特表 2023-513371 虚血貧血および急性呼吸窮迫症候群を治療する装置および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-30

(54)【発明の名称】虚血貧血および急性呼吸窮迫症候群を治療する装置および方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/543 20060101AFI20230323BHJP

   C12N 15/54 20060101ALN20230323BHJP

【ＦＩ】

G01N33/543 521

C12N15/54 ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022548872

(86)(22)【出願日】2021-02-12

(85)【翻訳文提出日】2022-08-10

(86)【国際出願番号】 US2021018015

(87)【国際公開番号】W WO2021163608

(87)【国際公開日】2021-08-19

(31)【優先権主張番号】62/977,133

(32)【優先日】2020-02-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/014,088

(32)【優先日】2020-04-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】522319664

【氏名又は名称】ギャラクシー・シーシーアールオー，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(72)【発明者】

【氏名】パイク，イアン・ヒューゴ

(72)【発明者】

【氏名】エルダー，テリー

(72)【発明者】

【氏名】ラロッシュ，マキシム

(72)【発明者】

【氏名】スタンコフ，ミロバン

(57)【要約】

ラテラルフローイムノクロマトグラフィアッセイを行うための装置および方法は、いくつかの態様で、ヒト対象が脳卒中であるかを決定するために、脳卒中であることが疑われるヒト対象から集められた体液におけるグルタチオンＳ－トランスフェラーゼパイのレベルを測定するために、または疑わしい脳卒中のための治療の選択および施術を助けるために使用できる。他の態様として、この種の装置は、例えばＣＯＶＩＤ－１９と称される新規コロナウィルスなどの急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を診断、監視および／または治療するために使用できる。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

体液試料中のグルタチオンＳ－トランスフェラーゼパイ（ＧＳＴ－ｐｉ）を検出および／またはその濃度を測定するためのラテラルフローイムノアッセイ装置であって、前記装置は前記試料中のＧＳＴ－Ｐｉを検出するための試験ストリップを含み、前記試験ストリップは：
ａ）吸収材料を含み、前記試料を受け取るように構成された、試料パッド；
ｂ）ＧＳＴ－Ｐｉに特異的な検出抗体を格納し、液体が存在すると前記格納された検出抗体の少なくとも一部を放出するように構成されたコンジュゲートパッドであって、前記検出抗体は着色された標識とコンジュゲートしている、コンジュゲートパッド；および
ｃ）吸収パッドから下流側に配置され、前記試験ストリップに固定されたＧＳＴ－Ｐｉに特異的な捕捉抗体を含む、比色指示部位
を含む、ラテラルフローイムノアッセイ装置。

【請求項2】

前記装置は、毛管路を有するランセットをさらに含む、請求項１に記載のラテラルフローイムノアッセイ装置。

【請求項3】

前記試験ストリップの少なくとも一部は、ニトロセルロース膜を含む、請求項１に記載のラテラルフローイムノアッセイ装置。

【請求項4】

前記試験ストリップの少なくとも一部は、少なくとも、最大でも、または約５、１０、１５、２０、２５または３０μｍの平均孔径を有するニトロセルロース膜を含む、請求項１に記載のラテラルフローイムノアッセイ装置。

【請求項5】

前記捕捉抗体および前記検出抗体は、ＧＳＴ－Ｐｉの異なる部分と結合するように構成されている、請求項１に記載のラテラルフローイムノアッセイ装置。

【請求項6】

前記捕捉抗体および／または前記検出抗体は、本明細書において記載されている抗体のいずれかからそれぞれ選択される、請求項１に記載のラテラルフローイムノアッセイ装置。

【請求項7】

前記着色された標識は、金ナノ粒子またはラテックスナノ粒子を含む、請求項１に記載のラテラルフローイムノアッセイ装置。

【請求項8】

前記着色された標識は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ＯＤの光学濃度で存在する、請求項１に記載のラテラルフローイムノアッセイ装置。

【請求項9】

前記捕捉抗体および／または前記検出抗体は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４または１．５、１．６、１．７、１．８、１．９または２．０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項１に記載のラテラルフローイムノアッセイ装置。

【請求項10】

前記捕捉抗体はＡ３０３－６２８Ａを含み、前記検出抗体はＨ００００２９５０－Ｍ０１を含む、請求項１に記載のラテラルフローイムノアッセイ装置。

【請求項11】

前記捕捉抗体はＭＡＢ１０８２３を含み、前記検出抗体はＨ００００２９５０－Ｍ０１を含む、請求項１に記載のラテラルフローイムノアッセイ装置。

【請求項12】

前記体液は、ヒト対象からの全血試料を含む、請求項１に記載のラテラルフローイムノアッセイ装置。

【請求項13】

前記ＧＳＴ－Ｐｉは、配列番号１のポリペプチド配列を含む、請求項１に記載のラテラルフローイムノアッセイ装置。

【請求項14】

前記ＧＳＴ－Ｐｉは、配列番号１と少なくとも９０％、９５％、または９９％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項１に記載のラテラルフローイムノアッセイ装置。

【請求項15】

対象が脳卒中または虚血性発作であるかを決定する方法であって：
ａ）脳卒中または虚血性発作であると疑われる対象から体液試料を得るステップと；
ｂ）試料の少なくとも一部を、本明細書に記載されているいずれかのラテラルフロー装置に適用するステップと；
ｃ）ラテラルフロー装置を使用して、試料中のＧＳＴ－Ｐｉのレベルおよび／または濃度を検出するステップと、
を含む、方法。

【請求項16】

ｄ）ステップｃ）で検出されたＧＳＴ－Ｐｉのレベルおよび／または濃度に基づいて、脳卒中または虚血性発作の推定発症時間を決定するステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

ｄ）その後の時点でステップａ）からステップｃ）を繰り返すステップと；
ｅ）前記試料において検出されたＧＳＴ－Ｐｉのレベルおよび／または濃度が時間とともに増加または減少したかを決定するステップと、
をさらに含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項18】

ｄ）ステップｃ）で検出されたＧＳＴ－Ｐｉのレベルおよび／または濃度に基づいて、脳卒中または虚血性発作の推定発症時間を決定するステップと；
ｅ）ステップｄ）で決定された推定発症時間に基づいて、対象のための治療を選択するステップと、
をさらに含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項19】

前記治療は、血栓溶解療法の施術を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を患っているヒト対象の現状および／または重度の疾患に進行する可能性を決定する方法であって：
ａ）ＡＲＤＳおよび／または播種性血管内凝固症候群であると疑われる対象から少なくとも１種の体液試料を得るステップと；
ｂ）ステップａ）で得られた少なくとも１種の試料のＧＳＴ－Ｐｉのレベルを検出および／または測定するステップと；
ｃ）ステップｂ）で検出または測定されたＧＳＴ－Ｐｉのレベルに基づいて、ヒト対象の現状および／または重度の疾患に進行する可能性を決定するステップと、
を含む、方法。

【請求項21】

前記ＡＲＤＳは、ＣＯＶＩＤ－１９である、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

ステップａ）は、異なる時点で前記ヒト対象から複数の試料を得るステップを含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項23】

ステップａ）は、異なる時点で前記ヒト対象から複数の試料を得るステップを含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項24】

