特表 2023-513132 吸入送達のための核酸又はタンパク質を担持した肺サーファクタント粒子及びその製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-30

(54)【発明の名称】吸入送達のための核酸又はタンパク質を担持した肺サーファクタント粒子及びその製造方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7088 20060101AFI20230323BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20230323BHJP

   A61K 47/44 20170101ALI20230323BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20230323BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20230323BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20230323BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230323BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20230323BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230323BHJP

   A61K 38/19 20060101ALI20230323BHJP

   C12N 15/88 20060101ALI20230323BHJP

   C07K 14/46 20060101ALN20230323BHJP

   C07K 14/785 20060101ALN20230323BHJP

【ＦＩ】

A61K31/7088

A61K38/00

A61K47/44

A61K9/127

A61K47/42

A61P11/00

A61K48/00

A61K31/713

A61P35/00

A61K38/19

C12N15/88 Z ZNA

C07K14/46

C07K14/785

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022547235

(86)(22)【出願日】2021-02-05

(85)【翻訳文提出日】2022-09-30

(86)【国際出願番号】 KR2021001516

(87)【国際公開番号】W WO2021158053

(87)【国際公開日】2021-08-12

(31)【優先権主張番号】10-2020-0013867

(32)【優先日】2020-02-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】514260642

【氏名又は名称】コリア アドバンスド インスティチュート オブ サイエンス アンド テクノロジィ

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】パク ジホ

(72)【発明者】

【氏名】オ チャンヒ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA19

4C076AA93

4C076AA95

4C076BB27

4C076CC14

4C076CC15

4C076CC27

4C076EE41

4C076EE51

4C076EE57

4C076FF31

4C076FF68

4C084AA02

4C084AA13

4C084BA03

4C084BA44

4C084DA19

4C084MA05

4C084MA13

4C084MA24

4C084MA56

4C084NA12

4C084NA13

4C084ZA59

4C084ZB22

4C084ZB26

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA02

4C086MA05

4C086MA13

4C086MA24

4C086NA12

4C086NA13

4C086ZA59

4C086ZB22

4C086ZB26

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045CA52

4H045EA20

4H045EA50

(57)【要約】

肺サーファクタントとして産生されるリポソームにタンパク質又は核酸が連関された複合体は、タンパク質又は核酸の構造を何ら損なうことなく、その本来の形態及び機能をｉｎ ｖｉｖｏ投与中に保存しながら、肺に選択的に送達され得るだけでなく、連関されたタンパク質又は核酸（遺伝子）を肺胞内に存在する肺サーファクタント膜と効果的に融合させることによって周囲の細胞に効率的に送達することもでき、毒性がほとんどなく、構造安定性に優れているという利点がある。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

タンパク質又は核酸の送達のための組成物であって、
肺サーファクタントを用いて調製されたリポソームに結合したタンパク質又は核酸である、組成物。

【請求項2】

前記リポソームに結合したタンパク質又は核酸が、正に帯電したタンパク質又はペプチドを介して前記リポソームに連関されている、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記正に帯電したタンパク質がプロタミンである、請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

前記リポソームに結合したタンパク質が負に帯電したタンパク質である、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

前記組成物がリポソーム結合タンパク質又は核酸を選択的に肺に送達するためのものである、請求項１に記載の組成物。

【請求項6】

前記肺サーファクタントがＩＩ型肺胞細胞で産生されるリポタンパク質複合体である、請求項１に記載の組成物。

【請求項7】

前記肺サーファクタントが膜タンパク質を含有する、請求項１に記載の組成物。

【請求項8】

前記複合体がＩＩ型肺胞細胞由来肺癌細胞を標的とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項9】

前記複合体が２５０ｎｍ～１２００ｎｍの範囲の平均直径を有する、請求項１に記載の組成物。

【請求項10】

タンパク質又は核酸の送達のための組成物を調製する方法であって、
肺サーファクタントを溶解する第１の溶液を調製する工程と、
前記肺サーファクタントが溶解した調製溶液を乾燥させることにより脂質膜を形成する工程と、
結合標的タンパク質又は核酸を溶解して水和させる第２の溶液で前記形成された脂質膜を処理することにより、肺サーファクタントを用いて調製されたリポソームに結合標的タンパク質又は核酸を結合させた複合体を調製する工程と、
を含む、方法。

【請求項11】

前記結合標的タンパク質又は核酸が溶解した前記第２の溶液で処理することにより、前記形成された脂質膜を水和する工程において、正に帯電したタンパク質又はペプチドが溶解した第３の溶液も処理して、前記タンパク質又は核酸を、前記正に帯電したタンパク質又はペプチドにより前記リポソームに結合させる、請求項１０に記載の組成物を調製する方法。

【請求項12】

前記組成物を調製する方法を行う際に、１重量部の前記結合標的タンパク質又は核酸に対して１００重量部～１４０重量部の前記肺サーファクタントを用い、同時に１ｍｏｌの前記結合標的タンパク質又は核酸に対して１ｍｏｌ～１０ｍｏｌの前記正に帯電したタンパク質又はペプチドを使用する、請求項１１に記載の組成物を調製する方法。

【請求項13】

前記組成物を調製する方法を行う際に、１重量部の前記結合標的タンパク質又は核酸に対して１００重量部の前記肺サーファクタントを用い、同時に１ｍｏｌの前記結合標的タンパク質又は核酸に対して１０ｍｏｌの前記正に帯電したタンパク質又はペプチドを使用する、請求項１１に記載の組成物を調製する方法。

【請求項14】

前記組成物を調製する方法を行う際に、１ｍｏｌの前記結合標的タンパク質又は核酸に対して０．５ｍｏｌ～２０ｍｏｌの前記正に帯電したタンパク質又はペプチドを使用する、請求項１１に記載の組成物を調製する方法。

【請求項15】

前記水和工程が３０℃～９０℃の温度で行われる、請求項１０に記載の組成物を調製する方法。

【請求項16】

前記水和工程を行った後に前記複合体の直径を調整する工程を更に含む、請求項１０に記載の組成物を調製する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、負に帯電したタンパク質又は核酸を肺の奥深くに送達するために生体適合性の肺サーファクタント粒子及び正に帯電したプロタミンタンパク質を用いて粒子形成を最適化する方法に関する。負に帯電したタンパク質又は核酸を担持するために、正に帯電したプロタミンを媒体として引力によって粒子と組み合わせることを試みた。その理由は、タンパク質又は核酸の構造を損なうことなく本来の形態を保存した状態で送達されることを意図するものだからである。

【背景技術】

【0002】

肺疾患の患者数は年々著しく増加しており、肺疾患を有する全患者のうち、呼吸器ウイルス感染を伴う患者は死亡率が最も高いカテゴリーに属している。したがって、肺を選択的に標的とし、構造を損なうことなく本来の形態及び機能を保存した状態で薬物又はタンパク質を送達することができる送達システムが必要とされている。

【0003】

特に、呼吸器感染症を引き起こすウイルスの中でも、インフルエンザ及びコロナウイルスは主に肺胞領域のＩＩ型肺胞細胞に感染する。そのため、免疫増強剤及び抗ウイルス剤を肺胞領域、特にＩＩ型肺胞細胞に効率的に送達する手法が必要とされている。

【0004】

ＩＩ型肺胞細胞は肺サーファクタントを分泌して貯蔵するように機能し、肺サーファクタントは呼吸の間の肺の張力を調節する役割を果たす。この肺サーファクタントは、脂質と膜タンパク質とで構成される（非特許文献１）。

【0005】

肺サーファクタントを用いてタンパク質又は核酸を肺胞に送達すれば、肺胞内の肺サーファクタント膜との融合により、タンパク質又は核酸を肺胞内で長期間維持することができ、タンパク質又は核酸が肺サーファクタントを分泌及び貯蔵するＩＩ型肺胞細胞を効果的に標的とし得ることが期待された。本発明は、肺サーファクタントを用いて調製されたリポソームにタンパク質又は核酸が結合した複合体を調製することにより完成された。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Eur Respir J. 1999 Jun; 13(6):1455-76

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の目的は、肺へのタンパク質又は核酸の選択的送達のためのタンパク質又は核酸の送達のための複合体を提供することである。

【0008】

本発明の別の目的は、肺へのタンパク質又は核酸の選択的送達のためのタンパク質又は核酸の送達のための複合体を調製する方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0009】

上記の目的を達成するためには、本発明は、タンパク質又は核酸の送達のための複合体であって、肺サーファクタントを用いて調製されたリポソームに結合したタンパク質又は核酸である、複合体を提供する。

【0010】

本発明はまた、タンパク質又は核酸の送達のための複合体を調製する方法であって、
肺サーファクタントを溶解する第１の溶液を調製する工程と、
前記肺サーファクタントが溶解した調製溶液を乾燥させることにより脂質膜を形成する工程と、
結合標的タンパク質又は核酸を溶解して水和させる第２の溶液で前記形成された脂質膜を処理することにより、肺サーファクタントを用いて調製されたリポソームに結合標的タンパク質又は核酸を結合させた複合体を調製する工程と、
を含む、方法を提供する。

【発明の効果】

【0011】

本発明の一態様で提供される肺サーファクタントを用いて調製されたリポソームにタンパク質又は核酸が結合した複合体は、ｉｎ ｖｉｖｏで投与された場合にタンパク質又は核酸の構造を損なうことなく、本来の形態及び機能を保存しながら肺に選択的に送達することができる。さらに、この複合体は、肺胞内に存在する肺サーファクタント膜と効率的に融合して、結合したタンパク質又は核酸（遺伝子）を周囲の細胞に効率的に送達し、また毒性が低く、構造安定性に優れている。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】肺サーファクタントを用いたタンパク質担持方法の模式図を示す図である。

