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▶ ラボラトリー コーポレイション オブ アメリカ ホールディングスの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-30
(54)【発明の名称】脆弱Ｘ症候群ＡＧＧ中断の遺伝子型決定
(51)【国際特許分類】
G16B 20/20 20190101AFI20230323BHJP
C12Q 1/686 20180101ALN20230323BHJP
【ＦＩ】
G16B20/20
C12Q1/686 Z ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022546022
(86)(22)【出願日】2021-01-29
(85)【翻訳文提出日】2022-09-26
(86)【国際出願番号】 US2021015663
(87)【国際公開番号】W WO2021155114
(87)【国際公開日】2021-08-05
(31)【優先権主張番号】62/967,792
(32)【優先日】2020-01-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】511172461
【氏名又は名称】ラボラトリー コーポレイション オブ アメリカ ホールディングス
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ジャン， ジェンシー
(72)【発明者】
【氏名】ロビンソン， マット
(72)【発明者】
【氏名】オカモト， パトリシア
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA12
4B063QA17
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR55
4B063QR62
4B063QR72
4B063QR77
4B063QS25
(57)【要約】
本開示は、脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）臨床試験に関し、特に、臨床試験への実施のためのＦＸＳ ＡＧＧ中断ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイおよびＡＧＧ中断遺伝子型決定アルゴリズムに関する。特に、態様は、試料に対して行われたＦＸＳアッセイから生データを取得し、生データを反復的に探索し、予想ＡＧＧピークサイズに基づいて決定された探索空間の第１のセットを使用して第１の対立遺伝子上の１またはそれを超えるＡＧＧピークを同定し、１またはそれを超えるＡＧＧピークに基づいて、最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数および第１の対立遺伝子上の最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数を決定し、最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数および最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数に基づいて、第１の対立遺伝子のＡＧＧ遺伝子型を生成することに関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
遺伝子分析装置を使用して試料に対して行われた脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）アッセイから生データを得ることであって、前記生データが、キャピラリー電気泳動によって分離された遺伝子特異的（ＧＳ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）データおよびＡＧＧ中断ＰＣＲデータを含むことと、前記生データにおいて同定された第１の対立遺伝子についての予想ＡＧＧピークサイズを決定することと、
前記生データを反復的に探索し、前記予想ＡＧＧピークサイズに基づいて決定された探索空間の第１のセットを使用して、前記第１の対立遺伝子上の１またはそれを超えるＡＧＧピークを同定することと、
前記ＧＳ ＰＣＲデータおよび前記第１の対立遺伝子上で同定された前記１またはそれを超えるＡＧＧピークに基づいて、前記第１の対立遺伝子上の最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数を決定することと、
前記ＧＳ ＰＣＲデータおよび前記第１の対立遺伝子上で同定された前記１またはそれを超えるＡＧＧピークに基づいて、前記第１の対立遺伝子上の最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数を決定することと、
前記最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数および前記最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数に基づいて、前記第１の対立遺伝子についてのＡＧＧ遺伝子型を生成することと、
前記第１の対立遺伝子について前記ＡＧＧ遺伝子型を提供することと
を含む、方法。
【請求項2】
前記ＧＳ ＰＣＲデータおよび前記第１の対立遺伝子上で同定された前記１またはそれを超えるＡＧＧピークに基づいて、前記第１の対立遺伝子上の任意の２つの隣接するＡＧＧ中断によって分離されたＣＧＧリピートの数を決定することをさらに含み、前記第１の対立遺伝子の前記ＡＧＧ遺伝子型が、前記最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数、任意の２つの隣接するＡＧＧ中断によって分離されたＣＧＧリピートの数、および前記最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数に基づいて生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記生データを反復的に探索し、前記予想ＡＧＧピークサイズに基づいて決定された探索空間の第２のセットを使用して、第２の対立遺伝子上の１またはそれを超えるＡＧＧピークを同定することと、前記ＧＳ ＰＣＲデータおよび前記第２の対立遺伝子上で同定された前記１またはそれを超えるＡＧＧピークに基づいて、前記第２の対立遺伝子上の最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数を決定することと、
前記ＧＳ ＰＣＲデータおよび前記第２の対立遺伝子上で同定された前記１またはそれを超えるＡＧＧピークに基づいて、前記第２の対立遺伝子上の最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数を決定することと、
前記最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数および前記最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数に基づいて、前記第２の対立遺伝子についてのＡＧＧ遺伝子型を生成することと、
前記第２の対立遺伝子についての前記ＡＧＧ遺伝子型を提供することと、をさらに含み、
（ｉ）前記第１の対立遺伝子が正常な対立遺伝子であり、前記第２の対立遺伝子が前変異対立遺伝子である、（ｉｉ）前記第１の対立遺伝子が正常な対立遺伝子であり、前記第２の対立遺伝子が異なる正常な対立遺伝子である、または（ｉｉｉ）前記第１の対立遺伝子が前変異対立遺伝子であり、前記第２の対立遺伝子が異なる前変異対立遺伝子である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記試料に関連する対象についてのリスクスコアを、前記第１の対立遺伝子、前記第２の対立遺伝子、または前記第１の対立遺伝子と前記第２の対立遺伝子の両方について生成された前記ＡＧＧ遺伝子型に基づいて決定することをさらに含み、前記リスクスコアが、前記対象が遅発性神経変性疾患、脆弱Ｘ関連振戦／運動失調症候群（ＦＸＴＡＳ）もしくは脆弱Ｘ関連原発性卵巣機能不全（ＦＸＰＯＩ）を発症するリスク、または完全変異対立遺伝子を対象の子孫に伝達するリスクもしくはそれらの任意の組み合わせを同定する、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項5】
前記生データを反復的に探索し、前記第１の対立遺伝子上の１またはそれを超えるＡＧＧピークを同定することが、前記予想ＡＧＧピークサイズに基づいて、前記第１の対立遺伝子についての前記探索空間の第１のセットの第１の探索空間を決定することと、
前記生データを探索し、第１の探索空間を使用して前記第１の対立遺伝子上の初期ＡＧＧピークを同定することと、
前記第１の対立遺伝子上の前記初期ＡＧＧピークのピークサイズに基づいて、前記第１の対立遺伝子についての第２の探索空間を決定することと、
前記生データを反復的に探索し、前記第２の探索空間を用いて前記第１の対立遺伝子上の１またはそれを超える追加のＡＧＧピークを同定することと、を含み、
前記最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数および前記最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数が、前記ＧＳ ＰＣＲデータ、前記第１の対立遺伝子で同定された前記初期ピーク、および前記第１の対立遺伝子で同定された前記１またはそれを超える追加のピークに基づいて、前記第１の対立遺伝子について決定される、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項6】
前記生データを反復的に探索し、前記第２の対立遺伝子上の１またはそれを超えるＡＧＧピークを同定することが、前記予想ＡＧＧピークサイズに基づいて、前記第２の対立遺伝子についての前記探索空間の第２のセットの第１の探索空間を決定することと、
前記生データを探索し、第２の探索空間を使用して前記第２の対立遺伝子上の初期ＡＧＧピークを同定することと、
前記第２の対立遺伝子上の前記初期ＡＧＧピークのピークサイズに基づいて、前記第２の対立遺伝子についての第２の探索空間を決定することと、
前記生データを反復的に探索し、前記第２の探索空間を使用して前記第２の対立遺伝子上の１またはそれを超える追加のＡＧＧピークを同定することと、を含み、
前記最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数および前記最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数が、前記ＧＳ ＰＣＲデータ、前記第２の対立遺伝子で同定された前記初期ピーク、および前記第２の対立遺伝子で同定された前記１またはそれを超える追加のピークに基づいて、前記第２の対立遺伝子について決定される、請求項３または５に記載の方法。
【請求項7】
前記第１の対立遺伝子上の前記１またはそれを超えるＡＧＧピークが同定されると、前記生データを反復的に探索し、前記第２の対立遺伝子上の前記１またはそれを超えるＡＧＧピークを同定する前に、前記第１の対立遺伝子上の前記１またはそれを超えるＡＧＧピークが前記生データから除去される、請求項３または５に記載の方法。
【請求項8】
１またはそれを超えるデータプロセッサと、前記１またはそれを超えるデータプロセッサ上で実行されると、前記１またはそれを超えるデータプロセッサに、
遺伝子分析装置を使用して試料に対して行われた脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）アッセイから生データを得ることであって、前記生データが、キャピラリー電気泳動によって分離された遺伝子特異的（ＧＳ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）データおよびＡＧＧ中断ＰＣＲデータを含むことと、
前記生データにおいて同定された第１の対立遺伝子についての予想ＡＧＧピークサイズを決定することと、
前記生データを反復的に探索し、前記予想ＡＧＧピークサイズに基づいて決定された探索空間の第１のセットを使用して、前記第１の対立遺伝子上の１またはそれを超えるＡＧＧピークを同定することと、
前記ＧＳ ＰＣＲデータおよび前記第１の対立遺伝子上で同定された前記１またはそれを超えるＡＧＧピークに基づいて、前記第１の対立遺伝子上の最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数を決定することと、
前記ＧＳ ＰＣＲデータおよび前記第１の対立遺伝子上で同定された前記１またはそれを超えるＡＧＧピークに基づいて、前記第１の対立遺伝子上の最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数を決定することと、
前記最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数および前記最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数に基づいて、前記第１の対立遺伝子についてのＡＧＧ遺伝子型を生成することと、
前記第１の対立遺伝子について前記ＡＧＧ遺伝子型を提供することと、
を含むアクションを実行させる命令を含む非一時的コンピュータ可読記憶媒体と、を含むシステム。
【請求項9】
前記アクションが、前記ＧＳ ＰＣＲデータおよび前記第１の対立遺伝子上で同定された前記１またはそれを超えるＡＧＧピークに基づいて、前記第１の対立遺伝子上の任意の２つの隣接するＡＧＧ中断によって分離されたＣＧＧリピートの数を決定することをさらに含み、前記第１の対立遺伝子の前記ＡＧＧ遺伝子型が、前記最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数、任意の２つの隣接するＡＧＧ中断によって分離されたＣＧＧリピートの数、および前記最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数に基づいて生成される、請求項８に記載のシステム。
【請求項10】
前記アクションは、前記生データを反復的に探索し、前記予想ＡＧＧピークサイズに基づいて決定された探索空間の第２のセットを使用して、第２の対立遺伝子上の１またはそれを超えるＡＧＧピークを同定することと、前記ＧＳ ＰＣＲデータおよび前記第２の対立遺伝子上で同定された前記１またはそれを超えるＡＧＧピークに基づいて、前記第２の対立遺伝子上の最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数を決定することと、
前記ＧＳ ＰＣＲデータおよび前記第２の対立遺伝子上で同定された前記１またはそれを超えるＡＧＧピークに基づいて、前記第２の対立遺伝子上の最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数を決定することと、
前記最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数および前記最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数に基づいて、前記第２の対立遺伝子についてのＡＧＧ遺伝子型を生成することと、
前記第２の対立遺伝子についての前記ＡＧＧ遺伝子型を提供することと、をさらに含み、
（ｉ）前記第１の対立遺伝子が正常な対立遺伝子であり、前記第２の対立遺伝子が前変異対立遺伝子である、（ｉｉ）前記第１の対立遺伝子が正常な対立遺伝子であり、前記第２の対立遺伝子が異なる正常な対立遺伝子である、または（ｉｉｉ）前記第１の対立遺伝子が前変異対立遺伝子であり、前記第２の対立遺伝子が異なる前変異対立遺伝子である、請求項８または９に記載のシステム。
【請求項11】
前記アクションが、前記試料に関連する対象についてのリスクスコアを、前記第１の対立遺伝子、前記第２の対立遺伝子、または前記第１の対立遺伝子と前記第２の対立遺伝子の両方について生成された前記ＡＧＧ遺伝子型に基づいて決定することをさらに含み、前記リスクスコアが、前記対象が遅発性神経変性疾患、脆弱Ｘ関連振戦／運動失調症候群（ＦＸＴＡＳ）もしくは脆弱Ｘ関連原発性卵巣機能不全（ＦＸＰＯＩ）を発症するリスク、または完全変異対立遺伝子を対象の子孫に伝達するリスクもしくはそれらの任意の組み合わせを同定する、請求項８、９または１０に記載のシステム。
【請求項12】
前記生データを反復的に探索し、前記第１の対立遺伝子上の１またはそれを超えるＡＧＧピークを同定することが、前記予想ＡＧＧピークサイズに基づいて、前記第１の対立遺伝子についての前記探索空間の第１のセットの第１の探索空間を決定することと、
前記生データを探索し、第１の探索空間を使用して前記第１の対立遺伝子上の初期ＡＧＧピークを同定することと、
前記第１の対立遺伝子上の前記初期ＡＧＧピークのピークサイズに基づいて、前記第１の対立遺伝子についての第２の探索空間を決定することと、
前記生データを反復的に探索し、前記第２の探索空間を用いて前記第１の対立遺伝子上の１またはそれを超える追加のＡＧＧピークを同定することと、を含み、
前記最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数および前記最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数が、前記ＧＳ ＰＣＲデータ、前記第１の対立遺伝子で同定された前記初期ピーク、および前記第１の対立遺伝子で同定された前記１またはそれを超える追加のピークに基づいて、前記第１の対立遺伝子について決定される、請求項８、９または１０に記載のシステム。
【請求項13】
前記生データを反復的に探索し、前記第２の対立遺伝子上の１またはそれを超えるＡＧＧピークを同定することが、前記予想ＡＧＧピークサイズに基づいて、前記第２の対立遺伝子についての前記探索空間の第２のセットの第１の探索空間を決定することと、
