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特表2023-512833新型コロナウイルス感染症に対するｍＲＮＡワクチンの組成物及び方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-29
(54)【発明の名称】新型コロナウイルス感染症に対するｍＲＮＡワクチンの組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
A61K 39/215 20060101AFI20230322BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20230322BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230322BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20230322BHJP
A61K 9/51 20060101ALI20230322BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20230322BHJP
A61K 47/44 20170101ALI20230322BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230322BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20230322BHJP
A61K 9/72 20060101ALI20230322BHJP
C12N 15/50 20060101ALI20230322BHJP
【ＦＩ】
A61K39/215 ZNA
A61K39/00 G
A61P31/14
A61K9/14
A61K9/51
A61K47/42
A61K47/44
A61K48/00
A61K9/10
A61K9/72
C12N15/50
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022548143
(86)(22)【出願日】2021-02-08
(85)【翻訳文提出日】2022-09-26
(86)【国際出願番号】 US2021017149
(87)【国際公開番号】W WO2021159118
(87)【国際公開日】2021-08-12
(31)【優先権主張番号】63/130,581
(32)【優先日】2020-12-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/971,834
(32)【優先日】2020-02-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/058,463
(32)【優先日】2020-07-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522313994
【氏名又は名称】アールエヌエーイミューン、インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＲＮＡＩＭＭＵＮＥ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】110000729
【氏名又は名称】弁理士法人ユニアス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】タン、ションカオ
(72)【発明者】
【氏名】シェン、トン
(72)【発明者】
【氏名】ルー、チュン
(72)【発明者】
【氏名】ホー、ツーヤン
(72)【発明者】
【氏名】ホー、チアシー
(72)【発明者】
【氏名】ルー、パトリック、ワイ．
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
【Ｆターム（参考）】
4C076AA29
4C076AA65
4C076AA93
4C076BB15
4C076BB16
4C076BB21
4C076CC06
4C076CC35
4C076EE41
4C076EE51
4C076FF63
4C084AA13
4C084MA05
4C084MA38
4C084MA43
4C084MA66
4C084MA70
4C084NA14
4C084ZB09
4C084ZB33
4C085AA03
4C085BA71
4C085CC31
4C085DD32
4C085EE01
4C085EE07
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG06
4C085GG10
(57)【要約】
【課題】２０１９年新規コロナウイルス（２０１９－ｎＣｏＶ）感染の予防及び治療のための強力なｍＲＮＡワクチン用の組成物及び方法が提供される。
【解決手段】組成物は、変異エピトープを含むスパイクタンパク質エピトープをコードする１つ以上のｍＲＮＡ分子、又は重要なウイルス遺伝子をコードするｍＲＮＡカクテルを、薬学的に許容される高分子ナノ粒子担体及びリポソームナノ粒子担体とともに含む薬学的組成物を含む。皮下、腹腔内及び筋肉内注射を含む、システム免疫応答を刺激する方法及び治療法が提供される。
【選択図】なし
【解決手段】組成物は、変異エピトープを含むスパイクタンパク質エピトープをコードする１つ以上のｍＲＮＡ分子、又は重要なウイルス遺伝子をコードするｍＲＮＡカクテルを、薬学的に許容される高分子ナノ粒子担体及びリポソームナノ粒子担体とともに含む薬学的組成物を含む。皮下、腹腔内及び筋肉内注射を含む、システム免疫応答を刺激する方法及び治療法が提供される。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
薬学的に許容される担体に配合される、２０１９－ｎＣｏＶタンパク質又はタンパク質断片をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）の有効量を含有し、該ｍＲＮＡ及び前記担体が高分子ナノ粒子を形成する、組成物。
【請求項2】
前記２０１９－ｎＣｏＶタンパク質がスパイク（Ｓ）タンパク質又はスパイク（Ｓ）サブユニットである、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記ＯＲＦが、配列表の配列番号１４～３１から選択されるペプチドをコードするｍＲＮＡ分子からなる群より選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
前記ＯＲＦが、配列表の配列番号３２～４９からなる群より選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項5】
前記ＯＲＦが、配列表の配列番号５０～５５から選択されるペプチドをコードするｍＲＮＡを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項6】
前記ＯＲＦが、配列表の配列番号９１～９６からなる群より選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項7】
前記ＯＲＦが、配列表の配列番号５６～６６から選択されるペプチドをコードするｍＲＮＡを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項8】
前記ＯＲＦが、配列表の配列番号９７～１０７からなる群より選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項9】
前記ＯＲＦが、配列表の配列番号１１、１３、６８、７０、７２、７４及び９０から選択されるアミノ酸配列をコードするｍＲＮＡ分子からなる群より選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項10】
前記ＯＲＦが、配列表の配列番号１０、１２、６７、６９、７１、７３及び８９からなる群より選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項11】
前記ＯＲＦが、配列表の配列番号１、２、３、及び４からなる群より選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項12】
ｏｒｆ１ａ及び／又はｏｒｆ１ｂの全部又は一部を含むｍＲＮＡをさらに含み、該ｍＲＮＡが２０１９－ｎＣｏＶ非構造タンパク質ポリメラーゼ及び／又はＲｄＲｐをコードする、任意の先行請求項に記載の組成物。
【請求項13】
前記ＯＲＦが、配列表の配列番号５及び６からなる群より選択されるｍＲＮＡである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
前記ＯＲＦが、エンベロープ（Ｅ）、膜（Ｍ）、及び／又はヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質をコードする２０１９ ｎＣｏＶの全て又は一部をコードする、請求項１に記載の組成物。
【請求項15】
エンベロープ（Ｅ）、膜（Ｍ）、及び／又はヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質をコードする２０１９－ｎＣｏＶの全部又は一部をコードする１つ又は複数のｍＲＮＡ配列をさらに含む、任意の先行請求項に記載の組成物。
【請求項16】
前記ＯＲＦが、配列表の配列番号７、８、及び９からなる群より選択される、請求項１４又は１５に記載の組成物。
【請求項17】
前記ｍＲＮＡが、１つ以上のＮ１－メチル－プソイドウリジン及び／又はプソイドウリジン残基を含む化学的に修飾されたｍＲＮＡ配列である、任意の先行請求項に記載の組成物。
【請求項18】
前記ｍＲＮＡ中の全てのウリジン残基がＮ１－メチルプソイドウリジン又はプソイドウリジンである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項19】
前記ｍＲＮＡ分子が、３´－ＵＴＲ、５´－ＵＴＲをさらに含み、任意に、（ａ）組成物を安定化し、（ｂ）前記ＯＲＦによってコードされるポリペプチドの発現を増強する追加の要素をさらに含む、任意の先行請求項に記載の組成物。
【請求項20】
前記５´－ＵＴＲが、ｍ７Ｇキャップ構造及び開始コドンを含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項21】
前記３´－ＵＴＲが停止コドン及びｐｏｌｙＡテールを含む、請求項１９又は２０に記載の組成物。
【請求項22】
前記ＯＲＦを線状インビトロ転写（ＩＶＴ）系で発現させることを含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の組成物を製造する方法。
【請求項23】
プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）ベクター送達システムを用いて前記ＯＲＦ発現を発現させることを含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の組成物の製造方法。
【請求項24】
前記組成物が、１つ以上のＯＲＦを含み、少なくとも２つのポリペプチドをコードする、請求項１～２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項25】
前記組成物が、ヒスチジン－リジン共重合体（ＨＫＰ）を含む高分子ナノ粒子担体をさらに含む、請求項１～２１又は２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項26】
前記ＨＫＰが、配列表の配列番号７５～８８から選択される側鎖を有するポリマーからなる群より選択される、請求項２５に記載の組成物。
【請求項27】
前記ＯＲＦを含む組成物をＨＫＰと接触させることを含み、前記ｍＲＮＡと前記ＨＫＰが自己集合してナノ粒子となる、請求項２５又は請求項２６に記載の組成物の製造方法。
【請求項28】
前記ナノ粒子が脂質をさらに含み、該脂質が任意にカチオン性脂質である、請求項１～２１又は請求項２４～２６のいずれかに記載の組成物。
【請求項29】
請求項１～２１、２４～２６又は２８のいずれか１項に記載の組成物の薬学的有効量を前記対象に投与することを含む、２０１９－ｎＣｏＶ感染を有する対象を治療する方法。
【請求項30】
前記組成物が、投与前又は投与中にネブライザー吸入システムによって霧化される、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記ネブライザーシステムが、全呼吸器官薬物送達用の携帯できるネブライザーである、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記組成物が皮下注射によって投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項33】
