特表 2023-513633 腫瘍微小環境細胞に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有するパーソナライズされた細胞を提供する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-31

(54)【発明の名称】腫瘍微小環境細胞に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有するパーソナライズされた細胞を提供する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20230324BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230324BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20230324BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230324BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20230324BHJP

   C12N 5/09 20100101ALI20230324BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10

A61P35/00

A61K35/17

A61K39/395 N

A61K39/00 H

C12N5/09

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022549339

(86)(22)【出願日】2021-01-15

(85)【翻訳文提出日】2022-08-16

(86)【国際出願番号】 EP2021050750

(87)【国際公開番号】W WO2021164959

(87)【国際公開日】2021-08-26

(31)【優先権主張番号】20157579.2

(32)【優先日】2020-02-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520094891

【氏名又は名称】ミルテニー バイオテック ベー．フェー． ウント コー． カー・ゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｂ．Ｖ． ＆ Ｃｏ． ＫＧ

【住所又は居所原語表記】Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ－Ｅｂｅｒｔ－Ｓｔｒａｓｓｅ ６８， ５１４２９ Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ

(74)【代理人】

【識別番号】100114890

【弁理士】

【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト

(74)【代理人】

【識別番号】100098501

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 拓

(74)【代理人】

【識別番号】100116403

【弁理士】

【氏名又は名称】前川 純一

(74)【代理人】

【識別番号】100134315

【弁理士】

【氏名又は名称】永島 秀郎

(74)【代理人】

【識別番号】100162880

【弁理士】

【氏名又は名称】上島 類

(72)【発明者】

【氏名】アンドレアス ボズィオ

(72)【発明者】

【氏名】オラフ トルステン ハルト

(72)【発明者】

【氏名】マリオ アッセンマッハー

【テーマコード（参考）】

4B065

4C085

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA02

4B065BA21

4B065CA24

4B065CA44

4C085AA04

4C085CC21

4C085EE01

4C087AA01

4C087AA03

4C087BB63

4C087BB65

4C087CA04

4C087NA14

4C087ZB26

(57)【要約】

本発明は、腫瘍微小環境細胞上に露出した１つ以上の標的抗原に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む細胞を提供するプロセスであって、腫瘍微小環境細胞および非腫瘍微小環境細胞を含む細胞サンプルを準備し、－細胞組織を蛍光部分と抗原認識部分とを含むコンジュゲートと接触させる工程、－細胞組織から非結合コンジュゲートを除去するとともに、コンジュゲートに結合した細胞を、第１のコンジュゲートの蛍光部分から放出される蛍光放射によって検出する工程、－コンジュゲートの蛍光部分から放出される蛍光を消失させる工程を、異なる抗原を認識する抗原認識部分を備え、組み合わせることで腫瘍微小環境細胞と非腫瘍微小環境細胞とを区別することができる、少なくとも２つのコンジュゲートが特定されるまで繰り返し、特定された少なくとも２つの抗原認識部分をキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）として有する細胞を提供することを特徴とする、プロセスを対象とする。好ましくは、腫瘍微小環境細胞は、腫瘍間質細胞またはＰａＣａ細胞に由来する腫瘍微小環境細胞である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

腫瘍微小環境細胞上に露出した１つ以上の標的抗原に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む細胞を提供するプロセスであって、腫瘍微小環境細胞および非腫瘍微小環境細胞を含む細胞サンプルを準備し、
－細胞組織を蛍光部分と抗原認識部分とを含むコンジュゲートと接触させる工程、
－前記細胞組織から非結合コンジュゲートを除去するとともに、前記コンジュゲートに結合した細胞を、第１のコンジュゲートの前記蛍光部分から放出される蛍光放射によって検出する工程、
－前記コンジュゲートの前記蛍光部分から放出される蛍光を消失させる工程
を、異なる抗原を認識する抗原認識部分を備え、組み合わせることで腫瘍微小環境細胞と非腫瘍微小環境細胞とを区別することができる、少なくとも２つのコンジュゲートが特定されるまで繰り返し、
特定された少なくとも２つの抗原認識部分をキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）として有する細胞を提供する
ことを特徴とする、プロセス。

【請求項2】

前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または他の細胞との結合によって誘発されて前記他の細胞を破壊するように改変された細胞からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１記載のプロセス。

【請求項3】

前記少なくとも２つの抗原認識部分がＡＮＤ型、ＯＲ型またはＮＯＴ型として設けられることを特徴とする、請求項１または２記載のプロセス。

【請求項4】

前記少なくとも２つの抗原認識部分がＡＤＡＰＴＥＲ型として設けられることを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項記載のプロセス。

【請求項5】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の抗原認識部分としてビオチンを含む細胞を準備し、前記特定された少なくとも２つの抗原認識部分と抗ビオチン部分とのコンジュゲートを準備し、前記コンジュゲートと前記細胞とをコンジュゲートすることによって、前記特定された少なくとも２つの抗原認識部分をキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）として前記細胞に設けることを特徴とする、請求項４記載のプロセス。

【請求項6】

第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の抗原認識部分としてビオチンをかつ第２のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の抗原認識部分として第２のエピトープを含む細胞を準備し、前記特定された少なくとも２つの抗原認識部分と抗ビオチン部分および第２の部分とのコンジュゲートを準備し、前記コンジュゲートと前記細胞とをコンジュゲートすることによって、前記特定された少なくとも２つの抗原認識部分をキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）として前記細胞に設けることを特徴とする、請求項４記載のプロセス。

