▶ ペルセウス サイエンス グループ エルエルシーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-30
(54)【発明の名称】中枢神経系損傷を診断するためのインビトロの方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/573 20060101AFI20230323BHJP
G01N 33/531 20060101ALI20230323BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20230323BHJP
C07K 16/40 20060101ALI20230323BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20230323BHJP
【ＦＩ】
G01N33/573 A
G01N33/531 A
C07K16/18 ZNA
C07K16/40
C12Q1/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022548504
(86)(22)【出願日】2021-02-05
(85)【翻訳文提出日】2022-10-11
(86)【国際出願番号】 US2021016740
(87)【国際公開番号】W WO2021158865
(87)【国際公開日】2021-08-12
(31)【優先権主張番号】62/970,769
(32)【優先日】2020-02-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522316504
【氏名又は名称】ペルセウス サイエンス グループ エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】コーネル－ベル、アン、エイチ．
【テーマコード（参考）】
4B063
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ79
4B063QR48
4B063QS33
4B063QX02
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA75
4H045DA76
4H045EA50
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）又は脳卒中などの中枢神経系（ＣＮＳ）の損傷を診断するための高感度のインビトロの方法を提供する。この方法は、ＣＮＳ損傷イベントを起こしていると疑われる対象の血液の試料を、バイオマーカーであるプロテインキナーゼＣのガンマアイソフォーム（ＰＫＣｇ又はＰＫＣγ）のタンパク質分解断片を検出可能な少なくとも１種類の抗体と接触させることを含み、この断片は神経損傷の結果生じる興奮毒性環境において形成されるＰＫＣｇのタンパク質分解断片に相当する。本質的に１００％の精度でのＣＮＳ損傷の診断を提供する本発明の診断方法において有用である、新しい抗ＰＫＣｇ抗体も開示される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
中枢神経系（ＣＮＳ）を含む損傷を診断するためのインビトロの方法であって、ａ）ＣＮＳ損傷を受けたと疑われる対象からの血液の試料を、プロテインキナーゼＣのガンマアイソフォーム（ＰＫＣｇ）の固有のエピトープ（unique epitope）であって、ＰＫＣｇの１つ又は複数のタンパク質分解断片に保持されているエピトープに結合する少なくとも１種類の抗体と接触させること、及び
ｂ）前記少なくとも１種類の抗体とＰＫＣｇ又はそのタンパク質分解断片との結合複合体の形成を検出することを含み、
前記試料中に形成された前記結合複合体の存在はＣＮＳ損傷を示す、
前記方法。
【請求項2】
前記試料は、ＰＫＣｇの固有のエピトープであって、ＰＫＣｇの３９５番目～６９７番目のアミノ酸の配列内にあるエピトープとそれぞれが結合複合体を形成する少なくとも２種類の異なる抗体と接触される、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
前記ＣＮＳ損傷は外傷性脳損傷である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記ＣＮＳ損傷は脳卒中である、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記少なくとも１種類の抗体はＰＫＣｇの３９５番目～６９７番目のアミノ酸の配列内にあるエピトープを認識する、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記少なくとも１種類の抗体はＰＫＣｇの４０５番目～４１４番目のアミノ酸の配列内にあるエピトープを認識する、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記少なくとも１種類の抗体はＰＫＣｇの６７３番目～６９７番目のアミノ酸の配列内にあるエピトープを認識する、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記血液の試料は、ＰＫＣｇの少なくとも１つのタンパク質分解断片上に存在するエピトープと結合複合体を形成可能な少なくとも２種類の抗体と接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記少なくとも１つのタンパク質分解断片は、３３ｋＤａ～３６ｋＤａ、４２ｋＤａ～４８ｋＤａ、４９ｋＤａ～５２ｋＤａ、及び５３ｋＤａ～６０ｋＤａを含む群から選択される分子量を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
ヒトＰＫＣｇ又はＰＫＣｇのタンパク質分解断片に結合可能な、抗体又はその抗原結合部分であって、前記抗体の抗原結合部分は、以下の表に挙げられるＣＤＲのセットの群から選択される、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３の６種類のＣＤＲのセットを含む、前記抗体又はその抗原結合部分。【表1】
【請求項11】
以下からなる群から選択されるＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む、抗ＰＫＣｇ抗体又はその抗原結合部分。【表2】
【請求項12】
請求項１～９に記載の中枢神経系損傷の診断のためのインビトロの方法における、請求項１０及び請求項１１に記載の抗ＰＫＣｇ抗体のうちいずれか１つの使用。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、外傷性脳損傷又は脳卒中などの中枢神経系を含む外傷性虚血イベントの発生及び重症度を迅速に診断するための改善されたインビトロの方法に関する。この方法は、中枢神経系に対する損傷後の血液脳関門の破綻の結果として血流中に入るプロテインキナーゼＣのガンマアイソフォーム（ＰＫＣγ）及びＰＫＣγのタンパク質分解断片の存在を検出するためのモノクローナル抗体の使用を含む。
【背景技術】
【0002】
外傷性脳損傷（ＴＢＩ）は、世界の主な死亡原因の一つであり、成人の身体障害の主要な原因である（Langlois et al., J. Head Trauma Rehabil., 21(5): 375-378 (2006)）。米国におけるＴＢＩの発生率は脳卒中に匹敵するが若年者に影響を及ぼすので、医療の負担がより大きくなる。米国では毎年およそ５百万の新たなＴＢＩの症例が生じており、推定年間費用は６０００億ドルである（Yu et al., Brain Res., 1287: 157-163 (2009)); Mammis et al., Surg. Neurol., 71:(5), 527-531 (2009)）。
【0003】
外傷性脳損傷（ＴＢＩ）による障害は、グルタミン酸受容体によって優位に媒介される電気的な活性及び神経伝達物質の活性の両方により、「興奮毒性」ともいわれる神経細胞の過剰興奮性をもたらす（Barr et al., Brain Inj., 26: 58-66 (2012)）。ＴＢＩは虚血性障害でもある。陽電子放射断層撮影を用いて、Veenithらは、ＴＢＩ後の虚血脳容積及び低酸素脳容積が対象患者と比べて大きいことを報告している（Veenith et al., JAMA Neurol., 73(5): 542-550 (2016)）。ＴＢＩにより虚血及び低酸素が非重複領域において生じ、酸化的代謝の広範囲にわたる減少がＴＢＩの大部分の症例で見られる（Vespa, P.M., JAMA Neurol., 73(5): 504-505 (2016)）。
【0004】
「脳卒中」は、脳機能の限局的な喪失を伴う、血管起源の急速に進行する症候群として臨床的に定義される。脳卒中は、脳の一部への血液供給が突然遮断された場合（虚血性脳卒中）、又は脳内の血管が破裂して脳細胞を囲う空間に血液が流出した場合（出血性脳卒中）に起こる。米国では４０秒に１人が脳卒中を起こしている。そのうちの８５％（年間およそ７５０，０００の症例）が虚血性であり、脳に血液を供給する血管内の閉塞の結果である。脳卒中の残りの１５％は、ＣＮＳ血管が断裂し血液が脳内に蓄積した場合に起こる（スタンフォード脳卒中センター）。
【0005】
外傷性脳損傷又は脳卒中の迅速な診断は、患者の回復にとって不可欠である。診断及び医学的介入の遅れは、臨床的悪化及び身体障害の一因となり得る。早期の診断によって、医師が適切な緊急介入をより効果的に選択することが可能になる。正確で確実な診断の評価の遅れは、脳が血流再開に応答が可能な限られた時間を無駄にし、大部分の永久的な損傷が生じた後の出血のリスクを顕著に上昇させる（Marler, J.R., Ann. Emerg. Med., 33: 450-451 (1999)）。虚血性脳卒中についてのＤＥＦＵＳＥ ３臨床試験（ＮＩＨ承認臨床試験）により、患者が「順調」であると最後に知られた後の血管内処置について６～２４時間の時間枠が検証された。血栓除去の時間枠は６～１６時間である（Albers et al., N. Engl. J. Med., 378: 708-718 (2018)）。２つの電気生理学研究により、重大な損傷はスポーツに関連した脳震盪を起こした８日後に影響を及ぼしており、４５日目までに回復したが、運動選手の臨床症状は５～８日間で明らかに回復したことを実証した。この知見は、生理的動揺は明らかな「臨床的回復」のかなり後も持続することを示す（McCrea et al., J. Head Trauma Rehabil., 25: 283-292 (2010); Barr et al., Brain Inj., 26: 58-66 (2012)）。中程度の外傷性頭部損傷により緊急治療室に運ばれた患者には、基本的な神経学的検査が行われ、ＭＲＩ又はＣＴスキャンなどの神経画像検査が行われてもよい。脳損傷の重症度に依存して、利尿剤、抗てんかん薬、及び／又は昏睡誘発剤などの特定の薬物が投与されてもよい。浮腫及び虚血の後の脳組織への損傷を最小限にするために外科手術が必要とされることがある（Herring et al., Med. Sci. Sports Exerc., 38(2): 395-399 (2006)）。
【0006】
脳から血液へのグルタミン酸の放出
脳は、ＴＢＩ後の虚血及び神経の広範囲な脱分極（電気的活性）に対して特に脆弱である。このような状況下で、通常は情報処理に関与しているシグナルが大きく遮断される。グルタミン酸（Ｇｌｕ）は、最初は神経末端から、最終的にはアストロサイトが関与する逆輸送により、大量に放出される（Szatkowski et al., Trends Neurosci., 17(9):359-365 (1994); Rossi et al., Nature, 403: 316-321 (2000); Phillis et al., Brain Res., 868(1): 105-112 (2000)）。アストロサイトは、細胞質の遊離Ｃａ２＋の迅速な上昇を伴ってグルタミン酸に応答するグルタミン酸感受性イオンチャネルを有している（Cornell-Bell et al., Science, 247(4941): 470-473 (1990)）。アストロサイトは、血液脳関門の制御において重要な役割を果たす。
脳は、ＴＢＩ後の虚血及び神経の広範囲な脱分極（電気的活性）に対して特に脆弱である。このような状況下で、通常は情報処理に関与しているシグナルが大きく遮断される。グルタミン酸（Ｇｌｕ）は、最初は神経末端から、最終的にはアストロサイトが関与する逆輸送により、大量に放出される（Szatkowski et al., Trends Neurosci., 17(9):359-365 (1994); Rossi et al., Nature, 403: 316-321 (2000); Phillis et al., Brain Res., 868(1): 105-112 (2000)）。アストロサイトは、細胞質の遊離Ｃａ２＋の迅速な上昇を伴ってグルタミン酸に応答するグルタミン酸感受性イオンチャネルを有している（Cornell-Bell et al., Science, 247(4941): 470-473 (1990)）。アストロサイトは、血液脳関門の制御において重要な役割を果たす。
【0007】
脳間質空間、又はいわゆる「細胞外空間」は、神経細胞と毛細血管の間の狭い空間である。間質空間中のグルタミン酸の直接測定には、脳内への微小透析カニューレの顕微手術による挿入が必要とされる（Chefer et al., Curr. Protoc. Neurosci., 47(1): 7.1.1-7.1.28 (2009); Baker et al., Neurochem., 57(4): 1370-1379 (1991)）。ヒト及び齧歯類における微小透析研究は、ＴＢＩにおいて間質のグルタミン酸が即座に上昇することを実証している（Guerriero et al., Curr. Neurol. Neurosci. Rep., 15:27 (2015)）。グルタミン酸の間質での上昇は、損傷後４日までに消失し、レベルは外傷後の死亡率と直接相関していたことがヒトで記録されている（Chamoun et al., J Neurosurg., 113(3): 564-570 (2010); 上述のGuerriero et al.）。脳における興奮性アミノ酸、すなわち、グルタミン酸及びアスパラギン酸の神経毒作用は文書で十分に裏付けされており、血液中のグルタミン酸含有量と急性虚血の重症度との相関が示されてきた（Castillo et al., Stroke, 27: 1060-1065 (1996); Castillo et al., Lancet, 349: 79-83 (1997)）。脳の損傷、及び進行性脳卒中との関連は、グルタミン酸放出の増加又はグルタミン酸取り込みの低下に起因すると考えられる（Davalos et al., Stroke, 28: 708-710 (1997)）。
