特表2023-513436２０１９新型コロナウイルス（２０１９－ｎＣｏＶ）によって引き起こされる重症急性呼吸器感染症の治療のためのＲＮＡｉ予防治療薬組成物及び方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-31
(54)【発明の名称】２０１９新型コロナウイルス（２０１９－ｎＣｏＶ）によって引き起こされる重症急性呼吸器感染症の治療のためのＲＮＡｉ予防治療薬組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
A61K 31/713 20060101AFI20230324BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230324BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230324BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20230324BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20230324BHJP
A61K 47/28 20060101ALI20230324BHJP
A61K 9/72 20060101ALI20230324BHJP
A61K 9/16 20060101ALI20230324BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20230324BHJP
C07K 14/00 20060101ALN20230324BHJP
【ＦＩ】
A61K31/713
A61P31/14
A61K48/00
A61K9/127
A61K47/42
A61K47/28
A61K9/72
A61K9/16
C12N15/113 100Z
C07K14/00 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022545047
(86)(22)【出願日】2021-01-25
(85)【翻訳文提出日】2022-09-09
(86)【国際出願番号】 US2021014962
(87)【国際公開番号】W WO2021151096
(87)【国際公開日】2021-07-29
(31)【優先権主張番号】62/965,063
(32)【優先日】2020-01-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509127310
【氏名又は名称】サーナオミクス インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】タン， ダニー
(72)【発明者】
【氏名】チェン， シュエピン
(72)【発明者】
【氏名】ルー， パトリック ワイ．
(72)【発明者】
【氏名】シモネンコ， ヴェラ
(72)【発明者】
【氏名】エヴァンズ， デーヴィッド エム．
(72)【発明者】
【氏名】シュ， ジョン
(72)【発明者】
【氏名】ワン， デリン
(72)【発明者】
【氏名】ルー， アラン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA19
4C076AA31
4C076AA93
4C076AA95
4C076BB21
4C076CC35
4C076DD70
4C076EE41
4C084AA13
4C084MA13
4C084MA24
4C084MA41
4C084MA56
4C084NA10
4C084NA13
4C084ZB331
4C084ZB332
4C084ZC611
4C084ZC612
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA02
4C086MA05
4C086MA13
4C086MA24
4C086MA41
4C086MA56
4C086NA10
4C086NA13
4C086ZB33
4C086ZC61
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA20
4H045EA29
4H045EA34
4H045FA20
(57)【要約】
コロナウイルス（２０１９－ｎＣｏＶ；ＣＯＶＩＤ－１９）感染症の予防と治療のための強力なｓｉＲＮＡ治療薬の開発のための組成物及び方法が提供される。組成物は、クリティカルなウイルス遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡカクテルと、薬学的に許容される高分子ナノ粒子担体及びリポソームナノ粒子担体を含む薬学的組成物を含む。気道への滴下注入、皮下注射、及びネブライザーエアロゾル化を含む、予防と治療のための投与方法が提供される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
武漢海鮮市場の新型肺炎２０１９新型コロナウイルス（２０１９－ｎＣｏＶ）の保存領域を標的とする少なくとも二種のｓｉＲＮＡ分子を含む薬学的組成物であって、薬学的に許容される担体を含み、前記担体が高分子ナノ粒子及び／又はリポソームナノ粒子担体を含む、組成物。
【請求項2】
ｓｉＲＮＡ分子が非構造（ＮＳ）ＲｄＲｐ、レプリカーゼ又はヘリカーゼウイルス遺伝子発現を阻害する、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
ｓｉＲＮＡ配列がスパイクウイルス遺伝子発現を標的とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
ｓｉＲＮＡ配列がスパイク以外の２０１９－ｎＣｏＶ遺伝子の発現を標的とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項5】
ｓｉＲＮＡ分子が、１９～２５塩基対の長さを有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項１から４の何れか一項に記載の組成物。
【請求項6】
ｓｉＲＮＡが、ＮＳ遺伝子のセンス鎖配列に対してデザインされている、請求項１から５の何れか一項に記載の組成物。
【請求項7】
ｓｉＲＮＡが、２０１９－ｎＣｏＶスパイク遺伝子の少なくとも一つのセンス鎖配列に対してデザインされている、請求項１に記載の組成物。
【請求項8】
ｓｉＲＮＡが、スパイク遺伝子以外の２０１９－ｎＣｏＶ遺伝子のセンス鎖配列に対してデザインされている、請求項１に記載の組成物。
【請求項9】
各ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、配列番号：１～１０１の配列を有するｓｉＲＮＡから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項10】
各ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、表Ｅの配列を有するｓｉＲＮＡから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項11】
二種のｓｉＲＮＡ分子が、ＣｏＶ３とＣｏｖ１８
ＣｏＶ３とＣｏＶ１４
ＣｏＶ４とＣｏＶ１４、並びに
ＡｏＶ４とＣｏＶ１８、
からなる群から選択され、ここで、ＣｏＶ３は、配列ＧＧＡＡＧＧＡＡＧＴＴＣＴＧＴＴＧＡＡ又はＧＧＡＡＧＧＡＡＧＴＴＣＴＧＴＴＧＡＡＴＴＡＡＡＡを有し、ＣｏＶ４は、配列ＧＣＣＡＴＴＡＧＴＧＣＡＡＡＧＡＡＴＡを含み、ＣｏＶ１４は、配列ＧＧＣＣＧＣＡＡＡＴＴＧＣＡＣＡＡＴＴを含み、ＣｏＶ１８は、配列ＣＣＡＣＣＡＡＣＡＧＡＧＣＣＴＡＡＡＡ又はＣＣＡＣＣＡＡＣＡＧＡＧＣＣＴＡＡＡＡＡＧＧＡＣＡを有する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項12】
高分子ナノ粒子担体がヒスチジン－リジン共重合体（ＨＫＰ）を含む、請求項１から１１の何れか一項に記載の組成物。
【請求項13】
リポソームナノ粒子担体が、コレステロールを含む製剤中にスペルミン－脂質複合体（ＳＬｉＣ）を含む、請求項１から１２の何れか一項に記載の組成物。
【請求項14】
前記ＨＫＰ及び前記ｓｉＲＮＡ分子がナノ粒子に自己集合する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項15】
前記ＳＬｉＣ及び前記ｓｉＲＮＡが、コレステロールを含む製剤中でナノ粒子に自己集合する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項16】
２０１９新型コロナウイルス感染症に感染した対象を治療する方法であって、前記対象に薬学的に有効な量の請求項１から１５の何れか一項に記載の組成物を投与することを含む方法。
【請求項17】
前記組成物が気道滴下注入により投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記組成物が腹腔内投与によって投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項19】
前記組成物が気道ネブライザーを介して投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項20】
対象が、ヒト、マウス、フェレット、又はサルである、請求項１６から１９の何れか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
この出願は、内容の全体が出典明示によりここに援用される２０２０年１月２３日出願の米国仮出願第６２／９６５０６３号について優先権を主張する。
【0002】
２０１９－ｎＣｏＶ感染症の治療のための新規治療薬が提供される。具体的には、武漢海鮮市場肺炎ウイルス（２０１９－ｎＣｏＶ）の遺伝子又は一本鎖ウイルスＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子が、化学修飾されたｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを含み、場合によってはサーファクタント溶液、Ｄ５Ｗ溶液、及びその他の気道表面に優しい溶液；ヒスチジン－リジン共重合体（ＨＫＰ）、又はスペルミン－リポソーム複合体（ＳＬｉＣ）、又は肺組織標的部分、例えばペプチド、ヌクレオチド、小分子及び抗体を含む更なる成分を含む薬学的製剤と共に、提供される。ｓｉＲＮＡ／ナノ粒子担体の製剤、プロセス開発法、及び特定の送達経路並びに治療レジメンを含む、ｓｉＲＮＡ分子及び薬学的組成物を作製し且つ使用する方法が提供される。
【背景技術】
【0003】
［２０１９－ｎＣｏＶウイルス疾患：生物学と病理学］
２０１９年１２月３１日に、世界保健機関（ＷＨＯ）中国オフィスは、中国の湖北省武漢市で検出された病因不明（原因不明）の肺炎の症例の報告を受けた。ＷＨＯは、１月７日に中国当局によって新型コロナウイルス（２０１９－ｎＣｏＶ）が原因ウイルスとして特定されたと報告した（Ｌｕ Ｈ，Ｓｔｒａｔｔｏｎ ＣＷ，Ｔａｎｇ ＹＷ．Ｏｕｔｂｒｅａｋ ｏｆ Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｏｆ Ｕｎｋｎｏｗｎ Ｅｔｉｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｗｕｈａｎ Ｃｈｉｎａ：ｔｈｅ Ｍｙｓｔｅｒｙ ａｎｄ ｔｈｅ Ｍｉｒａｃｌｅ．Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ．２０２０ Ｊａｎ １６．）。武漢海鮮市場肺炎ウイルス（２０１９－ｎＣｏＶ）は、新型の一本鎖ポジティブセンスＲＮＡベータコロナウイルスによって引き起こされる致死性の高い呼吸器疾患である。２０１９－ｎＣｏＶの症状は、インフルエンザなどの他の様々な疾病に類似しており、必ずしも患者が２０１９－ｎＣｏＶに感染していることを意味しない。症状には、発熱、咳、呼吸困難が含まれる。呼吸困難はありうる肺炎の徴候であり、直ちに医学的処置を必要とする。診断には、重症の肺炎、急性呼吸促迫症候群、敗血症性ショック、多臓器不全が含まれていた。武漢での２０１９－ｎＣｏＶ感染症は、重症度、症例致死率、感染力の点で全体的に見てＳＡＲＳ又はＭＥＲＳよりも臨床的に軽度のようである。
２０１９年１２月３１日に、世界保健機関（ＷＨＯ）中国オフィスは、中国の湖北省武漢市で検出された病因不明（原因不明）の肺炎の症例の報告を受けた。ＷＨＯは、１月７日に中国当局によって新型コロナウイルス（２０１９－ｎＣｏＶ）が原因ウイルスとして特定されたと報告した（Ｌｕ Ｈ，Ｓｔｒａｔｔｏｎ ＣＷ，Ｔａｎｇ ＹＷ．Ｏｕｔｂｒｅａｋ ｏｆ Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｏｆ Ｕｎｋｎｏｗｎ Ｅｔｉｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｗｕｈａｎ Ｃｈｉｎａ：ｔｈｅ Ｍｙｓｔｅｒｙ ａｎｄ ｔｈｅ Ｍｉｒａｃｌｅ．Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ．２０２０ Ｊａｎ １６．）。武漢海鮮市場肺炎ウイルス（２０１９－ｎＣｏＶ）は、新型の一本鎖ポジティブセンスＲＮＡベータコロナウイルスによって引き起こされる致死性の高い呼吸器疾患である。２０１９－ｎＣｏＶの症状は、インフルエンザなどの他の様々な疾病に類似しており、必ずしも患者が２０１９－ｎＣｏＶに感染していることを意味しない。症状には、発熱、咳、呼吸困難が含まれる。呼吸困難はありうる肺炎の徴候であり、直ちに医学的処置を必要とする。診断には、重症の肺炎、急性呼吸促迫症候群、敗血症性ショック、多臓器不全が含まれていた。武漢での２０１９－ｎＣｏＶ感染症は、重症度、症例致死率、感染力の点で全体的に見てＳＡＲＳ又はＭＥＲＳよりも臨床的に軽度のようである。
【0004】
２０１９－ｎＣｏＶの遺伝子コードの最新の研究では、その新型ウイルスは中国からの二種のコウモリのＳＡＲＳ様コロナウイルスサンプルに最も密接に関連していることが確認されており、ＳＡＲＳやＭＥＲＳのように、コウモリがまた２０１９－ｎＣｏＶの発生源であるかも知れないと初めに示唆されている（Ｊｉ Ｗ，Ｗａｎｇ Ｗ，Ｚｈａｏ Ｘ，Ｚａｉ Ｊ，Ｌｉ Ｘ．Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｓｐｉｋｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｗｌｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２０１９－ｎＣｏＶ ｍａｙ ｂｏｏｓｔ ｃｒｏｓｓ－ｓｐｅｃｉｅｓ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｆｒｏｍ ｓｎａｋｅ ｔｏ ｈｕｍａｎ．Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ．２０２０ Ｊａｎ ２２．）。ＣｏＶのゲノム及びサブゲノムは、少なくとも６つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいる。ゲノム長の約２／３の第一ＯＲＦ（ＯＲＦ１ａ／ｂ）は、ｎｓｐ１を欠くガンマコロナウイルスを除いて、１６個の非構造タンパク質（ｎｓｐ１－１６）をコードしている。ＯＲＦ１ａとＯＲＦ１ｂの間には－１フレームシフトがあり、ｐｐ１ａとｐｐ１ａｂの二種のポリペプチドが産生される。これらのポリペプチドは、ウイルスゲノムにコードされるキモトリプシン様プロテアーゼ（３ＣＬｐｒｏ）又はメインプロテアーゼ（Ｍｐｒｏ）と一又は二のパパイン様プロテアーゼ（ＰＬＰ）によって１６個のｎｓｐにプロセシングされる（Ｚｉｅｂｕｈｒ Ｊ，Ｓｎｉｊｄｅｒ ＥＪ，Ｇｏｒｂａｌｅｎｙａ ＡＥ．Ｖｉｒｕｓ－ｅｎｃｏｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２０００；８１（Ｐｔ４）：８５３－８７９．）。３’末端近くのゲノムの３分の１にあるその他のＯＲＦは、少なくとも４個の主要な構造タンパク質であるスパイク（Ｓ）、メンブラン（Ｍ）、エンベロープ（Ｅ）、及びヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質をコードしている。
【0005】
