAGTAGGCACCGGCCGCGGCTC
CCCCTGGACGGGGCGGGCCCTGCCTGAGGGTGGGCTTTTCCCTGGGTGGAGCAGGACTCC
CACCTAAACGGGGCAGTACTCCTCCCTGGGGGCGGGACTCCTCCCTGGGGGTGGGGCTCC
TACCTGGGGGCAGAACTCCTACCTGAAGGCAGGGCTCCTCCCTGGAGCTAGTGTCTCCTC
TCTGGTGGCTGGGCTGCTCCTGAATGAGGCGGAGCTCCAGGATGGGGAGGGGCTCTGCGT
TGGCTTCTCCCTGGGGACGGGGCTCCCCTGGACAGAGGCGGGGCTACAGATTGGGCGGGG
CTTCTCTTGGGTGGGACAGGGCTTCTCCTGCGGGGGCGAGGCCCCTCCCAGTAAGGGCGT
GGCTCTGGGTGGGCGGGGCACTAGGTAGGCTTCTACCTGCAGGCGGGGCTCCTCCTGAAG
GAGGCGGGGCTCTAGGATGGGGCACGGCTCTGGGGTAGGCTGCTCCCTGAGGGCG
＞ＥＮＡ｜ＡＢ０６０２８４｜ＡＢ０６０２８４．１、ホモ・サピエンス、ＷＮＴ３ＡのｍＲＮＡ、完全なコーディング配列。
CGGCGATGGCCCCACTCGGATACTTCTTACTCCTCTGCAGCCTGAAGCAGGCTCTGGGCA
GCTACCCGATCTGGTGGTCGCTGGCTGTTGGGCCACAGTATTCCTCCCTGGGCTCGCAGC
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GGCCCGTGCTGGACAAAGCTACCAGGGAGTCGGCCTTTGTCCACGCCATTGCCTCAGCCG
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GCAGCCGCCACCAGGGCTCACCAGGCAAGGGCTGGAAGTGGGGTGGCTGTAGCGAGGACA
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CGGAGATGGTGGTGGAGAAGCACCGGGAGTCCCGCGGCTGGGTGGAGACCCTGCGGCCGC
GCTACACCTACTTCAAGGTGCCCACGGAGCGCGACCTGGTCTACTACGAGGCCTCGCCCA
ACTTCTGCGAGCCCAACCCTGAGACGGGCTCCTTCGGCACGCGCGACCGCACCTGCAACG
TCAGCTCGCACGGCATCGACGGCTGCGACCTGCTGTGCTGCGGCCGCGGCCACAACGCGC
GAGCGGAGCGGCGCCGGGAGAAGTGCCGCTGCGTGTTCCACTGGTGCTGCTACGTCAGCT
GCCAGGAGTGCACGCGCGTCTACGACGTGCACACCTGCAAGTAGGCACCGGCCGCGGCTC
CCCCTGGACGGGGCGGGCCCTGCCTGAGGGTGGGCTTTTCCCTGGGTGGAGCAGGACTCC
CACCTAAACGGGGCAGTACTCCTCCCTGGGGGCGGGACTCCTCCCTGGGGGTGGGGCTCC
TACCTGGGGGCAGAACTCCTACCTGAAGGCAGGGCTCCTCCCTGGAGCTAGTGTCTCCTC
TCTGGTGGCTGGGCTGCTCCTGAATGAGGCGGAGCTCCAGGATGGGGAGGGGCTCTGCGT
TGGCTTCTCCCTGGGGACGGGGCTCCCCTGGACAGAGGCGGGGCTACAGATTGGGCGGGG
CTTCTCTTGGGTGGGACAGGGCTTCTCCTGCGGGGGCGAGGCCCCTCCCAGTAAGGGCGT
GGCTCTGGGTGGGCGGGGCACTAGGTAGGCTTCTACCTGCAGGCGGGGCTCCTCCTGAAG
GAGGCGGGGCTCTAGGATGGGGCACGGCTCTGGGGTAGGCTGCTCCCTGAGGGCG
【0076】
本明細書において数値アドレスを使用して特定のアミノ酸残基に言及する場合、番号付けは、野生型Ｗｎｔ３ａアミノ酸配列（又は核酸に言及する場合にはそれをコードするポリヌクレオチド配列）を参照して付与される。例示的な配列は、上記に提供されている。
【0077】
好適には、配列データベースの現在のバージョンに依拠する。代替としては、出願日の時点で有効なリリースに依拠する。疑いを回避するために、ＵｎｉＰｒｏｔリリース２０１９＿１１に依拠する。より詳細には、ＵｎｉＰｒｏｔ ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ （ＥＢＩ）， ＳＩＢ Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ （ＰＩＲ）’ｓ ＵｎｉＰｒｏｔ Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ （ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ）リリース２０１９＿１１に依拠する。ＵｎｉＰｒｏｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）は、タンパク質に関する情報の包括的なカタログである（"UniProt: the universal protein knowledgebase" Nucleic Acids Res. 45: D158-D169 (2017)）。
【0078】
ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）は、ＮＩＨ遺伝子配列データベースであり、すべての公的に入手可能なＤＮＡ配列の注釈付きの集合体である（Nucleic Acids Research, 2013 Jan;41(D1):D36-42）。ＧｅｎＢａｎｋは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎの一部であり、これは、ＤＮＡ ＤａｔａＢａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｒｃｈｉｖｅ（ＥＮＡ）、及びＧｅｎＢａｎｋ ａｔ ＮＣＢＩを含む。疑いを回避するために、２０１９年１０月１５日のＧｅｎＢａｎｋリリース２３４に依拠する。
【0079】
これは、当該技術分野において周知のように、目的の残基の位置を特定するために使用される。これは、必ずしも厳密なカウント方法ではなく、内容に注意を払う必要がある。例えば、目的のタンパク質が、わずかに異なる長さのものである場合、その配列内の正しい残基の位置は、配列をアライメントし、同等又は対応する残基を選択することを必要とし得る。これは、十分に当業者の技能の範囲内である。
【0080】
変異は、当該技術分野における通常の意味を有し、１つ又は２つ以上の残基、モチーフ、又はドメインの置換又は短縮又は欠失を指し得る。変異は、例えば、変異した配列を有するポリペプチドの合成によって、ポリペプチドレベルで実行されてもよく、又は例えば、変異した配列をコードするポリヌクレオチドを作製し、このポリヌクレオチドが、続いて、翻訳されて、変異したポリペプチドを産生することによって、ヌクレオチドレベルで実行されてもよい。
【0081】
以下の実験において、本発明者らは、まず、最近特定された幹細胞マーカーであるカドヘリン１３（ＣＤＨ１３）（Holley, R. J. et al (2015) Stem Cell Reports 4: 473-488）、及び分化マーカーオステオポンチン（ＯＰＮ、Osteopontin）を使用することによって、ＷＩＯＴＭの細胞同一性をさらに検証する。ＷＩＯＴＭにおけるＣＤＨ１３及びＯＰＮの発現パターンは、それぞれ、Ｓｔｒｏ１及びＯＣＮと類似であることが見出された。次に、ＷＩＯＴＭの形成の根底にある分子機序を、分析した。本発明者らはまた、頭蓋冠骨の臨界サイズの骨損傷のインビボマウスモデルにおいて、局在化されたＷｎｔ３ａ及びＷＩＯＴＭの再生能力を評価した。
【0082】
Ｗｎｔを、材料に共有結合で固定化し、ヒト骨格系幹細胞（ｈＳＳＣ）集団及び分化骨形成細胞のカスケードを維持するヒトＷｎｔ誘導型骨形成組織モデル（ＷＩＯＴＭ）を、１週間以内３Ｄで操作した。結果は、Ｗｎｔに媒介される非対称幹細胞分裂により、このプロセスが作動されることを示す。分裂ｈＳＳＣにおいて、局在化されたＷｎｔタンパク質（Ｗｎｔ）は、Ｗｎｔ／β－カテニン経路の構成要素、極性タンパク質、及び幹細胞マーカーカドヘリン－１３を、Ｗｎｔ源の近傍に分極させる。紡錘体は、局在化されたＷｎｔに対して垂直方向に配向され、これもまた、分化マーカーをＷｎｔから離れて分極させ、配向された非対称細胞分裂をもたらす。
【0083】
局在化されたＷｎｔ及びＷＩＯＴＭのインビボでの再生能力を証明するために、Ｗｎｔを、生物学的フィルム（Ｗｎｔバンデージ）に共有結合でつなげて、ＷＩＯＴＭを、バンデージ上で生成させた。それぞれのバンデージを、免疫不全マウスにおいて、臨界サイズの頭蓋冠骨欠損に重ねた。８週間後に、Ｗｎｔバンデージは、対照と比較して有意な内在性修復を有した。ＷＩＯＴＭバンデージは、さらに、新しい骨組織を生成することによって、修復をさらに改善させた。重要なことに、Ｗｎｔ応答性ｈＳＳＣは、Ｗｎｔバンデージの近傍に見出され、ｈＳＳＣの子孫である成熟した新しい骨細胞が形成された。
【0084】
したがって、これらの結果は、ヒト骨形成の分子的理解、及び骨欠損を修復する新しいアプローチを提供する。
【0085】
本発明は、これより、例示のみの目的で以下の非限定的な実施形態を参照して説明される。
［実施例］
材料及び方法
ヒト骨格系幹細胞の培養
［実施例］
材料及び方法
ヒト骨格系幹細胞の培養
【0086】
ヒト間葉幹細胞（ｈＳＳＣ）を、市販入手可能な骨髄吸引液（AllCells LLC社）から単離した。骨髄吸引液を、１０ｎｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Sigma-Aldrich社、ＵＫ）を事前にコーティングした培養フラスコに播種し、細胞を結合させた。表面マーカー発現（ＣＤ７３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、及びＣＤ４５－、ＣＤ３４－、ＣＤ１４－、ＣＤ１９－、及びＨＬＡ－ＤＲ－）の特徴付けを、次いで、前述のように実行した（Lowndes et al (2016)、上記; Marshak et al (1999)）。ｈＳＳＣを、基本培地：１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ Ｌ－グルタミン（Lonza社）、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Lonza社）を補充した高グルコース（４．５ｇ／Ｌ）ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）において、５％ ＣＯ２の加湿空気下で３７℃において、最大で５継代（Ｐ５）増大した。複能性を、免疫蛍光（R&D Systems社、ＳＣ００６、図９Ｄ）によって判定される脂肪生成、軟骨形成、及び骨形成系統への分化によって、Ｐ５で確認した。７ＴＣＦ－ｅＧＦＰ／ＳＶ４０－ｍＣｈｅｒｒｙ（Fuerer, C. & Nusse, R. (2010) PLoS ONE 5: e9370.）を安定に感染させたｈＳＳＣもまた、いくつかの実験に使用した。これらの細胞系は、標準的な条件下において培養及び継代させた。
【0087】
ＷＮＴ３Ａ精製
組換えマウスＷｎｔ３Ａを、懸濁培養で成長させたショウジョウバエ（Drosophila）Ｓ２細胞において産生させ、記載されるようにブルーセファロース親和性及びゲル濾過クロマトグラフィーによって精製した（Willert et al (2003) Nature 22;423(6938): 448-52）。Ｗｎｔ３Ａ活性を、記載されるようにＳｕｐｅｒＴＯＰＦｌａｓｈレポーターを安定にトランスフェクトしたＬ細胞を使用して、ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて判定した（Mikels A. J. & Nusse R. (2006) PLoS Biol. 4(4):e115）。
組換えマウスＷｎｔ３Ａを、懸濁培養で成長させたショウジョウバエ（Drosophila）Ｓ２細胞において産生させ、記載されるようにブルーセファロース親和性及びゲル濾過クロマトグラフィーによって精製した（Willert et al (2003) Nature 22;423(6938): 448-52）。Ｗｎｔ３Ａ活性を、記載されるようにＳｕｐｅｒＴＯＰＦｌａｓｈレポーターを安定にトランスフェクトしたＬ細胞を使用して、ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて判定した（Mikels A. J. & Nusse R. (2006) PLoS Biol. 4(4):e115）。
【0088】
Ｗｎｔプラットフォームの官能基化
Ｗｎｔプラットフォーム（Corning社ＰｕｒｅＣｏａｔ Ａｍｉｎｅ ９６ウェル平底マルチウェルプレート、ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カタログ番号７３４－１４７５）を官能基化するために、プレートのアミン処理ウェルを、１００μｌのダルベッコリン酸緩衝食塩水（ｄＰＢＳ、Dulbecco’s phosphate buffer saline）で１回洗浄し、次いで、５０μｌの５％（体積／体積）グルタルアルデヒド（Sigma-Aldrich社）とともに、暗所において室温で３０分間インキュベートした。ウェルを、１００μｌのｄＰＢＳで３回洗浄し、最後の洗浄液を残したまま、１０分間インキュベートした。ＰＢＳ中６０ｎｇのＷｎｔ３Ａを、ウェルにおいて室温で１時間インキュベートした。また、ウェルを、１００μｌのｄＰＢＳで３回洗浄し、最後の洗浄液を残したまま、１０分間インキュベートした。不活性Ｗｎｔプラットフォームについては、１００μｌの２０ｍＭ ＤＴＴを、ウェルにおいて、３７℃で３０分間インキュベートした。ウェルを、１００μｌのｄＰＢＳで３回洗浄した。最後の洗浄液を除去した後、ウェルを、ｈＳＳＣ基本培地とともに少なくとも１時間インキュベートした。
Ｗｎｔプラットフォーム（Corning社ＰｕｒｅＣｏａｔ Ａｍｉｎｅ ９６ウェル平底マルチウェルプレート、ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カタログ番号７３４－１４７５）を官能基化するために、プレートのアミン処理ウェルを、１００μｌのダルベッコリン酸緩衝食塩水（ｄＰＢＳ、Dulbecco’s phosphate buffer saline）で１回洗浄し、次いで、５０μｌの５％（体積／体積）グルタルアルデヒド（Sigma-Aldrich社）とともに、暗所において室温で３０分間インキュベートした。ウェルを、１００μｌのｄＰＢＳで３回洗浄し、最後の洗浄液を残したまま、１０分間インキュベートした。ＰＢＳ中６０ｎｇのＷｎｔ３Ａを、ウェルにおいて室温で１時間インキュベートした。また、ウェルを、１００μｌのｄＰＢＳで３回洗浄し、最後の洗浄液を残したまま、１０分間インキュベートした。不活性Ｗｎｔプラットフォームについては、１００μｌの２０ｍＭ ＤＴＴを、ウェルにおいて、３７℃で３０分間インキュベートした。ウェルを、１００μｌのｄＰＢＳで３回洗浄した。最後の洗浄液を除去した後、ウェルを、ｈＳＳＣ基本培地とともに少なくとも１時間インキュベートした。
