(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-30
(54)【発明の名称】ＣＬＤＮ１８．２抗体及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230323BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230323BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230323BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230323BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20230323BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230323BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230323BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230323BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230323BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20230323BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230323BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230323BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20230323BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C07K19/00
C07K16/28
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
A61P35/00
A61K39/395 N
G01N33/574 A
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022573794
(86)(22)【出願日】2021-02-10
(85)【翻訳文提出日】2022-10-07
(86)【国際出願番号】 CN2021076481
(87)【国際公開番号】W WO2021160154
(87)【国際公開日】2021-08-19
(31)【優先権主張番号】202010084476.3
(32)【優先日】2020-02-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522318966
【氏名又は名称】上海詩健生物科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＥＳＣＵＧＥＮ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．，ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ７１０，Ｎｏ．７８１ Ｃａｉｌｕｎ Ｒｄ，Ｃｈｉｎａ（Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｐｉｌｏｔ Ｆｒｅｅ Ｔｒａｄｅ Ｚｏｎｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１２０３，ＣＨＩＮＡ
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100151301
【弁理士】
【氏名又は名称】戸崎 富哉
(74)【代理人】
【識別番号】100152308
【弁理士】
【氏名又は名称】中 正道
(74)【代理人】
【識別番号】100201558
【弁理士】
【氏名又は名称】亀井 恵二郎
(72)【発明者】
【氏名】周清
(72)【発明者】
【氏名】許伝営
(72)【発明者】
【氏名】粘偉紅
(72)【発明者】
【氏名】何向宇
(72)【発明者】
【氏名】張新敏
(72)【発明者】
【氏名】鄭欣桐
(72)【発明者】
【氏名】何峰
(72)【発明者】
【氏名】肖▲靖▼
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA91X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4C085AA14
4C085AA19
4C085CC23
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
本発明はクローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）の抗体、及び胃癌、膵臓癌、食道癌の診断・治療におけるその使用を提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＬＤＮ１８．２抗体であって、重鎖ＣＤＲｓと軽鎖ＣＤＲｓとを含み、前記重鎖ＣＤＲｓは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＣＤＲ３を含むか、又は
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されるＣＤＲ３を含み、
前記軽鎖ＣＤＲｓは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるＣＤＲ３を含むか、又は
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるＣＤＲ３を含む、ＣＬＤＮ１８．２抗体。
【請求項2】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示される重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項3】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示される軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項4】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示される重鎖可変領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示される軽鎖可変領域とを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項5】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示される重鎖可変領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示される軽鎖可変領域とを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項6】
キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体である、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項7】
全長抗体である、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項8】
ＩｇＧ抗体である、請求項７に記載の抗体。
【請求項9】
ＣＬＤＮ１８．２に結合する抗体断片である、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項10】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ又は（Ｆａｂ’）２である、請求項９に記載の抗体。
【請求項11】
多重特異性抗体又は二重特異性抗体である、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項12】
前記多重特異性抗体又は二重特異性抗体は第２生物分子に結合する結合ドメインを含み、前記第２生物分子は細胞表面抗原である、請求項１１に記載の抗体。
【請求項13】
前記細胞表面抗原は腫瘍抗原である、請求項１２に記載の抗体。
【請求項14】
前記腫瘍抗原は、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＦｃＲＨ５、ＨＥＲ２、ＬＹＰＤ１、ＬＹ６Ｇ６Ｄ、ＰＭＥＬ１７、ＬＹ６Ｅ、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＥＤＡＲ、ＧＦＲＡ１、ＭＲＰ４、ＲＥＴ、Ｓｔｅａｐ１、及びＴｅｎＢ２から選択される、請求項１３に記載の抗体。
【請求項15】
請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体に連結される治療剤、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）受容体アゴニスト、サイトカイン、放射性核種又は酵素を含む、免疫複合体。
【請求項16】
前記治療剤は化学療法薬である、請求項１５に記載の免疫複合体。
【請求項17】
前記治療剤は細胞傷害性剤である、請求項１５に記載の免疫複合体。
【請求項18】
請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片を含む融合タンパク質又はポリペプチド。
【請求項19】
請求項１～１４のいずれか１項に記載の抗体、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の免疫複合体、請求項１８に記載の融合タンパク質又はポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項20】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１８～２９のうちの１つのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項21】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：３６～３９のうちの１つのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項２０に記載の核酸。
【請求項22】
請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項２１に記載の核酸。
【請求項23】
請求項２０～２２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド配列を含む、ベクター。
【請求項24】
請求項２０～２２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド配列又は請求項２３に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項25】
請求項２４に記載の宿主細胞を培養して培養物から前記抗体を単離することを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体の製造方法。
【請求項26】
請求項１～１４のいずれか１項に記載の抗体、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の免疫複合体、請求項１８に記載の融合タンパク質又はポリペプチドを含む医薬組成物の、癌を診断するための試薬の製造における使用。
【請求項27】
請求項１～１４のいずれか１項に記載の抗体、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の免疫複合体、請求項１８に記載の融合タンパク質又はポリペプチドを含む医薬組成物の、癌治療薬の製造における使用。
【請求項28】
前記癌は胃癌、膵臓癌又は食道癌である、請求項２６又は２７に記載の使用。
【請求項29】
請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む癌検出試薬。
【請求項30】
前記抗体又はその抗原結合断片は化学的に標識されたものである、請求項２９に記載の癌検出試薬。
【請求項31】
前記標識は酵素標識、蛍光標識、同位体標識又は化学発光物標識である、請求項３０に記載の癌検出試薬。
【請求項32】
請求項２９～３１のいずれか１項に記載の癌検出試薬を含む癌診断キット。
【請求項33】
前記癌は胃癌、膵臓癌又は食道癌である、請求項３２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は抗体の技術分野に関し、また、該抗体の使用及び製造方法に関する。具体的には、ＣＬＤＮ１８．２抗体及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
クローディン（Ｃｌａｕｄｉｎ）は分子量２０～３０ｋＤａの膜貫通タンパク質であり、そのファミリーには計２４個のメンバーが含まれており、多くの組織で発現し、細胞間密着結合（ＴＪ：Ｔｉｇｈｔ Ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ）構造を形成するための重要な分子である。上皮細胞又は内皮細胞は細胞表面で発現する密着結合分子（Ｃｌａｕｄｉｎ分子を含む）を介して高度に規則的な組織の結合、即ち細胞間密着結合を形成し、上皮細胞ギャップでの分子の移動を制御する。ＴＪは正常な生理条件下での上皮細胞又は内皮細胞の恒常性や、細胞極性を維持するのに重要な役割を果たす。その中でも、注目を集めているのはクローディン１８（Ｃｌａｕｄｉｎ１８、ＣＬＤＮ１８）であり、ＣＬＤＮ１８スプライス変異体１（Ｃｌａｕｄｉｎ１８．１、ＣＬＤＮ１８．１）とＣＬＤＮ１８スプライス変異体２（Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、ＣＬＤＮ１８．２）というスプライスによる２種類の変異体がある。
【0003】
これらのうち、ＣＬＤＮ１８．２（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１００２０２６、ＮＰ＿００１００２０２６）は分子量２７．８ｋＤａの膜貫通タンパク質であり、タンパク質のＮ末端及びＣ末端のいずれも細胞内にある。該タンパク質の主なコンフォメーションには４個の膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）と２個の細胞外ループ（ＥＣＬ）が含まれる。ＣＬＤＮ１８．２は複数種の哺乳類で高度に保存的であり、全長として２６１個のアミノ酸を含み、１～６位アミノ酸がＮ末端細胞内領域であり、７～２７位アミノ酸が膜貫通領域１（ＴＭＤ１）であり、２８～７８位アミノ酸が細胞外ループ１（ＥＣＬ１）であり、７９～９９位アミノ酸が膜貫通領域２（ＴＭＤ２）であり、１２３～１４４位アミノ酸が膜貫通領域３（ＴＭＤ３）であり、１００～１２２位アミノ酸がＴＭＤ２とＴＭＤ３を連結する細胞内領域であり、１４５～１６７位アミノ酸が細胞外ループ２（ＥＣＬ２）であり、１６８～１９０位アミノ酸が膜貫通領域４（ＴＭＤ４）であり、１９１～２６１位アミノ酸がＣ末端細胞内領域である。第１１６位のアスパラギンに１つの典型的なＮグリコシル化モチーフが存在する。
【0004】
ＣＬＤＮ１８．１は、ＣＬＤＮ１８．２に比べて、タンパク質のＮ末端－膜貫通領域１－細胞外ループ１という領域内のＮ末端の最初２６個のアミノ酸配列に違いが存在し、残りの配列が同じである。
【0005】
多くの証拠より明らかなように、胃、膵臓、食道などの組織の腫瘍細胞、特に腺癌サブタイプ腫瘍細胞においては、ＣＬＤＮ１８．２は高発現している。正常な組織においては、ＣＬＤＮ１８．１は肺及び胃組織の上皮細胞で選択的に発現し、ＣＬＤＮ１８．２は寿命の短い胃腺状上皮粘膜組織（分化済みの腺上皮細胞）でのみ発現し、胃の上皮幹細胞で発現せず、分化済みの腺上皮細胞は胃の上皮幹細胞により絶えずに補充される。これらの分子の発現特性は抗体に基づくＣＬＤＮ１８．２関連癌の治療のための潜在的な可能性を提供する。
【0006】
コンパニオン診断（ＣＤｘ：Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）方法によって臨床試験や臨床応用でＣＬＤＮ１８．２が高発現した腫瘍患者を選択することは、ＣＬＤＮ１８．２ターゲットを標的化した抗腫瘍薬の適応患者を指導することによって重要な指導意義がある。臨床では腫瘍特異的抗原に対する診断において、患者腫瘍標本が通常固定化されたパラフィン包埋（ＦＦＰＥ：Ｆｏｒｍａｌｉｎ Ｆｉｘｅｄ Ｐａｒａｆｆｉｎ Ｅｍｂｅｄｄｅｄ）組織であり、ＦＦＰＥ処理において腫瘍特異的抗原の天然コンフォメーションが変わり、後の抗原回復において天然コンフォメーションと異なる特殊なエピトープ露出(Biotech Histochem, 2009, 84(5):207-215)が生じるので、通常、腫瘍ＦＦＰＥ組織で癌特異的抗原に特異的に結合し得る抗体をスクリーニングして診断に用いる。
【0007】
本発明は、腫瘍及びそのＦＦＰＥ組織でＣＬＤＮ１８．２抗原を特異的に識別する抗体の製造方法、スクリーニング、配列及び使用に関する。
【発明の概要】
【0008】
本発明は、固定化された組織サンプル中のＣＬＤＮ１８．２抗原分子を識別することで胃癌、膵臓癌又は食道癌等を含む癌病変を診断することができる癌診断用のＣＬＤＮ１８．２抗体を提供する。また、本発明で提供されるＣＬＤＮ１８．２抗体は胃癌、膵臓癌又は食道癌などを含む癌病変を効果的に治療できる。具体的には、本願は、以下に関する。
【0009】
１． ＣＬＤＮ１８．２抗体であって、重鎖ＣＤＲｓと軽鎖ＣＤＲｓとを含み、
前記重鎖ＣＤＲｓは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＣＤＲ３を含むか、又は
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されるＣＤＲ３を含み、
前記軽鎖ＣＤＲｓは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるＣＤＲ３を含むか、又は
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるＣＤＲ３を含むＣＬＤＮ１８．２抗体。
２． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示される重鎖可変領域を含む、項１に記載の抗体。
３． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示される軽鎖可変領域を含む項１に記載の抗体。
４． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示される重鎖可変領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示される軽鎖可変領域とを含む、項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
５． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示される重鎖可変領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示される軽鎖可変領域とを含む、項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
６． キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体である、項１～５のいずれか１項に記載の抗体。
７． 全長抗体である、項１～６のいずれか１項に記載の抗体。
８． ＩｇＧ抗体である、項７に記載の抗体。
９． ＣＬＤＮ１８．２に結合する抗体断片である、項１～６のいずれか１項に記載の抗体。
１０． Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ又は（Ｆａｂ’）２である、項９に記載の抗体。
１１． 多重特異性抗体又は二重特異性抗体である、項１～８のいずれか１項に記載の抗体。
１２． 前記多重特異性抗体又は二重特異性抗体は第２生物分子に結合する結合ドメインを含み、前記第２生物分子は細胞表面抗原である、項１１に記載の抗体。
１３． 前記細胞表面抗原は腫瘍抗原である、項１２に記載の抗体。
１４． 記腫瘍抗原は、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＦｃＲＨ５、ＨＥＲ２、ＬＹＰＤ１、ＬＹ６Ｇ６Ｄ、ＰＭＥＬ１７、ＬＹ６Ｅ、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＥＤＡＲ、ＧＦＲＡ１、ＭＲＰ４、ＲＥＴ、Ｓｔｅａｐ１、及びＴｅｎＢ２から選択される、項１３に記載の抗体。
１５． 項１～１０のいずれか１項に記載の抗体に連結される治療剤、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）受容体アゴニスト、サイトカイン、放射性核種又は酵素を含む、免疫複合体。
１６． 前記治療剤は化学療法薬である、項１５に記載の免疫複合体。
１７． 前記治療剤は細胞傷害性剤（細胞毒性剤）である、項１５に記載の免疫複合体。
１８． 項１～１０のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片を含む融合タンパク質又はポリペプチド。
１９． 項１～１４のいずれか１項に記載の抗体、項１５～１７のいずれか１項に記載の免疫複合体、項１８に記載の融合タンパク質又はポリペプチドを含む医薬組成物。
２０． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１８～２９のうちの１つのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
２１． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：３６～３９のうちの１つのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む項２０に記載の核酸。
２２． 項１～１０のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む項２１に記載の核酸。
２３． 項２０～２２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター。
２４． 項２０～２２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド配列又は項２３に記載のベクターを含む宿主細胞。
２５． 項２４に記載の宿主細胞を培養して培養物から前記抗体を単離することを含む、項１～１０のいずれか１項に記載の抗体の製造方法。
２６． 項１～１４のいずれか１項に記載の抗体、項１５～１７のいずれか１項に記載の免疫複合体、項１８に記載の融合タンパク質又はポリペプチドを含む医薬組成物の、癌を診断するための試薬の製造における使用。