【請求項7】

抗原認識部分を備える前記少なくとも２つのコンジュゲートが、前記腫瘍微小環境細胞の少なくとも２０％および前記非腫瘍微小環境細胞の５％未満に少なくとも結合することを特徴とする、請求項１から６までのいずれか１項記載のプロセス。

【請求項8】

抗原認識部分を備える前記少なくとも２つのコンジュゲートが、前記細胞サンプルの非腫瘍微小環境細胞よりも少なくとも１０倍多い腫瘍微小環境細胞に結合することを特徴とする、請求項１から７までのいずれか１項記載のプロセス。

【請求項9】

前記蛍光部分から放出される蛍光放射を、前記コンジュゲートを酵素的に分解することによって消失させることを特徴とする、請求項１から８までのいずれか１項記載のプロセス。

【請求項10】

前記腫瘍微小環境細胞上に露出した１つ以上の標的抗原に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む細胞が、前記腫瘍微小環境細胞を伴う腫瘍細胞にさらに特異的であることを特徴とする、請求項１から９までのいずれか１項記載のプロセス。

【請求項11】

前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む細胞が、α－ＳＭＡ、ＣＤ７４、ＣＸＣＬ１２およびＰＤＧＦＲβからなる群から選択される腫瘍微小環境細胞上に露出した１つ以上の標的抗原に特異的であることを特徴とする、請求項１から１０までのいずれか１項記載のプロセス。

【請求項12】

前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む細胞が、α－ＳＭＡ、ＣＤ７４、ＣＸＣＬ１２およびＰＤＧＦＲβからなる群から選択される腫瘍微小環境細胞および腫瘍間質細胞上に露出した１つ以上の標的抗原に特異的であることを特徴とする、請求項１１記載のプロセス。

【請求項13】

前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む細胞が、ＣＤ４７、ＣＤ５１、ＣＤ５８、ＣＤ９０、ＣＤ２０６およびＣＤ２３９からなる群から選択される腫瘍微小環境細胞上に露出した１つ以上の標的抗原に特異的であることを特徴とする、請求項１から１０までのいずれか１項記載のプロセス。

【請求項14】

前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む細胞が、ＣＤ４７、ＣＤ５１、ＣＤ５８、ＣＤ９０、ＣＤ２０６およびＣＤ２３９からなる群から選択される腫瘍微小環境細胞およびＰａＣａ細胞上に露出した１つ以上の標的抗原に特異的であることを特徴とする、請求項１３記載のプロセス。

【請求項15】

腫瘍微小環境細胞、腫瘍細胞および非腫瘍微小環境細胞を含む細胞サンプルを準備し、
－細胞組織を蛍光部分と抗原認識部分とを含むコンジュゲートと接触させる工程、
－前記細胞組織から非結合コンジュゲートを除去するとともに、前記コンジュゲートに結合した細胞を、第１のコンジュゲートの前記蛍光部分から放出される蛍光放射によって検出する工程、
－前記コンジュゲートの前記蛍光部分から放出される蛍光を消失させる工程
を、異なる抗原を認識する抗原認識部分を備え、組み合わせることで腫瘍微小環境細胞および腫瘍細胞を非腫瘍微小環境細胞に対して区別することができる、少なくとも２つのコンジュゲートが特定されるまで繰り返し、
特定された少なくとも２つの抗原認識部分をキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）として有する細胞を提供する
ことを特徴とする、請求項１０記載のプロセス。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、腫瘍微小環境細胞（ＴＭＥ）の死滅／溶解に適切なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有する細胞を提供するために、個体の健常細胞ではなく腫瘍微小環境細胞（ＴＭＥ）上に露出した抗原を選択する方法に関する。

【0002】

発明の背景
癌は、無秩序な細胞成長を伴う広範な疾患群である。癌では、細胞は制御不能に分裂および成長し、悪性腫瘍を形成し、身体の周辺部位に浸潤する。癌は、リンパ系または血流を介して身体のより遠い部位に広がることもある。

【0003】

固形腫瘍または癌の組織は通常、血管、免疫細胞、線維芽細胞、周皮細胞、シグナル伝達分子および細胞外基質（ＥＣＭ）からなる腫瘍微小環境細胞（ＴＭＥ）によって包囲または被包される。ＴＭＥの定義は、“NCI Dictionary of Cancer Terms”, National Cancer Institute, 2011-02-02に開示されている。ＴＭＥに関する最近のレビューについては、Am J Cancer Res. 2019; 9(2): 228-241を参照されたい。

【0004】

ＣＡＲ Ｔ細胞は、腫瘍を標的とする有望な免疫療法であるため、固形腫瘍の治療は、例えば物理的障壁として働くか、または免疫抑制性であり得るＴＭＥの影響を受ける。これに対処する１つの考え得る方法は、ＣＡＲ Ｔ細胞をもう一度使用することである。

【0005】

生じる問題は、腫瘍およびＴＭＥが全ての患者で同じではなく、腫瘍およびＴＭＥの両方について正しい患者特異的標的を選択し、これに応じてＣＡＲ Ｔ細胞（または同様のもの）を生成する必要があることである。ＣＡＲ Ｔ細胞の選択および生成は、迅速な方法で、また大抵の場合、患者特異的に行われなければならない。