【図2】緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び肺サーファクタントの量をそれぞれ５０μｇ及び５ｍｇで固定した状態で、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）１ｍｏｌに対して、プロタミンの量をモル比で１：１、１：５、１：１０、１：２０に増加させて緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）担持率、粒径及び電荷を測定した結果を示す図である。

【図3】緑色蛍光タンパク質を担持した肺サーファクタント粒子の形状を電子顕微鏡（ＴＥＭ）下で観察した写真を示す図である。

【図4】完成した粒子の安定性を評価するために、生体と同様の環境であるＦＢＳ（ウシ胎児血清）を１０％（容量／容量）含有する培養培地に粒子を入れた後の３７℃における経時的な粒径及びＧＦＰ蛍光の変化を確認した結果、並びに粒子毒性を確認した結果を示す図である。

【図5】対照群であるプロタミン－タンパク質複合体（Ｐｒｏ－ＧＦＰ）で、ヒト肺胞上皮細胞（ＨＰＡｅｐｉｃ）、マクロファージ（Ｒａｗ２６４．７）、又はＩＩ型肺胞細胞由来肺癌細胞（Ａ５４９）をそれぞれ２４時間処理した後の共焦点顕微鏡下で観察される細胞内送達を確認した結果を示す図である。

【図6】肺サーファクタント－タンパク質－プロタミン（Ｓｕｒｆ－Ｐｒｏ－ＧＦＰ）粒子でヒト肺胞上皮細胞（ＨＰＡｅｐｉｃ）を２４時間処理した後に共焦点顕微鏡下で観察される細胞内送達を確認した結果を示す図である。

【図7】肺サーファクタント－タンパク質－プロタミン（Ｓｕｒｆ－Ｐｒｏ－ＧＦＰ）粒子でマクロファージ（Ｒａｗ２６４．７）を２４時間処理した後に共焦点顕微鏡下で観察される細胞内送達を確認した結果を示す図である。

【図8】肺サーファクタント－タンパク質－プロタミン（Ｓｕｒｆ－Ｐｒｏ－ＧＦＰ）粒子でＩＩ型肺胞細胞由来肺癌細胞（Ａ５４９）を２４時間処理した後に共焦点顕微鏡下で観察される細胞内送達を確認した結果を示す図である。

【図9】実際の小動物マウスモデルにおいて肺サーファクタント－タンパク質－プロタミン（Ｓｕｒｆ－Ｐｒｏ－ＧＦＰ）粒子が良好に肺に送達されたかどうかを確認するために、吸入により対照ＧＦＰタンパク質のみを肺に送達した場合と肺サーファクタント－タンパク質－プロタミン（Ｓｕｒｆ－Ｐｒｏ－ＧＦＰ）粒子を送達した場合を比較した結果を示す図である。

【図10】経時的に肺サーファクタント－タンパク質－プロタミン（Ｓｕｒｆ－Ｐｒｏ－ＧＦＰ）粒子の臓器分布を確認するために、肺サーファクタント－タンパク質－プロタミン（Ｓｕｒｆ－Ｐｒｏ－ＧＦＰ）粒子を１ｍｇの肺サーファクタントに基づいて作製した後、吸入によりマウス動物モデルに粒子を送達し、経時的にタンパク質及び粒子の臓器分布を確認した結果を示す図である。

【図11】１ｍｇの肺サーファクタントに基づいて肺サーファクタント－タンパク質－プロタミン（Ｓｕｒｆ－Ｐｒｏ－ＧＦＰ）粒子を製造して吸入により該粒子をマウス動物モデルに送達した後、経時的にタンパク質及び粒子の臓器分布を確認した結果である図１０の結果を定量化したグラフを示す図である。

【図12】肺サーファクタントを用いた核酸担持方法の模式図を示す図である。

【図13】ＤＬＳ装置を用いてｓｉＲＮＡ－プロタミン複合体のサイズ及び電荷を測定した結果を示す図である。

【図14】肺サーファクタント－プロタミン－ｓｉＲＮＡ（Ｓｕｒｆ－Ｐｒｏ－ｓｉＲＮＡ）粒子でＩＩ型肺胞細胞由来肺癌細胞（Ａ５４９）を２４時間処理した後に共焦点顕微鏡下で観察される細胞内送達を確認した結果を示す図である。

【図15】肺サーファクタントを用いてＬｕｃ－ｓｉＲＮＡのタンパク質発現低下能を確認するために、発光を示すＡ５４９細胞（Ａ５４９－ｌｕｃ）をＬｕｃ－ｓｉＲＮＡで処理した後、ＩＶＩＳ装置により発光を確認した結果を示す図である。

【図16】ＩＩ型肺胞細胞由来肺癌細胞（Ａ５４９－ｌｕｃ）を各実験群で処理した後にＭＴＴ法により細胞死率を確認した結果（左）及び肺サーファクタントを用いてＬｕｃ－ｓｉＲＮＡのタンパク質発現低下能を確認するためにＩＶＩＳ装置により発光を確認した定量結果（右）を示す図である。

【図17】既存の文献を通じてＩＩ型肺胞細胞由来肺癌細胞（Ａ５４９－ｌｕｃ）においてアポトーシスを誘導することができるｓｉＲＮＡとして知られるＫＲＡＳ－ｓｉＲＮＡ及びＲＰＮ２－ｓｉＲＮＡと、肺サーファクタントとを用いてＭＴＴ法によってアポトーシス効果を確認した結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0014】

この発明の実施形態は、様々な他の形態に修正することができ、本発明の範囲は、後述する実施形態に限定されない。本発明をより正確に説明するために本発明の実施形態が与えられることは、この分野に関する平均的な知識を有する当業者によって十分理解される。

【0015】

さらに、本明細書全体の要素の「包含」は、他の要素を除外しないが、具体的に明記されていない限り、他の要素を含めることができる。

【0016】

本発明は、タンパク質又は核酸の送達のための複合体であって、肺サーファクタントを用いて調製されたリポソームに結合したタンパク質又は核酸である、複合体を提供する。

【0017】

リポソームへのタンパク質又は核酸の結合は、リポソームの内部に結合及び／又は封入され得るか、又はリポソームの外側に結合され得る。

【0018】

肺サーファクタントは、生物由来肺サーファクタントとすることができ、本発明においては、実施例を通じて、タンパク質又は核酸の送達のための複合体を生物由来肺サーファクタントを用いて調製した。さらに、肺サーファクタントは、生物由来肺サーファクタントに限定されず、模倣生物由来肺サーファクタント、合成肺サーファクタント、及び半合成（すなわち、修飾天然）肺サーファクタントを含むことができる。

【0019】

生物由来肺サーファクタントを模倣するサーファクタント、又は合成若しくは半合成肺サーファクタントは、生物由来肺サーファクタントとのタンパク質相同性を１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％及び９０％超有する。

【0020】

この場合、リポソームに結合したタンパク質は、正に帯電したタンパク質又はペプチドによりリポソームに結合する。正に帯電したタンパク質としては、プロタミン、ヒストン、リゾチーム等を用いることができ、好ましくは、ＦＤＡ承認のプロタミンを使用することができる。

【0021】

正に帯電したタンパク質又はペプチドは、カチオン性アミノ酸に富むドメインを含むタンパク質又はペプチドであることが好ましい。カチオン性アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、及びリジンが挙げられる。例えば、アルギニン高含有タンパク質としては、プロタミンが挙げられる。

【0022】

したがって、リポソームに結合するタンパク質は、負電荷を有するタンパク質であることが好ましい。正に帯電したプロタミンをリンカーとして使用して負に帯電したタンパク質を担持させるが、その理由は、タンパク質構造を損なうことなく、本来のタンパク質形態を保存した状態でタンパク質を送達するためである。

【0023】

リポソームに結合する核酸は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡとすることができ、ＲＮＡは、例えば、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（核小体低分子ＲＮＡ）、ａＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、又はｐｉＲＮＡ（ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ）とすることができる。

【0024】

さらに、核酸は、遺伝子治療剤を含む。

【0025】

タンパク質又は核酸の送達のための複合体は、リポソームに結合したタンパク質又は核酸を肺に選択的に送達することができ、これは、リポソームを形成する肺サーファクタント及び肺サーファクタント膜と、肺内に存在する細胞との間の相互作用に起因する。

【0026】

より具体的には、肺サーファクタントは、ＩＩ型肺胞細胞で産生される脂質及びタンパク質で構成される脂質－タンパク質複合体とすることができる。すなわち、肺サーファクタントは、哺乳動物の肺から収集された哺乳動物の肺サーファクタントを含んでもよい。この場合、哺乳動物は、ヒトであってもよく、ヒト以外の動物、具体的には、ブタ又はウシであってもよい。

【0027】

一般に、天然の肺サーファクタントがＩＩ型肺胞細胞に分泌され保存されるため、肺サーファクタントに基づくリポソームは、ＩＩ型肺胞細胞を効率的に標的とし、結合したタンパク質及び核酸を送達することができる。

