特表 2023-513035 ｐＨ感応性ＦＣ変異体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-30

(54)【発明の名称】ｐＨ感応性ＦＣ変異体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20230323BHJP

   C12N 15/10 20060101ALI20230323BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20230323BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230323BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20230323BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230323BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230323BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230323BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230323BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C12N15/10 200P

C07K16/00 ZNA

C12N15/63 Z

C07K14/47

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022546354

(86)(22)【出願日】2021-01-29

(85)【翻訳文提出日】2022-09-29

(86)【国際出願番号】 KR2021001237

(87)【国際公開番号】W WO2021154046

(87)【国際公開日】2021-08-05

(31)【優先権主張番号】10-2020-0010336

(32)【優先日】2020-01-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2020-0148372

(32)【優先日】2020-11-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2020-0148373

(32)【優先日】2020-11-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518107501

【氏名又は名称】コリア ユニバーシティ リサーチ アンド ビジネス ファウンデーション

【氏名又は名称原語表記】ＫＯＲＥＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＡＮＤ ＢＵＳＩＮＥＳＳ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ

【住所又は居所原語表記】１４５，Ａｎａｍ－ｒｏ，Ｓｅｏｎｇｂｕｋ－ｇｕ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ

(74)【代理人】

【識別番号】100091683

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼川 俊雄

(74)【代理人】

【識別番号】100179316

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 寛奈

(72)【発明者】

【氏名】ジョン，サン－テク

(72)【発明者】

【氏名】コ，サン－ファン

(72)【発明者】

【氏名】ジョ，ミ－ギョン

【テーマコード（参考）】

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC15

4B065BA02

4B065CA44

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA42

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、ｐＨ依存的にＦｃＲｎに結合及び解離することにより半減期が延長されたＦｃ変異体に関し、本発明のＦｃ変異体は、従来の血中半減期延長Ｆｃ変異体よりも優れたｐＨ選択的ＦｃＲｎ結合及び解離能力を示し、血中半減期が最大化された変異体である。よって、体内で短い半減期及び維持時間を有する数多くのペプチド医薬品治療剤に結合し、延長された血中半減期により、長時間にわたって薬効を発揮させる。また、それにより、抗体及びバイオ医薬の投与用量及び頻度を画期的に減少させることができ、新薬開発のコストを減少させることができ、新薬開発の可能性を大幅に向上させることができるという効果がある。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

野生型免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）のＦｃ領域に、カバットナンバリングシステム（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）によるＬ３０９Ｙ、Ｑ３１１Ｍ及びＱ３１１Ｗからなる群から選択されるアミノ酸残基の改変を含む、Ｆｃ変異体。

【請求項2】

前記Ｆｃ変異体は、Ｌ３０９Ｙ及びＭ４２８Ｌ、Ｌ３０９Ｙ及びＱ３１１Ｍ、またはＬ３０９Ｙ、Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌのアミノ酸残基の改変を含む、請求項１に記載のＦｃ変異体。

【請求項3】

前記Ｆｃ変異体は、１）Ｌ３０９Ｙ及びＱ３１１Ｍ、２）Ｌ３０９Ｅ及びＱ３１１Ｍ、３）Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌ、４）Ｌ３０９Ｅ、Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌ、または５）Ｌ３０９Ｙ、Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌのアミノ酸残基の改変を含む、請求項１に記載のＦｃ変異体。

【請求項4】

前記Ｆｃ変異体は、１）Ｌ３０９Ｅ及びＱ３１１Ｗ、２）Ｑ３１１Ｗ及びＭ４２８Ｌ、または３）Ｌ３０９Ｅ、Ｑ３１１Ｗ及びＭ４２８Ｌのアミノ酸残基の改変を含む、請求項１に記載のＦｃ変異体。

【請求項5】

免疫グロブリンがＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ及びＩｇＧからなる群から選択される、請求項１に記載のＦｃ変異体。

【請求項6】

ｐＨ７．０～７．８において野生型免疫グロブリンＦｃ領域に比べてＦｃＲｎに対す結合親和性が低い、請求項１に記載のＦｃ変異体。

【請求項7】

ｐＨ５．６～６．５において野生型免疫グロブリンＦｃ領域に比べてＦｃＲｎに対する結合親和性が高い、請求項１に記載のＦｃ変異体。

【請求項8】

請求項１に記載のＦｃ変異体を含む、ポリペプチド。

【請求項9】

野生型と比較して生体内半減期（Ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ）が延長された、請求項８に記載のポリペプチド。

【請求項10】

請求項１に記載のＦｃ変異体を含む、抗体。

【請求項11】

野生型と比較して生体内半減期が延長された、請求項１０に記載の抗体。

【請求項12】

請求項１に記載のＦｃ変異体、請求項８に記載のポリペプチド、請求項１０に記載の抗体をコードする、核酸分子。

【請求項13】

請求項１２に記載の核酸分子を含む、ベクター。

【請求項14】

請求項１３に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項15】

請求項１に記載のＦｃ変異体、非ペプチド性重合体及び生理活性ポリペプチドが共有結合により連結されて生体内半減期が延長された、タンパク質結合体。

【請求項16】

生理活性ポリペプチドがヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキン、インターロイキン可溶性受容体、ＴＮＦ可溶性受容体、グルコセレブロシダーゼ、マクロファージ活性化因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α１－アンチトリプシン、アルブミン、アポリポタンパク質Ｅ、エリスロポエチン、高グリコシル化エリスロポエチン、血液因子ＶＩＩ、血液因子ＶＩＩＩ、血液因子ＩＸ、プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、タンパク質Ｃ、Ｃ反応性タンパク質、レニン阻害剤、コラゲナーゼ阻害剤、スーパーオキシドディスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、表皮成長因子、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、インスリン、インスリン誘導体、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド－１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ Ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ－１）、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、結合組織活性化因子、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン放出ホルモン、神経成長因子、副甲状腺ホルモン、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、受容体類、受容体拮抗物質、細胞表面抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント類及びウイルス由来ワクチン抗原からなる群から選択される、請求項１５に記載のタンパク質結合体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ｐＨ依存的にＦｃＲｎに結合及び解離することにより半減期が延長されたＦｃ変異体に関する。

【背景技術】

【0002】

タンパク質治療剤は、疾病ターゲットに対して特異性が非常に高く、副作用や毒性が少ないので、非特異的な低分子化合物治療剤を迅速に代替し、臨床で広く用いられており、現在臨床に用いられているタンパク質治療剤においては、抗体治療剤と抗体Ｆｃ領域が融合したＦｃ融合タンパク質治療剤が主流をなしている。

【0003】

治療用抗体は、従来の低分子薬物に比べてターゲットに対して特異性が非常に高く、生体毒性が低く、副作用が少ないだけでなく、約３週間という優れた血中半減期を有するので、最も効果的な癌治療方法の一つとされている。実際に、全世界の巨大製薬会社や研究所において、癌の原因因子をはじめとする癌細胞に特異的に結合して効果的に除去する治療用抗体の研究開発が盛んに行われている。治療用抗体医薬品の開発企業としては、ロシュ、アムジェン、ジョンソン・エンド・ジョンソン、アボット、ＢＭＳなどが主に挙げられ、特にロシュは、抗癌治療目的のハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）、リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）などが代表的な商品であり、この３つの治療用抗体で２０１２年の世界市場において約１９５億ドルの売上を達成するなど、大きな利潤を創出しているだけでなく、世界の抗体医薬品市場をリードしている。レミケード（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）を開発したジョンソン・エンド・ジョンソンも、売上の増加により世界抗体市場において急成長を遂げており、アボットやＢＭＳなどの製薬企業も、開発最終段階の治療用抗体を多数保有していることが知られている。その結果として、低分子医薬品が主導権を握っていた世界製薬市場において、疾病ターゲットに対して特異的で、副作用の少ない治療用抗体を含むバイオ医薬品がそれを急速に代替しつつある。

【0004】

しかしながら、抗体及びタンパク質治療剤は、経口投与すると、消化器による吸収率が非常に低く、消化管の内部で変性しやすく、タンパク質分解酵素により容易に分解され、バイオアベイラビリティが非常に低いので、静脈注射や皮下注射で投与しなければならず、顕著な治療効果を得るためには頻繁な接種が必要であるが、血液内での安定性に非常に優れるタンパク質治療剤の一つである抗体においても、治療効果を得るためには高用量の治療用抗体（２～８ｍｇ／体重ｋｇ）を２～３週間に１回は投与しなければならない。このような注射による頻繁な薬物投与は、患者に大きな痛みや不便をもたらし、浮腫、感染などの局所的及び全身的副作用をもたらすという問題がある。前記問題を解決するためには、当該治療用抗体及びタンパク質治療剤の血液中の半減期を画期的に改善しなければならない。

【0005】

免疫グロブリン（抗体）の生体内半減期は、ＦｃＲｎに対するＦｃの結合によりもたらされることが報告されている。免疫グロブリンのＦｃ断片は、非特異的細胞吸収作用を用いて内皮細胞により摂取（ｕｐｔａｋｅ）され、次いで酸性エンドソーム内に導入される。ＦｃＲｎは、エンドソーム内の酸性ｐＨ（＜６．５）下で免疫グロブリンに結合し、血流内の塩基性ｐＨ（＞７．４）下で免疫グロブリンを放出する。よって、ＦｃＲｎは、リソソーム退化経路から免疫グロブリンを回収する。血清免疫グロブリンの数値が減少すると、より多くのＦｃＲｎ分子を免疫グロブリン結合に用いることができ、免疫グロブリンの量を増加させることができる。反対に、血清免疫グロブリンの数値が上昇すると、ＦｃＲｎが飽和し、退化して細胞吸収される免疫グロブリンの比率を増加させることができる（非特許文献１）。すなわち、抗体の血中半減期と持続性は、抗体のＦｃ部位とＩｇＧ結合リガンドの一つであるＦｃＲｎ（ｎｅｏｎａｔａｌ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の結合に大きく依存する。免疫白血球または血清補体分子を集め、癌細胞や感染した細胞などの損傷した細胞が除去されるように働く抗体のＦｃ部位はＣγ２とＣγ３ドメイン間の部位であり、新生（ｎｅｏｎａｔａｌ）受容体ＦｃＲｎとの相互作用を媒介し、その結合は、エンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）から血流（ｂｌｏｏｄｓｔｒｅａｍ）に細胞移入した抗体を再循環させる（非特許文献１，２）。この過程は、全長分子の巨大なサイズにより、腎臓濾過（ｋｉｄｎｅｙ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）の阻止に関連し、１週間～３週間の範囲の有利な抗体血清半減期（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｅｒｕｍ ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ）を有する。また、ＦｃＲｎに対するＦｃの結合は、抗体輸送においても重要な役割を果たす。よって、Ｆｃ部位は、細胞内輸送（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）及びリサイクル機序により抗体を循環させ、延長された血清持続性（ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｓｅｒｕｍ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ）を維持する上で必須の役割を果たす。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】韓国公開特許第１０－２０１８－０１１３７１７号公報

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｇｈｅｔｉｅ及びＷａｒｄ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：７３９－７６６，２０００

【非特許文献2】Ｒａｇｈａｖａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １２：１８１－２２０

【非特許文献3】Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０：２３６１－２３７０，１９８１

【非特許文献4】Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，１９９１

【非特許文献5】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ

【非特許文献6】Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８

【非特許文献7】Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，ＮＹ，１９９４

【非特許文献8】Ｈａｒｄｍａｎ ａｎｄ Ｌｉｍｂｉｒｄ，ｅｄｓ．，Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ ｅｄ．（２００１），Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ

【非特許文献9】Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄ．（１９９０），Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．

【非特許文献10】Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ，１３ｔｈ ｅｄ．，Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．Ｉｎｃ．

【非特許文献11】Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ，１８ｔｈ，１９９０）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、抗体の血中半減期を延長させるために、細胞内エンドソーム（弱酸性ｐＨ条件）におけるＦｃＲｎに対する結合力を増加させ、血液（中性ｐＨ条件）におけるＦｃＲｎに対する結合力を減少させる突然変異を導入した抗体を開発することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

前記課題を解決するために、本発明は、ｐＨ感応性Ｆｃ変異体を提供する。

【0010】

また、本発明は、ｐＨ感応性Ｆｃ変異体を含むポリペプチドを提供する。

【0011】

さらに、本発明は、ｐＨ感応性Ｆｃ変異体を含む抗体を提供する。

【0012】

さらに、本発明は、ｐＨ感応性Ｆｃ変異体、ポリペプチドまたは抗体をコードする核酸分子を提供する。

【0013】

さらに、本発明は、前記核酸分子を含むベクターを提供する。

【0014】

さらに、本発明は、前記ベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0015】

さらに、本発明は、生体内半減期が延長されたタンパク質結合体を提供する。

【発明の効果】

【0016】

本発明のＦｃ変異体は、従来の血中半減期延長Ｆｃ変異体よりも優れたｐＨ選択的ＦｃＲｎ結合及び解離能力を示し、血中半減期が最大化された変異体である。体内で短い半減期及び維持時間を有する数多くのペプチド医薬品治療剤に結合し、延長された血中半減期により、長時間にわたって薬効を発揮させる。また、それにより、抗体及びバイオ医薬の投与用量及び頻度を画期的に減少させることができ、新薬開発のコストを減少させることができ、新薬開発の可能性を大幅に向上させることができるという効果がある。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌ Ｆｃ変異体を含むトラスツズマブのｐＨ６．０及び７．４におけるＦｃＲｎとの結合力をＥＬＩＳＡにより確認した図である。 ＰＦｃ２９：Ｑ３１１Ｒ及びＭ４２８Ｌ Ｆｃ変異体を含むトラスツズマブ Ｍ：Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌ Ｆｃ変異体を含むトラスツズマブ

【図2】Ｌ３０９位のアミノ酸変異体の作製模式図（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、及び各Ｆｃ変異体を含むトラスツズマブの発現精製後のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル写真である。

【図3】Ｆｃ変異体（Ｑ３１１Ｍ、Ｍ４２８Ｌ及び３０９位のアミノ酸変異）を含むトラスツズマブのｐＨ６．０におけるＦｃＲｎとの結合力をＥＬＩＳＡにより確認した図である。 ＰＦｃ２９：Ｑ３１１Ｒ及びＭ４２８Ｌ Ｆｃ変異体を含むトラスツズマブ ＦＭ：Ｌ３０９Ｆ、Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌ Ｆｃ変異体を含むトラスツズマブ ＩＭ：Ｌ３０９Ｉ、Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌ Ｆｃ変異体を含むトラスツズマブ ＭＭ：Ｌ３０９Ｍ、Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌ Ｆｃ変異体を含むトラスツズマブ ＶＭ：Ｌ３０９Ｖ、Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌ Ｆｃ変異体を含むトラスツズマブ ＴＭ：Ｌ３０９Ｔ、Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌ Ｆｃ変異体を含むトラスツズマブ ＡＭ：Ｌ３０９Ａ、Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌ Ｆｃ変異体を含むトラスツズマブ ＹＭ：Ｌ３０９Ｙ、Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌ Ｆｃ変異体を含むトラスツズマブ ＨＭ：Ｌ３０９Ｈ、Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌ Ｆｃ変異体を含むトラスツズマブ ＱＭ：Ｌ３０９Ｑ、Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌ Ｆｃ変異体を含むトラスツズマブ ＮＭ：Ｌ３０９Ｎ、Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌ Ｆｃ変異体を含むトラスツズマブ ＫＭ：Ｌ３０９Ｋ、Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌ Ｆｃ変異体を含むトラスツズマブ ＥＭ：Ｌ３０９Ｅ、Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌ Ｆｃ変異体を含むトラスツズマブ ＷＭ：Ｌ３０９Ｗ、Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌ Ｆｃ変異体を含むトラスツズマブ ＲＭ：Ｌ３０９Ｒ、Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌ Ｆｃ変異体を含むトラスツズマブ ＳＭ：Ｌ３０９Ｓ、Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌ Ｆｃ変異体を含むトラスツズマブ

【図4a】Ｆｃ変異体を含むトラスツズマブのｐＨ６．０におけるＦｃＲｎとの結合力をＥＬＩＳＡにより確認した図である。 ＰＦｃ２９：Ｑ３１１Ｒ及びＭ４２８Ｌ Ｆｃ変異体を含むトラスツズマブ ＭＬ：Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌ Ｆｃ変異体を含むトラスツズマブ ＹＭＬ：Ｌ３０９Ｙ、Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌ Ｆｃ変異体を含むトラスツズマブ

【図4b】Ｆｃ変異体を含むトラスツズマブのｐＨ７．４におけるＦｃＲｎとの結合力をＥＬＩＳＡにより確認した図である。

【図4c】Ｆｃ変異体を含むトラスツズマブのｐＨ６．０及びｐＨ７．４におけるＦｃＲｎとの結合力をＥＬＩＳＡにより確認して定量化した図である。

【図5】弱酸性環境における結合速度（ｏｎ ｒａｔｅ）及び中性環境における解離速度（ｏｆｆ ｒａｔｅ）を示す模式図である。

【図6a】Ｆｃ変異体のｐＨ６．０における結合速度を分析した結果を示す図である。 ＰＦｃ２９：Ｑ３１１Ｒ及びＭ４２８Ｌ Ｆｃ変異体を含むトラスツズマブ ＰＦｃ４１：Ｌ３０９Ｇ及びＭ４２８Ｌ Ｆｃ変異体を含むトラスツズマブ ＭＬ：Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌ Ｆｃ変異体を含むトラスツズマブ ＹＭＬ：Ｌ３０９Ｙ、Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌ Ｆｃ変異体を含むトラスツズマブ

【図6b】Ｆｃ変異体のｐＨ７．４における解離速度を分析した結果を示す図である。

【図6c】Ｆｃ変異体の結合速度及び解離速度を分析した結果を示す図である。

【図7】Ｌ３０９位のｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ模式図、及びＦｃ変異体を含むトラスツズマブの発現精製後のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル写真である。

【図8】Ｆｃ変異体を含むトラスツズマブのｐＨ６．０におけるＦｃＲｎとの結合力をＥＬＩＳＡにより確認した図である。

【図9】Ｆｃ変異体を含むトラスツズマブのｐＨ６．０及びｐＨ７．４におけるＦｃＲｎとの結合力をＥＬＩＳＡにより確認した図である。

【図10a】ＥＭＬ変異体を含むトラスツズマブのｐＨ６．０におけるＦｃＦｎとの結合力をＥＬＩＳＡにより確認した図である。

【図10b】ＥＭＬ変異体を含むトラスツズマブのｐＨ７．４におけるＦｃＦｎとの結合力をＥＬＩＳＡにより確認した図である。

【図11】Ｆｃ変異体のｐＨ６．０条件におけるＦｃＲｎとの結合力を確認するためにＦＡＣＳ分析を行った結果を示す図である。

【図12】トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）Ｆｃ変異体９種の発現及び精製後のＳＤＳＰＡＧＥ ｇｅｌ写真である（Ｍ４２８Ｌ、Ｌ３０９Ｇ変異体にＱ３１１Ｌ、Ｑ３１１Ｉ、Ｑ３１１Ｖ、Ｑ３１１Ｔ、Ｑ３１１Ａ、Ｑ３１１Ｙ、Ｑ３１１Ｈ、Ｑ３１１ＫまたはＱ３１１Ｗ）。

【図13】トラスツズマブＦｃ変異体９種のｐＨ６．０におけるＦｃＲｎとの結合力をＥＬＩＳＡにより分析した結果を示す図である（Ｍ４２８Ｌ、Ｌ３０９Ｇ変異体にＱ３１１Ｌ、Ｑ３１１が、Ｑ３１１Ｖ、Ｑ３１１Ｔ、Ｑ３１１Ａ、Ｑ３１１Ｙ、Ｑ３１１Ｈ、Ｑ３１１ＫまたはＱ３１１Ｗ）。

【図14】トラスツズマブＦｃ変異体３種のｐＨ６．０及びｐＨ７．４におけるＦｃＲｎとの結合力をＥＬＩＳＡにより分析した結果を示す図である。

【図15】トラスツズマブＦｃ変異体３０種の発現及び精製後のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル写真である。

【図16】トラスツズマブＦｃ変異体３０種のｐＨ６．０におけるＦｃＲｎとの結合力をＥＬＩＳＡにより分析した結果を示す図である。

【図17a】ＥＷＬ（Ｌ３０９Ｅ／Ｑ３１１Ｗ／Ｍ４２８Ｌ）変異体のｐＨ６．０及びｐＨ７．４におけるＦｃＲｎとの結合力をＥＬＩＳＡにより分析した結果を示す図である。

【図17b】ＥＷＬ（Ｌ３０９Ｅ／Ｑ３１１Ｗ／Ｍ４２８Ｌ）変異体のｐＨ６．０におけるＦｃＲｎとの結合力をＥＬＩＳＡにより分析した結果を示す図である。

【図17c】ＥＷＬ（Ｌ３０９Ｅ／Ｑ３１１Ｗ／Ｍ４２８Ｌ）変異体のｐＨ７．４におけるＦｃＲｎとの結合力をＥＬＩＳＡにより分析した結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0018】

以下、本発明の実施例を挙げて本発明について詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例は本発明を例示するものにすぎず、本発明がこれらに限定されるものではない。本発明は、請求の範囲及びその均等物の範囲内で様々な変形及び応用が可能である。

【0019】

特に断らない限り、本発明に用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により通常理解される意味と同じ意味を有する。本発明に記載されているものと類似または等価の任意の方法及び材料が本発明の実施または試験において用いられるが、好ましい材料及び方法が本発明に記載されている。