２０１９－ｎＣｏＶは、２０２０年１月７日に短時間で患者から単離され、ゲノムシークエンシングに供された。２０１９－ｎＣｏＶは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶと遺伝子配列が少なくとも７０％の類似性を持つ２Ｂ系統のβＣｏＶであり、ＷＨＯによって２０１９－ｎＣｏＶと命名された（Ｈｕｉ ＤＳ，Ｉ Ａｚｈａｒ Ｅ，Ｍａｄａｎｉ ＴＡ， Ｎｔｏｕｍｉ Ｆ，Ｋｏｃｋ Ｒ，Ｄａｒ Ｏ，Ｉｐｐｏｌｉｔｏ Ｇ，Ｍｃｈｕｇｈ ＴＤ，Ｍｅｍｉｓｈ ＺＡ，Ｄｒｏｓｔｅｎ Ｃ，Ｚｕｍｌａ Ａ，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ Ｅ．，“Ｔｈｅ ｃｏｎｔｉｎｕｉｎｇ ２０１９－ｎＣｏＶ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｔｈｒｅａｔ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ ｔｏ ｇｌｏｂａｌ ｈｅａｌｔｈ － Ｔｈｅ ｌａｔｅｓｔ ２０１９ ｎｏｖｅｌ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｉｎ Ｗｕｈａｎ，Ｃｈｉｎａ”Ｉｎｔ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２０２０ Ｊａｎ １４；９１：２６４－２６６．）。配列解析により、２０１９－ｎＣｏＶはコロナウイルスの典型的なゲノム構造を有しており、Ｂａｔ－ＳＡＲＳ様（ＳＬ）－ＺＣ４５、Ｂａｔ－ＳＬ ＺＸＣ２１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及び２０１９－ｎＣｏＶを含むベータコロナウイルスのクラスターに属していることが示された。ＣｏＶの系統樹に基づくと、２０１９－ｎＣｏｖはコウモリ－ＳＬ－ＣｏＶ ＺＣ４５及びコウモリ－ＳＬ－ＣｏＶ ＺＸＣ２１とより密接に関連しており、ＳＡＲＳ－ＣｏＶとの関連性はより離れている（Ｃｈｅｎ Ｙ，Ｌｉｕ Ｑ，Ｇｕｏ Ｄ．“Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ：ｇｅｎｏｍｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，”Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ． ２０２０ Ｊａｎ ２２．）。
【0006】
［現在の予防と治療］
現在、コロナウイルスに対する特定の抗ウイルス療法はなく、主な治療法は対症療法である。リバビリンを含む組換えインターフェロン（ＩＦＮ）は、コロナウイルス感染症に対して限られた効果しか持たない（Ｃｉｎａｔｌ Ｊ，Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ Ｂ，Ｂａｕｅｒ Ｇ，Ｃｈａｎｄｒａ Ｐ，Ｒａｂｅｎａｕ Ｈ，Ｄｏｅｒｒ ＨＷ．，“Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ＳＡＲＳ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ，”Ｌａｎｃｅｔ．２００３；３６２（９３８０）：２９３－２９４．）。ＳＡＲＳ及びＭＥＲＳの流行後、ＣｏＶプロテアーゼ、ポリメラーゼ、ＭＴａｓｅ、及び侵入タンパク質に対して多くの抗ＣｏＶ剤が開発されたが、これらの何れも臨床試験において有効性はまだ証明されていない（Ｄｙａｌｌ Ｊ，Ｇｒｏｓｓ Ｒ，Ｋｉｎｄｒａｃｈｕｋ Ｊ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＲＦ，Ｏｌｉｎｇｅｒ ＧＧ Ｊｒ，Ｈｅｎｓｌｅｙ ＬＥ，Ｆｒｉｅｍａｎ ＭＢ，Ｊａｈｒｌｉｎｇ ＰＢ．，“Ｍｉｄｄｌｅ Ｅａｓｔ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ ａｎｄ Ｓｅｖｅｒｅ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｏｐｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ Ｎｏｖｅｌ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ，“Ｄｒｕｇｓ．２０１７ Ｄｅｃ；７７（１８）：１９３５－１９６６；Ｃｈａｎ ＪＦ，Ｃｈａｎ ＫＨ，Ｋａｏ ＲＹ，Ｔｏ ＫＫ，Ｚｈｅｎｇ ＢＪ，Ｌｉ ＣＰ，Ｌｉ ＰＴ，Ｄａｉ Ｊ，Ｍｏｋ ＦＫ，Ｃｈｅｎ Ｈ，Ｈａｙｄｅｎ ＦＧ，ＹｕｅｎＫＹ．，“Ｂｒｏａｄ－ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎｔｉｖｉｒａｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｍｉｄｄｌｅ Ｅａｓｔ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ，”Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ．２０１３；６７（６）：６０６－６１６；Ｌｉｕ Ｑ，Ｚｈｏｕ ＹＨ，Ｙｅ Ｆ，Ｙａｎｇ ＺＱ．，“Ａｎｔｉｖｉｒａｌｓ ｆｏｒ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｂｌｅｍｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，”Ｓｅｍｉｎ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２０１６；３７（４）：６４０－６４６）。
現在、コロナウイルスに対する特定の抗ウイルス療法はなく、主な治療法は対症療法である。リバビリンを含む組換えインターフェロン（ＩＦＮ）は、コロナウイルス感染症に対して限られた効果しか持たない（Ｃｉｎａｔｌ Ｊ，Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ Ｂ，Ｂａｕｅｒ Ｇ，Ｃｈａｎｄｒａ Ｐ，Ｒａｂｅｎａｕ Ｈ，Ｄｏｅｒｒ ＨＷ．，“Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ＳＡＲＳ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ，”Ｌａｎｃｅｔ．２００３；３６２（９３８０）：２９３－２９４．）。ＳＡＲＳ及びＭＥＲＳの流行後、ＣｏＶプロテアーゼ、ポリメラーゼ、ＭＴａｓｅ、及び侵入タンパク質に対して多くの抗ＣｏＶ剤が開発されたが、これらの何れも臨床試験において有効性はまだ証明されていない（Ｄｙａｌｌ Ｊ，Ｇｒｏｓｓ Ｒ，Ｋｉｎｄｒａｃｈｕｋ Ｊ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＲＦ，Ｏｌｉｎｇｅｒ ＧＧ Ｊｒ，Ｈｅｎｓｌｅｙ ＬＥ，Ｆｒｉｅｍａｎ ＭＢ，Ｊａｈｒｌｉｎｇ ＰＢ．，“Ｍｉｄｄｌｅ Ｅａｓｔ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ ａｎｄ Ｓｅｖｅｒｅ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｏｐｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ Ｎｏｖｅｌ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ，“Ｄｒｕｇｓ．２０１７ Ｄｅｃ；７７（１８）：１９３５－１９６６；Ｃｈａｎ ＪＦ，Ｃｈａｎ ＫＨ，Ｋａｏ ＲＹ，Ｔｏ ＫＫ，Ｚｈｅｎｇ ＢＪ，Ｌｉ ＣＰ，Ｌｉ ＰＴ，Ｄａｉ Ｊ，Ｍｏｋ ＦＫ，Ｃｈｅｎ Ｈ，Ｈａｙｄｅｎ ＦＧ，ＹｕｅｎＫＹ．，“Ｂｒｏａｄ－ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎｔｉｖｉｒａｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｍｉｄｄｌｅ Ｅａｓｔ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ，”Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ．２０１３；６７（６）：６０６－６１６；Ｌｉｕ Ｑ，Ｚｈｏｕ ＹＨ，Ｙｅ Ｆ，Ｙａｎｇ ＺＱ．，“Ａｎｔｉｖｉｒａｌｓ ｆｏｒ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｂｌｅｍｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，”Ｓｅｍｉｎ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２０１６；３７（４）：６４０－６４６）。
【0007】
これまで、回復期患者から得られた血漿と抗体を用いた治療法が主要な治療法として提案されている（Ｍａｉｒ－Ｊｅｎｋｉｎｓ Ｊ，Ｓａａｖｅｄｒａ－Ｃａｍｐｏｓ Ｍ，Ｂａｉｌｌｉｅ ＪＫ，Ｃｌｅａｒｙ Ｐ，Ｋｈａｗ ＦＭ，Ｌｉｍ ＷＳ，Ｍａｋｋｉ Ｓ，Ｒｏｏｎｅｙ ＫＤ，Ｎｇｕｙｅｎ－Ｖａｎ－Ｔａｍ ＪＳ，Ｂｅｃｋ ＣＲ；“Ｃｏｎｖａｌｅｓｃｅｎｔ Ｐｌａｓｍａ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ｃｏｎｖａｌｅｓｃｅｎｔ ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｈｙｐｅｒｉｍｍｕｎｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｅｔｉｏｌｏｇｙ：ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ，”Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２０１５；２１１（１）：８０－９０）。しかし、現時点では、２０１９－ｎＣｏＶ感染症に関して利用可能な臨床情報は非常に限られており、年齢幅、ウイルスの動物源、潜伏期間、流行曲線、ウイルス動態、感染経路、病因、剖検所見及び重症例における抗ウイルス薬に対する治療反応に関してデータが欠けている。武漢での発生は、グローバルな健康安全保障に対する人獣共通感染症の脅威が続いていることをはっきりと思い出させる。全ての地理的地域の経験から学び、より協調的で協力的なグローバルな取り組みを行うには、より大きくかつより的を絞った投資が必要とされる（Ｚｕｍｌａ Ａ，Ｄａｒ Ｏ，Ｋｏｃｋ Ｒ，Ｍｕｔｕｒｉ Ｍ，Ｎｔｏｕｍｉ Ｆ，Ｋａｌｅｅｂｕ Ｐ等，“Ｔａｋｉｎｇ ｆｏｒｗａｒｄ ａ’Ｏｎｅ Ｈｅａｌｔｈ’ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｔｕｒｎｉｎｇ ｔｈｅ ｔｉｄｅ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ Ｍｉｄｄｌｅ Ｅａｓｔ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｚｏｏｎｏｔｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｗｉｔｈ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，”Ｉｎｔ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２０１６；４７：５－９）。
【0008】
残念ながら、コロナウイルス感染症に対して利用できる承認されたワクチン又は抗ウイルス治療法はない。ウイルスの発生源、伝染方法、複製方法を含む２０１９－ｎＣｏＶの生活環をよりよく理解することは、疾患の予防と治療の両方に必要である。効果的な治療法又はワクチンがないため、ＣｏＶの重症感染症に対処する最善の方法は、感染源を制御し、早期診断、報告、隔離、支持療法、及び伝染情報のタイムリーな公開を行って不必要なパニックを回避することである。同時に、画期的な薬剤の開発を迅速に促進することが極めて重要である。
【発明の概要】
【0009】
提供されるのは、武漢海鮮市場の新型肺炎２０１９新型コロナウイルス（２０１９－ｎＣｏＶ）の保存領域を標的とする少なくとも二種のｓｉＲＮＡ分子を含む薬学的組成物であって、薬学的に許容される担体を含み、該担体が高分子ナノ粒子及び／又はリポソームナノ粒子担体を含む、組成物である。ｓｉＲＮＡ分子は、１９～２５塩基対の長さを有するオリゴヌクレオチドを含む。組成物は、非構造（ＮＳ）ＲｄＲｐ、レプリカーゼ若しくはヘリカーゼウイルス遺伝子発現、又はスパイクウイルス遺伝子発現、スパイク以外の２０１９－ｎＣｏＶ遺伝子を阻害するｓｉＲＮＡ分子を含みうる。ｓｉＲＮＡは、ＮＳ遺伝子のセンス鎖配列及び／又は２０１９－ｎＣｏＶスパイク遺伝子の少なくとも一つのセンス鎖配列に対してデザインされうる。ｓｉＲＮＡは、スパイク遺伝子以外の２０１９－ｎＣｏＶ遺伝子のセンス鎖配列に対してデザインされうる。
【0010】
一実施態様では、各ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号：１～１０１の配列を有するｓｉＲＮＡから選択される。更なる実施態様では、各ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、表Ｅの配列を有するｓｉＲＮＡから選択される。特定セットの実施態様では、二種のｓｉＲＮＡ分子は、
ＣｏＶ３とＣｏｖ１８
ＣｏＶ３とＣｏＶ１４
ＣｏＶ４とＣｏＶ１４、並びに
ＡｏＶ４とＣｏＶ１８、
からなる群から選択され、ここで、ＣｏＶ３は、配列ＧＧＡＡＧＧＡＡＧＴＴＣＴＧＴＴＧＡＡ又はＧＧＡＡＧＧＡＡＧＴＴＣＴＧＴＴＧＡＡＴＴＡＡＡＡを有し、ＣｏＶ４は、配列ＧＣＣＡＴＴＡＧＴＧＣＡＡＡＧＡＡＴＡを含み、ＣｏＶ１４は、配列ＧＧＣＣＧＣＡＡＡＴＴＧＣＡＣＡＡＴＴを含み、ＣｏＶ１８は、配列ＣＣＡＣＣＡＡＣＡＧＡＧＣＣＴＡＡＡＡ又はＣＣＡＣＣＡＡＣＡＧＡＧＣＣＴＡＡＡＡＡＧＧＡＣＡを有する。
ＣｏＶ３とＣｏｖ１８
ＣｏＶ３とＣｏＶ１４
ＣｏＶ４とＣｏＶ１４、並びに
ＡｏＶ４とＣｏＶ１８、
からなる群から選択され、ここで、ＣｏＶ３は、配列ＧＧＡＡＧＧＡＡＧＴＴＣＴＧＴＴＧＡＡ又はＧＧＡＡＧＧＡＡＧＴＴＣＴＧＴＴＧＡＡＴＴＡＡＡＡを有し、ＣｏＶ４は、配列ＧＣＣＡＴＴＡＧＴＧＣＡＡＡＧＡＡＴＡを含み、ＣｏＶ１４は、配列ＧＧＣＣＧＣＡＡＡＴＴＧＣＡＣＡＡＴＴを含み、ＣｏＶ１８は、配列ＣＣＡＣＣＡＡＣＡＧＡＧＣＣＴＡＡＡＡ又はＣＣＡＣＣＡＡＣＡＧＡＧＣＣＴＡＡＡＡＡＧＧＡＣＡを有する。
【0011】
組成物は、ヒスチジン－リジン共重合体（ＨＫＰ）などの高分子ナノ粒子担体を含んでもよく、及び／又はコレステロールを含む製剤中にスペルミン－脂質複合体（ＳＬｉＣ）のようなリポソームナノ粒子担体を含んでもよい。これらの組成物において、ＨＫＰ及びｓｉＲＮＡ分子がナノ粒子に自己集合し、且つ／又はＳＬｉＣ及びｓｉＲＮＡが、コレステロールを含む製剤中でナノ粒子に自己集合する。
【0012】
また提供されるのは、２０１９新型コロナウイルス感染症に感染したヒト対象などの対象を、対象に薬学的に有効な量の上述の組成物を投与することによって治療する方法である。組成物は、気道滴下注入；腹腔内投与；及び／又は気道ネブライザーにより投与されうる。
【0013】
対象は、或いは、マウス、フェレット、又はサルでありうる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】図１は、ヒスチジン－リジン共重合体がインビボで局所及び皮下ｓｉＲＮＡ送達を促進することを示している。（ａ）自己集合ＨＫＰ／ｓｉＲＮＡナノ粒子（平均粒径１５０ｎｍ）を、水溶液に溶解させることができ、乾燥粉末に凍結乾燥させることができ、再溶解させてメチルセルロース又はＲＮＡｓｅフリー水と混合させることができる。ＨＫＰ／ｓｉＲＮＡナノ粒子のマウス気道への送達：上気道、気管支、肺胞。
【図2】三通りの異なる投与計画によるｓｉＲＮＡの経口気管送達後のＨＫＰ、ＤＯＴＡＰ及びＤ５Ｗ間の肺内因性遺伝子の標的ノックダウンの比較。ＨＫＰは、２０μｇの用量で標的遺伝子の効率的なｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンを示した。
【図3】図３は、ＨＫＰ－ｓｉＲＮＡナノ粒子製剤の腹腔内送達がウイルス曝露マウス（ｎ＝１０）においてＨ１Ｎ１に対して予防効果を示したことを示している。４０μｇ／２ｍｌの濃度のＨＫＰ－ｓｉＲＮＡの組み合わせ（比１：１のｓｉＲＮＡ１０３－ｓｉＲＮＡ１０５）を１、２、３、４及び５日目に腹腔内投与した（２．５ｍｇ／ｋｇ／日、紫色の矢印）。２×ＬＤ５０ Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４）の鼻腔内投与によるウイルス曝露を、ウイルスのみ、リバビリン及びｓｉＲＮＡ処置群に対して２日目（赤の矢印）に実施した。陽性対照としてのリバビリンは、２００ｕｌを強制経口投与し、１～５日にわたって７５ｍｇ／ｋｇ／日の投与量を与えた（オレンジの矢印）。ＨＫＰ－ｓｉＲＮＡ製剤の予防効果は、リバビリンよりも明らかに良好であった。
【図4】図４は、ＰＡＡ－ｓｉＲＮＡ製剤の腹腔内送達がウイルス曝露マウス（ｎ＝１５）においてＨ１Ｎ１に対して治療効果を示したことを示している。１×ＬＤ５０ Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９）の鼻腔内投与によるウイルス曝露を、ウイルスのみ、タミフル及びｓｉＲＮＡ処置群に対して１日目（赤の矢印）に実施した。Ｈ１Ｎ１曝露マウスを、２日目から６日目に（黒の矢印）、毎日腹腔内投与により、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの様々な投薬量のＰＡＡ－ｓｉＲＮＡの組み合わせ（比１：１のｓｉＲＮＡ８９－ｓｉＲＮＡ１０３）で処置した。同じ経路及び投与計画を採用して、２５ｍｇ／ｋｇのタミフルをまたＨ１Ｎ１感染マウスに毎日投与した。１０ｍｇ／ｋｇ／日のＰＡＡ－ｓｉＲＮＡの組み合わせの治療効果は、タミフル治療の２５ｍｇ／ｋｇ／日の効果とほぼ同等の抗インフルエンザ活性をもたらした。