２７． 項１～１４のいずれか１項に記載の抗体、項１５～１７のいずれか１項に記載の免疫複合体、項１８に記載の融合タンパク質又はポリペプチドを含む医薬組成物の、癌治療薬の製造における使用。
２８． 前記癌は胃癌、膵臓癌又は食道癌である、項２６又は２７に記載の使用。
２９． 項１～１０のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む癌検出試薬。
３０． 前記抗体又はその抗原結合断片は化学的に標識されたものである、項２９に記載の癌検出試薬。
３１． 前記標識は酵素標識、蛍光標識、同位体標識又は化学発光物標識である、項３０に記載の癌検出試薬。
３２． 項２９～３１のいずれか１項に記載の癌検出試薬を含む癌診断キット。
３３． 前記癌は胃癌、膵臓癌又は食道癌である、項３２に記載のキット。
３４． 項１～１４のいずれか１項に記載の抗体、項１８に記載の融合タンパク質又はポリペプチド又は項２９～３１のいずれか１項に記載の検出試薬を被検者由来の組織サンプルと接触させることを含む、被検者の癌診断方法。
３５． 前記組織サンプルは被検者の体液（例えば血液、尿）及び組織切片（例えば組織生検サンプル）である、項３４に記載の診断方法。
３６． 前記癌は胃癌、膵臓癌及び食道癌から選択される、項３４又は３５に記載の診断方法。
３７． 治療有効量の項１～１４のいずれか１項に記載の抗体、項１５～１７のいずれか１項に記載の免疫複合体、項１８に記載の融合タンパク質又はポリペプチド、又は項１９に記載の医薬組成物を被検者に投与することを含む被検者の癌の治療方法。
３８． 前記癌は胃癌、膵臓癌及び食道癌から選択される、項３７に記載の治療方法。
前記重鎖ＣＤＲｓは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＣＤＲ３を含むか、又は
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されるＣＤＲ３を含み、
前記軽鎖ＣＤＲｓは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるＣＤＲ３を含むか、又は
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるＣＤＲ３を含むＣＬＤＮ１８．２抗体。
２． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示される重鎖可変領域を含む、項１に記載の抗体。
３． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示される軽鎖可変領域を含む項１に記載の抗体。
４． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示される重鎖可変領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示される軽鎖可変領域とを含む、項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
５． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示される重鎖可変領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示される軽鎖可変領域とを含む、項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
６． キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体である、項１～５のいずれか１項に記載の抗体。
７． 全長抗体である、項１～６のいずれか１項に記載の抗体。
８． ＩｇＧ抗体である、項７に記載の抗体。
９． ＣＬＤＮ１８．２に結合する抗体断片である、項１～６のいずれか１項に記載の抗体。
１０． Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ又は（Ｆａｂ’）２である、項９に記載の抗体。
１１． 多重特異性抗体又は二重特異性抗体である、項１～８のいずれか１項に記載の抗体。
１２． 前記多重特異性抗体又は二重特異性抗体は第２生物分子に結合する結合ドメインを含み、前記第２生物分子は細胞表面抗原である、項１１に記載の抗体。
１３． 前記細胞表面抗原は腫瘍抗原である、項１２に記載の抗体。
１４． 記腫瘍抗原は、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＦｃＲＨ５、ＨＥＲ２、ＬＹＰＤ１、ＬＹ６Ｇ６Ｄ、ＰＭＥＬ１７、ＬＹ６Ｅ、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＥＤＡＲ、ＧＦＲＡ１、ＭＲＰ４、ＲＥＴ、Ｓｔｅａｐ１、及びＴｅｎＢ２から選択される、項１３に記載の抗体。
１５． 項１～１０のいずれか１項に記載の抗体に連結される治療剤、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）受容体アゴニスト、サイトカイン、放射性核種又は酵素を含む、免疫複合体。
１６． 前記治療剤は化学療法薬である、項１５に記載の免疫複合体。
１７． 前記治療剤は細胞傷害性剤（細胞毒性剤）である、項１５に記載の免疫複合体。
１８． 項１～１０のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片を含む融合タンパク質又はポリペプチド。
１９． 項１～１４のいずれか１項に記載の抗体、項１５～１７のいずれか１項に記載の免疫複合体、項１８に記載の融合タンパク質又はポリペプチドを含む医薬組成物。
２０． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１８～２９のうちの１つのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
２１． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：３６～３９のうちの１つのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む項２０に記載の核酸。
２２． 項１～１０のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む項２１に記載の核酸。
２３． 項２０～２２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター。
２４． 項２０～２２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド配列又は項２３に記載のベクターを含む宿主細胞。
２５． 項２４に記載の宿主細胞を培養して培養物から前記抗体を単離することを含む、項１～１０のいずれか１項に記載の抗体の製造方法。
２６． 項１～１４のいずれか１項に記載の抗体、項１５～１７のいずれか１項に記載の免疫複合体、項１８に記載の融合タンパク質又はポリペプチドを含む医薬組成物の、癌を診断するための試薬の製造における使用。
２７． 項１～１４のいずれか１項に記載の抗体、項１５～１７のいずれか１項に記載の免疫複合体、項１８に記載の融合タンパク質又はポリペプチドを含む医薬組成物の、癌治療薬の製造における使用。
２８． 前記癌は胃癌、膵臓癌又は食道癌である、項２６又は２７に記載の使用。
２９． 項１～１０のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む癌検出試薬。
３０． 前記抗体又はその抗原結合断片は化学的に標識されたものである、項２９に記載の癌検出試薬。
３１． 前記標識は酵素標識、蛍光標識、同位体標識又は化学発光物標識である、項３０に記載の癌検出試薬。
３２． 項２９～３１のいずれか１項に記載の癌検出試薬を含む癌診断キット。
３３． 前記癌は胃癌、膵臓癌又は食道癌である、項３２に記載のキット。
３４． 項１～１４のいずれか１項に記載の抗体、項１８に記載の融合タンパク質又はポリペプチド又は項２９～３１のいずれか１項に記載の検出試薬を被検者由来の組織サンプルと接触させることを含む、被検者の癌診断方法。
３５． 前記組織サンプルは被検者の体液（例えば血液、尿）及び組織切片（例えば組織生検サンプル）である、項３４に記載の診断方法。
３６． 前記癌は胃癌、膵臓癌及び食道癌から選択される、項３４又は３５に記載の診断方法。
３７． 治療有効量の項１～１４のいずれか１項に記載の抗体、項１５～１７のいずれか１項に記載の免疫複合体、項１８に記載の融合タンパク質又はポリペプチド、又は項１９に記載の医薬組成物を被検者に投与することを含む被検者の癌の治療方法。
３８． 前記癌は胃癌、膵臓癌及び食道癌から選択される、項３７に記載の治療方法。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】ヒトｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥ（Ｔ－細胞エピトープペプチド）レトロウイルス発現プラスミドのＨＥＫ２９３－Ｔ細胞への一過性トランスフェクションである。
【図2】ｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥレンチウイルス粒子のマウス腫瘍細胞株へのトランスフェクションマウス及びフローサイトメトリーによるｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥを高レベルで発現させたマウス腫瘍細胞の選別である。
【図3】ｈＣＬＤＮ１８．２ 、ｈＣＬＤＮ１８．１及びｍＣＬＤＮ１８．２、ｍＣＬＤＮ１８．１を安定トランスフェクションした細胞株のフローサイトアッセイである。
【図4】陽性対照抗体４３Ａ１１、１７５Ｄ１０及び１６３Ｅ１２のＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出である。
【図5】確認スクリーニングにおける陽性ハイブリドーマクローン上清とＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞及びＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞との結合である。
【図6】検証スクリーニングにおける一部の陽性ハイブリドーマクローン上清の５個の細胞株におけるフローサイトメトリー分析である。
【図7】一部の陽性ハイブリドーマクローン上清のＡＤＣＣ効果である。
【図8】陽性対照抗体のＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２（Ａ）、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１（Ｂ）及びＨＥＫ２９３－ＷＴ（Ｃ） セルブロックのパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織切片におけるＩＨＣ染色である。
【図9】５－Ｉ５ハイブリドーマクローン上清及び陽性対照抗体の胃癌組織パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織切片におけるＩＨＣ発色である。
【図10】ハイブリドーマ単クローン上清によるＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞へのフローサイトメトリー分析である。
【図11】組換え精製５－Ｉ１０及び５－Ｇ１７マウスモノクローナル抗体の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動である。
【図12】組換え精製５－Ｉ１０及び５－Ｇ１７モノクローナル抗体のＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２におけるフローサイトメトリー分析である。
【図13】組換え精製マウス５－Ｉ１０及び５－Ｇ１７モノクローナル抗体の胃癌ＦＦＰＥ組織切片における陽性染色である。
【発明を実施するための形態】
【0011】
１．定義
本明細書に記載の用語「抗体」は広義に使用され、ＣＬＤＮ１８．２に結合する、本明細書で開示された１つ又は複数のＣＤＲドメインを含む各種の抗体構造分子を含み、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）及び抗体断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２）、線状抗体や一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）などを含むが、これらに限定されるものではなく、所望のＣＬＤＮ１８．２への結合活性を示すものであればよい。
本明細書に記載の用語「抗体」は広義に使用され、ＣＬＤＮ１８．２に結合する、本明細書で開示された１つ又は複数のＣＤＲドメインを含む各種の抗体構造分子を含み、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）及び抗体断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２）、線状抗体や一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）などを含むが、これらに限定されるものではなく、所望のＣＬＤＮ１８．２への結合活性を示すものであればよい。
【0012】
当業者であれば、本発明で開示される１つ又は複数のＣＤＲドメインを他のポリペプチド配列の１種又は複数種と融合し、ＣＬＤＮ１８．２分子に結合する機能性融合タンパク質又はポリペプチド分子、例えばワクチン、細胞膜受容体拮抗薬、シグナル経路調整剤やキメラ抗原受容体分子などを製造することができる。例えば、本発明で開示される１つ又は複数のＣＤＲドメインを用いてＣＬＤＮ１８．２ ＣＡＲ－Ｔ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、キメラ抗原受容体Ｔ細胞免疫療法）分子を製造してもよい。本発明で開示される配列に基づいて誘導、製造された融合タンパク質分子も本発明の特許範囲に含まれる。
【0013】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」における修飾語「モノクローナル」とは、該抗体が実質的に均質な抗体集団から得られるものであって、天然に存在する変異又はモノクローナル抗体の製造中に生じる変異が微量しか含まれていないものをいう。異なるエピトープに対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤の代表例に比べて、モノクローナル抗体製剤中の各モノクローナル抗体は抗原上の単一のエピトープに対するものである。本発明のモノクローナル抗体は複数種の技術で製造されてもよく、ハイブリドーマ方法、組換えＤＮＡ方法、ファージディスプレイ方法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含有する遺伝子改変動物を利用した方法が含まれるが、これらに限定されない。
【0014】
「全長抗体」、「完全抗体」という用語とは、天然抗体の構造とほぼ類似している構造を有する抗体を指し、これらの用語は本明細書では交換して利用可能である。
【0015】
抗体の「クラス」とは、その重鎖が有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの５つのクラスがあり、これらのうちのいくつかは、さらに、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２などのサブクラス（アイソタイプ）に分類されてもよい。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖の定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【0016】
「キメラ抗体」は１つの種に由来の少なくとも一部の重鎖可変領域と少なくとも一部の軽鎖可変領域、及び別の種に由来の少なくとも一部の定常領域を含む抗体である。例えば、一実施形態では、キメラ抗体はマウス可変領域とヒト定常領域を含んでもよい。
【0017】
「ヒト化」抗体とは、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基とヒトＦＲ由来のアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、通常２つのほぼ可変ドメイン全体を含み、ここで、全て又はほぼ全てのＨＶＲ（例えばＣＤＲ）は非ヒト抗体に対応するものであり、しかも、全て又はほぼ全てのＦＲはヒト抗体に対応するものである。任意により、ヒト化抗体は少なくともヒト抗体から誘導される抗体定常領域の一部を含んでもよい。抗体（例えば非ヒト抗体）の「ヒト化形態」とはヒト化を受けた抗体のことである。
【0018】
「ヒト共通フレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列から選ばれる最も一般的に存在しているアミノ酸残基を代表するフレームワークである。一般には、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列は可変ドメイン配列のサブグループから選択される。一般には、配列サブグループは、Kabatら,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,NIH Publication 91-3242,Bethesda MD (1991),第1-3巻に記載のサブグループである。一実施形態では、ＶＬの場合、前記サブグループはＫａｂａｔら（同上）によるサブグループκＩである。一実施形態では、ＶＨの場合、前記サブグループはＫａｂａｔら（同上）によるサブグループＩＩＩである。
【0019】
「人間抗体」は「ヒト抗体」、「完全ヒト化抗体」又は「完全ヒト抗体」とも呼ばれ、そのアミノ酸配列が人間又は人間細胞から生じたアミノ酸配列に対応する抗体である。この人間抗体の定義は非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特異的に排除する。人間抗体は本分野で公知のさまざまな技術で製造されてもよく、このような技術はファージディスプレイライブラリ技術、Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marksら,J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)。Coleら,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss,第77頁(1985);Boernerら,J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)の文献に記載されたような技術を含む。人間抗体は、抗原チャレンジに応答するように修飾されてこのような抗体を産生させるが、その内因性遺伝子座が能力を失った遺伝子改変動物（例えば免疫異種マウス）へ抗原を投与することにより製造されてもよい（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術については、例えば米国特許第６,０７５,１８１号及び第６,１５０,５８４号を参照）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により生成された人間抗体についても、例えばＬｉら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,103: 3557-3562 (2006)を参照する。
【0020】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」とは、抗体可変ドメインに配列超可変領域（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」とも呼ばれる）を有する、及び／又は構造が明確なループ（「超可変ループ」）を形成する、及び／又は抗原接触残基（「抗原接点」）を含有する各領域である。一般には、抗体は、６個のＨＶＲ（ＣＤＲ領域）を含み、これらのうち、３個（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）はＶＨにあり、３個（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）はＶＬにある。本明細書のＨＶＲ（ＣＤＲ領域）の例には、
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）及び９６～１０１（Ｈ３）に現れる超可変ループ(Chothia及びLesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917(1987))；
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）及び９５～１０２（Ｈ３）に現れるＨＶＲ（ＣＤＲ領域）(Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991))；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）及び９３～１０１（Ｈ３）に現れる抗原接点(MacCallumら, J. Mol. Biol. 262: 732-745(1996))；及び
（ｄ）ＨＶＲ（ＣＤＲ領域）アミノ酸残基４６～５６（Ｌ２）、４７～５６（Ｌ２）、４８～５６（Ｌ２）、４９～５６（Ｌ２）、２６～３５（Ｈ１）、２６～３５ｂ（Ｈ１）、４９～６５（Ｈ２）、９３～１０２（Ｈ３）及び９４～１０２（Ｈ３）を含む（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の組み合わせ、が含まれる。
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）及び９６～１０１（Ｈ３）に現れる超可変ループ(Chothia及びLesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917(1987))；
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）及び９５～１０２（Ｈ３）に現れるＨＶＲ（ＣＤＲ領域）(Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991))；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）及び９３～１０１（Ｈ３）に現れる抗原接点(MacCallumら, J. Mol. Biol. 262: 732-745(1996))；及び
（ｄ）ＨＶＲ（ＣＤＲ領域）アミノ酸残基４６～５６（Ｌ２）、４７～５６（Ｌ２）、４８～５６（Ｌ２）、４９～５６（Ｌ２）、２６～３５（Ｈ１）、２６～３５ｂ（Ｈ１）、４９～６５（Ｈ２）、９３～１０２（Ｈ３）及び９４～１０２（Ｈ３）を含む（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の組み合わせ、が含まれる。
【0021】
特に断らない限り、ＨＶＲ（ＣＤＲ領域）残基及び可変領域内の他の残基（例えばＦＲ残基）は、本明細書では、Ｋａｂａｔら（同上）に従って番号付けられる。