【0006】

実際には、表面分子が非標的細胞上でも発現される可能性があり、安全性の問題が生じるため、腫瘍細胞またはＴＭＥの細胞に対する単一の標的では十分ではないことがある。さらに、表面分子は十分に選択的ではない可能性があり、すなわちＴＭＥ細胞で発現され、生存細胞を再発させ、かつ／もしくは不完全なＴＭＥ破壊を引き起こし、かつ／もしくは抗原の発現レベルを遮断する可能性があり、かつ／または単一の結合剤の親和性が効率的なＴ細胞活性化を可能にするには低すぎる可能性がある。

【0007】

個々の患者についての腫瘍マーカー発現のパーソナライズされた表現型検査を行うためには、ＣＡＲおよびＣＡＲ Ｔ細胞の組合せを、患者および適応症によって決まる許容可能な期間内に開発する必要がある。臨床的には、最適な期間は数週間である。

【0008】

したがって、ＣＡＲ細胞に基づく癌の任意の免疫療法の成功は、それぞれの腫瘍細胞に特異的な抗原の迅速かつ確実な選択にかかっている。

【0009】

かかるプロセスは、例えば欧州特許出願公開第３３１５５１１号明細書に開示されており、ここでは、ＣＡＲ Ｔ細胞に患者の免疫学的状況、すなわち腫瘍細胞が提示する抗原に従う抗原結合領域（「ＴＣＢＭ」）を設けている。

【0010】

特有の細胞表面抗原群がＴＭＥ細胞で発現されるが、非悪性細胞上では発現されないかまたはより低レベルにしか発現されないことが見出されている。これらの抗原（「マーカー」とも称される）を用い、マーカーに特異的に結合するリガンドを介してＴＭＥ細胞の回避機構を特定および／または標識および／または破壊および／または無効化することができる。欧州特許出願公開第３３１５５１１号明細書には、療法に最も有望な抗原結合領域（「ＴＣＢＭ」）の特定については記載されていない。さらに、欧州特許出願公開第３３１５５１１号明細書は、腫瘍細胞のみを対象とし、ＴＭＥの免疫学的状況については記載されていない。

【0011】

ＴＭＥ細胞がＣＡＲ細胞に認識された後、ＴＭＥ細胞は、これにより破壊されるか、またはそのように特定されたＣＡＲ細胞によって癌細胞を保護する効率が少なくとも低下する。

【0012】

したがって、本発明の課題は、非腫瘍細胞を攻撃することなく癌細胞を死滅／溶解させる細胞を改変するために、健常組織では発現されないＴＭＥ細胞に特異的な抗原を選択する方法を提供することであった。

【0013】

発明の概要
本発明の第１の課題は、腫瘍微小環境細胞上に露出した１つ以上の標的抗原に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む細胞を提供するプロセスであって、腫瘍微小環境細胞および非腫瘍微小環境細胞を含む細胞サンプルを準備し、
－細胞組織を蛍光部分と抗原認識部分とを含むコンジュゲートと接触させる工程、
－細胞組織から非結合コンジュゲートを除去するとともに、コンジュゲートに結合した細胞を、第１のコンジュゲートの蛍光部分から放出される蛍光放射によって検出する工程、
－コンジュゲートの蛍光部分から放出される蛍光を消失させる工程
を、組み合わせて腫瘍微小環境細胞と非腫瘍微小環境細胞とを区別することができる、異なる抗原を認識する抗原認識部分を備える少なくとも２つのコンジュゲートが特定されるまで繰り返し、
特定された少なくとも２つの抗原認識部分をキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）として有する細胞を提供する
ことを特徴とする、プロセスである。

【0014】

好ましくは、本発明の方法は、蛍光部分と異なる抗原を認識する抗原認識部分とを含むコンジュゲートを用い、少なくとも続いて行われる２サイクルの工程について上述の工程を繰り返すことを含む。

【0015】

第１の実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む細胞は、α－ＳＭＡ、ＣＤ７４、ＣＸＣＬ１２およびＰＤＧＦＲβからなる群から選択される腫瘍微小環境細胞上に露出した１つ以上の標的抗原に特異的である。

【0016】

この実施形態の好ましい変形形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む細胞は、α－ＳＭＡ、ＣＤ７４、ＣＸＣＬ１２およびＰＤＧＦＲβからなる群から選択される腫瘍微小環境細胞および腫瘍間質細胞上に露出した１つ以上の標的抗原に特異的である。

【0017】

第２の実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む細胞は、ＣＤ４７、ＣＤ５１、ＣＤ５８、ＣＤ９０、ＣＤ２０６およびＣＤ２３９からなる群から選択される腫瘍微小環境細胞上に露出した１つ以上の標的抗原に特異的である。

【0018】

この実施形態の好ましい変形形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む細胞は、ＣＤ４７、ＣＤ５１、ＣＤ５８、ＣＤ９０、ＣＤ２０６およびＣＤ２３９からなる群から選択される腫瘍微小環境細胞およびＰａＣａ（膵臓癌）細胞上に露出した１つ以上の標的抗原に特異的である。ＣＤ９０とＣＤ２３９との組合せは、ＰａＣａの腫瘍微小環境細胞に特に特異的であることが見出された。

【0019】

第３の実施形態では、腫瘍微小環境細胞上に露出した１つ以上の標的抗原に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む細胞は、腫瘍微小環境細胞を伴う腫瘍細胞にさらに特異的である。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の一般的なドメインを示す図である。