【図7】図７は、ヒスチジン－リジン重合体が肺におけるｓｉＲＮＡ送達を媒介した後のＩＦＮ－α発現を示す。図７ＡはＩＦＮ－α濃度の測定に使用した検量線（ローリー法）を示し、図７Ｂは各試料におけるＩＦＮ－α濃度を如何に決定し、総タンパク質量に対して正規化したかを示している。
【図8】図８は、二種の細胞を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質を標的とするｓｉＲＮＡをスクリーニングしたことを示している（パートＩ）。２９３Ｔ（上部）及びＡ５４９細胞（下部）を使用して、ＳＣＯ３１～３８、Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ１及びＧｕａｎｇｚｈｏｕ２などの１４種のｓｉＲＮＡを検出し、Ｓタンパク質遺伝子発現に対してより良好な阻害効果を持つｓｉＲＮＡを見出した。陰性対照ｓｉＲＮＡはＳＣＯ２９及びＳＣＯ３０であり、如何なる遺伝子の発現も阻害しない。
【図9】図９は、二種の細胞を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質を標的とするｓｉＲＮＡをスクリーニングしたことを示している（パートＩＩ）。２９３Ｔ及びＡ５４９細胞を使用して、ＳＣＯ３９～６９などの３１種のｓｉＲＮＡを検出し、Ｓタンパク質遺伝子発現に対してより良好な阻害効果を持つｓｉＲＮＡを同定した。
【図10】図１０は、二種の細胞を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質を標的とするｓｉＲＮＡをスクリーニングしたことを示している（パートＩＩＩ）。２９３Ｔ及びＡ５４９細胞株を使用して、ｇｕａｎｇｚｈｏｕ３～５、ｇｕａｎｇｚｈｏｕ１２～２０などの２６種のｓｉＲＮＡを検出し、Ｓタンパク質遺伝子発現に対して最も強力な阻害効果を持つｓｉＲＮＡを同定した。
【図11】図１１は、二種の細胞によって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＯＲＦ１ＡＢを標的とするｓｉＲＮＡをスクリーニングしたことを示している（パートＩ）。２９３Ｔ（上部の左右）及びＡ５４９細胞株（下部）を使用して、ＳＣＯ１、ＳＣＯ２、ＳＣＯ２２、ＳＣＯ２３を含む４種のｓｉＲＮＡを検出し、ＯＲＦ１Ａｂ遺伝子発現に対して強力な阻害効果を持つｓｉＲＮＡを同定した。
【図12】図１２は、二種の細胞によって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＯＲＦ１ＡＢを標的とするｓｉＲＮＡをスクリーニングしたことを示している（パートＩＩ）。２９３Ｔ（上部の左右）及びＡ５４９細胞株（下部の左右）を使用して、ＳＣＯ８～１７、ＳＣＯ２０、ＳＣＯ２４、ＳＣＯ２５、ＳＣＯ２６、ＳＣＯ２８を含む１５種のｓｉＲＮＡを検出し、ＯＲＦ１Ａｂ遺伝子発現に対して強力な阻害効果を持つｓｉＲＮＡを同定した。
【図13】図１３は、二種の細胞を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＯＲＦ１ＡＢを標的とするｓｉＲＮＡをスクリーニングしたことを示している（パートＩＩＩ）。２９３Ｔ（上部）及びＡ５４９（下部）細胞株を使用して、３種のｓｉＲＮＡ、ＳＣｏ１８、ＳＣｏ１９、ＳＣｏ２１を検出し、ＯＲＦ１ＡＢ遺伝子発現に対して強力な阻害効果を持つｓｉＲＮＡを同定した。
【図15】図１５は、ウイルスの阻害について様々な濃度でｓｉＲＮＡを個別に試験したことを示している。殆どのｓｉＲＮＡ（ＳＣｏ１、ＳＣｏ２、ＳＣｏ３４、ＳＣｏ３６）は、試験した最低濃度、つまり３．１２５ｎＭで感染の完全な遮断を示した。
【図16】図１６は、ポリペプチド核酸ナノ医薬品の調製及び特徴付けを示す。ＨＫＰを用いたｓｉＲＮＡの自己集合による静電相互作用によるナノ粒子の形成。平均粒径は１５０～２００ｎｍで、ゼータ電位は３０ｍＶより大きい。
【図17】図１７は、噴霧前後のｓｉＲＮＡの濃度及び安定性分析を示す。ｓｉＲＮＡがハンドヘルドネブライザーによって微粒化された後、噴霧された若しくはネブライザー内に残ったｓｉＲＮＡの濃度に変化はほとんどなく、分子構造は安定したままである。
【図18】図１８は、噴霧前後のＨＫＰの比較を示す。ポリペプチドナノ送達ベクターがハンドヘルドネブライザーによって微粒化された後、ＨＰＬＣ（二種のモデル）によって分析され、分子構造が安定したままであることを示している。
【図19-2】上記
【図20-2】上記
【図21-2】上記
【図21-3】上記
【図21-4】上記
【図21-5】上記
【発明を実施するための形態】
【0015】
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の感染及び／又は複製を阻害する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子組成物が提供される。ｓｉＲＮＡはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの保存された遺伝子配列を標的とし、ｓｉＲＮＡのセンス鎖はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの遺伝子配列と正確に同じである。これらの保存された遺伝子配列には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の侵入、複製、集合、放出に密接に関連する複数のタンパク質及び／又は酵素に関与する遺伝子が含まれる。ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ウイルスがこれらのタンパク質及び／又は酵素を欠く場合、その生活環全体を完了することができない。好ましくは、ｓｉＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の配列を同時に阻害するか、或いはＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の配列を同時に阻害することができる。製薬材料を送達担体として、例えばポリペプチド高分子担体を含む組成物がまた提供される。有利には、この担体は、ヒスチジンとリジンから構成されるポリペプチド重合体である。ｓｉＲＮＡを送達担体と組み合わせてナノ粒子を形成することにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスがインビボ及びインビトロで宿主細胞に感染するのを効果的に阻害し、複製及び集合、並びに細胞からの放出を阻害する組成物が提供される。
【0016】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、遺伝子制御の自然起源の非常に特異的な機序である。ＲＮＡｉの機構は精巧で、非常に識別性がある。作用発現時に、低分子（１９～２５ｂｐ）二本鎖ＲＮＡ配列（低分子干渉ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡと呼ばれる）は、細胞質に局在するＲＮＡ干渉サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する（Ｊｉｎｅｋ Ｍ，Ｄｏｕｄｎａ ＪＡ．，“Ａ ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ ｏｆ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，”Ｎａｔｕｒｅ．２００９；４５７（７２２８）：４０５－４１２．）。ついで、得られた複合体は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）で相補配列を検索し、最終的にこれらの転写産物を分解（且つ／又は翻訳を減弱）させる。科学者は内因性ＲＮＡｉ機構を取り入れて、治療薬としてを含むｓｉＲＮＡの幅広い使用を進めてきた。
【0017】
とりわけ、吸入された薬物に結合し、粘液クリアランス機構を介してそれらを除去しうる厚い弾力性のある粘液層、十分に分化した気道上皮細胞の頂端膜側での低い基底及び刺激速度のエンドサイトーシス、細胞外及び細胞内のＲＮａｓｅの存在、並びに標的細胞におけるエンドソーム分解系の存在など、肺を外来粒子から保護する多くの生物学的障壁及び因子がある。気道送達と効果的な細胞侵入及び機能に関する困難を克服することで、ｓｉＲＮＡの全身性抗２０１９－ｎＣｏＶ治療薬としての道が開かれるであろう。
【0018】
加えて、送達ビヒクルと投与方法は、例えば、上皮／内皮細胞での初期段階の感染／予防、及び全身投与による後期段階の疾患など、感染段階に適し、且つ必要な作用部位でのサイレンシングの最速の作用発現をもたらすように選択されなければならない。その中でも、吸入による局所／全身送達は、呼吸器系疾患を治療する最も効果的な方法であることが示されている。パンデミックの状況では、この送達アプローチにより、患者への直接投与が容易になる。
【0019】
［抗ウイルス剤戦略］
コロナウイルスはエンベロープウイルスであり、全てのＲＮＡウイルスの中で最大のそのプラス鎖ＲＮＡゲノムは、１６個もの非構造タンパク質（ｎｓｐｓ）、４個の主要な構造タンパク質、及び最大８個のアクセサリータンパク質をコードしている。これらのタンパク質の多くは、ウイルスの生活環中に不可欠な、しばしば酵素的な機能を提供するため、抗ウイルス剤による治療のための魅力的な標的である。コロナウイルス侵入と、コロナウイルスプロテアーゼ若しくはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）活性などの必須酵素機能を標的とするための抗ウイルス剤戦略が主に提案されている。例えば、スパイク（Ｓ）タンパク質は、気道上皮の繊毛又は非繊毛細胞の何れかに対する優先的なウイルス親和性に関連するイベントである、異なるＣｏＶのその特異的細胞受容体への結合を媒介する。Ｓタンパク質はまたウイルスエンベロープの脂質と宿主細胞の細胞膜又は細胞内小胞の膜との間の融合を媒介して、細胞質へのウイルスゲノムＲＮＡの送達を促進する。
コロナウイルスはエンベロープウイルスであり、全てのＲＮＡウイルスの中で最大のそのプラス鎖ＲＮＡゲノムは、１６個もの非構造タンパク質（ｎｓｐｓ）、４個の主要な構造タンパク質、及び最大８個のアクセサリータンパク質をコードしている。これらのタンパク質の多くは、ウイルスの生活環中に不可欠な、しばしば酵素的な機能を提供するため、抗ウイルス剤による治療のための魅力的な標的である。コロナウイルス侵入と、コロナウイルスプロテアーゼ若しくはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）活性などの必須酵素機能を標的とするための抗ウイルス剤戦略が主に提案されている。例えば、スパイク（Ｓ）タンパク質は、気道上皮の繊毛又は非繊毛細胞の何れかに対する優先的なウイルス親和性に関連するイベントである、異なるＣｏＶのその特異的細胞受容体への結合を媒介する。Ｓタンパク質はまたウイルスエンベロープの脂質と宿主細胞の細胞膜又は細胞内小胞の膜との間の融合を媒介して、細胞質へのウイルスゲノムＲＮＡの送達を促進する。
【0020】
ウイルス結合及び細胞侵入イベントは、Ｓタンパク質に対する抗体、ウイルス受容体に干渉する抗体又は小分子、又はＳタンパク質の融合誘発ヘプタッドリピート領域に由来する合成ペプチドによって阻害されうる。ウイルスの侵入に続いて、コロナウイルスゲノム、つまりポジティブセンスのキャップされ、ポリアデニル化されたＲＮＡ鎖が直接翻訳され、コロナウイルスレプリカーゼ遺伝子にコードされたｎｓｐが合成される。コロナウイルスｎｓｐは、タンパク質分解酵素、すなわちコロナウイルスポリタンパク質を広範囲にプロセシングして最大１６個のｎｓｐ（ｎｓｐ１～１６）を遊離するパパイン様及びキモトリプシン様プロテイナーゼを有する二個の大きなポリタンパク質として翻訳される。これらのタンパク質分解機能は、コロナウイルス複製に不可欠であると考えられ、その結果、コロナウイルスのポリタンパク質プロセシングを阻害する多くの候補薬が報告されている。同様に、ｎｓｐ８とｎｓｐ１２に存在するコロナウイルスのＲｄＲｐ活性は、コロナウイルスの複製に不可欠であり、抗ウイルス剤治療のための魅力的な標的であると考えられている。これらの古典的な薬物標的に加えて、コロナウイルスは、更なる候補標的を表す一連のＲＮＡプロセシング酵素をコードしている。これらには、ｎｓｐ１３のＮＴＰａｓｅ活性に関連するヘリカーゼ活性、ｎｓｐ１４のＮ７－メチルトランスフェラーゼ活性に関連する３’－５’－エキソヌクレアーゼ活性、ｎｓｐ１５のエンドヌクレアーゼ活性、及びｎｓｐ１６の２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ活性が含まれる。
【0021】
全てのプラス鎖ＲＮＡウイルスと同様に、コロナウイルスは、ウイルス生活環のこの重要なステップを、複製可能なウイルス及び宿主細胞因子が豊富であると同時に抗ウイルス宿主防御機構から保護された特殊化環境に区画化するために、小器官様構造でウイルスＲＮＡを合成する。現在、コロナウイルスを含む多くのプラス鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡ合成のための細胞膜の関与、再構成、及び要件に関する知識が増えている。三種のコロナウイルスｎｓｐ、すなわち、ｎｓｐ３、ｎｓｐ４、及びｎｓｐ６が、ウイルスＲＮＡ合成のためのこれらの部位の形成に関与すると考えられている。特に、これらのタンパク質は、細胞内膜の動員を通じてコロナウイルス複製複合体を固定して、回旋状膜と粗面ＥＲを含む外膜を介して相互連結された二重膜小胞（ＤＶＭ）を含む、改変され、頻繁に対になった膜の網状小胞網（ＲＶＮ）を形成すると考えられる複数の膜貫通ドメインを含む。
【0022】
ウイルスは、異なる戦略を使用してＲＮＡｉ機構を回避できる。ウイルスの進化の過程で、変異が時々発生する。ｓｉＲＮＡがＲＮＡｉ機構を開始すると、ウイルスは標的配列の変異によってｓｉＲＮＡを無効にする場合がある。従って、頻繁なウイルス変異とＲＮＡｉの高い特異性との間の矛盾を如何に解決するかが、ｓｉＲＮＡ分子デザインの重要な問題である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスは頻繁に変異し、最近、研究者はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの変異がヒト細胞に感染する能力を高めたことを発見した。この変異は「Ｄ６１４Ｇ」と名付けられた。この変異は、ウイルスの表面に突き出ているＳタンパク質に小さいながらも効果的な変化を引き起こし、ヒト細胞に感染する能力を高め、今日の世界で蔓延している優勢株になるのを助ける。ウイルス変異によって引き起こされうるＲＮＡｉ機構の回避というこの問題に対処するために、ここに提示される組成物及び方法は、二つの戦略を採用する：（１）ｓｉＲＮＡ分子を、ウイルス複製と集合のために最も重要であるウイルスの保存された遺伝子配列に対してデザインし、実際の検証後に高度に保存された配列であるようにする戦略；並びに（２）二種以上のｓｉＲＮＡ分子を使用して、ウイルスの二種以上の重要な遺伝子の発現を同時に阻害する。
【0023】
［標的選択］
２０１９－ｎＣｏＶは、ベータコロナウイルス属に属するエンベロープ型一本鎖ポジティブセンスＲＮＡウイルスである。ゲノム長は約３０ｋｎｔである。ゲノムは、１４個の予測されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：ＯＲＦ１ａ、ＯＲＦ１ｂ、スパイク（Ｓ）タンパク質、３、４ａ、４ｂ、５、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、メンブラン（Ｍ）タンパク質、及びヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質を含み、ゲノムの５’の３分の２（ＯＲＦ１ａ、ＯＲＦ１ｂ）は１６個の非構造タンパク質（ｎｓｐ１～１６）をコードし、ゲノムの残りの３’の３分の１は４個の構造タンパク質（Ｓ、Ｅ、Ｍ及びＮタンパク質）をコードする。
２０１９－ｎＣｏＶは、ベータコロナウイルス属に属するエンベロープ型一本鎖ポジティブセンスＲＮＡウイルスである。ゲノム長は約３０ｋｎｔである。ゲノムは、１４個の予測されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：ＯＲＦ１ａ、ＯＲＦ１ｂ、スパイク（Ｓ）タンパク質、３、４ａ、４ｂ、５、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、メンブラン（Ｍ）タンパク質、及びヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質を含み、ゲノムの５’の３分の２（ＯＲＦ１ａ、ＯＲＦ１ｂ）は１６個の非構造タンパク質（ｎｓｐ１～１６）をコードし、ゲノムの残りの３’の３分の１は４個の構造タンパク質（Ｓ、Ｅ、Ｍ及びＮタンパク質）をコードする。
【0024】
