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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-27
(54)【発明の名称】ＰＡＮＸ１関連疾患の治療
(51)【国際特許分類】
A61K 38/08 20190101AFI20230317BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230317BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230317BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20230317BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20230317BHJP
A61P 9/12 20060101ALI20230317BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20230317BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20230317BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230317BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20230317BHJP
A61P 19/00 20060101ALI20230317BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20230317BHJP
C07K 7/06 20060101ALI20230317BHJP
【ＦＩ】
A61K38/08
A61P35/00
A61P43/00 111
A61P43/00 105
A61P1/16
A61P9/10
A61P9/12
A61P27/02
A61P31/00
A61P25/00
A61P25/14
A61P19/00
A61P21/00
C07K7/06 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022548162
(86)(22)【出願日】2021-02-08
(85)【翻訳文提出日】2022-10-11
(86)【国際出願番号】 EP2021052939
(87)【国際公開番号】W WO2021156504
(87)【国際公開日】2021-08-12
(31)【優先権主張番号】20156088.5
(32)【優先日】2020-02-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518017819
【氏名又は名称】ニューリタス リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110001243
【氏名又は名称】弁理士法人谷・阿部特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ノラ カルディ
(72)【発明者】
【氏名】シリル ロペス
【テーマコード（参考）】
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA01
4C084AA02
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA09
4C084BA18
4C084BA23
4C084CA59
4C084NA14
4C084ZA021
4C084ZA022
4C084ZA331
4C084ZA332
4C084ZA361
4C084ZA362
4C084ZA421
4C084ZA422
4C084ZA751
4C084ZA752
4C084ZA941
4C084ZA942
4C084ZA961
4C084ZA962
4C084ZB211
4C084ZB212
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB321
4C084ZB322
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA16
4H045BA17
4H045BA18
4H045BA19
4H045EA20
4H045FA10
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、配列番号１（ＷＫＤＥＡＧＫＰＬＶＫ）のペプチドがＰＡＮＸ１を標的にすることを開示する。本発明はまた、このペプチド又はこのペプチドを含む組成物でＰＡＮＸ１に関連する疾患の治療に関係する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対照に、ＰＡＮＸ１に関連する疾患又は状態の治療又は予防のための方法に使用するための、５０個までのアミノ酸を有し、配列番号１を含むペプチド、又は、配列番号１の治療に効果的な変異体であって、前記疾患又は状態が、線維症、メラノーマ、肝がん、肝臓疾患、膀胱がん、虚血、高血圧、眼疾患又は状態、微生物感染、筋骨格障害、ハンチントン病、敗血症、及び多発性硬化症を含む群から選択されるもの。
【請求項2】
前記ＰＡＮＸ１に関連する疾患又は状態が線維症であり、線維症が、肝線維症、皮膚線維症、腎線維症、肺線維症、心筋細胞線維症、心筋線維症、骨髄線維症、腎臓の線維症（kidney fibrosis）、組織線維症、及び皮膚線維症を含む群から選択される、請求項１に記載の使用のためのペプチド。
【請求項3】
前記ＰＡＮＸ１に関連する疾患又は状態が虚血であり、前記虚血が、脳虚血、虚血性脳卒中、心虚血、腸管虚血、肢虚血、及び外傷又は閉塞によって起こる虚血を含む群から選択される、請求項１に記載の使用のためのペプチド。
【請求項4】
前記ＰＡＮＸ１に関連する疾患又は状態が肝がん、膀胱がん又はメラノーマである、請求項１に記載の使用のためのペプチド。
【請求項5】
前記ＰＡＮＸ１に関連する疾患又は状態ががん疾患又は状態である、請求項１に記載の使用のためのペプチド。
【請求項6】
前記ＰＡＮＸ１に関連する疾患又は状態が微生物感染である、請求項１に記載の使用のためのペプチド。
【請求項7】
前記ＰＡＮＸ１に関連する疾患又は状態が筋骨格障害である、請求項１に記載の使用のためのペプチド。
【請求項8】
前記筋骨格障害が腱炎又は手根管症候群である、請求項７に記載の使用のためのペプチド。
【請求項9】
前記ＰＡＮＸ１に関連する疾患又は状態がハンチントン病である、請求項１に記載の使用のためのペプチド。
【請求項10】
前記ＰＡＮＸ１に関連する疾患又は状態が敗血症である、請求項１に記載の使用のためのペプチド。
【請求項11】
前記ＰＡＮＸ１に関連する疾患又は状態が多発性硬化症である、請求項１に記載の使用のためのペプチド。
【請求項12】
前記ＰＡＮＸ１に関連する疾患又は状態が肝疾患であり、前記肝疾患が肝細胞の損傷、胆汁鬱滞の損傷、又は浸潤性の損傷に関連するものである、請求項１に記載の使用のためのペプチド。
【請求項13】
前記肝疾患がウイルス性肝炎、急性アルコール性肝炎、Ｃ型肝炎、アルコール性脂肪肝疾患、及び肝炎に関連する肝疾患を含む群から選択される、請求項１２に記載の使用のためのペプチド。
【請求項14】
前記ペプチドが配列番号１からなる、請求項１～１３の何れか１項に記載の使用のためのペプチド。
【請求項15】
前記治療に有効な変異体が、配列番号１と比較して１～８の修飾を含み、当該修飾又は各修飾が、アミノ酸の挿入、付加、欠失及び置換から選択される、請求項１～１４の何れか１項に記載の使用のためのペプチド。
【請求項16】
前記治療に有効な変異体が、配列番号１と比較して１～５の修飾を含み、当該修飾又は各修飾が、アミノ酸の挿入、付加、欠失及び置換から選択される、請求項１～１４の何れか１項に記載の使用のためのペプチド。
【請求項17】
前記治療に有効な変異体が、配列番号１と比較して１～２の修飾を含み、当該修飾又は各修飾が、アミノ酸の挿入、付加、欠失及び置換から選択される、請求項１６に記載の使用のためのペプチド。
【請求項18】
前記修飾が、配列番号１のアミノ酸の１以上をアミノ酸のＤ－型で置換することを含む、請求項１６又は１７に記載の使用のためのペプチド。
【請求項19】
前記修飾が、配列番号１の残基１、２、５、１０及び１１から選択される少なくとも２つの残基をアミノ酸のＤ－型で置換することを含む、請求項１８に記載の使用のためのペプチド。
【請求項20】
前記修飾が、配列番号１の残基１、２、５、１０及び１１から選択される少なくとも３つ又は４つの残基をアミノ酸のＤ－型で置換することを含む、請求項１８又は１９に記載の使用のためのペプチド。
【請求項21】
前記ペプチド変異体が、配列番号２から配列番号８７、及び配列番号９０から選択される、請求項１～２０の何れか１項に記載の使用のためのペプチド。
【請求項22】
前記ペプチド変異体が、配列番号８６又は配列番号８７である、請求項２１に記載の使用のためのペプチド。
【請求項23】
前記ペプチドが修飾される、請求項１～２２の何れか１項に記載の使用のためのペプチド。
【請求項24】
前記ペプチドが、側鎖への修飾、ペプチド合成の間における非天然アミノ酸及び／又はこれらの誘導体の取り込み、架橋－リンカー及びペプチドのコンホーメーションを束縛する他の方法によって、複合体パートナーへの複合体形成によって、融合パートナーへの融合、結合パートナーへの共有結合、脂質化、ＰＥＧ化、及びアミド化によって修飾される、請求項２３に記載の使用のためのペプチド。
【請求項25】
前記ペプチドが環化される、請求項１～２４の何れか１項に記載の使用のためのペプチド。
【請求項26】
対照に、ＰＡＮＸ１に関連する疾患又は状態の治療又は予防のための方法に使用するための、５０個までのアミノ酸を有し、配列番号１を含むペプチド、又は配列番号１の治療に効果的な変異体を含む組成物であって、前記疾患又は状態が、線維症、メラノーマ、肝がん、肝臓疾患、膀胱がん、虚血、高血圧、眼疾患又は状態、微生物感染、筋骨格障害、ハンチントン病、敗血症、及び多発性硬化症を含む群から選択される組成物。
【請求項27】
対照におけるＰＡＮＸ１に関連する疾患又は状態を治療又は予防するための方法であって、対照に、治療に有効量の、５０個までのアミノ酸を有し、配列番号１を含むペプチド、又は、配列番号１の治療に効果的な変異体を投与するステップを含み、前記疾患又は状態が、線維症、メラノーマ、肝がん、肝臓疾患、膀胱がん、虚血、高血圧、眼疾患又は状態、微生物感染、筋骨格障害、ハンチントン病、敗血症、及び多発性硬化症を含む群から選択される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、対象におけるＰＡＮＸ１関連疾患の治療又は予防に関する。
【背景技術】
【0002】
パンネキシン１（ＰＡＮＸ１）は、ＰＡＮＸ１遺伝子及び多くのパンネキシンファミリーによってコードされるタンパク質である。パンネキシンファミリーは、３種のメンバー、即ちＰＡＮＸ１、ＰＡＮＸ２及びＰＡＮＸ３を持つ、膜貫通（ＴＭ）チャネルタンパク質のファミリーである。ファミリーの各メンバーは、４つのα－ヘリカルＴＭドメイン、２つの細胞外ループ、及び１つの細胞内ループを含む（図１）。タンパク質のＮ及びＣ末端は、細胞の細胞質に曝されている。このタンパク質は、９Åの膜チャネル孔を提供し、これはＣａ２＋、Ｋ＋、ＡＴＰ及び約１．２ｋＤａの分子が細胞に入出することを可能にする。ＰＡＮＸ２及びＰＡＮＸ３の発現は、中枢神経系（ＣＮＳ）、線維芽細胞及び骨芽細胞に大きく制限される。ＰＡＮＸ１は、肝臓、腎臓、肺、消化管及び膵臓を含む多数のタイプの細胞で発現される。ＰＡＮＸ１は、主に、細胞の原形質膜に局在化している。
【0003】
ＰＡＮＸ１チャネルは、アデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）を放出し、広範囲の細胞及び組織型における多くの正常な病理学的プロセスに役割を有する。ＡＴＰは、多くの細胞プロセスを駆動するためのエネルギーを供給する細胞外シグナル伝達（signalling）分子である。疾患状態、例えば細胞のダメージ、脂質異常症、低酸素症、慢性炎症及び／又は感染は、細胞外（ＥＣ）ＡＴＰ産生を駆動する。炎症性シグナルのＥＣ ＡＴＰ産生の増加は、ＰＡＮＸ１チャネルの開放の増加を引き起こす。これは、ＡＴＰ細胞の流出及びＣａ２＋の細胞流入を刺激する（図２）。この過剰なＰＡＮＸ１シグナル伝達は、インフラマソームアセンブリを刺激し、インターロイキン（ＩＬ）－１β及びＩＬ－１８などの炎症誘発性サイトカインの放出を促進する。これは、次に、カスパーゼの活性化を導く。調節不全炎症誘発性サイトカインも、次に、ＴＦＧβ、ＴＮＦα、ＰＤＧＦなどの因子を活性化することができる。
【0004】
ＰＡＮＸ１は、虚血、痛み、線維症、微生物感染、炎症及びがんを含む複数の疾患及び状態に関係し、多くのグループが、疾患の治療における標的としてＰＡＮＸ１を研究している。研究は、ＰＡＮＸ１がてんかん、神経障害性の痛み、有痛性骨軟部疾患、虚血傷害、心筋線維症、ＨＩＶ感染、ヒト膀胱の過活動及びがんに関連していることを示されている（Di Wu, et al., Acta Biochim Biophys Sin, 2016（非特許文献１））。高い又は活動過多のＰＡＮＸ１のレベルも、とりわけ、メラノーマ、虚血性脳卒中（ischemic stroke）、発作、大腸炎、偏頭痛、頭痛、骨関節症、てんかんを含む疾患に関連付けられている（Laird et al., Nat Rev Drug Discov., 2018（非特許文献２））。
【0005】
Ｇｏｏｄら（Good, et al., Circulation Research, 2017（非特許文献３））は、ＰＡＮＸ１阻害に基づいた高血圧に抵抗するための治療法（therapeutic modality）を開示した。このグループは、高血圧の薬剤、スピロノラクトンのｉｎ ｖｉｖｏでの標的としてＰＡＮＸ１を調査した。他のグループは、高度に転移したがん細胞においてＰＡＮＸ１の突然変異した形態が関与していることを示した。突然変異したＰＡＮＸ１は、研究において乳がん細胞の生存を促進することによってＡＴＰの放出を増加し、転移の効率を高めた（Furlow PW, Nat Cell Biol, 2015（非特許文献４））。この研究では、ＰＡＮＸ１阻害剤は、転移を減少させることが示された。
【0006】
ＰＡＮＸ１標的化治療は、関節痛を軽減するためのアプローチとして研究されている（Mousseu et al., Neurophysiology Science Advances 8 Aug 2018（非特許文献５））。痛風の治療薬であるプロベネシッドは、ＰＡＮＸ１チャネルで誘導されるＡＴＰを弱めることが示されている（Silverman W., Am J Physiol Cell Physiol, 2008（非特許文献６））。ＰＡＮＸ１チャネル阻害剤であるカルベノキソロン（ＣＢＸ）は、胃潰瘍のための薬剤であり（Benefenati V, Channels., 2009（非特許文献７））、ハンチントン病用の試験に入っている。
【0007】
ＰＡＮＸ１チャネルは、オピエート離脱の治療上の標的として研究されている。このグループは、ＰＡＮＸ１をブロックすることで、オピエート無痛法に影響することなく離脱の辛さを軽減することを見出した（Burma et al., Nature Medicine, 2017（非特許文献８））。Ｍａｋａｒｅｎｋｏｖａ ＨＰらは、パンネキシンの減少が、神経損傷後の、痛みを減少し、再生を促すための効果的な戦略であり、炎症の抑制におけるＰＡＮＸ１シグナル伝達経路に影響を与えうることを示唆している。
【0008】
Ｆｅｉｇら（Feig et al., PLoS ONE 12, 2017（非特許文献９））は、抗ウイルス薬、テノホビルは、ＰＡＮＸ１媒介性ＡＴＰの遊離の阻害剤であり、肝臓及び皮膚のアデノシンレベルを下方調節（ダウンレギュレーション）する（downregulating）ことによって肝臓及び皮膚の線維症を防ぐ。Ｃｒｅｓｐｏ Ｙａｎｇｕａｓら（Crespo Yanguas et al, Arch Toxicol, 2018（非特許文献１０））は、肝線維症におけるＰＡＮＸ１の役割を研究し、化学的に誘導された肝線維症がＰＡＮＸ１発現を増加すること、及びＰＡＮＸ１アブレーションがＣＣＬ４で誘導された肝線維症を弱めることを報告した。
【0009】
Ｏｒｉｔｉｚら（Oritiz et al., Perspective 2020（非特許文献１１））は、多発性硬化症の進行の調節剤としての、パンネキシン１をベースとするチャネルの役割を報告した。
【0010】
欧州特許出願公開第３３２９９３０号明細書（EP3329930）（特許文献１）及び国際公開第２０１８／１０４３４６号（WO2018/104346）（特許文献２）は、アミノ酸配列、ＷＫＤＥＡＧＫＰＬＶＫを含むペプチド、及び糖尿病及び筋肉疲労又はタンパク質合成の低下によって特徴付けられる疾患などの代謝異常の治療におけるその使用を開示する。嚢胞性線維症が開示されているが、これは、ＰＡＮＸ１関連線維症ではない。
【0011】
欧州特許出願公開第３３２９９０５号明細書（EP3329905）（特許文献３）は、アンチエイジング法に使用するためのアミノ酸配列、ＷＫＤＥＡＧＫＰＬＶＫを含むペプチドを開示する。当該ペプチドを含む局所組成物も開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0012】
【特許文献1】欧州特許出願公開第３３２９９３０号明細書（EP3329930）
【特許文献2】国際公開第２０１８／１０４３４６号（WO2018/104346）
【特許文献3】欧州特許出願公開第３３２９９０５号明細書（EP3329905）
【特許文献4】欧州特許出願公開第２０５０４３７号明細書（EP2050437）
【特許文献5】国際公開第２００５／０２３２９０（WO2005023290）
【特許文献6】米国特許出願公開第２０１０／０９８６６０号明細書（US2010098660）
【特許文献7】米国特許出願公開第２００７／００５３８４５号明細書（US20070053845）
【特許文献8】欧州特許出願第１０７２６００．２号明細書（EP1072600.2）
【特許文献9】欧州特許出願第１３１７１７５７．１号明細書（EP13171757.1）
【特許文献10】米国特許出願公開第２０１４／１２０１４１号明細書（US2014120141）
【特許文献11】米国特許第４，７６６，１０６号明細書（U.S. Pat. No 4,766,106）
【特許文献12】米国特許第４，１７９，３３７号明細書（U.S. Pat. No 4,179,337）
【特許文献13】米国特許第４，４９５，２８５号明細書（U.S. Pat. No4,495,285）
【特許文献14】米国特許第４，６０９，５４６号明細書（U.S. Pat. No 4,609,546）
【特許文献15】米国特許第３，６５４，０９０号明細書（U.S. Pat. No. 3,654,090）
【特許文献16】米国特許第３，８５０，７５２号明細書（U.S. Pat. No. 3,850,752）
【特許文献17】米国特許第４，０１６，０４３号明細書（U.S. Pat. No. 4,016,043）
【非特許文献】
【0013】
【非特許文献1】Di Wu, et al., Acta Biochim Biophys Sin, 2016
【非特許文献2】Laird et al., Nat Rev Drug Discov., 2018
【非特許文献3】Good, et al., Circulation Research, 2017
【非特許文献4】Furlow PW, Nat Cell Biol, 2015
【非特許文献5】Mousseu et al., Neurophysiology Science Advances 8 Aug 2018
【非特許文献6】Silverman W., Am J Physiol Cell Physiol, 2008
【非特許文献7】Benefenati V, Channels., 2009
【非特許文献8】Burma et al., Nature Medicine, 2017
【非特許文献9】Feig et al., PLoS ONE 12, 2017
【非特許文献10】Crespo Yanguas et al, Arch Toxicol, 2018
【非特許文献11】Oritiz et al., Perspective 2020
【非特許文献12】Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd Edition, (1994), Edited by A Wade and PJ Weller
【非特許文献13】Topical drug delivery formulations edited by David Osborne and Antonio Aman, Taylor & Francis
【非特許文献14】Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)
【非特許文献15】J. M. Stewart and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984)
【非特許文献16】M. Bodanzsky and A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York (1984)
【非特許文献17】Cameselle, J.C., Ribeiro, J.M., and Sillero, A. (1986), Derivation and use of a formula to calculate the net charge of acid-base compounds. Its application to amino acids, proteins and nucleotides. Biochem. Educ. 14, 131-136
【非特許文献18】Topical drug delivery formulations edited by David Osborne and Antonio Aman, Taylor & Francis
【非特許文献19】O’Riordan, et al Respir Care, 2002, Nov. 47
【非特許文献20】Goodson, R. J. & Katre, N. V. (1990) Bio/Technology 8, 343
【非特許文献21】Kogan, T. P. (1992) Synthetic Comm. 22, 2417
【非特許文献22】Strohl, et al, BioDrug, 2015
【非特許文献23】Schlapschy, et al, Protein Eng Des Sel. 2013
【非特許文献24】Podust, VN, et al, Protein Eng Des Sel. 2013
【非特許文献25】Zhang, L et al, Curr Med Chem. 2012
【非特許文献26】Gaberc-Porekar, V, et al, Curr Opin Drug Discov Devel. 2008
