特表 2023-513403 パーキンソン病の治療における使用のための、アネトールトリチオンまたはその誘導体４－ＯＨ－アネトールトリチオンとドキシサイクリンまたはミノサイクリンとの組合せ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-30

(54)【発明の名称】パーキンソン病の治療における使用のための、アネトールトリチオンまたはその誘導体４－ＯＨ－アネトールトリチオンとドキシサイクリンまたはミノサイクリンとの組合せ

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/385 20060101AFI20230323BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20230323BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230323BHJP

   A61K 31/65 20060101ALI20230323BHJP

【ＦＩ】

A61K31/385

A61P25/16

A61P43/00 111

A61K31/65

A61P43/00 121

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022573799

(86)(22)【出願日】2021-02-11

(85)【翻訳文提出日】2022-10-07

(86)【国際出願番号】 FR2021050244

(87)【国際公開番号】W WO2021160968

(87)【国際公開日】2021-08-19

(31)【優先権主張番号】2001355

(32)【優先日】2020-02-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522319837

【氏名又は名称】プティジャン，オリヴィエ

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】プティジャン，オリヴィエ

【テーマコード（参考）】

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C086AA01

4C086AA02

4C086BB04

4C086DA29

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZA02

4C086ZC41

4C086ZC75

(57)【要約】

本発明は、パーキンソン病を治療する分野に関する。より詳細には、本発明は、パーキンソン病の治療における、アネトールトリチオン単独の使用、または抗シヌクレインテトラサイクリンと組み合わせた使用に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

パーキンソン病の治療における使用のための、アネトールトリチオンまたはその誘導体４－ＯＨ－アネトールトリチオンから選択される、ミトコンドリア起源のＲＯＳの産生を阻害する分子。

【請求項2】

前記分子の１日量が、３００ｍｇ～１２００ｍｇ／日である、請求項１に記載の使用のための、請求項１に記載の分子。

【請求項3】

前記治療が、前記パーキンソン病の初期段階の患者または無症候性患者を対象とする、請求項１または請求項２のいずれかに記載の使用のための、請求項１または請求項２に記載の分子。

【請求項4】

（ｉ）アネトールトリチオンまたはその誘導体４－ＯＨ－アネトールトリチオンから選択される、ミトコンドリア起源のＲＯＳの産生を阻害する分子と、（ｉ）抗シヌクレインテトラサイクリンとの、パーキンソン病の治療における使用のための、組合せ。

【請求項5】

前記テトラサイクリンが、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、またはそれらの誘導体の１つから選択される、請求項４に記載の組合せ。

【請求項6】

アネトールトリチオンまたはその誘導体４－ＯＨ－アネトールトリチオンの１日量が３００ｍｇ～１２００ｍｇであり、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、またはそれらの誘導体の１日量が３０ｍｇ～２００ｍｇである、請求項１に記載の使用のための、請求項５に記載の組合せ。

【請求項7】

ＡＴＴがドキシサイクリンと組み合わされる、請求項４～６のいずれか一項に記載の使用のための、請求項４～６のいずれか一項に記載の組合せ。

【請求項8】

Ｌ－ＤＯＰＡによる治療を受けている患者における、請求項４～６のいずれか一項に記載の使用のための、請求項４～６のいずれか一項に記載の組合せ。

【請求項9】

前記治療は、前記パーキンソン病の初期段階の患者または無症候性患者を対象とする、請求項４～７のいずれか一項に記載の使用のための、請求項４～８のいずれか一項に記載の組合せ。

【請求項10】

（ｉ）アネトールトリチオンまたはその誘導体４－ＯＨ－アネトールトリチオンなどのミトコンドリア起源のＲＯＳの産生を阻害する分子、（ｉｉ）抗シヌクレインテトラサイクリン、および（ｉｉｉ）担体を含む、薬学的組成物。

【請求項11】

１００ｍｇ～４００ｍｇのアネトールトリチオンまたはその誘導体４－ＯＨ－アネトールトリチオン、およびドキシサイクリン、ミノサイクリン、またはそれらの誘導体の１つから選択される１０ｍｇ～６５ｍｇのテトラサイクリンを含む、請求項１０に記載の薬学的組成物。

【請求項12】

ＡＴＴおよびドキシサイクリンを含む、請求項１０または請求項１１に記載の薬学的組成物。

【請求項13】

パーキンソン病の治療における使用のための、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項14】

Ｌ－ＤＯＰＡによる治療を受けている患者における、請求項１３に記載の使用のための、請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

（ｉ）ＡＴＸと（ｉｉ）ドキシサイクリンもしくはミノサイクリンのＣ９誘導体の１つとの、キメラ。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

本発明は、パーキンソン病を治療する分野に関する。より詳細には、本発明は、パーキンソン病の治療における、アネトールトリチオン（ＡＴＴ）または４－ヒドロキシ－アネトールトリチオン（ＡＴＸ）などのミトコンドリア起源のＲＯＳの産生を阻害する分子の、それ単独での、またはドキシサイクリンなどの抗シヌクレインテトラサイクリンとの組合せにおける使用に関する。

【0002】

〔従来技術〕
パーキンソン病は、中枢神経系に影響を及ぼす慢性変性神経疾患である。パーキンソン病は、振戦、運動の遅さ、および筋肉のこわばりを引き起こす。この疾患は長期間未治療のままであった。

【0003】

パーキンソン病（ＰＤ）の治療が実際に始まったのは、１９７０年にＦＤＡが発行したＬ－ＤＯＰＡの承認を得てからであり、中枢レベルで観察されるドーパミン欠乏を回復することを目的とした治療であった。この論理は、種々のドーパミン作動性アゴニストの場合と同様に、Ｌ－ＤＯＰＡ、ＣＯＭＴおよびＩＭＡＯ－Ｂ代謝阻害剤の市場への配置と共に繰り返される。全ての場合において、これらは、運動障害に作用し、その効果が時間と共に否応なく減少する、厳密に対症的な補助的治療である。

【0004】

多くの治療標的が同定されているが、それらのいずれも臨床的に検証されていない。これらの異なるアプローチの中で、ロチゴチン（ＵＳ２００７／０１９１４７０）、グリシンの部分的アゴニスト（ＵＳ２００４／００８７５９６）、ドーパミン作動薬とニコチン受容体アゴニストまたはニコチン受容体との組合せ（ＥＰ１９７７７４６）などを挙げることができる。

【0005】

今日まで、パーキンソン病の病因学的治療はない。

【0006】

〔発明の開示〕
本発明者は、パーキンソン病に関与する２つの経路の阻害を組み合わせた新しい治療アプローチを提案する。提案された戦略は図１に示されている。この戦略は、ドーパミン作動性ニューロンの死は、ミトコンドリアのＲＯＳとシナプス前終末に存在するα－シヌクレイン由来の毒性オリゴマーとの間に形成され、かつ自己持続性である悪循環に本質的に起因するという、これまでに提唱されたことのない仮説に基づいている。この主要メカニズムに追加されたものは：
・ ミトコンドリア機能不全に寄与しそれによってＲＯＳの産生に寄与する、炎症誘発性因子の放出に関与するミクログリアの活性化、および
・ ＲＯＳと負の循環を形成し、この破壊的システムの維持に関与する、ＭＭＰ、特にＭＭＰ３の活性化
である（図２参照）。

【0007】

したがって、本発明は、以下を組み合わせることによってこの悪循環を破ることを提案する：
－ アネトールトリチオン（ＡＴＴ）を投与することによって、ミトコンドリアレベルでのＲＯＳの産生の阻止、と共に
－ ドキシサイクリンとＡＴＴとの併用投与という手法による、毒性オリゴマーの産生を止めるためのα－シヌクレイン－プロトフィブリルの平衡の安定化。

【0008】

一方で、アネトールトリチオン（ＡＴＴ）は、呼吸鎖のＩｑ複合体におけるＲＯＳの産生を阻止する特性を有し（Ｄｅｔａｉｌｌｅ， ２０１９）；この阻止は、ＭＰＴＰによる毒性からドーパミン作動性ニューロンを保護する（ＷＯ２０１７／０４２２６７のマウスで実施された急性モデルに示されるように）。

【0009】

ＡＴＴは、ＡＴＴのフェノール形態に対応するＡＴＸによって置換され得る。

【0010】

他方で、ドキシサイクリンは（ｉ）プロトフィブリルに結合し、それによって、毒性オリゴマーの産生ならびにこれらの毒性オリゴマーの介在ニューロン伝播（シード効果）を阻止することによる抗アミロイド活性を示すが（Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｌｉｚａｒｒａｇａ， ２０１７）、（ｉｉ）ミクログリアの活性化に伴う炎症反応に対抗し（Ｂｏｒｔｏｌａｎｚａ， ２０１８）、さらにドーパミン作動性ニューロンにおけるＭＰＰの放出および発現を減少させもする（Ｂａｒｔｏｌａｎｚａ， ２０１８； Ｓａｎｔａ－Ｃｅｃｉｌｉａ， ２０１９）。