前記生データを探索し、第２の探索空間を使用して前記第２の対立遺伝子上の初期ＡＧＧピークを同定することと、
前記第２の対立遺伝子上の前記初期ＡＧＧピークのピークサイズに基づいて、前記第２の対立遺伝子についての第２の探索空間を決定することと、
前記生データを反復的に探索し、前記第２の探索空間を使用して前記第２の対立遺伝子上の１またはそれを超える追加のＡＧＧピークを同定することと、を含み、
前記最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数および前記最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数が、前記ＧＳ ＰＣＲデータ、前記第２の対立遺伝子で同定された前記初期ピーク、および前記第２の対立遺伝子で同定された前記１またはそれを超える追加のピークに基づいて、前記第２の対立遺伝子について決定される、請求項１０または１２に記載のシステム。
【請求項14】
前記第１の対立遺伝子上の前記１またはそれを超えるＡＧＧピークが同定されると、前記生データを反復的に探索し、前記第２の対立遺伝子上の前記１またはそれを超えるＡＧＧピークを同定する前に、前記第１の対立遺伝子上の前記１またはそれを超えるＡＧＧピークが前記生データから除去される、請求項１０または１２に記載のシステム。
【請求項15】
非一時的機械可読記憶媒体に有形に具現化されたコンピュータプログラム製品であって、１またはそれを超えるデータプロセッサに、遺伝子分析装置を使用して試料に対して行われた脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）アッセイから生データを得ることであって、前記生データが、キャピラリー電気泳動によって分離された遺伝子特異的（ＧＳ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）データおよびＡＧＧ中断ＰＣＲデータを含むことと、
前記生データにおいて同定された第１の対立遺伝子についての予想ＡＧＧピークサイズを決定することと、
前記生データを反復的に探索し、前記予想ＡＧＧピークサイズに基づいて決定された探索空間の第１のセットを使用して、前記第１の対立遺伝子上の１またはそれを超えるＡＧＧピークを同定することと、
前記ＧＳ ＰＣＲデータおよび前記第１の対立遺伝子上で同定された前記１またはそれを超えるＡＧＧピークに基づいて、前記第１の対立遺伝子上の最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数を決定することと、
前記ＧＳ ＰＣＲデータおよび前記第１の対立遺伝子上で同定された前記１またはそれを超えるＡＧＧピークに基づいて、前記第１の対立遺伝子上の最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数を決定することと、
前記最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数および前記最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数に基づいて、前記第１の対立遺伝子についてのＡＧＧ遺伝子型を生成することと、
前記第１の対立遺伝子について前記ＡＧＧ遺伝子型を提供することと、
を含むアクションを実行させるように構成された命令を含む、コンピュータプログラム製品。
【請求項16】
前記アクションが、前記ＧＳ ＰＣＲデータおよび前記第１の対立遺伝子上で同定された前記１またはそれを超えるＡＧＧピークに基づいて、前記第１の対立遺伝子上の任意の２つの隣接するＡＧＧ中断によって分離されたＣＧＧリピートの数を決定することをさらに含み、前記第１の対立遺伝子の前記ＡＧＧ遺伝子型が、前記最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数、任意の２つの隣接するＡＧＧ中断によって分離されたＣＧＧリピートの数、および前記最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数に基づいて生成される、請求項１５に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項17】
前記アクションは、前記生データを反復的に探索し、前記予想ＡＧＧピークサイズに基づいて決定された探索空間の第２のセットを使用して、第２の対立遺伝子上の１またはそれを超えるＡＧＧピークを同定することと、前記ＧＳ ＰＣＲデータおよび前記第２の対立遺伝子上で同定された前記１またはそれを超えるＡＧＧピークに基づいて、前記第２の対立遺伝子上の最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数を決定することと、
前記ＧＳ ＰＣＲデータおよび前記第２の対立遺伝子上で同定された前記１またはそれを超えるＡＧＧピークに基づいて、前記第２の対立遺伝子上の最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数を決定することと、
前記最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数および前記最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数に基づいて、前記第２の対立遺伝子についてのＡＧＧ遺伝子型を生成することと、
前記第２の対立遺伝子についての前記ＡＧＧ遺伝子型を提供することと、をさらに含み、
（ｉ）前記第１の対立遺伝子が正常な対立遺伝子であり、前記第２の対立遺伝子が前変異対立遺伝子である、（ｉｉ）前記第１の対立遺伝子が正常な対立遺伝子であり、前記第２の対立遺伝子が異なる正常な対立遺伝子である、または（ｉｉｉ）前記第１の対立遺伝子が前変異対立遺伝子であり、前記第２の対立遺伝子が異なる前変異対立遺伝子である、請求項１５または１６に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項18】
前記アクションが、前記試料に関連する対象についてのリスクスコアを、前記第１の対立遺伝子、前記第２の対立遺伝子、または前記第１の対立遺伝子と前記第２の対立遺伝子の両方について生成された前記ＡＧＧ遺伝子型に基づいて決定することをさらに含み、前記リスクスコアが、前記対象が遅発性神経変性疾患、脆弱Ｘ関連振戦／運動失調症候群（ＦＸＴＡＳ）もしくは脆弱Ｘ関連原発性卵巣機能不全（ＦＸＰＯＩ）を発症するリスク、または完全変異対立遺伝子を対象の子孫に伝達するリスクもしくはそれらの任意の組み合わせを同定する、請求項１５、１６、または１７に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項19】
前記生データを反復的に探索し、前記第１の対立遺伝子上の１またはそれを超えるＡＧＧピークを同定することが、前記予想ＡＧＧピークサイズに基づいて、前記第１の対立遺伝子についての前記探索空間の第１のセットの第１の探索空間を決定することと、
前記生データを探索し、第１の探索空間を使用して前記第１の対立遺伝子上の初期ＡＧＧピークを同定することと、
前記第１の対立遺伝子上の前記初期ＡＧＧピークのピークサイズに基づいて、前記第１の対立遺伝子についての第２の探索空間を決定することと、
前記生データを反復的に探索し、前記第２の探索空間を用いて前記第１の対立遺伝子上の１またはそれを超える追加のＡＧＧピークを同定することと、を含み、
前記最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数および前記最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数が、前記ＧＳ ＰＣＲデータ、前記第１の対立遺伝子で同定された前記初期ピーク、および前記第１の対立遺伝子で同定された前記１またはそれを超える追加のピークに基づいて、前記第１の対立遺伝子について決定される、請求項１５、１６または１７に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項20】
前記生データを反復的に探索し、前記第２の対立遺伝子上の１またはそれを超えるＡＧＧピークを同定することが、前記予想ＡＧＧピークサイズに基づいて、前記第２の対立遺伝子についての前記探索空間の第２のセットの第１の探索空間を決定することと、
前記生データを探索し、第２の探索空間を使用して前記第２の対立遺伝子上の初期ＡＧＧピークを同定することと、
前記第２の対立遺伝子上の前記初期ＡＧＧピークのピークサイズに基づいて、前記第２の対立遺伝子についての第２の探索空間を決定することと、
前記生データを反復的に探索し、前記第２の探索空間を使用して前記第２の対立遺伝子上の１またはそれを超える追加のＡＧＧピークを同定することと、を含み、
前記最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数および前記最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数が、前記ＧＳ ＰＣＲデータ、前記第２の対立遺伝子で同定された前記初期ピーク、および前記第２の対立遺伝子で同定された前記１またはそれを超える追加のピークに基づいて、前記第２の対立遺伝子について決定される、請求項１７または１９に記載のコンピュータプログラム製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
優先権主張
本出願は、２０２０年１月３０日に出願された米国仮出願第６２／９６７，７９２号に基づく利益および優先権を主張し、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年１月３０日に出願された米国仮出願第６２／９６７，７９２号に基づく利益および優先権を主張し、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
分野
本開示は、脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳまたはＦＲＡＸ）臨床試験、特に臨床試験への実装のためのＦＲＡＸ ＡＧＧ中断ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイおよびＡＧＧ中断の遺伝子型決定アルゴリズムに関する。
本開示は、脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳまたはＦＲＡＸ）臨床試験、特に臨床試験への実装のためのＦＲＡＸ ＡＧＧ中断ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイおよびＡＧＧ中断の遺伝子型決定アルゴリズムに関する。
【背景技術】
【0003】
背景
ＰＣＲおよび関連する増幅技術を分析用途に使用することができる。ＰＣＲの典型的な分析用途は、多型を有する遺伝子座を含む遺伝子型の状態または決定の診断を含む。医学的に関連する多型を示す遺伝子座の例は、Ｘ染色体上のヒトＦＭＲ１遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）である。正常個体は、典型的には、この遺伝子座に５～４４のＣＧＧリピートを有する。対照的に、大きなＣＧＧリピート伸長（２００超リピート、完全変異対立遺伝子）を含有するこの遺伝子座の対立遺伝子は、ＦＭＲ１遺伝子発現を破壊し、ＦＸＳを引き起こす。さらに、前変異（ＰＭ）対立遺伝子（５０～２００リピート）を有する個体は、遅発性神経変性疾患、脆弱Ｘ関連振戦／運動失調症候群（ＦＸＴＡＳ）または脆弱Ｘ関連原発性卵巣機能不全（ＦＸＰＯＩ）を発症するリスクがある。女性ＰＭ対立遺伝子キャリア（２０１分の１のｐａｎ－ｅｔｈｉｃ頻度）は、完全変異対立遺伝子を子孫に伝達するリスクがある。このリスクは、脆弱Ｘ ＰＣＲアッセイによって測定されるＣＧＧリピートのサイズ、およびＣＧＧリピート間のＡＧＧ中断の数に依存する（通常、９～１１のＣＧＧリピートごとに起こる）。
ＰＣＲおよび関連する増幅技術を分析用途に使用することができる。ＰＣＲの典型的な分析用途は、多型を有する遺伝子座を含む遺伝子型の状態または決定の診断を含む。医学的に関連する多型を示す遺伝子座の例は、Ｘ染色体上のヒトＦＭＲ１遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）である。正常個体は、典型的には、この遺伝子座に５～４４のＣＧＧリピートを有する。対照的に、大きなＣＧＧリピート伸長（２００超リピート、完全変異対立遺伝子）を含有するこの遺伝子座の対立遺伝子は、ＦＭＲ１遺伝子発現を破壊し、ＦＸＳを引き起こす。さらに、前変異（ＰＭ）対立遺伝子（５０～２００リピート）を有する個体は、遅発性神経変性疾患、脆弱Ｘ関連振戦／運動失調症候群（ＦＸＴＡＳ）または脆弱Ｘ関連原発性卵巣機能不全（ＦＸＰＯＩ）を発症するリスクがある。女性ＰＭ対立遺伝子キャリア（２０１分の１のｐａｎ－ｅｔｈｉｃ頻度）は、完全変異対立遺伝子を子孫に伝達するリスクがある。このリスクは、脆弱Ｘ ＰＣＲアッセイによって測定されるＣＧＧリピートのサイズ、およびＣＧＧリピート間のＡＧＧ中断の数に依存する（通常、９～１１のＣＧＧリピートごとに起こる）。
【0004】
５５～９０リピートのＰＭ対立遺伝子が、キャリアの女性によって伝達された場合、子孫における完全変異にまで拡大するリスクは、ＣＧＧリピート配列におけるＡＧＧ中断の数の増加と共に減少する。９０超のリピートを有するＰＭ対立遺伝子の場合、伸長リスクは、ＡＧＧ中断の数にかかわらず５０％超である。したがって、ＡＧＧ中断ＰＣＲアッセイは、５５～９０のＣＧＧリピートを有するＰＭ対立遺伝子についてのＡＧＧ中断の特徴付けにおいて最も大きな臨床的有用性を有し得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
要旨
様々な実施形態では、試料に対して行われた脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）アッセイから生データを得ることであって、生データが、キャピラリー電気泳動によって分離された遺伝子特異的（ＧＳ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）データおよびＡＧＧ中断ＰＣＲデータを含むことと、生データにおいて同定された第１の対立遺伝子についての予想ＡＧＧピークサイズを決定することと、生データを反復的に探索し、予想ＡＧＧピークサイズに基づいて決定された探索空間の第１のセットを使用して、第１の対立遺伝子上の１またはそれを超えるＡＧＧピークを同定することと、ＧＳ ＰＣＲデータおよび第１の対立遺伝子上で同定された１またはそれを超えるＡＧＧピークに基づいて、第１の対立遺伝子上の最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数を決定することと、ＧＳ ＰＣＲデータおよび第１の対立遺伝子上で同定された１またはそれを超えるＡＧＧピークに基づいて、第１の対立遺伝子上の最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数を決定することと、最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数および最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数に基づいて、第１の対立遺伝子についてのＡＧＧ遺伝子型を生成することと、第１の対立遺伝子についてＡＧＧ遺伝子型を提供することと、を含む、コンピュータ実装方法が提供される。
様々な実施形態では、試料に対して行われた脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）アッセイから生データを得ることであって、生データが、キャピラリー電気泳動によって分離された遺伝子特異的（ＧＳ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）データおよびＡＧＧ中断ＰＣＲデータを含むことと、生データにおいて同定された第１の対立遺伝子についての予想ＡＧＧピークサイズを決定することと、生データを反復的に探索し、予想ＡＧＧピークサイズに基づいて決定された探索空間の第１のセットを使用して、第１の対立遺伝子上の１またはそれを超えるＡＧＧピークを同定することと、ＧＳ ＰＣＲデータおよび第１の対立遺伝子上で同定された１またはそれを超えるＡＧＧピークに基づいて、第１の対立遺伝子上の最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数を決定することと、ＧＳ ＰＣＲデータおよび第１の対立遺伝子上で同定された１またはそれを超えるＡＧＧピークに基づいて、第１の対立遺伝子上の最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数を決定することと、最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数および最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数に基づいて、第１の対立遺伝子についてのＡＧＧ遺伝子型を生成することと、第１の対立遺伝子についてＡＧＧ遺伝子型を提供することと、を含む、コンピュータ実装方法が提供される。
【0006】
いくつかの実施形態では、本方法は、ＧＳ ＰＣＲデータおよび第１の対立遺伝子上で同定された１またはそれを超えるＡＧＧピークに基づいて、第１の対立遺伝子上の任意の２つの隣接するＡＧＧ中断によって分離されたＣＧＧリピートの数を決定することをさらに含み、第１の対立遺伝子のＡＧＧ遺伝子型が、最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数、任意の２つの隣接するＡＧＧ中断によって分離されたＣＧＧリピートの数、および最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数に基づいて生成される。