２０１９－ｎＣｏＶのスパイク（Ｓ）タンパク質は、１５０ｋＤａを超える分子量を有する、１２８２個のアミノ酸の糖タンパク質であり、ウイルス病原性と宿主範囲の重要な決定基である。Ｓタンパク質の三量体は、２０１９－ｎＣｏＶエンベロープにスパイクを形成し、これが受容体結合と膜融合に関与する。ＨＩＶエンベロープ（ｅｎｖ）及びインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）と同様に、２０１９－ｎＣｏＶのＳタンパク質はクラスＩウイルス融合タンパク質であり、Ｓ２の立体構造変化を可能にし、ウイルス侵入と合胞体形成を開始させるためにＳ１ドメインとＳ２ドメインの間のプロテアーゼ切断を必要とする。ウイルス侵入とウイルスと宿主の膜融合に対するＳタンパク質の重要性は、それを抗２０１９－ｎＣｏＶ ｓｉＲＮＡ開発のための優れた標的とする。
【0025】
細胞への侵入後、２０１９－ｎＣｏＶの二種のポリタンパク質、ｐｐ１ａとｐｐ１ａｂが発現し、ウイルス複製複合体を形成するタンパク質への同時翻訳タンパク質プロセシングを受ける。このプロセシング中、ｎｓｐ－３、パパイン様プロテアーゼ（ＰＬｐｒｏ）及びｎｓｐ－５、３Ｃ様プロテイナーゼ（３ＣＬｐｒｏ）の活性が、ポリタンパク質からの１６個の非構造タンパク質の生成に重要である。
【0026】
ｎｓｐ－１２によってコードされる２０１９－ｎＣｏＶ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）は、ウイルス複製複合体の最も重要な構成成分である。この複合体は、ネステッドサブゲノムｍＲＮＡの転写とゲノムのプラス鎖ＲＮＡの複製の両方を担っている。両プロセスが細胞質で起こる。ウイルスｍＲＮＡ転写では、マイナス鎖ＲＮＡが最初にゲノムＲＮＡから生成され、ついで、ゲノムの５’末端に由来する共通の５’「リーダー」配列（６７ｎｔ）を持つ、複製複合体によって３’共末端（coterminal）ネステッドサブゲノムｍＲＮＡのセットを転写する。新しく合成されたゲノムＲＮＡは、マイナス鎖ＲＮＡをテンプレートとして産生される。ウイルスｍＲＮＡ転写とゲノム複製に対するｎｓｐ－１２の重要な役割は、この遺伝子が抗２０１９－ｎＣｏＶ ｓｉＲＮＡのデザインの標的であることを意味する。
【0027】
上記の情報に基づいて、我々は、ｓｉＲＮＡカクテルを介した治療アプローチの標的としてＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）、レプリカーゼ、ヘリカーゼ、スパイク（Ｓ）タンパク質、及び幾つかの他の構造遺伝子（Ｍ及びＮタンパク質など）並びに非構造遺伝子（ｎｓｐ－２、ｎｓｐ－１０及びｎｓｐ－１５など）を選択した。本開示は、２１又は２５ヌクレオチド長の二本鎖配列を含むｓｉＲＮＡ分子を提供し、ここで、ｓｉＲＮＡ分子は、２０１９－ｎＣｏＶの標的遺伝子の発現を阻害する。ｓｉＲＮＡ分子は平滑末端を有するか、又は二本鎖領域の両側に一又は複数のヌクレオチドの３’オーバーハングを有する。本発明のｓｉＲＮＡカクテルは、２０１９－ｎＣｏＶの遺伝子を標的とする２つ、３つ、４つ、又はそれ以上の配列を含む。好ましくは、ｓｉＲＮＡのカクテルは、ウイルスの異なるセグメントに対するものである－これにより、両方のセグメントが同時にｓｉＲＮＡ標的部位に変異を受けない限り（かなりありそうもない可能性）、ウイルスが少なくとも一種のｓｉＲＮＡによって阻害されることが保証される。
【0028】
一連の２５塩基対の平滑末端ｓｉＲＮＡと１９塩基対の粘着末端ｓｉＲＮＡを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製サイクルに重要である重要な遺伝子又は部分的遺伝子配列に干渉するようにデザインした。これらの重要な遺伝子には、限定されないが、Ｓ遺伝子、Ｅ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｎ遺伝子、及びＲｄＲＰ遺伝子などが含まれる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株の各遺伝子は、このリストに含めることができる。
【0029】
特に、ここに記載のｓｉＲＮＡ組成物は、Ｓタンパク質の発現を効果的に阻害することができるスパイク糖タンパク質遺伝子（Ｓ）を阻害するｓｉＲＮＡを含む。Ｓタンパク質は、ウイルスの感染標的と感染能力を決定する宿主受容体（ＡＣＥ２）と相互作用することによって宿主細胞に感染する。
【0030】
ｓｉＲＮＡ分子組成物は、Ｍｐｒｏ（ｎｓｐ５）、ＰＬｐｒｏ、３ＣＬＰｒｏ（３ＣＬ加水分解酵素）、ＲｄＲｐ（ｎｓｐ１２）、ヘリカーゼ（ｎｓｐ１３）及び他のタンパク質／酵素の発現を効果的に阻害することができるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＯＲＦ１ＡＢ遺伝子を阻害するｓｉＲＮＡをまた含む。ＯＲＦ１ＡＢ遺伝子は、ウイルスゲノムの５’末端に位置し、ポリタンパク質の切断に関与するプロテアーゼを含む、ウイルスＲＮＡ転写及び複製に関与する多機能タンパク質をコードする。
【0031】
ｓｉＲＮＡ分子組成物は、ＯＲＦ３Ａタンパク質の発現を効果的に阻害するｓｉＲＮＡをまた含む。ＯＲＦ３ａによってコードされるタンパク質は、細胞アポトーシスを誘導する機能を有するアクセサリータンパク質であり、感染細胞内の環境変化を助け、ウイルスの複製を容易にする。ＯＲＦ３ａタンパク質は、感染細胞の膜に孔を開け、ウイルスが逃げ易くする。
【0032】
ｓｉＲＮＡ分子組成物は、エンベロープタンパク質遺伝子（Ｅ）を阻害するｓｉＲＮＡをまた含み、これはＥタンパク質の発現を効果的に阻害することができる。Ｅタンパク質は、ウイルスの形態形成と集合において重要な役割を果たし、宿主細胞膜での自己集合によって、イオン輸送を可能にする五量体タンパク質－脂質細孔を形成し、アポトーシスの誘導においてまた役割を果たす。
【0033】
ｓｉＲＮＡ分子組成物は、膜タンパク質遺伝子（Ｍ）を阻害するｓｉＲＮＡをまた含み、これは、Ｍタンパク質の発現を効果的に阻害することができる。Ｍタンパク質は、ウイルスエンベロープの重要な構成要素であり、他のウイルスタンパク質との相互作用を通してウイルスの形態形成と集合において中心的な役割を果たす。
【0034】
ｓｉＲＮＡ分子組成物は、ヌクレオカプシドタンパク質遺伝子（Ｎ）を阻害するｓｉＲＮＡをまた含み、これは、Ｎタンパク質の発現を効果的に阻害することができる。Ｎタンパク質は、ウイルス構築過程でウイルスゲノム及びＭタンパク質との相互作用によって機能し、ウイルスゲノムの転写効率及びウイルス複製の向上に重要な役割を果たす。
【0035】
ここに記載のｓｉＲＮＡ組成物は、ＯＲＦ１０遺伝子を阻害するｓｉＲＮＡを含み、これは、ＯＲＦ１０タンパク質の発現を効果的に阻害することができる。ＯＲＦ１０タンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特有の小さなアクセサリータンパク質であり、その機能はまだ十分には明らかにされていない。
【0036】
ｓｉＲＮＡ分子組成物は、３’末端非翻訳領域配列（３’－ＵＴＲ）を阻害するｓｉＲＮＡをまた含む。該分子はウイルスｍＲＮＡの３’－ＵＴＲに結合し、ウイルスｍＲＮＡを分解することができる。
【0037】
ここに記載のｓｉＲＮＡは、典型的には、１９塩基対又は２５塩基対の長さの短い二本鎖ＲＮＡ構造を有する。１９塩基対ｓｉＲＮＡは、各ＲＮＡ鎖の３’末端に二つのデオキシチミジン（ｄＴｄＴ）突起の粘着末端を持つ二本鎖ＲＮＡである。２５塩基対のｓｉＲＮＡは、平滑末端を持つ二本鎖ＲＮＡである。
【0038】
ウイルス遺伝子の保存領域を標的とするｓｉＲＮＡを予測するために、二つの方法を使用できる。一つの方法は、複数の株の全ての遺伝子を並べて、これらの遺伝子の重複領域を決定し、ついでこれらの特定の遺伝子ドメインを標的にして阻害するために関連する薬理活性を備えたｓｉＲＮＡをデザインすることができるかどうかを判断することである。この方法は通常は、良好な結果を達成することができるが、一部のウイルス株に大きな変異がある場合、予測可能なｓｉＲＮＡの数が著しく制限され、この方法によってデザインされたｓｉＲＮＡは遺伝子サイレンシングの有効性が低下する場合がある。
【0039】
有利には、ｓｉＲＮＡデザインは、ｓｉＲＮＡ配列とウイルス遺伝子中の標的遺伝子配列との一貫性を考慮に入れる。１９塩基対のｓｉＲＮＡは、インビボとインビトロの両方で関連遺伝子を効果的にサイレンシングすることが証明されている。ｓｉＲＮＡには２５塩基対のｓｉＲＮＡもまた含まれているため、これらのｓｉＲＮＡには幾つかの配列重複性がありうる。これらの重複配列を除去した後でも、標的遺伝子をなおも完全にサイレンシングすることができる。ｓｉＲＮＡ配列の全ての塩基と１００％同一ではない可能性がある遺伝子ドメインを検出する方法が確立されたが、遺伝子ドメインは、ｓｉＲＮＡと一致している少なくとも１９の連続した塩基を有している必要がある。全２５塩基対ｓｉＲＮＡと同一ではない遺伝子を特定できることにより、ｓｉＲＮＡの標的となりうるウイルス株の数が増える可能性がある。
【0040】
［複数のｓｉＲＮＡを組み合わせることによる相乗効果］
全てのコロナウイルス遺伝子と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などの全ての病原性コロナウイルスの配列に対してｓｉＲＮＡの検索を拡大することにより、我々は、次の二タイプのｓｉＲＮＡ：ａ）有意な株特異性を示すｓｉＲＮＡ；ｂ）特定のウイルス株の特定の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを決定することができる。（抗Ｓタンパク質など）幅広いウイルス株を阻害できるリスト中のｓｉＲＮＡ、（ＲｄＲＰ又はヘリカーゼなど）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の別の遺伝子に対する特異的なｓｉＲＮＡ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の別の特定の遺伝子を標的とすることができる第三のｓｉＲＮＡを組み合わせることにより、我々は、複数のウイルス株を阻害できる幅広い効果的なｓｉＲＮＡ組成物を産生できる。この組成物は、ウイルスの複数の標的を阻害することによってウイルス変異を阻害することができ、従ってウイルスが治療から逃避するのを防ぐ。
全てのコロナウイルス遺伝子と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などの全ての病原性コロナウイルスの配列に対してｓｉＲＮＡの検索を拡大することにより、我々は、次の二タイプのｓｉＲＮＡ：ａ）有意な株特異性を示すｓｉＲＮＡ；ｂ）特定のウイルス株の特定の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを決定することができる。（抗Ｓタンパク質など）幅広いウイルス株を阻害できるリスト中のｓｉＲＮＡ、（ＲｄＲＰ又はヘリカーゼなど）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の別の遺伝子に対する特異的なｓｉＲＮＡ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の別の特定の遺伝子を標的とすることができる第三のｓｉＲＮＡを組み合わせることにより、我々は、複数のウイルス株を阻害できる幅広い効果的なｓｉＲＮＡ組成物を産生できる。この組成物は、ウイルスの複数の標的を阻害することによってウイルス変異を阻害することができ、従ってウイルスが治療から逃避するのを防ぐ。
【0041】
ここに記載のｓｉＲＮＡ組成物は、一種、二種、又はそれ以上のｓｉＲＮＡを含む。ｓｉＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の遺伝子配列と一致しうる。ｓｉＲＮＡが宿主細胞に入ると、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合し、その後、ＲＮＡのガイド鎖がウイルスｍＲＮＡに結合する。ＲＩＳＣを担持するガイド鎖がウイルスｍＲＮＡに近づいた後、ＲＩＳＣのプロテアーゼがウイルスｍＲＮＡを分解し、それによってウイルス遺伝子発現を阻害する。ウイルスｍＲＮＡは、ウイルスのプラス鎖ゲノムＲＮＡであってもよいし、或いはウイルスゲノムの次世代のプラス鎖ＲＮＡとして作用するウイルスゲノムＲＮＡに基づいて複製されたものであってもよい。
【0042】
組成物が二種以上のｓｉＲＮＡを含む場合、これらのｓｉＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の異なる遺伝子を有利に標的とする。つまり、それらはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の二種以上の遺伝子の発現を同時に阻害する。より有利には、これらの二種以上のｓｉＲＮＡにおいて、一種のｓｉＲＮＡが少なくとも一つの構造タンパク質遺伝子を標的とし、少なくとも一種が非構造タンパク質遺伝子を標的とする。このようにして、組成物は、少なくとも一種の構造タンパク質遺伝子と一種の非構造タンパク質遺伝子の発現を同時に阻害することができる。
【0043】
Ｓタンパク質遺伝子とＯＲＦ１ＡＢに位置するＲｄＲｐ遺伝子の両方の発現を阻害することができるｓｉＲＮＡの組み合わせが提供される。これらの二種のｓｉＲＮＡを宿主細胞に導入した後、ＲｄＲｐ酵素の発現を阻害することができ、よってウイルスがそのＲＮＡを複製するのを防止し；同時に、それらはＳタンパク質の発現を阻害することもできるため、ウイルスを完全なウイルス粒子にパッケージングすることができず、新しい宿主細胞に感染する能力が失われる。
【0044】
ウイルス内のＯＲＦ１ａｂとＮタンパク質を阻害できる２種のｓｉＲＮＡの組み合わせが提供される。これらの標的の両方を同時にサイレンシングすると、ウイルスの複製が阻害されることが実証された。各ｓｉＲＮＡをそれぞれ４１ｐＭで組み合わせた場合、８０％を超えるウイルスの阻害が起こった。
【0045】
Ｅタンパク質遺伝子とＯＲＦ１ＡＢに位置するＲｄＲｐ遺伝子の両方の発現を阻害することができるｓｉＲＮＡの組み合わせが提供される。これらの二種のｓｉＲＮＡを宿主細胞に導入した後、ＲｄＲｐ酵素の発現を阻害することができ、よってウイルスがそのＲＮＡを複製するのを防止し；同時に、それらはＥタンパク質の発現を阻害することもできるため、ウイルスを完全なウイルス粒子にパッケージングすることができず、ウイルスの形態形成と集合を完了することができず、よって細胞から遊離する能力が失われる。
【0046】
Ｓタンパク質遺伝子とＯＲＦ１ＡＢに位置するヘリカーゼ遺伝子の両方の発現を阻害することができるｓｉＲＮＡの組み合わせが提供される。これらの二種のｓｉＲＮＡを宿主細胞に導入した後、それらはヘリカーゼの発現を阻害し、ウイルス複製に必要な核酸二重鎖の融解を阻害し、ウイルス複製／転写複合体の形成を抑制し；同時に、それらはＳタンパク質の発現を阻害することもできるため、ウイルスを完全なウイルス粒子にパッケージングすることができず、よって新しい宿主細胞に感染する能力が失われる。
【0047】
Ｅタンパク質遺伝子とＯＲＦ１ＡＢに位置するＲｄＲｐ遺伝子の両方の発現を阻害することができるｓｉＲＮＡの組み合わせが提供される。これらの二種のｓｉＲＮＡを宿主細胞に導入した後、ＲｄＲｐ酵素の発現を阻害することができ、よってウイルスがそのＲＮＡを複製するのを防止し；同時に、それらはＥタンパク質の発現を阻害することもできるため、ウイルスを完全なウイルス粒子にパッケージングすることができず、よって細胞から遊離する能力が失われる。
【0048】
Ｓタンパク質遺伝子、Ｅタンパク質遺伝子、及びＯＲＦ１ＡＢに位置するＲｄＲｐ遺伝子の発現を阻害できるｓｉＲＮＡの組み合わせが提供される。これらの三種のｓｉＲＮＡを宿主細胞に導入した後、ＲｄＲｐ酵素の発現を阻害することができ、よってウイルスがそのＲＮＡを複製するのを防止し；同時に、それらはＳタンパク質とＥタンパク質の発現を阻害することもできるため、ウイルスを完全なウイルス粒子にパッケージングして細胞から遊離することができず、よって新しい宿主細胞に感染する能力が失われる。
【0049】
ウイルス内のＯＲＦ１ａｂとＮタンパク質を阻害できる２種のｓｉＲＮＡの組み合わせが提供される。これらの標的の両方を同時にサイレンシングすると、ウイルスの複製が阻害されることが実証された。各ｓｉＲＮＡをそれぞれ４１ｐＭで組み合わせた場合、ウイルスの８０％を超える阻害が起こった。
【0050】
二種以上のｓｉＲＮＡを含む組成物は、個別に包装するか、又はパッケージに混合することができる。すなわち、二種以上のｓｉＲＮＡは、既に混合された状態で提供されてもよく、投与前に混合されてもよく、或いは別々に投与されてもよい。
【0051】
［ＨＫＰベースの高分子ナノ粒子ｓｉＲＮＡ送達系］
ｓｉＲＮＡを含む薬学的製剤は、有利には、主に球状又は楕円体である、特定粒径のナノ粒子製剤を含む。この製剤では、ポリペプチド／脂質カチオン高分子担体及びｓｉＲＮＡは静電力を介して相互作用する。過剰な高分子担体分子の場合、ｓｉＲＮＡの殆どがナノ粒子の内部に配置され、ナノ粒子の粒子全体が正電荷を帯びるようになる。ナノ粒子の粒径は５０～３００ｎｍであり、好ましくは粒径は１００～２００ｎｍである。ナノ粒子製剤の粒子の電位（ゼータ電位）は５～５０ｍＶであり、好ましくは電位は１０～４０ｍＶであり、より好ましくは電位は３０～４５ｍＶである。