【0011】

ドキシサイクリンは、パーキンソン病の治療の適応において、提案された適応において利用できるドキシサイクリンといくつかの特性を共有するミノサイクリンまたは他のテトラサイクリンに置き換えることができることに留意すべきである。

【0012】

さらに、本発明者は、ＡＴＴがまた、毒性オリゴマーの形成を阻害することができ、ドーパミン作動性ニューロンに関して神経保護的役割を果たすことができることを示した。この結果は、それ単独で既に顕著であるが、ＡＴＴがドキシサイクリンと組み合わされた場合、強力な相乗効果を伴う。

【0013】

したがって、本発明者は、ＡＴＴの単独での使用が、通常投与される投与量、すなわち最大１日量７５ｍｇ（Ｓｕｒｆａｌｅｍ（登録商標）の用量を参照）よりも高い投与量で、パーキンソン病の症状に顕著な効果を有することを実証した；パーキンソン病の治療において、考慮される投与量は少なくとも３００ｍｇ／日である。

【0014】

したがって、本発明は、パーキンソン病の治療のための、それ単独での、または抗シヌクレインテトラサイクリンとの組合せにおける、ＡＴＴまたはＡＴＸの使用に関する。

【0015】

〔発明の利点〕
本発明は、パーキンソン病に対する最初の病因学的治療アプローチを構成する。本発明は、長期間（現時点での追跡によれば、少なくとも３年間）にわたって維持される症状の好転を可能にし、それゆえ、患者に真の利益をもたらす。

【0016】

臨床症例で収集された知見は、疾患の種々の生理学的側面を代表するモデルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される分析によって確認される。以下に示される実験結果は、パーキンソン病の２つの主要な構成要素、すなわちミクログリアの活性化およびα－シヌクレインの凝集に対して両方を阻害する、ＡＴＸの直接的な効果を証明する。これらの結果は、それだけで、ＡＴＸ（またはＡＴＴ）を、パーキンソン病の治療における目的の候補とする。さらに、ＡＴＸと、α－シヌクレイン阻害剤、この場合ドキシサイクリンと、の組合せは、炎症の低減に対して相乗効果を有することが示される。この組合せはまた、ドーパミン作動性ニューロンの神経保護に相乗的に作用する。さらに、機能不全メカニズムの発生を回避することは非常に興味深い。前記組合せはまた、「シード効果」（すなわち伝播効果）を阻害すること、およびそれによって疾患の進行を予防することを可能にする。

【0017】

ＡＴＴとテトラサイクリンとを組み合わせた治療の有益な効果は、少なくとも、患者の状態の安定化を誘導することによって、全てのパーキンソン病患者において期待される。しかしながら、最初の症状が現れたばかりの初期段階の患者におけるこの治療の実施は、または疾患を発症する可能性が高い患者における予防手段としてさえ、症状の非常に顕著な（おそらくは全面的な）退行を可能にし、患者が長期間にわたってこの状態を維持することができることが予見可能である。

【0018】

すべてのパーキンソン病患者に利用可能なこの革新的な治療アプローチは、市場で入手可能な分子の使用に基づくものであり、その無害性が長い間にわたって確立されているという事実によって促進される。この側面は、医師および患者によるその採用にとって非常に好ましい。

【0019】

〔発明の詳細な説明〕
本発明の第１の目的は、パーキンソン病を治療するための、アネトールトリチオン（ＡＴＴ）またはその誘導体４－ＯＨ－アネトールトリチオン（ＡＴＸ）などの、ミトコンドリア起源のＲＯＳの産生を阻害する分子の使用に関し、ここで、１日量は、３００ｍｇ～１２００ｍｇである。

【0020】

ＡＴＴおよびＡＴＸは、ミトコンドリア起源のＲＯＳの２つの特異的阻害剤である。

【0021】

ＡＴＸは、ヒトおよび動物の両方において、肝臓によって代謝されるＡＴＴのフェノール形態に対応する。この４－ＯＨ－アネトールトリチオン形態は、既に記載されている（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ， ２００８， ４７： ６１２－６１７）。ＡＴＴの構造は、この代謝中に保存されるので、ＡＴＴが有していた抗ＲＯＳ活性がＡＴＸにおいて見出されると考える十分な理由があり、特に、現在市販されている形態である経口投与の後に見出される循環生成物の主要部分はＡＴＸである（Ｙｕ， ２０１１）。さらに、ＡＴＸは、エステルの形成を可能にするパラ－フェノール基を有する。

【0022】

特定の実施形態において、ＡＴＸがそのエステル化形態で、例えば以下のエステル形態：フォスフェート、エチリデンフォスフェート、サルフェート、ヘミスクシネート、アセテート、プロピオネート、イソブチレート、ヘキサノエート、ピバレート、エトキシカーボネート、ニコチネート、またはグリシン、ジエチルグリシン、もしくはバリンエステルなどのアミノ酸のエステルで使用され、このリストは全てを網羅していない。

【0023】

提案された投与量は、末梢損傷を引き起こす疾患を治療するために先行技術において提案された投与量よりも著しく高い。実際、３００ｍｇ～１２００ｍｇ／日の投与量は、血液脳関門を通過した後に活性分子がニューロンに到達することを可能にするために必要であると考えられる。この投与量は、例えば、１日あたり、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、１０００ｍｇまたは１２００ｍｇのように、病期および／または患者に応じて調節することができる。

【0024】

この病状の標的細胞であるドーパミン作動性ニューロンにおけるＡＴＴまたはＡＴＸの一定水準を可能な限り確実にするために、この投与量を、１日にわたって一定の間隔で、２回分、３回分または４回分に分けて投与することが好ましい。好ましくは、投与は３回に分割される。患者の生活の質を高めるために、２回に分けて服用することができる。

【0025】

２４時間にわたって患者の尿中にＡＴＴがほとんど見出され得ないほどに、ＡＴＴはＯ－脱メチル化を介してＡＴＸにほぼ直ちにかつ完全に代謝されるので、ＡＴＸがＡＴＴの活性の大部分を有する限り、ＡＴＸの投与量は、ＡＴＴについて提案された投与量と同じである（Ｈｅ Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ． ２０１１， ５４： ５５１－５５６； Ｌｉ ＴＭ． ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ ２００７， ５９４： ２７４－２７８； Ｌｉ ＷＹ． ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ． ２００８， ４７： ６１２－６１７）。

【0026】

ＡＴＴまたはＡＴＸの単剤療法の使用は、症状の発症のための一次予防的治療として、または最初の症状を緩和もしくは取り除き、且つその進行を減速もしくは停止させると考えられ得る。実際、ＡＴＴは炎症の阻害およびドーパミン作動性ニューロンにおける毒性凝集体の形成の両方に対して阻害効果を有し、これは、シード効果に関連する疾患の広がりを防止することを可能にする。したがって、本発明の好ましい実施形態において、ＡＴＴは、疾患の第１の症状（初期段階）を示す患者またはパーキンソン病を発症する可能性が高い患者に投与される。

【0027】

ＡＴＴ治療は特に、疾患の初期段階の患者または無症候性患者を対象とする。

【0028】

「無症候性患者」はパーキンソン病を発症する可能性が高いと診断されたが、症状を呈さない患者を意味すると理解される。

【0029】

ＡＴＴまたはＡＴＸは、Ｌ－ＤＯＰＡで治療された患者に投与することもできる。この実施形態では、Ｌ－ＤＯＰＡで長期間治療された患者が経験する運動障害症状が改善することが期待される。さらに、ＡＴＴ－テトラサイクリンの組合せを投与することにより、Ｌ－ＤＯＰＡの投与量を減らすことができ、その結果、運動障害の副作用が消失するという結果と共に、症状を制御することが可能になる。

【0030】

本発明の第２の目的は、パーキンソン病を治療するための、（ｉ）ＡＴＴまたはその誘導体ＡＴＸなどの、ミトコンドリア起源のＲＯＳの産生を阻害する分子と、（ｉｉ）抗シヌクレインテトラサイクリンとの組合せの使用に関する。

【0031】

「抗シヌクレインテトラサイクリン」とは、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、グリシルサイクリン、エラバサイクリン、オマダサイクリン、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、またはそれらの誘導体の１つを意味すると理解される。