【0028】

脂質－タンパク質複合体における脂質という用語は、一般に両親媒性である天然、合成又は半合成（すなわち、修飾天然）化合物を指す。脂質は、典型的には、親水性成分及び疎水性成分を含む。脂質としては、リン脂質、脂肪酸、脂肪アルコール、トリグリセリド、ホスファチド、油、糖脂質、脂肪族アルコール、ワックス、テルペン及びステロイドが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。「半合成（又は修飾天然）化合物」とは、何らかの方法で化学修飾された天然化合物を指す。

【0029】

リン脂質の例としては、天然及び／又は合成リン脂質が挙げられる。

【0030】

使用可能なリン脂質としては、ホスファチジルコリン（飽和及び不飽和）、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴ脂質、ジアシルグリセリド、カルジオリピン、セラミド及びセレブロシドが挙げられるが、必ずしもそれらに限定されるわけではない。例えば、リン脂質としては、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジラウリルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）（Ｃ１２：０）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）（Ｃ１４：０）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジフィタノイルホスファチジルコリン、ノナデカノイルホスファチジルコリン、アラキドイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）（Ｃ１８：１）、ジパルミトレオイルホスファチジルコリン（Ｃ１６：１）、リノレオイルホスファチジルコリン（Ｃ１８：２）、ミリストイルパルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、ステロイルミリストイルホスファチジルコリン（ＳＭＰＣ）、ステロイルパルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルパルミトレオイルホスファチジルコリン（ＰＰｏＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＳＰＳ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルセリン（ＰＯＰＳ）、大豆レシチン、卵黄レシチン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸及び卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）が挙げられるが、必ずしもそれらに限定されるわけではない。

【0031】

脂肪酸及び脂肪アルコールの例としては、ステロール、パルミチン酸、セチルアルコール、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、フィタン酸、ジパルミチン酸等が挙げられるが、必ずしもそれらに限定されるわけではない。脂肪酸の例としては、パルミチン酸が挙げられる。

【0032】

脂肪酸エステルの例としては、パルミチン酸メチル、パルミチン酸エチル、パルミチン酸イソプロピル、パルミチン酸コレステリル、パルミチン酸パルミチル、パルミチン酸ナトリウム、パルミチン酸カリウム、及びトリパルミチン等が挙げられるが、必ずしもそれらに限定されるわけではない。

【0033】

一方、肺サーファクタントは膜タンパク質を含有する。この膜タンパク質の存在は、ＩＩ型肺胞細胞を選択的かつ効果的に標的化することを可能にする。膜タンパク質は、ＳＰ－Ａ、ＳＰ－Ｂ、ＳＰ－Ｃ、及びＳＰ－Ｄからなる群から選択される少なくとも１つの天然サーファクタントポリペプチド、その一部又は混合物を含むことができる。例示的なペプチドは、天然サーファクタントポリペプチドの少なくとも約１個～５０個のアミノ酸、又は５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個若しくは５０個のアミノ酸断片を含有することができる。例示的なＳＰ－Ｂポリペプチドは、ＳＰ－Ｂの少なくとも約１個～５０個のアミノ酸、又は５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個若しくは５０個のアミノ酸断片を含有することができる。ＳＰ－Ｂペプチドは、アミノ末端ペプチド又はカルボキシ末端ペプチドであり得る。例示的なＳＰ－Ｂペプチドは、２５アミノ酸のアミノ末端ペプチドであり得る。

【0034】

本発明の別の実施形態においては、肺サーファクタントは、組換えにより生成されたサーファクタントポリペプチドを含むことができる。組換えＳＰ－Ａ、ＳＰＢ、ＳＰ－Ｃ、ＳＰ－Ｄ又はその一部は、様々な既知の手法を用いて適切な原核生物又は真核生物の発現系においてＳＰ－Ａ、ＳＰ－Ｂ、ＳＰ－Ｃ、ＳＰ－Ｄ又はその一部をコードするＤＮＡ配列を発現させることにより得ることができる。組換えベクターは、サーファクタントポリペプチド又はその一部をコードする単離された核酸を含有するように容易に適合し、組換えベクターを含む宿主細胞、並びにかかるベクター及び宿主細胞の調製方法、並びに組換え手法によるコードされたポリペプチドの産生におけるそれらの使用は十分に知らされている。サーファクタントポリペプチド又はその一部をコードする核酸配列は、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたサーファクタントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター中に提供され得る。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択及び／又は発現に望ましいタンパク質の種類等の因子に依存し得ることを理解しなければならない。ベクターのコピー数、コピー数の制御能力、及びベクターによってコードされる任意の他のタンパク質（例えば、抗生物質マーカー）の発現を考慮するべきである。例えば、標的の核酸は、融合タンパク質又はポリペプチドを含むタンパク質又はポリペプチドを産生し、培養によって増殖した細胞においてキナーゼ及びホスファターゼポリペプチドの発現及び過剰発現を引き起こすために使用することができる。

【0035】

サーファクタントポリペプチド又はその一部を発現させるために、宿主細胞を組換え遺伝子でトランスフェクトすることができる。宿主細胞は、任意の原核生物又は真核生物細胞であり得る。例えば、ポリペプチドは、細菌細胞、例えば大腸菌（E.coli）、昆虫細胞、酵母又は哺乳動物細胞において発現され得る。これらの例では、宿主細胞がヒト細胞である場合、生体内にあってもなくてもよい。他の適切な宿主細胞は、当業者に知られている。さらに、宿主細胞は、ポリペプチドの発現を最適化するために、宿主において典型的に見出されないｔＲＮＡ分子で補うことができる。ポリペプチドの発現を最大化するのに適した他の方法は、当業者に知られている。ポリペプチドを調製する方法は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、サーファクタントポリペプチド又はその一部をコードする発現ベクターをトランスフェクトした宿主細胞を、ポリペプチドの発現を可能にするために適切な条件下で培養することができる。ポリペプチドは、ポリペプチドを含有する細胞及び培地の混合物から分泌及び単離され得る。或いは、ポリペプチドは細胞質的に保存することができる。次いで、細胞を採取し、溶解し、細胞溶解物からタンパク質を単離する。

【0036】

サーファクタントポリペプチドとサーファクタント脂質とは、静水圧相互作用により相互作用する。荷電アミノ酸は脂質の極性ヘッド基と相互作用し、疎水性アミノ酸はリン脂質アシル側鎖と相互作用する。例えば、ＳＰ－Ｂ及びＳＰ－Ｃは疎水性タンパク質である。ＳＰ－Ｂ及びＳＰ－Ｃの両方がアニオン性脂質（例えば、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ））に優先的に結合する。ＳＰ－Ａ及びＳＰ－Ｄは親水性タンパク質であり、グリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質、スフィンゴ糖脂質、リピッドＡ及びリポグリカンを含む広範囲の両親媒性脂質と相互作用する。ＳＰ－ＡはＤＰＰＣに結合する。一例として、ＳＰ－Ｂ模倣体であるＫＬ４と、天然サーファクタント中の脂質、又は界面活性剤に含有される脂質との静水圧相互作用が観察される。例えば、ＫＬ４ペプチド中のリジン残基はＤＰＰＣの荷電ヘッド基と相互作用し、疎水性ロイシン残基はホスファチジルグリセロールのリン脂質アシル側鎖と相互作用する。

【0037】

一方、肺サーファクタントを用いて調製したリポソームにタンパク質が結合した複合体の平均直径範囲は特に限定されない。本発明の幾つかの実施形態においては、平均直径の範囲は、２５０ｎｍ～１２００ｎｍ、２６０ｎｍ～１２００ｎｍ、２７０ｎｍ～１２００ｎｍ、２８０ｎｍ～１２００ｎｍ、２９０ｎｍ～１２００ｎｍ、３００ｎｍ～１２００ｎｍ、２５０ｎｍ～１１５０ｎｍ、２５０ｎｍ～１１２０ｎｍ、２５０ｎｍ～１１１０ｎｍ、２６０ｎｍ～１１５０ｎｍ、２７０ｎｍ～１１２０ｎｍ、２８０ｎｍ～１１１０ｎｍ、２９８ｎｍ～１１０８ｎｍ、又は２９８．９ｎｍ～１１０８ｎｍであり得る。又は、平均直径の範囲を１μｍ以下とすることができ、１μｍ以上であると、肺胞にリポソームを送達することが困難となる場合がある。

【0038】

複合体の平均直径は、押出機キットを用いて複合体を調製する際に用いる肺サーファクタント、正に帯電したタンパク質又はペプチドの量を調整することにより適切に制御することができる。

【0039】

タンパク質又は核酸の送達のための複合体は、吸入によって肺に送達することができる。吸入器（乾燥粉末吸入器及び定量吸入器を含む）及びネブライザー（アトマイザーとしても知られる）等の吸入装置を使用して、結合したタンパク質又は核酸を肺に送達することができる。

【0040】

例示的な乾燥粉末吸入器は、Inhale Therapeutic Systemsから得ることができる。乾燥粉末吸入器は、3Mから得ることもできる。

【0041】

本発明の別の態様において、本発明は、タンパク質又は核酸の送達のための複合体を調製する方法であって、
肺サーファクタントを溶解する第１の溶液を調製する工程（工程１）と、
肺サーファクタントが溶解した調製溶液を乾燥させることにより脂質膜を形成する工程（工程２）と、
結合標的タンパク質又は核酸を溶解した第２の溶液で形成された脂質膜を処理することにより、肺サーファクタントを用いて調製されたリポソームに結合標的タンパク質又は核酸を結合させた複合体を調製する工程（工程３）と、
を含む、方法を提供する。