【0020】

本明細書全体を通して、天然に存在するアミノ酸に対する通常の１文字及び３文字コードが用いられるだけでなく、Ａｉｂ（α－アミノイソブチル酸）、Ｓａｒ（Ｎｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）などの他のアミノ酸に対して一般に許容される３文字コードが用いられる。また、本発明において略語で言及したアミノ酸は、次のようにＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ命名法に従って記載したものである。
アラニン：Ａ，アルギニン：Ｒ，アスパラギン：Ｎ，アスパラギン酸：Ｄ，システイン：Ｃ，グルタミン酸：Ｅ，グルタミン：Ｑ，グリシン：Ｇ，ヒスチジン：Ｈ，イソロイシン：Ｉ，ロイシン：Ｌ，リシン：Ｋ，メチオニン：Ｍ，フェニルアラニン：Ｆ，プロリン：Ｐ，セリン：Ｓ，トレオニン：Ｔ，トリプトファン：Ｗ，チロシン：Ｙ，バリン：Ｖ

【0021】

一態様において、本発明は、野生型免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）のＦｃ領域に、カバットナンバリングシステム（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）によるＬ３０９Ｙのアミノ酸残基の改変を含むＦｃ変異体に関する。

【0022】

一実施例において、本発明のＦｃ変異体は、Ｍ４２８Ｌ、Ｑ３１１Ｍ、またはＭ４２８Ｌ及びＱ３１１Ｍのアミノ酸残基の置換をさらに含んでもよい。

【0023】

一態様において、本発明は、野生型免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）のＦｃ領域に、カバットナンバリングシステム（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）によるＱ３１１Ｍのアミノ酸残基の改変を含むＦｃ変異体に関する。

【0024】

一実施例において、本発明のＦｃ変異体は、Ｍ４２８Ｌ、Ｌ３０９Ｅ、Ｌ３０９Ｙ、Ｍ４２８Ｌ及びＬ３０９Ｅ、またはＭ４２８Ｌ及びＬ３０９Ｙのアミノ酸残基の置換をさらに含んでもよい。

【0025】

一態様において、本発明は、野生型免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）のＦｃ領域に、カバットナンバリングシステム（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）によるＱ３１１Ｗのアミノ酸残基の改変を含むＦｃ変異体に関する。

【0026】

一実施例において、本発明のＦｃ変異体は、Ｍ４２８Ｌ、Ｌ３０９Ｅ、またはＭ４２８Ｌ及びＬ３０９Ｅのアミノ酸残基の置換をさらに含んでもよい。

【0027】

一実施例において、免疫グロブリンがＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤもしくはＩｇＧ、またはそれらの変形であってもよく、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４であってもよく、抗ＨＥＲ２抗体であることが好ましく、トラスツズマブであることがより好ましい。抗体のパパイン分解は、２つのＦａｂ断片と１つのＦｃ断片を形成し、ヒトＩｇＧ分子において、Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６のＮ末端をパパイン分解することにより生成される（非特許文献３）。

【0028】

一実施例において、野生型免疫グロブリンのＦｃ領域は、配列番号１のアミノ酸配列を含んでもよい。

【0029】

一実施例において、Ｆｃ変異体は、配列番号２のアミノ酸配列（Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌ）を含んでもよく、配列番号３のアミノ酸配列（Ｌ３０９Ｙ、Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌ）を含んでもよい。

【0030】

一実施例において、Ｆｃ変異体は、配列番号４のアミノ酸配列（Ｌ３０９Ｅ／Ｑ３１１Ｍ／Ｍ４２８Ｌ）を含んでもよい。

【0031】

一実施例において、Ｆｃ変異体は、配列番号５のアミノ酸配列（Ｌ３０９Ｅ／Ｑ３１１Ｗ／Ｍ４２８Ｌ）を含んでもよい。

【0032】

一実施例において、野生型免疫グロブリンのＦｃ領域は、配列番号６の塩基配列を含んでもよい。

【0033】

一実施例において、Ｆｃ変異体は、配列番号７の塩基配列（Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌ）を含んでもよく、配列番号８の塩基配列（Ｌ３０９Ｙ、Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌ）を含んでもよい。

【0034】

一実施例において、Ｆｃ変異体は、配列番号９の塩基配列（Ｌ３０９Ｅ／Ｑ３１１Ｍ／Ｍ４２８Ｌ）を含んでもよい。

【0035】

一実施例において、Ｆｃ変異体は、配列番号１０の塩基配列（Ｌ３０９Ｅ／Ｑ３１１Ｗ／Ｍ４２８Ｌ）を含んでもよい。

【0036】

一実施例において、配列番号１１のアミノ酸配列は、野生型トラスツズマブ重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）を含んでもよく、ＧＦＮＩＫＤＴＹ、ＩＹＰＴＮＧＹＴ及びＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹ配列は、それぞれＣＤＲ領域を示す。配列番号１１のアミノ酸配列のうち野生型トラスツズマブのＦｃ領域は、２２５番目から始まる配列に相当する。

【0037】

一実施例において、配列番号１２のアミノ酸配列は、野生型トラスツズマブ軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）を含んでもよく、ＱＤＶＮＴＡ、ＳＡＳ、ＱＱＨＹＴＴＰＰＴ配列は、それぞれＣＤＲ領域を示す。

【0038】

一実施例において、本発明のＦｃ変異体は、ｐＨ選択的に（依存的に）ＦｃＲｎとの結合／解離反応が起こるものであってもよい。

【0039】

一実施例において、本発明のＦｃ変異体は、ｐＨ７．０～７．８において野生型免疫グロブリンＦｃ領域に比べてＦｃＲｎに対する結合親和性が低いものであってもよく、血液の正常ｐＨ範囲であってもよく、ｐＨ７．２～７．６であってもよい。本発明のＦｃ変異体は、前記ｐＨ範囲においてＦｃＲｎから解離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）される程度が野生型Ｆｃドメインと比較して同一または実質的に変化しないものであってもよい。

【0040】

一実施例において、本発明のＦｃ変異体は、ｐＨ５．６～６．５において野生型免疫グロブリンＦｃ領域に比べてＦｃＲｎに対する結合親和性が高いものであってもよく、エンドソーム内の弱酸性条件であってもよく、ｐＨ５．８～６．０であってもよい。本発明のｐＨ感応性Ｆｃ変異体は、前記ｐＨ範囲においてＦｃＲｎに対する結合親和性が野生型Ｆｃドメインと比較して１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または１００％以上増加するものであってもよく、野生型Ｆｃドメインの２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、１０倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上または１００倍以上に増加するものであってもよい。

【0041】

本発明において、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域にアミノ酸の変異を含む変異体は、親免疫グロブリンＦｃ領域を構成するアミノ酸の改変に応じて定義され、通常の免疫グロブリンナンバリングは、カバットによるＥＵインデックスに従う（非特許文献４）。

【0042】

本発明の配列番号１～配列番号５のアミノ酸は、カバットナンバリングの２２１位から始まる。例えば、本願発明の配列番号１の１番目のアミノ酸であるＡｓｐ（Ｄ，１Ｄ）はカバットナンバリングの２２１Ｄと同一であり、配列番号２の９１番目のアミノ酸であるＭｅｔ（Ｍ，９１Ｍ）はカバットナンバリングの３１１Ｍと同一であり、配列番号３の８９番目のアミノ酸であるＴｙｒ（Ｙ，８９Ｙ）はカバットナンバリングの３０９Ｙと同一である。

【0043】

本発明における「トラスツズマブＦｃ変異体」とは、配列番号１１のアミノ酸を含む野生型トラスツズマブ重鎖のＦｃ領域を代替して本願発明のＦｃ変異体を導入したものである。また、配列番号１２のアミノ酸を含む野生型トラスツズマブ軽鎖を含む。よって、前記「トラスツズマブＦｃ変異体」の作製は、野生型トラスツズマブ重鎖のＦｃ領域を代替して本願発明のＦｃ変異体を導入した発現ベクターを作製し、配列番号１２のアミノ酸を含む野生型トラスツズマブ軽鎖を導入した発現ベクターを作製し、それらを動物細胞にトランスフェクションして発現させることにより行われる。

【0044】

本発明における「ＦｃＲｎ」または「新生児Ｆｃ受容体」とは、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合するタンパク質を意味し、これは少なくとも部分的にＦｃＲｎ遺伝子によりコードされる。前記ＦｃＲｎは、これらに限定するものではないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ及びサルが含まれる任意の有機体由来のものである。当該技術分野で公知のように、機能的ＦｃＲｎタンパク質は、しばしば軽鎖や重鎖と呼ばれる２つのポリペプチドを含む。軽鎖はβ２マイクログロブリン（β－２－ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）であり、重鎖はＦｃＲｎ遺伝子によりコードされる。本明細書において、特に断らない限り、ＦｃＲｎまたはＦｃＲｎタンパク質とは、ＦｃＲｎ重鎖とβ２マイクログロブリンの複合体を意味する。

【0045】

本発明における「野生型（ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ）ポリペプチド」とは、後に改変されると誘導体を生産する非改変ポリペプチドを意味する。野生型ポリペプチドは、自然界で見出されるポリペプチドであってもよく、自然界で見出されるポリペプチドの誘導体または操作されたものであってもよい。野生型ポリペプチドは、ポリペプチドそれ自体、前記野生型ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を示すものであってもよい。よって、本発明における「野生型免疫グロブリン」とは、アミノ酸残基が改変されると誘導体を生成する非改変免疫グロブリンポリペプチドを意味する。前記用語と互換的に、アミノ酸改変が導入されると誘導体を生成する非改変免疫グロブリンポリペプチドを意味する「親（ｐａｒｅｎｔ）免疫グロブリン」が用いられる。

【0046】

本発明における「アミノ酸改変」とは、ポリペプチド配列のアミノ酸の置換、挿入及び／または欠失、好ましくは置換を意味する。本発明における「アミノ酸置換」または「置換」とは、野生型ポリペプチド配列の特定の位置においてアミノ酸が他のアミノ酸に代替されることを意味する。例えば、Ｌ３０９Ｙ置換を含むＦｃ変異体とは、野生型免疫グロブリンＦｃ断片のアミノ酸配列において３０９番目のアミノ酸残基であるロイシンがチロシンに代替されたものを意味する。

【0047】

本明細書における「Ｆｃ変異体」とは、野生型免疫グロブリンＦｃ断片と比較して、少なくとも１つのアミノ酸残基の改変を含むものを意味する。本発明において、Ｆｃ変異体は、Ｌ３０９Ｙ、Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌ（前記ナンバリングはカバットのＥＵインデックスによるものである）、Ｌ３０９Ｅ、Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌ（前記ナンバリングはカバットのＥＵインデックスによるものである）、Ｌ３０９Ｅ、Ｑ３１１Ｗ及びＭ４２８Ｌ（前記ナンバリングはカバットのＥＵインデックスによるものである）からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の改変を含むことが好ましく、野生型免疫グロブリンＦｃ断片（領域）に比べて、弱酸性条件においてＦｃＲｎに対する結合親和性が増加し、中性条件においてＦｃＲｎに対する結合親和性が減少し、弱酸性の細胞内エンドソームにおいてＦｃＲｎに対する結合速度が向上し、中性の血液において迅速に解離する。