【0008】
ＰＫＣｇの活性化
プロテインキナーゼＣガンマ（ＰＫＣγ又はＰＫＣｇ）は、脳損傷の後、持続的に活性化され神経細胞膜に移行される。ＰＫＣｇは、Ｃａ２＋の上昇及び脂質の上昇（ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）曝露）によりＰＫＣｇの活性化及び細胞膜への移行が引き起こされるまで小胞内に含有される、高度に制御された細胞質酵素である（Mogami et al., J. Biol. Chem., 278(11): 9896-9904 (2003)）。ＰＫＣｇの完全な活性化には、Ｃａ２＋、ＤＡＧ、及びホスファチジルセリンが必要とされる（Oancea et al., Cell, 95:307-318 (1998); Nishizuka, Y., Science, 258: 607-614 (1992); Kaibuchi et al, J. Biol. Chem., 258: 6701-6704 (1983); Saido et al., Biomed. Biochim. Acta, 50(4-6): 485-489 (1991)）。これらの条件が満たされると、ＰＫＣｇは間質空間に放出される。グルタミン酸興奮毒性は、ＰＫＣｇの細胞内分布及び定量的放出に直接関与する（Selvatici et al., J. Neurosci. Res., 71: 64 -71 (2002); Domanska-Janik et al., J. Neurochem., 58(4): 1432-1439 (1992); O'Reagan et al., Neurosci. Lett., 185: 191-194 (1995); Lee et al., J. Clin. Invest., 106(6): 723-731 (2000)）。グルタミン酸興奮毒性は、ＰＫＣｇの活性化、神経細胞から間質空間へのＰＫＣｇ放出を誘発し、ＰＫＣｇの末梢循環への移行を可能にする血管脳関門の破綻を引き起こす。これは近年のＰＫＣｇバイオマーカーアッセイの根拠である（Cornell-Bell et al., US Pat. No. 6,268,223）。ＰＫＣｇの放出は損傷の増大と共に増加し（Selvatici et al., Neurochem. Int., 49(8): 729-736 (2006)）、損傷が治まると消失する。これによりＰＫＣｇはＴＢＩ又は脳卒中などのＣＮＳ損傷における脳損傷の程度を測定する理想的なバイオマーカーとなる。
プロテインキナーゼＣガンマ（ＰＫＣγ又はＰＫＣｇ）は、脳損傷の後、持続的に活性化され神経細胞膜に移行される。ＰＫＣｇは、Ｃａ２＋の上昇及び脂質の上昇（ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）曝露）によりＰＫＣｇの活性化及び細胞膜への移行が引き起こされるまで小胞内に含有される、高度に制御された細胞質酵素である（Mogami et al., J. Biol. Chem., 278(11): 9896-9904 (2003)）。ＰＫＣｇの完全な活性化には、Ｃａ２＋、ＤＡＧ、及びホスファチジルセリンが必要とされる（Oancea et al., Cell, 95:307-318 (1998); Nishizuka, Y., Science, 258: 607-614 (1992); Kaibuchi et al, J. Biol. Chem., 258: 6701-6704 (1983); Saido et al., Biomed. Biochim. Acta, 50(4-6): 485-489 (1991)）。これらの条件が満たされると、ＰＫＣｇは間質空間に放出される。グルタミン酸興奮毒性は、ＰＫＣｇの細胞内分布及び定量的放出に直接関与する（Selvatici et al., J. Neurosci. Res., 71: 64 -71 (2002); Domanska-Janik et al., J. Neurochem., 58(4): 1432-1439 (1992); O'Reagan et al., Neurosci. Lett., 185: 191-194 (1995); Lee et al., J. Clin. Invest., 106(6): 723-731 (2000)）。グルタミン酸興奮毒性は、ＰＫＣｇの活性化、神経細胞から間質空間へのＰＫＣｇ放出を誘発し、ＰＫＣｇの末梢循環への移行を可能にする血管脳関門の破綻を引き起こす。これは近年のＰＫＣｇバイオマーカーアッセイの根拠である（Cornell-Bell et al., US Pat. No. 6,268,223）。ＰＫＣｇの放出は損傷の増大と共に増加し（Selvatici et al., Neurochem. Int., 49(8): 729-736 (2006)）、損傷が治まると消失する。これによりＰＫＣｇはＴＢＩ又は脳卒中などのＣＮＳ損傷における脳損傷の程度を測定する理想的なバイオマーカーとなる。
【0009】
ＰＫＣｇの局在
ＰＫＣｇは脳及び脊髄のみで発現し、その局在は神経細胞に限定されている（Saito, N. and Shirai, Y., J. Biochem., 132: 683-687(2002)）。ＰＫＣｇは脳内において固有の神経細胞分布及び細胞内局在を示し、ＰＫＣｇのｍＲＮＡは脳及び脊髄でのみ見られる（Tanaka, C. and Saito, N., Neurochem. Int., 21: 499-512 (1992); 上述のSaito, N. and Shirai, Y.）。ＰＫＣｇは、海馬、大脳皮質、小脳、視床下部、及び網膜を含む多くの脳領域に免疫学的に局在していた（Huang, K.-P., and Huang, F. L., Biochem. Biophys. Res. Commun., 139: 320-326 (1986); 上述のSaito, N. and Shirai）。ＰＫＣｇのＣ１ドメイン及びＣ２ドメインはＤＡＧ及びＣａ２＋にそれぞれ結合する。ＰＫＣｇのＣ１ドメインは２つのシステインリッチリピート（Ｃ１Ａ及びＣ１Ｂ）からなり、これらの両方が高い親和性でＤＡＧに結合する（Ono et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 4868-4871 (1989)）。電子顕微鏡下で、活性化前にＰＫＣｇは、神経核、樹状突起、樹状突起のスパイン、軸索、及びシナプス終末を含む神経細胞の細胞質中に局在している（Kose et al., J. Neurosci., 8: 4262-4268 (1988)）。ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）標識ＰＫＣｇを用いるライブイメージングにより、Ｇタンパク質共役型受容体又はＣａ２＋イオノフォアの刺激時に、このアイソザイムの活性化及び細胞における細胞質と細胞膜との間での迅速な循環が明らかになった（Sakai et al., J. Cell Biol., 139: 1465-1476 (1997)）。ＰＫＣｇの動態的変動は、Ｃａ２＋及びＤＡＧによる活性化に応答して生じる。ＰＫＣｇの移行はこの酵素の基本的な分子機構である。Ｃａ２＋及びＤＡＧによりＰＫＣｇが活性化されると、前述のようにＧタンパク質共役型受容体に対する二次メッセンジャーの応答に続き、ＰＫＣｇは神経細胞の細胞膜を通過して脳間質中に入ることになる（上述のSakai et al.）。ＰＫＣｇの末梢血への移行を可能にする血管脳関門（ＢＢＢ）の破綻が大脳虚血により誘発される（Hawkins, B.T. and Davis, T.P., Pharmacol. Rev., 57: 173-185 (2005); Yang, Y. and Rosenberg, G.A., Stroke, 42: 3323-3328 (2011)）。
ＰＫＣｇは脳及び脊髄のみで発現し、その局在は神経細胞に限定されている（Saito, N. and Shirai, Y., J. Biochem., 132: 683-687(2002)）。ＰＫＣｇは脳内において固有の神経細胞分布及び細胞内局在を示し、ＰＫＣｇのｍＲＮＡは脳及び脊髄でのみ見られる（Tanaka, C. and Saito, N., Neurochem. Int., 21: 499-512 (1992); 上述のSaito, N. and Shirai, Y.）。ＰＫＣｇは、海馬、大脳皮質、小脳、視床下部、及び網膜を含む多くの脳領域に免疫学的に局在していた（Huang, K.-P., and Huang, F. L., Biochem. Biophys. Res. Commun., 139: 320-326 (1986); 上述のSaito, N. and Shirai）。ＰＫＣｇのＣ１ドメイン及びＣ２ドメインはＤＡＧ及びＣａ２＋にそれぞれ結合する。ＰＫＣｇのＣ１ドメインは２つのシステインリッチリピート（Ｃ１Ａ及びＣ１Ｂ）からなり、これらの両方が高い親和性でＤＡＧに結合する（Ono et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 4868-4871 (1989)）。電子顕微鏡下で、活性化前にＰＫＣｇは、神経核、樹状突起、樹状突起のスパイン、軸索、及びシナプス終末を含む神経細胞の細胞質中に局在している（Kose et al., J. Neurosci., 8: 4262-4268 (1988)）。ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）標識ＰＫＣｇを用いるライブイメージングにより、Ｇタンパク質共役型受容体又はＣａ２＋イオノフォアの刺激時に、このアイソザイムの活性化及び細胞における細胞質と細胞膜との間での迅速な循環が明らかになった（Sakai et al., J. Cell Biol., 139: 1465-1476 (1997)）。ＰＫＣｇの動態的変動は、Ｃａ２＋及びＤＡＧによる活性化に応答して生じる。ＰＫＣｇの移行はこの酵素の基本的な分子機構である。Ｃａ２＋及びＤＡＧによりＰＫＣｇが活性化されると、前述のようにＧタンパク質共役型受容体に対する二次メッセンジャーの応答に続き、ＰＫＣｇは神経細胞の細胞膜を通過して脳間質中に入ることになる（上述のSakai et al.）。ＰＫＣｇの末梢血への移行を可能にする血管脳関門（ＢＢＢ）の破綻が大脳虚血により誘発される（Hawkins, B.T. and Davis, T.P., Pharmacol. Rev., 57: 173-185 (2005); Yang, Y. and Rosenberg, G.A., Stroke, 42: 3323-3328 (2011)）。
【0010】
虚血後の血管脳関門の破綻
血管脳関門（ＢＢＢ）は脳微小血管の内皮細胞により形成され、末梢循環と中枢神経系の間のダイナミックインターフェースを提供する。ＢＢＢは、中枢神経系（ＣＮＳ）に出入りする分子の輸送を制御し、適切な神経細胞の機能に必要とされる神経細胞環境の厳しく管理された化学的組成を維持する（Sweeney et al., Physiol. Rev., 99(1): 21-78 (2019)）。虚血性脳卒中条件下で、ＢＢＢのタイトジャンクション完全性の低下は、両方向の傍細胞透過性の増加を引き起こし、脳の血管原性脳浮腫、出血性変化、及び死亡率の上昇の直接的な原因となる（Sandoval, K.E. and Witt, K.A., Neurobiol. Dis., 32(2): 200-219 (2008)）。多くの種類の実験的急性脳損傷の後にＢＢＢ透過性の亢進が起こったことが報告されている（Yang, Y. and Rosenberg, G.A., Stroke, 42: 3323-3328 (2011)）。脳震盪の流体衝撃モデル及びびまん性衝撃加速モデル、並びに低酸素虚血などの他の種類の脳傷害、及び成体ラットにおける放射線脳炎が、ＢＢＢ透過性の増大に付随して起こる。ＢＢＢ完全性の喪失の病因は、直接的な機械的破壊、又は炎症若しくは興奮毒性などの特定の機構に起因するものであると考えられてきた（Adelson et al., Acta Neurochir. Suppl., 71: 104-106 (1998)）。ＶＥＧＦからのＢＢＢ透過性の増大は、輸送される物質の大きさにより限定されており、大きさが小さいほどＢＢＢの通過が向上されることを示唆している（Ay et al., Brain Res., 1234: 198-205 (2008); Mikitsh, J.L. and Chacko, A.M., Perspect. Medicin. Chem., 6: 11-24 (2014)）。
血管脳関門（ＢＢＢ）は脳微小血管の内皮細胞により形成され、末梢循環と中枢神経系の間のダイナミックインターフェースを提供する。ＢＢＢは、中枢神経系（ＣＮＳ）に出入りする分子の輸送を制御し、適切な神経細胞の機能に必要とされる神経細胞環境の厳しく管理された化学的組成を維持する（Sweeney et al., Physiol. Rev., 99(1): 21-78 (2019)）。虚血性脳卒中条件下で、ＢＢＢのタイトジャンクション完全性の低下は、両方向の傍細胞透過性の増加を引き起こし、脳の血管原性脳浮腫、出血性変化、及び死亡率の上昇の直接的な原因となる（Sandoval, K.E. and Witt, K.A., Neurobiol. Dis., 32(2): 200-219 (2008)）。多くの種類の実験的急性脳損傷の後にＢＢＢ透過性の亢進が起こったことが報告されている（Yang, Y. and Rosenberg, G.A., Stroke, 42: 3323-3328 (2011)）。脳震盪の流体衝撃モデル及びびまん性衝撃加速モデル、並びに低酸素虚血などの他の種類の脳傷害、及び成体ラットにおける放射線脳炎が、ＢＢＢ透過性の増大に付随して起こる。ＢＢＢ完全性の喪失の病因は、直接的な機械的破壊、又は炎症若しくは興奮毒性などの特定の機構に起因するものであると考えられてきた（Adelson et al., Acta Neurochir. Suppl., 71: 104-106 (1998)）。ＶＥＧＦからのＢＢＢ透過性の増大は、輸送される物質の大きさにより限定されており、大きさが小さいほどＢＢＢの通過が向上されることを示唆している（Ay et al., Brain Res., 1234: 198-205 (2008); Mikitsh, J.L. and Chacko, A.M., Perspect. Medicin. Chem., 6: 11-24 (2014)）。