【図2】キメラ抗原受容体の一般的な構成概念を示す図である。

【図3】ＡＮＤ論理を備えるＣＡＲ－Ｔ細胞の機能を示す概略図である。

【図4】ＮＯＴ論理を備えるＣＡＲ－Ｔ細胞の機能を示す概略図である。

【図5a】膵癌に対するウルトラハイコンテントイメージングのスクリーニングによる標的の特定を示す図である。

【図5b】膵癌に対するウルトラハイコンテントイメージングのスクリーニングによる標的の特定を示す図である。

【図5c】膵癌に対するウルトラハイコンテントイメージングのスクリーニングによる標的の特定を示す図である。

【0021】

定義
以下、「腫瘍微小環境細胞」、「ＴＭＥ細胞」および「標的細胞」という用語は、本発明の方法によって提供されるＣＡＲ細胞に認識される（後に攻撃される）細胞に対して同義的に用いられる。

【0022】

かかる腫瘍微小環境細胞（ＴＭＥ）は、固形腫瘍の周囲に成長するか、または固形腫瘍を内包し、血管、免疫細胞、線維芽細胞、周皮細胞、シグナル伝達分子および細胞外基質（ＥＣＭ）からなり得る。科学的定義は、“NCI Dictionary of Cancer Terms”. National Cancer Institute. 2011-02-02に見ることができ、最近のレビューについては、Am J Cancer Res. 2019; 9(2): 228-241を参照されたい。

【0023】

したがって、「非腫瘍微小環境細胞」、「非ＴＭＥ細胞」および「非標的細胞」という用語は、本発明の方法によって提供されるＣＡＲ細胞に認識されない（後に攻撃されない）健常細胞に対して同義的に用いられる。

【0024】

「腫瘍細胞」という用語は、「腫瘍微小環境細胞」の一部ではなく、当然ながら健常な「非腫瘍微小環境細胞」ではない癌細胞を指す。

【0025】

「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、その細胞自体以外の起源に由来する新たな特異性を備える改変細胞を指す。

【0026】

「腫瘍」という用語は、医学では「新生物」として知られる。全ての腫瘍が癌性であるとは限らず、良性腫瘍は隣接組織に浸潤せず、全身に広がることはない。

【0027】

「癌」という用語は、無秩序な細胞成長を伴う広範な疾患群を指す。癌性細胞は、無制御に分裂および成長し、悪性腫瘍を形成し、身体の周辺部位に浸潤する。癌は、リンパ系または血流を介して身体のより遠い部位に広がることもある。

【0028】

抗体のようなリガンド、そのフラグメント、またはＣＡＲの抗原結合ドメインに関する「結合剤」または「特異的に結合する」または「に特異的な」という用語は、特定の抗原を認識し、これに結合するが、サンプル中の他の分子を実質的に認識または結合しない抗原結合ドメインを指す。或る種に由来する抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインは、別の種に由来するその抗原にも結合する場合がある。この異種間反応性は、その抗原結合ドメインが特異的であるという定義に反するものではない。或る抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインは、その抗原の異なる対立遺伝子型（対立遺伝子変異型、スプライス変異体、アイソフォーム等）にも結合する可能性がある。この交差反応性は、その抗原結合ドメインが特異的であるという定義に反するものではない。

【0029】

本明細書で使用される「改変細胞」および「遺伝子組み換え細胞」という用語は、区別なく用いられ得る。これらの用語は、細胞またはその子孫の遺伝子型または表現型を修飾する外来遺伝子または核酸配列を含み、かつ／または発現することを意味する。特に、これらの用語は、自然状態ではこれらの細胞において発現されないペプチドまたはタンパク質を安定的または一時的に発現するように、当該技術分野で既知の組み換え法によって操作された細胞、好ましくはＴ細胞を指す。例えば、Ｔ細胞はキメラ抗原受容体等の人工構築物を細胞表面に発現するように改変される。例えば、ＣＡＲをコードする配列は、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを用いて細胞内に送達することができる。

【0030】

「標的」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原結合ドメイン、例えば抗体またはＣＡＲの抗原結合ドメインによって特異的に認識されるのが望ましい、細胞と関連する抗原またはエピトープを指す。抗体認識のための抗原またはエピトープは、細胞表面に結合していてよいが、分泌されても、細胞外膜の一部であっても、または細胞から脱落してもよい。

【0031】

「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体およびそれらのフラグメントを指し、当業者に既知の方法によって生成することができる。抗体は任意の種、例えばマウス、ラット、ヒツジ、ヒトのものであり得る。治療目的では、非ヒト抗原結合フラグメントが使用される場合、当該技術分野で既知の任意の方法によってヒト化することができる。抗体は修飾抗体（例えばオリゴマー、還元抗体、酸化抗体および標識抗体）であってもよい。

【0032】

「キラー細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、別の細胞、例えば癌細胞を死滅／破壊／溶解させることができる細胞を指す。Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞およびマクロファージがキラー細胞として最もよく使用され得る。

【0033】

「改変キラー細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、標的細胞を特異的に死滅させることが可能となるように遺伝子組み換えされたキラー細胞、例えばそれぞれの標的を発現する腫瘍細胞および／またはＴＭＥ細胞を死滅させるように標的に対するＣＡＲで修飾された細胞を指す。