【0048】

本発明は、対応する野生型免疫グロブリンＦｃ断片と比較して、ＦｃＲｎに対する結合親和性が増加し、かつ／または血清半減期が延長されたＦｃ変異体を提供する。抗体及び他の生理活性分子の生体内半減期（すなわち、対象の血清または他の組織における持続性）は、抗体（または任意の他の薬学的分子）の投与量及び頻度を決定する重要な臨床変数である。よって、生体内半減期が延長された抗体をはじめとする前記生理活性分子は、製薬的に非常に重要である。本発明の置換されたＦｃ変異体の半減期は、野生型Ｆｃドメインと比較して１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または１００％以上増加するものであってもよく、野生型Ｆｃドメインの２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上または１０倍以上に増加するものであってもよい。

【0049】

本発明のＦｃ変異体は、野生型免疫グロブリンＦｃ断片（領域またはドメイン）と比較して、少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、それにより異なるアミノ酸配列を有する。本発明によるＦｃ変異体のアミノ酸配列は、野生型免疫グロブリンＦｃ断片のアミノ酸配列と実質的に相同である。例えば、本発明によるｐＨ感応性Ｆｃ変異のアミノ酸配列は、野生型免疫グロブリンのＦｃ断片のアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する。アミノ酸改変は、分子生物学的方法を用いて遺伝的に行ってもよく、酵素的または化学的方法を用いて行ってもよい。

【0050】

本発明において、トラスツズマブの生産や精製などは、特許文献１（韓国特許出願第１０－２０１７－００４５１４２号）を参照して行うことができる。

【0051】

本発明のＦｃ変異体は、当該技術分野で公知の任意の方法で製造することができる。一実施例において、本発明による免疫グロブリンのＦｃ変異体は、特定のアミノ酸改変を含むポリペプチド配列をコードし、必要に応じて、その後宿主細胞にクローニングされ、発現及び検定される核酸の形成に用いられる。そのための様々な方法が文献（非特許文献５）に記載されている。

【0052】

本発明によるＦｃ変異体をコードする核酸は、タンパク質の発現のために発現ベクターに挿入されてもよい。発現ベクターは、一般に調節もしくは制御（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）配列、選択マーカー、任意の融合パートナー、及び／または追加的要素と作動可能に連結された、すなわち、機能的関係にあるタンパク質を含む。適切な状態において、核酸に形質転換された宿主細胞、好ましくは本発明によるＦｃ変異体をコードする核酸を含有する発現ベクターを培養してタンパク質発現を誘導する方法により、本発明によるＦｃ変異体が生産される。哺乳類細胞、バクテリア、昆虫細胞及び酵母が含まれる様々な好適な宿主細胞が用いられるが、これらに限定されるものではない。外因性核酸を宿主細胞に導入する方法は、当該技術分野で公知であり、用いられる宿主細胞により異なる。生産費が安価で産業的に利用価値の高い大腸菌を宿主細胞とし、本発明によるＦｃ変異体を生産することが好ましい。

【0053】

よって、本発明の範囲には、Ｆｃ変異体をコードする核酸を導入した宿主細胞をタンパク質の発現に適した条件下で培養するステップと、宿主細胞から発現したＦｃ変異体を精製または分離するステップとを含む、Ｆｃ変異体の製造方法が含まれる。

【0054】

抗体は、当該技術分野で公知の様々な方法で分離または精製することができる。標準精製方法には、クロマトグラフィー技術、電気泳動、免疫沈降、透析、濾過、濃縮及びクロマト分画（ｃｈｒｏｍａｔｏｆｏｃｕｓｉｎｇ）技術が含まれる。当該技術分野で公知のように、例えば細菌性タンパク質Ａ、Ｇ、Ｌなどの様々な天然タンパク質が抗体に結合し、前記タンパク質が精製に用いられる。時には、特定の融合パートナーによる精製も可能である。

【0055】

一態様において、本発明は、本発明のＦｃ変異体を含むポリペプチドに関する。

【0056】

一実施例において、前記ポリペプチドは、野生型と比較して生体内半減期が延長されたものであってもよい。

【0057】

一態様において、本発明は、Ｆｃ変異体または前記ポリペプチドを含む抗体に関する。

【0058】

一実施例において、本発明の抗体は、野生型Ｆｃ領域を含む抗体より生体内半減期が延長されたものであってもよい。

【0059】

一実施例において、前記抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ドメイン抗体、二重特異的抗体、抗体模倣体、キメラ抗体、抗体複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、ヒト抗体もしくはヒト化抗体、またはそれらの断片であってもよい。

【0060】

本発明の抗体は、Ｆｃ領域の最適化（Ｌ３０９Ｙ、Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌ；Ｌ３０９Ｅ、Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌ；Ｌ３０９Ｅ、Ｑ３１１Ｗ及びＭ４２８Ｌ）によりＦｃドメイン（領域）またはそれを含むポリペプチドの半減期を最大化することができる。

【0061】

一態様において、本発明は、本発明のＦｃ変異体、非ペプチド性重合体及び生理活性ポリペプチドが共有結合により連結されて生体内半減期が延長されたタンパク質結合体に関する。

【0062】

一実施例において、本発明によるＦｃ変異体は、タンパク質薬物などの生理活性ポリペプチドの生体内半減期を延長させるためのキャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）として有用なものであってもよい。

【0063】

一実施例において、本発明のＦｃ変異体を含むタンパク質結合体は、生体内半減期が大幅に延長された持続性薬物製剤として用いられてもよい。

【0064】

本発明に使用可能な非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール－プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸；ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）やＰＬＧＡ（ポリ乳酸－グリコール酸；ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ－ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）などの生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、ポリエチレングリコールであることが好ましい。当該技術分野で公知のそれらの誘導体や当該技術分野の技術水準で容易に作製できる誘導体も本発明に含まれる。

【0065】

本発明によるＦｃ変異体に結合されて用いられる生理活性ポリペプチドとしては、血中半減期を延長させる必要があるものであれば、いかなるものを用いてもよい。例えば、ヒトの疾病を治療または予防する目的で用いられるサイトカイン、インターロイキン、インターロイキン結合タンパク質、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質または受容体、細胞表面抗原、受容体拮抗物質などの様々な生理活性ポリペプチド、それらの誘導体及びアナログが挙げられる。

【0066】

本発明に使用可能な生理活性ポリペプチドとしては、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類とインターフェロン受容体類（例えば、インターフェロンα、β及びγ、可溶性１型インターフェロン受容体）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、グルカゴン様ペプチド類（ＧＬＰ－１）、Ｇタンパク質共役受容体（Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、インターロイキン（例えば、ＩＬ－１受容体、ＩＬ－４受容体）、酵素類（例えば、グルコセレブロシダーゼ（ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ）、イズロン酸－２－スルファターゼ（ｉｄｕｒｏｎａｔｅ－２－ｓｕｌｆａｔａｓｅ）、αガラクトシダーゼＡ、アガルシダーゼα（ａｇａｌｓｉｄａｓｅ ａｌｐｈａ）、β、α－Ｌ－イズロニダーゼ（ａｌｐｈａ－Ｌ－ｉｄｕｒｏｎｉｄａｓｅ）、ブチリルコリンエステラーゼ（ｂｕｔｙｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ）、キチナーゼ（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）、イミグルセラーゼ（ｉｍｉｇｌｕｃｅｒａｓｅ）、リパーゼ（ｌｉｐａｓｅ）、ウリカーゼ（ｕｒｉｃａｓｅ）、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ ａｃｅｔｙｌｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、中性エンドペプチダーゼ（ｎｅｕｔｒａｌ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）、ミエロペルオキシダーゼ（ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ））、インターロイキン及びサイトカイン結合タンパク質（例えば、ＩＬ－１８ｂｐ、ＴＮＦ結合タンパク質）、マクロファージ活性化因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α１－アンチトリプシン、アルブミン、α－ラクトアルブミン（ａｌｐｈａ－ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ）、アポリポタンパク質Ｅ、エリスロポエチン、高グリコシル化エリスロポエチン、アンジオポエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）、ヘモグロビン、トロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）、トロンビン受容体活性化ペプチド、トロンボモジュリン（ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ）、血液因子ＶＩＩ、血液因子ＶＩＩａ、血液因子ＶＩＩＩ、血液因子ＩＸ、血液因子ＸＩＩＩ、プラスミノーゲン活性化因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン（ｈｉｒｕｄｉｎ）、タンパク質Ｃ、Ｃ反応性タンパク質、レニン阻害剤、コラゲナーゼ阻害剤、スーパーオキシドディスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、エンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、アンジオテンシン（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ）、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、インスリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン（ｅｌｃａｔｏｎｉｎ）、結合組織活性化因子、組織因子経路阻害剤（ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｐａｔｈｗａｙｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子類（例えば、神経成長因子、毛様体神経栄養因子（ｃｉｌｌｉａｒｙ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）、アキソジェネシス因子－１（ａｘｏｇｅｎｅｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－１）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ｂｒａｉｎ－ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ｇｌｉａｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）、ネトリン（ｎｅｔｒｉｎ）、好中球抑制因子（ｎｅｕｒｏｐｈｉｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｆａｃｔｏｒ）、神経栄養因子、ニュールツリン（ｎｅｕｔｕｒｉｎ））、副甲状腺ホルモン、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン（ａｕｔｏｔａｘｉｎ）、ラクトフェリン（ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ）、ミオスタチン（ｍｙｏｓｔａｔｉｎ）、受容体類（例えば、ＴＮＦＲ（Ｐ７５）、ＴＮＦＲ（Ｐ５５）、ＩＬ－１受容体、ＶＥＧＦ受容体、Ｂ細胞活性化因子受容体）、受容体拮抗物質（例えば、ＩＬ１－Ｒａ）、細胞表面抗原（例えば、ＣＤ２、３、４、５、７、１１ａ、１１ｂ、１８、１９、２０、２３、２５、３３、３８、４０、４５、６９）、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント類（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｄ）、ウイルス由来ワクチン抗原など、様々な種類が挙げられるが、これらに限定されるものではない。抗体断片は、特定の抗原に結合する能力を有するＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｓｃＦｖからなる群から選択される。

【0067】

一実施例において、Ｆｃ変異体を含むタンパク質結合体に抗体薬物が結合されてもよく、癌治療用抗体薬物は、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｚｕｍａｂ）、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、バシリキシマブ（ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）、インフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）またはアベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）であってもよい。

【0068】

本発明は、非ペプチド性重合体を介して、前記Ｆｃ変異体を生理活性ポリペプチドに共有結合により連結して持続性薬物製剤を製造する方法を含む。

【0069】

本発明による製造方法は、末端に反応基を有する非ペプチド性重合体を介して、生理活性ポリペプチドとＦｃ変異体を共有結合により連結するステップと、生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体及びＦｃ変異体が共有結合により連結された結合体を分離するステップとを含んでもよい。