【0011】
ＰＫＣｇ断片
ＣＮＳ損傷を診断するためのバイオマーカーの標的としてＰＫＣｇを用いる以前の方法に関する技術的問題は、末梢血中の完全長ＰＫＣｇに対するシグナルは患者によって異なるので、ＰＫＣｇ検出に着目したアッセイが偽陰性結果をもたらすことがあることである。これは、ＰＫＣｇの血液脳関門の横断をもたらす一連の事象において完全長ＰＫＣｇタンパク質がタンパク質分解断片に分解され、したがって、インタクトなタンパク質を標的とする検出方法は減少している標的を検索するものであるという事実に部分的に起因する。
ＣＮＳ損傷を診断するためのバイオマーカーの標的としてＰＫＣｇを用いる以前の方法に関する技術的問題は、末梢血中の完全長ＰＫＣｇに対するシグナルは患者によって異なるので、ＰＫＣｇ検出に着目したアッセイが偽陰性結果をもたらすことがあることである。これは、ＰＫＣｇの血液脳関門の横断をもたらす一連の事象において完全長ＰＫＣｇタンパク質がタンパク質分解断片に分解され、したがって、インタクトなタンパク質を標的とする検出方法は減少している標的を検索するものであるという事実に部分的に起因する。
【0012】
脳虚血の間質部位は、損傷を受けた神経細胞からの高Ｃａ２＋、リン脂質、及び高レベルのＤＡＧ、並びに有毒なレベルの神経伝達物質及びＰＫＣｇを標的とするプロテアーゼを伴う興奮毒性環境である。ＰＫＣｇのタンパク質分解断片は、１９７０年代以来、同定及び特徴解析がなされてきた（Inoue et al., J. Biol. Chem., 252: 7610-7616 (1977)）。虚血性の興奮毒性環境は、末梢循環への放出に先立つＰＫＣｇ断片の形成の一因となるタンパク質分解酵素が豊富に存在する。発明者らは、末梢血試料中に出現するＰＫＣｇタンパク質分解断片が、さらなるＣＮＳ損傷バイオマーカーとなり得ることを特定した。
【0013】
ヒトＰＫＣｇは以下のアミノ酸配列を有する。
【化1】
【0014】
ＰＫＣｇタンパク質分解の全ての部位は、Ｃ３／Ｃ４制御ドメインのすぐＮ末端側に位置するＶ３可変領域中に位置している。Kishimoto et al., J. Biol. Chem., 264(7): 4088-4092 (1989)を参照のこと。以下に再現するＰＫＣｇポリペプチド配列において、可変領域（Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３）は一重下線で示し、制御ドメイン（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３／Ｃ４）は二重下線で示す。
【化2】
【0015】
Ｖ３ドメインには、Ｓｅｒ３２１とＳｅｒ３２２の間及びＰｈｅ３３８とＰｈｅ３３９の間にカルパイン切断部位が存在する。
【0016】
カルパインはロイシン残基又はバリン残基（Ｐ２）で物質を優先的に切断するが、全ての物質がこれに従うわけではない。親水性アミノ酸（Ｐｒｏ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、及びＴｈｒ）を含む第二の認識部位もまた関与している。カルパインは細胞タンパク質の通常の分解を引き起こさないが、むしろそれらの物質の限定的な分解を誘発し、多くの例では実際に酵素ＰＫＣｇを含む多くの細胞系を活性化する（Zhivotovsky et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 230(3): 481-488 (1997)）。
【0017】
ＰＫＣｇの断片は、ＰＫＣｇ分子の結合ドメインを同定した初期の生化学研究から同定された分子量により名付けられてきた。文献で最初に同定されたＰＫＣｇ断片は、ＰＫＣｇ触媒ドメイン（Ｖ３）からの５０ｋＤａの断片である（Inoue et al., J. Biol. Chem., 252: 7610-7616 (1977)）。後の研究（上述のKishimoto et al. (1989)）は、４９ｋＤａ及び４７ｋＤａの２つの触媒断片を同定し、カルパイン消化の後に３６ｋＤａの制御ドメインが同定された。これらのアイソザイムからの４５～５０ｋＤａの断片はキナーゼの触媒ドメインを含み、３３～３８ｋＤａの断片はＰＳ／ホルボールエステル結合ドメインを含んでいた（上述のHuang, K.P. and Huang, F.L. (1986)）。ＰＫＣｇについて、５０ｋＤａ、４５ｋＤａ、３８ｋＤａ、３６ｋＤａ、３５ｋＤａ、及び３３ｋＤａの断片が再確認された（Huang, K.P. and Huang, F. L., J. Biol. Chem., 261: 14781-14787 (1986)）。列挙されたこれらのＰＫＣｇ断片は、定量可能であり、臨床血液試料中で安定なタンパク質分解の持続性産物であることが現在は実証されている。本発明は、ＣＮＳ損傷の定量的診断アッセイにおけるこれらの断片の使用手段を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0018】
現在のところ、ＣＮＳ損傷の短期間及び長期間の影響を最小限にするための迅速で効果的な医学介入を可能にする、外傷性脳損傷又は脳卒中の発生及び重症度を診断するための迅速で簡便な信頼性の高い方法が必要とされている。本発明は、外傷性脳損傷又は脳卒中などの中枢神経系損傷を受けていると疑われる対象から採血された静脈血試料中のＰＫＣｇ及びＰＫＣｇタンパク質分解断片の存在を検出することによる、ＣＮＳ神経細胞に対する損傷を診断するための新しいインビトロの方法を提供する。中枢神経系を含む虚血イベント後の静脈血中のＰＫＣｇ及びＰＫＣｇ断片のスクリーニングは、（１）損傷によって生じるグルタミン酸受容体の活性化により、このシグナル伝達物質は厳重に制御されている、（２）このバイオマーカーは神経及び脊髄の神経細胞中にのみ認められる、（３）ＰＫＣｇは細胞外空間中への基本的な漏出を伴わずに厳重に制御されている、（４）グルタミン酸の興奮毒性によって生じる血管脳関門の破綻は、ＰＫＣｇ及びＰＫＣｇ断片のＢＢＢの通過を可能にし、末梢血試料中の検出が可能になるので、特に有利である。４９～５２ｋＤａの断片などのタンパク質分解断片の分析は、この断片は正常ヒト血漿中にほとんど見られずシグナルが低いので、この断片がＴＢＩの超高感度な指標として使用され得ることを示す。ＰＫＣｇの断片を用いるＣＮＳ損傷の診断におけるこの上昇と共に、本明細書に記載される抗体である１Ｈ１（ＰＫＣ１１）、５Ｈ１（ＰＫＣ１３）、及び７Ｈ１（ＰＫＣ１４）の多重化された組み合わせは、同様に損傷の診断を改善し得ることが判明した。
【課題を解決するための手段】
【0019】
本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）損傷の迅速で正確な診断のための新しいインビトロの方法に関する。この方法は中枢神経系を含む損傷を受けたと疑われる対象の末梢血の試料を得ること、及びＰＫＣｇ及びＰＫＣｇ断片の存在について前記試料を分析することを含む。ＰＫＣｇ及びＰＫＣｇタンパク質分解断片は健康な個人の血流中には通常存在しないが、中枢神経系を含む外傷イベント又は虚血イベントの後に血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して血流中に移行する。この方法は、末梢血中に存在するＰＫＣｇ及びＰＫＣｇ断片のレベルを分析することにより対象における損傷の重症度を決定することも可能である。
【0020】
好ましい実施形態では、本発明は、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を受けたと疑われる対象におけるＴＢＩの診断のための新しい方法に関する。別の実施形態では、本発明は脳卒中を受けたと疑われる対象における脳卒中の新案のための新しい方法に関する。好ましい実施形態では、この方法はインビトロのアッセイを介して行われ、ここで、末梢血試料中のバイオマーカーは、バイオマーカー上に存在する少なくとも１つのエピトープに対する１種類又は複数種類のモノクローナル抗体と抗体がバイオマーカーと結合複合体を形成し得る条件下で接触され、前記複合体は当技術分野で既知の方法で検出され得る。本明細書に詳述される発見によると、診断の精度及び診断され得る速度は、ＰＫＣガンマアイソフォームの特定の固有のエピトープを含むＰＫＣｇの特定のタンパク質分解断片に結合可能な抗ＰＫＣｇ抗体の少なくとも１種を利用することにより、驚くほど大きく改善される。
【0021】
本発明の方法によれば、末梢血（例えば静脈血）の試料は、ＴＢＩ又は脳卒中などのＣＮＳ損傷を受けたと疑われる対象から得られ、この血液試料は、中枢神経系における虚血イベントのバイオマーカー指標、特に試料中の天然のタンパク質キナーゼＣのガンマアイソフォーム（以下、ＰＫＣγ又はＰＫＣｇ）及びＰＫＣｇの１つ又は複数の固有のタンパク質分解断片（分解産物）の存在について分析される。健康な個人の末梢血中では通常は認められないこれらのＰＫＣｇバイオマーカーは、中枢神経系の損傷の後、血管脳関門（ＢＢＢ）を通過して血流中に移行することが可能である。血流中のＰＫＣｇ及び／又はＰＫＣｇタンパク質分解断片の存在は、対象がＣＮＳ損傷を受けたことの指標である。本明細書に開示されるデータは、ＴＢＩ及び脳卒中損傷の発生の診断に要求される方法の精度の上昇を示す。さらに、ＴＢＩ又は脳卒中の後に末梢血中に存在するＰＫＣｇバイオマーカーの絶対レベル（量）は損傷の重症度の指標を与えるものであり、ＰＫＣｇ及び／又はＰＫＣｇタンパク質分解断片のレベルが高い場合は外傷イベントがより重症であることを示す。「レベルが高い」は、例えば、正常な対象（つまり、ＣＮＳ損傷を受けていない対象）の末梢血試料中で認められるバックグラウンドレベルとの比較であることを意味する。さらに、これらのバイオマーカーはＴＢＩ又は脳卒中のほぼ直後に血流中に出現するので、本願方法は、外傷イベントの直後又は数分以内の迅速で正確な診断を提供するために、野外又は緊急治療室において救急隊員により実行されてもよい。
【0022】
好ましい実施形態では、ＴＢＩを受けた又は脳卒中を起こした個人を同定する方法の精度及び信頼度は９０％以上またはそれより大きく上昇し（すなわち、１０人中９人以上の患者の正確な診断）、本明細書に記載される抗ＰＫＣｇモノクローナル抗体のうちの少なくとも２種類に対する検出レベルを組み合わせる（多重化する）ことで、１００％に近いレベルにさえ上昇する。プローブする試料からの検出シグナルを本明細書に記載される２種類以上の抗体と組み合わせることにより、診断の信頼度が基本的に試料の１００％（完全な精度）まで改善された。
【0023】
さらなる試みにおいて、ＴＢＩ又は脳卒中の診断の精度及び信頼度を改善するため、発明者らは、ＴＢＩ又は脳卒中の患者からの血液試料のプローブ結果と本明細書に記載される抗ＰＫＣｇモノクローナル抗体との組み合わせにより、診断の精度及び信頼度が改善されたＰＫＣｇ／ＰＫＣｇタンパク質分解断片の「プロファイル」またはパターンが提供されることを発見した。抗ＰＫＣｇ抗体がＴＢＩ又は脳卒中の血漿試料中で接触された場合に感受性が高く、特異性が高く、擬陽性結果が少ない、ＰＫＣｇ断片を認識する固有の抗体を同定した。
【0024】
さらに、本明細書に記載される新しいインビトロの方法は、血液試料中の完全長ＰＫＣｇ（６３～７３ｋＤａ）及び本明細書に記載される特定のＰＫＣｇタンパク質分解断片のレベル（濃度）の定量化を可能にし、これらのＰＫＣｇバイオマーカーのレベルが高いことは中枢神経系の損傷がより重度であることの指標であるので、それによりＣＮＳ損傷の重症度の信頼できる指標が提供される。侵襲の少ないこの診断法は、救急車又は緊急治療室の人員により容易に行うことができ、静脈血試料及び本明細書に記載されるアッセイキットを用いて行うことができ、前記キットは迅速で信頼できる診断のために必要な構成要素を全て含むことになる。
【0025】
別の実施形態では、本発明はまた、ヒトＰＫＣｇに結合可能な新しい抗体及びその抗原結合断片を提供し、前記抗体の可変領域は、以下の表に定義されるＣＤＲのセットの群から選択される、６種類の相補性決定領域（ＣＤＲ）（すなわち、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３）のセットを含む。
【表1】
【0026】
他の実施形態では、本発明の抗ＰＫＣｇ抗体は、ＶＨ（重鎖可変領域）ドメイン及びＶＬ（軽鎖可変領域）ドメインを含み、２つの可変領域は以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【表2】
【0027】
定義
本明細書で使用される場合、「虚血イベント」との用語は、組織への血流の排出の一時的又は永久的な減少に起因する、任意の潜在的に有害な発作、具体的には、本発明に関しては、中枢神経系（ＣＮＳ）の一部への血流、特に頭蓋血流を遮断し、中枢神経系の損傷をもたらす任意のイベント又は生理的な出来事をいう。具体的な虚血イベントとしては、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中、又はＣＮＳへの血流の遮断をもたらす他のイベントが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「虚血イベント」との用語は、組織への血流の排出の一時的又は永久的な減少に起因する、任意の潜在的に有害な発作、具体的には、本発明に関しては、中枢神経系（ＣＮＳ）の一部への血流、特に頭蓋血流を遮断し、中枢神経系の損傷をもたらす任意のイベント又は生理的な出来事をいう。具体的な虚血イベントとしては、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中、又はＣＮＳへの血流の遮断をもたらす他のイベントが挙げられる。
【0028】