前記組成物が筋肉内注射によって投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項34】
前記組成物が腹腔内注射（ｉ．ｐ）により投与される、請求項２９に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０２０年２月７日に出願された米国仮出願第６２／９７１，８３４号、２０２０年７月２９日に出願された６３／０５８，４６３号、及び２０２０年１２月２４日に出願された６３／１３０，５８１号の優先権を主張し、それぞれの内容は参照によりその全体としてここに組み込まれるものである。
２０１９－ｎＣｏＶ感染のワクチン接種、予防及び治療のための予防薬及び治療薬が、それらの使用のための方法とともに提供される。
２０１９－ｎＣｏＶ感染のワクチン接種、予防及び治療のための予防薬及び治療薬が、それらの使用のための方法とともに提供される。
【背景技術】
【0002】
新型コロナウイルス（２０１９－ｎＣｏＶ）感染症：生物学及び病理学
コロナウイルス（ＣｏＶｓ）は、繰り返し種の壁を越えており、一部は重要なヒトの病原体として出現している。過去２０年の間に、動物に感染する２つのコロナウイルスが進化し、ヒトでの大流行を引き起こした。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ （２００２， Ｂｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ， ｓｕｂｇｅｎｕｓ Ｓａｒｂｅｃｏｖｉｒｕｓ）とＭＥＲＳ－ＣｏＶ （２０１２， Ｂｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ， ｓｕｂｇｅｎｕｓ Ｍｅｒｂｅｃｏｖｉｒｕｓ） ［ Ｄｒｏｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ２００３； ３４８： １９６７－１９７６；Ｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ２０１２； ３６７： １８１４－１８２０］． ２０１９年１２月３１日、中国湖北省武漢市の武漢市衛生委員会は、武漢の華南海鮮卸売市場（異なる動物種を販売する魚や生きた動物の卸売市場）との関連が共通して報告された、７人の重症例を含む２７人の原因不明の肺炎の集団事例を報告した［Ｗｕｈａｎ Ｃｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ （ＷＣＨＣ）．武漢市衛生保健委員会の当市における現在の肺炎流行状況についての説明 ２０１９（２０１９年１２月３１日２０２０年１月１４日更新）。公開元：ｈｔｔｐ：／／ｗｊｗ．ｗｕｈａｎ．ｇｏｖ．ｃｎ／ｆｒｏｎｔ／ｗｅｂ／ｓｈｏｗＤｅｔａｉｌ／２０１９１２３１０８９８９］。
２０１９－ｎＣｏＶは、これまでヒトで確認されていない新型のコロナウイルス株である［Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ３８２：７２７－７３３ （２０２０）］。
コロナウイルス（ＣｏＶｓ）は、繰り返し種の壁を越えており、一部は重要なヒトの病原体として出現している。過去２０年の間に、動物に感染する２つのコロナウイルスが進化し、ヒトでの大流行を引き起こした。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ （２００２， Ｂｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ， ｓｕｂｇｅｎｕｓ Ｓａｒｂｅｃｏｖｉｒｕｓ）とＭＥＲＳ－ＣｏＶ （２０１２， Ｂｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ， ｓｕｂｇｅｎｕｓ Ｍｅｒｂｅｃｏｖｉｒｕｓ） ［ Ｄｒｏｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ２００３； ３４８： １９６７－１９７６；Ｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ２０１２； ３６７： １８１４－１８２０］． ２０１９年１２月３１日、中国湖北省武漢市の武漢市衛生委員会は、武漢の華南海鮮卸売市場（異なる動物種を販売する魚や生きた動物の卸売市場）との関連が共通して報告された、７人の重症例を含む２７人の原因不明の肺炎の集団事例を報告した［Ｗｕｈａｎ Ｃｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ （ＷＣＨＣ）．武漢市衛生保健委員会の当市における現在の肺炎流行状況についての説明 ２０１９（２０１９年１２月３１日２０２０年１月１４日更新）。公開元：ｈｔｔｐ：／／ｗｊｗ．ｗｕｈａｎ．ｇｏｖ．ｃｎ／ｆｒｏｎｔ／ｗｅｂ／ｓｈｏｗＤｅｔａｉｌ／２０１９１２３１０８９８９］。
２０１９－ｎＣｏＶは、これまでヒトで確認されていない新型のコロナウイルス株である［Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ３８２：７２７－７３３ （２０２０）］。
【0003】
この大流行は急速に拡大し、中国の他の地域や国外にも影響を及ぼしている。現在、アジアの数カ国だけでなく、オーストラリア、ヨーロッパ、北米でも症例が検出されている。２０１９－ｎＣｏＶは、呼吸器飛沫を介したヒト－ヒトの接触によって広がるようである［Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ２０２０； ３８２：１１９９－１２０７］。
【0004】
遺伝子解析の結果、２０１９－ｎＣｏＶはＳＡＲＳ－ＣｏＶと近縁であり、遺伝的にはベータコロナウイルス属にクラスター化し、コウモリ由来のＳＡＲＳ様２株とともにサーベコウイルス亜属の系統Ｂに明確なクレードを形成していることが明らかとなった。ウイルスゲノムは、コロナウイルスに共通する６つの主要なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、その他の多数の付属遺伝子から構成されている。さらなる解析の結果、２０１９－ｎＣｏＶの遺伝子の一部はＳＡＲＳ－ＣｏＶと８０％未満の配列同一性を有していた。しかし、ＣｏＶの種分類に使用したＯＲＦ１ａｂの７つの保存されたレプリカーゼ（ＲｄＲＰ）ドメインは、２０１９－ｎＣｏＶとＳＡＲＳ－ＣｏＶの間で９４．６％のＡＡ配列同一であり、両者は同じ種に属することが示唆される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶの細胞受容体として、膜外ペプチダーゼであるＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ＩＩ（ＡＣＥ２）が知られていた。この受容体は、２０１９－ｎＣｏＶがヒトの細胞内に侵入する際にも使用されることが示されている。ドメイン２６６－３３０（成熟タンパク質の配列に基づく番号付け）は、２０１９－ｎＣｏＶとＡＣＥ２との相互作用に必須であることが示されている［Ｖｅｌｊｋｏｖｉｃら、Ｆ１０００Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０２０；９：５２．］。
【0005】
新型コロナウイルス（２０１９－ｎＣｏＶ）の現在の予防法・治療法について
現在、２０１９－ｎＣｏＶの全ゲノム２８７，５４３個の配列が中国ＣＤＣ等からＧＩＳＡＩＤ［ＧＩＳＡＩＤ， Ｎｅｗｌｙ ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ ｂｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ， Ｗｕｈａｎ ２０１９－２０２０ （２０１９）； ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｉｓａｉｄ．ｏｒｇ／．］に提出されており、そのうち１つはＧｅｎＢａｎｋで公開（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ： ＭＮ９０８９４７．３）［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／．］されている。現在、２０１９－ｎＣｏＶ感染を含むコロナウイルス感染症を予防するためのワクチンは、緊急時使用認定ワクチンが２種類のみで、認可されたワクチンはない。
現在、２０１９－ｎＣｏＶの全ゲノム２８７，５４３個の配列が中国ＣＤＣ等からＧＩＳＡＩＤ［ＧＩＳＡＩＤ， Ｎｅｗｌｙ ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ ｂｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ， Ｗｕｈａｎ ２０１９－２０２０ （２０１９）； ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｉｓａｉｄ．ｏｒｇ／．］に提出されており、そのうち１つはＧｅｎＢａｎｋで公開（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ： ＭＮ９０８９４７．３）［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／．］されている。現在、２０１９－ｎＣｏＶ感染を含むコロナウイルス感染症を予防するためのワクチンは、緊急時使用認定ワクチンが２種類のみで、認可されたワクチンはない。
【0006】
ｍＲＮＡワクチンの利点
ワクチン接種は、疾病予防と制御に対する最も成功した医学的アプローチである。ワクチンの開発と使用の成功により、何千人もの命と多額の資金が救われている。ＲＮＡワクチンの主な利点は、実験室でＤＮＡを鋳型にＲＮＡを生産することができることで、鶏卵や他の哺乳類細胞を必要とする従来のワクチン生産よりも安価かつ迅速に生産できる。さらに、ｍＲＮＡワクチンは、ワクチンの発見と開発を合理化し、新興感染症への迅速な対応を促進する可能性がある［Ｍａｒｕｇｇｉ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２０１９； ２７（４）： ７５７－７７２］。
ワクチン接種は、疾病予防と制御に対する最も成功した医学的アプローチである。ワクチンの開発と使用の成功により、何千人もの命と多額の資金が救われている。ＲＮＡワクチンの主な利点は、実験室でＤＮＡを鋳型にＲＮＡを生産することができることで、鶏卵や他の哺乳類細胞を必要とする従来のワクチン生産よりも安価かつ迅速に生産できる。さらに、ｍＲＮＡワクチンは、ワクチンの発見と開発を合理化し、新興感染症への迅速な対応を促進する可能性がある［Ｍａｒｕｇｇｉ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２０１９； ２７（４）： ７５７－７７２］。
【0007】
前臨床試験及び臨床試験により、ｍＲＮＡワクチンは動物モデル及びヒトにおいて安全かつ長期的な免疫応答をもたらすことが示されている。感染症に対するｍＲＮＡワクチンは、予防的又は治療的治療として開発することができる。感染性病原体の抗原を発現するｍＲＮＡワクチンは、強力なＴ細胞及び液性免疫応答を誘導することが示されている［Ｐａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１８； １７： ２６１－２７９．］。ｍＲＮＡワクチンを生成するための製造手順は、全病原体ワクチン、弱毒生ワクチン、サブユニットワクチンの製造と比較して、無細胞でシンプルかつ迅速である。この迅速かつシンプルな製造プロセスにより、ｍＲＮＡは、新興感染症と効果的なワクチンの切実なニーズとの間のギャップを埋めることができる可能性のある有望なバイオ製品になる。
【発明の概要】
【0008】
薬学的に許容される担体中に配合された２０１９－ｎＣｏＶタンパク質又はタンパク質断片をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）の有効量を含む組成物が提供され、ここで、ｍＲＮＡ及び担体がポリマーナノ粒子を形成する。２０１９－ｎＣｏＶタンパク質は、スパイク（Ｓ）タンパク質又はスパイク（Ｓ）サブユニットであり得る。ＯＲＦは、配列表の配列番号１４～３１、又は５０～６６から選択される配列を有するペプチドなどのペプチドをコードするｍＲＮＡであってよい。ＯＲＦは、例えば、配列表の配列番号３２～４９又は配列番号９１～１０７に示されるような配列を有するｍＲＮＡを含んでもよい。ＯＲＦは、配列番号 Ｎｏ．１１、１３、６８、７０、７２、７４及び９０から選択されるアミノ酸配列をコードするｍＲＮＡ分子から選択されてもよい。ＯＲＦは、配列番号１～４、１０、１２、６７、６９、７１、７３又は８９のような配列を有していてもよい。