【0089】
Ｗｎｔプラットフォームにおけるヒト骨格系幹細胞の培養
細胞を、１００μｌのｈＳＳＣ基本培地を有する官能基化されたウェルに２，５００個の細胞／ウェルで播種し、２４時間培養し、その後、培地を除去し、１ｍｇ／ｍｌのラット尾部１型コラーゲン（Corning社）４０μｌを、細胞単層の上に重ねた。添加する前に、ラット尾部１型コラーゲンを、１Ｍ ＮａＯＨ（もともとのコラーゲンゲル１ｍｌ当たり２３μｌ、０．３％体積／体積）で中和し、無血清培地において希釈した。ゲルの架橋を導入するために、ウェルを、３７℃で２時間インキュベートした。１５０μｌの骨形成培地を、次いで、ゲルの上に載せた。骨形成培地は、基本培地に、デキサメタゾン（０．１μＭ）、β－グリセロリン酸（１０ｍＭ）、アスコルビン酸（５０μＭ）、及び非必須アミノ酸（１％体積／体積）を加えたものから構成されていた。試料を、５％ ＣＯ２の加湿空気下において３７℃で３日間培養し、培地は、２日ごとに交換した。
細胞を、１００μｌのｈＳＳＣ基本培地を有する官能基化されたウェルに２，５００個の細胞／ウェルで播種し、２４時間培養し、その後、培地を除去し、１ｍｇ／ｍｌのラット尾部１型コラーゲン（Corning社）４０μｌを、細胞単層の上に重ねた。添加する前に、ラット尾部１型コラーゲンを、１Ｍ ＮａＯＨ（もともとのコラーゲンゲル１ｍｌ当たり２３μｌ、０．３％体積／体積）で中和し、無血清培地において希釈した。ゲルの架橋を導入するために、ウェルを、３７℃で２時間インキュベートした。１５０μｌの骨形成培地を、次いで、ゲルの上に載せた。骨形成培地は、基本培地に、デキサメタゾン（０．１μＭ）、β－グリセロリン酸（１０ｍＭ）、アスコルビン酸（５０μＭ）、及び非必須アミノ酸（１％体積／体積）を加えたものから構成されていた。試料を、５％ ＣＯ２の加湿空気下において３７℃で３日間培養し、培地は、２日ごとに交換した。
【0090】
Ｗｎｔプラットフォームの免疫蛍光染色
１～７日間のインキュベーションの後に、骨形成培地を除去し、ウェルを、１００μｌのｄＰＢＳで１回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、paraformaldehyde）で３０分間固定した。ウェルを、次いで、ｄＰＢＳ（１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ）中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、bovine serum albumin）で、それぞれ３０分間で４回洗浄した。試料を、１％ ＢＳＡ／ｄＰＢＳ中の０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ １００μｌで、３０分間透過処理した。ウェルを、再び、１％ ＢＳＡ／ＰＢＳで、それぞれ３０分間で４回洗浄した。１％ ＢＳＡ／ｄＰＢＳ中の１０％ヤギ血清を、室温で２時間、試料に添加した。１００μｌの一次抗体カクテルを、次いで、試料に添加し、これを、室温で終夜インキュベートした。１％ ＢＳＡ／ｄＰＢＳ中の一次抗体カクテルは、次の通りである：β－カテニン（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、６１０１５４）（１：２５０）及びＡＰＣ（Santa Cruz社、ＳＣ－７９３０）（１：２５０）；Ｓｔｒｏ１（R&D Systems社、ＭＡＢ１０３８）（１：５０）及びオステオカルシン（ＯＣＮ）（Abcam社、ａｂ９３８７６）（１：５００）；カドヘリンＨ（ＣＤＨ１３）（Abcam社、ａｂ３６９０５）（１：１００）又はＰｌｅｘｉｎ Ａ２（ＰＬＸＮＡ２）（Abcam社、ａｂ３９３５７）及びオステオポンチン（ＯＰＮ）（Santa Cruz社、ｓｃ２１７４２）（１：１００）；セントリン１（０４－１６２４）（１：１５０）及びニネイン（Abcam社、ａｂ４４４７）（１：５００）、ＮＵＭＢ（Abcam社、ａｂ４１４７）（１：２５０）、ａＰＫＣζ（Santa Cruz社、ｓｃ１７７８１）、チューブリン（Abcam社、ａｂ６１６０）（１：１０００）。ウェルを、１％ ＢＳＡ／ＰＢＳで、それぞれ３０分間で４回洗浄した。試料を、次いで、二次抗体（１：１０００）及び４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（１：１０００）（ThermoFisher社）カクテルとともに、室温で２時間又は４℃で終夜インキュベートした。使用した二次抗体は、次の通りであった：ロバ抗マウスＩｇＧ ＡＦ４８８（Thermofisher社、Ａ２１２０２）、ロバ抗ウサギＩｇＧ ＡＦ６４７（Thermofisher社、Ａ３２７９５）、ロバ抗ヤギＩｇＧ ＡＦ５５５（Thermofisher社、Ａ３２８１６）、ロバ抗ラットＩｇＧ ＡＦ４８８（Thermofisher社、Ａ２１２０８）、ロバ抗マウスＩｇＧ ＡＦ６４７（Thermofisher社、Ａ３１５７１）、ヤギ抗マウスＩｇＭ ＡＦ４８８（Thermofisher社、Ａ２１０４２）、ヤギ抗ウサギＩｇＧ ＡＦ５５５（Thermofisher社、Ａ２１４２８）、ヤギ抗ウサギＩｇＧ ＡＦ４８８（Thermofisher社、Ａ１１０３４）、及びヤギ抗マウスＩｇＧ ＡＦ５５５（Thermofisher社、Ａ２１４２４）。２時間のインキュベーションの後に、ウェルを、１％ ＢＳＡ／ＰＢＳで、それぞれ３０分間で４回洗浄した。試料を、ｄＰＢＳ中０．０５％重量／体積のアジ化ナトリウム中で、画像を取得するまで４℃で保管した。
１～７日間のインキュベーションの後に、骨形成培地を除去し、ウェルを、１００μｌのｄＰＢＳで１回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、paraformaldehyde）で３０分間固定した。ウェルを、次いで、ｄＰＢＳ（１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ）中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、bovine serum albumin）で、それぞれ３０分間で４回洗浄した。試料を、１％ ＢＳＡ／ｄＰＢＳ中の０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ １００μｌで、３０分間透過処理した。ウェルを、再び、１％ ＢＳＡ／ＰＢＳで、それぞれ３０分間で４回洗浄した。１％ ＢＳＡ／ｄＰＢＳ中の１０％ヤギ血清を、室温で２時間、試料に添加した。１００μｌの一次抗体カクテルを、次いで、試料に添加し、これを、室温で終夜インキュベートした。１％ ＢＳＡ／ｄＰＢＳ中の一次抗体カクテルは、次の通りである：β－カテニン（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、６１０１５４）（１：２５０）及びＡＰＣ（Santa Cruz社、ＳＣ－７９３０）（１：２５０）；Ｓｔｒｏ１（R&D Systems社、ＭＡＢ１０３８）（１：５０）及びオステオカルシン（ＯＣＮ）（Abcam社、ａｂ９３８７６）（１：５００）；カドヘリンＨ（ＣＤＨ１３）（Abcam社、ａｂ３６９０５）（１：１００）又はＰｌｅｘｉｎ Ａ２（ＰＬＸＮＡ２）（Abcam社、ａｂ３９３５７）及びオステオポンチン（ＯＰＮ）（Santa Cruz社、ｓｃ２１７４２）（１：１００）；セントリン１（０４－１６２４）（１：１５０）及びニネイン（Abcam社、ａｂ４４４７）（１：５００）、ＮＵＭＢ（Abcam社、ａｂ４１４７）（１：２５０）、ａＰＫＣζ（Santa Cruz社、ｓｃ１７７８１）、チューブリン（Abcam社、ａｂ６１６０）（１：１０００）。ウェルを、１％ ＢＳＡ／ＰＢＳで、それぞれ３０分間で４回洗浄した。試料を、次いで、二次抗体（１：１０００）及び４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（１：１０００）（ThermoFisher社）カクテルとともに、室温で２時間又は４℃で終夜インキュベートした。使用した二次抗体は、次の通りであった：ロバ抗マウスＩｇＧ ＡＦ４８８（Thermofisher社、Ａ２１２０２）、ロバ抗ウサギＩｇＧ ＡＦ６４７（Thermofisher社、Ａ３２７９５）、ロバ抗ヤギＩｇＧ ＡＦ５５５（Thermofisher社、Ａ３２８１６）、ロバ抗ラットＩｇＧ ＡＦ４８８（Thermofisher社、Ａ２１２０８）、ロバ抗マウスＩｇＧ ＡＦ６４７（Thermofisher社、Ａ３１５７１）、ヤギ抗マウスＩｇＭ ＡＦ４８８（Thermofisher社、Ａ２１０４２）、ヤギ抗ウサギＩｇＧ ＡＦ５５５（Thermofisher社、Ａ２１４２８）、ヤギ抗ウサギＩｇＧ ＡＦ４８８（Thermofisher社、Ａ１１０３４）、及びヤギ抗マウスＩｇＧ ＡＦ５５５（Thermofisher社、Ａ２１４２４）。２時間のインキュベーションの後に、ウェルを、１％ ＢＳＡ／ＰＢＳで、それぞれ３０分間で４回洗浄した。試料を、ｄＰＢＳ中０．０５％重量／体積のアジ化ナトリウム中で、画像を取得するまで４℃で保管した。
【0091】
Ｗｎｔプラットフォームのイメージング及び分析
Ｗｎｔ／β－カテニン経路及びセントロソームの構成成分の分布を分析するために、様々な厚さの画像を、必要とされるイメージング深度に応じて、Zeiss顕微鏡、スピニングディスク共焦点倒立顕微鏡（Nikon社）及びLeica社製共焦点顕微鏡（Leica SP8）を使用して取得した。ステップサイズは、２００μｍ未満の総厚さで、ナイキストサンプリング基準に従って判定した。すべてのイメージングデータは、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して分析した。垂直方向の分裂細胞の分析では、標的化細胞の境界を目的の領域（ＲＯＩ、region of interest）として作製した後、最大強度ＤＡＰＩを有する面を、有糸分裂面を示す中心として取得した。タンパク質マーカーの平均強度は、この面のいずれかの側で測定し、それに続いて比較及び正規化を行って、差異倍数を計算した。平行方向の分裂細胞の分析では、細胞分裂の方向に応じて、分裂細胞内で２つのＲＯＩを設定した。分裂した細胞については、細胞間の境界部、又は明確ではない場合は、ＤＡＰＩシグナル間の中心点を、細胞境界としてとらえた。
Ｗｎｔ／β－カテニン経路及びセントロソームの構成成分の分布を分析するために、様々な厚さの画像を、必要とされるイメージング深度に応じて、Zeiss顕微鏡、スピニングディスク共焦点倒立顕微鏡（Nikon社）及びLeica社製共焦点顕微鏡（Leica SP8）を使用して取得した。ステップサイズは、２００μｍ未満の総厚さで、ナイキストサンプリング基準に従って判定した。すべてのイメージングデータは、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して分析した。垂直方向の分裂細胞の分析では、標的化細胞の境界を目的の領域（ＲＯＩ、region of interest）として作製した後、最大強度ＤＡＰＩを有する面を、有糸分裂面を示す中心として取得した。タンパク質マーカーの平均強度は、この面のいずれかの側で測定し、それに続いて比較及び正規化を行って、差異倍数を計算した。平行方向の分裂細胞の分析では、細胞分裂の方向に応じて、分裂細胞内で２つのＲＯＩを設定した。分裂した細胞については、細胞間の境界部、又は明確ではない場合は、ＤＡＰＩシグナル間の中心点を、細胞境界としてとらえた。
【0092】
生分解性ポリマーの製造
０．３ｇの質量を有するポリカプロラクトン（ＰＣＬ）又はポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）（Sigma-Aldrich社、ＵＫ）フィルムを、アニソール（Sigma-Aldrich社）中２％（重量／体積）の濃度で７ｃｍのガラス皿において溶媒キャストし、５０℃で７２時間静置して、溶媒を蒸発させた。
０．３ｇの質量を有するポリカプロラクトン（ＰＣＬ）又はポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）（Sigma-Aldrich社、ＵＫ）フィルムを、アニソール（Sigma-Aldrich社）中２％（重量／体積）の濃度で７ｃｍのガラス皿において溶媒キャストし、５０℃で７２時間静置して、溶媒を蒸発させた。
【0093】
生分解性ポリマーへのグルタルアルデヒド基の導入
７２時間後に、フィルムを、皿から注意深く取り出し、９０％（体積／体積）のイソプロパノール（Sigma-Aldrich社）中の２％（重量／体積）のヘキサメチレンジアミン（ＨＭＤＡ）（Sigma-Aldrich社）で、室温においてチューブローラーで１．５時間処理して、アミン基をフィルムの表面に導入した。フィルムを、次いで、１００％イソプロパノールで、それぞれ１０分間で３回洗浄し、乾燥させた。プラズマ－化学活性化については、フィルムを、０．２ｍｂａｒの圧力で３分間、無線周波数プラズマ発生装置（周波数１３．５６ＭＨｚ、電力５０ Ｗ Diener electronic社製Zepto-W6、Ｅｂｈａｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において、２０ｓｃｃｍの酸素ガス流下で、プラズマエッチング電極によってプラズマ活性化させた。新しくＯ２プラズマ活性化されたフィルムを、即座に、エタノール（Sigma-Aldrich社）中５％の３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）（Sigma-Aldrich社）で２時間処理した。フィルムを、次いで、１００％エタノールで、それぞれ１０分間で３回洗浄し、乾燥させた。これらのアミン基反応させたフィルムは、４℃で保管することによって、それらの活性を最大３ヶ月間保持することができる。アミン基を、さらに、７０％（体積／体積）エタノール（Fisher Scientific社）中０．０５％（重量／体積）のグルタルアルデヒド（Sigma-Aldrich社）と室温で５分間反応させて、アルデヒド基をポリマーの表面に導入した。ポリマーを、次いで、１００％エタノールで３回洗浄し、乾燥させた。ポリマーを、１００％エタノールで１５分間滅菌した後、ｄＰＢＳで３回洗浄した。