前記複数の試料は、前記ヒト対象から：
ａ）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、４８または７２時間ごとに；
ｂ）１日につき少なくとも１回、複数の日にわたって；または、
ｃ）ＡＲＤＳおよび／または播種性血管内凝固症候群のための治療がヒト対象に施される前または後に
得られた試料を含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項25】

対象が頭部外傷または脳震とうであるかを決定する方法であって：
ａ）頭部外傷または脳震とうであると疑われる対象から体液試料を得るステップと；
ｂ）前記試料の少なくとも一部を、本明細書において記載されているいずれかのラテラルフロー装置に適用するステップと；
ｃ）ラテラルフロー装置を使用して、前記試料中のＧＳＴ－Ｐｉのレベルおよび／または濃度を検出するステップと、
を含む、方法。

【請求項26】

ｄ）ステップｃ）で検出されたＧＳＴ－Ｐｉのレベルおよび／または濃度に基づいて、頭部外傷または脳震とうの推定発生時間を決定するステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

ｄ）その後の時点でステップａ）からステップｃ）を繰り返すステップと；
ｅ）前記試料において検出されたＧＳＴ－Ｐｉのレベルおよび／または濃度が時間とともに増加または減少したかを決定するステップと、
をさらに含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項28】

ｄ）ステップｃ）において検出されるＧＳＴ－Ｐｉのレベルおよび／または濃度に基づいて、頭部外傷または脳震とうの推定発生時間を決定するステップと；
ｅ）ステップｄ）において決定された推定発症時間に基づいて、対象のための治療を選択するステップと、
をさらに含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項29】

前記治療は、血栓溶解療法の施術を含む、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

ステップａ）は、異なる時点でヒト対象から複数の試料を得るステップを含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項31】

ステップａ）は、異なる時点でヒト対象から複数の試料を得るステップを含む、請求項２８に記載の方法。

【請求項32】

前記複数の試料は、ヒト対象から：
ａ）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、４８または７２時間ごとに；
ｂ）１日につき少なくとも１回、複数の日にわたって；または、
ｃ）ＡＲＤＳおよび／または播種性血管内凝固症候群のための治療がヒト対象に施される前または後に
得られた以下の試料を含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項33】

ＡＲＤＳを患っているヒト対象を治療する効果を監視する方法であって：
ａ）ＡＲＤＳの治療が対象に施される前および／または後に、ＡＲＤＳを患っていると疑われる対象から体液試料を得るステップと；
ｂ）ステップａ）で得られた試料中のＧＳＴ－Ｐｉのレベルを検出または測定するステップと；
ｃ）ステップｂ）で検出または測定されたＧＳＴ－Ｐｉのレベルに基づいて、前記治療が重度の疾患に至る可能性を減速および／または減少するかを決定するステップと、
を含む、方法。

【請求項34】

ステップａ）は、ＡＲＤＳの治療がヒト対象に施される前または後に実施される、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記ＡＲＤＳは、ＣＯＶＩＤ－１９である、請求項３３に記載の方法。

【請求項36】

前記ＡＲＤＳは、ＣＯＶＩＤ－１９である、請求項３４に記載の方法。

【請求項37】

体液試料中のグルタチオンＳ－トランスフェラーゼパイ（ＧＳＴ－ｐｉ）の濃度を検出および／または測定するためのキットであって：
ａ）試料中のＧＳＴ－Ｐｉを検出するための試験ストリップを含むラテラルフローイムノアッセイ装置であって、前記試験ストリップは：
ｉ）吸収材料を含み、前記試料を受け取るように構成された、試料パッド、；
ｉｉ）ＧＳＴ－Ｐｉに特異的な検出抗体を格納し、液体が存在すると前記格納された検出抗体の少なくとも一部を放出するように構成されたコンジュゲートパッドであって、前記検出抗体は着色された標識とコンジュゲートしている、コンジュゲートパッド；および
ｉｉｉ）吸収パッドから下流側に配置され、前記試験ストリップに固定されたＧＳＴ－Ｐｉに特異的な捕捉抗体を含む、比色指示部位
を含む、ラテラルフローイムノアッセイ装置；ならびに
ｂ）１種または複数種のバッファー
を含む、キット。

【請求項38】

前記ＧＳＴ－Ｐｉは、配列番号１のポリペプチド配列を含む、請求項３７に記載のキット。

【請求項39】

前記ＧＳＴ－Ｐｉは、配列番号１と少なくとも９０％、９５％、または９９％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項３７に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願についての相互参照
[0001]この出願は、２０２０年２月１４日に出願の米国仮特許出願第６２／９７７，１３３号および２０２０年４月２２日に出願の米国仮特許出願第６３／０１４，０８８号の利益を主張する。そして、それぞれの内容は引用により本明細書に完全に組み込まれる。

【0002】

[0002]本開示は、ラテラルフローアッセイ、特に、イムノアッセイに関する。より詳しくは、本開示は、体液試料（例えば、種々の状態を診断、監視および／または治療するための）に存在するグルタチオンＳ－トランスフェラーゼパイ（ＧＳＴ－ｐｉ）の濃度またはレベルを決定する装置および方法を提供する。

【背景技術】

【0003】

[0003]グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴｓ）は、解毒および、場合によっては、多種多様な化学化合物の活性化に関わっていることが知られている酵素の一系統である。ＧＳＴｓは、還元グルタチオンと多くの疎水性および求電子性化合物とのコンジュゲーションを触媒することによってこの機能を発揮する。生化学的、免疫学的および構造的特性に基づいて、可溶性ＧＳＴｓは、アルファ、ミュー、パイ、シグマおよびシータの５つの主要なクラスに構成される。ヒトグルタチオンＳ－トランスフェラーゼパイ遺伝子（ＧＳＴＰ１）は、２１０個のアミノ酸からなるタンパク質（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿０００８４３．１；配列番号１）をコードする多形性遺伝子であり、異物代謝、癌の感受性および種々の他の疾患変異に影響すると考えられる変異型アレルもコードしている。

【0004】

[0004]少なくとも一つの研究において、ＧＳＴ－ｐｉは、ヒト対象が脳卒中を患っているかを検出するための有望なバイオマーカーと見なされている。特に、Ｔｕｒｃｋらは、表題「Ｂｌｏｏｄ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ－π ａｓ ａ ｔｉｍｅ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｏｆ ｓｔｒｏｋｅ ｏｎｓｅｔ」、ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ７．９ （２０１２）の論文で、ＧＳＴ－Ｐｉが脳卒中の発症を決定するためのバイオマーカーとして使用できることを報告した。脳卒中は、依然として全世界的な健康課題のままであり、米国における主要な死因の１つであり、および重い長期の障害である。脳卒中は、動脈（または、いくつかの例では静脈）の妨害物によって生じる虚血貧血性脳卒中、および出血によって生じる出血性脳卒中、の２つの主要な種類に分類される。虚血貧血性脳卒中は、脳に血液を供給している血管の中で障害から生じる（血栓性脳卒中）場合と、または体のどこかで凝血塊から作り出され脳に移動する塞栓によって、脳の血管が結果として閉塞される（塞栓性脳卒中）場合がある。これらの妨害物は、脳から必要な酸素を奪って、患部の内外で永続的な脳細胞死になる場合がある。近年、血栓溶解治療（すなわち、凝血塊を分解する、または溶解する１種または複数種の血栓溶解剤の投与）が、脳卒中のための見込みある飛躍的な治療として出現した。しかしながら、現在の研究は、脳卒中の最初の発症後時間が進むにつれて、血栓溶解治療の効果が急速に減少することを示唆する。