本明細書で使用される場合、「抗体」との用語は、「免疫グロブリン」と同義であることを意図している。本明細書で使用される場合、「抗体」との用語は天然抗体、及び通常は抗体の「活性断片」といわれる天然抗体の生物学的に活性な誘導体、例えば、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、又はＦｖ断片、並びに単一ドメイン抗体及び単鎖（ｓｃＦｖ）抗体をいう。抗体の活性断片は、完全長（非断片化）抗体により認識される抗原に結合する能力を保持している。
【0029】
指定された要素又はステップの１又は複数「を含んでいる」（又は「含む」）として本明細書に記載される組成物又は方法は、オープンエンドであり、指定された要素又はステップは必須であるが、組成物又は方法の範囲内で他の要素又はステップが含まれていてもよいことを意味する。冗長さを回避するため、指定された要素又はステップの１又は複数「を含んでいる」と記載される任意の組成物又は方法は、指定された同じ要素又はステップ「から本質的になっている」（又は「から本質的になる」）、対応するより限定された組成物又は方法も記載し、この組成物又は方法は指定された必須の要素を含み、組成物又は方法の基本的で新規な特徴に物質的に影響しない追加の要素又はステップを含んでいてもよいことを意味することを理解されたい。指定された要素又はステップの１又は複数「を含んでいる」又は「から本質的になっている」として本明細書に記載される任意の組成物又は方法はまた、任意の他の要素又はステップを除外して、指定された要素又はステップ「からなっている」（又は「からなる」）、対応するより限定されたクローズエンドの組成物又は方法も記載することを理解されたい。本明細書に記載される任意の組成物又はステップにおいて、任意の指定された必須の要素又はステップはそれぞれその要素又はステップの既知の又は開示された等価物に置き換えられてもよい。
【0030】
本明細書で使用される場合、「対象」又は「患者」との用語は、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ネコ、モルモット、又は齧歯類を含む、任意の脊椎動物であり得る。「患者」は、疾患、障害、又は損傷を患っている哺乳類対象をいう。
【0031】
本明細書で使用される場合、「ＰＫＣｇの固有のタンパク質分解断片」との用語は、プロテインキナーゼＣの他の天然のアイソフォーム、例えば、プロテインキナーゼＣアルファアイソフォーム（ＰＫＣａ、ＰＫＣα）又はプロテインキナーゼＣベータアイソフォームＩ又はＩＩ（ＰＫＣｂｉ又はＰＫＣｂｉｉ；ＰＫＣβｉ又はＰＫＣβｉｉ）などでは認められないエピトープを含む、ＰＫＣｇの任意の断片を意味する。例えば、本明細書に記載される抗体は、例えばＰＫＣａ上に、対応するセグメント（連続したアミノ酸残基の範囲）を有しないＰＫＣｇのセグメントを指向する。以下の、ＰＫＣｇとＰＫＣａの配列比較を参照のこと。
【化3】
【0032】
本明細書で使用される場合、「ＰＫＣｇの固有のエピトープ」との用語は、抗原性であり、ＰＫＣａ、ＰＫＣｂｉ、又はＰＫＣｂｉｉなどの他のプロテインキナーゼＣアイソフォームのアミノ酸配列中に完全な同族を有していない、ＰＫＣｇの完全長配列内に認められるポリペプチド配列をいう。本明細書に記載される調査研究から、ＰＫＣｇの固有のエピトープの２つの例が、４０５～４１４番目のアミノ酸（配列番号３５）及び６７３～６９７番目のアミノ酸（配列番号３６）に位置される。候補となる他の固有のエピトープは、ＰＫＣｇの３０６～３１８番目のアミノ酸を含むポリペプチド（配列番号３７）である。プロテインキナーゼＣの他のアイソフォームを用いて、ＰＫＣｇとＰＫＣａの前述のような類似配列アライメント比較を行い、上述で同定されたエピトープがＰＫＣｇの固有のエピトープであることを確認した。そのような固有のエピトープを含む免疫原性コンストラクトを用いてＰＫＣｇの固有のエピトープに対する抗体を産生してもよく、これによりプロテインキナーゼＣの他のアイソフォームに対するＰＫＣｇの特異的な（differential）染色が可能になる。例えば、本発明に係る抗体を誘発するため、ニュージーランドホワイト種のウサギをこれらの固有ペプチド配列のうちの２種類（配列番号３５及び配列番号３６）で免疫化した。以下で論じるように、これらの固有のエピトープに対して産生された抗体は、完全長ＰＫＣｇ及び中枢神経系損傷の診断に適したＰＫＣｇタンパク質分解断片のそれぞれを認識（に結合）する。
【図面の簡単な説明】
【0033】
【図1】正常（対照）とＴＢＩ患者の末梢血試料における抗ＰＫＣｇ抗体の結合を検出するために使用された化学発光キャピラリーＥＬＩＳＡの結果を示す図である。図１は、１Ｈ１／１Ｋ１（ＰＫＣ１１）、５Ｈ１／５Ｋ１（ＰＫＣ１３）、又は７Ｈ１／７Ｋ３（ＰＫＣ１４）のＶＨ/ＶＬ構成成分を有する抗体で染色された正常血漿試料と比較された場合の、ＴＢＩシグナルの大幅な上昇を示す。９５％信頼限界での平均値と標準誤差を比較する両側独立スチューデントｔ検定分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェアを用いて完了した。
【図2A】正常（対照）対象とＴＢＩ血漿試料における、抗ＰＫＣｇ抗体であるＰＫＣ１１で染色された血漿試料におけるＰＫＣｇのレベル（化学発光単位）を示す図である。ＰＫＣｇ／ＰＫＣｇ断片のレベルは、正常対照と比較してＴＢＩ患者の血漿において上昇を示す。
【図2B】正常（対照）対象とＴＢＩ血漿試料における、抗ＰＫＣｇ抗体であるＰＫＣ１３で染色された血漿試料におけるＰＫＣｇのレベル（化学発光単位）を示す図である。ＰＫＣｇ／ＰＫＣｇ断片のレベルは、正常対照と比較してＴＢＩ患者の血漿において上昇を示す。
【図2C】正常（対照）対象とＴＢＩ血漿試料における、抗ＰＫＣｇ抗体であるＰＫＣ１４で染色された血漿試料におけるＰＫＣｇのレベル（化学発光単位）を示す図である。ＰＫＣｇ／ＰＫＣｇ断片のレベルは、正常対照と比較してＴＢＩ患者の血漿において上昇を示す。
【図3】２種類のモノクローナル抗体であるＰＫＣ１１（１Ｈ１／１Ｋ１）及びＰＫＣ１３（５Ｈ１／５Ｋ１）による染色を用いる正常試料とＴＢＩ血漿試料の多重化分析を示す図である。図は、ＰＫＣ１１（黒色のバー）及びＰＫＣ１３（灰色のバー）が多重化された場合の、ＴＢＩ試料のシグナルの上昇を示す。
【図4A】ＰＫＣ１１で染色されたＴＢＩ血漿と正常血漿のＲＯＣ曲線を示す図である。白色のドットは感度及び擬陽性が計算されたポイントを表す。化学発光１１３７；Ｐ＝０．４の擬陽性を伴うＰ＝０．９１の感度。
【図4B】ＰＫＣ１３で染色されたＴＢＩ血漿と正常血漿のＲＯＣ曲線を示す図である。白色のドットは感度及び擬陽性が計算されたポイントを表す。化学発光６６３０；（Ｐ＝０．５８）の擬陽性を伴うＰ＝０．９１の感度。
【図4C】ＰＫＣ１４で染色されたＴＢＩ血漿と正常血漿のＲＯＣ曲線を示す図である。白色のドットは感度及び擬陽性が計算されたポイントを表す。化学発光１３２０；Ｐ＝０．６６の擬陽性を伴うＰ＝０．９０６の感度。
【図5】ＰＫＣ１１（１Ｈ１）、ＰＫＣ１３（５Ｈ１）、及びＰＫＣ１４（７Ｈ１）で染色された正常試料とＴＢＩ試料の化学発光シグナルの統計的比較を示す図である。９５％信頼限界での平均値と標準誤差を比較する両側独立スチューデントｔ検定分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェアを用いて完了した。
【図6】正常ヒト血漿試料Ｈ０１１（上のグラフ）及びＴＢＩ患者試料Ｔ２６５（下のグラフ）からのＰＫＣ１３により認識されたＰＫＣｇ及びＰＫＣｇタンパク質分解断片の分布を示す図である。
【図7A】ＰＫＣ１１で染色されたＴＢＩ血漿試料におけるＰＫＣｇの４９～５２ｋＤａ断片のＲＯＣ曲線分析を示す図である。
【図7B】ＰＫＣ１３で染色されたＴＢＩ血漿試料におけるＰＫＣｇの４９～５２ｋＤａ断片のＲＯＣ曲線分析を示す図である。
【図7C】ＰＫＣ１４で染色されたＴＢＩ血漿試料におけるＰＫＣｇの４９～５２ｋＤａ断片のＲＯＣ曲線分析を示す図である。
【図8】ＰＫＣ１１、ＰＫＣ１３、及びＰＫＣ１４で染色された脳卒中血漿試料と正常血漿試料の多重化分析を示す図である。図は、脳卒中シグナルがＰＫＣ１１、ＰＫＣ１３、又はＰＫＣ１４で染色された正常血漿試料と比較された場合の大幅な上昇を示す。９５％信頼限界での平均値と標準誤差を比較する両側独立スチューデントｔ検定分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェアを用いて完了した。
【図9A】ＰＫＣ１１で染色された脳卒中血漿試料におけるＰＫＣｇのレベル（化学発光単位）を示す図である。
【図9B】ＰＫＣ１３で染色された脳卒中血漿試料におけるＰＫＣｇのレベル（化学発光単位）を示す図である。
【図9C】ＰＫＣ１１とＰＫＣ１３の両方で染色された脳卒中血漿試料と正常血漿試料の多重化分析結果を示す図である。
【図10A】ＰＫＣ１１で染色された脳卒中試料と正常試料における種々のＰＫＣｇタンパク質分解断片のレベルを示す統計分析を説明する図である。９５％信頼限界での平均値と標準誤差を比較する両側独立スチューデントｔ検定分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェアを用いて完了した。
【図10B】ＰＫＣ１３で染色された脳卒中試料と正常試料における種々のＰＫＣｇタンパク質分解断片のレベルを示す統計分析を説明する図である。９５％信頼限界での平均値と標準誤差を比較する両側独立スチューデントｔ検定分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェアを用いて完了した。
【図10C】ＰＫＣ１４で染色された脳卒中試料と正常試料における種々のＰＫＣｇタンパク質分解断片のレベルを示す統計分析を説明する図である。９５％信頼限界での平均値と標準誤差を比較する両側独立スチューデントｔ検定分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェアを用いて完了した。
【図11A】ＰＫＣ１１で染色された脳卒中患者試料における４９～５２ｋＤａのＰＫＣｇ断片のＲＯＣ曲線分析を示す図である。
【図11B】ＰＫＣ１３で染色された脳卒中患者試料における４９～５２ｋＤａのＰＫＣｇ断片のＲＯＣ曲線分析を示す図である。
【図11C】ＰＫＣ１４で染色された脳卒中患者試料における４９～５２ｋＤａのＰＫＣｇ断片のＲＯＣ曲線分析を示す図である。
【図12】ＰＫＣ１３で染色された脳卒中患者試料における４２～４８ｋＤａのＰＫＣｇ断片のＲＯＣ曲線分析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0034】
本発明は、外傷イベント又は虚血イベントにより引き起こされた中枢神経系の損傷を検出するための迅速で正確な方法を記載する。特に、本発明は、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）又は脳卒中の診断のための新しいインビトロの方法に関する。ＴＢＩ又は脳卒中などの中枢神経系における外傷イベントは、細胞損傷に起因する生化学的混乱をもたらす。これらの生化学的混乱としては、脳を含む虚血イベントの指標である血流中でのバイオマーカーの出現が挙げられ、これらのバイオマーカーは、中枢神経系における虚血発作の信頼できる指標として検出及び定量化されてもよい。
【0035】
本発明の方法の診断標的は、プロテインキナーゼＣのガンマアイソフォーム（ＰＫＣγ又はＰＫＣｇ）でああり、これは、正常な状態では中枢神経系に限局しているが、ＴＢＩ又は脳卒中の後など、ＣＮＳ障害後に血管脳関門の外側に出現する。さらに、ＣＮＳ損傷に起因するＣＮＳ間質の興奮毒性環境により、完全長ＰＫＣｇが１又は複数のタンパク質分解断片に分解され、これらの断片もＣＮＳ損傷を受けている個人の末梢血中に出現する。そのような末梢のＰＫＣｇ及びＰＫＣｇのタンパク質分解断片は、血管脳関門が開放されると血液試料中で検出可能であるので、ＰＫＣ断片が優位に検出されてプロテインキナーゼＣの他のアイソフォームと区別可能である場合は、ＴＢＩ及び脳卒中を含むＣＮＳ損傷の潜在的な診断上の指標を提供する。本発明は、そのような高感度の検出方法が可能であることを証明し、ＣＮＳ損傷を受けたと疑われる対象からの末梢血のインビトロでの分析からＣＮＳ損傷を完全で正確に決定するための具体的な材料及び方法を提供する。
【0036】
したがって、末梢血試料中のＰＫＣｇ及びＰＫＣｇタンパク質分解断片の検出は、中枢神経系を含む外傷イベント又は虚血イベントの早期の診断上の指標であるので、早期の検出及び早期の処置が可能になる。また、有利なことに、ＴＢＩを受けた又は脳卒中を起こした個人の静脈血中で検出されるＰＫＣｇ及びタンパク質分解断片の量は、組織損傷の程度に比例しており、したがって、本明細書に記載されるような末梢血試料中のＰＫＣｇ／ＰＫＣｇ断片のレベルを定量化するためのアッセイは、中枢神経系において持続する外傷の程度の指標である。
【0037】
ＰＫＣｇ／ＰＫＣｇタンパク質分解断片は虚血イベントの結果として血流中に移行するので、本発明のインビトロの方法は、ＴＢＩ又は脳卒中の迅速で信頼できる診断を提供する点において、特にＣＮＳ損傷の早期の検出及び処置により永久的な損傷の防止が可能な重要な期間内で、特に有利である。したがって、好ましくは、血液試料は、虚血イベントの直後又は虚血イベント後できるだけ早く、好ましくはＣＮＳ損傷の時間の６～２４時間以内に、より好ましくはＣＮＳ損傷の時間の６～１６時間以内に、外傷性脳損傷を受けた又は脳卒中を起こしたと疑われる対象から採血される。
【0038】
本願方法は、生物学的試料中のタンパク質の存在を検出／定量化するための当該技術分野で公知の任意の技術を用いてもよい。例えば、血液試料中のＰＫＣｇ及び１又は複数ＰＫＣｇタンパク質分解断片の存在を検出可能であるサンドイッチ型のアッセイを用いてもよい。この方法によれば、ＣＮＳ損傷を受けたと疑われる患者からの生物学的試料は、標的ＰＫＣｇタンパク質及び１又は複数のそのタンパク質分解断片を分離及び固定化する検出容器中に投入される。固定化された標的タンパク質／ポリペプチドは、次に、ＰＫＣｇタンパク質上の固有のエピトープに対して産生された第１の抗ＰＫＣｇ（一次）抗体と、ＰＫＣｇ／一次抗体結合複合体の形成が促進される条件下で接触される。試料混合物の残りから任意の未結合のタンパク質／抗体を除去するために、続いて洗浄ステップが行われてもよい。次に、一次抗体に結合可能な、検出可能に標識された（例えば、蛍光タグに結合された）二次抗体が標的／一次抗体複合体と接触され、検出可能な標識（例えば、蛍光シグナル）が検出され、試料中に存在するＰＫＣｇ及び／又はＰＫＣｇタンパク質分解断片の量が計算される。
