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特表2023-513200抗ＣＤ３および抗ＣＤ１２３二重特異性抗体およびその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-30
(54)【発明の名称】抗ＣＤ３および抗ＣＤ１２３二重特異性抗体およびその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20230323BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230323BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20230323BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230323BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20230323BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
A61P35/00
A61P35/02
A61K39/395 N
A61K39/395 D
C12N15/13
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022547913
(86)(22)【出願日】2020-03-30
(85)【翻訳文提出日】2022-09-29
(86)【国際出願番号】 CN2020082151
(87)【国際公開番号】W WO2021155635
(87)【国際公開日】2021-08-12
(31)【優先権主張番号】202010080449.9
(32)【優先日】2020-02-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522312126
【氏名又は名称】北京智仁美博生物科技有限公司
(71)【出願人】
【識別番号】522312137
【氏名又は名称】智翔（上海）医▲葯▼科技有限公司
(71)【出願人】
【識別番号】522312159
【氏名又は名称】重▲慶▼智翔金泰生物制▲葯▼股▲フン▼有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】▲劉▼ 志▲剛▼
(72)【発明者】
【氏名】▲ハオ▼ 小勃
(72)【発明者】
【氏名】▲張▼ 雪萍
(72)【発明者】
【氏名】▲劉▼ 玉▲蘭▼
(72)【発明者】
【氏名】郭 晶晶
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085AA13
4C085AA16
4C085BB11
4C085DD62
4H045AA11
4H045BA09
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA22
4H045EA31
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分および／またはヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分を含む二重特異性抗体を提供する。また、本発明は、前記二重特異性抗体の医学的使用および生物学的使用をさらに提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分を含む二重特異性抗体であって、前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分は、
配列番号１に記載のＨＣＤＲ１、
配列番号２に記載のＨＣＤＲ２、
配列番号３に記載のＨＣＤＲ３、
配列番号４に記載のＬＣＤＲ１、
配列番号５に記載のＬＣＤＲ２、および
配列番号６に記載のＬＣＤＲ３を含み、
ここで、ＨＣＤＲおよびＬＣＤＲはＫａｂａｔに従って定義される、
二重特異性抗体。
【請求項2】
ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分を含む二重特異性抗体であって、前記ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分は、
配列番号７に記載のＨＣＤＲ１、
配列番号８に記載のＨＣＤＲ２、
配列番号９に記載のＨＣＤＲ３、
配列番号４に記載のＬＣＤＲ１、
配列番号５に記載のＬＣＤＲ２、および
配列番号６に記載のＬＣＤＲ３を含み、
ここで、ＨＣＤＲおよびＬＣＤＲはＫａｂａｔに従って定義される、
二重特異性抗体。
【請求項3】
ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分およびヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分を含む二重特異性抗体であって、好ましくは、前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分は、
配列番号１に記載のＨＣＤＲ１、
配列番号２に記載のＨＣＤＲ２、
配列番号３に記載のＨＣＤＲ３、
配列番号４に記載のＬＣＤＲ１、
配列番号５に記載のＬＣＤＲ２、および
配列番号６に記載のＬＣＤＲ３を含み、ならびに／あるいは
前記ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分は、
配列番号７に記載のＨＣＤＲ１、
配列番号８に記載のＨＣＤＲ２、
配列番号９に記載のＨＣＤＲ３、
配列番号４に記載のＬＣＤＲ１、
配列番号５に記載のＬＣＤＲ２、および
配列番号６に記載のＬＣＤＲ３を含み、
ここで、ＨＣＤＲおよびＬＣＤＲはＫａｂａｔに従って定義される、
二重特異性抗体。
【請求項4】
請求項３に記載の二重特異性抗体であって、前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分および前記ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分は、同一の軽鎖可変領域を含み、好ましくは、同一の軽鎖を含み、ならびに／あるいは同一のヒンジ領域を備える重鎖定常領域を２種類含むＩｇＧ１抗体であり、前記ヒンジ領域のアミノ酸配列は配列番号１０に記載される、二重特異性抗体。
【請求項5】
請求項３または４に記載の二重特異性抗体であって、第１の重鎖定常領域および第２の重鎖定常領域を含むＩｇＧ１抗体であり、そのうち前記第１の重鎖定常領域の３５４番目および３６６番目のアミノ酸は、それぞれＣおよびＷであり、前記第２の重鎖定常領域の３４９、３６６、３６８および４０７番目のアミノ酸は、それぞれＣ、Ｓ、ＡおよびＶであり、ならびに／あるいは
前記第１の重鎖定常領域および第２の重鎖定常領域の２３４、２３５および３３１番目のアミノ酸は、それぞれＦ、ＥおよびＳであり、
抗体定常領域のアミノ酸位置は、ＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従って決定される、
二重特異性抗体。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体であって、前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分は、配列番号１１に記載の重鎖可変領域、および配列番号１２に記載の軽鎖可変領域を含み、ならびに／あるいは前記ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分は、配列番号１３に記載の重鎖可変領域、および配列番号１２に記載の軽鎖可変領域を含む、
二重特異性抗体。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体であって、前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分および／または前記ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分は、一本鎖抗体（ｓｃｆｖ）またはＦａｂ断片を含み、好ましくは、前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分はＦａｂ断片を含み、前記ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分はＦａｂ断片を含み、または
前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分はＦａｂ断片を含み、前記ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分は一本鎖抗体（ｓｃｆｖ）を含み、または
前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分は一本鎖抗体（ｓｃｆｖ）を含み、前記ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分はＦａｂ断片を含み、または
前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分は一本鎖抗体（ｓｃｆｖ）を含み、前記ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分は一本鎖抗体（ｓｃｆｖ）を含む、
二重特異性抗体。
【請求項8】
請求項３に記載の二重特異性抗体であって、前記抗体は第１のアームおよび第２のアームを備え、そのうち前記第１のアームはヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分を含み、前記第２のアームはヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分を含み、そのうち、前記第１のアームは、配列番号１１に記載の重鎖可変領域のアミノ酸配列、配列番号３１に記載の重鎖定常領域のアミノ酸配列、配列番号１２に記載の軽鎖可変領域のアミノ酸配列、および配列番号３２に記載の軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含み、
前記第２のアームは、配列番号１３に記載の重鎖可変領域のアミノ酸配列、配列番号３０に記載の重鎖定常領域のアミノ酸配列、配列番号１２に記載の軽鎖可変領域のアミノ酸配列、および配列番号３２に記載の軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む、
二重特異性抗体。
【請求項9】
ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分およびヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分を含む二重特異性抗体であって、同一のヒンジ領域を備える重鎖定常領域を２種類含むＩｇＧ１抗体であり、前記ヒンジ領域のアミノ酸配列は配列番号１０に記載される、二重特異性抗体。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を含む、医薬組成物。
【請求項11】
請求項１０に記載の医薬組成物であって、ＣＤ１２３陽性腫瘍を予防または治療するために用いられる、医薬組成物。前記ＣＤ１２３陽性腫瘍は、好ましくは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）からなる群から選ばれる。
【請求項12】
請求項１～９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体、または請求項１０または１１に記載の医薬組成物の、ＣＤ１２３陽性腫瘍を予防または治療するための医薬の製造における、使用。前記ＣＤ１２３陽性腫瘍は、好ましくは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）からなる群から選ばれる。
【請求項13】
ＣＤ１２３陽性腫瘍の予防または治療方法であって、請求項１～９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体、または請求項１０または１１に記載の医薬組成物を、それを必要とする個体に投与することを含む、方法。前記ＣＤ１２３陽性腫瘍は、好ましくは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）からなる群から選ばれる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願の同士を参照）
本出願は、２０２０年２月５日に出願された中国特許出願第２０２０１００８０４４９．９号の優先権を主張するものであり、ここでその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年２月５日に出願された中国特許出願第２０２０１００８０４４９．９号の優先権を主張するものであり、ここでその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、抗体医薬の分野に関し、具体的には、ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分および／またはヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分を含む二重特異性抗体、ならびにその医学的使用および生物学的使用を提供する。
【背景技術】
【0003】
二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＢｓＡｂ）は２つの異なる抗原結合部分を含む人工抗体である。二重特異性抗体は生物医薬分野、特に腫瘍免疫治療に広く応用されている。ＣＤ３を標的とする二重特異性抗体は、１つのアームがＴ細胞表面ＴＣＲ受容体複合体中のＣＤ３Ｅサブユニットと結合でき、もう１つのアームが腫瘍抗原を標的とする。このようにして、二重特異性抗体は、非組織適合性複合体（ＭＨＣ）を依存的に、Ｔ細胞特異的に腫瘍細胞を殺傷に向け直すことができる。
【0004】
二重特異性抗体のプラットフォームは多く、構造が複雑である。抗体構造区分ではＦｃ断片有りおよびＦｃ断片無しの２つの種類に大別できる。Ｆｃ断片無しの二重特異性抗体は、２つの抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域からなるか、またはＦａｂ断片からなり、このような二重特異性抗体のの主な代表はＢｉＴＥ、ＤＡＲＴ、ＴａｎｄＡｂｓ、ｂｉ－ｎａｎｏｂｏｄｙなどが挙げられる。このような二重特異性抗体の優勢は軽重鎖のミスマッチがないことにあり、欠点は半減期が短く、臨床応用が不便であることである。Ｆｃ断片有りの二重特異性抗体は伝統的なモノクローナル抗体の構造を保持し、そしてＦｃ断片の生物学的機能を媒介することができる。このような二重特異性抗体の代表的なものは、ＫＩＨ ＩｇＧ、ｃｒｏｓｓｍａｂ、ＤＶＤ－Ｉｇ、Ｔｒｉｏｍａｂなどが挙げられ、インビボ半減期が長く、かつ、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ活性（Ｈｏｎｇｙａｎ Ｌｉｕ， Ａｂｈｉｓｈｅｋ Ｓａｘｅｎａ， Ｓａｃｈｄｅｖ Ｓ． Ｓｉｄｈｕ， ｅｔ ａｌ． Ｆｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｎｏｖｅｌ Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ． Ｆｒｏｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１７；８：３８）を備えてもよい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
このため、二重特異性抗体の幅広い適用性に鑑み、当該技術分野では新規な二重特異性抗体の開発が求められている。
【課題を解決するための手段】
【0006】
第１の態様によれば、本発明は、ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分を含む二重特異性抗体を提供し、前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分は、
配列番号１に記載のＨＣＤＲ１（重鎖ＣＤＲ１）、
配列番号２に記載のＨＣＤＲ２（重鎖ＣＤＲ２）、
配列番号３に記載のＨＣＤＲ３（重鎖ＣＤＲ３）、
配列番号４に記載のＬＣＤＲ１（軽鎖ＣＤＲ１）、
配列番号５に記載のＬＣＤＲ２（軽鎖ＣＤＲ２）、および
配列番号６に記載のＬＣＤＲ３（軽鎖ＣＤＲ３）を含み、
ここで、ＨＣＤＲおよびＬＣＤＲはＫａｂａｔに従って定義される。
配列番号１に記載のＨＣＤＲ１（重鎖ＣＤＲ１）、
配列番号２に記載のＨＣＤＲ２（重鎖ＣＤＲ２）、
配列番号３に記載のＨＣＤＲ３（重鎖ＣＤＲ３）、
配列番号４に記載のＬＣＤＲ１（軽鎖ＣＤＲ１）、
配列番号５に記載のＬＣＤＲ２（軽鎖ＣＤＲ２）、および
配列番号６に記載のＬＣＤＲ３（軽鎖ＣＤＲ３）を含み、
ここで、ＨＣＤＲおよびＬＣＤＲはＫａｂａｔに従って定義される。
【0007】
第２の態様によれば、本発明は、ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分を含む二重特異性抗体を提供し、前記ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分は、
配列番号７に記載のＨＣＤＲ１（重鎖ＣＤＲ１）、
配列番号８に記載のＨＣＤＲ２（重鎖ＣＤＲ２）、
配列番号９に記載のＨＣＤＲ３（重鎖ＣＤＲ３）、
配列番号４に記載のＬＣＤＲ１（軽鎖ＣＤＲ１）、
配列番号５に記載のＬＣＤＲ２（軽鎖ＣＤＲ２）、および
配列番号６に記載のＬＣＤＲ３（軽鎖ＣＤＲ３）を含み、
ここで、ＨＣＤＲおよびＬＣＤＲはＫａｂａｔに従って定義される。
配列番号７に記載のＨＣＤＲ１（重鎖ＣＤＲ１）、
配列番号８に記載のＨＣＤＲ２（重鎖ＣＤＲ２）、
配列番号９に記載のＨＣＤＲ３（重鎖ＣＤＲ３）、
配列番号４に記載のＬＣＤＲ１（軽鎖ＣＤＲ１）、
配列番号５に記載のＬＣＤＲ２（軽鎖ＣＤＲ２）、および
配列番号６に記載のＬＣＤＲ３（軽鎖ＣＤＲ３）を含み、
ここで、ＨＣＤＲおよびＬＣＤＲはＫａｂａｔに従って定義される。
【0008】
第３の態様によれば、本発明は、ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分およびヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分を含む二重特異性抗体を提供する。
第３の態様のいくつかの実施形態において、前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分は、
配列番号１に記載のＨＣＤＲ１、
配列番号２に記載のＨＣＤＲ２、
配列番号３に記載のＨＣＤＲ３、
配列番号４に記載のＬＣＤＲ１、
配列番号５に記載のＬＣＤＲ２、および
配列番号６に記載のＬＣＤＲ３を含み、
ここで、ＨＣＤＲおよびＬＣＤＲはＫａｂａｔに従って定義される。
第３の態様のいくつかの実施形態において、前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分は、
配列番号１に記載のＨＣＤＲ１、
配列番号２に記載のＨＣＤＲ２、
配列番号３に記載のＨＣＤＲ３、
配列番号４に記載のＬＣＤＲ１、
配列番号５に記載のＬＣＤＲ２、および
配列番号６に記載のＬＣＤＲ３を含み、
ここで、ＨＣＤＲおよびＬＣＤＲはＫａｂａｔに従って定義される。
【0009】
第３の態様のいくつかの実施形態において、前記ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分は、
配列番号７に記載のＨＣＤＲ１、
配列番号８に記載のＨＣＤＲ２、
配列番号９に記載のＨＣＤＲ３、
配列番号４に記載のＬＣＤＲ１、
配列番号５に記載のＬＣＤＲ２、および
配列番号６に記載のＬＣＤＲ３を含み、
ここで、ＨＣＤＲおよびＬＣＤＲはＫａｂａｔに従って定義される。