【0005】

[0005]現在では、脳卒中の発症は、磁気共鳴画像（「ＭＲＩ」）技術を使用して、決定できる。しかしながら、これらの方法は、ＭＲＩ装置へのアクセスが制限されるという事実からみれば、非理想である。多くの病院および他の治療施設は、利用可能なＭＲＩ装置を備えていない。さらに、この装置は、家庭に導入または現場で使用（例えば、救護隊員によって）するためには、あまりに大きく、複雑で高価である。ＭＲＩに基づく方法は、画質の問題により、脳卒中発症のための診断の際には低感度を示すことも公知である。近年、研究者は、脳卒中の発症を決定するための臨床症候としての用途を有することができる様々なバイオマーカーを確認している。例えば、ＧＳＴ－Ｐｉは、上記の如く、Ｔｕｒｃｋらによって多くの潜在的バイオマーカーの１つとして確認された。しかしながら、現在まで、この領域の研究者による予備研究は、まだＧＳＴ－Ｐｉに基づく実現可能な診療現場（ＰＯＣ）装置を脳卒中および他の類似の医療事象の診断および治療に提供していない。

【0006】

[0006]ＧＳＴ－ｐｉも血小板活性化の進行に関係し、血小板活性化は血栓（凝血塊）の形成において必要とされる重要なステップである。特に、凝固過程の間の血小板の活性化は、ＧＳＴ－Ｐｉの放出と関係している。

【0007】

[0007]血小板減少症（血小板濃度の減少）は、細菌性およびウイルス性敗血症を含むいくつかの障害、ならびに２０００年代初頭の間に発生した重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）の流行および２０２０年のＣＯＶＩＤ－１９世界的流行病と関連する新規コロナウィルスによって生じる急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の一般な特徴であることが知られている。例として、ＣＯＶＩＤ－１９感染に見られる血小板濃度の減少は、ウイルス感染によって生じ、挿管によって悪化する内皮損傷を伴うと考えられている。これは次に血小板の活性化に至り、肺における凝集および血栓形成が続く。他の研究において、血小板調節異常（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）のより広範な証拠が、報告された。播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）は、生存者が１％未満であるのと比較して、死亡したＣＯＶＩＤ－１９患者の７０％以上で記載されており、高いレベルの静脈血栓塞栓症、高いＤ－ダイマー、およびフィブリノーゲンレベル、ならびに血管内血栓症を伴う血栓症促進事象と主に考えられている。これらの所見は、いくつかの成功の証拠とともに、急性呼吸窮迫症における線維素溶解および血栓性治療法の評価につながった。

【0008】

[0008]ＣＯＶＩＤ－１９患者に対するナドパリン（Ｎａｄｏｐａｒｉｎ）（ヘパリン）を伴う血栓予防治療の施術が、ＩＣＵ患者の３１％で血栓症が認められた最近のオランダの研究において、血栓性合併症を防止しないと分かった。組織プラスミノーゲン活性化因子（ｒＴＰＡ）を使用してＣＯＶＩＤ－１９患者において凝血塊を分解するまたはアスピリンおよび／またはプラビックスを使用して血小板活性化を防止する、代替の治療方針はこの時点で進行中である。

【0009】

[0009]ＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達経路によって調節される炎症と血小板活性化との間の関連についての証拠も増えてきている。この経路に関わるＳＴＡＴ－３は、コラーゲンによって強化された血小板活性化を生じることが示され、炎症状態における凝固の増加量と関連している （Ｚｈｏｕら ２０１３）。ＪＡＫ２－ＳＴＡＴ３の阻害は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける血小板活性化を減少することも示しており（Ｙｕａｎら ２０１５）、およびバリシチニブのようなＪＡＫ２阻害剤はＣＯＶＩＤ－１９の治療の見込みを示している。ＪＡＫ２およびＳＴＡＴ３のレベルは血液および気管支肺胞洗浄液のような末梢検体において測定するのは困難であるが、活性化血小板によって放出されるＧＳＴ－Ｐｉの高いレベルは直ちに検出可能である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

[0010]従って、疾患が制御されていない凝固による場合、凝固状態を決定して、著しい悪化のリスクを階層化するために、ＣＯＶＩＤ－１９患者を評価する手段を提供する需要は残っている。この文脈において、抗凝血剤および血栓溶解剤の投与は、結果を改善すると期待されている。本明細書に提供されているＧＳＴ－Ｐｉラテラルフロー装置は、階層化ツールを提供する。

【課題を解決するための手段】

【0011】

[0011]従来技術の欠点からみて、本開示は、例えば脳卒中およびクモ膜下出血などの脳血管障害、例えばＣＯＶＩＤ－１９と称される新規コロナウィルスなどのＡＲＤＳ、細菌感染またはウイルス感染による敗血症、炎症と関連するすべての状態、血小板活性化および異常な凝固を診断、監視および／または治療するために使用できる装置および方法を提供する。

【0012】

[0012]特に、ヒト対象が脳卒中であるかまたは何時脳卒中になったのかを決定する、または他の態様では、現状、重度の疾患に進行する可能性を決定する、およびＡＲＤＳを患っている対象の治療効果を監視するために使用される、携帯用、低コストおよび高感度ＰＯＣ装置の需要は、存在する。本開示は、対象から集められた体液中のＧＳＴ－Ｐｉ濃度を測定するために使用できる携帯型ラテラルフロー装置および方法を開示することによって、他の利益を提供することに加えて、これらの需要のいずれにも対処する。この種の装置は、低価格で製造できるという点で有利あり、携帯用（例えば、病院への配置に限られておらず、在宅または現場で利用できる）であり、急速に、高感度で（例えば、いくつかの態様で、開示された装置は、約２０ｎｇ／ｍｌを越えるＧＳＴ－Ｐｉ濃度が測定可能である）ＧＳＴ－Ｐｉ濃度を測定するのに使用できる。

【0013】

[0013]本明細書において記載されている携帯型ラテラルフロー装置は、特にＡＲＤＳを伴う血栓塞栓性合併症の診断、監視および治療のために有利であり、ＰＯＣで直接使用でき、可能な場合は、指を刺して採血されるまたは留置カテーテルから採血される少量の血液試料だけを必要とする。この種のアッセイは、追加器材を必要とせず、結果は血栓塞栓性合併症を確認するＧＳＴ－Ｐｉ線におけるポジティブ染色法を伴って５～１５分以内に読み取れる。追加の利点は、以下の説明および添付の図面から見て明らかになるだろう。

【0014】

[0014]第一の一般態様において、本開示は、体液試料中のＧＳＴ－Ｐｉの濃度を検出および／または測定するためのラテラルフローイムノアッセイ装置であって、装置は試料中のＧＳＴ－Ｐｉを検出するための試験ストリップを含み、試験ストリップは：
ａ）吸収材料を含み、試料を受け取るように構成された、試料パッド、；
ｂ）ＧＳＴ－Ｐｉに特異的な検出抗体を格納し、液体が存在すると格納された検出抗体の少なくとも一部を放出するように構成されたコンジュゲートパッドであって、検出抗体は着色された標識部分とコンジュゲートしている、コンジュゲートパッド；および
ｃ）吸収パッドから下流側に配置され、試験ストリップに固定されたＧＳＴ－Ｐｉに特異的な捕捉抗体を含む、比色指示部位
を含む、ラテラルフローイムノアッセイ装置を提供する。