【0070】

一態様において、本発明は、本発明のＦｃ変異体、ポリペプチドまたは抗体をコードする核酸分子に関する。

【0071】

本発明の核酸分子は、単離されたものであってもよく、組換えたものであってもよく、一本鎖及び二本鎖形態のＤＮＡ及びＲＮＡだけでなく、対応する相補性配列を含むものである。単離された核酸は、天然生成資源から単離された核酸であれば、核酸が単離された個体のゲノムに存在する周辺の遺伝配列から分離された核酸である。鋳型から酵素的または化学的に合成された核酸、例えばＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子またはオリゴヌクレオチドであれば、それらの過程で生成された核酸が単離された核酸分子であると解される。単離された核酸分子とは、別途の断片の形態、またはそれより大きな核酸構築物の成分としての核酸分子を意味する。核酸は、他の核酸配列と機能的関係に配置されると、作動可能に連結される。例えば、プレ配列または分泌リーダー（ｌｅａｄｅｒ）のＤＮＡは、ポリペプチドが分泌される前の形態であるプレタンパク質（ｐｒｅｐｒｏｔｅｉｎ）として発現すると、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結され、プロモーターまたはエンハンサーは、ポリペプチド配列の転写に影響を及ぼすと、コード配列に作動可能に連結され、あるいは、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されると、コード配列に作動可能に連結される。一般に、作動可能に連結されるとは、連結されるＤＮＡ配列が隣接して位置することを意味し、分泌リーダーの場合は、隣接して同じリーディングフレーム内に存在することを意味する。しかしながら、エンハンサーは、隣接して位置する必要がない。連結は、都合の良い制限酵素部位におけるライゲーションにより達成される。このような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを通常の方法により用いる。

【0072】

一態様において、本発明は、前記核酸分子を含むベクターに関する。

【0073】

本発明における「ベクター」とは、核酸配列を複製する細胞への導入のために核酸配列を挿入する担体を意味する。核酸配列は、外因性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）であってもよく、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）であってもよい。ベクターとしては、プラスミド、コスミド及びウイルス（例えば、バクテリオファージ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。当業者であれば、標準的な組換え技術によりベクターを構築することができる（非特許文献６、７など）。

【0074】

本発明における「発現ベクター」とは、転写される遺伝子産物の少なくとも一部分をコードする核酸配列を含むベクターを意味する。場合によっては、その後ＲＮＡ分子がタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに翻訳される。発現ベクターは、様々な調節配列を含む。転写及び翻訳を調節する調節配列と共に、ベクター及び発現ベクターは、他の機能を提供する核酸配列も含む。

【0075】

一態様において、本発明は、前記ベクターを含む宿主細胞に関する。

【0076】

本発明における「宿主細胞」とは、真核生物及び原核生物が含まれるものであって、前記ベクターを複製することができるか、ベクターによりコードされる遺伝子を発現することができる任意の形質転換可能な生物を意味する。宿主細胞は前記ベクターによりトランスフェクト（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）または形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）され、それらは外因性の核酸分子が宿主細胞内に送達または導入される過程を意味する。

【0077】

本発明の宿主細胞としては、好ましくは細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＯＰ５細胞、Ａ５４９細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0078】

一態様において、本発明は、非ペプチド性重合体を介して本発明のＦｃ変異体を生理活性ポリペプチドに共有結合により連結させるステップを含む、生理活性ポリペプチドの生体内半減期を延長させる方法に関する。

【0079】

一態様において、本発明は、本発明のＦｃ変異体、ポリペプチドまたは抗体を含む、癌の予防または治療用薬学的組成物に関する。

【0080】

一実施例において、免疫原性細胞死誘導剤をさらに含んでもよい。

【0081】

一実施例において、免疫原性細胞死誘導剤は、アントラサイクリン系抗癌剤、タキサン系抗癌剤、抗ＥＧＦＲ抗体、ＢＫチャネル作用薬、ボルテゾミブ（Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）、強心配糖体（ｃａｒｄｉａｃ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）、シクロホスファミド系抗癌剤、ＧＡＤＤ３４／ＰＰ１阻害剤、ＬＶ－ｔＳＭＡＣ、Ｍｅａｓｌｅｓウイルス、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）及びオキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）からなる群から選択される少なくとも１つであってもよく、アントラサイクリン系列抗癌剤は、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、ピキサントロン（ｐｉｘａｎｔｒｏｎｅ）、サバルビシン（ｓａｂａｒｕｂｉｃｉｎ）またはバルルビシン（ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）であってもよく、タキサン系抗癌剤は、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）またはドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）であってもよい。

【0082】

本発明の癌の予防または治療用薬学的組成物は、化学的抗癌薬物（抗癌剤）などと共に投与すると、癌細胞の死滅効果により従来の抗癌剤の癌治療効果を増加させることができる。併用投与は、前記抗癌剤と同時にまたは順次行われてもよい。前記抗癌剤の例としては、ＤＮＡアルキル化剤（ＤＮＡ ａｌｋｙｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）としてメクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、マスタード（ｍｕｓｔａｒｄ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ：ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ：ＣＣＮＵ）、ストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、抗癌抗生剤（ａｎｔｉ－ｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）としてアクチノマイシンＤ（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ：ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ）、植物アルカロイド（ｐｌａｎｔ ａｌｋａｌｏｉｄｓ）としてビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、イリノテカン（ｉｒｉｄｏｔｅｃａｎ）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0083】

一実施例において、癌には、白血病（ｌｅｕｋｅｍｉａｓ）、急性リンパ性白血病（ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、急性非リンパ性白血病（ａｃｕｔｅ ｎｏｎｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、慢性リンパ性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、ホジキン病（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）、非ホジキンリンパ腫（ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ）、多発性骨髄腫（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ）などのリンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｍａｓ）、脳腫瘍（ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒ）、神経芽細胞腫（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）、網膜芽細胞腫（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）、ウィルムス腫瘍（Ｗｉｌｍｓ Ｔｕｍｏｒ）、骨腫瘍（ｂｏｎｅ ｔｕｍｏｒ）、軟部肉腫（ｓｏｆｔ－ｔｉｓｓｕｅ ｓａｒｃｏｍａｓ）などの小児固形腫瘍（ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒ）、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）、尿路癌（ｕｒｉｎａｒｙ ｃａｎｃｅｒ）、子宮癌（ｕｔｅｒｉｎｅ ｃａｎｃｅｒ）、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ）及びその他皮膚癌（ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）、脳腫瘍（ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒ）、肝癌（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、喉頭癌（ｌａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺癌（ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）、食道癌（ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、睾丸癌（ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ ｃａｎｃｅｒ）などの成人の一般的な固形腫瘍（ｃｏｍｍｏｎ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒ）が含まれ、本発明において予防または治療する癌の種類は、限定されるものではない。

【0084】

本発明における「予防」とは、本発明による薬学的組成物の投与により癌の発生、拡散及び再発を抑制または遅延させるあらゆる行為を意味する。

【0085】

本発明における「治療」とは、本発明の組成物の投与により癌細胞を死滅させるか、癌の症状を好転または有利に変化させるあらゆる行為を意味する。本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、大韓医学協会などから提示された資料を参照することにより、本発明の組成物が効果を発揮する疾患の正確な基準を把握することができ、改善、向上及び治療された程度を判断することができるであろう。

【0086】

本発明において、有効成分と組み合わせて用いられる「治療学的に有効な量」とは、対象疾患を予防または治療するのに有効な組成物の薬学的に許容される塩の量を意味し、本発明の組成物の治療学的に有効な量は、様々な要素、例えば投与方法、標的部位、患者の状態などによって異なる。よって、人体に用いる場合、投与量は、安全性と効率性を共に考慮して適量を決定すべきである。動物実験により決定した有効量から、ヒトに用いられる量を推定することもできる。有効な量を決定の際に考慮するこれらの事項は、例えば非特許文献８及び９に記載されている。

【0087】

本発明の薬学組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明における「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用できる合理的な利益／リスク比で疾患を治療するのに十分であり、副作用を起こさない程度の量を意味し、有効用量レベルは、患者の健康状態、癌の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する感受性、投与方法、投与時間、投与経路及び排出率、治療期間、配合または同時用いられる薬物が含まれる要素、並びにその他医学分野で公知の要素により決定される。本発明の組成物は、単独でまたは他の治療剤と併用して投与してもよく、従来の治療剤と順次または同時に投与してもよく、単一または多重投与してもよい。前記要素を全て考慮して副作用なく最小限の量で最大限の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは当業者により容易に決定される。

【0088】

本発明の薬学組成物は、薬学的に許容される添加剤をさらに含んでもよく、ここで、薬学的に許容される添加剤としては、デンプン、ゼラチン化デンプン、微結晶セルロース、乳糖、ポビドン、コロイド性二酸化ケイ素、リン酸水素カルシウム、ラクトース、マンニトール、飴、アラビアガム、α化デンプン、トウモロコシデンプン、粉末セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、オパドライ、デンプングリコール酸ナトリウム、カルナウバロウ、合成ケイ酸アルミニウム、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸カルシウム、白糖、グルコース、ソルビトール、タルクなどが用いられる。本発明による薬学的に許容される添加剤は、前記組成物に対して０．１重量部～９０重量部含まれることが好ましいが、これに限定されるものではない。

【0089】

また、本発明の組成物は、生物学的製剤に通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤またはそれらの２つ以上の組み合わせを含んでもよい。薬学的に許容される担体は、組成物を生体内に送達するのに適したものであれば、特に限定されるものではなく、例えば非特許文献１０に記載された化合物、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、グルコース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセリン、エタノール及びそれらの成分の１成分以上を混合して用いてもよく、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加してもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び滑沢剤をさらに添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などの週利用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化してもよい。さらに、当該分野における適正な方法、または非特許文献１１に開示されている方法により、各疾患または成分に応じて製剤化することが好ましい。

【0090】

本発明の組成物は、目的とする方法に応じて非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に注射剤形で適用）または経口投与することができ、投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率、疾患の重症度などによりその範囲が異なる。本発明による組成物の１日投与量は、０．０００１～１０ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは０．０００１～５ｍｇ／ｍＬである。１日１回または数回に分けて投与することがより好ましい。

【0091】

本発明の組成物の経口投与のための液体製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが挙げられるが、通常用いられる通常の希釈剤である水、流動パラフィン以外にも種々の賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などを共に含んでもよい。非経口投与のための製剤には、滅菌水溶液剤、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥剤、坐剤などが含まれる。

【0092】

一態様において、本発明は、本発明のＦｃ変異体をコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を培養するステップと、前記宿主細胞により発現したＦｃ変異体を回収するステップとを含む、野生型より生体内半減期が延長されたＦｃ変異体の製造方法に関する。

【0093】

一態様において、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を培養するステップと、前記宿主細胞により発現したポリペプチドを回収するステップとを含む、野生型より生体内半減期が延長されたＦｃ変異体を含むポリペプチドの製造方法に関する。

【0094】

一態様において、本発明は、本発明の抗体をコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を培養するステップと、前記宿主細胞により発現した抗体を精製するステップとを含む、野生型より生体内半減期が延長されたｐＨ感応性Ｆｃ変異を含む抗体の製造方法に関する。

【0095】

一実施例において、抗体の精製には、濾過、ＨＰＬＣ、陰イオン交換もしくは陽イオン交換、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィーまたはそれらの組み合わせが用いられ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを用いるアフィニティークロマトグラフィーが好ましい。

【実施例】

【0096】

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例は本発明を例示するものにすぎず、本発明がこれらに限定されるものではない。