【0032】

「ドキシサイクリン誘導体」は、９－アミノ－ドキシサイクリンおよび９－アミノメチル－ドキシサイクリン、およびそれらのそれぞれのアシル化誘導体、ならびに９－アミノ－４－デジメチルアミノ－ドキシサイクリンおよび９－アミノメチル－４－デジメチルアミノ－ドキシサイクリン、およびそれらのそれぞれのアシル化誘導体を意味すると理解される。

【0033】

「ミノサイクリン誘導体」は、９－アミノ－ミノサイクリンおよび９－アミノメチル－ミノサイクリン、ならびにそれらのそれぞれのアシル化誘導体を意味すると理解される。

【0034】

この使用の特定の実施形態では、ＡＴＴまたはその誘導体ＡＴＸの１日量が３００ｍｇ～１２００ｍｇであり、ドキシサイクリンもしくはミノサイクリン、またはそれらの誘導体の１つの１日量は３０ｍｇ～２００ｍｇである。

【0035】

投与量は、疾患の段階および／または患者に応じて変わり得る。ドキシサイクリンまたはミノサイクリンの投与量は、例えば、１日当たり、３０ｍｇ～６０ｍｇ、６０ｍｇ～９０ｍｇ、９０ｍｇ～１２０ｍｇ、またさらには１２０ｍｇ～２００ｍｇであり得る。この１日量は、２回分、３回分または４回分、好ましくは２回分または３回分に分割される。

【0036】

好ましい実施形態において、この組合せは、ＡＴＴおよびドキシサイクリンを含む。

【0037】

ＡＴＴまたはＡＴＸと、ドキシサイクリンまたはミノサイクリンとの組合せは、おそらくそのような治療に加えて、確立された治療が失敗するメカニズムの発生に対する予防的または治癒的アプローチにおいて提案され得る。

【0038】

本発明の好ましい実施形態において、ＡＴＴおよびテトラサイクリンの組合せは、疾患の第１の症状（初期段階）を示す患者またはパーキンソン病を発症する可能性が高い患者に投与される。これらの患者において、予想される効果、すなわち、症状の消失またはその出現の予防および長期的な疾患の安定化は、より顕著である。

【0039】

ＡＴＴ＋テトラサイクリンの組合せは特に、疾患の初期段階の患者または無症候性患者を対象とする。

【0040】

分子のこの組合せは、Ｌ－ＤＯＰＡによる治療を受けている患者に投与することができる。これらの２つの治療は相補的であると考えることができる：ＡＴＴ／ＡＴＸ－テトラサイクリンの組合せは、パーキンソン病における２つの主要な作用メカニズムを阻害することを可能にし、一方で、Ｌ－ＤＯＰＡはドーパミン作動性ニューロンの機能の喪失を補償する。したがって、２つの治療は、一方ではドーパミン作動性ニューロンの消失の原因に対して、他方では存在する症状を緩和するためにドーパミン水準に対して、相補的な方法で作用することができる。これらの２つの治療を組み合わせることは、特に、標的治療経路の１つが失敗した場合に、完全に有利であり得る。

【0041】

本発明の第３の目的は、ＡＴＴまたはＡＴＸなどのミトコンドリア起源のＲＯＳの産生を阻害する分子、抗シヌクレインテトラサイクリン、および担体を含む薬学的組成物に関する。

【0042】

このような組成物は、１日当たり２回または３回の医薬品投与量を可能にするように製剤化することができる。例として、１日当たり３回の投与量の場合、このような組成物は、１００ｍｇ～４００ｍｇのＡＴＴまたはＡＴＸ、および１０ｍｇ～６５ｍｇのドキシサイクリンもしくはミノサイクリンまたはそれらの誘導体の１つを含んでいてもよい。１日当たり２回の投与量の場合、このような組成物は、１５０ｍｇ～６００ｍｇのＡＴＴまたはＡＴＸ、および１５ｍｇ～９８ｍｇのドキシサイクリンもしくはミノサイクリン、またはそれらの誘導体の１つを含んでいてもよい。

【0043】

好ましい実施形態において、薬学的組成物は、ＡＴＴおよびドキシサイクリンを含む。

【0044】

本発明の第４の目的は、（ｉ）ＡＴＴなどの、ミトコンドリア起源のＲＯＳの産生を阻害する分子、（ｉｉ）抗シヌクレインテトラサイクリン、および（ｉｉｉ）パーキンソン病を治療するための担体を含む、薬学的組成物の使用に関する。

【0045】

この組成物は、Ｌ－ＤＯＰＡで治療された患者、特にＬ－ＤＯＰＡ投薬を受けているにもかかわらず症状を示す患者に投与することができる。

【0046】

本発明の第５の目的は、（ｉ）ＡＴＸと（ｉｉ）ドキシサイクリンもしくはミノサイクリンなどの抗シヌクレインテトラサイクリン誘導体とのキメラに関する。

【0047】

「キメラ」は、縮合生成物とも呼ばれ、４－ＯＨ－アネトールトリチオン（ＡＴＸ）とドキシサイクリンまたはミノサイクリンの９位の誘導体の１つとの縮合反応後に形成される分子を意味すると理解される。

【0048】

好ましい実施形態では、キメラは、ＡＴＸとドキシサイクリン誘導体との共役を含む。

【0049】

本発明は、以下の実施例を読むことで一層理解されるであろう。これらの実施例は、例示として提供され、決して本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではない、。

【0050】

〔図面の簡単な説明〕
図１：パーキンソン病に関与する２つの経路の阻害を組み合わせた、本発明の主題である治療アプローチのグラフィック表現；これらの経路は、ミトコンドリアＲＯＳおよびシナプス前終末に存在するα－シヌクレイン由来の毒性オリゴマーを組み合わせ、かつ自己持続性である悪循環を作り出す。ＥＳＫ Ｅｌ Ｓａｙｅｄ， ２０１８およびＲＭ Ｍｅａｄｅ， ２０１９による。

【0051】

図２：パーキンソン病におけるニューロンレベルで観察された細胞死メカニズムの模式図；Ｂｏｒｔｏｌａｎｚａ， ２０１８； Ｅｌ Ｓａｙｅｄ， ２０１８； Ｇｕｏ， ２０１８； Ｌｉｕ， ２０１８； Ｍｅａｄ， ２０１９； Ｓａｎｔａ Ｃｅｃｉｌｉａ， ２０１９による。（略語：ＥＴＣ－電子輸送鎖；ＭＭＰ－マトリックスメタロプロテイナーゼ；ｍＰＴＰ－ミトコンドリア透過性遷移孔；ｍｔＤＮＡ－ミトコンドリアＤＮＡ；ＲＯＳ－活性酸素種）。

【0052】

図３：ＬＰＳで活性化された培養物中のミクログリアに対するＡＴＸ、ＤＯＸ、またはＡＴＸ＋ＤＯＸを用いた治療の影響－Ａ－ＬＰＳによって活性化された培養物中のミクログリアに対するＡＴＸの抗炎症効果。ＡＴＸ（１～３０μＭ）またはＤＥＸ（２．５μＭ）の存在下または非存在下で、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）に２４時間曝露されたミクログリアの培養物におけるＴＮＦ－αの放出のＥＬＩＳＡ試験の手法による測定。データは、炎症誘引物質（ｉｎｆｌａｍｍｏｇｅｎ）の単独存在下における測定値の％として表される平均±標準偏差値を表す（ｎ＝３～７ウェル／条件）。^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ 対 対照；^＃＃ｐ＜０．０１、^＃＃＃＃ｐ＜０．０００１ 対 ＬＰＳ。Ｂ－ＬＰＳによって活性化された培養物中のミクログリアに対するＤＯＸの抗炎症効果。ＤＯＸ（１０～１００μＭ）またはＤＥＸ（２．５μＭ）の存在下または非存在下で、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）に２４時間曝露されたミクログリアの培養物におけるＴＮＦ－αの放出のＥＬＩＳＡ試験の手法による測定。データは、炎症誘引物質の単独存在下における測定値の％として表される平均±標準偏差値を表す（ｎ＝３～９ウェル／条件）。^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ 対 対照；＃＃＃＃ｐ＜０．０００１ 対 ＬＰＳ。Ｃ－ＬＰＳによって活性化された培養物中のミクログリアに対するＡＴＸ＋ＤＯＸを組み合わせた治療の抗炎症効果。ＡＴＸ（１０μＭ）、ＤＯＸ（５０、１００μＭ）、２つの併用治療（ＡＴＸ＋ＤＯＸ）またはＤＥＸ（２．５μＭ）の存在下または非存在下で、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）に２４時間曝露されたミクログリアの培養物におけるＴＮＦ－αの放出のＥＬＩＳＡ試験の手法による測定。データは、炎症誘引物質の単独存在下における測定値の％として表される平均±標準偏差値を表す（ｎ＝５～１３ウェル／条件）。^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ 対 対照；＃＃＃ｐ＜０．００１、＃＃＃＃ｐ＜０．０００１ 対 ＬＰＳ；＆＆ｐ＜０．０１ 対 ＡＴＸまたはＤＯＸ単独。