ｓｉＲＮＡを含む薬学的製剤は、有利には、主に球状又は楕円体である、特定粒径のナノ粒子製剤を含む。この製剤では、ポリペプチド／脂質カチオン高分子担体及びｓｉＲＮＡは静電力を介して相互作用する。過剰な高分子担体分子の場合、ｓｉＲＮＡの殆どがナノ粒子の内部に配置され、ナノ粒子の粒子全体が正電荷を帯びるようになる。ナノ粒子の粒径は５０～３００ｎｍであり、好ましくは粒径は１００～２００ｎｍである。ナノ粒子製剤の粒子の電位（ゼータ電位）は５～５０ｍＶであり、好ましくは電位は１０～４０ｍＶであり、より好ましくは電位は３０～４５ｍＶである。
【0052】
本開示はまた、ｓｉＲＮＡ分子と薬学的に許容される担体とを含む治療剤であるＨＫＰ－ｓｉＲＮＡナノ粒子を提供する。ヒスチジン－リジン重合体（ＨＫＰ）は、インビトロ及びインビボでのｓｉＲＮＡ送達に利用されている。ＨＫ重合体種のペア、Ｈ３Ｋ４ｂとＨ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂは、ヒスチジン、リジン又はアスパラギンの複数のリピートを含む四つの分岐を持つリジン骨格を有している。このＨＫＰ水溶液をｓｉＲＮＡと質量で４：１、又は３：１、又は５：１のＮ／Ｐ比で混合すると、ナノ粒子（粒径１００～２００ｎｍの平均粒径）が自己集合した（図１）。最適な分岐状ヒスチジン－リジン重合体ＨＫＰを、Ｒａｉｎｉｎ Ｖｏｙａｇｅｒシンセサイザー（ＰＴＩ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）で合成した。この研究において使用されたＨＫＰの二種は、（Ｒ）Ｋ（Ｒ）－Ｋ（Ｒ）－（Ｒ）Ｋ（Ｘ）の構造を持つＨ３Ｋ４ｂであり、Ｈ３Ｋ４ｂに対して、Ｒ＝ＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫ；Ｋ＝リジン及びＨ＝ヒスチジンである。粒径とゼータ電位は、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅｒ ９０ Ｐｌｕｓで測定した。ＨＫＰ－ｓｉＲＮＡ水溶液は半透明で、目立った凝集や沈殿物は見られず、４℃において少なくとも３か月間保存できた。我々はまたこのＨＫＰ－ｓｉＲＮＡ溶液を乾燥粉末に凍結乾燥するための方法を開発した。この乾燥粉末をＰＢＳ又はＤ５Ｗで溶解した後、治療薬をＩＶ注入によって血流に投与するか、或いは表皮への局所投与に使用できる。薬物は、吸入投与によって呼吸器系の特定の病巣に送達することもまたできる。
【0053】
［ＳＬｉＣベースの脂質ナノ粒子ｓｉＲＮＡ送達系］
我々はまた新規カチオン性脂質とコレステロールとを含む新規薬物送達担体を開発した（図２）。カチオン性脂質はスペルミンヘッドとオレイルアルコールテールで構成され、新規で独特なｓｉＲＮＡ送達系（スペルミン－脂質コレステロール、ＳＬｉＣ）としてコレステロールと結合される。スペルミンのＣＡＳ登録番号は７１－４４－３である。ＳＬｉＣが水溶液中でｓｉＲＮＡ二本鎖と混合されると、ｓｉＲＮＡ／ＳＬｉＣナノ粒子が自己集合プロセスによって形成される。この新しい形態の脂質ナノ粒子は、容易に生分解される。図５は、カチオンヘッドとしてスペルミンを、中間の二つの３級アミン基で様々な結合を介して結合されたオレイルアルコールテールを持つこの新しい脂質構造の幾つかの種を示している。我々は、インビトロでの標的遺伝子ノックダウンのためにこの担体をＨｅｌａ細胞及び２９３細胞でのｓｉＲＮＡトランスフェクションに利用し、また我々は、それをｓｉＲＮＡのインビボ送達についてマウスモデルでも試験した。
我々はまた新規カチオン性脂質とコレステロールとを含む新規薬物送達担体を開発した（図２）。カチオン性脂質はスペルミンヘッドとオレイルアルコールテールで構成され、新規で独特なｓｉＲＮＡ送達系（スペルミン－脂質コレステロール、ＳＬｉＣ）としてコレステロールと結合される。スペルミンのＣＡＳ登録番号は７１－４４－３である。ＳＬｉＣが水溶液中でｓｉＲＮＡ二本鎖と混合されると、ｓｉＲＮＡ／ＳＬｉＣナノ粒子が自己集合プロセスによって形成される。この新しい形態の脂質ナノ粒子は、容易に生分解される。図５は、カチオンヘッドとしてスペルミンを、中間の二つの３級アミン基で様々な結合を介して結合されたオレイルアルコールテールを持つこの新しい脂質構造の幾つかの種を示している。我々は、インビトロでの標的遺伝子ノックダウンのためにこの担体をＨｅｌａ細胞及び２９３細胞でのｓｉＲＮＡトランスフェクションに利用し、また我々は、それをｓｉＲＮＡのインビボ送達についてマウスモデルでも試験した。
【0054】
［ウイルス標的遺伝子に対する薬物のサイレンシング効果とウイルスに対するその阻害効果］
標的遺伝子に対して有意な阻害効果を有し、ウイルスの感染と複製を効果的に遮断するｓｉＲＮＡを特定するために、デュアルルシフェラーゼシュードタイプウイルスベースのレポーター系又は実際のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを使用して、これら二つの目標を達成できる。適切なレポーター系は、ｐｓｉＣＨＥＣＫ系（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）である。
標的遺伝子に対して有意な阻害効果を有し、ウイルスの感染と複製を効果的に遮断するｓｉＲＮＡを特定するために、デュアルルシフェラーゼシュードタイプウイルスベースのレポーター系又は実際のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを使用して、これら二つの目標を達成できる。適切なレポーター系は、ｐｓｉＣＨＥＣＫ系（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）である。
【0055】
［ネブライザーによる薬剤の吸入投与］
ＣＯＶＩＤ－１９は呼吸器系の感染症である。それは、気道及び肺の表皮細胞上のＡＣＥ２受容体又はニューロピリン１受容体を介して細胞に侵入し、複製生活環を開始する。従って、気道を通しての投与は効果的な投与方法である。薬物は呼吸器系、特に下気道と肺に特定の吸入装置を介して送達され、ウイルス感染と複製の病巣に効果的に到達して、高効率のウイルス阻害を達成できる。新型コロナウイルス感染症の予防と治療のための一投与形態は、微粒化吸入投与である。具体的には、ハンドヘルド微粒化装置を使用して、ナノ粒子製剤を微粒化する。吸入された薬剤製剤の液滴は気道を通して噴霧され、下気道及び肺に薬剤を送達する。装置は、好ましくは超音波微粒化装置を使用し、より好ましくはマイクロネット超音波微粒化吸入装置を使用する。
ＣＯＶＩＤ－１９は呼吸器系の感染症である。それは、気道及び肺の表皮細胞上のＡＣＥ２受容体又はニューロピリン１受容体を介して細胞に侵入し、複製生活環を開始する。従って、気道を通しての投与は効果的な投与方法である。薬物は呼吸器系、特に下気道と肺に特定の吸入装置を介して送達され、ウイルス感染と複製の病巣に効果的に到達して、高効率のウイルス阻害を達成できる。新型コロナウイルス感染症の予防と治療のための一投与形態は、微粒化吸入投与である。具体的には、ハンドヘルド微粒化装置を使用して、ナノ粒子製剤を微粒化する。吸入された薬剤製剤の液滴は気道を通して噴霧され、下気道及び肺に薬剤を送達する。装置は、好ましくは超音波微粒化装置を使用し、より好ましくはマイクロネット超音波微粒化吸入装置を使用する。
【0056】
本発明は、特定の実施態様と併せて以下に更に詳細に説明されるが、本発明の範囲は次の実施態様には限定されない。その目的は、当業者が本発明の内容を理解し、それを実施できるようにすることであり、これは本発明の保護範囲を限定するものではない。本発明の着想に従ってなされた全ての同等の変更又は修正は、本発明の保護範囲に包含されるべきである。
【実施例】
【0057】
実施例１ ２０１９－ｎＣｏＶのウイルス構造及びタンパク質機能
２０１９－ｎＣｏＶは、２９９０３ｎｔのゲノムを持つＡＮエンベロープ一本鎖ポジティブセンスＲＮＡウイルスである。２０１９－ｎＣｏＶのゲノム構造は、２０１９－ｎＣｏＶなどの他のコロナウイルスと類似しており、ゲノムの５’の３分の２がウイルスゲノム複製に必要な非構造タンパク質（ＮＳＰ）をコードし、ゲノムの残りの３’の３分の１がビリオンを構成する構造遺伝子（スパイク、エンベロープ、メンブラン、及びヌクレオカプシドタンパク質）と、構造遺伝子領域内に散在した４個のアクセサリー遺伝子をコードする。ゲノムの５’末端にはリーダー配列（６７ｎｔ）があり、これに非翻訳領域（ＵＴＲ）が続く。ＲＮＡゲノムの３’末端には別のＵＴＲがあり、可変長のポリ（Ａ）配列が続く。転写調節配列（ＴＲＳ ５’ＡＡＣＧＡＡ ３’）は、リーダー配列の３’末端と、２０１９－ｎＣｏＶのゲノム３’近位ドメインの遺伝子の上流の異なる位置に見出される。２０１９－ｎＣｏＶゲノムは、ＯＲＦ１ａ、ＯＲＦ１ｂ、Ｓ、３、４ａ、４ｂ、５、Ｅ、Ｍ、及びＮの少なくとも１４個の予測されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、１６個の予測される非構造タンパク質がＯＲＦ１ａ／ｂによってコードされている。ウイルスの複製に必須ではない幾つかの特有の群特異的ＯＲＦが２０１９－ｎＣｏＶによってコードされる。これらの群特異的ＯＲＦの機能は不明である；しかし、他のコロナウイルスとの類推により、それらは構造タンパク質又はインターフェロンアンタゴニスト遺伝子をコードしうる。オープンリーディングフレームＯＲＦ２、－６、－７、及び－８ａは、次の４種の限界構造遺伝子をコードすると予測されるサブゲノムｍＲＮＡから翻訳される：それぞれ、＞１５０ｋＤａのスパイク糖タンパク質（Ｓ）；約２３ｋＤａのメンブラン糖タンパク質（Ｍ）；低分子エンベロープタンパク質（Ｅ）；及び約５０ｋＤａのヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ）。
２０１９－ｎＣｏＶは、２９９０３ｎｔのゲノムを持つＡＮエンベロープ一本鎖ポジティブセンスＲＮＡウイルスである。２０１９－ｎＣｏＶのゲノム構造は、２０１９－ｎＣｏＶなどの他のコロナウイルスと類似しており、ゲノムの５’の３分の２がウイルスゲノム複製に必要な非構造タンパク質（ＮＳＰ）をコードし、ゲノムの残りの３’の３分の１がビリオンを構成する構造遺伝子（スパイク、エンベロープ、メンブラン、及びヌクレオカプシドタンパク質）と、構造遺伝子領域内に散在した４個のアクセサリー遺伝子をコードする。ゲノムの５’末端にはリーダー配列（６７ｎｔ）があり、これに非翻訳領域（ＵＴＲ）が続く。ＲＮＡゲノムの３’末端には別のＵＴＲがあり、可変長のポリ（Ａ）配列が続く。転写調節配列（ＴＲＳ ５’ＡＡＣＧＡＡ ３’）は、リーダー配列の３’末端と、２０１９－ｎＣｏＶのゲノム３’近位ドメインの遺伝子の上流の異なる位置に見出される。２０１９－ｎＣｏＶゲノムは、ＯＲＦ１ａ、ＯＲＦ１ｂ、Ｓ、３、４ａ、４ｂ、５、Ｅ、Ｍ、及びＮの少なくとも１４個の予測されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、１６個の予測される非構造タンパク質がＯＲＦ１ａ／ｂによってコードされている。ウイルスの複製に必須ではない幾つかの特有の群特異的ＯＲＦが２０１９－ｎＣｏＶによってコードされる。これらの群特異的ＯＲＦの機能は不明である；しかし、他のコロナウイルスとの類推により、それらは構造タンパク質又はインターフェロンアンタゴニスト遺伝子をコードしうる。オープンリーディングフレームＯＲＦ２、－６、－７、及び－８ａは、次の４種の限界構造遺伝子をコードすると予測されるサブゲノムｍＲＮＡから翻訳される：それぞれ、＞１５０ｋＤａのスパイク糖タンパク質（Ｓ）；約２３ｋＤａのメンブラン糖タンパク質（Ｍ）；低分子エンベロープタンパク質（Ｅ）；及び約５０ｋＤａのヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ）。
【0058】
実施例２ ２０１９－ｎＣｏＶの重要な遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡのデザイン
我々は、２５量体オリゴと２１量体オリゴの両方を含む複数のｓｉＲＮＡ配列をデザインした。表１は、様々なウイルスＲＮＡ（非構造タンパク質）を標的とするｓｉＲＮＡ配列、２５量体平滑末端オリゴ及び２１量体粘着末端オリゴを示す。これらの配列の特徴には、限定されないが、保存的な遺伝子配列のターゲティング、合理的な熱力学的安定性、及び低毒性の副作用が含まれる。表２は、様々なウイルスＲＮＡ（スパイクタンパク質）を標的とするｓｉＲＮＡ配列、２５量体平滑末端オリゴ及び２１量体粘着末端オリゴを示し、太字で示されているｓｉＲＮＡは最も強力なｓｉＲＮＡ阻害剤であり、下線が付されているｓｉＲＮＡは二番目に優れたｓｉＲＮＡ阻害剤である。表３は、他の様々なウイルスタンパク質及び遺伝子を標的とする、最も強力なｓｉＲＮＡオリゴ、２５量体平滑末端オリゴ、及び２１量体粘着末端オリゴを示す。
我々は、２５量体オリゴと２１量体オリゴの両方を含む複数のｓｉＲＮＡ配列をデザインした。表１は、様々なウイルスＲＮＡ（非構造タンパク質）を標的とするｓｉＲＮＡ配列、２５量体平滑末端オリゴ及び２１量体粘着末端オリゴを示す。これらの配列の特徴には、限定されないが、保存的な遺伝子配列のターゲティング、合理的な熱力学的安定性、及び低毒性の副作用が含まれる。表２は、様々なウイルスＲＮＡ（スパイクタンパク質）を標的とするｓｉＲＮＡ配列、２５量体平滑末端オリゴ及び２１量体粘着末端オリゴを示し、太字で示されているｓｉＲＮＡは最も強力なｓｉＲＮＡ阻害剤であり、下線が付されているｓｉＲＮＡは二番目に優れたｓｉＲＮＡ阻害剤である。表３は、他の様々なウイルスタンパク質及び遺伝子を標的とする、最も強力なｓｉＲＮＡオリゴ、２５量体平滑末端オリゴ、及び２１量体粘着末端オリゴを示す。
【0059】
実施例３ 強力な抗２９１０－ｎＣｏＶ ｓｉＲＮＡオリゴの細胞培養ベースのスクリーニング
ベロ細胞培養実験において２０１９－ｎＣｏＶ遺伝子をサイレンシングするための最も強力なｓｉＲＮＡを同定するために、我々は、２０１９－ｎＣｏＶ遺伝子配列を担持するｐｓｉＣｈｅｃｋプラスミドを最初に使用した。次に、我々は実際の２０１９－ｎＣｏＶに感染したベロ細胞を使用して、選択されたｓｉＲＮＡをその抗２０１９－ｎＣｏＶ感染活性について試験した。
ベロ細胞培養実験において２０１９－ｎＣｏＶ遺伝子をサイレンシングするための最も強力なｓｉＲＮＡを同定するために、我々は、２０１９－ｎＣｏＶ遺伝子配列を担持するｐｓｉＣｈｅｃｋプラスミドを最初に使用した。次に、我々は実際の２０１９－ｎＣｏＶに感染したベロ細胞を使用して、選択されたｓｉＲＮＡをその抗２０１９－ｎＣｏＶ感染活性について試験した。
【0060】
Ａ． ベロ細胞におけるｓｉＲＮＡ効力検査のサロゲートとしての２０１９－ｎＣｏＶウイルス遺伝子断片のサブクローニング
標的とされた２０１９－ｎＣｏＶ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ候補の分解効果を調査するために、我々は、デュアルルシフェラーゼレポーターベクターｐｓｉＣＨＥＣＫ－２を、パパイン様ウイルスタンパク質（ｎｓｐ５）、コノラウイルスエンドペプチダーゼＣ３０（ｎｓｐ６）、ＲＮＡ合成タンパク質（ｎｓｐ１０）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ｎｓｐ１２）、及び構造タンパク質Ｓ、Ｅ、Ｍ及びＮの遺伝子断片と共に使用した。ｐｓｉＣＨＥＣＫ－２ベクターは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の初期最適化のための定量的で迅速なアプローチを提供するようにデザインされる。そのベクターは、レポーター遺伝子に融合された標的遺伝子の発現変化のモニタリングを可能にする。ｎｓｐ５、ｎｓｐ６、ｎｓｐ１０、ｎｓｐ１２及び構造タンパク質Ｓ、Ｅ、Ｍ及びＮのＤＮＡ断片を、これらの遺伝子に特異的なプライマーを用いたＰＣＲによって増幅し、ついでｐｓｉＣＨＥＣＫ－２ベクターの多重クローニング部位にクローニングした。このベクターでは、ウミシイタケルシフェラーゼが一次レポーター遺伝子として使用され、ｓｉＲＮＡ標的遺伝子はウミシイタケ翻訳停止コドンの下流に位置される。
標的とされた２０１９－ｎＣｏＶ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ候補の分解効果を調査するために、我々は、デュアルルシフェラーゼレポーターベクターｐｓｉＣＨＥＣＫ－２を、パパイン様ウイルスタンパク質（ｎｓｐ５）、コノラウイルスエンドペプチダーゼＣ３０（ｎｓｐ６）、ＲＮＡ合成タンパク質（ｎｓｐ１０）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ｎｓｐ１２）、及び構造タンパク質Ｓ、Ｅ、Ｍ及びＮの遺伝子断片と共に使用した。ｐｓｉＣＨＥＣＫ－２ベクターは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の初期最適化のための定量的で迅速なアプローチを提供するようにデザインされる。そのベクターは、レポーター遺伝子に融合された標的遺伝子の発現変化のモニタリングを可能にする。ｎｓｐ５、ｎｓｐ６、ｎｓｐ１０、ｎｓｐ１２及び構造タンパク質Ｓ、Ｅ、Ｍ及びＮのＤＮＡ断片を、これらの遺伝子に特異的なプライマーを用いたＰＣＲによって増幅し、ついでｐｓｉＣＨＥＣＫ－２ベクターの多重クローニング部位にクローニングした。このベクターでは、ウミシイタケルシフェラーゼが一次レポーター遺伝子として使用され、ｓｉＲＮＡ標的遺伝子はウミシイタケ翻訳停止コドンの下流に位置される。