【0009】
これらの組成物はまた、ｏｒｆ１ａ及び／又はｏｒｆ１ｂの全部又は一部を含むｍＲＮＡを含んでもよく、ここで、ｍＲＮＡは２０１９－ｎＣｏＶ非構造タンパク質ポリメラーゼ及び／又はＲｄＲｐをコードしていてもよい。ＯＲＦは、配列番号５又は６のような配列を有するｍＲＮＡであり得る。ＯＲＦは、２０１９ｎＣｏＶをコードするエンベロープ（Ｅ）、膜（Ｍ）、及び／又はヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質の全て又は一部をコードしていてもよい。これらの組成物はまた、２０１９ ｎＣｏＶをコードするエンベロープ（Ｅ）、膜（Ｍ）、及び／又はヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質の全て又は一部をコードする１つ又は複数のｍＲＮＡ配列を含んでもよい。ＯＲＦは、配列番号 Ｎｏ．７、８、又は９に示される配列を有するｍＲＮＡ分子から選択されてもよい。
【0010】
これらの組成物のいずれかにおいて、ｍＲＮＡは、１つ以上のＮ１－メチル－プソイドウリジン及び／又はプソイドウリジン残基で化学的に修飾されてもよい。ｍＲＮＡ中のウリジン残基は、全てＮ１－メチルプソイドウリジン又はプソイドウリジンであり得る。
【0011】
これらの組成物のいずれにおいても、ｍＲＮＡ分子は、３´－ＵＴＲ、５´－ＵＴＲをさらに含み、任意に、（ａ）組成物を安定化し、（ｂ）ＯＲＦによってコードされるポリペプチドの発現を増強する追加の要素をさらに含むことができる。５´－ＵＴＲは、ｍ７Ｇキャップ構造及び開始コドンを含むことができ、及び／又は３´－ＵＴＲは、停止コドン及びポリＡテールを含むことができる。
【0012】
組成物は、１つ以上のＯＲＦを含んでいてもよく、少なくとも２つのポリペプチドをコードしていてもよい。
【0013】
組成物は、ヒスチジン－リジン共重合体（ＨＫＰ）を含む高分子ナノ粒子担体を含んでもよい。適切なＨＫＰの例には、配列表の配列番号７５～８８から選択される側鎖を有するポリマーが含まれるが、これらに限定されない。
【0014】
また、線状インビトロ転写（ＩＶＴ）系で、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）ベクター送達系でＯＲＦを発現させることによって、上記のような組成物を製造する方法も提供される。
【0015】
上記のような組成物は、ＯＲＦ（複数可）を含む組成物をＨＫＰと接触させることによって製造されてもよく、ここでｍＲＮＡとＨＫＰはナノ粒子に自己集合する。 組成物は、脂質をさらに含んでもよく、ここで、脂質は任意にカチオン性脂質であり得る。
【0016】
また、上記のような組成物の薬学的有効量を対象に投与することにより、２０１９－ｎＣｏＶ感染症に罹患している対象を治療する方法も提供される。組成物は、投与前又は投与中に、ネブライザー吸入システムによって霧化されてもよい。ネブライザーシステムは、全呼吸器官薬物送達のための携帯用ネブライザーであり得る。組成物は、皮下注射、筋肉内注射、又は腹腔内注射（ｉ．ｐ）により投与されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【発明を実施するための形態】
【0018】
２０１９－ｎＣｏＶ感染のワクチン接種、予防及び治療のための予防薬及び治療薬が提供される。医薬用賦形剤と共に製剤化されたｍＲＮＡ配列を含む医薬組成物が提供される。ｍＲＮＡベースの医薬製剤の組成物は、コロナウイルス感染及び複製に必要なウイルスタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列、及び特定の担体を含む。好適な担体は、ヒスチジン－リジン共重合体（ＨＫＰ）、及び／又はＨＫＰプラス脂質、例えばカチオン性脂質である。治療方法、プロセス開発、及び特定の送達経路及びレジメンを含む、これらの医薬組成物を使用するための方法も提供される。
【0019】
２０１９－ｎＣｏＶに対するｍＲＮＡワクチンのための標的の選択および設計
タンパク質レベルについて、様々な２０１９－ｎＣｏＶの予測された遺伝子を特定し、注釈づけした。６つすべての２０１９－ｎＣｏＶゲノムの注釈づけ結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ様コロナウイルスにおいて確認される７つの機能的タンパク質（ｐｐ１ａ、Ｅ２糖タンパク質前駆体、仮想タンパク質ｓａｒｓ３ａ、マトリックスタンパク質、仮想ンパク質ｓａｒｓ６、仮想タンパク質ｓａｒｓ７ａ、ヌクレオカプシドタンパク質）を含めて同一であることが見出された［Ｂ．Ｂｕｃｈｆｉｎｋ他、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１５；１２：５９～６０］。これらの結果は、２０１９－ｎＣｏＶと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＭＥＲＳ－ＣｏＶ様コロナウイルスとの間における類似性および差異を例示している。
タンパク質レベルについて、様々な２０１９－ｎＣｏＶの予測された遺伝子を特定し、注釈づけした。６つすべての２０１９－ｎＣｏＶゲノムの注釈づけ結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ様コロナウイルスにおいて確認される７つの機能的タンパク質（ｐｐ１ａ、Ｅ２糖タンパク質前駆体、仮想タンパク質ｓａｒｓ３ａ、マトリックスタンパク質、仮想ンパク質ｓａｒｓ６、仮想タンパク質ｓａｒｓ７ａ、ヌクレオカプシドタンパク質）を含めて同一であることが見出された［Ｂ．Ｂｕｃｈｆｉｎｋ他、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１５；１２：５９～６０］。これらの結果は、２０１９－ｎＣｏＶと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＭＥＲＳ－ＣｏＶ様コロナウイルスとの間における類似性および差異を例示している。
【0020】
２０１９－ｎＣｏＶについての主たるヒト受容体はヒトアンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）であると考えられている。２０１９－ｎＣｏＶ由来のＳ１タンパク質のドメイン２８８～３３０が有望な治療標的および／またはワクチン標的を表している［Ｖｅｌｊｋｏｖｉｃ他、前出］。一般に、２０１９－ｎＣｏＶを含めたコロナウイルスのスパイク（Ｓ）タンパク質は中和抗体の主要な誘導因子であり、Ｓタンパク質のＳ１サブユニットにおける受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）は多数の立体配座的な中和エピトープを含有する［Ｈｅ他、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５；１７４（８）：４９０８～４９１５］。このことから、ＲＢＤを含有する組換えタンパク質、およびＲＢＤ配列をコードするｍＲＮＡを含むベクターは、安全かつ効果的な２０１９－ｎＣｏＶワクチンを開発するために使用することができることが示唆される。
【0021】
本明細書中に記載されるように、新しいタイプのｍＲＮＡワクチン（ｍＲＮＡ－１２７３）が、２０１９－ｎＣｏＶの１つまたは複数のタンパク質に由来する１つまたは複数のエピトープをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を含有する免疫原性組成物を使用して開発されている。このｍＲＮＡは、ポリマーナノ粒子および／またはリポソームナノ粒子を含有する医薬的に許容され得るキャリアにおいて配合される。組成物は、２０１９－ｎＣｏＶに対する特異的免疫応答を対象において誘導するために効果的な量で対象に投与される場合がある。組成物は１つを超えるタイプのｍＲＮＡ分子を含有する場合がある。それぞれの追加されたコピー体により、組成物の免疫刺激活性が強化される。そのようなｍＲＮＡのすべてが、非常に免疫原性であり、かつ、２０１９－ｎＣｏＶが上皮細胞に進入する（これは２０１９－ｎＣｏＶ感染における最初の段階である）ために要求される抗原をコードする。
【0022】
１つの実施形態において、組成物は、２０１９－ｎＣｏＶのスパイク（Ｓ）タンパク質全体をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含有する（図３）。このＳタンパク質が、宿主細胞受容体に付着するためにウイルスによって使用される。Ｓｐｉｋｅタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列は長く、したがって、ｍＲＮＡ発現システム調製の効率を改善するために、当該配列を４つの領域に、すなわち、これらの領域の１つ、いくつか、またはすべてが、Ｓｐｉｋｅタンパク質ドメインについてインフレームで発現したときにはＳｐｉｋｅタンパク質構造に対するｍＲＮＡ抗原として使用することができる４つの領域に分割した（配列番号１～配列番号４）。エピトープになりそうな２４個の短いペプチドフラグメントを標的として選択した（配列番号１４～配列番号３１）。選択される短いペプチドは２０アミノ酸未満であり、好都合には１５アミノ酸未満である。短いペプチド配列をコードするｍＲＮＡ配列を、この技術分野において広く知られている方法を使用して設計した（配列番号３２～配列番号４９）。
【0023】
さらに、他のコロナウイルスと比較して、２０１９－ｎＣｏＶはいくつかの特異な挿入をスパイクタンパク質において有する。２０１９－ｎＣｏＶのＳタンパク質のそれらの挿入部位におけるアミノ酸残基は、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）の複製タンパク質ｇｐ１２０またはＧａｇにおけるアミノ酸残基と同一であるか、または類似している。別の実施形態において、ヒト免疫系によって認識される、２０１９－ｎＣｏＶとＨＩＶ－１との間で同一であるアミノ酸残基をコードする一連のｍＲＮＡ配列を設計した（配列番号５０～配列番号６６）。
【0024】
別の実施形態において、ｍＲＮＡは、スパイクタンパク質のＯＲＦのＤ６１４Ｇバリアントをコードする。コロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）の大流行は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされたものであるが、今や世界的パンデミックに急速に拡大している。Ｄ６１４Ｇ変異をウイルススパイク（Ｓ）タンパク質においてコードする様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単離株が、それが見出される現場では次第に支配的になっており、このことは、この変化がウイルス伝播を増強することを暗示している。残基６１４においてアスパラギン酸（Ｄ６１４）およびグリシン（Ｇ６１４）を有するＳタンパク質は、機能的特性が異なる。具体的には、Ｇ６１４によりシュードタイプ化したレトロウイルスが、野生型（Ｄ６１４）を有するレトロウイルスよりもはるかに効率的にＡＣＥ２発現細胞に感染することが見出された。このより大きい感染力は、より少ないＳ１シェディング（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）、およびＳタンパク質の偽ビリオンへのより多くの組み込みと相関していた。同様の結果が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＭタンパク質、Ｎタンパク質、Ｅタンパク質およびＳタンパク質を伴って産生されるウイルス様粒子を使用して得られた。相関分析において、Ｄ６１４Ｇ変異を持つスパイクタンパク質は死亡率との有意な正の相関を示した（ｒ＝０．４３、Ｐ＝０．０２２）。これらの結果は、Ｄ６１４Ｇ変異を有するスパイクタンパク質は野生型よりも安定であることを示しており、このことは、スパイクのＤ６１４Ｇ変異を有するウイルスがより効率的に伝染することを示唆する疫学的データと一致している（配列番号１０）。Ｓａｒｓ－Ｃｏｖ－２の優勢株に対するより効果的な保護をもたらすであろうので、Ｄ６１４Ｇ変異を組み込むＯＲＦを有するワクチンが作製された。
【0025】
別の実施形態において、ｍＲＮＡは、Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質の前駆体Ｓ２Ｐをコードする、配列番号８９を有するＯＲＦをコードする。
【0026】