【非特許文献27】Werle M, Bernkop-Schnurch A. Amino Acids. 2006 Jun;30(4):351-67
【非特許文献28】Strategies to improve plasma half life time of peptide and protein drugs. Werle M, Bernkop-Schnurch A. Amino Acids. 2006 Jun;30(4):351-67
【非特許文献29】Strategic Approaches to Optimizing Peptide ADME Properties. Li Di AAPS J. 2015 Jan; 17(1): 134-143
【非特許文献30】Jensen, Knud (2009-09-01). Peptide and Protein Design for Biopharmaceutical Applications. John Wiley & Sons. ISBN 9780470749715
【非特許文献31】Wenyan, Xu; Jun, Tang; Changjiu, Ji; Wenjun, He; Ninghua, Tan (2008). "Application of a TLC chemical method to detection of cyclotides in plants". Science Bulletin. 53 (11): 1671-1674. doi:10.1007/s11434-008-0178-8
【非特許文献32】Borthwick AD (May 2012). "2,5-Diketopiperazines: Synthesis, Reactions, Medicinal Chemistry, and Bioactive Natural Products". Chemical Reviews. 112 (7): 3641-3716. doi:10.1021/cr200398y. PMID 22575049
【非特許文献33】Barber, Carla J. S.; Pujara, Pareshkumar T.; Reed, Darwin W.; Chiwocha, Shiela; Zhang, Haixia; Covello, Patrick S. (2013). "The Two-step Biosynthesis of Cyclic Peptides from Linear Precursors in a Member of the Plant Family Caryophyllaceae Involves Cyclization by a Serine Protease-like Enzyme". Journal of Biological Chemistry. 288 (18): 12500-12510. doi:10.1074/jbc.M112.437947. PMC 3642298. PMID 23486480
【非特許文献34】Wenyan Xu; et al. (2011). "Various mechanisms in cyclopeptide production from precursors synthesized independently of non-ribosomal peptide synthetases". Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 43 (10): 757-762. doi:10.1093/abbs/gmr062. PMC 3180235. PMID 21764803
【非特許文献35】Wenyan Xu; et al. "Plant Cyclopeptides and Possible Biosynthetic Mechanisms"
【非特許文献36】David J. Craik (17 March 2006). "Seamless Proteins Tie Up Their Loose Ends". Science. 311 (5767): 1563-7. doi:10.1126/science.1125248. PMID 16543448
【非特許文献37】Fusion Proteins for Half-Life Extension of Biologics as a Strategy to Make BiobettersWilliam R. Strohl BioDrugs. 2015; 29(4): 215-239
【非特許文献38】Schlapschy, M, Binder, U, Borger, C et al. PASYlation: a biological alternative to PEGylation for extending the plasma half-life of pharmaceutically active proteins. Protein Eng Des Sel. 2013;26(8):489-501
【非特許文献39】Podust, VN, Sim, BC, Kothari, D et al. Extension of in vivo half-life of biologically active peptides via chemical conjugation to XTEN protein polymer. Protein Eng Des Sel. 2013;26(11):743-53
【非特許文献40】Zhang, L, Bulaj, G. Converting Peptides into Drug Leads by Lipidation. Curr Med Chem. 2012;19(11):1602-18
【非特許文献41】Gaberc-Porekar, V, Zore, I, Podobnik, B et al. Obstacles and pitfalls in the PEGylation of therapeutic proteins. Curr Opin Drug Discov Devel. 2008;11(2):242-50
【非特許文献42】By Dr Ronald V. Swanson - Long live peptides evolution of peptide half-life extension technologies and emerging hybrid approaches. From Drug Discovery World on line.Spring 2014
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0014】
本発明は、驚くべきことに、ＰＡＮＸ１関連疾患の治療又は予防のためにＰＡＮＸ１を標的化する薬剤（agent）を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0015】
本発明者らは、驚くべきことに、配列番号１のペプチド（ＷＫＤＥＡＧＫＰＬＶＫ）がＰＡＮＸ１を標的にすることを発見した。本発明のペプチドは、ＰＡＮＸ１又はＰＡＮＸ１シグナル伝達を調節する手段を提供し、ＰＡＮＸ１に関連する疾患又は状態を治療又は予防するために使用されうる。一実施形態では、本発明のペプチドは、ＰＡＮＸ１又はＰＡＮＸ１シグナル伝達をブロックすること又は阻害することによってその効果を引き出す。
【0016】
従って、第１の態様では、本発明は、対象において、ＰＡＮＸ１に関連する疾患又は状態を治療又は予防する方法に使用するための、配列番号１を含むペプチド、又は配列番号１の機能的（又は治療的に有効な）変異体（以後、「ペプチド活性剤」又は「本発明のペプチド」）を提供する。
【0017】
更なる態様では、本発明は、対象において、ＰＡＮＸ１に関連する疾患又は状態を治療又は予防する方法に使用するための配列番号１を含むペプチド、又は配列番号１の治療的に有効な変異体をすくむ組成物を提供する。
【0018】
適切には、組成物は複数のペプチドを含む。
【0019】
別の態様では、本発明は、対象において、ＰＡＮＸ１に関連する疾患又は状態を治療又は予防する方法であって、治療に有効な量の、配列番号１を含むペプチド、又は配列番号１の機能的（又は治療的に有効な）変異体（以後「ペプチド活性剤」）を対象に投与するステップを含む方法に関する。
【0020】
機能的（又は治療的に有効な）変異体は、配列番号１の機能的又は治療的フラグメントでありうる。
【0021】
好ましくは、疾患又は状態は、線維症、メラノーマ、肝がん、肝臓疾患、虚血、高血圧、眼疾患又は状態、微生物感染、筋骨格障害、ハンチントン病、敗血症、及び多発性硬化症を含む群から選択される。
【0022】
好ましくは、疾患又は状態は、免疫疾患又は状態、線維性疾患、がん、虚血及び心疾患を含む群から選択されるものでありうる。
【0023】
好ましくは、疾患又は状態は、線維症、メラノーマ、肝がん、虚血、高血圧、及び多発性硬化症を含む群から選択されるものでありうる。
【0024】
疾患は、クローン病などの炎症性腸疾患、慢性胃腸炎、敗血症、肝線維症、皮膚線維症、腎線維症、肺線維症、メラノーマ、乳癌（breast carcinoma）、肝細胞癌（hepatocellular carcinoma）、脳虚血、虚血性脳卒中、痛み、心筋細胞線維症（cardiomyocyte fibrosis）、微生物感染症、脳の炎症、高血圧、神経変性疾患、及び抹消神経症を含むが、これらに限定されない。
【0025】
好ましくは、ペプチドは、長さが最大で５０個のアミノ酸である。一実施形態では、ペプチドは、最大で４０、３５、３０、２５、２０、又は１５個のアミノ酸を有する。一実施形態では、ペプチドは１１～１５個のアミノ酸を有する。
【0026】
ペプチド（又は機能的変異体若しくはフラグメント）は、単独で、又は治療効果を高める他の共薬剤（co-drug）と組み合わせて投与され、共薬剤には、ＰＡＮＸ１に関連する疾患又は状態の治療に効果が認められている薬剤（これらに限定されない）が含まれる。
【0027】
一実施形態では、ペプチドは配列番号１から本質的になる。
【0028】
一実施形態では、ペプチドの変異体は、配列番号１と比較して１～８の修飾又は変更を有し、修飾は、典型的には、アミノ酸の挿入、付加、欠失及び置換（理想的には保存的置換）から独立して選択される。
【0029】
一実施形態では、１以上のアミノ酸（例えば、１～５、１～４、１～３、又は１～２）が、Ｄ－アミノ酸で置換される。一実施形態では、１以上の残基、１、２、５、１０、１１が、Ｄ－アミノ酸の、例えば２、３、４、又は５個の残基で置換される。一実施形態では、１以上のアミノ酸は、保存的アミノ酸置換で置換される。
【0030】
一実施形態では、機能的又は治療的変異体は、配列｛ｄ｝Ｗ｛ｄ｝ＫＤＥ｛ｄ｝ＡＧＫＰＬ｛ｄ｝Ｖ｛ｄ｝Ｋ（配列番号８６）を有し、これは、アミノ酸１、２、５、１０及び１１がＤ－型のアミノ酸で置換されていること以外配列番号１と同じである。
【0031】
一実施形態では、ペプチドは修飾される。一実施形態では、ペプチドは組換えペプチドである。一実施形態では、ペプチドは環化される。
【0032】
好ましくは、ペプチドは、側鎖への修飾（単数又は複数）、ペプチド合成の間での非天然アミノ酸及び／又はそれらの誘導体の取り込み、架橋結合剤の使用及びペプチドのコンホーメーションに制限を課す他の方法によって、複合体パートナーとの複合体形成によって、融合パートナーとの融合、結合パートナーとの共有結合、脂質化、ＰＥＧ化（PEGylation）及びアミド化によって修飾される。
【0033】
環化されたペプチドの例は、（１（ｃｌａｃ）ｗＫＥ（Ｍｅ）ＥＣ１ＧＫ（Ｍｅ）ＰＬＶｋ－ＯＨ）－配列番号８７である。この変異体において、残基「ｗ」及び「ｋ」はＤ－アミノ酸であり、残基「Ｅ」及び「Ｐ」は、メチル化されており、このペプチドは、ｎ－末端とシステイン残基の間でチオエーテル環化を含み、「１（ｃｌａｃ）」及び「Ｃ１」は環の２つの端部を示す。
【0034】
好ましくは、変異体は、配列番号２から配列番号８７まで、及び配列番号９０から選択される。
【0035】
本発明の一態様は、配列番号２から８７及び配列番号９０から選択される配列を含む（又はからなる）ペプチドを提供する。この配列を含むペプチドは、長さが最大で５０アミノ酸でありうる。
【0036】
本発明の他の態様及び好ましい実施形態は、以下に述べる他の請求事項（claims）で定義され、記載される。
【図面の簡単な説明】
【0037】
【図3】図３は、ヒト膜タンパク質に対する本発明のペプチド（配列番号１のペプチド）の結合親和性を示す。ＣＹ５－標識化ペプチド（０．０１及び０．０５μｇ／ｍｌ）を、５５２８ヒト原形質膜タンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞に対してスクリーニングした。
【図4】図４は、配列番号１のペプチドが、不死化肝細胞でＩＬ－８の分泌を低下することを示す。ＨｅｐＧ２細胞を、２４時間ペプチド（５ｎｇ／ｍｌ）で処理し、次いで、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで２４時間処理した。示されたデータは、少なくとも２つの独立した実験の平均±ＳＥＭである。（*Ｐ＜０．０５ **Ｐ＜０．０１ ***Ｐ＜０．００１）
【図5】図５Ａ及びＢは、配列番号１のペプチドが一次（primary）ヒト肝星細胞で抗線維症活性を示すことを例示する。（Ａ）α－ＳＭＡの発現を刺激するためにＴＧＦ－β１で処理され、次いでペプチド（５ｎＭ）で処理されたヒト肝星細胞の共焦点像。（Ｂ）α－ＳＭＡ発現の定量化。
【図8】図８は、Ｃ－末端ＣＹ５タグ化ペプチド（配列番号１）（赤）及び初期エンドソームのマーカー（緑）による共焦点顕微鏡法を示す。ＥＡＡ１は、このペプチドが、ヒト骨格筋細胞で１時間の時間経過にわたって、細胞侵入の進行を表示することを示す。このペプチドとエンドソームとの共局所化（co-localisation）は、ペプチドが膜結合性細胞外標的に結合し、これ以後内部で転送された（trafficked）ことを示唆する。
【図9A】図９Ａ、Ｂ及びＣは、ペプチド（配列番号１）によるＡＴＰ媒介性Ｃａ２＋イオンの流動（flux）の下方調節を示す。ＴＨＰ－１細胞のＡＴＰ処理は、ＦＩＴＣ標識化したＣａ2+イオンの検出の増加を引き起こす（Ａ）。１μＭのペプチドを用いたＴＨＰ－１の４５秒の予備培養（preincubation）は、ＡＴＰ媒介性Ｃａ２＋イオンの流動をブロックする（Ｂ）。ＦＩＴＣ蛍光単位の比較は、ペプチドと独立して及びペプチドの存在下でフローサイトメトリーにより検出した（Ｃ）。
【図9B】図９Ａ、Ｂ及びＣは、ペプチド（配列番号１）によるＡＴＰ媒介性Ｃａ２＋イオンの流動（flux）の下方調節を示す。ＴＨＰ－１細胞のＡＴＰ処理は、ＦＩＴＣ標識化したＣａ2+イオンの検出の増加を引き起こす（Ａ）。１μＭのペプチドを用いたＴＨＰ－１の４５秒の予備培養（preincubation）は、ＡＴＰ媒介性Ｃａ２＋イオンの流動をブロックする（Ｂ）。ＦＩＴＣ蛍光単位の比較は、ペプチドと独立して及びペプチドの存在下でフローサイトメトリーにより検出した（Ｃ）。
【図9C】図９Ａ、Ｂ及びＣは、ペプチド（配列番号１）によるＡＴＰ媒介性Ｃａ２＋イオンの流動（flux）の下方調節を示す。ＴＨＰ－１細胞のＡＴＰ処理は、ＦＩＴＣ標識化したＣａ2+イオンの検出の増加を引き起こす（Ａ）。１μＭのペプチドを用いたＴＨＰ－１の４５秒の予備培養（preincubation）は、ＡＴＰ媒介性Ｃａ２＋イオンの流動をブロックする（Ｂ）。ＦＩＴＣ蛍光単位の比較は、ペプチドと独立して及びペプチドの存在下でフローサイトメトリーにより検出した（Ｃ）。
【図10】図１０Ａ～Ｄは、ＡＰＡＰ急性肝傷害マウスモデルの研究における本発明のペプチドによる肝酵素の変化の防止を例示する。ＡＰＡＰは０時間でＩＰ注入により投与された。本発明のペプチド、１０ＰＡＮＸ１又は生理食塩水対照の処理を１．５時間後に施した。５匹の動物を各グループに含めた。全てのマウスのＡＬＴ及びＡＳＴのレベルを、２．２５及び６時間でのサバイバル及び末端出血（terminal breeds）から測定した。２．２５時間では、全てのグループにおいて、ＡＰＡＰ／生理食塩水処理と比較してペプチドの投与でＡＬＴレベルが減少し（Ａ）、１０ＰＡＮＸでより優れていた。ＡＰＡＰ／生理食塩水のグループは、生理食塩水／生理食塩水のグループと比較してＡＬＴ及びＡＳＴの両方の増加を示した。データは、平均±ＳＥＭである。
【発明を実施するための形態】
【0038】
本発明は、添付の図面を参照して説明される。
【0039】
本発明の詳細な説明
本明細書に記載された全ての刊行物、特許、特許出願及び他の参照文献は、あたかも、それぞれ個別の刊行物、特許又は特許出願が特に及び個別に、参照により取り込まれることを指示されたかのように、全ての目的に対してそれらの全体及び完全に引用されたそれらの内容を参照により本明細書に取り込む。
本明細書に記載された全ての刊行物、特許、特許出願及び他の参照文献は、あたかも、それぞれ個別の刊行物、特許又は特許出願が特に及び個別に、参照により取り込まれることを指示されたかのように、全ての目的に対してそれらの全体及び完全に引用されたそれらの内容を参照により本明細書に取り込む。
【0040】
本発明のペプチドは、驚くべきことに、組織内のＰＡＮＸ１タンパク質を標的とし、これに結合すること、及び、ＰＡＮＸ１シグナル伝達に関連する細胞プロセスを調節することが見いだされた。このように、本発明のペプチドは、ＰＡＮＸ１に関連する疾患及び状態を治療するために使用されうる。
【0041】
ＰＡＮＸ１（アイソフォーム１）のアミノ酸配列は以下のとおりである。
【0042】
ＭＡＩＡＱＬＡＴＥＹＶＦＳＤＦＬＬＫＥＰＴＥＰＫＦＫＧＬＲＬＥＬＡＶＤＫＭＶＴＣＩＡＶＧＬＰＬＬＬＩＳＬＡＦＡＱＥＩＳＩＧＴＱＩＳＣＦＳＰＳＳＦＳＷＲＱＡＡＦＶＤＳＹＣＷＡＡＶＱＱＫＮＳＬＱＳＥＳＧＮＬＰＬＷＬＨＫＦＦＰＹＩＬＬＬＦＡＩＬＬＹＬＰＰＬＦＷＲＦＡＡＡＰＨＩＣＳＤＬＫＦＩＭＥＥＬＤＫＶＹＮＲＡＩＫＡＡＫＳＡＲＤＬＤＭＲＤＧＡＣＳＶＰＧＶＴＥＮＬＧＱＳＬＷＥＶＳＥＳＨＦＫＹＰＩＶＥＱＹＬＫＴＫＫＮＳＮＮＬＩＩＫＹＩＳＣＲＬＬＴＬＩＩＩＬＬＡＣＩＹＬＧＹＹＦＳＬＳＳＬＳＤＥＦＶＣＳＩＫＳＧＩＬＲＮＤＳＴＶＰＤＱＦＱＣＫＬＩＡＶＧＩＦＱＬＬＳＶＩＮＬＶＶＹＶＬＬＡＰＶＶＶＹＴＬＦＶＰＦＲＱＫＴＤＶＬＫＶＹＥＩＬＰＴＦＤＶＬＨＦＫＳＥＧＹＮＤＬＳＬＹＮＬＦＬＥＥＮＩＳＥＶＫＳＹＫＣＬＫＶＬＥＮＩＫＳＳＧＱＧＩＤＰＭＬＬＬＴＮＬＧＭＩＫＭＤＶＶＤＧＫＴＰＭＳＡＥＭＲＥＥＱＧＮＱＴＡＥＬＱＧＭＮＩＤＳＥＴＫＡＮＮＧＥＫＮＡＲＱＲＬＬＤＳＳＣ（配列番号８８）
【0043】
ＰＡＮＸ１のアイソフォーム２は以下の配列を有する。
【0044】
ＭＡＩＡＱＬＡＴＥＹＶＦＳＤＦＬＬＫＥＰＴＥＰＫＦＫＧＬＲＬＥＬＡＶＤＫＭＶＴＣＩＡＶＧＬＰＬＬＬＩＳＬＡＦＡＱＥＩＳＩＧＴＱＩＳＣＦＳＰＳＳＦＳＷＲＱＡＡＦＶＤＳＹＣＷＡＡＶＱＱＫＮＳＬＱＳＥＳＧＮＬＰＬＷＬＨＫＦＦＰＹＩＬＬＬＦＡＩＬＬＹＬＰＰＬＦＷＲＦＡＡＡＰＨＩＣＳＤＬＫＦＩＭＥＥＬＤＫＶＹＮＲＡＩＫＡＡＫＳＡＲＤＬＤＭＲＤＧＡＣＳＶＰＧＶＴＥＮＬＧＱＳＬＷＥＶＳＥＳＨＦＫＹＰＩＶＥＱＹＬＫＴＫＫＮＳＮＮＬＩＩＫＹＩＳＣＲＬＬＴＬＩＩＩＬＬＡＣＩＹＬＧＹＹＦＳＬＳＳＬＳＤＥＦＶＣＳＩＫＳＧＩＬＲＮＤＳＴＶＰＤＱＦＱＣＫＬＩＡＶＧＩＦＱＬＬＳＶＩＮＬＶＶＹＶＬＬＡＰＶＶＶＹＴＬＦＶＰＦＲＱＫＴＤＶＬＫＶＹＥＩＬＰＴＦＤＶＬＨＦＫＳＥＧＹＮＤＬＳＬＹＮＬＦＬＥＥＮＩＳＥＶＫＳＹＫＣＬＫＶＬＥＮＩＫＳＳＧＱＧＩＤＰＭＬＬＬＴＮＬＧＭＩＫＭＤＶＶＤＧＫＴＰＭＳＡＥＭＲＥＥＱＧＮＱＴＡＥＬＱＤＳＥＴＫＡＮＮＧＥＫＮＡＲＱＲＬＬＤＳＳＣ（配列番号８９）
【0045】
ＰＡＮＸ１に対するヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ参照配列アクセス番号ＮＧ＿０２７９３６．１を有する。
【0046】
疾患又は状態は、ＰＡＮＸ１の介在に関連するか、又はＰＡＮＸ１の介在によって媒介されるものである。疾患又は状態は、対象又は対象の生物学的サンプルにおけるＰＡＮＸ１シグナル伝達又は発現の増加に関連するか、又はこれらによって特徴付けられるものでありうる。
【0047】
注目すべきは、疾患又は状態は、炎症、線維症、がん、虚血及び心疾患を含む群から選択されうる。疾患又は状態は、痛み、神経系に関連する疾患又は状態でありうる。疾患又は状態は、脳に関連するものでありうる。
【0048】
炎症は、慢性の炎症環境によって特徴付けられるものなどの、任意のタイプの炎症又は炎症性疾患若しくは状態でありうる。炎症は、大脳の炎症、腸の炎症、脳の炎症、胃の炎症又は脈管の炎症でありうる。炎症は損傷によって引き起こされるものでありうる。炎症は、クローン病及び慢性胃腸（ＧＩ）炎などの炎症性腸疾患を含みうるが、これらに限定されない。
【0049】
線維性疾患又は状態、又は線維症は、あらゆる組織にあり、又はあらゆる組織に関連する。適切な例は、肝線維症、腎線維症（renal fibrosis）、肺線維症、心筋細胞線維症、心筋線維症、骨髄線維症、腎臓の線維症（kidney fibrosis）、組織の線維症及び皮膚の線維症を含むが、これらに限定されない。肺線維症は特発性肺線維症でありうる。線維症は、典型的には、環境因子によって誘導されるものであり、遺伝的な線維症ではない。
【0050】
がんは、メラノーマ、乳がん、肝細胞がんを含む肝がん、肺がん、膀胱がん、精巣がん、グリオーマ、多発性骨髄腫、結腸がん、白血病及び子宮内膜がんを含みうるが、これらに限定されない。
【0051】
心疾患は、冠動脈心疾患、脳卒中、末梢血管疾患、心筋梗塞、横紋筋融解症、心筋ミオパチー、アテローム性動脈硬化症を含みうるが、これらに限定されない。一実施形態では、心疾患は、アテローム性動脈硬化症を含まない。
【0052】
疾患又は状態は抵抗性高血圧でありうる。
【0053】
虚血は、脳虚血、虚血性脳卒中、心虚血、腸管虚血、肢虚血、及び外傷又は閉塞によって起こる虚血を含みうるが、これらに限定されない。
【0054】
疾患又は状態は、末梢神経疾患を含む神経系のものである。疾患又は状態は、多発性硬化症等の神経変性病でありうる。
【0055】
疾患又は状態は、敗血症及び痛みである。痛みは対象の何れの部位であってもよい。痛みは関節痛でありうる。
【0056】
状態は傷害でありうる。
【0057】
疾患又は状態は、眼の疾患又は状態でありうる。
【0058】
疾患又は状態は、細菌感染、ウイルス感染、又は真菌感染などの微生物感染でありうる。感染は、ＨＩＶ感染でありうる。
【0059】
状態は、オピオイドなどの薬物からの離脱でありうる。
【0060】
疾患又は状態は、腱炎などの骨格筋障害、又は手根管症候群でありうる。
【0061】
疾患又は状態は、偏頭痛、頭痛、発作、変形性関節症性てんかん（osteoarthritis epilepsy）、病原性てんかん、薬物耐性てんかん、及びてんかんを含む群から選択されうる。
【0062】
疾患又は状態は、膀胱の過活動を含む腎臓疾患又は膀胱疾患でありうる。状態は、急性腎臓傷害でありうる。
【0063】
疾患又は状態は、胃潰瘍でありうる。疾患又は状態は、痛風でありうる。疾患又は状態は、ハンチントン病でありうる。
【0064】
疾患又は状態は、肝臓の損傷でありうる。これは、肝細胞の損傷、胆汁鬱滞の損傷及び／又は浸潤性の損傷に関連した肝臓疾患を含みうる。肝細胞では、一次傷害は肝細胞に対するものである。胆汁鬱滞では、一次傷害は、胆管に対するものである。浸潤性では、肝臓は、新生物又はアミロイド等の肝臓以外の物質によって侵入されるか又は置換される。ＡＳＴ及びＡＬＴは、肝臓の損傷又は肝細胞の傷害の典型的なマーカーである。肝疾患は、ウイルス性肝炎、急性アルコール性肝炎、ＮＡＦＬＤ、Ｃ型肝炎、アルコール性脂肪肝疾患及び例えばスタチンによる薬物効果の１つ以上を含みうる。
