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特表2023-513563様々な植物に抵抗性を誘導するバシラスサチリスＪＣＫ－１３９８菌株、これを用いたマツ材線虫病防除用組成物及び防除方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-31
(54)【発明の名称】様々な植物に抵抗性を誘導するバシラスサチリスＪＣＫ－１３９８菌株、これを用いたマツ材線虫病防除用組成物及び防除方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/20 20060101AFI20230324BHJP
A01P 21/00 20060101ALI20230324BHJP
A01N 63/22 20200101ALI20230324BHJP
A01N 43/653 20060101ALI20230324BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20230324BHJP
C12N 15/61 20060101ALI20230324BHJP
【ＦＩ】
C12N1/20 A
A01P21/00 ZNA
A01N63/22
A01N43/653 C
C12N1/20 E
C12N15/31
C12N15/61
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022548597
(86)(22)【出願日】2020-12-10
(85)【翻訳文提出日】2022-10-05
(86)【国際出願番号】 KR2020018113
(87)【国際公開番号】W WO2021162226
(87)【国際公開日】2021-08-19
(31)【優先権主張番号】10-2020-0017232
(32)【優先日】2020-02-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】308026861
【氏名又は名称】インダストリー ファウンデーション オブ チョンナム ナショナル ユニバーシティー
(71)【出願人】
【識別番号】519183896
【氏名又は名称】ナショナル インスティテュート オブ フォレスト サイエンス
【氏名又は名称原語表記】ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＦＯＲＥＳＴ ＳＣＩＥＮＣＥ
【住所又は居所原語表記】５７， Ｈｏｅｇｉｒｏ， Ｄｏｎｇｄａｅｍｕｎ－ｇｕ， Ｓｅｏｕｌ ０２４５５ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(71)【出願人】
【識別番号】513281404
【氏名又は名称】プサン ナショナル ユニバーシティ インダストリー－ユニバーシティ コーポレーション ファウンデーション
(74)【代理人】
【識別番号】100107766
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠重
(74)【代理人】
【識別番号】100107515
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100070150
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠彦
(72)【発明者】
【氏名】キム，ジン－チョル
(72)【発明者】
【氏名】パク，エ ラン
(72)【発明者】
【氏名】チョン，ヒ ウォン
(72)【発明者】
【氏名】スン，ミン ジョン
(72)【発明者】
【氏名】ジョン，セ－イン
(72)【発明者】
【氏名】ソ，ヨン－ス
(72)【発明者】
【氏名】キム，ナム ギュ
(72)【発明者】
【氏名】キム，ジュン ホン
(72)【発明者】
【氏名】リ，サン－ヒョン
【テーマコード（参考）】
4B065
4H011
【Ｆターム（参考）】
4B065AA19X
4B065AC20
4B065CA47
4H011AB03
4H011BA06
4H011BB09
4H011BB21
(57)【要約】
【課題】 松及び様々な植物に誘導抵抗性活性を有するバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株（受託番号ＫＣＴＣ １４０８４ＢＰ）及びこれを有効成分として含む殺虫剤又は抗菌剤組成物、植物病又は害虫防除用組成物及びこれを用いた防除方法を提供する。
【解決手段】本発明のバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株は、奇主に抵抗性を誘導することによって、様々な植物病原因害虫、線虫及び菌に対する防除活性を有することを実験的に確認した。したがって、本発明のバシラスサチリスＪＣＫ－１３９８菌株は、関連植物病防除用途に有用に用いることができ、葉面散布による広範囲地域散布が可能なので、低コストでマツ材線虫病の拡散を防止できることが期待される。
【選択図】 図７Ｃ
【解決手段】本発明のバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株は、奇主に抵抗性を誘導することによって、様々な植物病原因害虫、線虫及び菌に対する防除活性を有することを実験的に確認した。したがって、本発明のバシラスサチリスＪＣＫ－１３９８菌株は、関連植物病防除用途に有用に用いることができ、葉面散布による広範囲地域散布が可能なので、低コストでマツ材線虫病の拡散を防止できることが期待される。
【選択図】 図７Ｃ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
病害虫に対する植物の誘導抵抗性（ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を活性化する受託番号ＫＣＴＣ １４０８４ＢＰのバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株。
【請求項2】
前記菌株は、配列番号３３のｇｙｒＡ塩基配列を含む、請求項１に記載の菌株。
【請求項3】
前記菌株は、マツ材線虫病、唐辛子細菌性斑点病、芝ダラースポット病及びトマトサビダニからなる群から選ばれる１種以上の植物病又は害虫に対する防除効果を示す、請求項１に記載の菌株。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか一項の菌株、該菌株の培養物、該培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物及び前記菌株の培養上澄液からなる群から選ばれる１種以上を含む殺虫剤又は抗菌剤組成物。
【請求項5】
前記組成物は、マツ材線虫（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）及びトマトサビダニ（Ａｃｕｌｏｐｓ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）からなる群から選ばれる１種以上に対する殺虫活性を示す、請求項４に記載の組成物。
【請求項6】
前記組成物は、キサントモナスユーベシカトリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｅｕｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ）及びスクレロチニアホモエオカルパ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａ）からなる群から選ばれる１種以上に対する坑菌活性を示す、請求項４に記載の組成物。
【請求項7】
請求項１～３のいずれか一項の菌株、該菌株の培養物、該培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物及び前記菌株の培養上澄液からなる群から選ばれる１種以上を含む植物病又は害虫防除用組成物。
【請求項8】
前記植物病又は害虫は、マツ材線虫病、唐辛子細菌性斑点病、芝ダラースポット病及びトマトサビダニからなる群から選ばれる、請求項７に記載の組成物。