【0034】

発明の詳細な説明
本発明のプロセスは、細胞サンプルのＴＭＥ細胞の少なくとも一部を破壊するために、好適なコンジュゲートのセットの迅速な特定およびその後の適切なＣＡＲ細胞の迅速な改変を可能にする。ＴＭＥ細胞、非ＴＭＥ細胞および非腫瘍細胞を含む細胞サンプルは、好ましくは同じ患者の同じ組織または器官に由来する。

【0035】

細胞サンプル中のＴＭＥ細胞と非ＴＭＥ細胞とを区別するために、病理学者のような当業者は、細胞サンプルが腫瘍を含むかどうか、またそうである場合に細胞サンプルのどの部分であるかを、腫瘍学における既知の基準または常法に従って決定することができる。かかる基準は、例えばArbeitsgemeinschaft der Wissenschaftlichen Medizinischen Fachgesellschaften（ＡＷＭＦ）によって発表された指針であり、例えば細胞の形態、組織の構造、倍数性、バイオマーカー発現（Ｈｅｒ２、ｐ５３、ＢＲＡＣ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ等）を含み得る。

【0036】

ＴＭＥ細胞の一部のみが特定または攻撃される場合であっても腫瘍が破壊される可能性があるため、特定されたコンジュゲートが全てのＴＭＥ細胞に結合する必要はない。好ましくは、本発明のプロセスは、ＴＭＥ細胞の少なくとも１％、より好ましくは少なくとも１０％、最も好ましくは少なくとも３０％に結合する、異なる抗原を認識する抗原認識部分を備える少なくとも２つのコンジュゲートが特定されるまで行われる。

【0037】

コンジュゲートは非ＴＭＥ細胞または非腫瘍細胞の０％に結合することが望まれるが、或る量の非腫瘍／非ＴＭＥ細胞（すなわち健常細胞）が標的とされることは療法に許容され得る。好ましくは、本発明のプロセスは、ＴＭＥ細胞に結合し、同じタイプの組織または器官の非ＴＭＥ細胞の最大でも１０％、より好ましくは最大でも５％、最も好ましくは最大でも１％に結合する、異なる抗原を認識する抗原認識部分を少なくとも備える少なくとも２つのコンジュゲートが特定されるまで行われる。「同じタイプの組織または器官」という用語は、例えば膵臓、肝臓または間質を指す。

【0038】

本発明のプロセスは、異なる抗原を認識する抗原認識部分を備える２つのコンジュゲートの１つ以上のセット、およびその後の特定された少なくとも２つの抗原認識部分をキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）として有する１つ以上の異なる細胞の迅速な特定を可能にする。コンジュゲートの２つ以上のセットおよび２つ以上のＣＡＲ細胞を準備することで、ＴＭＥ細胞を破壊する可能性を高め、かつ／またはＴＭＥ細胞が標的化を回避するために抗原を下方調節することを防ぐ。

【0039】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または他の細胞への結合によって誘発されて他の細胞を破壊する（溶解させる）ように改変された細胞からなる群から選択され得る。

【0040】

本発明のプロセスでは、認識パターンを特徴付け、ＴＭＥ細胞に特異的な結合剤および非ＴＭＥ細胞に特異的な結合剤を選択するために、細胞サンプルを続いて複数の結合剤と接触させてもよい。このように特定された結合剤は、後に規定するようにその後の療法に使用することができる。

【0041】

プロセスの変形形態では、異なる抗原を認識する抗原認識部分を備える少なくとも２つのコンジュゲートは、細胞サンプルのＴＭＥ細胞の少なくとも２０％および非ＴＭＥ細胞の５％未満に結合する。好ましくは、異なる抗原を認識する抗原認識部分を備える少なくとも２つのコンジュゲートは、細胞サンプルのＴＭＥ細胞の少なくとも５０％および非ＴＭＥ細胞の５％未満に結合する。より好ましくは、異なる抗原を認識する抗原認識部分を備える少なくとも２つのコンジュゲートは、細胞サンプルのＴＭＥ細胞の少なくとも７０％および非ＴＭＥ細胞の５％未満に結合する。

【0042】

別の変形形態では、少なくとも２つのコンジュゲートは、細胞サンプルの非ＴＭＥ細胞より少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも５０倍、より好ましくは少なくとも１００倍多いＴＭＥ細胞を破壊する抗原認識部分を備える。

【0043】

本発明のプロセスは、ＴＭＥ細胞に結合するが、非ＴＭＥ細胞には結合しないかまたは実質的に結合しない、異なる抗原を認識する抗原認識部分を備える少なくとも２つのコンジュゲートを特定することを含む。

【0044】

ＣＡＲが少なくとも２つの抗原認識部分を備える場合、ＣＡＲは異なる論理ゲートで実行されるように誘発され得る。論理ゲートは「ＡＮＤ」型、「ＮＯＴ」型、「ＯＲ」型のＣＡＲ細胞として文献に記載されている。後により詳細に開示するように、本発明のプロセスでは、少なくとも２つの抗原認識部分はＡＮＤ型、ＯＲ型またはＮＯＴ型として設けられ、かつ／または少なくとも２つの抗原認識部分は、ＡＤＡＰＴＥＲ型として設けられる。これら全ての変形形態における少なくとも２つの抗原認識部分は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）として設けられる。