【0007】
いくつかの実施形態では、本方法は、生データを反復的に探索し、予想ＡＧＧピークサイズに基づいて決定された探索空間の第２のセットを使用して、第２の対立遺伝子上の１またはそれを超えるＡＧＧピークを同定することと、ＧＳ ＰＣＲデータおよび第２の対立遺伝子上で同定された１またはそれを超えるＡＧＧピークに基づいて、第２の対立遺伝子上の最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数を決定することと、ＧＳ ＰＣＲデータおよび第２の対立遺伝子上で同定された１またはそれを超えるＡＧＧピークに基づいて、第２の対立遺伝子上の最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数を決定することと、最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数および最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数に基づいて、第２の対立遺伝子についてのＡＧＧ遺伝子型を生成することと、第２の対立遺伝子についてのＡＧＧ遺伝子型を提供することと、をさらに含み、（ｉ）第１の対立遺伝子が正常な対立遺伝子であり、第２の対立遺伝子が前変異対立遺伝子である、（ｉｉ）第１の対立遺伝子が正常な対立遺伝子であり、第２の対立遺伝子が異なる正常な対立遺伝子である、または（ｉｉｉ）第１の対立遺伝子が前変異対立遺伝子であり、第２の対立遺伝子が異なる前変異対立遺伝子である。
【0008】
いくつかの実施形態では、本方法は、試料に関連する対象についてのリスクスコアを、第１の対立遺伝子、第２の対立遺伝子、または第１の対立遺伝子と第２の対立遺伝子の両方について生成されたＡＧＧ遺伝子型に基づいて決定することをさらに含み、リスクスコアが、対象が遅発性神経変性疾患、脆弱Ｘ関連振戦／運動失調症候群（ＦＸＴＡＳ）もしくは脆弱Ｘ関連原発性卵巣機能不全（ＦＸＰＯＩ）を発症するリスク、または完全変異対立遺伝子を対象の子孫に伝達するリスクもしくはそれらの任意の組み合わせを同定する。
【0009】
いくつかの実施形態では、生データを反復的に探索し、第１の対立遺伝子上の１またはそれを超えるＡＧＧピークを同定することが、予想ＡＧＧピークサイズに基づいて、第１の対立遺伝子についての探索空間の第１のセットの第１の探索空間を決定することと、生データを探索し、第１の探索空間を使用して第１の対立遺伝子上の初期ＡＧＧピークを同定することと、第１の対立遺伝子上の初期ＡＧＧピークのピークサイズに基づいて、第１の対立遺伝子についての第２の探索空間を決定することと、生データを反復的に探索し、第２の探索空間を用いて第１の対立遺伝子上の１またはそれを超える追加のＡＧＧピークを同定することと、を含み、最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数および最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数が、ＧＳ ＰＣＲデータ、第１の対立遺伝子で同定された初期ピーク、および第１の対立遺伝子で同定された１またはそれを超える追加のピークに基づいて、第１の対立遺伝子について決定される。
【0010】
いくつかの実施形態では、生データを反復的に探索し、第２の対立遺伝子上の１またはそれを超えるＡＧＧピークを同定することが、予想ＡＧＧピークサイズに基づいて、第２の対立遺伝子についての探索空間の第２のセットの第１の探索空間を決定することと、生データを探索し、第２の探索空間を使用して第２の対立遺伝子上の初期ＡＧＧピークを同定することと、第２の対立遺伝子上の初期ＡＧＧピークのピークサイズに基づいて、第２の対立遺伝子についての第２の探索空間を決定することと、生データを反復的に探索し、第２の探索空間を使用して第２の対立遺伝子上の１またはそれを超える追加のＡＧＧピークを同定することと、を含み、最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数および最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数が、ＧＳ ＰＣＲデータ、第２の対立遺伝子で同定された初期ピーク、および第２の対立遺伝子で同定された１またはそれを超える追加のピークに基づいて、第２の対立遺伝子について決定される。
【0011】
いくつかの実施形態では、第１の対立遺伝子上の１またはそれを超えるＡＧＧピークが同定されると、生データを反復的に探索し、第２の対立遺伝子上の１またはそれを超えるＡＧＧピークを同定する前に、第１の対立遺伝子上の１またはそれを超えるＡＧＧピークが生データから除去される。
【0012】
いくつかの実施形態では、１またはそれを超えるデータプロセッサと、１またはそれを超えるデータプロセッサ上で実行されると、１またはそれを超えるデータプロセッサに、本明細書に開示される１またはそれを超える方法またはプロセスの一部または全部を実行させる命令を含む非一時的コンピュータ可読記憶媒体と、を含むシステムが提供される。
【0013】
いくつかの実施形態では、非一時的機械可読記憶媒体に有形に具現化され、１またはそれを超えるデータプロセッサに、本明細書に開示された１またはそれを超える方法の一部または全部を実行させるように構成された命令を含むコンピュータプログラム製品が提供される。
【0014】
本開示のいくつかの実施形態は、１またはそれを超えるデータプロセッサを含むシステムを含む。いくつかの実施形態では、システムは、１またはそれを超えるデータプロセッサ上で実行されると、１またはそれを超えるデータプロセッサに、１またはそれを超える方法の一部または全部および／または本明細書に開示される１またはそれを超えるプロセスの一部または全部を実行させる命令を含む非一時的コンピュータ可読記憶媒体を含む。本開示のいくつかの実施形態は、１またはそれを超えるデータプロセッサに、本明細書に開示された１またはそれを超える方法の一部または全部および／または１またはそれを超えるプロセスの一部または全部を実行させるように構成された命令を含む、非一時的機械可読記憶媒体で有形に具現化されたコンピュータプログラム製品を含む。
【0015】
使用された用語および表現は、限定ではなく説明の用語として使用され、そのような用語および表現の使用において、示され説明された特徴またはその一部の均等物を除外する意図はないが、特許請求される発明の範囲内で様々な修正が可能であることが認識される。したがって、本発明は実施形態および任意選択の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示された概念の変形および変形は当業者によって使用されてもよく、そのような修正および変形は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内にあると見なされることを理解されたい。
【0016】
本発明は、以下の非限定的な図を考慮してよりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【0018】
【0019】
【0020】
【0021】
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【0023】
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【0025】
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【0027】
【0028】
【0029】
【0030】
【0031】
【0032】
【発明を実施するための形態】
【0033】
添付の図面において、類似の構成要素および／または特徴は、同じ参照標識を有することができる。さらに、同じ種類の様々な構成要素は、参照標識の後にダッシュおよび類似の構成要素を区別する第２の標識を続けることによって区別することができる。本明細書で第１の参照標識のみが使用される場合、説明は、第２の参照標識に関係なく、同じ第１の参照標識を有する同様の構成要素のいずれにも適用可能である。
【0034】
詳細な説明
以下の説明は、好ましい例示的な実施形態のみを提供し、本開示の範囲、適用性または構成を限定することを意図しない。むしろ、好ましい例示的な実施形態の以下の説明は、様々な実施形態を実施するための可能な説明を当業者に提供する。添付の特許請求の範囲に記載の趣旨および範囲から逸脱することなく、要素の機能および配置に様々な変更を加えることができることが理解される。
以下の説明は、好ましい例示的な実施形態のみを提供し、本開示の範囲、適用性または構成を限定することを意図しない。むしろ、好ましい例示的な実施形態の以下の説明は、様々な実施形態を実施するための可能な説明を当業者に提供する。添付の特許請求の範囲に記載の趣旨および範囲から逸脱することなく、要素の機能および配置に様々な変更を加えることができることが理解される。
【0035】
以下の説明では、実施形態の完全な理解を提供するために具体的な詳細が示されている。しかしながら、これらの具体的な詳細なしで実施形態を実施することができることが理解されよう。例えば、回路、システム、ネットワーク、プロセス、および他の構成要素は、実施形態を不必要に詳細に不明瞭にしないために、ブロック図形式の構成要素として示されてもよい。他の例では、実施形態を不明瞭にすることを避けるために、周知の回路、プロセス、アルゴリズム、構造、および技術を不必要な詳細なしで示すことができる。
【0036】
また、個々の実施形態は、フローチャート、フロー図、データフロー図、構造図、またはブロック図として示されるプロセスとして説明され得ることに留意されたい。フローチャートまたは図は、動作を順次プロセスとして説明することができるが、動作の多くは並列にまたは同時に実行されてもよい。さらに、動作の順序は並べ替えられてもよい。プロセスは、その動作が完了したときに終了するが、図に含まれていない追加の工程を有することができる。プロセスは、方法、機能、手順、サブルーチン、サブプログラムなどに対応することができる。プロセスが関数に対応する場合、その終了は、呼び出し関数またはメイン関数への関数の返しに対応することができる。
Ｉ．序論
Ｉ．序論
【0037】
従来のシステムは、大きなＣＧＧリピート伸長を含有する遺伝子座の対立遺伝子を同定するために、ＣＥによって分離されたＣＧＧリピートプライム（ＴＲＰ）－ＰＣＲを使用する。ＡＧＧ中断の存在下では、ＣＧＧリピートプライマーの標的配列に対する親和性が低下し、それによってＰＣＲ効率が低下し、ＣＥ電気泳動図に「ディップ」が生じる。ＴＲＰ－ＰＣＲ ＣＥデータに基づいて、各ＡＧＧの数および位置を間接的に計算することが可能であり得る。しかしながら、ＣＧＧリピート領域の開始から同様の距離に位置するＡＧＧ中断を段階的かつ正確に検出することは非常に困難である。これらの欠点を克服するために、いくつかの従来のシステムは、直接的なＡＧＧ検出のためにＧＧＡプライムＰＣＲを利用し、続いて手動遺伝子型決定分析を利用する。しかしながら、ＧＧＡプライムＰＣＲは、非常に高いバックグラウンドを生成する可能性があり、典型的には、より厳格な品質基準を満たさない。さらに、従来の手動遺伝子型決定分析は、パフォーマンスが悪く、誤りが非常に起こりやすい。
【0038】
これらの制限および問題に対処するために、本明細書に記載のＦＸＳ ＡＧＧ ＰＣＲアッセイは、ＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲのＣＧＧリピート領域を標的とし、すべての対立遺伝子上のＣＧＧリピート内のすべてのＡＧＧ中断を検出する。ＦＸＳ ＡＧＧ ＰＣＲアッセイは、ＣＧＧリピートと、ＣＧＧリピートのＡＧＧ中断に特異的に結合する３’末端に「Ａ」ヌクレオチドの両方を含むプライマー、ならびに検出のためのリバースプライマーを利用する（例えば、図１Ａを参照されたい）。キャピラリー電気泳動（ＣＥ）を使用して、電気泳動図上でＡＧＧ中断の位置に対応する個々のピークとしてこれらのアンプリコンを分離することができる（例えば、図１Ｂを参照されたい）。いくつかの例では、１またはそれを超えるエンドプライマー（例えば、フォワードおよび／またはリバースプライマー）を蛍光タグ（例えば、フルオレセインアミダイト（ＦＡＭ））で標識して、ＣＥによる分離を助けることができる。他の例では、蛍光標識は、ＰＣＲ伸長中に組み込まれる標識塩基を添加することによって提供され得る。他の例では、蛍光標識は使用されず、ＰＣＲ産物は、高分離能ＣＥによって分離され得る非タグ化プライマーによって生成される。ＡＧＧは、典型的には、同じ対立遺伝子上に位置するとき、リピート領域内で約３０ｂｐの周期性で生じるので、ＡＧＧのフェージングは、ＦＸＳ ＡＧＧ ＰＣＲおよび遺伝子特異的（ＧＳ）ＰＣＲアッセイの両方の結果を利用して可能である。ピーク同定技術を使用して、ＦＸＳ ＧＳおよびＡＧＧ ＰＣＲ ＣＥの生データのピークを同定することができる。生データは、分析された各ＰＣＲアンプリコンのサイズおよび存在量を、それぞれピークサイズ（塩基対）および高さ（例えば、相対蛍光単位（ＲＦＵ））として含み得る。データ分析を容易にするために、本明細書に記載のＦＸＳ ＡＧＧ遺伝子型決定技術は、ＦＸＳ ＧＳおよびＡＧＧ ＰＣＲ ＣＥの生データを処理し、各対立遺伝子のＡＧＧ遺伝子型を決定する。
【0039】
ＦＸＳ ＡＧＧ遺伝子型決定技術は、最初にサイジング標準およびピーク高さをチェックして、ＦＸＳ ＧＳおよびＡＧＧ ＰＣＲ ＣＥの生データ品質が、分析において許容され得ることを確実にする。次いで、ＦＸＳ ＡＧＧ遺伝子型決定技術は、ＦＸＳ ＧＳおよびＡＧＧ ＰＣＲ ＣＥ生データを使用して、各対立遺伝子（例えば、正常対立遺伝子およびＰＭ対立遺伝子）のＣＧＧリピート数を計算する。各対立遺伝子に対するＡＧＧ中断の数および位置を決定するために、本技術は、通常は正常な対立遺伝子に対応する、より少ないリピートの数を有する対立遺伝子上のＡＧＧピークを反復的に探索および同定することをさらに含む。ピーク出力表からこの対立遺伝子に割り当てられたすべてのＡＧＧピークを除去した後、本技術は、ＰＭ対立遺伝子についてのプロセスをリピートすることをさらに含む。このようにして、同じピークが両方の対立遺伝子に割り当てられることが防止され、そうでなければＰＭ対立遺伝子の伸長リスクを過小評価する可能性がある。ピークが同定され、対立遺伝子に割り当てられると、技術は、各対立遺伝子上のＡＧＧ遺伝子型を評価することをさらに含む。いくつかの実施形態では、各対立遺伝子上の最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数は、以下の式を使用して計算される。（Ｐ－１３２）÷３－１（Ｐ：各対立遺伝子上の最小ＡＧＧ中断のピークサイズ）。いくつかの実施形態では、任意の２つの隣接するＡＧＧ中断（存在する場合）によって分離されたＣＧＧリピートの数は、以下の式を使用して計算される。（Ｐｎ－Ｐｎ－１）÷３－１（Ｐｎ－Ｐｎ－１：隣接するＡＧＧ中断のピークサイズ）。いくつかの実施形態では、最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数は、ＧＳ－ＰＣＲアッセイによって決定される対立遺伝子の総ＣＧＧリピート数から、最終ＡＧＧの下流のＣＧＧリピートの数、隣接するＡＧＧ中断を分離するＣＧＧリピートの総数、およびＡＧＧ中断の総数を減算することによって決定される。
【0040】
本明細書で使用される場合、「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」、「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」、および「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、当業者によって理解されるように、大部分が特定されるものであるが、必ずしも完全には特定されないもの（および完全に特定されるものを含む）として定義される。任意の開示された実施形態では、「実質的に」、「およそ」、または「約」という用語は、指定されたものの「［パーセンテージ］以内」で置き換えることができ、パーセンテージは、０．１、１、５、および１０％を含む。本明細書で使用される場合、アクションが何かに「基づく」場合、これは、アクションが何かの少なくとも一部に少なくとも部分的に基づくことを意味する。
【0041】
本明細書に開示されるＦＸＳ ＡＧＧ遺伝子型決定技術は、本明細書に具体的に記載されるＦＸＳ ＧＳおよびＡＧＧ ＰＣＲ ＣＥ生データと比較して、他のタイプのＦＸＳ ＰＣＲ ＣＥ生データを評価するために適用できることが理解されよう。ＣＧＧリピートおよびＡＧＧ中断を同定するために、他のタイプのＦＸＳ ＰＣＲが企図されることも理解されよう。例えば、代替的または追加的に、ＣＧＧリピートおよび／またはＡＧＧ中断を同定するために、非アンカープライムＰＣＲを使用してもよい。
ＩＩ．ＦＸＳ ＡＧＧ ＰＣＲアッセイ技術
ＩＩ．ＦＸＳ ＡＧＧ ＰＣＲアッセイ技術
【0042】