【0042】

以下、本発明の一態様で提供されるタンパク質又は核酸の送達のための複合体を調製する方法について、段階的に詳細に説明する。

【0043】

本発明の一態様で提供されるタンパク質又は核酸の送達のための複合体を調製する方法において、工程１は、リポソームを形成する肺サーファクタントが溶解した第１の溶液を調製する工程である。

【0044】

肺サーファクタントを溶解するために用いられる溶媒の種類としては、肺サーファクタントを容易に溶解できる任意の溶媒を制限なく用いることができ、一実施形態においては、クロロホルム、メタノール等を単独又は組み合わせて用いることができる。

【0045】

肺サーファクタント特有の性質により、肺サーファクタントを用いて調製されたリポソームは、肺に存在する細胞との相互作用により肺を選択的に標的とする効果を有する。

【0046】

一方、肺サーファクタントは、ＩＩ型肺胞細胞で産生される脂質とタンパク質とで構成される複合体（すなわち、脂質－タンパク質複合体）であり、肺サーファクタントは、膜タンパク質を含有することが好ましい。

【0047】

一態様においては、タンパク質又は核酸が肺サーファクタントを用いて調製されたリポソームに結合した複合体は、ＩＩ型肺胞細胞を標的とすることができる。

【0048】

しかしながら、これは、本発明による肺サーファクタントで調製したリポソームのＩＩ型肺胞細胞又はＩＩ型肺胞細胞に由来する肺癌細胞への送達の限定を意図するものではなく、肺送達の一例にすぎない。

【0049】

本発明の一態様で提供されるタンパク質又は核酸の送達のための複合体の調製方法において、工程２は、肺サーファクタントが溶解した調製溶液を乾燥させて脂質膜を形成する工程である。

【0050】

脂質膜を形成する方法は、従来既知の方法により行うことができ、一実施形態においては、肺サーファクタントが溶解した溶液をガラスバイアルに入れ、室温で乾燥させて脂質膜を形成する。

【0051】

本発明の一態様で提供されるタンパク質又は核酸の送達のための複合体を調製する方法において、工程３は、結合標的タンパク質又は核酸を溶解した第２の溶液で形成された脂質膜を処理することにより、肺サーファクタントを用いて調製したリポソームに結合標的タンパク質又は核酸を結合させた複合体を調製する工程である。

【0052】

ここで、結合標的タンパク質又は核酸が溶解した第２の溶液で処理することにより、形成された脂質膜を水和する工程において、正に帯電したタンパク質又はペプチドが溶解した第３の溶液も処理して、正に帯電したタンパク質又はペプチドによるリポソームへのタンパク質又は核酸の結合を誘導させる。

【0053】

上述のように、ほとんどのタンパク質又は核酸は負に帯電している。したがって、結合標的タンパク質又は核酸が負電荷を有する場合、脂質膜の水和工程では正に帯電したタンパク質又はペプチドが溶解した第３の溶液を共に処理する。このようにして、正に帯電したタンパク質又はペプチドを介して、肺サーファクタントを用いて調製したリポソームの内部及び／又は外部に、結合標的タンパク質又は核酸を安定に結合させることができる（図１）。

【0054】

肺サーファクタントを用いて調製したリポソームの内側及び／又は外側に、結合標的タンパク質又は核酸が安定に結合している場合、ｉｎ ｖｉｖｏで投与する際にタンパク質又は核酸の構造を損なうことなく、本来のタンパク質又は核酸の形態が保存された状態で肺に送達することができる。

【0055】

本発明の一態様は、負に帯電したタンパク質又は核酸を肺の奥深くに送達するために生体適合性の肺サーファクタント粒子及び正に荷電したプロタミンタンパク質を用いる粒子形成方法を最適化するための発明である。この最適化は、タンパク質又は核酸の送達のための複合体を調製する方法を実施する際に以下のように肺サーファクタント、結合標的タンパク質又は核酸、及び正に帯電したタンパク質又はペプチドの量を指定することによって達成することができる。

【0056】

より具体的には、タンパク質又は核酸の送達のための複合体を調製する方法を実施する場合、１重量部の結合標的タンパク質又は核酸に対して、１００重量部～１４０重量部の肺サーファクタントを使用する。

【0057】

同時に、１ｍｏｌの結合標的タンパク質又は核酸に対して１ｍｏｌ～１０ｍｏｌの正に帯電したタンパク質又はペプチドを用いることが好ましい。

【0058】

さらに、１重量部の結合標的核酸に対して０．５重量部～２０重量部の正に帯電したタンパク質又はペプチドを用いることが好ましい。

【0059】

（結合標的核酸の重量）／（正に帯電したタンパク質又はペプチドの重量）は、例えば、０．５、０．７５、１、１．２５、１．５、２、４であり得、好ましくは１であり得る。

【0060】

さらに、結合標的核酸と正に帯電したタンパク質又はペプチドとの複合体の重量に対する肺サーファクタントの質量比は、１：１～１：２０とすることができ、例えば、１：１～１：１８、１：２～１：１５、１：２～１：１３、１：２～１：８、１：８～１：１０、又は１：５～１：１５とすることができる。

【0061】

肺サーファクタントの場合、１重量部の結合標的タンパク質又は核酸に対して１００重量部～１３０重量部の肺サーファクタントを用いることができる。

【0062】

好ましくは、１重量部の結合標的タンパク質又は核酸に対して１００重量部～１２０重量部の肺サーファクタントを用いることができる。

【0063】

より好ましくは、１重量部の結合標的タンパク質又は核酸に対して１００重量部～１１０重量部の肺サーファクタントを用いることができる。

【0064】

最も好ましくは、１重量部の結合標的タンパク質又は核酸に対して１００重量部の肺サーファクタントを用いることができる。

【0065】

同時に、正に帯電したタンパク質又はペプチドの場合には、１ｍｏｌの結合標的タンパク質又は核酸に対して２ｍｏｌ～１０ｍｏｌの正に帯電したタンパク質又はペプチドを用いることができる。

【0066】

好ましくは、１ｍｏｌの結合標的タンパク質又は核酸に対して４ｍｏｌ～１０ｍｏｌの正に帯電したタンパク質又はペプチドを用いることができる。

【0067】

より好ましくは、１ｍｏｌの結合標的タンパク質又は核酸に対して６ｍｏｌ～１０ｍｏｌの正に帯電したタンパク質又はペプチドを用いることができる。

【0068】

より好ましくは、１ｍｏｌの結合標的タンパク質又は核酸に対して８ｍｏｌ～１０ｍｏｌの正に帯電したタンパク質又はペプチドを用いることができる。

【0069】

最も好ましくは、１ｍｏｌの結合標的タンパク質又は核酸に対して１０ｍｏｌの正に帯電したタンパク質又はペプチドを用いることができる。

【0070】

本発明の一実施形態においては、結合標的タンパク質又は核酸の量を５０μｇで固定し、肺サーファクタントの量を５ｍｇで固定した場合、正に荷電したタンパク質又はペプチドの量が１ｍｏｌの結合標的タンパク質又は核酸に基づいて変化するにつれて変化する結合標的タンパク質又は核酸の結合効率（％）の結果を図２に実証する。図２のグラフにおいて、ｘ軸上の比率は、１ｍｏｌの結合標的タンパク質又は核酸に対する正に帯電したタンパク質又はペプチドの使用ｍｏｌを意味する。

【0071】

１ｍｏｌの結合標的タンパク質に対して１ｍｏｌ、５ｍｏｌ、１０ｍｏｌ、及び２０ｍｏｌの正に帯電したタンパク質又はペプチドを用いた場合、結合標的タンパク質の結合効率（％）は徐々に増加したが、１０ｍｏｌを超える量では、結合標的タンパク質の結合効率（％）は有意に低下した。さらに、正に帯電したタンパク質又はペプチドの量が１０ｍｏｌを超えると、粒径が異常に凝集する傾向を示し、粒子の電荷が変動して不安定な形状を示した。

【0072】

すなわち、図２の結果から、１ｍｏｌの結合標的タンパク質又は核酸に対して１ｍｏｌ～１０ｍｏｌ、特に１０ｍｏｌの正に帯電したタンパク質又はペプチドを用いた場合にのみ、結合標的タンパク質又は核酸の優れた結合効率（％）が達成されることが確認された。

【0073】

要約すると、タンパク質又は核酸の送達のための複合体を調製する方法を実施する場合、１重量部の結合標的タンパク質又は核酸に対して１００重量部の肺サーファクタントと、１ｍｏｌの結合標的タンパク質又は核酸に対して１０ｍｏｌの正に帯電したタンパク質又はペプチドを同時に用いることが最も好ましい。

【0074】

一方、水和工程は、脂質膜を容易に水和させることができるものであれば制限なく行うことができる。例えば、水和は、３０℃～９０℃、３５℃～９０℃、４０℃～９０℃、４５℃～９０℃、３０℃～８０℃、３０℃～７０℃、３０℃～６０℃、３０℃～５０℃、３０℃～４５℃、３５℃～５５℃、４０℃～５０℃の温度範囲、又は４５℃の温度で行うことができる。

【0075】

また、水和工程を行った後に複合体の直径を調整する工程を更に含むことができる。本発明の一実施形態においては、複合体の直径を、押出機キットを用いて調整したが、特にこれに限定されるものではない。