【0061】
ベロ細胞を９６ウェルプレートに播種し、１２時間インキュベートした。レポータープラスミド（組換えベクター）ｐｓｉ－ｎｓｐ５、ｐｓｉ－ｎｓｐ６、ｐｓｉ－ｎｓｐ１０、ｐｓｉ－ｎｓｐ１２、ｐｓｉ－Ｓ、ｐｓｉ－Ｅ、ｐｓｉ－Ｍ及びｐｓｉ－Ｎ、並びにｓｉＲＮＡ候補を、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ中のリポフェクタミン２０００を使用してベロ細胞にコトランスフェクトした。ブランクのｐｓｉベクターを陰性対照とする。トランスフェクションの６時間後、培地を、１０％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭに交換した。トランスフェクションの１８、２４、３６及び４８時間後に、デュアルルシフェラーゼキットを使用して、各ウェルにおけるホタル発光とウミシイタケルシフェラーゼの活性を検出した。ｓｉＲＮＡ候補はルシフェラーゼ活性を劇的に低下させ、ｓｉＲＮＡがインビトロで２０１９－ｎＣｏＶの標的遺伝子の発現を大幅に阻害できたことを示している。
【0062】
Ｂ． ２０１９－ｎＣｏＶによるベロ細胞の感染
ｎｓｐ５、ｎｓｐ６、ｎｓｐ１０、ｎｓｐ１２及び構造タンパク質Ｓ、Ｅ、Ｍ及びＮの２０１９－ｎＣｏＶ ｍＲＮＡがＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の特異的機構によって直接分解されるかどうかを調べるために、ベロ細胞を２４ウェルプレートに播種し、細胞単層が８０％の集密度に達したときに、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ中のリポフェクタミン２０００を使用して、選択した治療用の単一ｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡの組み合わせ候補をトランスフェクトした。トランスフェクション効果の対照は、Ｃｙ３標識ｓｉＲＮＡである。陰性対照としてＰＢＳを使用した。２０１９－ｎＣｏＶとは無関係の配列を持つｓｉＲＮＡを、更なる陰性対照として使用した。トランスフェクションの２４時間後、トランスフェクション試薬を含む培地を、２％のＦＢＳを補充した新鮮培地に交換し、細胞に２０１９－ｎＣｏＶを感染させた。感染の１時間後、接種溶液を、１０％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭに置き換えた。感染の２４時間後、細胞を、ＲＮＡ単離及びｃＤＮＡ末端の５’－迅速増幅（５’－ＲＡＣＥ）のために収集した。並列実験において、感染後２４、４８、及び７２時間で、ウイルス力価定量のために細胞上清を収集した。全ての実験は、バイオセーフティレベル２の条件下で実施した。
ｎｓｐ５、ｎｓｐ６、ｎｓｐ１０、ｎｓｐ１２及び構造タンパク質Ｓ、Ｅ、Ｍ及びＮの２０１９－ｎＣｏＶ ｍＲＮＡがＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の特異的機構によって直接分解されるかどうかを調べるために、ベロ細胞を２４ウェルプレートに播種し、細胞単層が８０％の集密度に達したときに、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ中のリポフェクタミン２０００を使用して、選択した治療用の単一ｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡの組み合わせ候補をトランスフェクトした。トランスフェクション効果の対照は、Ｃｙ３標識ｓｉＲＮＡである。陰性対照としてＰＢＳを使用した。２０１９－ｎＣｏＶとは無関係の配列を持つｓｉＲＮＡを、更なる陰性対照として使用した。トランスフェクションの２４時間後、トランスフェクション試薬を含む培地を、２％のＦＢＳを補充した新鮮培地に交換し、細胞に２０１９－ｎＣｏＶを感染させた。感染の１時間後、接種溶液を、１０％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭに置き換えた。感染の２４時間後、細胞を、ＲＮＡ単離及びｃＤＮＡ末端の５’－迅速増幅（５’－ＲＡＣＥ）のために収集した。並列実験において、感染後２４、４８、及び７２時間で、ウイルス力価定量のために細胞上清を収集した。全ての実験は、バイオセーフティレベル２の条件下で実施した。
【0063】
ウイルスＲＮＡを細胞上清から抽出し、順方向プライマーと逆方向プライマー、及び２０１９－ｎＣｏＶ分離株ＦＲＡ／ＵＡＥスパイクタンパク質に特異的なＴａｑＭａｎプローブを用いて、ワンステップ定量的リアルタイムＰＣＲを実施した。収集した細胞から全ＲＮＡを抽出し、ｎｓｐ５、ｎｓｐ６、ｎｓｐ１０、ｎｓｐ１２及び構造タンパク質Ｓ、Ｅ、Ｍ及びＮのｃＤＮＡ産物のために遺伝子特異的プライマーを用いて５’－ＲＡＣＥアッセイを実施した。保護効率の高い単一ｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡの組み合わせをインビボ研究のために選択した。
【0064】
ＰＢＳを含まないＤＭＥＭ培地（細胞培養培地）において、リポフェクタミン２０００を使用して、これらのレポータープラスミド（異なるウイルス遺伝子断片を含む）とｓｉＲＮＡ（これらの遺伝子断片に対するもの）をベロＥ６細胞中にコトランスフェクトした。何れのウイルス遺伝子も標的としないｓｉＲＮＡを陰性対照として使用した。トランスフェクションの６時間後、各ウェルにおいてウミシイタケルシフェラーゼとホタルルシフェラーゼがそれぞれの基質を触媒して蛍光を発する能力を、デュアルルシフェラーゼキットを用いて試験した。系の蛍光発現が減少する場合、それは、ｓｉＲＮＡがルシフェラーゼの発現を阻害していることを示す。酵素が基質を触媒して蛍光を発する能力の低下は、ｓｉＲＮＡ候補薬物分子がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的遺伝子の発現を効果的に阻害できることを意味する。この方法を使用して、我々は、複数の有効なｓｉＲＮＡをスクリーニングした（図３～５）。２９３Ｔ及びＡ５４９細胞では、両細胞において標的遺伝子に対して８０％を超える阻害効果を有する８種のｓｉＲＮＡを選択した（そのうち、これら二種の細胞において８５％を超える阻害効果を有するｓｉＲＮＡが三種類ある：すなわちＧ３２、Ｒ０３、及びＲ２４）。特にＡ５４９細胞株では、標的遺伝子に対して９０％を超える阻害効果を有するｓｉＲＮＡが５種ある。我々は二種の細胞の阻害効率に対するこれらのｓｉＲＮＡのＥＣ５０を更に測定した。その中で最も阻害効果の高いＲｅｃ＃３のＥＣ５０は、それぞれ、Ａ５４９で０．３ｐｇ／μＬ、２９３Ｔ細胞で５．８ｐｇ／μＬであった。
【0065】
実施例４ インビトロ細胞実験によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するｓｉＲＮＡの阻害効果の検証
ベロＥ６細胞を一晩培養した後、異なる濃度のｓｉＲＮＡ（３．１２５ｎＭから１００ｎＭまで）でトランスフェクトし、細胞を特定のＭＯＩ（感染効率）でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた。数日間培養した後、ウイルス感染率を細胞変性効果によって決定した。感染％は、（特異的抗体を使用して染色した、ウイルスＮタンパク質を発現する）感染細胞の数を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２色素で染色された細胞核としてカウントされた細胞の全数で割って計算した。殆どのｓｉＲＮＡ（ＳＣｏ１、ＳＣｏ２、ＳＣｏ３４、ＳＣｏ３６）は、試験した最低濃度、つまり３．１２５ｎＭで感染の完全な遮断を示した。
ベロＥ６細胞を一晩培養した後、異なる濃度のｓｉＲＮＡ（３．１２５ｎＭから１００ｎＭまで）でトランスフェクトし、細胞を特定のＭＯＩ（感染効率）でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた。数日間培養した後、ウイルス感染率を細胞変性効果によって決定した。感染％は、（特異的抗体を使用して染色した、ウイルスＮタンパク質を発現する）感染細胞の数を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２色素で染色された細胞核としてカウントされた細胞の全数で割って計算した。殆どのｓｉＲＮＡ（ＳＣｏ１、ＳＣｏ２、ＳＣｏ３４、ＳＣｏ３６）は、試験した最低濃度、つまり３．１２５ｎＭで感染の完全な遮断を示した。
【0066】
実施例５ ＨＫＰ／ｓｉＲＮＡナノ粒子と肺への送達
ヒスチジン－リジン共重合体（ＨＫＰ）ｓｉＲＮＡナノ粒子製剤は、ＨＫＰとｓｉＲＮＡの水溶液を４：１の分子量（Ｎ／Ｐ）比で混合することにより調製できる。典型的なＨＫＰ／ｓｉＲＮＡ製剤は、平均粒径１５０ｎｍのナノ粒子を提供する。自己集合したＨＫＰ／ｓｉＲＮＡナノ粒子を水溶液に再懸濁し、凍結乾燥して乾燥粉末にし、ついでＲＮａｓｅフリー水に再懸濁させた。ＨＫＰ／ｓｉＲＮＡ（赤色標識）ナノ粒子をマウスの気道に経口気管投与した後、我々は、上部気道（気管支）と下部気道（肺胞）に蛍光ｓｉＲＮＡを観察することができた。我々は、ＨＫＰ、ＤＯＴＡＰ、及びＤ５Ｗを含む三通りの異なる用量のｓｉＲＮＡを経口気管送達した後、肺におけるシクロフィリンＢのＲＮＡｉの有効性を比較した。ＨＫＰを介した送達は、２０μｇの用量で標的遺伝子の効率的なＲＮＡｉを示した（図８）。
ヒスチジン－リジン共重合体（ＨＫＰ）ｓｉＲＮＡナノ粒子製剤は、ＨＫＰとｓｉＲＮＡの水溶液を４：１の分子量（Ｎ／Ｐ）比で混合することにより調製できる。典型的なＨＫＰ／ｓｉＲＮＡ製剤は、平均粒径１５０ｎｍのナノ粒子を提供する。自己集合したＨＫＰ／ｓｉＲＮＡナノ粒子を水溶液に再懸濁し、凍結乾燥して乾燥粉末にし、ついでＲＮａｓｅフリー水に再懸濁させた。ＨＫＰ／ｓｉＲＮＡ（赤色標識）ナノ粒子をマウスの気道に経口気管投与した後、我々は、上部気道（気管支）と下部気道（肺胞）に蛍光ｓｉＲＮＡを観察することができた。我々は、ＨＫＰ、ＤＯＴＡＰ、及びＤ５Ｗを含む三通りの異なる用量のｓｉＲＮＡを経口気管送達した後、肺におけるシクロフィリンＢのＲＮＡｉの有効性を比較した。ＨＫＰを介した送達は、２０μｇの用量で標的遺伝子の効率的なＲＮＡｉを示した（図８）。
【0067】
実施例６ ナノ粒子製剤の調製と同定
ヒスチジン－リジン共重合体（ＨＫＰ）とｓｉＲＮＡ水溶液を、４：１の分子量比（Ｎ／Ｐ）で混合して、ＨＫＰ／ｓｉＲＮＡナノ粒子製剤を調製した（図１６Ａ）。標準的なＨＫＰ／ｓｉＲＮＡナノ粒子の平均粒径は概して１５０～２００ｎｍである。自己集合ＨＫＰ／ｓｉＲＮＡナノ粒子は、水溶液に懸濁されうる。乾燥粉末に凍結乾燥した後、リボヌクレアーゼを含まない水に再懸濁させることができる（図１６Ｂ）。Ｍａｌｖｅｒｎ粒径分析を使用して、製剤化されたナノ粒子製剤を分析して検出した。結果は、ナノ粒子の平均粒径が１９３．４ｎｍであり（図１６Ｃ）、ゼータ電位が３２．７ｍＶである（図１６Ｄ）ことを示しており、これは、その結果が期待された要件を満たしていることを示している。
ヒスチジン－リジン共重合体（ＨＫＰ）とｓｉＲＮＡ水溶液を、４：１の分子量比（Ｎ／Ｐ）で混合して、ＨＫＰ／ｓｉＲＮＡナノ粒子製剤を調製した（図１６Ａ）。標準的なＨＫＰ／ｓｉＲＮＡナノ粒子の平均粒径は概して１５０～２００ｎｍである。自己集合ＨＫＰ／ｓｉＲＮＡナノ粒子は、水溶液に懸濁されうる。乾燥粉末に凍結乾燥した後、リボヌクレアーゼを含まない水に再懸濁させることができる（図１６Ｂ）。Ｍａｌｖｅｒｎ粒径分析を使用して、製剤化されたナノ粒子製剤を分析して検出した。結果は、ナノ粒子の平均粒径が１９３．４ｎｍであり（図１６Ｃ）、ゼータ電位が３２．７ｍＶである（図１６Ｄ）ことを示しており、これは、その結果が期待された要件を満たしていることを示している。
【0068】
実施例７ 噴霧吸入投与試験
噴霧吸入による呼吸器／肺疾患の治療におけるＨＫＰとｓｉＲＮＡで構成されるナノ医薬製剤の開発可能性を試験するために、我々は、有効医薬成分（ＡＰＩ：ｓｉＲＮＡ）、送達担体ポリペプチド（ＨＫＰ）、及びナノ製剤（ｓｉＲＮＡとＨＫＰの両方）のエアロゾル化試験を更に実施した。更に、我々は、インビトロでのエアロゾル化の前後において、ＡＰＩ、添加物、及び薬物製剤の物理的及び化学的特性と生物学的活性をまた分析した。
噴霧吸入による呼吸器／肺疾患の治療におけるＨＫＰとｓｉＲＮＡで構成されるナノ医薬製剤の開発可能性を試験するために、我々は、有効医薬成分（ＡＰＩ：ｓｉＲＮＡ）、送達担体ポリペプチド（ＨＫＰ）、及びナノ製剤（ｓｉＲＮＡとＨＫＰの両方）のエアロゾル化試験を更に実施した。更に、我々は、インビトロでのエアロゾル化の前後において、ＡＰＩ、添加物、及び薬物製剤の物理的及び化学的特性と生物学的活性をまた分析した。
【0069】
クリーンベンチにおいて、我々は、事前にＺｈｅｎｇｙｕａｎ ＹＳ３１Ｅアトマイザーを洗浄・消毒し、スプレーポート（ノズル含む）を５０ｍＬの滅菌遠心管に挿入し、遠心管をアイスボックスに挿入し、遠心管とアトマイザーを直角にし、それらを別々に４５°に傾け；特定濃度のｓｉＲＮＡ、ＨＫＰ又はＳＴＰ７０５水溶液を調製し、溶液の大部分を取ってアトマイザーに入れ、１０～２０分、噴霧を開始する（約６～８分、２ｍＬを噴霧）。噴霧後、濃縮溶液（Ｂ溶液）を５０ｍＬの遠心管に回収し、アトマイザー内の残りの溶液はＣ溶液であり、アトマイザーなしの元の構成はＡ溶液である。その後、次のように進む：１）分光光度計を使用して、噴霧の前後での三種の溶液Ａ、Ｂ、及びＣ中のタンパク質（ＨＫＰ）及び／又は核酸（ｓｉＲＮＡ）の濃度を測定し、２）電気泳動によりｓｉＲＮＡとＳＴＰ７０５の完全性を確認し、３）細胞をトランスフェクトすることにより、標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡの阻害効果を分析する。
【0070】
最初に、我々は、噴霧後のｓｉＲＮＡ溶液の安定性を試験した（図１７Ａ）。その結果は、０．２ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡの噴霧後、分光光度計試験で濃度が（２２７．８５ｕｇ／ｍＬから２１８．６９ｕｇ／ｍＬに）約４％低下したことが示され、噴霧装置中の残りのｓｉＲＮＡ溶液の影響はなかったことを示している。更に、電気泳動の結果からもまた上記の結果が確認された（図１７Ｂ）。つまり、エアロゾル化後にｓｉＲＮＡ溶液の濃度が僅かに低下したことを除き、ｓｉＲＮＡの断片は完全に保持されていた。
【0071】
ＨＫＰポリペプチド送達系に対する噴霧の影響を分析するために、本発明はＹＳ３１Ｅアトマイザーを使用して（約０．８ｍｇ／ｍＬの濃度の）ＨＫＰ溶液を噴霧する。我々は、上記のＨＫＰ溶液の三種の異なる溶液、すなわちＡ、Ｂ、及びＣを収集した後、それらをＨＰＬＣで試験した。結果から、噴霧された溶液の濃度は低下したが、ＨＫＰは噴霧後も完全な構造を維持していたことが確認され、噴霧がＨＫＰの構造に有意な影響を与えなかったことを示している（図１８）。
【0072】
実施例８ 腹腔内送達のためのＨＫＰ／ｓｉＲＮＡ製剤
インフルエンザ感染に対するｓｉＲＮＡ阻害剤の予防及び治療効果の評価中に、我々は、異なる投薬量とレジメンを使用した腹腔内投与によるＨＫＰ／ｓｉＲＮＡ製剤を試験した。これらの治療結果の観察に基づいて、我々は、ＨＫＰ／ｓｉＲＮＡ（二種のｓｉＲＮＡがインフルエンザ遺伝子に特異的）の予防効果がリバビリンの効果を上回ったことを見出した（図３）。同様に、ＨＫＰ／ｓｉＲＮＡ（インフルエンザ遺伝子に特異的な二種のｓｉＲＮＡ）の治療効果は、タミフルの効果よりも大きい（図４）。
インフルエンザ感染に対するｓｉＲＮＡ阻害剤の予防及び治療効果の評価中に、我々は、異なる投薬量とレジメンを使用した腹腔内投与によるＨＫＰ／ｓｉＲＮＡ製剤を試験した。これらの治療結果の観察に基づいて、我々は、ＨＫＰ／ｓｉＲＮＡ（二種のｓｉＲＮＡがインフルエンザ遺伝子に特異的）の予防効果がリバビリンの効果を上回ったことを見出した（図３）。同様に、ＨＫＰ／ｓｉＲＮＡ（インフルエンザ遺伝子に特異的な二種のｓｉＲＮＡ）の治療効果は、タミフルの効果よりも大きい（図４）。
【0073】
実施例９ ＳＬｉＣ／ｓｉＲＮＡナノ粒子
［ＳＬｉＣリポソーム調製］
新たに合成したＳＬｉＣ分子を用いて、薄膜法や溶媒注入法などの一般的な方法でリポソームを調製しようと最初に試みたが、殆ど成功しなかった。Ｍａｕｒｅｒ等は、ｓｉＲＮＡ又はオリゴヌクレオチド溶液をリポソームの５０％エタノール溶液（ｖ／ｖ）にボルテックスしながらゆっくりと添加し、その後、エタノールを透析によって除去するリポソーム調製法を報告している。これにより、粒径が小さく均一なナノ粒子が得られた。この方法では、リポソームの形成中にカチオン性脂質によってｓｉＲＮＡが直接、包まれたが、殆どの他の方法では、ｓｉＲＮＡ又は核酸分子は、リポフェクタミン２０００などの前もって形成されたリポソームにロード（又は封入）される。
［ＳＬｉＣリポソーム調製］
新たに合成したＳＬｉＣ分子を用いて、薄膜法や溶媒注入法などの一般的な方法でリポソームを調製しようと最初に試みたが、殆ど成功しなかった。Ｍａｕｒｅｒ等は、ｓｉＲＮＡ又はオリゴヌクレオチド溶液をリポソームの５０％エタノール溶液（ｖ／ｖ）にボルテックスしながらゆっくりと添加し、その後、エタノールを透析によって除去するリポソーム調製法を報告している。これにより、粒径が小さく均一なナノ粒子が得られた。この方法では、リポソームの形成中にカチオン性脂質によってｓｉＲＮＡが直接、包まれたが、殆どの他の方法では、ｓｉＲＮＡ又は核酸分子は、リポフェクタミン２０００などの前もって形成されたリポソームにロード（又は封入）される。