【0022】
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗体と抗原の結合に関連する抗体重鎖又は軽鎖ドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖（それぞれＶＨ及びＶＬ）の可変ドメインは一般には類似の構造を有し、各ドメインは４個の保存的フレームワーク領域（ＦＲ）及び３個の相補性決定領域（ＣＤＲ領域）を含む（例えばKindtら,Kuby Immunology,第6版参照）。単一のＶＨ又はＶＬドメインは抗原へ結合特異性を付与するのに十分である。
【0023】
「抗体断片」とは、完全抗体以外の、該完全抗体が結合する抗原を結合する完全抗体の一部を含む分子を指す。抗体断片の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；二機能性抗体；線状抗体；一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片で形成される多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0024】
本明細書で使用される用語「細胞傷害性剤」とは、細胞機能を抑制又は予防する、及び／又は細胞死亡又は破壊を引き起こす物質である。細胞傷害性剤は、放射性同位体（例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）；化学治療剤又は薬物（例えばメトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）；成長阻害剤；酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素；抗生物質；毒素、例えば細菌、真菌、植物又は動物由来の小分子毒素や酵素活性毒素、例えばその断片及び／又はバリアント；本分野で公知の各種の抗腫瘍薬又は抗癌剤を含むが、これらに限定されるものではない。
【0025】
「免疫複合体」は抗体と１つ又は複数の異種分子（を含むが、細胞傷害性剤に限定されるものではない）との複合体である。
【0026】
インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ：ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇｅｎｅｓ）受容体アゴニストは、ＳＴＩＮＧが依存するシグナル経路を活性化することでＩ型インターフェロンの分泌や抗ウイルス免疫及び抗腫瘍免疫に関連するタンパク質の発現を促進し、ウイルスコピーをブロックし、癌細胞への免疫反応を促進する分子である。このような分子は、例えば環状ジヌクレオチド類、アミノベンズイミダゾール類、キサントン類やアクリドン類、ベンゾチオフェン類及びベンゾジオキソール類などの構造タイプのＳＴＩＮＧアゴニストである。
【0027】
「被検者」又は「個体」は哺乳動物である。哺乳動物は、家畜化動物（例えばウシ、羊、猫、犬及び馬）、霊長類（例えばヒト及び非ヒト霊長類、例えばサル）、ウサギ及び齧歯類動物（例えばマウス及びラット）を含むが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、前記被検者又は個体は人間である。
【0028】
「プロトコール（添付文書）」という用語は、通常、治療製品の商業包装に含まれる取扱書を指し、この取扱書には、適応症、使用方法、用量、投与、併用療法、禁忌症及び／又はこのような治療製品の使用についての警告に関する情報を含む。
【0029】
「親和性」とは、分子（例えば抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有結合相互作用の全強度を指す。特に断らない限り、本明細書に使用される場合、「結合親和性」とは固有の結合親和性を指し、結合パートナーメンバー（例えば抗体と抗原）同士の１：１の相互作用を反映する。そのパートナーＹに対する分子Ｘの親和性は一般には解離定数（Ｋｄ）で表されてもよい。親和性は、本明細書に記載の方法など、本分野で公知の常法により測定されてもよい。結合親和性を測定するための説明的かつ例示的な特定の実施形態は以下で記載される。
【0030】
参照ポリペプチド配列の「アミノ酸配列の相同性百分率（％）」は、候補配列と参照ポリペプチド配列とをアラインメントし、必要に応じてギャップを導入して最大の配列相同性百分率を実現し、かついずれの保存的置換も配列相同性の一部と見なさない場合、候補配列と参照ポリペプチド配列における、アミノ酸残基が一致するアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列の相同性百分率は本分野における複数種の手段により決定されてもよく、例えば、相同性は例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ又は Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）などのソフトウェアを用いてアラインメントされてもよい。当業者は配列のアラインメントに適したパラメータを決定してもよく、比較対象の配列の全長に亘って最大アラインメントを行うのに必要な任意のアルゴリズムが含まれる。
【0031】
例えば、ＡＬＩＧＮ－２を用いてアミノ酸配列比較を行う場合、所定のアミノ酸配列Ａと所定のアミノ酸配列Ｂの、あるいは所定のアミノ酸配列Ｂに対するアミノ酸配列の相同性％は以下のように計算される。
１００×分数Ｘ／Ｙ
式中、ＸはＡとＢについてプログラムアラインメントを行うときに配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２によりマッチングしたと評価されたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢ中のアミノ酸残基総数である。理解できるものとして、アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、ＡとＢのアミノ酸配列の相同性％はＢとＡのアミノ酸配列の相同性％に等しくない。特に断らない限り、本明細書に使用される全てのアミノ酸配列の相同性％の値はＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムにより取得される。
１００×分数Ｘ／Ｙ
式中、ＸはＡとＢについてプログラムアラインメントを行うときに配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２によりマッチングしたと評価されたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢ中のアミノ酸残基総数である。理解できるものとして、アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、ＡとＢのアミノ酸配列の相同性％はＢとＡのアミノ酸配列の相同性％に等しくない。特に断らない限り、本明細書に使用される全てのアミノ酸配列の相同性％の値はＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムにより取得される。
【0032】
２．抗体、製造方法、組成物及び製品
１）抗体
本発明は抗ＣＬＤＮ１８．２抗体に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を提供し、以下の（ａ）～（ｆ）から選択される少なくとも１、２、３、４、５又は６個の超可変領域（ＨＶＲ）（又は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる。）を含有する結合ドメインを含む。（ａ）ＨＶＲ－Ｈ１であって、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１のアミノ酸配列又は該配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む；（ｂ） ＨＶＲ－Ｈ２であって、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸配列又は該配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む；（ｃ） ＨＶＲ－Ｈ３であって、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のアミノ酸配列又は該配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む；（ｄ） ＨＶＲ－Ｌ１であって、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７のアミノ酸配列又は該配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む；（ｅ） ＨＶＲ－Ｌ２であって、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８のアミノ酸配列又は該配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む；及び（ｆ） ＨＶＲ－Ｌ３であって、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９のアミノ酸配列又は該配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同性のアミノ酸配列を含む。いくつかの場合、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体が有する重鎖可変（ＶＨ）ドメイン（領域）は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７と少なくとも９０％の配列相同性（例えば少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％配列相同性）を有するアミノ酸配列、又は配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７のアミノ酸配列を含み、及び／又はその軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン（領域）は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９と少なくとも９０％の配列相同性（例えば少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性）を有するアミノ酸配列、又は配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９のアミノ酸配列を含んでもよい。
１）抗体
本発明は抗ＣＬＤＮ１８．２抗体に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を提供し、以下の（ａ）～（ｆ）から選択される少なくとも１、２、３、４、５又は６個の超可変領域（ＨＶＲ）（又は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる。）を含有する結合ドメインを含む。（ａ）ＨＶＲ－Ｈ１であって、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１のアミノ酸配列又は該配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む；（ｂ） ＨＶＲ－Ｈ２であって、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸配列又は該配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む；（ｃ） ＨＶＲ－Ｈ３であって、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のアミノ酸配列又は該配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む；（ｄ） ＨＶＲ－Ｌ１であって、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７のアミノ酸配列又は該配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む；（ｅ） ＨＶＲ－Ｌ２であって、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８のアミノ酸配列又は該配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む；及び（ｆ） ＨＶＲ－Ｌ３であって、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９のアミノ酸配列又は該配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同性のアミノ酸配列を含む。いくつかの場合、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体が有する重鎖可変（ＶＨ）ドメイン（領域）は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７と少なくとも９０％の配列相同性（例えば少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％配列相同性）を有するアミノ酸配列、又は配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７のアミノ酸配列を含み、及び／又はその軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン（領域）は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９と少なくとも９０％の配列相同性（例えば少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性）を有するアミノ酸配列、又は配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９のアミノ酸配列を含んでもよい。
【0033】
いくつかの実施形態では、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、重鎖可変領域は下記アミノ酸配列を含む。
【0034】
２）抗体断片
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は抗体断片である。抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ及びｓｃＦｖ断片、並びに下記した他の断片を含むが、これらに限定されるものではない。いくつかの抗体断片の概要に関しては、Hudsonら,Nat. Med. 9: 129-134(２００３）を参照する。ｓｃＦｖ断片に関しては、例えばＷＯ ９３／１６１８５を参照する。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は抗体断片である。抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ及びｓｃＦｖ断片、並びに下記した他の断片を含むが、これらに限定されるものではない。いくつかの抗体断片の概要に関しては、Hudsonら,Nat. Med. 9: 129-134(２００３）を参照する。ｓｃＦｖ断片に関しては、例えばＷＯ ９３／１６１８５を参照する。
【0035】
二機能性抗体は２つの抗原結合部位を有する抗体断片であり、二価又は二重特異性であり得る。例えばＥＰ ４０４,０９７；ＷＯ１９９３／０１１６１を参照する。三機能性抗体及び四機能性抗体は例えばHudsonら,Nat. Med. 9: 129-134(2003)を参照する。
【0036】
シングルドメイン抗体は、抗体の全て又は一部の重鎖可変領域あるいは全て又は一部の軽鎖可変領域を含む抗体断片である。いくつかの実施形態では、シングルドメイン抗体はヒトシングルドメイン抗体（例えば米国特許６,２４８,５１６ Ｂ１参照）である。
【0037】
抗体断片はさまざまな技術により産生されてもよく、完全抗体のタンパク質水解消化及び組換え宿主細胞（例えば大腸菌又はファージ）による産生を含むが、これらに限定されるものではない。
【0038】
３）キメラ抗体及びヒト化抗体
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体はキメラ抗体である。キメラ抗体の製造は例えば米国特許４,８１６,５６７を参照してもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体はキメラ抗体である。キメラ抗体の製造は例えば米国特許４,８１６,５６７を参照してもよい。
【0039】
いくつかの実施形態では、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的に、非ヒト抗体はヒト化されることで人間への免疫原性を低下させるとともに、親非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持する。一般には、ヒト化抗体は１つ又は複数の可変領域を含み、これらのうち、ＨＶＲ（ＣＤＲ）領域の全て又は一部が非ヒト抗体に由来し、そして、ＦＲ（又はその一部） が人間抗体配列に由来する。ヒト化抗体は任意により人間の定常領域の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態では、非ヒト抗体由来の対応する残基でヒト化抗体のいくつかのＦＲ残基を置換することにより、抗体の親和性を回復又は改善することができる。
【0040】
ヒト化抗体及びその製造方法は、米国特許第５,８２１,３３７号、第７,５２７,７９１号、第６,９８２,３２１号及び第７,０８７,４０９号を参照してもよい。
【0041】
４）人間抗体
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は人間抗体である。人間抗体は本分野で公知のさまざまな技術で生産されてもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は人間抗体である。人間抗体は本分野で公知のさまざまな技術で生産されてもよい。
【0042】
人間抗体としては、修飾された遺伝子改変動物に免疫原を投与した後、抗原チャレンジにより、完全な人間抗体又はヒト可変領域を有する完全抗体を製造する。このような動物は、典型的に、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、染色体外に存在するか、又は動物の染色体にランダムに組み込まれるヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含有する。このような遺伝子改変マウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は一般には不活性化される。遺伝子改変動物から人間抗体を取得する方法に関しては、例えば米国特許第６,０７５,１８１号及び第６,１５０,５８４号（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術が記載された）；米国特許第５,７７０,４２９号；米国特許第７,０４１,８７０号（Ｋ－Ｍ技術が記載された）；及び米国出願公開第ＵＳ ２００７／００６１９００号を参照する。このような動物からの完全抗体から得られるヒト可変領域はさらに修飾されて、例えば異なるヒト定常領域と組み合わせられてもよい。
【0043】
人間抗体はハイブリドーマに基づく方法によって製造されてもよい。ヒトモノクローナル抗体を産生するヒト骨髄腫及びマウス－ヒトハイブリッド骨髄腫細胞株が報告されており、例えばBoernerら,J. Immunol., 147: 86(1991)を参照する。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により産生された人間抗体もLiら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 3557-3562(2006)に記載されている。他の方法は、例えば米国特許第７,１８９,８２６号（ハイブリドーマ細胞株からモノクローナルヒトＩｇＭ抗体を産生することが記載される）及びNi,Xiandai Mianyixue, 26(4): 265-268(2006)（ヒト－ヒトハイブリドーマが記載される）に記載の方法を含む。
【0044】
人間抗体は、ヒト由来のファージディスプレイライブラリから選択されるＦｖクローン可変領域配列を単離することにより製造されてもよい。次に、このような可変領域配列と所望のヒト定常ドメインとを組み合わせてもよい。
【0045】
具体的には、高親和性を有する本発明の抗体は、ＣＬＤＮ１８．２結合活性を有する抗体に対してコンビナトリアルライブラリをスクリーニングして単離されてもよい。例えば、ファージディスプレイライブラリを産生し、および所望の結合特徴を有する抗体に対してこのようなライブラリをスクリーニングする複数種類の方法が本分野で知られている。このような方法は、例えばHoogenboomら,Methods in Molecular Biology 178: 1-37(O’Brien ら編,Human Press, Totowa,NJ,2001),Marks及びBradbury,Methods in Molecular Biology 248: 161-175 (Lo編,Human Press, Totowa, NJ, 2003)及びLeeら,J. Immunol. Methods 284(1-2) :119-132 (2004)を参照することができる。
【0046】
いくつかのファージディスプレイ方法では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＶＨ及びＶＬ遺伝子系統を単独でクローニングし、ファージライブラリにランダムに組換え、次に、抗原－結合ファージに対してスクリーニングを行う。典型的に、ファージは抗体断片を一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片又はＦａｂ断片として提示する。ヒト抗体ファージライブラリを記載する特許には、例えば、米国特許第５,７５０,３７３号及び米国特許公開第２００５／００７９５７４号、第２００５／０１１９４５５号、第２００５／０２６６０００号、第２００７／０１１７１２６号、第２００７／０１６０５９８号、第２００７／０２３７７６４号、第２００７／０２９２９３６号及び第２００９／０００２３６０号が含まれる。
【0047】
本明細書では、ヒト抗体ライブラリから単離された抗体又は抗体断片は人間抗体又は人間抗体断片とみなされる。
【0048】
５）多重特異性抗体