配列番号７に記載のＨＣＤＲ１、
配列番号８に記載のＨＣＤＲ２、
配列番号９に記載のＨＣＤＲ３、
配列番号４に記載のＬＣＤＲ１、
配列番号５に記載のＬＣＤＲ２、および
配列番号６に記載のＬＣＤＲ３を含み、
ここで、ＨＣＤＲおよびＬＣＤＲはＫａｂａｔに従って定義される。
【0010】
第３の態様のいくつかの実施形態において、前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分および前記ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分は同一の軽鎖可変領域を含む。
第３の態様のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体は同一のヒンジ領域を備える重鎖定常領域を２種類含むＩｇＧ１抗体であり、前記ヒンジ領域のアミノ酸配列は配列番号１０に記載される。
第３の態様のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体は第１の重鎖定常領域および第２の重鎖定常領域を含むＩｇＧ１抗体であり、そのうち、前記第１の重鎖定常領域の３５４番目および３６６番目のアミノ酸はそれぞれＣおよびＷであり、前記第２の重鎖定常領域の３４９、３６６、３６８および４０７番目のアミノ酸はそれぞれＣ、Ｓ、ＡおよびＶであり、抗体定常領域アミノ酸位置はＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従って決定される。
第３の態様のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体は第１の重鎖定常領域および第２の重鎖定常領域を含むＩｇＧ１抗体であり、そのうち前記第１の重鎖定常領域および第２の重鎖定常領域の２３４、２３５および３３１番目のアミノ酸はそれぞれＦ、ＥおよびＳであり、抗体定常領域アミノ酸位置はＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従って決定される。
第３の態様のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体は同一のヒンジ領域を備える重鎖定常領域を２種類含むＩｇＧ１抗体であり、前記ヒンジ領域のアミノ酸配列は配列番号１０に記載される。
第３の態様のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体は第１の重鎖定常領域および第２の重鎖定常領域を含むＩｇＧ１抗体であり、そのうち、前記第１の重鎖定常領域の３５４番目および３６６番目のアミノ酸はそれぞれＣおよびＷであり、前記第２の重鎖定常領域の３４９、３６６、３６８および４０７番目のアミノ酸はそれぞれＣ、Ｓ、ＡおよびＶであり、抗体定常領域アミノ酸位置はＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従って決定される。
第３の態様のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体は第１の重鎖定常領域および第２の重鎖定常領域を含むＩｇＧ１抗体であり、そのうち前記第１の重鎖定常領域および第２の重鎖定常領域の２３４、２３５および３３１番目のアミノ酸はそれぞれＦ、ＥおよびＳであり、抗体定常領域アミノ酸位置はＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従って決定される。
【0011】
第１の態様および第３の態様のいくつかの実施形態において、前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分は、配列番号１１に記載の重鎖可変領域、および配列番号１２に記載の軽鎖可変領域を含む。
【0012】
第２の態様および第３の態様のいくつかの実施形態において、前記ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分は、配列番号１３に記載の重鎖可変領域、および配列番号１２に記載の軽鎖可変領域を含む。
上記のいずれかの態様のいくつかの実施形態において、前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分は一本鎖抗体（ｓｃｆｖ）またはＦａｂ断片を含む。
上記のいずれかの態様のいくつかの実施形態において、前記ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分は一本鎖抗体（ｓｃｆｖ）またはＦａｂ断片を含む。
上記のいずれかの態様のいくつかの実施形態において、前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分は一本鎖抗体（ｓｃｆｖ）またはＦａｂ断片を含む。
上記のいずれかの態様のいくつかの実施形態において、前記ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分は一本鎖抗体（ｓｃｆｖ）またはＦａｂ断片を含む。
【0013】
第３の態様のいくつかの実施形態において、前記抗体は第１のアームおよび第２のアームを備え、そのうち前記第１のアームはヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分を含み、前記第２のアームはヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分を含み、そのうち、
前記第１のアームは、配列番号１１に記載の重鎖可変領域のアミノ酸配列、配列番号３１に記載の重鎖定常領域のアミノ酸配列、配列番号１２に記載の軽鎖可変領域のアミノ酸配列、および配列番号３２に記載の軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含み、
前記第２のアームは、配列番号１３に記載の重鎖可変領域のアミノ酸配列、配列番号３０に記載の重鎖定常領域のアミノ酸配列、配列番号１２に記載の軽鎖可変領域のアミノ酸配列、および配列番号３２に記載の軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。
前記第１のアームは、配列番号１１に記載の重鎖可変領域のアミノ酸配列、配列番号３１に記載の重鎖定常領域のアミノ酸配列、配列番号１２に記載の軽鎖可変領域のアミノ酸配列、および配列番号３２に記載の軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含み、
前記第２のアームは、配列番号１３に記載の重鎖可変領域のアミノ酸配列、配列番号３０に記載の重鎖定常領域のアミノ酸配列、配列番号１２に記載の軽鎖可変領域のアミノ酸配列、および配列番号３２に記載の軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。
【0014】
第４の態様によれば、本発明は、第１乃至第３の態様のいずれかの態様に記載の二重特異性抗体を含む医薬組成物を提供する。
第４の態様のいくつかの実施形態において、ＣＤ１２３陽性腫瘍を予防または治療するための医薬組成物を提供する。
第４の態様のいくつかの実施形態において、ＣＤ１２３陽性腫瘍を予防または治療するための医薬組成物を提供する。
【0015】
第５の態様によれば、本発明は、第１乃至第３の態様のいずれかの態様に記載の二重特異性抗体、または第４の態様に記載の医薬組成物、ＣＤ１２３陽性腫瘍を予防または治療するための医薬の製造における使用を提供する。
【0016】
第６の態様によれば、本発明は、第１乃至第３の態様のいずれかの態様に記載の二重特異性抗体、または第４の態様に記載の医薬組成物を、それを必要とする個体に投与することを含むＣＤ１２３陽性腫瘍の予防または治療方法提供する。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】フローサイトメトリーを用いて組換え抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体と細胞表面のＣＤ１２３との特異的結合を分析する結果を示す図である。
【図2】フローサイトメトリーを用いてＨ７Ａ３ヒト化変異体Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５＋Ｌ２７Ｅ５とＭＶ－４－１１細胞表面のＣＤ１２３との結合を分析する結果を示す図である。
【図3】ＥＬＩＳＡを用いて二重特異性抗体ＣＤ３Ｅ×ＣＤ１２３とＣＤ３ＥおよびＣＤ１２３の２種類の抗原との結合を分析する結果を示す図である。
【図4】フローサイトメトリーを用いて二重特異性抗体ＣＤ３Ｅ×ＣＤ１２３とＪｕｒｋａｔ－Ｄｕａｌ細胞表面のＣＤ３Ｅとの結合能を分析する結果を示す図である。
【図5】フローサイトメトリーを用いて二重特異性抗体ＣＤ３Ｅ×ＣＤ１２３とＭＶ－４－１１細胞表面のＣＤ１２３との結合能を分析する結果を示す図である。
【図6】ＣＤ１２３陽性腫瘍細胞の存在下で二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３のＪｕｒｋａｔ－Ｄｕａｌに対する活性化の結果を示す図である。ここで、図のＡは、二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３、抗ＣＤ３Ｅモノクローナル抗体Ｈ３Ｂ８＋Ｌ２７Ｅ５、抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５＋Ｌ２７Ｅ５、および抗ＣＤ３Ｅモノクローナル抗体Ｈ３Ｂ８＋Ｌ２７Ｅ５と抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５＋Ｌ２７Ｅ５との組み合わせのＪｕｒｋａｔ－Ｄｕａｌに対する活性化の結果であり、図のＢは、ＣＤ１２３陽性標的細胞の存在下で二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３、二重特異性抗体対照試料Ｘｍａｂ１４０４５およびＨＩｇＧのＪｕｒｋａｔ－Ｄｕａｌに対する活性化の結果、並びにＣＤ１２３陰性標的細胞の存在下で二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３および二重特異性抗体対照試料Ｘｍａｂ１４０４５のＪｕｒｋａｔ－Ｄｕａｌに対する活性化の結果を示す図である。
【図7】二重特異性抗体ＣＤ３Ｅ×ＣＤ１２３によって媒介されて精製されたＴ細胞ＣＤ１２３陽性腫瘍細胞に対する殺傷の結果を示す図である。
【図8】フローサイトメトリーを用いて検出れた二重特異性抗体ＣＤ３Ｅ×ＣＤ１２３がＣＤ１２３陽性腫瘍細胞の存在下で特異的にＴ細胞を活性化し、ＣＤ６９の発現を上方制御した結果を示す図である。
【図9】フローサイトメトリーを用いて検出れた二重特異性抗体ＣＤ３Ｅ×ＣＤ１２３がＣＤ１２３陽性腫瘍細胞の存在下でＴ細胞増殖を促進する結果を示す図であり、ここで、図のＡは、二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３、抗ＣＤ３Ｅモノクローナル抗体Ｈ３Ｂ８＋Ｌ２７Ｅ５、抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５＋Ｌ２７Ｅ５、および抗ＣＤ３Ｅモノクローナル抗体Ｈ３Ｂ８＋Ｌ２７Ｅ５と抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５＋Ｌ２７Ｅ５との組み合わせがＣＤ１２３陽性腫瘍細胞の存在下でＴ細胞増殖を促進する結果であり、図のＢは、二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３および二重特異性抗体対照試料Ｘｍａｂ１４０４５がＣＤ１２３陽性腫瘍細胞の存在下でＴ細胞増殖を促進する結果である。
【図10】二重特異性抗体ＣＤ３Ｅ×ＣＤ１２３で治療されたｈＣＤ３４＋ヒト化ＭＶ－４－１１細胞腫瘍モデルのマウス腫瘍体積の変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0018】
〔配列説明〕
配列番号１は、抗ヒトＣＤ３Ｅモノクローナル抗体Ｈ３Ｂ８＋Ｌ２７Ｅ５の重鎖可変領域Ｈ３Ｂ８のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
配列番号２は、抗ヒトＣＤ３Ｅモノクローナル抗体Ｈ３Ｂ８＋Ｌ２７Ｅ５の重鎖可変領域Ｈ３Ｂ８のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
配列番号３は、抗ヒトＣＤ３Ｅモノクローナル抗体Ｈ３Ｂ８＋Ｌ２７Ｅ５の重鎖可変領域Ｈ３Ｂ８のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
配列番号４は、軽鎖可変領域Ｌ２７Ｅ５のＬＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
配列番号５は、軽鎖可変領域Ｌ２７Ｅ５のＬＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
配列番号６は、軽鎖可変領域Ｌ２７Ｅ５のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
配列番号７は、抗ヒトＣＤ１２３モノクローナル抗体Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５＋Ｌ２７Ｅ５の重鎖可変領域Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
配列番号８は、抗ヒトＣＤ１２３モノクローナル抗体Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５＋Ｌ２７Ｅ５の重鎖可変領域Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
配列番号９は、抗ヒトＣＤ１２３モノクローナル抗体Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５＋Ｌ２７Ｅ５の重鎖可変領域Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
配列番号１０は、ヒンジ領域のアミノ酸配列である。
配列番号１は、抗ヒトＣＤ３Ｅモノクローナル抗体Ｈ３Ｂ８＋Ｌ２７Ｅ５の重鎖可変領域Ｈ３Ｂ８のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
配列番号２は、抗ヒトＣＤ３Ｅモノクローナル抗体Ｈ３Ｂ８＋Ｌ２７Ｅ５の重鎖可変領域Ｈ３Ｂ８のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
配列番号３は、抗ヒトＣＤ３Ｅモノクローナル抗体Ｈ３Ｂ８＋Ｌ２７Ｅ５の重鎖可変領域Ｈ３Ｂ８のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
配列番号４は、軽鎖可変領域Ｌ２７Ｅ５のＬＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
配列番号５は、軽鎖可変領域Ｌ２７Ｅ５のＬＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
配列番号６は、軽鎖可変領域Ｌ２７Ｅ５のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
配列番号７は、抗ヒトＣＤ１２３モノクローナル抗体Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５＋Ｌ２７Ｅ５の重鎖可変領域Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
配列番号８は、抗ヒトＣＤ１２３モノクローナル抗体Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５＋Ｌ２７Ｅ５の重鎖可変領域Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
配列番号９は、抗ヒトＣＤ１２３モノクローナル抗体Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５＋Ｌ２７Ｅ５の重鎖可変領域Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
配列番号１０は、ヒンジ領域のアミノ酸配列である。
【0019】
配列番号１１は、ラットモノクローナル抗体ＷＭ０３－Ｃ６のヒト化重鎖変異体Ｈ３Ｂ８のアミノ酸配列である。
配列番号１２は、ラットモノクローナル抗体ＷＭ０３－Ｃ６のヒト化の軽鎖変異体Ｌ２７Ｅ５のアミノ酸配列である。
配列番号１３は、ヒト化バージョンＨ７Ａ３－ｈ２－ｍ５のアミノ酸配列である。
配列番号１４は、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＣＤ３Ｅ細胞外領域（ｈＣＤ３Ｅ）のアミノ酸配列である。
配列番号１５は、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＣＤ３Ｄ細胞外領域（ｈＣＤ３Ｄ）のアミノ酸配列である。
配列番号１６は、蟹喰猿（カニクイザル：Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＤ３Ｅ細胞外領域（ｍｆＣＤ３Ｅ）のアミノ酸配列である。
配列番号１７は、蟹喰猿（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＤ３Ｄ細胞外領域（ｍｆＣＤ３Ｄ）のアミノ酸配列である。
配列番号１８は、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＣＤ３Ｅ細胞外領域（ｍＣＤ３Ｅ）のアミノ酸配列である。
配列番号１９は、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＣＤ３Ｄ細胞外領域（ｍＣＤ３Ｄ）のアミノ酸配列である。
配列番号２０は、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＣＤ１２３サブタイプ１細胞外領域（ｈＣＤ１２３－ＳＰ１）のアミノ酸配列である。
配列番号１２は、ラットモノクローナル抗体ＷＭ０３－Ｃ６のヒト化の軽鎖変異体Ｌ２７Ｅ５のアミノ酸配列である。
配列番号１３は、ヒト化バージョンＨ７Ａ３－ｈ２－ｍ５のアミノ酸配列である。
配列番号１４は、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＣＤ３Ｅ細胞外領域（ｈＣＤ３Ｅ）のアミノ酸配列である。
配列番号１５は、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＣＤ３Ｄ細胞外領域（ｈＣＤ３Ｄ）のアミノ酸配列である。
配列番号１６は、蟹喰猿（カニクイザル：Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＤ３Ｅ細胞外領域（ｍｆＣＤ３Ｅ）のアミノ酸配列である。
配列番号１７は、蟹喰猿（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＤ３Ｄ細胞外領域（ｍｆＣＤ３Ｄ）のアミノ酸配列である。
配列番号１８は、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＣＤ３Ｅ細胞外領域（ｍＣＤ３Ｅ）のアミノ酸配列である。
配列番号１９は、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＣＤ３Ｄ細胞外領域（ｍＣＤ３Ｄ）のアミノ酸配列である。
配列番号２０は、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＣＤ１２３サブタイプ１細胞外領域（ｈＣＤ１２３－ＳＰ１）のアミノ酸配列である。
【0020】
配列番号２１は、蟹喰猿（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＤ１２３サブタイプ１細胞外領域（ｍｆＣＤ１２３－ＳＰ１）のアミノ酸配列である。