【0074】
エタノールに溶解した脂質は、リポソームがあまり安定しておらず、凝集する傾向がある準安定状態にある。我々は、ついで、修正Ｍａｕｒｅｒ法を使用して、ロードされていない又は前もって形成されたリポソームを調製した。我々は、エタノールを１２．５％（ｖ／ｖ）の最終濃度に希釈するだけで安定したリポソーム溶液を作製できることを見出した。リポソームは、エタノールに溶解した脂質（カチオン性ＳＬｉＣ／コレステロール、５０：５０モル％）を滅菌ｄｄ－Ｈ２Ｏに添加することによって調製した。迅速混合下、エタノール性脂質溶液をゆっくりと添加した。
【0075】
そのプロセスでは、小さくより均一なリポソームの形成が可能になるけれども、ＳＬｉＣリポソームの調製を成功させるには、エタノールをゆっくりと添加し、迅速に混合する必要があった（図５）。リポソーム製剤化の過程でｓｉＲＮＡがロードされ、製造の最後にエタノール又は他の溶媒が除去される一般的な方法とは異なり、我々のＳＬｉＣリポソームは、エタノールが溶液中に残って、リポソームがなお準安定状態にあると考えられるように製剤化された。ｓｉＲＮＡ溶液にリポソーム溶液を混合／ロードすると、脂質のカチオン基がアニオン性ｓｉＲＮＡと相互作用し、縮合してコアを形成する。ＳＬｉＣリポソームの準安定状態は、ｓｉＲＮＡ又は核酸をより効果的に封入するリポソーム構造変換を支援若しくは促進した。ｓｉＲＮＡの封入の結果として、ＳＬｉＣリポソームはよりコンパクトで均一になる。
【0076】
［ＳＬｉＣリポソームの物理化学的及び生物学的特徴］
リポソーム形成後、我々は、粒径、表面電位、形態研究、ｓｉＲＮＡ負荷効率及び生物学的活性などを含む、ＳＬｉＣリポソームの物理化学的性質を特徴付ける一連のアッセイを開発した。ＳＬｉＣリポソームの粒径とゼータ電位は、Ｎａｎｏ ＺＳ Ｚｅｔａ Ｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＫ）を用いて測定した。それぞれの新規ＳＬｉＣリポソームを、エタノール含有量が５０％から２５％に、並びに１２．５％に変化したときに、粒径とゼータ電位について試験した。データは、異なるエタノール含有量の製剤から得た。ＳＬｉＣリポソームは全て１ｍｇ／ｍｌの濃度で調製し、ｓｉＲＮＡをロードした（２：１ｗ／ｗ）。それぞれのＳＬｉＣリポソームは、例えばＴＭ２（１２．５）など、１２．５％でエタノールに溶解したカチオン性ＳＬｉＣ及びコレステロールで構成された。
リポソーム形成後、我々は、粒径、表面電位、形態研究、ｓｉＲＮＡ負荷効率及び生物学的活性などを含む、ＳＬｉＣリポソームの物理化学的性質を特徴付ける一連のアッセイを開発した。ＳＬｉＣリポソームの粒径とゼータ電位は、Ｎａｎｏ ＺＳ Ｚｅｔａ Ｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＫ）を用いて測定した。それぞれの新規ＳＬｉＣリポソームを、エタノール含有量が５０％から２５％に、並びに１２．５％に変化したときに、粒径とゼータ電位について試験した。データは、異なるエタノール含有量の製剤から得た。ＳＬｉＣリポソームは全て１ｍｇ／ｍｌの濃度で調製し、ｓｉＲＮＡをロードした（２：１ｗ／ｗ）。それぞれのＳＬｉＣリポソームは、例えばＴＭ２（１２．５）など、１２．５％でエタノールに溶解したカチオン性ＳＬｉＣ及びコレステロールで構成された。
【0077】
ＳＬｉＣリポソームの物理化学的境界を更に分析すると、エタノール濃度は粒径に正に比例した（エタノール濃度が低いほど、粒径が小さくなる）が、ゼータ電位には負に比例した（エタノール濃度が低いほど、ゼータ電位が同時に高くなる）ことが示唆された。表面電位が高いほど、粒子は溶液中でより安定になる。溶液中での安定性に加えて、後で示されるデータは、エタノール濃度が低いほど毒性がまたより低いことを更に示していた。従って、これらの要因に照らして、リポソーム製剤の調製に使用される前に、マスター作業原液にコレステロールとＳＬｉＣを懸濁する溶媒として、１２．５％（ｖ／ｖ）のエタノール濃度を選択した。
【0078】
ベアＳＬｉＣリポソーム製剤とは対照的に、ｓｉＲＮＡを２：１（ｗ／ｗ）でロードすると、リポソーム粒径は更に小さくなり、１１０から１９０ｎｍの範囲の粒径と、更に低いＰＤＩ値になった。リポソーム構造の一般的な考察では、ｓｉＲＮＡが静電力によってカチオン性脂質にロードされ又は相互作用し、リポソームがｓｉＲＮＡを包み込んで球状粒子を形成し、表面張力を低下させると理解される。その結果、ｓｉＲＮＡをロードした後にリポソーム粒径が更に小さくなった。ｓｉＲＮＡで製剤化したリポソームはまた低い表面電荷を有しており、これはロードされたｓｉＲＮＡからの中和効果によって説明できる。ＳＬｉＣを媒介したｓｉＲＮＡ送達の阻害効果は、シクロフィリンＢの発現について、抗シクロフィリンＢ ｓｉＲＮＡで確認された。
【0079】
実施例１０ マウスモデルでの気道送達
ヒト宿主細胞ジペプチジルペプチダーゼ４（ｈＤＰＰ４）及びＡＣＥ２及びＮＲＰ１は、２０１９－ｎＣｏＶの受容体であることが示されている。しかし、マウスはウイルスによって認識され結合される受容体を有していないため、２０１９－ｎＣｏＶの適切な小動物モデルではない。この研究では、気道においてｈＤＰＰ４を発現するアデノウイルス又はレンチウイルスベクターを形質導入することにより、マウスを２０１９－ｎＣｏＶ感染に対して感作させた。このマウスモデルを、インビボで２０１９－ｎＣｏＶ感染を阻害するｓｉＲＮＡの効率を調査するために使用した。ｓｉＲＮＡの組み合わせ候補を、ＨＫＰ－ＳＬｉＣナノ粒子系を用いたキャプシド形成によって送達した。我々は、全てのマウス研究を、バイオセーフティレベル３の条件下で実施した。
ヒト宿主細胞ジペプチジルペプチダーゼ４（ｈＤＰＰ４）及びＡＣＥ２及びＮＲＰ１は、２０１９－ｎＣｏＶの受容体であることが示されている。しかし、マウスはウイルスによって認識され結合される受容体を有していないため、２０１９－ｎＣｏＶの適切な小動物モデルではない。この研究では、気道においてｈＤＰＰ４を発現するアデノウイルス又はレンチウイルスベクターを形質導入することにより、マウスを２０１９－ｎＣｏＶ感染に対して感作させた。このマウスモデルを、インビボで２０１９－ｎＣｏＶ感染を阻害するｓｉＲＮＡの効率を調査するために使用した。ｓｉＲＮＡの組み合わせ候補を、ＨＫＰ－ＳＬｉＣナノ粒子系を用いたキャプシド形成によって送達した。我々は、全てのマウス研究を、バイオセーフティレベル３の条件下で実施した。
【0080】
全てのＢＡＬＢ／ｃマウスは１８週齢であり、この研究の開始時に特定病原体除去状態として試験した。２０１９－ｎＣｏＶに対する感受性を発現させるために、アデノウイルスベクター群の３０匹のマウスとレンチウイルスベクター群の３０匹のマウスに、ｈＤＰＰ４を発現するアデノウイルスベクターとレンチウイルスベクターをそれぞれ形質導入した。別の２０匹のマウスには、対照として空のアデノウイルス又はレンチウイルスベクターを形質導入した。アデノウイルスベクター群では、ｈＤＤＰ４遺伝子をＡｄ５にクローニングした。ついで、ＭＬＥ１５細胞にＡｄ５－ｈＤＤＰ４を２０のＭＯＩで形質導入した。感染の４８時間後に上清を回収した。マウスに、１０８ｐｆｕのＡｄ５－ｈＤＤＰ４を鼻腔内形質導入した。レンチウイルスベクター群では、ｈＤＤＰ４遺伝子をプラスミドｐＷＰＸＬｄにクローニングした。ついで、ｐＷＰＸＬｄ－ｈＤＰＰ４を、パッケージングベクターｐｓＰＡＸ２及びエンベロープベクターｐＭＤ２．Ｇと共に、リン酸カルシウム法を使用してパッケージング細胞株ＨＥＫ２９３Ｔにコトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、構築されたウイルスベクターを収集して精製し、ＣＨＯ細胞に形質導入した。レンチウイルスを収集し、濃縮した。マウスに、１０８形質導入単位／ｍｌ（ＴＵ／ｍｌ）の力価でｈＤＰＰ４を発現するレンチウイルスを鼻腔内形質導入した。
【0081】
ｈＤＰＰ４がマウスの気道において発現されていたことをウェスタンブロットで確認した後、アデノウイルス及びレンチウイルスベクター群を、各下位群に１０匹のマウスを含む予防、治療、及び対照下位群に更に分割した。Ａｄ５－ｈＤＤＰ４又はｐｓＰＡＸ２－ｈＤＤＰ４予防下位群の１０匹のマウスに、接種の２４時間前に、ＨＫＰ－ＳＬｉＣナノ粒子系でキャプシド形成されたｓｉＲＮＡの組み合わせを鼻腔内接種した。２４時間後、空のベクターが形質導入されたマウスを含む８０匹全てのマウスに、１０５ｐｆｕの２０１９－ｎＣｏＶを静脈内感染させた。感染後０、２４、４８、７２、及び９６時間で、予防、治療、及び対照下位群にｓｉＲＮＡ又はＰＢＳを鼻腔内接種した。
【0082】
全てのマウスの体重を測定し、各下位群の生存率を毎日カウントした。ウイルス力価測定のために、感染後１、３、５、７、９、及び１４日目に鼻洗浄液を収集した。各群から２匹の感染マウスを、感染後３日目及び５日目にそれぞれ屠殺した。病理学的及びウイルス学的研究のために、肺、気管、脾臓、肝臓、心臓、脳及び腎臓を含む組織を収集した。
【0083】
ウイルス力価を決定するために、組織試料をＤＭＥＭでホモジナイズし、遠心分離によって清澄化した。組織懸濁液と鼻洗浄液の両方を１０倍に連続希釈した。希釈物を、９６ウェルプレートで増殖させたベロ細胞単層に添加した。細胞変性効果（ＣＰＥ）が感染後３日目に観察され、ＴＣＩＤ５０をＲｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ法によって計算した。
【0084】
ウイルス遺伝子発現を阻害するｓｉＲＮＡ候補の効率を調査するために、組織から全ＲＮＡを抽出し、順方向、逆方向プライマー、及び２０１９－ｎＣｏＶのｎｓｐ１２の保存領域（ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ）に特異的なＴａｑＭａｎプローブを用いて、ワンステップ定量的リアルタイムＰＣＲを実施した。
【0085】
実施例１１ 腹腔内ｓｉＲＮＡナノ粒子溶液
［ｓｉＲＮＡのインビボ投与］
インビボ実験を、６～８週齢の雌マウスを使用して行った。接種には、インフルエンザウイルスを５×１０４ＥＩＤ５０／ｍＬの用量で含む尿膜腔液を使用した。尿膜腔液中のウイルスの感染活性は、致死性の滴定によってインビボで決定した。ウイルスの力価は、Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ法（１７ａ）を使用して計算した。感染動物と同じ条件で飼育された非感染マウスを陰性対照として使用した。軽いエーテル麻酔下でウイルスを動物に鼻腔内投与した。動物の各群には、１５匹のマウスを含めた。上記のようにＰＡＡと複合体を形成したｓｉＲＮＡ（１：１の比の抗インフルエンザｓｉＲＮＡ８９及び１０３）を、１～１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で動物に投与した。ｓｉＲＮＡは腹腔内投与した（注射当たり２００ｕｌ）。対照動物には、ｓｉＲＮＡなしでＰＡＡを投与した。
［ｓｉＲＮＡのインビボ投与］
インビボ実験を、６～８週齢の雌マウスを使用して行った。接種には、インフルエンザウイルスを５×１０４ＥＩＤ５０／ｍＬの用量で含む尿膜腔液を使用した。尿膜腔液中のウイルスの感染活性は、致死性の滴定によってインビボで決定した。ウイルスの力価は、Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ法（１７ａ）を使用して計算した。感染動物と同じ条件で飼育された非感染マウスを陰性対照として使用した。軽いエーテル麻酔下でウイルスを動物に鼻腔内投与した。動物の各群には、１５匹のマウスを含めた。上記のようにＰＡＡと複合体を形成したｓｉＲＮＡ（１：１の比の抗インフルエンザｓｉＲＮＡ８９及び１０３）を、１～１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で動物に投与した。ｓｉＲＮＡは腹腔内投与した（注射当たり２００ｕｌ）。対照動物には、ｓｉＲＮＡなしでＰＡＡを投与した。
【0086】
接種後１４日間、動物を観察した。対照群及び実験群の動物の死亡率を毎日登録した。各群の死亡率（Ｍ）は次のように計算した：Ｍ＝Ｎ／Ｎｔ、ここで、Ｎ－感染後１４日以内に死亡した動物の数；Ｎｔ－群内の動物の全数。保護指数（ＩＰ）は次のように計算した：ＩＰ＝（（Ｍｃ－Ｍｅ）／Ｍｃ）×１００％、ここで、Ｍｃ及びＭｅ－対照群と実験群の死亡率にそれぞれ対応。１４日以内の死亡日の中央値（ＭＤＤ）は次のように計算した：ＭＤＤ＝（ΣＮＤ）／Ｎｔ、ここで、Ｎ－日数Ｄを生存した動物の数、Ｎｔ－群内の動物の全数。タミフル（リン酸オセルタミビル、Ｒｏｃｈｅ、スイス）を参照化合物として使用した。それは同じプロトコルによって２５ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。
【0087】
腹腔内投与は、特にガス交換量が少ない重度インフルエンザ若しくはＣｏｖｉｄ１９感染症の患者及び／又は機械的肺換気を受けている患者では、実行可能な代替手段になる場合がある。同じ長さのｓｉＲＮＡは類似の特性（電荷、疎水性、分子量など）を示し、ｓｉＲＮＡは迅速にデザイン及び製造できるため、ナノ粒子を介したｓｉＲＮＡ送達は、一般集団を保護するワクチンが開発中であるところ、既存の治療法に応答しない高い死亡率を持つ急速に出現するインフルエンザウイルス又はコロナウイルス株の治療における中間の治療戦略を形成する可能性があることはありうる。この原稿において実証されたｓｉＲＮＡカクテルは、幅広い抗Ｃｏｖｉｄ１９株をカバーする予防／治療薬として顕著な価値をもたらす可能性があり、この適用範囲は、将来出現する可能性のある未知のＣｏｖｉｄ１９株にまで十分に及ぶ可能性がある。
一般集団を保護するワクチンが開発中であるところ、既存の治療法に応答しない高い死亡率を持つ急速に出現するインフルエンザウイルス株の治療。この原稿において実証されたｓｉＲＮＡカクテルは、幅広い抗インフルエンザ株をカバーする予防／治療薬として顕著な価値をもたらす可能性があり、この適用範囲は、将来出現する可能性のある未知のインフルエンザ株にまで十分に及ぶ可能性がある。
一般集団を保護するワクチンが開発中であるところ、既存の治療法に応答しない高い死亡率を持つ急速に出現するインフルエンザウイルス株の治療。この原稿において実証されたｓｉＲＮＡカクテルは、幅広い抗インフルエンザ株をカバーする予防／治療薬として顕著な価値をもたらす可能性があり、この適用範囲は、将来出現する可能性のある未知のインフルエンザ株にまで十分に及ぶ可能性がある。
【0088】
我々は、この研究において、ＩＰ投与を介した二種のｓｉＲＮＡの組み合わせの高分子ナノ粒子媒介送達が、ウイルスに曝露された動物に強力な抗ウイルス効果をもたらす可能性があることを実証した。ヒスチジンリジン共重合体（ＨＫＰ）ナノ粒子を介したｓｉＲＮＡ送達は、様々な動物モデルで複数の経路を通して十分に検証された。我々は、マウスとサルの両方のモデルへの皮下投与によるＨＫＰ－ｓｉＲＮＡナノ粒子製剤の本格的な安全性研究を最近完了した（データは示さず）。ＨＫＰ－ｓｉＲＮＡ１０３／１０５製剤をＩＰ投与（１０ｍｇ／ｋｇ／日）した場合、２ｘＬＤ５０用量のウイルスへの曝露からマウスを保護する上で、リバビリン（７５ｍｇ／ｋｇ／日）で観察されたものよりも大きな予防及び治療効果が得られた。得られたデータは、ｓｉＲＮＡを含むペプチドナノ粒子又はｓｉＲＮＡを担持するポリカチオン性送達ビヒクルのＩＰ注射が、マウスのインフルエンザ感染によって誘発される致死率を共に改善し、従ってこれらの障壁の幾つかを克服する能力があることを示している。両親媒性ポリ（アリルアミン）（ＰＡＡ）形成高分子ミセル（ＰＭ）は、ＧＩ管を介したｓｉＲＮＡ送達について評価されており（３３）、効率的なｓｉＲＮＡ送達とエンドソーム／リソソーム放出をもたらす。ＰＡＡ及びｓｉＲＮＡは、ナノサイズの粒径（１５０～３００ｎｍ）及びカチオン表面電荷（＋２０から３０ｍＶ）を持つ複合体に自己集合されうる。我々がＰＡＡ－ｓｉＲＮＡ８９／１０３製剤（１０ｍｇ／ｋｇ）をＩＰ投与したとき、タミフル（２５ｍｇ／ｋｇ）と同等の治療的抗ウイルス活性が観察された。これらの結果から、ｓｉＲＮＡの組み合わせの高分子ナノ粒子送達が、インフルエンザウイルスの新たに出現した株に対する予防的／治療的応答を提供できることが明確に証明された。
【0089】
実施例１２ 非ヒト霊長類研究
現在、２０１９－ｎＣｏＶに対する予防又は治療剤戦略に利用できる有効なワクチンも薬剤もない。最近、アカゲザルが、気管内接種を使用する２０１９－ｎＣｏＶのモデルとして開発された。ヒトと同様に、感染したサルは疾患の臨床的徴候、ウイルス複製、及び組織学的病変を示し、アカゲザルが２０１９－ｎＣｏＶ感染に対するワクチン及び抗ウイルス剤戦略の評価のための良好なモデルであることを示している。２０１９－ｎＣｏＶ感染からの保護と治癒に対するｓｉＲＮＡの効率を調査するために、我々は、アカゲザルで非ヒト霊長類研究を実施した。ｓｉＲＮＡカクテル候補を、ＨＫＰ－ＳＬｉＣナノ粒子系でキャプシド形成し、気管内投与した。このサル研究は、バイオセーフティレベル３の条件下で実施した。
