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▶ エスアンドピー・イングリーディエント・ディベロップメント・エルエルシーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-03
(54)【発明の名称】有機酸産生を最大化するための微生物細胞株の使用
(51)【国際特許分類】
C12P 7/40 20060101AFI20230327BHJP
C12P 7/52 20060101ALI20230327BHJP
C12P 7/54 20060101ALI20230327BHJP
C12P 7/56 20060101ALI20230327BHJP
【ＦＩ】
C12P7/40 ZNA
C12P7/52
C12P7/54
C12P7/56
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022549158
(86)(22)【出願日】2021-02-12
(85)【翻訳文提出日】2022-10-14
(86)【国際出願番号】 US2021017940
(87)【国際公開番号】W WO2021163548
(87)【国際公開日】2021-08-19
(31)【優先権主張番号】62/977,087
(32)【優先日】2020-02-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520498398
【氏名又は名称】エスアンドピー・イングリーディエント・ディベロップメント・エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100122644
【弁理士】
【氏名又は名称】寺地 拓己
(72)【発明者】
【氏名】ホワイト，デリック
(72)【発明者】
【氏名】ブローフィ，ジェームス・エス
(72)【発明者】
【氏名】ピチャイ，クリシュナムールティ
【テーマコード（参考）】
4B064
【Ｆターム（参考）】
4B064AD04
4B064AD05
4B064AD15
4B064AD33
4B064CA02
4B064DA16
(57)【要約】
最適化された発酵培地を使用してプロピオン酸産生を増強させるための共培養に使用される方法、微生物細胞株、及び培地、並びに、例えばラクトバチルス・カゼイ及び高酸耐性プロピオン酸菌を共培養することによって、プロピオン酸収率を上昇させるための方法を、本明細書に記載する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
有機酸の生成方法であって、酸耐性有機酸排出微生物を提供し；
酸耐性乳酸産生微生物を提供し；
グルコース炭素源及びラクトース炭素源を含み、約５．８～約６．５のｐＨを有する増殖培地を提供し；
酸耐性有機酸排出微生物及び酸耐性乳酸産生微生物を増殖培地に添加し、これにより培養物を生成し；そして
培養物を制御された発酵条件下でインキュベートし、これにより有機酸を生成する；
ことを含む前記方法。
【請求項2】
酸耐性有機酸排出微生物が、プロピオニバクテリウム属、アネロビブリオ属、バクテロイデス属、クロストリジウム属、フソバクテリウム属、メガスファエラ属、プロピオニスピラ属、セレノモナス属、ベイロネラ属、及びそれらの組合せから成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
プロピオニバクテリウム属微生物がプロピオン酸菌（ＮＦＳ ２０１８）である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
酸耐性有機酸排出微生物が増殖培養物として提供される、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
酸耐性乳酸産生微生物が、ラクトコッカス属、ペディオコッカス属、オエノコッカス属、エンテロコッカス属、ロイコノストック属、ビフィドバクテリム属、バシラス属、ラクトバシラス属、クロストリジウム属、パエニバシラス属、スポロラクトバチルス属、及びそれらの組合せから成る群より選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
酸耐性乳酸産生微生物が、ラクトコッカス属、ペディオコッカス属、オエノコッカス属、エンテロコッカス属、ロイコノストック属、ビフィドバクテリム属、バシラス属から成る群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