７２時間後に、フィルムを、皿から注意深く取り出し、９０％（体積／体積）のイソプロパノール（Sigma-Aldrich社）中の２％（重量／体積）のヘキサメチレンジアミン（ＨＭＤＡ）（Sigma-Aldrich社）で、室温においてチューブローラーで１．５時間処理して、アミン基をフィルムの表面に導入した。フィルムを、次いで、１００％イソプロパノールで、それぞれ１０分間で３回洗浄し、乾燥させた。プラズマ－化学活性化については、フィルムを、０．２ｍｂａｒの圧力で３分間、無線周波数プラズマ発生装置（周波数１３．５６ＭＨｚ、電力５０ Ｗ Diener electronic社製Zepto-W6、Ｅｂｈａｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において、２０ｓｃｃｍの酸素ガス流下で、プラズマエッチング電極によってプラズマ活性化させた。新しくＯ２プラズマ活性化されたフィルムを、即座に、エタノール（Sigma-Aldrich社）中５％の３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）（Sigma-Aldrich社）で２時間処理した。フィルムを、次いで、１００％エタノールで、それぞれ１０分間で３回洗浄し、乾燥させた。これらのアミン基反応させたフィルムは、４℃で保管することによって、それらの活性を最大３ヶ月間保持することができる。アミン基を、さらに、７０％（体積／体積）エタノール（Fisher Scientific社）中０．０５％（重量／体積）のグルタルアルデヒド（Sigma-Aldrich社）と室温で５分間反応させて、アルデヒド基をポリマーの表面に導入した。ポリマーを、次いで、１００％エタノールで３回洗浄し、乾燥させた。ポリマーを、１００％エタノールで１５分間滅菌した後、ｄＰＢＳで３回洗浄した。
【0094】
生分解性ポリマーのＷｎｔ３ａ改変
上述のように調製した精製Ｗｎｔ３ａ溶液を、次いで、ｄＰＢＳ中で希釈して、２０ｎｇ又は６０ｎｇのＷｎｔ３Ａの量で、６ｍｍのフィルムにおいて約２９ｍｍ２の作業面積をカバーするように、１滴当たり２０μｌの最終体積にした。フィルムを、可溶性Ｗｎｔ３ａとともに１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、２０％ ＦＢＳを含有する高グルコースＤＭＥＭとともにさらにインキュベートして、任意の未反応アルデヒド基をブロッキングした。対照として、ＢＳＡ及び不活性化Ｗｎｔ３ａフィルムもまた、産生させた。これは、室温で１時間、Ｗｎｔ３Ａを使用する代わりにアルデヒド基を０．１％（重量／体積）ＢＳＡと反応させること、及びＷｎｔ３Ａ改変ポリマーを、それぞれ、３７℃で３０分間、２０μｌの２０ｍＭ ＤＤＴで不活性化することによって、達成した。
上述のように調製した精製Ｗｎｔ３ａ溶液を、次いで、ｄＰＢＳ中で希釈して、２０ｎｇ又は６０ｎｇのＷｎｔ３Ａの量で、６ｍｍのフィルムにおいて約２９ｍｍ２の作業面積をカバーするように、１滴当たり２０μｌの最終体積にした。フィルムを、可溶性Ｗｎｔ３ａとともに１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、２０％ ＦＢＳを含有する高グルコースＤＭＥＭとともにさらにインキュベートして、任意の未反応アルデヒド基をブロッキングした。対照として、ＢＳＡ及び不活性化Ｗｎｔ３ａフィルムもまた、産生させた。これは、室温で１時間、Ｗｎｔ３Ａを使用する代わりにアルデヒド基を０．１％（重量／体積）ＢＳＡと反応させること、及びＷｎｔ３Ａ改変ポリマーを、それぞれ、３７℃で３０分間、２０μｌの２０ｍＭ ＤＤＴで不活性化することによって、達成した。
【0095】
Ｗｎｔ官能基化及び対照の生分解性ポリマーにおけるヒト骨格系幹細胞（ｈＳＳＣ）の培養
官能基化されたフィルムのインビトロでの分析のために、７ｘＴＣＦ－ｅＧＦＰ／ＳＶ４０－ｍＣｈｅｒｒｙレポーターを有するｈＳＳＣを、官能基化されたポリマーフィルムに、３５，０００個の細胞／ｃｍ２（１０，０００個の細胞／バンデージ）で播種し、ｈＳＳＣ基本培地において２４時間培養した。対照実験のために、ｈＳＳＣを、９６ウェルプレートに、同じ希釈で播種し、５０ｎｇ／ｍｌ又は１５０ｎｇ／ｍｌの可溶性Ｗｎｔ３Ａ又は０．１％ ＢＳＡ溶液の存在下において、２４時間培養した。
官能基化されたフィルムのインビトロでの分析のために、７ｘＴＣＦ－ｅＧＦＰ／ＳＶ４０－ｍＣｈｅｒｒｙレポーターを有するｈＳＳＣを、官能基化されたポリマーフィルムに、３５，０００個の細胞／ｃｍ２（１０，０００個の細胞／バンデージ）で播種し、ｈＳＳＣ基本培地において２４時間培養した。対照実験のために、ｈＳＳＣを、９６ウェルプレートに、同じ希釈で播種し、５０ｎｇ／ｍｌ又は１５０ｎｇ／ｍｌの可溶性Ｗｎｔ３Ａ又は０．１％ ＢＳＡ溶液の存在下において、２４時間培養した。
【0096】
インビボでの細胞バンデージの調製のために、官能基化されたポリマーフィルム（ＷＩＯＴＭ－バンデージは活性Ｗｎｔ３ａ、ｉＷｎｔ－ｈＳＳＣ－バンデージは不活性Ｗｎｔ３ａ）に、同じ密度で細胞を播種し、付着させた。次いで、基本培地を除去し、上述のように、１００μｌの１ｍｇ／ｍｌラット尾部１型コラーゲンを重ね、静置させ、その上に骨形成培地を載せた。ＷＩＯＴＭ－及びｉＷｎｔ－ｈＳＳＣバンデージを、それぞれ、７及び２日間培養し、それぞれ、３回及び２回の培地交換を行った。
【0097】
Ｗｎｔ官能基化生分解性ポリマーにおけるＷｎｔ活性の分析
７ｘＴＣＦ－ｅＧＦＰ／ＳＶ４０－ｍＣｈｅｒｒｙを安定に感染させたＷｎｔ反応性ｈＳＳＣからの蛍光強度を、Operetta High-Content Imaging System（PerkinElmer社）を使用して測定した。イメージングの前に、細胞を、Hoechst33342（ThermoFisher社）で５分間染色し、ｄＰＢＳで洗浄し、次いで、１０％ ＦＢＳを含有するｄＰＢＳ ２０μｌで培地を新しくした。ＳｕｐｅｒＴＯＰＦｌａｓｈレポーター（ＬＳ／Ｌ）をトランスフェクトしたＬ細胞を、１０％ ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを有するＤＭＥＭ中で、Ｗｎｔ活性化表面において培養した。また、ＳｕｐｅｒＴＯＰＦｌａｓｈレポーター（ＬＳ／Ｌ）をトランスフェクトしたＬ細胞を、１０％ ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭにおいて終夜培養することによって、官能基化された生分解性ポリマーのＷｎｔ活性を測定し、Dual-Light Systems（Applied Biosystems社）を使用して、Ｗｎｔに誘導されるルシフェラーゼ活性を定量化した。
７ｘＴＣＦ－ｅＧＦＰ／ＳＶ４０－ｍＣｈｅｒｒｙを安定に感染させたＷｎｔ反応性ｈＳＳＣからの蛍光強度を、Operetta High-Content Imaging System（PerkinElmer社）を使用して測定した。イメージングの前に、細胞を、Hoechst33342（ThermoFisher社）で５分間染色し、ｄＰＢＳで洗浄し、次いで、１０％ ＦＢＳを含有するｄＰＢＳ ２０μｌで培地を新しくした。ＳｕｐｅｒＴＯＰＦｌａｓｈレポーター（ＬＳ／Ｌ）をトランスフェクトしたＬ細胞を、１０％ ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを有するＤＭＥＭ中で、Ｗｎｔ活性化表面において培養した。また、ＳｕｐｅｒＴＯＰＦｌａｓｈレポーター（ＬＳ／Ｌ）をトランスフェクトしたＬ細胞を、１０％ ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭにおいて終夜培養することによって、官能基化された生分解性ポリマーのＷｎｔ活性を測定し、Dual-Light Systems（Applied Biosystems社）を使用して、Ｗｎｔに誘導されるルシフェラーゼ活性を定量化した。
【0098】
Ｗｎｔ官能基化生分解性ポリマーのウエスタンブロット分析
インプット及びフィルム表面官能基化中の洗浄液におけるタンパク質レベルを判定するために、タンパク質電気泳動及びウエスタンブロッティングを使用した。ポリマーフィルムのＷｎｔ３Ａ改変後に、Ｗｎｔ３Ａ又は対照溶液を、ウエスタンブロット（ＷＢ、Western blot）のために採取し、フィルムを、２０μｌのｄＰＢＳ中で洗浄し、これもまた、ＷＢのために３回採取した。試料を、４×レムリー緩衝液（Bio-Rad社）と混合し、Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸ無染料ゲル（Bio-Rad社）にロードし、次いで、ＴＢＳＴ（Ｔｒｉｓ緩衝化食塩水及びＴｗｅｅｎ ２０、１：１，０００）中５％ミルクにおいて１時間ブロッキングした後、αＷＮＴ３Ａ（Millipore社、０９－１６２）に関して４℃で終夜、ＴＢＳＴ中５％ミルクにおいてイムノブロッティングした。バンドを、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（Bio-Rad社）において化学発光により視覚化した。
インプット及びフィルム表面官能基化中の洗浄液におけるタンパク質レベルを判定するために、タンパク質電気泳動及びウエスタンブロッティングを使用した。ポリマーフィルムのＷｎｔ３Ａ改変後に、Ｗｎｔ３Ａ又は対照溶液を、ウエスタンブロット（ＷＢ、Western blot）のために採取し、フィルムを、２０μｌのｄＰＢＳ中で洗浄し、これもまた、ＷＢのために３回採取した。試料を、４×レムリー緩衝液（Bio-Rad社）と混合し、Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸ無染料ゲル（Bio-Rad社）にロードし、次いで、ＴＢＳＴ（Ｔｒｉｓ緩衝化食塩水及びＴｗｅｅｎ ２０、１：１，０００）中５％ミルクにおいて１時間ブロッキングした後、αＷＮＴ３Ａ（Millipore社、０９－１６２）に関して４℃で終夜、ＴＢＳＴ中５％ミルクにおいてイムノブロッティングした。バンドを、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（Bio-Rad社）において化学発光により視覚化した。
【0099】
Ｗｎｔ又はＷｎｔ誘導型ヒト骨形成組織モデル（ＷＩＯＴＭ）バンデージの調製
移植実験において使用したＷｎｔ３Ａ改変ＰＣＬポリマーは、Ｗｎｔバンデージと命名する。Ｗｎｔバンデージは、移植手術の１日前に調製した。一方で、Ｗｎｔプラットフォーム実験において記載されるように３Ｄ培養条件下においてｈＳＳＣを１週間培養した、Ｗｎｔ３ａ改変ＰＣＬポリマーは、ＷＩＯＴＭバンデージと命名する。ＷＩＯＴＭバンデージの場合、ポリマーは、外科手術の８日前に調製した。Ｗｎｔバンデージを上述のように調製した細胞とともに２４時間インキュベートした後に、基本培地を除去し、１００μｌの１ｍｇ／ｍｌラット尾部１型コラーゲンを、細胞単層上に載せた。添加する前に、ラット尾部１型コラーゲンを、上述のように調製した。ゲルの架橋を導入するために、ウェルを、３７℃で２時間インキュベートした。１５０μｌの骨形成培地を、次いで、ゲルの上に載せた。骨形成培地は、２～３日ごとに交換し、外科手術の前に７日間培養した。
移植実験において使用したＷｎｔ３Ａ改変ＰＣＬポリマーは、Ｗｎｔバンデージと命名する。Ｗｎｔバンデージは、移植手術の１日前に調製した。一方で、Ｗｎｔプラットフォーム実験において記載されるように３Ｄ培養条件下においてｈＳＳＣを１週間培養した、Ｗｎｔ３ａ改変ＰＣＬポリマーは、ＷＩＯＴＭバンデージと命名する。ＷＩＯＴＭバンデージの場合、ポリマーは、外科手術の８日前に調製した。Ｗｎｔバンデージを上述のように調製した細胞とともに２４時間インキュベートした後に、基本培地を除去し、１００μｌの１ｍｇ／ｍｌラット尾部１型コラーゲンを、細胞単層上に載せた。添加する前に、ラット尾部１型コラーゲンを、上述のように調製した。ゲルの架橋を導入するために、ウェルを、３７℃で２時間インキュベートした。１５０μｌの骨形成培地を、次いで、ゲルの上に載せた。骨形成培地は、２～３日ごとに交換し、外科手術の前に７日間培養した。
【0100】
ｈＳＳＣあり又はなしのＷｎｔ官能基化生分解性ポリマーの移植
１３週齢の雌性重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスを、頭蓋冠骨欠損部へのＷｎｔバンデージ及びＷＩＯＴＭバンデージの移植に使用した。すべての手順を、滅菌条件下において実行した。まず、全身麻酔を、麻酔カクテル（１０μｌ／体重）を使用して腹腔内経路によってマウスに投与したが、このカクテルは、滅菌塩化ナトリウム０．９％生理食塩水、７．５ｍｇ／ｍｌのケタミン（Ｖｅｔａｌａｒ（登録商標））、及び０．１ｍｇ／ｍＬのメデトミジン（Ｄｏｍｉｔｏｒ（登録商標））からなっていた。尾部及び後肢引き込め反射の喪失を試験した後、頭頂部を小型のヘアトリマーで剃り、リドカイン５％ Ｍ／Ｍ軟膏（登録商標）を拡げて、局所麻酔を促進させた。眼を、Ｖｉｓｃｏｔｅａｒｓ（登録商標）液体ゲルで潤し、矢状皮膚切開を、外科用メスで正中線に沿って行った。マウスを、立体顕微鏡下においた。頭蓋冠を露出させ、綿棒を使用して外側方向に分離する動きによって、頭蓋に重なる骨膜層を除去した。歯科用ハンドピースを使用して、摩擦による熱の蓄積を回避しながら、緩徐に、１又は２つの４ｍｍの欠損部の孔を開けた。骨片を除去し、欠損部を、Ｗｎｔバンデージ又は４０μｌの１ｍｇ／ｍｌラット尾部１型コラーゲンを有するＷＩＯＴＭバンデージで被覆し、Ｖｅｔｂｏｎｄ（登録商標）を使用して正しい場所に固定した後、またＶｅｔｂｏｎｄ（登録商標）を使用して皮膚切開部を閉じた。１．２５ｍｇ／ｍｌのアチパメゾール（Ａｎｔｉｓｅｄａｎ（登録商標））及び０．０１ｍｇ／ｍＬのブプレノルフィン（Ｖｅｔｅｒｇｅｓｉｃ（登録商標））を有する滅菌塩化ナトリウム０．９％生理食塩水からなる回復カクテルを、マウスに注射し（１０μｌ／体重）、これを、２８℃のインキュベーターにおいて非常に注意深く観察した。
１３週齢の雌性重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスを、頭蓋冠骨欠損部へのＷｎｔバンデージ及びＷＩＯＴＭバンデージの移植に使用した。すべての手順を、滅菌条件下において実行した。まず、全身麻酔を、麻酔カクテル（１０μｌ／体重）を使用して腹腔内経路によってマウスに投与したが、このカクテルは、滅菌塩化ナトリウム０．９％生理食塩水、７．５ｍｇ／ｍｌのケタミン（Ｖｅｔａｌａｒ（登録商標））、及び０．１ｍｇ／ｍＬのメデトミジン（Ｄｏｍｉｔｏｒ（登録商標））からなっていた。尾部及び後肢引き込め反射の喪失を試験した後、頭頂部を小型のヘアトリマーで剃り、リドカイン５％ Ｍ／Ｍ軟膏（登録商標）を拡げて、局所麻酔を促進させた。眼を、Ｖｉｓｃｏｔｅａｒｓ（登録商標）液体ゲルで潤し、矢状皮膚切開を、外科用メスで正中線に沿って行った。マウスを、立体顕微鏡下においた。頭蓋冠を露出させ、綿棒を使用して外側方向に分離する動きによって、頭蓋に重なる骨膜層を除去した。歯科用ハンドピースを使用して、摩擦による熱の蓄積を回避しながら、緩徐に、１又は２つの４ｍｍの欠損部の孔を開けた。骨片を除去し、欠損部を、Ｗｎｔバンデージ又は４０μｌの１ｍｇ／ｍｌラット尾部１型コラーゲンを有するＷＩＯＴＭバンデージで被覆し、Ｖｅｔｂｏｎｄ（登録商標）を使用して正しい場所に固定した後、またＶｅｔｂｏｎｄ（登録商標）を使用して皮膚切開部を閉じた。１．２５ｍｇ／ｍｌのアチパメゾール（Ａｎｔｉｓｅｄａｎ（登録商標））及び０．０１ｍｇ／ｍＬのブプレノルフィン（Ｖｅｔｅｒｇｅｓｉｃ（登録商標））を有する滅菌塩化ナトリウム０．９％生理食塩水からなる回復カクテルを、マウスに注射し（１０μｌ／体重）、これを、２８℃のインキュベーターにおいて非常に注意深く観察した。
【0101】
マイクロＣＴスキャニング及び分析