別の実施形態において、ｍＲＮＡは、これまでに特定されているスパイクタンパク質内の他の変異を組み込む、配列番号６７を有するＯＲＦをコードする。これらには、ＨＶ６９～７０欠失スパイクタンパク質、Ｙ１４４欠失スパイクタンパク質、Ｎ５０１Ｙ変異スパイクタンパク質、Ａ５７０Ｄ変異スパイクタンパク質、Ｐ６８１Ｈ変異スパイクタンパク質、Ｔ７１６Ｉ変異スパイクタンパク質、Ｆ８１７Ｐ改変スパイクタンパク質、Ａ８９２Ｐ改変スパイクタンパク質、Ａ８９９Ｐ改変スパイクタンパク質、Ａ９４２Ｐ改変スパイクタンパク質、Ｓ９８２Ａ変異スパイクタンパク質、およびＤ１１１８Ｈ変異スパイクタンパク質が含まれる。これらの知られている変異のいずれかの１つまたは複数をコードするｍＲＮＡを含有するワクチン組成物を、本明細書中に記載される方法を使用して調製することができる。
【0027】
他の実施形態において、ｍＲＮＡは、エンベロープ（Ｅ）、膜（Ｍ）またはヌクレオカプシド（Ｎ）の構造タンパク質を含めた１つまたは複数の他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質コード配列をコードする場合がある。２０１９－ｎＣｏＶゲノムは５’－レプリカーゼ（ｏｒｆ１／ａｂ）－構造タンパク質［Ｓｐｉｋｅ（Ｓ）－エンベロープ（Ｅ）－膜（Ｍ）－ヌクレオカプシド（Ｎ）］－３’の順で並んでおり（Ｚｕｌｍａ他、２０１６、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、１５：３２７～３４７）、系統Ａβ－ＣｏＶにおいて特徴的に見出されるヘマグルチニンエステラーゼ遺伝子を欠いている。したがって、２０１９－ｎＣｏＶをコードするｍＲＮＡのＳタンパク質とは異なる、または２０１９－ｎＣｏＶをコードするｍＲＮＡのＳタンパク質に加えての様々なウイルスタンパク質を、ｍＲＮＡに基づくワクチン接種標的として適用することができる。１つの実施形態において、ウイルスの表面タンパク質が好都合にはｍＲＮＡワクチンのための標的である。ＯＲＦ１ａの領域におけるウイルスポリメラーゼに関わるウイルス機能的タンパク質（配列番号５）およびＯＲＦ１ｂの領域における複製に関わるウイルス機能的タンパク質（ＲｄＲｐ）（配列番号６）もまた、ワクチン組成物を調製するために使用される場合がある。
【0028】
他のウイルスタンパク質もまた、ｍＲＮＡワクチンの標的である場合がある。例えば、コロナウイルスの膜（Ｍ）タンパク質は、ビリオン組立てにおいて役割を果たす重要なものである。その機能の１つが、スパイクのウイルスエンベロープへの組み込みを媒介することである。ヌクレオカプシドＮタンパク質は、典型的には高度に保存されている非常に免疫原性のリンタンパク質である。コロナウイルスのＮタンパク質はしばしば、診断アッセイにおけるマーカーとして使用される。コロナウイルス（ＣｏＶ）のエンベロープ（Ｅ）タンパク質は、ウイルスの形態形成および病理発生を含めて多数の役割を感染期間中に果たしている。他の実施形態において、１つまたは複数のウイルス由来のＭタンパク質、Ｎタンパク質およびＥタンパク質のすべてまたは一部についてそれらの特異的抗原としてコードするｍＲＮＡが、抗原性ワクチン組成物における成分として使用するために選択される場合がある（配列番号７、配列番号８、配列番号９）。
【0029】
様々な改変が、ワクチン組成物を調製するためにｍＲＮＡ配列においてなされる場合がある。例えば、５’キャップ構造がｍＲＮＡ配列に付加される場合がある。１つの実施形態において、５’ＣｌｅａｎＣａｐが付加される。この構造では、開始用のキャップ化三量体が、天然に存在する５’キャップ構造を生じさせるために使用される。好都合には、ポリＡテールが、ｍＲＮＡ安定性を増大させるために配列に付加される。ＡＵまたはＧＵに富む配列が３’ＵＴＲにおいて選択される場合があり、一方で、ランダム配列が、宿主遺伝子配列に対する類似性を低下させるために５’ＵＴＰにおいて利用される場合がある。ｍＲＮＡ配列のコドン最適化もまた、翻訳効率を改善するために使用される場合がある。具体的には、存在量がより少ないｔＲＮＡ種に対応し、したがって、より少ないタンパク質発現をもたらすコドンが、より高レベルのタンパク質発現をもたらす、存在量がより多いｔＲＮＡに対応するコドンにより置き換えられる。（Ｂｒｏｗｎ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ、２００８、５９：９４～１０２；Ｍａｅｒｔｅｎｓ他、２０１０、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ、９：１３１２～１３２６；Ｐｌｏｔｋｉｎ他、２０１１、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ、１２：３２～４２；Ｋｕｄｌａ他、２００９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２４：２５５～２５８）
【0030】
ｍＲＮＡワクチン発現効率の改善
哺乳動物細胞におけるｍＲＮＡ発現効率を改善するために、ｍＲＮＡ安定性が部分的な化学的修飾によって高められる場合がある。翻訳効率をさらに増大させるために、異常なＲＮＡポリメラーゼ活性に由来する短いＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡが、例えば、ＦＰＬＣ、ＨＰＬＣ、またはセルロースをマトリックスとして使用するクロマトグラフィーによって除かれる。ｍＲＮＡワクチンの効能を改善するために、配列最適化が、修飾ヌクレオシド（例えば、プソイドウリジン（φ）、５－メチルシチジン（５ｍＣ）など）の使用、Ｃａｐ－１構造、および翻訳効率が結果として改善される最適化コドンと一緒に使用される場合がある。［修飾ヌクレオシドの使用に関して情報が何かさらにありますか。またはそれは常識ですか。コドン最適化が現段階では常識であると思います。］ ｍＲＮＡのインビトロ転写の期間中には、未成熟ｍＲＮＡが、自然免疫活性化を刺激することにより翻訳を阻害する共存物として生じることがある（Ｋａｒｉｋｏ他、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、２００８、１６（１１）：１８３３～４０；Ａｎｄｒｉｅｓ他、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ、２０１５（１１月１０日）、２１７：３３７～４４）。ＦＰＬＣ精製およびＨＰＬＣ精製が、これらの共存物を除くために使用される場合がある。
哺乳動物細胞におけるｍＲＮＡ発現効率を改善するために、ｍＲＮＡ安定性が部分的な化学的修飾によって高められる場合がある。翻訳効率をさらに増大させるために、異常なＲＮＡポリメラーゼ活性に由来する短いＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡが、例えば、ＦＰＬＣ、ＨＰＬＣ、またはセルロースをマトリックスとして使用するクロマトグラフィーによって除かれる。ｍＲＮＡワクチンの効能を改善するために、配列最適化が、修飾ヌクレオシド（例えば、プソイドウリジン（φ）、５－メチルシチジン（５ｍＣ）など）の使用、Ｃａｐ－１構造、および翻訳効率が結果として改善される最適化コドンと一緒に使用される場合がある。［修飾ヌクレオシドの使用に関して情報が何かさらにありますか。またはそれは常識ですか。コドン最適化が現段階では常識であると思います。］ ｍＲＮＡのインビトロ転写の期間中には、未成熟ｍＲＮＡが、自然免疫活性化を刺激することにより翻訳を阻害する共存物として生じることがある（Ｋａｒｉｋｏ他、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、２００８、１６（１１）：１８３３～４０；Ａｎｄｒｉｅｓ他、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ、２０１５（１１月１０日）、２１７：３３７～４４）。ＦＰＬＣ精製およびＨＰＬＣ精製が、これらの共存物を除くために使用される場合がある。
【0031】
本明細書中に記載される組成物において、ｍＲＮＡのインビトロ転写のための鋳型は、５つのシス作用する構造エレメント、すなわち、５’から３’に、（ｉ）最適化されたキャップ構造、（ｉｉ）最適化された５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、（ｉｉｉ）コドン最適化されたコード配列、（ｉｖ）最適化された３’ＵＴＲ、および（ｖ）反復したアデニンヌクレオチドの区間（ポリＡテール）を含有する（図１８）。（Ｍｕｒｒａｙ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２００７、２７、２７９１～２７９９；Ｌｏｕｉｓ他、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．、２０１１、２１、４４４～４５１；Ｆｅｒｉｚｉ他、Ｌａｂ Ｃｈｉｐ、２０１５、１５、３５６１～３５７１；Ｖｏｎ Ｎｉｅｓｓｅｎ他、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２０１９、２７、８２４～８３６）これらのシス作用する構造エレメントは、半減期および発現レベルを含めたより良好なｍＲＮＡ特徴のための努力においてさらに最適化される。本明細書中に提供される場合、５’－ＵＴＲは開始部を含み、しかしポリペプチドをコードしない（すなわち、５’－ＵＴＲは非コードである）。いくつかの実施形態において、本開示の５’－ＵＴＲは、７－メチルグアノシン（７ｍＧ）配列を有するキャップ構造を含む。３’－ＵＴＲは終止コドン（終結シグナルを表すｍＲＮＡ転写物のコドン）のすぐ下流側（３’）にあり、ポリペプチドをコードしない（非コードである）。ポリＡテールは、３’－ＵＴＲの下流にあり、かつ多数の連続したアデノシン一リン酸を含有するｍＲＮＡの特別な領域である；ポリＡテールが効率的なｍＲＮＡ産生のために要求される。ｍＲＮＡインビトロ転写鋳型が、ｍＲＮＡ産生の効率のためだけでなく、その後のタンパク質産生またはペプチド産生のためにもまた使用される。
【0032】
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡが、ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６）および種々のヌクレオシドの混合物を使用することによって、バクテリオファージプロモーター、最適化ＵＴＲ、およびコドン最適化配列を含有する線状ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写（ＩＶＴ）によって産生される。他の実施形態において、線状ＤＮＡ鋳型を送達ベクターとしてのプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）にクローン化することができる。プラスミドベクターをｍＲＮＡワクチン産生のために適合化することができる。一般に使用されるプラスミドには、ｐＳＦＶ１、ｐｃＤＮＡ３およびｐＴＫ１２６が含まれ、これらはすべてが市販されている。１つの特異なｍＲＮＡ発現システムがｐＥＶＬである（Ｇｒｉｅｒ他、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ、１９；５：ｅ３０６（２０１６）を参照のこと）。
【0033】
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、すべてのウリジン残基がインビトロ転写の期間中にプソイドウリジン類によって置換される修飾ｍＲＮＡである。この修飾はｍＲＮＡを細胞において酵素分解に対して安定化し、これにより、ｍＲＮＡの高まった翻訳効率がもたらされる。使用されるプソイドウリジン類として、Ｎ１－メチル－プソイドウリジン、またはこの技術分野において広く知られている他の修飾体、例えば、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、イノシン、プソイドウリジン、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシチジン（ｈｍ５Ｃ）、およびＮ１－メチルアデノシン（ｍ１Ａ）などが可能である。修飾が場合により、ＯＲＦ、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを含めてｍＲＮＡ全体にわたって行われる。当業者は、他の修飾ＲＮＡ残基が、タンパク質の３次元構造を安定化し、タンパク質翻訳を増大させるために使用され得ることを認識しているであろう。
【0034】
効率のレベルを調べるために、実施例３、実施例４および実施例５に記載される実験を行った。
【0035】
ｍＲＮＡワクチン送達システムとしてのヒスチジン－リシン（ＨＫ）ポリペプチド