酸耐性乳酸産生微生物が増殖培養物として提供される、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
酸耐性乳酸産生微生物が、バシラス属、ラクトバシラス属、クロストリジウム属、パエニバシラス属、スポロラクトバチルス属、及びそれらの組合せから成る群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項9】
酸耐性乳酸産生微生物がラクトバチルス・カゼイである、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
酸耐性乳酸産生微生物が胞子として提供され、該胞子が炭素源の一部として提供されてもよい、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項11】
培地のｐＨが約６．０である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
増殖培地が、窒素源、ビタミン、ＭｇＳＯ４、ＮａＰＯ４、及びＫＰＯ４をさらに含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
グルコース炭素源及びラクトース炭素源が同じである、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
グルコース炭素源及びラクトース炭素源が異なる、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
グルコース炭素源が植物ベースのグルコース炭素源である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
植物炭素源が、加水分解コムギ、加水分解トウモロコシ、加水分解マメ、加水分解デンプン、及びそれらの組合せから成る群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
ラクトース炭素源が乳清である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
窒素源が、酵母エキス、ペプチド、硫酸アンモニア、水酸化アンモニア、アミノ酸、及びそれらの組合せから選択される、請求項１２～１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
窒素源が酵母エキスである、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
ビタミンがビタミンＢ１２である、請求項１２～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
酸耐性乳酸産生微生物を、酸耐性有機酸排出微生物を培地に添加してから６～３６時間後、所望により１２～２４時間後に培地に添加し；そして、培養物を、所望量の有機酸を産生するのに十分な時間にわたり維持する；
請求項１に記載の方法。
【請求項22】
有機酸が、プロピオン酸、酢酸、乳酸、コハク酸、及びそれらの組合せから成る群より選択される、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
優先権の主張
本願は、２０２０年２月１４日に出願された米国仮出願第６２／９７７０８７号の利益を主張する。前述の内容全体は本明細書に援用される。
発明の技術分野
本開示は、一般に、最適化された発酵培地を使用してプロピオン酸産生を増強させるための共培養に使用される方法、微生物細胞株、及び培地、並びに、例えばラクトバチルス・カゼイ及び高酸耐性プロピオン酸菌（Acidipropionibacterium Acidipropionici）を共培養することによって、プロピオン酸収率を上昇させるための方法に関する。
本願は、２０２０年２月１４日に出願された米国仮出願第６２／９７７０８７号の利益を主張する。前述の内容全体は本明細書に援用される。
発明の技術分野
本開示は、一般に、最適化された発酵培地を使用してプロピオン酸産生を増強させるための共培養に使用される方法、微生物細胞株、及び培地、並びに、例えばラクトバチルス・カゼイ及び高酸耐性プロピオン酸菌（Acidipropionibacterium Acidipropionici）を共培養することによって、プロピオン酸収率を上昇させるための方法に関する。
【背景技術】
【0002】
有機酸は、酸性特性を有する炭素含有化合物である。有機酸の例としては、とりわけ、酢酸、クエン酸、グルコン酸、乳酸、及びプロピオン酸が挙げられる。それらは完全に分解性であるので、有機酸は生分解性ポリマーの生産に使用することができる。それらはまた、主に防腐剤として、食品及び飼料添加物としてなど、他の重要な工業的用途を有する。