移植の８週間後に、マウスの頭部試料を採取した。全頭部試料を、室温で終夜、ローター上のプラスチックチューブにおいて４０ｍＬの４％ ＰＦＡで固定した。試料を、翌日、ＰＢＳで、それぞれ１５分間で３回洗浄した。頭部試料を、次いで、Scanco社製μＣＴ５０マイクロＣＴスキャナー（Scanco社、Ｂｒｕｅｔｔｉｓｅｌｌｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、スキャニングした。標本を、綿ガーゼを使用して１９ｍｍのスキャニングチューブに固定化し、硬Ｘ線を減弱化するために、７０ｋＶｐ、１１４μＡ、及び０．５ｍｍアルミニウムフィルタのＸ線設定を使用してスキャニングして、辺長１０μｍのボクセルサイズ体積を得た。０～７９０ｍｇ ＨＡ／ｃｍ３の濃度の５ロッドのヒドロキシアパタイト（ＨＡ）からなる、ＣＴ製造業者によって提供されるキャリブレーションオブジェクトを使用して、スキャンを再構成時に自動的にスケーリングし、吸収値は、ハウンスフィールド単位（ＨＵ）で表した。標本を、Parallax社のＭｉｃｒｏｖｉｅｗソフトウェアパッケージを使用して特徴付けし、３Ｄ画像を、未加工のＣＴスキャニングデータから再構成した。画像を、新しい骨の再生の面積及び体積に関して分析した（Parallax Innovations Inc.社、Ｉｌｄｅｒｔｏｎ、ＯＮ Ｃａｎａｄａ）。柔らかい非石灰化組織及び空気に対応するバックグラウンドシグナル（２５０ｍｇ ＨＡ／ｃｍ３未満）を、閾値によって除去し、欠損部における石灰化組織は、５００ｍｇ ＨＡ／ｃｍ３を上回る密度として考えた。
移植の８週間後に、マウスの頭部試料を採取した。全頭部試料を、室温で終夜、ローター上のプラスチックチューブにおいて４０ｍＬの４％ ＰＦＡで固定した。試料を、翌日、ＰＢＳで、それぞれ１５分間で３回洗浄した。頭部試料を、次いで、Scanco社製μＣＴ５０マイクロＣＴスキャナー（Scanco社、Ｂｒｕｅｔｔｉｓｅｌｌｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、スキャニングした。標本を、綿ガーゼを使用して１９ｍｍのスキャニングチューブに固定化し、硬Ｘ線を減弱化するために、７０ｋＶｐ、１１４μＡ、及び０．５ｍｍアルミニウムフィルタのＸ線設定を使用してスキャニングして、辺長１０μｍのボクセルサイズ体積を得た。０～７９０ｍｇ ＨＡ／ｃｍ３の濃度の５ロッドのヒドロキシアパタイト（ＨＡ）からなる、ＣＴ製造業者によって提供されるキャリブレーションオブジェクトを使用して、スキャンを再構成時に自動的にスケーリングし、吸収値は、ハウンスフィールド単位（ＨＵ）で表した。標本を、Parallax社のＭｉｃｒｏｖｉｅｗソフトウェアパッケージを使用して特徴付けし、３Ｄ画像を、未加工のＣＴスキャニングデータから再構成した。画像を、新しい骨の再生の面積及び体積に関して分析した（Parallax Innovations Inc.社、Ｉｌｄｅｒｔｏｎ、ＯＮ Ｃａｎａｄａ）。柔らかい非石灰化組織及び空気に対応するバックグラウンドシグナル（２５０ｍｇ ＨＡ／ｃｍ３未満）を、閾値によって除去し、欠損部における石灰化組織は、５００ｍｇ ＨＡ／ｃｍ３を上回る密度として考えた。
【0102】
凍結切片の調製
試料をトリミングするために、頭部の皮膚及び脳を、ハサミ及び２セットのピンセットを用いて、固定したマウス頭部から摘出した。トリミングの後に、試料を、脱灰のために終夜、１０％ギ酸中に入れた。まず、水中３０％のスクロース、次いで、水中３０％のスクロース及び３０％の最適切断温度（ＯＣＴ、Optimal Cutting Temperature）化合物を用いて、二晩にわたって脱水を行った。試料を、ＯＣＴ化合物を充填した凍結型において瞬間凍結させ、ドライアイス及び１００％エタノールによって冷却した。マウス頭部試料を、Ｃｒｙｏｓｔａｔｓ（登録商標）を使用して、１２～２０μｍのスライスで、前方から後方への方向で、横方向に切片化した。全試料は、切片化するまで、－８０℃で保管した。切片化したスライスを、染色するまで、－２０℃で保管した。
試料をトリミングするために、頭部の皮膚及び脳を、ハサミ及び２セットのピンセットを用いて、固定したマウス頭部から摘出した。トリミングの後に、試料を、脱灰のために終夜、１０％ギ酸中に入れた。まず、水中３０％のスクロース、次いで、水中３０％のスクロース及び３０％の最適切断温度（ＯＣＴ、Optimal Cutting Temperature）化合物を用いて、二晩にわたって脱水を行った。試料を、ＯＣＴ化合物を充填した凍結型において瞬間凍結させ、ドライアイス及び１００％エタノールによって冷却した。マウス頭部試料を、Ｃｒｙｏｓｔａｔｓ（登録商標）を使用して、１２～２０μｍのスライスで、前方から後方への方向で、横方向に切片化した。全試料は、切片化するまで、－８０℃で保管した。切片化したスライスを、染色するまで、－２０℃で保管した。
【0103】
組織切片の組織学的染色
ヘマトキシリン（Vector Labs.社、Ｈ－３４０４）及びエオシン（Sigma-Aldrich社、３１８９０６）（Ｈ＆Ｅ）染色を、標準的なプロトコールによって行った。モバットのペンタクローム染色（Abcam社、ａｂ２４５８８４）を、供給されている方法に従って行った。切片を、ＤＰＸ（Sigma-Aldrich社、０６５２２）とともにカバーガラスに載置した。
ヘマトキシリン（Vector Labs.社、Ｈ－３４０４）及びエオシン（Sigma-Aldrich社、３１８９０６）（Ｈ＆Ｅ）染色を、標準的なプロトコールによって行った。モバットのペンタクローム染色（Abcam社、ａｂ２４５８８４）を、供給されている方法に従って行った。切片を、ＤＰＸ（Sigma-Aldrich社、０６５２２）とともにカバーガラスに載置した。
【0104】
組織切片の免疫蛍光（ＩＦ）及び免疫組織化学（ＩＨＣ）染色
まず、試料を、予熱した水（３７℃）に１５分ずつ入れることによって、切片化スライドからＯＣＴ化合物を除去した。ＩＨＣ切片を、ＨＲＰ／ＡＥＣ検出ＩＨＣキット（Abcam社、ａｂ９３７０５）の一部として供給された過酸化水素ブロック剤でブロッキングした。ＩＦ切片を、ＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１％ ＢＳＡ、ＰＢＳ中）を使用して、それぞれ１５分間で３回、洗浄しブロッキングした。次いで、スライドを、上に列挙されるように、１：２５０のヒトβ２－ミクログロブリン（ｈβＭＧ２、human β2-Microglobulin）（Sigma-Aldrich社、Ｍ７３９８）、１：１００のスクレロスチン（Abcam社、ａｂ８５７９９及びBio-Rad社、ＨＣＡ２３０Ｚ）、１：４００のＧＦＰ（Aves Lab社、ＧＦＰ－１０２０）、並びに１：４００のＲＦＰ（Rockland社、６００－４０１－３７９）を添加し、染色緩衝液（ＩＦ：０．０５％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１％ ＢＳＡ、ＰＢＳ中、ＩＨＣ：ＰＢＳ）中に希釈した一次抗体とともに、４℃で終夜インキュベートした。ＩＦについては、ＰＢＳＴを使用して、スライドを洗浄した後、室温で１時間、二次抗体とともにインキュベートした。使用した二次抗体は、上述のように、ヤギ抗マウスＩｇＭ ＡＦ４８８、ヤギ抗ウサギＩｇＧ ＡＦ５５５（ThermoFisher社、Ａ２１４２８）、ヤギ抗ウサギＩｇＧ ＡＦ４８８（ThermoFisher社、Ａ１１０３４）、及びヤギ抗マウスＩｇＧ ＡＦ５５５（ThermoFisher社、Ａ２１４２４）であり、ロバ抗ニワトリＩｇＹ ＡＦ４８８（Jackson ImmunoResearch Labs.社、７０３－５４５－１５５）を追加した。ＩＦ切片を、次いで、ＰＢＳＴを使用して３回洗浄し、１：１０００のＤＡＰＩを使用して対比染色した。ＩＨＣについては、スライドを、ＩＨＣキットに記載されるようにさらに処理し、ヘマトキシリン（Vector Labs.社、Ｈ－３４０４）で対比染色した。スライドを、イメージングの前に水性封入剤（Abcam社、ａｂ１２８９８２）で封止した。すべてのタイプの染色を、少なくとも３匹の別個の動物の組織において確認した。
まず、試料を、予熱した水（３７℃）に１５分ずつ入れることによって、切片化スライドからＯＣＴ化合物を除去した。ＩＨＣ切片を、ＨＲＰ／ＡＥＣ検出ＩＨＣキット（Abcam社、ａｂ９３７０５）の一部として供給された過酸化水素ブロック剤でブロッキングした。ＩＦ切片を、ＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１％ ＢＳＡ、ＰＢＳ中）を使用して、それぞれ１５分間で３回、洗浄しブロッキングした。次いで、スライドを、上に列挙されるように、１：２５０のヒトβ２－ミクログロブリン（ｈβＭＧ２、human β2-Microglobulin）（Sigma-Aldrich社、Ｍ７３９８）、１：１００のスクレロスチン（Abcam社、ａｂ８５７９９及びBio-Rad社、ＨＣＡ２３０Ｚ）、１：４００のＧＦＰ（Aves Lab社、ＧＦＰ－１０２０）、並びに１：４００のＲＦＰ（Rockland社、６００－４０１－３７９）を添加し、染色緩衝液（ＩＦ：０．０５％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１％ ＢＳＡ、ＰＢＳ中、ＩＨＣ：ＰＢＳ）中に希釈した一次抗体とともに、４℃で終夜インキュベートした。ＩＦについては、ＰＢＳＴを使用して、スライドを洗浄した後、室温で１時間、二次抗体とともにインキュベートした。使用した二次抗体は、上述のように、ヤギ抗マウスＩｇＭ ＡＦ４８８、ヤギ抗ウサギＩｇＧ ＡＦ５５５（ThermoFisher社、Ａ２１４２８）、ヤギ抗ウサギＩｇＧ ＡＦ４８８（ThermoFisher社、Ａ１１０３４）、及びヤギ抗マウスＩｇＧ ＡＦ５５５（ThermoFisher社、Ａ２１４２４）であり、ロバ抗ニワトリＩｇＹ ＡＦ４８８（Jackson ImmunoResearch Labs.社、７０３－５４５－１５５）を追加した。ＩＦ切片を、次いで、ＰＢＳＴを使用して３回洗浄し、１：１０００のＤＡＰＩを使用して対比染色した。ＩＨＣについては、スライドを、ＩＨＣキットに記載されるようにさらに処理し、ヘマトキシリン（Vector Labs.社、Ｈ－３４０４）で対比染色した。スライドを、イメージングの前に水性封入剤（Abcam社、ａｂ１２８９８２）で封止した。すべてのタイプの染色を、少なくとも３匹の別個の動物の組織において確認した。
【0105】
インビボでの定量化
陽性細胞の定量化を、図１６Ａ～Ｂに記載されるように、免疫蛍光画像の閾値方法によって、判定した。染色された対照組織の面積を選択し、目的のマーカーに関してもっとも高い強度の細胞シグナルを判定した。この強度を、試料組織の閾値として使用し、すべての残りのシグナルは、対照組織よりも高い強度のものとなるようにした。陽性細胞を、次いで、細胞シグナルの存在によって定量化することができた。
陽性細胞の定量化を、図１６Ａ～Ｂに記載されるように、免疫蛍光画像の閾値方法によって、判定した。染色された対照組織の面積を選択し、目的のマーカーに関してもっとも高い強度の細胞シグナルを判定した。この強度を、試料組織の閾値として使用し、すべての残りのシグナルは、対照組織よりも高い強度のものとなるようにした。陽性細胞を、次いで、細胞シグナルの存在によって定量化することができた。
【0106】
結果
局在化されたＷｎｔ３ａバンデージ及びＷＩＯＴＭバンデージを操作し、インビボで重度の頭蓋冠欠損を修復するそれらの能力を評価した。
局在化されたＷｎｔ３ａバンデージ及びＷＩＯＴＭバンデージを操作し、インビボで重度の頭蓋冠欠損を修復するそれらの能力を評価した。
【0107】
局在化されたＷｎｔ３ａタンパク質は、３Ｄ Ｗｎｔ誘導型ヒト骨形成組織モデル（ＷＩＯＴＭ）を生成するように、ｈＳＳＣの紡錘体を配向させた
これまでの研究（Lowndes, M. et al (2017)、上記）において、固定化されたＷｎｔ３ａプラットフォームが、ｈＳＳＣを、Ｗｎｔ３ａ源の近傍に維持し、３Ｄ １型コラーゲンゲルにおいて分化が進む骨形成細胞のカスケードを生成して、ＷＩＯＴＭを形成することができることが、示されている（図１Ａ）。この実験では、このプロセスの根底にある分子機序を理解することが、目的となっていた。固定化されたＷｎｔ３ａとは異なり、培地に添加された可溶性Ｗｎｔ３ａタンパク質は、ｈＳＳＣｓの増殖を誘導することができるが、細胞遊走は促進しなかった（Lowndes, M. et al (2017)、上記）。したがって、細胞分裂の配向及び多層形成は、ｈＳＳＣの片側へのＷｎｔ３ａの非対称提示によって、関連付けられ調節されることが推測された（図１Ｂを参照されたい）。
これまでの研究（Lowndes, M. et al (2017)、上記）において、固定化されたＷｎｔ３ａプラットフォームが、ｈＳＳＣを、Ｗｎｔ３ａ源の近傍に維持し、３Ｄ １型コラーゲンゲルにおいて分化が進む骨形成細胞のカスケードを生成して、ＷＩＯＴＭを形成することができることが、示されている（図１Ａ）。この実験では、このプロセスの根底にある分子機序を理解することが、目的となっていた。固定化されたＷｎｔ３ａとは異なり、培地に添加された可溶性Ｗｎｔ３ａタンパク質は、ｈＳＳＣｓの増殖を誘導することができるが、細胞遊走は促進しなかった（Lowndes, M. et al (2017)、上記）。したがって、細胞分裂の配向及び多層形成は、ｈＳＳＣの片側へのＷｎｔ３ａの非対称提示によって、関連付けられ調節されることが推測された（図１Ｂを参照されたい）。
【0108】
２Ｄシステムにおいて、局在化されたＷｎｔ３ａは、マウス胚性幹細胞の紡錘体の配向させることができ（Habib, S. J. et al (2013)、上記）、そのため、局在化されたＷｎｔ３ａが、３Ｄ環境においてもｈＳＳＣの紡錘体を配向させることができるかどうかを確認するために、調査を行った。骨髄から単離されたｈＳＳＣのうちの平均で５３％が、Ｗｎｔ３ａに応答し、Ｗｎｔ／β－カテニン経路を活性化し得る（Lowndes, M. et al 2017、上記）。ｈＳＳＣを、Ｗｎｔ３ａプラットフォームで培養し、細胞を１型コラーゲンで覆い、３Ｄ環境を作成した。分裂中期のｈＳＳＣの有糸分裂面を、３Ｄイメージング及びインシリコ再構成を使用して、視覚化した。２つのカテゴリーの分裂細胞を特定することができた：局在化されたＷｎｔ３ａに対して垂直方向に分裂し、上から観察した場合に分裂中期には花のようなクロマチン環で染色体と整列する細胞（軸方向分解）（図１Ｄ及び図１Ｅを参照されたい）、又はＷｎｔ３ａ源及びクロマチン環と平行して分裂し、縁部に存在し、上から見た場合に楕円形に見える細胞（図１Ｈ及び図１Ｉを参照されたい）。有糸分裂面の配向はまた、微小管及びセントロソームを視覚化することによっても確認した（図８Ａ、Ｂ、Ｄ、及びＥ）。興味深いことに、Ｗｎｔ３ａのジスルフィド架橋を破壊するようにＤＴＴで処理し、タンパク質を生物学的に不活性にした不活性化Ｗｎｔ３ａプラットフォーム（ｉＷｎｔ３ａ）と比較して、Ｗｎｔ３ａプラットフォームに対して垂直方向に分裂する細胞の有意な増加が観察された（図１Ｃを参照されたい）（Lowndes, M. et al (2017)、上記；Lowndes, M. et al (2016)、上記）。ｉＷｎｔ３ａプラットフォームは、Ｗｎｔ３ａのジスルフィド架橋を破壊するようにＤＴＴで処理して、タンパク質を生物学的に不活性にした。ｈＳＳＣの片側へのＷｎｔ３ａの局在化された提示は、３Ｄにおいて有糸分裂の軸を配向させ、Ｗｎｔ３ａ源に対して垂直な分裂を促進すると結論付けられた。
【0109】
特定の紡錘体配向は、細胞の片側への極性タンパク質非定形プロテインキナーゼＣ ζ（ａＰＫＣ ζ）の区分化を必要とすることが多い（Schlessinger, K. et al (2007) J. Cell Biol. 178: 355-361）。したがって、垂直方向に分裂する単一ｈＳＳＣにおいて、ａＰＫＣζは、細胞のＷｎｔ３ａ近位側半分において濃縮されており、一方で、平行方向に分裂する細胞では、ａＰＫＣζは、いずれの側にも最低限の偏りで細胞全体に分布していたことが見出された（図８Ｃ～８Ｅ）。対照的に、いくつかの系においてＡＣＤに関与するＮｏｔｃｈ阻害剤であるＮｕｍｂ（Inaba, M. & Yamashita, Y. M. (2012) Cell Stem Cell 11, 461-469）は、分裂ｈＳＳＣにおいて分極されておらず、分裂配向に関係なく両側に同等に分布していた（図８Ｆ～８Ｊ）。