【請求項9】
前記組成物は、合成農薬との合剤用に使用される、請求項７に記載の組成物。
【請求項10】
前記合成農薬は、テブコナゾール（ｔｅｂｕｃｏｎａｚｏｌｅ）である、請求項８に記載の組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、大韓民国山林庁の支援下で課題番号ＦＥ０７０２－２０１６－０２によってなされたものであり、当該課題の研究管理専門機関は国立山林科学院、研究事業名は「用役研究事業」、研究課題名は「誘導抵抗性を用いた環境親和的マツ材線虫病防除剤開発及び検定」、主管機関はジョンナム大学校産学協力団、研究期間は２０１９．０４．１９～２０１９．１１．２９である。
【0002】
本特許出願は、２０２０年２月１２日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０－２０２０－００１７２３２号に対して優先権を主張し、当該特許出願の開示事項は本明細書に参照によって組み込まれる。
【0003】
本発明は、松及び様々な植物において抵抗性を誘導するバシラスサチリスＪＣＫ－１３９８菌株、これを用いた植物病防除用組成物及び防除方法に関する。
【背景技術】
【0004】
マツ材線虫（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）によるマツ材線虫病は、韓国内及び海外において松に深刻な被害を誘発しており、近年、気候変化による山林生態系環境の変化に伴って複雑な様相を示しながら急速に広がっている。
【0005】
マツ材線虫病の主要原因としてはマツ材線虫が知られてきており、奇主、病源体、媒介虫、環境要因間の複雑な相互作用によって松を枯死させる、防除し難い山林病害虫であり、一旦感染すると治療されず、ほぼ全ての松が枯死してしまう。
【0006】
このようなマツ材線虫病の防除のために様々な方法が提示されているが、予防方法は、樹幹注入による防除方法がほぼ唯一である。しかし、樹幹注入用に多用されているアバメクチン（ａｂａｍｅｃｔｉｎ）及びエマメクチン安息香酸塩（Ｅｍａｍｅｃｔｉｎ ｂｅｎｚｏａｔｅ）は、薬効持続期間が２年と短く、注入時期も限定的であり、日本のグリーンガードは高価であって、汎用適用に限界がある。
【0007】
また、樹幹注入は、薬剤価格の問題の他、広範囲な地域の予防に不向きであるという問題もあり、高い山岳地帯にある松林には接近し難いため、効果的な方法と言えない。その上、Ｋｕｒｏｄａ及びＫｅｎｍｏｃｈｉ（Ｐｉｎｅ Ｗｉｌｔ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，ＩＵＦＲＯ，２０１６）は、マツ材線虫病を防除するための殺線虫剤の反復した樹幹注入が却って、感染していない松を殺す原因を提供すると警告した。
【0008】
このため、土壌灌注又は葉面散布などを用いた、広範囲の地域を効果的に防除できる環境にやさしい薬剤の開発が至急な実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明者らは、松及び様々な植物において抵抗性を誘導する微生物製剤を開発しようとした。その結果、本発明の新規なバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株に、マツ材線虫病の原因線虫を含む様々な植物病源体に対する防除効果があり、この効果がこの菌株の抵抗性誘導活性に起因することを究明し、本発明を完成するに至った。
【0010】
したがって、本発明の目的は、病害虫に対する植物の誘導抵抗性（ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を活性化する受託番号ＫＣＴＣ １４０８４ＢＰのバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株を提供することである。
【0011】
本発明の他の目的は、バシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株、該菌株の培養物、該培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、前記菌株の培養上澄液及びこれらの組合せからなる群から選ばれる１種以上を有効成分として含む殺虫剤又は抗菌剤組成物を提供することである。
【0012】
本発明のさらに他の目的は、バシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株、該菌株の培養物、該培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、前記菌株の培養上澄液及びこれらの組合せからなる群から選ばれる１種以上を有効成分として含む植物病又は害虫防除用組成物を提供することである。
【0013】
本発明のさらに他の目的は、バシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株、前記菌株の培養物、該培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、前記菌株の培養上澄液及びこれらの組合せからなる群から選ばれる１種以上を用いた植物病又は害虫防除方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0014】
本発明者らは、松及び様々な植物において抵抗性を誘導する微生物製剤を開発しようとした。その結果、本発明の新規なバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株に、マツ材線虫を含む様々な植物病原因線虫及び菌に対する誘導抵抗性活性があることを究明した。
【0015】
本発明は、病害虫に対する植物の誘導抵抗性（ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を活性化する受託番号ＫＣＴＣ １４０８４ＢＰのバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株、該菌株の培養物などを有効成分として含む殺虫剤又は抗菌剤組成物、及び植物病又は害虫防除用組成物に関する。
【0016】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【0017】
本発明の一態様は、受託番号ＫＣＴＣ １４０８４ＢＰのバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株に関する。
【0018】
前記菌株は、配列番号３３のｇｙｒＡ塩基配列を含むことを特徴とする。
【0019】
前記配列番号３３の塩基配列は、公知菌株であるＣＰ０２１８９２と９９％の相同性を有し、両菌株間に１％の相違性が認められ、新規な菌株として判明された。
【0020】
前記バシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株のｇｙｒＡ（Ｇｙｒａｓｅ Ａ ｓｕｂｕｎｉｔ）塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースとＮＣＢＩデータベースのＢｌａｓｔ検索によって確認された。
【0021】
前記得られた新規な菌株をバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株と命名し、２０１９年１２月１９日付で生物資源センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に寄託し、受託番号ＫＣＴＣ １４０８４ＢＰを受け取った。
【0022】
前記バシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株は、トマト植物体から分離及び同定して得ることができ、該菌株の菌体性状は次の通りである：
【0023】