【0065】
本発明は、対象において、ＰＡＮＸ１に関連した疾患又は状態の治療又は予防方法に使用するための、配列番号１を含むペプチド、又は配列番号１の機能的（又は治療的に効果的な）変異体（以後、「ペプチド活性剤」又は「本発明のペプチド」）を提供する。
【0066】
特に、組成物は人工の組成物である。
【0067】
組成物は、医薬組成物であり得、少なくとも１つの適切な薬学的担体を更に含む。
【0068】
変異体は、配列番号１の機能性又は治療用フラグメントであり得る。
【0069】
一実施形態では、変異体は、配列番号１に比較して１～８のアミノ酸の変化又は修飾を有する。一実施形態では、変異体は、配列番号１に比較して１～７のアミノ酸の変化を有する。一実施形態では、変異体は、配列番号１に比較して１～６のアミノ酸の変化を有する。一実施形態では、変異体は、配列番号１に比較して１～５のアミノ酸の変化を有する。一実施形態では、変異体は、配列番号１に比較して１～４のアミノ酸の変化を有する。一実施形態では、変異体は、配列番号１に比較して１～３のアミノ酸の変化を有する。一実施形態では、変異体は、配列番号１に比較して１～２のアミノ酸の変化を有する。一実施形態では、アミノ酸の変化は、アミノ酸の置換である。一実施形態では、アミノ酸の変化は、保存的置換である。一実施形態では、アミノ酸の変化は、アミノ酸の付加である。一実施形態では、アミノ酸の変化は、アミノ酸の欠失である。
【0070】
本発明の変異体は、以下のものを含む：
配列番号１の変異体
１、２又は３つの保存的アミノ酸置換、１、２又は３つの非保存的アミノ酸置換、１、２又は３つのアミノ酸の付加、１、２又は３つのアミノ酸の欠失を有する変異体を含む配列番号１（ＷＫＤＥＡＧＫＰＬＶＫ）の変異体は、以下に提供される。
配列番号１の変異体
１、２又は３つの保存的アミノ酸置換、１、２又は３つの非保存的アミノ酸置換、１、２又は３つのアミノ酸の付加、１、２又は３つのアミノ酸の欠失を有する変異体を含む配列番号１（ＷＫＤＥＡＧＫＰＬＶＫ）の変異体は、以下に提供される。
【0071】
１つの保存的アミノ酸置換：
ＷＫＥＥＡＧＫＰＬＶＫ（配列番号２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２））、ＦＫＤＥＡＧＫＰＬＶＫ（配列番号３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３））、ＷＫＤＥＡＧＫＰＭＶＫ（配列番号４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４））、ＷＫＤＥＡＧＲＰＬＶＫ（配列番号５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５））、ＷＲＤＥＡＧＫＰＬＶＫ（配列番号６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６））、ＷＫＤＥＡＧＫＰＬＭＫ（配列番号７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７））、ＷＫＤＱＡＧＫＰＬＶＫ（配列番号８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８））、ＷＫＤＥＡＴＫＰＬＶＫ（配列番号９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９））
ＷＫＥＥＡＧＫＰＬＶＫ（配列番号２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２））、ＦＫＤＥＡＧＫＰＬＶＫ（配列番号３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３））、ＷＫＤＥＡＧＫＰＭＶＫ（配列番号４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４））、ＷＫＤＥＡＧＲＰＬＶＫ（配列番号５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５））、ＷＲＤＥＡＧＫＰＬＶＫ（配列番号６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６））、ＷＫＤＥＡＧＫＰＬＭＫ（配列番号７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７））、ＷＫＤＱＡＧＫＰＬＶＫ（配列番号８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８））、ＷＫＤＥＡＴＫＰＬＶＫ（配列番号９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９））
【0072】
２つの保存的アミノ酸置換：
ＹＫＮＥＡＧＫＰＬＶＫ（配列番号１０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０））、ＷＫＮＥＳＧＫＰＬＶＫ（配列番号１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１））、ＷＫＤＥＡＧＫＴＬＶＲ（配列番号１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２））、ＦＫＤＥＡＴＫＰＬＶＫ（配列番号１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． １３））、ＦＫＤＥＡＧＫＰＬＩＫ（配列番号１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． １４））、ＷＫＤＥＡＧＫＴＬＬＫ（配列番号１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． １５））、ＷＫＮＥＡＧＫＰＶＶＫ（配列番号１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６））、ＷＫＤＥＡＧＲＴＬＶＫ（配列番号１７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７））
ＹＫＮＥＡＧＫＰＬＶＫ（配列番号１０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０））、ＷＫＮＥＳＧＫＰＬＶＫ（配列番号１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１））、ＷＫＤＥＡＧＫＴＬＶＲ（配列番号１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２））、ＦＫＤＥＡＴＫＰＬＶＫ（配列番号１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． １３））、ＦＫＤＥＡＧＫＰＬＩＫ（配列番号１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． １４））、ＷＫＤＥＡＧＫＴＬＬＫ（配列番号１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． １５））、ＷＫＮＥＡＧＫＰＶＶＫ（配列番号１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６））、ＷＫＤＥＡＧＲＴＬＶＫ（配列番号１７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７））
【0073】
３つの保存的アミノ酸置換：
ＷＥＤＥＳＧＫＰＬＬＫ（配列番号１８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８））、ＷＫＥＥＡＧＫＰＩＶＱ（配列番号１９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９））、ＹＫＮＥＡＧＫＰＬＶＲ（配列番号２０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０））、ＷＫＤＱＡＴＲＰＬＶＫ（配列番号２１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１））、ＷＫＤＥＳＧＫＰＶＬＫ（配列番号２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２））、ＷＱＤＤＳＧＫＰＬＶＫ（配列番号２３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３））、ＷＫＮＥＡＧＫＴＬＬＫ（配列番号２４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４））、ＷＫＤＫＡＧＥＰＬＶＲ（配列番号２５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５））
ＷＥＤＥＳＧＫＰＬＬＫ（配列番号１８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８））、ＷＫＥＥＡＧＫＰＩＶＱ（配列番号１９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９））、ＹＫＮＥＡＧＫＰＬＶＲ（配列番号２０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０））、ＷＫＤＱＡＴＲＰＬＶＫ（配列番号２１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１））、ＷＫＤＥＳＧＫＰＶＬＫ（配列番号２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２））、ＷＱＤＤＳＧＫＰＬＶＫ（配列番号２３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３））、ＷＫＮＥＡＧＫＴＬＬＫ（配列番号２４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４））、ＷＫＤＫＡＧＥＰＬＶＲ（配列番号２５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５））
【0074】
１つの非保存的アミノ酸置換：
ＷＫＤＥＡＧＮＰＬＶＫ（配列番号２６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６））、ＣＫＤＥＡＧＫＰＬＶＫ（配列番号２７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７））、ＷＫＤＥＡＧＫＰＬＧＫ（配列番号２８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２８））、ＷＫＤＥＮＧＫＰＬＶＫ（配列番号２９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２９））、ＷＫＤＥＡＲＫＰＬＶＫ（配列番号３０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０））、ＷＫＤＥＡＧＫＰＬＶＴ（配列番号３１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３１））、ＷＫＤＥＡＧＫＲＬＶＫ（配列番号３２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３２））、ＷＫＷＥＡＧＫＰＬＶＫ（配列番号３３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３））
ＷＫＤＥＡＧＮＰＬＶＫ（配列番号２６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６））、ＣＫＤＥＡＧＫＰＬＶＫ（配列番号２７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７））、ＷＫＤＥＡＧＫＰＬＧＫ（配列番号２８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２８））、ＷＫＤＥＮＧＫＰＬＶＫ（配列番号２９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２９））、ＷＫＤＥＡＲＫＰＬＶＫ（配列番号３０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０））、ＷＫＤＥＡＧＫＰＬＶＴ（配列番号３１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３１））、ＷＫＤＥＡＧＫＲＬＶＫ（配列番号３２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３２））、ＷＫＷＥＡＧＫＰＬＶＫ（配列番号３３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３））
【0075】
２つの非保存的アミノ酸置換：
ＷＫＤＥＡＧＦＰＴＶＫ（配列番号３４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３４））、ＷＹＤＭＡＧＫＰＬＶＫ（配列番号３５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３５））、ＷＫＤＹＥＧＫＰＬＶＫ（配列番号３６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３６））、ＷＫＲＥＡＧＫＰＧＶＫ（配列番号１３７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３７））、ＷＫＬＥＫＧＫＰＬＶＫ（配列番号３８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３８））、ＷＫＤＥＡＧＫＰＣＶＫ（配列番号３９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３９））、ＷＫＫＥＡＰＫＰＬＶＫ（配列番号４０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４０））、ＳＫＤＥＡＧＰＰＬＶＫ（配列番号４１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４１））
ＷＫＤＥＡＧＦＰＴＶＫ（配列番号３４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３４））、ＷＹＤＭＡＧＫＰＬＶＫ（配列番号３５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３５））、ＷＫＤＹＥＧＫＰＬＶＫ（配列番号３６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３６））、ＷＫＲＥＡＧＫＰＧＶＫ（配列番号１３７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３７））、ＷＫＬＥＫＧＫＰＬＶＫ（配列番号３８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３８））、ＷＫＤＥＡＧＫＰＣＶＫ（配列番号３９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３９））、ＷＫＫＥＡＰＫＰＬＶＫ（配列番号４０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４０））、ＳＫＤＥＡＧＰＰＬＶＫ（配列番号４１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４１））
【0076】
３つの非保存的アミノ酸置換：
ＷＫＨＥＰＧＫＰＬＡＫ（配列番号４２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４２））、ＷＫＤＥＲＥＫＰＦＶＫ（配列番号４３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４３））、ＷＫＱＥＡＧＫＰＷＲＫ（配列番号４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４４））、ＶＫＤＥＡＫＫＰＬＶＨ（配列番号４５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４５））、ＮＷＤＥＡＧＫＭＬＶＫ（配列番号４６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４６））、ＩＫＤＥＤＧＰＰＬＶＫ（配列番号４７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４７））、ＬＫＤＥＹＧＫＰＬＶＮ（配列番号４８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４８））、ＷＫＤＲＡＧＫＥＬＴＫ（配列番号４９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４９））
ＷＫＨＥＰＧＫＰＬＡＫ（配列番号４２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４２））、ＷＫＤＥＲＥＫＰＦＶＫ（配列番号４３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４３））、ＷＫＱＥＡＧＫＰＷＲＫ（配列番号４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４４））、ＶＫＤＥＡＫＫＰＬＶＨ（配列番号４５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４５））、ＮＷＤＥＡＧＫＭＬＶＫ（配列番号４６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４６））、ＩＫＤＥＤＧＰＰＬＶＫ（配列番号４７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４７））、ＬＫＤＥＹＧＫＰＬＶＮ（配列番号４８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４８））、ＷＫＤＲＡＧＫＥＬＴＫ（配列番号４９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４９））
【0077】
アミノ酸の付加
ＷＫＤＥＡＧＫＰＬＰＶＫ（配列番号５０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５０））、ＷＫＧＤＥＮＹＡＧＫＰＬＶＫ（配列番号５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５１））、ＬＷＫＤＥＡＧＲＫＹＰＬＶＫ（配列番号５２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５２））、ＷＫＤＣＥＧＡＧＫＰＬＶＫ（配列番号５３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５３））、ＷＫＤＥＰＡＧＫＰＬＶＶＫ（配列番号５４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５４））、ＷＫＤＥＡＧＰＫＰＬＶＫ（配列番号５５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５５））、ＷＫＤＥＡＧＷＡＤＫＰＬＶＫ（配列番号５６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５６））、ＷＫＮＤＥＡＧＫＰＬＶＫ（配列番号５７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５７））
ＷＫＤＥＡＧＫＰＬＰＶＫ（配列番号５０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５０））、ＷＫＧＤＥＮＹＡＧＫＰＬＶＫ（配列番号５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５１））、ＬＷＫＤＥＡＧＲＫＹＰＬＶＫ（配列番号５２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５２））、ＷＫＤＣＥＧＡＧＫＰＬＶＫ（配列番号５３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５３））、ＷＫＤＥＰＡＧＫＰＬＶＶＫ（配列番号５４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５４））、ＷＫＤＥＡＧＰＫＰＬＶＫ（配列番号５５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５５））、ＷＫＤＥＡＧＷＡＤＫＰＬＶＫ（配列番号５６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５６））、ＷＫＮＤＥＡＧＫＰＬＶＫ（配列番号５７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５７））
【0078】
アミノ酸の欠失
ＷＫＤＡＫＰＬＶＫ（配列番号５８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５８））、ＷＫＥＡＧＫＰＶＫ（配列番号５９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５９））、ＷＫＤＥＡＫＰＬＶＫ（配列番号６０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６０））、ＷＤＥＡＧＫＰＶ（配列番号６１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６１））、ＷＫＤＥＡＧＫＰＶＫ（配列番号６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６２））、ＷＤＡＧＫＰＬＶＫ（配列番号６３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６３））、ＷＫＤＥＡＧＫＰＬＶ（配列番号６４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６４））、ＷＥＡＧＫＰＬＶ（配列番号６５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６５））
ＤＥＡＧＫＰＬＶ（配列番号９０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９０））