配列番号２２は、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＣＤ１２３サブタイプ１細胞外領域（ｍＣＤ１２３－ＳＰ１）のアミノ酸配列である。
配列番号２３は、Ｈｉｓタグのアミノ酸配列である。
配列番号２４は、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＩｇＧ２ａ抗体のＦｃ断片（ｍＦｃ）のアミノ酸配列である。
配列番号２５は、ヘテロダイマーのヒトＩｇＧ１サブタイプのＦｃ変異体ＦｃＫのアミノ酸配列である。
配列番号２６は、ヘテロダイマーのヒトＩｇＧ１サブタイプのＦｃ変異体ＦｃＨのアミノ酸配列である。
配列番号２７は、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＩｇＧ１サブタイプ抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列である。
配列番号２８は、ヒトＩｇＧ１サブタイプ抗体重鎖定常領域変異体ＩｇＧ１Ｈのアミノ酸配列である。
配列番号２９は、ヒトＩｇＧ１サブタイプ抗体重鎖定常領域変異体ＩｇＧ１Ｋのアミノ酸配列である。
配列番号３０は、ヒトＩｇＧ１サブタイプ抗体重鎖定常領域変異体ＩｇＧ１ｍ３－Ｈのアミノ酸配列である。
配列番号２２は、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＣＤ１２３サブタイプ１細胞外領域（ｍＣＤ１２３－ＳＰ１）のアミノ酸配列である。
配列番号２３は、Ｈｉｓタグのアミノ酸配列である。
配列番号２４は、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＩｇＧ２ａ抗体のＦｃ断片（ｍＦｃ）のアミノ酸配列である。
配列番号２５は、ヘテロダイマーのヒトＩｇＧ１サブタイプのＦｃ変異体ＦｃＫのアミノ酸配列である。
配列番号２６は、ヘテロダイマーのヒトＩｇＧ１サブタイプのＦｃ変異体ＦｃＨのアミノ酸配列である。
配列番号２７は、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＩｇＧ１サブタイプ抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列である。
配列番号２８は、ヒトＩｇＧ１サブタイプ抗体重鎖定常領域変異体ＩｇＧ１Ｈのアミノ酸配列である。
配列番号２９は、ヒトＩｇＧ１サブタイプ抗体重鎖定常領域変異体ＩｇＧ１Ｋのアミノ酸配列である。
配列番号３０は、ヒトＩｇＧ１サブタイプ抗体重鎖定常領域変異体ＩｇＧ１ｍ３－Ｈのアミノ酸配列である。
【0021】
配列番号３１は、ヒトＩｇＧ１サブタイプ抗体重鎖定常領域変異体ＩｇＧ１ｍ３－Ｋのアミノ酸配列である。
配列番号３２は、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）κサブタイプ軽鎖定常領域のアミノ酸配列である。
配列番号３３は、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）λサブタイプ軽鎖定常領域のアミノ酸配列である。
配列番号３４は、モノクローナル抗体ＷＭ０３－Ｃ６の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号３５は、モノクローナル抗体ＷＭ０３－Ｃ６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号３６は、抗ヒトＣＤ１２３の一本鎖抗体Ｓ８Ｆ３のアミノ酸配列である。
配列番号３７は、抗ヒトＣＤ１２３の一本鎖抗体Ｓ８Ｆ３の重鎖可変領域Ｓ８Ｆ３ＶＨのアミノ酸配列である。
配列番号３８は、抗ＣＤ１２３抗体ＣＳＬ３６２の重鎖アミノ酸配列である。
配列番号３９は、抗ＣＤ１２３抗体ＣＳＬ３６２の軽鎖アミノ酸配列である。
配列番号４０は、Ｈｏｌｅ変異含有ＩｇＧ１ｍ３サブタイプのＸｍａｂ１４０４５の結合するＣＤ１２３の重鎖のアミノ酸配列である。
配列番号４１は、Ｋｎｏｂ変異含有ＩｇＧ１ｍ３サブタイプのＸｍａｂ１４０４５の結合するＣＤ３ＥのｓｃＦｖ構造のアミノ酸配列である。
配列番号４２は、Ｘｍａｂ１４０４５の軽鎖のアミノ酸配列である。
配列番号３２は、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）κサブタイプ軽鎖定常領域のアミノ酸配列である。
配列番号３３は、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）λサブタイプ軽鎖定常領域のアミノ酸配列である。
配列番号３４は、モノクローナル抗体ＷＭ０３－Ｃ６の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号３５は、モノクローナル抗体ＷＭ０３－Ｃ６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号３６は、抗ヒトＣＤ１２３の一本鎖抗体Ｓ８Ｆ３のアミノ酸配列である。
配列番号３７は、抗ヒトＣＤ１２３の一本鎖抗体Ｓ８Ｆ３の重鎖可変領域Ｓ８Ｆ３ＶＨのアミノ酸配列である。
配列番号３８は、抗ＣＤ１２３抗体ＣＳＬ３６２の重鎖アミノ酸配列である。
配列番号３９は、抗ＣＤ１２３抗体ＣＳＬ３６２の軽鎖アミノ酸配列である。
配列番号４０は、Ｈｏｌｅ変異含有ＩｇＧ１ｍ３サブタイプのＸｍａｂ１４０４５の結合するＣＤ１２３の重鎖のアミノ酸配列である。
配列番号４１は、Ｋｎｏｂ変異含有ＩｇＧ１ｍ３サブタイプのＸｍａｂ１４０４５の結合するＣＤ３ＥのｓｃＦｖ構造のアミノ酸配列である。
配列番号４２は、Ｘｍａｂ１４０４５の軽鎖のアミノ酸配列である。
【0022】
〔定義〕
以下の定義および方法は、本発明をより明確に定義し、本発明の実践において当業者を指導するために提供されるものである。特に断らない限り、本明細書に記載された全ての用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。本明細書に引用される全ての特許文献、学術論文及びその他の公開出版物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
以下の定義および方法は、本発明をより明確に定義し、本発明の実践において当業者を指導するために提供されるものである。特に断らない限り、本明細書に記載された全ての用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。本明細書に引用される全ての特許文献、学術論文及びその他の公開出版物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0023】
本明細書に抗体構造を説明する際、アミノ酸位置番号に関する説明は、ヒトＩｇＧ１抗体のＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ定義を参照されたいが、これは当業者には周知であり、かつ容易に照会し入手可能である。また、本明細書では、ＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇの位置に合わせて変異を記述する場合、天然抗体配列に対して発生する変異を指す。
【0024】
本明細書に記載の用語「Ｆｃ断片」、「Ｆｃ領域」、「Ｆｃ部分」または類似の用語とは、抗体重鎖定常領域の一部を指し、ヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ）、定常領域のＣＨ２断片およびＣＨ３断片を含む。ヒトＩｇＧ１抗体のＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇの定義を参照すると、Ｆｃ断片は抗体定常領域における２１６～４４７番目のアミノ酸配列である。
【0025】
本明細書に記載の用語「Ｆａｂ（ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ）断片」、「Ｆａｂ部分」または類似の用語とは、完全な抗体をパパイン処理した後に生成される、抗原に結合可能な抗体断片を指し、完全な軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）、重鎖可変領域およびＣＨ１断片（ＶＨ－ＣＨ１）を含む。
【0026】
本明細書に記載の用語「一本鎖抗体（ｓｃｆｖ：ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｖａｒｉａｂｌｅ）」とは、一般的に遺伝子工学技術を用いて構築された一本鎖構造の抗体を指し、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むポリペプチド鎖である。重鎖可変領域および軽鎖可変領域の間には、通常、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが抗原を結合できる正しい配座に折り畳まれるようにフレキシブルな連結ペプチド（可撓性リンカー）が設計されている。
【0027】
本明細書に記載の用語「抗原結合部分」とは、抗体構造のうち抗原結合能を決定する部分を指す。抗体構造のうち抗原結合能を決定する主要な部分がＣＤＲであり、したがってＣＤＲも抗原結合部分の中核的な構成要素であることは、当業者にとって理解すべきである。二重特異性抗体構築において、「抗原結合部分」の例としては一本鎖抗体（ｓｃｆｖ）またはＦａｂ断片を含むが、これらに限らない。
【0028】
本明細書に記載の用語「二重特異性抗体」とは、２つの異なる抗原を結合する能力を持つ抗体であって、２つのＦｃ断片とそれぞれ融合した２つの抗原結合部分からなる抗体を指す。
【0029】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の「二重特異性抗体」とは、ヒトＩｇＧ１抗体に基づく二重特異性抗体を指し、かつ、本明細書中に記載の改変構造に加えて、ヒトＩｇＧ１抗体の基本的な特徴および機能を有する。本明細書に記載の「二重特異性抗体」は、ヒトＩｇＧ２抗体のような他の免疫グロブリンサブタイプにも基づくものであってもよいことは当業者に知られている。
【0030】
相補決定領域（ＣＤＲ、通常ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が有り）は、可変領域のうち抗体の親和性および特異性への影響が最も大きい領域であることが当業者に知られている。ＶＨまたはＶＬのＣＤＲ配列には、ｋａｂａｔ定義およびＣｈｏｔｈｉａ定義という２つの一般的な定義方式がある（例えば、Ｋａｂａｔ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）、Ａ１－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２７３：９２７－９４８（１９９７）、およびＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：９２６８－９２７２（１９８９）を参照）。所与の抗体の可変領域配列について、ＶＨおよびＶＬ配列におけるＣＤＲ領域配列は、Ｋａｂａｔ定義またはＣｈｏｔｈｉａ定義に基づいて決定することができる。本発明のいくつかの実施形態において、Ｋａｂａｔを用いてＣＤＲ配列を定義する。
【0031】
所与の抗体の可変領域配列について、可変領域配列におけるＣＤＲ領域配列は様々な方法で分析することができ、例えばオンラインソフトウェアＡｂｙｓｉｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｙｓｉｓ．ｏｒｇ／）を用いて決定することができる。
【0032】
本明細書に記載の用語「特異的結合」とは、２つの分子間の非ランダム結合反応、例えば、抗体と抗原エピトープとの結合を指す。
【0033】
ＣＤ３分子はＴ細胞膜上の重要な分化抗原であり、成熟Ｔ細胞の特徴的な標識でもある。ＣＤ３はγ、δ、εおよびζという４種類の鎖またはγ、δ、ε、ζおよびη（ζおよびηは、相同異性体であり）という５種類の鎖からなり、ＣＤ３γε、ＣＤ３δεおよびＣＤ３ζζ（またはＣＤ３ζη）という３種のダイマーからなり、かつＴ細胞膜上に発現されている。ＣＤ３γ、δおよびεという３本の鎖には、高度に保存された酸性アミノ酸残基（γはグルタミン酸、δおよびεはアスパラギン酸）を含有し、塩橋を介して非共有結合でＴ細胞受容体（ＴＣＲ）αおよびβ鎖上の塩基性アミノ酸残基と結合して安定なＴＣＲ－ＣＤ３複合体構造を形成している。当該複合体はＴ細胞の活性化シグナルを伝達してＴＣＲ構造を安定することができる。ＣＤ３の各鎖の細胞内領域には、いずれもＩＴＡＭ（免疫受容体チロシン活性化モチーフ）構造を含有し、当該構造は、ＣＤ３分子が細胞内シグナル伝達を媒介する基礎である。ＴＣＲが特異的に抗原（ＭＨＣ分子が提示した抗原ペプチド）を識別し結合した後、Ｔ細胞内におけるチロシンタンパク質キナーゼリン酸化ＩＴＡＭ上のチロシン残基は、ＳＨ２領域含有チロシンタンパク質キナーゼ（ＺＡＰ－７０）を募集し、シグナルをＴ細胞の細胞質内に伝達して細胞内活性化機序を起動し、このためＣＤ３はＴＣＲが抗原を識別して発生した活性化シグナルを伝達する機能を有し、Ｔ細胞の活性化を誘導する第１のシグナルである。
【0034】
ＣＤ１２３は、ヒトインターロイキン－３（ＩＬ－３）受容体α鎖とも呼ばれ、サイトカイン受容体スーパーファミリーメンバーに属し、分子量は約４０ＫＤａであり、Ｉ型膜貫通糖タンパク質である。インターロイキン－３受容体は、α鎖（ＣＤ１２３）およびβ鎖（ＣＤ１３１）からなるヘテロ二量体である。ＩＬ－３とＣＤ１２３とが結合した後、ＣＤ１３１からシグナル伝達を提供し、さらに造血細胞および免疫細胞の機能を調整し、内皮細胞増殖を刺激する（Ｔｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｒｋ Ｒｅｓ．２：４（２０１４））。
【0035】
ＣＤ１２３は、主に発現在骨髄前駆細胞、形質細胞様樹状細胞、単核細胞（単球）、好塩基球および少量のＢ細胞サブセット（Ｍｕｎｏｚ Ｌ ｅｔ ａｌ，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．８６（１２）：１２６１－９）。約８０％のＡＭＬ患者の前幼若細胞はＣＤ１２３を過剰発現しており、ＣＤ１２３抗原の過剰発現がＡＭＬの不良予後と比較的低い寛解率（緩和率）に対応することが研究により示されている（Ｔｅｓｔａ Ｕ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ． ２００２；１００（８））。多くのＡＭＬ患者は初期治療に対する反応は良好であるが、まだ一部の患者（６０～８０％）は完全に寛解（緩和）に達するために強固な治療を必要とする。
【0036】
第１の態様によれば、本発明は、ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分を含む二重特異性抗体を提供する。前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分は、
配列番号１に記載のＨＣＤＲ１、
配列番号２に記載のＨＣＤＲ２、
配列番号３に記載のＨＣＤＲ３、
配列番号４に記載のＬＣＤＲ１、
配列番号５に記載のＬＣＤＲ２、および
配列番号６に記載のＬＣＤＲ３を含み、
ここで、ＨＣＤＲおよびＬＣＤＲはＫａｂａｔに従って定義される。
配列番号１に記載のＨＣＤＲ１、
配列番号２に記載のＨＣＤＲ２、
配列番号３に記載のＨＣＤＲ３、
配列番号４に記載のＬＣＤＲ１、
配列番号５に記載のＬＣＤＲ２、および
配列番号６に記載のＬＣＤＲ３を含み、
ここで、ＨＣＤＲおよびＬＣＤＲはＫａｂａｔに従って定義される。
【0037】
第２の態様によれば、本発明は、ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分を含む二重特異性抗体を提供する。前記ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分は、
配列番号７に記載のＨＣＤＲ１、
配列番号８に記載のＨＣＤＲ２、
配列番号９に記載のＨＣＤＲ３、
配列番号４に記載のＬＣＤＲ１、
配列番号５に記載のＬＣＤＲ２、および
配列番号６に記載のＬＣＤＲ３を含み、
ここで、ＨＣＤＲおよびＬＣＤＲはＫａｂａｔに従って定義される。
配列番号７に記載のＨＣＤＲ１、
配列番号８に記載のＨＣＤＲ２、
配列番号９に記載のＨＣＤＲ３、
配列番号４に記載のＬＣＤＲ１、
配列番号５に記載のＬＣＤＲ２、および
配列番号６に記載のＬＣＤＲ３を含み、
ここで、ＨＣＤＲおよびＬＣＤＲはＫａｂａｔに従って定義される。
【0038】
第３の態様によれば、本発明は、ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分およびヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分を含む二重特異性抗体を提供する。
第３の態様のいくつかの実施形態において、前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分は、
配列番号１に記載のＨＣＤＲ１、
配列番号２に記載のＨＣＤＲ２、
配列番号３に記載のＨＣＤＲ３、
配列番号４に記載のＬＣＤＲ１、
配列番号５に記載のＬＣＤＲ２、および
配列番号６に記載のＬＣＤＲ３を含み、
ここで、ＨＣＤＲおよびＬＣＤＲはＫａｂａｔに従って定義される。
第３の態様のいくつかの実施形態において、前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分は、
配列番号１に記載のＨＣＤＲ１、
配列番号２に記載のＨＣＤＲ２、
配列番号３に記載のＨＣＤＲ３、
配列番号４に記載のＬＣＤＲ１、
配列番号５に記載のＬＣＤＲ２、および
配列番号６に記載のＬＣＤＲ３を含み、
ここで、ＨＣＤＲおよびＬＣＤＲはＫａｂａｔに従って定義される。
【0039】
第３の態様のいくつかの実施形態において、前記ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分は、
配列番号７に記載のＨＣＤＲ１、
配列番号８に記載のＨＣＤＲ２、
配列番号９に記載のＨＣＤＲ３、
配列番号４に記載のＬＣＤＲ１、
配列番号５に記載のＬＣＤＲ２、および
配列番号６に記載のＬＣＤＲ３を含み、
ここで、ＨＣＤＲおよびＬＣＤＲはＫａｂａｔに従って定義される。
配列番号７に記載のＨＣＤＲ１、
配列番号８に記載のＨＣＤＲ２、
配列番号９に記載のＨＣＤＲ３、
配列番号４に記載のＬＣＤＲ１、
配列番号５に記載のＬＣＤＲ２、および
配列番号６に記載のＬＣＤＲ３を含み、
ここで、ＨＣＤＲおよびＬＣＤＲはＫａｂａｔに従って定義される。
【0040】
第３の態様のいくつかの実施形態において、前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分および前記ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分は同一の軽鎖可変領域を含む。
第３の態様のいくつかの具体実施形態において、前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分および前記ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分には、同一の軽鎖を含み、当該実施形態は、軽鎖および重鎖の正確な組み立てに有利であり、好ましい実施形態の１つでもある。
第３の態様のいくつかの具体実施形態において、前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分および前記ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分には、同一の軽鎖を含み、当該実施形態は、軽鎖および重鎖の正確な組み立てに有利であり、好ましい実施形態の１つでもある。
【0041】