【0045】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
図１および図２に概略的に示されているように、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含み得る。細胞外ドメインは、リンカーによって膜貫通ドメインに連結され得る。細胞外ドメインは、シグナルペプチドに連結されていてもよい。

【0046】

「シグナルペプチド」という用語は、細胞内のタンパク質の、例えば或る特定の細胞小器官（小胞体等）および／または細胞表面への輸送および局在化を指示するペプチド配列を指す。

【0047】

「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原に特異的に結合する（これにより抗原を含む細胞を標的とすることができる）、ＣＡＲの領域を指す。本発明によって得られるＣＡＲは、１つ以上の抗原結合ドメインを含み得る。概して、ＣＡＲ上の抗原結合ドメインは細胞外である。抗原結合ドメインは、抗体またはそのフラグメントを含み得る。抗原結合ドメインは、例えば完全長重鎖、Ｆａｂフラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント、二価一本鎖抗体またはダイアボディを含み得る。アフィボディ、または天然の受容体に由来するリガンド結合ドメイン等の所与の抗原に特異的に結合する任意の分子を抗原結合ドメインとして使用することができる。多くの場合、抗原結合ドメインはｓｃＦｖである。通常、ｓｃＦｖでは、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変部分がフレキシブルリンカーによって融合し、ｓｃＦｖを形成する。かかるリンカーは、例えば「（Ｇ_４／Ｓ_１）_３－リンカー」であり得る。

【0048】

ＣＡＲの膜貫通ドメインは、例えば４－１ＢＢ、ＣＤ８および／またはＣＤ２８の膜貫通ドメインの配列を含み得る。さらに、ＣＤ２８、ＣＤ１３７またはＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインの配列を含む活性化細胞内シグナル伝達ドメインが存在していてもよい。

【0049】

活性化細胞内シグナル伝達ドメインの代わりに、ＣＡＲは、ＰＤ１またはＣＴＬＡ４等の細胞内シグナル伝達ドメインの配列を有する阻害細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。

【0050】

この実施形態の好ましい変形形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、付加的な抗原結合ドメインまたは付加的なＣＡＲなしにＣＤ２０に特異的な抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインが１つの膜貫通ドメインおよび１つ以上のシグナル伝達ドメインにコンジュゲートする。この変形形態は図２Ａに例として示されている。

【0051】

場合によっては、抗原結合ドメインが、ＣＡＲが使用されるのと同じ種に由来することが有益である。例えば、ＣＡＲをヒトにおいて治療的に使用することが意図される場合、ＣＡＲの抗原結合ドメインがヒト抗体もしくはヒト化抗体またはそのフラグメントを含むことが有益であり得る。ヒト抗体もしくはヒト化抗体またはそのフラグメントは、当該技術分野で既知の様々な方法によって作製することができる。

【0052】

「スペーサー」または「ヒンジ」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にある親水性領域を指す。本発明によって特定されたＣＡＲは、細胞外スペーサードメインを含み得るが、かかるスペーサーを除外することも可能である。スペーサーは、抗体もしくはそのフラグメントのＦｃフラグメント、抗体もしくはそのフラグメントのヒンジ領域、抗体のＣＨ２もしくはＣＨ３領域、アクセサリータンパク質、人工スペーサー配列、またはこれらの組合せを含み得る。スペーサーの顕著な例は、ＣＤ８αヒンジである。

【0053】

ＣＡＲの膜貫通ドメインは、かかるドメインの任意の所望の天然源または合成源に由来し得る。起源が天然である場合、ドメインは任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来し得る。

【0054】

本発明のＣＡＲの細胞質ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが発現される免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化に関与する。「エフェクター機能」は、細胞の特殊な機能を意味し、例えばＴ細胞では、エフェクター機能は細胞溶解活性、またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達し、本発明のＣＡＲを発現する細胞が特殊な機能を果たすよう指示するタンパク質の部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な所与のタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの任意の完全なまたは切断された部分を含み得る。

【0055】

ＣＡＲに使用される細胞内シグナル伝達ドメインの顕著な例は、抗原受容体連結後にシグナル伝達を開始するように協調して作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および共同受容体の細胞質配列が挙げられる。

【0056】

少なくとも２つの抗原結合ドメインを有するＣＡＲについては、抗原結合ドメインが異なる機能を有していてもよい。本発明のプロセスは、「ＡＮＤ」型、「ＮＯＴ」型、「ＯＲ」型のＣＡＲ細胞として提供され得る、腫瘍治療に適した新たなＣＡＲ細胞の開発時間を短縮する。

【0057】

本発明の一実施形態では、両方の抗原結合ドメインがそれぞれの抗原に結合する場合にのみＣＡＲ細胞が活性化され、すなわちシグナルドメインのシグナルが誘発される。かかるＣＡＲ細胞を以下、「ＡＮＤ－ＣＡＲ」と称する。「ＡＮＤ－ＣＡＲ」細胞の抗原結合ドメインは、例えば、健常細胞では発現されないかまたは多くとも一方しか発現されない、ＴＭＥ細胞上にある２つの抗原を特定することによって、本発明の方法で特定することができる。図３（Transl Cancer Res 2016;5(S1):S61-S65に掲載）には、ＡＮＤ－ＣＡＲが健常細胞（ｉ）および（ｉｉ）によって不活性化されるが、ＴＭＥ細胞（ｉｉｉ）によって活性化される様子が示されている。