【0110】
ビーズにつなげたＷｎｔ３ａタンパク質と接触する単一ＥＳＣは、Ｗｎｔ３ａ／β－カテニン経路の成分、例えば、β－カテニン及びＡＰＣを、Ｗｎｔ３ａ－ビーズへと分極させた（Habib, S. J. et al (2013)、上記）。両方のタンパク質の１つの機能は、細胞において多数ある中でも、紡錘体配向の調節である（Garcin, C. L. & Habib, S. J. (2017)、上記）。分裂ｈＳＳＣにおける両方の分子の分布を、視覚化した。Ｗｎｔ３ａ－プラットフォームに対して垂直方向の分裂においては、ＡＰＣ及びβ－カテニンは、主として、細胞のＷｎｔ３ａ近位側半分に局在化することが、見出された（図１Ｄ～図１Ｇ及び１Ｌを参照されたい）。Ｗｎｔ３ａ源に対して平行方向の分裂においては、両方のタンパク質は、細胞の両半分に同様に分布していた（図１Ｈ及び１Ｌを参照されたい）。
【0111】
まとめると、局在化されたＷｎｔ３ａタンパク質は、ａＰＫＣ ζ、ＡＰＣ、及びβ－カテニンを、Ｗｎｔ応答性かつ分裂ｈＳＳＣに分極させ、有糸分裂面をＷｎｔ３ａ源に対して垂直方向に配向させて、ＡＣＤを促進した。この配向された分裂により、１つのＷｎｔ３ａ近位側ｈＳＳＣが生成され、Ｗｎｔ３ａ遠位側細胞は、骨形成分化となり、３Ｄ １型コラーゲンゲルにおいて上方に移動する（図１Ｂ）。
【0112】
固定化されたＷｎｔ３ａタンパク質は、分裂ｈＳＳＣにおいて細胞運命マーカーを分離する
Ｗｎｔ３ａプラットフォームは、高いレベルの幹細胞マーカーＳｔｒｏ１及び低いレベルの骨形成細胞運命マーカーオステオカルシン（ＯＣＮ）を発現するｈＳＳＣを維持した。３Ｄゲルにおいて上方に遊走する細胞は、徐々にＳｔｒｏ１を下方調節し、ＯＣＮを上方調節した（図１２Ａ）（Lowndes, M. et al (2016)、上記）。近年では、骨髄から単離されたｈＳＳＣのプロテオミクス及び機能的分析は、カドヘリン－１３（ＣＤＨ１３）及びセマフォリン共受容体ＰＬＸＮＡ２を、新規なｈＳＳＣマーカーとして示している（Holley, R. J. et al (2015) Stem Cell Reports 4: 473-488）。ＣＤＨ１３、ＰＬＸＮＡ２、及び早期分化マーカーオステオポンチン（ＯＰＮ）のタンパク質発現プロファイルの評価（Zohar, R. et al (1998) Eur. J. Oral Sci. 106(1): 401-407）を、ＷＩＯＴＭを含む細胞において行った。Ｓｔｒｏ１と同様に、ＣＤＨ１３及びＰＬＸＮＡ２は、Ｗｎｔ３ａの近位側の細胞において高度に発現され、固定化されたＷｎｔ３ａから離れて遊走した細胞においては下方調節されていた。ＯＰＮは、ＯＣＮと類似の発現パターンを示した（図２Ａ～２Ｃ、及び図１２Ａ）。これらのマーカーにより、ＷＩＯＴＭの組成及び骨形成同一性がさらに確認される。ｈＳＳＣは、異なるレベルではあるが幹細胞及び分化マーカーを共発現するため、これらのマーカーの分布を、細胞分裂中にモニタリングした。Ｗｎｔ３ａに対して垂直方向に分裂するｈＳＳＣにおけるＣＤＨ１３及びＯＰＮの共染色は、Ｗｎｔ３ａ近位側半分が、Ｗｎｔ３ａ遠位側半分と比較して、高いレベルのＣＤＨ１３を有したことを示した。対照的に、ＯＰＮは、細胞のＷｎｔ３ａ遠位側半分において濃縮されていた（図２Ｄ及びＦ、並びに図９Ａ）。マーカーのこの分離パターンはまた、分裂終期及び分裂後にも観察された（図２Ｇ、２Ｈ、及び２Ｋ、並びに図９Ｂ）。有糸分裂面がＷｎｔ３ａ源に対して平行方向に配向されたた細胞において、幹細胞及び分化マーカーは、細胞の両半分で同様に分布していた（図２Ｅ、２Ｆ、２Ｉ、及び２Ｋ、並びに図９Ｃ）。分裂細胞のＯＰＮ：ＣＤＨ１３比の非対称性は、有糸分裂単一細胞及び有糸分裂後の細胞二倍体の両方において、ＯＰＮ：ＰＬＸＮＡ２及びＯＣＮ：Ｓｔｒｏ１の相対発現を定量化することによって、確認した（図１０Ｄ～１０Ｇ、図１１Ａ～１１Ｃ、及び図１２Ｂ～１２Ｇ）。
Ｗｎｔ３ａプラットフォームは、高いレベルの幹細胞マーカーＳｔｒｏ１及び低いレベルの骨形成細胞運命マーカーオステオカルシン（ＯＣＮ）を発現するｈＳＳＣを維持した。３Ｄゲルにおいて上方に遊走する細胞は、徐々にＳｔｒｏ１を下方調節し、ＯＣＮを上方調節した（図１２Ａ）（Lowndes, M. et al (2016)、上記）。近年では、骨髄から単離されたｈＳＳＣのプロテオミクス及び機能的分析は、カドヘリン－１３（ＣＤＨ１３）及びセマフォリン共受容体ＰＬＸＮＡ２を、新規なｈＳＳＣマーカーとして示している（Holley, R. J. et al (2015) Stem Cell Reports 4: 473-488）。ＣＤＨ１３、ＰＬＸＮＡ２、及び早期分化マーカーオステオポンチン（ＯＰＮ）のタンパク質発現プロファイルの評価（Zohar, R. et al (1998) Eur. J. Oral Sci. 106(1): 401-407）を、ＷＩＯＴＭを含む細胞において行った。Ｓｔｒｏ１と同様に、ＣＤＨ１３及びＰＬＸＮＡ２は、Ｗｎｔ３ａの近位側の細胞において高度に発現され、固定化されたＷｎｔ３ａから離れて遊走した細胞においては下方調節されていた。ＯＰＮは、ＯＣＮと類似の発現パターンを示した（図２Ａ～２Ｃ、及び図１２Ａ）。これらのマーカーにより、ＷＩＯＴＭの組成及び骨形成同一性がさらに確認される。ｈＳＳＣは、異なるレベルではあるが幹細胞及び分化マーカーを共発現するため、これらのマーカーの分布を、細胞分裂中にモニタリングした。Ｗｎｔ３ａに対して垂直方向に分裂するｈＳＳＣにおけるＣＤＨ１３及びＯＰＮの共染色は、Ｗｎｔ３ａ近位側半分が、Ｗｎｔ３ａ遠位側半分と比較して、高いレベルのＣＤＨ１３を有したことを示した。対照的に、ＯＰＮは、細胞のＷｎｔ３ａ遠位側半分において濃縮されていた（図２Ｄ及びＦ、並びに図９Ａ）。マーカーのこの分離パターンはまた、分裂終期及び分裂後にも観察された（図２Ｇ、２Ｈ、及び２Ｋ、並びに図９Ｂ）。有糸分裂面がＷｎｔ３ａ源に対して平行方向に配向されたた細胞において、幹細胞及び分化マーカーは、細胞の両半分で同様に分布していた（図２Ｅ、２Ｆ、２Ｉ、及び２Ｋ、並びに図９Ｃ）。分裂細胞のＯＰＮ：ＣＤＨ１３比の非対称性は、有糸分裂単一細胞及び有糸分裂後の細胞二倍体の両方において、ＯＰＮ：ＰＬＸＮＡ２及びＯＣＮ：Ｓｔｒｏ１の相対発現を定量化することによって、確認した（図１０Ｄ～１０Ｇ、図１１Ａ～１１Ｃ、及び図１２Ｂ～１２Ｇ）。
【0113】
これらの結果は、Ｗｎｔ３ａにより配向される単一ｈＳＳＣの分裂において、局在化されたＷｎｔ３ａはまた、細胞の対称性も破壊することを示す。局在化されたＷｎｔ３ａは、幹細胞運命マーカーと共分離するＷｎｔ／β－カテニン経路の構成成分及び極性タンパク質ａＰＫＣ ζの、細胞のＷｎｔ３ａ近位側半分への非対称分布を誘導する。細胞のＷｎｔ３ａ遠位側半分は、存在するとしても、ａＰＫＣ ζ、β－カテニン、及びＡＰＣのレベルは低く、早期骨形成分化マーカーが濃縮されている。分裂中期における細胞対称性の破壊により、細胞は、２つの別個の娘細胞を産生する非対称幹細胞分裂の準備が整う：Ｗｎｔ３ａ近位側ｈＳＳＣは、Ｗｎｔ源の近傍で、高いレベルの幹細胞マーカーを有し、高いレベルの骨形成分化マーカーを発現するＷｎｔ３ａ遠位側細胞は幹細胞ニッチから遠くに誘導される。まとめると、２Ｄ系における単一マウス胚性幹細胞（Habib, S. J. et al. (2013) Science 339, 1445-1448）から、３Ｄ培養物におけるヒト成体幹細胞まで、非対称細胞分裂（asymmetric cell division、ＡＣＤ）を配向する局在化されたＷｎｔ３ａタンパク質の役割に関する本発明者らの観察が、拡張された。重要なことに、局在化されたＷｎｔが、Ｗｎｔ近位側細胞の幹細胞同一性を維持することによって、培地から分化の合図に打ち勝つことができることが示されている。Ｗｎｔ機序と進化論的に保存された本質的な極性の合図との間の相互関係が、ＡＣＤの調節において協働することが明らかとなった。
【0114】
局在化されたＷｎｔ３ａタンパク質は、ｈＳＳＣのＡＣＤを作動させて、ＷＩＯＴＭを生成し、これが、ヒト骨ニッチの態様を再現し、骨修復の治療能力を有し得る。これを試験するために、ＷＩＯＴＭを骨欠損部位に送達するための生体模倣スキャフォールドを開発した。
【0115】
骨形成促進性インプラントのための生分解性Ｗｎｔ３ａバンデージの製造
骨膜は、寿命にわたって骨の周囲にある薄い線維細胞性の膜（７０～１５０μｍ）である（Squier, C.A. et al (1990) J. Anat. 171: 233-239）。これは、骨の成長、リモデリング、及び破砕修復を担う骨格系幹細胞及び骨芽細胞を含む多様な細胞組成を有する。この実験では、ＷＩＯＴＭが、幹細胞集団の長期維持及び成熟骨細胞の形成に寄与する能力に関して、インビボで骨膜の態様を再現し得るかどうかを試験した。
骨膜は、寿命にわたって骨の周囲にある薄い線維細胞性の膜（７０～１５０μｍ）である（Squier, C.A. et al (1990) J. Anat. 171: 233-239）。これは、骨の成長、リモデリング、及び破砕修復を担う骨格系幹細胞及び骨芽細胞を含む多様な細胞組成を有する。この実験では、ＷＩＯＴＭが、幹細胞集団の長期維持及び成熟骨細胞の形成に寄与する能力に関して、インビボで骨膜の態様を再現し得るかどうかを試験した。
【0116】
これまでの研究では、Ｗｎｔ３ａタンパク質を固定化するためにガラスプラットフォームを使用していたが、これは、インビボでの研究には好適ではない。この問題を克服するために、移植された細胞を保持することができ、それらの「幹細胞様」特性を維持することができ、移植された領域へのそれらの分布を制限することができる、Ｗｎｔ３ａ結合型バンデージを操作した。骨組織操作のためのスキャフォールド要件としては、生体適合性及び適切な時間スケールにわたる分解性が挙げられる（Alghazali, K. M. et al (2015) Drug Metab. Rev. 47: 431-454）。
【0117】
バンデージスキャフォールドを生成するために、臨床的に承認されているポリカプロラクトン（ＰＣＬ）ポリマーを使用して、溶媒蒸発によってフィルムを製造し、次いで、スキャフォールド表面を、酸素プラズマ処理した。この処理により、後続のアミノプロピル－トリエトキシシランを使用したＷｎｔ３ａタンパク質コンジュゲーション（Ｏ２／ＡＰＴＥＳ）のための一級アミン官能基が得られた（図１３Ａ）（Wulf, K. et al (2011) J. Biomed. Mater. Re. Part B Appl. Biomater. 98: 89-100）。Ｏ２／ＡＰＴＥＳ表面官能基化アプローチは、従来的なヘキサメチルジアミン（ＨＭＤＡ）アプローチよりも効率的であることが見出された（Zhu, Y. et al (2002) Biomacromolecules 3: 1312-1319）。これは、ＦＩＴＣ－イソチオシアネートと一級アミン官能基との間の共有結合での結合からのおよそ１０倍高いフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ、Fluorescein isothiocyanate）強度によって実証された（図１３Ｂ）。ＦＩＴＣ強度の標準曲線からの外挿により、１．０３１×１０６／μｍ２の利用可能な一級アミンが、Ｗｎｔ３ａリガンドに架橋され得ると推定された（図１３Ｃ及び１３Ｄ）。スキャフォールド上の一級アミン官能基は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で室温において８週間の保管にわたって安定なままであった（図１３Ｂ）。次に、精製したＷｎｔ３ａタンパク質を、これまでに説明されているグルタルアルデヒドタンパク質コンジュゲーションアプローチを使用して、共有結合によりコンジュゲートした（Mills, K. M. et al (2017)、上記;Lowndes, M. et al (2017)、上記;Lowndes, M. et al (2016)、上記）。αＷｎｔ３ａウエスタンブロットアッセイによって確認すると、Ｗｎｔ３ａタンパク質は、表面に効率的に結合し、未結合で系内に残るＷｎｔ３ａタンパク質は最小限であった（図３Ａ）。
【0118】
固定化されたＷｎｔ３ａタンパク質の機能的活性を、次いで、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路活性化を評価することによって、検証した。これを行うために、ＴＣＦ－ルシフェラーゼレポーター細胞系（ＬＳ／Ｌ）アッセイを使用し、ｈＳＳＣに、７ｘＴＣＦ－ｅＧＦＰ／ＳＶ４０－ｍＣｈｅｒｒｙレポーターを形質導入した（Lowndes, M. et al (2017)、上記;Lowndes, M. et al (2016)、上記）。ＬＳアッセイにより、活性Ｗｎｔ３ａタンパク質がコンジュゲートされた表面上において、Ｗｎｔ／１ β－カテニンシグナル伝達経路の活性化を示すルシフェラーゼ活性の有意な増加が明らかとなった（図３Ｂ）。ルシフェラーゼ活性は、不活性化Ｗｎｔ３ａ（ｉＷｎｔ３ａ）では有意に減少した（Habib, S. J. et al (2013)、上記）。Ｏ２／ＡＰＴＥＳ官能基化方法は、Ｗｎｔ３ａタンパク質への共有結合による結合に関して、ＨＭＤＡアプローチよりも効率的であった。これは、Ｏ２／ＡＰＴＥＳ－Ｗｎｔ３ａ－ＰＣＬフィルム上で培養されたＬＳ／Ｌ細胞において、ＨＭＤＡ－Ｗｎｔ３ａ－ＰＣＬフィルムと比較して、Ｗｎｔ／β－カテニン経路の有意に高い活性化倍数によって反映された（図３Ｂ）。
【0119】
固定化されたＷｎｔ３ａスキャフォールドの生物学的活性を、７ｘＴＣＦ－ｅＧＦＰ／ＳＶ４０－ｍＣｈｅｒｒｙレポーターを有するｈＳＳＣを使用して、検証した。このレポーターにおいて、ｅＧＦＰシグナルの産生は、７ＴＣＦの制御下にあり、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路活性化のシグネチャーである（Fuerer, C. & Nusse, R. (2010)、上記）。ｍＣｈｅｒｒｙは、細胞において構成的に発現される。これらのｈＳＳＣをスキャフォールドに播種すると、細胞は、用量依存性のｅＧＦＰ発現の増加を示した（２０ｎｇ対６０ｎｇ、３１．３％対４８．３％）（図３Ｃ及び３Ｄ）。共有結合で固定化された不活性Ｗｎｔ３ａタンパク質又は非シグナル伝達分子であるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の対照フィルムは、存在するとしても有意に低いレベルのｅＧＦＰを示した。
【0120】
示されるように、本発明者らは、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路を活性化し、インビボに送達することができ、移植目的でＷＩＯＴＭを生成することができる、生体適合性材料から作製されるＷｎｔ３ａバンデージの開発に成功した。
【0121】
Ｗｎｔ３ａバンデージ及びＷＩＯＴＭバンデージは、インビボでの骨修復を促進する