棒状の円筒形桿菌で、鞭毛があって活発に運動し、菌体の中央に円形又は卵円形の芽胞（ｓｐｏｒｅ）を形成する。通常の培養器でもよく発育し、灰白色の大きな群集を形成し、その周囲は放射状をなす。芽胞を有するので、乾燥や高温に対する抵抗力がきわめて強く、菌体は、グリコーゲンを含有するグラム陽性菌であって、多数の炭水化物を分解して酸を生成する。Ｄ－グルコース、Ｌ－アラビノース、スクロースなどの炭素源をエネルギ源として使用する。
【0024】
【0025】
前記バシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株は、誘導抵抗性（ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）活性により、病害虫防除活性を有する。
【0026】
前記バシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株は、植物病原性線虫、害虫、又は植物病原性細菌及び真菌（かび）が誘発する植物病又は害虫防除活性を有する。
【0027】
前記線虫は、マツ材線虫（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）であってよいが、これに限定されるものではない。
【0028】
前記害虫は、トマトサビダニ（Ａｃｕｌｏｐｓ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）であってよいが、これに限定されるものではない。
【0029】
前記細菌及び真菌は、キサントモナスユーベシカトリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｅｕｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ）及び／又はスクレロチニアホモエオカルパ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａ）であってよいが、これに限定されるものではない。
【0030】
前記植物病は、マツ材線虫病、唐辛子細菌性斑点病及び／又は芝ダラースポット病であってあってよいが、これに限定されるものではない。
【0031】
したがって、本発明のバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株は、奇主に抵抗性を誘導して植物病原性線虫、細菌、真菌、害虫の生長を阻害する活性によって植物病防除活性を有する。
【0032】
また、前記バシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株は、既存の誘導抵抗性物質との合剤処理時に上昇効果を誘発し、環境親和的に植物病を防除するために使用可能である。
【0033】
前記バシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株との合剤に使用する誘導抵抗性物質は、アシベンゾラル－エス－メチル（Ａｃｉｂｅｎｚｏｌａｒ－Ｓ－ｍｅｔｈｙｌ，ＡＳＭ）及び／又はサリチル酸メチル（Ｍｅｔｈｙｌ ｓａｌｉｃｙｌａｔｅ，ＭｅＳＡ）であってよいが、これに限定されるものではない。
【0034】
また、前記バシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株は、既存合成殺菌剤（合成農薬）との合剤処理時に、上昇効果を誘発して常用濃度以下の合成農薬使用時にも、常用濃度使用と類似のレベル又はそれ以上の植物病防除効果を有する。したがって、合成殺菌剤の常用濃度使用量を減らすと同時に、環境親和的に植物病を防除するために使用可能である。
【0035】
前記バシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株との合剤に使用する合成農薬は、テブコナゾール（ｔｅｂｕｃｏｎａｚｏｌｅ）、イプロジオン（ｉｐｒｏｄｉｏｎｅ）、フルジオキソニル（ｆｌｕｄｉｏｘｏｎｉｌ）、ベノミル（ｂｅｎｏｍｙｌ）及び／又はジフェノコナゾール（ｄｉｆｅｎｏｃｏｎａｚｏｌｅ）であってよいが、これに限定されるものではない。
【0036】
本発明の他の態様は、受託番号ＫＣＴＣ １４０８４ＢＰのバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株、該菌株の培養物、該培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、前記菌株の培養上澄液及びこれらの組合せからなる群から選ばれる１種以上を含む殺虫剤又は抗菌剤組成物に関する。
【0037】
したがって、本発明は、バシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株、該菌株の培養物、該培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、前記菌株の培養上澄液及びこれらの組合せからなる群から選ばれる１種以上を含む殺虫剤又は抗菌剤微生物製剤を提供することができ、該微生物製剤を処理することによって殺虫又は坑菌方法を提供することができる。
【0038】
前記微生物製剤は、通常の方法で剤形化でき、乾燥粉末又は液状肥料の形態で製造できる。具体的に、本発明に係る微生物製剤は、液状の形態で製造されてよく、そこに増量剤を添加して粉末の形態で使用してもよく、それを剤形化して顆粒化させてもよい。ただし、その剤形に特に限定されない。
【0039】
本発明において、前記微生物製剤は、菌株又はその培養物に添加剤、増量剤、栄養剤などの付加剤を添加して製造することができる。このとき、添加剤としては、ポリカルボキシレート、リグノスルホン酸ナトリウム、リグノスルホン酸カルシウム、ジアルキルスルホコハク酸ナトリウム、アルキルアリールスルホン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、トリポリリン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルアリールリン酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンアルキルアリールポリマー、ポリオキシアルキルオンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ナフタレンホルムアルデヒドスルホン酸ナトリウム、トリトン１００及びツイン８０からなる群から選ばれる１つ以上を使用することができ、増量剤及び栄養剤としては、スキムミルク（培地）、黄な粉、コメ、小麦、黄土、珪藻土、ベントナイト（ｂｅｎｔｏｎｉｔｅ）、デキストリン、ブドウ糖及び澱粉からなる群から選ばれる１つ又は２つ以上を使用し、崩解剤としては、ベントナイト（ｂｅｎｔｏｎｉｔｅ）、タルク（ｔａｌｃ）、ダイヤライト（ｄｉａｌｉｔｅ）、カオリン（ｋａｏｌｉｎ）及び炭酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）からなる群から選ばれる１つ以上を使用することができる。
【0040】
また、本発明は、前記微生物製剤を土壌又は植物に処理することによって植物体に抵抗性を誘導させる方法を提供する。このとき、処理方法としては、一般に行っている方法、すなわち、散布（例えば、噴霧、ミスティング、アトマイジング、粉末散布、顆粒散布、水面施用、常施用など）、土壌施用（例えば、混入、灌注など）、表面施用（例えば、塗布、塗抹法、被服など）、浸漬、毒餌、燻煙試用などによって行うことができる。その使用量は、その剤形、被害状況、適用方法、適用場所などによって適切に決定できる。
【0041】
本発明において、前記方法によって処理される製剤に含まれている微生物の有効量は、耕作地面積（ｍ２）につき１～１×１０１００の微生物数で含まれてよい。また、前記方法のうち、散布によって処理される製剤に含まれている微生物の有効量は、ｍｌにつき１～１×１０１００の微生物濃度で含まれてよく、浸漬によって処理される組成物に含まれている微生物の有効量は、ｍｌにつき１～１×１０１００の微生物濃度で含まれてよい。
【0042】