【0015】

[0015]いくつかの態様において、装置は、毛管路を有するランセットをさらに含む。いくつかの態様において、試験ストリップの少なくとも一部は、ニトロセルロース膜（例えば、５、１０、１５、２０、２５または３０μｍの平均孔径を有する）を含む。いくつかの態様において、捕捉抗体および検出抗体は、ＧＳＴ－Ｐｉの異なる部分と結合するように構成されている。捕捉および検出抗体は、本明細書において記載されている抗体のいずれかから、それぞれに選択されることができる。いくつかの態様において、着色された標識部分は、金ナノ粒子またはラテックスナノ粒子を含み、任意選択的に１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の光学濃度で存在する。いくつかの態様において、捕捉抗体および／または検出抗体は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４または１．５、１．６、１．７、１．８、１．９または２．０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。いくつかの態様において、体液は、ヒト対象からの全血試料を含む。

【0016】

[0016]他の一般的態様において、本開示は、対象が脳卒中または虚血性発作であるかどうかを決定する方法であって：
ａ）脳卒中または虚血性発作であると疑われる対象から体液試料を得るステップと；
ｂ）試料の少なくとも一部を、本明細書に記載されているラテラルフロー装置に適用するステップと；
ｃ）ラテラルフロー装置を使用して、試料中のＧＳＴ－Ｐｉのレベルおよび／または濃度を検出するステップと、を含む、方法を提供する。いくつかの態様において、この種の方法は：
ｄ）ステップｃ）で検出されたＧＳＴ－Ｐｉのレベルおよび／または濃度に基づいて、脳卒中または虚血性発作の推定発症時間を決定するステップをさらに含むことができる。さらに他の態様において、この種の方法は：
ｄ）ステップｃ）で検出されたＧＳＴ－Ｐｉのレベルおよび／または濃度に基づいて、脳卒中または虚血性発作の推定発症時間を決定するステップと；
ｅ）ステップｄ）で決定された推定発症時間に基づいて、対象のための治療を選択するステップと、を含むことができる。対象のための治療は、血栓溶解療法の施術を含んでもよい。

【0017】

[0017]他の一般的な態様において、本開示は、ＡＲＤＳを患っているヒト対象の現状および／または重度の疾患に進行する可能性を決定する方法であって：
ａ）播種性血管内凝固症候群であると疑われる対象から体液試料を得るステップと；
ｂ）ステップａ）で得られた試料のＧＳＴ－Ｐｉのレベルを検出または測定するステップと；
ｃ）ステップｂ）で検出または測定されたＧＳＴ－Ｐｉのレベルに基づいて、ヒト対象の現状および／または重度の疾患に進行する可能性を決定するステップと、を含む、方法を提供する。この種の方法は、本明細書に記載されているように、例えば、時間とともに、治療の前および／または後などに、ＧＳＴ－Ｐｉのレベルを測定することによって、ＡＲＤＳについてヒト対象を治療する効果を監視するために使用できる。

【0018】

[0018]いくつかの態様において、本開示は、ＡＲＤＳを患っている対象を治療する方法であって：
ａ）播種性血管内凝固症候群であると疑われる対象から体液試料を得るステップと；
ｂ）ステップａ）で得られた試料のＧＳＴ－Ｐｉのレベルを検出または測定するステップと；ステップｂ）における高いＧＳＴ－Ｐｉのレベルの検出および／または測定に基づいて、対象のためにＪＡＫ－ＳＴＡＴ阻害剤、血栓溶解剤または抗血小板物質治療を選択するステップと、を含む、方法も提供する。

【0019】

[0019]本開示の典型的な態様のこの簡略化された概要は、本発明の基本的な理解に役立つ。この概要は、すべての考察された態様の広範囲な概要であるというわけではなく、ならびに、すべての態様の鍵となるもしくは重要な要素を確認すること、または本発明の態様の一部もしくは全部の範囲を詳細に描写することを意図しない。その唯一の目的は、この後に続く本発明のより詳細な説明の前兆として１つまたは複数の態様を簡略化された形で示すことである。前述の成果に、１つまたは複数の本発明の態様は、記載され、特に請求項において指し示される特徴を含有する。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】[0020]図１は、本開示による典型的なラテラルフロー装置の試験ストリップ部の構造を示す線図である。

【図2】[0021]図２は、本明細書において記載されている種々の捕捉抗体および検出抗体の組合せを使用する比較試験の結果を要約する図表である。

【図3】[0022]図３は、異なる光学濃度レベルで存在するナノ粒子にコンジュゲートした検出抗体を使用する効果を評価したアッセイの結果を示す図表である。

【図4】[0023]図４は、既知量のＧＳＴ－Ｐｉを含む指を刺して得たヒト全血試料中のＧＳＴ－Ｐｉの濃度を測定するために、本開示よる典型的なラテラルフロー装置の使用を評価した研究の結果を示すグラフである。

【図5】[0024]図５は、ヒト対象から得られた生体試料中の血小板からのＧＳＴ－Ｐｉ放出量を評価するために血液画分を調製する典型的なプロトコルを示す流れ図である。

【図6】[0025]図６は、ＧＳＴ－Ｐｉのレベルとヒト対象から得られた生体試料から調製された血液画分の血小板レベルとが相関することを示すグラフである。

【図7】[0026]図７は、早期（＜３時間）および晩期（＞６時間）の時点での臨床的慢性脳卒中患者から採取された血漿試料中のＧＳＴ－Ｐｉの測定結果を示す写真である。

【図8A】[0027]図８Ａは、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）感染患者および健常な対照から採取された血清試料中のＧＳＴ－Ｐｉ濃度を測定するために、本開示による典型的なラテラルフロー装置の使用を評価する研究の結果を示すグラフである。ＣＯＶＩＤ－１９群の中央値は健常な対照群者と比較して上昇しており、個々の患者はＧＳＴ－Ｐｉシグナルの異なる時間的発達を示した。

【図8B】[0028]図８Ｂは、病院で治療を受けている３０人の個別のＣＯＶＩＤ－１９感染患者から採取した６４個の血清試料のＧＳＴ－Ｐｉスコアを示すグラフである。１５個の個別の試料は、高いレベル（スコア≧６）を示して、これらは９人の別々の患者から採取された。

【発明を実施するための形態】

【0021】

[0029]米国において、約６７５，０００人が、毎年虚血貧血性脳卒中を患う。脳卒中症状の約２０％は、発症時間が確立していない。例えば、寝入る前には存在しなかった脳卒中症状によって患者が目覚める状況と定義される、「起床時（ｗａｋｅ－ｕｐ）脳卒中」（ＷＵＳ）は、急性虚血性脳卒中のおよそ２０％に相当する。治療があまりに長く遅れた場合、出血するリスクのため、ＷＵＳを患った対象は血栓溶解には不適格である。さらに、専門の脳卒中センターへの患者の移送が遅れれば、多くの患者が血栓溶解治療に適した時間帯から外れてしまう。このように、虚血貧血脳卒中患者の１５％だけが、この人生を変える治療を受ける。脳の酸素圧低下の一瞬一瞬が２，０００，０００個の脳細胞を殺すので、血栓溶解療法の迅速な施術は決定的であり、脳卒中発症の２時間以内に施術される凝血塊を溶かす治療は臨床結果を著しくより良好にする。