【0039】
ＴＢＩ又は脳卒中を診断するための本願方法において、試料中のタンパク質の存在を検出するための、当該技術分野の任意の既知のインビトロの方法を用いてもよい。好ましくは、ＰＫＣｇの結合パートナー、すなわち、ＰＫＣｇと会合複合体を形成可能なペプチド、免疫グロブリン、小分子、又は他の部分と試料を接触させることにより、哺乳類対象からの血液試料中でＰＫＣｇが検出される。より好ましくは、試料中のＰＫＣｇは、ＰＫＣｇ／抗ＰＫＣｇ抗体結合複合体を形成するための本明細書に記載されるような抗ＰＫＣｇモノクローナル抗体を用いて検出される。また、ＰＫＣｇ／抗ＰＫＣｇ抗体結合複合体の検出及び定量化は、これらに限定されないが、ガスクロマトグラフィー質量分析、薄層クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー、酵素結合免疫吸着検定法などを含む、当該技術分野において周知である方法により行われてもよい。好ましくは、血液試料は、以下に記載する蛍光アッセイ又は化学発光キャピラリーアッセイ法により分析される。
【0040】
他の実施形態では、本発明は、ＣＮＳ損傷などの持続が疑われる対象の血液試料から外傷性脳損傷又は脳卒中を診断するための、ポイントオブケアアッセイキットに関する。ポイントオブケアアッセイキットは、本発明の方法によるＴＢＩ又は脳卒中の診断のための迅速免疫アッセイに必要とされる全ての材料を含むことになる。これらの材料としては、試薬、容器、患者情報の迅速なダウンロードのためのコンピューターと無線接続可能な携帯型読み取り機、装置、及び／又はこの方法を行うために必要とされる説明書が挙げられる。ポイントオブケアアッセイキットは、ＴＢＩ又は脳卒中などの虚血イベントの確定診断に基づいて患者を迅速にトリアージするための救急医療従事者による使用に特に適している。
【0041】
本発明の診断方法を説明する実施例が、以下に記載される。実施例は、発明を実施するために有用な方法及び試薬を実証するものであり、発明の範囲を限定することなく発明を説明することを意図している。本開示及び当業者の通常のレベルの観点から、実施者は、開示される主題の範囲から逸脱することなく多数の変更、修正、及び代替が適用され得ることを理解するだろう。
【実施例】
【0042】
実施例１．ウサギにおける抗ＰＫＣｇモノクローナル抗体の産生
ニュージーランドホワイト種のウサギにおいてＰＫＣｇに対するモノクローナル抗体を産生した。１匹のニュージーランドホワイト種のウサギを、ＰＫＣｇの３９５～６９７番目のアミノ酸を含む３０３アミノ酸のポリペプチドで免疫化した。
ニュージーランドホワイト種のウサギにおいてＰＫＣｇに対するモノクローナル抗体を産生した。１匹のニュージーランドホワイト種のウサギを、ＰＫＣｇの３９５～６９７番目のアミノ酸を含む３０３アミノ酸のポリペプチドで免疫化した。
【0043】
【化4】
【0044】
２番目のニュージーランドホワイト種のウサギを、アミノ酸配列：ＬＧＧＲＧＰＧＧＲＰ（配列番号３５）を含む４０５～４１４番目のアミノ酸（ペプチド＃１）とアミノ酸配列：ＦＴＹＶＮＰＤＦＶＨＰＤＡＲＳＰＴＳＰＶＰＶＰＶＭ（配列番号３６）を含む６７３～６９７番目のアミノ酸（ペプチド＃２）とを含むＰＫＣｇのＣ３／Ｃ４触媒ドメイン由来の固有の配列を有する２本の短いぺプチドで免疫化した。ペプチド＃１及びペプチド＃２は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）キャリアタンパク質に複数のペプチドを連結するための反応部位として使用されるＮ末端のシステイン残基を用いて合成された。
【0045】
両ウサギの免疫化は、以下のような標準的な７８日間のプロトコール（ＩｍｍｕｎｏＰｒｅｃｉｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社、カナダ、バンクーバー ビクトリア）にしたがった。すなわち、０日目：対照血清の採取／免疫前出血、１日目：完全フロイントアジュバント中の０．２５ｍｇの抗原で免疫化するための一次接種、１４日目：不完全フロイントアジュバント中の０．１ｍｇの抗原での追加免疫、２８日目：血清採取（ウサギ１匹あたり２５ｍｌ）、４２日目：不完全フロイントアジュバント中の０．１０ｍｇの抗原での２回目の追加免疫、５６日目：２回目の血清採取（ウサギ１匹あたり２５ｍｌ）及び不完全フロイントアジュバント中の０．１０ｍｇも抗原での３回目の追加免疫、７２日目：ウサギ１匹あたり５０ｍｌの血清採取、７８日目：ウサギにおける抗体濃度を検証するためのＥＬＩＳＡ力価測定。
【0046】
接種に先立って、一次免疫のための完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中に各ペプチド（抗原）を１：１で混合した。（上述の７８日目のプロトコールに記載される）その後の追加免疫接種は、不完全フロイントアジュバント（ＩＣＦＡ）中の１：１の抗原混合物で行われた。ペプチドとアジュバントの混合物を４つの等分量に分け、各ウサギの前肢及び後肢の４箇所に皮下注射した。
【0047】
各ウサギについて２８日目、５６日目、及び７２日目に試験出血を行い、間接ＥＬＩＳＡにより血清を試験した。両方のウサギの力価はウサギモノクローナル抗体試験手順に適していることが実証された。両方のウサギは、間接ＥＬＩＳＡにおいて類似した力価を示した。間接ＥＬＩＳＡは、より良好な検出のためにシグナルを増幅するため、両方の種類の抗体を用いる。間接ＥＬＩＳＡ法は、以下のように行われた。９６穴プレートを抗原と共にインキュベートし、非特異的結合を阻害するために洗浄した。一次抗体を添加して洗浄した。酵素結合二次抗体を添加して洗浄した。間接抗体は比色分析評価項目のために酵素結合されており、これによりプレートに結合された抗体の分光計を用いた定量化が可能になる。
【0048】
上述の血清採取のそれぞれにつき、各ウサギからおよそ３０ｍｌのヘパリン処理済全血を採血し、Ｂ細胞の培養のためにプールした。各ウサギの全血から末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離し、上清を４０×９６穴プレート中で培養し、９日目にＰＫＣｇに対する間接ＥＬＩＳＡにより選別した。抗原陽性細胞をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＲＮＡ溶解緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）中で保存し、－８０℃で保管した。
【0049】
個々のＲＮＡ試料からｃＤＮＡを合成し、２ラウンドのＰＣＲを行って、クローニングのための抗体可変領域ｃＤＮＡを調製した。ウサギＩｇＧ重鎖ｃＤＮＡ及びウサギＩｇＧκ軽鎖ｃＤＮＡを哺乳類発現ベクター中にクローニングした。発現コンストラクトをＨＥＫ２９３細胞中に同時遺伝子導入し、細胞培養上清をサンドイッチＥＬＩＳＡで検定した。Ｍｕｌｔｉ－Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｒｉｎｔ ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ、ＭＡＰＩＡ（Lyashchenko et al., J. Immunol. Methods, 242(1-2): 91-100 (2000)）を用いて、遺伝子導入された細胞培養上清をさらに試験した。
【0050】
上位２８の陽性クローンを第ＩＩＩ相クローニングに進めた。ぞれぞれ１．５ｍｌの遺伝子導入上清中で、２２種類のクローンをさらに試験した。細胞培養上清がニトロセルロース膜上に固定化された後、標準的な発色性の免疫現像（immunodevelopment）を用いる抗体検出が行われる、Ｃｈｅｍｂｉｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｕｌｔｉ－Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｒｉｎｔ ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ（ＭＡＰＩＡ）法を用いる５０ｍｌスケールの発現／精製のために５種類のクローンを選択した（表１参照）。
【0051】
【表3】
表１中の５クローンのＤＮＡ配列を決定した。
【0052】
ウサギＩｇＧ抗体重鎖及びＩｇＧ抗体軽鎖のＤＮＡ配列分析
ウサギＩｇＧ重鎖を単離及び配列決定したところおよそ１２００ｂｐであった。ウサギのカッパー軽鎖を単離及び配列決定したところおよそ７００ｂｐであった。表１の各クローンからの重鎖及び軽鎖（１Ｈ１／１Ｋ１、４Ｈ１／４Ｋ１、７Ｈ１／７Ｋ３、２０Ｈ１／２０Ｋ３、及び５Ｈ１／５Ｋ１）のＤＮＡ配列は全て、可変領域内において異なる配列を有することが特定された。単離されたＤＮＡによりコードされる５種類のクローンの可変領域アミノ酸配列を以下の表２に示す。各クローンについての３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３）及び３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３）を表２において下線で示した。
ウサギＩｇＧ重鎖を単離及び配列決定したところおよそ１２００ｂｐであった。ウサギのカッパー軽鎖を単離及び配列決定したところおよそ７００ｂｐであった。表１の各クローンからの重鎖及び軽鎖（１Ｈ１／１Ｋ１、４Ｈ１／４Ｋ１、７Ｈ１／７Ｋ３、２０Ｈ１／２０Ｋ３、及び５Ｈ１／５Ｋ１）のＤＮＡ配列は全て、可変領域内において異なる配列を有することが特定された。単離されたＤＮＡによりコードされる５種類のクローンの可変領域アミノ酸配列を以下の表２に示す。各クローンについての３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３）及び３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３）を表２において下線で示した。
【0053】
【表4】
【0054】
配列データは、回収された全ての抗体クローンが異なる可変領域配列を有していることを示しており、このことは、回収された全てのウサギモノクローナル抗体がＰＫＣｇタンパク質上の異なるエピトープに結合することを示唆している。
【0055】
５種類のモノクローナル抗体のクローニング、発現、及び精製
各クローンに対するウサギＩｇＧ重鎖ＤＮＡ及び各クローンに対するウサギカッパー軽鎖ＤＮＡを別々にＣＭＶ発現ベクター中にクローニングした。リンパ球をポリエチレングリコールの存在下でウサギ骨髄細胞（２４０Ｅ－Ｗ）と融合させた。結果として生じるハイブリドーマクローンを中間対数期に達するまで組織培養培地中で増殖させた（ＩｍｍｕｎｏＰｒｅｃｉｓｅ社の独自方法）。ハイブリドーマをＩｇＧ、ＩｇＭ、及びＩｇＡにアイソタイプ分類し、ＩｇＧアイソタイプを発現したクローンを選択した。Ｃｈｅｍｂｉｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ社により開発されたＭｕｌｔｉ－Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｒｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＭＡＰＩＡ）（Lyashchenko et al., J. Immunol. Methods, 242(1-2): 91-100 (2000)）を用いて、クローンをＰｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社の組換えＲＫＣＧ（カタログａｇ５９１０）でプローブした。クローニングされた重鎖及び軽鎖から作製した抗ＰＫＣｇモノクローナル抗体を結合活性について試験し、ＰＫＣ１１（１Ｈ１／１Ｋ１）、ＰＫＣ１３（５Ｈ１／５Ｋ１）、及びＰＫＣ１４（７Ｈ１／７Ｋ３）とそれぞれ呼ばれる、３種類の高親和性抗ＰＫＣｇ ｍＡｂを追加の試験のために選択した。
各クローンに対するウサギＩｇＧ重鎖ＤＮＡ及び各クローンに対するウサギカッパー軽鎖ＤＮＡを別々にＣＭＶ発現ベクター中にクローニングした。リンパ球をポリエチレングリコールの存在下でウサギ骨髄細胞（２４０Ｅ－Ｗ）と融合させた。結果として生じるハイブリドーマクローンを中間対数期に達するまで組織培養培地中で増殖させた（ＩｍｍｕｎｏＰｒｅｃｉｓｅ社の独自方法）。ハイブリドーマをＩｇＧ、ＩｇＭ、及びＩｇＡにアイソタイプ分類し、ＩｇＧアイソタイプを発現したクローンを選択した。Ｃｈｅｍｂｉｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ社により開発されたＭｕｌｔｉ－Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｒｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＭＡＰＩＡ）（Lyashchenko et al., J. Immunol. Methods, 242(1-2): 91-100 (2000)）を用いて、クローンをＰｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社の組換えＲＫＣＧ（カタログａｇ５９１０）でプローブした。クローニングされた重鎖及び軽鎖から作製した抗ＰＫＣｇモノクローナル抗体を結合活性について試験し、ＰＫＣ１１（１Ｈ１／１Ｋ１）、ＰＫＣ１３（５Ｈ１／５Ｋ１）、及びＰＫＣ１４（７Ｈ１／７Ｋ３）とそれぞれ呼ばれる、３種類の高親和性抗ＰＫＣｇ ｍＡｂを追加の試験のために選択した。
【0056】
実施例２．ヒト血漿試料からのＴＢＩの診断におけるＰＫＣｇタンパク質分解断片への抗ＰＫＣｇモノクローナル抗体結合の分析