上記のいずれかの態様では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、一方の結合特異性はＣＬＤＮ１８．２に対するものであり、他方の結合特異性は他の任意の抗原（例えば第２生物分子、例えば細胞表面抗原、例えば腫瘍抗原）に対する。相応的に、二重特異性抗ＣＬＤＮ１８．２抗体はＣＬＤＮ１８．２及び腫瘍抗原、例えばＣＤ３、ＣＤ２０、ＦｃＲＨ５、ＨＥＲ２、ＬＹＰＤ１、ＬＹ６Ｇ６Ｄ、ＰＭＥＬ１７、ＬＹ６Ｅ、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＥＤＡＲ、ＧＦＲＡ１、ＭＲＰ４、ＲＥＴ、Ｓｔｅａｐ１又はＴｅｎＢ２に対して結合特異性を有してもよい。二重特異性抗体は全長抗体又は抗体断片として製造されてもよい。
上記のいずれかの態様では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、一方の結合特異性はＣＬＤＮ１８．２に対するものであり、他方の結合特異性は他の任意の抗原（例えば第２生物分子、例えば細胞表面抗原、例えば腫瘍抗原）に対する。相応的に、二重特異性抗ＣＬＤＮ１８．２抗体はＣＬＤＮ１８．２及び腫瘍抗原、例えばＣＤ３、ＣＤ２０、ＦｃＲＨ５、ＨＥＲ２、ＬＹＰＤ１、ＬＹ６Ｇ６Ｄ、ＰＭＥＬ１７、ＬＹ６Ｅ、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＥＤＡＲ、ＧＦＲＡ１、ＭＲＰ４、ＲＥＴ、Ｓｔｅａｐ１又はＴｅｎＢ２に対して結合特異性を有してもよい。二重特異性抗体は全長抗体又は抗体断片として製造されてもよい。
【0049】
多重特異性抗体を製造する技術は、特異性の異なる２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖ペアの組換え共発現を含むが、これらに限定されるものではなく、ＷＯ ９３／ ０８８２９、ＷＯ２００９／０８０２５及びＷＯ ２００９／０８９００４Ａ１等を参照してもよい。
【0050】
６）抗体バリアント
本発明の抗体は、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のアミノ酸配列バリアントを含む。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的性質をさらに改善するために製造された抗体バリアントである。抗体のアミノ酸配列バリアントは、該抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することにより製造されてもよい。このような修飾は、例えば抗体アミノ酸配列中の残基の欠如及び／又は挿入及び／又は置換を含む。欠如、挿入及び置換を任意に組み合わせて最終的な構築体を得て、その条件としては、最終的な構築体は所望の特徴、例えばＣＬＤＮ１８．２抗原との結合特性を有する。
本発明の抗体は、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のアミノ酸配列バリアントを含む。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的性質をさらに改善するために製造された抗体バリアントである。抗体のアミノ酸配列バリアントは、該抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することにより製造されてもよい。このような修飾は、例えば抗体アミノ酸配列中の残基の欠如及び／又は挿入及び／又は置換を含む。欠如、挿入及び置換を任意に組み合わせて最終的な構築体を得て、その条件としては、最終的な構築体は所望の特徴、例えばＣＬＤＮ１８．２抗原との結合特性を有する。
【0051】
いくつかの実施形態では、１つ又は複数のアミノ酸置換を有する抗体バリアントを提供する。ＨＶＲ（ＣＤＲ）領域及び／又はＦＲ領域の１つ又は複数の部位で置換して置換型変異体（保存的置換変異体又は非保存的置換変異体を含む）を取得してもよい。
アミノ酸は共通の側鎖の性質によって群分けされてもよい。
（１）疎水性：ｎ－ロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
アミノ酸は共通の側鎖の性質によって群分けされてもよい。
（１）疎水性：ｎ－ロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【0052】
保存的置換は同一群のアミノ酸同士の置換として定義され、非保存的置換は異なるクラス（群）のうち1種のアミノ酸が別の群のアミノ酸で置換されるものとして定義される。アミノ酸置換を本発明の抗体に導入し、所望の活性（例えば抗原結合の保持／改善又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの改善）に基づいて産物をスクリーニングすることにより、本発明の抗体バリアントを得ることができる。
【0053】
本発明は、本発明で開示される抗体から得られた非保存的突然変異及び／又は保存的突然変異を含有する抗体バリアントを含み、該バリアントは所望のＣＬＤＮ１８．２結合活性を有していればよい。
【0054】
１種の置換型バリアントは、親抗体（例えばヒト化抗体又は人間抗体）の１つ又は複数の超可変領域残基を置換した抗体バリアントに関する。一般には、さらなる研究用のために選択されるバリアントは、一部の生物学的性質（例えば親和性向上）が親抗体に対して、修飾（例えば改善）される、及び／又は親本抗体のいくつかの生物学的性質が実質的に保持される。例示的な置換型バリアントは親和性成熟抗体であり、例えばファージディスプレイに基づく親和性成熟技術（例えば本明細書に記載のもの）によって容易に産生され得る。簡単に言えば、１つ又は複数のＨＶＲ（ＣＤＲ）残基を変異させ、この変異された抗体をファージにディスプレイし、特定の生物学的活性（例えば結合親和性）に基づいて変異された抗体をスクリーニングする。
【0055】
いくつかの実施形態では、１つ又は複数のＨＶＲ（ＣＤＲ）においては置換、挿入又は欠如が発生してもよく、このような変化により抗体のＣＬＤＮ１８．２結合能力が実質的に減弱しなければよい。例えば、ＨＶＲ（ＣＤＲ）において結合親和性を実質的に低下させない保存的変化が起こってもよい。例えば、このような変化としては、ＨＶＲの抗原接触残基以外、例えばＦＲ領域の１個、２個、３個、４個、５個のアミノ酸残基で保存的又は非保存的アミノ酸置換が発生してもよい。
【0056】
７）組換え方法
本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、例えば、米国特許第４,８１６,５６７号に記載のとおり、組換え方法によって製造されてもよい。一実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体をコードする単離された核酸が提供されている。このような核酸は、抗体のＶＬアミノ酸配列及び／又はＶＨのアミノ酸配列をコードし得る。別の実施形態では、このような核酸を含む１種又は複数種ベクター（例えば発現ベクター）が提供されている。別の実施形態では、このような核酸を含む宿主細胞が提供されている。１つのこのような実施形態では、宿主細胞は、（１）該抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び該抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター；又は（２）該抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１ベクター、及び該抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２ベクターを含む（例えば、形質転換によって有する）。一実施形態では、該宿主細胞は、真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ系細胞（例えばＹ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施形態では、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の製造方法が提供されており、該方法は、該抗体の発現に適した条件下で該抗体をコードする核酸を含む上記の宿主細胞を培養することと、必要に応じて該宿主細胞（又は宿主細胞培地）から該抗体を回収することとを含む。
本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、例えば、米国特許第４,８１６,５６７号に記載のとおり、組換え方法によって製造されてもよい。一実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体をコードする単離された核酸が提供されている。このような核酸は、抗体のＶＬアミノ酸配列及び／又はＶＨのアミノ酸配列をコードし得る。別の実施形態では、このような核酸を含む１種又は複数種ベクター（例えば発現ベクター）が提供されている。別の実施形態では、このような核酸を含む宿主細胞が提供されている。１つのこのような実施形態では、宿主細胞は、（１）該抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び該抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター；又は（２）該抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１ベクター、及び該抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２ベクターを含む（例えば、形質転換によって有する）。一実施形態では、該宿主細胞は、真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ系細胞（例えばＹ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施形態では、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の製造方法が提供されており、該方法は、該抗体の発現に適した条件下で該抗体をコードする核酸を含む上記の宿主細胞を培養することと、必要に応じて該宿主細胞（又は宿主細胞培地）から該抗体を回収することとを含む。
【0057】
抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を組換え産生するために、抗体をコードする核酸（例えば、上記のとおり）を単離し、１つ又は複数のベクターに挿入して、宿主細胞においてさらにクローン及び／又は発現する。このような核酸は、一般的な手順（例えば、該抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用する）によって容易に単離されて配列決定にかけられてもよい。
【0058】
抗体コードベクターのクローン又は発現に適用できる宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞を含む。例えば、特にグリコシル化及びＦｃ効果機能が必要とされない場合、細菌にて抗体を産生する。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現に関しては、例えば米国特許第５,６４８,２３７号、第５,７８９,１９９号及び第５,８４０,５２３号を参照する。発現させた後、細菌細胞質から可溶性部分にある抗体を単離して、さらに精製してもよい。
【0059】
原核生物に加えて、例えば糸状真菌又は酵母の真核微生物も、抗体コードベクターにとって適切なクローン又は発現宿主であり、グリコシル化経路が「ヒト化」されて、部分的又は完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体を産生する真菌及び酵母菌株を含む。Liら, Nat. Biotech. 24: 210-215(2006)を参照する。
【0060】
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）に由来してもよい。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。昆虫細胞に結合する、特にツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞にトランスフェクションし得るバキュロウイルス株が多く同定されている。
【0061】
植物細胞培養物も宿主として利用可能である。例えば米国特許第５,９５９,１７７号、第６,０４０,４９８号、第６,４２０,５４８号、第７,１２５,９７８号及び第６,４１７,４２９号（遺伝子改変植物にて抗体を産生するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術が記載されている）を参照する。
【0062】
脊椎動物細胞も宿主として利用可能である。例えば、懸濁液における生長に適した哺乳動物細胞株は適用し得る。哺乳動物宿主細胞株に適した他の例には、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１細胞株（ＣＯＳ－７）；ヒト胎児腎細胞株（例えば２９３細胞）；幼若ハムスター腎細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリー細胞（例えばＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；犬腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）；ＴＲＩ細胞；ＭＲＣ ５細胞；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えばＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞；及び骨髄腫細胞株、例えばＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０が挙げられる。
【0063】
８）免疫複合体
本発明はまた、本明細書に係る抗ＣＬＤＮ１８．２抗体と１種又は複数種の細胞傷害性剤とを結合した免疫複合体を提供しており、このような細胞傷害性剤は例えば化学治療剤又は化学治療薬、成長阻害剤、毒素（例えばタンパク質毒素、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素又はその断片）又は放射性同位体である。
本発明はまた、本明細書に係る抗ＣＬＤＮ１８．２抗体と１種又は複数種の細胞傷害性剤とを結合した免疫複合体を提供しており、このような細胞傷害性剤は例えば化学治療剤又は化学治療薬、成長阻害剤、毒素（例えばタンパク質毒素、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素又はその断片）又は放射性同位体である。
【0064】
一実施形態では、免疫複合体は、抗体と１種又は複数種の薬物とが結合された抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）であり、メイタンシン、オルリスタット、ドラスタチン、メトトレキサート、ビンデシン、タキサン、トリコテセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅ）及びＣＣ１０６５を含むが、これらに限定されるものではない。
【0065】
別の実施形態では、免疫複合体は、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体と酵素活性毒素又はその断片との複合体であり、該酵素活性毒素は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖及びトリコテセンなどを含むが、これらに限定されるものではない。
【0066】
別の実施形態では、免疫複合体は、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体と放射性原子とが結合された放射性複合体を含む。複数種の放射性同位体は放射性複合体の産生に有用である。その例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。
【0067】
抗体と細胞傷害性剤との複合体は、複数種の二官能性タンパク質結合剤を用いて製造されてもよく、この結合剤は、例えば、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばアジピン酸ジメチル塩酸塩）、活性エステル（例えばジスクシニミジルスベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ジアジド化合物（例えばビス(ｐ－アジドベンゾイル)ヘキサメチレンジアミン）、ビスジアゾ誘導体（例えばビス(ｐ－ジアゾベンゾイル)－エチレンジアミン）、ジイソチオシアネート（例えばトルエン２,６－ジイソチオシアネート）及び二重活性フッ素化合物（例えば１,５－ジフルオロ－２,４－ジニトロベンゼン）である。
【0068】
９）薬物製剤
本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の薬物製剤は、所望の純度を有する抗体と、１種又は複数種の薬学的に許容される任意の担体とを混合して凍結乾燥製剤又は水溶液の形態とすることで製造される。薬学的に許容される担体は、一般に、使用された用量及び濃度において受容体に対して無毒であり、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンなどの抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルフェニルアンモニウムクロライド；バイオトリウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンザルコニウム；フェノール、ブタノール又はベンジルアルコール；ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチル、またはｐ－ヒドロキシ安息香酸プロピルなどのｐ－ヒドロキシ安息香酸アルキルエステル；カテコール；レゾルシン；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびメタクレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース及びデキストリンを含む、単糖類、二糖類及びその他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、フコース、ソルビトールなどの糖；ナトリウムのような塩形成対イオン；金属錯体（例えば、亜鉛－タンパク質錯体）及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含むが、これらに限定されるものではない。
本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の薬物製剤は、所望の純度を有する抗体と、１種又は複数種の薬学的に許容される任意の担体とを混合して凍結乾燥製剤又は水溶液の形態とすることで製造される。薬学的に許容される担体は、一般に、使用された用量及び濃度において受容体に対して無毒であり、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンなどの抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルフェニルアンモニウムクロライド；バイオトリウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンザルコニウム；フェノール、ブタノール又はベンジルアルコール；ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチル、またはｐ－ヒドロキシ安息香酸プロピルなどのｐ－ヒドロキシ安息香酸アルキルエステル；カテコール；レゾルシン；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびメタクレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース及びデキストリンを含む、単糖類、二糖類及びその他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、フコース、ソルビトールなどの糖；ナトリウムのような塩形成対イオン；金属錯体（例えば、亜鉛－タンパク質錯体）及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含むが、これらに限定されるものではない。
【0069】
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６,２６７,９５８号に記載されている。水性抗体製剤は、米国特許第６,１７１,５８６号及びＷＯ２００６／０４４９０８に記載のものを含む。
【0070】
本明細書における製剤は、治療対象の特定適応症にとって必須な１種以上の活性成分を含んでもよく、好ましくは、互いに悪影響を与えない補完的な活性を有する活性成分が好ましい。例えば、追加の治療剤（例えば化学療法剤、細胞傷害性剤、成長阻害剤及び／又は抗ホルモン剤）が必要とされる場合がある。このような活性成分は組み合わせの形態として所定の目的に有効な量で存在するのに適している。
【0071】
１０）製品
本発明の別の態様では、本発明の抗体又は医薬組成物を含有する製品が提供されている。該製品は容器と、該容器上にある又は該容器に関連するレベルや添付文書（プロトコル）とを含む。適切な容器は、例えばボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどを含む。このような容器は、例えばガラスやプラスチックなどの各種の材料で形成されてもよい。該容器は本発明の組成物単独又は該組成物と別の組成物との組み合わせを収容し、そして、滅菌入口を備えてもよい（例えば、該容器は点滴バッグ又は皮下注射針で穿刺可能な瓶栓を備えたバイアルであってもよい）。該組成物の少なくとも１種の活性化剤は本発明の抗体である。該レベル又は添付文書は該組成物が特定の腫瘍の治療に用いられることを示す。さらに、該製品は、（ａ）本発明の抗体を含む組成物を収容する第１容器と、（ｂ）別の腫瘍治療薬又は別の抗体を含む組成物を収容する第２容器とを含んでもよい。本発明の本実施形態の製品は、このような組成物が治療し得る腫瘍を示す添付文書をさらに含んでもよい。任意選択的に、また、該製品は、医薬的に許容される緩衝剤、例えば注射用抗菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液を収容する第２（又は第３）容器をさらに含んでもよい。市販品及び使用者のニーズに合わせる他の材料をさらに含んでもよく、このような材料は、他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針及び注射器を含む。