本明細書に記載の１またはそれを超える実施形態は、プログラムモジュール、エンジン、または構成要素を使用して実施することができる。プログラムモジュール、エンジン、またはコンポーネントは、プログラム、サブルーチン、プログラムの一部、または１もしくはそれを超える記載されたタスクもしくは機能を実行することができるソフトウェアコンポーネントもしくはハードウェアコンポーネントを含むことができる。本明細書で使用される場合、モジュールまたはコンポーネントは、他のモジュールまたはコンポーネントとは独立してハードウェアコンポーネント上に存在することができる。あるいは、モジュールまたはコンポーネントは、他のモジュール、プログラムまたは機械の共有要素またはプロセスであり得る。図２は、ＰＭ対立遺伝子キャリア（例えば、５５～９０のＣＧＧリピート伸長を有する試料）の中断試験のためのＦＸＳ ＡＧＧ ＰＣＲアッセイプラットフォーム２００のブロック図を示し、様々な実施形態による分析装置システム２０５の様々なサブシステムを実装するために使用され得る１またはそれを超えるプロセッサによって実行可能なモジュール、エンジン、またはコンポーネント（例えば、プログラム、コード、または命令）を示す。分析装置システム２０５は、遺伝子分析装置（ＤＮＡシーケンサとしても知られる）であり、ＤＮＡをシーケンシングし、様々な用途のために断片を分析することができる自動化されたシステムである。いくつかの例では、遺伝子分析装置は、プローブに結合したＤＮＡ断片がポリマーを通って移動し、蛍光発光が測定されるキャピラリー電気泳動に基づくシステムである。複数のキャピラリーのアレイは、マルチウェルマイクロプレート形式での試料ローディングを可能にする。他の例では、遺伝子分析装置は、迅速な配列決定および分析のためのパイロシーケンシング技術ベースのシステムである。パイロシーケンシングは、「合成によるシーケンシング」原理に基づくＤＮＡシーケンシングの方法であり、シーケンシングは、ＤＮＡポリメラーゼによって組み込まれたヌクレオチドを検出することによって行われる。パイロシーケンシングは、ピロリン酸塩が放出されたときの連鎖反応に基づく光検出に依存する。モジュール、エンジン、またはコンポーネントは、非一時的コンピュータ媒体に記憶されてもよい。必要に応じて、モジュール、エンジン、または構成要素のうちの１またはそれを超えるものをシステムメモリ（例えば、ＲＡＭ）にロードし、分析装置システム２０５の１またはそれを超えるプロセッサによって実行することができる。図２に示す例では、遺伝子地図製作者サブシステム２１０およびＡＧＧ遺伝子型決定サブシステム２１５を実装するためのモジュール、エンジン、またはコンポーネントが示されている。
【0043】
図２はまた、化学物質、薬物、または他の材料もしくは生物学的物質が試験され、水、直接換気、および専用の配管ユーティリティを必要として分析される実験室を含む湿式実験室サブシステム２２０を示す。ＦＸＳ ＡＧＧ ＰＣＲアッセイプラットフォーム２００は、ブロック２２７において、湿式実験室サブシステム２２０内で１つまたはそれを超える試料２２５を得ることを含む。いくつかの例では、試料２２５のバッチは同時に処理され、例えば、２０超、５０超、または１００超の試料は、ＦＸＳ ＡＧＧ ＰＣＲアッセイプラットフォーム２００を使用して同時に処理することができる。例えば、９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレートなどの複数のウェルアッセイプレートは、ＦＸＳ ＡＧＧ ＰＣＲアッセイプラットフォーム２００を使用して、２０超、５０超、または１００超の試料を同時に分析することができる。特定の例では、複数のアッセイプレートを構築し、次いで、キャピラリー電気泳動装置のプレートスタッカーに並べて、アッセイプレートを連続的に注入することができる。いくつかの例では、試料２２５は、核酸を含む。いくつかの例では、試料２２５は、女性患者から得られた核酸を含む。いくつかの例では、試料２２５は、女性患者から得られた核酸を含む全血または羊水である。特定の例では、ＦＲＡＸ ＡＧＧ ＰＣＲアッセイは、脆弱Ｘ ＰＣＲ診断アッセイからの反射アッセイであり、反射アッセイは、脆弱Ｘ ＰＣＲ診断アッセイが、ＦＭＲ１遺伝子のＰＭ対立遺伝子において少なくとも４５～１００のＣＧＧリピート（例えば、５５～９０のＣＧＧリピート）を有する１つまたは複数の試料２２５を同定したときに始動される。特定の例では、反射アッセイは、脆弱Ｘ ＰＣＲ診断アッセイが、ＦＭＲ１遺伝子のＰＭ対立遺伝子において５５～９０リピートを有する１つまたは複数の試料２２５を同定したときに始動される。
【0044】
湿式実験室サブシステム２２０内のブロック２３０において、ＧＳ ＰＣＲ ２３５およびＡＧＧ中断ＰＣＲ ２４０（ＡＧＧ ＰＣＲ）を含むＦＸＳ ＡＧＧ ＰＣＲアッセイが行われる。アッセイの実行は、試料２２５を希釈すること（例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを使用すること）、希釈された試料２２５を、アッセイシステムにおけるＧＳ ＰＣＲ ２３５およびＡＧＧ ＰＣＲ ２４０のための試薬／プライマーと混合すること（例えば、ＰＣＲ試験管またはウェルプレート）、ＧＳ ＰＣＲ ２３５およびＡＧＧ ＰＣＲ ２４０の両方のためのＰＣＲ増幅（例えば、反応サイクル）、ＰＣＲ後のクリーンアップ（例えば、ＰＣＲ産物の精製）、およびＰＣＲ産物の分離（例えば、キャピラリー電気泳動またはＬｏｎｚａ ＭｅｔａＰｈｏｒ Ａｇａｒｏｓｅなどの高分離ゲル）を含み得る。いくつかの例では、ＦＸＳ ＡＧＧ ＰＣＲアッセイをＰＣＲプレート（例えば、９６ウェルＰＣＲアッセイプレート）で行う。ＧＳ ＰＣＲ ２３５およびＡＧＧ ＰＣＲ ２４０は、同じＰＣＲプレート上で並行して実施されてもよく、コントロールは、品質管理のためにＰＣＲプレート上にロードされてもよい。ＧＳ ＰＣＲ ２３５は、ＦＭＲ１遺伝子のＣＧＧリピートを含む領域を増幅し、ＦＭＲ１遺伝子内のリピートされたＣＧＧトリヌクレオチド配列の長さを決定するために使用される。この領域のＧＣ含有量が高いため、ＧＣリッチＰＣＲシステムを調製し、信頼性が高くロバストなＧＳ ＰＣＲ増幅に使用することができる。いくつかの例では、ＧＣリッチＰＣＲシステムは、ＧＣリッチＰＣＲ反応緩衝液およびＧＣリッチ分離能溶液を含む。ＧＣリッチＰＣＲシステムはまた、プルーフリーディング（３’－５’エキソヌクレアーゼ）活性を有する熱安定性酵素である熱安定性Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびＴｇｏ ＤＮＡポリメラーゼの酵素ブレンドを含み得る。ＧＣリッチＰＣＲ反応緩衝液、ＧＣリッチ分離能溶液および添加剤としてのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、この困難なＣＧＧリピート領域のロバストな増幅を可能にする。ＡＧＧ ＰＣＲ ２４０は、ＣＧＧリピート領域を標的とし、すべての対立遺伝子上のその中のすべてのＡＧＧ中断を検出する。ＡＧＧ ＰＣＲシステムは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびＴｇｏ ＤＮＡポリメラーゼが、最小バックグラウンドでのＡＧＧ特異的配列のロバストな増幅のためにＫＡＰＡ２Ｇ Ｒｏｂｕｓｔ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼなどの他のＤＮＡポリメラーゼによって置き換えられ得ることを除いて、ＧＣリッチＰＣＲシステムに基づいている。
【0045】
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｇｏ ＤＮＡポリメラーゼ、およびＫＡＰＡ２Ｇ Ｒｏｂｕｓｔ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ合成の出発点を提供する短いヌクレオチド配列であるプライマーが与えられた場合にのみＤＮＡを作製することができる。いくつかの例では、ＧＳ ＰＣＲ ２３５は、フォワードプライマーＦＲＡＸ－Ｆ１およびリバースプライマーＦＲＡＸ－Ｒ－６を使用して標的領域（コピーされるべきＣＧＧリピート領域）に隣接する。いくつかの例では、ＧＳ ＰＣＲ ２３５は、ＦＲＡＸ－Ｒ－６ＦＡＭなどの蛍光標識リバースプライマーを使用する。いくつかの例では、ＡＧＧ ＰＣＲ ２４０は、フォワードプライマーＦＸＳ－ＡＧＧ－Ｆｏｒｗを使用し、これは３つのＣＧＧリピートと３’末端に「Ａ」ヌクレオチドとを含有するキメラプライマーである。フォワードプライマーＦＸＳ－ＡＧＧ－Ｆｏｒｗは、ＣＧＧリピート内のＡＧＧ中断に特異的に結合し、それによって様々なサイズのアンプリコンを産生する。いくつかの例では、ＡＧＧ ＰＣＲ ２４０は、ＧＣ ＰＣＲ ２３５と同じＦＲＡＸ－Ｒ－６ＦＡＭなどの蛍光標識リバースプライマーを使用する。他の例では、ＡＧＧ ＰＣＲ ２４０は、ＧＣ ＰＣＲ ２３５のものとは異なる蛍光標識リバースプライマー、例えばＦＲＡＸ－Ｒ－＊ＦＡＭを使用する。
【0046】
いくつかの例では、ＰＣＲ後のクリーンアップは、ＧＳ ＰＣＲ ２３５およびＡＧＧ ＰＣＲ ２４０産物を磁気ビーズと混合すること、７０％エタノールなどの洗浄液で洗浄すること、風乾すること、および精製ＰＣＲ産物２４５を溶出してシグナル対ノイズ比を高めることを含む。増幅およびＰＣＲ後のクリーンアップの後、精製されたＰＣＲ産物２４５を分析装置システム２０５（例えば、蛍光ベースの分離機器システム）にロードすることができ、ＣＧＧリピートおよびＡＧＧ中断などの増幅産物は、ブロック２５０で決定され、ＧＳおよびＡＧＧ ＰＣＲ ＣＥ生データ２５５として出力される。いくつかの例では、ＧＳ ＰＣＲ ２３５は、大きなＣＧＧリピートを検出するように最適化され、例えば、最大３００のＣＧＧリピート（例えば、２６２リピート）がＧＳ ＰＣＲ ２３５によって一貫して増幅および検出され得る。特定の例では、精製されたＰＣＲ産物を、ＣＥを使用して検出または分離し、アンプリコンを「スタッター」ピークとして可視化し、各ピークを１つのＣＧＧリピートによって分離する。特定の実施形態では、長い注入時間または増加した電圧などの第１のパラメータは、より大きなサイズの対立遺伝子（例えば、６９のＣＧＧを超える）を検出するために使用され、一方、短い注入時間または減少した電圧などの第２のパラメータは、より小さなサイズの対立遺伝子（例えば、６９のＣＧＧ以下の）の正確なサイジングのために使用される。伸長対立遺伝子は、スタッターが５５のＣＧＧリピートを超えて伸長する場合に検出される場合があり、ＰＭ対立遺伝子は、スタッターが４５と２００のＣＧＧリピートの間に伸長する場合に検出され得る。
【0047】
分析装置システム２０５内のブロック２６０において、分離モジュール２６５（例えば、生のＣＥデータを取得し、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ（商標）などの断片サイズおよび量を決定することができる任意のソフトウェアおよび／またはハードウェア）を使用して、前に確立されたＱＣメトリックに基づいてＧＳおよびＡＧＧ ＰＣＲ ＣＥ生データ２５５のピークを同定する。いくつかの例では、ＡＧＧ ＰＣＲアッセイとＧＳ ＰＣＲアッセイの両方が、遺伝子地図製作者モジュール２６５の同じパラメータ（例えば、同じ長い注入または増加した電圧）ＣＥ分析方法を使用して、ＧＳおよびＡＧＧ ＰＣＲ ＣＥ生データ２５５のピークを同定する。遺伝子地図製作者モジュール２６５は、分析された各ＰＣＲアンプリコンのサイズおよび存在量をピークサイズおよび高さとしてそれぞれ出力し、次いでブロック２７０で、ＡＧＧ遺伝子型決定サブシステム２１５のＡＧＧ遺伝子型決定モジュール２７５によって処理される。ＡＧＧ遺伝子型決定モジュール２６０は、まず、サイジング基準およびピーク高さをチェックして、ＧＳおよびＡＧＧ ＰＣＲ ＣＥ生データ２５５の品質が分析に許容され得ることを確実にする。次いで、ＡＧＧ遺伝子型決定モジュール２７５は、ＧＳ－ＰＣＲピークデータを使用して、各対立遺伝子のＣＧＧリピート数を計算する。各対立遺伝子についてのＡＧＧ中断の数および位置を決定するために、ＡＧＧ遺伝子型決定モジュール２７５は、通常は正常な対立遺伝子に対応する、より少ないリピートの数を有する対立遺伝子上のＡＧＧピークを反復的に探索および同定することによって開始する。遺伝子地図製作者モジュール２６５のピーク出力表からこの対立遺伝子に割り当てられているすべてのＡＧＧピークを除去した後、ＡＧＧ遺伝子型決定モジュール２７５は、１またはそれを超えるＰＭ対立遺伝子についてプロセスをリピートする。このようにして、同じピークが正常な対立遺伝子およびＰＭ対立遺伝子の両方に割り当てられることが防止され、そうでなければ１またはそれを超えるＰＭ対立遺伝子の伸長リスクを過小評価する可能性がある。次いで、ＡＧＧ遺伝子型決定モジュール２７５は、各対立遺伝子のＣＧＧリピート数ならびに各対立遺伝子のＡＧＧ中断の数および位置を使用して、各対立遺伝子のＡＧＧ遺伝子型を決定する。各対立遺伝子のＡＧＧ遺伝子型および各試料の任意選択のリスク結果は、分析装置システム２０５によって最終結果２８０として出力される。いくつかの例では、ＡＧＧ遺伝子型決定モジュール２７５によって使用されるすべての閾値およびＱＣパラメータは、別個の構成ファイルに維持され、任意の数のＦＸＳ ＡＧＧ ＰＣＲアッセイにわたって使用することができる。
ＩＩＩ．ＡＧＧ遺伝子型決定技術
ＩＩＩ．ＡＧＧ遺伝子型決定技術
【0048】
図３は、ＦＸＳ ＡＧＧ ＰＣＲアッセイプラットフォームおよび遺伝子型決定技術（例えば、図２に関して記載されるＦＸＳ ＡＧＧ ＰＣＲアッセイプラットフォーム２００）を使用したＡＧＧ遺伝子型決定のためのプロセス３００を示す。プロセス３００はブロック３０５で開始し、生データは試料に対して行われたＦＸＳアッセイから得られる。いくつかの例では、生データは、ＣＥによって分離されたＧＳ ＰＣＲデータおよびＡＧＧ中断ＰＣＲデータを含む。ブロック３１０において、生データにおいて同定された第１の対立遺伝子について、予想ＡＧＧピークサイズが決定される。いくつかの例では、第１の対立遺伝子は、最も少ないリピートの数を有する対立遺伝子または正常な対立遺伝子である。特定の例では、予想ＡＧＧピークサイズは、式（１）を用いて計算される。
予想ＡＧＧピークサイズ（塩基対）＝（（Ｎ－Ｌ）＊３）＋Ａ
式（１）
式中、Ｎは、対立遺伝子（例えば、最も少ないリピートの数を有する対立遺伝子）におけるＣＧＧリピートの数であり、Ｌは、最初のＡＧＧ中断の（ＣＧＧリピートの数における）予想位置であり、８と１０のＣＧＧリピートとの間、例えば９のＣＧＧリピートであってよく、３は、各ＣＧＧリピートに対する塩基対の数であり、Ａは、リピートのないＰＣＲアンプリコンのサイズであり、いくつかの例では、ＰＣＲアンプリコンは１３２塩基対を有し、したがってＡ＝１３２である。
予想ＡＧＧピークサイズ（塩基対）＝（（Ｎ－Ｌ）＊３）＋Ａ
式（１）
式中、Ｎは、対立遺伝子（例えば、最も少ないリピートの数を有する対立遺伝子）におけるＣＧＧリピートの数であり、Ｌは、最初のＡＧＧ中断の（ＣＧＧリピートの数における）予想位置であり、８と１０のＣＧＧリピートとの間、例えば９のＣＧＧリピートであってよく、３は、各ＣＧＧリピートに対する塩基対の数であり、Ａは、リピートのないＰＣＲアンプリコンのサイズであり、いくつかの例では、ＰＣＲアンプリコンは１３２塩基対を有し、したがってＡ＝１３２である。
【0049】
ブロック３１５および３２０において、生データを反復的に探索して、予想ＡＧＧピークサイズに基づいて決定された探索空間の第１のセットを使用して、第１の対立遺伝子上の１またはそれを超えるＡＧＧピークを同定する。探索空間の第１のセットは、予想ＡＧＧピークサイズに基づいて決定された１またはそれを超える探索空間を含み得る。いくつかの例では、探索および同定は、（ｉ）ブロック３１５において、予想ＡＧＧピークサイズに基づいて、第１の対立遺伝子についての探索空間の第１のセットの第１の探索空間を決定することと、（ｉｉ）ブロック３１５において、生データを探索し、第１の探索空間を使用して第１の対立遺伝子上の初期ＡＧＧピークを同定することと、（ｉｉｉ）ブロック３２０において、第１の対立遺伝子上の初期ＡＧＧピークのピークサイズに基づいて、第１の対立遺伝子についての第２の探索空間を決定し、ブロック３２０において、生データを反復的探索し、第２の探索空間を使用して、第１の対立遺伝子上の１またはそれを超える追加のＡＧＧピークを同定することと、を含む。探索が、ブロック３１５において、第１の探索空間を使用して第１の対立遺伝子上の初期ＡＧＧピークを同定することにならない場合、ブロック３２５において、第１の探索空間は修正されてよく（例えば、３０ｂｐｓは、予想ＡＧＧピークサイズから減算され得る）、ブロック３１５および３２０は修正された第１の探索空間を用いて実行され得る。
【0050】
第１の探索空間は、第１のピークサイズ範囲に基づいて決定され得る。いくつかの例では、第１のピークサイズ範囲は、予想ＡＧＧピークサイズの周りの塩基対の所定量またはサイズ範囲調整閾値（＋／－）である。特定の例では、所定の量またはサイズ範囲調整閾値は、予想される最初のＡＧＧピークサイズの＋／－１２または１５塩基対である。第２の探索空間は、新しいまたは第２のピークサイズ範囲に基づいて決定することができる。いくつかの例では、第２のピークサイズ範囲は、同定された初期ピークのピークサイズ付近の塩基対の所定量またはサイズ範囲調整閾値（＋／－）である。特定の例では、所定の量またはサイズ範囲調整閾値は、同定された初期ピークのピークサイズの＋／－１２または１５塩基対である。他の例では、第２のピークサイズ範囲は、修正されたピークサイズの周りの塩基対の所定の量またはサイズ範囲調整閾値（＋／－）である（ピークサイズ調整閾値は、同定された初期ピークのピークサイズから減算される）。いくつかの実施形態では、ピークサイズ調整閾値は、１５～５０ｂｐｓ（例えば、３０ｂｐｓ）である。特定の例では、所定の量またはサイズ範囲調整閾値は、改変されたピークサイズの＋／－１２または１５塩基対である（２４または３０ｂｐｓが、同定された初期ピークのピークサイズから減算される）。
【0051】