上述のＰＫＣ１１、ＰＫＣ１３、及びＰＫＣ１４の３種類の選択されたウサギモノクローナル抗体を用いて、ＴＢＩ又は脳卒中の患者から得られた血液の試料中のＰＫＣｇ及びＰＫＣｇタンパク質分解断片の存在を検出した。以下の結果は、３種類のウサギモノクローナル抗体の全てが、正常ヒト血漿（対照）からの臨床試料とＴＢＩ又は脳卒中の患者からの血漿からの臨床試料について固有の染色パターンを示すことを実証している。各抗体についての異なる断片の染色プロファイル、及び正常臨床血漿試料とＴＢＩ試料についてみられる効果を定量化するため、モノクローナル抗体で染色（複合体化）された各試料について、複合体特異的化学発光シグナルをグラフ化した。キャピラリー電気泳動化学発光免疫測定法（Ｒａｙｂｉｏｔｅｃｈ社、ジョージア州、ノークロス）を用いて、３３個のＴＢＩ血漿試料と１２個の正常ヒト対照血漿試料のコホートについてシグナルレベルを生成した。
上述のＰＫＣ１１、ＰＫＣ１３、及びＰＫＣ１４の３種類の選択されたウサギモノクローナル抗体を用いて、ＴＢＩ又は脳卒中の患者から得られた血液の試料中のＰＫＣｇ及びＰＫＣｇタンパク質分解断片の存在を検出した。以下の結果は、３種類のウサギモノクローナル抗体の全てが、正常ヒト血漿（対照）からの臨床試料とＴＢＩ又は脳卒中の患者からの血漿からの臨床試料について固有の染色パターンを示すことを実証している。各抗体についての異なる断片の染色プロファイル、及び正常臨床血漿試料とＴＢＩ試料についてみられる効果を定量化するため、モノクローナル抗体で染色（複合体化）された各試料について、複合体特異的化学発光シグナルをグラフ化した。キャピラリー電気泳動化学発光免疫測定法（Ｒａｙｂｉｏｔｅｃｈ社、ジョージア州、ノークロス）を用いて、３３個のＴＢＩ血漿試料と１２個の正常ヒト対照血漿試料のコホートについてシグナルレベルを生成した。
【0057】
受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線による抗体／ＰＫＣｇ結合データの分析
前記３種類のモノクローナル抗体についてのＰＫＣｇ／ＰＫＣｇタンパク質分解断片結合プロファイルをＴＢＩ患者及び脳卒中患者の血漿と正常対象（対照）からの血漿とで比較する分析について、上述の臨床コホートにおける感度と擬陽性（１－特異性）試料との重複の確率をＲＯＣ曲線により比較した。この目的のための感度は、陽性の試験結果が陽性の疾患（ＴＢＩ又は脳卒中）と重複した確率（Ｐ）［Ｐ（Ｔｅｓｔ＋｜Ｄｉｓｅａｓｅ＋）として記載された。擬陽性についての類似の試験として、疾患が存在しない場合に陽性の試験が存在する条件である［Ｐ（Ｔｅｓｔ＋｜Ｄｉｓｅａｓｅ－）を用いた。Ｅｘｃｅｌのピボットテーブルアプリケーションを用いて、健康試料と疾患試料の数を計数した。（＝ＳＵＭ 個々の疾患試料）／全疾患試料の合計）を用いて感度を計算した。（＝ＳＵＭ 各個人の健康試料／全健康試料の合計）を用いて擬陽性を計算した。特異性は（１－擬陽性）として定義される。この統計的方法は、感度を最大にし、擬陽性の確率を同定する。健康試料と疾患試料の間の各ＲＯＣ曲線のカットオフ値を計算した後、それらの確率で表される化学発光シグナル総量と関連付けた。ＰＫＣ１１抗体、ＰＫＣ１３抗体、及びＰＫＣ１４抗体で染色された各試料コホートについてのカットオフ値は、以下の各グラフにおいて線で示される。
前記３種類のモノクローナル抗体についてのＰＫＣｇ／ＰＫＣｇタンパク質分解断片結合プロファイルをＴＢＩ患者及び脳卒中患者の血漿と正常対象（対照）からの血漿とで比較する分析について、上述の臨床コホートにおける感度と擬陽性（１－特異性）試料との重複の確率をＲＯＣ曲線により比較した。この目的のための感度は、陽性の試験結果が陽性の疾患（ＴＢＩ又は脳卒中）と重複した確率（Ｐ）［Ｐ（Ｔｅｓｔ＋｜Ｄｉｓｅａｓｅ＋）として記載された。擬陽性についての類似の試験として、疾患が存在しない場合に陽性の試験が存在する条件である［Ｐ（Ｔｅｓｔ＋｜Ｄｉｓｅａｓｅ－）を用いた。Ｅｘｃｅｌのピボットテーブルアプリケーションを用いて、健康試料と疾患試料の数を計数した。（＝ＳＵＭ 個々の疾患試料）／全疾患試料の合計）を用いて感度を計算した。（＝ＳＵＭ 各個人の健康試料／全健康試料の合計）を用いて擬陽性を計算した。特異性は（１－擬陽性）として定義される。この統計的方法は、感度を最大にし、擬陽性の確率を同定する。健康試料と疾患試料の間の各ＲＯＣ曲線のカットオフ値を計算した後、それらの確率で表される化学発光シグナル総量と関連付けた。ＰＫＣ１１抗体、ＰＫＣ１３抗体、及びＰＫＣ１４抗体で染色された各試料コホートについてのカットオフ値は、以下の各グラフにおいて線で示される。
【0058】
化学発光キャピラリーＥＬＩＳＡによる正常試料及びＴＢＩ試料の分析
正常血漿試料及びＴＢＩ血漿試料の全てを、化学発光キャピラリーＥＬＩＳＡアッセイによりＰＫＣｇ及びＰＫＣｇタンパク質分解断片の存在について、３種類の抗ＰＫＣｇモノクローナル抗体のそれぞれでスクリーニングした。有利に、本開示の免疫プローブとしてＰＫＣｇ及びＰＫＣｇ断片の検出抗体を用いる化学発光キャピラリーＥＬＩＳＡは、潜在的な外傷性脳損傷又は脳卒中の後の個人の静脈血の試料中に存在するＰＫＣｇ及び／又はＰＫＣｇタンパク質分解断片の存在を検出するための高感度の方法を提供する。
正常血漿試料及びＴＢＩ血漿試料の全てを、化学発光キャピラリーＥＬＩＳＡアッセイによりＰＫＣｇ及びＰＫＣｇタンパク質分解断片の存在について、３種類の抗ＰＫＣｇモノクローナル抗体のそれぞれでスクリーニングした。有利に、本開示の免疫プローブとしてＰＫＣｇ及びＰＫＣｇ断片の検出抗体を用いる化学発光キャピラリーＥＬＩＳＡは、潜在的な外傷性脳損傷又は脳卒中の後の個人の静脈血の試料中に存在するＰＫＣｇ及び／又はＰＫＣｇタンパク質分解断片の存在を検出するための高感度の方法を提供する。
【0059】
ＴＢＩ試料のアッセイ
簡潔に言うと、この実施例における化学発光キャピラリーＥＬＩＳＡを実施するため、試薬及び正常臨床試料とＴＢＩ臨床試料からの個人の血漿を、（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ Ｌｉｆｅ社のＡｕｔｏ－Ｗｅｓｔｅｒｎサービスを用いて）自動ウエスタンブロット装置にロードした。第1のステップにおいて、試料はキャピラリー中に自動でロードされる。次に、タンパク質がスタッキング及び分離マトリックスを通って電気泳動的に移動するので、それらは大きさにより分離される。次に、分離されたタンパク質は独自の光活性化捕捉化学によりキャピラリー壁上に固定化される。標的タンパク質、すなわちＰＫＣｇ及び／又はＰＫＣｇタンパク質分解断片は、一次抗体、すなわち本明細書に記載されるウサギモノクローナル抗体を用いて同定され、ＨＲＰ結合二次抗体であるヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体及び化学発光基質を用いて免疫プローブされる。各ピークのベースライン、分子量、及び定量的化学発光シグナルをプロットする電気泳動図が作成される。定量的シグナルは、電気泳動図ごとの各分子量のバンドについて抽出された。式（Ｃ２－Ｃ１／Ｃ１）を用いて定量的化学発光シグナルのそれぞれを生成した。式中、Ｃ２は曲線下面積であり、Ｃ１はその試料についてのベースラインである。この特異的化学発光測定は、ＰＫＣ１１抗体、ＰＫＣ１３抗体、又はＰＫＣ１４抗体で染色された後に、ＴＢＩ又は脳卒中の血漿試料と比較した全ての正常ヒト血漿の比較において用いられた。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェアを用いて統計的比較がなされた。結果として生じる特異的化学発光シグナルは、ピコグラム／ｍｌの範囲の感度で検出及び定量化され、ＴＢＩバイオマーカー、すなわち、ＰＫＣｇ、及び／又はＰＫＣｇタンパク質分解断片の直接測定を提供する。
簡潔に言うと、この実施例における化学発光キャピラリーＥＬＩＳＡを実施するため、試薬及び正常臨床試料とＴＢＩ臨床試料からの個人の血漿を、（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ Ｌｉｆｅ社のＡｕｔｏ－Ｗｅｓｔｅｒｎサービスを用いて）自動ウエスタンブロット装置にロードした。第1のステップにおいて、試料はキャピラリー中に自動でロードされる。次に、タンパク質がスタッキング及び分離マトリックスを通って電気泳動的に移動するので、それらは大きさにより分離される。次に、分離されたタンパク質は独自の光活性化捕捉化学によりキャピラリー壁上に固定化される。標的タンパク質、すなわちＰＫＣｇ及び／又はＰＫＣｇタンパク質分解断片は、一次抗体、すなわち本明細書に記載されるウサギモノクローナル抗体を用いて同定され、ＨＲＰ結合二次抗体であるヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体及び化学発光基質を用いて免疫プローブされる。各ピークのベースライン、分子量、及び定量的化学発光シグナルをプロットする電気泳動図が作成される。定量的シグナルは、電気泳動図ごとの各分子量のバンドについて抽出された。式（Ｃ２－Ｃ１／Ｃ１）を用いて定量的化学発光シグナルのそれぞれを生成した。式中、Ｃ２は曲線下面積であり、Ｃ１はその試料についてのベースラインである。この特異的化学発光測定は、ＰＫＣ１１抗体、ＰＫＣ１３抗体、又はＰＫＣ１４抗体で染色された後に、ＴＢＩ又は脳卒中の血漿試料と比較した全ての正常ヒト血漿の比較において用いられた。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェアを用いて統計的比較がなされた。結果として生じる特異的化学発光シグナルは、ピコグラム／ｍｌの範囲の感度で検出及び定量化され、ＴＢＩバイオマーカー、すなわち、ＰＫＣｇ、及び／又はＰＫＣｇタンパク質分解断片の直接測定を提供する。
【0060】
自動ウエスタンブロット技術を用いて合計で２０１個のヒト血漿試料を分析した。正常ヒト血漿試料をＰＫＣ１１（ｎ＝１３）、ＰＫＣ１３（ｎ＝１３）、及びＰＫＣ１４（ｎ＝１４）で染色した（と接触させた）。各ウサギモノクローナル抗体を用いて、少なくとも１３個の個別の正常ヒト血漿試料を分析した。５つの別個のデータの比較からの反復計算について説明すると、合計で５６個の正常ヒト血漿試料をキャピラリーＥＬＩＳＡアッセイにより分析した。ＴＢＩ患者からの血漿もまた、ＰＫＣ１１（ｎ＝３４）、ＰＫＣ１３（ｎ＝３３）、及びＰＫＣ１４（ｎ＝３３）に対して分析した（と接触させた）。各ウサギモノクローナル抗体及びモノクローナル抗体の組み合わせについて、少なくとも３３個の個別の試料を分析した。合計で１４５個のＴＢＩ血漿試料を実行し、５つの別個のデータから関連付けた。
【0061】
全ての統計的比較は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、カリフォルニア州、ラ・ホーヤ）を用いて実行した。正常コホートとＴＢＩ試料のコホートからの化学発光シグナルを比較した。パラメーターの分布を推測する両側独立スチューデントｔ検定を実行した。Ｗｅｌｃｈの補正を用いて、両試料の等しいＳＤについて試験した。Ｐ値はＰ＜０．０５で有意である。９５％信頼レベルで平均値及び標準誤差を計算した。
【0062】
抗ＰＫＣｇ ｍＡｂであるＰＫＣ１１、ＰＫＣ１３、及びＰＫＣ１４で染色されたＴＢＩ血漿試料と正常血漿試料の複合シグナルの比較
Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ジョージア州、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社）を用いて、ＰＫＣ１１、ＰＫＣ１３、及びＰＫＣ１４で染色された正常ヒト血漿と外傷性脳損傷血漿の試料におけるＰＫＣｇシグナルの特徴付けを行った。９５％信頼限界で両側独立スチューデントｔ検定を用いて統計比較を行った。試験した３種類のウサギモノクローナル抗体のそれぞれについて、正常血漿試料と比較された場合、ＴＢＩ血漿試料について顕著に高い化学発光シグナルが存在していた。結果を図１に示す。
Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ジョージア州、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社）を用いて、ＰＫＣ１１、ＰＫＣ１３、及びＰＫＣ１４で染色された正常ヒト血漿と外傷性脳損傷血漿の試料におけるＰＫＣｇシグナルの特徴付けを行った。９５％信頼限界で両側独立スチューデントｔ検定を用いて統計比較を行った。試験した３種類のウサギモノクローナル抗体のそれぞれについて、正常血漿試料と比較された場合、ＴＢＩ血漿試料について顕著に高い化学発光シグナルが存在していた。結果を図１に示す。
【0063】
図１で見られるように、個々の試料（正常とＴＢＩ）の染色パターンは、異なるウサギモノクローナル抗体であるＰＫＣ１１、ＰＫＣ１３、及びＰＫＣ１４に固有であり、各抗体については、正常血漿試料に対してＴＢＩ血漿試料においてシグナルが高かった。
【0064】
抗ＰＫＣｇ ｍＡｂでプローブされた個々の試料についての染色パターンを図２に示す。正常ヒト血漿試料（ｎ＝１３人）を、ＰＫＣ１１抗体（パネルＡ）、ＰＫＣ１３抗体（パネルＢ）、及びＰＫＣ１４抗体（パネルＣ）で染色された外傷性脳損傷試料（ｎ＝３４人）と比較した。
【0065】
ＰＫＣ１１、ＰＫＣ１３、及びＰＫＣ１４での染色パターンは固有である。ＰＫＣ１１ ＴＢＩ試料（Ｔ）の高いピークはＴ１３０、Ｔ２２３、Ｔ２４７を含んでいるのに対し、ＰＫＣ１３はＴ２２０、Ｔ２３３、Ｔ２４０、Ｔ２６５、Ｔ２６６、Ｔ２９３、Ｔ３０５でピークに達し、ＰＫＣ１４はＴ０７９、Ｔ２０９、Ｔ２５８でピークに達する。ＴＢＩの陽性診断は、ＰＫＣ１１について試料の９１％（３０／３３のＴＢＩ試料がバックグランドを超える）、ＰＫＣ１３について試料の９１％（３１／３４のＴＢＩ試料が陽性）、ＰＫＣ１４について試料の９１％（３０／３３のＴＢＩ試料が陽性）で行われた。
【0066】
ＴＢＩ試料の多重分析
以下で実証されるように、ＰＫＣｇに対する２種類のモノクローナル抗体に対する化学発光結合の結果を組み合わせる（本明細書では「多重化する」ともいう）ことにより、ＴＢＩ診断の精度及び信頼度における顕著な改善がもたらされることが発見された。ＴＢＩ試料に対するＰＫＣ１１抗体及びＰＫＣ１３抗体のＰＫＣｇ結合結果の多重化の結果を、ＰＫＣ１１を黒色の縦線、及びＰＫＣ１３を灰色の縦線として、図３に示す。
以下で実証されるように、ＰＫＣｇに対する２種類のモノクローナル抗体に対する化学発光結合の結果を組み合わせる（本明細書では「多重化する」ともいう）ことにより、ＴＢＩ診断の精度及び信頼度における顕著な改善がもたらされることが発見された。ＴＢＩ試料に対するＰＫＣ１１抗体及びＰＫＣ１３抗体のＰＫＣｇ結合結果の多重化の結果を、ＰＫＣ１１を黒色の縦線、及びＰＫＣ１３を灰色の縦線として、図３に示す。