本発明の別の態様では、本発明の抗体又は医薬組成物を含有する製品が提供されている。該製品は容器と、該容器上にある又は該容器に関連するレベルや添付文書（プロトコル）とを含む。適切な容器は、例えばボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどを含む。このような容器は、例えばガラスやプラスチックなどの各種の材料で形成されてもよい。該容器は本発明の組成物単独又は該組成物と別の組成物との組み合わせを収容し、そして、滅菌入口を備えてもよい（例えば、該容器は点滴バッグ又は皮下注射針で穿刺可能な瓶栓を備えたバイアルであってもよい）。該組成物の少なくとも１種の活性化剤は本発明の抗体である。該レベル又は添付文書は該組成物が特定の腫瘍の治療に用いられることを示す。さらに、該製品は、（ａ）本発明の抗体を含む組成物を収容する第１容器と、（ｂ）別の腫瘍治療薬又は別の抗体を含む組成物を収容する第２容器とを含んでもよい。本発明の本実施形態の製品は、このような組成物が治療し得る腫瘍を示す添付文書をさらに含んでもよい。任意選択的に、また、該製品は、医薬的に許容される緩衝剤、例えば注射用抗菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液を収容する第２（又は第３）容器をさらに含んでもよい。市販品及び使用者のニーズに合わせる他の材料をさらに含んでもよく、このような材料は、他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針及び注射器を含む。
【0072】
１１）検出試薬及びキット
本発明はまた、本明細書の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片を含む癌検出試薬を提供している。癌検出試薬は、実際の患者の腫瘍又は血液組織の試験に用いられる。試験は、例えばＰＣＲ、マイクロアレイやチップ技術によって行われてもよい。患者に癌検出試薬が存在すると検出すると、これらの試薬は、選択され患者の治療又は治療の指導に用いられる。
本発明はまた、本明細書の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片を含む癌検出試薬を提供している。癌検出試薬は、実際の患者の腫瘍又は血液組織の試験に用いられる。試験は、例えばＰＣＲ、マイクロアレイやチップ技術によって行われてもよい。患者に癌検出試薬が存在すると検出すると、これらの試薬は、選択され患者の治療又は治療の指導に用いられる。
【0073】
一実施形態では、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片は化学標識したものであり、具体的には、例えばアルカリホスファターゼやグルコースオキシダーゼなどの酵素標識；フルオレセインやローダミンなどの蛍光標識；ヨウ素（１２５Ｉ、１３１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１２１Ｉｎ）及びテクネチウム（９９ｍＴｃ）などの同位体標識；又はルミノールやルシフェラーゼなどの化学発光物標識であってもよい。
【0074】
本発明はまた、本明細書の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片を含む癌検出キットを提供している。キットは、標識された抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片をさらに含んでもよい。具体的、癌検出キットは胃癌、膵臓癌又は食道癌の検出に有用である。
【0075】
以下図面を参照して本発明の具体的な実施例について詳細に説明する。図面においては本発明の具体的な実施例が示されているが、本発明は、ここでの実施例により限制されることなく、さまざまな形態で実現されてもよいことが理解される。むしろ、これらの実施例は本発明をより完全に理解できるようにし、本発明の範囲を完全に当業者に伝えるために提供されるのである。
実施例
実施例
【0076】
実施例１ 免疫及びスクリーニング材料の調製
（１） ヒトｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥ（Ｔ－細胞エピトープペプチド） レトロウイルス発現プラスミドの構築
ｈＣＬＤＮ１８．２ ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）をクローニングして、Ｃ－末端にＴ－細胞エピトープペプチドを融合し、ｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥを得た。Ｔ－細胞エピトープペプチドにより抗原は免疫耐性を突破して、抗体の産生（Percival-Alwyn J. et al, mAbs, 2015, 7(1), 129-137）が促進される。ｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥをレトロウイルスベクターにクローニングして、ｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥレトロウイルス発現プラスミドを得た。ｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥレトロウイルス発現プラスミドをＨＥＫ２９３－Ｔ細胞に一過性トランスフェクションし、トランスフェクション７２時間後、ｈＣＬＤＮ１８．２のＨＥＫ２９３－Ｔ細胞表面での発現についてフローサイトメトリー分析を行った。一次抗体（１ｓｔ Ａｂ）は自作された陽性対照（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋｅｒ）キメラ抗体１６３Ｅ１２である。まず、細胞を一次抗体（１μｇ／ｍＬ）とともに４℃の条件で４５ｍｉｎインキュベートし、ＰＢＳで洗浄した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識ヤギ抗ヒトＦｃ二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、品番Ａ－１１０１３））（２ｎｄ Ａｂ、１：２００希釈）とともに、４℃の条件で４５分間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）解析を行い、陰性対照細胞については、二次抗体だけインキュベートした。図１に示す結果から、野生ＨＥＫ２９３－Ｔ細胞の表面ではｈＣＬＤＮ１８．２の発現が認められず、ｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥレトロウイルス発現プラスミドを一過性トランスフェクションしたＨＥＫ２９３－Ｔ 細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ ＣＬＤＮ１８．２ ＴＣＥ）では、陽性細胞の８０．９％はｈＣＬＤＮ１８．２を発現させた。該ベクタープラスミドは実施例２の（１）ＤＮＡ免疫スキームに用いられる。
（２） ｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥを高レベルで発現させたマウス腫瘍細胞
ｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥレトロウイルス発現プラスミドとレンチウイルスパッケージングプラスミドとを混合して２９３－Ｔ細胞にトランスフェクションし、ｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥレンチウイルス粒子を製造した。ｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥレンチウイルス粒子をマウス腫瘍細胞系にトランスフェクションし、７２時間後、フローサイトメトリー検出を行ってｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥを高発現させたマウス腫瘍細胞プールを選別した。一次抗体（１ｓｔ Ａｂ）は自作された陽性対照（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋｅｒ）キメラ抗体１６３Ｅ１２である。まず、細胞を一次抗体（１μｇ／ｍＬ）とともに４℃の条件で４５分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識したヤギ抗ヒトＦｃ二次抗体（２ｎｄ Ａｂ、１：２００希釈）とともに４℃の条件で４５分間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄した後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）解析を行い、陰性対照細胞については二次抗体だけインキュベートした。図２に示す結果から、野生マウス腫瘍細胞（ＵＢＥＲ ｐａｒｅｎｔａｌ）の表面では１６．８％の陽性シグナルしかなかった。ｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥレトロウイルスをトランスフェクションしたマウス腫瘍細胞（ＵＢＥＲ ＣＬＤＮ１８．２ ＴＣＥ）では、８２．７％の陽性細胞があった。フローサイトメトリー分析により選別した結果、９５．７％と多くのマウス腫瘍細胞では、ｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥは高レベルで発現されていた。このｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥのマウス腫瘍細胞は実施例２の（２）細胞免疫スキームに用いられる。
（３） ｈＣＬＤＮ１８．２細胞外ループ１ ウイルス様粒子の製造
Thorsten K.が発表した方法（Thorsten K., et al, Cancer Res, 2011, 71(2), 515-527）に従って、ｈＣＬＤＮ１８．２の細胞外ループ１（ＥＣＬ１：Ｅｘｔｒａ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｌｏｏｐ１）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）をＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃＡｇ：Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｃｏｒｅ ａｎｔｉｇｅｎ）の主要免疫優性領域（ＭＩＲ：Ｍａｊｏｒ ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）に挿入し、ＥＣＬ１ Ｎ－末端及びＣ－末端のそれぞれにＧ４ＳＧ４リンカーを導入し、全長融合タンパク質のＣ－末端に６ｘＨｉｓ タグ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を添加した。融合タンパク質の遺伝子全長を合成して、ｐＥＴ２４ａ（＋）プラスミドにクローニングした後、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌発現系にトランスフェクションして融合タンパク質の発現を行った。融合タンパク質の精製後、復元緩衝液にてＨＢＶ ｈＣＬＤＮ１８．２細胞外ループ１ ウイルス様粒子を製造した。該ｈＣＬＤＮ１８．２細胞外ループ１ ウイルス様粒子の調製は、実施例２の（３）ウイルス様粒子多部位反復免疫－細胞免疫スキーム及び（４）ウイルス様粒子飛節免疫－細胞免疫スキームに用いられる。
（４） ＣＬＤＮ１８安定トランスフェクション細胞株の構築
ｈＣＬＤＮ１８．２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ｈＣＬＤＮ１８．１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、マウスｍｈＣＬＤＮ１８．２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、ｍＣＬＤＮ１８．１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）遺伝子全長をそれぞれ合成し、ｐｃＤＮＡ３．４ベクタープラスミドにそれぞれクローニングした。プラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションして、ネオマイシン（Ｇ４１８）を加えて加圧スクリーニングを行った。限界希釈法によってｈＣＬＤＮ１８．２、ｈＣＬＤＮ１８．１、ｍｈＣＬＤＮ１８．２、ｍＣＬＤＮ１８．１を高発現させたＨＥＫ２９３安定トランスフェクション細胞株をそれぞれ選択した。フローサイトメトリー検出の結果、ｈＣＬＤＮ１８．２及びｍＣＬＤＮ１８．２をトランスフェクションしたＨＥＫ２９３安定トランスフェクション細胞株（ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２、ＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．２）では、パラホルムアルデヒド固定化及び非固定化の細胞のいずれも自作された抗ＣＬＤＮ１８．２陽性対照抗体１６３Ｅ１２又は１７５Ｄ１０により特異的に識別され（図３．Ａ、Ｃ）、また、市販の広範な抗ＣＬＤＮ１８抗体３４Ｈ１４Ｌ１５、（Ａｂｃａｍ 品番ａｂ２０３５６３）によって識別され得る（図３．Ａ、Ｃ）。ｈＣＬＤＮ１８．１及びｍＣＬＤＮ１８．１をトランスフェクションしたＨＥＫ２９３安定トランスフェクション細胞株（ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１、ＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．１）では、パラホルムアルデヒド固定化及び非固定化の細胞はいずれも自作された抗ＣＬＤＮ１８．２陽性対照抗体１６３Ｅ１２又は１７５Ｄ１０によって特異的に識別できず（図３．Ｂ、Ｄ）、一方、市販の広範な抗ＣＬＤＮ１８抗体（３４Ｈ１４Ｌ１５）によって識別され得る（図３．Ｂ、Ｄ）。上記のＨＥＫ２９３安定トランスフェクション細胞株は実施例３のハイブリドーマスクリーニングに用いられる。
（５）陽性対照抗体４３Ａ１１、１７５Ｄ１０、及び１６３Ｅ１２の調製
ヒトマウスキメラ陽性対照抗体４３Ａ１１の重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）及び軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、１７５Ｄ１０の重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）及び軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、並びに１６３Ｅ１２の重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）及び軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）の抗体遺伝子全長をそれぞれ合成して、それぞれのＮ－末端にシグナルペプチドを添加し、その後、ｐｃＤＮＡ３．４真核発現ベクターにクローニングした。４３Ａ１１、１７５Ｄ１０及び１６３Ｅ１２の重鎖及び軽鎖発現プラスミドをそれぞれ混合してＣＨＯＳ細胞に共トランスフェクションし、一過性トランスフェクションタンパク質の発現を行い、上清を収集して、Ｐｒｏｔｉｅｎ Ａを用いて親和精製を行い、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出を行い、結果を図４に示す。
（１） ヒトｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥ（Ｔ－細胞エピトープペプチド） レトロウイルス発現プラスミドの構築
ｈＣＬＤＮ１８．２ ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）をクローニングして、Ｃ－末端にＴ－細胞エピトープペプチドを融合し、ｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥを得た。Ｔ－細胞エピトープペプチドにより抗原は免疫耐性を突破して、抗体の産生（Percival-Alwyn J. et al, mAbs, 2015, 7(1), 129-137）が促進される。ｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥをレトロウイルスベクターにクローニングして、ｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥレトロウイルス発現プラスミドを得た。ｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥレトロウイルス発現プラスミドをＨＥＫ２９３－Ｔ細胞に一過性トランスフェクションし、トランスフェクション７２時間後、ｈＣＬＤＮ１８．２のＨＥＫ２９３－Ｔ細胞表面での発現についてフローサイトメトリー分析を行った。一次抗体（１ｓｔ Ａｂ）は自作された陽性対照（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋｅｒ）キメラ抗体１６３Ｅ１２である。まず、細胞を一次抗体（１μｇ／ｍＬ）とともに４℃の条件で４５ｍｉｎインキュベートし、ＰＢＳで洗浄した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識ヤギ抗ヒトＦｃ二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、品番Ａ－１１０１３））（２ｎｄ Ａｂ、１：２００希釈）とともに、４℃の条件で４５分間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）解析を行い、陰性対照細胞については、二次抗体だけインキュベートした。図１に示す結果から、野生ＨＥＫ２９３－Ｔ細胞の表面ではｈＣＬＤＮ１８．２の発現が認められず、ｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥレトロウイルス発現プラスミドを一過性トランスフェクションしたＨＥＫ２９３－Ｔ 細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ ＣＬＤＮ１８．２ ＴＣＥ）では、陽性細胞の８０．９％はｈＣＬＤＮ１８．２を発現させた。該ベクタープラスミドは実施例２の（１）ＤＮＡ免疫スキームに用いられる。
（２） ｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥを高レベルで発現させたマウス腫瘍細胞
ｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥレトロウイルス発現プラスミドとレンチウイルスパッケージングプラスミドとを混合して２９３－Ｔ細胞にトランスフェクションし、ｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥレンチウイルス粒子を製造した。ｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥレンチウイルス粒子をマウス腫瘍細胞系にトランスフェクションし、７２時間後、フローサイトメトリー検出を行ってｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥを高発現させたマウス腫瘍細胞プールを選別した。一次抗体（１ｓｔ Ａｂ）は自作された陽性対照（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋｅｒ）キメラ抗体１６３Ｅ１２である。まず、細胞を一次抗体（１μｇ／ｍＬ）とともに４℃の条件で４５分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識したヤギ抗ヒトＦｃ二次抗体（２ｎｄ Ａｂ、１：２００希釈）とともに４℃の条件で４５分間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄した後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）解析を行い、陰性対照細胞については二次抗体だけインキュベートした。図２に示す結果から、野生マウス腫瘍細胞（ＵＢＥＲ ｐａｒｅｎｔａｌ）の表面では１６．８％の陽性シグナルしかなかった。ｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥレトロウイルスをトランスフェクションしたマウス腫瘍細胞（ＵＢＥＲ ＣＬＤＮ１８．２ ＴＣＥ）では、８２．７％の陽性細胞があった。フローサイトメトリー分析により選別した結果、９５．７％と多くのマウス腫瘍細胞では、ｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥは高レベルで発現されていた。このｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥのマウス腫瘍細胞は実施例２の（２）細胞免疫スキームに用いられる。
（３） ｈＣＬＤＮ１８．２細胞外ループ１ ウイルス様粒子の製造
Thorsten K.が発表した方法（Thorsten K., et al, Cancer Res, 2011, 71(2), 515-527）に従って、ｈＣＬＤＮ１８．２の細胞外ループ１（ＥＣＬ１：Ｅｘｔｒａ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｌｏｏｐ１）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）をＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃＡｇ：Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｃｏｒｅ ａｎｔｉｇｅｎ）の主要免疫優性領域（ＭＩＲ：Ｍａｊｏｒ ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）に挿入し、ＥＣＬ１ Ｎ－末端及びＣ－末端のそれぞれにＧ４ＳＧ４リンカーを導入し、全長融合タンパク質のＣ－末端に６ｘＨｉｓ タグ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を添加した。融合タンパク質の遺伝子全長を合成して、ｐＥＴ２４ａ（＋）プラスミドにクローニングした後、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌発現系にトランスフェクションして融合タンパク質の発現を行った。融合タンパク質の精製後、復元緩衝液にてＨＢＶ ｈＣＬＤＮ１８．２細胞外ループ１ ウイルス様粒子を製造した。該ｈＣＬＤＮ１８．２細胞外ループ１ ウイルス様粒子の調製は、実施例２の（３）ウイルス様粒子多部位反復免疫－細胞免疫スキーム及び（４）ウイルス様粒子飛節免疫－細胞免疫スキームに用いられる。
（４） ＣＬＤＮ１８安定トランスフェクション細胞株の構築