【0076】

肺サーファクタントを用いて調製したリポソームにタンパク質又は核酸が結合した複合体の平均直径範囲は特に限定されない。本発明の幾つかの実施形態においては、平均直径の範囲は、２５０ｎｍ～１２００ｎｍ、２６０ｎｍ～１２００ｎｍ、２７０ｎｍ～１２００ｎｍ、２８０ｎｍ～１２００ｎｍ、２９０ｎｍ～１２００ｎｍ、３００ｎｍ～１２００ｎｍ、２５０ｎｍ～１１５０ｎｍ、２５０ｎｍ～１１２０ｎｍ、２５０ｎｍ～１１１０ｎｍ、２６０ｎｍ～１１５０ｎｍ、２７０ｎｍ～１１２０ｎｍ、２８０ｎｍ～１１１０ｎｍ、２９８ｎｍ～１１０８ｎｍ、又は２９８．９ｎｍ～１１０８ｎｍであり得る。又は、平均直径の範囲を１μｍ以下とすることができ、１μｍ以上であると、肺胞にリポソームを送達することが困難となる場合がある。

【0077】

本発明の一態様で提供される肺サーファクタントを用いて調製されたリポソームにタンパク質又は核酸が結合した複合体は、ｉｎ ｖｉｖｏで投与された場合にタンパク質又は核酸の構造を損なうことなく、本来の形態及び機能を保存しながら肺に選択的に送達することができる。さらに、この複合体は、肺胞内に存在する肺サーファクタント膜と効率的に融合して、結合したタンパク質又は核酸（遺伝子）を周囲の細胞に効率的に送達し、また毒性が低く、構造安定性に優れている。これらは、後述する実施例及び実験例によって支持される。

【0078】

これより、本発明を以下の実施例及び実験例によって詳細に説明する。

【0079】

しかしながら、以下の実施例及び実験例は、本発明の例示のためであるにすぎず、本発明の内容は実施例及び実験例に限定されるものではない。

【実施例】

【0080】

実施例１：タンパク質担持肺サーファクタント系粒子の調製
肺サーファクタントは強い負電荷を有し、ほとんどのタンパク質は弱い負電荷を有することから、正に帯電したプロタミンタンパク質を中間リンカーとして用いて、タンパク質と肺サーファクタントとの間の結合を誘導した。

【0081】

具体的な実験手順は以下の通りである。
（１）クロロホルムとメタノールの混合溶液（２：１、容量：容量）に肺サーファクタント粉末（製造元：Yuhan Corporation／製品名：ＮＥＷＦＡＣＴＥＮ）を１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解することにより肺サーファクタント溶液を調製した。

【0082】

（２）プロタミンを蒸留水に２ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解することによりプロタミンタンパク質溶液を調製した。

【0083】

（３）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を蒸留水に０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解して緑色蛍光タンパク質溶液を調製した。

【0084】

（４）（１）で調製した肺サーファクタント溶液をガラスバイアルに入れ、溶媒を蒸発させて脂質膜を形成した。

【0085】

（５）（２）で調製したプロタミンタンパク質溶液及び（３）で調製した緑色蛍光タンパク質溶液を、肺サーファクタント脂質膜を形成したガラスバイアルに入れ、この混合物を温度４５℃のホットプレート上で混合して肺サーファクタント脂質膜を水和させた。水和プロセス中に産生された粒子は、押出機キットを用いて４００ｎｍの平均直径を有するようにした。このプロセスにおいて、プロタミンタンパク質及び緑色蛍光タンパク質は、肺サーファクタント系粒子の内側及び／又は外側に結合した。

【0086】

（６）その後、粒子中の未結合タンパク質を、１００ｋＤａ膜を用いた透析により除去した。

【0087】

肺サーファクタントを用いたタンパク質担持方法の模式図を図１に示す。

【0088】

＜実施例１＞では、結合標的タンパク質又は核酸として緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を用いた。その理由は、緑色蛍光タンパク質は蛍光を発しているため、定量的に確認することが有利であり、ほとんどのタンパク質と同様に、弱い負電荷を有するからである。

【0089】

緑色蛍光タンパク質は約２６．９ｋＤａの分子量を有し、ＤＬＳ（動的光散乱）装置により電荷を測定すると、約－５ｍＶ～－７ｍＶの負電荷を有する。対応する内容を以下の表１に示す。

【0090】

【表1】

【0091】

一方、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、結合標的タンパク質又は核酸の最大結合効率（％）を達成するために、肺サーファクタント及びプロタミンの量を種々制御しながら、タンパク質に結合した肺サーファクタント系粒子を上述の工程を経て調製した。

【0092】

より具体的には、比率最適化のため、粒子の調製に用いた緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び肺サーファクタントの量を５０μｇ及び５ｍｇで固定し、プロタミンの量を変化させた。モデルタンパク質である緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の量を５０μｇで固定し、肺サーファクタントの量を５ｍｇで固定した状態で、プロタミンの量を緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のｍｏｌと比較して１（１：１ ｍｏｌ／ｍｏｌ）倍～２０（１：２０ ｍｏｌ／ｍｏｌ）倍で使用した。

【0093】

さらに、細胞内取り込みを観察するために、肺サーファクタントを以下のように非常に疎水性で難水溶性の色素であるＤｉＩで追加標識した。

【0094】

より具体的には、赤色色素ＤｉＩをメタノールに１．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させた溶液を別途調製した。（１）で調製した肺サーファクタント溶液とＤｉＩを溶解させた溶液とを混合し、肺サーファクタントとＤｉＩとを質量比１０００：１で混合できるように調整した。混合溶液をガラスバイアルに入れ、溶媒を蒸発させて脂質膜を形成した。以降の処理は、上述した工程（５）及び（６）と同様にして行った。

【0095】

実験例１：肺サーファクタント及びプロタミンの量による緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、結合標的タンパク質又は核酸の担持率（％）の変化の評価
＜実施例１＞における透析により粒子中の未結合タンパク質を除去する前後の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）蛍光を介して粒子中の結合タンパク質の量を比較することにより、担持率（％）変化を評価した。上述のように、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の量を５０μｇで固定した。

【0096】

緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び肺サーファクタントの量をそれぞれ５０μｇ及び５ｍｇで固定した状態で、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の担持率、粒径及び電荷を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の１ｍｏｌに対して１：１、１：５、１：１０、１：２０のモル比でプロタミンの量を増加させてＤＬＳで測定した。

【0097】

結果を図２に示す。

【0098】

図２は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び肺サーファクタントの量をそれぞれ５０μｇ及び５ｍｇで固定した状態で、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）１ｍｏｌに対して、プロタミンの量をモル比で１：１、１：５、１：１０、１：２０に増加させて緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）担持率、粒径及び電荷を測定した結果を示す図である。

【0099】

図２に示すように、モル比を、１：１０を超えるように高めると、担持率が低下するだけでなく、粒径も異常に凝集する傾向を示し、粒子の電荷が変動して不安定な形状を示した。そこで、最終的に、１ｍｏｌの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対して１０ｍｏｌのプロタミンを使用することにした。

【0100】

以上をまとめると、１重量部の結合標的タンパク質又は核酸（ＧＦＰ）に対して１００重量部の肺サーファクタントと、１ｍｏｌの結合標的タンパク質（ＧＦＰ）に対して１ｍｏｌ～１０ｍｏｌのプロタミン、特に１０ｍｏｌのプロタミンを用いて＜実施例１＞のタンパク質が結合した肺サーファクタント系粒子を調製することが好ましいことが確認された。

【0101】

図３に示すように、緑色蛍光タンパク質を担持した肺サーファクタント粒子の形状を、粒子の透過型電子顕微鏡写真により観察した。これにより、円形で均一なナノ粒子が良好に製造されていることを確認した。

【0102】

結合標的タンパク質又は核酸（ＧＦＰ）の１重量部に対して肺サーファクタント１００重量部と結合標的タンパク質１ｍｏｌに対してプロタミン１０ｍｏｌとを用いて調製した粒子を、以下の実験例においてタンパク質担持肺サーファクタント系粒子として用いた。

【0103】

実験例２：粒子安定性の評価
完成した粒子の安定性を評価するため、生体と同様の環境である１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含有する培養培地に粒子を入れ、３７℃で経時的に粒子のサイズを比較した。さらに、粒子の安定性は、ネブライザー処理前後の粒径を比較することにより試験した。さらに、ＩＩ型肺胞細胞由来のＡ５４９肺癌細胞に対する粒子毒性を試験した。

【0104】

【表2】

【0105】

表２に示すように、粒子の安定性を、ネブライザー処理前後の粒径を比較することにより確認した。粒子の安定性を、ネブライザー処理前に約２６１ｎｍのサイズの粒子が形成され、ネブライザー処理後に約２５３．８ｎｍのサイズの粒子が形成されたことを確認することによって検証した。

【0106】

結果を図４に示す。

【0107】

図４は、完成した粒子の安定性を評価するために、生体と同様の環境であるＦＢＳ（ウシ胎児血清）を１０％（容量／容量）含有する培養培地に粒子を入れた後の３７℃における経時的な粒径の変化を確認した結果を示す図である。

【0108】

図４に示すように、粒子のサイズを１２０分まで１時間毎にＤＬＳ装置で調べたところ、サイズは変化せず、粒子がｉｎ ｖｉｖｏ環境において安定であることを確認した。さらに、ＧＦＰの蛍光が変化しなかったことを確認することにより、担持されたタンパク質が対応する環境において変性していないことを確認した。