ＷＫＤＡＫＰＬＶＫ（配列番号５８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５８））、ＷＫＥＡＧＫＰＶＫ（配列番号５９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５９））、ＷＫＤＥＡＫＰＬＶＫ（配列番号６０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６０））、ＷＤＥＡＧＫＰＶ（配列番号６１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６１））、ＷＫＤＥＡＧＫＰＶＫ（配列番号６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６２））、ＷＤＡＧＫＰＬＶＫ（配列番号６３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６３））、ＷＫＤＥＡＧＫＰＬＶ（配列番号６４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６４））、ＷＥＡＧＫＰＬＶ（配列番号６５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６５））
ＤＥＡＧＫＰＬＶ（配列番号９０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９０））
【0079】
配列番号１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のフラグメントの例は、以下に提供される。
【0080】
ＷＫＤＥＡＧ（配列番号６６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６６））、ＷＫＤＥＡ（配列番号６７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６７））、ＫＤＥＡＧＫＰＬ（配列番号６８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６８））、ＫＤＥＡＧ（配列番号６９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６９））、ＤＥＡＧＫＰＬ（配列番号７０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７０））、ＧＫＰＬＶ（配列番号７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７１））、ＤＥＡＧＫ（配列番号７２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７２））、ＷＫＤＥＡＧＫＰＬ（配列番号７３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７３））、ＷＫＤ（配列番号７４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７４））、ＫＤＥ（配列番号７５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７５））、ＫＰＬＶＫ（配列番号７６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７６））、ＷＫＤＥ（配列番号７７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７７））、ＡＧＫＰＬ（配列番号７８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７８））、ＥＡＧ（配列番号７９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７９））、ＡＧＫ（配列番号８０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８０））、ＫＰＬ（配列番号８１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８１））、ＬＶＫ（配列番号８２（ＳＥＱ ２０ ＩＤ ＮＯ．８２））、ＧＫＰ（配列番号８３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８３））、ＤＥＡ（配列番号８４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８４））、ＰＬＶ（配列番号８５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８５））
【0081】
組成物は、複数のペプチド、フラグメント及び／又は変異体を含むことが認識される。好ましくは、組成物は、少なくとも２つの本発明のペプチドを含む。好ましくは、組成物は、少なくとも３つの本発明のペプチドを含む。好ましくは、組成物は、少なくとも４つの本発明のペプチドを含む。好ましくは、組成物は、少なくとも５つの本発明のペプチドを含む。好ましくは、組成物は、少なくとも６つの本発明のペプチドを含む。好ましくは、組成物は、少なくとも７つの本発明のペプチドを含む。好ましくは、組成物は、少なくとも８つの本発明のペプチドを含む。好ましくは、組成物は、少なくとも９の本発明のペプチドを含む。好ましくは、組成物は、少なくとも１０の本発明のペプチドを含む。一実施形態では、組成物は、実質的に全てのペプチドを含む。一実施形態では、組成物は、実質的に全ての変異体を含む。一実施形態では、組成物は、実質的に他のペプチドを含まない。
【0082】
図１は、ＰＡＮＸ１チャネルタンパク質を例示する。このタンパク質は、４つのα－ヘリカル膜貫通（ＴＭ）ドメイン、２つの細胞外ループ、及び１つの細胞内ループを含む。タンパク質のＮ及びＣ末端は細胞の細胞質に曝されている。
【0083】
図２は、正常なホメオスタシスでのＰＡＮＸ１の活性を例示する（Ａ）。この図はまた、細胞外ＡＴＰ及びＫ＋が増加した場合におけるＰＡＮＸ１の活性を例示する（Ｂ）。この環境では、チャネルの開放の増加がある。炎症及び無調節ホメオスタシスは、ＡＴＰ放出の増加及びＣａ２＋の細胞流入の増加を伴う過剰なシグナル伝達を駆動する。
【0084】
図６は、ＰＡＮＸ１によって媒介される、又はＰＡＮＸ１の関連する細胞プロセス及び／又は疾患の例を示す。含まれる全てが、本明細書において、本発明内に想定されることが認識される。
【0085】
定義及び一般的優先事項
本明細書で使用される場合、特に別段の指示がない限り、以下の用語は、その用語が当技術分野で有するよりも広い（又は狭い）意味に加えて、以下の意味を有することが意図される。
本明細書で使用される場合、特に別段の指示がない限り、以下の用語は、その用語が当技術分野で有するよりも広い（又は狭い）意味に加えて、以下の意味を有することが意図される。
【0086】
文脈によって特に要求されない限り、本明細書での単数の使用は、複数を含み、その逆も同様であると理解されるべきである。エンティティ（実在物（entity））に対して使用される用語「ａ」又は「ａｎ」は、１以上のそのエンティティを言うように理解されるべきである。従って、用語「ａ」（又は「ａｎ」）、「１以上」、及び「少なくとも１つ」は本明細書で交換可能に使用される。
【0087】
本明細書で使用されるとき、用語「含む（comprise）」、又は、「含む（comprises）」若しくは「含んでいる（comprising）」などのその変形は、任意の列挙されたインテジャ（事項、物、完全体（integer））（例えば、特徴、要素、特性、性質、方法／プロセスステップ、又は制限）又は一群のインテジャ（特徴（複数）、要素、特性（複数）、性質（複数）、方法／プロセスステップ（複数）、又は制限（複数））を包含することを示すが、任意の他のインテジャ又は一群のインテジャを排除しない、と理解されるべきである。
【0088】
本明細書で使用するとき、語句「ＰＡＮＸ１に関連する疾患」は、ＰＡＮＸ１又はＰＡＮＸ１シグナル伝達が役割を果たす疾患又は状態をいう。この疾患又は状態は、対象又は対象の生物学的サンプルにおいてＰＡＮＸ１シグナル伝達又はＰＡＮＸ１発現の増加によって特徴づけられる、又は当該増加によって媒介されるものでありうる。この増加は、健常な対象と比較された場合である。サンプルは、血液、組織、細胞、器官などの任意の生物学的サンプルでありうる。一実施形態では、ＰＡＮＸ１は、ＰＡＮＸ１シグナル伝達及び／又は発現が、変異されていないＰＡＮＸ１と比較して増加されるように、前記対象において変異される。このような疾患及び状態は、当技術分野で公知であり、全てがここで想定される。ＰＡＮＸ１発現及びシグナル伝達を検出する手段は、当業者に周知である。
【0089】
本明細書で使用されるとき、用語「疾患」は、生理学的機能を損ない、特定の症状に関連した任意の異常な状態を定義するために使用される。この用語は、任意の障害、病気（illness）、異常、病状、病気（sickness）、生理学的機能が、病因の性質（又は、疾患の病因学的基礎が実際に確立しているかどうか）に関わりなく損なわれる状態又は症候群を包含するように広く使用される。従って、これは、感染、外傷、傷害、手術、放射線学的焼灼（radiological ablation）、老化（age）、中毒、又は栄養失調から生じる状態を包含する。
【0090】
本明細書で使用するとき、用語「治療（treatment）」又は「治療する（treating）」は、疾患の症状を治す、改善する、又は減少させる、又はその原因を除去する（又はその影響を低下する）治療介入（例えば、対象への薬剤の投与）をいう。この場合において、この用語は、用語「治療（療法、therapy）」と同意語として使用される。
【0091】
加えて、用語「治療」又は「治療する」は、疾患の始まり又は進行を予防し又は遅らせるか、又は治療集団の範囲内でその発生を減少する（又は根絶する）治療介入（例えば、対象への薬剤の投与）をいう。この場合において、この用語は、用語「予防（Prophylaxis）」と同意語として使用される。
【0092】
本明細書で使用するとき、薬剤の「有効量」又は「治療的に有効な量」は、過度な毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症を伴わずに対象に投与することができ、合理的な利益／リスク比と等しい量であるが、所望の効果、例えば、対象の状態を恒久的に又は一時的に改善することによって示される治療又は予防を患者に提供する量を規定する。この量は、対象の物理的大きさ、年齢、及び個々の一般的状態、投与の方法、及び他の因子に依存して、いろいろに変化する。従って、実際の有効量を特定することは可能でないが、当業者は、日常の実験及び一般的なバックグラウンドの知識を用いて任意の個々の場合の適切な「有効」量を決定することができるであろう。この文脈での治療的な結果は、症状の根絶又は減少、痛み又は不快の低減、生存率の延長、移動の改善、及び臨床的な改善の他のマーカーを含む。治療的な結果は、必ずしも完治である必要はない。改善は、生物学的／分子マーカー、臨床的又は観察的な改善で観測されればよい。好ましい実施形態では、本発明の方法は、ヒト、大型のレーシング動物（racing animals）（ウマ、ラクダ、イヌ）、及び家庭内コンパニオンアニマル（domestic companion animals)（ネコ及びイヌ）に適用可能である。
【0093】
先に定義した治療及び有効量の文脈では、用語「対象」（これは、文脈が許す限り、「個人」、「動物」、「患者」、又は「哺乳類」を含むと理解されるべきである。）は、治療が意図される任意の対象、特に哺乳類対象を規定する。哺乳類対象は、ヒト、飼育動物（家畜（domestic animals））、畜産動物（家畜（farm animals））、動物園の動物、スポーツ動物（sport animals）、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ラクダ、バイソン、牛（cattle）、ウシ（cow）などのペット動物、類人猿、サル、オランウータン、及びチンパンジーなどの霊長類、イヌ及びオオカミなどのイヌ科の動物、ネコ、ライオン、及びトラなどのネコ科の動物、ウマ、ロバ、及びシマウマなどのウマ化の動物、ウシ、ブタ、及びヒツジなどの食用動物、シカ及びキリンなどの有蹄類、並びに、マウス、ラット、ハムスター、及びモルモットなどの齧歯動物を含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、対象はヒトである。本明細書で使用されるとき、用語「ウマ科」は、ウマ科（family Equidae）の動物をいい、これには、ウマ、ロバ（donkeys）、ロバ（asses）、キヤン（kiang）、及びシマウマが含まれる。対象は、治療を必要とする、即ち、疾患又は状態の治療又は予防が必要な対象でありうる。
【0094】
「医薬組成物」：本発明の更なる態様は、1以上の薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤もしくは担体と混合された、又は治療効果を高める他の薬剤と共投与されるペプチド活性剤を含む医薬組成物に関する。本発明のペプチド及び組成物は単独で投与されうるが、これらは、特にヒトの治療のための薬学的担体、賦形剤又は希釈剤との混合物として一般に投与される。医薬組成物は、ヒト及び獣医学の医薬におけるヒトもしくは動物に使用するためのものである。本明細書に記載された医薬組成物の種々の異なる形態に対するかかる適切な賦形剤の例は、「Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd Edition, (1994), Edited by A Wade and PJ Weller」（非特許文献１２）に見出すことができる。特に、局所送達のための製剤は、Topical drug delivery formulations edited by David Osborne and Antonio Aman, Taylor & Francis（非特許文献１３）に記載されており、この全内容は参照により本明細書に取り込まれる。治療用途のための許容される担体又は希釈剤は、薬学的技術分野の当業者に周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.（A. R. Gennaro edit. 1985)（非特許文献１４）に記載されている。適切な担体の例には、ラクトース、デンプン、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ソルビトールなどが含まれる。適切な希釈剤の例には、エタノール、グリセロール及び水が含まれる。薬学的担体、賦形剤又は希釈剤の選択は、意図した投与経路及び標準的な薬学的実務に関して選択されうる。医薬組成物は、担体、賦形剤又は希釈剤として、又はこれらに加えて、任意の適切な、結合剤（単数又は複数）、潤滑剤（単数又は複数）、懸濁剤（単数又は複数）、コーティング剤（単数又は複数）、可溶化剤（単数又は複数）を含むことができる。適切な結合剤の例には、デンプン、ゼラチン、グルコースなどの天然糖、無水ラクトース、フリーフローラクトース、ベータ－ラクトース、コーンスウィートナー、アカシア、トラガガントもしくはアルギン酸ナトリウムなどの天然及び合成ゴム、カルボキシメチルセルロース及びポリエチレングリコールが含まれる。適切な潤滑剤の例には、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが含まれる。防腐剤、安定化剤、色素及び着香剤さえも医薬組成物に提供することができる。防腐剤の例には、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びｐ－ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。抗酸化剤及び懸濁剤も使用されうる。
【0095】
本明細書で使用される用語「ペプチド」は、ペプチド結合を介して典型的に結合された最大５０個までのアミノ酸、例えば５～５０個のアミノ酸モノマーから構成されるポリマーをいう。本発明のペプチド及び本発明で使用されるペプチド（そのフラグメント及び変異体を含む）は、化学合成によって又は核酸からの発現によって完全に又は部分的に生成されうる。例えば、本発明のペプチド及び本明細書で使用されるペプチドは、当技術分野で公知のよく確立された標準的な液相又は好ましくは固相ペプチド合成法に従って、容易に調製されうる（例えば、J. M. Stewart and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984)（非特許文献１５）、M. Bodanzsky and A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York (1984)（非特許文献１６）参照）。必要であれば、本明細書で使用されるいずれのペプチドもそれらの安定性を高めるために化学的に修飾されうる。化学的に修飾されたペプチド又はペプチド類似体は、本発明の実施に関して、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでその増加した安定性及び／又は有効性によって特徴付けられるペプチドの任意の機能的化学的等価体を含む。用語ペプチド類似体はまた、本明細書に記載されたペプチドの任意のアミノ酸誘導体をいう。ペプチド類似体は、側鎖への修飾、ペプチド合成の間の非天然アミノ酸及び／又はそれらの誘導体の取り込み、並びに、架橋剤の使用、及びペプチドもしくはそれらの類似体のコンホーメーションの束縛を付与する他の方法を含む（但し、これらに限定されない）手順によって製造されうる。側鎖の修飾の例は、アルデヒドと反応し、次いでＮａＢＨ４で還元することによる還元的アルキル化、メチルアセトアミデートでのアミド化、無水酢酸でのアセチル化、シアネートでのアミノ基のカルバミル化、２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）でのアミノ基のトリニトロベンジル化、無水コハク酸と無水テトラヒドロフタル酸でのアミノ基のアルキル化、並びにピリドキサ－５’－ホスフェートでのリジンのピリドキシル化と引き続きのＮａＢＨ４での還元によるなどのアミノ基の修飾を含む。アルギニン残基のグアニジノ基は、２，３－ブタンジオン、フェニルグリオキサール及びグリオキサールなどの試薬によるヘテロ環縮合産物の形成によって修飾されうる。カルボキシル基は、ｏ－アシルイソ尿素の形成とこれに続く、例えば対応するアミドへの誘導体化を介したカルボジイミド活性化によって修飾されうる。スルフヒドリル基は、ヨード酢酸もしくはヨードアセトアミドでのカルボキシメチル化、システイン酸への過ギ酸酸化、他のチオール化合物による混合ジスルフィドの形成、マレイミド、無水マレイン酸もしくは他の置換マレイミドとの反応、４－クロロマーキュリー安息香酸塩、４－クロロマーキュリーフェニルスルホン酸、フェニル水銀クロリド、２－クロロマーキュリー－４－ニトリフェノール（2-chloromercuric-4-nitrophenol）及び他の水銀化合物を用いた水銀誘導体の形成、アルカリ性ｐＨでのシアネートでのカルバミル化などの方法によって修飾されうる。トリプトファン残基は、例えば、Ｎ－ブロモスクシンイミドによる酸化、又は２－ヒドロキシ－５－ニトロベンジルブロミドもしくはスルホニルハライドでのインドール環のアルキル化によって修飾されうる。チロシン残基は、テトラニトロメタンでニトロ化し、３－ニトロチロシン誘導体を形成することにより変化されうる。ヒスチジン残基のイミダゾール間の修飾は、ヨード酢酸誘導体でのアルキル化、又はジエチルピロカーボネートでのＮ－カルベチオキシル化によって実現されうる。ペプチド合成の間の非天然アミノ酸及び誘導体の取り込みの例は、ノルロイシン、４－アミノ酪酸、４－アミノ－３－ヒドロキシ－５－フェニルペンタン酸、６－アミノヘキサン酸、ｔ－ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、４－アミノ－３－ヒドロキシ－６－メチルヘプタン酸、２－チエニルアラニン、及び／又はアミノ酸のＤ－異性体の使用を含むが、これらに限定されない。ペプチド構造の修飾は、Ｄ－アミノ酸によりコードされるリバース配列（reversed sequence）を含むレトロ－インベルソペプチド（retro-inverso peptide）の生成を含む。変更は、タンパク質分解に対する感受性を低下する、酸化に対する感受性を低下する、変異体の配列の結合親和性を変化する（典型的には、親和性を増加するものが望ましい）、及び／又は、関連する変異体／類似体ペプチドの他の物理化学的又は機能的特性を付与するもしくは修飾するものでありうる。
【0096】
参照ペプチドに対して適用される、用語「治療に有効な変異体」は、参照ペプチドと実質的に同一であり、以下に定義するような治療に有効であるアミノ酸配列を有するペプチドを意味する。従って、例えば、この用語は、１以上のアミノ酸残基に関して変更された変異体を含むように受け取られるべきである。好ましくは、このような変更は、６以下のアミノ酸、好ましくは５以下、４以下、更に好ましくは３以下、最も好ましくは１又は２のアミノ酸のみの、挿入、付加、欠失及び／又は置換を含む。天然及び修飾アミノ酸での挿入、付加及び置換が考えられる。変異体は、保存的なアミノ酸の変化を有ことができ、この場合、導入されるアミノ酸は、置換されるものと構造的に、化学的に、又は機能的に同じである。一般に、変異体は、元の配列と、少なくとも５０％、６０％、７０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは９０％の配列同一性、理想的には、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。いずれの変異体も、基本的には、疾患のｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏモデルで試験された場合、同じ治療効果を有するか、又は、増強された効果を有しうる。５つのアミノ酸がＤ－型のアミノ酸で置換された例示的な変異体が、配列番号８６として提供される。
【0097】
本発明のペプチドに適用されるとき、「機能性」と交換可能に使用される「治療に有効な」は、ＰＡＮＸ１を標的にでき、その機能を調節することができるペプチドを意味する。ＰＡＮＸ１のターゲティングを決定する手段は、本明細書に記載されているとおりである。ＰＡＮＸ１調節を決定する手段は、本明細書に記載されているとおりであり、当技術分野で知られているとおりである。
【0098】
用語変異体はまた、用語「フラグメント」を包含するように受け取られ、従って、アミノ酸の配列番号１のフラグメントを意味する。典型的には、フラグメントは、長さが３～１０の隣接したアミノ酸を有する。一般に、フラグメントは、－５～＋３の電荷を有する。ペプチド、フラグメント又は領域の電荷は、Cameselle, J.C., Ribeiro, J.M., and Sillero, A. (1986). Derivation and use of a formula to calculate the net charge of acid-base compounds. Its application to amino acids, proteins and nucleotides. Biochem. Educ. 14, 131-136（非特許文献１７）の方法を用いて決定される。