核酸を標的細胞内に移送するための効果的な手段は、基礎研究環境において、また、臨床適用において両方で重要なツールである。特定のキャリアの有効性が、トランスフェクションされようとする核酸の特徴に依存するので、多様な数々の核酸キャリアが現在要求される［Ｂｌａｋｎｅｙ他、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２０１８、１９：２８７０～２８７９；Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ他、Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ、２０１６、１３：３１５３～３１６３；Ｋａｕｆｆｍａｎ他、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２０１８、１９：３８６１～３８７３；Ｐｅｎｇ他、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２０１９、２０：３６１３～３６２６；Ｓｃｈｏｌｚ他、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ、２０１２、１６１：５５４～５６５］。様々なキャリアの中でも、非ウイルス性送達システムが開発されており、多くの局面においてウイルス性送達システムよりも好都合であると報告されている［Ｂｒｉｔｏ他、Ａｄｖ Ｇｅｎｅｔ、２０１５；８９：１７９～２３３］。例えば、高分子量の分岐型ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、２５ｋＤａ）が、ｍＲＮＡではなく、プラスミドＤＮＡのための優れたキャリアである。しかしながら、ＰＥＩの分子量を２ｋＤａに低下させることによって、ＰＥＩは、ｍＲＮＡのより効果的なキャリアになる［Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、２００１；２９：３８８２～３８９１］。
核酸を標的細胞内に移送するための効果的な手段は、基礎研究環境において、また、臨床適用において両方で重要なツールである。特定のキャリアの有効性が、トランスフェクションされようとする核酸の特徴に依存するので、多様な数々の核酸キャリアが現在要求される［Ｂｌａｋｎｅｙ他、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２０１８、１９：２８７０～２８７９；Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ他、Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ、２０１６、１３：３１５３～３１６３；Ｋａｕｆｆｍａｎ他、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２０１８、１９：３８６１～３８７３；Ｐｅｎｇ他、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２０１９、２０：３６１３～３６２６；Ｓｃｈｏｌｚ他、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ、２０１２、１６１：５５４～５６５］。様々なキャリアの中でも、非ウイルス性送達システムが開発されており、多くの局面においてウイルス性送達システムよりも好都合であると報告されている［Ｂｒｉｔｏ他、Ａｄｖ Ｇｅｎｅｔ、２０１５；８９：１７９～２３３］。例えば、高分子量の分岐型ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、２５ｋＤａ）が、ｍＲＮＡではなく、プラスミドＤＮＡのための優れたキャリアである。しかしながら、ＰＥＩの分子量を２ｋＤａに低下させることによって、ＰＥＩは、ｍＲＮＡのより効果的なキャリアになる［Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、２００１；２９：３８８２～３８９１］。
【0036】
４つに分岐したヒスチジン－リシン（ＨＫ）ペプチドポリマーＨ２Ｋ４ｂは、高分子量ＤＮＡプラスミドの良好なキャリアであることが示されており［Ｌｅｎｇ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、２００５；３３：ｅ４０］、しかし比較的低分子量のｓｉＲＮＡの不良なキャリアであることが示されている［Ｌｅｎｇ他、Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ、２００５；７：９７７～９８６］。Ｈ２Ｋ４ｂの２つの富ヒスチジンペプチド類似体、すなわち、Ｈ３Ｋ４ｂおよびＨ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂが、ｓｉＲＮＡの効果的なキャリアであることが示され［Ｌｅｎｇ他、Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ、２００５、７：９７７～９８６；Ｃｈｏｕ他、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２０１４、３５：８４６～８５５］、だが、Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂの方がやや効果的であるようであった［Ｌｅｎｇ他、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、２０１２、２０：２２８２～２２９０］。そのうえ、ｓｉＲＮＡのＨ３Ｋ４ｂキャリアはサイトカインをインビトロおよびインビボにおいて、Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂ ｓｉＲＮＡポリプレックスよりも有意に大きい程度に誘導した［Ｌｅｎｇ他、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、２０１２、２０：２２８２～２２９０］。好適なＨＫポリペプチドが、国際公開ＷＯ／２００１／０４７４９６、同ＷＯ／２００３／０９０７１９および同ＷＯ／２００６／０６０１８２に記載される（それらのそれぞれの内容がそれらの全体において本明細書中に組み込まれる）。これらのポリペプチドは、リシン側鎖のε－アミノ基と、Ｎ末端とが様々なＨＫ配列に結合するリシン骨格（３つのリシン残基）を有する。様々なＨＫポリペプチドキャリアを、例えば、固相合成を含めて、この技術分野において広く知られている方法によって合成することができる。
【0037】
そのようなヒスチジン－リシンペプチドポリマー（「ＨＫポリマー」）はｍＲＮＡキャリアとして驚くほど効果的であること、また、それらは単独であっても、またはリポソームとの組み合わせであっても、標的細胞内へのｍＲＮＡの効果的な送達をもたらすために使用できることが見出された。ＰＥＩおよび他のキャリアと同様に、初期の結果からは、ＨＫポリマーは、核酸を輸送し、放出するその能力が異なることが示唆された。しかしながら、様々なＨＫポリマーをペプチド合成機で再現性よく作製することができるので、それらのアミノ酸配列を容易に変化させることができ、それにより、ｍＲＮＡの結合および放出、同様にまた、ＨＫポリマーおよびｍＲＮＡを含有するポリプレックスの安定性の精密な制御が可能である［Ｃｈｏｕ他、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２０１４、３５：８４６～８５５；Ｍｉｄｏｕｘ他、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ、１９９９、１０：４０６～４１１；Ｈｅｎｉｇ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９９９、１２１：５１２３～５１２６］。ｍＲＮＡ分子が１つまたは複数のＨＫＰキャリアと混合されたとき、これらの成分は自己集合してナノ粒子になる。
【0038】
本明細書中に記載されるように、好都合なことにＨＫポリマーは、リシンが３つのアミノ酸コアに連結される４つの短いペプチド分枝を含む。これらのペプチド分枝は、異なる構成でヒスチジンおよびリシンであるアミノ酸からなる。これらのヒスチジン－リシンペプチドポリマー（ＨＫポリマー）の一般構造が式Ｉに示され、式中、Ｒはペプチド分枝を表し、Ｋはアミノ酸のＬ－リシンである。
【0039】
【化1】
【0040】
式Ｉにおいて、ＫはＬ－リシンであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれが独立してヒスチジン－リシンペプチドである。Ｒ１～４分枝は本発明のＨＫポリマーにおいて同じであってもよく、または異なっていてもよい。Ｒ分枝が「異なっている」とき、その分枝のアミノ酸配列は、ポリマーにおけるそれ以外のＲ分岐のそれぞれと異なる。式Ｉに示される本発明のＨＫポリマーにおいて使用される好適なＲ分枝には、下記のＲ分枝（ＲＡ～Ｒ－Ｊ）が含まれるが、それらに限定されない：
【0041】
ＲＡ ＝ ＫＨＫＨＨＫＨＨＫＨＨＫＨＨＫＨＨＫＨＫ-（配列番号：７９）
ＲＢ ＝ ＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫ-（配列番号：８０）
ＲＣ ＝ ＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＫ-（配列番号：８１）
ＲＤ ＝ ｋＨＨＨｋＨＨＨｋＨＨＨＨｋＨＨＨｋ-（配列番号：８２）
ＲＥ ＝ ＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＫ-（配列番号：８３）
ＲＦ ＝ ＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＫ-（配列番号：８４）
ＲＧ ＝ ＫＨＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＨＫ-（配列番号：８５）
ＲＨ ＝ ＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫ-（配列番号：８６）
ＲＩ ＝ ＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫ-（配列番号：８７）
ＲＪ ＝ ＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫ-（配列番号：８８）
ＲＢ ＝ ＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫ-（配列番号：８０）
ＲＣ ＝ ＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＫ-（配列番号：８１）
ＲＤ ＝ ｋＨＨＨｋＨＨＨｋＨＨＨＨｋＨＨＨｋ-（配列番号：８２）
ＲＥ ＝ ＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＫ-（配列番号：８３）
ＲＦ ＝ ＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＫ-（配列番号：８４）
ＲＧ ＝ ＫＨＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＨＫ-（配列番号：８５）
ＲＨ ＝ ＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫ-（配列番号：８６）
ＲＩ ＝ ＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫ-（配列番号：８７）
ＲＪ ＝ ＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫ-（配列番号：８８）
【0042】
ｍＲＮＡ組成物において使用され得る具体的なＨＫポリマーには、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれが同じであり、ＲＡ～ＲＪから選択されるＨＫポリマー（表１）が含まれるが、それらに限定されない。これらのＨＫポリマーは、Ｈ２Ｋ４ｂ、Ｈ３Ｋ４ｂ、Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂ、Ｈ３ｋ（＋Ｈ）４ｂ、Ｈ－Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂ、ＨＨ－Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂ、Ｈ４Ｋ４ｂ、Ｈ３Ｋ（１＋Ｈ）４ｂ、Ｈ３Ｋ（３＋Ｈ）４ｂ、およびＨ３Ｋ（１，３＋Ｈ）４ｂとそれぞれ称される。これら１０例のそれぞれにおいて、大文字「Ｋ」はＬ－リシンを表し、小文字「ｋ」はＤ－リシンを表す。追加のヒスチジン残基には、Ｈ３Ｋ４ｂとの比較で、分枝配列内において下線が引かれる。ＨＫポリマーの命名法は下記の通りである：
１）Ｈ３Ｋ４ｂについて、分枝における主要な反復配列が－ＨＨＨＫ－であり、したがって、「Ｈ３Ｋ」は名称の一部であり、一方、「４ｂ」は分枝の数を示す；