ｈＣＬＤＮ１８．２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ｈＣＬＤＮ１８．１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、マウスｍｈＣＬＤＮ１８．２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、ｍＣＬＤＮ１８．１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）遺伝子全長をそれぞれ合成し、ｐｃＤＮＡ３．４ベクタープラスミドにそれぞれクローニングした。プラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションして、ネオマイシン（Ｇ４１８）を加えて加圧スクリーニングを行った。限界希釈法によってｈＣＬＤＮ１８．２、ｈＣＬＤＮ１８．１、ｍｈＣＬＤＮ１８．２、ｍＣＬＤＮ１８．１を高発現させたＨＥＫ２９３安定トランスフェクション細胞株をそれぞれ選択した。フローサイトメトリー検出の結果、ｈＣＬＤＮ１８．２及びｍＣＬＤＮ１８．２をトランスフェクションしたＨＥＫ２９３安定トランスフェクション細胞株（ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２、ＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．２）では、パラホルムアルデヒド固定化及び非固定化の細胞のいずれも自作された抗ＣＬＤＮ１８．２陽性対照抗体１６３Ｅ１２又は１７５Ｄ１０により特異的に識別され（図３．Ａ、Ｃ）、また、市販の広範な抗ＣＬＤＮ１８抗体３４Ｈ１４Ｌ１５、（Ａｂｃａｍ 品番ａｂ２０３５６３）によって識別され得る（図３．Ａ、Ｃ）。ｈＣＬＤＮ１８．１及びｍＣＬＤＮ１８．１をトランスフェクションしたＨＥＫ２９３安定トランスフェクション細胞株（ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１、ＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．１）では、パラホルムアルデヒド固定化及び非固定化の細胞はいずれも自作された抗ＣＬＤＮ１８．２陽性対照抗体１６３Ｅ１２又は１７５Ｄ１０によって特異的に識別できず（図３．Ｂ、Ｄ）、一方、市販の広範な抗ＣＬＤＮ１８抗体（３４Ｈ１４Ｌ１５）によって識別され得る（図３．Ｂ、Ｄ）。上記のＨＥＫ２９３安定トランスフェクション細胞株は実施例３のハイブリドーマスクリーニングに用いられる。
（５）陽性対照抗体４３Ａ１１、１７５Ｄ１０、及び１６３Ｅ１２の調製
ヒトマウスキメラ陽性対照抗体４３Ａ１１の重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）及び軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、１７５Ｄ１０の重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）及び軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、並びに１６３Ｅ１２の重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）及び軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）の抗体遺伝子全長をそれぞれ合成して、それぞれのＮ－末端にシグナルペプチドを添加し、その後、ｐｃＤＮＡ３．４真核発現ベクターにクローニングした。４３Ａ１１、１７５Ｄ１０及び１６３Ｅ１２の重鎖及び軽鎖発現プラスミドをそれぞれ混合してＣＨＯＳ細胞に共トランスフェクションし、一過性トランスフェクションタンパク質の発現を行い、上清を収集して、Ｐｒｏｔｉｅｎ Ａを用いて親和精製を行い、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出を行い、結果を図４に示す。
【0077】
実施例２ マウス免疫プログラム及びハイブリドーマの調製
合計４種類の免疫スキーム（表１）を採用し、そして、免疫スキームごとに少なくとも２つの異なる種（ｓｔｒａｉｎ）のマウスを用いて免疫を行った（表２）。いずれの免疫スキームにおいても、マウスの一部の個体で高レベルの血清免疫力価が認められた。各免疫スキームにおいて高レベルの免疫力価が認められたマウスの個体を殺して脾臓を摘出し、Ｂリンパ球を単離して混合した後、マウス骨髄腫細胞株と電気融合し、ハイブリドーマを調製した。合計３バッチのハイブリドーマを製造した（表２）。
合計４種類の免疫スキーム（表１）を採用し、そして、免疫スキームごとに少なくとも２つの異なる種（ｓｔｒａｉｎ）のマウスを用いて免疫を行った（表２）。いずれの免疫スキームにおいても、マウスの一部の個体で高レベルの血清免疫力価が認められた。各免疫スキームにおいて高レベルの免疫力価が認められたマウスの個体を殺して脾臓を摘出し、Ｂリンパ球を単離して混合した後、マウス骨髄腫細胞株と電気融合し、ハイブリドーマを調製した。合計３バッチのハイブリドーマを製造した（表２）。
【0078】
【表1-1】
【0079】
【表1-2】
【0080】
【表2】
【0081】
実施例３ ハイブリドーマのスクリーニング
３バッチ由来のハイブリドーマを限界希釈法によってクローン化培養し、クローン上清をフローサイトメトリーで結合又は逆結合スクリーニングを３回行い、抗体タイピング及び抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｘｉｔｙ）を測定し、ＣＬＤＮ１８．２に強く特異的に結合し得るが、ＣＬＤＮ１８．１に結合せず又は僅かに結合され、そしてＡＤＣＣ機能を有するハイブリドーマクローンを１２８個スクリーニングした。スクリーニングステップ及び各段階のスクリーニングにより得られたハイブリドーマクローンを表３にまとめて示す。
３バッチ由来のハイブリドーマを限界希釈法によってクローン化培養し、クローン上清をフローサイトメトリーで結合又は逆結合スクリーニングを３回行い、抗体タイピング及び抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｘｉｔｙ）を測定し、ＣＬＤＮ１８．２に強く特異的に結合し得るが、ＣＬＤＮ１８．１に結合せず又は僅かに結合され、そしてＡＤＣＣ機能を有するハイブリドーマクローンを１２８個スクリーニングした。スクリーニングステップ及び各段階のスクリーニングにより得られたハイブリドーマクローンを表３にまとめて示す。
【0082】
【表3】
【0083】
１）一次スクリーニング：各クローン上清発現産物とＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥを高レベルで発現させたマウス腫瘍細胞株（ＵＢＥＲ ＣＬＤＮ１８．２ ＴＣＥ）との結合をフローサイトメトリーによって解析した。限界希釈法によって融合後のハイブリドーマを３８４ウェルプレートに接種し、１０日間培養後、上清を取り、フローサイトメトリーで陽性ハイブリドーマクローンをスクリーニングした。上清をＵＢＥＲ ＣＬＤＮ１８．２ ＴＣＥ細胞（２００００個（細胞）／ウェル）とともに４℃で４５分間共インキュベートした後、プレートを洗浄し、以Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－４８８－ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ 品番Ａ２８１７５）を二次抗体としてフローサイトメトリー検出を行い、平均蛍光強度が１００,０００以上のクローンをスクリーニングして増幅し、飽和上清を収集し、確認スクリーニングを行った。
３バッチのハイブリドーマについて、各バッチを限界希釈法によって１０個の３８４ウェルプレートにクローン化した。一次スクリーニングによって、３バッチのハイブリドーマは、ＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥのマウス腫瘍細胞株との結合が陽性であるハイブリドーマクローンをそれぞれ３４１個の（ＭＦＩ＞１００,０００）、３３６個の（ＭＦＩ＞７５,０００又はＭＦＩ＞８０,０００）及び８９個の（ＭＦＩ＞９０,０００）を得た。
２）確認スクリーニング：前のステップである一次スクリーニングによる陽性クローンの上清発現産物を、それぞれＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞、及びＨＥＫ２９３野生型細胞とインキュベートし（２００００個（細胞）／ウェル、４℃、４５分間）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－４８８－ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ 品番Ａ２８１７５）を二次抗体として、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞との結合が陽性であるが、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞及びＨＥＫ２９３野生型細胞との結合が陰性であるクローンをローサイトメトリーによってスクリーニングして増幅し、飽和上清を収集し、検証スクリーニングを行った。
確認スクリーニングをした結果、３バッチのハイブリドーマは、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞に強く特異的に結合され得るが、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞に弱く結合され、しかもＨＥＫ２９３野生型細胞に結合しないクローンをそれぞれ１６５個の（ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２ ＭＦＩ＞２００,０００、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１ ＭＦＩ＜１００,０００）、１２０個の（ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２ ＭＦＩ＞５０,０００、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１ ＭＦＩ＜４０,０００）、及び２１個の（ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２ ＭＦＩ＞７０,０００、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１ ＭＦＩ＜３０,０００）を得た。陽性クローンの一部のＦＡＣＳ解析を図５に示す。
３）検証スクリーニング：３バッチ由来のハイブリドーマの確認スクリーニングにおいて得られた３０６個の（１６５個＋１２０個＋２１個）陽性ハイブリドーマの上清発現産物を、それぞれＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞、ＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．２細胞、ＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．１ 細胞、及びＨＥＫ２９３野生型細胞とインキュベートし（２００００個（細胞）／ウェル、４℃、４５分間）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－４８８－ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ 品番Ａ２８１７５）を二次抗体として、フローサイトメトリーによって解析した。図６に示す一部のクローンの５個の細胞株におけるフローサイトメトリー分析結果から、陽性クローンは、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞及びＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．２細胞のいずれでも、平均蛍光強度（ＭＦＩ）が５００,０００を超え、一方、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞、ＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．１細胞、及びＨＥＫ２９３野生型細胞細胞株では、平均蛍光強度が全て５０,０００未満であり、多くのクローン（１６／２２）は、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞及びＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．２細胞では、平均蛍光強度（ＭＦＩ）がＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞及びＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．１ 細胞の場合の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の５０倍を上回ることが示された。
４）抗体タイピング：ＩｇＧ分子は、サブタイプによって、ＡＤＣＣ効果媒介能力が異なる。このため、抗体依存性細胞殺傷検出に先立って、マウス抗体サブタイプ検出キットを用いて、３バッチ由来のハイブリドーマの確認スクリーニングにより得られた３０６個の（１６５個＋１２０個＋２１個の）陽性ハイブリドーマの上清抗体発現産物について、マウス抗体サブタイプのタイピングを行った。３０６個のクローンのサブタイプのほとんどはＡＤＣＣ機能を備えたマウスＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３であり、僅か少量（２６／３０６）はＡＤＣＣ機能を備えないＩｇＧ１サブタイプ（ヒトに対応する抗体ＩｇＧ４サブタイプ）である。一部のクローンは混合サブタイプであり、これは、ハイブリドーマクローンがモノクローナルではないことによると考えられる。軽鎖は全てマウスκサブタイプである。
５）ＡＤＣＣ効果測定
前述確認スクリーニング、検証スクリーニング及び抗体タイピングの結果を総合的に考慮して、１２８個の陽性クローンの飽和上清を選択して、抗体依存性細胞傷害性の機能検出を行った。エフェクター細胞は、２人のドナー（４５及び４６号）から試験の前日に採血して、採取した血液を室温で保存し、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離を行うことにより新たに単離されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）である。ターゲット細胞はＣＬＤＮ１８．２を発現させたＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２）である。ハイブリドーマ発現産物を全て４倍希釈した。新しく取得したＰＢＭＣｓ細胞とターゲット細胞を２５：１のエフェクター細胞／ターゲット細胞比で各サンプルと４時間共インキュベートした。細胞傷害性に関連する乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を測定することによって抗体のＡＤＣＣ効果を表す。ターゲット細胞が自発的に溶解した場合に検出された吸光度値を０％、ターゲット細胞が全て溶解した場合に検出された吸光度値を１００％に定義して、試験サンプルごとに、活性百分率でＡＤＣＣ効果を表す。一部のクローンのＡＤＣＣ効果の結果は、図７に示すように、クローン上清のＡＤＣＣ殺傷効果が平均で２０％よりも高く、一部のクローン（９Ｄ－１、８－Ｏ１１）のＡＤＣＣ効果は５０％よりも高く、一方、マウスＩｇＧ１サブタイプの６－Ｇ１１及び４－Ｏ２に対しては、ＡＤＣＣ効果は１０％を下回った。
３バッチのハイブリドーマについて、各バッチを限界希釈法によって１０個の３８４ウェルプレートにクローン化した。一次スクリーニングによって、３バッチのハイブリドーマは、ＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥのマウス腫瘍細胞株との結合が陽性であるハイブリドーマクローンをそれぞれ３４１個の（ＭＦＩ＞１００,０００）、３３６個の（ＭＦＩ＞７５,０００又はＭＦＩ＞８０,０００）及び８９個の（ＭＦＩ＞９０,０００）を得た。
２）確認スクリーニング：前のステップである一次スクリーニングによる陽性クローンの上清発現産物を、それぞれＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞、及びＨＥＫ２９３野生型細胞とインキュベートし（２００００個（細胞）／ウェル、４℃、４５分間）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－４８８－ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ 品番Ａ２８１７５）を二次抗体として、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞との結合が陽性であるが、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞及びＨＥＫ２９３野生型細胞との結合が陰性であるクローンをローサイトメトリーによってスクリーニングして増幅し、飽和上清を収集し、検証スクリーニングを行った。
確認スクリーニングをした結果、３バッチのハイブリドーマは、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞に強く特異的に結合され得るが、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞に弱く結合され、しかもＨＥＫ２９３野生型細胞に結合しないクローンをそれぞれ１６５個の（ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２ ＭＦＩ＞２００,０００、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１ ＭＦＩ＜１００,０００）、１２０個の（ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２ ＭＦＩ＞５０,０００、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１ ＭＦＩ＜４０,０００）、及び２１個の（ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２ ＭＦＩ＞７０,０００、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１ ＭＦＩ＜３０,０００）を得た。陽性クローンの一部のＦＡＣＳ解析を図５に示す。
３）検証スクリーニング：３バッチ由来のハイブリドーマの確認スクリーニングにおいて得られた３０６個の（１６５個＋１２０個＋２１個）陽性ハイブリドーマの上清発現産物を、それぞれＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞、ＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．２細胞、ＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．１ 細胞、及びＨＥＫ２９３野生型細胞とインキュベートし（２００００個（細胞）／ウェル、４℃、４５分間）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－４８８－ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ 品番Ａ２８１７５）を二次抗体として、フローサイトメトリーによって解析した。図６に示す一部のクローンの５個の細胞株におけるフローサイトメトリー分析結果から、陽性クローンは、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞及びＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．２細胞のいずれでも、平均蛍光強度（ＭＦＩ）が５００,０００を超え、一方、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞、ＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．１細胞、及びＨＥＫ２９３野生型細胞細胞株では、平均蛍光強度が全て５０,０００未満であり、多くのクローン（１６／２２）は、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞及びＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．２細胞では、平均蛍光強度（ＭＦＩ）がＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞及びＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．１ 細胞の場合の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の５０倍を上回ることが示された。
４）抗体タイピング：ＩｇＧ分子は、サブタイプによって、ＡＤＣＣ効果媒介能力が異なる。このため、抗体依存性細胞殺傷検出に先立って、マウス抗体サブタイプ検出キットを用いて、３バッチ由来のハイブリドーマの確認スクリーニングにより得られた３０６個の（１６５個＋１２０個＋２１個の）陽性ハイブリドーマの上清抗体発現産物について、マウス抗体サブタイプのタイピングを行った。３０６個のクローンのサブタイプのほとんどはＡＤＣＣ機能を備えたマウスＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３であり、僅か少量（２６／３０６）はＡＤＣＣ機能を備えないＩｇＧ１サブタイプ（ヒトに対応する抗体ＩｇＧ４サブタイプ）である。一部のクローンは混合サブタイプであり、これは、ハイブリドーマクローンがモノクローナルではないことによると考えられる。軽鎖は全てマウスκサブタイプである。
５）ＡＤＣＣ効果測定
前述確認スクリーニング、検証スクリーニング及び抗体タイピングの結果を総合的に考慮して、１２８個の陽性クローンの飽和上清を選択して、抗体依存性細胞傷害性の機能検出を行った。エフェクター細胞は、２人のドナー（４５及び４６号）から試験の前日に採血して、採取した血液を室温で保存し、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離を行うことにより新たに単離されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）である。ターゲット細胞はＣＬＤＮ１８．２を発現させたＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２）である。ハイブリドーマ発現産物を全て４倍希釈した。新しく取得したＰＢＭＣｓ細胞とターゲット細胞を２５：１のエフェクター細胞／ターゲット細胞比で各サンプルと４時間共インキュベートした。細胞傷害性に関連する乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を測定することによって抗体のＡＤＣＣ効果を表す。ターゲット細胞が自発的に溶解した場合に検出された吸光度値を０％、ターゲット細胞が全て溶解した場合に検出された吸光度値を１００％に定義して、試験サンプルごとに、活性百分率でＡＤＣＣ効果を表す。一部のクローンのＡＤＣＣ効果の結果は、図７に示すように、クローン上清のＡＤＣＣ殺傷効果が平均で２０％よりも高く、一部のクローン（９Ｄ－１、８－Ｏ１１）のＡＤＣＣ効果は５０％よりも高く、一方、マウスＩｇＧ１サブタイプの６－Ｇ１１及び４－Ｏ２に対しては、ＡＤＣＣ効果は１０％を下回った。
【0084】