臨界サイズの頭蓋冠骨欠損は、放射線医学的及び組織学的分析によって骨修復を評価するための標準化された一様なモデル傷害として使用することが成功している（Gomes, P. S. & Fernandes, M. H. (2011) Lab. Anim. 45, 14-24; Samsonraj, R. M. et al (2010) PLoS ONE 5: e9370）。頭蓋冠は、主として膜内骨化を介して形成される扁平骨である。このプロセスにおいて、上にある骨膜、下にある硬膜、及び頭蓋縫合により、骨修復のための骨前駆細胞が提供される（Doro, D. H. et al (2017) Front Physiol. 8: 956）。これらの幹細胞／前駆細胞の部分集団は、Ｗｎｔ応答性であり、骨の形成及び修復に寄与する（Doro, D. H. et al (2017)上記;Zhao, H. et al (2015) Nat. Cell Biol. 17: 386-396; Maruyama, T. et al (2016) Nat. Commun. 7: 10526; Wilk, K. et al (2017) Stem Cell Reports 8: 933-946）。Ｗｎｔ３ａバンデージが、それ自体で内在性骨修復を刺激することができるかどうか、並びにインビボに組み込まれ、新しい骨の生成に寄与するＷＩＯＴＭバンデージの能力を、調査した。臨界癒合不全欠損部を、１３週齢の雌性重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにおいて頭頂骨の両側又は片側に、直径４ｍｍで作成した。１型コラーゲンの薄い層を、欠損部に付加し、Ｗｎｔ３ａバンデージ又はＷＩＯＴＭバンデージを、欠損部位の上に重ね、医療用接着剤でバンデージを固定した（図４Ａ）。３Ｄ骨形成コンストラクトの影響を判定するために、ＷＩＯＴＭバンデージは、インプラント時に２０，０００個未満の細胞を有するように制限した。同等の面積の健常な頭蓋冠骨において見出される細胞の数を考慮すると（１２．６ｍｍ２当たり合計およそ２７万個の細胞）、これは、外因性細胞のストリンジェントな導入を表す。このアプローチは、多数の移植細胞が過剰に導入されることに寄与し得る結果及びアーチファクトを回避する。外科手術の前に、すべての種類のバンデージは、マイコプラズマが存在しないことを確認した。骨修復は、８週間後に、マイクロコンピュータ断層（マイクロ－ＣＴ、micro-Computed Tomography）及び組織学的分析を使用して、試験した。
臨界サイズの頭蓋冠骨欠損は、放射線医学的及び組織学的分析によって骨修復を評価するための標準化された一様なモデル傷害として使用することが成功している（Gomes, P. S. & Fernandes, M. H. (2011) Lab. Anim. 45, 14-24; Samsonraj, R. M. et al (2010) PLoS ONE 5: e9370）。頭蓋冠は、主として膜内骨化を介して形成される扁平骨である。このプロセスにおいて、上にある骨膜、下にある硬膜、及び頭蓋縫合により、骨修復のための骨前駆細胞が提供される（Doro, D. H. et al (2017) Front Physiol. 8: 956）。これらの幹細胞／前駆細胞の部分集団は、Ｗｎｔ応答性であり、骨の形成及び修復に寄与する（Doro, D. H. et al (2017)上記;Zhao, H. et al (2015) Nat. Cell Biol. 17: 386-396; Maruyama, T. et al (2016) Nat. Commun. 7: 10526; Wilk, K. et al (2017) Stem Cell Reports 8: 933-946）。Ｗｎｔ３ａバンデージが、それ自体で内在性骨修復を刺激することができるかどうか、並びにインビボに組み込まれ、新しい骨の生成に寄与するＷＩＯＴＭバンデージの能力を、調査した。臨界癒合不全欠損部を、１３週齢の雌性重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにおいて頭頂骨の両側又は片側に、直径４ｍｍで作成した。１型コラーゲンの薄い層を、欠損部に付加し、Ｗｎｔ３ａバンデージ又はＷＩＯＴＭバンデージを、欠損部位の上に重ね、医療用接着剤でバンデージを固定した（図４Ａ）。３Ｄ骨形成コンストラクトの影響を判定するために、ＷＩＯＴＭバンデージは、インプラント時に２０，０００個未満の細胞を有するように制限した。同等の面積の健常な頭蓋冠骨において見出される細胞の数を考慮すると（１２．６ｍｍ２当たり合計およそ２７万個の細胞）、これは、外因性細胞のストリンジェントな導入を表す。このアプローチは、多数の移植細胞が過剰に導入されることに寄与し得る結果及びアーチファクトを回避する。外科手術の前に、すべての種類のバンデージは、マイコプラズマが存在しないことを確認した。骨修復は、８週間後に、マイクロコンピュータ断層（マイクロ－ＣＴ、micro-Computed Tomography）及び組織学的分析を使用して、試験した。
【0122】
インプラントなしの欠損部位、ｉＷｎｔ３ａバンデージがインプラントされたもの、又はｈＳＳＣとともに培養したｉＷｎｔ３ａバンデージがインプラントされたもののマイクロ－ＣＴ分析は、８週間の期間の後に無視できる程度の治癒を示した（図４Ｂ及び４Ｄ）。これら３つの対照は、組織化されていない様式で小さな表面石灰化組織が欠損面積に散乱していた（欠損部単独については６．６％、ｉＷＮＴ３Ａバンデージについては７．４％、ｉＷｎｔ３ａ－ＰＣＬ＋ｈＳＳＣについては７．９％の面積をカバー）。陰性対照とは対照的に、活性なＷｎｔ３ａバンデージで覆われた欠損部位は、インプラントの８週間後に、有意な骨のデノボ形成（平均で１７．６７％の面積をカバー）を示した。さらに、ＷＩＯＴＭバンデージは、さらにより顕著な骨再生を示した（２８．４％の面積をカバー、図４Ｃ及び４Ｄ）。高密度の石灰化を有する広い新しい骨の面積は、欠損した骨の縁部から中心までをカバーすることが見出された（図４Ｃ）。
【0123】
ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）並びにモバットのペンタクローム染色を使用したさらなる評価により、マイクロ－ＣＴ分析によって特定された欠損部位に新しく形成される骨の石灰化領域が、健康な骨のシグネチャーを示し、核が、長く、整列し、まばらに分布していると見られた。加えて、周囲の石灰化された組織は、線状痕を示し、有機マトリックスのコラーゲン繊維のアライメント及びコンピテントな層状骨の石灰化特徴を示した（図４Ｅ及び４Ｆ）。緻密に詰まった核とともに、欠損部にまたがって、結合／間質様組織もまた、観察された（図４Ｅ）。活性Ｗｎｔ３ａバンデージ及びＷＩＯＴＭバンデージで処理した欠損部において、新しく形成される骨は、欠損部位の中央部分及び欠損縁部と直接接続された状態の両方で存在しており、これは、修復及び再生のプロセスにおける新しい骨と既存の骨との骨融合を示す（図４Ｅ）。新しく形成される骨内の血管もまた、検出された（図４Ｆ）。
【0124】
ＷＩＯＴＭバンデージは、幹細胞集団を維持し、頭蓋冠骨欠損部における骨の形成に寄与する。
傷害部位におけるＷＩＯＴＭの組込み及び新しく形成される骨へのその寄与を、調査した。したがって、この実験は、宿主とインプラントされた細胞とを区別することができる細胞同一性マーカーの解剖学的分布を特徴付けることを目的としている。ｈＳＳＣマーカーＳｔｒｏ１及びＣＤＨ１３及びＰＬＸＮＡ２は、ＷＩＯＴＭインプラント範囲において高度に発現されることが見出された。これらのマーカーを発現する細胞は、新しく形成される骨に重なる結合／間質様組織、並びにその周囲の薄層を形成した（図１４Ａ～１４Ｃ、及び図１５Ａ）。宿主骨膜におけるＳｔｒｏ１染色は、最小限であり、可能性としては非特異的であり、主としてもっとも外側の細胞層の端に限定されていた（図１４Ｂ）。縫合線においては、バックグラウンド染色しか確認されなかった（図１５Ｃ）。
傷害部位におけるＷＩＯＴＭの組込み及び新しく形成される骨へのその寄与を、調査した。したがって、この実験は、宿主とインプラントされた細胞とを区別することができる細胞同一性マーカーの解剖学的分布を特徴付けることを目的としている。ｈＳＳＣマーカーＳｔｒｏ１及びＣＤＨ１３及びＰＬＸＮＡ２は、ＷＩＯＴＭインプラント範囲において高度に発現されることが見出された。これらのマーカーを発現する細胞は、新しく形成される骨に重なる結合／間質様組織、並びにその周囲の薄層を形成した（図１４Ａ～１４Ｃ、及び図１５Ａ）。宿主骨膜におけるＳｔｒｏ１染色は、最小限であり、可能性としては非特異的であり、主としてもっとも外側の細胞層の端に限定されていた（図１４Ｂ）。縫合線においては、バックグラウンド染色しか確認されなかった（図１５Ｃ）。
【0125】
わずかなＣＤＨ１３及びＰＬＸＮＡ２染色が、宿主の骨膜及び縫合線において観察された（図１４Ａ、１５Ａ、及び１５Ｃ）。ヒト及びマウスＣＤＨ１３及びＰＬＸＮＡ２は、それぞれ、９４．８％及び９６．６％のタンパク質配列同一性を共有し、したがって、抗体は、両方の種のタンパク質を認識すると見られる。これらの結果は、ＣＤＨ１３及びＰＬＸＮＡ２もまた、マウス頭蓋冠の幹細胞コンパートメントにおいて発現されることを示唆する。
【0126】
早期分化マーカーＯＰＮが、新しく形成される骨及び宿主骨において、並びに低い程度で骨膜及び縫合線において、発現された（図１５Ａ及び１５Ｃ）。骨前駆体コンパートメントの骨縁部に沿ったＯＰＮのより高度な沈着は、骨芽細胞及び骨細胞が、マトリックスリモデリング及び骨の増大を誘導していたことを示す（Morinobu, M. et al (2003) J. Bone Miner. Res. 18: 1706-1715; Tsai, T.-L. & Li, W.-J. (2017) Stem Cell Reports 8, 387-400）。
【0127】
骨形成分化マーカーであるオステオカルシン（ＯＣＮ）は、新しく形成される骨において豊富に発現されたが、幹細胞コンパートメントにおいても発現された（図１５Ａ及び１５Ｃ）。これらの結果は、オステオカルシンが後期骨芽細胞から成熟骨細胞への発達の間に産生されるというこれまでの観察と一致する（Bonewald, L.F. (2011) J. Bone Miner. Res. 26: 229-238）。ＯＣＮは、分泌タンパク質であり、したがって、石灰化した組織だけに局在化する可能性は低い。
【0128】
陰性対照及びアイソタイプ対照により、免疫組織化学的染色の特異性を確認する（図１５Ｄ）。
【0129】
免疫組織化学は、新しく形成される骨の構造及び組成に関して定性的見識を提供する。しかしながら、これらの実験において使用される幹細胞及び分化マーカーは、ヒト及びマウス細胞を特定することができる。したがって、新しく形成される骨へのＷＩＯＴＭの寄与を定量するためには、ヒト特異的マーカーが必要である。Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路は、ｈＳＳＣの維持及びＷＩＯＴＭの形成に必須であり（Lowndes, M. et al (2016)、上記）、インビボでの骨修復を統制する（Doro, D.H. et al (2017)、上記; Zhao, H. et al (2015)、上記; Maruyama, T. et al (2016)、上記; Wilk, K. et al (2017)、上記）。骨再生に対するＷＩＯＴＭインプラントの影響をさらに解明するために、７ｘＴＣＦ－ｅＧＦＰ／／ＳＶ４０－ｍＣｈｅｒｒｙレポーターを有するｈＳＳＣを使用して、ＷＩＯＴＭバンデージを生成した。構成的に発現されるｍＣｈｅｒｒｙは、系統追跡目的で、ヒト細胞の特定を可能にする。分析の一部において、ヒトβ２－ミクログロブリン（ｈβＭＧ２）を、マーカーとして利用した。注目すべきことに、ｈβＭＧ２の染色は、ｍＣｈｅｒｒｙとのオーバーラップを示し、ヒトマーカーの特異性を示した（図１６Ｃ）。
【0130】
試料組織の免疫蛍光画像を、同じ試料内の対照組織シグナル強度に基づいて閾値処理する方法を利用して、インサイチュでの組織切片における陽性細胞の特性が可能となった（図１６Ａ及び１６Ｂ）。新しく形成される骨組織の範囲のこの免疫蛍光分析により、スクレロスチン（ＳＯＳＴ）陽性細胞が、健常な頭蓋冠骨と同等の密度のものであったことが示された（図５Ａ及び５Ｃ～５Ｆ、図１６Ａ）。ＳＯＳＴは、石灰化の進行時に成熟骨細胞において発現されるマーカーであり（Fan, J. et al. (2015) Tissue Eng. Part A 21, 2053-2065）、そのため、成熟骨の主要な細胞成分を表す。石灰化機能に加えて、スクレロスチンはまた、骨芽細胞から骨細胞への移行時に重要なＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路におけるアンタゴニストとしての機能を果たすことも見出された（Ramachandran, K. & Gouma, P.-I. (2008) Recent Pat. Nanotechnol. 2, 1-7）。
【0131】
系統追跡により、ＷＩＯＴＭバンデージ処置では、スクレロスチン（ＳＯＳＴ）陽性細胞の大部分が、ヒト起源のものであったことが明らかとなった。欠損部の中央及び縁部における新しい骨の範囲内で、ヒトｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞は、それぞれ、総ＳＯＳＴ＋集団（ＲＯＩ１及びＲＯＩ２、図５Ｂ）の３９．６％及び４１．６％を占め、新しい骨において全体平均で３５．９％がヒト起源ＳＯＳＴ＋細胞であった（図５Ｃ及び５Ｄ）。インプラントされたヒト細胞は、宿主骨又は縫合線の近傍組織には検出されなかった（図５Ｄ、図６Ｃ）。
【0132】
対照的に、不活性Ｗｎｔ３ａバンデージで培養し、コラーゲンゲルで覆われたｈＳＳＣは、新しい骨の最小範囲に良好に組み込まれなかった。これらの試料において、ＳＯＳＴ＋細胞のヒトマーカーｈβＭＧ２との共染色によって特定すると、ヒト細胞は、総ＳＯＳＴ＋細胞の６．５％しか構成しない（図５Ｂ、５Ｃ、及び５Ｆ）。これらの結果は、インビボにおける生存、組込み、及び骨修復への寄与において、幹細胞単独のインプラントと比べた完全な骨形成構造の重要性を強調する。この理由により、新しい骨の成長を支持する結合組織に対して同等の分析を行うことは重要であった。
【0133】
ＷＩＯＴＭにインプラントされたｈＳＳＣは、Ｗｎｔ／β－カテニン経路が活性化されると、ｅＧＦＰを発現した（図３Ｃ及び３Ｄを参照されたい）。Ｗｎｔ応答性細胞は、主として、固定化されたＷｎｔ３ａバンデージと緊密に接触し、それらは、近位側領域においては総細胞の２５．６％（近位側ヒト細胞の６３．８％）を占めるが、遠位側領域においては総細胞の３．６％（遠位側ヒト細胞の３２．１％）のみを占める（図６Ａ及び６Ｂ、図１６Ｂ）。全体として、インプラントの８週間後に、結合／間質様組織全体に位置する細胞のうちの１８．５％が、ヒト起源のものであり、ｍＣｈｅｒｒｙを発現した。これらのヒト細胞のうちの平均４５．７％が、ｅＧＦＰ発現によって特定すると、Ｗｎｔ応答性細胞であった（５６０個のヒト細胞中２５６個、３匹の動物から得られた切片にわたって計数）。
【0134】