【0053】

図４：ＰＡＭ３ＣＳＫ４で活性化された培養物中のミクログリアに対するＡＴＸ、ＤＯＸ、またはＡＴＸ＋ＤＯＸを用いた治療の影響－Ａ－ＰＡＭ３ＣＳＫ４によって活性化された培養物中のミクログリアに対するＡＴＸの抗炎症効果。ＡＴＸ（５～３０μＭ）またはＤＥＸ（２．５μＭ）の存在下または非存在下で、ＰＡＭ３ＣＳＫ４（１μｇ／ｍＬ）に２４時間曝露されたミクログリアの培養物におけるＴＮＦ－αの放出のＥＬＩＳＡ試験の手法による測定。データは、炎症誘引物質の単独存在下における測定値の％として表される平均±標準偏差値を表す（ｎ＝４～１２ウェル／条件）。^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ 対 対照；＃ｐ＜０．０５、＃＃＃＃ｐ＜０．０００１ 対 ＰＡＭ３ＣＳＫ４。Ｂ－ＰＡＭ３ＣＳＫ４によって活性化された培養物中のミクログリアに対するＤＯＸの抗炎症効果。ＤＯＸ（１０～１００μＭ）またはＤＥＸ（２．５μＭ）の存在下または非存在下で、ＰＡＭ３ＣＳＫ４（１μｇ／ｍＬ）に２４時間曝露したミクログリアの培養物におけるＴＮＦ－αの放出のＥＬＩＳＡ試験の手法による測定。データは、炎症誘引物質の単独存在下における測定値の％として表される平均±標準偏差値を表す（ｎ＝４～８ウェル／条件）。^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ 対 対照；＃ｐ＜０．０５、＃＃＃ｐ＜０．００１、＃＃＃＃ｐ＜０．０００１ 対 ＰＡＭ３ＣＳＫ４。Ｃ－ＰＡＭ３ＣＳＫ４によって活性化された培養物中のミクログリアに対するＡＴＸ＋ＤＯＸを組み合わせた治療の抗炎症効果。ＡＴＸ（５μＭ）、ＤＯＸ（５０、１００μＭ）、および２つの併用治療またはＤＥＸ（２．５μＭ）の存在下または非存在下で、ＰＡＭ３ＣＳＫ４（１μｇ／ｍＬ）に２４時間曝露されたミクログリアの培養物におけるＴＮＦ－αの放出のＥＬＩＳＡ試験の手法による測定。データは、炎症誘引物質の単独存在下における測定値の％として表される平均±標準偏差値を表す（ｎ＝４～１２ウェル／条件）。^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ 対 対照；＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１、＃＃＃＃ｐ＜０．０００１ 対 ＬＰＳ；＆ｐ＜０．０５ 対 ＡＴＸまたはＤＯＸ単独。

【0054】

図５：α－シヌクレインのアミロイド凝集に対する、ＡＴＸ、ＤＯＸ、またはＡＴＸ＋ＤＯＸの阻害効果－Ａ－α－シヌクレインのアミロイド凝集に対するＤＯＸおよびＤＭＦの効果。単量体α－シヌクレイン（αＳｍ）がＤＯＸ（１００μＭ）またはＤＭＦ（１％）の存在下または非存在下で振盪される条件（６００ｒｐｍ、３７℃、９６時間）下で、ＴｈＴによって放出される蛍光の強度。振盪されないαＳｍとの比較。実験データは、単量体が処理なしで単独で振盪される状態下で得られた値の％での平均値±標準偏差を表す（ｎ＝６～８測定／条件）。^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ 対 対照；＃＃＃＃ｐ＜０．０００１ 対 振盪αＳｍ。Ｂ－α－シヌクレインのアミロイド凝集に対する、場合によりＤＯＸと組み合わせたＡＴＸの効果。単量体α－シヌクレインがＤＯＸ（１０μＭ）またはＡＴＸ（１、１０または１００μＭ）の存在下または非存在下で振盪される条件（６００ｒｐｍ、３７℃、９６時間）下で、ＴｈＴによって放出される蛍光の強度。実験データは、単量体が処理なしで単独で振盪される状態下で得られた値の％での平均±標準偏差を表す（ｎ＝６～８測定／条件）。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ 対 振盪αＳ。

【0055】

図６：ＡＴＸ化合物の抗凝集効果を示す透過型電子顕微鏡検査。ＡＴＸ（１０μＭ；αＳ：ＡＴＸ）、ＤＯＸ（１０μＭ；αＳ：ＤＯＸ）、または組み合わせられた２つの処理（αＳ：ＤＯＸ：ＡＴＸ）の存在下で産生されたα－シヌクレイン凝集体の画像。スケールバー：１μｍ（４，０００Ｘ）および５００ｎｍ（１０，０００Ｘ）。

【0056】

図７：低ノイズの自然発生的酸化ストレスを受けたドーパミン作動性ニューロンに対するＡＴＸの神経保護能力。７日齢の中脳培養物におけるＡＴＸ（３μＭ）、ＤＯＸ（Ｄ－３４４７、Ｓｉｇｍａ Ａｄｒｉｃｈ；１０μＭ）またはアポトランスフェリン（ＡＰＯ；Ｔ－１４２８、Ｓｉｇｍａ Ａｄｒｉｃｈ；１５０μｇ／ｍＬ）の神経保護効果を説明する図。

【0057】

図８：低ノイズの自然発生的慢性酸化ストレスを受けた培養物におけるドーパミン作動性ニューロンに対するＡＴＸおよびＤＯＸの協調的神経保護効果。アポトランスフェリン（ＡＰＯ；１５０μｇ／ｍＬ）、ＡＴＸ（０．７５μＭ；３μＭ）、ＤＯＸ（７．５μＭ；１０μＭ）またはＡＴＸ（０．７５μＭ）＋ＤＯＸ（７．５μＭ）の組合せで７日間、任意に処理した、中脳培養物中のドーパミン作動性ニューロンの生存。実験データは、アポトランスフェリンの存在下で得られた値の％での平均±標準偏差値を表す（ｎ＝４～１３ウェル／状態）。^＊＊＊ｐ＜０．００１ 対 対照；^＃＃＃ｐ＜０．００１ 対 単独で適用された同濃度のＡＴＸまたはＤＯＸ。

【0058】

〔実施例〕
〔実施例１：症例の説明〕
この治療用溶液を、パーキンソン病を有する６９歳の男性に対して試験した。３年間にわたる事象の履歴（現在追跡調査中）を以下に示す：
－ ステージ１：パーキンソン病の症状に対するＡＴＴの効果
症状：２０１８年の初めに、パーキンソン病の最初の徴候が出現した：左手の振戦、歩行ペースの緩慢化、階段の無秩序な下降、筋拘縮の形態の背痛を伴う胴体の前方への傾斜、ならびに種々の明らかな非運動障害（引きこもり、無関心、意思決定困難、人生における喜びの喪失、抑うつなど）の開始、便秘、嗅覚低下。最初に、ＡＴＴを単剤療法として試験した。

【0059】

治療：その後、どの投与量を使用するかを決定するという問題が生じた。患者は、良性前立腺肥大症の問題を治療するために、すでにＡＴＴを服用しており（特許ＷＯ２０１９／Ｏ７３１７３参照）、朝および夕方に与えられた３ｃｐ～２５ｍｇの投与量で、最大の満足度でＡＴＴを使用したが、前記投与量はパーキンソン病を治療するのに不十分であることが判明した。血液－脳関門通過問題が疑われ、濃度変動を極力軽減するため（ヒトにおけるＡＴＴの血漿中半減期は約３時間）、１日当たり４回の投与量、すなわち４×６錠／日（６００ｍｇ／日に相当）に分けることによって４回までこの投与量を増量することとした。

【0060】

結果：非常に目覚ましいことに、３日後には、振戦、嗅覚低下および便秘を除いて、すべての臨床症状が消失した。

【0061】

これらの最初の結果は、パーキンソン病に対するＡＴＴの有益な効果の概念の最初の証明となる。相関する方法で、これらは、ＲＯＳ、特にミトコンドリアＲＯＳがパーキンソン病に関与するという仮説を確認する。