実施例４ ＰＰＦＥ組織切片におけるｈＣＬＤＮ１８．２免疫組織化学陽性染色ハイブリドーマのスクリーニング
コンパニオン診断において、患者の腫瘍組織の生検をした後、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）、組織切片、病理検出を行うことは共通のプロセスである。癌抗原（ＴＡＡ：Ｔｕｍｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）は、ＦＦＰＥ組織切片を行うときに、天然構造が失われ、抗原賦活化（Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）を行っても、一部のコンフォメーション構造をある程度で回復する、又は一部の線状ペプチドセグメントだけを暴露させるしかない。前述の好ましい１２８個の陽性ハイブリドーマクローン上清は、細胞表面の天然ＣＬＤＮ１８．２コンフォメーションに特異的に結合する能力及びＡＤＣＣ機能を備えるものの、コンパニオン診断抗体としては、ＦＦＰＥ組織切片上で抗原特異的結合についてＩＨＣスクリーニングを行われなければならない。本実施例では、ＰＰＦＥ組織切片の免疫組織化学（ＩＨＣ：Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）方法によって、１２８個の陽性ハイブリドーマ上清の３個の遺伝子操作細胞株（ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞、 ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞及びＨＥＫ２９３野生型細胞）セルブロック（ｃｅｌｌ ｂｌｏｃｋ）のパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織切片への結合が検出された。
まず、ＣＬＤＮ１８を安定的に発現させたＨＥＫ２９３セルブロックＦＦＰＥ組織切片についてＩＨＣ染色を行った。これには、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞、及びＨＥＫ２９３野生型細胞の培養、細胞収集、遠心分離・セルブロック形成、脱水・透徹、パラフィン包埋ステップ後、ＦＦＰＥ組織切片及びＩＨＣ染色を行ったことを含む。ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２セルブロックＦＦＰＥ組織切片では陽性発色であるが、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞及びＨＥＫ２９３野生型セルブロックＦＦＰＥ組織切片では陰性染色であるハイブリドーマクローン上清をスクリーニングした。その後、得た陽性ハイブリドーマ上清についてヒト胃癌組織ＦＦＰＥ組織切片でＩＨＣ染色検証を行った。最後に、検証したＩＨＣ陽性染色ハイブリドーマ上清を、正常なヒト胃及び胃癌ＦＦＰＥ組織マイクロアレイ（ＴＭＡ：Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｃｒｏ－Ａｒｒａｙ）でＩＨＣ染色を行い、ＩＨＣ染色強度及び染色比率によって最終的なＩＨＣ陽性染色クローンを決定した。
セルブロックＦＦＰＥ組織切片、胃癌ＦＦＰＥ組織切片、並びに正常な胃及び胃癌ＦＦＰＥ組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）に対するハイブリドーマクローンのＩＨＣ方法は以下のステップを含む。１）脱パラフィン・ベーキング：６０℃、３０分間。２）脱パラフィン：キシレンにて３段（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）浸漬、１段ごとに５分間。３）水和：エタノールで１００％×２回、９５％ ×１回、７５％×１回勾配浸漬、１回３分間、蒸留水で５分間浸漬。４）抗原回復：抗原回復液（Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ、ｐＨ＝９．０）を１００℃の水浴に投入し、ＦＦＰＥ組織切片を抗原回復液に入れて３０分間インキュベートし、室温で３０分間冷却し、ＰＢＳ緩衝液で５分間ずつ３回洗浄する。５）ブロッキング：３％ Ｈ２Ｏ２－ＰＢＳにて室温、遮光下、１０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、その後、５％ ＢＳＡ（ＰＢＳ－ＢＳＡ）にて室温下６０分間インキュベートし、ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄する。６）一次抗体によるインキュベート：ウサギ抗ＣＬＤＮ１８．２市販陽性抗体（ＥＰＲ１９２０２, Ａｂｃａｍ, 品番ａｂ２２２５１２）を１：１００で希釈するか、又はマウスハイブリドーマ上清を４℃で一晩インキュベートする。７）二次抗体によるインキュベート：ＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄヤギ抗ウサギ（Ａｂｃａｍ、品番ａｂ６７２１、１：１０００希釈）及びＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄヤギ抗マウス二次抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ, 品番６２－６５２０、１：２０００希釈）。８）発色：ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）で３分間発色させる。９）ヘマトキシリンで対比染色を１分間行い、０．５％ ＨＣｌ－７５％エタノールで数秒液切りし、２０分間水洗、ブルーイングする。１０）脱水・透徹：７０％エタノール、８０％エタノール、９５％エタノール、無水エタノールＩ、無水エタノールＩＩを用いて２分間ずつ脱水し、キシレンＩ及びキシレンＩＩを用いて５分間ずつ透徹化する。１１）封入：中性封入剤で封入する。
コンパニオン診断において、患者の腫瘍組織の生検をした後、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）、組織切片、病理検出を行うことは共通のプロセスである。癌抗原（ＴＡＡ：Ｔｕｍｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）は、ＦＦＰＥ組織切片を行うときに、天然構造が失われ、抗原賦活化（Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）を行っても、一部のコンフォメーション構造をある程度で回復する、又は一部の線状ペプチドセグメントだけを暴露させるしかない。前述の好ましい１２８個の陽性ハイブリドーマクローン上清は、細胞表面の天然ＣＬＤＮ１８．２コンフォメーションに特異的に結合する能力及びＡＤＣＣ機能を備えるものの、コンパニオン診断抗体としては、ＦＦＰＥ組織切片上で抗原特異的結合についてＩＨＣスクリーニングを行われなければならない。本実施例では、ＰＰＦＥ組織切片の免疫組織化学（ＩＨＣ：Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）方法によって、１２８個の陽性ハイブリドーマ上清の３個の遺伝子操作細胞株（ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞、 ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞及びＨＥＫ２９３野生型細胞）セルブロック（ｃｅｌｌ ｂｌｏｃｋ）のパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織切片への結合が検出された。
まず、ＣＬＤＮ１８を安定的に発現させたＨＥＫ２９３セルブロックＦＦＰＥ組織切片についてＩＨＣ染色を行った。これには、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞、及びＨＥＫ２９３野生型細胞の培養、細胞収集、遠心分離・セルブロック形成、脱水・透徹、パラフィン包埋ステップ後、ＦＦＰＥ組織切片及びＩＨＣ染色を行ったことを含む。ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２セルブロックＦＦＰＥ組織切片では陽性発色であるが、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞及びＨＥＫ２９３野生型セルブロックＦＦＰＥ組織切片では陰性染色であるハイブリドーマクローン上清をスクリーニングした。その後、得た陽性ハイブリドーマ上清についてヒト胃癌組織ＦＦＰＥ組織切片でＩＨＣ染色検証を行った。最後に、検証したＩＨＣ陽性染色ハイブリドーマ上清を、正常なヒト胃及び胃癌ＦＦＰＥ組織マイクロアレイ（ＴＭＡ：Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｃｒｏ－Ａｒｒａｙ）でＩＨＣ染色を行い、ＩＨＣ染色強度及び染色比率によって最終的なＩＨＣ陽性染色クローンを決定した。
セルブロックＦＦＰＥ組織切片、胃癌ＦＦＰＥ組織切片、並びに正常な胃及び胃癌ＦＦＰＥ組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）に対するハイブリドーマクローンのＩＨＣ方法は以下のステップを含む。１）脱パラフィン・ベーキング：６０℃、３０分間。２）脱パラフィン：キシレンにて３段（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）浸漬、１段ごとに５分間。３）水和：エタノールで１００％×２回、９５％ ×１回、７５％×１回勾配浸漬、１回３分間、蒸留水で５分間浸漬。４）抗原回復：抗原回復液（Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ、ｐＨ＝９．０）を１００℃の水浴に投入し、ＦＦＰＥ組織切片を抗原回復液に入れて３０分間インキュベートし、室温で３０分間冷却し、ＰＢＳ緩衝液で５分間ずつ３回洗浄する。５）ブロッキング：３％ Ｈ２Ｏ２－ＰＢＳにて室温、遮光下、１０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、その後、５％ ＢＳＡ（ＰＢＳ－ＢＳＡ）にて室温下６０分間インキュベートし、ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄する。６）一次抗体によるインキュベート：ウサギ抗ＣＬＤＮ１８．２市販陽性抗体（ＥＰＲ１９２０２, Ａｂｃａｍ, 品番ａｂ２２２５１２）を１：１００で希釈するか、又はマウスハイブリドーマ上清を４℃で一晩インキュベートする。７）二次抗体によるインキュベート：ＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄヤギ抗ウサギ（Ａｂｃａｍ、品番ａｂ６７２１、１：１０００希釈）及びＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄヤギ抗マウス二次抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ, 品番６２－６５２０、１：２０００希釈）。８）発色：ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）で３分間発色させる。９）ヘマトキシリンで対比染色を１分間行い、０．５％ ＨＣｌ－７５％エタノールで数秒液切りし、２０分間水洗、ブルーイングする。１０）脱水・透徹：７０％エタノール、８０％エタノール、９５％エタノール、無水エタノールＩ、無水エタノールＩＩを用いて２分間ずつ脱水し、キシレンＩ及びキシレンＩＩを用いて５分間ずつ透徹化する。１１）封入：中性封入剤で封入する。
【0085】
図８は、陽性対照である市販抗体ＥＰＲ１９２０２のＨＥＫ２９３セルブロックＦＦＰＥ組織切片のＩＨＣ染色結果を示しており、抗体は、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２を安定的に発現させた細胞株のセルブロックＦＦＰＥ組織切片で特異的に発色し、且つ細胞膜の位置では陽性発色が明らかであり（図８．Ａの矢印参照）、これは、ＣＬＤＮ１８．２が膜タンパク質であるという結論と一致する（図８．Ａ）。一方、抗体は、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１を安定的に発現させた細胞株のセルブロックＦＦＰＥ組織切片では、発色が明らかではなく（図８．Ｂ）、ＨＥＫ２９３野生細胞株では、明らかな発色が認められなかった（図８．Ｃ）。
１２０個のハイブリドーマクローン上清の、３個の細胞株（ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞、及びＨＥＫ２９３野生型細胞）セルブロックのＦＦＰＥ組織切片でのＩＨＣ染色により、４個のハイブリドーマクローン（５－Ｉ５、５－Ｉ１０、５－Ｇ１７及び１０－Ｄ３）を得た。これらのクローン上清は、いずれも、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２セルブロックのＦＦＰＥ組織切片では、陽性ＩＨＣ発色が認められ、一方、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１及びＨＥＫ２９３－ＷＴセルブロックＦＦＰＥ組織切片では、発色無し又は弱発色であった。
ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２セルブロックＦＦＰＥ組織切片上でスクリーニングした４個のＩＨＣ陽性ハイブリドーマクローン上清に対して、ヒト胃癌組織由来のＦＦＰＥ組織切片上でＩＨＣ発色検証を行い、これらのうち、５－Ｉ５ハイブリドーマクローン上清は、３例のヒト胃癌組織ＦＦＰＥ組織切片でのＩＨＣ発色結果として、図９（Ａ、Ｂ、Ｃ）に示すように、抗体の陽性発色が腺上皮細胞位置（矢印で示す）でしか認められず、間質細胞に対しては、明らかな陽性発色反応がないか、又は弱染色（三角矢印で示す）であった。５－Ｉ５は、３例の胃癌組織ＦＦＰＥ組織切片での陽性染色位置、陽性染色組織構造が、陽性対照抗体（ＥＰＲ１９２０２）のＩＨＣ発色結果（図９Ｄ、Ｅ及びＦ）と一致する。
１２０個のハイブリドーマクローン上清の、３個の細胞株（ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞、及びＨＥＫ２９３野生型細胞）セルブロックのＦＦＰＥ組織切片でのＩＨＣ染色により、４個のハイブリドーマクローン（５－Ｉ５、５－Ｉ１０、５－Ｇ１７及び１０－Ｄ３）を得た。これらのクローン上清は、いずれも、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２セルブロックのＦＦＰＥ組織切片では、陽性ＩＨＣ発色が認められ、一方、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１及びＨＥＫ２９３－ＷＴセルブロックＦＦＰＥ組織切片では、発色無し又は弱発色であった。
ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２セルブロックＦＦＰＥ組織切片上でスクリーニングした４個のＩＨＣ陽性ハイブリドーマクローン上清に対して、ヒト胃癌組織由来のＦＦＰＥ組織切片上でＩＨＣ発色検証を行い、これらのうち、５－Ｉ５ハイブリドーマクローン上清は、３例のヒト胃癌組織ＦＦＰＥ組織切片でのＩＨＣ発色結果として、図９（Ａ、Ｂ、Ｃ）に示すように、抗体の陽性発色が腺上皮細胞位置（矢印で示す）でしか認められず、間質細胞に対しては、明らかな陽性発色反応がないか、又は弱染色（三角矢印で示す）であった。５－Ｉ５は、３例の胃癌組織ＦＦＰＥ組織切片での陽性染色位置、陽性染色組織構造が、陽性対照抗体（ＥＰＲ１９２０２）のＩＨＣ発色結果（図９Ｄ、Ｅ及びＦ）と一致する。
【0086】
コンパニオン診断用の抗体として腫瘍関連抗原を高発現させた患者を精度よく識別することは治療に対しては重要な臨床的意義がある。癌患者自体の違いや患者腫瘍組織の異質性が原因で、同一の腫瘍関連抗原に対する異なる診断抗体のＩＨＣ発色結果に差異が生じる場合がよくある。４個のＩＨＣ陽性候補ハイブリドーマ発現上清及び４個の上清の混合物（Ｃｏｃｋｔａｉｌ）については、正常なヒト胃及び胃癌ＦＦＰＥ組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）チップ（Ｂｉｏｍａｘ, ＳＴ８０７）でＩＨＣ発色を行った。抗体インキュベートにおいては、単一のハイブリドーマクローン上清及び陽性対照抗体のインキュベート時間は３０分間、４個のハイブリドーマ上清混合物のインキュベート時間は１２０分間とした。表４には、細胞膜が陽性発色である組織部位及び細胞質が陽性発色である組織部位、組織タイプ及び対応する陽性染色クローンが示されている。５－Ｉ１０、５－Ｇ１７、５－Ｉ５、１０－Ｄ３及びこの４個のクローン上清の混合物は、計７６個の組織部位では、細胞膜陽性発色率がそれぞれ２８．９％、１７．１％、１４．５％、１１．８％、及び２８．９％であり、陽性対照抗体（ＥＰＲ１９２０２）の細胞膜陽性率が２３．７％であった。なお、クローン上清及び陽性抗体は、正常な胃組織では、染色がほぼ全て陽性（５－Ｉ１０ ８７．５％、５－Ｇ１７ ８７．５％、５－Ｉ５ １００％、１０－Ｄ３ ８７．５％、Ｍｉｘ． Ｏｆ ４ １００％、ＥＰＲ１９２０２ １００％）であり、これは、文献で報告された、ＣＬＤＮ１８．２が正常な胃粘膜上皮細胞で特異的に発現されることと一致する(Sahin. U. et al, Human Cancer Biology, 2008, 14(23), 7624-7634)。正常な胃組織の高陽性率染色に比べて、各ハイブリドーマ上清は、胃癌組織では、陽性染色に大きな差があり、胃癌組織では、細胞膜陽性染色率はそれぞれ５－Ｉ１０ ２３．５％、５－Ｇ１７ １０％、５－Ｉ５ ４．４％、１０－Ｄ３ ２．９％、及び４個のハイブリドーマ上清混合物（Ｍｉｘ． Ｏｆ ４ ）２２％であり、これは、胃癌組織の高異質性につながると考えられる。これらの中でも、５－Ｉ１０ハイブリドーマクローン上清は、胃癌組織細胞膜では陽性発色率が最も高く、２３．５％に達し、陽性対照抗体ＥＰＲ１９２０２の１４．７％よりもはるかに高く、また、Zhu G.ら(Zhu G. et al, Sci Rep., 2019, 9: 8420-8431)により報告された１６～２３％の陽性率とほぼ一致する。
ただし、５－Ｉ１０及び５－Ｇ１７は、胃癌ＦＦＰＥ組織では、陽性発色率が高く、且つ、両方の複合（５－Ｉ１０＋５－Ｇ１７）陽性率は最高で２６％に達し、陽性発色胃癌ＦＦＰＥ組織部位は、ほぼ５－Ｉ５及び１０－Ｄ３で現れる陽性部位を含む。このため、組換え発現、精製された５－Ｉ１０と５－Ｇ１７抗体を所定の割合で抗体混合物にしてコンパニオン診断に用いることにより、ＣＬＤＮ１８．２高発現胃癌患者をできるだけ同定することができ、これは、ＣＬＤＮ１８．２を標的とする薬物の臨床投薬を指導することにとっては重要な意義がある。
ただし、５－Ｉ１０及び５－Ｇ１７は、胃癌ＦＦＰＥ組織では、陽性発色率が高く、且つ、両方の複合（５－Ｉ１０＋５－Ｇ１７）陽性率は最高で２６％に達し、陽性発色胃癌ＦＦＰＥ組織部位は、ほぼ５－Ｉ５及び１０－Ｄ３で現れる陽性部位を含む。このため、組換え発現、精製された５－Ｉ１０と５－Ｇ１７抗体を所定の割合で抗体混合物にしてコンパニオン診断に用いることにより、ＣＬＤＮ１８．２高発現胃癌患者をできるだけ同定することができ、これは、ＣＬＤＮ１８．２を標的とする薬物の臨床投薬を指導することにとっては重要な意義がある。
【0087】
【表4-1】
【0088】
【表4-2】
【0089】
実施例５ ＦＦＰＥ組織切片ｈＣＬＤＮ１８．２陽性染色ハイブリドーマクローンのサブクローン及び抗体分子配列の配列決定
本実施例では、ＦＦＰＥ組織切片上でＩＨＣ陽性染色であった４個のハイブリドーマクローン（５－Ｉ１０、５－Ｇ１７、５－Ｉ５及び１０－Ｄ３）について、限界希釈法によってサブクローン及び抗体分子の可変領域配列の配列決定を行った。凍結保存して蘇生させたハイブリドーマクローンを限界希釈し、０．８個（細胞）／ウェルの密度で１９２ウェルプレートに接種し、顕微鏡検査を通じてモノクローンを選択し、１４日間培養後、上清を収集して、フローサイトメトリー分析方法によってサブクローン上清とＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞との特異的結合を検出しながら、モノクローナルを増幅培養した。フローサイトアッセイ方法によって単クローン上清とＨＥＫ２９３－ＣＬＤＮ１８．２細胞（２００００個（細胞）／ウェル）とを４℃で４５分間共インキュベートした後、プレートを洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－４８８－ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ 品番Ａ２８１７５）を二次抗体として、フローサイトメトリー検出を行った。ハイブリドーマごとに、１０個の（５－Ｉ５、９個の）モノクローンを選択して増幅し、凍結保存し、上清を収集して、ＦＦＰＥ組織切片のＩＨＣ発色検証を行った。図１０に示したＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞に対する４個のハイブリドーマの単クローン上清のフローサイトメトリー分析から、単クローン上清はＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞への特異的結合を維持し、且つ、単クローン上清の一部とＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞との結合強度が、対応するハイブリドーマ上清（Ｐａｒｅｎｔａｌ ｓｕｐｅ．）の結合強度に相当することが示された。各ハイブリドーマクローンについてＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞との結合強度が最も高い最初の５個のモノクローン（図９には青枠で示される）上清を選択して、ＦＦＰＥ組織切片のＩＨＣ検証を行った結果、全ての単クローン上清では、ＩＨＣ陽性発色は認められた。各ハイブリドーマについては、ＦＦＰＥ組織切片のＩＨＣ発色強度が最も高い２個のモノクローン（５－Ｉ５－３１と５－Ｉ５－２５、１０－Ｄ３－２２と１０－Ｄ３－２１、５－Ｇ１７－３０と５－Ｇ１７－６、５－Ｉ１０－３３と５－Ｉ１０－１８）を選択して、重鎖及び軽鎖の可変領域の遺伝子クローンシーケンシングを行った。
ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端高速増幅技術）方法を用いて、ハイブリドーマモノクローンのＶＨ及びＶＬのＤＮＡ配列を増幅した。増幅させたハイブリドーマモノクローナル細胞からＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写し、５’－ＲＡＣＥ反応によって５’－のユニバーサルプライマーと３’－Ｈ、Ｌ（κ）又はＬ（λ）ＦＲ１領域の縮重プライマーとの組み合わせを用いて、重鎖又は軽鎖のＶ領域にＰＣＲを行い、ＴＯＰＯ ｃｌｏｎｅ方法でＰＣＲ増幅断片を配列決定ベクターに連結して配列決定を行った。配列決定の結果から明らかなように、５－Ｉ５－３１と５－Ｉ５－２５は同じＶＨを有するが、ＶＬ配列が異なり、このことから、５－Ｉ５－３１と５－Ｉ５－２５は異なるモノクローンであることが示された。５－Ｉ５に加えて、１０－Ｄ３、５－Ｇ１７及び５－Ｉ１０のそれぞれについて配列決定を行った２つのモノクローンはいずれも一致するＶＨ及びＶＬを有し、これらのうち、５－Ｉ１０及び５－Ｇ１７のＶＨ及びＶＬのＤＮＡ配列を表５に示し、対応するアミノ酸配列を表６に示し、ここでは、軽鎖、重鎖のＣＤＲ領域はＣｈｏｔｈｉａ番号系統に応じて分けられる。