【0099】
本明細書において、用語「配列同一性（sequence identity）」は、配列同一性と配列類似性（sequence similarity）の両方を含むと理解されるべきであり、即ち、参照配列と７０％の配列同一性を共有する変異体（又はホモログ）は、変異体の変化した残基の任意の７０％が、配列の全長にわたって参照配列の対応する残基と同一であるか、又は当該残基の保存的置換体であるものである。配列同一性は、２つの異なる配列間で実際に一致する文字（キャラクター（characters））の量である。従って、ギャップはカウントされず、測定は２つの配列のより短い部分に関連する。
【0100】
「配列相同性」の用語について、この用語は、変異体（又はホモログ）の変化された残基のパーセントが参照配列の対応する残基と同一であるか又は当該残基の保存的置換体であり、この変異体（又はホモログ）が参照配列と同じ機能を共有するとき、定義されたパーセント類似性又は同一性を参照配列と共有する変異体（又はホモログ）を意味すると理解されるべきである。
【0101】
整列及びパーセント相同性もしくは配列同一性は、当技術分野で公知のソフトウェアプログラムを用いて決定することができ、例えば、１つの整列プログラムはデフォルトパラメータを用いるＢＬＡＳＴである。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレス：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgiに見出すことができる。
【0102】
フラグメントに適用される「Ｃ－末端ドメイン」は、フラグメントのｃ－末端での最初の３つのアミノ酸を意味する。
【0103】
フラグメントに適用される「Ｎ－末端ドメイン」は、フラグメントのｎ－末端での最後の３つのアミノ酸を意味する。
【0104】
参照タンパク質の「相同体」は、参照タンパク質と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列相同性を有する、異なる種の植物からのタンパク質を意味すると理解されるべきである。
【0105】
ペプチド又は組成物は、局所、経口、直腸、非経口、筋肉内、腹腔内、動脈内、気管支内、皮下、皮内、静脈内、鼻、膣、口腔又は舌下の経路の投与に適し、これらの経路によって投与されうる。経口投与については、特定用途は、圧縮錠剤、ピル、錠剤、ゲルル（gellules）、ドロップ、及びカプセルで作成される。好ましくは、これらの組成物は、用量あたり、１～２５０ｍｇ、より好ましくは、１０～１００ｍｇの活性成分を含有する。他の投与形態は,溶液又はエマルジョンを含み、これらは、静脈内、動脈内、皮下、皮内、腹腔内又は筋肉内で注入され得、滅菌又は滅菌可能な溶液から調製される。本発明の医薬組成物はまた、座薬、膣リング、ペッサリー、懸濁液、エマルジョン、ローション、軟膏、クリーム、ゲル、スプレー、溶液又は散布剤の形態であってもよい。本発明の組成物は、局所送達用に製剤化されうる。局所送達は、一般に、皮膚への送達を意味するが、上皮細胞で覆われている体腔、例えば、肺若しくは気道、胃腸管、口腔への送達をも意味する。特に、局所送達のための製剤は、Topical drug delivery formulations edited by David Osborne and Antonio Aman, Taylor & Francis（非特許文献１８）に記載されており、この全内容は参照により本明細書に取り込まれる。気道への送達のための組成物又は製剤は、Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎら（O’Riordan et al, Respir Care, 2002, Nov. 47)（非特許文献１９）、欧州特許出願公開第２０５０４３７号明細書（EP2050437）（特許文献４）、国際公開第２００５／０２３２９０（WO2005023290）（特許文献５）、米国特許出願公開第２０１０／０９８６６０号明細書（US2010098660）（特許文献６）及び米国特許出願公開第２００７／００５３８４５号明細書（US20070053845）（特許文献７）に記載されている。回腸、特に近位回腸へ活性剤を送達するための組成物及び製剤は、マイクロ粒子及びマイクロカプセルを含み、これらでは、活性剤が、酸に抵抗性であるが、回腸のよりアルカリ性の環境で溶解する傾向のあるポリマー若しくは乳タンパク質（daily protein）で形成された保護用マトリックス内にカプセル化される。このような送達系の例は、欧州特許出願第１０７２６００．２号明細書（EP1072600.2）（特許文献８）及び欧州特許出願第１３１７１７５７．１号明細書（EP13171757.1）（特許文献９）に記載されている。経皮投与の代替の手段は、皮膚パッチの使用によるものである。例えば、活性成分は、ポリエチレングリコール又は液体パラフィンの水性エマルジョンからなるクリームに混合される。活性成分はまた、１～１０重量％の濃度で、白色ワックス又は白色軟質パラフィンベースからなる軟膏に、必要な安定剤及び防腐剤などと共に混合されうる。注入可能な形態は、用量あたり１０～１０００ｍｇ、好ましくは１０～２５０ｍｇの活性成分を含有しうる。組成物は、単位用量形態、即ち、単位用量を含有する個別部分の形態、又は単位用量の複数又はサブユニットで製剤化されうる。
【0106】
当業者は、本発明の組成物を１つの適切な用量を容易に決定し、過度の実験をすることなく対象に投与することができる。典型的には、医師は、個々の患者に最も適するであろう実際の用量を決定することができ、実際の用量は、使用される特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性及び活性の長さ、年齢、体重、一般的な健康、性別、食餌、投与の方法及び時間、排出の速度、薬剤の組み合わせ、特定の状態の重篤度、及び個々が受ける治療を含む種々の因子に依存する。本明細書で開示される用量は、平均的な場合の例示である。もちろん、より高い又はより低い用量の範囲が正当な個々の例があり得、これは本発明の範囲内である。必要に応じて、薬剤は０．０１～３０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば０．１～１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは、０．１～１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与されうる。例示的な実施形態では、１０～３００ｍｇ／日、又は、より好ましくは１０～１５０ｍｇ／日の１以上の用量が、炎症性障害の治療のために患者に投与される。
【0107】
特に好ましい実施形態では、本発明の方法及び使用は、１以上の他の活性剤、例えば治療又は予防される疾患の市場で利用可能な既存の薬剤又は薬学的向上剤（エンハンサー（enhancers））と組み合わせてペプチド又は組成物を投与することを含む。このような場合、本発明の化合物は、１以上の他の活性剤と続けて、同時に、又は逐次的に投与されうる。
【0108】
本発明の一実施形態では、ペプチド活性剤は、ペプチド、リンカー、及びｉｎ－ｖｉｖｏで複合体の半減期を増加することを意図した抗体分子（又は抗体フラグメント）を含む複合体の形態で投与されうる。
【0109】
「修飾ペプチド」：一実施形態では、本発明のペプチド（ペプチド変異体を含む）は、修飾ペプチドであってもよい。用語「修飾ペプチド」は、用語ペプチドの誘導体と交換可能に使用される。一実施形態では、用語「修飾ペプチド」は、修飾されていないペプチドと比較して以下の特性の１以上を示すように修飾されたペプチドを意味する：典型的にはｒｐＳ６ホスホリル化を維持しながら、血漿半減期を増加する、ペプチドの親油性を増加する、修飾ペプチドの腎クリアランスを増加する、及びタンパク質分解に対する修飾ペプチドの耐性を増加する。これらの特性を示すように本発明のペプチドを修飾する種々の方法が本明細書で開示され、これらには、結合パートナー（例えば、アルブミン結合性小分子、大きなポリマー、長寿命血漿タンパク質、又は抗体もしくは抗体フラグメント）とペプチドの複合体形成、環化、Ｎ－もしくはＣ－末端、又は側鎖の付加、基を保護すること、Ｌ－アミノ酸をＤ－異性体で置換すること、アミノ酸修飾、血漿タンパク質の結合性の増加、アルブミン結合性の増加を含む。修飾ペプチドは、本明細書で定義した１以上の基で置換されたペプチド、結合パートナーと複合体形成されたペプチド、又は環化されたペプチドを含むが、これらに限定されない。一般に、ペプチドは、動物のｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を増加するように修飾される。種々の修飾の方法が以下に提供される。
【0110】
一実施形態では、修飾は、細胞に侵入する能力が増加した本発明のペプチド及び／又は組成物を提供する任意の修飾でありうる。一実施形態では、修飾は、本発明の組成物又はペプチドの半減期を増やす任意の修飾でありうる。一実施形態では、修飾は、本発明の組成物又はペプチドの活性を高める任意の修飾でありうる。一実施形態では、修飾は、本発明の組成物又はペプチドの選択性を増加する任意の修飾でありうる。
【0111】
一実施形態では、基は保護基である。保護基は、Ｎ－末端保護基、Ｃ－末端保護基、又は側鎖保護基でありうる。ペプチドは、１以上のこれらの保護基を有しうる。
【0112】
当業者は、アミノ酸をこれらの保護基と反応するのに適した技術を知っている。これらの基は、当技術分野で公知の調製方法、例えば米国特許出願公開第２０１４／１２０１４１号明細書（US2014120141）の段落［０１０４］～［０１０７］に概説されている方法によって付加することができる。基は、ペプチドに維持されてもよく、又は除去されてもよい。保護基は合成の間に付加されうる。
【0113】
本発明の実施形態では、ペプチドは、飽和又は不飽和の、ヒドロキシル、アミノ、アミノアシル、サルフェートもしくはスルフィド基で置換された又は無置換の、１～２９個の炭素原子を有する直鎖もしくは分岐鎖、長鎖もしくは短鎖の１以上から選択される基で置換されうる。Ｎ－アシル誘導体は、酢酸、カプリン酸、ミリスチン酸、オクタン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、リノール酸、リノレン酸、リポ酸、オレイン酸、イソステアリン酸、エライジン酸、２－エチルヘキサン酸、ココナッツオイル脂肪酸、タロウ脂肪酸、硬化タロウ脂肪酸（hardened tallow fatty acid）、パーム核脂肪酸、ラノリン脂肪酸、又は同様の酸由来のアシル基を含む。これらは、置換されてもよく、又は置換されなくともよい。置換される場合、これらは、好ましくは、ヒドロキル、又はＳＯ３Ｈ、ＳＨ、又はＳ－Ｓ（これらに限定されない）などの硫黄含有基で置換されうる。
【0114】
本発明の実施形態では、ペプチドは、Ｒ１－Ｘ－Ｒ２である。
【0115】
Ｒ１及び／又はＲ２基は、それぞれ、ペプチド配列のアミノ末端（Ｎ－末端）及びカルボキシル末端（Ｃ－末端）に結合する。
【0116】
一実施形態では、ペプチドは、Ｒ１－Ｘである。あるいは、ペプチドは、Ｘ－Ｒ２である。
【0117】
好ましくは、Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１～４アルキル、アセチル、ベンゾイル、又はトリフルオロアセチルである。
【0118】
Ｘは本発明のペプチドである。
【0119】
Ｒ２は、ＯＨ又はＮＨ２である。
【0120】
一実施形態では、Ｒ１は、Ｈ、非環状の置換もしくは非置換脂肪族基、置換もしくは非置換の脂環式（alicyclyl）、置換もしくは非置換複素環、置換もしくは非置換ヘテロアリールアルキル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換アラルキル、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、及びＲ５－ＣＯ－（式中、Ｒ５はＨ、非環状の置換もしくは非置換脂肪族基、置換もしくは非置換の脂環式、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換アラルキル、置換もしくは非置換複素環、及び置換もしくは非置換ヘテロアリールアルキルによって形成される基から選択される）によって形成される基から選択される。
【0121】
Ｒ２は、Ｒ１及びＲ２はα－アミノ酸ではないという条件下で、－ＮＲ３Ｒ４、－ＯＲ３及び－ＳＲ３（式中、Ｒ３及びＲ４は、Ｈ、非環状の置換もしくは非置換脂肪族基、置換もしくは非置換の脂環式、置換もしくは非置換複素環、置換もしくは非置換ヘテロアリールアルキル、置換もしくは非置換アリール、及び置換もしくは非置換アラルキルによって形成される基から独立して選択される）によって形成される基から選択される。
【0122】
別の好ましい実施形態によれば、Ｒ２は、－ＮＲ３Ｒ４、－ＯＲ３又は－ＳＲ３であり、式中、Ｒ３及びＲ４は、Ｈ、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２４アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２４アルケニル、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２４アルキニル、置換もしくは非置換Ｃ３～Ｃ２４シクロアルキル、置換もしくは非置換Ｃ５～Ｃ２４シクロアルケニル、置換もしくは非置換Ｃ８～Ｃ２４シクロアルキニル、置換もしくは非置換Ｃ６～Ｃ３０アリール、置換もしくは非置換Ｃ７～Ｃ２４アラルキル、Ｃ３～１０員の置換もしくは非置換ヘテロ環（hetericyclyl ring）、及び２～２４個の炭素原子及び１～３個の炭素以外の原子の置換もしくは非置換ヘテロアリールアルキルであってアルキル鎖が１～６個の炭素原子であるものによって形成される基から独立して選択される。任意選択的には、Ｒ３及びＲ４は、飽和又は不飽和炭素－炭素結合によって結合され、窒素原子を有する環を形成しうる。より好ましくは、Ｒ２は、－ＮＲ３Ｒ４又は－ＯＲ３であり、式中、Ｒ３及びＲ４は、Ｈ、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２４アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２４アルケニル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２４アルキニル、置換もしくは非置換Ｃ３～Ｃ１０シクロアルキル、置換もしくは非置換Ｃ６～Ｃ１５アリール及びＣ３～１０員の置換もしくは非置換ヘテロ環（hetericyclyl）、３～１０員の環及び１～６個の炭素原子のアルキル鎖を有する置換もしくは非置換ヘテロアリールアルキルによって形成される基から独立して選択される。より好ましくは、Ｒ３及びＲ４は、Ｈ、メチル、エチル、ヘキシル、ドデシル、又はヘキサデシルによって形成される基から選択される。更に好ましくは、Ｒ３はＨであり、Ｒ４は、Ｈ、メチル、エチル、ヘキシル、ドデシル、又はヘキサデシルによって形成される基から選択される。更に好ましい実施形態によれば、Ｒ２は、－ＯＨ及び－ＮＨ２から選択される。
【0123】
本発明の別の実施形態によれば、Ｒ１は、Ｈ、アセチル、ラウロイル、ミリストイル又はパルミトイルによって形成される基から選択され、Ｒ２は、－ＮＲ３Ｒ４又は－ＯＲ３であり、式中、Ｒ３及びＲ４は、Ｈ、メチル、エチル、ヘキシル、ドデシル及びヘキサデシルから独立して選択され、好ましくは、Ｒ２は－ＯＨ又は－ＮＨ２である。より好ましくは、Ｒ１はアセチル又はパルミトイルであり、Ｒ２は－ＮＨ２である。
【0124】
好ましい実施形態では、アシル基は、ペプチドの少なくとも１つのアミノ酸のＮ－末端に結合される。
【0125】
本発明の実施形態では、ペプチドは、側鎖保護基を含むように修飾される。側鎖保護基は、ベンジルもしくはベンジルベースの基、ｔ－ブチルベースの基、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基、及びアリルオキシカルボニル（ａｌｌｏｃ）保護基を含む基の１つ以上でありうる。側鎖保護基は、アキラルのグリシンなどのアキラルアミノ酸から誘導されうる。アキラルアミノ酸の使用は、得られたペプチドを安定化する助けとなり、本発明の合成経路を容易にもする。好ましくは、ペプチドは、修飾されたＣ－末端、好ましくはアミド化されたＣ－末端を更に含む。アキラル残基は、α－アミノイソ酪酸（メチルアラニン）でありうる。使用される特定の側鎖保護基は、ペプチドの配列及び使用されるＮ－末端保護基のタイプに依存することが理解されるであろう。
【0126】
本発明の一実施形態では、ペプチドは、ポリエチレングリコールポリマー又は分子量を増加する化合物などの他の化合物の１以上に複合体化される、結合される、又は融合される。分子量を増加する化合物は、典型的には、得られる複合体の１０～９０％、又は２０～５０％まで分子量を増加する任意の化合物であり、２００～２０，０００、好ましくは５００～１０，０００の分子量を有しうる。分子量を増加する化合物は、ＰＥＧ、任意の水溶性（両親媒性又は親水性）ポリマー部分、ＰＥＧのホモポリマーもしくはコポリマー、ＰＥＧのモノメチル置換ポリマー（ｍＰＥＧ）及びポリオキシエチレングリコール（ＰＯＧ）、ポリリシン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、Ｌ－コンホーメーションの特定のもの、アルブミン、ゼラチン、脂肪酸、多糖、脂質アミノ酸（lipid amino acid）及びデキストランなどの薬理学的に不活性なタンパク質でありうる。ポリマー部分は、直鎖又は分岐鎖であってよく、５００～４００００Ｄａ、５０００～１００００Ｄａ、１００００～５０００Ｄａの分子量を有しうる。この化合物は、ｔａｔペプチド、ペネトラチン（penetratin）、ｐｅｐ－１などの、任意の適切な細胞透過性化合物でありうる。この化合物は、抗体分子でありうる。この化合物は、親油性部分又はポリマー部分でありうる。
【0127】
親油性置換基及びポリマー置換基は当技術分野で公知である。親油性置換基は、アシル基、スルホニル基、Ｎ原子、Ｏ原子又はＳ原子を含み、エステル、スルホニルエステル、チオエステルアミド又はスルホンアミドの部分を形成するものである。親油性部分は、４～３０個の炭素原子、好ましくは８～１２個の炭素原子を有する炭化水素鎖を含みうる。これは、直鎖もしくは分岐鎖、飽和もしくは不飽和であってよい。炭化水素鎖は、更に置換されていてもよい。これは、シクロアルカン又はヘテロシクロアルカンでありうる。
【0128】
ペプチドは、Ｎ－末端、Ｃ－末端又はその両方で修飾されうる。ポリマー又は化合物は、好ましくは、アミノ基、カルボキシル基又はチオ基に結合され、任意のアミノ酸残基の側鎖のＮ－末端又はＣ－末端によって結合されうる。ポリマー又は化合物は、任意の適切な残基の側鎖に複合体化されうる。
【0129】
ポリマー又は化合物は、スペーサーを介して複合体化されうる。スペーサーは、天然又は非天然アミノ酸、琥珀酸、リシル、グルタミル、アルパラギル、グリシル、β－アラニル、γ－アミノブタノイルでありうる。ポリマー又は化合物は、エステル、スルホニルエステル、チオエステル、アミド、カルバメート、ウレア、スルホンアミドを介して複合体化されうる。当業者は、記載した複合体を調製する適切な手段を知っている。
【0130】
ペプチドは、例えばこれらの循環半減期（circulating half-life）を高めるために、ポリマーへの共有結合での複合体化により化学的に修飾されうる。例示的なポリマー及びこのようなポリマーをペプチドに結合する方法は、米国特許第４，７６６，１０６号明細書（U.S. Pat. No 4,766,106）（特許文献１１）、米国特許第４，１７９，３３７号明細書（U.S. Pat. No 4,179,337）（特許文献１２）、米国特許第４，４９５，２８５号明細書（U.S. Pat. No4,495,285）（特許文献１３）、及び米国特許第４，６０９，５４６号明細書（U.S. Pat. No 4,609,546）（特許文献１４）に例示されている。追加の具体的ポリマーは、ポリオキシエチル化ポリオール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む。
【0131】
本発明のペプチドは、保存安定性、薬動力学、及び／又は、有効性、選択性及び薬物相互作用などのペプチドの生物活性の任意の側面を操作するために１以上の修飾を受けうる。ペプチドが受ける化学的修飾は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシプロピレングリコール、デキストラン、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、及びポリビニルアルコール、コロミン酸又は他の炭水化物ベースのポリマー、アミノ酸のポリマー、及びビオチン誘導体の１つ以上のペプチドへの複合体化を含むが、これらに限定されない。Ｃｙｓ残基でのタンパク質のＰＥＧ複合体化は、例えば、Goodson, R. J. & Katre, N. V. (1990) Bio/Technology 8, 343（非特許文献２０）及びKogan, T. P. (1992) Synthetic Comm. 22, 2417（非特許文献２１）に開示されている。
【0132】
修飾ペプチドはまた、１以上の残基が修飾された（即ち、ホスホリル化、サルフェーション、アシル化、ＰＥＧ化などによって）配列、及び元の配列に対して修飾された１以上の残基を含む突然変異体を含みうる。アミノ酸配列はまた、検出可能なシグナルをもたらすことができる標識で、直接的又は間接的に修飾さてもよく、このような標識は、放射性同位体、蛍光、及び酵素標識を含むが、これらに限定されない。蛍光標識は、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、アレクサ（Alexa）、ＢＯＤＩＰＹ、フルオロセイン（例えば、ＦｌｕｏｒＸ、ＤＴＡＦ、及びＦＩＴＣ）、ローダミン（例えばＴＲＩＴＣ）、オーラミン、テキサスレッド、ＡＭＣＡブルー、及びルシファーイエローを含む。好ましい同位体標識は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、及び２８６Ｒｅを含む。好ましい酵素標識は、ペルオキシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、β－Ｄ－グルコシダーゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼプラスペルオキシダーゼ、及びアルカリ性ホスファターゼを含む（例えば、米国特許第３，６５４，０９０号明細書（U.S. Pat. No. 3,654,090）（特許文献１５）、米国特許第３，８５０，７５２号明細書（U.S. Pat. No. 3,850,752）（特許文献１６）、及び米国特許第４，０１６，０４３号明細書（U.S. Pat. No. 4,016,043）（特許文献１７）参照）。酵素は、カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒドなどのような架橋分子と反応することにより複合体化されうる。酵素標識は、視覚的に検出されうるか、又は、熱量測定技術、分光学的技術、蛍光分光学的技術、電流測定技術もしくは気体定量技術によって測定されうる。アビジン／ビオチン、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ（商標））などの他の標識システムは、当技術分野で公知であり、商業的に利用可能である（例えば、ＡＢＣキット、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ｃａｌｉｆ．、ＮＥＮ（登録商標）、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ．、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．参照）。