第３の態様のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体は、２種類の同一のヒンジ領域を備える重鎖定常領域を含むＩｇＧ１抗体であり、前記ヒンジ領域のアミノ酸配列配列番号１０に示すように、天然ヒトＩｇＧ１抗体定常領域の２１６～２３０番目の配列に置換され、抗体定常領域アミノ酸位置はＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従って決定される。
【0042】
第３の態様のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体は、第１の重鎖定常領域および第２の重鎖定常領域を含むＩｇＧ１抗体であり、そのうち第１の重鎖定常領域の３５４番目および３６６番目のアミノ酸は、それぞれＣおよびＷであり、第２の重鎖定常領域の３４９、３６６、３６８および４０７番目のアミノ酸は、それぞれＣ、Ｓ、ＡおよびＶであり、抗体定常領域アミノ酸位置はＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従って決定される。
【0043】
抗体Ｆｃ領域を保留する二重特異性抗体を構築する場合、以下の２つの角度から二重特異性抗体の構造を最適化することができる。その１は、重鎖のヘテロマー化であり、その２は軽鎖および重鎖の正確な組み立てである。いくつかの実施形態において、２種類のＦｃ断片は、重鎖のヘテロマー化を確保することができる変異を含む。ＫＩＨ技術（ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ：ＫＩＨ）は、重鎖のヘテロマー化を解決する戦略である。一般的には、ＫＩＨ技術とは、ＣＨ３領域のアミノ酸配列を改造することで異種の不完全抗体同士の対にするの（ペアリング）に有利な構造を形成することを指し、二重特異性抗体を構成すると同時に、正常な抗体の構造をできるだけ維持することができる。いくつかの実施形態において、用いられるＫＩＨ技術は、１つのＦｃ断片の３５４番目および３６６番目のアミノ酸をそれぞれＣおよびＷとすること、もう１つのＦｃ断片の３４９、３６６、３６８および４０７番目のアミノ酸をそれぞれＣ、Ｓ、ＡおよびＶとすることを含む。ＫＩＨ技術の指導については、例えば、「Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒｏｕｔｅ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ」， Ａ． Ｍａｒｇａｒｅｔ Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ １６， １９９８を参照されたく、この文献の全文を援用により本明細書に組み込む。
【0044】
第３の態様のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体は、第１の重鎖定常領域および第２の重鎖定常領域を含むＩｇＧ１抗体であり、そのうち第１の重鎖定常領域および第２の重鎖定常領域の２３４、２３５および３３１番目のアミノ酸は、それぞれＦ、ＥおよびＳであり、抗体定常領域アミノ酸位置はＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従って決定される。
【0045】
第３の態様のいくつかの実施形態において、２種類の重鎖定常領域のＣＨ２断片の２３４番目、２３５番目および３３１番目のアミノ酸は、それぞれＦ、ＥおよびＳであり、抗体Ｆｃ断片によって媒介される抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を低減することができ、二重特異性抗体の体内での副作用を減少させる可能性がある。上記の変異の指導について、例えば、「Ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｆｏｒ ｉｔｓ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｔｈｅ ＣＨ２ ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ ｉｓ ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ」， Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｍ． Ｃａｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｖｏｌｕｍｅ １７３， １９９１を参照されたく、この文献の全文を援用により本明細書に組み込む。
【0046】
第１および第３の態様のいくつかの実施形態において、ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分は、配列番号１１（配列番号１に記載のＨＣＤＲ１、配列番号２に記載のＨＣＤＲ２、および配列番号３に記載のＨＣＤＲ３を含む）に記載の重鎖可変領域、および配列番号１２に記載の軽鎖可変領域（配列番号４に記載のＬＣＤＲ１、配列番号５に記載のＬＣＤＲ２、および配列番号６に記載のＬＣＤＲ３を含む）を含む。
【0047】
第２および第３の態様のいくつかの実施形態において、ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分は、配列番号１３（配列番号７に記載のＨＣＤＲ１、配列番号８に記載のＨＣＤＲ２、および配列番号９に記載のＨＣＤＲ３を含む）に記載の重鎖可変領域、および配列番号１２に記載の軽鎖可変領域（配列番号４に記載のＬＣＤＲ１、配列番号５に記載のＬＣＤＲ２、および配列番号６に記載のＬＣＤＲ３を含む）を含む。
【0048】
上記のいずれかの態様のいくつかの実施形態において、前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分は一本鎖抗体（ｓｃｆｖ）またはＦａｂ断片を含む。
【0049】
上記のいずれかの態様のいくつかの実施形態において、前記ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分は一本鎖抗体（ｓｃｆｖ）またはＦａｂ断片を含む。
【0050】
二重特異性抗体は２種類の異なる抗原に対する２つの異なる抗原結合部分を備え、抗原結合部分は一本鎖抗体（ｓｃｆｖ）またはＦａｂ断片という２種類の形でを含むことができ、そこで、所与の２種類の抗原に対する場合、二重特異性抗体の抗原結合部分は、Ｆａｂ＋Ｆａｂ、Ｆａｂ＋ｓｃｆｖ、ｓｃｆｖ＋Ｆａｂ、およびｓｃｆｖ＋ｓｃｆｖという４種の組み合せの方式を配置することができる。
【0051】
上記のいずれかの態様のいくつかの具体実施形態において、前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分はＦａｂ断片を含み、前記ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分はＦａｂ断片を含む。
【0052】
上記のいずれかの態様のいくつかの具体実施形態において、前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分はＦａｂ断片を含み、前記ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分は一本鎖抗体（ｓｃｆｖ）を含む。
【0053】
上記のいずれかの態様のいくつかの具体実施形態において、前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分は一本鎖抗体（ｓｃｆｖ）を含み、前記ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分はＦａｂ断片を含む。
【0054】
上記のいずれかの態様のいくつかの具体実施形態において、前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分は一本鎖抗体（ｓｃｆｖ）を含み、前記ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分は一本鎖抗体（ｓｃｆｖ）を含む。
【0055】
本明細書において、二重特異性抗体が２つの「アーム（腕）」を備えることも記載されており、中間を境に二重特異性抗体を２つのアームに分けることができる。二重特異性抗体は、Ｆｃ断片および抗原結合部分（Ｆａｂ断片または一本鎖抗体）から構成することができる。Ｆｃ断片およびＦａｂ断片から構成するアームは、その構造が一般的な抗体に類似し、完全な重鎖および軽鎖を含有するため、このようなアームの構造はＦｃ＋Ｆａｂと表すことができ、重鎖（Ｆｃ＋Ｆａｂにおける重鎖可変領域およびＣＨ１断片）＋軽鎖（Ｆａｂにおける軽鎖部分）とも表すことができる。２つのアームのいずれもＦａｂ断片形式の抗原結合部分を含有する場合、これによって形成される二重特異性抗体の構造は天然抗体に近いので、これが好ましい実施形態の１つである。
【0056】
第３の態様のいくつかの実施形態において、前記抗体は第１のアームおよび第２のアームを備え、そのうち第１のアームはヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分を含み、第２のアームはヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分を含み、そのうち、
前記第１のアームは、配列番号１１に記載の重鎖可変領域のアミノ酸配列、配列番号３１に記載の重鎖定常領域のアミノ酸配列、配列番号１２に記載の軽鎖可変領域のアミノ酸配列、および配列番号３２に記載の軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含み、
前記第２のアームは、配列番号１３に記載の重鎖可変領域のアミノ酸配列、配列番号３０に記載の重鎖定常領域のアミノ酸配列、配列番号１２に記載の軽鎖可変領域のアミノ酸配列、および配列番号３２に記載の軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。
前記第１のアームは、配列番号１１に記載の重鎖可変領域のアミノ酸配列、配列番号３１に記載の重鎖定常領域のアミノ酸配列、配列番号１２に記載の軽鎖可変領域のアミノ酸配列、および配列番号３２に記載の軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含み、
前記第２のアームは、配列番号１３に記載の重鎖可変領域のアミノ酸配列、配列番号３０に記載の重鎖定常領域のアミノ酸配列、配列番号１２に記載の軽鎖可変領域のアミノ酸配列、および配列番号３２に記載の軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。
【0057】
上記のいずれかの態様のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体の重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１サブタイプまたは選択されたヒトＩｇＧ１サブタイプの各種の変異体、例えば、ＩｇＧ１Ｈ、ＩｇＧ１Ｋ、ＩｇＧ１ｍ３－ＨまたはＩｇＧ１ｍ３－Ｋである。
上記のいずれかの態様のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体の軽鎖定常領域は、ヒトκサブタイプまたはヒトλサブタイプであり、ヒトκサブタイプであることが好ましい。
上記のいずれかの態様のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体の軽鎖定常領域は、ヒトκサブタイプまたはヒトλサブタイプであり、ヒトκサブタイプであることが好ましい。
【0058】
第４の態様によれば、本発明は、第１乃至第３の態様のいずれかの態様に記載の二重特異性抗体を含む医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤などをさらに含む。
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、ＣＤ１２３陽性腫瘍、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）を予防または治療するためのものである。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、潤滑剤（例えばタルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油）、潤湿剤、乳化剤、懸濁化剤、防食剤（例えば安息香酸、ソルビン酸およびプロピオン酸カルシウム）、甘味剤および／または調味剤などをさらに含んでもよい。
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤などをさらに含む。
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、ＣＤ１２３陽性腫瘍、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）を予防または治療するためのものである。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、潤滑剤（例えばタルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油）、潤湿剤、乳化剤、懸濁化剤、防食剤（例えば安息香酸、ソルビン酸およびプロピオン酸カルシウム）、甘味剤および／または調味剤などをさらに含んでもよい。
【0059】
いくつかの実施形態において、本発明に係る医薬組成物は錠剤、丸剤、粉剤、トローチ剤、エリキシル剤、懸濁液、乳剤、溶液、シロップ剤、坐剤またはカプセル剤などの形態で製剤化することができる。
いくつかの実施形態において、本発明に係る医薬組成物は、任意の生理学的に許容される投与方式で送達することができる。これら投与方式は、経口投与、胃腸外投与、経鼻投与、直腸投与、腹腔内投与、血管内注射、皮下投与、経皮投与、吸入投与などを含むが、これらに限らない。
いくつかの実施形態において、所望な純度のある試薬と、必要に応じて薬学的に許容される担体、賦形剤などを配合し、貯蔵（保存）のために凍結乾燥製剤または水溶液の形で治療用の医薬組成物を製剤化することができる。
いくつかの実施形態において、本発明に係る医薬組成物は、任意の生理学的に許容される投与方式で送達することができる。これら投与方式は、経口投与、胃腸外投与、経鼻投与、直腸投与、腹腔内投与、血管内注射、皮下投与、経皮投与、吸入投与などを含むが、これらに限らない。
いくつかの実施形態において、所望な純度のある試薬と、必要に応じて薬学的に許容される担体、賦形剤などを配合し、貯蔵（保存）のために凍結乾燥製剤または水溶液の形で治療用の医薬組成物を製剤化することができる。
【0060】
第５の態様によれば、本発明は、第１乃至第３の態様のいずれかの態様に記載の二重特異性抗体、または第４の態様に記載の医薬組成物、ＣＤ１２３陽性腫瘍を予防または治療するための医薬の製造における使用を提供する。
第５の態様のいくつかの実施形態において、前記ＣＤ１２３陽性腫瘍は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）からなる群から選ばれる。
第５の態様のいくつかの実施形態において、前記ＣＤ１２３陽性腫瘍は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）からなる群から選ばれる。
【0061】
第６の態様によれば、本発明は、第１乃至第３の態様のいずれかの態様に記載の二重特異性抗体、または第４の態様に記載の医薬組成物を、それを必要とする個体に投与することを含むＣＤ１２３陽性腫瘍の予防または治療方法を提供する。
第６の態様のいくつかの実施形態において、前記ＣＤ１２３陽性腫瘍は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）からなる群から選ばれる。
第６の態様のいくつかの実施形態において、前記ＣＤ１２３陽性腫瘍は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）からなる群から選ばれる。
【0062】
なお、上記の詳細な説明は、当業者がより明確に本発明の内容を理解できるようにするためのものだけであり、いずれかの態様を限定する意図ではないことを理解すべきである。当業者は、前記実施形態にさまざまな変更及び変形をすることができる。
【0063】
以下の実施例は、単に説明のためのものであり、本発明の範囲を限定する目的ではない。
【実施例】
【0064】
実施例１：組換えタンパク質の製造
ＣＤ３Ｅ×ＣＤ１２３二重特異性抗体の製造および同定の過程において、複数種類の異なる組換えタンパク質を用いる必要があり、ヒトＣＤ３Ｅ細胞外領域（ｈＣＤ３Ｅ、配列番号１４）、ヒトＣＤ３Ｄ細胞外領域（ｈＣＤ３Ｄ、配列番号１５）、サルＣＤ３Ｅ細胞外領域（ｍｆＣＤ３Ｅ、配列番号１６）、サルＣＤ３Ｄ細胞外領域（ｍｆＣＤ３Ｄ、配列番号１７）、マウスＣＤ３Ｅ細胞外領域（ｍＣＤ３Ｅ、配列番号１８）、マウスＣＤ３Ｄ細胞外領域（ｍＣＤ３Ｄ、配列番号１９）およびヒトＣＤ１２３サブタイプ１細胞外領域（ｈＣＤ１２３－ＳＰ１、配列番号２０）、サルＣＤ１２３サブタイプ１細胞外領域（ｍｆＣＤ１２３－ＳＰ１、配列番号２１）、マウスＣＤ１２３サブタイプ１細胞外領域（ｍＣＤ１２３－ＳＰ１、配列番号２２）を含む。これらの組換えタンパク質は、いずれも大量の翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはジスルフィド結合など）を有するため、哺乳類細胞発現系を用いることにより、組換えタンパク質の構造および機能をさらに維持するのに有利である。なお、精製を容易にするため、非抗体系の組換えタンパク質のＣ末端に、Ｈｉｓタグ（配列番号２３）またはマウス抗体ＩｇＧ２ａのＦｃ断片（ｍＦｃ、配列番号２４）を加え、またはＫＩＨ（Ｋｎｏｂ－Ｉｎｔｏ－Ｈｏｌｅ）技術に基づいてヘテロダイマーのヒトＩｇＧ１サブタイプのＦｃ変異体（ＦｃＫ、配列番号２５またはＦｃＨ、配列番号２６）を形成する。組換え抗体を製造する場合、抗体重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１サブタイプ（配列番号２７）または選択されたヒトＩｇＧ１サブタイプの各種の変異体であってもよく、例えばＩｇＧ１Ｈ（配列番号２８）、ＩｇＧ１Ｋ（配列番号２９）、ＩｇＧ１ｍ３－Ｈ（配列番号３０）またはＩｇＧ１ｍ３－Ｋ（配列番号３１）であり、軽鎖定常領域はヒトκサブタイプ（配列番号３２）またはヒトλサブタイプ（配列番号３３）である。
ＣＤ３Ｅ×ＣＤ１２３二重特異性抗体の製造および同定の過程において、複数種類の異なる組換えタンパク質を用いる必要があり、ヒトＣＤ３Ｅ細胞外領域（ｈＣＤ３Ｅ、配列番号１４）、ヒトＣＤ３Ｄ細胞外領域（ｈＣＤ３Ｄ、配列番号１５）、サルＣＤ３Ｅ細胞外領域（ｍｆＣＤ３Ｅ、配列番号１６）、サルＣＤ３Ｄ細胞外領域（ｍｆＣＤ３Ｄ、配列番号１７）、マウスＣＤ３Ｅ細胞外領域（ｍＣＤ３Ｅ、配列番号１８）、マウスＣＤ３Ｄ細胞外領域（ｍＣＤ３Ｄ、配列番号１９）およびヒトＣＤ１２３サブタイプ１細胞外領域（ｈＣＤ１２３－ＳＰ１、配列番号２０）、サルＣＤ１２３サブタイプ１細胞外領域（ｍｆＣＤ１２３－ＳＰ１、配列番号２１）、マウスＣＤ１２３サブタイプ１細胞外領域（ｍＣＤ１２３－ＳＰ１、配列番号２２）を含む。これらの組換えタンパク質は、いずれも大量の翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはジスルフィド結合など）を有するため、哺乳類細胞発現系を用いることにより、組換えタンパク質の構造および機能をさらに維持するのに有利である。なお、精製を容易にするため、非抗体系の組換えタンパク質のＣ末端に、Ｈｉｓタグ（配列番号２３）またはマウス抗体ＩｇＧ２ａのＦｃ断片（ｍＦｃ、配列番号２４）を加え、またはＫＩＨ（Ｋｎｏｂ－Ｉｎｔｏ－Ｈｏｌｅ）技術に基づいてヘテロダイマーのヒトＩｇＧ１サブタイプのＦｃ変異体（ＦｃＫ、配列番号２５またはＦｃＨ、配列番号２６）を形成する。組換え抗体を製造する場合、抗体重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１サブタイプ（配列番号２７）または選択されたヒトＩｇＧ１サブタイプの各種の変異体であってもよく、例えばＩｇＧ１Ｈ（配列番号２８）、ＩｇＧ１Ｋ（配列番号２９）、ＩｇＧ１ｍ３－Ｈ（配列番号３０）またはＩｇＧ１ｍ３－Ｋ（配列番号３１）であり、軽鎖定常領域はヒトκサブタイプ（配列番号３２）またはヒトλサブタイプ（配列番号３３）である。