本発明のさらに他の態様は、受託番号ＫＣＴＣ １４０８４ＢＰのバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株、該菌株の培養物、該培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、前記菌株の培養上澄液及びこれらの組合せからなる群から選ばれる１種以上を含む植物病又は害虫防除用組成物に関する。
【0043】
本発明の前記各組成物は、有効成分である前記菌株、その培養物、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物及び／又は前記菌株の培養上澄液の他に菌体を含む培養物、菌体の抽出物、それらの濃縮液、濃縮物、乾燥物、さらには必要によって希釈液、希釈物などを含むことができ、培養液、培養物を処理して得られるあらゆる状態のものを含むことができる。
【0044】
前記菌株の培養法、抽出法、分離法、濃縮法、乾燥法、希釈法などは、特に限定されない。
【0045】
前記菌株を培養するための培地としては、一般に、脱脂乳、ホエー、カゼインなどの牛乳タンパク質、糖類、酵母エキスなどを含んでおり、培養方法としては、一般の各種好気的又は嫌気的な方法を適当に用いることができる。
【0046】
前記菌株を培養した後には、必要によって培養物又はその上澄液を濃縮、乾燥、希釈することもできる。
【0047】
また、遠心分離法又は膜分離法を用いて培養物の上澄液と菌体を分離し、菌体を濃縮した状態で回収することもできる。また、菌体に超音波処理又は酵素処理などを行って菌体内の成分を抽出するか、培養物又はその上澄液、菌体又はその抽出物などを乾燥させることもできる。これらは、本発明の前記組成物の有効成分として使用することができる。
【0048】
前記菌株及びそれを含む各組成物の重複する内容は、本明細書の複雑性を考慮して省略する。
【発明の効果】
【0049】
本発明は、松及び様々な植物に誘導抵抗性活性を有するバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株（受託番号ＫＣＴＣ １４０８４ＢＰ）及びこれを有効成分として含む殺虫剤又は抗菌剤組成物、植物病又は害虫防除用組成物及びこれを用いた防除方法に関し、本発明のバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株が奇主に抵抗性を誘導することによって様々な植物病原因害虫、線虫及び菌に対する防除活性を有することを実験的に確認した。したがって、本発明のバシラスサチリスＪＣＫ－１３９８菌株は、関連植物病防除用途に有用に使用可能であり、葉面散布による広範囲地域散布が可能なので、低コストでマツ材線虫病の拡散を防止できることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【0050】
【図1】本発明の一実施例に係るバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株による誘導抵抗性関連遺伝子の発現を確認した図である。
【図2】本発明の一実施例に係るバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株のｇｙｒＡ塩基配列の系統図分析結果を示す図である。
【図3A】本発明の一実施例に係るバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株のマツ材線虫病防除効果を確認したものであり、赤松の幼苗に対するＪＣＫ－１３９８菌株培養液の幼苗検定結果を病進展曲線で示す。
【図3B】本発明の一実施例に係るバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株のマツ材線虫病防除効果を確認したものであり、ＪＣＫ－１３９８菌株培養液（ａ）、無処理区（ｂ）及び無接種区（ｃ）処理された赤松の幼苗を示す。
【図4A】本発明の一実施例に係るバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株のマツ材線虫病防除効果を確認したものであり、ＪＣＫ－１３９８菌株のＯ．Ｄ６００＝０．８での培養液、培養濾液及び細胞分画のマツ材線虫病防除効果を示す。
【図4B】本発明の一実施例に係るバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株のマツ材線虫病防除効果を確認したものであり、ＪＣＫ－１３９８菌株培養液（ａ）、ＪＣＫ－１３９８菌株培養濾液（ｂ）、ＪＣＫ－１３９８菌株細胞分画（ｃ）、無処理区（ｄ）及び無接種区（ｅ）処理された赤松の幼苗を示す。
【図5A】本発明の一実施例によってバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株培養液の処理時期によるマツ材線虫病防除効果を確認したものであり、赤松の幼苗に対するＪＣＫ－１３９８菌株培養液の幼苗検定結果を病進展曲線で示す。
【図5B】本発明の一実施例によってバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株培養液の処理時期によるマツ材線虫病防除効果を確認したものであり、マツ材線虫接種６０日後のＪＣＫ－１３９８菌株培養液防除効果を示す。
【図5C】本発明の一実施例によってバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株培養液の処理時期によるマツ材線虫病防除効果を確認したものであり、マツ材線虫接種２週前－１週前処理（ａ）、３週前－１週前処理（ｂ）、4週前－１週前処理（ｃ）、無処理区（ｄ）及び無接種区（ｅ）処理された赤松の幼苗を示す。
【図6】本発明の一実施例によってバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株培養液の処理濃度によるマツ材線虫病防除効果を確認した図である。
【図7A】本発明の一実施例に係るバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株のマツ材線虫病防除効果を確認したものであり、赤松の成木に対するＪＣＫ－１３９８菌株培養液の幼苗検定結果を病進展曲線で示す。
【図7B】本発明の一実施例に係るバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株のマツ材線虫病防除効果を確認したものであり、１～２次圃場試験を用いたバシラスサチリスＪＣＫ－１３９８菌株の防除効果を示す。
【図7C】本発明の一実施例に係るバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株のマツ材線虫病防除効果を確認したものであり、ＪＣＫ－１３９８菌株噴霧乾燥粉末５０倍希釈液（ａ）、エマメクチン安息香酸塩（ｂ）及び無接種区（ｃ）処理された赤松の成木を示す。
【図8】本発明の一実施例に係るバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８ ２０％ＳＣ製剤と誘導抵抗性物質であるＡＳＭ及びＭｅＳＡとの合剤のマツ材線虫病防除効果を確認した図である。
【図9】本発明の一実施例に係るバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８ ２０％ＳＣ製剤とＪＣＫ－１３９８ １０％ＳＣ製剤の様々な濃度でのマツ材線虫病防除効果を確認した図である。
【図10A】本発明の一実施例に係るバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８ １０％ＳＣ製剤の３０年生成木に対するマツ材線虫病防除効果を確認したものであり、無人ヘリコプターを用いた実用化評価結果を病進展曲線で示す。
【図10B】本発明の一実施例に係るバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８ １０％ＳＣ製剤の３０年生成木に対するマツ材線虫病防除効果を確認したものであり、材線虫接種６月後の発病率を示す。
【図11】本発明の一実施例に係るバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株培養液の唐辛子細菌性斑点病防除効果を確認した図である。