【0133】
一実施形態では、ペプチド、変異体及び／又は組成物は、薬物性能の能力を増加するために修飾される。一実施形態では、ペプチド、変異体及び／又は組成物は、安定性を高め、浸透性を高め、維持能力を高め、毒性を除き、及び／又は半減期を増加するために修飾されうる。修飾は、上述したとおりでありうる。例えば、修飾は、Ｎ及びＣ－末端を保護することであり得、修飾されたアミノ酸、環化、アミノ酸の置換、及び／又はマクロ分子又は大きなポリマー又は長寿命の血漿タンパク質への複合体化でありうる。半減期を延ばす戦略は、Ｓｔｒｏｈｌら（Strohl, et al, BioDrug, 2015）（非特許文献２２）、Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙら（Schlapschy, et al, Protein Eng Des Sel. 2013）（非特許文献２３）、Ｐｏｄｕｓｔ，ＶＮら（Podust, VN, et al, Protein Eng Des Sel. 2013）（非特許文献２４）、Ｚｈａｎｇ，Ｌら（Zhang, L et al, Curr Med Chem. 2012）（非特許文献２５）、Ｇａｂｅｒｃ－Ｐｏｒｅｋａｒ，Ｖ，ら（Gaberc-Porekar, V, et al, Curr Opin Drug Discov Devel. 2008）（非特許文献２６）によって記載されているとおりでありうる。例として、ＰＥＧ化、脂質化（ペプチド側鎖への脂肪酸の共有結合）、Ｆｃドメイン及びヒト血清アルブミンへの融合、親水性アミノ酸ポリマー、例えばＸＴＥＮ又はＰＡＳとの融合、及び／又は半減期延長タンパク質との融合を使用することが含まれる。
【0134】
ペプチドのｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を延ばすためのペプチドの修飾は、例えば、以下の文献に記載されている。
【0135】
Strategies to improve plasma half life time of peptide and protein drugs. Werle M, Bernkop-Schnurch A. Amino Acids. 2006 Jun;30(4):351-67（非特許文献２７）。
【0136】
長期作用性ペプチド及びタンパク質薬剤の明らかな利点により、このような化合物の血漿半減期を延ばす戦略は、非常に要求されている。短い血漿半減期は、一般に、速い腎クリアランス、並びに体循環の間に起こる酵素的分解による。ペプチド／タンパク質の修飾は、長い血漿半減期につながりうる。ソマトスタチンの全アミノ酸量を短くすることによって、及びＬ－類似アミノ酸をＤ－アミノ酸で置換することによって、ソマトスタチンの数分のみと比較して、誘導オクトレオチド（deviate octreotide）の血漿半減期は１．５時間であった。ＩＮＦ－α－２ｂのＰＥＧ（２，４０Ｋ）複合体は、天然のタンパク質と比較して３３０倍長い血漿半減期を示した。Ｎ－及びＣ－末端の修飾又はＰＥＧ化などの血漿半減期を延ばすための可能な戦略の概説、及び薬剤修飾の有効性を評価する方法を提供することがこのレビューの目的であった。更に、ヒト血液、肝臓及び腎臓の最も重要なタンパク質分解酵素、並びにそれらの開裂特異性及びそれらに対する阻害剤についての基本データが、体循環中のペプチド及びタンパク質薬剤の酵素的開裂を予測するために提供される。
【0137】
Strategic Approaches to Optimizing Peptide ADME Properties. Li Di AAPS J. 2015 Jan; 17(1): 134-143（非特許文献２９）
【0138】
タンパク質分解からペプチドを安定化するための戦略
【0139】
構造の修飾を通してペプチドの安定性を高めるために、多くのアプローチが利用可能である。幾つかのアプローチは安定性を改善するだけでなく、他のＡＤＭＥ特性を高める。例えば、環化は、安定性と透過性を増加させることができ、マクロ分子への複合体化は、安定性改善し、腎クリアランスを低下することができる。ペプチドの安定性及びＡＤＭＥ特性を改善しながら、有効性を維持し、毒性を防ぐことが重要である。
【0140】
・ Ｎ－及びＣ－末端を保護すること
多くの、血液／血漿、肝臓又は腎臓におけるタンパク質分解酵素はエキソペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ及びカルボキシぺプチダーゼであり、これらは、Ｎ－及びＣ－末端からペプチド配列を分解する。Ｎ－及び／又はＣ－末端の修飾は、ペプチドの安定性を改善できることが多い。多くの例は、Ｎ－アセチル化及びＣ－アミノ化がたんぱく質分解に対する耐性を増加することを報告している。
多くの、血液／血漿、肝臓又は腎臓におけるタンパク質分解酵素はエキソペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ及びカルボキシぺプチダーゼであり、これらは、Ｎ－及びＣ－末端からペプチド配列を分解する。Ｎ－及び／又はＣ－末端の修飾は、ペプチドの安定性を改善できることが多い。多くの例は、Ｎ－アセチル化及びＣ－アミノ化がたんぱく質分解に対する耐性を増加することを報告している。
【0141】
・ Ｌ－アミノ酸をＤ－アミノ酸で置換すること
天然のＬ－アミノ酸を非天然のＤ－アミノ酸で置換することは、タンパク質分解酵素の基質認識及び結合親和性を低下し、安定性を高める。一例はバソプレシンであり、これはＬ－Ａｒｇを含有し、ヒトにおいて１０～３５分の半減期を有する。Ｄ－Ａｒｇ類似体、デスモプレシンは、健康なヒトボランティアにおいて、３．７時間の半減期を有する。がん関連プロテアーゼのウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化剤（ｕＰＡ）の二環式ペプチド阻害剤の研究では、特定のグリシンをＤ－セリンで置換すると、マウス血漿において、１．８倍に有効性が改善されるのみでなく、４倍に安定性を増加する。
天然のＬ－アミノ酸を非天然のＤ－アミノ酸で置換することは、タンパク質分解酵素の基質認識及び結合親和性を低下し、安定性を高める。一例はバソプレシンであり、これはＬ－Ａｒｇを含有し、ヒトにおいて１０～３５分の半減期を有する。Ｄ－Ａｒｇ類似体、デスモプレシンは、健康なヒトボランティアにおいて、３．７時間の半減期を有する。がん関連プロテアーゼのウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化剤（ｕＰＡ）の二環式ペプチド阻害剤の研究では、特定のグリシンをＤ－セリンで置換すると、マウス血漿において、１．８倍に有効性が改善されるのみでなく、４倍に安定性を増加する。
【0142】
・ アミノ酸の修飾
天然アミノ酸の修飾は、立体障害を導入すること、又は酵素認識を妨害することによってペプチドの安定性を改善することができる。例えば、ゴナドトロピン放出ホルモンは、非常に短い半減期（分）を有するが、１つのＧｌｙがｔ－ブチル－Ｄ－Ｓｅｒで置換され、別のＧｌｙがエチルアミドによって置換されているブセレリンは、ヒトにおいて非常に長い半減期を有する。
天然アミノ酸の修飾は、立体障害を導入すること、又は酵素認識を妨害することによってペプチドの安定性を改善することができる。例えば、ゴナドトロピン放出ホルモンは、非常に短い半減期（分）を有するが、１つのＧｌｙがｔ－ブチル－Ｄ－Ｓｅｒで置換され、別のＧｌｙがエチルアミドによって置換されているブセレリンは、ヒトにおいて非常に長い半減期を有する。
【0143】
・ 環化
本発明のペプチドは環化されうる。環化はコンホーメーションの束縛を導入し、ペプチドの柔軟性を低下し、安定性及び透過性を高める。官能基に依存して、ペプチドは、頭－尾（head-to-tail）、頭／尾－側鎖、又は側鎖－側鎖（side-chain-to-side-chain）で環化されうる。環化は、一般に、ラクタム化、ラクトン化、及びスルフィドベースのブリッジ（架橋（bridge））を通して達成される。ジスルフィドのブリッジ（bridge）は、折り畳み及びコンホーメーションの束縛を生じ、これらは有効性、選択性及び安定性を改善しうる。ジスルフィド結合が豊富な多くのペプチド、例えばリナクロチド（linaclotide）、レピルジン（lepirudin）及びジコノチド（ziconotide）が、市場に、又は前臨床もしくは臨床開発にある。一実施形態では、ペプチドは、ペプチドのアミノ末端とカルボキシ末端との間で環化される。一実施形態では、ペプチドは側鎖の間で環化される。一実施形態では、環状ペプチドはホモデチック環状ペプチド、環状イソペプチド、環状デプシペプチド、又は単環式もしくは二環式ペプチドから選択される。ペプチドの環化の方法は、以下に記載されている。
本発明のペプチドは環化されうる。環化はコンホーメーションの束縛を導入し、ペプチドの柔軟性を低下し、安定性及び透過性を高める。官能基に依存して、ペプチドは、頭－尾（head-to-tail）、頭／尾－側鎖、又は側鎖－側鎖（side-chain-to-side-chain）で環化されうる。環化は、一般に、ラクタム化、ラクトン化、及びスルフィドベースのブリッジ（架橋（bridge））を通して達成される。ジスルフィドのブリッジ（bridge）は、折り畳み及びコンホーメーションの束縛を生じ、これらは有効性、選択性及び安定性を改善しうる。ジスルフィド結合が豊富な多くのペプチド、例えばリナクロチド（linaclotide）、レピルジン（lepirudin）及びジコノチド（ziconotide）が、市場に、又は前臨床もしくは臨床開発にある。一実施形態では、ペプチドは、ペプチドのアミノ末端とカルボキシ末端との間で環化される。一実施形態では、ペプチドは側鎖の間で環化される。一実施形態では、環状ペプチドはホモデチック環状ペプチド、環状イソペプチド、環状デプシペプチド、又は単環式もしくは二環式ペプチドから選択される。ペプチドの環化の方法は、以下に記載されている。
【0144】
Jensen, Knud (2009-09-01). Peptide and Protein Design for Biopharmaceutical Applications. John Wiley & Sons. ISBN 9780470749715（非特許文献３０）
【0145】
Wenyan, Xu; Jun, Tang; Changjiu, Ji; Wenjun, He; Ninghua, Tan (2008). "Application of a TLC chemical method to detection of cyclotides in plants". Science Bulletin. 53 (11): 1671-1674. doi:10.1007/s11434-008-0178-8（非特許文献３１）
【0146】
Borthwick AD (May 2012). "2,5-Diketopiperazines: Synthesis, Reactions, Medicinal Chemistry, and Bioactive Natural Products". Chemical Reviews. 112 (7): 3641-3716. doi:10.1021/cr200398y. PMID 22575049（非特許文献３２）
【0147】
Barber, Carla J. S.; Pujara, Pareshkumar T.; Reed, Darwin W.; Chiwocha, Shiela; Zhang, Haixia; Covello, Patrick S. (2013). "The Two-step Biosynthesis of Cyclic Peptides from Linear Precursors in a Member of the Plant Family Caryophyllaceae Involves Cyclization by a Serine Protease-like Enzyme". Journal of Biological Chemistry. 288 (18): 12500-12510. doi:10.1074/jbc.M112.437947. PMC 3642298. PMID 23486480（非特許文献３３）
【0148】
Wenyan Xu; et al. (2011). "Various mechanisms in cyclopeptide production from precursors synthesized independently of non-ribosomal peptide synthetases". Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 43 (10): 757-762. doi:10.1093/abbs/gmr062. PMC 3180235. PMID 21764803（非特許文献３４）
【0149】
Wenyan Xu; et al. "Plant Cyclopeptides and Possible Biosynthetic Mechanisms"（非特許文献３５）
【0150】
David J. Craik (17 March 2006). "Seamless Proteins Tie Up Their Loose Ends". Science. 311 (5767): 1563-7. doi:10.1126/science.1125248. PMID 16543448（非特許文献３６）
【0151】
マクロ分子への複合体化
マクロ分子（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン）への複合体化は、ぺプチドの安定性を改善し、腎クリアランスを減少する有効な戦略である。
マクロ分子（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン）への複合体化は、ぺプチドの安定性を改善し、腎クリアランスを減少する有効な戦略である。
【0152】
腎クリアランス
多くのペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの薬理学的活性の期待を示すが、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期（分）が非常に短いため、ｉｎ ｖｉｖｏでの実証に失敗する。ペプチドの迅速なクリアランス及び短い半減期は、これらがうまく薬剤へ開発されるのを阻む。体循環からのペプチドの迅速なクリアランスの主要な原因は、酵素的タンパク質分解又は／及び腎クリアランスである。糸球体は、約８ｎｍの孔サイズを有し、ＭＷ＜２～２５ｋＤａを有する親水性ペプチドは、腎臓の糸球体を通る迅速な濾過の影響を受ける。ペプチドは、尿細管を通して容易に再吸収されないので、これらは、しばしば、高い腎クリアランス及び短い半減期を有する。ペプチドのクリアランスの他のマイナーな経路は、プロテアソーム及び肝臓によるエンドサイトーシス及び分解である。動物モデルにおける全身及び腎クリアランスの間の比較は、腎クリアランスが主要な排せつ経路であると思われるかどうかに関する有益な情報を提供する。
多くのペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの薬理学的活性の期待を示すが、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期（分）が非常に短いため、ｉｎ ｖｉｖｏでの実証に失敗する。ペプチドの迅速なクリアランス及び短い半減期は、これらがうまく薬剤へ開発されるのを阻む。体循環からのペプチドの迅速なクリアランスの主要な原因は、酵素的タンパク質分解又は／及び腎クリアランスである。糸球体は、約８ｎｍの孔サイズを有し、ＭＷ＜２～２５ｋＤａを有する親水性ペプチドは、腎臓の糸球体を通る迅速な濾過の影響を受ける。ペプチドは、尿細管を通して容易に再吸収されないので、これらは、しばしば、高い腎クリアランス及び短い半減期を有する。ペプチドのクリアランスの他のマイナーな経路は、プロテアソーム及び肝臓によるエンドサイトーシス及び分解である。動物モデルにおける全身及び腎クリアランスの間の比較は、腎クリアランスが主要な排せつ経路であると思われるかどうかに関する有益な情報を提供する。
【0153】
腎障害のある患者については、腎機能障害を持つ患者の不適切な投薬が毒性及び効果のない治療の原因になるので、蓄積及び薬物への高い暴露を防止するために、用量の調節がペプチド薬剤について必要でありうる。幾つかの戦略がペプチドの腎クリアランスを低下させ、半減期を延ばすために開発されている。これらは、次に概説される。
【0154】
・ 血漿タンパク質結合を増加する
ペプチドの腎クリアランスは、ペプチドが膜タンパク質又は血清タンパク質に結合されたときに低下される。一例は、内分泌腫瘍の治療の環状ペプチド薬剤のオクトレオチドであり、これはリポプロテインに結合（非結合分率（fraction unbound）０．６５）することによりヒトで約１００分の半減期を有する。
ペプチドの腎クリアランスは、ペプチドが膜タンパク質又は血清タンパク質に結合されたときに低下される。一例は、内分泌腫瘍の治療の環状ペプチド薬剤のオクトレオチドであり、これはリポプロテインに結合（非結合分率（fraction unbound）０．６５）することによりヒトで約１００分の半減期を有する。
【0155】
・ アルブミン結合性小分子への共有結合
アルブミン結合性小分子をペプチドに共有結合すると、強く結合した小分子を介してアルブミンと間接的に相互作用することにより、糸球体ろ過を低下し、タンパク質分解の安定性を改善し、半減期を延ばす。
アルブミン結合性小分子をペプチドに共有結合すると、強く結合した小分子を介してアルブミンと間接的に相互作用することにより、糸球体ろ過を低下し、タンパク質分解の安定性を改善し、半減期を延ばす。
【0156】
・ 大きなポリマーへの複合体化
大きな合成又は天然ポリマー又は炭水化物へペプチドを複合体化すると、それらの分子量及び流体力学的体積を増加することができ、これによって、これらの腎クリアランスが低下する。ペプチドの複合体化に使用される一般的ポリマーはＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、及びヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）である。
大きな合成又は天然ポリマー又は炭水化物へペプチドを複合体化すると、それらの分子量及び流体力学的体積を増加することができ、これによって、これらの腎クリアランスが低下する。ペプチドの複合体化に使用される一般的ポリマーはＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、及びヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）である。
【0157】
・ 長寿命血漿タンパク質への融合
アルブミン及び免疫グロブリン（ＩｇＧ）フラグメントなどの血漿タンパク質は、ヒトで１９～２１日の長い半減期を有する。高いＭＷ（６７～１５０ｋＤａ）のため、これらのタンパク質は、低い腎クリアランスを有し、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）へのこれらの結合は、血管上皮による食作用を通しての排せつを低下する。アルブミン又はＩｇＧフラグメントへのペプチドの共有結合は、腎クリアランスを低下し、半減期を延ばす。
アルブミン及び免疫グロブリン（ＩｇＧ）フラグメントなどの血漿タンパク質は、ヒトで１９～２１日の長い半減期を有する。高いＭＷ（６７～１５０ｋＤａ）のため、これらのタンパク質は、低い腎クリアランスを有し、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）へのこれらの結合は、血管上皮による食作用を通しての排せつを低下する。アルブミン又はＩｇＧフラグメントへのペプチドの共有結合は、腎クリアランスを低下し、半減期を延ばす。
【0158】
バイオをよりよいものにする戦略としての生物製剤の半減期を延ばすための融合タンパク質（Fusion Proteins for Half-Life Extension of Biologics as a Strategy to Make Biobetters）
【0159】
William R. Strohl BioDrugs. 2015; 29(4): 215-239（非特許文献３７）
【0160】
Schlapschy, M, Binder, U, Borger, C et al. PASYlation: a biological alternative to PEGylation for extending the plasma half-life of pharmaceutically active proteins. Protein Eng Des Sel. 2013;26(8):489-501（非特許文献３８）
【0161】
Podust, VN, Sim, BC, Kothari, D et al. Extension of in vivo half-life of biologically active peptides via chemical conjugation to XTEN protein polymer. Protein Eng Des Sel. 2013;26(11):743-53（非特許文献３９）
【0162】
Zhang, L, Bulaj, G. Converting Peptides into Drug Leads by Lipidation. Curr Med Chem. 2012;19(11):1602-18（非特許文献４０）
【0163】
Gaberc-Porekar, V, Zore, I, Podobnik, B et al. Obstacles and pitfalls in the PEGylation of therapeutic proteins. Curr Opin Drug Discov Devel. 2008;11(2):242-50（非特許文献４１）
【0164】
By Dr Ronald V. Swanson - Long live peptides evolution of peptide half-life extension technologies and emerging hybrid approaches. From Drug Discovery World on line.