【0109】

さらに、粒子自体の毒性を評価するため、ＩＩ型肺胞細胞由来肺癌細胞株Ａ５４９を９６ウェルプレート（５０００細胞／ウェル）に分散させ、１日後に肺サーファクタントに基づいて０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、及び１ｍｇ／ｍｌの濃度の粒子で該細胞を処理した。約１時間後、培地をＰＢＳで置き換え、２４時間後に細胞死率を確認した。その結果、１ｍｇ／ｍｌの濃度で処理しても、粒子毒性は認められなかった。

【0110】

実験例３：細胞種別肺サーファクタント粒子の細胞内送達効率の評価
肺サーファクタント－タンパク質－プロタミン（Ｓｕｒｆ－Ｐｒｏ－ＧＦＰ）粒子の細胞内送達を確認した。

【0111】

まず、肺サーファクタントによる細胞内送達効果を検証するために、肺サーファクタントを含まないプロタミン－タンパク質複合体（Ｐｒｏ－ＧＦＰ）を対照として用い、細胞内送達が達成されたか否かを判定した。７μｇのタンパク質（ＧＦＰ）に基づいて、プロタミンを１：１０のモル比で混合し、複合体を形成した。この複合体は、約１３６４ｎｍの平均直径、及び１５．３ｍＶの正電荷を有した。調製した対照複合体でヒト肺胞上皮細胞（ＨＰＡｅｐｉｃ）、マクロファージ（Ｒａｗ２６４．７）、又はＩＩ型肺胞細胞由来肺癌細胞（Ａ５４９）をそれぞれ２４時間処理し、共焦点顕微鏡により細胞内送達を確認した。このとき、細胞を実験の２４時間前に６ウェルプレート（３００００細胞／ウェル）で継代培養した。

【0112】

結果を図５に示す。

【0113】

図５は、対照群であるプロタミン－タンパク質複合体（Ｐｒｏ－ＧＦＰ）で、ヒト肺胞上皮細胞（ＨＰＡｅｐｉｃ）、マクロファージ（Ｒａｗ２６４．７）、又はＩＩ型肺胞細胞由来肺癌細胞（Ａ５４９）をそれぞれ２４時間処理した後の共焦点顕微鏡下で観察される細胞内送達を確認した結果を示す図である。

【0114】

図５に示すように、核をヘキスト色素で５分間染色し（青色）、共焦点顕微鏡下でタンパク質蛍光（緑色）を観察したところ、３つの細胞群のいずれにおいても細胞内送達が円滑に起こらなかったことが確認された。

【0115】

次に、肺サーファクタント－タンパク質－プロタミン（Ｓｕｒｆ－Ｐｒｏ－ＧＦＰ）粒子で同じ細胞を処理した。０．２ｍｇの肺サーファクタント粒子をＤｉＩ蛍光（メタノール中１．２５ｍｇ／ｍｌ）で標識し、粒子（赤色）及びタンパク質（緑色）が細胞内に良好に送達されたかどうかを確認した。２４時間の処理後、細胞核をヘキストで染色し、共焦点顕微鏡下で細胞内送達を確認した。このとき、細胞を実験の２４時間前に６ウェルプレート（３００００細胞／ウェル）で継代培養した。

【0116】

結果を図６、図７及び図８に示す。

【0117】

図６は、肺サーファクタント－タンパク質－プロタミン（Ｓｕｒｆ－Ｐｒｏ－ＧＦＰ）粒子でヒト肺胞上皮細胞（ＨＰＡｅｐｉｃ）を２４時間処理した後に共焦点顕微鏡下で観察される細胞内送達を確認した結果を示す図である。

【0118】

図７は、肺サーファクタント－タンパク質－プロタミン（Ｓｕｒｆ－Ｐｒｏ－ＧＦＰ）粒子でマクロファージ（Ｒａｗ２６４．７）を２４時間処理した後に共焦点顕微鏡下で観察される細胞内送達を確認した結果を示す図である。

【0119】

図８は、肺サーファクタント－タンパク質－プロタミン（Ｓｕｒｆ－Ｐｒｏ－ＧＦＰ）粒子でＩＩ型肺胞細胞由来肺癌細胞（Ａ５４９）を２４時間処理した後に共焦点顕微鏡下で観察される細胞内送達を確認した結果を示す図である。

【0120】

図６、図７及び図８に示すように、Ｓｕｒｆ－Ｐｒｏ－ＧＦＰ粒子はヒト肺胞上皮細胞（ＨＰＡｅｐｉｃ細胞）にはほとんど送達されないことが確認された。また、Ｓｕｒｆ－Ｐｒｏ－ＧＦＰ粒子がマクロファージ（Ｒａｗ２６４．７）にほとんど送達されないことも確認された。一方、ＩＩ型肺胞細胞由来肺癌細胞（Ａ５４９）の場合、肺サーファクタントとの相互作用により粒子が細胞内に良好に送達され、粒子に担持されたタンパク質も細胞内に良好に送達されることがわかった。

【0121】

実験例４：動物マウスモデルにおける肺サーファクタント粒子の送達効率の評価
実際の小動物マウスモデルにおいてＳＧＰ粒子が肺に良好に送達されたかどうかを確認するために、吸入により対照ＧＦＰタンパク質のみを肺に送達した場合と、ＳＧＰ粒子を送達した場合とを比較した。このとき、タンパク質又はＳＧＰ粒子を、SCIREQのネブライザーを用いた吸入によりマウスに送達した。１５μｇのタンパク質及び同量のタンパク質結合ＳＧＰ粒子を吸入によって動物モデルに送達した。１時間後、実際の小動物マウスモデルにおいてＳｕｒｆ－Ｐｒｏ－ＧＦＰ粒子が肺に良好に送達されたかどうかを確認するために、吸入により対照ＧＦＰタンパク質のみを肺に送達した場合と、Ｓｕｒｆ－Ｐｒｏ－ＧＦＰ粒子を送達した場合とを比較した。このとき、タンパク質又はＳＧＰ粒子を、SCIREQのネブライザーを用いた吸入によりマウスに送達した。１５μｇのタンパク質と同量のタンパク質結合ＳＧＰ粒子を吸入により動物モデルに送達した後、１時間後に肺を切除し、ＩＶＩＳ装置を用いて肺内のＧＦＰシグナルを分析した。

【0122】

結果を図９に示す。

【0123】

図９は、実際の小動物マウスモデルにおいてＳｕｒｆ－Ｐｒｏ－ＧＦＰ粒子が良好に肺に送達されたかどうかを確認するために、吸入により対照ＧＦＰタンパク質のみを肺に送達した場合とＳｕｒｆ－Ｐｒｏ－ＧＦＰ粒子を送達した場合を比較した結果を示す図である。

【0124】

図９に示すように、ＧＦＰタンパク質のみを送達した場合、ＧＦＰタンパク質は肺全体に広がらず、気道に濃縮されたが、一方、＜実施例１＞のＳｕｒｆ－Ｐｒｏ－ＧＦＰ粒子として送達された場合、ＧＦＰタンパク質は肺全体に送達された。

【0125】

実験例５：動物マウスモデルにおける吸入後の経時的な肺サーファクタント粒子の臓器分布の評価
時間によるＳｕｒｆ－Ｐｒｏ－ＧＦＰ粒子の臓器分布を確認するため、１ｍｇの肺サーファクタントに基づいてＳｕｒｆ－Ｐｒｏ－ＧＦＰ粒子を調製し、次いでマウス動物モデルに吸入により送達し、時間に応じたタンパク質及び粒子の臓器分布を確認した。このとき、粒子をＤｉＩ（メタノール中１ｍｇ／ｍｌ）蛍光で標識し、ＧＦＰ蛍光によりタンパク質を観察した。吸入送達後、マウスを０時間、１時間、６時間、及び２４時間インキュベートし、臓器を取り出した。次いで、粒子の分布を確認した。臓器におけるＤｉＲの分布を、ＬｉＣｏＲ装置を用いて確認した。さらに、ＧＦＰシグナルを、取り出した臓器においてＩＶＩＳ装置を用いて測定した。

【0126】

結果を図１０に示す。

【0127】

図１０は、経時的にＳｕｒｆ－Ｐｒｏ－ＧＦＰ粒子の臓器分布を確認するために、Ｓｕｒｆ－Ｐｒｏ－ＧＦＰ粒子を１ｍｇの肺サーファクタントに基づいて作製した後、吸入によりマウス動物モデルに粒子を送達し、経時的にタンパク質及び粒子の臓器分布を確認した結果を示す図である。

【0128】

図１０に示すように、臓器におけるＤｉＲの分布を確認すると、２４時間まで肺にのみ粒子が分布していることが確認された。図１０において、赤色は臓器自発蛍光を示し、緑色は肺サーファクタント粒子を示す。

【0129】

以上の結果を定量化した結果を図１１に示す。

【0130】

図１１は、１ｍｇの肺サーファクタントに基づいて肺サーファクタント－タンパク質－プロタミン（Ｓｕｒｆ－Ｐｒｏ－ＧＦＰ）粒子を製造して吸入により該粒子をマウス動物モデルに送達した後、経時的にタンパク質及び粒子の臓器分布を確認した結果である図１０の結果を定量化したグラフを示す図である。

【0131】

図１１に示すように、粒子とタンパク質の両方が肺にのみ２４時間存在し、粒子及びタンパク質のシグナルの傾向は類似していた。このことから、吸入により送達された粒子及びタンパク質は肺内に良好にとどまり、他の臓器に拡散しないことが確認された。