ブロック３１５、３２０および３２５のプロセスは、生データ内のすべてのピークデータおよび対立遺伝子が評価されるまで、各追加の対立遺伝子（例えば、１またはそれを超えるＰＭ対立遺伝子）についてリピートされ得る。例えば、生データを反復的に探索して、予想ＡＧＧピークサイズに基づいて決定された探索空間の第２のセットを使用して、第２の対立遺伝子上の１またはそれを超えるＡＧＧピークを同定することができる。探索空間の第２のセットは、予想ＡＧＧピークサイズに基づいて決定された１またはそれを超える探索空間を含み得る。特定の例では、探索空間の第２のセットの１またはそれを超える探索空間の一部または全部は、探索空間の第１のセットの１またはそれを超える探索空間と同じである。いくつかの例では、探索および同定は、（ｉ）予想ＡＧＧピークサイズに基づいて、第２の対立遺伝子についての探索空間の第２のセットの第１の探索空間を決定することと、（ｉｉ）生データを探索し、第２の探索空間を使用して第２の対立遺伝子上の初期ＡＧＧピークを同定することと、（ｉｉｉ）第２の対立遺伝子上の初期ＡＧＧピークのピークサイズに基づいて、第２の対立遺伝子についての第２の探索空間を決定することと、（ｉｖ）生データを反復的に探索し、第２の探索空間を使用して第２の対立遺伝子上の１またはそれを超える追加のＡＧＧピークを同定することと、を含む。探索の結果、第１の探索空間を使用して第２の対立遺伝子上の初期ＡＧＧピークが同定されない場合、第１の探索空間は修正されてよく（例えば、２４ｂｐｓは、予想ＡＧＧピークサイズから減算され得る）、処理は修正された第１の探索空間で継続し得る。
【0052】
第２の探索空間は、第２のピークサイズ範囲に基づいて決定され得る。いくつかの例では、第２のピークサイズ範囲は、予想ＡＧＧピークサイズの周りの塩基対の所定量またはサイズ範囲調整閾値（＋／－）である。特定の例では、所定の量またはサイズ範囲調整閾値は、予想される最初のＡＧＧピークサイズの＋／－１２または１５塩基対である。第２の探索空間は、新しいまたは第２のピークサイズ範囲に基づいて決定することができる。いくつかの例では、第２のピークサイズ範囲は、同定された初期ピークのピークサイズ付近の塩基対の所定量またはサイズ範囲調整閾値（＋／－）である。特定の例では、所定の量またはサイズ範囲調整閾値は、同定された初期ピークのピークサイズの＋／－１２または１５塩基対である。他の例では、第２のピークサイズ範囲は、修正されたピークサイズの周りの塩基対の所定の量またはサイズ範囲調整閾値（＋／－）である（ピークサイズ調整閾値は、同定された初期ピークのピークサイズから減算される）。いくつかの実施形態では、ピークサイズ調整閾値は、１５～５０ｂｐｓ（例えば、２４ｂｐｓ）である。特定の例では、所定の量またはサイズ範囲調整閾値は、改変されたピークサイズの＋／－１２または１５塩基対である（２４または３０ｂｐｓが、同定された初期ピークのピークサイズから減算される）。いくつかの例では、第１の対立遺伝子または任意の他の前の対立遺伝子上の１またはそれを超えるＡＧＧピークが同定されると、生データを反復的に探索し、第２の対立遺伝子または別の後続の対立遺伝子上の１またはそれを超えるＡＧＧピークを同定する前に、第１の対立遺伝子または任意の他の前の対立遺伝子上の１またはそれを超えるＡＧＧピークが生データから除去され得る。
【0053】
ブロック３３０において、ブロック３１５、３２０および３２５で評価された各対立遺伝子の遺伝子型がＡＧＧ遺伝子型決定される。いくつかの例では、遺伝子型決定は、（ｉ）ＧＳ ＰＣＲデータおよび対応する対立遺伝子で同定された１またはそれを超えるＡＧＧピークに基づいて、第１の対立遺伝子、第２の対立遺伝子または任意の他の対立遺伝子上の最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数を決定することと、（ｉｉ）ＧＳ ＰＣＲデータおよび対応する対立遺伝子で同定された１またはそれを超えるＡＧＧピークに基づいて、第１の対立遺伝子、第２の対立遺伝子または任意の他の対立遺伝子上の任意の２つの隣接するＡＧＧ中断によって分離されたＣＧＧリピートの数を決定すること（存在する場合）と、（ｉｉｉ）ＧＳ ＰＣＲデータおよび対応する対立遺伝子で同定された１またはそれを超えるＡＧＧピークに基づいて、第１の対立遺伝子、第２の対立遺伝子または任意の他の対立遺伝子上の最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数を決定することと、を含む。いくつかの例では、遺伝子型決定は、最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数、任意の２つの隣接するＡＧＧ中断によって分離されたＣＧＧリピートの数（存在する場合）、および最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数に基づいて、第１の対立遺伝子、第２の対立遺伝子、または任意の他の対立遺伝子のＡＧＧ遺伝子型を生成することをさらに含む。
【0054】
必要に応じて、ブロック３３５において、ブロック３３０で決定された１またはそれを超える対立遺伝子の遺伝子型（例えば、第１の対立遺伝子、第２の対立遺伝子、または第１の対立遺伝子と第２の対立遺伝子の両方）を使用して、試料に関連する対象のリスクスコアを決定する。リスクスコアは、対象が遅発性神経変性疾患である脆弱Ｘ関連振戦／運動失調症候群（ＦＸＴＡＳ）もしくは脆弱Ｘ関連原発性卵巣機能不全（ＦＸＰＯＩ）を発症するリスク、または完全変異対立遺伝子を対象の子孫に伝達するリスクもしくはそれらの任意の組み合わせを同定する。ブロック３４０において、ブロック３３０で決定された１またはそれを超える対立遺伝子について決定されたＡＧＧ遺伝子型が出力され得る。ブロック３３０で決定された１またはそれを超える対立遺伝子について決定されたＡＧＧ遺伝子型および任意選択のリスクスコアの出力は、エンドユーザに出力を提供することおよび／またはストレージデバイスに出力を記録すること（例えば、ユーザインターフェース上に出力を表示すること、および／またはデータベースの結果ファイルに出力を記憶すること）を含み得る。
【0055】
図４Ａ～図４Ｈは、ＦＸＳ ＡＧＧ ＰＣＲアッセイプラットフォームおよび遺伝子型決定技術（例えば、ＦＸＳ ＡＧＧ ＰＣＲアッセイプラットフォーム２００ならびに図２および図３に関して記載される技術）を使用したＡＧＧ遺伝子型決定のための処理の一例を示す簡略化されたフローチャート４００を示す。プロセス４００は、以下のセクションに分割される：（ｉ）データ準備（図４Ａ）、（ｉｉ）最短のまたは正常な対立遺伝子のアルゴリズムフロー（図４Ｂおよび図４Ｃ）、（ｉｉｉ）ＰＭ対立遺伝子のアルゴリズムフロー（図４Ｃ、図４Ｄ、図４Ｅ、図４Ｆ、図４Ｇ）、および（ｉｖ）各対立遺伝子のＡＧＧ遺伝子型フロー（図４Ｈ）。
データの準備
データの準備
【0056】
図４Ａは、ブロック４０２において、各ＰＣＲアンプリコンのサイズおよび存在量（例えば、ピークサイズおよび高さ）を含むＧＳおよびＡＧＧ ＰＣＲ ＣＥ生データが、１つまたはそれを超える試料について得られることを示す。いくつかの例では、初期ＣＧＧデータセット（ＧＳおよびＡＧＧ ＰＣＲ ＣＥの生データの一部）が、第１のパラメータ（例えば、短い注入時間）分析および第２のパラメータ（例えば、長い注入時間）分析のそれぞれに対して作成される。第１のパラメータ分析は最大３つの対立遺伝子を返すことができ、第２のパラメータ分析は最大２つの対立遺伝子を返すことができる。第１のパラメータ分析および第２のパラメータ分析の各々のために作成された初期ＣＧＧデータセットの組み合わせを含む最終ＣＧＧデータセットを作成することができる。例えば、（ｉ）短いＣＧＧ（０～５９リピート）に関するピークのチェックを行って、重複が選択されないことを確認してもよく、（ｉｉ）長いＣＧＧ（６０～９０リピート）に関するチェックを行って、長い対立遺伝子が短い対立遺伝子と重複しないこと（例えば、５８リピートのショートコールと６０リピートのロングコール）を確認してもよく、（ｉｉｉ）長いＣＧＧに関するピークのチェックを行って、重複が選択されないことを確認してもよい。特定の例では、＋／－１～５ＣＧＧリピート、例えば２ＣＧＧリピートのピークバッファを、短いＣＧＧおよび長いＣＧＧの重複ピークのチェック中に使用することができる。重複および重複がチェックされ、除去されると、短いＣＧＧおよび長いＣＧＧを含む最終ＣＧＧデータセットが作成され得る。いくつかの例では、第１のパラメータ分析と第２のパラメータ分析との組み合わせを含む最終ＡＧＧデータセット（ＧＳおよびＡＧＧ ＰＣＲ ＣＥ生データの一部）が作成される。
【0057】
ブロック４０４において、最終ＣＧＧデータセットおよびＡＧＧデータセット内のサイジング基準およびピーク高さをチェックして、ＧＳおよびＡＧＧ ＰＣＲ ＣＥの生データ品質が分析に許容され得ることを確認する。いくつかの例では、チェックは、最終ＣＧＧデータセットおよびＡＧＧデータセット内のサイジング基準およびピーク高さを、１もしくはそれを超える品質管理（ＱＣ）パラメータまたはメトリックと比較して、ＧＳおよびＡＧＧ ＰＣＲ ＣＥの生データ品質が分析に許容され得るかどうかを決定することを含むことができる。特定の例では、ＱＣパラメータまたは測定基準は、２より大きい（＞２）１２５／１０００の高さ比の赤色染料（サイズマーカー）のＱＣチェック閾値を含む。追加的または代替的に、ＡＧＧ特異的ピーク高さＱＣパラメータまたはメトリックは、ＡＧＧ特異的ピークをスクリーニングするための最小ＲＦＵ閾値を含み得る。正常な対立遺伝子は、１０００ＲＦＵより大きい（＞１０００）ＲＦＵ閾値を有し得る。一方、必要に応じて、ＰＭ対立遺伝子は、正常な対立遺伝子における最低ＡＧＧピークの１０％超（＞１０％）、正常な対立遺伝子においてピークが検出されない場合、２００ＲＦＵより大きい（＞２００）のＲＦＵ閾値を有し得る。最終ＣＧＧデータセットおよびＡＧＧデータセット内のサイジング基準およびピーク高さがＱＣパラメータまたはメトリックを満たす場合、最終ＣＧＧデータセットを使用して、ブロック４０６において各対立遺伝子（例えば、正常または短い対立遺伝子、およびＰＭまたは長い対立遺伝子）のＣＧＧリピート数を計算する。最終ＣＧＧデータセットおよびＡＧＧデータセット内のサイジング基準およびピーク高さがＱＣパラメータまたはメトリックを満たさない場合、ブロック４０８において、試料のアッセイ、ＧＳおよびＡＧＧ ＰＣＲ ＣＥ生データ、ならびに／またはＧＳおよびＡＧＧ ＰＣＲ ＣＥ生データからの各ＰＣＲアンプリコンのサイズおよび存在量（例えば、ピークサイズおよび高さ）が拒否され、プロセスは終了する。
【0058】
ブロック４０６において、各対立遺伝子からのＣＧＧリピートの計算された数が所定の範囲内にあるかどうかに関する決定が行われる。いくつかの例では、ＦＸＳ ＡＧＧ ＰＣＲアッセイは、脆弱Ｘ ＰＣＲ診断アッセイからの反射アッセイであり、反射アッセイは、脆弱Ｘ ＰＣＲ診断アッセイが、ＦＭＲ１遺伝子のＰＭ対立遺伝子において少なくとも４５～１００のＣＧＧリピート（例えば、５５～９０のＣＧＧリピート）を有する１つまたは複数の試料を同定したときに始動される。特定の例では、反射アッセイは、脆弱Ｘ ＰＣＲ診断アッセイが、ＦＭＲ１遺伝子のＰＭ対立遺伝子において５５～９０リピートを有する１つまたは複数の試料２２５を同定したときに始動される。したがって、４０～６０リピートの最小ＣＧＧ閾値（ＭｉｎＣＧＧ）および７５～１１０リピートの最大ＣＧＧ閾値（ＭａｘＣＧＧ）を設定して、ＦＭＲ１遺伝子のＰＭ対立遺伝子において少なくとも４０～１１０のＣＧＧリピート（例えば、５５～９０のＣＧＧリピート）を有する１つまたは複数の試料に対してのみＡＧＧ遺伝子型決定が確実に行われるようにすることができる。特定の実施形態では、ＭｉｎＣＧＧ閾値は５５リピートに設定され、ＭａｘＣＧＧ閾値は９０リピートに設定され、ＣＧＧリピートの数の所定の範囲は５５～９０リピートの間である（９０超のリピートを有するＰＭ対立遺伝子の伸長リスクは、ＡＧＧ中断の数にかかわらず５０％超である）。最終ＣＧＧデータセットにおいて同定されたＣＧＧリピートの数が所定の範囲内にある場合、ＡＧＧ遺伝子型決定プロセスは、図４Ｂに示される正常または短い対立遺伝子アルゴリズムフローに続く。最終ＣＧＧデータセットにおいて同定されたＣＧＧリピート回数が所定の範囲外である場合、ブロック４１０においてＣＧＧリピート回数が出力され、プロセスは終了する。ブロック４１０において、ＡＧＧ遺伝子型決定が実行されなかったことを述べるメッセージと共にＣＧＧリピートの数を出力することができる。ＣＧＧリピート回数および任意選択のメッセージの出力は、エンドユーザに出力を提供すること、および／またはストレージデバイス（例えば、ユーザインターフェース上に出力を表示すること、および／またはデータベースの結果ファイルに出力を記憶すること）に出力を記録することを含むことができる。
正常な対立遺伝子アルゴリズムフロー
正常な対立遺伝子アルゴリズムフロー
【0059】
各対立遺伝子に対するＡＧＧ中断の数および位置を決定するために、プロセスは、通常は正常な対立遺伝子に対応する、より少ないリピートの数を有する対立遺伝子上のＡＧＧピークを反復的に探索および同定することによって開始する。図４Ｂに示されるように、ブロック４１２において、予想ＡＧＧピークサイズが対立遺伝子について計算される。予想ＡＧＧピークサイズは、最も少ないＣＧＧリピートの数を有する対立遺伝子について計算され得る（例えば、正常な対立遺伝子）。いくつかの例では、予想ＡＧＧピークサイズは、式（１）を使用して計算される。
予想ＡＧＧピークサイズ（塩基対）＝（（Ｎ－Ｌ）＊３）＋Ａ
式（１）
式中、Ｎは、対立遺伝子（例えば、最も少ないリピートの数を有する対立遺伝子）におけるＣＧＧリピートの数であり、Ｌは、最初のＡＧＧ中断の（ＣＧＧリピートの数における）予想位置であり、８と１０のＣＧＧリピートとの間、例えば９のＣＧＧリピートであってよく、３は、各ＣＧＧリピートに対する塩基対の数であり、Ａは、リピートのないＰＣＲアンプリコンのサイズであり、いくつかの例では、ＰＣＲアンプリコンはリピートのない１３２塩基対を有し、したがってＡ＝１３２である。
予想ＡＧＧピークサイズ（塩基対）＝（（Ｎ－Ｌ）＊３）＋Ａ
式（１）
式中、Ｎは、対立遺伝子（例えば、最も少ないリピートの数を有する対立遺伝子）におけるＣＧＧリピートの数であり、Ｌは、最初のＡＧＧ中断の（ＣＧＧリピートの数における）予想位置であり、８と１０のＣＧＧリピートとの間、例えば９のＣＧＧリピートであってよく、３は、各ＣＧＧリピートに対する塩基対の数であり、Ａは、リピートのないＰＣＲアンプリコンのサイズであり、いくつかの例では、ＰＣＲアンプリコンはリピートのない１３２塩基対を有し、したがってＡ＝１３２である。
【0060】
ブロック４１４において、対立遺伝子について初期ピークが同定される（例えば、最も少ないリピートの数を有する対立遺伝子）。初期ピークを同定することは、ブロック４１６において、対立遺伝子についての初期ピークサイズ探索空間（塩基対におけるピークサイズ探索空間）を決定することを含む。初期ピークサイズ探索空間は、初期ピークサイズ範囲に基づいて決定することができる。いくつかの例では、初期ピークサイズ範囲は、予想ＡＧＧピークサイズの周りの塩基対の所定の量またはサイズ範囲調整閾値（＋／－）である（範囲＝＋／サイズ範囲調整閾値）。特定の例では、所定の量またはサイズ範囲調整閾値は、予想ＡＧＧピークサイズの周りの＋／－１５塩基対である。初期ピークサイズ探索空間が決定されると、ブロック４１８において、初期ピークサイズ探索空間を使用して最終ＡＧＧデータセットを探索し、最高ピークの基準に基づいて初期ピークサイズ探索空間内の最高ピークを同定することができる。いくつかの例では、初期ピークサイズ探索空間内の最高ピークを同定するための基準は、（ｉ）ピークサイズが最小ピークサイズ閾値（いくつかの実施形態では、最小ピークサイズ閾値が１３２塩基対に設定される）よりも大きいこと、（ｉｉ）ピーク高さが最小ピーク高さ閾値（いくつかの実施形態では、最小ピーク高さ閾値が２００ＲＦＵに設定される）よりも大きいこと、（ｉｉｉ）ピーク高さがバックグラウンドピーク高さ閾値（いくつかの実施形態では、バックグラウンドピーク高さ閾値が１０００ＲＦＵに設定される）よりも大きいこと、または（ｉｖ）それらの任意の組み合わせを含む。初期ピークサイズ探索空間における最高ピークを同定するための基準は、（ｉ）最小ピークサイズ閾値は、リピートのないＰＣＲアンプリコンのサイズであり、偽ピークの呼び出しを防止するための基準として使用され得る、（ｉｉ）最小ピーク高さ閾値は、バックグラウンド低レベルピークの呼び出しを防止するために使用され得る、および（ｉｉｉ）バックグラウンドピーク高さ閾値は、正常な対立遺伝子におけるＡＧＧピークに必要な最小ピーク高さとして使用され得る、およびバックグラウンドピークの呼び出しを防止するためにも使用され得る、を含む様々な技術的利点を提供する。
【0061】
最高ピークの基準を満たすピークが初期ピークサイズ探索空間内で見つかった場合、ブロック４２０において、見つかったピークは初期ピークとして同定される。さらに、ブロック４２０において、初期ピークの高さは、（ｉ）前のピーク高さ閾値の高さ、（ｉｉ）最低正常な高さ閾値の高さ、および（ｉｉｉ）第１の正常なピーク閾値の高さとして設定される。この設定は、バックグラウンドまたはスタッター（偽陽性）ピークを呼び出すことを防止すること含む様々な技術的利点を提供する。対立遺伝子（例えば、最も少ないリピートの数を有する対立遺伝子）について初期ピークが同定されると、初期ピークに関連するピークデータが最終ＡＧＧデータセットから除去され得る。最終ＡＧＧデータセットの出力表からこの対立遺伝子に割り当てられているＡＧＧピークを除去した後、プロセスは、同じ対立遺伝子内の別の探索空間についてリピートするか、または別の対立遺伝子（例えば、ＰＭ対立遺伝子）についての新しいプロセスを開始する。最終ＡＧＧデータセットの出力表から対立遺伝子に割り当てられた（このブロックまたは本明細書に記載の任意の他のブロックにおける）発見されたＡＧＧピークを除去することは、最終ＡＧＧデータセットの出力表内の同じピークが重複して発見されることおよび／または複数の対立遺伝子に割り当てられることが防止され、そうでなければＰＭ対立遺伝子の伸長リスクを過小評価する可能性があるという技術的利点を達成する。出力表からのデータの除去はまた、下流処理の複雑さおよび時間を低減する。
【0062】