【0067】
ＴＢＩの陽性診断に対する結果として生じる効果を決定するためにＰＫＣ１１とＰＫＣ１３を多重化した。ＰＫＣ１１とＰＫＣ１３に対する化学発光結果を組み合わせることにより、抗体が個別に評価された場合の９１％のＴＢＩ陽性診断から、組み合わされた抗体についての１００％のＴＢＩ陽性（３４／３４のＴＢＩ（＋）試料がバックグランドライン、又はバックグランドラインより上）に改善された。ＰＫＣ１４との多重化はこの（１００％精度の）診断をさらに改善はしなかった（データは示さず）。
【0068】
正常ヒト血漿とＴＢＩ試料のＰＫＣ１１及びＰＫＣ１３の抗体染色を同時にプロットしたところ、２種類の抗体間の染色の違いを示した。いくつかの試料、例えば、Ｔ０２２、Ｔ１３０、及びＴ２２３については、ＰＫＣ１１ ｍＡｂ化学発光シグナルはＰＫＣ１３ ｍＡｂシグナルを超えたが、ＴＢＩ試料であるＴ２６５及びＴ２６６については、ＰＫＣ１１ ｍＡｂで染色された同じ試料についての低いシグナルと比べて、非常に高いシグナルが示された。図３における水平カットオフ（線）は、ＰＫＣ１１＋ＰＫＣ１３多重化抗体のＲＯＣ曲線適合分析に由来する１１３７化学発光単位である。このレベルより高いシグナルはいずれも、標的ＰＫＣｇ及びＰＫＣｇタンパク質分解断片標的バイオマーカーに結合する抗体の検出に基づく予測ＴＢＩ（＋）試料を表す。ＰＫＣ１１ ｍＡｂとＰＫＣ１３ ｍＡｂの多重化に対してＰＫＣ１４ ｍＡｂを追加しても、ＲＯＣ曲線分析又はＴＢＩ陽性試料の診断は改善されなかった（データは示さず）。
【0069】
抗ＰＫＣｇ ｍＡｂで染色されたＴＢＩ血漿試料と正常血漿試料の分析
正常及びＴＢＩ患者からの血漿試料をＰＫＣ１１モノクローナル抗体、ＰＫＣ１３モノクローナル抗体、又はＰＫＣ１４モノクローナル抗体で処理し、ＰＫＣｇ及びＰＫＣｇタンパク質分解断片の存在について上述の化学発光アッセイにより分析した。ＴＢＩ血漿試料と正常血漿試料についてのＲＯＣ曲線の結果を図４Ａ～図４Ｃに示す。正常試料とＴＢＩ試料のいくつかのサブセットを実行したところ、いくつかの反復測定が生じて最終的に１４５個のＴＢＩ試料が解析された。
正常及びＴＢＩ患者からの血漿試料をＰＫＣ１１モノクローナル抗体、ＰＫＣ１３モノクローナル抗体、又はＰＫＣ１４モノクローナル抗体で処理し、ＰＫＣｇ及びＰＫＣｇタンパク質分解断片の存在について上述の化学発光アッセイにより分析した。ＴＢＩ血漿試料と正常血漿試料についてのＲＯＣ曲線の結果を図４Ａ～図４Ｃに示す。正常試料とＴＢＩ試料のいくつかのサブセットを実行したところ、いくつかの反復測定が生じて最終的に１４５個のＴＢＩ試料が解析された。
【0070】
図４に示される結果は、３種類の抗体全てが、異なる特異性及び擬陽性と共に９１％を超える感度に達したことを実証している。ＰＫＣ１１（パネルＡ）は、９１％の感度、５８％の特異性、及び４２％の擬陽性であった。ＰＫＣ１３（パネルＢ）は、９１％の感度、４２％の特異性、及び５８％の最も高い擬陽性を示した。ＰＫＣ１４（パネルＣ）は、９４％の感度、７０％の特異性、及び３０％の擬陽性を示した。
【0071】
擬陽性の確率を示す患者への影響は、患者が追加の採血を受け、試料中のＰＫＣｇレベルを確認するためのＰＫＣｇアッセイの再試験が必要となり得るということである。これは、ＣＮＳ損傷の効果を減弱させるための有効治療の処方にとって時間が最も重要である診断環境においては重要な要因である。正常より高いレベルのＰＫＣｇの別の指標により、患者に対する他の臨床的問題を同定するための神経学的検査及び介入性の放射線検査を患者は受けることになる。擬陽性の発生率及び確率が高い場合は、ＴＢＩの迅速で正確な診断の臨床的利点は失われる。このことは、感度が改善されたＴＢＩ診断アッセイを非常に望ましいものにする。
【0072】
ＰＫＣ１１抗体、ＰＫＣ１３抗体、及びＰＫＣ１４抗体によるＰＫＣｇ／ＰＫＣｇタンパク質分解断片の検出
ＰＫＣ１１、ＰＫＣ１３、及びＰＫＣ１４で染色された正常試料及びＴＢＩ試料の化学発光シグナルの統計比較を行った。結果を図５に示す。統計比較は、両側独立スチューデントｔ検定である（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８）。図５のグラフは、平均値及び標準誤差を示し、＊は９５％信頼レベルでの有意性を表し、Ｐ値は有意性のある測定について記載される。図５で見られるように、各モノクローナル抗体は、正常血漿及びＴＢＩ血漿について固有の染色パターンを示す。ＰＫＣｇの４９～５２ｋＤａ断片は、３種類の抗体の全てについて一般的であり、ＴＢＩ（＋）の診断を改善する。３種類の抗体は全て、正常血漿と比べてＴＢＩ試料において顕著に高いレベルの４９～５２ｋＤａ断片の検出を示す。
ＰＫＣ１１、ＰＫＣ１３、及びＰＫＣ１４で染色された正常試料及びＴＢＩ試料の化学発光シグナルの統計比較を行った。結果を図５に示す。統計比較は、両側独立スチューデントｔ検定である（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８）。図５のグラフは、平均値及び標準誤差を示し、＊は９５％信頼レベルでの有意性を表し、Ｐ値は有意性のある測定について記載される。図５で見られるように、各モノクローナル抗体は、正常血漿及びＴＢＩ血漿について固有の染色パターンを示す。ＰＫＣｇの４９～５２ｋＤａ断片は、３種類の抗体の全てについて一般的であり、ＴＢＩ（＋）の診断を改善する。３種類の抗体は全て、正常血漿と比べてＴＢＩ試料において顕著に高いレベルの４９～５２ｋＤａ断片の検出を示す。
【0073】
ＰＫＣ１１抗体は、４９～５２ｋＤａ断片について正常血漿と比べてＴＢＩ血漿に対するシグナルの顕著な増大を示し、ＰＫＣ１１は、正常血漿の試料と比べてＴＢＩ血漿において完全長ＰＫＣｇ（６３～７３ｋＤａ）に対して最も高いシグナルを示す。
【0074】
ＰＫＣ１３抗体は、ＰＫＣｇ／ＰＫＣｇ断片標的の結合に対して最も高いシグナル応答を示す。ＰＫＣ１３は、４２～４８ｋＤａ、４９～５２ｋＤａ、及び５３～６０ｋＤａの断片に対するシグナルの顕著な増大を有し、ＴＢＩ（＋）の診断を改善する。
【0075】
ＰＫＣ１４抗体は、４９～５２ｋＤａ断片の検出に対するシグナルの顕著な増大を有する。最も高いシグナルは５３～６０ｋＤａの断片に対するものであったが、４２～４８ｋＤａに対するシグナルは正常試料とＴＢＩ試料で顕著な違いはなかった。
【0076】
正常血漿試料とＴＢＩ血漿試料の抗体染色バンドの比較
図６は、ＴＢＩ患者の血漿試料（Ｔ２６５）（下部パネル）と比較した正常ヒト血漿試料（Ｈ０１１）（上部パネル）における、ＰＫＣ１３で認識されるＰＫＣｇ及びＰＫＣｇタンパク質分解断片の典型的な特異的分布を示す。
図６は、ＴＢＩ患者の血漿試料（Ｔ２６５）（下部パネル）と比較した正常ヒト血漿試料（Ｈ０１１）（上部パネル）における、ＰＫＣ１３で認識されるＰＫＣｇ及びＰＫＣｇタンパク質分解断片の典型的な特異的分布を示す。
【0077】
図６の結果は、正常ヒト血漿において、４９～５２ｋＤａ断片の存在が非常に稀であることを実証している。対照的に、ＰＫＣ１３は、ＴＢＩ血漿において４９～５２ｋＤａ断片を高いレベルで検出し、これによりＴＢＩ（＋）を診断する能力が促進される。
【0078】
ＰＫＣ１１、ＰＫＣ１３、ＰＫＣ１４で染色された４９～５２ｋＤａ断片の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線
ウサギモノクローナル抗体であるＰＫＣ１１（Ａ）、ＰＫＣ１３（Ｂ）、ＰＫＣ１４（Ｃ）で染色されたＰＫＣｇの４９～５２ｋＤａ断片について、ＲＯＣ曲線を作成した。結果を図７Ａ、図７Ｂ、及び図７Ｃに示す。
ウサギモノクローナル抗体であるＰＫＣ１１（Ａ）、ＰＫＣ１３（Ｂ）、ＰＫＣ１４（Ｃ）で染色されたＰＫＣｇの４９～５２ｋＤａ断片について、ＲＯＣ曲線を作成した。結果を図７Ａ、図７Ｂ、及び図７Ｃに示す。
【0079】
図７中の黒色の丸はＴＢＩ血漿試料を示す。白色の丸は擬陽性を伴わない最大感度を表す。灰色の丸は擬陽性、すなわち、ＰＫＣｇの４９～５２ｋＤａ断片に対して陽性反応を示す正常血漿試料を示す。
【0080】
図７Ａにおいて、７１０化学発光単位（白色の丸）以上のシグナルを有するＰＫＣ１１で染色された試料のＲＯＣ曲線は、ＴＢＩ陽性であった。この点まで擬陽性は存在しないが（Ｐ＝０．６４の感度、Ｐ＝０．０の擬陽性、及びＰ＝１．０の特異性）、６３０化学発光単位で１つの擬陽性が存在する。これは、これらの条件下でＰＫＣｇの４９～５２ｋＤａ断片について陽性に染色された、唯一の正常（又はＴＢＩではない）ヒト血漿試料である。追加の試験により、この試料は、実際にはＣＮＳ損傷について陽性の試料であると示されることもある。これにより、感度が、曲線Ｂ及び曲線Ｃにおいて見られるように、Ｐ＝０．９を超えることになり得る。
【0081】
図７Ｂは、ＴＢＩ血漿と比較した正常ヒト血漿に対するＰＫＣｇの４９～５２ｋＤａ断片のＰＫＣ１３染色を示す。白色の丸は、試料のシグナルが６５８化学発光単位以上であり、ＴＢＩ（＋）試料である点を特定する。この点における感度はＰ＝０．９５、特異性はＰ＝１．０、擬陽性はＰ＝０．０であった。２つの正常ヒト血漿試料より低いシグナルで同定されたＴＢＩ陽性試料が１つのみ存在する。５８２化学発光単位及び５７９化学発光単位で２つの擬陽性正常血漿試料が同定された（灰色の丸）。対応する感度はＰ＝０．９５であるが、擬陽性の確率はこれらの２点でＰ＝０．５及びＰ＝１．０まで上昇する。
【0082】
図７Ｃは、ＴＢＩ血漿と比較した正常ヒト血漿に対するＰＫＣｇの４９～５２ｋＤａ断片のＰＫＣ１４染色を示す。白色の丸は、試料のシグナルが２９９化学発光単位であることを特定し、これと同じ又はこれ以上でシグナルを有するいずれの試料もＴＢＩ陽性であると特定される。この点において、感度はＰ＝０．９２であり、擬陽性はＰ＝０であり、特異性はＰ＝１．０である。低い化学発光シグナルを有する３つの擬陽性試料（灰色の丸）及び追加のＴＢＩ（＋）が存在する。これらの追加の点について、感度はＰ＝１．０まで上昇し、擬陽性はＰ＝０．３３の確率まで上昇する。
【0083】
ＴＢＩについての結論
上で示したデータは、本発明の新しいインビトロの方法は、静脈血の試料から外傷性脳損傷を診断するための、簡便で、迅速で、信頼できるツールを提供することを実証している。上述のキャピラリー化学発光アッセイなどの標準的なアッセイを用いて、上述のＰＫＣ１１、ＰＫＣ１３、及びＰＫＣ１４の３種類のウサギモノクローナル抗体の全てがＣＮＳ損傷についてのＰＫＣｇ／ＰＫＣｇタンパク質分解断片バイオマーカー上の固有のエピトープを認識し、各抗体がこれらのバイオマーカーについて固有の染色パターンを示し、それにより単独で又は組み合わせて、外傷性脳損傷の発生及び重症度を決定するための信頼できる診断ツールを提供することが実証された。
上で示したデータは、本発明の新しいインビトロの方法は、静脈血の試料から外傷性脳損傷を診断するための、簡便で、迅速で、信頼できるツールを提供することを実証している。上述のキャピラリー化学発光アッセイなどの標準的なアッセイを用いて、上述のＰＫＣ１１、ＰＫＣ１３、及びＰＫＣ１４の３種類のウサギモノクローナル抗体の全てがＣＮＳ損傷についてのＰＫＣｇ／ＰＫＣｇタンパク質分解断片バイオマーカー上の固有のエピトープを認識し、各抗体がこれらのバイオマーカーについて固有の染色パターンを示し、それにより単独で又は組み合わせて、外傷性脳損傷の発生及び重症度を決定するための信頼できる診断ツールを提供することが実証された。
【0084】
結果はまた、４９～５２ｋＤａ断片は、通常はＴＢＩ（＋）試料でのみ認められ、したがって、ＰＫＣｇ／ＰＫＣ断片は、本発明の方法により試験された対象におけるＴＢＩの診断を改善する。ＲＯＣ曲線により分析された４９～５２ｋＤａ断片の感度は、試験された３種類のモノクローナル抗体の全てについてＰ＝０．９１の確率を超えており、臨床ＴＢＩ診断の理想的な増幅器となる。
【0085】
３３～３６ｋＤａ断片、４２～４８ｋＤａ断片、５３～６０ｋＤａ断片などの別の断片は、４９～５２ｋＤａ断片よりもＲＯＣ分析による感度が低く（Ｐ≦０．９）、同様の擬陽性の確率の上昇も伴う。したがって、これらの別の断片は、前記３種類のモノクローナル抗体で染色された試料におけるＴＢＩの診断をそれほど促進しないが、依然としてＴＢＩの有用で信頼できる指標を提供する。さらに、１又は複数の通常のＰＫＣｇタンパク質分解断片を認識する抗ＰＫＣｇ抗体のいずれか２つを組み合わせることにより、診断の精度が１００％まで改善される。
【0086】
実施例３．ヒト血漿試料からの脳卒中の診断におけるＰＫＣｇタンパク質分解断片に結合する抗ＰＫＣｇモノクローナル抗体の分析
上述の化学発光キャピラリーＥＬＩＳＡアッセイにしたがってＰＫＣ１１ ｍＡｂ、ＰＫＣ１３ ｍＡｂ、及びＰＫＣ１４ ｍＡｂで染色することにより、ＰＫＣｇ及びＰＫＣｇタンパク質分解断片の存在について、脳卒中を起こしたと診断された対象からの血漿試料を分析した。結果は、本発明の新しい方法は脳卒中を起こしたと疑われる患者において脳卒中を検出するための迅速で信頼できる診断方法を提供することを実証している。
上述の化学発光キャピラリーＥＬＩＳＡアッセイにしたがってＰＫＣ１１ ｍＡｂ、ＰＫＣ１３ ｍＡｂ、及びＰＫＣ１４ ｍＡｂで染色することにより、ＰＫＣｇ及びＰＫＣｇタンパク質分解断片の存在について、脳卒中を起こしたと診断された対象からの血漿試料を分析した。結果は、本発明の新しい方法は脳卒中を起こしたと疑われる患者において脳卒中を検出するための迅速で信頼できる診断方法を提供することを実証している。
【0087】
正常血漿試料と脳卒中血漿試料におけるＰＫＣｇの検出
化学発光キャピラリーアッセイを用いたＰＫＣ１１、ＰＫＣ１３、及びＰＫＣ１４での脳卒中試料の染色は、正常ヒト血漿試料に対して脳卒中血漿試料において顕著に高いレベルのＰＫＣｇを示した。図８は、各モノクローナル抗体（ＰＫＣ１１、ＰＫＣ１３、及びＰＫＣ１４）で染色された脳卒中試料と正常血漿試料の全ての寄与試料からのシグナルの集計を示す。ＴＢＩ血漿試料について実証されたように、各モノクローナル抗体は固有の染色パターンを示す。
化学発光キャピラリーアッセイを用いたＰＫＣ１１、ＰＫＣ１３、及びＰＫＣ１４での脳卒中試料の染色は、正常ヒト血漿試料に対して脳卒中血漿試料において顕著に高いレベルのＰＫＣｇを示した。図８は、各モノクローナル抗体（ＰＫＣ１１、ＰＫＣ１３、及びＰＫＣ１４）で染色された脳卒中試料と正常血漿試料の全ての寄与試料からのシグナルの集計を示す。ＴＢＩ血漿試料について実証されたように、各モノクローナル抗体は固有の染色パターンを示す。