Spring 2014（非特許文献４２）
Spring 2014（非特許文献４２）
【0165】
ＰＥＧ化（PEGylation）
親水性ポリマーのポリエチレングリコールの長鎖に目的の分子を結合すること、即ちＰＥＧ化は、そもそも、免疫系による外来タンパク質の認識を防止するための修飾として着想され、これによって、治療薬（therapeutics）としてのこれらの利用を可能にした。一旦形成されると、非修飾の薬剤に対する抗体は、迅速に中和され、タンパク質薬剤を除去することができる。予想外に、ＰＥＧ化は、抗体医薬の抗体の非存在下でも、タンパク質の薬物動態を改善する１。単純には、大きな薬剤分子を作成することによって、ＰＥＧ化は、腎臓によってよりゆっくりと濾過される薬剤を導く。従って、大きさ又は流体力学的半径を増加することが、腎クリアランスを低下させ、半減期を増加するという実験的な観測は、タンパク質及びペプチド薬剤のＰＥＧ化のための主要な理由付けとなる。ＰＥＧ化は、より水溶性のタンパク質又はペプチドを作成すること、及びタンパク質分解酵素による分解からこれらを保護することを含む、分子についての種々の効果を有しうる。ＰＥＧ化はまた、治療用タンパク質のこれらの類似した細胞性受容体への結合に影響し、通常、親和性を低下しうる。ＰＥＧポリマーの大きさ、構造及び結合様式の変化は、結合された薬剤の生物学的活性に影響しうる。
親水性ポリマーのポリエチレングリコールの長鎖に目的の分子を結合すること、即ちＰＥＧ化は、そもそも、免疫系による外来タンパク質の認識を防止するための修飾として着想され、これによって、治療薬（therapeutics）としてのこれらの利用を可能にした。一旦形成されると、非修飾の薬剤に対する抗体は、迅速に中和され、タンパク質薬剤を除去することができる。予想外に、ＰＥＧ化は、抗体医薬の抗体の非存在下でも、タンパク質の薬物動態を改善する１。単純には、大きな薬剤分子を作成することによって、ＰＥＧ化は、腎臓によってよりゆっくりと濾過される薬剤を導く。従って、大きさ又は流体力学的半径を増加することが、腎クリアランスを低下させ、半減期を増加するという実験的な観測は、タンパク質及びペプチド薬剤のＰＥＧ化のための主要な理由付けとなる。ＰＥＧ化は、より水溶性のタンパク質又はペプチドを作成すること、及びタンパク質分解酵素による分解からこれらを保護することを含む、分子についての種々の効果を有しうる。ＰＥＧ化はまた、治療用タンパク質のこれらの類似した細胞性受容体への結合に影響し、通常、親和性を低下しうる。ＰＥＧポリマーの大きさ、構造及び結合様式の変化は、結合された薬剤の生物学的活性に影響しうる。
【0166】
第１世代のＰＥＧ化方法は試練に満ちていた。しかし、ＰＥＧ化の化学は非常にシンプルである。このプロセスは、ポリエチレングリコール鎖の、タンパク質又はペプチドの反応性側鎖への共有結合を含む。例えば、ＰＥＧは、タンパク質又はペプチドの表面のリジンのアミノ基に容易に結合される２。反応は、ｐＨ依存性である。高いｐＨ（８．０以上）で、リジン側鎖のアミノ基は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドを介してＰＥＧに共有結合される。この方法は、典型的には、単一の個別の生成物よりも、タンパク質の異なる部位に結合された異なる数のＰＥＧ鎖を含有する生成物のファミリーを生じる３。最初に承認されたＰＥＧ化医薬品は、重篤な複合免疫不全用の酵素補充療法としてのウシペグアデマーゼ（Pegademase bovine）（ＰＥＧ化されたウシアデノシンデアミダーゼ）、及び急性リンパ性白血病の治療用のペグアスパラガーゼ（Pegaspargase）（ＰＥＧ化されたアスパラギナーゼ）であった１。これらの薬剤は、種々のＰＥＧ化された種の複雑な混合物であったが、血清半減期の増加、タンパク質の免役原生の低下を含む天然の酵素を越える改善された治療特性を有していた。ＰＥＧの固有多分散性により、品質及びバッチ毎の再現性が困難であった。この制限にもかかわらず、多数のモノ－ＰＥＧ化された位置異性体の不均一分布物である２種類のＰＥＧ化インターフェロン（ペグインターフェロンα－２ｂ及びペグインターフェロンα－２ａ）がＣ型肝炎の治療に対してＦＤＡ承認されている。これらの薬剤は、２００１年及び２００２年にそれぞれ販売されるに至った。
【0167】
多くの強化及び変更が基本的なＰＥＧ化技術に対してなされている。第２世代のＰＥＧ化プロセスは、分岐構造だけでなくＰＥＧ結合に対する別の化学の使用を導入した。特に、マレイミド又はヨードアセトアミドなどのシステイン反応性基を持つＰＥＧｓは、ペプチド又はタンパク質内の単一残基へのＰＥＧ化の標的化を可能にし、最終生成物の不均一性を減少するが、ＰＥＧ自身の多分散性によりこれを排出しない。
【0168】
ＰＥＧ化に向けた最初の根本理由は、免役原生を低下することであったが、それにもかかわらず、免役原生ＰＥＧ化タンパク質の幾つかの例があった。一例は、ＰＥＧ化された尿酸酸化酵素、即ち痛みを有する患者で血漿尿酸値を低下する酵素である。臨床試験では、痛風を持つ患者のかなり高い割合が治療に応答せず、ＰＥＧに特異的な抗体を発生させたが、ウリカーゼタンパク質については発生しなかった２。非免役原生であるとも一般に考えられているＰＥＧ化されたリポソームは、幾つかの研究で免役原生であることが見出されている。ＰＥＧ化されたリポソームは、強い抗－ＰＥＧ免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）応答を引き出す。加えて、ＰＥＧ－グルクロニダーゼの複数回の注入が、特異的抗－ＰＥＧＩｇＭ抗体の生成を引き出すことが示され、これによって、身体からＰＥＧ修飾されたタンパク質のクリアランスを加速した。
【0169】
修飾剤としてＰＥＧを用いることの主な潜在的欠点は、これが非生分解性であることである。アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）は、注入可能な製剤、局所投与製剤、直腸投与製剤及び鼻腔投与製剤を含む医薬品においてビヒクルとして使用するためのＰＥＧを承認している。ＰＥＧは、毒性がほとんどなく、腎臓（ＰＥＧｓ＜３０ｋＤａについて）又は便（ＰＥＧｓ＞２０ｋＤａについて）のいずれかによってそのまま身体から排せつされる１。動物への幾つかのＰＥＧ化タンパク質の繰り返し投与は、尿細管細胞性空胞形成の観測をもたらす。最近、脈絡叢上皮細胞の空胞形成も、大きなＰＥＧ（≧４０ｋＤａ）と複合体形成されたタンパク質で、毒性試験において見出されている。脈絡叢上皮細胞は、脳脊髄液を生じ、血液脳脊髄液関門（blood CSF barrier）を形成する。細胞性空胞形成の長期の陰性の結果は不明であるが、これは幾つかの可能な治療に対して望まない結果を示す。１つの可能な代替は、ＰＥＧに代えて生分解性ポリマーで置換することである。ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）等のポリマーは可能な代替である。ＨＥＳは、非毒性であり、生分解性であり、血液増量剤（blood expander）として使用される。ＨＥＳ化のプロセスは、ペプチドの流体力学半径を増加することによって腎クリアランスを低下することにおいてＰＥＧ化と同様に機能するが、生分解性に蓄積に対してより低い傾向が付与されうる。しかし、ＨＥＳ及び他の提案された生分解性ポリマーＰＥＧ代替物は、ＰＥＧと同様に、多分散性であり、最終生成物と代謝産物の特徴付けを困難にする。両者を和らげる１つの新しい解決は、定義されたポリペプチドをポリマー成分として使用することである。このアプローチは、本開示で後に議論する。
【0170】
脂質化（Lipidation）
ペプチドの半減期を増加するための第２の主要な化学的修飾方法は脂質化であり、これは、ペプチド側鎖への脂肪酸の共有結合を含む４。インスリンの半減期を伸ばすための方法として最初に着想され、当該方法として開発されたものでは、脂質化は、ＰＥＧ化と同じ半減期の延長の基本的メカニズム、即ち、流体力学半径を増加し、腎臓濾過を低下することを共有する。しかし、脂質部分は、それ自身相対的に小さく、その効果は、循環するアルブミンに対する脂質部分の非共有結合を介して間接的に媒介される。ヒト血清中の大きく（６７ｋＤａ）、非常に豊富なタンパク質（３５～５０ｇ／Ｌ）であるアルブミンは、生来、脂質を含む分子を身体全体に輸送する機能を持つ。血漿タンパク質への結合も、立体障害によりペプチダーゼによる攻撃からペプチドを保護することができ、重ねて、ＰＥＧ化で見られるものと類似する。脂質化の１つの意義は、これがペプチドの水溶性を低下するが、ペプチドと脂肪酸の間のリンカーを加工する（engeneering）ことで、例えば、リンカー内でグルタメート又はミニＰＥＧｓを使用することによって、これが調節されうることである。リンカーの加工及び脂質部分の変形は、生体内分布の速度を落とすことによって、アルブミンとは独立して、半減期の増加に寄与することができる自己会合（self-aggregation）に影響しうる５。
ペプチドの半減期を増加するための第２の主要な化学的修飾方法は脂質化であり、これは、ペプチド側鎖への脂肪酸の共有結合を含む４。インスリンの半減期を伸ばすための方法として最初に着想され、当該方法として開発されたものでは、脂質化は、ＰＥＧ化と同じ半減期の延長の基本的メカニズム、即ち、流体力学半径を増加し、腎臓濾過を低下することを共有する。しかし、脂質部分は、それ自身相対的に小さく、その効果は、循環するアルブミンに対する脂質部分の非共有結合を介して間接的に媒介される。ヒト血清中の大きく（６７ｋＤａ）、非常に豊富なタンパク質（３５～５０ｇ／Ｌ）であるアルブミンは、生来、脂質を含む分子を身体全体に輸送する機能を持つ。血漿タンパク質への結合も、立体障害によりペプチダーゼによる攻撃からペプチドを保護することができ、重ねて、ＰＥＧ化で見られるものと類似する。脂質化の１つの意義は、これがペプチドの水溶性を低下するが、ペプチドと脂肪酸の間のリンカーを加工する（engeneering）ことで、例えば、リンカー内でグルタメート又はミニＰＥＧｓを使用することによって、これが調節されうることである。リンカーの加工及び脂質部分の変形は、生体内分布の速度を落とすことによって、アルブミンとは独立して、半減期の増加に寄与することができる自己会合（self-aggregation）に影響しうる５。
【0171】
インスリンの先駆的仕事に続いて、種々のペプチド、特に、ヒトグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）類似体、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド及びＧＬＰ－１Ｒ／グルカゴン受容体共アゴニストを含む糖尿病スペース（diabetes space）内のペプチドの脂質化が探索されている。２種類の脂質化されたペプチド薬剤が、ヒトにおける使用について現在ＦＤＡで承認されている。これらは、両方とも、長期作用型抗糖尿病薬、即ち、ＧＬＰ－１類似体のリラグルチド及びインスリンデテミルである。
【0172】
ＰＥＧ化と脂質化の間の、潜在的に、薬理学的に関連する差は、治療上活性なペプチドが非常に大きなＰＥＧに共有結合され、一方、小さな脂肪酸アシルペプチド複合体が大きなアルブミンに非共有結合で結合され、結合及び非結合形態が平衡で存在することである。これは、生体内分布に差を生じ得、これは、異なる組織内に局在化された受容体へアクセスするときに、異なる薬理学を生じる。幾つかの場合では、より制限された生体内分布が望ましい場合があり、他の場合には、大きな組織浸透性が重要でありうる。この問題を取り扱うＰＥＧアプローチの興味のあるバリエーションがＳａｎｔｉらによって開発されており、これには、予想される開裂速度を有する放出可能なＰＥＧ複合体が利用される７。
【0173】
ＰＥＧ化及び脂質化は、両方とも、立体障害を介して遮蔽することによって、及び流体力学半径を増加することを介して循環半減期を延ばすことによって、直接的に又は間接的にプロテアーゼ及びペプチダーゼに対する保護を付与する。両方法は、化学的複合体化を利用し、これらが生物学的に生成されるものであろうと、合成により生成されるものであろと、修飾しているペプチドを生じるのに使用される手段に対して強制的でないということにおいて、柔軟性がある。合成ペプチドを使用する利点は、これらが公知のタンパク質分解開裂のしやすさによる不安定性を含む多くの特定の問題を取り扱うためにデザインされた非天然アミノ酸を取り込むことができるということである。これらは、活性又は可能性が、自由末端に又はＣ末端アミドなどの修飾された部位に顕著に依存するかどうかの、重要な結合部位の選択に関してもより柔軟性がありうる。
【0174】
古典的遺伝子融合
長寿命の血清タンパク質への古典的遺伝子融合は、ＰＥＧ又は脂質への化学的複合体とは別の半減期の延長の代替法をもたらす。２種類の主要なタンパク質が、伝統的に、融合パートナーとして使用されており、これらは抗体Ｆｃドメイン及びヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）である。Ｆｃ融合は、ペプチド、タンパク質又は受容体細胞外ドメインを抗体のＦｃ部分に融合することを含む。Ｆｃとアルブミンの両方の融合は、ペプチド薬剤の大きさを増加することによって半減期を伸ばすことを実現するだけでなく、両者はまた、身体の自然のリサイクルメカニズム：新生児Ｆｃ受容体、ＦｃＲｎをうまく利用する。ＦｃＲｎへのこれらのタンパク質のｐＨ依存的結合は、エンドソーム内の融合タンパク質の分解を防止する。これらのタンパク質に基づく融合は、典型的なＰＥＧ化又は脂質化されたペプチドよりも非常に長い３～１６日の範囲の半減期を有しうる。抗体Ｆｃへの融合は、ペプチド又はタンパク質薬剤の溶解性及び安定性を改善しうる。ペプチドＦｃ融合の例は、デュラグルチド、即ち、現在後期臨床試験にあるＧＬＰ－１受容体アゴニストである。ヒト血清アルブミン、脂肪酸アシル化されたペプチドによって開発された同じタンパク質は、他の普及している融合パートナーである。アルビグルチドは、このプラットホームに基づいたＧＬＰ－１受容体アゴニストである。Ｆｃとアルブミンの間の主な違いは、Ｆｃの二量体性（dimetic nature）に対するＨＡＳの単量体構造であり、これは融合パートナーの選択に依存して二量体又は単量体として融合されたペプチドの提示に導く。ペプチドＦｃ融合の二量体性は、標的受容体が互いに十分近接して空間配置されても、又はそれら自身二量体であっても、アビディティ効果を生じうる。これは望ましいか、又は標的に依存しない。
長寿命の血清タンパク質への古典的遺伝子融合は、ＰＥＧ又は脂質への化学的複合体とは別の半減期の延長の代替法をもたらす。２種類の主要なタンパク質が、伝統的に、融合パートナーとして使用されており、これらは抗体Ｆｃドメイン及びヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）である。Ｆｃ融合は、ペプチド、タンパク質又は受容体細胞外ドメインを抗体のＦｃ部分に融合することを含む。Ｆｃとアルブミンの両方の融合は、ペプチド薬剤の大きさを増加することによって半減期を伸ばすことを実現するだけでなく、両者はまた、身体の自然のリサイクルメカニズム：新生児Ｆｃ受容体、ＦｃＲｎをうまく利用する。ＦｃＲｎへのこれらのタンパク質のｐＨ依存的結合は、エンドソーム内の融合タンパク質の分解を防止する。これらのタンパク質に基づく融合は、典型的なＰＥＧ化又は脂質化されたペプチドよりも非常に長い３～１６日の範囲の半減期を有しうる。抗体Ｆｃへの融合は、ペプチド又はタンパク質薬剤の溶解性及び安定性を改善しうる。ペプチドＦｃ融合の例は、デュラグルチド、即ち、現在後期臨床試験にあるＧＬＰ－１受容体アゴニストである。ヒト血清アルブミン、脂肪酸アシル化されたペプチドによって開発された同じタンパク質は、他の普及している融合パートナーである。アルビグルチドは、このプラットホームに基づいたＧＬＰ－１受容体アゴニストである。Ｆｃとアルブミンの間の主な違いは、Ｆｃの二量体性（dimetic nature）に対するＨＡＳの単量体構造であり、これは融合パートナーの選択に依存して二量体又は単量体として融合されたペプチドの提示に導く。ペプチドＦｃ融合の二量体性は、標的受容体が互いに十分近接して空間配置されても、又はそれら自身二量体であっても、アビディティ効果を生じうる。これは望ましいか、又は標的に依存しない。
【0175】
デザインされたポリペプチド融合：ＸＴＥＮ及びＰＡＳ
組換え融合の概念の興味をそそる変更は、ＰＥＧの機能性類似体である基本的に構造化されていない親水性アミノ酸ポリマーである、融合パートナーとしての、デザインされた複雑さの低い配列の開発である。ポリペプチドプラットホームの固有の生分解性は、ＰＥＧに対する潜在的により有益な代替物としてこれを魅力的にする。他の利点は、ＰＥＧの多分散性とは対称的な組換え分子の正確な分子構造である。融合パートナーの三次元折り畳みが維持される必要のあるＨＳＡ及びＦｃペプチド融合物と異なり、非構造化パートナーへの組換え融合は、多くの場合、ＨＰＬＣ精製などの高温又は苛酷な条件にかけられる。
組換え融合の概念の興味をそそる変更は、ＰＥＧの機能性類似体である基本的に構造化されていない親水性アミノ酸ポリマーである、融合パートナーとしての、デザインされた複雑さの低い配列の開発である。ポリペプチドプラットホームの固有の生分解性は、ＰＥＧに対する潜在的により有益な代替物としてこれを魅力的にする。他の利点は、ＰＥＧの多分散性とは対称的な組換え分子の正確な分子構造である。融合パートナーの三次元折り畳みが維持される必要のあるＨＳＡ及びＦｃペプチド融合物と異なり、非構造化パートナーへの組換え融合は、多くの場合、ＨＰＬＣ精製などの高温又は苛酷な条件にかけられる。
【0176】
ポリペプチドのこのクラスの最も進んだものは、ＸＴＥＮ（Ａｍｕｎｉｘ）と呼ばれ、８６４個のアミノ酸長であり、６種のアミノ酸（Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｐ、Ｓ及びＴ）より構成される。ポリマーの生分解可能な性質により可能になることは、これが典型的に使用される４０ｋＤａＰＥＧｓよりもはるかに大きく、付随してより大きな半減期の延長を付与することである。ＸＴＥＮのペプチド薬剤への融合は、本来の分子より６０～１３０倍まで半減期の延長をもたらす。完全に組換えにより生成された２種類のＸＴＥＮ化された生成物、即ちＶＲＳ－８５９（エキセナチド－ＸＴＥＮ）及びＶＲＳ－３１７（ヒト成長ホルモン－ＸＴＥＮ）が臨床に入っている。フェーズＩａ試験において、ＶＲＳ－８５９には、２型糖尿病を持つ患者において、良好な耐容性を示し、効き目を有することが見出された。ＶＲＳ－３１７は、以前に試験されたｒｈＧＨ生成物と比較して優れた薬物動態学特性及び薬力学特性を記録し、一月に１回の用量の可能性を有する。
【0177】
同様の概念的考察に基づく第２のポリマーは、ＰＡＳ（ＸＬ－Ｐｒｏｔｅｉｎ ＧｍｂＨ）である９。ランダムコイルポリマーは、わずかに３つの小さな非荷電アミノ酸、即ちプロリン、アラニン及びセリンの更に制限されたセットから構成される。ＰＡＳの生物物理学的特性と高度に陰性に荷電されたＸＴＥＮにおける差が、生体内分布及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ活性における差に寄与しうるかどうかはまだ未知であるが、これらのポリペプチドは多数の治療に組み込まれており、融合物の挙動が特徴付けられているので、関連しているであろう。
【0178】
パートナーがＦｃ、ＨＳＡ、ＸＴＥＮ又はＰＡＳであるかどうかにかかわらず、ペプチドタンパク質融合物は、全て、一般的にコード化され、結果として同様の束縛を受ける。１つの制限は、合成ペプチドを使用して非天然アミノ酸を取り込むことができる化学的複合体化を使用する方法とは異なり、天然に存在するアミノ酸のみが取り込まれることである。遺伝子コードを拡張することによってこれを克服する方法が、Ａｍｂｒｘ又はＳｕｔｒｏ等の会社によって開発されているが、これらはまだ広く使用されていない。第２の制限は、ペプチドのＮ－又はＣ－末端のいずれかが、パートナーに融合される必要があるということである。しばしば、ペプチド末端は、受容体相互作用に関与し、一方又は両方の末端への遺伝子融合は、活性を大きく損ないうる。ＰＥＧ又は脂質複合体化の部位は、何処であってもペプチド上であり得、生じた治療剤の生物学的活性を最大にするように最適化されうる。
【0179】
合成ペプチドを半減期の延びたタンパク質と組み合わせるハイブリッド法