最高ピークの基準を満たすピークが初期ピークサイズ探索空間内に見つからない場合、ブロック４２２において、ピークサイズ調整閾値が、対立遺伝子についてブロック４２２で決定された予想ＡＧＧピークサイズ（または前に計算された新しい予想ＡＧＧピークサイズ）から減算されて、新しい予想ＡＧＧピークサイズが得られる。新しい予想ＡＧＧピークサイズは、ブロック４１４をリピートすることによって初期ピークを同定するために使用される。この調整は、初期ピークサイズ探索空間をシフト／拡大して、最終ＡＧＧデータセット内の初期ピークを見つけるのを助ける。いくつかの実施形態では、ピークサイズ調整閾値は、１５～５０ｂｐｓ（例えば、３０ｂｐｓ）である。
【0063】
ブロック４１４において対立遺伝子について初期ピークが同定されると、対立遺伝子（例えば、最も少ないリピートの数を有する対立遺伝子）についてさらなるＡＧＧピークが同定され得る。ブロック４２４において、対立遺伝子について追加のピークが同定される。追加のピークを同定することは、ブロック４２６において、次の予想ＡＧＧピークサイズを得るために、ブロック４１４で見つかった初期ピークのピークサイズからピークサイズ調整閾値を減算することを含む。ブロック４２８において、次に予想ＡＧＧピークサイズに基づいて、対立遺伝子について次のピークサイズ探索空間（塩基対のピークサイズ探索空間）が決定される。次のピークサイズ探索空間は、次の予想ＡＧＧピークサイズの周りの次のピークサイズ範囲に基づいて決定することができる。いくつかの例では、次のピークサイズ範囲は、次の予想ＡＧＧピークサイズの周りの塩基対の所定量またはサイズ範囲調整閾値（＋／－）である。特定の例では、所定の量またはサイズ範囲調整閾値は、次の予想ＡＧＧピークサイズの＋／－１５塩基対である。
【0064】
次のピークサイズ探索空間が決定されると、ブロック４３０において、第２の探索空間を使用して最終ＡＧＧデータセットを探索し、最高ピークの基準に基づいて次のピークサイズ探索空間内の最高ピークを同定することができる。いくつかの例では、次のピークサイズ探索空間内の最高ピークを同定するための基準は、（ｉ）ピークサイズが最小ピークサイズ閾値（いくつかの実施形態では、最小ピークサイズ閾値が１３２塩基対に設定される）よりも大きいこと、（ｉｉ）ピーク高さが最小ピーク高さ閾値（いくつかの実施形態では、最小ピーク高さ閾値が２００ＲＦＵに設定される）よりも大きいこと、（ｉｉｉ）ピーク高さがバックグラウンドピーク高さ閾値（いくつかの実施形態では、バックグラウンドピーク高さ閾値が１０００ＲＦＵに設定される）よりも大きいこと、（ｉｖ）初期ピークサイズ探索空間内に初期ピークが見つかった場合、追加の見つかったピークのピーク高さは、前のピーク高さ閾値（ブロック４２０で設定）＊二次正常高さパーセント閾値（例えば、５０％）、または（ｖ）それらの任意の組み合わせを含む。次のピークサイズ探索空間における最高ピークを同定するための基準は、（ｉ）最小ピークサイズ閾値は、リピートのないＰＣＲアンプリコンのサイズであり、偽ピークの呼び出しを防止するための基準として使用され得る、（ｉｉ）最小ピーク高さ閾値がバックグラウンド低レベルピークの呼び出しを防止するために使用され得る、および（ｉｉｉ）バックグラウンドピーク高さ閾値が正常な対立遺伝子におけるＡＧＧピークに必要な最小ピーク高さとして使用され得る、を含む様々な技術的利点を提供する。
【0065】
最高ピークの基準を満たす次のピークサイズ探索空間内にピークが見つかった場合、ブロック４３２において、見つかったピークは追加のピークとして同定される。さらに、追加のピークの高さは、（ｉ）前のピーク高さ閾値の高さとして設定され、（ｉｉ）見つかったピークの高さが初期ピークの高さよりも小さい場合、見つかったピークの高さは、最低正常高さ閾値の高さとして設定される。この設定は、バックグラウンドまたはスタッター（偽陽性）ピークを呼び出すことを防止すること含む様々な技術的利点を提供する。対立遺伝子（例えば、最も少ないリピートの数を有する対立遺伝子）について追加のピークが同定されると、追加のピークに関連するピークデータが最終ＡＧＧデータセットから除去され得る。最終ＡＧＧデータセットの出力表からこの対立遺伝子に割り当てられているＡＧＧピークを除去した後、プロセスは、同じ対立遺伝子内の別の探索空間についてリピートするか、または別の対立遺伝子（例えば、ＰＭ対立遺伝子）についての新しいプロセスを開始する。
【0066】
ブロック４３４において、最終ＡＧＧデータセットが追加のピークを求めて探索され続けるべきかどうか（最終ＡＧＧデータセットの出力表は短い対立遺伝子についてより多くのピークを有するか）に関する決定が行われる。いくつかの実施形態では、最終ＡＧＧデータセットの探索を継続するかどうかの決定は、短い／正常な対立遺伝子についてＰＣＲアンプリコンのサイズ限界（例えば、１３２ｂｐ）に達したかどうかに基づいて行われる。対立遺伝子についての最終ＡＧＧデータセットにさらなるピークがあると決定された場合、ブロック４２４がリピートされる。ブロック４２６において、次の予測ＡＧＧピークサイズ（本質的に、第３、第４、第５などの予想ＡＧＧピークサイズ）を得るために、前に計算された次の予測ＡＧＧピークサイズからピークサイズ調整閾値が減算される。この調整は、最終ＡＧＧデータセット内の追加のピーク（単数または複数）を見つけるのを助けるために、追加のピークサイズ探索空間をシフト／拡大する。対立遺伝子（例えば、最も少ないリピートの数を有する対立遺伝子）のすべてのピークが最終ＡＧＧデータセット内で同定されるまで、ブロック４２４および４３４をリピートする。対立遺伝子（例えば、最も少ないリピートの数を有する対立遺伝子）のすべてのピークが最終ＡＧＧデータセット内で同定されると、ＡＧＧ遺伝子型決定プロセスは、ブロック４４０において残りの対立遺伝子のそれぞれについて継続する。
ＰＭ対立遺伝子アルゴリズムフロー
ＰＭ対立遺伝子アルゴリズムフロー
【0067】
ブロック４４０において、最終ＡＧＧデータセット内の別の対立遺伝子（例えば、５５～９０の間のリピートの数を有するＰＭ対立遺伝子）について初期ピークが同定される。初期ピークを同定することは、ブロック４４２において、別の対立遺伝子についての初期ピークサイズ探索空間（塩基対におけるピークサイズ探索空間）を決定することを含む。初期ピークサイズ探索空間は、初期ピークサイズ範囲に基づいて決定することができる。いくつかの例では、初期ピークサイズ範囲は、ブロック４１２で決定された予想ＡＧＧピークサイズの周りの塩基対の所定量またはサイズ範囲調整閾値（＋／－）である。特定の例では、所定の量またはサイズ範囲調整閾値は、予想ＡＧＧピークサイズの＋／－１２塩基対である。特定の例では、６５を超えるＣＧＧリピートの数を有する別の対立遺伝子（例えば、ＰＭ対立遺伝子）について：初期ピークサイズ範囲の下端がブロック４２０で設定された第１の正常ピーク閾値未満（未満）である場合、初期ピークサイズ範囲の下端を第１の正常ピーク閾値に設定する。
【0068】
初期ピークサイズ探索空間が決定されると、ブロック４４４において、初期ピークサイズ探索空間を使用して最終ＡＧＧデータセットを探索し、最高ピークの基準に基づいて初期ピークサイズ探索空間内の最高ピークを同定することができる。いくつかの例では、初期ピークサイズ探索空間内の最高ピークを同定するための基準は、（ｉ）ピークサイズが最小ピークサイズ閾値（いくつかの実施形態では、最小ピークサイズ閾値が１３２塩基対に設定される）よりも大きいこと、（ｉｉ）ピーク高さが最小ピーク高さ閾値（いくつかの実施形態では、最小ピーク高さ閾値が２００ＲＦＵに設定される）よりも大きいこと、（ｉｉｉ）ピーク高さが最低正常高さ閾値（ブロック４２０または４３２で設定される）＊最小パーセンテージＰＭ閾値（いくつかの実施形態では、最小パーセンテージＰＭ閾値が１０％に設定される）よりも大きいこと、または（ｉｖ）それらの任意の組み合わせを含む。初期ピークサイズ探索空間における最高ピークを同定するための基準は、（ｉ）最小ピークサイズ閾値が、リピートのないＰＣＲアンプリコンのサイズであり、偽ピークの呼び出しを防止するための基準として使用され得る、（ｉｉ）最小ピーク高さ閾値が、バックグラウンド低レベルピークの呼び出しを防止するために使用され得る、および（ｉｉｉ）ＰＭ対立遺伝子におけるＡＧＧピーク探索のための閾値として前に同定されたピークの高さを使用することによって、ＰＭ対立遺伝子におけるＡＧＧピークの高さに対して組み込まれた動的ＤＮＡ入力量制御が提供される、を含む、様々な技術的利点を提供する。より具体的には、ＰＭ対立遺伝子のＡＧＧピークサイズは、５５～９０リピート範囲のために非常に可変的であり、対応するＡＧＧピーク高さもまた劇的に変化し、これもまた可変量のＤＮＡ入力によって大きく影響される。より低いＤＮＡ入力は、正常な対立遺伝子においてより低いピーク高さをもたらし、逆もまた同様である。ＰＭ対立遺伝子におけるＡＧＧピークの固定ピーク高さ閾値スクリーニングを使用する代わりに、この動的閾値は、プロセスがＡＧＧピークをより正確に同定することを可能にする。
【0069】
最高ピークの基準を満たす初期ピークサイズ探索空間内にピークが見つかった場合、見つかったピークは初期ピークとして同定される。さらに、初期ピークの高さは、（ｉ）前のピーク高さ閾値の高さ、および（ｉｉ）一時的な前のピーク高さとして設定される（これは、二次ピークをどのピークと比較するかを決定するために二次ピークが見つかった場合に使用される）。この設定は、バックグラウンドまたはスタッター（偽陽性）ピークを呼び出すことを防止すること含む様々な技術的利点を提供する。別の対立遺伝子について初期ピークが同定されると（例えば、５５～９０の間のリピートの数を有するＰＭ対立遺伝子）、初期ピークに関連するピークデータが最終ＡＧＧデータセットから除去され得る。最終ＡＧＧデータセットの出力表からこの対立遺伝子に割り当てられているＡＧＧピークを除去した後、プロセスは、同じ対立遺伝子内の別の探索空間についてリピートするか、または別の対立遺伝子（例えば、別のＰＭ対立遺伝子）についての新しいプロセスを開始する。
【0070】
ブロック４５０において、初期ピークサイズ探索空間を使用して最終ＡＧＧデータセットが探索され、次の最高ピークの基準に基づいて初期ピークサイズ探索空間内の次の最高ピークまたは二次ピークが同定される。いくつかの例では、初期ピークサイズ探索空間内の次に最高ピークを同定するための基準は、（ｉ）二次ピークのピークサイズが、ブロック４４０で同定された初期ピークのピークサイズから二次ピーク閾値（例えば、７）より大きいかまたは小さいこと、（ｉｉ）二次ピークのサイズを初期の発見されたピークと比較すること、および二次ピークのピークサイズが初期ピークのピークサイズ未満である場合、二次ピークの高さは、ブロック４４６で同じ探索空間で呼び出される設定された前のピーク高さ閾値＊二次ＰＭピーク高さ閾値（いくつかの実施形態では、二次ＰＭピーク高さ閾値は８０％に設定される）よりも大きくあるべきである、または、二次ピークのピークサイズが初期ピークのピークサイズよりも大きい場合、二次ピークの高さは、ブロック４３２での前の探索空間からの設定された前のピーク高さ閾値＊二次ＰＭピーク高さ閾値（いくつかの実施形態では、二次ＰＭピーク高さ閾値は８０％に設定される）よりも大きくあるべきである、または（ｉｉｉ）それらの任意の組み合わせを含む。プロセスが初期ピークサイズ探索空間にある場合、閾値はまだ確立されていないので、使用される閾値は０である。初期ピークサイズ探索空間の後、前のピーク高さ閾値が既に確立される。初期ピークサイズ探索空間内の次の最高ピークまたは二次ピークを同定するための基準は、第１のピークが同定された後の同じ探索ウィンドウ内の追加のＡＧＧピークの欠落を回避することを含む様々な技術的利点を提供する。
【0071】
次の最高ピークの基準を満たすピークが初期ピークサイズ探索空間内で見つかった場合、ブロック４５４において、見つかったピークは二次ピークとして同定される。いくつかの例では、次の最高ピークを二次ピークとして同定するための基準を満たすピークが、初期ピークサイズ探索空間内に見出され、二次ピークのピークサイズが初期ピークのピークサイズよりも小さい場合、二次ピークの高さは前のピーク高さ閾値として設定される。この設定は、バックグラウンドまたはスタッター（偽陽性）ピークを呼び出すことを防止すること含む様々な技術的利点を提供する。別の対立遺伝子について二次ピークが同定されると（例えば、５５～９０の間のリピートの数を有するＰＭ対立遺伝子）、二次ピークに関連するピークデータが最終ＡＧＧデータセットから除去され得る。ブロック４５６で、別の対立遺伝子についての初期ピークおよび／または二次ピークが以下のように報告される（例えば、プロセッサは、ユーザがユーザインターフェース、記録目的のためのストレージデバイス、将来の処理のためのコンピューティングデバイスの別の他の構成要素、またはレポートのハードコピーのためのプリンタなどの出力デバイスを介して見るためにディスプレイに初期ピークおよび／または二次ピークを提供する）：（ｉ）ピークが見つからない場合（初期ピークおよび二次ピークがない）、ピークが見つからないことを報告する、（ｉｉ）一方のピークが見つかった場合（初期ピークまたは二次ピーク）、見つかったピークを報告する、または（ｉｉｉ）両方のピークが見つかった場合（初期ピークおよび二次ピーク）、アルゴリズムがＣＧＧの末端で始まるので降順でピークを報告する。例えば、初期ピークサイズ１＜二次ピークサイズ２の場合：ピーク２、ピーク１を返す；一方、二次ピークサイズ２＞初期ピークサイズ２の場合：ピーク１、ピーク２を返す。ＡＧＧ遺伝子型決定プロセスは、ブロック４６０において、別の対立遺伝子の残りのピークのそれぞれについて継続する。
【0072】
次の最高ピークの基準を満たすピークが初期ピークサイズ探索空間内に見つからない場合、ブロック４５８において、ピークサイズ調整閾値が、ブロック４１２で決定された予想ＡＧＧピークサイズ（または前に計算された新しい予想ＡＧＧピークサイズ）から減算されて、新しい予想ＡＧＧピークサイズが得られる。新しい予想ＡＧＧピークサイズは、ブロック４４０をリピートすることによって初期ピークを同定するために使用される。この調整は、初期ピークサイズ探索空間をシフト／拡大して、最終ＡＧＧデータセット内の初期ピークを見つけるのを助ける。いくつかの実施形態では、ピークサイズ調整閾値は、１５～５０ｂｐｓ（例えば、２４ｂｐｓ）である。
【0073】
ブロック４４０／４５０において対立遺伝子について初期ピークが同定されると、対立遺伝子（例えば、より多くのリピートの数を有する対立遺伝子）についてさらなるＡＧＧピークが同定され得る。ブロック４６０において、対立遺伝子について追加のピークが同定される。追加のピークを同定することは、ブロック４６２において、次の予想ＡＧＧピークサイズを得るために、ブロック４４０／４５０で見つかった初期ピークのピークサイズからピークサイズ調整閾値を減算することを含む。ブロック４６４において、次に予想ＡＧＧピークサイズに基づいて、対立遺伝子について次のピークサイズ探索空間（塩基対のピークサイズ探索空間）が決定される。次のピークサイズ探索空間は、次のピークサイズ範囲に基づいて決定されてもよい。いくつかの例では、次のピークサイズ範囲は、ブロック４４０／４５０で見出される初期ピークのピークサイズ付近の塩基対の所定量またはサイズ範囲調整閾値（＋／－）である。特定の例では、所定の量またはサイズ範囲調整閾値は、初期ピークのピークサイズの＋／－１２塩基対である。特定の例では、次のピークサイズ範囲の下端が第１の正常ピーク閾値未満である場合、次のピークサイズ範囲の下端を第１の正常ピーク閾値に設定する。
【0074】
第２の探索空間が決定されると、ブロック４６４において、次のピークサイズ探索空間を使用して最終ＡＧＧデータセットを探索して、最高ピークの基準に基づいて次のピークサイズ探索空間内の最高ピークを同定することができる。いくつかの例では、次のピークサイズ探索空間内の最高ピークを同定するための基準は、（ｉ）ピークサイズが最小ピークサイズ閾値（いくつかの実施形態では、最小ピークサイズ閾値が１３２塩基対に設定される）よりも大きいこと、（ｉｉ）ピーク高さが最小ピーク高さ閾値（いくつかの実施形態では、最小ピーク高さ閾値が２００ＲＦＵに設定される）よりも大きいこと、（ｉｉｉ）ピーク高さが最低正常高さ閾値（ブロック４２０または４３２で設定される）＊最小パーセンテージＰＭ閾値（いくつかの実施形態では、最小パーセンテージＰＭ閾値が１０％に設定される）よりも大きいこと、（ｉｖ）ピーク高さが前のピーク高さ閾値（ブロック４４６または４５４で設定される）＊二次ＰＭピーク高さパーセント閾値（例えば、８０％）よりも大きいこと、または（ｖ）それらの任意の組み合わせを含む。次のピークサイズ探索空間における最高ピークを同定するための基準は、（ｉ）最小ピークサイズ閾値が、リピートのないＰＣＲアンプリコンのサイズであり、偽ピークの呼び出しを防止するための基準として使用され得る、（ｉｉ）最小ピーク高さ閾値が、バックグラウンド低レベルピークの呼び出しを防止するために使用され得る、および（ｉｉｉ）ＰＭ対立遺伝子におけるＡＧＧピーク探索のための閾値として前に同定されたピークの高さを使用することによって、ＰＭ対立遺伝子におけるＡＧＧピークの高さに対して組み込まれた動的ＤＮＡ入力量制御が提供される、を含む、様々な技術的利点を提供する。
【0075】
最高ピークの基準を満たす次のピークサイズ探索空間内にピークが見つかった場合、ブロック４６８において、見つかったピークは追加のピークとして同定される。さらに、追加のピークのサイズは、一時的な前のピーク高さとして設定される（これは、二次ピークをどのピークと比較するかを決定するために二次ピークが見つかった場合に使用される）。別の対立遺伝子について追加のピークが同定されると、追加のピークに関連するピークデータが最終ＡＧＧデータセットから除去され得る。
【0076】