【0058】

本発明の別の実施形態では、一方の抗原結合ドメインがそれぞれの抗原に結合し、他方が結合しない場合にのみＣＡＲ細胞が活性化され、すなわちシグナルドメインのシグナルが誘発される。かかるＣＡＲ細胞を以下、「ＮＯＴ－ＣＡＲ」と称する。「ＮＯＴ－ＣＡＲ」細胞の抗原結合ドメインは、例えば、一方のみがＴＭＥ細胞で発現される、健常細胞上にある２つの抗原を特定することによって本発明の方法で特定することができる。図４（Transl Cancer Res 2016;5(S1):S61-S65に掲載）には、ＮＯＴ－ＣＡＲが健常細胞（ｉ）によって不活性化されるがＴＭＥ細胞（ｉｉ）によって活性化される様子が示されている。

【0059】

本発明のさらに別の実施形態では、２つの抗原結合ドメインの一方のみがそれぞれの抗原に結合する場合にＣＡＲ細胞が既に活性化され、すなわちシグナルドメインのシグナルが誘発される。かかるＣＡＲ細胞を以下、「ＯＲ－ＣＡＲ」と称する。「ＯＲ－ＣＡＲ」細胞の抗原結合ドメインは、例えば、ＴＭＥ細胞上にあるが健常細胞上にはない２つの抗原を特定することによって、本発明の方法で特定することができる。

【0060】

処理時間の更なる短縮は、いわゆる「ＡＤＡＰＴＥＲ ＣＡＲ」技術を用いて達成することができる。「ＡＤＡＰＴＥＲ ＣＡＲ」細胞は、シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、リンカードメインとを含み、抗原認識特性を有しない。次いで、このリンカードメインに１つ以上の抗原認識部分をコンジュゲートする（リンカー＋分子＝アダプター）。したがって、本発明によるプロセスでは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）としての少なくとも２つの抗原認識部分は、ＡＤＡＰＴＥＲ型として設けられ得る。

【0061】

本発明の変形形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の抗原認識部分としてビオチンを含む細胞を準備し、特定された少なくとも２つの抗原認識部分と抗ビオチン部分とのコンジュゲートを準備し、上記コンジュゲートと上記細胞とをコンジュゲートすることによって、特定された少なくとも２つの抗原認識部分をキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）として細胞に設ける。

【0062】

本発明の別の変形形態では、第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の抗原認識部分としてビオチンをかつ第２のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の抗原認識部分として第２のエピトープを含む細胞を準備し、特定された少なくとも２つの抗原認識部分と抗ビオチン部分および第２の部分とのコンジュゲートを準備し、上記コンジュゲートと上記細胞とをコンジュゲートすることによって、特定された少なくとも２つの抗原認識部分をキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）として細胞に設ける。

【0063】

好適なリンカーは、哺乳動物（ヒト）の体内には存在しないか、または哺乳動物（ヒト）の体内の天然抗体に対して低い親和性を有する分子である。例えば、抗原認識部分との所望のコンジュゲートにコンジュゲートする抗ビオチン抗体または抗チアミン抗体のような適切なアダプターによって特定される、ビオチン単位またはチアミン単位（化学修飾または非修飾）が好適である。

【0064】

「ＡＤＡＰＴＥＲ ＣＡＲ」技術は、国際公開第２０１８０７８０６６号に開示されており、ＣＡＲ細胞に結合したリンカーについて「リンカー／標識エピトープ」（ＬＬＥ）という用語が用いられる。

【0065】

好ましくは、ＬＬＥは、ＣＡＲを発現する細胞で治療されることが意図される被験体において免疫反応を引き起こさない。これは、リンカー部分を有しない内因性標識部分、すなわち被験体内の天然分子（自己抗原）よりも高い選好性でＬＬＥが結合するように、天然エピトープ認識分子に由来するＣＡＲの細胞外ＬＬＥ結合ドメインを用いることで達成することができる。

【0066】

例えば、ＣＡＲの細胞外ＬＬＥ結合ドメインは、上記天然分子よりも少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍高い親和性で上記ＬＬＥに結合する。

【0067】

「ＡＤＡＰＴＥＲ」ＣＡＲ細胞の場合、リンカー単位を備えるＣＡＲ細胞およびアダプターを患者に並行して適用する。この実施形態の利点は、リンカーを有するＣＡＲ細胞を、特定された抗原認識部分とは独立して作製することができ、ゼロから開発する必要がないことである。アダプターのみを生成し試験する必要がある。このアプローチでは、従来の化学療法と同様に、療法の強度および動態を制御することもできる。

【0068】

検出プロセス
本発明の方法では、細胞に結合したコンジュゲートの蛍光部分から放出される蛍光を消失させる必要がある。この工程により、コンジュゲート（すなわち、抗原結合部分、すなわちＴＭＥ細胞の抗原）の最良の組合せが決定されるまで複数の潜在的な結合剤またはコンジュゲートを調査することができる。「蛍光を消失させる」という用語は、細胞サンプルの蛍光放射を消光する任意の方法を指し、例えばコンジュゲートを酵素的に分解することで、結合したコンジュゲートを蛍光部分から除去することを含む。かかるコンジュゲートは、例えば欧州特許出願公開第３０３７８２１号明細書、欧州特許出願公開第１６２０３６８９．１号明細書または欧州特許出願公開第１６２０３６０７．３号明細書に開示されている。