【図12】本発明の一実施例に係るバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株培養液の芝ダラースポット病防除効果を確認した図である。
【図13】本発明の一実施例に係るバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株２０％ＳＣ製剤のトマトサビダニ防除効果を確認した図である。
【発明を実施するための形態】
【0051】
病害虫に対する植物の誘導抵抗性（ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を活性化する受託番号ＫＣＴＣ １４０８４ＢＰのバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＫ－１３９８菌株に関する。
【実施例】
【0052】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
【0053】
実施例１．誘導抵抗性を誘導する菌株の選抜
【0054】
マツ材線虫病に対して誘導抵抗性を誘導する菌株を見出すために、様々な植物から５００余個の植物由来微生物菌株を分離した。ＰＲ－１プロモーターにＧＵＳが標識されたベクターが形質転換されたシロイヌナズナを用いて分離した５００余個の植物由来微生物菌株から誘導抵抗性を誘導する菌株（２５個菌株）を選抜し、その結果を下記の表１に示した。
【0055】
【表1】
【0056】
実施例２．松カルス（ｃａｌｌｕｓ）を用いたインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）誘導抵抗性検定
【0057】
上記の実施例１で選抜した２５個菌株に対して、赤松の松カルスの誘導抵抗性関連遺伝子の発現を確認した。
【0058】
具体的に、１２ウェルマイクロプレートで５００ｕｌのＬＭ培地を用いて松誘導抵抗性菌株を６００ｎｍの吸光度（ＯＤ６００）で０．８になるまで培養させた後、培養液５００ｕｌを１００ｍｇの赤松の松カルス表面に処理し、暗条件の２５℃、５０ｒｐｍ振盪培養器で２４時間カルス表面と松誘導抵抗性菌株培養液とを十分に反応させた。その後、遠心分離機を用いて６００ｘｇ、５～１０分間遠心分離し、反応の完了したカルスを分離した。分離されたカルスからＲＮＡを抽出した後にｃＤＮＡを合成し、また、ＲＴ－ＰＣＲ又はｑＲＴ－ＰＣＲを用いて特異的に増加する誘導抵抗性遺伝子の発現を確認し、その結果を図１及び表２に示した。ｑＲＴ－ＰＣＲに使用した誘導抵抗性関連遺伝子は、下記表３に示した。
【0059】
【表2】
【0060】
【表3】
【0061】
図１及び表２から確認できるように、選抜した２５個菌株のうち、本発明のバシラスサチリスＪＣＫ－１３９８菌株がＰＲ－１ｂ ｆａｍｉｌｙ、ＰＲ－３ ｆａｍｉｌｙ ｃｌａｓｓ ４、ＰＲ－４ ｆａｍｉｌｙ、ＰＲ－５ ｆａｍｉｌｙ、ＰＲ－９ ｆａｍｉｌｙ、ＰＲ－１０ ｆａｍｉｌｙ、抗微生物ペプチド（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）及びメタロチオネイン様タンパク質（Ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）などのタンパク質を作る遺伝子を特異的に増加させることを確認した。
【0062】
実施例３．分子生物学的同定及び系統学的分類
【0063】
バシラスサチリスＪＣＫ－１３９８菌株をＴＳＡ（Ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ａｇａｒ，Ｄｉｆｃｏ）固体培地にストリーキングした後、３０℃で１日間静置培養した。得られた単一コロニーを、滅菌したループを用いてＴＳＢ（Ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ，Ｄｉｆｃｏ）液体培地に接種した後、３０℃で１日間１５０ｒｐｍで振盪培養した。その後、ＥＬＰＩＳ－ＢｉｏｔｅｃｈのＤＯＫＤＯ－プレップバクテリアゲノムＤＮＡ精製キットを用いて、プロトコルにしたがって菌株のｇＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）を抽出した。抽出されたｇＤＮＡとイントロンバイオテクノロジー（ｉＮｔＲＯＮ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のＰＣＲ－プレミックス（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ－ｐｒｅｍｉｘ）及びｇｙｒＡ（Ｇｙｒａｓｅ Ａ ｓｕｂｕｎｉｔ）遺伝子を増幅し得るプライマーセットを混合した後、ＰＣＲを用いて前記ＪＣＫ－１３９８菌株のｇｙｒＡ遺伝子を増幅した。ＰＣＲに用いられたプライマーセットは、次の表４に示す。
【0064】
【表4】
【0065】
ＰＣＲは、９５℃で５分から始まって、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒を３０回反復した後、７２℃で７分、１２℃で増幅を終えた。増幅されたＰＣＲ産物に対する塩基配列分析は、ゼノテック（デジュン、大韓民国）に依頼し、ＪＣＫ－１３９８菌株のｇｙｒＡ（配列番号３３）遺伝子の塩基配列を得た。得られたｇｙｒＡ遺伝子の塩基配列をＮＣＢＩのｎＢｌａｓｔ検索を用いてＧｅｎＢａｎｋデータベースの塩基配列と比較した。また、ＧｅｎＢａｎｋデータベースから類似性の高いｇｙｒＡ遺伝子塩基配列を確保し、ＢｉｏＥｄｉｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｅｄｉｔｏｒを用いてＪＣＫ－１３９８菌株のｇｙｒＡ遺伝子塩基配列と全ての塩基配列を整列し、メガプログラムバージョン６．０を用いてブートストラップトライアルセット（ｂｏｏｔ－ｓｔｒａｐ ｔｒｉａｌｓ ｓｅｔ）１，０００条件でＮＪ（ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ）アルゴリズムに基づいて系統学的に分析し、その結果を図２に示した。
【0066】
【表5】
【0067】
図２から確認できるように、ＪＣＫ－１３９８菌株は、バシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株と同定された。
【0068】
実施例４．マツ材線虫病防除効果確認
【0069】
バシラスサチリスＪＣＫ－１３９８菌株培養液のマツ材線虫病に対する防除効果を確認するために、赤松（Ｐｉｎｕｓ ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａ）３～４年生幼苗（直径５．５ｍｍ前後、身長が土壌から約３５～４５ｃｍ）を用いて幼苗検定を行った。
【0070】
４－１．ＪＣＫ－１３９８菌株培養液の製造
【0071】
２０％のグリセロール溶液に懸濁して－８０℃の超低温冷凍庫（ｄｅｅｐ ｆｒｅｅｚｅｒ）に貯蔵されていたＪＣＫ－１３９８菌株を、ＴＳＡで３０℃、約２４時間静置培養した。その後、試験管にＴＳＢを入れ、入口を綿栓で塞いで滅菌した後、培養されたＪＣＫ－１３９８菌株の１つのコロニーを白金耳でかいてＴＳＢに接種した後、３０℃、１５０ｒｐｍで約２４時間好気条件でさらに振盪培養した。滅菌した５０ｍｌのＴＳＢが含まれた２５０ｍｌ三角フラスコに、ＵＶスペクトルフォトメーター６００ｎｍで光学密度（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）の値が１．０になるようにＪＣＫ－１３９８菌株培養液を入れ、懸濁液を製造した。その後、３０℃、１５０ｒｐｍで約２４時間好気条件で振盪培養した。
【0072】
４－２．ＪＣＫ－１３９８菌株培養液の散布
【0073】
まず、ＪＣＫ－１３９８菌株培養液が葉に吸着しやすくなるように、２５０ｕｇ／ｍｌツイン２０を松当たりに５ｍｌずつ十分に前処理した後、２時間乾燥させた。その後、前記実験例4－１で培養されたＪＣＫ－１３９８菌株培養液を、２５０ｕｇ／ｍｌツイン２０含有の水溶液に、光学密度の値が０．８レベルになるように溶解させた後、微細噴射器に入れ、松当たりに５ｍｌずつ葉面散布した。
【0074】