遺伝子融合は、歴史的に、半減期の大きな延長についての可能性を提示してきたが、これらは、非天然アミノ酸の結合部位及び取り込み又はペプチド骨格への修飾の柔軟性に関する化学的複合体化、即ちＰＥＧ化及び脂質化を用いる方法によってもたらされる利点を欠く。半減期の延長のための、遺伝子融合と化学的複合体化の利点を組み合わせる初期の努力の１つは、後に、バイオテック社（the biotech company）のＣｏｖＸ１０，１１に対する基礎を形成した技術である、Ｌａ Ｊｏｌｌａのスクリップス研究所（Scripps Research Institute）での研究によって行われた。触媒的アルドラーゼ抗体を使用し、これらの研究者は、この抗体の活性部位のリジンが、ペプチド又は小分子に取り込まれたβ－ジケトンと可逆的な共有結合性エナミン結合を形成するプラットホームを開発した。得られた複合体は、ＣｏｖＸＢｏｄｙ（商標）と命名された。このアプローチは、抗体の長い血清半減期を有するペプチド薬剤又は小分子の機能的品質を、遺伝子融合を通してではなく、むしろ化学的結合を通して組み合わせる。この技術の初期の例示に続いて、研究者は、インテグリンを標的とするペプチド模倣型薬理活性基（ペプチドミメティック・ファルマコフォア（peptidomimetic pharmacophore））を基礎とするＣｏｖＸ－Ｂｏｄｙ（商標）プロトタイプの使用を拡張した。この構成に基づく少なくとも３つの分子、即ちＧｌｐ－１ＲアゴニストであるＣＶＸ－０９８、アンジオポイエチン－２結合ペプチドであるＣＶＸ－０６０、及びトロンボスポンジン模倣体であるＣＶＸ－０４５が臨床開発に入っている。
遺伝子融合は、歴史的に、半減期の大きな延長についての可能性を提示してきたが、これらは、非天然アミノ酸の結合部位及び取り込み又はペプチド骨格への修飾の柔軟性に関する化学的複合体化、即ちＰＥＧ化及び脂質化を用いる方法によってもたらされる利点を欠く。半減期の延長のための、遺伝子融合と化学的複合体化の利点を組み合わせる初期の努力の１つは、後に、バイオテック社（the biotech company）のＣｏｖＸ１０，１１に対する基礎を形成した技術である、Ｌａ Ｊｏｌｌａのスクリップス研究所（Scripps Research Institute）での研究によって行われた。触媒的アルドラーゼ抗体を使用し、これらの研究者は、この抗体の活性部位のリジンが、ペプチド又は小分子に取り込まれたβ－ジケトンと可逆的な共有結合性エナミン結合を形成するプラットホームを開発した。得られた複合体は、ＣｏｖＸＢｏｄｙ（商標）と命名された。このアプローチは、抗体の長い血清半減期を有するペプチド薬剤又は小分子の機能的品質を、遺伝子融合を通してではなく、むしろ化学的結合を通して組み合わせる。この技術の初期の例示に続いて、研究者は、インテグリンを標的とするペプチド模倣型薬理活性基（ペプチドミメティック・ファルマコフォア（peptidomimetic pharmacophore））を基礎とするＣｏｖＸ－Ｂｏｄｙ（商標）プロトタイプの使用を拡張した。この構成に基づく少なくとも３つの分子、即ちＧｌｐ－１ＲアゴニストであるＣＶＸ－０９８、アンジオポイエチン－２結合ペプチドであるＣＶＸ－０６０、及びトロンボスポンジン模倣体であるＣＶＸ－０４５が臨床開発に入っている。
【0180】
最近、ＸＴＥＮポリペプチドはまた、ＰＥＧに対して、これを更に直接に類似体にする化学的複合体形成様式で使用されている。この方法を用いて生成された、ＸＴＥＮ化されたペプチドの最初の例は、ＧＬＰ２－２Ｇ－ＸＴＥＮであり、この例では、ペプチドがマレイミド－チオール化学を用いてＸＴＥＮタンパク質ポリマーに化学的に複合体形成される。化学的に複合体形成されたＧＬＰ２－２ＧＸＴＥＮ分子は、比較可能なｉｎ ｖｉｔｒｏ活性、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの血漿安定性、及び組換えにより融合されたＧＬＰ２－２Ｇ－ＸＴＥＮに匹敵するラットでの薬動力学を示した。
【0181】
ＸＴＥＮ又はＰＡＳポリペプチドの完全にデザインされた配列中のリジン又はシステイン側鎖などの反応性基の数及び間隔は、これらが構成される制限されたアミノ酸セットにより、部位特異的な（site-directed）変化を通して正確に制御されうる。これは、その配列が多くの反応性基に天然に含有されるＦｃ又はアルブミンを使用する方法を越える程度の追加の柔軟性を提供し、顕著に特化された活性部位の反応性残基に依拠するＣｏｖＸ技術とは対称的な位置にある。加えて、ＸＴＥＮ又はＰＡＳの三次構造（tertiary structure）の欠如は、カップリングで及び複合体の精製で使用される条件及び化学を越えたより大きな柔軟性を提供するはずである。
【0182】
まとめとして、利点を組み合わせ、化学的複合体形成及び遺伝子融合法の個別の制限を克服するハイブリッドペプチド半減期延長法が出現している。これらの方法は、単に天然のＬ－アミノ酸から構成される制限から、又は、Ｎ－又はＣ－末端のいずれかで融合された線状の一方向のペプチドとして単に構成される制限から、長期の半減期を付与するが、治療用ペプチド部分を含まない組換えポリペプチドベースのパートナーに基づく分子の生成を可能とし、これによって、広範囲の、長期間作用するペプチドベースの薬剤に対する扉が開かれる。
【実施例】
【0183】
本発明は、特定の実施例を参照して説明される。これらは、単に具体例であり、例示を目的とするものである。これらは、独占的に請求され、又は説明された本発明の範囲を何れの様式においても制限することを意図しない。これらの実施例は、本発明を実施するために現在考慮されるベストモードを構成する。
【0184】
（実施例１）
ペプチド受容体／標的タンパク質の同定
方法論
ＣＹ５－標識されたペプチド（配列番号１）（０．０１及び０．０５μｇ／ｍｌ）を５５２８ヒト細胞膜タンパク質（plasma membrane proteins）を発現する固定化されたＨＥＫ２９３細胞に対する結合についてスクリーニングした。スクリーニングは、２つの複製を通して実施され、最初の該当物（hits）を選択し、より特異的な確認アッセイでスクリーニングした。
ペプチド受容体／標的タンパク質の同定
方法論
ＣＹ５－標識されたペプチド（配列番号１）（０．０１及び０．０５μｇ／ｍｌ）を５５２８ヒト細胞膜タンパク質（plasma membrane proteins）を発現する固定化されたＨＥＫ２９３細胞に対する結合についてスクリーニングした。スクリーニングは、２つの複製を通して実施され、最初の該当物（hits）を選択し、より特異的な確認アッセイでスクリーニングした。
【0185】
結果
図３は、ヒト膜タンパク質に対する本発明のペプチドの結合親和性を例示する。３種の高選択的標的物（Three Highly Selective Targets）、即ちＰａｎｘ１、ＳＬＣ３５Ｆ２、及びＴＡＣＲ１を同定した。生物学、組織分布、及び複数のアイソホーム（Isoforms）に結合するペプチドに基づいて、ＰＡＮＸ１がペプチドに対する一次標的であることが結論づけられた。
図３は、ヒト膜タンパク質に対する本発明のペプチドの結合親和性を例示する。３種の高選択的標的物（Three Highly Selective Targets）、即ちＰａｎｘ１、ＳＬＣ３５Ｆ２、及びＴＡＣＲ１を同定した。生物学、組織分布、及び複数のアイソホーム（Isoforms）に結合するペプチドに基づいて、ＰＡＮＸ１がペプチドに対する一次標的であることが結論づけられた。
【0186】
（実施例２）
本発明のペプチドは、不死化肝細胞においてＩＬ－８の分泌を低下する
方法論
ＨｅｐＧ２細胞を、２４時間ペプチド（５ｎｇ／ｍｌ）で処理し、次いで、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで２４時間処理した。データは、少なくとも２つの独立した実験の平均±ＳＥＭで表した（*ｐ＜０．０５ **ｐ＜０．０１ ***ｐ＜０．００１）。
本発明のペプチドは、不死化肝細胞においてＩＬ－８の分泌を低下する
方法論
ＨｅｐＧ２細胞を、２４時間ペプチド（５ｎｇ／ｍｌ）で処理し、次いで、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで２４時間処理した。データは、少なくとも２つの独立した実験の平均±ＳＥＭで表した（*ｐ＜０．０５ **ｐ＜０．０１ ***ｐ＜０．００１）。
【0187】
結果
図４に例示されるように、本発明のペプチドはＩＬ－８の分泌を低下した。
図４に例示されるように、本発明のペプチドはＩＬ－８の分泌を低下した。
【0188】
肝線維症の特徴は、ＩＬ－８などの炎症マーカーの分泌を増加させることである。このマーカーの発現を低下することは、このペプチドがこの疾患の状況において効能を有することを示す。
【0189】
（実施例３）
ヒト一次肝星細胞（human primary hepatic stellate cell）における抗線維化活性
方法論
ヒト星細胞をＴＧＦ－β１で処理し、α－ＳＭＡ（平滑筋作用、線維症に対する一次マーカー）の発現を刺激し、次いで、ペプチド（５ｎＭ、配列番号１）で処理した。細胞の共焦点画像を取得した。
ヒト一次肝星細胞（human primary hepatic stellate cell）における抗線維化活性
方法論
ヒト星細胞をＴＧＦ－β１で処理し、α－ＳＭＡ（平滑筋作用、線維症に対する一次マーカー）の発現を刺激し、次いで、ペプチド（５ｎＭ、配列番号１）で処理した。細胞の共焦点画像を取得した。
【0190】
結果
図５は、処理前後のヒト星細胞の共焦点画像を示す。α－ＳＭＡ発現の減少は、ペプチドの抗線維化活性の証拠である。このペプチドは、等しいモル用量で、エラフィブラノル（Elafibranor）よりも性能が優れていた。
図５は、処理前後のヒト星細胞の共焦点画像を示す。α－ＳＭＡ発現の減少は、ペプチドの抗線維化活性の証拠である。このペプチドは、等しいモル用量で、エラフィブラノル（Elafibranor）よりも性能が優れていた。
【0191】
（実施例４）
ＰＡＮＸ１活性化後の細胞内ペプチド濃度
方法論
本発明のペプチド（配列番号１）を細胞（Ｃａｃｏ２）に添加した。ＰＡＮＸ１チャネルが、細胞外カルシウムレベルを増加することによって細胞内で活性化された。ペプチドの細胞内濃度は活性化の前後で測定された。
ＰＡＮＸ１活性化後の細胞内ペプチド濃度
方法論
本発明のペプチド（配列番号１）を細胞（Ｃａｃｏ２）に添加した。ＰＡＮＸ１チャネルが、細胞外カルシウムレベルを増加することによって細胞内で活性化された。ペプチドの細胞内濃度は活性化の前後で測定された。
【0192】
結果
特定の生理学的条件下、即ち細胞外ＡＴＰ又はカルシウムの増加で、パンネキシンチャネルが活性化され、シグナル伝達分子のより大きな流入を可能にする。図７は、ペプチドの細胞内濃度は、チャネルが活性化されるときに増加されることを示す。これは、ペプチドが、好ましくは、活性化された条件下又は疾患の条件下でチャネルと相互作用するであろうことの証拠である。図７における緑色素は、膜の色素であり、赤色色素は、標識されたペプチドである。
特定の生理学的条件下、即ち細胞外ＡＴＰ又はカルシウムの増加で、パンネキシンチャネルが活性化され、シグナル伝達分子のより大きな流入を可能にする。図７は、ペプチドの細胞内濃度は、チャネルが活性化されるときに増加されることを示す。これは、ペプチドが、好ましくは、活性化された条件下又は疾患の条件下でチャネルと相互作用するであろうことの証拠である。図７における緑色素は、膜の色素であり、赤色色素は、標識されたペプチドである。
【0193】
（実施例５）
Ｒｅｔｒｏｇｅｎｉｘ Ｐａｎｘ１の初期同定
多数の画像化研究が実施され、ペプチド（配列番号１）の標的細胞型との相互作用の動力学及び性質を決定した。これらの実験は、ペプチドの標的が細胞内又は細胞外タンパク質であるかどうかを決定することを必要とした。図８の代表的な画像から、このペプチドのシリーズが、細胞透過に必要であること、及び、ヒト骨格筋細胞（ＨＳＫＭＣ細胞）（赤色蛍光）において６０分のインキュベーションの後に十分な細胞内蓄積を示したことが決定された。標識されていないＣＹ５色素を用いた対照染色は、この細胞型に取り込まれなかった。この初期の研究は、ペプチド標的が、初期エンドソームに対するマーカーであるＥＥＡ１色素と細胞内共染色され、共局在化されることを確認すると同時に、このペプチドが、内側でタンパク質を結合した細胞外膜を細胞内に輸送する役を担っているこれらの細胞内オルガネラと共に配置されているようであることを示した。ゴルジ装置などの他の内部オルガネラ及びミトコンドリアに対するマーカーでの同様の共染色は、オーバーラップを示さなかった。
Ｒｅｔｒｏｇｅｎｉｘ Ｐａｎｘ１の初期同定
多数の画像化研究が実施され、ペプチド（配列番号１）の標的細胞型との相互作用の動力学及び性質を決定した。これらの実験は、ペプチドの標的が細胞内又は細胞外タンパク質であるかどうかを決定することを必要とした。図８の代表的な画像から、このペプチドのシリーズが、細胞透過に必要であること、及び、ヒト骨格筋細胞（ＨＳＫＭＣ細胞）（赤色蛍光）において６０分のインキュベーションの後に十分な細胞内蓄積を示したことが決定された。標識されていないＣＹ５色素を用いた対照染色は、この細胞型に取り込まれなかった。この初期の研究は、ペプチド標的が、初期エンドソームに対するマーカーであるＥＥＡ１色素と細胞内共染色され、共局在化されることを確認すると同時に、このペプチドが、内側でタンパク質を結合した細胞外膜を細胞内に輸送する役を担っているこれらの細胞内オルガネラと共に配置されているようであることを示した。ゴルジ装置などの他の内部オルガネラ及びミトコンドリアに対するマーカーでの同様の共染色は、オーバーラップを示さなかった。
【0194】
培養物中のペプチドの細胞外膜結合を確認するために、受容体スクリーニングを実施した（Ｒｅｔｒｏｇｅｎｉｘ）。Ｒｅｔｒｏｇｅｎｉｘの細胞マイクロアレイ技術を、ＣＹ５標識したペプチド（ｐｅｐ＿ＨＴＷＣＦＬ、配列番号１のＣＹ５標識された変形物）の特異的細胞表面標的相互作用についてのスクリーニングに使用した。
【0195】
異なるインキュベーション条件を使用した、固定した形質転換していないＨＥＫ２９３細胞への試験ペプチドの結合のレベルの研究は、適切なスクリーニング条件である３０分間の固体化された細胞で０．０１μｇ／ｍｌの試験ペプチドを示した。この条件下で、試験ペプチドは、固定化されたヒトＨＥＫ２９３細胞に対する結合についてスクリーニングされ、５５２８全長のヒト細胞膜タンパク質を個別に発現し、タンパク質を分泌した。この初期スクリーニングは、４３の一次該当物（hits）に関連した。
【0196】
各一次該当物（hit）は、次に、２種類の対照受容体（ＣＤ２０（ＭＳ４Ａ１）及びＥＧＦＲ）と共に再発現され、対照ペプチドと同じ濃度の０．０１μｇ／ｍｌ及び０．０５μｇ／ｍｌの試験ペプチド、及び他の陽性対照及び陰性対照処理を用いて再試験された。試験ペプチドに対して９つの特定の相互作用が見出された。これらの中には、ＰＡＮＸ１（２つの別々の発現クローンから）、ＳＬＣ３５Ｆ２、及びＴＡＣＲ１があった。
【0197】
生細胞のマイクロアレイ実験でのフォローアップにおいて、試験ペプチドは、ＴＡＣＲ１（サブスタンスＰ受容体）及びＳＬＣ３５Ｆ２との特異的相互作用を示し、このことは、これらが機能的に関連する相互作用でありうるというより大きな証拠を提供する。固定化された細胞について、ＰＡＮＸ１は、バックグラウンドに対して最も大きなシグナルを示し、２つの別々の発現クローンから観測された。固定化された細胞と生細胞の間の実験的差は、生細胞で見られるシグナルの欠如の説明となりうる。
【0198】
図３は、結合性パートナー及び導かれた該当物（hits）の強度を示す。
【0199】
（実施例６）
Ｐａｎｘ１カルシウム結合
ペプチド（配列番号１）と結合するＰａｎｘ１を、Ｃａ2+流入アッセイ及びフローサイトメトリーを用いて試験した。Ｐａｎｘ１は、細胞膜でのＣａ2+イオン及びＡＴＰのバランスを調節する重要な役割を担う。この関係は、Ｐａｎｘ１の活性をモニターするために活用されうる。Ｐａｎｘ１をブロックすることは、ＡＴＰ刺激に応答して細胞内Ｃａ2+流入の有意な減少を導く。
Ｐａｎｘ１カルシウム結合
ペプチド（配列番号１）と結合するＰａｎｘ１を、Ｃａ2+流入アッセイ及びフローサイトメトリーを用いて試験した。Ｐａｎｘ１は、細胞膜でのＣａ2+イオン及びＡＴＰのバランスを調節する重要な役割を担う。この関係は、Ｐａｎｘ１の活性をモニターするために活用されうる。Ｐａｎｘ１をブロックすることは、ＡＴＰ刺激に応答して細胞内Ｃａ2+流入の有意な減少を導く。
【0200】
ＴＨＰ－１細胞を、細胞内Ｃａ2+イオンを標識するために３０分間ＦＩＴＣ蛍光色素とインキュベートした。次に、細胞をＡＴＰで刺激し、細胞からのカルシウム流入を駆動し、次いで、この蛍光の増加をフローサイトメトリーで検出する。ＡＴＰ刺激の前に、カルシウムの流れの低下が観測されるかどうか、この低下がＰａｎｘ１に対するペプチドの結合によって引き起こされ、従ってＡＴＰで媒介されるカルシウム流れを阻害するがどうかを研究するために、細胞を１μＭ用量のペプチドでインキュベートした。
【0201】
これらの結果は、図９（Ａ）～（Ｃ）に示されている。
【0202】
（実施例７）
ＡＰＡＰ（パラセタモール）肝傷害試験
ペプチド（配列番号１）の作用メカニズムに対する極めて重要なものとしてＰａｎｘ１を例示しているが、本発明者らは、ＡＰＡＰ（Ｎ－アセチル－パラ－アミノフェノール、パラセタモール）についての治療効果を示したこのペプチド（及びその変異体であるＨ－｛ｄ｝Ｗ｛ｄ｝ＫＤＥ｛ｄ｝ＡＧＫＰＬ｛ｄ｝Ｖ｛ｄ｝Ｋ－ＯＨ（配列番号８６）及びＤＥＡＧＫＰＬＶ（配列番号９０））が、肝傷害のモデルを誘導するかどうかを試験した。Ｐａｎｘ１は、肝疾患の病因に大きく影響され、ＡＰＡＰの過剰用量でひどく上方調節される。
ＡＰＡＰ（パラセタモール）肝傷害試験
ペプチド（配列番号１）の作用メカニズムに対する極めて重要なものとしてＰａｎｘ１を例示しているが、本発明者らは、ＡＰＡＰ（Ｎ－アセチル－パラ－アミノフェノール、パラセタモール）についての治療効果を示したこのペプチド（及びその変異体であるＨ－｛ｄ｝Ｗ｛ｄ｝ＫＤＥ｛ｄ｝ＡＧＫＰＬ｛ｄ｝Ｖ｛ｄ｝Ｋ－ＯＨ（配列番号８６）及びＤＥＡＧＫＰＬＶ（配列番号９０））が、肝傷害のモデルを誘導するかどうかを試験した。Ｐａｎｘ１は、肝疾患の病因に大きく影響され、ＡＰＡＰの過剰用量でひどく上方調節される。
【0203】
初期のパイロット試験は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス対生理食塩水対照において、２００ｍｐｋのＡＰＡＰが、ＡＰＡＰで誘導される肝傷害の生化学的特徴であるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の両レベルを有意に増加することを示した。従って、これは、肝傷害試験（trial）での使用に対する最適濃度と考えられる。
【0204】
８週齢のオスＣ５７ＢＬ／６マウスを、ＡＰＡＰ（２００ｍｇ／ｋｇ）又は生理食塩水投与に先だって、一夜（約１６時間）絶食した。最初のＡＰＡＰの投薬の後１．５時間に、ペプチド及び１０ＰＡＮＸ１（高用量で効果のある１０Ｐａｎｘ１の薬理学的阻害剤）を、１０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内（ＩＶ）で投与し、同じ肝酵素のレベルが２．２５及び６時間で観測された。
【0205】
治療剤（treatments）は、予め決められた時間（ＡＰＡＰ注入後又は生理食塩水注入後１．５時間）に基づいて投与された。各グループには８～１０匹のマウスがおり、これは、ＰＫ分析用の３～４匹のマウス及び有効性の終点のための５～６匹のマウスを含む。投与の経路は、試験品についてはＩＶであり、ＡＰＡＰ（２００ｍｇ／ｋｇ）に対してはＩＰであった。
【0206】
早い時間点では、全てのペプチドは最大８０％ＡＬＴのレベルを低下し、これに対し、ＡＰＡＰ／生理食塩水対照及び非常に性能の優れた１０ＰＡＮＸは、ＡＬＴで４１％の減少を誘導した。同様の傾向が、２．２５時間でのＡＳＴで観測された。６時間では、ＡＰＡＰ／生理食塩水グループのＡＬＴ及びＡＳＴレベルは、それぞれ４倍及び２倍増加した。１０ＰＡＮＸの活性は、この時間点で大きく安定したままであり、４５％～５３％の両肝酵素の有意でない減少を誘導した。ペプチドで処理されたマウスで測定されたＡＳＴ及びＡＬＴのレベルは、ＡＰＡＰ対照動物の範囲内で６時間で増加した。これは、最初の２時間で可能な機能性を示すように思われ、そのうえ、マウスで少なくとも３倍長く持続する１０ＰＡＮＸ１とは異なり、同じように代謝されるペプチドの薬力学的プロファイルの兆候を示す（図１０）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10】
【配列表】
【国際調査報告】