【0022】

[0030]急速なＰＯＣ診断プラットフォームは、例えば、心筋梗塞のための心筋トロポニンおよび肺動脈塞栓症のためのＤ－ダイマーのように、多くの病状の治療に革命をもたらした。しかしながら、早期診断を提供して、ＷＵＳの発症の時間を確立する血液バイオマーカーの見込みは、従来の方法によってはまだ実現されていない。本開示は、脳卒中発症時間を素早く、正確に決定できるＰＯＣ装置を提供することによって、この課題に対処し、脳卒中患者が診断および正しい治療をタイムリーに受けられるようにする。

【0023】

[0031]本明細書において記載されているＰＯＣ装置は、虚血貧血性または出血性脳卒中のためのバイオマーカーとしてＧＳＴ－Ｐｉ濃度を使用し、脳卒中発症時間を決定するため、ＧＳＴ－Ｐｉの上昇レベルを繰り返し追跡するために使用できる。血液のＧＳＴ－Ｐｉの濃度は、虚血性貧血または出血性脳卒中後に数分で増加し、６時間で再び基準値レベルに消失する。本開示は、例えば、事象後の最初の６０分にわたってＧＳＴ－Ｐｉレベルの動力学的プロファイルを決定するために使用できるラテラルフロー装置を提供する。これらの装置は、発症が３時間未満に発生したと決定するために使用でき、患者が血栓溶解治療に適格であることを確認する。本明細書において記載されている携帯可能で迅速な装置は、特に現場での使用に有利であるが、救急室および外傷センターによって脳卒中診断の速度および正確さを向上させるために使用することもできる。本明細書において開示される装置が、脳卒中または脳血管障害を患っている疑いがある個人の血液中のＧＳＴ－Ｐｉのレベルの増加または減少の比率を確立するため、１０、１５または２０分の一定間隔で使用され、この動力学的値を使用して発症の相対時刻を決定することも特に有利であり、ここで増加している値は進行中の脳卒中が３時間以内に始まったことを表す。

【0024】

[0032]本装置が、脳震とうによって特徴づけられる外傷後の頭部外傷または衝突によって誘発された頭部外傷の状態を評価するために使用できることは、本発明のさらなる特徴である。この点で、スポーツ頭部外傷の評価の間、および例えば、戦場、交通事故および落下のような緊急時の間に、脳震とうの評価のための結果が１５分以内に得られることは、特に有利である。

【0025】

[0033]上記の如く、本開示は、ＡＲＤＳを患っているヒト対象（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９に感染した患者）の現状および／または重度の疾患に進行する可能性を決定するために使用される方法も提供する。関連した態様において、この種の方法は、ＡＲＤＳを患っている対象の状態を監視するため、またはこの種の対象の治療効果を評価するため（治療の施術の前または後など、異なる時点でＧＳＴ－Ｐｉのレベルを測定することによって）、使用される。この種の方法は、本明細書において記載されている携帯機器を使用して実施されることができ、アッセイはＰＯＣで直接実行でき、追加の専門器材は不要である。さらに、この種のアッセイは、都合よく５～１５分以内に完了することができ、ＧＳＴ－Ｐｉのレベルの迅速検出および／または測定ができ、次に、診断または対象の状態を監視、または対象のための適切な治療を選択するために、使用されることができる。

【0026】

[0034]いくつかの態様において、本開示は、試験ストリップと、任意選択的に、毛管路を有するオンボードランセット（ｏｎ－ｂｏａｒｄ ｌａｎｃｅｔ）とを含む、ラテラルフロー装置を提供する。試験ストリップは、例えば、多孔性紙、マイクロ構造ポリマーまたは焼結ポリマーなどの１種または複数種の毛細管床を含むことができ、毛細管床は液体を装置全体の少なくとも一部に毛管作用によって横方向に流すことができる。この種の装置は、１種または複数種の包装済み試薬（例えば、試験ストリップを濡らすバッファー）および／または自動化されたフロー方式を含むキットの一部として、任意選択的に提供されてもよい。試験ストリップは、横方向の流れの間、ＧＳＴ－Ｐｉと結合するために、コロイド粒子（例えば、金、ラテックスまたは他の着色粒子）に結合されたＧＳＴ－Ｐｉに対する固定化抗体を含有することができ、試験された体液中のＧＳＴ－Ｐｉレベルを検出または測定するために使用できる比色指標を提供する。本明細書において記載されている装置は、脳卒中、またはＡＲＤＳおよび／または播種性血管内凝固症候群を患っていると疑われる対象から、体液を集める（例えば、指を刺すことによって血液を集める）ために使用される。収集された血液は、次にバッファーまたは他の液体とともに本装置に供されることができ、１個または複数個の毛細管床の少なくとも一部に流れることができ、最終的には、コロイド粒子とコンジュゲートしたＧＳＴ－Ｐｉに対する固定化抗体に達する（すなわち、比色指標が生成する）。いくつかの態様において、１個または複数個の追加比色指標を提供するために、１個または複数個の毛細管床は、追加の標識抗体および／または固定化抗体（例えば、ヒト血液の１種または複数種の追加成分に対する抗体）を含んでもよく、追加比色指標は実験対照または他のシグナルとして役立つことができる。

【0027】

[0035]いくつかの態様において、本明細書で提供されているこれらのラテラルフロー装置は、１０分以内またはそれ未満（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０分以内に）で、ヒトまたは電子システムによる外観検査によって検出される比色指標を生成できる。本明細書において記載されているラテラルフロー装置は、この比色指標の強度がＧＳＴ－Ｐｉ濃度により直線的に変化するようにさらに構成されることができ、逐次試験（例えば、異なる時点で実施される）に渡りＧＳＴ－Ｐｉ動力学を評価する手段を提供する。

【0028】

[0036]ＧＳＴ－Ｐｉが脳卒中発症、および血小板活性化のための潜在的診断バイオマーカーと認められるとともに、先行研究は脳卒中患者およびＡＲＤＳ（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）を患っている対象の診断および治療を助けるために、この関係に影響を及ぼすことができるいかなる迅速なＰＯＣアッセイ（例えば、ラテラルフロー装置）も得ることに失敗している。ＧＳＴ－Ｐｉの異なる部分に対して抗体の特定の一対が生じたという驚くべき発見に基づいて、この種の装置は現在提供されており、本装置（捕捉および検出のための）により使用されるサンドイッチフォーマットにおけるそれらの方向性は、２０ｎｇ／ｍｌを超えるＧＳＴ－Ｐｉ濃度を検出することができる比色指標を生成するために使用でき、カットオフ値が脳卒中を除外するために予め設定される。実際、この発見は組換えＧＳＴ－Ｐｉが混ぜられたヒト血漿における１４０を越える抗体の組合せの研究の成果であり、それらの圧倒的多数が本明細書において記載されている迅速および高感度のラテラルフローアッセイへの使用には不適当であると分かった。いくつかの態様において、本装置は、シグナル強度を最大にするため、特定の標識（例えば、金または赤いラテックス）および／または毛細管床として使われるニトロセルロースの特定の孔径をさらに必要とする。