【0003】
プロピオン酸（ＰＡ）は、かなりの商業的価値を得ていて、いくつかの炭素源からの糖の微生物発酵によって生成することができるカルボン酸である（例えばＧｏｎｚａｌｅｚ－Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１７及びＡｈｍａｄｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７を参照）。プロピオン酸は、歴史的に、経済的に適していると考えられたので、「石油化学」プロセスを用いて商業的に生産されてきた。これは、原油及び石油化学製品のコストが長年にわたって上昇し、消費者が、食品に使用するためのプロピオン酸に天然源を求めるようになるにつれて変化し、その結果、微生物発酵を使用する生成方法に対する関心が高まっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１７
【非特許文献2】Ａｈｍａｄｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７
【発明の概要】
【0005】
再生可能でないベース製品の使用及びそれらの環境影響に関する懸念を考慮して、商業規模での再生可能なエネルギー源を使用するプロピオン酸の微生物生合成は、大きな関心を集めている。本明細書に、炭素源としてグルコースを含有する微生物発酵培地における高収率でのプロピオン酸の生成方法を記載する。これらの方法は、プロピオン酸の商業規模の生産に適用することができる。
【0006】
本開示は、共培養を使用することによる有機酸の工業規模生産に適した微生物細胞株、及び最適化培地を使用して有機酸収率を最大化する方法を提供する。
したがって、本明細書において提供されるのは、有機酸の生成方法である。本方法は、（ｉ）酸耐性有機酸排出微生物及び（ｉｉ）酸耐性乳酸産生微生物を、培地のｐＨが約５．８～６．５である培地中で制御された発酵条件下にて培養し、同じ条件下で使用される単一の微生物細胞株と比較してより高収率の有機酸をもたらすことを包含する。
したがって、本明細書において提供されるのは、有機酸の生成方法である。本方法は、（ｉ）酸耐性有機酸排出微生物及び（ｉｉ）酸耐性乳酸産生微生物を、培地のｐＨが約５．８～６．５である培地中で制御された発酵条件下にて培養し、同じ条件下で使用される単一の微生物細胞株と比較してより高収率の有機酸をもたらすことを包含する。
【0007】
いくつかの態様では、酸耐性有機酸排出微生物は、プロピオニバクテリウム属、アネロビブリオ属、バクテロイデス属、クロストリジウム属、フソバクテリウム属、メガスファエラ属、プロピオニスピラ属（Propionispira）、セレノモナス属、又はベイロネラ属生物である。いくつかの態様では、プロピオニバクテリウム属生物はプロピオン酸菌（ＮＦＳ ２０１８）である。
【0008】
いくつかの態様では、乳酸産生微生物は、培養した、又は胞子形成性の乳酸産生生物である。いくつかの態様では、非胞子形成性で酸耐性の乳酸菌は、ラクトコッカス属、ペディオコッカス属、オエノコッカス属、エンテロコッカス属、ロイコノストック属、及びビフィドバクテリム属を含む。いくつかの態様では、胞子形成性で酸耐性の乳酸菌は、バシラス属、ラクトバシラス属、クロストリジウム属、パエニバシラス属、又はスポロラクトバチルス属生物を含む。いくつかの態様では、ラクトバシラス属生物はラクトバチルス・カゼイである。
【0009】
いくつかの態様では、培地のｐＨは約６．０である。
いくつかの態様では、本方法は、グルコース、酵母エキス、ＭｇＳＯ４、ＮａＰＯ４、ビタミンＢ１２、及びＫＰＯ４を含む出発培地を提供し、ここで、出発培地は約６のｐＨを有し；酸耐性有機酸排出微生物を培地に添加し、６～３６時間後、例えば１２～２４時間後に、乳酸産生微生物を培地に添加し；そして、望ましい量の有機酸を産生するのに十分な時間にわたり培養物を維持する；ことを含む。
いくつかの態様では、本方法は、グルコース、酵母エキス、ＭｇＳＯ４、ＮａＰＯ４、ビタミンＢ１２、及びＫＰＯ４を含む出発培地を提供し、ここで、出発培地は約６のｐＨを有し；酸耐性有機酸排出微生物を培地に添加し、６～３６時間後、例えば１２～２４時間後に、乳酸産生微生物を培地に添加し；そして、望ましい量の有機酸を産生するのに十分な時間にわたり培養物を維持する；ことを含む。
【0010】