次に、結合／間質様組織における幹細胞マーカーを発現する細胞の分布を、調査した。組織内のＣＤＨ１３＋細胞のパーセンテージは、固定化された活性Ｗｎｔ３ａの近位側で有意に高かった：Ｗｎｔ３ａバンデージにおいては４９．５％、ｉＷｎｔ３ａ－バンデージ＋ｈＳＳＣにおいては２７．１％のみ（図６Ｄ及び６Ｆ～６Ｈ）。ＣＤＨ１３＋細胞のこの比率は、ＷＩＯＴＭバンデージではさらに増加し、合計６６．３％がＣＤＨ１３陽性近位側細胞であった。細胞のうちの２２．６％は、ヒトＣＤＨ１３＋細胞であった（図６Ｃ、６Ｅ、及び６Ｈ）。ヒトＣＤＨ１３＋細胞はまた、ＷＩＯＴＭバンデージの中央及び遠位側領域においても検出され、これはまた、Ｗｎｔ３ａバンデージ又はｈＳＳＣを有するｉＷｎｔ３ａバンデージと比較して、総ＣＤＨ１３＋細胞の濃縮も有した。ＰＬＸＮＡ２＋細胞の類似の分布が、ＷＩＯＴＭバンデージにおいて見られた（図１７Ｂ及び１７Ｃ）。
【0135】
細胞密度に関して、この結合／間質様組織（バンデージ処置の種類に関係なく）は、内在性ＳＳＣ／前駆体の源である骨膜及び縫合線間葉に類似であることが見出された（ＤＡＰＩ、白色のバー；図６Ｃ及び６Ｄ、図１７Ａ）。しかしながら、Ｗｎｔ３ａ及びＷＩＯＴＭバンデージ処置における結合／間質様組織は、骨膜又は縫合線における宿主源のＣＤＨ１３＋細胞（約２００，０００／ｍｍ３未満）と比較して、有意に高いＣＤＨ１３＋細胞密度を有した（それぞれ、約５００，０００／ｍｍ３及び４００，０００／ｍｍ３）。このＣＤＨ１３＋細胞の密度の増加は、ｈＳＳＣをインプラントしたｉＷｎｔ３ａバンデージでは見られず（約２００，０００／ｍｍ３）、これは、宿主骨膜と類似であった（図６Ｄ、図１７Ａ）。活性及び不活性細胞バンデージ間でのＣＤＨ１３＋細胞の密度の増加の有意な差が、ｈＳＳＣマーカーＳｔｒｏ１の分析においても見られた（図１７Ｄ及び１７Ｅ）。すべての結果を考慮すると、本発明者らのデータは、Ｗｎｔ３ａバンデージが、結合／間質様組織において幹細胞マーカーを発現する細胞集団を増加させることを示唆する。ＷＩＯＴＭバンデージは、組織にヒト細胞を供給することによって、この増加にさらに寄与する。
【0136】
ＰＬＧＡバンデージへのＷｎｔの固定化
ＷＩＯＴＭバンデージのフィルムとしてのＰＬＧＡの有効性もまた、評価した。方法は、上記のように設定されており、フィルムとしてＰＣＬを有するＷＩＯＴＭバンデージに使用されたものと同じである。
ＷＩＯＴＭバンデージのフィルムとしてのＰＬＧＡの有効性もまた、評価した。方法は、上記のように設定されており、フィルムとしてＰＣＬを有するＷＩＯＴＭバンデージに使用されたものと同じである。
【0137】
図７Ａに示されるように、１３週齢の雌性ＳＣＩＤマウスにおいて、直径４ｍｍの臨界サイズの片側頭蓋冠骨欠損部の骨修復の面積パーセンテージを、８週間後に定量化した。孔を開けた欠損部を、コラーゲンで覆った。欠損のみの動物（ｎ＝１４匹）において、さらなる処置は与えなかった。ＰＬＧＡ－ＷＩＯＴＭ処置動物（ｎ＝１０匹）においては、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）Ｗｎｔ３ａバンデージを、ｈＳＳＣとともに播種し、移植前にインビトロで３Ｄ骨形成マトリックスにおいて７日間培養して、Ｗｎｔ誘導型ヒト骨形成組織モデル（ＷＩＯＴＭ）を形成した。
【0138】
図７Ｂは、外科手術の８週間後の頭蓋冠骨欠損部のマイクロコンピュータ断層撮影（マイクロＣＴ）スキャンの代表的な画像を示す。黄色破線の楕円形は、もともとも直径４ｍｍの欠損サイズを表す。
【0139】
図７Ｃは、ＰＬＧＡバンデージ又は組織培養プラスチックに播種した場合の７ｘＴＣＦ－ルシフェラーゼ構築物を有するＷｎｔ／β－カテニンレポーターＬＳＬ細胞によって測定した、ルシフェラーゼ活性の変化倍数を示す。条件からの読み取りは、次の通りである：Ｗｎｔ３ａ－ＰＬＧＡ（６０ｎｇのインプット、Ｗｎｔ３ａをＰＬＧＡに固定化）、培地対照（組織培養プラスチック及び標準的な培養培地）、並びに可溶性Ｗｎｔ３ａ（組織培養プラスチック、及び４５ｎｇの可溶性Ｗｎｔ３ａを補充した培地）。すべての読み取りは、ＢＳＡ－ＰＬＧＡ（ウシ血清アルブミンをＰＬＧＡに固定化）に対して正規化し、結果は、３回の独立した実験からプールし、ｎ＝９匹から得られたデータを示す。
【0140】
図７Ｄは、６０ｎｇのＷｎｔ３ａ（固定化ステップにおけるインプット量と同等）、未結合Ｗｎｔ３ａ（固定化後に回収）、洗浄液１～３、及びＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）のみを示す、代表的なウエスタンブロットである。
【0141】
結果は、ＰＬＧＡバンデージへのＷｎｔの固定化、並びにＷｎｔレポーター細胞系におけるＷｎｔ／ベータ－カテニン経路の活性化の成功を示す。ＷＩＯＴＭ－ＰＬＧＡバンデージは、８週間後に、臨界サイズの頭蓋冠骨欠損部において骨修復を有意に改善した。ＰＣＬではなくＰＬＧＡを使用する１つの利点は、ＰＬＧＡが、約２８日間のインビボ生分解性を有することである。対照的に、ＰＣＬの生分解性は、数年間継続し得る。結果として、ＰＬＧＡは、バンデージの短い処置又は高速な分解のいずれかを必要とする用途に好適である。
【0142】
すべてを合わせると、これは、ヒトＳＳＣ集団の維持と、骨修復を促進するマウス骨欠損におけるヒト起源の分化骨形成細胞のカスケードとを初めて同時に示す。これらの発見はまた、Ｗｎｔ３応答性幹細胞を動員及び増大し、同時に、成熟及び機能性骨細胞を生成することによって骨再生を統制することにおける、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の対照的な役割をさらに強調する。
【0143】
結果は、Ｗｎｔ３ａバンデージが、対照バンデージと比較して、内在性骨修復の増強を促進させたことを示す。興味深いことに、ＷＩＯＴＭバンデージは、ヒト成熟骨細胞を含有する追加の新しい骨を形成すると同時に、Ｗｎｔ応答性幹細胞集団を維持することによって、骨修復をさらに改善した。
【0144】
結果はまた、局在化されたＷｎｔ３ａが、３ＤにおいてｈＳＳＣの非対称細胞分裂（ＡＣＤ）を誘導し、これが、ＷＩＯＴＭ形成を作動させることも示した。このプロセスにおいて、分裂中期の間、ｈＳＳＣは、β－カテニン及びＡＰＣ、並びに極性タンパク質非定形プロテインキナーゼＣ ζ（ａＰＫＣ ζ）を、細胞のＷｎｔ３ａ近位側半分に分極させ、有糸分裂面を、Ｗｎｔ３ａ源に対して垂直方向に配向させる。さらに、幹細胞マーカーＣＤＨ１３は、細胞のＷｎｔ３ａ近位側半分に濃縮されており、一方で、早期分化タンパク質マーカーオステオポンチン（ＯＰＮ）は、細胞のＷｎｔ３ａ遠位側半分に濃縮されていたことが見出された。この分裂の結果は、Ｗｎｔ３ａ近位側細胞がｈＳＳＣ細胞運命を有し、Ｗｎｔ３ａ遠位側細胞が骨形成分化の傾向を受け、３Ｄゲル内で局在化される。
【0145】
考察
非対称細胞分裂（ＡＣＤ）は、細菌からヒトまで、進化論的に保存されている機序である（Pereira, G. & Yamashita, Y.M. (2011) Trends Cell Biol. 21: 526-533）。このプロセスは、多様な細胞型の生成を確実にし、これは、環境又は発達への適合、多細胞生物における組織のパターン形成及び維持に必須である。ＡＣＤはまた、組織における幹細胞の数を調節する。有糸分裂中に、幹細胞は、細胞運命決定基を分割し、幹細胞数を維持し、同時に、分化した娘細胞が生成され、増殖するように、有糸分裂の紡錘体を配向する。
非対称細胞分裂（ＡＣＤ）は、細菌からヒトまで、進化論的に保存されている機序である（Pereira, G. & Yamashita, Y.M. (2011) Trends Cell Biol. 21: 526-533）。このプロセスは、多様な細胞型の生成を確実にし、これは、環境又は発達への適合、多細胞生物における組織のパターン形成及び維持に必須である。ＡＣＤはまた、組織における幹細胞の数を調節する。有糸分裂中に、幹細胞は、細胞運命決定基を分割し、幹細胞数を維持し、同時に、分化した娘細胞が生成され、増殖するように、有糸分裂の紡錘体を配向する。
【0146】
幹細胞の自己再生は、外部シグナルに依存し、これには、Ｗｎｔファミリーのものが含まれることが多い（Garcin, C. L. & Habib, S. J. (2017)、上記）。Ｗｎｔタンパク質は、局所的に分泌され、応答性細胞の片側に提示されることが多い（Mills, K. M. et al (2017)、上記）。線虫（C. elegans）において、Ｗｎｔタンパク質のこの局在化作用は、胚性及び成体細胞において非対称細胞分裂を誘導する（Goldstein, B. et al (2006) Dev. Cell 10: 391-396）。インビボでの状況を模倣するために、本発明者らは、これまでに、Ｗｎｔを、共有結合により合成表面に固定化し、哺乳動物幹細胞にそれらを導入している（Lowndes, M. et al (2017)、上記）。局在化されたＷｎｔ３ａは、２Ｄ培養物において、単一マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）のＡＣＤの配向を誘導することができる（Habib, S. J. et al (2013)、上記）。この研究においては、この観察が拡張されており、本発明者らは、局在化されたＷｎｔ３ａが、分化を支持する培地において３Ｄ環境で、成体ｈＳＳＣのＡＣＤの配向を誘導することができることを示した。培地全体に添加された可溶性Ｗｎｔ３ａタンパク質ではなく、このＷｎｔ３ａのｈＳＳＣに対する局在化された指向性作用が、ＷＩＯＴＭ形成に必須である（Lowndes, M. et al (2017)、上記）。結果は、組織形成及びパターン形成に必須のプロセスである、異なる細胞運命を有する２つの娘細胞を生成することができる細胞対称性を破壊することにおける局在化されたＷｎｔ３ａの進化論的に保存された役割を強調する（Mills, K. M. et al (2017)、上記）。
【0147】
３ＤスキャフォールドにおけるＷｎｔ３ａに誘導されるｈＳＳＣのＡＣＤのプロセスにおいて、分裂中期の細胞は、有糸分裂の軸をＷｎｔ３ａ源の方へと配向させる。β－カテニン及びＡＰＣ（Ｗｎｔ３ａ／β－カテニン経路の成分）、細胞極性タンパク質ａＰＫＣζ、並びに幹細胞マーカーＣＤＨ１３及びＰＬＡＸＮ２は、分裂細胞のＷｎｔ３ａ近位側半分に濃縮されている。対照的に、細胞のＷｎｔ３ａ遠位側半分は、高いレベルの早期分化マーカーＯＰＮ及びＯＣＮを有する。このＷｎｔに媒介される分裂細胞の対称性の破壊は、１つのＷｎｔ３ａ近位側ｈＳＳＣ細胞と、ゲル内で局在化され、Ｗｎｔ３ａ源から離れて分化を開始する１つのＷｎｔ３ａ遠位側細胞とを生成する。重要なことに、活性Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達が、ＷＩＯＴＭにおける幹細胞コンパートメントの維持に必要である。本発明者らは、ＩＷＲによって経路を遮断することが、Ｓｔｒｏ１の発現の喪失をもたらし、ＷＩＯＴＭ形成を重度に損なうことを、これまでに示している（Lowndes, M. et al (2016)、上記）。
【0148】
Ｗｎｔに誘導されるｈＳＳＣのＡＣＤは、高い空間的／時間的分解能で、ヒト骨細胞形成の初期段階に関与する分子機序及びタンパク質ネットワークを分析する固有の機会を提供する。
【0149】
最初の観察により、ＣＤＨ１３及びａＰＫＣζの上流の調節因子として、局在化されたＷｎｔが特定された。古典的なカドヘリン（ＣＤＨ１３を含む）及びβ－カテニンは、接着結合上に複合体を形成し得る。これらの複合体はまた、Ｗｎｔに媒介されるシグナル伝達に関与するβ－カテニンの利用可能性を調節し得る。古典的カドヘリンにおける機能変異の喪失は、細胞接着の減少、及び細胞運動性の増加をもたらす（Nelson, W. J. & Nusse, R. (2004) Science 303: 1483-1487）。興味深いことにＷｎｔ３ａ近位側ｈＳＳＣは、高いレベルのβ－カテニン及びＣＤＨ１３を受け継ぎ、一方でＷｎｔ３ａ遠位側の細胞は、低いレベルのβ－カテニン及びＣＤＨ１３を有し、ゲルへと上方に移動する。
【0150】
ａＰＫＣζタンパク質は、ＰＡＲ複合体の進化論的に保存された機序の成分である。多くの生物及び発生段階において、この機序は、外部の合図から独立して、細胞極性及びＡＣＤを調節するように作用する（Rafiq, Q. A. et al (2013) Biotechnol. Lett. 35, 1233-1245）。局在化されたＷｎｔが、ａＰＫＣζの位置を制御するという本明細書に提示されている見解は固有であり、細胞非対称性を制御する両方の機序の間の新しい相互関係を追求する根拠を提供する。
【0151】
加えて、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）シグナル伝達は、骨形成分化及び骨の形成を調節する（Lee, S. et al (2014) BMC Cell Biol. 15: 42; Jeong, H. M. et al (2012) Biochim. Biophys. Acta 1823: 1225-1232）。ａＰＫＣζを含むＰＫＣタンパク質のいくつかのアイソフォームは、転写因子Ｍｓｘ２と相互作用し、そのタンパク質レベルを安定させる（Jeong, H. M. et al (2012)、上記）。Ｍｓｘ２は、骨形成性転写因子Ｒｕｎｘ２、Ｄｌｘ３、及びＤｌｘ５の転写活性を抑制する（Yoshizawa, T. et al (2004) Mol. Cell Biol. 24: 3460-3472; Zhang, H. et al (1996) Proc. Nat. Acad. Sci. 93: 1764-1769）。Ｍｓｘ２はまた、ＤＫＫ１発現を低減し、続いて、Ｗｎｔシグナル伝達を増強させることが示されている（Cheng, S.-L. et al (2008) J. Biol. Chem. 283: 20505-20522）。
【0152】
骨再生を統制することにおけるＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の役割は、様々なモデルにおいて十分に文書化されている（Im, J.-Y. et al (2013) Lab Anim. Res 29, 196-203; Brennan, M. A. et al (2014) Stem Cell Res. lTher. 5, 114-15; Nakahara, H. et al (2009) Transplantation 88, 346-353; Garcin, C. L. & Habib, S. J. (2017) Results Probl. Cell Differ. 61, 323-350; Mills, K. M. et al (2017) Open Biology 7, 170140; Lowndes, M. et al () Nat Protoc. 12, 1498; Lowndes, M. et al (2016) Stem Cell Reports 7, 126-137; Nimni, M. E. et al (1987) J. Biomed. Mater. Res. 21, 741-771; Habib, S. J. et al (2013) Science 339, 1445-1448; Schlessinger, K. et al (2007) J. Cell Biol. 178, 355-361）。Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の重要な負の調節因子としての機能を果たす、Ａｘｉｎ２発現における異常は、マウスモデルにおいて、前駆細胞の増殖を加速させ、早期分化を引き起こすことが見出されている（Mills, K. et al (2017) Open Biology 7, 170140; Habib, S. J. et al. (2013) Science 339, 1445-1448）。マウスモデルにおける系統追跡により、傷害後のＷｎｔ誘導型骨形成性再生が説明され、ここでは、縫合線間葉に存在するＷｎｔ応答性幹細胞集団が、増大及び分化を作動させることにおける鍵となることが見出される（Im, J.-Y. et al (2013)、上記; Brennan, M. A. et al (2014)、上記）。したがって、骨再生を促進することにおけるＷｎｔタンパク質の治療的有効性を調べるための薬理学的研究が、開発された。