現在、２０１９－ｎＣｏＶに対する予防又は治療剤戦略に利用できる有効なワクチンも薬剤もない。最近、アカゲザルが、気管内接種を使用する２０１９－ｎＣｏＶのモデルとして開発された。ヒトと同様に、感染したサルは疾患の臨床的徴候、ウイルス複製、及び組織学的病変を示し、アカゲザルが２０１９－ｎＣｏＶ感染に対するワクチン及び抗ウイルス剤戦略の評価のための良好なモデルであることを示している。２０１９－ｎＣｏＶ感染からの保護と治癒に対するｓｉＲＮＡの効率を調査するために、我々は、アカゲザルで非ヒト霊長類研究を実施した。ｓｉＲＮＡカクテル候補を、ＨＫＰ－ＳＬｉＣナノ粒子系でキャプシド形成し、気管内投与した。このサル研究は、バイオセーフティレベル３の条件下で実施した。
【0090】
全てのアカゲザルは、この研究の開始時に２～３歳であった。当初、全てのサルは２０１９－ｎＣｏＶに対して検査で陰性であった。１２匹のサルを三群に分けた－各群に４匹の動物を含む予防、保護、及び対照群である。ネブライザーを使用して、ＨＫＰ－ＳＬｉＣナノ粒子系にキャプシド形成されたｓｉＲＮＡの組み合わせを、予防群の４匹のサルに気管内接種した。２４時間後、１２匹のサル全てに、１ｍＬ中の２０１９－ｎＣｏＶの６．５×１０７ＴＣＩＤ５０を気管内接種した。ネブライザーを使用して、感染後０、２４、４８、７２及び９６時間で、予防及び保護群にｓｉＲＮＡの組み合わせを連続的に接種した。対照群には、同じ時点でＰＢＳを接種した。
【0091】
全てのサルを、症状と死亡率について毎日２回観察した。胸部Ｘ線を、感染の１日前と感染の３日及び５日後に実施した。口咽頭、鼻、及び総排泄腔スワブを、ウイルス力価測定のために、感染後１、３、５、７、９、１４、２１、及び２８日目に収集した。感染後３日目に、各群から２匹の感染サルを屠殺した。病理学的及びウイルス学的研究のために、肺、気管、脾臓、肝臓、心臓、脳、腎臓、及び結腸組織を含む組織を収集した。
【0092】
組織及びスワブ試料におけるウイルス力価の定量は、実施例２に記載のように実施した。ウイルス遺伝子発現の阻害に対するｓｉＲＮＡ候補の効率を調査するために、組織から全ＲＮＡを抽出し、ワンステップ定量的リアルタイムＰＣＲを実施した。
【0093】
ウイルスタンパク質発現の阻害に対するｓｉＲＮＡ候補の効率を調査するために、組織から全ＲＮＡを抽出し、実施例８に記載のようにワンステップ定量的リアルタイムＰＣＲを実施した。
【0094】
実施例１３ 動物薬力学試験
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対するｓｉＲＮＡの有効性を研究するために、非ヒト霊長類実験（中国マカクザル）を使用することができる。研究は、バイオセーフティレベル３（ＢＳＬ－３）の実験室で行われる。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対するｓｉＲＮＡの有効性を研究するために、非ヒト霊長類実験（中国マカクザル）を使用することができる。研究は、バイオセーフティレベル３（ＢＳＬ－３）の実験室で行われる。
【0095】
研究開始前、全てのマカクザルは２～３歳で、全てのマカクザルはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検査で陰性であった。１２匹のサルを無作為に３群、すなわち予防群、治療群、及び対照群（各群に４匹のサル）に分ける。予防群の４匹のサルに、ハンドヘルド噴霧スプレー装置を使用してポリペプチド又はリポソーム様ナノ担体によってカプセル化されたｓｉＲＮＡ組成物を、気道を通して接種する。２４時間後、１２匹のサル全てに６．５×１０７ＴＣＩＤ５０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（１ｍＬ）を、気道を通して接種する。感染後０時間（ｈ）、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、及び９６ｈの時点で、予防群及び保護群のサルに、噴霧スプレー装置を介してｓｉＲＮＡ組成物を投与し続ける。対照群には、対応する時点でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を接種する。
【0096】
我々は全てのサルを一日２回観察し、その症状と死亡率を記録する。我々は、感染の１日前と感染の３日後及び５日後にマカクザルに胸部Ｘ線検査を実施した。感染後１日（ｄ）、３ｄ、５ｄ、７ｄ、９ｄ、１４ｄ、２１ｄ、及び２８ｄの時点で、我々は、ウイルス力価測定のために口咽頭、鼻、及び総排泄腔のスワブを収集した。感染後に異なる時期に死亡したサルについて、肺、気管、脾臓、肝臓、心臓、脳、腎臓、及び結腸組織を含むその組織を病理学的及びウイルス学的研究のために収集した。
【0097】
ウイルス遺伝子の発現の阻害におけるｓｉＲＮＡ候補薬の有効性を研究するために、我々は気道におけるウイルス力価を定量した。同時に、我々は、細胞上清からウイルスＲＮＡを抽出し、ワンステップ定量的リアルタイムＰＣＲを実施するために、ＦＲＡ／ＵＡＥスパイクタンパク質特異的な順方向及び逆方向プライマー、及びＭＥＲＳ－ＣｏＶから単離されたＴａｑＭａｎプローブを使用した。我々は、次に、収集した細胞から全ＲＮＡを抽出し、非構造タンパク質ＯＲＦ１ＡＢ及び構造タンパク質Ｓ、Ｅ、Ｍ、及びＮのｃＤＮＡ産物に遺伝子特異的プライマーを使用して、５’－ＲＡＣＥ試験を実施し、ｓｉＲＮＡの作用機構を検証した。
【0098】
実施例１４：生ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２に対するｓｉＲＮＡのデザインと試験
配列解析により、様々なＣｏＶ及びＳＡＲＳウイルスに共通する、２５個の部分的に重複するｓｉＲＮＡ分子を特定した。これらの２５の配列を、ウイルス感染２９３Ｔ及びＡ５４９細胞に対してｐｓｉＣｈｅｃｋ２プラスミド系で試験した（図２１、表３を参照）。結果を以下の表Ａ～Ｃに示す：
配列解析により、様々なＣｏＶ及びＳＡＲＳウイルスに共通する、２５個の部分的に重複するｓｉＲＮＡ分子を特定した。これらの２５の配列を、ウイルス感染２９３Ｔ及びＡ５４９細胞に対してｐｓｉＣｈｅｃｋ２プラスミド系で試験した（図２１、表３を参照）。結果を以下の表Ａ～Ｃに示す：
【0099】
これらのデータは、表ＤのｓｉＲＮＡの配列が最も強力な配列であることを示唆している。
【0100】
試験のために提供されたｓｉＲＮＡのアイデンティティー、遺伝子上のその位置、及びそのＧＣ含量を以下の表Ｅに示す：
【0101】
配列３、４、１４、及び１８は、生ウイルスを使用した一次スクリーニングで最良の活性を有していた。これらの試験から得られたデータを以下に示す。
【0102】
解析は、全細胞の感染％（左の列）、非サイレンシング対照に見られる平均感染率に基づく阻害％（右側の次の列）として、ついで次の複製並びに複製の平均についても同様に示されている。感染％は、（特異的抗体を使用して染色された、ウイルスＮタンパク質を発現する）感染細胞の数を、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２色素で染色された細胞核としてカウントされた細胞の総数で割って計算される。５０％の閾値を設定した（非サイレンシング対照のおよそ３標準偏差）。ＣＯＶ３又はＣＯＶ４で見られた＞７０％の阻害率は堅牢であり、開発の有望性を示している。
【0103】
次の試験ラウンドで試験したｓｉＲＮＡ（濃度曲線）を以下に示す；主なヒットを太字と下線で示す
【0104】
ｓｉＲＮＡを、ウイルスの阻害について様々な濃度で個別に試験した。
図２２Ａ及び２２Ｂに示すようにデータをプロットした。
核の喪失は、細胞内のｓｉＲＮＡによる毒性を示していたため、これらのｓｉＲＮＡは、更なる試験のための優先度を下げた。
図２２Ａ及び２２Ｂに示すようにデータをプロットした。
核の喪失は、細胞内のｓｉＲＮＡによる毒性を示していたため、これらのｓｉＲＮＡは、更なる試験のための優先度を下げた。
【0105】
試験したｓｉＲＮＡのうち、殆どが以前の評価と一貫したパフォーマンスを示した。全てのｓｉＲＮＡに対して、ｓｉＲＮＡの性能がｓｉＲＮＡ使用量との関係を示さないｓｉＲＮＡとフラットであったため、ＥＣ５０値を計算することはできなかった。感染の一般的な阻害に基づいてｓｉＲＮＡをランク付けすると、ＣＯＶ６、ＣＯＶ９及びＳＣ０８が最も弱く、ＮＳ対照と比較して約５０％の阻害効果を示した。ＣＯＶ５、ＣＯＶ１３、ＣＯＶ１９は次に最も強力で、対照感染レベルの＞７０％を遮断した。
【0106】
残りのｓｉＲＮＡは、試験した最低濃度（３ｎＭ）で感染の完全な遮断を示した。これらは、ＣＯＶ３、ＣＯＶ４、ＣＯＶ１４、ＣＯＶ１５、ＣＯＶ１７、ＣＯＶ１８、ＣＯＶ２１、ＣＯＶ２３、ＣＯＶ２４、ＳＣ０１、ＳＣ０２、ＳＣ０３４、ＳＣ０３６であった。
【0107】
一部のｓｉＲＮＡ処置では、ウェルから核が有意に失われた。これはおそらく、ウイルスが細胞を殺していたこと（細胞変性効果）、又はウイルス感染と組み合わされた場合にｓｉＲＮＡが毒性であったことを示している。非特異的な対照ｓｉＲＮＡ処置では、細胞の喪失が見られたが、二セットの対照から少なくとも一つの複製セットが対照として使用できた。これがデータに与える影響は、処置の効力を過小評価することであろう。２以上の複製で細胞喪失を引き起こした処置は、プレートセット２ｓｉＲＮＡの第二のグラフの等級付けによって示される。セット１のデータでは核の喪失が見られたが、３つの複製のうち少なくとも２つが未処置の対照核数の＞５０％を有していたため、データは精確であると予想される。感染しているが未処置の対照は、ウイルスを受け入れなかった細胞と比較して細胞数の４０％の低下を示したが、これはウイルスが細胞増殖を阻害するためであると予想され、これは、このアッセイでは１細胞分裂であり、細胞数の変化を説明する。
【0108】
次の一連の実験において、４種の最も強力なｓｉＲＮＡの用量効果を調べて、最も強力な配列を決定した。我々は、ｓｉＲＮＡ＃３、４、１４及び１８を評価のために選択した。
【0109】
ウイルスに対する効力を決定するために用量応答アッセイにおいて各ｓｉＲＮＡを評価した。データを図２３に示す。
実験結果から、Ｃｏｖ３及びＣｏｖ４配列並びにＣｏｖ１８配列が、０．１２３ｎＭを超える濃度でウイルスを１００％阻害するように見える。
実験結果から、Ｃｏｖ３及びＣｏｖ４配列並びにＣｏｖ１８配列が、０．１２３ｎＭを超える濃度でウイルスを１００％阻害するように見える。
【0110】
Ｃｏｖ＃３とＣｏｖ＃４はＯＲＦ１ａｂセグメントに対するものであり、Ｃｏｖ＃１８はＮタンパク質に対するものであったので、我々は、異なるセグメントに対する２種のｓｉＲＮＡを組み合わせることが有効性に影響するかどうかを決定するために、＃３と＃１８の組み合わせ並びに＃４と＃１８の組み合わせを比較することを決定した。図２４は、ウイルスの阻害に関するＣｏｖ＃４とＣｏｖ＃１８の比較を示している。
Ｃｏｖ＃４の濃度は０．０４１ｎＭと０．００５ｎＭの間で変化させ、Ｃｏｖ＃１８はＣｏｖ＃４と組み合わせて２通りの濃度（０．０４１ｎＭ及び０．０１３ｎｍ）で試験した。
２種ｓｉＲＮＡを０．０４１ｎＭのＣｏｖ＃４及び０．０４１ｎＭのＣｏｖ＃１８で組み合わせた場合、最大阻害が観察された。これらの濃度での組み合わせの最大阻害は５５％であった。
Ｃｏｖ＃４の濃度は０．０４１ｎＭと０．００５ｎＭの間で変化させ、Ｃｏｖ＃１８はＣｏｖ＃４と組み合わせて２通りの濃度（０．０４１ｎＭ及び０．０１３ｎｍ）で試験した。
２種ｓｉＲＮＡを０．０４１ｎＭのＣｏｖ＃４及び０．０４１ｎＭのＣｏｖ＃１８で組み合わせた場合、最大阻害が観察された。これらの濃度での組み合わせの最大阻害は５５％であった。
【0111】
図２５に示すように、我々はまた同様の条件下でＣｏｖ＃３とＣｏｖ＃１８の組み合わせを比較した。
Ｃｏｖ＃３の濃度は０．０４１ｎＭと０．００５ｎＭの間で変化させ、Ｃｏｖ＃１８は、Ｃｏｖ＃３と組み合わせて２通りの濃度（０．０４１ｎＭ及び０．０１３ｎｍ）で試験した。
２種ｓｉＲＮＡを０．０４１ｎＭのＣｏｖ＃３及び０．０４１ｎＭのＣｏｖ＃１８で組み合わせた場合、最大阻害が観察された。これらの濃度での組み合わせの最大阻害は７５％であった。この濃度でのＣｏｖ３単独では、約４８％の阻害しか得られなかった－これは、２種のｓｉＲＮＡを組み合わせた場合のある程度の相加性を示唆している。
Ｃｏｖ＃３の濃度は０．０４１ｎＭと０．００５ｎＭの間で変化させ、Ｃｏｖ＃１８は、Ｃｏｖ＃３と組み合わせて２通りの濃度（０．０４１ｎＭ及び０．０１３ｎｍ）で試験した。
２種ｓｉＲＮＡを０．０４１ｎＭのＣｏｖ＃３及び０．０４１ｎＭのＣｏｖ＃１８で組み合わせた場合、最大阻害が観察された。これらの濃度での組み合わせの最大阻害は７５％であった。この濃度でのＣｏｖ３単独では、約４８％の阻害しか得られなかった－これは、２種のｓｉＲＮＡを組み合わせた場合のある程度の相加性を示唆している。
【0112】
Ｃｏｖ＃３とＣｏｖ＃１８を組み合わせることで、ウイルスが、ｓｉＲＮＡ配列によって特異的に標的とされるＯＲＦ１ａｂセグメントとＮタンパク質セグメントの両方の領域で変異しない限り、ウイルスが治療圧力を逃れる能力を回避できるという利点が得られる。
ＣｏＶ３：ＧＧＡＡＧＧＡＡＧＴＴＣＴＧＴＴＧＡＡ
ＣｏＶ１８：ＣＣＡＣＣＡＡＣＡＧＡＧＣＣＴＡＡＡＡ
ＣｏＶ３とＣｏＶ１８の２５量体型をまた調製し、使用することができる：
ＣｏＶ３ ２５量体：ＧＧＡＡＧＧＡＡＧＴＴＣＴＧＴＴＧＡＡＴＴＡＡＡＡ
ＣｏＶ１８ ２５量体：ＣＣＡＣＣＡＡＣＡＧＡＧＣＣＴＡＡＡＡＡＧＧＡＣＡ
２種ｓｉＲＮＡは、両方が同じ細胞に同時に確実に送達されるように、ナノ粒子製剤を使用して送達できる。
ＣｏＶ３：ＧＧＡＡＧＧＡＡＧＴＴＣＴＧＴＴＧＡＡ
ＣｏＶ１８：ＣＣＡＣＣＡＡＣＡＧＡＧＣＣＴＡＡＡＡ
ＣｏＶ３とＣｏＶ１８の２５量体型をまた調製し、使用することができる：
ＣｏＶ３ ２５量体：ＧＧＡＡＧＧＡＡＧＴＴＣＴＧＴＴＧＡＡＴＴＡＡＡＡ
ＣｏＶ１８ ２５量体：ＣＣＡＣＣＡＡＣＡＧＡＧＣＣＴＡＡＡＡＡＧＧＡＣＡ
２種ｓｉＲＮＡは、両方が同じ細胞に同時に確実に送達されるように、ナノ粒子製剤を使用して送達できる。
【0113】
ＮＲＰ１（ニューロピリン受容体）は、肺の内皮細胞へのＳＡＲＳ－ＣＯＶ２の取り込みを助けると仮定されている（Ｃａｎｔｕｔｉ－Ｃａｓｔｅｌｖｅｔｒｉ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａｂｄ２９８５（２０２０））。特定の配向のヒスチジン部分及びリジン部分からなるポリペプチドナノ粒子の選択された製剤が、ＮＲＰ１受容体を介した結合を提供できることが以前に示されている。Ｌｅｎｇ及びＭｉｘｓｏｎ，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ；１８：１３４－１４４（２０１６）。これにより、ペプチドナノ粒子を介したｓｉＲＮＡの、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２を取り込む同じ細胞への送達が可能になる。ｓｉＲＮＡは、ウイルスの生存に必要とされる遺伝子をサイレンシングするため、ウイルス力価を低下させる。
【0114】
ＣｏＶ３とＣｏｖ１８；ＣｏＶ３とＣｏＶ１４；ＣｏＶ４とＣｏＶ１４；及びＣｏＶ４とＣｏＶ１８の組み合わせなど、二種以上のｓｉＲＮＡを含むポリペプチドナノ粒子の送達は、腹腔内投与、ＩＶ投与、又は肺への物質の直接吸入によって達成されうる。適切な所与の粒径のナノ粒子を、Ｈ２Ｋを単独で、又はＨ３Ｋと組み合わせて、上記のｓｉＲＮＡの組み合わせと一緒に使用して調製することができる。Ｈ２Ｋ及びＨ３Ｋ４ｂ（ＨＫＰ）の様々な組み合わせの製剤は、例えば、３：１のＨＫ：ｓｉＲＮＡ比を使用して調製されうる。以前の実験では、Ｈ２Ｋ単独でｓｉＲＮＡと混合すると、粒径約１２４ｎｍのナノ粒子を形成できることが示された。Ｈ２Ｋ：ＨＫＰの比が１：１を超えるナノ粒子もまたｓｉＲＮＡで形成される。最適な粒径（＜２００ｎｍ）は、１：２及び１：５の比率で観察される。ＨＫＰ単独では１２１ｎｍのナノ粒子を形成する。
【0115】
加えて、ナノ粒子の形成を、（Ｃ末端にシステインを含む）Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）－Ｃなどの追加の線形ペプチドを使用するか、或いは分岐したＨＫＰ（ＨＫＰ（＋Ｈ））を使用して試験した。１：０．２のＨ２Ｋ：Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）－Ｃの比率では、１６１ｎｍのナノ粒子が得られた。１：０．２の比のＨ２Ｋ：ＨＫＰ（＋Ｈ）では１４６ｎｍのナノ粒子が得られ、ＨＫＰ（＋Ｈ）単独では１２９ｎｍの粒子が得られ、ＨＫＰ単独では１２１ｎｍが得られた。これらの結果は、Ｈ２Ｋを単独で、又はこれらの他のペプチド配列と組み合わせて使用すると、様々な度合いのＮＲＰ１ターゲティングを示すナノ粒子が作製されることを示している。高度のＨ２Ｋを含むナノ粒子は、より少ない量のものよりもＮＲＰ１への改善された結合性を示す場合がある。
【図1】
【図2】
【図3】
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【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19-1】
【図19-2】
【図20-1】
【図20-2】
【図21-1】
【図21-2】
【図21-3】
【図21-4】
【図21-5】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【配列表】
【国際調査報告】