【0065】
Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースにおける各種の目的の組換えタンパク質のアミノ酸配列に基づき、上記の各種の組換えタンパク質の遺伝子（Ｈｉｓタグ、ｍＦｃまたはＦｃコード遺伝子を含む）を設計し合成する。通常の分子生物学技術を用いて合成された各種の組換えタンパク質遺伝子を適切な真核発現ベクター（例えば、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐｃＤＮＡ３．１など）にクローンし、その後リポソーム（例えば、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の２９３ｆｅｃｔｉｎなど）またはその他のトランスフェクション試薬（例えば、ＰＥＩなど）を用いて製造された組換えタンパク質発現プラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞（例えば、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＨＥＫ２９３Ｆ）にトランスフェクションさせ、無血清懸濁培養条件下で３～５日間培養した。その後遠心などにより培養上清を回収した。
【0066】
Ｈｉｓタグ融合発現した組換えタンパク質は、金属キレート親和性クロマトグラフィーカラム（例えば、ＧＥ社のＨｉｓＴｒａｐ ＦＦなど）を用いて培養上清における組換えタンパク質に対してさらに精製した。ｍＦｃ融合発現した組換えタンパク質および組換え抗体は、ＰｒｏｔｅｉｎＡ／Ｇ親和性クロマトグラフィーカラム（例えば、ＧＥ社のＭａｂｓｅｌｅｃｔ ＳＵＲＥなど）に対してさらに精製した。その後、脱塩カラム（例えば、ＧＥ社のＨｉｔｒａｐ ｄｅｓａｕｌｔｉｎｇなど）を用いて組換えタンパク質保存用緩衝液をＰＢＳ（ｐＨ７．０）または他の適切な緩衝液に置換する。必要に応じて、抗体試料を濾過して除菌し、その後分注して－２０℃に保存することができる。
【0067】
実施例２：固定軽鎖に基づくＣＤ１２３マウス免疫ライブラリの構築
共通軽鎖に基づくＣＤ３Ｅ×ＣＤ１２３二重特異性抗体を構築するために、特定の抗ＣＤ３Ｅモノクローナル抗体軽鎖可変領域を選択し、ＣＤ１２３抗原の体内親和性成熟を経たマウス重鎖可変領域に配合し、通常の分子生物学的手段を用いて一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）ライブラリを構築し、ＣＤ１２３に対する特異的抗体をスクリーニングするために使用する。
共通軽鎖に基づくＣＤ３Ｅ×ＣＤ１２３二重特異性抗体を構築するために、特定の抗ＣＤ３Ｅモノクローナル抗体軽鎖可変領域を選択し、ＣＤ１２３抗原の体内親和性成熟を経たマウス重鎖可変領域に配合し、通常の分子生物学的手段を用いて一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）ライブラリを構築し、ＣＤ１２３に対する特異的抗体をスクリーニングするために使用する。
【0068】
ｈＣＤ１２３－ＳＰ１－ＨｉｓおよびｍｆＣＤ１２３－ＳＰ１－Ｈｉｓ組換えタンパク質を用いて６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを交差免疫した後、脾細胞を収集した。マウスリンパ球分離液（達科為生物技術股扮有限公司、ＣＡＴ＃ＤＫＷ３３－Ｒ０１００）を用いてマウス脾臓リンパ球を分離し、細胞全ＲＮＡ抽出キット（天根生化科技（北京）有限公司、ＣＡＴ＃ＤＰ４３０）を用い、分離したリンパ球を全ＲＮＡの抽出を行った。抽出した全ＲＮＡをテンプレートとして第１の鎖ｃＤＮＡ合成キット（ＣＡＴ＃Ｋ１６２１、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて抗体の重鎖可変領域を合成した。ＰＣＲ増幅法などの従来の分子生物学的手段を用い、ヒトおよび蟹喰猿ＣＤ３Ｅを特異的に識別するラットモノクローナル抗体ＷＭ０３－Ｃ６（特許ＷＯ２０１６１１６６２６Ａ１に記載のモノクローナル抗体２０Ｅ５－Ｆ１０の配列を参照し、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号３４に記載され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号３５に記載される）の軽鎖可変領域、およびＣＤ１２３組換え抗原でマウスを免疫して得たマウス重鎖可変領域を得た。その後オーバーラップ伸長ＰＣＲ技術を用いて一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を構築し、製造したマウス一本鎖抗体遺伝子を担体ｐＡＤＳＣＦＶ－Ｓ（実験技術手順は、中国特許出願第２０１５１００９７１１７．０号の実施例１を参照）にクローンし、ｓｃＦｖライブラリを構築した。この抗体ライブラリのライブラリ容量は１．２×１０Ｅ８に達し、正解率は６５％であった。
【0069】
実施例３：固定軽鎖のＣＤ１２３マウス免疫ライブラリのスクリーニング
３．１ 抗ヒトＣＤ１２３マウス一本鎖抗体のスクリーニング
実施例１で製造された組換えｈＣＤ１２３－ＳＰ１－ｈｉｓを抗原として、固相スクリーニング戦略（実験プロトコールは、バクテリオファージ展示：汎用実験マニュアル／（米）Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．、（米）Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．編集、馬嵐ら翻訳。化学工業出版社、２００８．５を参照）を用いて実施例２で構築されたマウス一本鎖抗体を展示するバクテリオファージライブラリをスクリーニングし、結合、溶出、中和、感染、増幅の方式で合計３回スクリーニングを行い、最終的にヒトＣＤ１２３に特異的に結合する一本鎖抗体Ｓ８Ｆ３（配列番号３６）１株を得た。
３．１ 抗ヒトＣＤ１２３マウス一本鎖抗体のスクリーニング
実施例１で製造された組換えｈＣＤ１２３－ＳＰ１－ｈｉｓを抗原として、固相スクリーニング戦略（実験プロトコールは、バクテリオファージ展示：汎用実験マニュアル／（米）Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．、（米）Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．編集、馬嵐ら翻訳。化学工業出版社、２００８．５を参照）を用いて実施例２で構築されたマウス一本鎖抗体を展示するバクテリオファージライブラリをスクリーニングし、結合、溶出、中和、感染、増幅の方式で合計３回スクリーニングを行い、最終的にヒトＣＤ１２３に特異的に結合する一本鎖抗体Ｓ８Ｆ３（配列番号３６）１株を得た。
【0070】
通常の分子生物学的手段を用いてＳ８Ｆ３の重鎖可変領域Ｓ８Ｆ３ＶＨ（配列番号３７）および軽鎖可変領域ＷＭ０３－Ｃ６ＶＫ（配列番号３５）をコードするヌクレオチド配列を、それぞれヒト重鎖定常領域および軽鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列が融合された真核発現ベクター（例えば、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐｃＤＮＡ３．１など）にクローニングし、全抗体Ｓ８Ｆ３ＶＨ＋Ｃ６ＶＫを組み合わせて発現させた。同時に、米国特許ＵＳ２０１４０１７８３６４Ａ１を参照し、抗ＣＤ１２３抗体ＣＳＬ３６２（重鎖アミノ酸配列は配列番号３８に記載され、軽鎖アミノ酸配列は配列番号３９に記載される）製造して陽性対照抗体として後続の研究に用いられる。
【0071】
３．２ 組換え抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体の親和性分析
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００を用いて表面プラズマ共鳴技術により抗ＣＤ１２３抗体の親和性を測定した。アミノコンジュゲーションキットキット（Ａｍｉｎｏ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（ＢＲ－１０００－５０）、ヒト抗体捕獲キット（ＢＲ－１００８－３９）、ＣＭ５チップ（ＢＲ１０００１２）およびｐＨ７．４の１０× ＨＢＳ－ＥＰ（ＢＲ１００６６９）などの関連試薬および消耗品は、すべてＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入した。キットに関する取扱説明書に従い、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（１－Ｅｔｈｙｌ－３－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ） ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：ＥＤＣ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ－Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ：ＮＨＳ）を用いてカルボキシル化ＣＭ５チップ表面を活性化し、１０ｍＭ、ｐＨ５．０の酢酸ナトリウムで抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（捕獲抗体）を２５μｇ／ｍＬまで希釈させた後に、流速１０μＬ／ｍｉｎで注射して約１００００個の応答単位（ＲＵ）のカップリング量を実現した。捕獲抗体を注射した後、１Ｍエタノールアミンを注射して未反応基をブロックした。動力学的測定では、抗ＣＤ１２３抗体（Ｓ８Ｆ３ＶＨ＋Ｃ６ＶＫおよびＣＳＬ３６２）を０．５～１μｇ／ｍＬまで希釈し、１０μＬ／ｍｉｎで注射し、１００ＲＵ程度の抗体が抗ヒトＦｃ抗体に捕獲されるように確保した。その後ｈＣＤ１２３－ＳＰ１－ｈｉｓを一連の濃度勾配（例えば、２．４７ｎＭ、７．４ｎＭ、２２．２ｎＭ、６６．７ｎＭ、２００ｎＭ）に設定し、２５℃、３０μＬ／ｍｉｎで低濃度から高濃度まで注射し、結合時間は１２０ｓであり、解離時間は６００～２４００ｓであり、１０μＬ／ｍｉｎで３ＭのＭｇＣｌ２溶液を３０ｓ注射してチップ表面を再生した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００評価ソフトウェアのバージョン２．０．１を用いて結合速度（Ｋｏｎ）および解離速度（Ｋｏｆｆ）を１：１結合モデルフィッティング結合と解離センサーマップから計算した。比率Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎで解離平衡定数（ＫＤ）を計算した。フィッティング結果を表１に示す。
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００を用いて表面プラズマ共鳴技術により抗ＣＤ１２３抗体の親和性を測定した。アミノコンジュゲーションキットキット（Ａｍｉｎｏ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（ＢＲ－１０００－５０）、ヒト抗体捕獲キット（ＢＲ－１００８－３９）、ＣＭ５チップ（ＢＲ１０００１２）およびｐＨ７．４の１０× ＨＢＳ－ＥＰ（ＢＲ１００６６９）などの関連試薬および消耗品は、すべてＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入した。キットに関する取扱説明書に従い、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（１－Ｅｔｈｙｌ－３－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ） ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：ＥＤＣ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ－Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ：ＮＨＳ）を用いてカルボキシル化ＣＭ５チップ表面を活性化し、１０ｍＭ、ｐＨ５．０の酢酸ナトリウムで抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（捕獲抗体）を２５μｇ／ｍＬまで希釈させた後に、流速１０μＬ／ｍｉｎで注射して約１００００個の応答単位（ＲＵ）のカップリング量を実現した。捕獲抗体を注射した後、１Ｍエタノールアミンを注射して未反応基をブロックした。動力学的測定では、抗ＣＤ１２３抗体（Ｓ８Ｆ３ＶＨ＋Ｃ６ＶＫおよびＣＳＬ３６２）を０．５～１μｇ／ｍＬまで希釈し、１０μＬ／ｍｉｎで注射し、１００ＲＵ程度の抗体が抗ヒトＦｃ抗体に捕獲されるように確保した。その後ｈＣＤ１２３－ＳＰ１－ｈｉｓを一連の濃度勾配（例えば、２．４７ｎＭ、７．４ｎＭ、２２．２ｎＭ、６６．７ｎＭ、２００ｎＭ）に設定し、２５℃、３０μＬ／ｍｉｎで低濃度から高濃度まで注射し、結合時間は１２０ｓであり、解離時間は６００～２４００ｓであり、１０μＬ／ｍｉｎで３ＭのＭｇＣｌ２溶液を３０ｓ注射してチップ表面を再生した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００評価ソフトウェアのバージョン２．０．１を用いて結合速度（Ｋｏｎ）および解離速度（Ｋｏｆｆ）を１：１結合モデルフィッティング結合と解離センサーマップから計算した。比率Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎで解離平衡定数（ＫＤ）を計算した。フィッティング結果を表１に示す。
【0072】
表１：組換え抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体のｈＣＤ１２３－ＳＰ１－ｈｉｓへの結合の親和定数
【表1】
【0073】
３．３ 組換え抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体結合細胞表面ＣＤ１２３抗原の同定
成長対数期のＫＧ－１ａ（ヒト急性骨髄性白血病細胞、中国医学科学院基礎医学研究所細胞資源センターから購入）を取り、遠心後１％のＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液で２×１０６個／ｍＬまで再懸濁し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルＶ底板に敷き、遠心後に上清を取り除いた。被検試料Ｓ８Ｆ３ＶＨ＋Ｃ６ＶＫ、対照試料ＣＳＬ３６２、およびＨＩｇＧ非関連抗体（Ａ０１００６、ヒトＩｇＧ対照（全分子、精製）、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）を、ＰＢＳ緩衝液でそれぞれ５μｇ／ｍＬおよび０．５μｇ／ｍＬの最終濃度に調製し、細胞を含有するウェルに加え、４℃で１時間インキュベートした。その後２００μＬのＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＦＩＴＣ（中杉金橋、ＺＦ－０３０８）二次抗体（１００μＬ／ウェル）を加えて４℃、暗所で３０分間インキュベートした。その後２００μＬのＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、ＰＢＳ緩衝液１００μＬで再懸濁した後フローサイトメトリー（ＡＣＥＡ，Ｎｏｖｏｃｙｔｅ）でＦＩＴＣチャネルを検出した。その結果、Ｓ８Ｆ３ＶＨ＋Ｃ６ＶＫはＣＤ１２３陽性細胞ＫＧ－１ａに特異的に結合できることが示された（図１）。
成長対数期のＫＧ－１ａ（ヒト急性骨髄性白血病細胞、中国医学科学院基礎医学研究所細胞資源センターから購入）を取り、遠心後１％のＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液で２×１０６個／ｍＬまで再懸濁し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルＶ底板に敷き、遠心後に上清を取り除いた。被検試料Ｓ８Ｆ３ＶＨ＋Ｃ６ＶＫ、対照試料ＣＳＬ３６２、およびＨＩｇＧ非関連抗体（Ａ０１００６、ヒトＩｇＧ対照（全分子、精製）、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）を、ＰＢＳ緩衝液でそれぞれ５μｇ／ｍＬおよび０．５μｇ／ｍＬの最終濃度に調製し、細胞を含有するウェルに加え、４℃で１時間インキュベートした。その後２００μＬのＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＦＩＴＣ（中杉金橋、ＺＦ－０３０８）二次抗体（１００μＬ／ウェル）を加えて４℃、暗所で３０分間インキュベートした。その後２００μＬのＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、ＰＢＳ緩衝液１００μＬで再懸濁した後フローサイトメトリー（ＡＣＥＡ，Ｎｏｖｏｃｙｔｅ）でＦＩＴＣチャネルを検出した。その結果、Ｓ８Ｆ３ＶＨ＋Ｃ６ＶＫはＣＤ１２３陽性細胞ＫＧ－１ａに特異的に結合できることが示された（図１）。
【0074】
実施例４：ＷＭ０３－Ｃ６モノクローナル抗体のヒト化および活性同定
４．１ ＷＭ０３－Ｃ６ヒト化設計
ラットのモノクローナル抗体ＷＭ０３－Ｃ６に対してヒト化研究を行い、その免疫原性を低減させた。
４．１ ＷＭ０３－Ｃ６ヒト化設計
ラットのモノクローナル抗体ＷＭ０３－Ｃ６に対してヒト化研究を行い、その免疫原性を低減させた。
【0075】
ヒト化方案は、古典的なフレームワーク移植戦略を採用した（Ｊ ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９、１１１９－１１２５、２００２）。ＷＭ０３－Ｃ６の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を、それぞれＩＭＧＴデータベースにおけるヒト抗体生殖細胞遺伝子配列に比べて適切な生殖細胞遺伝子配列を選択して抗体のフレームワーク領域１～３（ＦＲ１＋ＦＲ２＋ＦＲ３）を提供し、適切なＪ領域遺伝子配列を選択してフレームワーク領域４（ＦＲ４）を提供した。このテンプレートは、例えば、抗体の相対的な全長、ＣＤＲの大きさ、抗体フレームワーク領域（ＦＲ）および超可変領域（ＣＤＲ）との接合部に位置するアミノ酸残基、配列全体の相同性などの複数種類の要因に基づいて選択することができる。選択されたテンプレートは、親相補決定領域（ＣＤＲ）の適切な配座（コンフォメーション）を可能な限り維持するために、複数の配列の混合物であってもよく、または共有テンプレートであってもよい。同時に、抗体超可変領域（ＣＤＲ）における脱アミノ基部位ＮＧがもたらす可能性のあるタンパク質不均一性（異質性）を回避するため、ヒト化後の抗体軽重鎖に対してそれぞれ変異設計を行った。最終的には、ヒト化の軽鎖変異体Ｌ２７Ｅ５（配列番号１２）およびヒト化重鎖変異体Ｈ３Ｂ８（配列番号１１）を得た。
【0076】
４．２ ＷＭ０３－Ｃ６ヒト化モノクローナル抗体の親和性分析