【0029】

[0037]いくつかの態様において、本開示によるラテラルフロー装置は、下記の表１に記入される個々の抗体の任意の組合せから選択される抗体（ＧＳＴ－Ｐｉの捕捉および検出のための）の少なくとも１種の一対を利用することができる。例えば、ラテラルフロー装置は、ＧＳＴ－Ｐｉの捕捉のための６２８Ａ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国、から入手可能；Ａ３０３－６２８Ａ）と、ＧＳＴ－Ｐｉの検出のための、ストレプトアビジン／ビオチンリンカー系を使用して間接的に金粒子にコンジュゲートしたＭ０１（Ａｂｃａｍ ＰＬＣ、台湾、から入手可能；Ｈ００００２９５０－Ｍ０１）とを含有できる。試験は、低いバックグラウンドシグナルを伴って、この特別な結合が約２０～４０ｎｇ／ｍｌの検出限界を出せることを証明した。

【0030】

【表1】

【0031】

[0038]いくつかの態様において、本開示によるラテラルフロー装置は、本装置の操作の間、捕捉抗体および／または検出抗体が０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４または１．５、１．６、１．７、１．８、１．９または２．０ｍｇ／ｍＬ（またはこれらの値の任意の一対によって囲まれている範囲内の濃度に存在する）の濃度で存在するように、構成されてもよい。追加の濃度は、与えられた実装に応じて代替的に使用されてもよい。

【0032】

[0039]いくつかの態様において、検出抗体は、着色粒子（例えば、金ナノ粒子または赤いラテックス粒子）にコンジュゲートすることができる。本開示によるラテラルフロー装置は、コンジュゲートした粒子が１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の光学濃度で存在するように、構成されてよい。例えば、光学濃度は、３、５または７でもよい。

【0033】

[0040]いくつかの態様において、本開示によるラテラルフロー装置は、体液（例えば、全血または血清）のＧＳＴ－Ｐｉの濃度を測定するように構成されてよい。体液は、例えば、全血の≦１０、２０、３０、４０または５０μＬの試料を含むことができる。いくつかの態様において、体液は、全血の一画分を含んでよい。

【0034】

[0041]いくつかの態様において、本開示によるラテラルフロー装置は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｎｇ／ｍＬのＧＳＴ－Ｐｉの検出下限値を有するように構成されてよい。ＧＳＴ－Ｐｉを検出するために使用する比色指標は、ヒトに、または、いくつかの態様では、電子装置（例えば、自動化されたまたは補助装置を使った読み込みができる）に、視覚的でもあってよい。

【0035】

[0042]いくつかの態様において、本開示によるラテラルフロー装置は、少なくとも、最大でも、または約５、１０、１５、２０、２５または３０μｍの孔径を有する（またはこれらの値のいずれかで囲まれている範囲内の平均孔径を有する）ニトロセルロース膜を含んでよい。追加の孔径は、与えられた実装に応じて代替的に使用されてもよい。いくつかの態様において、捕捉抗体は、ニトロセルロース膜上へ印刷されるかまたは固定されてよい。

【0036】

[0043]図１は、本開示よる典型的なラテラルフロー装置を示す。この図に示すように、ラテラルフロー装置は、試料パッド（試験される体液試料を受け取るため）、標識（検出）抗体を提供するコンジュゲートパッド、捕捉抗体（例えば、膜上へ印刷される）を含有するニトロセルロース膜、および吸収パッドを含んでよい。いくつかの態様において、吸収パッドは、ブロッキングバッファー（例えば、トリス、ＢＳＡおよびＴｗｅｅｎを含む）で処理される。

【0037】

[0044]図２は、本開示によるラテラルフロー装置に使用する検出および捕捉抗体として表１に記載された抗体の種々の組合せを比較した一連の試験の結果を示す。この表で示すように、これらの抗体の大部分の組合せは、目視可能なシグナルを出すことに失敗したかまたは負の特性（例えば、曖昧または偽陽性結果）を示した。しかしながら、これらの抗体の少数の特定の一対は、強くて正確な信号を出した（例えば、検出抗体であるＭ０１またはＭ０３いずれかと、捕捉抗体である６２８－Ａとの組合せ）。

【0038】

[0045]図３は、ナノ粒子にコンジュゲートした検出抗体を異なる光学濃度（ＯＤ）レベルで使用して、ＧＳＴ－Ｐｉの検出下限値を比較するように設計されたアッセイの結果を示す。これらのアッセイで示すように、３、５または７のＯＤレベルが２０ｎｇ／ｍＬの検出下限値までＧＳＴ－Ｐｉを検出することができると分かった、この時、６２８－Ａが捕捉抗体として、Ｍ０１が検出抗体として使用された。

【0039】

[0046]図４は、種々の濃度でＧＳＴ－Ｐｉが混ぜられた全血中のＧＳＴ－Ｐｉ濃度を測定することについて、本開示によるラテラルフロー装置の能力を評価したアッセイの結果を示す。これらの試験で示すように、本開示による典型的な装置は、２０～１５０ｎｇ／ｍｌの臨床と関連する範囲全体で線形信号応答を生じることが可能であり、そのため、脳卒中を検出するための、および発症時間を推定するための使用に適している。

【0040】

[0047]図５は、ヒト対象から得られた生体試料中の血小板からのＧＳＴ－Ｐｉ放出を評価する血液画分を調製するための典型的なプロトコルを示し、この生体試料は、例えば、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）感染を伴う好中球減少症などの血小板使用の重症例において予想されるシグナルのダイナミックレンジを決めるために使用された。

【0041】

[0048]図６は、ラテラルフロー装置によって測定されるＧＳＴ－Ｐｉのレベルと、ヒト対象から得られた生体試料から調製された血液画分中の血小板レベルとが相関したことを示す図表である。凝固の間の血小板からのＧＳＴ－Ｐｉの放出は、血漿と比較して、血清および全血においてわずかにより高いシグナル強度として反映された。最高レベルは、血液から派生した血小板を機械的に破壊して濃縮した調合液で得られた。

【0042】

[0049]図７は、早期（＜３時間）および晩期（＞６時間）の時点で臨床的に慢性脳卒中患者から採取される血漿試料中のＧＳＴ－Ｐｉの濃度を測定して、本開示による典型的なラテラルフロー装置の使用を評価した研究の結果を示す写真である。４人が晩期にＧＳＴ－Ｐｉレベルのわずかな減少を示したのに対して、１人の患者は２つの時点の間にＧＳＴ－Ｐｉレベルの安定した高さを示した。

【0043】

[0050]図８Ａは、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）感染を患っている患者および健常な対照から採取された血清試料中のＧＳＴ－Ｐｉ濃度を測定して、本開示による典型的なラテラルフロー装置の使用を評価した研究の結果を示すグラフである。ＣＯＶＩＤ－１９群の中央値は、健常な対照と比較して上昇しており、個々の患者はＧＳＴ－Ｐｉシグナルの異なる時間的発達を示した。