【0088】
多重化抗体を用いたＰＫＣｇの検出
前述の化学発光キャピラリーＥＬＩＳＡアッセイにしたがって、ＰＫＣ１１モノクローナル抗体及びＰＫＣ１３モノクローナル抗体で個別に及び多重化して（ＰＫＣ１１とＰＫＣ１３の両方で）染色することにより、ＰＫＣｇ及びＰＫＣｇタンパク質分解断片の存在について脳卒中患者からの血漿試料を分析した。結果を図９Ａ～図９Ｃに示す。Ｓを付した番号の試料は脳卒中患者から得られたものであり、Ｈを付した番号の試料は正常（非脳卒中）個人から得られたものである。
前述の化学発光キャピラリーＥＬＩＳＡアッセイにしたがって、ＰＫＣ１１モノクローナル抗体及びＰＫＣ１３モノクローナル抗体で個別に及び多重化して（ＰＫＣ１１とＰＫＣ１３の両方で）染色することにより、ＰＫＣｇ及びＰＫＣｇタンパク質分解断片の存在について脳卒中患者からの血漿試料を分析した。結果を図９Ａ～図９Ｃに示す。Ｓを付した番号の試料は脳卒中患者から得られたものであり、Ｈを付した番号の試料は正常（非脳卒中）個人から得られたものである。
【0089】
結果は、本発明の新しい方法が、脳卒中イベントを受けた患者における脳卒中の発生を検出するための、迅速で、信頼できる診断方法を提供することを実証している。さらに、結果は、異なるＰＫＣｇ断片特異性を有する抗ＰＫＣｇ抗体を多重化することにより、この診断の確実性が改善されることも示唆している。
【0090】
図９Ａにおける脳卒中患者の血漿試料と比較した正常ヒト血漿の個別の試料のＰＫＣ１１染色は、ベースラインより大きい７/１０個の陽性脳卒中試料を示す（７０％検出）。図９Ｂに示されているＰＫＣ１３染色は、ベースラインを超える９個の脳卒中試料を示す（９/１１、又は８２％検出）。図９Ｃに示されるように、ＰＫＣ１１とＰＫＣ１３が多重化された場合、陽性の脳卒中診断の検出の増加は、ベースラインを超える１０個の脳卒中試料で計算される（１０/１１、又は９１％検出）。図９Ａ及び図９Ｂは、図９Ａ中の試料Ｓ０１３における高い陽性シグナル及び図９Ｂ中の試料Ｓ０１７における高い陽性シグナルなど、異なる化学発光パターンを示す。したがって、アッセイにおいてＰＫＣ１１ ｍＡｂ及びＰＫＣ１３ ｍＡｂの感度及び特異性を組み合わせることにより、脳卒中の診断精度は９１%まで改善する。図９中の水平ベースラインは、３４４５化学発光単位を表す。
【0091】
正常血漿試料と脳卒中血漿試料におけるＰＫＣｇ断片の検出
ＰＫＣ１１、ＰＫＣ１３、及びＰＫＣ１４で染色された正常血漿試料及び脳卒中血漿試料の化学発光シグナルの統計比較を行った。結果を図１０Ａ～図１０Ｃに示す。統計比較は、両側独立スチューデントｔ検定分析（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を使用）である。図１０のグラフは、平均値及び標準誤差を示し、＊は９５％信頼レベルでの有意性を表し、Ｐ値は有意性のある測定について記載される。
ＰＫＣ１１、ＰＫＣ１３、及びＰＫＣ１４で染色された正常血漿試料及び脳卒中血漿試料の化学発光シグナルの統計比較を行った。結果を図１０Ａ～図１０Ｃに示す。統計比較は、両側独立スチューデントｔ検定分析（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を使用）である。図１０のグラフは、平均値及び標準誤差を示し、＊は９５％信頼レベルでの有意性を表し、Ｐ値は有意性のある測定について記載される。
【0092】
図１０Ａは、ＰＫＣ１１ ｍＡｂと接触させた脳卒中試料について６３～７３ｋＤａのＰＫＣｇ断片及び４９～５２ｋＤａのＰＫＣｇ断片で高いピークを示すが、これらの違いは正常ヒト血漿と比較された場合は統計的に有意ではなかった。ＰＫＣ１１で染色された脳卒中血漿試料と比較された場合、正常ヒト血漿においてＰＫＣｇの５３～６０ｋＤａ断片について有意なピークが存在する。
【0093】
図１０Ｂは、ＰＫＣ１３ ｍＡｂで染色された対照血漿に対して脳卒中試料における４２～４８ｋＤａのＰＫＣｇ断片の存在の有意な増加を示す（Ｐ＝０．０３８）。正常ヒト血漿と比較された場合、４９～５２ｋＤａ断片は脳卒中血漿において高く、有意に近かった（Ｐ＝０．０６）。恐らく、試料数が大きくなると、ＰＫＣｇの４９～５２ｋＤａ断片について脳卒中（＋）試料の有意な増加を示すであろう。ＰＫＣ１３で染色された正常試料と比較された場合、９５～１０５ｋＤａでのより分子量の大きいバンドが脳卒中試料において顕著であった。ＰＫＣ１３で染色された脳卒中試料においては６３～７３ｋＤａ断片は明らかではなかった。
【0094】
図１０Ｃは、ＰＫＣ１４ ｍＡｂでプローブされた正常ヒト血漿と脳卒中血漿の染色を示す。この抗体は、有意に特異的な染色バンドを示さず、試験された他の２種類の抗体より低いシグナルを有する。
【0095】
正常血漿試料と脳卒中血漿試料におけるＰＫＣｇの４９～５２ｋＤａ断片の検出
図１１Ａ～図１１Ｃは、ＰＫＣ１１（パネルＡ）、ＰＫＣ１３（パネルＢ）、及びＰＫＣ１４（パネルＣ）でそれぞれ染色された正常血漿試料と脳卒中血漿試料におけるＰＫＣｇの４９～５２ｋＤａ断片のＲＯＣ曲線分析を示す。
図１１Ａ～図１１Ｃは、ＰＫＣ１１（パネルＡ）、ＰＫＣ１３（パネルＢ）、及びＰＫＣ１４（パネルＣ）でそれぞれ染色された正常血漿試料と脳卒中血漿試料におけるＰＫＣｇの４９～５２ｋＤａ断片のＲＯＣ曲線分析を示す。
【0096】
ＲＯＣ曲線分析は、ＰＫＣ１１、ＰＫＣ１３、及びＰＫＣ１４で染色された正常血漿試料と脳卒中血漿試料からの個別の４９～５２ｋＤａ断片の高い感度を示し、このことは、脳卒中の診断についてのＰＫＣｇの４９～５２ｋＤａタンパク質分解断片に対するアッセイの診断的有用性の向上を支持する。図１１Ａに示される分析はわずかな試料（ｎ＝３）のみに対するものであるが、感度は高いまま（Ｐ＝１．０）であり、擬陽性はない（Ｐ＝０）。白色の丸は、ＰＫＣ１１で染色された７９７化学発光単位を超えるシグナルでの脳卒中陽性試料を同定する。灰色の丸は、６０２化学発光単位での健康な対照を示す。
【0097】
４９～５２ｋＤａ断片のＰＫＣ１３染色について、図１１Ｂに示されるように、感度は高いまま（Ｐ＝１．０）であり、擬陽性はなく（Ｐ＝０）、特異性は（Ｐ＝１．０）である。白色の丸は、９９９化学発光単位を示し、この値より高いシグナルはいずれも脳卒中陽性試料を表す。５８２化学発光単位及び５７９化学発光単位でシグナルを有する２個の健康な対照試料が存在する（灰色の丸）。
【0098】
４９～５２ｋＤａ断片のＰＫＣ１４染色の結果は、図１１Ｃに示されるように、この断片が脳卒中の診断のための重要な診断標的であることを支持している。断片のそれぞれからの全体の複合シグナルは低いが（例えば、図１０）、アッセイの感度は非常に高いまま（Ｐ＝１．０）であり、擬陽性は０である（特異性Ｐ＝０）。白色の丸は、２５７化学発光単位であり、この値より高いシグナルは脳卒中陽性試料を表す。健康な（非脳卒中）血漿試料（灰色の丸）は、白色の丸に対して化学発光シグナルが低い。
【0099】
正常血漿試料と脳卒中血漿試料における代替的なＰＫＣｇ断片の検出
正常ヒト血漿試料と比較した脳卒中試料の分析は、ＰＫＣｇ断片が脳卒中陽性診断に貢献し得る程度を説明している。ＰＫＣ１１、ＰＫＣ１３、及びＰＫＣ１４で染色されたＰＫＣｇの３３～３６ｋＤａ断片、４２～４８ｋＤａ断片、及び５３～６０ｋＤａ断片のＲＯＣ分析は、４９～５２ｋＤａ断片で見られた感度（Ｐ＞０．９）に到達しないが、それにより、脳卒中の診断に対する改善の程度を変化させることに貢献する。結果を(以下の)表３に示す。
正常ヒト血漿試料と比較した脳卒中試料の分析は、ＰＫＣｇ断片が脳卒中陽性診断に貢献し得る程度を説明している。ＰＫＣ１１、ＰＫＣ１３、及びＰＫＣ１４で染色されたＰＫＣｇの３３～３６ｋＤａ断片、４２～４８ｋＤａ断片、及び５３～６０ｋＤａ断片のＲＯＣ分析は、４９～５２ｋＤａ断片で見られた感度（Ｐ＞０．９）に到達しないが、それにより、脳卒中の診断に対する改善の程度を変化させることに貢献する。結果を(以下の)表３に示す。
【0100】
例えば、ＰＫＣ１３染色はＰ＝０．７～Ｐ＝０．８の範囲の感度、Ｐ＝０．２以下の擬陽性、及びＰ＝０．８～Ｐ＝１．０の特異性を示す。４２～４８ｋＤａ断片及び５３～６０ｋＤａ断片のシグナルに対する貢献は、２２００化学発光単位を超え、擬陽性の確率は低いレベル（２０％）である。
【0101】
表３の他の例は、６３～７３ｋＤａ断片に対する脳卒中の診断の大きな貢献は、Ｐ＝０．５の感度、Ｐ＝０．３の擬陽性、及びＰ＝０．７の特異性を有するＰＫＣ１１からである。対照的に、ＰＫＣ１３は６３～７３ｋＤａ断片に対して応答を示さない（表３参照）。ＰＫＣ１４は、６８８化学発光単位のシグナルで６３～７３ｋＤａ断片に対する応答を示すが、感度が低く、擬陽性が高い（感度Ｐ＝０．５、擬陽性Ｐ＝０．５）。
【0102】
【表5】
【0103】
したがって、感度が高く、特異性が高く、擬陽性が低いＰＫＣｇ断片からのシグナルは、脳卒中（＋）診断を促進することが示される。
【0104】
ＰＫＣ１３ ｍＡｂで染色された正常血漿試料と脳卒中血漿試料におけるＰＫＣｇの４２～４８ｋＤａ断片についてのＲＯＣ曲線
図１２は、ＰＫＣ１３で染色された正常試料と脳卒中試料の４２～４８ｋＤａのＰＫＣｇ断片についてのＲＯＣ曲線分析を示す。ＰＫＣｇの４２～４８ｋＤａ断片のＰＫＣ１３による染色は、擬陽性が０であり、Ｐ＝０．８の感度及びＰ＝１．０の特異性を示す。図１２の黒色の点は脳卒中（＋）試料を表し、灰色の点は正常健康対照を表す。白色の点は２２１３化学発光シグナルに相当する。２２１３化学発光単位以上のシグナルを有する試料は、脳卒中診断について陽性であると考えられる。４２～４８ｋＤａ断片のＰＫＣ１３染色などのＰＫＣｇ断片からのシグナルは、比較的高い感度、高い特異性、及び低い擬陽性を有し、脳卒中（＋）診断の精度を向上させる。
図１２は、ＰＫＣ１３で染色された正常試料と脳卒中試料の４２～４８ｋＤａのＰＫＣｇ断片についてのＲＯＣ曲線分析を示す。ＰＫＣｇの４２～４８ｋＤａ断片のＰＫＣ１３による染色は、擬陽性が０であり、Ｐ＝０．８の感度及びＰ＝１．０の特異性を示す。図１２の黒色の点は脳卒中（＋）試料を表し、灰色の点は正常健康対照を表す。白色の点は２２１３化学発光シグナルに相当する。２２１３化学発光単位以上のシグナルを有する試料は、脳卒中診断について陽性であると考えられる。４２～４８ｋＤａ断片のＰＫＣ１３染色などのＰＫＣｇ断片からのシグナルは、比較的高い感度、高い特異性、及び低い擬陽性を有し、脳卒中（＋）診断の精度を向上させる。
【0105】
結論
回収された全てのウサギモノクローナル抗体が異なる可変領域配列を有し、ＰＫＣｇタンパク質上の異なるエピトープに結合する。ウサギモノクローナル抗体のうちの３種類、すなわち、ＰＫＣ１１、ＰＫＣ１３、及びＰＫＣ１４は、定量的化学発光キャピラリーウエスタンブロット技術を用いて、ＴＢＩを受けたと診断された患者及び脳卒中を起こしたと診断された患者の血漿試料におけるＰＫＣｇ及びＰＫＣｇタンパク質分解断片を検出する能力について、正常（対照）対象からの血漿試料と比較して分析された。
回収された全てのウサギモノクローナル抗体が異なる可変領域配列を有し、ＰＫＣｇタンパク質上の異なるエピトープに結合する。ウサギモノクローナル抗体のうちの３種類、すなわち、ＰＫＣ１１、ＰＫＣ１３、及びＰＫＣ１４は、定量的化学発光キャピラリーウエスタンブロット技術を用いて、ＴＢＩを受けたと診断された患者及び脳卒中を起こしたと診断された患者の血漿試料におけるＰＫＣｇ及びＰＫＣｇタンパク質分解断片を検出する能力について、正常（対照）対象からの血漿試料と比較して分析された。
【0106】
ウサギモノクローナル抗体であるＰＫＣ１１、ＰＫＣ１３、及びＰＫＣ１４は、完全長ＰＫＣｇタンパク質上に存在する固有のエピトープに結合することができる。さらに、これら３種類のウサギモノクローナル抗体の全てが、ＣＮＳ損傷及びＢＢＢを通過して末梢循環への輸送の結果として生じる３２～３６ｋＤａ、４２～４８ｋＤａ、４９～５２ｋＤａ、及び５３～６０ｋＤａのＰＫＣｇタンパク質分解断片上に存在するエピトープを認識する。
【0107】
ＰＫＣ１１及びＰＫＣ１３は、完全長ＰＫＣｇ及びＰＫＣｇタンパク質分解断片に対する強いシグナル（結合）を示す。ＰＫＣｇタンパク質分解断片に対するＰＫＣ１１抗体とＰＫＣ１３抗体の多重化は、血漿試料におけるＴＢＩ又は脳卒中の診断を大幅に向上させる。ＰＫＣ１１、ＰＫＣ１３、及びＰＫＣ１４の染色から組み合わせられたＰＫＣｇのタンパク質分解断片の分析は、試験された臨床試料における種々の程度のＴＢＩ及び脳卒中の両方に対する検出率（診断）を改善し得る。特に、ＰＫＣｇの４９～５２ｋＤａ断片は正常ヒト血漿にはほとんど認められないので、試料におけるこの断片の存在は、ＴＢＩ試料及び脳卒中（＋）の両方の診断を大幅に改善し、脳卒中（＋）試料及びＴＢＩ（＋）試料の両方において高い感度、低い擬陽性、及び高い特異性を示す。
【0108】
したがって、上述されるように、静脈血試料からのＰＫＣｇタンパク質分解断片及びＰＫＣｇの存在を検出及び定量化するための本発明の新しいインビトロの方法は、患者における外傷性脳損傷又は脳卒中などのＣＮＳ損傷の発生の迅速で、信頼できる診断を可能にする。本発明はまた、ＴＢＩ及び脳卒中を診断するための新しいインビトロの方法における使用に特に適した固有のモノクローナル抗体を提供し、これらの抗体は、完全長ＰＫＣｇタンパク質上に存在する少なくとも１つのエピトープを認識（及び前記エピトープと検出可能な結合複合体を形成）し、上述の少なくとも１つのＰＫＣｇタンパク質分解断片上に存在する少なくとも１つの固有のエピトープを認識（及び前記エピトープと結合複合体を形成）し、この結合複合体は生物学的試料中の検出バイオマーカーについて当該技術分野で知られている任意のプロセスにより検出されてもよい。
【0109】
本明細書に記載された文献、特許出願、特許、及び他の文書は、その全体が参照により取り込まれる。上述の実施例は一例にすぎず、限定することを目的としていない。開示される方法に対する自明な変形及び本発明の代替的な実施形態は、上述の開示を考慮して当業者に明らかになるであろう。そのような自明な変形物及び代替物は全て本明細書に記載される発明の範囲内であると考えられる。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12】
【配列表】
【国際調査報告】