実施例３．２を参照し、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体をＣＭ５チップ表面にカップリングし、抗ＣＤ３Ｅ抗体（ＷＭ０３－Ｃ６およびＨ３Ｂ８＋Ｌ２７Ｅ５）を、０．５～１μｇ／ｍＬまで希釈した。１０μＬ／ｍｉｎで注射し、３５０～４００ＲＵ程度の抗体が抗ヒトＦｃの抗体に捕獲されるように確保する。その後、ｈＣＤ３Ｅ－ｈｉｓを一連の濃度勾配（例えば、６．１７ｎＭ、１８．５ｎＭ、５５．６ｎＭ、１６７ｎＭ、５００ｎＭ）に設定し、２５℃、３０μＬ／ｍｉｎで低濃度から高濃度まで注射し、結合時間は１２０ｓであり、解離時間は６００～１８００ｓであり、１０μＬ／ｍｉｎで３ＭのＭｇＣｌ２を３０ｓ注射してチップ表面を再生した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００評価ソフトウェアのバージョン２．０．１を用いて結合速度（Ｋｏｎ）および解離速度（Ｋｏｆｆ）を１：１結合モデルフィッティング結合と解離センサーマップから計算した。比率Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎで解離平衡定数（ＫＤ）を計算した。フィッティング結果を表２に示す。
実施例３．２を参照し、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体をＣＭ５チップ表面にカップリングし、抗ＣＤ３Ｅ抗体（ＷＭ０３－Ｃ６およびＨ３Ｂ８＋Ｌ２７Ｅ５）を、０．５～１μｇ／ｍＬまで希釈した。１０μＬ／ｍｉｎで注射し、３５０～４００ＲＵ程度の抗体が抗ヒトＦｃの抗体に捕獲されるように確保する。その後、ｈＣＤ３Ｅ－ｈｉｓを一連の濃度勾配（例えば、６．１７ｎＭ、１８．５ｎＭ、５５．６ｎＭ、１６７ｎＭ、５００ｎＭ）に設定し、２５℃、３０μＬ／ｍｉｎで低濃度から高濃度まで注射し、結合時間は１２０ｓであり、解離時間は６００～１８００ｓであり、１０μＬ／ｍｉｎで３ＭのＭｇＣｌ２を３０ｓ注射してチップ表面を再生した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００評価ソフトウェアのバージョン２．０．１を用いて結合速度（Ｋｏｎ）および解離速度（Ｋｏｆｆ）を１：１結合モデルフィッティング結合と解離センサーマップから計算した。比率Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎで解離平衡定数（ＫＤ）を計算した。フィッティング結果を表２に示す。
【0077】
表２：ＷＭ０３－Ｃ６ヒト化モノクローナル抗体結合ｈＣＤ３Ｅ－ｈｉｓ親和定数
【表2】
【0078】
実施例５：Ｓ８Ｆ３のインビトロ親和性成熟
標的抗原に対する二重特異性抗体の特異性を高め、二重特異性抗体の投与過程における組織分布と殺傷効率を強めるために、Ｓ８Ｆ３重鎖可変領域に対してインビトロ親和性成熟を行った。通常の分子生物学的手段を用いてＳ８Ｆ３重鎖可変領域のＣＤＲ３に変異を導入することにより、Ｓ８Ｆ３ＶＨに基づくＣＤＲ３変異ライブラリを構築した。設計した変異方案は、表３に示す通りであり、構築ライブラリ容量は１．７×１０Ｅ８であり、正解率は８６％である。
標的抗原に対する二重特異性抗体の特異性を高め、二重特異性抗体の投与過程における組織分布と殺傷効率を強めるために、Ｓ８Ｆ３重鎖可変領域に対してインビトロ親和性成熟を行った。通常の分子生物学的手段を用いてＳ８Ｆ３重鎖可変領域のＣＤＲ３に変異を導入することにより、Ｓ８Ｆ３ＶＨに基づくＣＤＲ３変異ライブラリを構築した。設計した変異方案は、表３に示す通りであり、構築ライブラリ容量は１．７×１０Ｅ８であり、正解率は８６％である。
【0079】
表３：Ｓ８Ｆ３ＶＨ－ＣＤＲ３変異ライブラリ設計方案
【表3】
【0080】
ダブルベクターバクテリオファージ展示システム（実験技術手順は中国特許出願第２０１５１００９７１１７．０号に記載の実施例５を参照）に基づいて、固相スクリーニングの方法により、ｈＣＤ１２３－ＳＰ１抗原を用いて構築したＳ８Ｆ３ＶＨ－ＣＤＲ３変異ライブラリに対して合計３回のスクリーニング濃縮を行い、最終的に親和性が向上した重鎖可変領域変異体Ｈ７Ａ３を得た。得られたＨ７Ａ３可変領域をコードするヌクレオチド配列を、ヒト重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列が融合された真核発現ベクターにクローニングし、Ｌ２７Ｅ５軽鎖発現ベクターと組み合わせて全抗体を発現させた。
【0081】
実施例３．２を参照してＢｉａｃｏｒｅ Ｘ１００を用いてＳ８Ｆ３重鎖変異体Ｈ７Ａ３に対する親和性測定を行い、結果を表４に示す通りである。
【0082】
表４：Ｓ８Ｆ３重鎖変異体のｈＣＤ１２３－ＳＰ１－ｈｉｓへの結合の親和定数
【表4】
【0083】
実施例６：Ｈ７Ａ３のヒト化およびその活性同定
抗ヒトＣＤ１２３マウスモノクローナル抗体重鎖Ｈ７Ａ３のヒト化は古典的なフレームワーク移植戦略を採用した。実施例４を参照してＨ７Ａ３の重鎖可変領域に対するＣＤＲ移植を行い、ヒト化バージョンＨ７Ａ３ＶＨ－ｈ２を得、同時に抗体の配座および親和性を確保するために、ヒト化抗体フレームワーク領域のいくつかの重要なアミノ酸（例えばＩ６９、Ｒ７１、Ｔ７３、Ａ７５）に対して回復変異を行い、最終的にヒト化バージョンＨ７Ａ３－ｈ２－ｍ５（配列番号１３）を得た。ヒト化抗体のアミノ酸配列に基づいて抗体可変領域遺伝子を設計し合成し、真核発現ベクターにクローニングし、共通軽鎖Ｌ２７Ｅ５を配合してヒトＩｇＧ１バージョン全抗体を発現させた。
抗ヒトＣＤ１２３マウスモノクローナル抗体重鎖Ｈ７Ａ３のヒト化は古典的なフレームワーク移植戦略を採用した。実施例４を参照してＨ７Ａ３の重鎖可変領域に対するＣＤＲ移植を行い、ヒト化バージョンＨ７Ａ３ＶＨ－ｈ２を得、同時に抗体の配座および親和性を確保するために、ヒト化抗体フレームワーク領域のいくつかの重要なアミノ酸（例えばＩ６９、Ｒ７１、Ｔ７３、Ａ７５）に対して回復変異を行い、最終的にヒト化バージョンＨ７Ａ３－ｈ２－ｍ５（配列番号１３）を得た。ヒト化抗体のアミノ酸配列に基づいて抗体可変領域遺伝子を設計し合成し、真核発現ベクターにクローニングし、共通軽鎖Ｌ２７Ｅ５を配合してヒトＩｇＧ１バージョン全抗体を発現させた。
【0084】
実施例３．２を参照してＢｉａｃｏｒｅ Ｘ１００を用いてＨ７Ａ３ヒト化バージョンＨ７Ａ３－ｈ２－ｍ５に対して親和性測定を行い、結果を表５に示す通りである。
【0085】
表５：Ｈ７Ａ３ヒト化バージョンのｈＣＤ１２３－ＳＰ１－ｈｉｓへの結合の親和定数
【表5】
【0086】
成長対数期のＭＶ－４－１１（ヒト急性単核細胞白血病細胞、南京科佰生物科技有限公司から購入）を取って、遠心後、１％のＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液で２×１０６個／ｍＬに再懸濁し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルＶ底板に敷き、遠心後に上清を取り除いた。被検試料Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５＋Ｌ２７Ｅ５、対照試料ＣＳＬ３６２およびＨＩｇＧ非関連抗体（Ａ０１００６、ヒトＩｇＧ対照（全分子、精製）、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）を、ＰＢＳ緩衝液でそれぞれ初期濃度１００ｎＭから３倍段階希釈して合計９つの最終濃度点として調製し、細胞を含有するウェルに加えて４℃で１時間インキュベートした。その後、２００μＬのＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＦＩＴＣ（中杉金橋、ＺＦ－０３０８）を１００μＬ／ウェルで加え、４℃、暗所で３０分間インキュベートした。その後、２００μＬのＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、ＰＢＳ緩衝液１００μＬで再懸濁した後フローサイトメトリー（ＡＣＥＡ，Ｎｏｖｏｃｙｔｅ）でＦＩＴＣチャネルを検出した。結果は、図２に示すように、Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５＋Ｌ２７Ｅ５がＣＤ１２３陽性細胞ＭＶ－４－１１とよく結合することができ、ＫＤ値は３．１ｎＭである。
【0087】
実施例７：二重特異性抗体の製造
ＣＤ３Ｅモノクローナル抗体の重鎖可変領域Ｈ３Ｂ８およびＣＤ１２３モノクローナル抗体の重鎖可変領域Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５をコードするヌクレオチド配列を、それぞれ適切な真核発現ベクターにクローニングし、共通軽鎖に基づくヘテロダイマーを構築した。すなわち、ＣＤ３Ｅ抗体の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を、Ｋｎｏｂ変異のＩｇＧ１定常領域ＩｇＧ１ｍ３－Ｋをコードするヌクレオチド配列が融合された真核発現ベクターにクローニングし、ＣＤ１２３抗体の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を、Ｈｏｌｅ変異のＩｇＧ１定常領域ＩｇＧ１ｍ３－Ｈをコードするヌクレオチド配列を含有する真核発現ベクターにクローニングし、共通軽鎖Ｌ２７Ｅ５の可変領域ＶＫをコードするヌクレオチド配列を、ヒト軽鎖定常領域ＣＫをコードするヌクレオチド配列が融合された真核発現ベクターにクローニングした。同時に、候補分子と臨床で研究しているＣＤ３Ｅ×ＣＤ１２３二重特異性抗体との生物学の活性を比較するために、特許ＷＯ２０１７２１０４４３を参照してと同一のＦｃ構造に基づくＸｍａｂ１４０４５（配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２）を構築した。
ＣＤ３Ｅモノクローナル抗体の重鎖可変領域Ｈ３Ｂ８およびＣＤ１２３モノクローナル抗体の重鎖可変領域Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５をコードするヌクレオチド配列を、それぞれ適切な真核発現ベクターにクローニングし、共通軽鎖に基づくヘテロダイマーを構築した。すなわち、ＣＤ３Ｅ抗体の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を、Ｋｎｏｂ変異のＩｇＧ１定常領域ＩｇＧ１ｍ３－Ｋをコードするヌクレオチド配列が融合された真核発現ベクターにクローニングし、ＣＤ１２３抗体の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を、Ｈｏｌｅ変異のＩｇＧ１定常領域ＩｇＧ１ｍ３－Ｈをコードするヌクレオチド配列を含有する真核発現ベクターにクローニングし、共通軽鎖Ｌ２７Ｅ５の可変領域ＶＫをコードするヌクレオチド配列を、ヒト軽鎖定常領域ＣＫをコードするヌクレオチド配列が融合された真核発現ベクターにクローニングした。同時に、候補分子と臨床で研究しているＣＤ３Ｅ×ＣＤ１２３二重特異性抗体との生物学の活性を比較するために、特許ＷＯ２０１７２１０４４３を参照してと同一のＦｃ構造に基づくＸｍａｂ１４０４５（配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２）を構築した。
【0088】
構築されたＨ３Ｂ８－ＩｇＧ１ｍ３－Ｋを発現し、Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５－ＩｇＧ１ｍ３－Ｈを発現しおよびＬ２７Ｅ５－ＣＫを発現する３つの真核発現ベクターを、リポソームを用いてＨＥＫ２９３Ｆ細胞に同時トランスフェクションさせ、無血清懸濁培養条件下で３～５日間培養し、その後遠心などにより培養上清を回収した。培養上清における二重特異性抗体に対してＰｒｏｔｅｉｎＡ／Ｇ親和性クロマトグラフィーカラム（例えば、ＧＥ社のＭａｂｓｅｌｅｃｔ ＳＵＲＥなど）で精製を行い、その後、脱塩カラム（例えば、ＧＥ社のＨｉｔｒａｐ ｄｅｓａｕｌｔｉｎｇなど）で組換えタンパク質保存用緩衝液をＰＢＳ（ｐＨ７．０）または他の適切な緩衝液に置換した。脱塩後、タンパク質溶液を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）でＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ）により精製して標的タンパク質を得た。必要に応じて抗体試料を濾過して除菌することができ、その後分注して－２０℃に保存して用意することができる。
【0089】
実施例８：二重特異性抗体の親和性分析
実施例３．２および４．２を参照し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００を用いて表面プラズマ共鳴技術により抗ＣＤ３Ｅモノクローナル抗体Ｈ３Ｂ８＋Ｌ２７Ｅ５、抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５＋Ｌ２７Ｅ５、二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３（ＣＤ３×ＣＤ１２３ ＢｓＡｂ）、および対照抗体Ｘｍａｂ１４０４５に対して親和性測定を行い、親和性フィッティング結果を表６および表７に示す。
実施例３．２および４．２を参照し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００を用いて表面プラズマ共鳴技術により抗ＣＤ３Ｅモノクローナル抗体Ｈ３Ｂ８＋Ｌ２７Ｅ５、抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５＋Ｌ２７Ｅ５、二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３（ＣＤ３×ＣＤ１２３ ＢｓＡｂ）、および対照抗体Ｘｍａｂ１４０４５に対して親和性測定を行い、親和性フィッティング結果を表６および表７に示す。
【0090】
表６：二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３のｈＣＤ１２３－ＳＰ１－ｈｉｓへの結合の親和定数
【表6】
【0091】
表７：二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３のＣＤ３Ｅへの結合の親和定数
【表7】
【0092】
実施例９：二重特異性抗体がＣＤ３ＥとＣＤ１２３との２種類の抗原を同時に識別する能力の同定
通常ＥＬＩＳＡ方法を用いて二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３（ＣＤ３×ＣＤ１２３ ＢｓＡｂ）のＣＤ３ＥとＣＤ１２３との２種類の抗原の同時結合を検出した。ＣＤ１２３－ＳＰ１－ｍＦｃ抗原を、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（３μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル）で被覆し、４℃で一晩被覆した。ブロッキング液ＰＢＳ－０．１％Ｔｗｅｅｎ２０－３％牛乳を用いて３７℃で１時間ブロッキングした後、それぞれ抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５＋Ｌ２７Ｅ５、抗ＣＤ３Ｅモノクローナル抗体Ｈ３Ｂ８＋Ｌ２７Ｅ５および二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３（１０μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル）を、それぞれ重複で２つのウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ－０．１％Ｔｗｅｅｎ２０でＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、その後ＣＤ３Ｅ－ｈｉｓ抗原（１μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル）を加えて３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ－０．１％Ｔｗｅｅｎ２０でＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、その後ＨＲＰマウス抗ｈｉｓ ＩｇＧ（ｃｗ０２８５Ｍ、北京康為世紀生物科技有限公司）を加えて３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ－０．１％Ｔｗｅｅｎ２０でＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、ＯＰＤ基質発色液を加えて５～１０分間後１ＭのＨ２ＳＯ４で発色を停止し、マイクロプレートリーダーにより４９２ｎｍ／６３０ｎｍの二波長における光学濃度値を測定した。ＥＬＩＳＡ分析結果、図３に示すように、二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３は、ＣＤ３ＥとＣＤ１２３との２種類の抗原を同時に識別することができる。
通常ＥＬＩＳＡ方法を用いて二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３（ＣＤ３×ＣＤ１２３ ＢｓＡｂ）のＣＤ３ＥとＣＤ１２３との２種類の抗原の同時結合を検出した。ＣＤ１２３－ＳＰ１－ｍＦｃ抗原を、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（３μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル）で被覆し、４℃で一晩被覆した。ブロッキング液ＰＢＳ－０．１％Ｔｗｅｅｎ２０－３％牛乳を用いて３７℃で１時間ブロッキングした後、それぞれ抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５＋Ｌ２７Ｅ５、抗ＣＤ３Ｅモノクローナル抗体Ｈ３Ｂ８＋Ｌ２７Ｅ５および二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３（１０μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル）を、それぞれ重複で２つのウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ－０．１％Ｔｗｅｅｎ２０でＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、その後ＣＤ３Ｅ－ｈｉｓ抗原（１μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル）を加えて３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ－０．１％Ｔｗｅｅｎ２０でＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、その後ＨＲＰマウス抗ｈｉｓ ＩｇＧ（ｃｗ０２８５Ｍ、北京康為世紀生物科技有限公司）を加えて３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ－０．１％Ｔｗｅｅｎ２０でＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、ＯＰＤ基質発色液を加えて５～１０分間後１ＭのＨ２ＳＯ４で発色を停止し、マイクロプレートリーダーにより４９２ｎｍ／６３０ｎｍの二波長における光学濃度値を測定した。ＥＬＩＳＡ分析結果、図３に示すように、二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３は、ＣＤ３ＥとＣＤ１２３との２種類の抗原を同時に識別することができる。
【0093】
実施例１０：二重特異性抗体が細胞表面ＣＤ３ＥおよびＣＤ１２３を識別する能力の同定
１０．１ 二重特異性抗体が細胞表面ＣＤ３Ｅを識別する能力の同定