【実施例1】

【0097】

Ｌ３０９Ｙのアミノ酸残基改変Ｆｃ変異体
＜１－１＞Ｆｃ変異体（Ｑ３１１Ｍ／Ｍ４２８Ｌ）の生産及び精製
先行研究において半減期延長効果が知られているＹＴＥのＭ２５２Ｙ、ＬＳのＭ４２８Ｌに見られるように、ＦｃＲｎ結合力が向上した変異体はＭｅｔが他のアミノ酸に置換されていることが確認された（野生型Ｆｃドメインのアミノ酸配列：配列番号１）。これらの理由から、抗体ＦｃのＦｃＲｎ結合部位におけるＭｅｔはＦｃＲｎに対するｐＨ依存的な結合力を阻害するアミノ酸であると判断した。ＰＦｃ２９（Ｑ３１１Ｒ及びＭ４２８Ｌ Ｆｃ変異体）に導入するとＦｃＲｎ結合力を実際に阻害するか否かを確認するために、トラスツズマブ重鎖（配列番号１１）にＦｃ変異体（Ｑ３１１Ｍ／Ｍ４２８Ｌ）変異体（配列番号２）を導入したトラスツズマブ－ＭＬを作製し、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ動物細胞にトランスフェクションした。具体的には、まず、フリースタイル２９３発現（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）培養液（Ｇｉｂｃｏ社，１２３３８－０１８）３０ｍＬに、前記Ｑ３１１にＭｅｔを導入したＦｃ変異体（Ｑ３１１Ｍ／Ｍ４２８Ｌ）の重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子を１：１の割合で混合した。次に、ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）（ポリサイエンス社，２３９６６）：変異体遺伝子＝４：１の割合で混合して常温で２０分間静置し、１日前に２×１０^６細胞／ｍＬの密度になるように分注して培養したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞株と混合した。振盪培養器にて３７℃、１２５ｒｐｍ及び８％ＣＯ_２の条件で７日間培養し、その後遠心分離して上清のみ採取した。その後、２５×ＰＢＳを用いて平衡（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）にし、０．２μｍフィルター（メルクミリポア社）及びボトルトップフィルター（ｂｏｔｔｌｅ ｔｏｐ ｆｉｌｔｅｒ）を用いて濾過した。濾過した培養液にプロテインＡレジン５００μＬを注入し、４℃で１６時間攪拌した。その後、カラムを流してレジンを回収し、５ｍＬのＰＢＳで洗浄して３ｍＬの１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．７）バッファに溶出し、次いで１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０を用いて中和させた。バッファを変えるために、遠心濾過器ユニット（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒ ｕｎｉｔｓ）３Ｋ（メルクミリポア社）を用いた。

【0098】

＜１－２＞Ｆｃ変異体（Ｑ３１１Ｍ／Ｍ４２８Ｌ）のｐＨ依存的な結合力の確認
実施例１－１で精製したトラスツズマブ－ＭＬのＦｃＲｎに対するｐＨ依存的な結合力をＥＬＩＳＡにより確認した。具体的には、０．０５Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３（ｐＨ９．６）に、４μｇ／ｍＬに希釈した前記ＩｇＧ Ｆｃ変異体を５０μＬずつ平底ポリスチレン（Ｆｌａｔ Ｂｏｔｔｏｍ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ ９６ウェルマイクロプレート（ｃｏｓｔａｒ）にて４℃で１６時間固定化した。その後、１００μＬの４％スキムミルク（ゲノムベース；ＧｅｎｏｍｉｃＢａｓｅ）（ｉｎ ０．０５％ ＰＢＳＴ ｐＨ６．０）にて常温で２時間ブロッキングした。０．０５％ＰＢＳＴ（ｐＨ６．０）１８０μＬで４回ずつ洗浄し、その後１％スキムミルク（ｉｎ ０．０５％ ＰＢＳＴ，ｐＨ６．０）で連続希釈したＦｃＲｎ ５０μＬを各ウェルに分注し、常温で１時間反応させた。洗浄過程後に、抗ＧＳＴ－ＨＲＰコンジュゲート（ＧＥヘルスケア社）５０μＬを用いて、常温で１時間抗体反応を行って洗浄した。その後、１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を５０μＬずつ添加して発色させ、次いで２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を５０μＬずつ注入して反応を終了させ、Ｅｐｏｃｈマイクロプレート分光光度計（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）（ＢｉｏＴｅｋ社）を用いて分析した。

【0099】

その結果、ＦｃＲｎとの結合力を阻害するものと予想されていたＭｅｔがむしろｐＨ６．０でＰＦｃ２９よりよく結合し、ｐＨ７．４ではＰＦｃ２９と同等の結合力を示すことが確認された。すなわち、Ｑ３１１Ｍ変異体は、ｐＨ６．０でＰＦｃ２９よりよく結合し、ｐＨ７．４ではＰＦｃ２９と同等の結合力を示す（図１）。

【0100】

＜１－３＞ＦｃＲｎ結合力が向上したＦｃ変異体の探索
実施例１－１で選択したＱ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌの変異を有するＦｃ変異体より向上したＦｃＲｎ結合力を有する変異体をさらに見出そうとした。具体的には、Ｌ３０９位にＬ、Ｇ、Ｐ、Ｃ、Ｄを除く１５種のアミノ酸を導入した変異体１５種を実施例１－１と同様に作製し、動物細胞で培養して精製した（図２）。

【0101】

＜１－４＞Ｆｃ変異体を含む抗体のｐＨ依存的な結合力の確認
実施例１－３で精製した変異体のｐＨ６．０におけるＦｃＲｎに対する結合力を確認するために、実施例１－２と同様にＥＬＩＳＡ分析を行った。その結果、ｐＨ６．０で最も結合力が高いＬ３０９Ｙ、Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌ（トラスツズマブ－ＹＭＬ）（図３のＹＭ，以下ではＹＭＬという，配列番号３）変異体が確保された（図３）。よって、選択したＹＭＬ変異体のＦｃＲｎに対するｐＨ依存的な結合力をＥＬＩＳＡにより測定した。その結果、従来のＰＦｃ２９（Ｑ３１１Ｒ及びＭ４２８Ｌ Ｆｃ変異体）及び実施例１－１で選択したＭＬ変異体（Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌ Ｆｃ変異体）よりも、ｐＨ６．０におけるＦｃＲｎとの結合力が高いことが分かった。また、ｐＨ７．４においては同程度の解離を示した（図４ａ～図４ｃ）。

【0102】

＜１－５＞Ｆｃ変異体のＦｃＲｎに対する血中半減期延長効果の確認
血中半減期の延長のためにはＦｃＲｎに対するＦｃのｐＨ依存的な結合力が重要であるので（図５参照）、Ｓｏｕｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ ２０１５を参照して、弱酸性環境における結合瞬間速度（ｏｎ ｒａｔｅ）及び中性環境における解離瞬間速度（ｏｆｆ ｒａｔｅ）を実施例１－１及び１－４で選択したトラスツズマブ－ＭＬ（Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌ Ｆｃ変異体）及びトラスツズマブ－ＹＭＬ（Ｌ３０９Ｙ、Ｑ３１１Ｍ及びＭ４２８Ｌ Ｆｃ変異体）において確認した。その対照群として、従来のＰＦｃ２９（Ｑ３１１Ｒ及びＭ４２８Ｌ Ｆｃ変異体）及びＰＦｃ４１（Ｌ３０９Ｇ及びＭ４２８Ｌ Ｆｃ変異体）を用いた。具体的には、ＮＩ－ＮＴＡバイオセンサ（Ｐａｌｌ Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社）に４０μｇ／ｍＬのＨｉｓタグ付けしたヒトＦｃＲｎを３分間固定化した。その後、ｐＨ６．０のＰＢＳバッファを基準（ｂａｓｅｌｉｎｅ）とし、次いで７００ｎＭの各抗体Ｆｃ変異体（ｉｎ ＰＢＳ ｐＨ６．０）を２０秒間結合させた。弱酸性環境（ｐＨ６．０）でＦｃＲｎに抗体Ｆｃ変異体が結合した状態において、ｐＨ７．４のＰＢＳにバッファを変えて５秒間解離させ、バイオレイヤー干渉法（ｂｉｏｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ ａｓｓａｙ）（ＢＬＩｔｚ，Ｐａｌｌ Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社）により測定した。このようにして測定したデータ（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）において、各ｐＨの線形区間（ｐＨ６．０，結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）：２秒／ｐＨ７．４，解離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）：１秒）の傾きにより結合瞬間速度と解離瞬間速度を確認した。その後、Ｆｃ変異体の比較のために、各Ｆｃ変異体の傾き値を除算して比率を求めた。結合速度比と解離速度比の平均をスコアリング（ｓｃｏｒｉｎｇ）し、結合速度と解離速度が最も速いＦｃ変異体を確認した。その結果、半減期延長効果が最も大きくなると期待される抗体Ｆｃ変異体（ＹＭＬ，配列番号３）を選択した（図６ａ～図６ｃ）。

【実施例2】

【0103】

Ｑ３１１Ｍのアミノ酸残基改変Ｆｃ変異体
＜２－１＞Ｑ３１１Ｍ／Ｍ４２８Ｌ突然変異を有するトラスツズマブＦｃ変異体の生産及び精製
先行研究によれば、ＦｃＲｎ結合力が向上した変異体はＭｅｔが他のアミノ酸に置換されていることが分かる（野生型Ｆｃドメインのアミノ酸配列：配列番号１）。これらの理由から、抗体ＦｃのＦｃＲｎ結合部位におけるＭｅｔはＦｃＲｎに対するｐＨ依存的な結合力を阻害するアミノ酸であると判断した。よって、Ｍｅｔを本発明者らが見出したＰＦｃ２９（Ｑ３１１Ｒ／Ｍ４２８Ｌ）に導入するとＦｃＲｎ結合力を実際に阻害するか否かを確認するために、本実験を行った。

【0104】

より具体的には、野生型トラスツズマブ重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）（配列番号１１）にＦｃ変異体（Ｑ３１１Ｍ／Ｍ４２８Ｌ，配列番号２）を導入した重鎖発現ベクターと、野生型トラスツズマブ軽鎖（配列番号１２）発現ベクターを作製した。その後、２つのベクターをＥｘｐｉ２９３Ｆ動物細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの１日前に、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を２×１０^６細胞／ｍＬの密度になるように３００ｍＬ継代培養し、その翌日、ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ，ポリサイエンス社，２３９６６）を用いてトランスフェクションした。まず、フリースタイル２９３発現培養液（Ｇｉｂｃｏ社，１２３３８－０１８）３０ｍＬに、変異体の重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子を１：１の割合で混合した。次に、ＰＥＩ：変異体遺伝子＝４：１の割合で混合して常温で２０分間静置し、その前日に継代培養しておいた細胞に混合し、振とう（ｓｈａｋｉｎｇ）ＣＯ_２インキュベーターにて３７℃、１２５ｒｐｍ、８％ＣＯ_２の条件で７日間培養し、その後遠心分離して上清のみ採取した。その後、２５×ＰＢＳを用いて平衡（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）にした。ボトルトップフィルター及び０．２μｍのフィルター（メルクミリポア社）を用いて濾過した。濾過した培養液にタンパク質Ａ樹脂５００μＬを注入し、４℃で１６時間攪拌し、その後カラムを流した。レジン（ｒｅｓｉｎ）を回収し、５ｍＬのＰＢＳで洗浄して３ｍＬの１００ｍＭグリシンｐＨ２．７緩衝液に溶出し、次いで１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０を用いて中和させた。緩衝液を変えるために、遠心濾過器ユニット３Ｋ（メルクミリポア社）を用いた。