【0132】

実施例２：核酸担持肺サーファクタント系粒子の調製
＜２－１＞プロタミン－ｓｉＲＮＡ複合体の調製
核酸担持肺サーファクタント系粒子を調製するため、プロタミン－ｓｉＲＮＡ（Ｐｒｏ－ｓｉＲＮＡ）複合体を以下のようにして調製した。まず、ｓｉＲＮＡを蒸留水に１０ｎｍｏｌ／ｍＬの濃度で溶解することによってｓｉＲＮＡ溶液を調製し、プロタミンを１ｍｇ／ｍＬの濃度で蒸留水に溶解することによってプロタミンタンパク質溶液を調製した。このとき、ｓｉＲＮＡとプロタミンの質量比に応じたサイズ及び電荷を測定するために、ｓｉＲＮＡとプロタミンを２ｎｍｏｌのｓｉＲＮＡに基づいて０．５：１、０．７５：１、１：１、１．２５：１、１．５：１、２：１、４：１の質量比で混合し、この混合物を室温で約１５分間反応させてｓｉＲＮＡ－プロタミン複合体を調製した。

【0133】

図１２は、肺サーファクタントを用いた核酸担持方法の模式図を示す。

【0134】

調製したプロタミン－ｓｉＲＮＡ複合体のサイズ及び電荷を、ＤＬＳ装置を用いて測定し、その結果を図１３に示す。結果より、ｓｉＲＮＡとプロタミンの質量比が増加するにつれて、プロタミン－ｓｉＲＮＡ複合体が負に帯電することが確認された。一方、負に帯電した肺サーファクタントに良好に担持される正に帯電した複合体を選択することが効率的である。そこで、図１３からわかるように、核酸担持肺サーファクタント系粒子を、サイズ約２００ｎｍ、正電荷２０ｍＶ、及び質量比１：１を有する複合体を選択することによって調製した。

【0135】

＜２－２＞ｓｉＲＮＡ結合肺サーファクタント系粒子の調製
実施例＜２－１＞で調製したプロタミン－ｓｉＲＮＡ複合体を用いてｓｉＲＮＡ結合肺サーファクタント系粒子を調製するため、肺サーファクタント（Ｎｅｗｆａｃｔｅｎ）をクロロホルムとメタノール（２：１）の溶液に１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解することにより、肺サーファクタント溶液を調製した。次いで、実施例＜２－１＞で調製したプロタミン－ｓｉＲＮＡ複合体に対して質量比１：５又は１：１０の肺サーファクタント溶液をガラスバイアルに入れ、溶媒を蒸発させて脂質膜を形成した。その後、ｓｉＲＮＡ－プロタミン複合体を脂質膜に添加し、約４５℃以上で水和処理を行い、ｓｉＲＮＡ結合肺サーファクタント系粒子を調製した。

【0136】

調製したｓｉＲＮＡ結合肺サーファクタント系粒子のサイズ及び電荷を、ＤＬＳ装置を用いて測定した結果を下記表３に示す。

【0137】

【表3】

【0138】

表３に示すように、肺サーファクタント単独の電荷は約－４０ｍＶであり、複合体が肺サーファクタントに良好に担持されたとき、最終粒子も同様の電荷を有していた。複合体に対する肺サーファクタントの比率を変化させたところ、粒子を１：１０の比率で製造した場合、サイズが約２５０ｎｍ及び－３５ｍＶの粒子が製造されたことを確認した。

【0139】

実験例６：ＩＩ型肺胞細胞由来肺癌細胞への肺サーファクタント粒子の送達効率の評価
実施例２で調製した肺サーファクタント－プロタミン－ｓｉＲＮＡ（Ｓｕｒｆ－Ｐｒｏ－ｓｉＲＮＡ）粒子のＩＩ型肺胞細胞由来肺癌細胞への送達を確認した。肺サーファクタントによる肺細胞への送達の効果を検証するために、実施例＜２－１＞で調製した肺サーファクタントを含まないプロタミン－ｓｉＲＮＡ（Ｐｒｏ－ｓｉＲＮＡ）を対照として用い細胞内送達を確認した。

【0140】

まず、Ａ５４９細胞を６ウェルプレート（２００００細胞／ウェル）で培養し、１日後に陰性対照、プロタミン－フルオレセイン－ｓｉＲＮＡ複合体、及び肺サーファクタント－プロタミン－フルオレセイン－ｓｉＲＮＡ（Ｓｕｒｆ－Ｐｒｏ－ｓｉＲＮＡ）で細胞を処理した。このとき、全群を処理したｓｉＲＮＡの濃度を２ｎｍｏｌ／ｍＬに固定した。約２４時間培養した後、共焦点顕微鏡下で細胞を写真撮影し、その結果を図１４に示す。

【0141】

図１４に示すように、Ｐｒｏ－ｓｉＲＮＡのみを用いた場合には、ＩＩ型肺胞細胞由来Ａ５４９肺癌細胞に効果的に送達されないことが確認された。一方、肺サーファクタントを用いてｓｉＲＮＡを送達すると、ＩＩ型肺胞細胞由来肺癌細胞に効果的に送達できることが確認された。

【0142】

実験例７：肺サーファクタントを用いたｓｉＲＮＡのタンパク質発現低下能の確認
実施例２で調製した核酸担持肺サーファクタント系粒子を用いてｓｉＲＮＡのタンパク質発現阻害効果を確認するために、以下の実験を行った。具体的には、陰性対照ｓｉＲＮＡとルシフェラーゼｓｉＲＮＡ自体の効果を比較するため、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡを、複合体を介して送達した場合と肺サーファクタント粒子の形態で送達した場合との効果差を確認するため、及び細胞培養環境におけるリポフェクタミン３０００と肺サーファクタントとの効率の違いを確認するため、以下の実験を行った。

【0143】

まず、Ａ５４９－ルシフェラーゼ細胞を２４ウェルプレート（３００００細胞／ウェル）で培養し、陰性対照、プロタミン－ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ複合体（Ｐｒｏ－Ｌｕｃ－ｓｉＲＮＡ）、肺サーファクタント－プロタミン－陰性対照ｓｉＲＮＡ（Ｓｕｒｆ－Ｐｒｏ－ＮＣ－ｓｉＲＮＡ）、肺サーファクタント－プロタミン－ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ（Ｓｕｒｆ－Ｐｒｏ－Ｌｕｃ－ｓｉＲＮＡ）、及びリポフェクタミン３０００－ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ（ＬＦ－Ｌｕｃ－ｓｉＲＮＡ）で細胞を処理した。このとき、各群を約２００ｐｍｏｌ／ｍＬの濃度のｓｉＲＮＡで処理した。細胞を２４時間培養し、細胞培地を洗浄した後、細胞を更に２４時間培養してタンパク質発現を減少させた。次いで、各ウェルを１０μＬのルシフェリン（１２．５ｍｇ／ｍＬ）で処理して発光を確認し、ＩＶＩＳ装置を用いて発光を測定した。さらに、細胞死率を確認するためにＭＴＴアッセイを行った。結果を図１５及び図１６に示す。

【0144】

その結果、プロタミン－ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ複合体単独ではタンパク質発現低下能が確認できず、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡを肺サーファクタント粒子の形態で送達した場合、タンパク質発現低下能を確認することができた。対照群と比較すると、統計的に有意な差があったが、効率はリポフェクタミンのものよりも低かった。しかしながら、肺サーファクタントとは異なり、リポフェクタミンはｉｎ ｖｉｖｏでは全く使用できないという欠点があるため、肺サーファクタント粒子は肺におけるｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションに有効に使用され得る。

【0145】

実験例８：肺サーファクタントを用いた肺癌アポトーシスの確認
まず、Ａ５４９－ルシフェラーゼ細胞を２４ウェルプレート（３００００細胞／ウェル）で培養し、陰性対照、プロタミン－ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ複合体（Ｐｒｏ－Ｌｕｃ－ｓｉＲＮＡ）、肺サーファクタント－プロタミン－陰性対照ｓｉＲＮＡ（Ｓｕｒｆ－Ｐｒｏ－ＮＣ－ｓｉＲＮＡ）、肺サーファクタント－プロタミン－ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ（Ｓｕｒｆ－Ｐｒｏ－Ｌｕｃ－ｓｉＲＮＡ）、及びリポフェクタミン３０００－ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ（ＬＦ－Ｌｕｃ－ｓｉＲＮＡ）で細胞を処理した。このとき、各群を約２００ｐｍｏｌ／ｍＬの濃度のｓｉＲＮＡで処理した。細胞を２４時間培養し、細胞培地を洗浄した後、細胞を更に２４時間培養してタンパク質発現を減少させた。次いで、各ウェルを１０μＬのルシフェリン（１２．５ｍｇ／ｍＬ）で処理して発光を確認し、ＩＶＩＳ装置を用いて発光を測定した。さらに、細胞死率を確認するためにＭＴＴアッセイを行った。結果を図１５及び図１６に示す。

【0146】

その結果、プロタミン－ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ複合体単独ではタンパク質発現低下能が確認できず、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡを肺サーファクタント粒子の形態で送達した場合、タンパク質発現低下能を確認することができた。対照群と比較すると、統計的に有意な差があったが、効率はリポフェクタミンのものよりも低かった。しかしながら、肺サーファクタントとは異なり、リポフェクタミンはｉｎ ｖｉｖｏでは全く使用できないという欠点があるため、肺サーファクタント粒子は肺におけるｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションに有効に使用され得る。