成長対数期のＪｕｒｋａｔ－Ｄｕａｌ細胞（ｊｋｔｄ－ｉｓｎｆ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎから購入）を取って、遠心後１％のＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液で２×１０６個／ｍＬに再懸濁し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルＶ底板に敷き、遠心後に上清を取り除いた。二重特異性抗体対照試料Ｘｍａｂ１４０４５、抗ＣＤ３Ｅモノクローナル抗体Ｈ３Ｂ８＋Ｌ２７Ｅ５、ＨＩｇＧ非関連抗体（Ａ０１００６、ヒトＩｇＧ対照（全分子、精製）、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）、および二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３（ＣＤ３×ＣＤ１２３ ＢｓＡｂ）をＰＢＳ緩衝液で希釈し、４００ｎＭを初期濃度とし、前の３つの濃度点に対して２倍希釈し、その後の５つの濃度点に対して３倍希釈し、合計８つの濃度点とし、細胞を含有するウェルに加え、４℃で１時間インキュベートした。その後２００μＬのＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＦＩＴＣ（中杉金橋、ＺＦ－０３０８）を１００μＬ／ウェルで加え、４℃、暗所で３０分間インキュベートした。その後２００μＬのＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、ＰＢＳ緩衝液１００μＬで再懸濁した後フローサイトメトリー（ＡＣＥＡ、Ｎｏｖｏｃｙｔｅ）でＦＩＴＣチャネルを検出した。結果は、二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３がＪｕｒｋａｔ－Ｄｕａｌ細胞表面のＣＤ３Ｅとをよく結合できることが示されており、結合強度が対照試料Ｘｍａｂ１４０４５よりも弱く、実施例９の親和性測定結果と同様である（図４）。
１０．１ 二重特異性抗体が細胞表面ＣＤ３Ｅを識別する能力の同定
成長対数期のＪｕｒｋａｔ－Ｄｕａｌ細胞（ｊｋｔｄ－ｉｓｎｆ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎから購入）を取って、遠心後１％のＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液で２×１０６個／ｍＬに再懸濁し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルＶ底板に敷き、遠心後に上清を取り除いた。二重特異性抗体対照試料Ｘｍａｂ１４０４５、抗ＣＤ３Ｅモノクローナル抗体Ｈ３Ｂ８＋Ｌ２７Ｅ５、ＨＩｇＧ非関連抗体（Ａ０１００６、ヒトＩｇＧ対照（全分子、精製）、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）、および二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３（ＣＤ３×ＣＤ１２３ ＢｓＡｂ）をＰＢＳ緩衝液で希釈し、４００ｎＭを初期濃度とし、前の３つの濃度点に対して２倍希釈し、その後の５つの濃度点に対して３倍希釈し、合計８つの濃度点とし、細胞を含有するウェルに加え、４℃で１時間インキュベートした。その後２００μＬのＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＦＩＴＣ（中杉金橋、ＺＦ－０３０８）を１００μＬ／ウェルで加え、４℃、暗所で３０分間インキュベートした。その後２００μＬのＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、ＰＢＳ緩衝液１００μＬで再懸濁した後フローサイトメトリー（ＡＣＥＡ、Ｎｏｖｏｃｙｔｅ）でＦＩＴＣチャネルを検出した。結果は、二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３がＪｕｒｋａｔ－Ｄｕａｌ細胞表面のＣＤ３Ｅとをよく結合できることが示されており、結合強度が対照試料Ｘｍａｂ１４０４５よりも弱く、実施例９の親和性測定結果と同様である（図４）。
【0094】
１０．２ 二重特異性抗体が細胞表面ＣＤ１２３を識別する能力の同定
成長対数期のＭＶ－４－１１細胞を取って遠心後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液で２×１０６個／ｍＬに再懸濁し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルＶ底板に敷き、遠心後に上清を取り除いた。ＰＢＳ緩衝液で試料を希釈し、二重特異性抗体対照試料Ｘｍａｂ１４０４５、抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５＋Ｌ２７Ｅ５、二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３（ＣＤ３×ＣＤ１２３ ＢｓＡｂ）およびＨＩｇＧ非関連抗体（Ａ０１００６、ヒトＩｇＧ対照（全分子、精製）、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）を、それぞれ１００ｎＭの初期濃度から３倍段階希釈して合計９つの濃度点とし、細胞を含有する９６ウェルプレートに加え、４℃で１時間インキュベートした。その後２００μＬのＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＦＩＴＣ（中杉金橋、ＺＦ－０３０８）を１００μＬ／ウェルで加え、４℃、暗所で３０分間インキュベートした。その後２００μＬのＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、ＰＢＳ緩衝液１００μＬで再懸濁した後フローサイトメトリー（ＡＣＥＡ、Ｎｏｖｏｃｙｔｅ）でＦＩＴＣチャネルを検出した。結果は、二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３がＣＤ１２３陽性細胞ＭＶ－４－１１表面のＣＤ１２３とをよく結合できることが示されており、ＫＤ値は７．０８ｎＭであり、Ｘｍａｂ１４０４５（ＫＤ＝６．０７ｎＭ）と相当する（図５）。
成長対数期のＭＶ－４－１１細胞を取って遠心後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液で２×１０６個／ｍＬに再懸濁し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルＶ底板に敷き、遠心後に上清を取り除いた。ＰＢＳ緩衝液で試料を希釈し、二重特異性抗体対照試料Ｘｍａｂ１４０４５、抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５＋Ｌ２７Ｅ５、二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３（ＣＤ３×ＣＤ１２３ ＢｓＡｂ）およびＨＩｇＧ非関連抗体（Ａ０１００６、ヒトＩｇＧ対照（全分子、精製）、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）を、それぞれ１００ｎＭの初期濃度から３倍段階希釈して合計９つの濃度点とし、細胞を含有する９６ウェルプレートに加え、４℃で１時間インキュベートした。その後２００μＬのＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＦＩＴＣ（中杉金橋、ＺＦ－０３０８）を１００μＬ／ウェルで加え、４℃、暗所で３０分間インキュベートした。その後２００μＬのＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、ＰＢＳ緩衝液１００μＬで再懸濁した後フローサイトメトリー（ＡＣＥＡ、Ｎｏｖｏｃｙｔｅ）でＦＩＴＣチャネルを検出した。結果は、二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３がＣＤ１２３陽性細胞ＭＶ－４－１１表面のＣＤ１２３とをよく結合できることが示されており、ＫＤ値は７．０８ｎＭであり、Ｘｍａｂ１４０４５（ＫＤ＝６．０７ｎＭ）と相当する（図５）。
【0095】
実施例１１：二重特異性抗体で媒介されたＪｕｒｋａｔ－Ｄｕａｌ細胞の特異的活性化
成長対数期にあるＭＶ－４－１１細胞（ＣＤ１２３＋細胞）を収集し、遠心後１６４０培地で２×１０６個／ｍＬまで再懸濁し、５０μＬ／ウェルで細胞プレートに敷き、遠心後に上清を取り除いた。成長対数期のＪｕｒｋａｔ－Ｄｕａｌ細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎから購入）収集し、遠心後１６４０培地で２×１０６個／ｍＬまで再懸濁し、５０μＬ／ウェルで細胞プレートに加えて１：１の最終的なＥ：Ｔ割合を得た。その後、初期濃度６ｎＭから４倍段階希釈してなる８つの濃度点の二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３（ＣＤ３×ＣＤ１２３ ＢｓＡｂ、５０μＬ／ウェル）を加えた。二重特異性抗体対照試料Ｘｍａｂ１４０４５、抗ＣＤ３Ｅモノクローナル抗体Ｈ３Ｂ８＋Ｌ２７Ｅ５、抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５＋Ｌ２７Ｅ５、Ｈ３Ｂ８＋Ｌ２７Ｅ５とＨ７Ａ３－ｈ２－ｍ５＋Ｌ２７Ｅ５との組み合せ（Ｈ３Ｂ８＋Ｌ２７Ｅ５ ＆ Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５＋Ｌ２７Ｅ５）、ＣＤ１２３陰性標的細胞（ＢＡＦ３細胞）、およびＨＩｇＧ非関連抗体（Ａ０１００６、ヒトＩｇＧ対照（全分子、精製）、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）は対照群として設置され、それぞれ二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３の濃度と同一の濃度を使用した。２０時間インキュベートした後、上清を取って、ＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃ（登録商標）取扱説明書（ＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、ｒｅｐ－ｑｌｃ２）を参照しては異なる条件下で媒介された腫瘍細胞のＪｕｒｋａｔ－Ｄｕａｌ細胞に対する特異的活性化を検出し分析した（図６のＡ～Ｂ）。
成長対数期にあるＭＶ－４－１１細胞（ＣＤ１２３＋細胞）を収集し、遠心後１６４０培地で２×１０６個／ｍＬまで再懸濁し、５０μＬ／ウェルで細胞プレートに敷き、遠心後に上清を取り除いた。成長対数期のＪｕｒｋａｔ－Ｄｕａｌ細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎから購入）収集し、遠心後１６４０培地で２×１０６個／ｍＬまで再懸濁し、５０μＬ／ウェルで細胞プレートに加えて１：１の最終的なＥ：Ｔ割合を得た。その後、初期濃度６ｎＭから４倍段階希釈してなる８つの濃度点の二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３（ＣＤ３×ＣＤ１２３ ＢｓＡｂ、５０μＬ／ウェル）を加えた。二重特異性抗体対照試料Ｘｍａｂ１４０４５、抗ＣＤ３Ｅモノクローナル抗体Ｈ３Ｂ８＋Ｌ２７Ｅ５、抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５＋Ｌ２７Ｅ５、Ｈ３Ｂ８＋Ｌ２７Ｅ５とＨ７Ａ３－ｈ２－ｍ５＋Ｌ２７Ｅ５との組み合せ（Ｈ３Ｂ８＋Ｌ２７Ｅ５ ＆ Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５＋Ｌ２７Ｅ５）、ＣＤ１２３陰性標的細胞（ＢＡＦ３細胞）、およびＨＩｇＧ非関連抗体（Ａ０１００６、ヒトＩｇＧ対照（全分子、精製）、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）は対照群として設置され、それぞれ二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３の濃度と同一の濃度を使用した。２０時間インキュベートした後、上清を取って、ＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃ（登録商標）取扱説明書（ＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、ｒｅｐ－ｑｌｃ２）を参照しては異なる条件下で媒介された腫瘍細胞のＪｕｒｋａｔ－Ｄｕａｌ細胞に対する特異的活性化を検出し分析した（図６のＡ～Ｂ）。
【0096】
実施例１２：二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３で媒介して精製されたＴ細胞の表面活性化分子の発現およびＣＤ１２３陽性腫瘍細胞に対する殺傷
１２．１ ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の分離
正常なボランティアの血液（各５０ｍＬ）を採取し、すべてのボランティアがインフォームドコンセントを締結した。
１２．１ ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の分離
正常なボランティアの血液（各５０ｍＬ）を採取し、すべてのボランティアがインフォームドコンセントを締結した。
【0097】
ボランティアの入選基準は、次の通りである。
１．年齢が１８歳を超え、
２．ＨＩＶ、ＨＢＶ感染がなく、
３．血液ルーチン検査は正常であり、
４．妊婦または授乳中の女性でない。
Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心法を用いてボランティア全血細胞からＰＢＭＣを分離して得、１６４０培地に培養した。
１．年齢が１８歳を超え、
２．ＨＩＶ、ＨＢＶ感染がなく、
３．血液ルーチン検査は正常であり、
４．妊婦または授乳中の女性でない。
Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心法を用いてボランティア全血細胞からＰＢＭＣを分離して得、１６４０培地に培養した。
【0098】
１２．２ 二重特異性抗体で媒介して精製されたＴ細胞のＣＤ１２３陽性腫瘍細胞を殺傷する検出
成長対数期のＭＶ－４－１１細胞（ＣＤ１２３＋細胞）収集し、遠心後１６４０培地で１×１０６個／ｍＬまで再懸濁し、５０μＬ／ウェルで細胞プレートに敷いた。その後、初期濃度１ｎＭから４倍段階希釈してなる８つの濃度点の二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３（ＣＤ３×ＣＤ１２３ ＢｓＡｂ、５０μＬ／ウェル）を加えた。Ｔ細胞陰性選別キット取扱説明書（ＢＤ ＩＭａｑ ｈｕｍａｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｓｅｔ－ＤＭ、ＢＤ、５５７８７４）に従ってＰＢＭＣから精製のＴ細胞（５×１０６個／ｍＬ、５０μＬ／ウェル）を選別して得、最終的なＥＴ比（ｅｆｆｅｃｔｏｒ－ｔａｒｇｅｔ ｒａｔｉｏ）は５：１となった。同時に、標的細胞単独の対照（ＭＶ－４－１１細胞）、効果細胞単独の対照（Ｔ）、培地単独の空白対照を設定し、そして培地を用いて体積が１５０μＬになるまで補充した。２０時間インキュベートした後、上清を取って、ｃｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性検出試薬取扱説明書（ｃｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標） Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ、ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０）に従って二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３で媒介されたＴ細胞の腫瘍細胞に対する殺傷率を検出し分析した。結果は、二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３がＣＤ１２３陽性腫瘍細胞に対するＴ細胞の殺傷を特異的に媒介できることが示されており、ＣＤ１２３陰性腫瘍細胞（ＢＡＦ３細胞）に対する殺傷効果が示されていなかった（図７）。
成長対数期のＭＶ－４－１１細胞（ＣＤ１２３＋細胞）収集し、遠心後１６４０培地で１×１０６個／ｍＬまで再懸濁し、５０μＬ／ウェルで細胞プレートに敷いた。その後、初期濃度１ｎＭから４倍段階希釈してなる８つの濃度点の二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３（ＣＤ３×ＣＤ１２３ ＢｓＡｂ、５０μＬ／ウェル）を加えた。Ｔ細胞陰性選別キット取扱説明書（ＢＤ ＩＭａｑ ｈｕｍａｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｓｅｔ－ＤＭ、ＢＤ、５５７８７４）に従ってＰＢＭＣから精製のＴ細胞（５×１０６個／ｍＬ、５０μＬ／ウェル）を選別して得、最終的なＥＴ比（ｅｆｆｅｃｔｏｒ－ｔａｒｇｅｔ ｒａｔｉｏ）は５：１となった。同時に、標的細胞単独の対照（ＭＶ－４－１１細胞）、効果細胞単独の対照（Ｔ）、培地単独の空白対照を設定し、そして培地を用いて体積が１５０μＬになるまで補充した。２０時間インキュベートした後、上清を取って、ｃｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性検出試薬取扱説明書（ｃｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標） Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ、ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０）に従って二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３で媒介されたＴ細胞の腫瘍細胞に対する殺傷率を検出し分析した。結果は、二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３がＣＤ１２３陽性腫瘍細胞に対するＴ細胞の殺傷を特異的に媒介できることが示されており、ＣＤ１２３陰性腫瘍細胞（ＢＡＦ３細胞）に対する殺傷効果が示されていなかった（図７）。
【0099】
１２．３ 二重特異性抗体がＴ細胞を特異的に活性化した後の表面活性化分子発現の同定
上記１２．２項の実験において、上清を取った後の細胞をＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、抗ヒトＣＤ３－ＡＰＣ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、１７－００３７－４２）および抗ヒトＣＤ６９－ＰＥ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、１１－００６９－４２）というフローサイトメトリー用抗体を加えて４℃、暗所で３０分間インキュベートした後に、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、ＰＢＳ緩衝液１００μＬで再懸濁した後フローサイトメーター（ＡＣＥＡ ＮｏｖｏＣｙｔｅ）により検出し、二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３（ＣＤ３×ＣＤ１２３ ＢｓＡｂ）処理後のＣＤ３陽性細胞群（ＭＶ－４－１１細胞）における活性化マーカーＣＤ６９の発現の相違を比較した。結果は、二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３が、陽性腫瘍細胞の存在下で、Ｔ細胞表面ＣＤ６９の発現を特異的に上方制御することができ、ＣＤ１２３陰性腫瘍細胞（ＢＡＦ３細胞）がＴ細胞表面ＣＤ６９の発現を上方制御できないことが示されている（図８）。