【0105】

＜２－２＞精製したトラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）Ｆｃ変異体（Ｑ３１１Ｍ／Ｍ４２８Ｌ）のＥＬＩＳＡ分析
実施例２－１で精製したトラスツズマブ－ＭＬのＦｃＲｎに対するｐＨ依存的な結合力を測定するために、ＥＬＩＳＡを行った。

【0106】

より具体的には、ＦｃＲｎに対するｐＨ依存的な結合力を確認するために、０．０５Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３ ｐＨ９．６に、４μｇ／ｍＬに希釈したＩｇＧ Ｆｃ変異体をそれぞれ５０μＬずつ平底ポリスチレンｈｉｇｈ ｂｉｎｄ ９６ウェルマイクロプレート（ｃｏｓｔａｒ）にて４℃で１６時間固定化し、その後１００μＬの４％脱脂乳（ゲノムベース）（ｉｎ ０．０５％ ＰＢＳＴ ｐＨ６．０／ｐＨ７．４）にて常温で２時間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。０．０５％ＰＢＳＴ（ｐＨ６．０／ｐＨ７．４）１８０μＬで４回ずつ洗浄し、その後１％脱脂乳（ｉｎ ０．０５％ ＰＢＳＴ ｐＨ６．０／ｐＨ７．４）で順次希釈（ｓｅｒｉａｌｌｙ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）したＦｃＲｎ ５０μＬを各ウェルに分注し、常温で１時間反応させた。洗浄後に、抗ＧＳＴ－ＨＲＰ抗体複合体（ａｎｔｉ－ＧＳＴ－ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）（ＧＥヘルスケア社）５０μＬずつを用いて、常温で１時間抗体反応を行って洗浄した。１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を５０μＬずつ添加して発色させ、その後２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を５０μＬずつ注入して反応を終了させ、次いでＥｐｏｃｈマイクロプレート分光光度計（ＢｉｏＴｅｋ社）を用いて分析した。その結果、ＦｃＲｎとの結合力を阻害するものと予想されていたＭｅｔがむしろｐＨ６．０でＰＦｃ２９よりよく結合し、ｐＨ７．４ではＰＦｃ２９と同等の結合力を示すことが確認された（図１）。

【0107】

すなわち、実験前の予測とは逆に、Ｑ３１１Ｍ突然変異は、ｐＨ６．０で結合力を向上させることが確認された。

【0108】

＜２－３＞ＦｃＲｎ結合力が向上したＦｃ変異体の追加探索及び動物細胞の発現精製
前述したように選択したＱ３１１Ｍ／Ｍ４２８Ｌより向上した結合力を有する変異体を見出そうとした。具体的には、ＦｃＲｎに結合するために重要であることが知られているＬ３０９位にＬ、Ｇ、Ｐ、Ｃ、Ｄを除く１５種のアミノ酸を導入した変異体１５種を実施例２－２と同様に動物細胞で培養して精製した（図７）。

【0109】

＜２－４＞精製したトラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）Ｆｃ変異体のＥＬＩＳＡ分析
前述したように実施例２－３で作製した変異体のｐＨ６．０におけるＦｃＲｎに対する結合力を確認するために、ＥＬＩＳＡを行った。

【0110】

より具体的には、ＦｃＲｎに対するｐＨ依存的な結合力を確認するために、０．０５Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３ ｐＨ９．６に、４μｇ／ｍＬに希釈したＩｇＧ Ｆｃ変異体をそれぞれ５０μＬずつ平底ポリスチレンｈｉｇｈ ｂｉｎｄ ９６ウェルマイクロプレート（ｃｏｓｔａｒ）にて４℃で１６時間固定化し、その後１００μＬの４％脱脂乳（ゲノムベース）（ｉｎ ０．０５％ ＰＢＳＴ ｐＨ６．０）にて常温で２時間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。０．０５％ＰＢＳＴ（ｐＨ６．０）１８０μＬで４回ずつ洗浄し、その後１％脱脂乳（ｉｎ ０．０５％ ＰＢＳＴ ｐＨ６．０）で順次希釈（ｓｅｒｉａｌｌｙ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）したＦｃＲｎ ５０μＬを各ウェルに分注し、常温で１時間反応させた。洗浄後に、抗ＧＳＴ－ＨＲＰ抗体複合体（ＧＥヘルスケア社）５０μＬを用いて、常温で１時間抗体反応を行って洗浄した。１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を５０μＬずつ添加して発色させ、その後２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を５０μＬずつ注入して反応を終了させ、次いでＥｐｏｃｈマイクロプレート分光光度計（ＢｉｏＴｅｋ社）を用いて分析した。その結果、ＰＦｃ２９よりｐＨ６．０における結合力が高い野生型トラスツズマブ重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）（配列番号１１）にＦｃ変異体（Ｌ３０９Ｙ／Ｑ３１１Ｍ／Ｍ４２８Ｌ，配列番号３）を導入した重鎖と野生型トラスツズマブ軽鎖（配列番号１２）が結合したトラスツズマブ－ＹＭＬ、野生型トラスツズマブ重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）（配列番号１１）にＦｃ変異体（Ｌ３０９Ｅ／Ｑ３１１Ｍ／Ｍ４２８Ｌ，配列番号３）を導入した重鎖と野生型トラスツズマブ軽鎖（配列番号１２）が結合したトラスツズマブ－ＥＭＬ（配列番号４）の２種の変異体を確保した（図８）。

【0111】

＜２－５＞Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ Ｆｃ変異体（Ｌ３０９Ｙ／Ｑ３１１Ｍ／Ｍ４２８Ｌ（ＹＭＬ），Ｌ３０９Ｅ／Ｑ３１１Ｍ／Ｍ４２８Ｌ（ＥＭＬ））のｐＨ依存的なＦｃＲｎ結合力の分析
実施例２－４で精製したトラスツズマブ－ＹＭＬ、トラスツズマブ－ＥＭＬ（配列番号４）の２種の変異体のＦｃＲｎに対するｐＨ依存的な結合力を確認するために、ＥＬＩＳＡを行った。

【0112】

より具体的には、ＦｃＲｎに対するｐＨ依存的な結合力を確認するために、０．０５Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３ ｐＨ９．６に、４μｇ／ｍＬに希釈したＩｇＧ Ｆｃ変異体をそれぞれ５０μＬずつ平底ポリスチレンＨｉｇｈ Ｂｉｎｄ ９６ウェルマイクロプレート（ｃｏｓｔａｒ）にて４℃で１６時間固定化した。その後、１００μＬの４％脱脂乳（ゲノムベース）（ｉｎ ０．０５％ ＰＢＳＴ ｐＨ６．０／ｐＨ７．４）にて常温で２時間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。０．０５％ＰＢＳＴ（ｐＨ６．０／ｐＨ７．４）１８０μＬで４回ずつ洗浄し、その後１％脱脂乳（ｉｎ ０．０５％ ＰＢＳＴ ｐＨ６．０／ｐＨ７．４）で順次希釈（ｓｅｒｉａｌｌｙ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）したＦｃＲｎ ５０μＬを各ウェルに分注し、常温で１時間反応させた。洗浄後に、抗ＧＳＴ－ＨＲＰ抗体複合体（ＧＥヘルスケア社）５０μＬずつを用いて、常温で１時間抗体反応を行った。洗浄後に、１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を５０μＬずつ添加して発色させ、その後２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を５０μＬずつ注入して反応を終了させ、次いでＥｐｏｃｈマイクロプレート分光光度計（ＢｉｏＴｅｋ社）を用いて分析した。

【0113】

その結果、ＹＭＬはＥＭＬよりｐＨ６．０条件でＰＦｃ２９より高い結合力を示すが、ＹＭＬにおいては、ｐＨ７．４でも結合力が向上することが確認された（図９）。

【0114】

よって、ｐＨ７．４ではＰＦｃ２９と同等の結合力を示すと共に、ｐＨ６．０では向上した結合力を示すＥＭＬ変異体においてｐＨ依存的な結合力が向上し、それにより抗体の再循環過程が向上し、血中半減期が延長されるものと判断した（図１０ａ～図１０ｂ）。

【実施例3】

【0115】

Ｑ３１１Ｗのアミノ酸残基改変Ｆｃ変異体
＜３－１＞ＰＦｃ４１（Ｌ３０９Ｇ，Ｍ４２８Ｌ）のＱ３１１位における１７種のアミノ酸置換変異体の作製及び分析
先行研究において半減期が延長されたＰＦｃ４１（Ｌ３０９Ｇ，Ｍ４２８Ｌ）及びＰＦｃ２９（Ｑ３１１Ｒ及びＭ４２８Ｌ Ｆｃ変異体）をベースにＬ３０９Ｇを固定し、Ｑ３１１位においてＱ、Ｃ、Ｒを除く１７種のアミノ酸に置換された変異体をバクテリアディスプレイで分析できるように、ｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－Ｆｃ変異体プラスミド（ｖａｒｉａｎｔｓ ｐｌａｓｍｉｄ）を作製した。作製したプラスミドに対して、ＦＡＣＳを用いてｐＨ６．０条件におけるヒトＦｃＲｎに対する結合力が向上した変異体を選択するために、ＦＡＣＳ分析を行った。その結果、先行研究により見出されたＰＦｃ２９よりｐＨ６．０で結合力が向上し、Ｑ３１１位においてＬ、Ｉ、Ｖ、Ｔ、Ａ、Ｙ、Ｈ、Ｋ、Ｗに置換された９つの変異体を選択した（Ｍ４２８Ｌ、Ｌ３０９Ｇ Ｆｃ変異体にＱ３１１Ｌ、Ｑ３１１Ｉ、Ｑ３１１Ｖ、Ｑ３１１Ｔ、Ｑ３１１Ａ、Ｑ３１１Ｙ、Ｑ３１１Ｈ、Ｑ３１１ＫまたはＱ３１１Ｗ）（図１１）。

【0116】

＜３－２＞ＰＦｃ４１（Ｌ３０９Ｇ，Ｍ４２８Ｌ）においてＱ３１１位にＬ、Ｉ、Ｖ、Ｔ、Ａ、Ｙ、Ｈ、Ｋ、Ｗ変異体を含むトラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）Ｆｃ変異体の生産及び精製
実施例３－１で選択した９種の変異体の抗体フォーマットにおける特性を確認するために、野生型トラスツズマブ重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）（配列番号１１）にＦｃ変異体を導入した重鎖発現ベクターと、野生型トラスツズマブ軽鎖（配列番号１２）発現ベクターを作製した。その後、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ動物細胞にトランスフェクションした。