いくつかの態様では、乳酸産生微生物は、酸耐性有機酸排出微生物のための炭素を提供する。いくつかの態様では、酸耐性有機酸排出微生物は、乳清（チーズ生産の副産物）、穀物（コムギ、トウモロコシ、若しくはデンプン）、又は植物（マメ）由来の炭素源からのグルコースを消費し、及び／又は１以上の培養した、若しくは胞子形成性の乳酸産生生物によって産生される乳酸を消費する。
【0011】
いくつかの態様では、有機酸は、プロピオン酸；酢酸；乳酸；及び／又はコハク酸を含む。
いくつかの態様では、発酵プロセス中の制御された発酵条件は、好気性条件、嫌気性条件、又はその両方を含む。
いくつかの態様では、発酵プロセス中の制御された発酵条件は、好気性条件、嫌気性条件、又はその両方を含む。
【0012】
本明細書では、酸耐性有機酸排出微生物を提供し；酸耐性乳酸産生微生物を提供し；グルコース炭素源及びラクトース炭素源を含み、約５．８～約６．５のｐＨを有する増殖培地を提供し；酸耐性有機酸排出微生物及び酸耐性乳酸産生微生物を増殖培地に添加し、これにより培養物を生成し；そして、培養物を制御された発酵条件下でインキュベートし、これにより有機酸を生成する；ことを含む、有機酸の生成方法も提供する。
【0013】
いくつかの態様では、酸耐性有機酸排出微生物は、プロピオニバクテリウム属、アネロビブリオ属、バクテロイデス属、クロストリジウム属、フソバクテリウム属、メガスファエラ属、プロピオニスピラ属、セレノモナス属、ベイロネラ属、及びそれらの組合せから成る群より選択される。いくつかの態様では、プロピオニバクテリウム属微生物はプロピオン酸菌（ＮＦＳ ２０１８）である。
【0014】
いくつかの態様では、酸耐性有機酸排出微生物は、増殖培養物として提供される。
いくつかの態様では、酸耐性乳酸産生微生物は、ラクトコッカス属、ペディオコッカス属、オエノコッカス属、エンテロコッカス属、ロイコノストック属、ビフィドバクテリム属、バシラス属、ラクトバシラス属、クロストリジウム属、パエニバシラス属、スポロラクトバチルス属、及びそれらの組合せから成る群より選択される。
いくつかの態様では、酸耐性乳酸産生微生物は、ラクトコッカス属、ペディオコッカス属、オエノコッカス属、エンテロコッカス属、ロイコノストック属、ビフィドバクテリム属、バシラス属、ラクトバシラス属、クロストリジウム属、パエニバシラス属、スポロラクトバチルス属、及びそれらの組合せから成る群より選択される。
【0015】
いくつかの態様では、酸耐性乳酸産生微生物は、ラクトコッカス属、ペディオコッカス属、オエノコッカス属、エンテロコッカス属、ロイコノストック属、ビフィドバクテリム属、バシラス属から成る群より選択される。
【0016】
いくつかの態様では、酸耐性乳酸産生微生物は、増殖培養物として提供される。
いくつかの態様では、酸耐性乳酸産生微生物は、バシラス属、ラクトバシラス属、クロストリジウム属、パエニバシラス属、スポロラクトバチルス属、及びそれらの組合せから成る群より選択される。いくつかの態様では、酸耐性乳酸産生微生物はラクトバチルス・カゼイである。
いくつかの態様では、酸耐性乳酸産生微生物は、バシラス属、ラクトバシラス属、クロストリジウム属、パエニバシラス属、スポロラクトバチルス属、及びそれらの組合せから成る群より選択される。いくつかの態様では、酸耐性乳酸産生微生物はラクトバチルス・カゼイである。
【0017】
いくつかの態様では、酸耐性乳酸産生微生物は胞子として提供され、所望により、該胞子は炭素源の一部として提供される。
いくつかの態様では、培地のｐＨは約６．０である。
いくつかの態様では、培地のｐＨは約６．０である。
【0018】
いくつかの態様では、増殖培地は、窒素源、ビタミン、ＭｇＳＯ４、ＮａＰＯ４、及びＫＰＯ４をさらに含む。
いくつかの態様では、グルコース炭素源及びラクトース炭素源は同じである。いくつかの態様では、グルコース炭素源及びラクトース炭素源は異なる。
いくつかの態様では、グルコース炭素源及びラクトース炭素源は同じである。いくつかの態様では、グルコース炭素源及びラクトース炭素源は異なる。
【0019】
いくつかの態様では、グルコース炭素源は、植物ベースのグルコース炭素源である。いくつかの態様では、植物炭素源は、加水分解コムギ、加水分解トウモロコシ、加水分解マメ、加水分解デンプン、及びそれらの組合せから成る群より選択される。
【0020】
いくつかの態様では、ラクトース炭素源は乳清である。
いくつかの態様では、窒素源は、酵母エキス、ペプチド、硫酸アンモニア、水酸化アンモニア、アミノ酸、及びそれらの組合せから選択される。いくつかの態様では、窒素源は酵母エキスである。
いくつかの態様では、窒素源は、酵母エキス、ペプチド、硫酸アンモニア、水酸化アンモニア、アミノ酸、及びそれらの組合せから選択される。いくつかの態様では、窒素源は酵母エキスである。