２）４つの－ＨＨＨＫ－モチーフがＨ３Ｋ４ｂおよび類似体のそれぞれの分枝に存在しており、第１の－ＨＨＨＫ－モチーフ（「１」）がリシンコアに最も近い；
３）Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂは、１つの追加ヒスチジンがＨ３Ｋ４ｂの第２の－ＨＨＨＫ－モチーフ（モチーフ２）に挿入されるＨ３Ｋ４ｂの類似体である；
４）Ｈ３Ｋ（１＋Ｈ）４ｂペプチドおよびＨ３Ｋ（３＋Ｈ）４ｂペプチドについて、追加のヒスチジンが第１のモチーフ（モチーフ１）および第３のモチーフ（モチーフ３）にそれぞれ存在する；５）Ｈ３Ｋ（１，３＋Ｈ）４ｂについて、２つの追加ヒスチジンが分枝の第１のモチーフおよび第３のモチーフの両方に存在する。
１）Ｈ３Ｋ４ｂについて、分枝における主要な反復配列が－ＨＨＨＫ－であり、したがって、「Ｈ３Ｋ」は名称の一部であり、一方、「４ｂ」は分枝の数を示す；
２）４つの－ＨＨＨＫ－モチーフがＨ３Ｋ４ｂおよび類似体のそれぞれの分枝に存在しており、第１の－ＨＨＨＫ－モチーフ（「１」）がリシンコアに最も近い；
３）Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂは、１つの追加ヒスチジンがＨ３Ｋ４ｂの第２の－ＨＨＨＫ－モチーフ（モチーフ２）に挿入されるＨ３Ｋ４ｂの類似体である；
４）Ｈ３Ｋ（１＋Ｈ）４ｂペプチドおよびＨ３Ｋ（３＋Ｈ）４ｂペプチドについて、追加のヒスチジンが第１のモチーフ（モチーフ１）および第３のモチーフ（モチーフ３）にそれぞれ存在する；５）Ｈ３Ｋ（１，３＋Ｈ）４ｂについて、２つの追加ヒスチジンが分枝の第１のモチーフおよび第３のモチーフの両方に存在する。
【0043】
【表1】
【0044】
ゲル遅延アッセイ、ヘパリン置換アッセイおよびフローサイトメトリーを含めてこの技術分野において広く知られている様々な方法を、リポソームに加えてＨＫポリマーを含有する異なる配合物の性能をｍＲＮＡの成功した送達において評価するために実施することができる。好適な方法が、例えば、Ｇｕｊｒａｔｉ他、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、１１：２７３４～２７４４（２０１４）；Ｐａｒｎａｓｔｅ他、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ、７：１～１０（２０１７）に記載される。
【0045】
細胞内へのｍＲＮＡ取り込みの検出もまた、ＳｍａｒｔＦｌａｒｅ（登録商標）技術（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を使用して達成することができる。これらのスマートフレアは、スマートフレアがＲＮＡ配列を細胞において認識すると、蛍光顕微鏡により分析することができる蛍光における増大をもたらす配列が結合しているビーズである。
【0046】
他の方法には、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を測定することが含まれ、例えば、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを、この技術分野において広く知られている方法を使用してトランスフェクションの効率を測定するために使用することができる。例えば、参照のこと。これらが、ＨＫＰおよびリポソームの配合物を使用してｍＲＮＡ送達効力を明らかにするために、最新の刊行物（Ｈｅ他、Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ、２０２１（Ｆｅｂ）、２３（２）：ｅ３２９５）では、ルシフェラーゼｍＲＮＡを用いて行われた。
【0047】
ｍＲＮＡ送達におけるＤＯＴＡＰおよびＨＫキャリアの相乗的活性
Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂとＤＯＴＡＰ（カチオン性脂質）との組み合わせは驚くべきことに、ｍＲＮＡをＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞内に輸送するその能力において相乗的であった（Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂ／リポソーム対リポソーム、Ｐ＜０．０００１）。この組み合わせはｍＲＮＡのキャリアとして、ポリマー単独およびカチオン性脂質キャリアよりも約３倍および８倍それぞれ効果的であった。すべてのＨＫペプチドがＤＯＴＡＰ脂質との相乗的活性を明らかにしたわけではなかった。例えば、Ｈ３Ｋ４ｂとＤＯＴＡＰとの組み合わせはルシフェラーゼｍＲＮＡのキャリアとして、ＤＯＴＡＰリポソームよりも効果的でなかった。ＤＯＴＡＰのほかに、ＨＫペプチドとともに使用され得る他のカチオン性脂質には、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、リポフェクタミン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＤＯＳＰＥＲが含まれる（図２２）。
Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂとＤＯＴＡＰ（カチオン性脂質）との組み合わせは驚くべきことに、ｍＲＮＡをＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞内に輸送するその能力において相乗的であった（Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂ／リポソーム対リポソーム、Ｐ＜０．０００１）。この組み合わせはｍＲＮＡのキャリアとして、ポリマー単独およびカチオン性脂質キャリアよりも約３倍および８倍それぞれ効果的であった。すべてのＨＫペプチドがＤＯＴＡＰ脂質との相乗的活性を明らかにしたわけではなかった。例えば、Ｈ３Ｋ４ｂとＤＯＴＡＰとの組み合わせはルシフェラーゼｍＲＮＡのキャリアとして、ＤＯＴＡＰリポソームよりも効果的でなかった。ＤＯＴＡＰのほかに、ＨＫペプチドとともに使用され得る他のカチオン性脂質には、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、リポフェクタミン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＤＯＳＰＥＲが含まれる（図２２）。
【0048】
分枝におけるＬ－リシンがＤ－リシンにより置き換えられるＨ３ｋ（＋Ｈ）４ｂのＤ－異性体が、最も効果的なポリマーキャリアであった（Ｈ３ｋ（＋Ｈ）４ｂ対Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂ、Ｐ＜０．０５）。ｍＲＮＡのＤ－異性体／リポソームキャリアは、Ｈ３ｋ（＋Ｈ）４ｂ単独およびリポソームキャリアよりもほぼ４倍および１０倍それぞれ効果的であった。Ｄ－Ｈ３ｋ（＋Ｈ）４ｂ／脂質の組み合わせはＬ－Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂ／脂質の組み合わせよりもやや効果的であったにもかかわらず、この比較は統計学的には差がなかった（図２３）。
【0049】
ＨＫポリマーのうちのｍＲＮＡ用キャリアとしてのＨ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂ
Ｈ３Ｋ４ｂおよびＨ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂの両方がインビトロにおいて核酸のキャリアとして使用される場合がある［Ｌｅｎｇ他、Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ、２００５、７：９７７～９８６；Ｃｈｏｕ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、２０１１、１８：７０７～７１６］。これらの以前の知見にもかかわらず、Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂは、他の同様な類似体と比較して、ｍＲＮＡのキャリアとして著しくより良好であった（表２）。
Ｈ３Ｋ４ｂおよびＨ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂの両方がインビトロにおいて核酸のキャリアとして使用される場合がある［Ｌｅｎｇ他、Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ、２００５、７：９７７～９８６；Ｃｈｏｕ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、２０１１、１８：７０７～７１６］。これらの以前の知見にもかかわらず、Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂは、他の同様な類似体と比較して、ｍＲＮＡのキャリアとして著しくより良好であった（表２）。
【表2】
【0050】
とりわけ、Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂは、様々な質量：質量（ＨＫ：ｍＲＮＡ）比においてＨ３Ｋ４ｂよりも高いｍＲＮＡトランスフェクション効率を有する。４：１の比率では、ルシフェラーゼ発現がＨ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂに関して、有意な細胞傷害性を伴うことなく、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞においてＨ３Ｋ４ｂよりも１０倍高かった。そのうえ、Ｈ３Ｋ４ｂおよびＨ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂにおけるヒスチジンの割合（質量基準）がそれぞれ６８．９％および７０．６％であるので、緩衝能は、それらのトランスフェクション差における本質的要因ではないようである。
【0051】
ゲル遅延アッセイにより、ｍＲＮＡの電気泳動移動度がＨＫポリマーによって遅れたことが示される。遅延効果が、ペプチド対ｍＲＮＡ質量比が大きくなるとともに増大した。しかしながら、ｍＲＮＡは、２：１の比率のＨ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂでは完全に遅れ、これに対してＨ３Ｋ４ｂによって完全には遅れなかった。このことから、Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂは、ｍＲＮＡ送達のための好適なキャリアとなり得るために好都合であるより安定なポリプレックスを形成することができるであろうことが示唆された。
【0052】
Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂペプチドがｍＲＮＡに対してより強固に結合するというさらなる確認が、ヘパリン置換アッセイにより明らかにされた。様々な濃度のヘパリンを、ｍＲＮＡおよびＨＫにより形成されるポリプレックスに加えた。より低濃度のヘパリンでは特に、ｍＲＮＡが、Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂポリマーよりも容易にＨ３Ｋ４ｂポリマーによって放出されたことが認められた。これらのデータから、Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂはｍＲＮＡに結合し、かつ、Ｈ３Ｋ４ｂよりも安定なポリプレックスを形成することができたことが示唆される。
【0053】
シアニン－５により標識されるｍＲＮＡに関して、Ｈ３Ｋ４ｂポリプレックスおよびＨ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂポリプレックスのＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞内への取り込みを、フローサイトメトリーを使用して比較した。異なる時点（１時間、２時間および４時間）で、Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂポリプレックスが、Ｈ３Ｋ４ｂポリプレックスよりも効率的に細胞内に移入された（データは示されず）。これらの結果と同様に、蛍光顕微鏡法は、Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂポリプレックスがＨ３Ｋ４ｂポリプレックスよりも有意に多く酸性エンドソーム小胞内に局在化することを示した（Ｈ３Ｋ４ｂ対Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂ、Ｐ＜０．００１）。興味深いことに、不規則な形状をしたＨ３Ｋ４ｂポリプレックスは、エンドサイトーシス小胞と重ならなかったので、おそらくは細胞外にあり、また、Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂポリプレックスに関しては認められなかった。