【0062】

－ ステージ２：ＡＴＴとドキシサイクリンとの組合せの効果
症状：２０１９年４～５月に、患者が激しい作業を行ったときに異常な疲労が現れた。

【0063】

２０１９年７月に、重度の疲労の状況においてバランス問題が出現したことから、Ｓｉｎｅｍｅｔ（登録商標）の導入が正当化された；Ｌ－ＤＯＰＡはバランスの喪失の問題を解決したが、手の振戦がわずかにのみ改善し、疲労が持続し、患者は歩行速度を速くすることが困難になり、便秘も持続した。小字症が出現した。

【0064】

治療：疲労の悪化に直面し、２０１９年１２月１９日、６時間ごとに５０ｍｇの投与量でドキシサイクリンを添加するという決定がなされ、この投与量はＬＣＲ中の安定な濃度を約０．９μＭ／Ｌ（Ｄｏｔｅｖａｌｌ， １９８９； Ｋａｒｌｓｓｏｎ， １９９６）、すなわち、Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｌｉｚｚａｒａｇａ（２０１７）が推奨する濃度の約３倍に保つことを意図したものであった。

【0065】

結果：５日後、患者の疲労問題は大幅に退行し、彼はなんとかより速いペースで歩行し、１０日目に疲労感は消失し、患者の歩行ペースは実質的に正常に戻り、彼の手の振戦ももはやほとんど知覚できなかった。１か月の治療後、患者はほとんど背痛を経験せず、小字症は消失した。同時に、Ｓｉｎｅｍｅｔ（登録商標）の投与量を最初の週から２０～２５％、および今日（２月２１日）に５０～６０％減少させることが可能であった。最後に、２０２０年１月１５日より、用量が１日当たり３回投与［ＡＴＴ２５ｍｇを８錠３回＋ドキシサイクリン５０ｍｇを３回］に調整されているが、治療効果は失われていない。

【0066】

ＡＴＴの服用に関連する鼓腸を除いて、これらの２年間の治療中に重大な副作用が認められなかったことを追記することは重要である。患者の状態は安定している。

【0067】

要約すると：
ＡＴＴ（１５０ｍｇ、１日４回）で１３ヵ月間満足できる
新たな症状が発現し、７カ月間の失敗が続く（常に１５０ｍｇのＡＴＴ、１日４回）
ＡＴＴ＋ＤＯＸ（１日当たりＡＴＴ６００ｍｇ＋ＤＯＸ１５０ｍｇ）で１３ヵ月間満足できる。

【0068】

結論：ＡＴＴによる治療の失敗、そしてその後、ドキシサイクリンに頼った後に観察された回復は、中枢ドーパミン作動性ニューロンの死に至る過程で協働するこれら２つの標的（ＲＯＳおよびα－シヌクレインの毒性オリゴマー）のリアリティの最初の検証となる。したがって、この協働は、完全に効果的であり且つ経時的に持続可能であるために選択される療法が、これらの２つの標的のそれぞれに同時に向けられることを意味する。

【0069】

〔実施例２：ミクログリアの活性化に対するＡＴＸとドキシサイクリンとの組合せの効果〕
〔１－材料および方法〕
動物の使用のプロトコル：この研究のために用いたマウスは、２０１０年９月２２日の欧州議会および理事会の指令２０１０／６３／ＥＵに従って飼育し、取り扱った。実験プロトコルは、動物実験倫理委員会（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｄａｒｗｉｎ ｎｏ．５）によって承認された。

【0070】

ミクログリアの精製：Ｓｅｐｕｌｖｅｄａ－Ｄｉａｚら（Ｇｌｉａ， ２０１６）によって記載され、その後ｄｏｓ－Ｓａｎｔｏｓ－Ｐｅｒｅｉｒａら（Ｇｌｉａ， ２０２０）によって改変されたプロトコルに従って、新生マウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｊａｎｖｉｅｒ ＬＡＢＳ）の脳の機械的解離によって得られた細胞懸濁液から培養物を作製した。使用されるプロトコルは、欧州連合理事会の指令（２０１０／６３／ＥＵ）に従う。使用されるプロトコルは、動物実験倫理委員会（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｄａｒｗｉｎ ｎｏ．５）によって承認された。ポリカチオン、ホウ酸緩衝液ｐＨ８．３で希釈したポリエチレンイミン（ＰＥＩ；１ｍｇ／ｍＬ）でプレコートした７５ｃｍ^２のコーニング培養フラスコを、１５～２０日間の培養後にミクログリア細胞の自発的単離を得るために使用し、この単離は、他の細胞集団、特に星状細胞を犠牲にして行われた。フラスコ培養物を維持するために、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｂｉｏｗｅｓｔ ＬＬＣ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンカクテルを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を使用した（Ｓｅｐｕｌｖｅｄａ－Ｄｉａｚらの出版物に記載されている実験の詳細を参照されたい）。ミクログリア精製工程の後、培養フラスコに付着しているミクログリアをトリプシン処理して、４８ウェルマルチウェルＮｕｎｃプレート中で継代培養物を作製した。これらの培養物を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび１％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭの存在下で維持した。

【0071】

培養過程パラダイム：ミクログリアの刺激は、２つの基準炎症誘引物質、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）４アゴニスト（Ｄｏｓ－Ｓａｎｔｏｓ－Ｐｅｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ， ２０２０）またはＰＡＭ３ＣＳＫ４（１μｇ／ｍＬ）、ＴＬＲ２アゴニスト（Ａｃｕｎａ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌｓ， ２０１９）を用いた２４時間の処理によって得られた。基準抗炎症剤として用いた４－ヒドロキシ－アネトールトリチオン（ＡＴＸ）、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）およびデキサメタゾン（ＤＥＸ；２．５μＭ）を、炎症誘引物質によるミクログリア細胞の活性化を誘発する４時間前に添加した。ＡＴＸの原液はＤＭＳＯ中２５ｍＭであり、ＤＯＸの原液は蒸留水中１０ｍＭであった。ミクログリア細胞に対するＤＯＸの抗炎症効果のメカニズムは、Ｓａｎｔａ－Ｃｅｃｉｌｉａらによって以前に報告された（Ｎｅｕｒｏｔｏｘ Ｒｅｓ， ２０１６）。

【0072】

ＴＮＦ－αレベルの評価：炎症誘引物質による刺激が開始されてから２４時間後に回収されたミクログリアの培養培地を、次いで分析まで－２０℃で凍結させた。ＴＮＦ－αを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（ＢＭＳ６０７－３ＴＷＯ）からのＥＬＩＳＡキットを用いて、供給者の指示に従って検出した（ｄｏｓ－Ｓａｎｔｏｓ－Ｐｅｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ， Ｇｌｉａ， ２０２０）。各試料の吸光度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３Ｘを用いて４５０ｎｍで測定した。

【0073】

統計解析：実験データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．３．１ソフトウェアを用いて、一元配置分散分析試験を適用し、続いて、Ｓｔｕｄｅｎｔ Ｎｅｗｍａｎ Ｋｅｕｌｓ事後検定を適用することによって解析した。

【0074】

〔２－結果〕
ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化されたミクログリアの培養物における炎症に対するＡＴＸとドキシサイクリンとの組合せの効果を、それぞれの分子の効果と個々に比較した。ミクログリアの活性化は、２つの異なる実験モデルにおいて試験され、前記活性化はＬＰＳまたはＰＡＭ３ＣＳＫ４のいずれかによって模倣される。

【0075】

ＬＰＳによって活性化されたミクログリアで得られた結果を図３に示し、ＰＡＭ３ＣＳＫ４によって活性化されたミクログリアで得られた結果を図４に示す。

【0076】

ＡＴＸ単独が炎症マーカーであるＴＮＦ－αの放出を阻害できることが観察された（図３Ａおよび４Ａ）。ドキシサイクリン（ＤＯＸ）単独でも炎症の減少を誘導した（図３Ｂおよび４Ｂ）。非常に興味深いことに、ＡＴＸ＋ＤＯＸの組合せは、別々に試験した分子のそれぞれで得られたものと比較して、ＴＮＦ－αの放出の阻害を改善した（図３Ｃおよび４Ｃ）。