ブロック４７０において、次のピークサイズ探索空間を使用して最終ＡＧＧデータセットを探索して、次のピークサイズ探索空間内の二次ピークまたは次の最高ピークを同定する。いくつかの例では、次のピークサイズ探索空間内の二次ピークを同定するための基準は、（ｉ）二次ピークのピークサイズが、ブロック４６０で同定された追加のピークサイズのピークサイズから二次ピーク閾値（例えば、７）より大きいかまたは小さいこと、（ｉｉ）二次ピークのサイズを追加の発見されたピークと比較すること、および二次ピークのピークサイズが追加のピークのピークサイズ未満である場合、二次ピークの高さは、ブロック４６８で設定された一時的な前のピーク高さ＊二次ＰＭピーク高さ閾値（いくつかの実施形態では、二次ＰＭピーク高さ閾値は８０％に設定される）よりも大きくあるべきである、または二次ピークのピークサイズが追加のピークのピークサイズよりも大きい場合、二次ピークの高さは、ブロック４５４または４６８＊二次ＰＭピーク高さ閾値（いくつかの実施形態では８０％に設定された閾値に設定される）よりも大きくあるべきである、または（ｉｉｉ）それらの任意の組み合わせを含む。次のピークサイズ探索空間内の二次ピークまたは次の最高ピークを同定するための基準は、（ｉ）呼び出しバックグラウンドまたはスタッター（偽陽性）ピークを防止すること、および（ｉｉ）最初のピークが同定された後に同じ探索ウィンドウ内で追加のＡＧＧピークの欠落を回避することを含む様々な技術的利点を提供する。
【0077】
二次ピークの基準を満たすピークが第２の探索空間内で見つかった場合、見つかったピークは二次ピークとして同定される。いくつかの例では、次の最高ピークを二次ピークとして同定するための基準を満たすピークが、次のピークサイズ探索空間内で見出され、二次ピークのピークサイズが追加のピークのピークサイズよりも小さい場合、二次ピークの高さは前のピーク高さ閾値として設定される。この設定は、バックグラウンドまたはスタッター（偽陽性）ピークを呼び出すことを防止すること含む様々な技術的利点を提供する。別の対立遺伝子について二次ピークが同定されると（例えば、５５～９０の間のリピートの数を有するＰＭ対立遺伝子）、二次ピークに関連するピークデータが最終ＡＧＧデータセットから除去され得る。ブロック４５６で、別の対立遺伝子についての初期ピークおよび／または二次ピークが以下のように報告される（例えば、プロセッサは、ユーザがユーザインターフェース、記録目的のためのストレージデバイス、将来の処理のためのコンピューティングデバイスの別の他の構成要素、またはレポートのハードコピーのためのプリンタなどの出力デバイスを介して見るためにディスプレイに初期ピークおよび／または二次ピークを提供する）：（ｉ）ピークが見つからない場合（初期ピークおよび二次ピークがない）、ピークが見つからないことを報告する、（ｉｉ）一方のピークが見つかった場合（初期ピークまたは二次ピーク）、見つかったピークを報告する、または（ｉｉｉ）両方のピークが見つかった場合（初期ピークおよび二次ピーク）、アルゴリズムがＣＧＧの末端で始まるので降順でピークを報告する。例えば、初期ピークサイズ１＜二次ピークサイズ２の場合：ピーク２、ピーク１を返す；一方、二次ピークサイズ２＞初期ピークサイズ２の場合：ピーク１、ピーク２を返す。
【0078】
ブロック４７８において、最終ＡＧＧデータセットが追加のピーク（すなわち、最終ＡＧＧデータセットの出力表は、長い対立遺伝子についてより多くのピークを有するか）を求めて探索され続けるべきかどうかに関する決定が行われる。いくつかの実施形態では、６５未満のリピートサイズを有するＰＭ対立遺伝子について、最終ＡＧＧデータセットの探索を継続するかどうかの決定が、長い／ＰＭ対立遺伝子についてリピートなしのＰＣＲアンプリコンのサイズ限界（例えば、１３２ｂｐ）に達したかどうかに基づいて行われる。他の実施形態では、６５超のリピートサイズを有するＰＭ対立遺伝子について、最終ＡＧＧデータセットの探索を継続するかどうかの決定は、長い／ＰＭ対立遺伝子について、正常な／短い対立遺伝子に見られる最大サイズＡＧＧピークに達したかどうかに基づいて行われる。対立遺伝子についての最終ＡＧＧデータセットにおいてより多くのピークが存在すると決定された場合、ブロック４６０および４７０がリピートされる。ブロック４６０において、次の予想ＡＧＧピークサイズ（本質的に、第３、第４、第５などの予想ＡＧＧピークサイズ）を得るために、前に計算された次の予測ＡＧＧピークサイズからピークサイズ調整閾値が減算される。この調整は、最終ＡＧＧデータセット内の追加のピーク（単数または複数）を見つけるのを助けるために、追加のピークサイズ探索空間をシフト／拡大する。対立遺伝子（例えば、より多くのリピートの数を有する対立遺伝子）のすべてのピークが最終ＡＧＧデータセット内で同定されるまで、ブロック４６０および４７０をリピートする。対立遺伝子（例えば、最も少ないリピートの数を有する対立遺伝子）のすべてのピークが最終ＡＧＧデータセット内で同定されると、ブロック４８０において、最終ＡＧＧデータセットがさらなる対立遺伝子について探索され続けるべきかどうか（最終ＡＧＧデータセットの出力表は他の対立遺伝子のピークを有するか）に関する決定が行われる。より多くの対立遺伝子が存在すると決定された場合、ＡＧＧ遺伝子型決定プロセスは、残りの対立遺伝子のそれぞれについてブロック４４０に続く。対立遺伝子がそれ以上存在しないと決定された場合、プロセスはブロック４９０に続き、ブロック４１２～４７６で得られたＡＧＧ中断データに基づいて対立遺伝子を遺伝子型決定する。
ＡＧＧ遺伝子型フロー
ＡＧＧ遺伝子型フロー
【0079】
ブロック４９０において、対立遺伝子（例えば、正常な対立遺伝子またはＰＭ対立遺伝子）上の最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数が、ブロック４０２～４１０において同定されたＣＧＧリピートおよびブロック４１２～４８０において同定されたＡＧＧピークを使用して計算される。いくつかの実施形態では、対立遺伝子上の最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数を、式（２）を使用して計算する。
最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数（ＣＣＧ＃を使用）＝（（Ｐｎ－Ａ）／３）－１
式（２）
ここで、Ｐｎは、対立遺伝子上の最後のＡＧＧ中断（例えば、各対立遺伝子上の最小ＡＧＧ中断）に対応するピークサイズであり、ＡはリピートのないＰＣＲアンプリコンのサイズであり、いくつかの例では、ＰＣＲアンプリコンは１３２塩基対を有し、したがってＡ＝１３２であり、３は各ＣＧＧリピートに対する塩基対の数であり、１は単一のＡＧＧ中断を示す。最後のＡＧＧ中断の位置は、対立遺伝子の結果文字列を開始するために使用され得る（後方に構築）。ＡＧＧ（ＣＧＧ）ｎ－式中「ｎ」は、式（１）の結果である（すなわち、予想される第１のＡＧＧピークサイズ）。
最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数（ＣＣＧ＃を使用）＝（（Ｐｎ－Ａ）／３）－１
式（２）
ここで、Ｐｎは、対立遺伝子上の最後のＡＧＧ中断（例えば、各対立遺伝子上の最小ＡＧＧ中断）に対応するピークサイズであり、ＡはリピートのないＰＣＲアンプリコンのサイズであり、いくつかの例では、ＰＣＲアンプリコンは１３２塩基対を有し、したがってＡ＝１３２であり、３は各ＣＧＧリピートに対する塩基対の数であり、１は単一のＡＧＧ中断を示す。最後のＡＧＧ中断の位置は、対立遺伝子の結果文字列を開始するために使用され得る（後方に構築）。ＡＧＧ（ＣＧＧ）ｎ－式中「ｎ」は、式（１）の結果である（すなわち、予想される第１のＡＧＧピークサイズ）。
【0080】
その後、ブロック４１２～４８０で同定された残りのＡＧＧピークは、すべてが対立遺伝子について処理されるまで循環される。いくつかの実施形態では、（存在する場合）任意の２つの隣接するＡＧＧ中断によって分離されたＣＧＧリピートの数は、式（３）を使用して計算される。
任意の２つの隣接するＡＧＧ中断によって分離されたＣＧＧリピートの数（ＣＣＧ＃を使用）＝（（Ｐｎ－Ｐｎ－１）／３）－１
式（３）
ここで、ＰｎおよびＰｎ－１は、対立遺伝子上の隣接するＡＧＧ中断に対応するピークサイズであり、３は各ＣＧＧリピートに対する塩基対の数であり、１は単一のＡＧＧ中断を示す。任意の２つの隣接するＡＧＧ中断によって分離されたＣＧＧリピートの数を処理した後、結果文字列は、同じフォーマットの文字列の先頭に追加することによって更新されてもよい（逆方向に構築）。ＡＧＧ（ＣＧＧ）ｎ－式中「ｎ」は、式（１）の結果である（すなわち、予想される第１のＡＧＧピークサイズ）。
任意の２つの隣接するＡＧＧ中断によって分離されたＣＧＧリピートの数（ＣＣＧ＃を使用）＝（（Ｐｎ－Ｐｎ－１）／３）－１
式（３）
ここで、ＰｎおよびＰｎ－１は、対立遺伝子上の隣接するＡＧＧ中断に対応するピークサイズであり、３は各ＣＧＧリピートに対する塩基対の数であり、１は単一のＡＧＧ中断を示す。任意の２つの隣接するＡＧＧ中断によって分離されたＣＧＧリピートの数を処理した後、結果文字列は、同じフォーマットの文字列の先頭に追加することによって更新されてもよい（逆方向に構築）。ＡＧＧ（ＣＧＧ）ｎ－式中「ｎ」は、式（１）の結果である（すなわち、予想される第１のＡＧＧピークサイズ）。
【0081】
最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数は、（ｉ）式（２）で計算された最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数、（ｉｉ）式（３）で計算された隣接するＡＧＧ中断を分離するＣＧＧリピートの総数、および（ｉｉｉ）ブロック４１２～４８０で特定されたＡＧＧピークによって決定されたＡＧＧ中断の総数を、ＧＳ－ＰＣＲアッセイによって同定され、ブロック４０２～４１０で同定された対立遺伝子のＣＧＧリピートの総数から減算することによって計算することができる。最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数を処理した後、結果文字列は、同じフォーマットの文字列の先頭に追加することによって更新されてもよい（逆方向に構築）。ＡＧＧ（ＣＧＧ）ｎ－式中「ｎ」は、式（１）の結果である（すなわち、予想される第１のＡＧＧピークサイズ）。最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数を処理した後の最終結果文字列は、対立遺伝子のＡＧＧ遺伝子型である。ブロック４９０のプロセスは、試料について同定された各対立遺伝子についてリピートされ得る。
【0082】
任意選択のブロック４９２において、試料の各対立遺伝子について決定されたＡＧＧ遺伝子型に基づいて、伸長リスクスコアを計算することができる。リスクスコアは、表１に示すように、ＣＧＧリピートの数およびその中のＡＧＧ中断を使用して計算することができる。いくつかの例では、リスクスコアは、患者が遅発性神経変性疾患である脆弱Ｘ関連振戦／運動失調症候群（ＦＸＴＡＳ）もしくは脆弱Ｘ関連原発性卵巣機能不全（ＦＸＰＯＩ）を発症するリスク、または完全変異対立遺伝子を対象の子孫に伝達するリスクもしくはそれらの任意の組み合わせを同定する。特定の例では、５つを超えるＡＧＧ中断がある場合、５つの中断および５つを超える中断は一般に同じ臨床結果を有するので、リスクスコア（単数または複数）の計算のためにＡＧＧ中断の数を５に設定することができる。
【表1】
【0083】
ブロック４９４において、各対立遺伝子について決定されたＡＧＧ遺伝子型が出力され得る。各対立遺伝子および任意選択のリスクスコアについて決定されたＡＧＧ遺伝子型の出力は、エンドユーザに出力を提供すること、および／またはストレージデバイスに出力を記録すること（例えば、ユーザインターフェース上に出力を表示すること、および／またはデータベースの結果ファイルに出力を記憶すること）を含み得る。理解されるように、図４Ａ～図４Ｈに関して説明したＦＸＳ ＡＧＧ ＰＣＲアッセイプラットフォームおよび遺伝子型決定技術を使用したＡＧＧ遺伝子型決定のプロセスフローは、ユーザがヒューマンエラーなしにバッチですべての試料を並行して処理し、その結果をシームレスに、ターンアラウンド時間を大幅に短縮する報告概要に組み込むことを可能にする。報告概要に関して、ＡＧＧ遺伝子型および任意選択のリスクスコアは、母親がＰＭ伸長のリスクが高いと決定された場合、現在または将来の妊娠、例えば将来の妊娠のための家族計画のオプション（例えば、インビトロ診断（ＩＶＤ））を通して対象（例えば、患者）をどのように誘導するか、または現在の妊娠のためにオプションを提供する／準備するかについて臨床医／遺伝学専門家に知らせる。したがって、最後の工程として、臨床医／遺伝学専門家は、ＡＧＧ遺伝子型および任意選択のリスクスコアに基づいて対象または患者に助言を提供する。助言は、示されるように、その後の医療診断試験（例えば、ＩＶＤ）、ＦＸＤの遺伝パターンの詳細な議論、３つすべての症状の臨床所見（ＦＸＳ、ＦＸＰＯＩ、ＦＸＴＡＳ）、適切な場合の生殖オプション、子供および長期のリスクのある家族との会話に関するガイダンス、無症候性の子供を試験するための考慮事項、研究機会、家族の支援、ならびに医療、発達および示されるように心理学的提供者の紹介などの家族計画オプションを含み得る。
【0084】
図５は、本開示によるＦＸＳ ＡＧＧ ＰＣＲアッセイプラットフォームおよび遺伝子型決定技術を使用したＡＧＧ遺伝子型決定のためのシステムおよび方法での使用に適した例示的なコンピューティングデバイス５００を示す。例示的なコンピューティングデバイス５００は、１またはそれを超える通信バス５１５を使用してメモリ５１０およびコンピューティングデバイス５００の他の構成要素と通信するプロセッサ５０５を含む。プロセッサ５０５は、図３および図４Ａ～図４Ｈに関して上述した例示的プロセス３００または４００の一部または全部などの異なる例に従って、生データ内に存在するＡＧＧピークを探索および同定し、対立遺伝子のＡＧＧ遺伝子型を決定し、および／または患者のリスクスコアを決定するための１またはそれを超える方法を実行するために、メモリ５１０に記憶されたプロセッサ実行可能命令を実行するように構成される。この例では、メモリ５１０は、図２、図３、および図４Ａ～図４Ｈに関して上述したように、ＡＧＧピーク分析５２０およびＡＧＧ遺伝子型決定５２５を提供するプロセッサ実行可能命令を記憶する。
【0085】
コンピューティングデバイス５００は、この例では、ユーザ入力を受け入れるために、キーボード、マウス、タッチスクリーン、マイクロフォンなどの１またはそれを超えるユーザ入力デバイス５３０も含む。コンピューティングデバイス５００はまた、ユーザインターフェースなどのユーザに視覚的出力を提供するためのディスプレイ５３５を含む。コンピューティングデバイス５００はまた、通信インターフェース５４０を含む。いくつかの例では、通信インターフェース５４０は、ローカルエリアネットワーク（「ＬＡＮ」）、インターネットなどの広域ネットワーク（「ＷＡＮ」）、メトロポリタン・エリア・ネットワーク（「ＭＡＮ」）、ポイントツーポイントまたはピアツーピア接続などを含む１またはそれを超えるネットワークを使用した通信を可能にすることができる。他のデバイスとの通信は、任意の適切なネットワークプロトコルを使用して達成され得る。例えば、１つの適切なネットワークプロトコルは、インターネットプロトコル（「ＩＰ」）、伝送制御プロトコル（「ＴＣＰ」）、ユーザデータグラムプロトコル（「ＵＤＰ」）、またはＴＣＰ／ＩＰもしくはＵＤＰ／ＩＰなどのそれらの組み合わせを含むことができる。
【実施例】
【0086】
ＩＶ．実施例
様々な実施形態で実施されるシステムおよび方法は、以下の例を参照することによってよりよく理解され得る。
実施例１：ＦＲＡＸ ＡＧＧ中断ＰＣＲアッセイおよびＡＧＧ遺伝子型決定アルゴリズム
使用した検体および再現性
様々な実施形態で実施されるシステムおよび方法は、以下の例を参照することによってよりよく理解され得る。
実施例１：ＦＲＡＸ ＡＧＧ中断ＰＣＲアッセイおよびＡＧＧ遺伝子型決定アルゴリズム
使用した検体および再現性
【0087】
ＡＧＧ中断のために外部試験を行った５つの試料を含む第１の外部試験実験室で１０個の血液試料（Ｓ１～Ｓ１０）を抽出した。第１の臨床実験室で血液から抽出し、前に脆弱Ｘ ＰＣＲアッセイを行った５つの試料（Ｓ１１～Ｓ１５）。これらの５つの試料は、臨床試験のために受け取ることができる試料を表すと予想される。２３個の試料を抽出し、第２の外部試験実験室でＡＧＧ中断について試験した（Ｓ１６～Ｓ３８）。これらの２３個の試料のＡＧＧ遺伝子型を、この実施例での使用前にオペレータに盲検化した。上記の試料に加えて、自動ＦＲＡＸ ＡＧＧ ＰＣＲ遺伝子型決定アルゴリズム呼び出しを手動遺伝子型決定からのものと比較するために、アッセイ開発で使用した２５個の試料も試験した。アッセイ内再現性のために、既知のＡＧＧ遺伝子型結果を有する３つを含む５つの試料を３つ組で分析した。これらの試料はまた、アッセイ間再現性のために単回で２回のさらなる実行で試験され、そのうちの１回の実行は、異なるロットのＫＡＰＡ２Ｇ Ｒｏｂｕｓｔ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＥｎｚｙｍｅミックスおよびＡＧＧ ＰＣＲプライマーミックスを使用して別のオペレータによって行われた。ロットおよび有効期限情報を表２に列挙する。機器間の再現性を評価するために、サーマルサイクラーの２つのモデルおよび２つのＡＢＩ ３７３０ｘｌ機器も含めた。
【表2】
【0088】
ＦＲＡＸ ＡＧＧ遺伝子型決定アルゴリズムによる遺伝子型決定の呼び出しは、５つすべての試料で再現可能であった（表３）。特にＣＥによって分離された高度に反復性のＧＣリッチ領域については、実験的変動に起因して、反復間のわずかな遺伝子型の違いが予想されることに留意されたい。さらに、ＧＳ－ＰＣＲによって決定されたＣＧＧリピート数の分離能は、リピートの長さに応じて１～４リピートだけ変動することが前に確認された。したがって、固有の実行間変動を考えると、反復間の１～２回のリピート（すなわち、３～６塩基）の差は、正常もしくはＰＭ対立遺伝子について、またはＡＧＧによって中断されたＣＧＧの数について予想される変動の範囲内である。