【0054】
ＨＫポリマーおよびカチオン性脂質（すなわち、ＤＯＴＡＰ）はともに、プラスミドによるトランスフェクションを有意に、かつ独立して増大させることが知られている［Ｃｈｅｎ他、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、２０００、７：１６９８～１７０５］。したがって、これらの脂質がＨＫポリマーと一緒になった場合にｍＲＮＡトランスフェクションを増強するかどうかを調べた。注目すべきことに、Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂキャリアおよびＨ３ｋ（＋Ｈ）４ｂキャリアは、ＤＯＴＡＰリポソームよりもｍＲＮＡの有意に良好なキャリアあった。Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂとＤＯＴＡＰ脂質との組み合わせは、ｍＲＮＡをＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞内に輸送する能力において相乗的であった。この組み合わせはｍＲＮＡのキャリアとして、ポリマー単独およびリポソームキャリアよりも約３倍および８倍それぞれ効果的であった（Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂ／脂質対リポソームまたはＨ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂ）。注目すべきことに、すべてのＨＫペプチドがＤＯＴＡＰ脂質との改善された活性を明らかにしたわけではなかった。Ｈ３Ｋ４ｂとＤＯＴＡＰキャリアとの組み合わせはルシフェラーゼｍＲＮＡのキャリアとして、ＤＯＴＡＰリポソームよりも効果的でなかった。ＤＯＴＡＰおよびＨ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂキャリアの組み合わせは、ｍＲＮＡを細胞内に輸送するそれらの能力において相乗的であることが見出された［Ｈｅ他、Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ、２０２０（１１月１０日）：ｅ３２９５］。
【0055】
ｍＲＮＡワクチンの投与
本明細書中に記載されるワクチン配合物は、ワクチンを投与するために従来的に使用される投与様式によってどのような投与様式であれ、ヒト対象を含めた対象に投与される場合がある。したがって、組成物は、エアロゾル、分散物、溶液または懸濁物の形態が可能であり、吸入投与、筋肉内投与、経口投与、舌下投与、口腔投与、非経口投与、経鼻投与、皮下投与、皮内投与または局所投与のために配合することができる。用語の非経口には、本明細書中で使用される場合、経皮、皮下、血管内（例えば、静脈内）、筋肉内またはクモ膜下腔内の注射技術または注入技術などが含まれる。
本明細書中に記載されるワクチン配合物は、ワクチンを投与するために従来的に使用される投与様式によってどのような投与様式であれ、ヒト対象を含めた対象に投与される場合がある。したがって、組成物は、エアロゾル、分散物、溶液または懸濁物の形態が可能であり、吸入投与、筋肉内投与、経口投与、舌下投与、口腔投与、非経口投与、経鼻投与、皮下投与、皮内投与または局所投与のために配合することができる。用語の非経口には、本明細書中で使用される場合、経皮、皮下、血管内（例えば、静脈内）、筋肉内またはクモ膜下腔内の注射技術または注入技術などが含まれる。
【0056】
本明細書中で使用される場合、ワクチンの効果的な用量は、ワクチンが投与される対象において防御免疫応答をもたらすために要求される用量である。本文脈における防御免疫応答は、２０１９－ｎＣｏＶによる抗原暴露を受ける対象において疾患を防止する、または改善するものである。ワクチンが防御免疫応答をもたらすかどうかを判定するために臨床試験を多数の対象において実施する様々な方法が、この技術分野では広く知られている。
【0057】
ワクチンは１回または複数回投与される場合がある。ワクチンに対する免疫応答の最初の測定が、ワクチンを受ける対象において抗体の産生を測定することによって行われる場合がある。抗体産生をこの様式で測定する方法もまた、この技術分野では広く知られている。疾患状態を防止するために、疾患状態の発生を阻害するために、または疾患状態を処置する（疾患状態の１つの症状をある程度緩和する、好ましくは疾患状態の症状のすべてを緩和する）ために要求されるその用量である。医薬的に効果的な用量は、疾患のタイプ、使用される組成物、投与経路、処置中の哺乳動物のタイプ、検討中の具体的哺乳動物の身体的特徴、同時薬物療法、および医学分野の当業者が認識するであろう他の要因に依存する。一般に、０．１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の間での有効成分の量が、配合された組成物の効能に依存して投与される。
【0058】
しかしながら、それらの適用は最近に至るまで、ｍＲＮＡの不安定性および非効率的なインビボ送達によって制限されてきた。本明細書中に記載される方法は、ｍＲＮＡワクチンを作製し、ポリペプチド送達システムおよびポリペプチドナノ粒子送達システムとともに使用する方法を提供する。
【0059】
本明細書中に記載される方法は、様々な疾患に対する、とりわけ感染性疾患に対する予防的ワクチンおよび治療的ワクチンを含めたｍＲＮＡの臨床適用において使用される場合がある。
【実施例】
【0060】
実施例１：ｍＲＮＡ合成：
ＣｌｅａｎＣａｐ ＳＡＲＳ－ＣＯＶ ２スパイクタンパク質（Ｓ１ＰおよびＳ２Ｐ）と、ＣｌｅａｎＣａｐ強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）とが発現されるｍＲＮＡを合成した。ＣｌｅａｎＣａｐ ＳＡＲＳ－ＣＯＶ ２スパイクタンパク質（Ｓ６Ｐ）が、ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって製造され、エタノール含有緩衝液におけるセルロースに対するｄｓＲＮＡの選択的結合によって精製された。１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、１６％エタノールおよびセルロース繊維を含有するクロマトグラフィー緩衝液をｍＲＮＡ生成物と共に微量遠心機スピンカラムに加え、遠心分離した。ほぼ９０％のｄｓＲＮＡをこの手順の後で除去することができた（Ｂａｉｅｒｓｄｏｒｆｅｒ他、２０１９）。共存物もまた、ＦＰＬＣおよびＨＰＬＣを使用して取り除くことができた（Ｋａｒｉｋｏ他、２０１１）。
ＣｌｅａｎＣａｐ ＳＡＲＳ－ＣＯＶ ２スパイクタンパク質（Ｓ１ＰおよびＳ２Ｐ）と、ＣｌｅａｎＣａｐ強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）とが発現されるｍＲＮＡを合成した。ＣｌｅａｎＣａｐ ＳＡＲＳ－ＣＯＶ ２スパイクタンパク質（Ｓ６Ｐ）が、ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって製造され、エタノール含有緩衝液におけるセルロースに対するｄｓＲＮＡの選択的結合によって精製された。１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、１６％エタノールおよびセルロース繊維を含有するクロマトグラフィー緩衝液をｍＲＮＡ生成物と共に微量遠心機スピンカラムに加え、遠心分離した。ほぼ９０％のｄｓＲＮＡをこの手順の後で除去することができた（Ｂａｉｅｒｓｄｏｒｆｅｒ他、２０１９）。共存物もまた、ＦＰＬＣおよびＨＰＬＣを使用して取り除くことができた（Ｋａｒｉｋｏ他、２０１１）。
【0061】
実施例２：ペプチド（ＨＫポリマー）の調製
ＨＫペプチドポリマーが、メリーランド大学のバイオポリマーコア設備によって、Ｒａｉｎｉｎ Ｖｏｙａｇｅｒ合成機（Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）で合成された。
ＨＫペプチドポリマーが、メリーランド大学のバイオポリマーコア設備によって、Ｒａｉｎｉｎ Ｖｏｙａｇｅｒ合成機（Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）で合成された。
【0062】
実施例３：ｍＲＮＡのインビトロトランスフェクション
ｍＲＮＡ、ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ、およびＳＡＲＳ－ＣＯＶ ２ ＳＰの適切なタンパク質発現を検証するために、ｍＲＮＡをヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ細胞）に一過性にトランスフェクションした。簡単に記載すると、４．８×１０５個の細胞を、２ｍｌのＤＭＥＭ（１０％のウシ胎児血清および１％のペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を含有する６ウェルプレートに置床した。２４時間後、細胞が７０％～９０％のコンフルエンスになったとき、ｍＲＮＡを、リポフェクタミンＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を提供されたプロトコルに従って使用して２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。２９３Ｔ細胞をインビトロタンパク質発現測定のために２日間にわたって培養した。
ｍＲＮＡ、ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ、およびＳＡＲＳ－ＣＯＶ ２ ＳＰの適切なタンパク質発現を検証するために、ｍＲＮＡをヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ細胞）に一過性にトランスフェクションした。簡単に記載すると、４．８×１０５個の細胞を、２ｍｌのＤＭＥＭ（１０％のウシ胎児血清および１％のペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を含有する６ウェルプレートに置床した。２４時間後、細胞が７０％～９０％のコンフルエンスになったとき、ｍＲＮＡを、リポフェクタミンＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を提供されたプロトコルに従って使用して２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。２９３Ｔ細胞をインビトロタンパク質発現測定のために２日間にわたって培養した。
【0063】
カチオン性リポソームＤＯＴＡＰ（１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン、Ｒｏｃｈｅ）、ＭＣ３（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＣｈｅｍＳｃｅｎｅ）、およびＰＬＡ（ポリ乳酸）と会合する２つのＨＫ型ポリマーを、ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ、およびＳＡＲＳ－ＣＯＶ ２ ＳＰ ｍＲＮＡをヒト胚性腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３細胞）内に輸送するそれらの能力について調べた。簡単に記載すると、４．８×１０５個の細胞を、２ｍｌのＤＭＥＭ（１０％のウシ胎児血清およびペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を含有する６ウェルプレートに置床した。２４時間後、細胞が７０％～９０％のコンフルエンスになったとき、ＥＧＦＰおよびＳＰｓ ｍＲＮＡを伴う２つのＨＫ型ポリマー配合物をそれぞれのウェルに加えた。２９３Ｔ細胞をインビトロタンパク質発現測定のために２日間にわたって培養した。
【0064】
実施例４：インビトロタンパク質発現測定
免疫蛍光分析：トランスフェクションの２日後、タンパク質発現を、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５細胞イメージング・マルチモードリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を使用する免疫蛍光イメージングによって測定した。
免疫蛍光分析：トランスフェクションの２日後、タンパク質発現を、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５細胞イメージング・マルチモードリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を使用する免疫蛍光イメージングによって測定した。