【0077】

〔３－結果の考察〕
疾患の神経炎症性成分の再現を可能にする細胞モデル（Ｓｅｐｕｌｖｅｄａ－Ｄｉａｚ ｅｔ ａｌ， ２０１６）において、ＡＴＸは、基準炎症誘引物質、リポ多糖（ＬＰＳ）またはＰＡＭ３ＣＳＫ４、ＴＬＲ－４受容体およびＴＬＲ－２受容体のアゴニストのそれぞれ、に対して、（活性化パラダイムに応じて、１０μＭまたは３０μＭで）強力な抗炎症効果を発揮したことがここで示されている。同じ実験パラダイムにおいて、ＤＯＸは、５０～１００μＭにおいて抗炎症効果を発揮した。ＡＴＸとＤＯＸとの異なる組合せを試験することにより、それらのいくつかは、厳密に言えば、古典的に定義付けされているような相乗効果をもたらすことなく、別々に試験された各化合物によって生じるものよりもより強力な抗炎症効果の起源にあることを示すことが可能であった。

【0078】

しかし、使用した濃度に基づいて観察された応答が直線的でなく、ＡＴＸまたはＤＯＸであるかどうかにかかわらず、濃度が増加するにつれて効果が減少する場合（例えば、ＬＰＳモデルにおいて：１００μＭがＴＮＦαの放出を約７０％阻害した場合に、５０μＭのＤＯＸはＴＮＦαの放出を５０％阻害した；同様に、３０μＭのＡＴＸは、１０μＭ後に観察されたＴＮＦαの放出を３倍低下させず、むしろ１５～２０％しか低下させなかった）、本明細書中で所望の相乗効果を実証することは困難であるように思われる；しかし、この文脈において、ＬＰＳモデルにおいても、２つのドキシサイクリン治療群、ＤＯＸ５０およびＤＯＸ１００のそれぞれに、同じ濃度の１０μＭのＡＴＸを添加するという単なる事実が、それ単独で使用したドキシサイクリンを用いて観察される利益を増やしたことが観察された（図３Ｂ参照）。ＰＡＭ３ＣＳＫ４モデルでも同じ事実が見出された（図４参照）。本発明者にとって、この現象は、組合せの相乗的ポテンシャルの発現であり、ＬＰＳモデルにおいて、１０μＭのＡＴＸ＋１００μＭのＤＯＸが基準デキサメタゾンとほぼ同じであるという事実によって補強される判断である。

【0079】

〔実施例３：α‐シヌクレインの凝集に及ぼすＡＴＸの効果〕
〔１－材料および方法〕
α－シヌクレインの調製：ヒト組換えα－シヌクレインを、タンパク質のコード配列を含むプラスミドｐＴ７－７を保有する大腸菌株から産生させた（Ｋａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ２００５； Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｌｉｚａｒｒａｇａ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉ Ｒｅｐ， ２０２０）。精製工程後、変性条件下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって、タンパク質の純度を評価した。α－シヌクレインのストック溶液を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび１５０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液中、ｐＨ７．４で調製した。凝集プロトコルを開始する前に、微小凝集体を除去するために、タンパク質を１２０００ｇで３０分間遠心分離した。タンパク質濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ８０００分光光度計を用いて２８０ｎｍで測定した（Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｌｉｚａｒｒａｇａ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉ Ｒｅｐ， ２０２０）。

【0080】

ｅｘ ｖｉｔｒｏでのα－シヌクレインの凝集：凝集プロトコルを、以前の研究（Ｋａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ２００５； Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｌｉｚａｒｒａｇａ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉ Ｒｅｐ， ２０２０）から選択した。簡単に述べると、α－シヌクレインの凝集を、ｐＨ７．４の２０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび１５０ｍＭのＮａＣｌ中に可溶化された組換えタンパク質（７０μＭ）を、３７℃で９６時間、軌道振盪（６００ｒｐｍ； Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｃｏｍｆｏｒｔ； Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）することによって得た。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を使用して、この実験プロトコルにおいてＡＴＸを希釈した。凝集体構造の形成を、チオフラビン－Ｔ（ＴｈＴ）試験の手法によってモニターした（ＬｅＶｉｎｅ ｅｔ ａｌ， Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ， １９９９）。

【0081】

〔２－結果〕
α－シヌクレインの凝集を防止するＡＴＸ＋ＤＯＸの組合せの能力を、単独で試験した各分子の効果と比較して評価した。

【0082】

ｅｘ ｖｉｔｒｏモデルで得られた結果を図５に示す。

【0083】

図５Ａで確認されるように、ＤＯＸはこの凝集を阻害することができることが観察された。

【0084】

予想外に、ＡＴＸもこの特性を有する。さらに、ＡＴＸによる阻害は、低濃度でも効果的である（図５Ｂ）。

【0085】

ＡＴＸ＋ＤＯＸの組合せは、このモデルにおいて阻害の利点を改善することができなかった。しかし、異なる代謝経路を経由して作用する２つの分子を組み合わせることは、機能不全メカニズムを予防するために特に有望である。

【0086】

ＡＴＸがミクログリアの炎症およびα－シヌクレインの凝集の両方に対して阻害効果を有することが実証されていることは、特にドキシサイクリンなどのα－シヌクレイン阻害剤と組み合わせたパーキンソン病の治療におけるその使用にとって非常に有望な結果である。

【0087】

〔３－結果の考察〕
この実験研究は、タンパク質の単量体形態のアミロイド凝集が軌道振盪によって得られたｅｘ ｖｉｔｒｏ試験（Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｌｉｚａｒｒａｇａ ｅｔ ａｌ， ２０１７）において、ＡＴＸ分子がヒト組換えα－シヌクレイン（αＳ）の凝集を効果的かつ濃度依存的に阻害し得ることを実証することを可能にした。しかしながら、１～５０μＭの間で観察可能なＡＴＸの阻害効果は、１０μＭ（すなわち、それ自体の抗凝集効果を欠く濃度）で使用されたＤＯＸによって増幅されず、２つの分子の作用メカニズムが基本的に異なること：ＤＯＸはα－シヌクレインの可溶性単量体－四量体形態を安定化する一方、ＡＴＴはα－シヌクレインの将来をその凝集した「毒性オリゴマー」形態に向けて方向転換することに関与するミトコンドリアＲＯＳの過剰産生を阻止すること、を想起させる間接的な方法である。

【0088】

〔実施例４：透過型電子顕微鏡法によって可視化したＡＴＸ化合物のα－シヌクレインの抗凝集効果〕
〔１－材料および方法〕
透過型電子顕微鏡法：目的の処理の任意の存在下で振盪したα－シヌクレイン試料を、透過型電子顕微鏡法によって特徴付けた。各溶液の５０μｌのアリコートをこの分析に使用した。試料調製プロトコルは、Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｌｉｚａｒｒａｇａら（２０２０）によって詳細に記載されている。画像は、透過型電子顕微鏡、Ｐｈｉｌｉｐｓ ＥＭ ３０１を用いて得た。

【0089】

〔２－結果〕
結果を図６に示す。これらの画像から、ＡＴＸ（１０μＭ）はα－シヌクレインのアミロイド凝集を効果的に減少させる一方、ＤＯＸはこの同じ濃度では効果がないことが確認される。１０μＭのＡＴＸによって生成される効果に匹敵する効果が、１００μＭのＤＯＸを用いて得られた（Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｌｉｚａｒｒａｇａ ｅｔ ａｌ， ２０２０）。２つの分子の協調的効果は、この実験では実証できなかった。

【0090】

〔実施例５：低ノイズの自然発生的酸化ストレスを受けた培養中のドーパミン作動性ニューロンに対するＡＴＴの神経保護効果、ＡＴＴは単独、またはドキシサイクリンと併用である。〕
〔１－材料および方法〕
中脳培養物およびチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）の免疫検出：マウス中脳培養物を、Ｔｒｏａｄｅｃら（２００１）によって最初に記載され、その後、Ｒｏｕｓｓｅａｕら（２０１３）によって取り上げられたプロトコルに基づいて作製した。培養物は、妊娠１３．５日目に妊娠した母親から取り出したスイスマウス胚（Ｊａｎｖｉｅｒ ＬＡＢＳ、Ｌｅ Ｇｅｎｅｓｔ－Ｓｔ Ｉｓｌｅｓ）から作製した。中脳から解離した細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｂｉｏｗｅｓｔ ＬＬＣ、Ｌｅｓ Ｕｌｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を補充した５００μｌのＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地を含む４８ウェルプレート中で培養した。約８０～１００ １０^３個の細胞を最初に各培養ウェルに添加した。１時間後、最初の培地を、２０μｇ／ｍＬのインスリンを補充したＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地と交換した。培養培地（３５０μｌ）および処理を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで１日目および３日目に更新した。培養物を、結合および分析の前に合計７日間維持した。ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地中の微量Ｆｅ（ＩＩ）サルフェート（１．５μＭ）の存在は、中脳培養物中のドーパミン作動性ニューロンの進行性消失を引き起こす低ノイズの自然発生的酸化ストレスを誘発するのに十分であった（Ｒｏｕｓｓｅａｕ ｅｔ ａｌ， ２０１３）。基準培養物を１５０μｇ／ｍＬのアポトランスフェリン（ＡＰＯ；Ｔ－１４２８、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理した。チロシンヒドロキシラーゼの免疫検出を、マウス抗チロシンヒドロキシラーゼ抗体（Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｒ ＃２２９４１）を用いて実施し、その存在はＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ ５５５で標識した２^ｓｄ抗マウス抗体を用いて明らかにした。ＴＨ^＋ニューロンを、以前に記載されたプロトコル（Ｒｏｕｓｓｅａｕ ｅｔ ａｌ， ２０１３）に従ってカウントした。カウントは、アポトランスフェリンで処理した対照培養物で得られた値の％として表される。