４－３．マツ材線虫（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）の培養
【0075】
ＰＤＡ（Ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ａｇａｒ，Ｄｉｆｃｏ）培地に、マツ材線虫が餌とするボトリティスシネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）を接種し、２５℃培養器で７日間静置培養した。培養されたボトリティスシネレア上にマツ材線虫（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ，国立山林科学院）を接種した後、２５℃培養器で７日間静置培養した。培養されたマツ材線虫は、漏斗法（Ｂａｅｒｍａｎｎ ｆｕｎｎｅｌ ｍｅｔｈｏｄ）を用いて収穫した後、光学顕微鏡下で数を調べて２０，０００匹／ｍｌレベルに調整した。
【0076】
４－４．マツ材線虫病防除効果確認
【0077】
実験例4－２のＪＣＫ－１３９８菌株培養液が葉面散布で前処理された松の木質部１ｃｍ程度を、滅菌した刃で内皮深層部位まで切開した後、滅菌した脱脂綿を横０．５ｃｍ、縦１ｃｍにして切開部位に挿入し、分離したマツ材線虫を１００ｕｌずつ２，０００匹接種（ＪＣＫ－１３９８菌株培養液などの薬剤処理１週後に接種）し、接種された部位はパラフィルムで密封して乾燥しないようにした（樹皮剥皮接種法）。マツ材線虫接種４５日後に枯れ程度を観察し、その結果を、図３Ａ、図３Ｂ及び表６に示した。
【0078】
【表6】
【0079】
【0080】
実施例５．インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）殺線虫活性評価
【0081】
５－１．ＪＣＫ－１３９８菌株培養濾液及び防除対象線虫の確保
【0082】
実施例４－１と同じ方法でＪＣＫ－１３９８菌株を培養した後、遠心分離機を用いて１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して培養濾液を収穫し、培養濾液を滅菌されたマイクロシリンジフィルター０．２ｕｍを用いて除菌した。
【0083】
サツマイモネコブ線虫（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）は、クァンジュ広域市ジョンナム大学校親環境農業センターの温室で人為的にサツマイモネコブ線虫に感染したトマト根から卵を獲得し、漏斗法を用いて卵から孵化した幼虫（２齢幼虫）を分離して実験に使用した。マツ材線虫は、実施例４－３と同じ方法で収穫した。
【0084】
５－２．ＪＣＫ－１３９８菌株培養濾液及び線虫の確保
【0085】
実施例５－１で確保した各線虫の懸濁液を、９６ウェルマイクロプレートの各ウェルにそれぞれ入れた後、ＪＣＫ－１３９８菌株培養濾液を０．６２５～２０％濃度になるように処理し、ウェルの最終体積が１００ｕｌになるようにした。試料処理後に、９６ウェルプレートを３０秒間撹拌し、相対湿度１００％プラスチック容器に入れて室温保管した。試料処理７２時間後に、光学倒立顕微鏡下で下記計算式を用いて殺線虫率を確認した。全ての実験は３回反復し、その結果を下記表７に示した。
【0086】
［計算式］
【0087】
殺線虫率（％）＝［（処理区の致死率－対照群の致死率）／（１００－対照群の致死率）］×１００
【0088】
【表7】
【0089】
前記表７から確認できるように、サツマイモネコブ線虫は、２０％培養濾液処理区では９７．４５％、１０％培養濾液処理区では１３．１５％の殺線虫活性を示しており、５％以下の濃度では殺線虫活性を示していないことが分かる。
【0090】
一方、マツ材線虫は、いかなる処理区でも殺線虫活性が見られなかったが、これは、バシラスサチリスＪＣＫ－１３９８のマツ材線虫病に対する防除効果が、直接の殺線虫活性ではなく誘導抵抗性による効果であることを示唆する。
【0091】
実施例６．マツ材線虫病防除効果を奏する誘導抵抗性物質確認
【0092】
実施例５の結果に基づいて、バシラスサチリスＪＣＫ－１３９８菌株のマツ材線虫病に対する防除効果を奏する誘導抵抗性物質の存在（培養液、培養濾液及び細胞分画）を確認した。ＪＣＫ－１３９８菌株の培養は、実施例４－１と同じ方法で光学密度の値が０．８になるように調整して行った。
【0093】
ＪＣＫ－１３９８菌株の培養液を遠心分離（１，３００ｒｐｍ、１５分）して培養濾液と細胞分画とに分けた。沈殿した細胞分画は、遠心分離前に使用したのと同じ体積のリン酸塩緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）を添加して懸濁した。各試料（培養液、培養濾液及び細胞分画）が葉に吸着しやすくなるように、２５０ｕｇ／ｍｌツイン２０を松当たりに５ｍｌずつ十分に前処理した後、２時間乾燥させた。その後、培養液、培養濾液及び細胞分画を、２５０ｕｇ／ｍｌツイン２０含有の水溶液に、光学密度の値が０．８レベルになるように溶解させた後、微細噴射器に入れ、松当たりに５ｍｌずつ葉面散布した。この時、対照群として、殺線虫物質であるエマメクチン安息香酸塩（Ｅｍａｍｅｃｔｉｎ ｂｅｎｚｏａｔｅ）を１０％メタノール含有の水溶液に２０ｍｇ／ｍｌレベルに溶解させた後、樹幹注入した。その結果は、図４Ａ、図４Ｂ及び表８に示す。
【0094】
【表8】
【0095】
【0096】
このような結果は、本発明のＪＣＫ－１３９８菌株によるマツ材線虫病防除効果は、細胞外に分泌する分泌物による効果であることを示唆する。
【0097】
実施例７．マツ材線虫病防除効果を奏する最適処理時期確認
【0098】
実施例６の結果に基づいて、バシラスサチリスＪＣＫ－１３９８菌株培養液のマツ材線虫病インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）検定によって最適処理時期を確認した。インビボ検定は、赤松３～４年生幼苗（直径５．５ｍｍ前後、身長が土壌から約３５～４５ｃｍ）を用いて行った。
【0099】
実施例４－１と同じ方法でＪＣＫ－１３９８菌株を培養して光学密度値が０．８レベルになるように調整した後、培養液を松当たりに５ｍｌずつ葉面散布した。この時、培養液処理は、その時期を別々にし、マツ材線虫接種２週前と１週前、4週前と１週前、及び４週前と１週前に２回ずつ行ったし、マツ材線虫の接種は、前記実施例４－４と同じ方法で２回目の培養液処理７日後に行った。最後に、マツ材線虫接種６０日後に枯れ程度を観察し、その結果を図５Ａ～図５Ｃ、表９及び表１０に示した。
【0100】
【表9】
【0101】
【表10】
【0102】
図５Ａ～図５Ｃ、表９及び表１０から確認できるように、接種４９日までは処理時期に関係なくマツ材線虫病の発病度が類似のレベルに保たれたが、その後には処理時期によって大きく変化することが分かった（図５Ａ）。結果的に、接種２週前－１週前（５９．２％）処理時に、4週前－１週前（２０．４％）及び４週前－１週前（３８．８％）処理時に比べて優れた防除効果を示した。
【0103】
実施例８．マツ材線虫病防除効果を奏する最適処理濃度確認
【0104】
実施例７の結果に基づいて、バシラスサチリスＪＣＫ－１３９８菌株噴霧乾燥粉末のマツ材線虫病インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）検定によって最適処理濃度を確認した。同様に、インビボ検定は、赤松３～４年生幼苗を用いて行った。
【0105】
具体的に、下記表１１の方法で製造したＪＣＫ－１３９８菌株の噴霧乾燥粉末を、滅菌水を用いて５０倍、５００倍及び５，０００倍希釈液にした後、前記実施例４－２と同じ方法で松に７日間隔で２回葉面散布した。最後に、マツ材線虫は、前記実施例４－４と同じ方法で前記希釈液２次処理７日後に接種し、マツ材線虫接種５５日後に枯れ程度を観察し、その結果を図６及び表１２に示した。
【0106】
【表11】
【0107】
【表12】
【0108】
図６及び表１２から確認できるように、ＪＣＫ－１３９８菌株噴霧乾燥粉末の５０倍希釈液（８５．５％）処理時に、５００倍（６０．４７％）及び５，０００倍（６９．７７％）希釈液に比べて優れた防除効果を示した。
【0109】
実施例９．マツ材線虫病防除効果確認