【0065】
細胞溶解物調製：トランスフェクションの２日後、培養培地を吸引し、細胞を氷冷ＰＢＳにより氷上で洗浄した。プロテアーゼ阻害剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む氷冷溶解緩衝液（ＲＩＰＡ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え、細胞を４℃で３０分間インキュベーションした。細胞を、細胞スクレーパーを使用して集め、超音波処理によって溶解した。１０，０００ｇでの遠心分離を４℃で２０分間行って、細胞破片をペレット化し、上清を新しい微量遠心機チューブに移した。溶解物のタンパク質濃度をウエスタンブロットのためにＢｒａｄｆｏｒｄアッセイまたはＢＣＡタンパク質アッセイによって求めた。
【0066】
ウエスタンブロット：簡単に記載すると、ゲルのそれぞれのウェルにおいて、２０ｕｇ～５０ｕｇのタンパク質を、４×ＳＤＳサンプル緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０×還元性緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、および追加のｄｄＨ２Ｏ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と一緒にし、総負荷体積を２５μｌ／ウェルとした。混合物を９５℃での５分間の加熱によって変性させ、室温に冷却し、遠心分離し、その後、ＮｕＰＡＧＥ（商標）４～１２％，Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に負荷した。電気泳動分離後、ゲルをカセットから取り出し、ｉＢｌｏｔ（商標）２乾式ブロッティングシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して転写した。転写メンブランをＴＢＳＴにおける５％無脂肪粉乳によりＲＴで１時間にわたってブロッキング処理し、一次抗体と４℃で一晩インキュベーションし、ＴＢＳＴ緩衝液（ＴＢＳにおける０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）により３回洗浄し、ＨＲＰコンジュゲート化マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ２４５１２）である二次抗体とＲＴで１時間インキュベーションした。転写メンブランを、Ｐｉｅｒｃｅ ＥＣＬウエスタンブロッティング基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって発色させ、化学発光イメージングシステムを使用して画像化した。
【0067】
実施例５：インビボ配合物調製
１．ＰＮＩ－Ｇｅｎｖｏｙ ＬＮＰ配合物：脂質ナノ粒子をインビトロアッセイおよびインビボアッセイの両方における陽性コントロールとして、ＰＮＩ ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ、カナダ）を伴うＧｅｎＶｏｙプラットフォームを使用して配合した。
１．ＰＮＩ－Ｇｅｎｖｏｙ ＬＮＰ配合物：脂質ナノ粒子をインビトロアッセイおよびインビボアッセイの両方における陽性コントロールとして、ＰＮＩ ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ、カナダ）を伴うＧｅｎＶｏｙプラットフォームを使用して配合した。
【0068】
２．ＨＫＰ（＋Ｈ）配合物：ＨＫＰ（＋Ｈ）ストック溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）をヌクレアーゼ非含有水において調製した。高濃度ストック溶液を水で４ｍｇ／ｍＬに希釈した。ｍＲＮＡ作業溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を１ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）において調製した。ｍＲＮＡ／ＨＫＰ（＋Ｈ）ポリプレックスを、等体積の４ｍｇ／ｍＬのＨＫＰ（＋Ｈ）および１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡを混合することによって形成させた。ＨＫＰ（＋Ｈ）対ｍＲＮＡの質量比が４：１である。ｍＲＮＡ／ＨＫＰ（＋Ｈ）ポリプレックスを使用前に室温で３０分間インキュベーションした。それぞれのペプチド型ポリプレックスのサイズを、トランスフェクションまたは注射の前にＺｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を用いて求めた。
【0069】
３．ＨＫＰ（＋Ｈ）／ＤＯＴＡＰ配合物（後混合されたＤＯＴＡＰ）：ＨＫＰ（＋Ｈ）ストック溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）をヌクレアーゼ非含有水において調製した。高濃度ストック溶液を水で４ｍｇ／ｍＬに希釈した。ＤＯＴＡＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）は水性緩衝化溶液において１ｍｇ／ｍＬである。ｍＲＮＡ作業溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を１ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）において調製した。最初に、ｍＲＮＡ／ＨＫＰ（＋Ｈ）ポリプレックスを、等体積の４ｍｇ／ｍＬのＨＫＰ（＋Ｈ）および１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡを混合することによって形成させた。ｍＲＮＡ／ＨＫＰ（＋Ｈ）ポリプレックスを室温で３０分間インキュベーションした。次に、同じ体積のＤＯＴＡＰ対ＨＫＰ（＋Ｈ）溶液をｍＲＮＡ／ＨＫＰ（＋Ｈ）ポリプレックスに加えた。ＨＫＰ（＋Ｈ）／ＤＯＴＡＰ対ｍＲＮＡの質量比が４：１：１であった。ｍＲＮＡ／ＨＫＰ（＋Ｈ）／ＤＯＴＡＰナノ粒子を使用前に室温で３０分間インキュベーションした。
【0070】
４．ＨＫＰ（＋Ｈ）／ＭＣ３配合物またはＨＫＰ（＋Ｈ）／ＤＯＴＡＰ配合物（事前混合されたＭＣ３またはＤＯＴＡＰ）：ＨＫＰ（＋Ｈ）ストック溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）をヌクレアーゼ非含有水において調製した。高濃度ストック溶液を水で４ｍｇ／ｍＬに希釈した。ＤＯＴＡＰまたはＭＣ３は水性緩衝化溶液において１ｍｇ／ｍＬである。ｍＲＮＡ作業溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を１ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）において調製した。等体積のＨＫＰ（＋Ｈ）およびＭＣ３を４：１の質量比で事前混合し、同じ体積のｍＲＮＡ対ＨＫＰ（＋Ｈ）溶液を事前混合ＨＫＰ（＋Ｈ）／ＭＣ３に加えた。ｍＲＮＡ／ＨＫＰ（＋Ｈ）／ＭＣ３ナノ粒子を、事前混合された４ｍｇ／ｍＬのＨＫＰ（＋Ｈ）／１ｍｇ／ｍＬのＭＣ３と、１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡとを混合することによって形成させた。ＨＫＰ（＋Ｈ）／ＭＣ３対ｍＲＮＡの質量比が４：１：１である。ｍＲＮＡ／ＨＫＰ（＋Ｈ）／ＭＣ３ナノ粒子を使用前に室温で３０分間インキュベーションした。
【0071】
５．ＨＫＰ（＋Ｈ）／ＰＬＡ ＮＰ配合物：ＨＫＰ（＋Ｈ）ストック溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）をヌクレアーゼ非含有水において調製した。高濃度ストック溶液を水で４ｍｇ／ｍＬに希釈した。ポリ－Ｌ－乳酸（ＰＬＡ）ナノ粒子（５ｍｇ／ｍＬ）を水において調製した。ｍＲＮＡ作業溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を１ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）において調製した。等体積のＨＫＰ（＋Ｈ）およびｍＲＮＡを４：１の質量比で混合した。ｍＲＮＡ／ＨＫＰ（＋Ｈ）ポリプレックスを室温で３０分間インキュベーションし、その後、ＨＫＰ（＋Ｈ）溶液に対する同じ体積のＰＬＡナノ粒子をｍＲＮＡ／ＨＫＰ（＋Ｈ）ナノ粒子に加え、その結果、ｍＲＮＡ／ＨＫＰ（＋Ｈ）ポリプレックスをＰＬＡナノ粒子の表面に吸着させた。ＨＫＰ（＋Ｈ）／ＰＬＡ対ｍＲＮＡの質量比が４：５：１であった。ｍＲＮＡ／ＨＫＰ（＋Ｈ）／ＰＬＡナノ粒子を使用前に室温で３０分間インキュベーションした。
【0072】
実施例６：インビボ動物モデルおよび注射
インビボ研究が、Ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔｓ（ＡＩＣ）Ｉｎｃ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で実施された。簡単に記載すると、８匹の６週齢～８週齢のメスＢＡＬＢ／Ｃをそれぞれの群に、それぞれの群あたり４匹のマウスで無作為化し、３０μｇのＥＧＦＰを異なる配合物とともに右側腹部内に筋肉内注射した。上述される同じ配合物を用いて、ＣｌｅａｎＣａｐ ＳＡＲＳ－ＣＯＶ ２スパイクタンパク質（Ｓ６Ｐ）ポリプレックスをインビボ分析ならびに抗体価測定および抗体結合のために調製した。
インビボ研究が、Ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔｓ（ＡＩＣ）Ｉｎｃ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で実施された。簡単に記載すると、８匹の６週齢～８週齢のメスＢＡＬＢ／Ｃをそれぞれの群に、それぞれの群あたり４匹のマウスで無作為化し、３０μｇのＥＧＦＰを異なる配合物とともに右側腹部内に筋肉内注射した。上述される同じ配合物を用いて、ＣｌｅａｎＣａｐ ＳＡＲＳ－ＣＯＶ ２スパイクタンパク質（Ｓ６Ｐ）ポリプレックスをインビボ分析ならびに抗体価測定および抗体結合のために調製した。
【0073】
２８日目に追加免疫化のための２回目の注射を行い、３５日目に、血清を抗体価の測定のために採取し、イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって分析した。
【0074】
結果
免疫蛍光分析
作製から１週間後、製剤をＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に送達した（図２）。すべてのＨＫＰ（Ｈ）群は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｍＲＮＡを細胞内に運ぶ可能性を証明した。ＨＫＰ（Ｈ）グループのうち，ＨＫＰ（Ｈ）単独グループは，他のグループ及びＰＮＩ Ｇｅｎｖｏｙ（陽性対照）よりも高いＥＧＦＰ発現を示した。
免疫蛍光分析
作製から１週間後、製剤をＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に送達した（図２）。すべてのＨＫＰ（Ｈ）群は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｍＲＮＡを細胞内に運ぶ可能性を証明した。ＨＫＰ（Ｈ）グループのうち，ＨＫＰ（Ｈ）単独グループは，他のグループ及びＰＮＩ Ｇｅｎｖｏｙ（陽性対照）よりも高いＥＧＦＰ発現を示した。
【0075】
ウェスタンブロット解析
Ｓ１Ｐ Ｄ６１４Ｇ ｍＲＮＡ 導入群では、細胞表面に発現したスパイクタンパク質は、細胞膜に局在した後、脱落することがわかった（図３）。細胞表面にはスパイクタンパク質のＳ２ドメインのみが残存していた。ウェスタンブロットのバンドサイズ（７０－８０ＫＤａ）はこの仮説を支持した。しかし、Ｓ２Ｐ Ｄ６１４Ｇのスパイクタンパク質は、完全な１８０ＫＤａのバンドサイズを示した。
Ｓ１Ｐ Ｄ６１４Ｇ ｍＲＮＡ 導入群では、細胞表面に発現したスパイクタンパク質は、細胞膜に局在した後、脱落することがわかった（図３）。細胞表面にはスパイクタンパク質のＳ２ドメインのみが残存していた。ウェスタンブロットのバンドサイズ（７０－８０ＫＤａ）はこの仮説を支持した。しかし、Ｓ２Ｐ Ｄ６１４Ｇのスパイクタンパク質は、完全な１８０ＫＤａのバンドサイズを示した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図4-4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図10-3】
【図10-4】
【図11】
【図12-1】
【図12-2】
【図13】
【図14-1】
【図14-2】
【配列表】
【国際調査報告】