【0091】

統計解析：実験データは、平均±標準偏差値に対応する。各実験点についての個々の値（ｎ）は、少なくとも２つの独立した実験から得られる。データはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．３．１ソフトウェアまたはＳｉｇｍａｐｌｏｔ １２．５ソフトウェアを用いて、一元配置分散分析を用いて分析し、その後、Ｓｔｕｄｅｎｔ Ｎｅｗｍａｎ Ｋｅｕｌｓ事後検定を行った。

【0092】

〔２－結果〕
結果を図７および図８に示す。

【0093】

アポトランスフェリンによる処理は、基準保護処理を表す。処理の非存在下では、ＴＨで免疫標識されたニューロンが培養物から実質的に消失したことに留意されたい。蛍光画像は、反転されたフォーマットで提示される。

【0094】

図７はＡＴＴの保護効果を示しており、ＤＯＸおよびアポトランスフェリンの保護効果よりも優れていると思われる。

【0095】

図８は、２つの濃度のＡＴＴの効果、２つの濃度のＤＯＸの効果、およびそれらの組合せの結果を比較したものである。ＡＴＴについては、試験した２つの濃度は０．７５μＭおよび３μＭであり、３μＭの濃度は基準処理（この場合はアポトランスフェリン）に匹敵する保護効果を示したが、０．７５μＭではほとんど効果を示さなかった（ＡＰＯの保護の０．６％に等しい保護）。ＤＯＸに関しても、２つの濃度、７．５μＭおよび１０μＭ、について試験したが、１０μＭの濃度で最大効果が観察された一方、７．５μＭではＤＯＸの保護効果はアポトランスフェリンの保護効果の２７％にしか達しなかった。非常に興味深いことに、０．７５μＭのＡＴＴと７．５μＭのＤＯＸとの組合せは、ＡＰＯの保護と同等の保護を提供し、これは２つの分子の相乗効果を明らかに実証する。

【0096】

〔３－結果の考察〕
ＡＴＸの神経保護能力は、ここでは、ＤＯＸも保護的であるドーパミン作動性神経変性の細胞モデルにおいて実証される（図７および８を参照されたい）。ＤＯＸとＡＴＸとの異なる組合せの評価は、ほとんどまたは全く効果がない各化合物の濃度を用いて進行中であるが、提示された最初の一連の実験データは、特にＡＴＸ（０．７５μＭ）＋ＤＯＸ（７．５μＭ）の組合せについて、協調的効果を明確に実証している（図８）。

【0097】

〔結論〕
このＡＴＴ＋ＤＯＸの組合せがこの悪循環を断ち切ることができるのは、異なる相補的な作用メカニズムの結果であることを強調することは重要である。当該悪循環は、自己持続性でありかつ最終的にはニューロンの変性につながり、ここでは以下の一連の事象が疾患の影響下で連続的に結び付く：
・ 自己凝集し、毒性オリゴマーを形成する可溶性α－シヌクレイン、
・ ミトコンドリアの外膜に付着し、その機能不全を引き起こし、事実上の電子的漏出およびＲＯＳの過剰産生を誘発する、これらの毒性オリゴマー、
・ 最後に、循環を閉じる、未変性の可溶性形態から毒性凝集形態へとα－シヌクレインの産生を方向転換させるＲＯＳの過剰産生、
・ そして、同時に、このシステムは、シード効果を介して細胞から細胞へと段階的に広がる（図１を参照されたい）。

【0098】

本特許において報告した症例によって非常によく示されているように、前記疾患が繁栄することを可能にするこの負の循環を破ることによって、ＡＴＴ－ＤＯＸの組合せは、単剤療法の選択によって患者がさらされる治療失敗のリスクから患者を保護する；問題の患者は、ＡＴＴ－ＤＯＸの組合せによる治療に入って１４ヶ月であり、現在のところ全てが患者にとってうまくいっていることに留意されたい。

【0099】

最後に、非常に興味深いことに、本研究では、ＡＴＸの抗凝集効果を透過型電子顕微鏡法によって確認した。

【0100】

〔展望－実験プロジェクトの継続〕
プロジェクトの残りの部分は、ＡＴＴ－ＤＯＸ治療が、Ｌ－ＤＯＰＡによって誘発される運動障害を阻害できることを検証することにある。第一段階は、Ｌ－ＤＯＰＡによって誘発される運動障害のモデルを確立して、それ単独で、またはＤＯＸと同時に投与されるＡＴＴの抗運動障害効果を試験することである。ＤＯＸは、抗運動障害の基準分子として使用される（Ｂｏｒｔｏｌａｎｚａ ｅｔ ａｌ， ２０２０）。ＡＴＸが、ＤＯＸと同様に、抗運動障害効果を発揮するかどうか、およびＤＯＸ／ＡＴＸの組合せが動物の行動を協調的な方法で改善するかどうかを決定することが論点となるであろう。使用される運動障害のげっ歯類モデルは、「内側前脳束」レベルでの６－ヒドロキシドーパミンの定位注入によって黒質の片側性病変を誘発し、それによって黒質において９０％を超えるドーパミン作動性ニューロン消失が生じ、同側背側線条体におけるほぼ完全なドーパミン枯渇を引き起こすことにある。ニューロンの消失の程度は、アポモルヒネ回転試験によって確認され、損傷ラットは、この試験に対する動物の応答に従って、異なる実験群に均等に分配される。病変の２週間後（１４日目）、Ｌ－ＤＯＰＡおよびベンセラジドＨＣｌ（末梢ＤＯＰＡデカルボキシラーゼ阻害剤）による毎日の処理によって、損傷ラットを運動障害にする。これらの処理は、２週間の期間にわたって実施される。Ｌ－ＤＯＰＡ処理の開始の１０日後（２４日目）に、目的の化合物（ＤＯＸ、ＡＴＴ）を単独で、または組み合わせて投与し、これらの動物における異常な運動またはＡＩＭＳ（異常不随意運動）を、文献（Ｄｏｓ－Ｓａｎｔｏｓ Ｐｅｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ， ２０２１； Ｂｏｒｔｏｌａｎｚａ ｅｔ ａｌ， ２０２０）において体系化され、詳細に記載されたプロトコルに従って評価する。最後に、目的の化合物がＬ－ＤＯＰＡの期待される運動効果を妨害しないかどうかを決定するために、動物を試験する。この目的のために、水平挙動、常同症および立ち上がり行動を、自動ビデオ監視システムを使用して、目的の治療の任意の存在下で、Ｌ－ＤＯＰＡ下で測定する。

【図面の簡単な説明】

【0101】

【図1】パーキンソン病に関与する２つの経路の阻害を組み合わせた、本発明の主題である治療アプローチのグラフィック表現；これらの経路は、ミトコンドリアＲＯＳおよびシナプス前終末に存在するα－シヌクレイン由来の毒性オリゴマーを組み合わせ、かつ自己持続性である悪循環を作り出す。ＥＳＫ Ｅｌ Ｓａｙｅｄ， ２０１８およびＲＭ Ｍｅａｄｅ， ２０１９による。

【図2】パーキンソン病におけるニューロンレベルで観察された細胞死メカニズムの模式図；Ｂｏｒｔｏｌａｎｚａ， ２０１８； Ｅｌ Ｓａｙｅｄ， ２０１８； Ｇｕｏ， ２０１８； Ｌｉｕ， ２０１８； Ｍｅａｄ， ２０１９； Ｓａｎｔａ Ｃｅｃｉｌｉａ， ２０１９による。（略語：ＥＴＣ－電子輸送鎖；ＭＭＰ－マトリックスメタロプロテイナーゼ；ｍＰＴＰ－ミトコンドリア透過性遷移孔；ｍｔＤＮＡ－ミトコンドリアＤＮＡ；ＲＯＳ－活性酸素種）。