【0044】

[0051]図８Ｂは、病院の治療を受けている３０人の個別のＣＯＶＩＤ－１９感染患者から採取した各６４個の血清試料のＧＳＴ－Ｐｉスコアを示すグラフである。１５個の個々の試料は高いレベル（スコア≧６）を示し、これらは９人の別々の患者から採取された。

【0045】

[0052]本明細書において記載されているラテラルフロー装置は、対象が脳卒中または一過性脳虚血性発作があったかどうか検出するために使用されてもよく、およびいくつかの態様において、治療の適切な選択および施術ができるように、この種の事象の発症時間の推定に使用されてよい。このように、いくつかの態様で、本装置は、対象が０．５、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０または８．０時間前（またはこれらの値のいずれかによって囲まれている範囲内）以内に脳卒中を経験したかどうか、さらに、必要に応じて対象に血栓溶解治療を行うべきかを決定するために使用できる。追加の使用方法は、本開示の全体から明らかになるだろう。

【0046】

[0053]例えば、上記の如く、本明細書で提供されるラテラルフロー装置は、ＡＲＤＳを患っているヒト対象の、現状、重度の疾患への進行の可能性を決定するため、監視のため、または、この種の対象の治療を導くため、使用されてよい。血小板から放出されるＧＳＴ－Ｐｉを測定するこれらの装置の能力を評価するために、４つの異なる血液画分、全血、血漿、血清および多血小板血漿（ＰＲＰ）、からのシグナル強度は、比較された。血清以外のすべての試料において、検出レベルに対するＥＤＴＡおよびヘパリンの影響も、比較された。この実験のプロトコルおよび結果は、それぞれ、図５および図６に要約される。

【0047】

[0054]要するに、新鮮血は、健常な男性対象から適切な管に集められ、各血液画分を生成するために図５に示すように処理された。多血小板血漿を調製するため、我々は、１０分間、２００Ｇで低速遠心分離した。上澄は除去され、血小板を溶解させるため５分間超音波処理され、５分間、１０，０００Ｇで遠心分離することによって、破片が取り除かれた。上澄は、続いて、本開示によるラテラルフロー装置を使用して、ＧＳＴ－Ｐｉレベルを測定するために使用された。加えて、健常な男性からの全血は、標準ＥＤＴＡ管または標準ヘパリン管に集められ、直接分析された。測定するために、各血液画分の２０μｌは、ＧＳＴ－Ｐｉラテラルフロー装置の試料ポート上に充填された。一旦血液試料が完全に吸収されると、アッセイランニングバッファーが加えられて、ラテラルフロー膜全体にわたって血液成分を輸送することができた。陽性シグナルは、血液試料中のＧＳＴ－Ｐｉの存在によって展開し、その濃度と比例する染色強度を有する。すべての試験は、手動読取装置により、目で読み込まれた。

【0048】

[0055]図６で示すように、ＧＳＴＰレベルは、血小板含量のレベルと相関し、ＰＲＰ試料は他の血液画分より非常に強い信号を示した。この実験は、血漿と比較して、血清および全血における凝固プロセスの活性化が、ＧＳＴ－Ｐｉシグナルを増加させることも示したが、２つの異なる抗凝血剤が存在する場合には、測定されたレベルにほとんど違いがなかった。

【0049】

[0056]この研究によって証明されたように、本明細書において記載されているラテラルフロー装置は、ＡＲＤＳを患っている対象の、現状、重度の疾患に進行する可能性を決定するため、および治療効果を監視するため、使用されてよい。いくつかの態様において、この種の方法は：ａ）ＡＲＤＳまたは播種性血管内凝固症候群であると疑われる対象から体液試料を得るステップと；ｂ）ステップａ）で得られた試料中のＧＳＴ－Ｐｉのレベルを検出および／または測定するステップと；ｃ）ステップｂ）で検出または測定されたＧＳＴ－Ｐｉのレベルに基づいて、ヒト対象の、現状および／または重度の疾患に進行する可能性を決定するステップと、を含むことができる。いくつかの態様において、この種の方法は、一定期間にわたって（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、４８または７２時間ごとに集められた）、ヒト対象から得られた一連の体液試料のＧＳＴ－Ｐｉのレベルを検出または測定することによって、ヒト対象の状態を監視するために使用されてもよい。さらに他の態様において、現状および／または重度の疾患に進行する可能性については、上述した期間または他の期間にわたってヒト対象から得られた複数の試料に基づいて、決定されてもよい。本方法は、ヒト対象に施術される治療の効果を決定または治療法を選択するために使用されてよい。例えば、治療法は、対象から得られた体液試料中で検出および／または測定されるＧＳＴ－Ｐｉのレベルに基づいて、選択または変更できる。上述した方法のいずれも、本明細書において記載されているラテラルフロー装置を使用して有利に実行されてよく、このラテラルフロー装置は、追加の専門器材のないＰＯＣで、体液試料中のＧＳＴ－Ｐｉのレベルの迅速な検出および／または測定（例えば、５～１５分以内）を可能にする。

【実施例】

【0050】

[0057]
実施例１－ＧＳＴ－Ｐｉラテラルフロー装置（ＬＦＤ）の開発
[0058]ＧＳＴ－Ｐｉに特異的な抗体は、表１で明示した商業的業者から購入した。これらの抗体は、ＬＦＤの捕捉抗体および検出抗体として、一対にして組合せごとに試験した。捕捉抗体をニトロセルロース膜上の別々の線として印刷した後、適切な大きさのストリップに切断し、図１に従って、予め充填されたコンジュゲートパッド、ならびに試料装填およびバッファーを毛管作用で運ぶためのさらなる吸収性パッドとを組み込み、カセットに組み立てた。検出抗体は、コロイド金粒子にコンジュゲートし、ＬＦＤカセット組み立ての間に、コンジュゲートパッドに充填した。

【0051】

[0059]抗体対ごとに、二重のＬＦＤｓにバッファー単独（陰性試料）、または５００ｎｇ／ｍｌの組換えＧＳＴ－Ｐｉが混ぜられたバッファー２０μｌを充填し、室温で１５分間放置した。捕捉抗体の線における色彩強度は、参照用金色カード（ＮＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、手動で読み込んだ。各対の結果を図２に示し、ここで、強度＞４は陽性であると認め、さらなる評価のための好適な組合せを示す「＋」とともに表２に要約した。

【0052】

【表2】

【0053】

[0060]
実施例２－ヒト血漿中の組換えＧＳＴ－Ｐｉの測定
[0061]抗ＧＳＴ－Ｐｉ抗体「６２８－Ａ」を検出窓の中で別々の線のニトロセルロース膜ストリップ上に固定して、金粒子にコンジュゲートした検出用抗ＧＳＴ－Ｐｉ抗体「ＭＯ３」をコンジュゲートパッドに吸収させることによって、ＬＦＤを製造した。その後、ニトロセルロース膜およびコンジュゲートパッドを吸収パッドとともにカセットに組み立て、最終試験装置を製造した。正常ヒト血清は、健康な成人男性に静脈穿刺して、標準的なプラスチックチューブに収集することによって調製した。血液を室温で３０分間保持して、凝血塊を遠心分離して除去し、組換えＧＳＴ－Ｐｉの終濃度が０、２０、４０、７０、１００および１５０ｎｇ／ｍｌである希釈系列を調製するために、血清を使用した。ＧＳＴ－Ｐｉの濃度ごとに、２０μｌの血清を、複製した３つのＬＦＤの試料ポートに加えた。すべての血清が一旦吸収されると、２滴の試験バッファーを加え、ＬＦＤを室温で１５分間インキュベートした。ＧＳＴ－Ｐｉ線での金粒子染色の強度は、金色カード（ＮＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を参照して、手動で測定した。結果を図２に示す。この図は、本試験が４０ｎｇ／ｍｌで必要な生理学的範囲内の検出限界を達成したことを証明している。

