特表 2023-513285 生体物質と連結し得る両性蛍光物質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-30

(54)【発明の名称】生体物質と連結し得る両性蛍光物質

(51)【国際特許分類】

   C07D 403/14 20060101AFI20230323BHJP

   A61K 49/00 20060101ALI20230323BHJP

   A61K 31/4045 20060101ALI20230323BHJP

【ＦＩ】

C07D403/14 CSP

A61K49/00

A61K31/4045

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022548531

(86)(22)【出願日】2020-02-10

(85)【翻訳文提出日】2022-10-06

(86)【国際出願番号】 KR2020001852

(87)【国際公開番号】W WO2021162133

(87)【国際公開日】2021-08-19

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522316940

【氏名又は名称】シーバイオメックス カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002321

【氏名又は名称】弁理士法人永井国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】チャ，ジュンフェ

(72)【発明者】

【氏名】チェ，ハクス

【テーマコード（参考）】

4C063

4C085

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C063AA03

4C063BB08

4C063CC06

4C063DD04

4C063EE10

4C085HH11

4C085KB56

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086BC13

4C086GA07

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZC78

(57)【要約】

【課題】生体物質と連結し得る両性蛍光物質を提供する。
【解決手段】下記の構造式１で表される化合物のうち少なくとも一つを含む、
生体物質と連結し得る両性蛍光物質である。
＜構造式１＞
【化２４】

【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記の構造式１で表される化合物のうち少なくとも一つを含む、
生体物質と連結し得る両性蛍光物質：
＜構造式１＞

【化18】

上記構造式１において、
Ｌは、－（Ｌ１）_n－（Ｌ２）であり、
Ｌ１は、－ＮＨ－ＣＨ₂－（ＣＨ₂－Ｏ－ＣＨ₂）_m－ＣＨ₂－Ｃ（＝Ｏ）－であり、
Ｌ２は、アジド（ａｚｉｄｅ）、アセチレン（ａｃｅｔｙｌｅｎｅ）、マレイミド（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）、ヒドラジド（ｈｙｄｒｉｚｉｄｅ）、

【化19】

、

【化20】

、－Ｒ₃－（Ｃ（＝Ｏ）₂－ＮＨ－ＮＨ₂、及び－Ｒ₄－（Ｓ（＝Ｏ）₂－ＮＨ－ＮＨ₂のうち一つであり、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ₃、Ｒ₄は、それぞれＣ１～６の２価脂肪族炭化水素、Ｃ１～６のアルキレン又は２価芳香族炭化水素、及びこの誘導体であり、
ｎは、０又は１であり、
ｍは、０～４の定数である。

【請求項2】

上記構造式１で表される化合物は、下記の構造式２で表される化合物のうち少なくとも一つである、
請求項１に記載の生体物質と連結し得る両性蛍光物質：
＜構造式２＞

【化21】

上記構造式２において、Ｌ１、ｎは、それぞれ上記構造式１に定義したとおりである。

【請求項3】

上記構造式２で表される化合物のうち一つは、下記の構造式３で表される化合物である、
請求項２に記載の生体物質と連結し得る両性蛍光物質。
＜構造式３＞

【化22】

【請求項4】

上記構造式２で表される化合物のうち一つは、下記の構造式４で表される化合物である、
請求項２に記載の生体物質と連結し得る両性蛍光物質．
＜構造式４＞

【化23】

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生体物質と連結し得る両性蛍光物質に関する。

【背景技術】

【0002】

蛍光染料（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅ）は、生物学的研究において幅広く使用されてきており、最近は、臨床診断（免疫化学、分子診断等）のみならず、癌治療といった特殊な手術に活用されている。

【0003】

オーミクスに関連するマイクロアレイ技術、細胞分析研究等に蛍光染料が使用されてきており、最近は、ウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）、ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ等、分子生物学的研究にも蛍光染料が活用されている。

【0004】

蛍光染料は、伝統的な免疫化学診断から最近開発されたＰＯＣＴ（ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃａｒｅ ｔｅｓｔｉｎｇ）、分子診断（バイオセンサ等）までに幅広く活用されている。

【0005】

また、最近、標的治療剤及びそれに伴う診断技術が発達しつつ、蛍光染料を用いて癌手術と同時に癌細胞の転移の程度が確認できる技術が開発されている。

【0006】

既存に開発されて商品化したほとんどの蛍光染料は、電荷を帯びており、電荷を有するタンパク質、核酸、脂質等、バイオ巨大分子との非特異的結合を誘導する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