【0021】
いくつかの態様では、ビタミンはビタミンＢ１２である。
いくつかの態様では、酸耐性乳酸産生微生物を、酸耐性有機酸排出微生物を培地に添加してから６～３６時間後、所望により１２～２４時間後に培地に添加し；そして、培養物を、望ましい量の有機酸を産生するのに十分な時間にわたり維持する。
いくつかの態様では、酸耐性乳酸産生微生物を、酸耐性有機酸排出微生物を培地に添加してから６～３６時間後、所望により１２～２４時間後に培地に添加し；そして、培養物を、望ましい量の有機酸を産生するのに十分な時間にわたり維持する。
【0022】
いくつかの態様では、有機酸は、プロピオン酸、酢酸、乳酸、コハク酸、及びそれらの組合せから成る群より選択される。
「グルコース」及び「デキストロース」という語は、本明細書において互換的に使用される。
「グルコース」及び「デキストロース」という語は、本明細書において互換的に使用される。
【0023】
別途定義されない限り、本明細書に用いられるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の技術者により一般に理解されるのと同じ意味をもつ。方法及び材料は本発明において使用するために本明細書に記載されており、当技術分野において公知の他の適切な方法及び材料を使用することもできる。材料、方法、及び実施例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、及び他の参考文献は、その全体を援用する。矛盾がある場合、定義を含む本明細書を優先する。
【0024】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】図１は、発酵糖培地を用い、３０Ｌの作業容量中の５％接種物を用い、温度を３０℃に維持し、ｐＨ６（中和塩基としてＮａＯＨ）であるバイオリアクターにおける、プロピオン酸菌（ＮＦＳ－２０１８）による有機酸産生を示す。
【発明を実施するための形態】
【0026】
プロピオン酸（ＰＡ）は、ベーカリー食品、乳製品、肉、鶏肉、及びペットフードなどの用途において、食品製品中の酵母及びカビの増殖を制御するための抗真菌剤として使用される。プロピオン酸はまた、除草剤、香料、及び他の製品に使用されるさまざまな最終化学製品の生産における中間体として広く使用されている。
【0027】
プロピオン酸の生成は一般に、炭素源及び窒素源含有培地を適切な微生物細胞株で発酵させることによって達成される。典型的には、プロピオニバクテリウム属生物を用いて、培地中の炭素源をプロピオン酸及び他の代謝産物に変換させる。発酵培地中のプロピオニバクテリウム属細胞の増殖速度は、通常、プロピオン酸蓄積の阻害効果及び発酵時間にわたる栄養素の利用可能性に起因して制限される。酸耐性プロピオニバクテリウム属株を開発し、微生物を共培養することにより、プロピオン酸産生を改善する方法が開発されている。しかしながら、微生物のため栄養素の不均衡に起因して、産生収率は依然として限定されていた。本明細書には、炭素源を流加(fed-batching)し、最適化された時間ステップでラクトバチルス・カゼイを添加して（共発酵）、プロピオン酸の産生収率を上昇させるための方法を記載する。
【0028】
他の細菌もプロピオン酸を作ることができるが、プロピオニバクテリウム属はプロピオン酸を排出する最も一般的に使用される細菌であり、広く研究されてきた（Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。培地製剤の進歩、株の開発、及び発酵パラメーターの最適化は、ブロス（培地）中で２５～５０ｇ／Ｌのプロピオン酸産生収率をもたらした（Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｓｔｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４；２０１４ Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｋａｇｌｉｗａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。発酵中に１００＋ｇ／Ｌに達するプロピオン酸産生の報告もあるが、これらの値は発酵を数週間から数カ月間延長することによって生じており、商業的スケールアップに適していなかった（Ｚｈａｎｇ及びＹａｎｇ，２００９；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４；並びにＪｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