【図3】ＬＰＳで活性化された培養物中のミクログリアに対するＡＴＸ、ＤＯＸ、またはＡＴＸ＋ＤＯＸを用いた治療の影響－Ａ－ＬＰＳによって活性化された培養物中のミクログリアに対するＡＴＸの抗炎症効果。ＡＴＸ（１～３０μＭ）またはＤＥＸ（２．５μＭ）の存在下または非存在下で、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）に２４時間曝露されたミクログリアの培養物におけるＴＮＦ－αの放出のＥＬＩＳＡ試験の手法による測定。データは、炎症誘引物質（ｉｎｆｌａｍｍｏｇｅｎ）の単独存在下における測定値の％として表される平均±標準偏差値を表す（ｎ＝３～７ウェル／条件）。^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ 対 対照；^＃＃ｐ＜０．０１、^＃＃＃＃ｐ＜０．０００１ 対 ＬＰＳ。Ｂ－ＬＰＳによって活性化された培養物中のミクログリアに対するＤＯＸの抗炎症効果。ＤＯＸ（１０～１００μＭ）またはＤＥＸ（２．５μＭ）の存在下または非存在下で、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）に２４時間曝露されたミクログリアの培養物におけるＴＮＦ－αの放出のＥＬＩＳＡ試験の手法による測定。データは、炎症誘引物質の単独存在下における測定値の％として表される平均±標準偏差値を表す（ｎ＝３～９ウェル／条件）。^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ 対 対照；＃＃＃＃ｐ＜０．０００１ 対 ＬＰＳ。Ｃ－ＬＰＳによって活性化された培養物中のミクログリアに対するＡＴＸ＋ＤＯＸを組み合わせた治療の抗炎症効果。ＡＴＸ（１０μＭ）、ＤＯＸ（５０、１００μＭ）、２つの併用治療（ＡＴＸ＋ＤＯＸ）またはＤＥＸ（２．５μＭ）の存在下または非存在下で、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）に２４時間曝露されたミクログリアの培養物におけるＴＮＦ－αの放出のＥＬＩＳＡ試験の手法による測定。データは、炎症誘引物質の単独存在下における測定値の％として表される平均±標準偏差値を表す（ｎ＝５～１３ウェル／条件）。^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ 対 対照；＃＃＃ｐ＜０．００１、＃＃＃＃ｐ＜０．０００１ 対 ＬＰＳ；＆＆ｐ＜０．０１ 対 ＡＴＸまたはＤＯＸ単独。

【図4】ＰＡＭ３ＣＳＫ４で活性化された培養物中のミクログリアに対するＡＴＸ、ＤＯＸ、またはＡＴＸ＋ＤＯＸを用いた治療の影響－Ａ－ＰＡＭ３ＣＳＫ４によって活性化された培養物中のミクログリアに対するＡＴＸの抗炎症効果。ＡＴＸ（５～３０μＭ）またはＤＥＸ（２．５μＭ）の存在下または非存在下で、ＰＡＭ３ＣＳＫ４（１μｇ／ｍＬ）に２４時間曝露されたミクログリアの培養物におけるＴＮＦ－αの放出のＥＬＩＳＡ試験の手法による測定。データは、炎症誘引物質の単独存在下における測定値の％として表される平均±標準偏差値を表す（ｎ＝４～１２ウェル／条件）。^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ 対 対照；＃ｐ＜０．０５、＃＃＃＃ｐ＜０．０００１ 対 ＰＡＭ３ＣＳＫ４。Ｂ－ＰＡＭ３ＣＳＫ４によって活性化された培養物中のミクログリアに対するＤＯＸの抗炎症効果。ＤＯＸ（１０～１００μＭ）またはＤＥＸ（２．５μＭ）の存在下または非存在下で、ＰＡＭ３ＣＳＫ４（１μｇ／ｍＬ）に２４時間曝露したミクログリアの培養物におけるＴＮＦ－αの放出のＥＬＩＳＡ試験の手法による測定。データは、炎症誘引物質の単独存在下における測定値の％として表される平均±標準偏差値を表す（ｎ＝４～８ウェル／条件）。^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ 対 対照；＃ｐ＜０．０５、＃＃＃ｐ＜０．００１、＃＃＃＃ｐ＜０．０００１ 対 ＰＡＭ３ＣＳＫ４。Ｃ－ＰＡＭ３ＣＳＫ４によって活性化された培養物中のミクログリアに対するＡＴＸ＋ＤＯＸを組み合わせた治療の抗炎症効果。ＡＴＸ（５μＭ）、ＤＯＸ（５０、１００μＭ）、および２つの併用治療またはＤＥＸ（２．５μＭ）の存在下または非存在下で、ＰＡＭ３ＣＳＫ４（１μｇ／ｍＬ）に２４時間曝露されたミクログリアの培養物におけるＴＮＦ－αの放出のＥＬＩＳＡ試験の手法による測定。データは、炎症誘引物質の単独存在下における測定値の％として表される平均±標準偏差値を表す（ｎ＝４～１２ウェル／条件）。^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ 対 対照；＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１、＃＃＃＃ｐ＜０．０００１ 対 ＬＰＳ；＆ｐ＜０．０５ 対 ＡＴＸまたはＤＯＸ単独。

【図5】α－シヌクレインのアミロイド凝集に対する、ＡＴＸ、ＤＯＸ、またはＡＴＸ＋ＤＯＸの阻害効果－Ａ－α－シヌクレインのアミロイド凝集に対するＤＯＸおよびＤＭＦの効果。単量体α－シヌクレイン（αＳｍ）がＤＯＸ（１００μＭ）またはＤＭＦ（１％）の存在下または非存在下で振盪される条件（６００ｒｐｍ、３７℃、９６時間）下で、ＴｈＴによって放出される蛍光の強度。振盪されないαＳｍとの比較。実験データは、単量体が処理なしで単独で振盪される状態下で得られた値の％での平均値±標準偏差を表す（ｎ＝６～８測定／条件）。^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ 対 対照；＃＃＃＃ｐ＜０．０００１ 対 振盪αＳｍ。Ｂ－α－シヌクレインのアミロイド凝集に対する、場合によりＤＯＸと組み合わせたＡＴＸの効果。単量体α－シヌクレインがＤＯＸ（１０μＭ）またはＡＴＸ（１、１０または１００μＭ）の存在下または非存在下で振盪される条件（６００ｒｐｍ、３７℃、９６時間）下で、ＴｈＴによって放出される蛍光の強度。実験データは、単量体が処理なしで単独で振盪される状態下で得られた値の％での平均±標準偏差を表す（ｎ＝６～８測定／条件）。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ 対 振盪αＳ。

【図6】ＡＴＸ化合物の抗凝集効果を示す透過型電子顕微鏡検査。ＡＴＸ（１０μＭ；αＳ：ＡＴＸ）、ＤＯＸ（１０μＭ；αＳ：ＤＯＸ）、または組み合わせられた２つの処理（αＳ：ＤＯＸ：ＡＴＸ）の存在下で産生されたα－シヌクレイン凝集体の画像。スケールバー：１μｍ（４，０００Ｘ）および５００ｎｍ（１０，０００Ｘ）。

【図7】低ノイズの自然発生的酸化ストレスを受けたドーパミン作動性ニューロンに対するＡＴＸの神経保護能力。７日齢の中脳培養物におけるＡＴＸ（３μＭ）、ＤＯＸ（Ｄ－３４４７、Ｓｉｇｍａ Ａｄｒｉｃｈ；１０μＭ）またはアポトランスフェリン（ＡＰＯ；Ｔ－１４２８、Ｓｉｇｍａ Ａｄｒｉｃｈ；１５０μｇ／ｍＬ）の神経保護効果を説明する図。

【図8】低ノイズの自然発生的慢性酸化ストレスを受けた培養物におけるドーパミン作動性ニューロンに対するＡＴＸおよびＤＯＸの協調的神経保護効果。アポトランスフェリン（ＡＰＯ；１５０μｇ／ｍＬ）、ＡＴＸ（０．７５μＭ；３μＭ）、ＤＯＸ（７．５μＭ；１０μＭ）またはＡＴＸ（０．７５μＭ）＋ＤＯＸ（７．５μＭ）の組合せで７日間、任意に処理した、中脳培養物中のドーパミン作動性ニューロンの生存。実験データは、アポトランスフェリンの存在下で得られた値の％での平均±標準偏差値を表す（ｎ＝４～１３ウェル／状態）。^＊＊＊ｐ＜０．００１ 対 対照；^＃＃＃ｐ＜０．００１ 対 単独で適用された同濃度のＡＴＸまたはＤＯＸ。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【国際調査報告】