完璧な中性蛍光染料の場合、強い芳香性及び疎水性により、芳香性の大きいアミノ酸を多数含むタンパク質や、疎水性の大きい巨大生体分子との非特異的結合による偽陽性反応（ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ）を示す。これら偽陽性反応は、タンパク質の特異的ペプチド技術の免疫化学診断及びバイオチップの活用における信頼性の減少を引き起こす。

【0008】

一方、ペプチド、アプタマー等といった微細生体分子（ｓｍａｌｌ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）は、分子量が少なくて、既存の蛍光染料と結合する場合、蛍光染料の有する電荷的特性に支配されるようになる。

【0009】

蛍光染料と生体分子との非特異的結合を最小化するために、緩衝溶液や中性界面活性剤を用いる方法等が考えられるが、最近、蛍光染料がバイオセンサ、外科手術に使用されつつ、分析の精密性が要求されている。

【0010】

本発明は、上記した従来技術の問題点を解決するために発明されたものであり、本願発明者らは、蛍光染料をアミノ酸及びタンパク質の基本特性である両性物質として開発し、蛍光染料の生体分子に対する非特異的反応性自体を最小化し得ることに着目して、本発明を完成した。

【0011】

本発明が解決しようとする課題は、タンパク質の検出・分析の正確性を向上させることのできる新規な蛍光染料を提供することである。

【0012】

本発明の課題は、以上に言及した技術的課題に制限されず、言及していないさらに他の技術的課題は、下記の記載から当業者にとって明確に理解することができる。

【課題を解決するための手段】

【0013】

発明による生体物質と連結し得る両性蛍光物質は、下記の構造式１で表される化合物のうち少なくとも一つを含む。

【0014】

＜構造式１＞

【化1】

【0015】

上記構造式１において、Ｌは、－（Ｌ１）_n－（Ｌ２）である。

【0016】

上記構造式１において、Ｌ１は、－ＮＨ－ＣＨ₂－（ＣＨ₂－Ｏ－ＣＨ₂）_m－ＣＨ₂－Ｃ（＝Ｏ）－である。

【0017】

上記構造式１において、Ｌ２は、アジド（ａｚｉｄｅ）、アセチレン（ａｃｅｔｙｌｅｎｅ）、マレイミド（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）、ヒドラジド（ｈｙｄｒｉｚｉｄｅ）、

【化2】

、

【化3】

、－Ｒ₃－（Ｃ（＝Ｏ）₂－ＮＨ－ＮＨ₂、及び－Ｒ₄－（Ｓ（＝Ｏ）₂－ＮＨ－ＮＨ₂のうち一つであり、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ₃、Ｒ₄は、それぞれＣ１～６の２価脂肪族炭化水素、Ｃ１～６のアルキレン又は２価芳香族炭化水素、及びこの誘導体である。

【0018】

上記構造式１において、ｎは、０又は１である。

【0019】

上記構造式１において、ｍは、０～４の定数である。

【0020】

その他実施例の具体的な事項は、詳細な説明及び図面に含まれている。

【発明の効果】

【0021】

本発明は、少なくとも次のような効果がある。

【0022】

本発明による両性蛍光物質は、生体物質に対する非特異的反応を最小化して、タンパク質の検出・分析の正確性を向上させることができる。

【0023】

本発明による効果は、以上に例示の内容によって制限されず、より多様な効果が本明細書内に含まれている。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】本発明の一実施例による両性蛍光物質のＵＰＬＣ（Ｕｌｔｒａ－Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）分析結果。

【発明を実施するための最善の形態】

【0025】

本発明の利点及び特徴、そしてそれらを達成する方法は、詳細に後述される実施例を参照すれば明確になる。本発明は、以下に開示の実施例に限定されるものではなく、互いに異なる様々な形態に具現されるものである。ただし、実施例は、本発明の開示を完全にして、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものであり、本発明は、請求項の範疇によって定義されるだけである。

【0026】

また、本明細書に開示の技術を説明することにおいて、関連する公知の技術に対する具体的な説明が本明細書に開示の技術の要旨を曖昧にすると判断される場合には、その詳細な説明を省略する。

【0027】

本明細書の全体において、ある部分がある構成要素を「含む」、「有する」とするとき、これは特に逆に記載されない限り、他の構成要素を除くものではなく、他の構成要素をさらに含むことができることを意味する。