【0069】

その変形形態では、親和性系を含むコンジュゲート、例えばビオチン／抗ビオチンを使用することができ、親和性系は遊離競合分子（ビオチン／抗ビオチン系のビオチン等）の添加によって抑止される。いずれの場合にも、コンジュゲートから蛍光部分を放出させ、続いて「放出された」蛍光部分を洗い流すことによって蛍光が消失する。

【0070】

「蛍光を消失させる」代替方法では、過酸化水素のような酸化剤を添加するか、または適切な波長の放射（ＵＶ放射等）を供給することによって、蛍光放射を発する能力がなくなる程度まで蛍光部分を化学的に破壊する。

【0071】

癌の治療への使用
本発明の方法によって得られる細胞集団は、好ましくはヒト癌、特にヒト膵臓癌またはヒト間質癌の治療方法において医薬組成物として使用することができる。

【0072】

医薬組成物は、好ましくは本発明の方法によって得られるＣＡＲを発現する改変細胞の集団を含む。本発明の変形形態では、医薬組成物は化学療法剤、放射線または免疫調節剤と組み合わせて癌の治療に使用される。

【0073】

医薬組成物によるＴＭＥの認識は、ＣＡＲ細胞による分子の分泌等の反応を引き起こすことができ、これにより更なる細胞が動員され、ＴＭＥが癌細胞を保護する効率が低下する。最終的に、癌細胞は、例えば適切なＣＡＲ細胞によって攻撃され得る。

【0074】

治療される癌のＴＭＥ細胞は、造血癌、骨髄異形成症候群、膵癌、頭頸部癌、皮膚腫瘍、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）における微小残存病変（ＭＲＤ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌、黒色腫、もしくは他の血液癌および固形腫瘍、またはこれらの任意の組合せを含み得る。別の実施形態では、癌は白血病（例えば慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ））、リンパ腫（例えばマントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫またはホジキンリンパ腫）もしくは多発性骨髄腫等の血液癌、またはこれらの任意の組合せを含む。さらに、癌は口腔咽頭癌（舌、口腔、咽頭、頭頸部）、消化器系癌（食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓、肝内胆管、胆嚢、膵臓）、呼吸器系癌（喉頭、肺および気管支）、骨関節癌、軟部組織癌、皮膚癌（黒色腫、基底および扁平上皮癌）を含む成人癌、小児腫瘍（神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫）、中枢神経系の腫瘍（脳神経芽細胞腫、星状細胞腫、膠芽腫、神経膠腫）、ならびに乳房、生殖器系（子宮頸部、子宮体部、卵巣、外陰部、膣、前立腺、精巣、陰茎、子宮内膜）、泌尿器系（膀胱、腎臓および腎盂、尿管）、眼および眼窩、内分泌系（甲状腺）、ならびに脳および他の神経系の癌、またはこれらの任意の組合せを含み得る。

【0075】

癌の治療は、標的分子として開示される少なくとも１つの抗原または開示される抗原の任意の組合せを用いる任意の方法を包含し得る。かかる方法は、例えば抗原に結合し、この抗原を発現する癌性細胞の生存能力に影響を与え、好ましくは癌性細胞を死滅させる作用物質による治療であり得る。例は、既に開示されている腫瘍溶解性ウイルス、ＢｉＴＥ（登録商標）、ＡＤＣＣおよび免疫毒素である。

【0076】

治療のために被験体の免疫細胞、例えばＴ細胞を単離することができる。被験体は上記癌を患っていても、または健常被験体であってもよい。これらの細胞は、本発明の１つ以上のＣＡＲを発現するようにｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで遺伝子操作される。これらの改変細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで活性化し、増殖させることができる。細胞療法では、これらの改変細胞を、これを必要とするレシピエントに注入することができる。これらの細胞は、医薬組成物（上記細胞＋薬学的に許容可能な担体）であってもよい。注入された細胞は、レシピエントにおいて開示の抗原の１つ以上を発現する癌性細胞を死滅させる（または少なくともその成長を止める）ことができる。レシピエントは、細胞が得られたのと同じ被験体であっても（自己細胞療法）、または同じ種の別の被験体であってもよい（同種細胞療法）。

【0077】

実施例
以下の実施例は、本発明のより詳細な説明を意図するものであるが、本発明はこれらの実施例に限定されない。

【0078】

新鮮凍結膵癌標本をスライスし、アセトンで固定した。その後のスクリーニングをＭＡＣＳｉｍａ（商標）ウルトラハイコンテントイメージングプラットホーム（Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG）で９０種の抗体の連続染色を用いて行い、そのうち９種を示す。核はＤＡＰＩで染色した。

【0079】

図５には、マーカーＣＤ４７、ＣＤ５１、ＣＤ５８、ＣＤ９０、ＣＤ２０６およびＣＤ２３９の組合せを用いて、ＴＭＥおよび腫瘍細胞を健常細胞に対して区別し得ることが示されている。特に、ＣＤ９０とＣＤ２３９との組合せは、双方が間質性の細胞で重複発現を示すが、他の細胞型では示さないことから、腫瘍微小環境細胞に特異的であった。これらのマーカーと腫瘍細胞に特異的なマーカーまたはマーカーの組合せとを組み合わせることで、ＴＭＥおよび任意に腫瘍を特異的に攻撃することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5a】

【図5b】

【図5c】

【国際調査報告】