【0029】
上記の戦略を用いた改善だけでなく、混合培養を用いることによってプロピオン酸の生産性を高める努力もなされてきた。例えば共培養法は、供給原料として乳清を使用してＰＡを生成するために使用されている（ＷＯ８５／０４９０１；ＥＰ０１４１６４２ Ａ１）。ＷＯ８５／０４９０１号には、ベイロネラ・クリセティの存在下でラクトバチルス・カゼイ亜種ラムノサスを使用して、２段階発酵プロセスを介して乳酸をプロピオン酸に変換することが記載されている。第１段階において炭水化物をラクトバチルス・カゼイによって乳酸に変換し；第２段階において乳酸をベイロネラ・クリセティによってＰＡに発酵させる。（ラクトバシラス属及びベイロネラ属は両方ともファーミキューテス門に属する一方、プロピオニバクテリウム属はアクチノバクテリア門に属する。）ＥＰ０１４１６４２号にはまた、発酵収率を最大化するための、乳酸産生菌（ラクトバチルス・カゼイ）及びＰＡ産生菌（プロピオニバクテリウム・シャーマニイ）の混合培養の使用について記載されている。ＷＯ８５／０４９０１号及びＥＰ０１４１６４２号の共培養系は、ラクトースからのＰＡ産生に関して非常に生産的であり、最終収量は２０～１００ｇ／Ｌであることが報告されている。しかしながら、そのような共培養系は、プロセスパラメーターとかなり密接な関係を有する。例えば、それらは、系中の各生物の増殖及び代謝活性に対する制御を欠くという問題を有し、これにより、いずれかの生物の増殖不全がもたらされるか、又はいずれかの生物が望ましい生成物の形成に寄与できない可能性がある。再現性の欠如は、共培養系では一般的である。Ｂｏｒｄｅｒ ｅｔ ａｌ，１９８７による研究は、ラクトバシラス属株を発酵に添加した場合、プロピオン酸産生が２０ｇ／Ｌから３０ｇ／Ｌに増加することを示した。混合培養を用いた他のプロセスは、混合培養を用いた場合ブロス中のプロピオン酸が６５ｇ／Ｌまで増加することを示したが、このプロセスは乳清のみを用いて行われた（ＥＰ０１４１６４２Ａ１号）。
【0030】
本開示では、プロピオン酸産生を最大化するためのプロセスであって、簡易培地を使用し、小麦粉及びデンプンなど複数の炭素源からのグルコースを使用し、このプロセス中に他の有機酸を同時に産生させるプロセスを開発した。このプロセスは、すべてのプロピオン酸及び乳酸産生細菌に使用することができ、発酵は、混合培養発酵中に培地を嫌気性にするための窒素ガスの添加の有無にかかわらず実施することができる。本明細書に示すように、プロピオン酸菌（例えばＮＦＳ－２０１８）を乳酸菌を加えずにグルコースと共に発酵させた場合、１６８時間以内のプロピオン酸収率は約５．３％であった。乳酸菌を発酵槽に添加すると、共培養法を用いて、プロピオン酸産生は１．４％上昇し、プロピオン酸の最終収率は６．７％であった。
【0031】
本明細書には、有機酸産生を増加させるために微生物細胞株の共培養を使用する方法が記載される。本方法では、有機酸を産生する微生物細胞株（例えばアシディプロピオニバクテリウム属）を、炭素源を添加したｐＨ制御培地中で２４時間使用し、別の微生物細胞株（例えばラクトバシラス属）を添加して、有機酸産生をさらに増強させる。いくつかの態様では、発酵期間の全体にわたり、バイオリアクターは３０℃の温度に維持される。いくつかの態様では、これらの培養条件下で、ｐＨは６に維持される。いくつかの態様では、微生物細胞株は、すべての発酵槽及びバイオリアクターについて同じ期間培養することができる。いくつかの態様では、微生物細胞株を発酵槽及びバイオリアクターに同時に接種した。
【0032】
いくつかの態様では、プロピオン酸は、ラクトバチルス・カゼイと高酸耐性プロピオン酸菌ＮＦＳ－２０１８との共培養によって生成することができる。本明細書に示すように、プロピオン酸収量は、単培養での５０ｇ／Ｌから、本明細書に記載する共培養発酵法を使用して６５ｇ／Ｌに改善された。ラクトバチルス・カゼイを、最適化された時間ステップで微生物発酵に添加して、プロピオン酸収率を最大化した。プロピオン酸以外に、共培養発酵からの発酵ブロスは、７～８ｇ／Ｌの酢酸及び９～１０ｇ／Ｌのコハク酸を共代謝産物として含有していた。
有機酸排出微生物