【0028】

また、本明細書の全体において、「Ａ～Ｂ」は、Ａ以上かつＢ以下の範囲内であることを意味し、「Ａ以上～Ｂ未満」は、Ａ以上かつＢ未満の範囲内であることを意味し、「Ａ超～Ｂ以下」は、Ａ超かつＢ以下の範囲内であることを意味する。本明細書において、「Ｃａ～ｂ」は、炭素数がａ～ｂであることを意味する。

【発明を実施するための形態】

【0029】

発明の両性蛍光物質は、カチオンとアニオンとが共存する両性イオン部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含むため、アミノ酸、ペプチド、又はタンパク質等といった生体物質に対する非特異的反応を最小化することができる。

【0030】

発明による生体物質と連結し得る両性蛍光物質（以下、「発明の両性蛍光物質」と言う）は、下記の構造式１で表される化合物のうち少なくとも一つを含む。

【0031】

＜構造式１＞

【化4】

【0032】

上記構造式１で表される化合物は、ペンタメチンシアニン染料（ｐｅｎｔａｍｅｔｈｉｎｅ ｃｙａｎｉｎｅ ｄｙｅ）に対の両性イオン部分と、アミノ酸、ペプチド、又はタンパク質等といった生体物質に連結し得るリンカーとして、－Ｐｈ－ＣＨ₂－ＣＨ₂－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌを導入した化合物である。Ｐｈは、

【化5】

である。

【0033】

発明者らが確認したところによれば、リンカーとして－Ｏ－Ｐｈ－ＣＨ₂－ＣＨ₂－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌが導入された対照群は、バッファ水溶液（ｂｕｆｆｅｒ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）における構造が不安定であったし、タンパク質等の生体物質にラベル付け（ｌａｂｅｌｉｎｇ）したとき、時間が経過するにつれて、スクリーン時、蛍光強さが弱くなった。他方、リンカーとして－Ｐｈ－ＣＨ₂－ＣＨ₂－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌが導入された発明の両性蛍光物質は、前記対照群に比べてバッファ水溶液における構造的安全性が高かった。

【0034】

上記構造式１において、Ｌは、－（Ｌ１）_n－（Ｌ２）である。Ｌ１は、－ＮＨ－ＣＨ₂－（ＣＨ₂－Ｏ－ＣＨ₂）_m－ＣＨ₂－Ｃ（＝Ｏ）－であり、Ｌ２は、アジド（ａｚｉｄｅ）、アセチレン（ａｃｅｔｙｌｅｎｅ）、マレイミド（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）、ヒドラジド（ｈｙｄｒｉｚｉｄｅ）、

【化6】

、

【化7】

、－Ｒ₃－（Ｃ（＝Ｏ）₂－ＮＨ－ＮＨ₂、及び－Ｒ₄－（Ｓ（＝Ｏ）₂－ＮＨ－ＮＨ₂のうちの一つである。Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ₃、Ｒ₄は、それぞれＣ１～６の２価脂肪族炭化水素、Ｃ１～６のアルキレン又は２価芳香族炭化水素、及びこの誘導体である。

【0035】

上記構造式１において、ｎは、０又は１である。前記ｎが０である場合、－Ｐｈ－ＣＨ₂－ＣＨ₂－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌにおいて、－Ｌは、－Ｌ２である。前記ｎが１である場合、－Ｐｈ－ＣＨ₂－ＣＨ₂－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌにおいて、－Ｌは、－Ｌ１－Ｌ２である。

【0036】

上記構造式１において、ｍは、０～４の定数である。前記ｍが０である場合、Ｌ１は、－ＮＨ－ＣＨ₂－ＣＨ₂－Ｃ（＝Ｏ）－であり、前記ｍが１である場合、Ｌ１は、－ＮＨ－ＣＨ₂－ＣＨ₂－Ｏ－ＣＨ₂－ＣＨ₂－Ｃ（＝Ｏ）－であり、前記ｍが２である場合、Ｌ１は、－ＮＨ－ＣＨ₂－（ＣＨ₂－Ｏ－ＣＨ₂）－（ＣＨ₂－Ｏ－ＣＨ₂）－ＣＨ₂－Ｃ（＝Ｏ）－であり、前記ｍが３である場合、Ｌ１は、－ＮＨ－ＣＨ₂－（ＣＨ₂－Ｏ－ＣＨ₂）－（ＣＨ₂－Ｏ－ＣＨ₂）－（ＣＨ₂－Ｏ－ＣＨ₂）－ＣＨ₂－Ｃ（＝Ｏ）－であり、前記ｍが４である場合、Ｌ１は、－ＮＨ－ＣＨ₂－（ＣＨ₂－Ｏ－ＣＨ₂）－（ＣＨ₂－Ｏ－ＣＨ₂）－（ＣＨ₂－Ｏ－ＣＨ₂）－（ＣＨ₂－Ｏ－ＣＨ₂）－ＣＨ₂－Ｃ（＝Ｏ）－である。