【0110】
上記の結果に基づいて、バシラスサチリスＪＣＫ－１３９８菌株の成木におけるマツ材線虫病に対する防除効果を確認するために、さらに、１５年生赤松（根元直径８～１１ｃｍ、高さ６～８ｍ）を用いて圃場試験を行った。圃場試験は、２０１８年（１次圃場試験）及び２０１９年（２次圃場試験）に２回行った。１次圃場試験は、ＪＣＫ－１３９８菌株培養液の噴霧乾燥粉末を使用（実施例８と同じ方法で製造）し、２次圃場試験は、ＪＣＫ－１３９８菌株培養液の噴霧乾燥粉末をＪＣＫ－１３９８ ２０％ＳＣ（乳剤）に剤形化して使用した。ＪＣＫ－１３９８ ２０％ＳＣ製剤は、ＪＣＫ－１３９８噴霧乾燥粉末２０．０％、ＣＲ－ＮＦ １３５Ｂ ４．５％、キサンタンガム０．０３％、消泡剤０．１％、水７５．３７％の組成で剤形化した。
【0111】
ＪＣＫ－１３９８菌株培養液の噴霧乾燥粉末及びＪＣＫ－１３９８ ２０％ＳＣ製剤を、２５０ｕｇ／ｍｌツイン２０含有の水溶液にそれぞれ５０倍及び２０００倍に希釈後に噴霧器に入れ、松当たりに約１Ｌずつ葉面散布した。葉面散布は、１月間隔で２回処理した。前記２次処理１週後に、樹幹注入方法により、１次圃場試験には松当たりに２０，０００匹ずつ、２次圃場試験には１０，０００匹ずつマツ材線虫を接種した。この時、対照群としては、アファーム（エマメクチン安息香酸塩２．１５％、乳剤、シンジェンタ）を胸高直径当たりに１ｍｌずつ樹幹注入し、アファームは、マツ材線虫接種１週前に１回処理した。無処理区は、薬剤無しで２５０ｕｇ／ｍｌツイン２０のみを同一に処理した。その結果を図７Ａ～図７Ｃ、表１３及び表１４に示す。
【0112】
【表13】
【0113】
【表14】
【0114】
図７Ａ～図７Ｃ、表１３及び表１４から確認できるように、ＪＣＫ－１３９８菌株培養液噴霧乾燥粉末５０倍希釈液（ＪＣＫ－１３９８）及びＪＣＫ－１３９８ ２０％ＳＣ製剤（２０％ＳＣ製剤）は、無処理区に比してそれぞれ６５．５％及び６８．８％の防除効果を示した。２回の圃場試験から、ＪＣＫ－１３９８菌株のマツ材線虫病に対する防除効果再現性を確認した。
【0115】
実施例１０．合剤によるマツ材線虫病防除上昇効果確認
【0116】
実施例の結果に基づいて、バシラスサチリスＪＣＫ－１３９８菌株の誘導抵抗性物質であるアシベンゾラル－エス－メチル（Ａｃｉｂｅｎｚｏｌａｒ－Ｓ－ｍｅｔｈｙｌ，ＡＳＭ）及びサリチル酸メチル（Ｍｅｔｈｙｌ ｓａｌｉｃｙｌａｔｅ，ＭｅＳＡ）との合剤の成木におけるマツ材線虫病に対する防除効果を確認するために、さらに、１５年生赤松（根元直径８～１１ｃｍ、高さ６～８ｍ）を用いて圃場試験を行った。
【0117】
ＪＣＫ－１３９８ ２０％ＳＣ製剤、ＡＳＭ ５％ＳＣ製剤、ＭｅＳＡ ２０％ＥＣ－ＬＶ製剤をそれぞれ２０００倍希釈、０．１ｍＭ、０．５ｍＭで製造した。ＪＣＫ－１３９８ ２０％ＳＣ＋ＡＳＭ ５％ＳＣの合剤とＪＣＫ－１３９８ ２０％ＳＣ＋ＭｅＳＡ ２０％ＥＣ－ＬＶの合剤は、最終濃度が各単剤処理区濃度の半量が含まれるように製造した。各試料は、噴霧器に入れ、松当たりに約１Ｌずつ１月間隔で２回処理した。前記２次処理１週後に、樹幹注入方法で１０，０００匹ずつマツ材線虫を接種した。この時、対照群としては、アファーム（エマメクチン安息香酸塩２．１５％、乳剤、シンジェンタ）を胸高直径当たりに１ｍｌずつ樹幹注入したし、アファームは、マツ材線虫接種１週前に１回処理した。無処理区は、薬剤無しで２５０μｇ／ｍｌツイン２０のみを同一に処理した。その結果を図８及び表１５に示す。
【0118】
【表15】
【0119】
図８及び表１５から確認できるように、ＪＣＫ－１３９８ ２０％ＳＣ製剤、ＡＳＭ５％ ＳＣ製剤、ＭｅＳＡ ２０％ ＥＣ－ＬＶ製剤は、無処理区に比してそれぞれ２３．１％、２７．３％及び３３．９％の防除効果を示した。一方、ＪＣＫ－１３９８ ２０％ＳＣ＋ＡＳＭ ５％ＳＣの合剤とＪＣＫ－１３９８ ２０％ＳＣ＋ＭｅＳＡ ２０％ＥＣ－ＬＶの合剤は、無処理区に比してそれぞれ４６．２％と５３．８％の上昇した防除効果を示した。
【0120】
したがって、バシラスサチリスＪＣＫ－１３９８菌株は、誘導抵抗性物質であるＡＳＭ及びＭｅＳＡと共に処理された時に、シナジー効果によってマツ材線虫病をより効果的に防除できることを確認した。
【0121】
実施例１１．航空散布用製剤製造及びマツ材線虫病に対する防除効果確認
【0122】
バシラスサチリスＪＣＫ－１３９８菌株の成木に対して航空散布によるマツ材線虫病の防除効果を確認するために、新しい製剤を製造した。ＪＣＫ－１３９８ １０％ＳＣ製剤は、ＪＣＫ－１３９８噴霧乾燥粉末１０．０％、ＣＲ－ＮＦ １３５Ｂ ３．０％、キサンタンガム０．０１％、消泡剤０．１％、プロピレングリコール５．０％、ベンゾ酸ナトリウム０．２％、水８１．６９％の組成で剤形化した。
【0123】
ＪＣＫ－１３９８ １０％ＳＣ製剤とＪＣＫ－１３９８ ２０％ＳＣ製剤（既存製剤、実施例９）をそれぞれ、１０倍、１００倍及び５００倍希釈液にした後、３年生松に接種２週前と１週前に、７日間隔で松当たりに１００ｕｌ（既存処理量の５０分の１）ずつ２回葉面散布した。最後に、マツ材線虫は、前記実施例４－４と同じ方法で前記希釈液２次処理７日後に接種したし、マツ材線虫接種４０日後に枯れ程度を観察し、その結果を図９及び表１６に示した。
【0124】
【表16】
【0125】
図９及び表１６から確認できるように、ＪＣＫ－１３９８ ２０％ＳＣ製剤と比較すると、ＪＣＫ－１３９８ １０％ＳＣは１０倍希釈液（８７．９％）、１００倍希釈液（７９．３％）及び５００倍希釈液（８６．２％）のいずれの濃度においても安定した防除効果を示した。したがって、今後の航空散布のためにＪＣＫ－１３９８ １０％ＳＣを最終製剤として選抜した。
【0126】
実施例１２．航空散布用ＪＣＫ－１３９８ １０％ＳＣ製剤のマツ材線虫防除実用化評価
【0127】
上記の結果に基づいて、航空散布用ＪＣＫ－１３９８ １０％ＳＣ製剤の成木におけるマツ材線虫病に対する防除効果を確認するために、３０年生赤松を用いて圃場試験を行った。
【0128】
ＪＣＫ－１３９８ １０％ＳＣ製剤の５０倍希釈液を製造した後、無人ヘリコプターを用いてジンジュ試験林４５０Ｍ２に３．６Ｌ（８０Ｌ／１ｈａレベル）を無人航空機で航空散布した。航空散布は、マツ材線虫接種２月前、１月前及び１月後に３回処理した。前記２次処理１月後に、実施例９と同じ方法で松当たりに２０，０００匹ずつマツ材線虫を接種した。その結果を図１０Ａ、図１０Ｂ及び表１７に示す。
【0129】
【表17】
【0130】
図１０Ａ、図１０Ｂ及び表１７から確認できるように、材線虫接種６月後に、ＪＣＫ－１３９８ １０％ＳＣ製剤（２０．０％）は、無処理区（７３．３％）に比して非常に低い発病率を示した。すなわち、７２．７％の防除効果を示すことにより、ＪＣＫ－１３９８ １０％ＳＣ製剤は、圃場でも幼苗検定と同様に非常に効果的にマツ材線虫病を防除できることを確認した。
【0131】
実施例１３．様々な植物病防除効果確認
【0132】
バシラスサチリスＪＣＫ－１３９８菌株の誘導抵抗性効果に基づいて、適用拡大実験のためにＪＣＫ－１３９８菌株培養液の噴霧乾燥粉末を用いて様々な植物病に対する防除効果を確認した。
【0133】
１３－１．唐辛子細菌性斑点病（病原菌：×ａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｅｕｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ）防除効果確認
【0134】
実施例８と同じ方法でＪＣＫ－１３９８菌株の噴霧乾燥粉末をそれぞれ５００倍及び５，０００倍に希釈した溶液に界面活性剤２５０ｕｇ／ｍｌツイン２０を添加した後、８～９葉枝唐辛子（フンノン種子社、ブルタブ唐辛子）に土壌灌注及び葉面散布方法でポットにつき２０ｍｌずつ処理した。各試料はいずれも唐辛子細菌性斑点病菌株接種源接種４日前に処理した。この時、対照群としては、合成農薬殺菌剤であるソンボサイクリン水和剤（ｏｘｙｔｅｔｒａｃｙｄｉｎｅ、（株）ソンボ化学）及びイルプム水和剤（オキソリン酸２０％ ＷＰ、（株）ドンバンアグロ）をそれぞれ定量（１，０００倍希釈液）で処理したし、無処理区は、薬剤無しで２５０ｕｇ／ｍｌツイン２０のみを同一に処理した。
【0135】