本実施例では、ＦＦＰＥ組織切片上でＩＨＣ陽性染色であった４個のハイブリドーマクローン（５－Ｉ１０、５－Ｇ１７、５－Ｉ５及び１０－Ｄ３）について、限界希釈法によってサブクローン及び抗体分子の可変領域配列の配列決定を行った。凍結保存して蘇生させたハイブリドーマクローンを限界希釈し、０．８個（細胞）／ウェルの密度で１９２ウェルプレートに接種し、顕微鏡検査を通じてモノクローンを選択し、１４日間培養後、上清を収集して、フローサイトメトリー分析方法によってサブクローン上清とＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞との特異的結合を検出しながら、モノクローナルを増幅培養した。フローサイトアッセイ方法によって単クローン上清とＨＥＫ２９３－ＣＬＤＮ１８．２細胞（２００００個（細胞）／ウェル）とを４℃で４５分間共インキュベートした後、プレートを洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－４８８－ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ 品番Ａ２８１７５）を二次抗体として、フローサイトメトリー検出を行った。ハイブリドーマごとに、１０個の（５－Ｉ５、９個の）モノクローンを選択して増幅し、凍結保存し、上清を収集して、ＦＦＰＥ組織切片のＩＨＣ発色検証を行った。図１０に示したＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞に対する４個のハイブリドーマの単クローン上清のフローサイトメトリー分析から、単クローン上清はＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞への特異的結合を維持し、且つ、単クローン上清の一部とＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞との結合強度が、対応するハイブリドーマ上清（Ｐａｒｅｎｔａｌ ｓｕｐｅ．）の結合強度に相当することが示された。各ハイブリドーマクローンについてＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞との結合強度が最も高い最初の５個のモノクローン（図９には青枠で示される）上清を選択して、ＦＦＰＥ組織切片のＩＨＣ検証を行った結果、全ての単クローン上清では、ＩＨＣ陽性発色は認められた。各ハイブリドーマについては、ＦＦＰＥ組織切片のＩＨＣ発色強度が最も高い２個のモノクローン（５－Ｉ５－３１と５－Ｉ５－２５、１０－Ｄ３－２２と１０－Ｄ３－２１、５－Ｇ１７－３０と５－Ｇ１７－６、５－Ｉ１０－３３と５－Ｉ１０－１８）を選択して、重鎖及び軽鎖の可変領域の遺伝子クローンシーケンシングを行った。
ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端高速増幅技術）方法を用いて、ハイブリドーマモノクローンのＶＨ及びＶＬのＤＮＡ配列を増幅した。増幅させたハイブリドーマモノクローナル細胞からＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写し、５’－ＲＡＣＥ反応によって５’－のユニバーサルプライマーと３’－Ｈ、Ｌ（κ）又はＬ（λ）ＦＲ１領域の縮重プライマーとの組み合わせを用いて、重鎖又は軽鎖のＶ領域にＰＣＲを行い、ＴＯＰＯ ｃｌｏｎｅ方法でＰＣＲ増幅断片を配列決定ベクターに連結して配列決定を行った。配列決定の結果から明らかなように、５－Ｉ５－３１と５－Ｉ５－２５は同じＶＨを有するが、ＶＬ配列が異なり、このことから、５－Ｉ５－３１と５－Ｉ５－２５は異なるモノクローンであることが示された。５－Ｉ５に加えて、１０－Ｄ３、５－Ｇ１７及び５－Ｉ１０のそれぞれについて配列決定を行った２つのモノクローンはいずれも一致するＶＨ及びＶＬを有し、これらのうち、５－Ｉ１０及び５－Ｇ１７のＶＨ及びＶＬのＤＮＡ配列を表５に示し、対応するアミノ酸配列を表６に示し、ここでは、軽鎖、重鎖のＣＤＲ領域はＣｈｏｔｈｉａ番号系統に応じて分けられる。
【0090】
【表5】
【0091】
【表6】
【0092】
実施例６ 組換えマウスモノクローナル抗体の発現
５－Ｉ１０及び５－Ｇ１７の重鎖及び軽鎖のＶ領域を、それぞれマウスＩｇＧ２ａ型重鎖の定常領域（表７、 Ｍｏｕｓｅ ＩＧＨＣ２Ａ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）及びマウスのκ型軽鎖の定常領域（表７、Ｍｏｕｓｅ ＩＧＫＣ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）と融合し、それぞれ重鎖及び軽鎖の配列のＮ－末端にシグナルペプチドを添加した。５－Ｉ１０及び５－Ｇ１７のマウス重鎖全長遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２, ３３）と軽鎖全長遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４, ３５）を合成して発現ベクターにクローニングし、配列決定を行って検証した（金唯智生物科技有限公司、蘇州）。候補分子ごとに構築された発現プラスミドに対して増幅及びプラスミド抽出を行い、アガロースゲル電気泳動を通じて検証し、トランスフェクション材料として使用した。
ＨＥＫ２９３細胞を振とうフラスコに接種して、化学成分が明確な無血清培地を用いて懸濁種子培養を行った。トランスフェクションの前日に、増幅させたＨＥＫ２９３細胞を新しい振とうフラスコに接種して、新しい培地に変換した。５－Ｉ１０及び５－Ｇ１７の重鎖及び軽鎖の発現プラスミドをそれぞれＨＥＫ２９３細胞に共トランスフェクションし、細胞活性が低下するまで振とうフラスコで培養して、上清を収集して産物精製を行った。好ましくは上清液に対する遠心分離及びろ過によって、大部分の細胞破片及び不溶性微粒子を除去し、その後、試料液をＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラムに注入し、抗体分子を充填剤におけるＰｒｏｔｅｉｎ Ａと結合し、平衡化ステップの後に、大部分の不純物を除去し、低ｐＨの溶出液で抗体タンパク質を溶出して、画分を収集した。ｐＨを調整して限外ろ過を通じて製剤緩衝液に置換した。最後にＯＤ２８０を測定してタンパク質の濃度を算出した。図１１に示すように、５－Ｉ１０及び５－Ｇ１７モノクローナル抗体の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる電気泳動図から、重鎖及び軽鎖のバンド位置が陽性対照ＩｇＧの重鎖及び軽鎖の位置と一致することが示され、分子量は予測通りであり、明らかな不純物バンドがなく、タンパク質の純度は９５％よりも高かった。
５－Ｉ１０及び５－Ｇ１７の重鎖及び軽鎖のＶ領域を、それぞれマウスＩｇＧ２ａ型重鎖の定常領域（表７、 Ｍｏｕｓｅ ＩＧＨＣ２Ａ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）及びマウスのκ型軽鎖の定常領域（表７、Ｍｏｕｓｅ ＩＧＫＣ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）と融合し、それぞれ重鎖及び軽鎖の配列のＮ－末端にシグナルペプチドを添加した。５－Ｉ１０及び５－Ｇ１７のマウス重鎖全長遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２, ３３）と軽鎖全長遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４, ３５）を合成して発現ベクターにクローニングし、配列決定を行って検証した（金唯智生物科技有限公司、蘇州）。候補分子ごとに構築された発現プラスミドに対して増幅及びプラスミド抽出を行い、アガロースゲル電気泳動を通じて検証し、トランスフェクション材料として使用した。
ＨＥＫ２９３細胞を振とうフラスコに接種して、化学成分が明確な無血清培地を用いて懸濁種子培養を行った。トランスフェクションの前日に、増幅させたＨＥＫ２９３細胞を新しい振とうフラスコに接種して、新しい培地に変換した。５－Ｉ１０及び５－Ｇ１７の重鎖及び軽鎖の発現プラスミドをそれぞれＨＥＫ２９３細胞に共トランスフェクションし、細胞活性が低下するまで振とうフラスコで培養して、上清を収集して産物精製を行った。好ましくは上清液に対する遠心分離及びろ過によって、大部分の細胞破片及び不溶性微粒子を除去し、その後、試料液をＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラムに注入し、抗体分子を充填剤におけるＰｒｏｔｅｉｎ Ａと結合し、平衡化ステップの後に、大部分の不純物を除去し、低ｐＨの溶出液で抗体タンパク質を溶出して、画分を収集した。ｐＨを調整して限外ろ過を通じて製剤緩衝液に置換した。最後にＯＤ２８０を測定してタンパク質の濃度を算出した。図１１に示すように、５－Ｉ１０及び５－Ｇ１７モノクローナル抗体の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる電気泳動図から、重鎖及び軽鎖のバンド位置が陽性対照ＩｇＧの重鎖及び軽鎖の位置と一致することが示され、分子量は予測通りであり、明らかな不純物バンドがなく、タンパク質の純度は９５％よりも高かった。
【0093】
【表7】
【0094】
実施例７ 組換えマウスモノクローナル抗体のＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２結合活性
フローサイトメトリーによって、５－Ｉ１０及び５－Ｇ１７精製モノクローナル抗体のＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２への結合を検証し、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２を９６ウェルＵ字底プレート（１．５×１０５個／ウェル）に接種し、１％ ＦＢＳ含有のＰＢＳ緩衝液でプレートを１回洗浄し、５－Ｉ１０及び５－Ｇ１７精製モノクローナル抗体をそれぞれＰＢＳ（１％ ＦＢＳ）で希釈し、１０μｇ／ｍＬ濃度から３倍勾配希釈を行い、合計８個の濃度を取得し、９６ウェルＵ字底プレートに１００μＬ／ウェルで加え、４℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ（１％ ＦＢＳ）で１回洗浄し、１：１０００希釈Ａｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗マウス二次抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ, Ａ１１００１）を１００μＬ／ウェルで加え、４℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ（１％ ＦＢＳ）で２回洗浄後、２００μＬ ＰＢＳ（１％ ＦＢＳ）で再懸濁し、ＦＡＣＳにより検出した。図１２は、５－Ｉ１０及び５－Ｇ１７精製モノクローナル抗体のＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２への結合の曲線を示し、両方は用量依存的にＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合することができ、結合能力が同じであった。
フローサイトメトリーによって、５－Ｉ１０及び５－Ｇ１７精製モノクローナル抗体のＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２への結合を検証し、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２を９６ウェルＵ字底プレート（１．５×１０５個／ウェル）に接種し、１％ ＦＢＳ含有のＰＢＳ緩衝液でプレートを１回洗浄し、５－Ｉ１０及び５－Ｇ１７精製モノクローナル抗体をそれぞれＰＢＳ（１％ ＦＢＳ）で希釈し、１０μｇ／ｍＬ濃度から３倍勾配希釈を行い、合計８個の濃度を取得し、９６ウェルＵ字底プレートに１００μＬ／ウェルで加え、４℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ（１％ ＦＢＳ）で１回洗浄し、１：１０００希釈Ａｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗マウス二次抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ, Ａ１１００１）を１００μＬ／ウェルで加え、４℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ（１％ ＦＢＳ）で２回洗浄後、２００μＬ ＰＢＳ（１％ ＦＢＳ）で再懸濁し、ＦＡＣＳにより検出した。図１２は、５－Ｉ１０及び５－Ｇ１７精製モノクローナル抗体のＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２への結合の曲線を示し、両方は用量依存的にＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合することができ、結合能力が同じであった。
【0095】
実施例８ 組換えマウスモノクローナル抗体の胃癌ＦＦＰＥ組織切片での陽性染色
６例の胃癌ＦＦＰＥ組織切片で５－Ｉ１０及び５－Ｇ１７精製モノクローナル抗体のＣＬＤＮ１８．２ ＩＨＣ陽性染色について検証を行い、ＥＰＲ１９２０２を陽性対照とした。ＩＨＣ染色ステップは実施例４の記載と同じであり、ただし、一次抗体をインキュベートするステップでは、陽性対照抗体ＥＰＲ１９２０２の作動濃度は１：１００希釈、５－Ｉ１０及び５－Ｇ１７精製抗体の作動濃度は５μｇ／ｍＬとした。図１３に示す発色結果から、組換え精製マウスＩｇＧ２ａ型５－Ｉ１０及び５－Ｇ１７モノクローナル抗体は、複数例の胃癌組織ＦＦＰＥ組織切片では、陽性染色であった。５－Ｇ１７及び５－Ｉ１０の陽性染色率は、それぞれ、８３．３％（５／６）及び６６．７％（４／６）に達し、陽性対照抗体ＥＰＲ１９２０２の５０％（３／６）よりも大幅に高かった。組織Ｓ０７－３７３５８－２Ａ、Ｓ０８－１９３４６及びＳ１０－３６００９－３では、胃癌細胞は、明らかな胃腺上皮構造を形成し、５－Ｉ１０、５－Ｇ１７及び陽性対照抗体ＥＰＲ１９２０２は、いずれも、強い腺上皮細胞の特異的染色が認められ、一方、間質細胞では、染色がなかった。Ｓ１１－４７２５－１組織では、胃癌細胞は腺様構造を形成したが、前述切片での腺構造とは明らかに異なり、陽性対照ＳＰＲ１９２０２は、明らかなＩＨＣ染色がなく、一方、５－Ｉ１０及び５－Ｇ１７は、びまん性の強い陽性染色があり、腺様上皮細胞及び間質細胞のいずれも染色が認められた。Ｓ０９－１５７８５－２ＦＳ及びＳ０７－７９３９－Ｃ切片での腫瘍細胞は明らかな腺構造を形成しておらず、これらのうち、Ｓ０９－１５７８５－２ＦＳでは、陽性対照ＳＰＲ１９２０２、５－Ｉ１０及び５－Ｇ１７のいずれも、ＩＨＣ陽性染色がなかった。Ｓ０７－７９３９－Ｃでは、５－Ｇ１７だけはＩＨＣ弱陽性染色を示した。
６例の胃癌ＦＦＰＥ組織切片で５－Ｉ１０及び５－Ｇ１７精製モノクローナル抗体のＣＬＤＮ１８．２ ＩＨＣ陽性染色について検証を行い、ＥＰＲ１９２０２を陽性対照とした。ＩＨＣ染色ステップは実施例４の記載と同じであり、ただし、一次抗体をインキュベートするステップでは、陽性対照抗体ＥＰＲ１９２０２の作動濃度は１：１００希釈、５－Ｉ１０及び５－Ｇ１７精製抗体の作動濃度は５μｇ／ｍＬとした。図１３に示す発色結果から、組換え精製マウスＩｇＧ２ａ型５－Ｉ１０及び５－Ｇ１７モノクローナル抗体は、複数例の胃癌組織ＦＦＰＥ組織切片では、陽性染色であった。５－Ｇ１７及び５－Ｉ１０の陽性染色率は、それぞれ、８３．３％（５／６）及び６６．７％（４／６）に達し、陽性対照抗体ＥＰＲ１９２０２の５０％（３／６）よりも大幅に高かった。組織Ｓ０７－３７３５８－２Ａ、Ｓ０８－１９３４６及びＳ１０－３６００９－３では、胃癌細胞は、明らかな胃腺上皮構造を形成し、５－Ｉ１０、５－Ｇ１７及び陽性対照抗体ＥＰＲ１９２０２は、いずれも、強い腺上皮細胞の特異的染色が認められ、一方、間質細胞では、染色がなかった。Ｓ１１－４７２５－１組織では、胃癌細胞は腺様構造を形成したが、前述切片での腺構造とは明らかに異なり、陽性対照ＳＰＲ１９２０２は、明らかなＩＨＣ染色がなく、一方、５－Ｉ１０及び５－Ｇ１７は、びまん性の強い陽性染色があり、腺様上皮細胞及び間質細胞のいずれも染色が認められた。Ｓ０９－１５７８５－２ＦＳ及びＳ０７－７９３９－Ｃ切片での腫瘍細胞は明らかな腺構造を形成しておらず、これらのうち、Ｓ０９－１５７８５－２ＦＳでは、陽性対照ＳＰＲ１９２０２、５－Ｉ１０及び５－Ｇ１７のいずれも、ＩＨＣ陽性染色がなかった。Ｓ０７－７９３９－Ｃでは、５－Ｇ１７だけはＩＨＣ弱陽性染色を示した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-10-21
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＬＤＮ１８．２抗体であって、重鎖ＣＤＲｓと軽鎖ＣＤＲｓとを含み、前記重鎖ＣＤＲｓは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＣＤＲ３を含むか、又は
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されるＣＤＲ３を含み、
前記軽鎖ＣＤＲｓは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるＣＤＲ３を含むか、又は
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるＣＤＲ３を含む、ＣＬＤＮ１８．２抗体。
【請求項2】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示される重鎖可変領域を含み、及び／又は
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示される軽鎖可変領域を含み、
好ましく、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示される重鎖可変領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示される軽鎖可変領域とを含み、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示される重鎖可変領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示される軽鎖可変領域とを含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項3】
キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体である、請求項１～２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項4】
全長抗体であり、好ましく、ＩｇＧ抗体である、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項5】
ＣＬＤＮ１８．２に結合する抗体断片であり、好ましくはＦａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ又は（Ｆａｂ’）
２
である、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項6】
多重特異性抗体又は二重特異性抗体であり、好ましく、前記多重特異性抗体又は二重特異性抗体は第２生物分子に結合する結合ドメインを含み、前記第２生物分子は細胞表面抗原であり、更に好ましく、前記細胞表面抗原は腫瘍抗原であり、更に好ましく、前記腫瘍抗原は、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＦｃＲＨ５、ＨＥＲ２、ＬＹＰＤ１、ＬＹ６Ｇ６Ｄ、ＰＭＥＬ１７、ＬＹ６Ｅ、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＥＤＡＲ、ＧＦＲＡ１、ＭＲＰ４、ＲＥＴ、Ｓｔｅａｐ１、及びＴｅｎＢ２から選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項7】
請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体に連結される治療剤、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）受容体アゴニスト、サイトカイン、放射性核種又は酵素を含み、好ましく、前記治療剤は化学療法薬又は細胞傷害性剤である、免疫複合体。
【請求項8】
請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片を含む融合タンパク質又はポリペプチド。
【請求項9】
請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体、請求項７に記載の免疫複合体、請求項８に記載の融合タンパク質又はポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項10】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１８～２９の１つのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含み、好ましく、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：３６～３９のうちの１つのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含み、更に好ましく、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項11】
請求項１０に記載のポリヌクレオチド配列を含む、ベクター。
【請求項12】
請求項１０に記載のポリヌクレオチド配列又は請求項１１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項13】
請求項１２に記載の宿主細胞を培養して培養物から前記抗体を単離することを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体の製造方法。
【請求項14】
請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体、請求項７に記載の免疫複合体、請求項８に記載の融合タンパク質又はポリペプチドの、癌を診断、好ましく胃癌、膵臓癌又は食道癌を診断における使用。
【請求項15】
請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む癌検出試薬であって、好ましく、前記抗体又はその抗原結合断片は化学的に標識されたものであり、更に好ましく、前記標識は酵素標識、蛍光標識、同位体標識又は化学発光物標識である、癌検出試薬。
【国際調査報告】