【0153】
リポソーム小胞によって傷害を受けた脛骨に送達されるＷｎｔ３ａは、骨修復を改善することが特定された。μＣＴデータは欠如しているが、著者らは、Ｗｎｔ３ａ－リポソーム処置が、骨格前駆細胞の増殖を刺激し、したがって、骨成長に必須である骨芽細胞分化を加速させたことを示す（Schlessinger, K. et al (2007)、上記）。しかしながら、このタンパク質に基づくアプローチは、骨成長を促進及び増強させるであろうＷｎｔ応答性細胞への到達を、傷害部位におけるリポソームの非標的化拡散に依存する。グリコーゲン－シンターゼ－キナーゼ－３β（ＧＳＫ３β）及びペルオキシソーム増殖因子－活性化受容体－γ（ＰＰＡＲγ）を阻害することによって、骨形成に有利になるようにＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路を調節することを目的とする他の小分子アプローチは、骨誘導において有効であることが見出されている（Lowndes, M. et al (2016)、上記; Inaba, M. & Yamashita, Y. M. (2012) Cell Stem Cell 11, 461-469）。これらの分子は、欠損部に物理的に架橋する多孔質骨伝導性スキャフォールドを用いて送達されることが多いが、機械的特性が低い網状で多孔質の骨組織の形成をもたらす。有望な候補ではあるが、小分子は、非特異的であることが多く、他のシグナル伝達経路を活性化又は阻害する可能性がある（Lee, K. et al (2005) The Spine Journal; Holley, R. J. et al (2015) Stem Cell Reports 4, 473-488）。
【0154】
可溶性薬物送達を使用した薬理学的アプローチは、欠損部位において網状の骨を生成することによって、有望な治療効果を示しているが、これはまた、生物安全性の問題も呈する。例えば、可溶性薬物送達アプローチは、所望される作用を達成するために、傷害を受けた部位への複数回の注射を必要とし得、感染の危険性が増加する。これらの薬剤の特異性及び局在化作用の欠如は、付帯的損傷、例えば、望ましくない細胞集団の応答の活性化／抑制をトリガーする可能性がある。結果として、標的組織のアーキテクチャ及び機能、並びに／又は拡散により薬物を受容し得る隣接する組織は、負の影響を受ける可能性がある。例えば、Ｗｎｔシグナル伝達の過剰活性化は、骨体積の増加、異常な骨密度、及び骨の病理学的肥厚をもたらし得る（Zohar, R. et al (1998) Eur. J. Oral. Sci. 106 Suppl. 1, 401-407; Junaid, A. et al (2007) Am. J. Physiol., Cell Physiol. 292, C919-26; Squier, C. A. et al (1990) J. Anat. 171, 233-239; Hutmacher, D. W. & Sittinger, M. (2003) Tissue Eng. 9 Suppl. 1, S45-64）。
【0155】
腫瘍原性もまた、がんを罹患しやすい患者における懸念である。多くのがんにおいて、腫瘍原性細胞は、シグナル伝達カスケードを活性化するＷｎｔ／β－カテニン経路の下流エフェクターにおける変異を有する（Alghazali, K. M. et al (2015) Drug Metab. Rev. 47, 431-454）。拡散によってこれらの細胞に到達し得、さらにＷｎｔ／β－カテニン経路を活性化し得る薬剤の投与は、がんの進行を増強させ得る。したがって、制御され、標的細胞に局在化されるＷｎｔ／β－カテニン経路の活性化を引き起こすことができる治療剤の標的化送達が、副作用を制限しながら治癒を促進するためには必須である。本発明のＷｎｔ３ａパッチは、この基準を達成する。
【0156】
本発明のＷｎｔ３ａパッチは、共有結合による結合を使用して、Ｗｎｔ３ａタンパク質をフィルムに固定することによって、骨治療作用を送達する。この操作設計は、自発的なタンパク質の漏出の危険性、並びにそれに続く他のシグナル伝達経路の活性化、望ましくない細胞集団に影響を及ぼすこと、及び発癌性の誘導という副作用を軽減し、それによって、トランスレーショナルな適用の可能性を増加させる。
【0157】
ＰＣＬのインビボでの分解速度は、遅く、完全に分解されるまで数年を必要とし得る（Yang, Y. & Haj, El, A. J. (2006) Expert Opinion on Biological Therapy 6, 485-498）。本発明において、ＰＣＬは、欠損部位の上に重ねられ、形成される骨には組み込まれないため、必要があれば、修復後に用意に除去することができる。代替的には、より高速な分解速度を有する他の種類の生体適合性材料を、Ｗｎｔ３ａの固定化及びインビボでの送達のためのスキャフォールドとして使用してもよい。例えば、ポリ乳酸－コ－グリコール酸（ＰＬＧＡ）のインビボでの分解速度は、１ヶ月程度と短くあり得る（Malikmammadov, E. et al (2018) J. Biomaterials Science, Polymer Edition 29, 863-893）。
【0158】
複数のシグナル伝達経路のリガンドが、骨修復を促進することが示されており、もっとも強力なのは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ、Bone morphogenic protein）である（Wulf, K. et al (2011) J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 98, 89-100）。本発明のＷｎｔパッチを使用するナノ規模の量のＷｎｔタンパク質と比較して、現在公知のアプローチは、有効な骨修復を促進するためには生理学的用量を上回るＢＭＰ（μｇ～ｍｇ）を投与する。残念なことに、これらのアプローチは、コンパートメント症候群及び進行性ミオパシー及び従属栄養性骨化を含む、多数の望ましくない副作用を有し、いくつかの事例は、生命を脅かす併発症をもたらす（Zhu, Y. et al (2002) Biomacromolecules 3, 1312-1319; Fuerer, C. & Nusse, R. (2010) PLoS ONE 5, e9370）。加えて、骨修復のための無細胞アプローチを調査した報告されている研究は、野生型若齢マウスに対して行われていた（Gomes, P. S. & Fernandes, M. H. (2011) Lab. Anim. 45, 14-24）。若齢マウスの骨格は、完全に成熟しておらず、本研究の焦点である成体動物と比較して、改善された骨治癒能力を有する（Samsonraj, R. M. et al (2017) Tissue Eng. Part C Methods 23, 686-693; Doro, D. H. et al (2017) Front Physiol. 8, 956）。さらに、本研究では、免疫不全マウスを使用しており、これは、治癒にさらなる障害を課す。ＳＣＩＤマウスは、骨芽細胞成熟及び後期石灰化を含む骨形成分化及び活性を調節する適応免疫応答が欠如している（Zhao, H. et al (2015) Nat. Cell Biol. 17, 386-396）。本明細書に提供される結果は、これらの鍵となる合図の不在時であっても、本発明のＷｎｔ３ａパッチが、依然として、有意な内在性骨修復を開始させることができることを示す。加えて、多孔質骨伝導性スキャフォールドを使用する他のアプローチによって産生される組織化されていない網状骨とは異なり、本発明のＷｎｔ３ａパッチの結果として産生される新しく形成される骨は、組織学的に、健常な骨と同等である。
【0159】
多くの事例において、内在性修復は、老体の患者、又は骨粗鬆症、糖尿病、及びがんを含む医学的共存疾患を有するもの、又は外傷後に特定の再構成手術を必要とする患者などにおいては、骨欠損を治癒するのに十分ではない（Wulf, K. et al (2011)、上記）。細胞に基づく治療法は、この制限に取り組む可能性を有する。しかしながら、この分野における主要な課題は、ｈＳＳＣを含む外因性幹細胞、及びそれらの子孫をインビボで維持することである。欠損部位における先進的な３Ｄ骨誘導スキャフォールド内での数百万個の外因性ｈＳＳＣの移植でさえも、長期生存率を改善しなかったことが、いくつかの報告により示されている。これは、傷害部位の不利な環境に帰属していた（Maruyama, T. et al (2016) Nat. Commun. 7, 10526; Wilk, K. et al (2017) Stem Cell Reports 8, 933-946）。本発明者らは、幹細胞単独ではなく、幹細胞を骨形成細胞とともに含む骨形成コンストラクトであれば、傷害部位に組み込まれる改善された能力を有するであろうと仮説を立てた。３Ｄ骨形成性コンストラクトは、骨ニッチの態様を緊密に模倣し、細胞の生存及び組込みを改善するはずであることがその根拠であった。
【0160】
これを調査するために、Ｗｎｔ誘導型ヒト骨形成組織モデル（ＷＩＯＴＭ）を、操作されたＷｎｔ３ａパッチ上に生成した。この仮説及び外因性ヒト細胞に取り組むために、パッチは、骨欠損の範囲及び同じ傷害モデルを使用した他の報告されている細胞療法と比較して、比較的低い細胞数である２０，０００個未満の細胞を含むように操作した（Krause, U. et al (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4147-4152; Zeitouni, S. et al (2012) Sci. Transl. Med. 4, 132ra55-132ra55; Hyun, J. et al (2013) Stem Cells Transl. Med. 2, 690-702; Tsai, T.-L. & Li, W.-J. (2017) Stem Cell Reports 8, 387-400; Levi, B. et al (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20379-20384; Brennan, M. A. et al (2014) Stem Cell Res. Ther. 5, 114-15; Nakahara, H. et al (2009) Transplantation 88, 346-353; Levi, B. et al (2010) PLoS ONE 5, e11177; Lough, D. et al (2017) Plast. Reconstr. Surg. 139, 893-905; Fan, J. et al (2015) Tissue Eng. Part A 21, 2053-2065）。骨伝導性材料によって作動される受動的宿主細胞遊走からの再生寄与を低減させるために、骨芽細胞の遊走に好ましいナノ線維性表面をもたらすエレクトロスピニングと比較して比較的平滑な表面をもたらす成形方法を使用して、ＰＣＬフィルムを生成した（Ramachandran, K. & Gouma, P.-I. (2008) Recent Pat. Nanotechnol. 2, 1-7; Gao, Y. et al (2017) Sci. Rep. 7, 947）。インプラントの形状因子及び機械的特性は、頭蓋外科手術における正確さ及び低侵襲性を促すように設計した。また、欠損部に架橋するために使用されることが多く、網状で多孔質の骨形成を増強させる従来的な骨移植鉱物質であるヒドロキシアパタイトは、排除した（Im, J.-Y. et al (2013) Lab. Anim. Res. 29, 196-203; Chung, M. T. et al (2013) Tissue Eng. Part A 19, 989-997; Quinlan, E. et al (2015) J. Control Release 207, 112-119）。したがって、製造設計は、骨修復に対する本発明のコンストラクトの影響を表す。
【0161】
免疫不全マウスにおける臨界サイズの頭蓋冠欠損部へのインプラント時に、Ｗｎｔ３ａパッチ及びＷＩＴＯＭパッチはいずれも、骨再生を有意に改善した。重要なことに、パッチの設計は、新しく形成される骨が、多孔質スキャフォールドでは網状で間のあいた新しい骨の誘導が報告されることが多いのと比較して、健常な骨と組織学的に近かったという点で、別の利点を示した。ＷＩＯＴＭ細胞インプラントは、幹細胞マーカーＳｔｒｏ１、ＣＤＨ１３、及びＰＬＡＸＮ２、インビボにおいて８週間後でさえもパッチの近傍に維持し、石灰化した骨の生成に寄与する成熟骨細胞を産生した。詳細な分析は、ヒト細胞が、欠損内の結合／間質様組織における細胞のうち平均で１８．５％、及び新しく形成される骨におけるＳＯＳＴ陽性成熟骨細胞のうちの３５．９％を構成することを示す。重要なことに、Ｗｎｔ３ａ表面の近位にあるヒト幹細胞マーカー陽性細胞のうちの６４％が、ＧＦＰ陽性染色によって明らかなように、Ｗｎｔ／β－カテニン経路活性を有した。哺乳動物細胞におけるＧＦＰの半減期は２６時間であるため、必ずしもすべてのＧＦＰ陽性細胞が、試料固定時に活性Ｗｎｔ／β－カテニン経路を示すわけではないことに留意することが重要である（Corish, P. & Tyler-Smith, C. (1999) Protein Eng. 12, 1035-1040）。したがって、必ずしもすべてのＧＦＰ陽性細胞が、試料固定前に活性Ｗｎｔ／β－カテニン経路を示すわけではないことに留意することが重要である。
【0162】
本研究は、高い時空間分解能を使用して、単一細胞レベルでヒト骨細胞形成を研究するための根拠を提供し、このプロセスに必須である新しい分子マーカー及び経路の特定を可能にする。高スループットのイメージングを使用することによって、本発明はまた、ヒト骨形成を調節する薬物のスクリーニング及び毒性研究のためのプラットフォームも提供し得る。最後に、Ｗｎｔ３ａを生体適合性かつ生分解性のフィルムに共有結合で固定化することによって、臨界サイズの骨欠損部の内在性治癒を促進する無細胞Ｗｎｔ３ａバンデージ／パッチを生成した。本発明の骨形成組織モデルはまた、３Ｄ細胞スキャフォールド上にも生成することができ、インビボにおいてヒト骨形成細胞の維持を促進し、骨修復を加速させるために使用することができる。
【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図8-3】
【図9-1】
【図9-2】
【図10-1】
【図10-2】
【図10-3】
【図11-1】
【図11-2】
【図12-1】
【図12-2】
【図12-3】
【図13-1】
【図13-2】
【図14】
【図15-1】
【図15-2】
【図16-1】
【図16-2】
【図16-3】
【図17-1】
【図17-2】
【図17-3】
【図17-4】
【国際調査報告】