【0037】

前記ｍの値が大きくなるほど、バッファ水溶液における発明の両性蛍光物質の溶解度が増加して、ラベル付け（ｌａｂｅｌｉｎｇ）を効果的に行うことができ、タンパク質等の生体物質と発明の両性蛍光物質との間の距離を空けて、発明の両性蛍光物質がタンパク質等の生体物質に及ぼす影響を最小化することができる。

【0038】

例えば、上記構造式１で表される化合物は、下記の構造式２で表される化合物のうち少なくとも一つであってもよい。

【0039】

＜構造式２＞

【化8】

【0040】

上記構造式２において、Ｌ１、ｎは、それぞれ上記構造式１に定義したとおりである。

【0041】

例えば、上記構造式２で表される化合物のうち一つは、下記の構造式３で表される化合物、又は下記の構造式４で表される化合物であってもよい。

【0042】

＜構造式３＞

【化9】

【0043】

＜構造式４＞

【化10】

【0044】

＜合成例＞
下記の合成スキーム（ｓｃｈｅｍｅ）によって構造式４で表される化合物を合成した。

【化11】

【0045】

（Ｅ）－Ｎ－（（Ｚ）－２－Ｂｒｏｍｏ－３－（ｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｏ）ａｌｌｙｌｉｄｅｎｅ）ｂｅｎｚｅｎａｍｉｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（１）。

【0046】

ムコブロム酸（Ｍｕｃｏｂｒｏｍｉｃ ａｃｉｄ）（５．９４０ｇ、２３．０４ｍｍｏｌ）をエタノール（４０ｍＬ）に溶解させた後、１０分以上エタノール（２０ｍＬ）で希釈したアニリン（４．２８６ｇ、４．２ｍＬ、４６．１ｍｍｏｌ）を滴下した。

【0047】

反応槽を激しく攪拌して、４０℃まで徐々に加熱した。アニリンの滴下を完了した後、反応が終了していないことを示す二酸化炭素（ＣＯ₂）がさらに生成された。二酸化炭素の放出を完了後、黄金－茶色反応混合物を氷槽（ｉｃｅ ｂａｔｈ）で冷凍させた。明るい黄色固体が沈殿するまでに低温で攪拌しつつ、ジエチルエーテル（５０ｍＬ）を添加した。生成された固体を濾過し、エーテルで洗浄しており、乾燥した後、精製せずに後続反応で使用した。

【0048】

収率（Ｙｉｅｌｄ）７５％；融点（ｍｐ）１８９℃～１９１℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ７．３３０（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）、７．４９６（ｔ、Ｊ＝８Ｈｚ、４Ｈ）、７．７０８（ｄ、Ｊ＝８Ｈｚ、４Ｈ）、９．５５９（ｓ、２Ｈ）、１１．５１３（ｓ、２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）：ｄ８９．３、１１９．５、１２３．９、１２６．０、１２９．２、１２９．６、１３８．５、１５７．４。

【化12】

【0049】

２，３，３－Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ－１－［３－（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐｙｌ］－３Ｈ－ｉｎｄｏｌｉｕｍ－５－ｓｕｌｆｏｎａｔｅ ｄｉｂｒｏｍｉｄｅ（２）。

【0050】

２，３，３－トリメチル－３Ｈ－インドール－５－スルホン酸（２，３，３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ－３Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－５－ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（７．１７ｇ、３６．４ｍｍｏｌ）と、（３－ブロモプロピル）トリメチルアンモニウムブロム化物（（３－ｂｒｏｍｏｐｒｏｐｙｌ）ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）（１０．５ｇ、４０ｍｍｏｌ）の混合物のトルエン（６０ｍＬ）溶液を窒素雰囲気下で、７２時間、１３０℃で加熱した。混合物を室温まで冷却して、溶媒を注いた。粗生成物（ｃｒｕｄｅ ｐｒｏｄｕｃｔ）をメタノール及びＭＴＢＥから結晶化し、桃色結晶を得て、これをさらに精製せずに後続段階で使用した。