【0147】

ＫＲＡＳサイレンシングｓｉＲＮＡ（ヒト）
センス：５’－ＧＵＣＵＣＵＵＧＧＡＵＡＵＵＣＵＣＧＡ－３’（配列番号１）
アンチセンス：３’－ＵＣＧＡＧＡＡＵＡＵＣＣＡＡＧＡＧＡＣ－５’（配列番号２）

【0148】

ＲＰＮ２サイレンシングｓｉＲＮＡ（ヒトリボホリンＩＩ）
センス：５’－ＧＧＣＣＡＣＵＧＵＵＡＡＡＣＵＡＧＡＡＣＡ－３’（配列番号３）
アンチセンス：３’－ＧＵＣＣＧＧＵＧＡＣＡＡＵＵＵＧＡＵＣＵＵ－５’（配列番号４）

【0149】

Ａ５４９－ルシフェラーゼ細胞を２４ウェルプレート（３００００細胞／ウェル）で培養し、陰性対照、リポフェクタミン３０００－ＲＰＮ２ ｓｉＲＮＡ（ＬＦ－ＲＰＮ２－ｓｉＲＮＡ）、肺サーファクタント－プロタミン－ＲＰＮ２ ｓｉＲＮＡ（Ｓｕｒｆ－Ｐｒｏ－ＲＰＮ２－ｓｉＲＮＡ）、リポフェクタミン３０００－ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ、及び肺サーファクタント－プロタミン－ＫＲＡＳ－ｓｉＲＮＡ（Ｓｕｒｆ－Ｐｒｏ－ＫＲＡＳ－ｓｉＲＮＡ）で細胞を処理した。このとき、各群を約３００ｐｍｏｌ／ｍＬの濃度のｓｉＲＮＡで処理した。細胞を２４時間培養し、細胞培地を洗浄した後、細胞を更に２４時間培養してタンパク質発現を減少させた。次いで、ＭＴＴアッセイを行い、細胞死率を確認した。結果を図１７に示す。

【0150】

図１７に示すように、ＫＲＡＳ－ｓｉＲＮＡ及びＲＰＮ２－ｓｉＲＮＡの両方を肺サーファクタント粒子の形態で細胞に送達した場合、ＩＩ型肺胞細胞由来肺癌に対して優れたアポトーシス能を示した。比較のためにリポフェクタミンで処置した群も同様の結果を示した。このことから、吸入によって送達される本発明による実施例のｓｉＲＮＡ担持肺サーファクタント粒子は、肺におけるタンパク質発現の抑制に優れていることが確認された。

【0151】

したがって、本発明による肺サーファクタント粒子は、肺疾患において誘導される異常なタンパク質発現を抑制する手段としてｓｉＲＮＡ等の核酸を肺細胞に効果的に送達するために用いることができる。代表的な肺疾患である肺癌は、様々な癌遺伝子によって引き起こされ、対応するタンパク質が過剰発現するにつれて悪化する傾向がある。したがって、肺癌を抑制するためには癌遺伝子を阻害できる技術が必要であり、本発明による核酸担持肺サーファクタント系粒子を用いてその阻害を達成することができる。

【0152】

実施例３：タンパク質担持肺サーファクタント系粒子の調製－２
以下の実験工程を経て、免疫タンパク質ＧＭ－ＣＳＦ担持肺サーファクタント系粒子を調製した。

【0153】

具体的な実験手順は以下の通りである。
（１）クロロホルムとメタノールの混合溶液（２：１、容量：容量）に肺サーファクタント粉末（Ｎｅｗｆａｃｔｅｎ）を１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解することにより肺サーファクタント溶液を調製した。

【0154】

（２）ＧＭ－ＳＣＦを蒸留水に１０μｇ／ｍｌの濃度で溶解することによりＧＭ－ＳＣＦ溶液（１ｍｌ）を調製した。

【0155】

（３）ＧＭ－ＳＣＦの１０倍モルの硫酸プロタミン溶液を調製した。

【0156】

（４）上記（１）で調製した肺サーファクタント（１ｍｇ）を用いて脂質膜を形成した。

【0157】

（５）（２）で調製した１ｍｌのＧＭ－ＳＣＦ溶液及び（３）で調製した硫酸プロタミン溶液を、脂質膜に加え、温度約４５℃のホットプレート上で混合して肺サーファクタント脂質膜を水和させた。水和プロセス中に産生された粒子は、押出機キット（ナノ粒子化）を用いて４００ｎｍの平均直径を有するようにした。このプロセスにおいて、プロタミンタンパク質及びＧＭ－ＳＣＦは、肺サーファクタント系粒子に結合した。

【0158】

（６）粒子に担持されていないタンパク質を除去するため、蒸留水中で１００ｋＤａ膜を用いて少なくとも８時間透析を行った。

【0159】

（７）ＤＬＳ装置を用いて調製した粒子のサイズ及び電荷を測定し、ＥＬＩＳＡキットを用いて調製した粒子に担持されたＧＭ－ＳＣＦの量を測定した。

【0160】

結果を以下の表４に示す。

【0161】

【表4】

【0162】

負に帯電した免疫タンパク質である１０μｇのＧＭ－ＣＳＦを、電荷を用いて１ｍｇの肺サーファクタントに担持させた。その結果、ＧＭ－ＣＳＦを担持した肺サーファクタント粒子は、約３００ｎｍのサイズ、及び約－２０ｍＶの電荷を有することが確認された。担持されていないタンパク質を除去した後に担持されたＧＭ－ＣＳＦの量を測定したところ、約１．０６μｇのタンパク質が担持されていることが確認された。これにより、免疫タンパク質であるＧＭ－ＣＳＦを、プロタミンを用いて肺サーファクタント系粒子に効率的に担持できることが確認された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【配列表】

2023513132000001.app

【手続補正書】

【提出日】2022-10-24

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

タンパク質又は核酸の送達のための組み合わせ物であって、
肺サーファクタントを用いて調製されたリポソームに結合したタンパク質又は核酸である、組み合わせ物。

【請求項2】

前記リポソームに結合したタンパク質又は核酸が、正に帯電したタンパク質又はペプチドを介して前記リポソームに連関されている、請求項１に記載の組み合わせ物。

【請求項3】

前記正に帯電したタンパク質がプロタミンである、請求項２に記載の組み合わせ物。

【請求項4】

前記リポソームに結合したタンパク質が負に帯電したタンパク質である、請求項１に記載の組み合わせ物。

【請求項5】

前記組み合わせ物がリポソーム結合タンパク質又は核酸を選択的に肺に送達するためのものである、請求項１に記載の組み合わせ物。

【請求項6】

前記肺サーファクタントがＩＩ型肺胞細胞で産生されるリポタンパク質複合体である、請求項１に記載の組み合わせ物。

【請求項7】

前記肺サーファクタントが膜タンパク質を含有する、請求項１に記載の組み合わせ物。

【請求項8】

前記複合体がＩＩ型肺胞細胞由来肺癌細胞を標的とする、請求項１に記載の組み合わせ物。

【請求項9】

前記複合体が２５０ｎｍ～１２００ｎｍの範囲の平均直径を有する、請求項１に記載の組み合わせ物。

【請求項10】

タンパク質又は核酸の送達のための組み合わせ物を調製する方法であって、
肺サーファクタントを溶解する第１の溶液を調製する工程と、
前記肺サーファクタントが溶解した調製溶液を乾燥させることにより脂質膜を形成する工程と、
結合標的タンパク質又は核酸を溶解して水和させる第２の溶液で前記形成された脂質膜を処理することにより、肺サーファクタントを用いて調製されたリポソームに結合標的タンパク質又は核酸を結合させた組み合わせ物を調製する工程と、
を含む、方法。

【請求項11】

前記結合標的タンパク質又は核酸が溶解した前記第２の溶液で処理することにより、前記形成された脂質膜を水和する工程において、正に帯電したタンパク質又はペプチドが溶解した第３の溶液も処理して、前記タンパク質又は核酸を、前記正に帯電したタンパク質又はペプチドにより前記リポソームに結合させる、請求項１０に記載の組み合わせ物を調製する方法。

【請求項12】

前記組み合わせ物を調製する方法を行う際に、１重量部の前記結合標的タンパク質又は核酸に対して１００重量部～１４０重量部の前記肺サーファクタントを用い、同時に１ｍｏｌの前記結合標的タンパク質又は核酸に対して１ｍｏｌ～１０ｍｏｌの前記正に帯電したタンパク質又はペプチドを使用する、請求項１１に記載の組み合わせ物を調製する方法。

【請求項13】

前記組み合わせ物を調製する方法を行う際に、１重量部の前記結合標的タンパク質又は核酸に対して１００重量部の前記肺サーファクタントを用い、同時に１ｍｏｌの前記結合標的タンパク質又は核酸に対して１０ｍｏｌの前記正に帯電したタンパク質又はペプチドを使用する、請求項１１に記載の組み合わせ物を調製する方法。

【請求項14】

前記組み合わせ物を調製する方法を行う際に、１ｍｏｌの前記結合標的タンパク質又は核酸に対して０．５ｍｏｌ～２０ｍｏｌの前記正に帯電したタンパク質又はペプチドを使用する、請求項１１に記載の組み合わせ物を調製する方法。

【請求項15】

前記水和工程が３０℃～９０℃の温度で行われる、請求項１０に記載の組み合わせ物を調製する方法。

【請求項16】

前記水和工程を行った後に前記複合体の直径を調整する工程を更に含む、請求項１０に記載の組み合わせ物
を調製する方法。

【国際調査報告】