【0117】

より具体的には、トランスフェクションの１日前に、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を２×１０^６細胞／ｍＬの密度になるように３０ｍＬ継代培養し、その翌日、ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ，ポリサイエンス社，２３９６６）を用いてトランスフェクションした。まず、フリースタイル２９３発現培養液（Ｇｉｂｃｏ社，１２３３８－０１８）３ｍＬに、変異体の重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子を１：１の割合で混合した。次に、ＰＥＩ：変異体遺伝子を４：１の割合で混合して常温で２０分間静置し、その前日に継代培養しておいた細胞に混合し、振とうＣＯ_２インキュベーターにて３７℃、１２５ｒｐｍ、８％ＣＯ_２の条件で７日間培養し、その後遠心分離して上清のみ採取した。その後、２５×ＰＢＳを用いて平衡（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）にした。ボトルトップフィルター及び０．２μｍのフィルター（メルクミリポア社）を用いて濾過した。濾過した培養液にタンパク質Ａ樹脂１００μＬを注入し、４℃で１６時間攪拌し、その後カラムを流してレジン（ｒｅｓｉｎ）を回収した。その後、１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄し、その後１ｍＬの１００ｍＭグリシンｐＨ２．７バッファに溶出（ｅｌｕｔｉｏｎ）し、次いで１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０を用いて中和させた。バッファを変えるために、遠心濾過器ユニット３０Ｋ（メルクミリポア社）を用いた。終了した試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにより確認した（図１２）。

【0118】

＜３－３＞精製したトラスツズマブＦｃ変異体のＥＬＩＳＡ分析
野生型トラスツズマブ重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）（配列番号１１）にＦｃ変異体を導入した重鎖と野生型トラスツズマブ軽鎖（配列番号１２）が結合したトラスツズマブ変異体のＦｃＲｎに対するｐＨ依存的な結合力を測定するために、ＥＬＩＳＡ測定を行った。まず、ｐＨ６．０条件におけるＦｃＲｎに対する結合力を確認するために、０．０５Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３ ｐＨ９．６に、４μｇ／ｍＬに希釈したＩｇＧ Ｆｃ変異体をそれぞれ５０μＬずつ平底ポリスチレンｈｉｇｈ ｂｉｎｄ ９６ウェルマイクロプレート（ｃｏｓｔａｒ）にて４℃で１６時間固定化した。その後、１００μＬの４％脱脂乳（ゲノムベース）（ｉｎ ０．０５％ ＰＢＳＴ ｐＨ６．０）にて常温で２時間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。０．０５％ＰＢＳＴ（ｐＨ６．０）１８０μＬで４回ずつ洗浄し、その後１％脱脂乳（ｉｎ ０．０５％ ＰＢＳＴ ｐＨ６．０）で順次希釈（ｓｅｒｉａｌｌｙ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）したＦｃＲｎ ５０μＬを各ウェルに分注し、常温で１時間反応させた。洗浄後に、抗ＧＳＴ－ＨＲＰ抗体複合体（ＧＥヘルスケア社）５０μＬずつを用いて、常温で１時間抗体反応を行って洗浄した。１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を５０μＬずつ添加して発色させ、その後２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を５０μＬずつ注入して反応を終了させた。その後、Ｅｐｏｃｈマイクロプレート分光光度計（ＢｉｏＴｅｋ社）を用いて分析した。その結果、ｐＨ６．０条件においてＦｃＲｎに対する結合力が向上した上位３つの変異体（Ｌ３０９Ｇ／Ｑ３１１Ｙ／Ｍ４２８Ｌ，Ｌ３０９Ｇ／Ｑ３１１Ｈ／Ｍ４２８Ｌ，Ｌ３０９Ｇ／Ｑ３１１Ｗ／Ｍ４２８Ｌ）を選択した（図１３）。

【0119】

選択した３種のトラスツズマブ変異体のＦｃＲｎに対するｐＨ依存的な結合力を測定するために、ＥＬＩＳＡ測定を行った。まず、ＦｃＲｎに対するｐＨ依存的な結合力を確認するために、０．０５Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３ ｐＨ９．６に、４μｇ／ｍＬに希釈したＩｇＧ Ｆｃ変異体をそれぞれ５０μＬずつ平底ポリスチレンｈｉｇｈ ｂｉｎｄ ９６ウェルマイクロプレート（ｃｏｓｔａｒ）にて４℃で１６時間固定化した。その後、１００μＬの４％脱脂乳（ゲノムベース）（ｉｎ ０．０５％ ＰＢＳＴ ｐＨ６．０／ｐＨ７．４）にて常温で２時間ブロッキングした。０．０５％ＰＢＳＴ（ｐＨ６．０／ｐＨ７．４）１８０μＬで４回ずつ洗浄し、その後１％脱脂乳（ｉｎ ０．０５％ ＰＢＳＴ ｐＨ６．０／ｐＨ７．４）で順次希釈（ｓｅｒｉａｌｌｙ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）したＦｃＲｎ ５０μＬを各ウェルに分注し、常温で１時間反応させた。洗浄後に、抗ＧＳＴ－ＨＲＰ抗体複合体（ＧＥヘルスケア社）５０μＬずつを用いて、常温で１時間抗体反応を行い、洗浄過程を行った。１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を５０μＬずつ添加して発色させ、その後２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を５０μＬずつ注入して反応を終了させ、次いでＥｐｏｃｈマイクロプレート分光光度計（ＢｉｏＴｅｋ社）を用いて分析した。

【0120】

その結果、ｐＨ６．０条件でＦｃＲｎに対する結合力がＰＦｃ２９より向上したが、ｐＨ７．４でもＰＦｃ２９より結合力が向上し、ｐＨ依存的な結合力は向上しなかった（図１４）。

【0121】

＜３－４＞Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ及び動物細胞の発現及び精製
実施例３－３で選択した３種の変異体（Ｌ３０９Ｇ／Ｑ３１１Ｙ／Ｍ４２８Ｌ，Ｌ３０９Ｇ／Ｑ３１１Ｈ／Ｍ４２８Ｌ，Ｌ３０９Ｇ／Ｑ３１１Ｗ／Ｍ４２８Ｌ）のうち、先行研究において既に知られているＱ３１１Ｈを除き、Ｑ３１１ＹまたはＷを含み、Ｌ３０９位においてＦ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｔ、Ａ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｅ、Ｗ、Ｒ、Ｓに置換された１５種のトラスツズマブ変異体３０種を発現するためのプラスミドを作製した。作製した発現用ベクターを用いて、トラスツズマブ変異体３０種を前述した方法と同様に動物細胞で培養し、その後精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにより確認した（図１５）。

【0122】

＜３－５＞トラスツズマブＦｃ変異体のｐＨ６．０条件におけるＦｃＲｎに対するＥＬＩＳＡ分析
実施例３－４の３０種のトラスツズマブ変異体のＦｃＲｎに対するｐＨ６．０における結合力を測定するために、ＥＬＩＳＡ測定を行った。まず、ＦｃＲｎに対するｐＨ依存的な結合力を確認するために、０．０５Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３ ｐＨ９．６に、４μｇ／ｍＬに希釈したＩｇＧ Ｆｃ変異体をそれぞれ５０μＬずつ平底ポリスチレンｈｉｇｈ ｂｉｎｄ ９６ウェルマイクロプレート（ｃｏｓｔａｒ）にて４℃で１６時間固定化し、その後１００μＬの４％脱脂乳（ゲノムベース）（ｉｎ ０．０５％ ＰＢＳＴ ｐＨ６．０）にて常温で２時間ブロッキングした。０．０５％ＰＢＳＴ（ｐＨ６．０）１８０μＬで４回ずつ洗浄し、その後１％脱脂乳（ｉｎ ０．０５％ ＰＢＳＴ ｐＨ６．０）で順次希釈（ｓｅｒｉａｌｌｙ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）したＦｃＲｎ ５０μＬを各ウェルに分注し、常温で１時間反応させた。洗浄後に、抗ＧＳＴ－ＨＲＰ抗体複合体（ＧＥヘルスケア社）５０μＬずつを用いて、常温で１時間抗体反応を行って洗浄した。１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を５０μＬずつ添加して発色させ、その後２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を５０μＬずつ注入して反応を終了させ、次いでＥｐｏｃｈマイクロプレート分光光度計（ＢｉｏＴｅｋ社）を用いて分析した。その結果、ｐＨ６．０においてＰＦｃ２９より結合力が向上したＬ３０９Ｅ／Ｑ３１１Ｗ／Ｍ４２８Ｌ（ＥＷＬ，配列番号８）変異体を見出した（図１６）。

【0123】

＜３－６＞Ｌ３０９Ｅ／Ｑ３１１Ｗ／Ｍ４２８Ｌ（ＥＷＬ）突然変異を導入したトラスツズマブＦｃ変異体のｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合力の分析
野生型トラスツズマブ重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）（配列番号１１）にＥＷＬ Ｆｃ変異体（配列番号５）を含む重鎖とトラスツズマブ軽鎖（配列番号１２）が結合したトラスツズマブ－ＥＷＬのＦｃＲｎに対するｐＨ依存的な結合力を測定するために、ＥＬＩＳＡを行った。まず、ＦｃＲｎに対するｐＨ依存的な結合力を確認するために、０．０５Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３ ｐＨ９．６に、４μｇ／ｍＬに希釈したＩｇＧ Ｆｃ変異体をそれぞれ５０μＬずつ平底ポリスチレンＨｉｇｈ Ｂｉｎｄ ９６ウェルマイクロプレート（ｃｏｓｔａｒ）にて４℃で１６時間固定化し、その後１００μＬの４％脱脂乳（ゲノムベース）（ｉｎ ０．０５％ ＰＢＳＴ ｐＨ６．０／ｐＨ７．４）にて常温で２時間ブロッキングした。０．０５％ＰＢＳＴ（ｐＨ６．０／ｐＨ７．４）１８０μＬで４回ずつ洗浄し、その後１％脱脂乳（ｉｎ ０．０５％ ＰＢＳＴ ｐＨ６．０／ｐＨ７．４）で順次希釈（ｓｅｒｉａｌｌｙ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）したＦｃＲｎ ５０μＬを各ウェルに分注し、常温で１時間反応させた。

【0124】

洗浄後に、抗ＧＳＴ－ＨＲＰ抗体複合体（ＧＥヘルスケア社）５０μＬずつを用いて、常温で１時間抗体反応を行って洗浄した。１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を５０μＬずつ添加して発色させ、その後２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を５０μＬずつ注入して反応を終了させ、次いでＥｐｏｃｈマイクロプレート分光光度計（ＢｉｏＴｅｋ社）を用いて分析した。その結果、ＰＦｃ２９よりｐＨ６．０条件でヒトＦｃＲｎに対してよく結合し、ｐＨ７．４条件でＰＦｃ２９より低い結合力を示した（図１７ａ～図１７ｃ）。よって、変異体ＥＷＬは、ｐＨ依存的な結合力を向上させ、それにより抗体の再循環過程を最大化し、血中半減期を延長させるものと予測される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4a】

【図4b】

【図4c】

【図5】

【図6a】

【図6b】

【図6c】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10a】

【図10b】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17a】

【図17b】

【図17c】

【配列表】

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【国際調査報告】