【0051】

収率（Ｙｉｅｌｄ）８１％；融点（ｍｐ）２３２℃～２３５℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ１．５６（ｓ、６Ｈ）、２．５１（ｓ、３Ｈ）、３．０７（ｍ、２Ｈ）、３．１２（ｓ、９Ｈ）、３．６２（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）、４．５０（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）、７．７１（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．７９（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．０１（ｓ、１Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ１５．０、２１．６、２２．３、４５．２、５３．１、５５．０、６２．４、１１５．４、１２１．２、１２６．８、１４１．３、１４２．０、１４９．９、１９９．１。Ｃ₁₇Ｈ₂₇Ｎ₂Ｏ₃Ｓ［Ｍ］＋に対するＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ計算値３３９．１７４０、ｍ／ｚ実測値３３９．１７４２。

【化13】

【0052】

２－（（１Ｅ，３Ｚ）－３－ｂｒｏｍｏ－５－（（Ｅ）－３，３－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－５－ｓｕｌｆｏｎａｔｏ－１－（３－（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐｙｌ）ｉｎｄｏｌｉｎ－２－ｙｌｉｄｅｎｅ）ｐｅｎｔａ－１，３－ｄｉｅｎ－１－ｙｌ）－３，３－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－１－（３－（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐｙｌ）－３Ｈ－ｉｎｄｏｌ－１－ｉｕｍ－５－ｓｕｌｆｏｎａｔｅ ｂｒｏｍｉｄｅ（３）。

【0053】

無水酢酸（ａｃｅｔｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）（８ｍＬ）と酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）（４ｍｏｌ ｅｑ）の存在下、７０℃で、Ｎ－ヘテロサイクリク４級アンモニウム部分２（Ｎ－ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｍｏｉｅｔｙ２）（２ｍｏｌ ｅｑ）を有する、置換された２，３，３－トリメチルインドレニン塩（Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ２，３，３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ｉｎｄｏｌｅｎｉｎｅ ｓａｌｔｓ）をブロム化メチン試薬１（１ｍｏｌ ｅｑ）と反応させた。

【0054】

メタノール中のＵＶ－Ｖｉｓ－ＮＩＲ吸収分光法及びＬＣ－ＭＳを利用して反応をモニタリングした。２～４時間後、反応を完了した。溶媒を真空下で除去した。粗物質（ｃｒｕｄｅ ｍａｔｅｒｉａｌ）をメタノールと水の勾配溶媒組成を利用したフルカ（Ｆｌｕｋａ）シリカゲル９０ÅＣ１８逆相クロマトグラフィーを用いて精製して、高純度の最終化合物を得た。

【0055】

収率（Ｙｉｅｌｄ）７７％；融点（ｍｐ）２５２℃～２５４℃；１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ２．０５（ｓ、１２Ｈ）、２．７１（ｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、４Ｈ）、３．４７（ｓ、１８Ｈ）、３．８６（ｔｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、７．２Ｈｚ、４Ｈ）、４．６４（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、４Ｈ）、６．７８（ｄ、Ｊ＝１３．２Ｈｚ、２Ｈ）、７．７３（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、２Ｈ）、８．２１（ｄ、Ｊ＝８Ｈｚ、２Ｈ）、８．２５（ｓ、２Ｈ）、８．５６（ｄ、Ｊ＝１３．２Ｈｚ、２Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）、δ：２０．３、２６．３、４０．６、４９．７、５２．３、６３．６、１０３．０、１１０．２、１１６．４、１１９．１、１２６．６、１４０．３、１４１．３、１４２．５、１５０．６、１７６．７。理論的組成：（ｘ３Ｈ₂Ｏ）：Ｃ（４７．９５％）、Ｈ（６．３１％）、Ｎ（６．０５％）；実際組成：Ｃ（４７．４６％）、Ｈ（６．４８％）、Ｎ（６．０５％）；［Ｃ₃₇Ｈ₅₂ＢｒＮ₄Ｏ₆Ｓ₂］＋に対するＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ理論値７９２．８８２２、ｍ／ｚ実測値７９２．８８５４。

【化14】

【0056】

３－（４－（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）－１－（３，３－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－５－ｓｕｌｆｏｎａｔｏ－１－（３－（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐｙｌ）－３Ｈ－ｉｎｄｏｌ－１－ｉｕｍ－２－ｙｌ）－５－（３，３－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－５－ｓｕｌｆｏｎａｔｏ－１－（３－（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐｙｌ）ｉｎｄｏｌｉｎ－２－ｙｌｉｄｅｎｅ）ｐｅｎｔａ－１，３－ｄｉｅｎ－３－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏａｔｅ（５）。