上記１２．２項の実験において、上清を取った後の細胞をＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、抗ヒトＣＤ３－ＡＰＣ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、１７－００３７－４２）および抗ヒトＣＤ６９－ＰＥ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、１１－００６９－４２）というフローサイトメトリー用抗体を加えて４℃、暗所で３０分間インキュベートした後に、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、ＰＢＳ緩衝液１００μＬで再懸濁した後フローサイトメーター（ＡＣＥＡ ＮｏｖｏＣｙｔｅ）により検出し、二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３（ＣＤ３×ＣＤ１２３ ＢｓＡｂ）処理後のＣＤ３陽性細胞群（ＭＶ－４－１１細胞）における活性化マーカーＣＤ６９の発現の相違を比較した。結果は、二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３が、陽性腫瘍細胞の存在下で、Ｔ細胞表面ＣＤ６９の発現を特異的に上方制御することができ、ＣＤ１２３陰性腫瘍細胞（ＢＡＦ３細胞）がＴ細胞表面ＣＤ６９の発現を上方制御できないことが示されている（図８）。
【0100】
実施例１３：二重特異性抗体で媒介されたＴ細胞のインビトロ増殖実験
１３．１ ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の分離
実施例１２．１を参照し選別してＰＢＭＣを得た。
１３．１ ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の分離
実施例１２．１を参照し選別してＰＢＭＣを得た。
【0101】
１３．２ 二重特異性抗体で媒介されたＴ細胞のインビトロ増殖実験
Ｔ細胞陰性選別キット取扱説明書（ＢＤ ＩＭａｑ ｈｕｍａｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｓｅｔ－ＤＭ、ＢＤ、５５７８７４）を参照し、ＰＢＭＣから選別して精製のＴ細胞を得た。ＣＦＳＥ着色取扱説明書に従って精製のＴ細胞に対して（ＣＦＳＥ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、６５－０８５０－８４）着色し、１６４０培地で２×１０６個／ｍＬまで再懸濁し、５０μＬ／ウェルで細胞培養プレートに加えた。成長対数期のＭＶ－４－１１（ＣＤ１２３＋細胞）を収集し、遠心後１６４０培地で５×１０５個／ｍＬまで再懸濁し、５０μＬ／ウェルで細胞プレートに敷き、最終的なＥＴ比（ｅｆｆｅｃｔｏｒ－ｔａｒｇｅｔ ｒａｔｉｏ）は４：１となった。その後、初期濃度０．２５ｎＭから４倍段階希釈してなる８つの濃度点の二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３（ＣＤ３×ＣＤ１２３ ＢｓＡｂ、５０μＬ／ウェル）、およびＸｍａｂ１４０４５を加えた。別途で、０．２５ｎＭ濃度点の対照（群）としてそれぞれ抗ＣＤ３Ｅモノクローナル抗体Ｈ３Ｂ８＋Ｌ２７Ｅ５単独、抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５＋Ｌ２７Ｅ５単独、およびＨ３Ｂ８＋Ｌ２７Ｅ５とＨ７Ａ３－ｈ２－ｍ５＋Ｌ２７Ｅ５との組み合せ（Ｈ３Ｂ８＋Ｌ２７Ｅ５ ＆ Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５＋Ｌ２７Ｅ５）を設定した。なお、０．２５ｎＭ濃度点の二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３がＣＤ１２３陰性腫瘍細胞（ＢＡＦ３細胞）の存在下で作用させる対照（群）をさらに設定した。５日間インキュベートした後、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、抗ヒトＣＤ３－ＡＰＣ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１７－００３７－４２）というフローサイトメトリー用抗体を用いて４℃、暗所で３０分間インキュベートした後に、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、ＰＢＳ緩衝液１００μＬで再懸濁した後、フローサイトメトリー（ＡＣＥＡ、Ｎｏｖｏｃｙｔｅ）でＴ細胞増殖の状況を検出した（図９Ａ～Ｂ）。
Ｔ細胞陰性選別キット取扱説明書（ＢＤ ＩＭａｑ ｈｕｍａｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｓｅｔ－ＤＭ、ＢＤ、５５７８７４）を参照し、ＰＢＭＣから選別して精製のＴ細胞を得た。ＣＦＳＥ着色取扱説明書に従って精製のＴ細胞に対して（ＣＦＳＥ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、６５－０８５０－８４）着色し、１６４０培地で２×１０６個／ｍＬまで再懸濁し、５０μＬ／ウェルで細胞培養プレートに加えた。成長対数期のＭＶ－４－１１（ＣＤ１２３＋細胞）を収集し、遠心後１６４０培地で５×１０５個／ｍＬまで再懸濁し、５０μＬ／ウェルで細胞プレートに敷き、最終的なＥＴ比（ｅｆｆｅｃｔｏｒ－ｔａｒｇｅｔ ｒａｔｉｏ）は４：１となった。その後、初期濃度０．２５ｎＭから４倍段階希釈してなる８つの濃度点の二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３（ＣＤ３×ＣＤ１２３ ＢｓＡｂ、５０μＬ／ウェル）、およびＸｍａｂ１４０４５を加えた。別途で、０．２５ｎＭ濃度点の対照（群）としてそれぞれ抗ＣＤ３Ｅモノクローナル抗体Ｈ３Ｂ８＋Ｌ２７Ｅ５単独、抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５＋Ｌ２７Ｅ５単独、およびＨ３Ｂ８＋Ｌ２７Ｅ５とＨ７Ａ３－ｈ２－ｍ５＋Ｌ２７Ｅ５との組み合せ（Ｈ３Ｂ８＋Ｌ２７Ｅ５ ＆ Ｈ７Ａ３－ｈ２－ｍ５＋Ｌ２７Ｅ５）を設定した。なお、０．２５ｎＭ濃度点の二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３がＣＤ１２３陰性腫瘍細胞（ＢＡＦ３細胞）の存在下で作用させる対照（群）をさらに設定した。５日間インキュベートした後、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、抗ヒトＣＤ３－ＡＰＣ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１７－００３７－４２）というフローサイトメトリー用抗体を用いて４℃、暗所で３０分間インキュベートした後に、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、ＰＢＳ緩衝液１００μＬで再懸濁した後、フローサイトメトリー（ＡＣＥＡ、Ｎｏｖｏｃｙｔｅ）でＴ細胞増殖の状況を検出した（図９Ａ～Ｂ）。
【0102】
実施例１４：ＣＤ３４＋マウスモデルにおける二重特異性抗体の活性同定
４２匹（３２匹を群分け、１０匹を予備し）２０～２４週齡の雌性ｈＣＤ３４＋ヒト化マウス（澎立生物医薬技術（上海）有限公司から購入）を選択し、１００μＬの１×１０７個のＭＶ－４－１１細胞および１００μＬのＭａｔｒｉｇｅｌを均一に混合させた後に皮下注射によりマウスの背中の右側に接種し、接種前に３～４％イソフルランでマウス麻酔させた。腫瘍が平均で約５０～８０ｍｍ３程度まで増殖した際に、３２匹の腫瘍担持マウスを末梢血中のｈＣＤ４５＋の割合および腫瘍体積に基づいて群ごとに８匹ずつ４群に無作為に分けた。群分け投与当日を０日目と定義した。試験は、二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３の０．０１ｍｇ／ｋｇ群、０．１ ｍｇ／ｋｇ群、０．５ｍｇ／ｋｇ群および陰性対照群（ＩｇＧ１ｍ３、０．５ｍｇ／ｋｇ）という４群とし、群ごとに８匹であり、０日目、３日目、７日目、１４日目および２１日目に尾静脈注射投与し、合計５回投与した。相対腫瘍阻害率（ＴＧＩ）に基づいて療効評価を行い、動物の体重変化および死亡状況に基づいて安全性の評価を行った。
４２匹（３２匹を群分け、１０匹を予備し）２０～２４週齡の雌性ｈＣＤ３４＋ヒト化マウス（澎立生物医薬技術（上海）有限公司から購入）を選択し、１００μＬの１×１０７個のＭＶ－４－１１細胞および１００μＬのＭａｔｒｉｇｅｌを均一に混合させた後に皮下注射によりマウスの背中の右側に接種し、接種前に３～４％イソフルランでマウス麻酔させた。腫瘍が平均で約５０～８０ｍｍ３程度まで増殖した際に、３２匹の腫瘍担持マウスを末梢血中のｈＣＤ４５＋の割合および腫瘍体積に基づいて群ごとに８匹ずつ４群に無作為に分けた。群分け投与当日を０日目と定義した。試験は、二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３の０．０１ｍｇ／ｋｇ群、０．１ ｍｇ／ｋｇ群、０．５ｍｇ／ｋｇ群および陰性対照群（ＩｇＧ１ｍ３、０．５ｍｇ／ｋｇ）という４群とし、群ごとに８匹であり、０日目、３日目、７日目、１４日目および２１日目に尾静脈注射投与し、合計５回投与した。相対腫瘍阻害率（ＴＧＩ）に基づいて療効評価を行い、動物の体重変化および死亡状況に基づいて安全性の評価を行った。
【0103】
実験過程において動物の精神状態は全般的に良好であり、インビボ実験終了時（２４日目）には、陰性対照群（ＩｇＧ１ｍ３ ｉ．ｖ．０．５ｍｇ／ｋｇ投与量群、Ｇ１群）に比べて、投与群動物は対照群に比べて体重に有意差がなかった（Ｐ＞０．０５）。二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３は、０．５ｍｇ／ｋｇの投与量下で（Ｇ２群）を測定したところ、腫瘍の増殖を顕著に阻害する効果があり、相対腫瘍阻害率ＴＧＩ（％）は９７．３５％であり、かつ６匹の動物の腫瘍はほとんど完全に消退し、同期陰性対照群（Ｇ１群）に比べて極めて有意差がある（ｐ＜０．００１）。二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３の０．１ｍｇ／ｋｇ投与量群（Ｇ３群）の動物は、投与後の腫瘍体積の増加が緩慢であり、相対腫瘍阻害率ＴＧＩ（％）は５２．０８％であり、同期陰性対照群（Ｇ１群）に比べて有意差があり（ｐ＜０．０５）、Ｇ４は二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３の０．０１ｍｇ／ｋｇ投与量群である。二重特異性抗体ＣＤ３×ＣＤ１２３の腫瘍増殖と明らかな用量－効果関係（ｄｏｓｅ－ｅｆｆｅｃｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）があり、各群の動物のそれぞれの時間点の腫瘍増殖状況は図１０に示す通りである。ここで、Ｇ１群に比べて一元配置分散分析／Ｄｕｎｎｅｔｔ－ｔ検定統計を用いた場合、＊は、Ｐ＜０．０５を表し、＊＊は、Ｐ＜０．０１を表し、＊＊＊は、Ｐ＜０．００１を表す。重複測定／Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正統計を用いた場合、＃＃＃はＰ＜０．００１を表す。
【0104】
上記のように、本発明は一般的な説明および具体実施形態を用いて詳細に説明したが、当業者には本発明に基づき修正または改良できることが自明である。したがって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲での変更や改良を加えることは、本発明に係る特許請求の範囲に含まれている。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-09-29
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分を含む二重特異性抗体であって、前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分は、
配列番号１に記載のＨＣＤＲ１、
配列番号２に記載のＨＣＤＲ２、
配列番号３に記載のＨＣＤＲ３、
配列番号４に記載のＬＣＤＲ１、
配列番号５に記載のＬＣＤＲ２、および
配列番号６に記載のＬＣＤＲ３を含み、
ここで、ＨＣＤＲおよびＬＣＤＲはＫａｂａｔに従って定義される、
二重特異性抗体。
【請求項2】
ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分を含む二重特異性抗体であって、前記ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分は、
配列番号７に記載のＨＣＤＲ１、
配列番号８に記載のＨＣＤＲ２、
配列番号９に記載のＨＣＤＲ３、
配列番号４に記載のＬＣＤＲ１、
配列番号５に記載のＬＣＤＲ２、および
配列番号６に記載のＬＣＤＲ３を含み、
ここで、ＨＣＤＲおよびＬＣＤＲはＫａｂａｔに従って定義される、
二重特異性抗体。
【請求項3】
ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分およびヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分を含む、二重特異性抗体。
【請求項4】
請求項３に記載の二重特異性抗体であって、
前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分は、
配列番号１に記載のＨＣＤＲ１、
配列番号２に記載のＨＣＤＲ２、
配列番号３に記載のＨＣＤＲ３、
配列番号４に記載のＬＣＤＲ１、
配列番号５に記載のＬＣＤＲ２、および
配列番号６に記載のＬＣＤＲ３を含み、
ここで、ＨＣＤＲおよびＬＣＤＲはＫａｂａｔに従って定義される、
二重特異性抗体。
【請求項5】
請求項３に記載の二重特異性抗体であって、
前記ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分は、
配列番号７に記載のＨＣＤＲ１、
配列番号８に記載のＨＣＤＲ２、
配列番号９に記載のＨＣＤＲ３、
配列番号４に記載のＬＣＤＲ１、
配列番号５に記載のＬＣＤＲ２、および
配列番号６に記載のＬＣＤＲ３を含み、
ここで、ＨＣＤＲおよびＬＣＤＲはＫａｂａｔに従って定義される、
二重特異性抗体。
【請求項6】
請求項３～５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体であって、前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分および前記ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分は、同一の軽鎖可変領域を含み、好ましくは、同一の軽鎖を含み、ならびに／あるいは同一のヒンジ領域を備える重鎖定常領域を２種類含むＩｇＧ１抗体であり、前記ヒンジ領域のアミノ酸配列は配列番号１０に記載される、二重特異性抗体。
【請求項7】
請求項３～６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体であって、第１の重鎖定常領域および第２の重鎖定常領域を含むＩｇＧ１抗体であり、そのうち前記第１の重鎖定常領域の３５４番目および３６６番目のアミノ酸は、それぞれＣおよびＷであり、前記第２の重鎖定常領域の３４９、３６６、３６８および４０７番目のアミノ酸は、それぞれＣ、Ｓ、ＡおよびＶであり、ならびに／あるいは
前記第１の重鎖定常領域および第２の重鎖定常領域の２３４、２３５および３３１番目のアミノ酸は、それぞれＦ、ＥおよびＳであり、
抗体定常領域のアミノ酸位置は、ＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従って決定される、
二重特異性抗体。
【請求項8】
請求項１、３～７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体であって、前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分は、配列番号１１に記載の重鎖可変領域、および配列番号１２に記載の軽鎖可変領域を含む、二重特異性抗体。
【請求項9】
請求項２、３～７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体であって、
前記ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分は、配列番号１３に記載の重鎖可変領域、および配列番号１２に記載の軽鎖可変領域を含む、
二重特異性抗体。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体であって、前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分および／または前記ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分は、一本鎖抗体（ｓｃｆｖ）またはＦａｂ断片を含み、好ましくは、前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分はＦａｂ断片を含み、前記ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分はＦａｂ断片を含み、または
前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分はＦａｂ断片を含み、前記ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分は一本鎖抗体（ｓｃｆｖ）を含み、または
前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分は一本鎖抗体（ｓｃｆｖ）を含み、前記ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分はＦａｂ断片を含み、または
前記ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分は一本鎖抗体（ｓｃｆｖ）を含み、前記ヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分は一本鎖抗体（ｓｃｆｖ）を含む、
二重特異性抗体。
【請求項11】
請求項３に記載の二重特異性抗体であって、前記抗体は第１のアームおよび第２のアームを備え、そのうち前記第１のアームはヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分を含み、前記第２のアームはヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分を含み、そのうち、前記第１のアームは、配列番号１１に記載の重鎖可変領域のアミノ酸配列、配列番号３１に記載の重鎖定常領域のアミノ酸配列、配列番号１２に記載の軽鎖可変領域のアミノ酸配列、および配列番号３２に記載の軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含み、
前記第２のアームは、配列番号１３に記載の重鎖可変領域のアミノ酸配列、配列番号３０に記載の重鎖定常領域のアミノ酸配列、配列番号１２に記載の軽鎖可変領域のアミノ酸配列、および配列番号３２に記載の軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む、
二重特異性抗体。
【請求項12】
ヒトＣＤ３Ｅに対する抗原結合部分およびヒトＣＤ１２３に対する抗原結合部分を含む二重特異性抗体であって、同一のヒンジ領域を備える重鎖定常領域を２種類含むＩｇＧ１抗体であり、前記ヒンジ領域のアミノ酸配列は配列番号１０に記載される、二重特異性抗体。
【請求項13】
請求項３～１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を含む、医薬組成物。
【請求項14】
請求項３～１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を含み、ＣＤ１２３陽性腫瘍を予防または治療するために用いられる、医薬組成物。
【請求項15】
請求項１４に記載の医薬組成物であって、前記ＣＤ１２３陽性腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）からなる群から選ばれる、医薬組成物。【国際調査報告】