分析感度および特異性
【表3-1】
【表3-2】
【0089】
分析感度および特異性を、検証されたプラットフォームを使用して外部試験実験室からＡＧＧ遺伝子型が前に報告された５つの血液ＤＮＡ試料（試料Ｓ１～Ｓ５）を使用して最初に評価した。ＡＧＧ ＰＣＲ産物のＣＥ電気泳動図を図６Ａおよび図６Ｂに示す。外部実験室から得られたＡＧＧ遺伝子型およびＦＲＡＸ ＡＧＧ ＰＣＲアッセイを表４に列挙する。すべての対照が合格し、偽陽性も偽陰性も呼び出されなかった。ＦＲＡＸ ＡＧＧ ＰＣＲアッセイは、予想された結果と同じ数のＡＧＧ中断をすべての試料において同定し、それらのうちの４つは一致した遺伝子型を示した（表４）。前述のように、この実施例からの結果と外部試験からの結果との間の１～２リピートによるＡＧＧ中断の位置および／または総リピート数の差は、予想通りであり、一致していると考えられた。
【表4】
【0090】
試料Ｓ２について、ＦＲＡＸ ＡＧＧ ＰＣＲアッセイによって同定されたＡＧＧ中断の総数は、予想された結果と一致した。しかしながら、ＡＧＧ中断の対立遺伝子フェージングは、外部実験室の結果と一致しなかった（表３）。外部実験室による試験では、正常な対立遺伝子（対立遺伝子１）に対して１つだけ中断が割り当てられたが、ＦＲＡＸ ＡＧＧ ＰＣＲアッセイでは、２つのＡＧＧ特異的ピークが同定された（１５９および１８９ｂｐ、図６Ａ）。注目すべきことに、その両方がそれらの正常な対立遺伝子において２９の総リピートを有し、試料Ｓ２と同じサイズのＡＧＧピークを有する他の２つの試料は、予想される結果と比較した場合、２つのＡＧＧ中断について一致していた（図６Ａおよび図６Ｂ、試料Ｓ２～Ｓ４）。上述のように、ＦＲＡＸ ＡＧＧ ＰＣＲ遺伝子型決定アルゴリズムは、最初にＡＧＧピークを正常な対立遺伝子に割り当てるために最初に開発されたので、試料Ｓ２について観察された遺伝子型決定の違いは、どの対立遺伝子にＡＧＧピークが最初に割り当てられるかに起因する可能性がある。
【0091】
遺伝子型決定の不一致の問題を解決するために、２つのアプローチが使用される。ＦＲＡＸ ＰＣＲアッセイの一部として、ＴＲＰ－ＰＣＲアッセイは、ＣＧＧリピート領域を増幅するためにＧＳプライマーと対になったＣＧＧリピートプライマーを使用することによって、拡大されたＦＲＡＸ対立遺伝子についてスクリーニングする。ＡＧＧ中断の存在下では、ＣＧＧリピートプライマーの標的配列に対する親和性が低下し、それによってＰＣＲ効率が低下し、ＣＥ電気泳動図における「ディップ」が生じる（図７Ａ）。一方の対立遺伝子が他方よりも多くのリピートを有する場合（例えば、ＰＭ対正常な対立遺伝子）、またはＡＧＧ中断が両方の対立遺伝子において同じ位置で一致する場合、これらのディップのシグナル強度はベースラインに近いであろう。したがって、試料Ｓ２について、正常な対立遺伝子に２つのＡＧＧ中断があった場合、ＴＲＰ－ＰＣＲ電気泳動図は、正常な対立遺伝子のリピート範囲の中断に対応する２つのＡＧＧディップを示す。
【0092】
図７Ａに示すように、ＴＲＰ－ＰＣＲの結果は、試料Ｓ２のＦＲＡＸ ＡＧＧ ＰＣＲアッセイのＡＧＧフェージング結果を支持する。試料Ｓ３およびＳ４についても同様のプロファイルが観察された。興味深いことに、さらに詳しく調べると、Ｓ２についての正常な対立遺伝子におけるＡＧＧディップのうちの１つについてのシグナル強度が、ベースラインレベル付近に低下したことが認められ、ＡＧＧ中断が、おそらく両方の対立遺伝子において同じ位置に存在したことが示された（Ｓ２パネルにおける１８９ｂｐのＡＧＧディップ、図７Ａ）。これを確認するために、正常およびＰＭ対立遺伝子を増幅し、ゲル精製し、ＦＲＡＸ ＡＧＧ ＰＣＲアッセイによって分析して、各対立遺伝子上のＡＧＧ中断の数を別々に決定した。予想通り、ＦＲＡＸ ＡＧＧ ＰＣＲ ＣＥ電気泳動図は、正常な対立遺伝子では２つのＡＧＧを、ＰＭ対立遺伝子では４つのＡＧＧを明確に同定した。重要なことに、ＦＲＡＸ ＡＧＧ ＰＣＲアッセイも外部の実験室試験からの結果も、両方の対立遺伝子における重複したＡＧＧ中断を同定しなかったが、この差は伸長のリスクスコアを変化させなかったことは注目に値する（＜１％、表１を参照されたい）。
【0093】
ＦＲＡＸ ＡＧＧ ＰＣＲアッセイおよびＦＲＡＸ ＡＧＧ ＰＣＲ遺伝子型決定アルゴリズムの分析感度、特異性および精度をさらに評価するために、外部実験室からの既知のＡＧＧ遺伝子型のさらなる２３個の試料を反復において試験した（表５）。試験前に試料をオペレータに匿名化し、すべての呼び出しを手動でＦＲＡＸ ＡＧＧ ＰＣＲ遺伝子型決定アルゴリズムを用いて分析した。
【表5-1】
【表5-2】
【表5-3】
【表5-4】
【0094】
表５に示すように、少なくとも１つのＡＧＧ中断がすべての試料で検出され、ＦＲＡＸ ＡＧＧ ＰＣＲアッセイからのＡＧＧ遺伝子型呼び出しは、２３個の試料のうち２１個で一致した。対照は失敗せず、偽陰性または偽陽性の呼び出しは行われなかった。ＰＭ対立遺伝子におけるリピートの数が、ＦＲＡＸ ＡＧＧ ＰＣＲ遺伝子型決定アルゴリズムについて指定された９０リピート限界を超えたので、試料Ｓ２５およびＳ３７は、ＦＲＡＸ ＡＧＧ ＰＣＲアッセイによって遺伝子型決定されなかったが、正常な対立遺伝子あたりのＡＧＧ中断の数は、予想された結果と一致した。
【0095】
ＦＲＡＸ ＡＧＧ ＰＣＲアッセイは、両方の対立遺伝子における同じ位置でのＡＧＧ中断、または対立遺伝子が中断のために割り当てられた順序のいずれかによって引き起こされた可能性が高い試料Ｓ１７およびＳ２３についての予想される結果と一致しなかった。試料Ｓ１７では、ＰＭ対立遺伝子におけるＡＧＧ中断についての予想結果は、６つであったが、ＦＲＡＸ ＡＧＧ ＰＣＲアッセイは、５つのＡＧＧを同定した（表５および図８Ａ）。上記の試料Ｓ２と同様に、ＴＲＰ－ＰＣＲ ＣＥデータのレビューは、正常な対立遺伝子サイズ範囲のＡＧＧディップの１つが、正常な対立遺伝子と前変異対立遺伝子の両方の同じ位置に潜在的に位置し得ることを示した（１５９ｂｐ ＡＧＧディップ、図８Ｂ）。ゲル精製された正常およびＰＭ対立遺伝子ＰＣＲ産物を使用するＦＲＡＸ ＡＧＧ ＰＣＲは、１５９ｂｐピークによって表されるＡＧＧ中断が両方の対立遺伝子で発生したことをさらに確認した（図８Ｃ）。
【0096】
試料Ｓ２３の場合、１５９ｂｐのＡＧＧ ＰＣＲピークによって表されるＡＧＧ中断は、１５９ｂｐのＡＧＧ中断からの約３０ｂｐまたは約１０リピートの両方である１８６ｂｐおよび１９２ｂｐの２つの近接したＡＧＧピークに基づいて、正常またはＰＭ対立遺伝子のいずれかに割り当てることができた（図９Ａ）。外部実験室では、正常およびＰＭ対立遺伝子にそれぞれ２および５のＡＧＧ中断が割り当てられたが、ＦＲＡＸ ＡＧＧ ＰＣＲ遺伝子型決定アルゴリズムは、ＡＧＧ中断ピークをより短い対立遺伝子に最初に割り当てるように開発されたので、３つのＡＧＧを正常な対立遺伝子に割り当て、４つのＡＧＧを前変異対立遺伝子に割り当てた（表５および図９Ａ）。ＴＲＰ－ＰＣＲ分析は、１５９ｂｐピークに対応するＡＧＧ中断が１つのみであること、およびそれが正常またはＰＭ対立遺伝子のいずれかに位置し得ることを示した（図９Ｂ）。ＦＲＡＸ ＡＧＧ ＰＣＲによる各対立遺伝子の分析は、外部試験実験室からの遺伝子型と一致して、正常な対立遺伝子およびＰＭ対立遺伝子における２および５つのＡＧＧ中断をそれぞれ明確に示した（図９Ｃ）。
【0097】
まとめると、ＦＲＡＸ ＡＧＧ ＰＣＲアッセイは、２８個の試料のうち２７個のＡＧＧ中断の総数について一致した。予想される結果とＡＧＧの数に差があった１つの試料（Ｓ１７）は、外部試験からのものと比較して、ＦＲＡＸ ＡＧＧ ＰＣＲ遺伝子型決定アルゴリズムによって割り当てられるＡＧＧピークデータの順序に起因する可能性が最も高かった。さらに、ＡＧＧ中断が正常およびＰＭ対立遺伝子の両方において同じ位置で起こる場合、ＦＲＡＸ ＡＧＧ ＰＣＲアッセイと外部実験室試験の両方で限界があることも同定された。ＣＥおよびＧｅｎｅＭａｐｐｅｒが１つのＡＧＧ ＰＣＲピークのみを検出および出力することを考えると、これは驚くべきことではなかった。しかし、表１に示すように、中断の数が２またはそれを超える、かつリピートサイズが６５未満である場合、この差は伸長リスクスコアに影響しない。６５超リピートおよび少なくとも１つのＡＧＧ中断の場合、遺伝子型は一致していた。これらのより長いリピートにおける中断に対応するＡＧＧ ＰＣＲ断片は、ＦＲＡＸ ＡＧＧ ＰＣＲ遺伝子型決定アルゴリズムによる明確な対立遺伝子フェージングを可能にする正常な対立遺伝子におけるものよりもはるかに大きい。
ＦＲＡＸ ＡＧＧ ＰＣＲ遺伝子型決定アルゴリズム試験
ＦＲＡＸ ＡＧＧ ＰＣＲ遺伝子型決定アルゴリズム試験
【0098】
ＦＲＡＸ ＡＧＧ遺伝子型決定アルゴリズムからの結果は、この例で実行された３８個の試料に基づく手動遺伝子型決定分析からの結果と１００％一致した。一致をさらに試験するために、アッセイ開発中に使用された２５個の試料も手動およびＦＲＡＸ ＡＧＧ遺伝子型決定アルゴリズムによって遺伝子型決定し、結果は、２つの方法の間で１００％一致した。アルゴリズムは、遺伝子型決定のための手動分析と同等に機能しただけでなく、入力されたＣＥデータの質が変動したか、または遺伝子型出力が正常範囲外である任意の試料を同定し、それらを「手動レビュー」のためのフラグで示すのにも良好に機能した。
【0099】
理解されるように、試験基準（例えば、５５～９０の総リピートの範囲におけるＰＭ対立遺伝子を有する女性の試料）を満たすが、ＡＧＧ中断を含まない試料に遭遇することが可能である。例えば、試料の正常な対立遺伝子は、２１の総リピートを有し、ＡＧＧ中断を含まない場合がある。そのＰＭ対立遺伝子もまた、試料Ｓ１またはＳ４と同様に、ＡＧＧを有しない場合がある（表４）。ＡＧＧ ＰＣＲ産物の欠如は、低いアッセイパフォーマンスと区別することが困難であり得る。正確な呼び出しを確実にするために、アッセイをリピートし、「ＡＧＧなし」の結果を確認することに加えて、試料のＦＲＡＸ ＴＲＰ－ＰＣＲアッセイＣＥ電気泳動図もレビューされ得る。図７Ａ、図８Ｂおよび図９Ｂで観察されるものとは対照的に、信号の急激な低下なしにＣＧＧスタッターピーク高さの滑らかで段階的な減少は、「ＡＧＧなし」呼び出しをサポートする（図１０）。典型的には女性のＰＭ対立遺伝子キャリアのみが試験されるであろうことを考えると、ＡＧＧ中断のない試料に遭遇しなかったアッセイ開発および検証中に試験された合計約９５個の試料に基づいて、ＡＧＧ中断を含まない試料の可能性はまれであろう。
結論
結論
【0100】
ＦＲＡＸ ＡＧＧ中断ＰＣＲアッセイの技術的パフォーマンスは、ＡＧＧ特異的ＰＣＲ産物の生成、およびＦＲＡＸ ＡＧＧ遺伝子型決定アルゴリズムによるＡＧＧ遺伝子型の自動化された結果について、再現性があり、ロバストであると決定された。
【0101】
既知のＡＧＧ遺伝子型を有する２８個の試料のうち、２７個が予想される結果と一致した。１つの試料について、ＡＧＧ中断の総数は予想される数と一致したが、ＡＧＧ遺伝子型は、ＡＧＧがＦＲＡＸ ＡＧＧ遺伝子型決定アルゴリズムによって割り当てられた対立遺伝子の順序のために異なっていた。しかし、この差は、この試料の最終リスクスコアに臨床的影響を及ぼさなかったであろう。アッセイ間およびアッセイ内再現性はまた、既知のＡＧＧ遺伝子型を有する３つの試料を含む５つすべての試料のＡＧＧ遺伝子型決定について１００％であった。ＦＲＡＸ ＡＧＧ中断ＰＣＲアッセイは、血液検体から抽出された１０～１６０ｎｇの入力ＤＮＡに耐えることができ、アッセイパフォーマンスは、血液検体から抽出されたｇＤＮＡに対してロバストなままであった。さらに、ＦＲＡＸ ＡＧＧ遺伝子型決定アルゴリズムは、ＡＧＧ特異的ピークを同定し、試験したすべての試料についてＡＧＧ遺伝子型を決定する際の手動遺伝子型決定分析と１００％一致した。
Ｖ．さらなる考察
Ｖ．さらなる考察
【0102】
上記の説明では、実施形態の完全な理解を提供するために具体的な詳細が示されている。しかしながら、これらの具体的な詳細なしで実施形態を実施することができることが理解される。例えば、実施形態を不必要に詳細に不明瞭にしないために、回路をブロック図に示すことができる。他の例では、実施形態を不明瞭にすることを避けるために、周知の回路、プロセス、アルゴリズム、構造、および技術を不必要な詳細なしで示すことができる。
【0103】
上述した技術、ブロック、工程、および手段の実装は、様々な方法で行うことができる。例えば、これらの技法、ブロック、工程、および手段は、ハードウェア、ソフトウェア、またはそれらの組み合わせで実施することができる。ハードウェア実装の場合、処理ユニットは、１またはそれを超える特定用途向け集積回路（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｃｉｒｃｕｉｔ：ＡＳＩＣ）、デジタル信号プロセッサ（ｄｉｇｉｔａｌ ｓｉｇｎａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ：ＤＳＰ）、デジタル信号処理デバイス（ｄｉｇｉｔａｌ ｓｉｇｎａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｄｅｖｉｃｅ：ＤＳＰＤ）、プログラマブルロジックデバイス（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｌｏｇｉｃ ｄｅｖｉｃｅ：ＰＬＤ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ｆｉｅｌｄ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｇａｔｅ ａｒｒａｙ：ＦＰＧＡ）、プロセッサ、コントローラ、マイクロコントローラ、マイクロプロセッサ、上述した機能を実行するように設計された他の電子ユニット、および／またはそれらの組み合わせ内で実装され得る。
【0104】
また、実施形態は、フローチャート、フロー図、データフロー図、構造図、またはブロック図として示されるプロセスとして説明することができることに留意されたい。フローチャートは、動作を順次プロセスとして説明することができるが、動作の多くは並行してまたは同時に実行することができる。さらに、動作の順序を並べ替えることができる。プロセスは、その動作が完了したときに終了するが、図に含まれていない追加の工程を有することができる。プロセスは、方法、機能、手順、サブルーチン、サブプログラムなどに対応することができる。プロセスが関数に対応する場合、その終了は、呼び出し関数またはメイン関数への関数の返しに対応する。
【0105】
さらに、実施形態は、ハードウェア、ソフトウェア、スクリプト言語、ファームウェア、ミドルウェア、マイクロコード、ハードウェア記述言語、および／またはそれらの任意の組み合わせによって実施することができる。ソフトウェア、ファームウェア、ミドルウェア、スクリプト言語、および／またはマイクロコードで実装される場合、必要なタスクを実行するためのプログラムコードまたはコードセグメントは、記憶媒体などの機械可読媒体に記憶することができる。コードセグメントまたは機械実行可能命令は、手順、関数、サブプログラム、プログラム、ルーチン、サブルーチン、モジュール、ソフトウェアパッケージ、スクリプト、クラス、または命令、データ構造、および／もしくはプログラム文の任意の組み合わせを表すことができる。コードセグメントは、情報、データ、引数、パラメータ、ならびに／またはメモリ内容を渡すおよび／もしくは受け取ることによって、別のコードセグメントまたはハードウェア回路に結合することができる。情報、引数、パラメータ、データなどは、メモリ共有、メッセージパッシング、チケットパッシング、ネットワーク送信などを含む任意の適切な手段を介して渡す、転送する、または送信することができる。
【0106】
ファームウェアおよび／またはソフトウェア実装の場合、方法論は、本明細書に記載の機能を実行するモジュール（例えば、手順、機能など）で実装することができる。本明細書に記載の方法論を実施する際に、命令を実体的に具現化する任意の機械可読媒体を使用することができる。例えば、ソフトウェアコードをメモリに記憶することができる。メモリは、プロセッサ内またはプロセッサの外部に実装することができる。本明細書で使用される場合、「メモリ」という用語は、任意のタイプの長期、短期、揮発性、不揮発性、または他の記憶媒体を指し、任意の特定のタイプのメモリまたはメモリの数、またはメモリが記憶される媒体のタイプに限定されるものではない。
【0107】
さらに、本明細書で開示されるように、「記憶媒体」、「記憶」または「メモリ」という用語は、読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、磁気ＲＡＭ、コアメモリ、磁気ディスク記憶媒体、光記憶媒体、フラッシュメモリデバイス、および／または情報を記憶するための他の機械可読媒体を含む、データを記憶するための１またはそれを超えるメモリを表すことができる。「機械可読媒体」という用語は、携帯型もしくは固定型ストレージデバイス、光ストレージデバイス、無線チャネル、ならびに／または命令および／もしくはデータを含むもしくは搬送する記憶することができる様々な他の記憶媒体を含むが、これらに限定されない。
【0108】
本開示の原理は、特定の装置および方法に関連して上述されているが、この説明は、例としてのみ行われ、本開示の範囲に対する限定としてではないことを明確に理解されたい。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図4G】
【図4H】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7A-1】
【図7A-2】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10】
【国際調査報告】