【0057】

ブロモ染料前駆体３（１．０ｍｍｏｌ）と、３－（４－ボロノフェニル）プロピオン酸（３－（４－ｂｏｒｏｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）４（１．８ｍｍｏｌ）の水溶液を７２時間、Ｐｄ（ＰＰｈ₃）₄（０．０６５ｍｍｏｌ）の存在下で、還流下に加熱した。

【0058】

ブロモロシアニン（ｂｒｏｍｏｒｏｃｙａｎｉｎｅ）の吸収が消滅するまで、メタノールで希釈した分取量をもって、可視／近赤外線分光法により反応進行をモニタリングした。

【0059】

次いで、反応混合物を室温で冷凍させて、Ｈ₂Ｏを減圧下で除去した。固体をＭｅＯＨ／アセトンで沈殿させて分離し、沈殿物をアセトンでさらに洗浄した。

【0060】

開放－逆相コラムクロマトグラフィー（アセトニトリル／水で溶離）を用いて、最終蛍光物質を得た。

【0061】

収率（Ｙｉｅｌｄ）７２％；融点（ｍｐ）＞２６０℃；λｍａｘ＝６４５ｎｍ ｉｎ Ｈ₂Ｏ；１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）、δ：１．７８（ｓ、１２Ｈ）、１．９９（ｂｒ ｓ、４Ｈ）、２．６５（ｂｒ ｓ、２Ｈ）、２．９３（ｂｒ ｓ、２Ｈ）、３．０８（ｓ、１８Ｈ）、３．２５（ｂｒ ｓ、４Ｈ）、３．８４（ｂｒ ｓ、４Ｈ）、５．６５（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、７．２７（ｄ、Ｊ＝３．８Ｈｚ、２Ｈ）、７．３５（ｄ、Ｊ＝４．２Ｈｚ、２Ｈ）、７．４２（ｄ、Ｊ＝４．０Ｈｚ、２Ｈ）、７．６０（ｄ、Ｊ＝４．２Ｈｚ、２Ｈ）、７．８７（ｓ、１Ｈ）、８．５４（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、１２．３３（ｓ、１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ、７０℃）、δ：２１．１６、２７．５１、３２．２５、３９．４２、４１．３０、４９．８２、５３．８４、６３．９５、１０２．８７、１１１．３７、１２０．４９、１２７．５１、１２９．９２、１３０．６７、１３３．２５、１３７．１９、１４１．２３、１４２．０４、１４３．５７、１５５．２３、１７５．２１、１８１．８８；Ｃ₄₆Ｈ₆₀Ｎ₄Ｏ₈Ｓ₂に対するＨＲＭＳ（ＴＯＦ ＭＳ ＥＳ＋）ｍ／ｚ理論値８６０．３８５３［Ｍ］＋、ｍ／ｚ実測値８６２．４０３８［Ｍ＋２Ｈ］＋。

【0062】

化合物５に－ＮＨ－ＣＨ₂－（ＣＨ₂－Ｏ－ＣＨ₂）₄－ＣＨ₂－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨＳを導入して、構造式４で表される化合物を得た。

【0063】

＜ＮＨＳ＞

【化15】

【0064】

＜構造式４＞

【化16】

【0065】

図１には、構造式４で表される化合物のＵＰＬＣ（Ｕｌｔｒａ－Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）分析結果が示されている。

【0066】

ＵＰＬＣ分析
ＵＰＬＣ：ウォーターズ（ＷＡＴＥＲＳ）。
カラム（Ｃｏｌｕｍｎ）：ＨＳＳ Ｃ１８ ＳＢ １．８ｍｍ ２．１×５０ｍｍ。
勾配（Ｇｒａｄｉｅｎｔ）：３分以上、５～５０％メタノールで行う。

【0067】

以上、本発明の実施例を説明したが、本発明は、前記実施例に限定されるものではなく、互いに異なる様々な形態に製造することができ、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術思想や必須特徴を変更せずに、他の具体的な形態に実施できることを理解することができる。よって、以上に記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的ではないと理解しなければならない。

【産業上利用可能性】

【0068】

発明は、生体物質と連結し得る両性蛍光物質を提供する。

【0069】

前記両性蛍光物質は、下記の構造式１で表される化合物のうち少なくとも一つを含む。

【0070】

＜構造式１＞

【化17】

【0071】

上記構造式１において、Ｌは、明細書に定義したとおりである。

【図1】

【国際調査報告】