【0054】

[0062]
実施例３－虚血性脳卒中の５つの症例におけるＧＳＴ－Ｐｉの測定
[0063]ＧＳＴ－Ｐｉを測定して、脳卒中の存在および可能性のある発症時間を確定するための、ラテラルフロー装置のパフォーマンスを評価するために、我々は、脳卒中の診断受け、病院に入院した６人の個人から、血漿試料および血清試料を得た。すべての試料は、標準的な臨床診療に従って調製し、および完全な同意を受けた。患者ごとに、我々は症状の発症からの時間および国立衛生研究所脳卒中スコア（ＮＩＨＳＳ）も得た（表３）。

【0055】

【表3】

【0056】

[0064]抗ＧＳＴ－Ｐｉ抗体「８２３」を検出窓の中で別々の線のニトロセルロース膜ストリップ上に固定して、金粒子にコンジュゲートした検出用抗ＧＳＴ－Ｐｉ抗体「Ｍ０１」をコンジュゲートパッドに吸収させることによって、ＬＦＤを製造した。その後、ニトロセルロース膜およびコンジュゲートパッドを吸収パッドとともにカセットに組み立て、最終試験装置を製造した。ＧＳＴ－Ｐｉのレベルを測定するために、２０μｌ量の血漿または予め希釈された血清を、各試料のために複製した３つのＬＦＤカセットの試料ポートに加え、試料パッドに吸収させた。すべての試料が一旦吸収されると、２滴の試験バッファーを加え、ＬＦＤを室温で１５分間インキュベートした。ＧＳＴ－Ｐｉ線での金粒子染色の強度は、金色カード（ＮＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を参照して、手動で測定した。結果を図７および表３に示す。予想されるように、５つの全血漿試料について、ＧＳＴ－Ｐｉのレベルは早期試料と晩期試料との間で減少した。同様に、予め希釈した血清において、４人の個人でＧＳＴ－Ｐｉのレベルの減少を観察したが、第５番目の個人は安定した、高いレベルを示した。

【0057】

[0065]
実施例４－ＣＯＶＩＤ－１９感染患者試料のＧＳＴ－Ｐｉの測定
[0066]ＣＯＶＩＤ－１９患者の血清のＧＳＴ－Ｐｉのレベルを調査するため、我々は、各４４人の健常な提供者からのそれぞれ単一の試料に加えて、病院（表４）に入院している３０の感染個体から６４個の試料のコーホートを得た。

【0058】

【表4-1】

【0059】

【表4-2】

【0060】

[0067]捕捉抗体として「８２３」および検出のためのコロイド金にコンジュゲートしたＭ０１を使用して、ＬＦＤカセットを製造した。試料ごとに、血清の１０μｌ一定分量を試料ポートに加えた。すべての試料が一旦吸収されると、２滴の試験バッファーを試料ポートに加え、装置を室温で１０分間インキュベートした。染色の強度は、金色カード（ＮＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を参照して、手動で測定した。結果を図８に示す。２種類の個体群のデータが分析されるときに（図８Ａ）、ＣＯＶＩＤ－１９集団におけるＧＳＴ－Ｐｉ血清レベルの中央値は、明白に高いほうに分離していた。カットオフスコアとして６を使用して、ＣＯＶＩＤ－１９患者から１５／６４の陽性試料および対照群から３／４４の陽性試料があった。ＣＯＶＩＤ－１９に感染したコーホートの中で、３０人の別々の患者のうちの９人がＧＳＴ－Ｐｉの上昇を示した。これらの個人において、ＧＳＴ－Ｐｉの上昇は、発症からの時間、入院の長さまたは抗ＣＯＶＩＤ－１９抗体価（実験的なラテラルフロー試験で測定される）とのいかなる関連も示さなかった。

【0061】

[0068]明快さのために、典型的な態様の慣例的な特徴のすべてが、本明細書において開示されるというわけではない。本開示のいかなる実際の実装の進歩において、多数の実装に特有の決定が特定の目的を達成するためになされなければならず、それは異なる実装のために変化することが理解されよう。この種の試みは、複雑で時間がかかるかもしれないが、それにもかかわらず、この開示の利益を有する当業者には慣例的な仕事になることは理解されよう。

【0062】

[0069]さらに、本明細書において使用される語法または用語は、説明の目的のためのものであって、限定の目的でないことを理解すべきであり、本明細書の用語または語法は、発明時に当業者が利用できる知識と結合して、本明細書において示された教示およびガイダンスを考慮して解釈される。その上、明細書それ自体に明確に記載されない限り、明細書または請求項のいかなる用語も普通ではないまたは特別な意味と見なされることを意図しない。

【0063】

[0070]本明細書において開示される種々の態様は、実例として本明細書において参照される既知の構造および機能要素に、現在および将来の既知の均等物を包含する。その上、態様および応用例が示されて記述されているが、前述されているより多くの変形が本明細書において開示される発明の概念を逸脱しない範囲で可能であるということは、この開示の利益を有する当業者にとっては明らかである。例えば、本明細書において開示された典型的な態様のいずれかからの個々の特徴が組み合わせられて、本明細書において開示される発明の概念に従う追加の態様が生じることを、当業者は直ちに理解されよう。

【0064】

[0071]移行句「含む」、「から本質的になる」、「からなる」は、最初および補正された書式において、添付の請求の範囲で使われるときは、列挙されない追加の請求項の要素またはステップが、もしあれば、請求項の範囲から除外されることに関して請求項範囲を定める。「含む」という用語は、包含的なことまたは制限がないことを意味しており、いかなる追加の、非列挙の要素、方法、ステップまたは材料を除外しない。「からなる」という用語は、請求項で特定された以外のいかなる要素、ステップまたは材料を除外し、後者の例としては、特定された材料と通常関連する不純物を排除する。「から本質的になる」という用語は、特定された要素、ステップまたは材料、および請求された発明の基本的で新規な特性に物質的に影響を及ぼさないものに、請求項の範囲を制限する。本明細書において記載され、本発明の態様を具体化する、すべての組成物、装置、方法およびキットは、別の実施形態で、移行句「含む」、「から本質的になる」および「からなる」いずれかによって、より詳しく定義されることができる。このように、本開示における移行句「含む」へのすべての参照は、列挙された同じ要素「からなる」または「から基本的になる」他の態様も考慮すると、理解される。

【0065】

[0072]実例となる典型的な態様を示して記載したが、広範囲にわたる変形、変化および置換は以前の開示において考察されおり、いくつかの例で、実施形態のいくつかの特徴は他の特徴の使用に対応することなく使用される。その結果、添付の請求の範囲が広く解釈されて、本明細書において開示された実施形態の範囲と一致することは、適切である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【配列表】

2023513371000001.app

【国際調査報告】