その後、唐辛子細菌性斑点病菌株（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｅｕｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ）をＴＳＡで３０℃、約４８時間静置培養した後に、滅菌水２ｍｌを使用してセルを収穫した。収穫した唐辛子細菌性斑点病原菌は、ＵＶスペクトルフォトメーターを用いて６００ｎｍで光学密度の値が０．１になるように希釈し、接種源を製造した。接種源は、幼苗につき５ｍｌずつ葉面散布した。接種した幼苗は、２５±２℃の生育室で湿度９５％を３日間維持した。その後、一定灌水と葉面に水をやりながら発病度を観察し、その結果を図１１及び表１８に示した。
【0136】
全ての処理は３回反復で行い、全ての実験は２回反復した。Ａｂｂａｓｉによって発病程度を０～６の指数で測定し、唐辛子の葉に形成された唐辛子細菌性斑点病の発病度を確認した。発病程度の指数基準は次の通りである：
【0137】
０＝発病皆無、
１＝１～２個の小さな半点が１～２枚の葉で発生、
２＝複数の半点が複数の葉に発生、
３＝多い半点が凝集して葉に発生、
４＝多い半点が凝集して多くの葉に発生、
５＝深刻な発病と共に脱葉発生、
６＝植物体死ぬ。
１＝１～２個の小さな半点が１～２枚の葉で発生、
２＝複数の半点が複数の葉に発生、
３＝多い半点が凝集して葉に発生、
４＝多い半点が凝集して多くの葉に発生、
５＝深刻な発病と共に脱葉発生、
６＝植物体死ぬ。
【0138】
【表18】
【0139】
図１１及び表１８から確認できるように、バシラスサチリスＪＣＫ－１３９８の噴霧乾燥粉末５，０００倍希釈溶液を土壌灌注処理した場合に、５２．１％の防除効果を示しており、葉面散布した場合に、３１．３％の防除効果を示している。また、５００倍希釈溶液を土壌灌注処理した場合に、３７．５％の防除効果を示しており、葉面散布した場合に、２０．８％の防除効果を示している。したがって、ＪＣＫ－１３９８菌株培養液を唐辛子に処理する場合に、抵抗性を効果的に誘導し、唐辛子細菌性斑点病防除に有用であると期待される。
【0140】
１３－２．芝ダラースポット病（病原菌：Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａ）防除効果確認
【0141】
ＪＣＫ－１３９８培養液の希釈液は、実施例４－１と同じ方法でＪＣＫ－１３９８菌株を培養した後、ＵＶスペクトルフォトメーターを用いて６００ｎｍで光学密度の値が０．０８になるように希釈したものを１００倍希釈溶液として、０．００８になるように希釈したものを１，０００倍希釈溶液として使用した。ＪＣＫ－１３９８ ２０％ＳＣは、滅菌水を使用して１００倍及び１，０００倍に希釈したＪＣＫ－１３９８培養液希釈液を用いて製造した。無処理区は、ツイン２０が２５０ｕｇ／ｍｌレベルで添加された溶液を使用し、対照群としては、テブコナゾール２５％ＥＣ（ホリクア乳剤）を定量（２，０００倍希釈液）及び半量（４，０００倍希釈液）使用した。
【0142】
各試料はいずれも、芝ダラースポット病菌株接種源接種４日前に土壌灌注処理したし、ＪＣＫ－１３９８培養液は、１００倍及び１，０００倍希釈液として単剤処理するか、それぞれテブコナゾール２５％ＥＣ ４，０００倍希釈液と合剤処理し、ＪＣＫ－１３９８ ２０％ＳＣは、１００倍及び１，０００倍希釈液で単剤処理するか、それぞれテブコナゾール２５％ＥＣ ４，０００倍希釈液と合剤処理した。
【0143】
その後、芝ダラースポット病菌株（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａ）の菌叢を横×縦２×２ｍｍサイズの寒天プラグ（ａｇａｒ ｐｌｕｇ）に切り離してＰＤＡ培地に接種した後に、５日間２５℃恒温器で培養した。２回滅菌されたふすま－もみ殻培地（ふすま９ｇ、もみ殻１．５ｇ、蒸留水１０ｍｌ）に、培養された菌株の菌叢を横×縦１×１ｃｍサイズに切って５個ずつ移植した後、バイオシリストッパーのみで入口を塞ぎ、２５℃恒温器で７日間培養した。その後、培養された菌を培地と共に粉碎機に入れ、蒸留水１１０ｍｌ及び１．１ｍｌのストレプトマイシン硫酸塩（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ）２００ｕｇ／ｍｌを入れて摩砕した。
【0144】
最後に、播種して約１月間成長させたクリーピングベントグラス（ｃｒｅｅｐｉｎｇ ｂｅｎｔｇｒａｓｓ）のポット中央に１ｃｍ程度の穴をあけた後、摩砕した接種源をポットにつき３．３ｍｌずつ接種した。接種した芝は、湿度９５％、温度２５℃で、無処理区と処理区間の差異が見られるまで観察を行った。ポット全面積に対する発病した面積を調べて発病度（ｄｉｓｅａｓｅ ｓｅｖｅｒｉｔｙ）を算出したし、処理区につき３ポット２反復で実験を行い、その結果を図１２及び表１９に示した。
【0145】
【表19】
【0146】
図１２及び表１９から確認できるように、ＪＣＫ－１３９８培養液（１００倍希釈液及び１，０００倍希釈液）及びＪＣＫ－１３９８ ２０％ＳＣ（１００倍希釈液）を単剤処理した場合にはいずれも無処理区と類似の発病度を示した。一方、ＪＣＫ－１３９８培養液（１００倍希釈液）をテブコナゾール２５％ＥＣ ４，０００倍希釈液と合剤処理した場合に、９７．２６％の高い防除効果を示したし、ＪＣＫ－１３９８ ２０％ＳＣ（１００倍希釈液及び１，０００倍希釈液）をテブコナゾール２５％ＥＣ ４，０００倍希釈液と合剤処理した場合にも、それぞれ８４．９３％及び７３．９７％の防除効果を示し、濃度依存的に防除効果を示すことが分かった。したがって、本発明のＪＣＫ－１３９８菌株培養液を使用する場合に、芝ダラースポット病防除時に使用する化学農薬処理量を格段に減少させることができると期待される。
【0147】
１３－３．トマトサビダニ（害虫：Ａｃｕｌｏｐｓ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）防除効果確認
【0148】
ＪＣＫ－１３９８ ２０％ＳＣは、滅菌水を使用して２５０倍、５００倍及び１，０００倍に希釈したＪＣＫ－１３９８培養液希釈液を用いて製造した。無処理区は、ツイン２０が２５０ｕｇ／ｍｌレベルで添加された溶液を使用したし、対照群としては、線虫炭液剤（ホスチアゼート３０％ＳＬ、（株）ファームハンノン）を定量（４，０００倍希釈液）使用した。
【0149】
各試料は、４～５葉枝ソガントマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ Ｍｉｌｌ）に１株につき２０ｍｌずつ土壌灌注処理した。この時、ＪＣＫ－１３９８ ２０％ＳＣは、３日間隔で２回処理したし、線虫炭液剤は１回処理した。その後、サビダニの発生適正温度及び湿度（２５～２８℃、３０％）を保持してサビダニを自然発病させた。薬剤２次処理２週後に、サビダニが発病したし、サビダニ発病２週後に地上部の長さを測定してサビダニに対する防除効果を調べ、その結果を図１３及び表２０に示した。
【0150】
【表20】
【0151】
図１３及び表２０から確認できるように、ＪＣＫ－１３９８ ２０％ＳＣ ２５０倍、５００倍及び１，０００倍希釈液処理区は、地上部の長さがそれぞれ２６．１３ｃｍ、２１．７５ｃｍ、１５．８８ｃｍであって、濃度が上がるほど地上部の長さが長くなることが分かった。一方、対照群として使用したホスチアゼート３０％ＳＬ ４，０００倍希釈液は３２ｃｍと地上部の長さが最も長かったし、無処理区は１６．８３ｃｍと最も短かった。したがって、ＪＣＫ－１３９８菌株培養液をトマトに処理する場合に、抵抗性を効果的に誘導し、トマトサビダニ防除時に有用であると期待される。
【受託番号】
【0152】
寄託機関名：生物資源センター
受託番号：ＫＣＴＣ １４０８４ＢＰ
受託日：２０１９１２１９
受託番号：ＫＣＴＣ １４０８４ＢＰ
受託日：２０１９１２１９
【産業上の利用可能性】
【0153】
松及び様々な植物において抵抗性を誘導するバシラスサチリスＪＣＫ－１３９８菌株、これを用いた植物病防除用組成物及び防除方法に関する。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】
【国際調査報告】