本発明の方法は、有機酸産生菌、例えばプロピオン酸菌属の使用を包含する。プロピオニバクテリウム属は、ＰＡ（並びにビタミンＢ１２及びスイスチーズ）の生産にもっともよく用いられる微生物である。プロピオニバクテリウム属は、グラム陽性で、非運動性で、非胞子形成性で、桿状で、嫌気性の細菌属であり、プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ、Ｐ．ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｐ．ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｉｃｕｍ、Ｐ．ａｕｓｔｒａｌｉｅｎｓｅ、プロピオン酸菌、Ｐ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｐ．ｔｈｏｅｎｉｉ、Ｐ．ｍｉｃｒｏａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐ．ｏｌｉｖａｅ、Ｐ．ｄａｍｎｏｓｕｍ、Ｐ．ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、アクネ菌、プロピオニバクテリウム・アビダム、プロピオニバクテリウム・グラニュローサム、Ｐ．ｈｕｍｅｒｕｓｉｉ、及びＰ．ｌｙｍｐｈｏｐｈｉｌｕｍの種を包含する。工業的ＰＡ生産の場合、もっとも一般的に使用される株は、プロピオン酸菌である。（プロピオニバクテリウム属内の種を３つの新規属：アシディプロピオニバクテリウム属、キューティバクテリウム属、及びシュードプロピオニバクテリウム属に再分類する提案がなされている（Ｓｃｈｏｌｚ＆Ｋｉｌｉａｎ，２０１６））。しかしながら、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ及びＡｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉは、依然としてやや互換的に使用されている。プロピオニバクテリウム属細胞増殖に最適なｐＨ及び温度は、それぞれ約６．０～７．０及び約３０～３７℃である（Ａｈｍａｄｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。中性ｐＨで開始された発酵槽はｐＨ４．４に達する可能性があるが、細胞増殖は約５．０未満のｐＨで阻害される（Ｒｅｈｂｅｒｇｅｒ及びＧｌａｔｚ，１９９８）。Ａｈｍａｄｉ ｅｔ ａｌ．は、文献（Ａｈｍａｄｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７）に報告されているように、プロピオニバクテリウム属のさまざまな種によるいくつかの炭素源でのＰＡ産生の概要を提供しており、これを本明細書に援用する。 ＰＡはまた、他の嫌気性細菌、例えば、アネロビブリオ属、バクテロイデス属、クロストリジウム属、フソバクテリウム属、メガスファエラ属、プロピオニスピラ属、セレノモナス属、及びベイロネラ属の特定種によって産生され得る。
有機酸排出微生物
本発明の方法は、有機酸産生菌、例えばプロピオン酸菌属の使用を包含する。プロピオニバクテリウム属は、ＰＡ（並びにビタミンＢ１２及びスイスチーズ）の生産にもっともよく用いられる微生物である。プロピオニバクテリウム属は、グラム陽性で、非運動性で、非胞子形成性で、桿状で、嫌気性の細菌属であり、プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ、Ｐ．ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｐ．ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｉｃｕｍ、Ｐ．ａｕｓｔｒａｌｉｅｎｓｅ、プロピオン酸菌、Ｐ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｐ．ｔｈｏｅｎｉｉ、Ｐ．ｍｉｃｒｏａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐ．ｏｌｉｖａｅ、Ｐ．ｄａｍｎｏｓｕｍ、Ｐ．ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、アクネ菌、プロピオニバクテリウム・アビダム、プロピオニバクテリウム・グラニュローサム、Ｐ．ｈｕｍｅｒｕｓｉｉ、及びＰ．ｌｙｍｐｈｏｐｈｉｌｕｍの種を包含する。工業的ＰＡ生産の場合、もっとも一般的に使用される株は、プロピオン酸菌である。（プロピオニバクテリウム属内の種を３つの新規属：アシディプロピオニバクテリウム属、キューティバクテリウム属、及びシュードプロピオニバクテリウム属に再分類する提案がなされている（Ｓｃｈｏｌｚ＆Ｋｉｌｉａｎ，２０１６））。しかしながら、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ及びＡｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉは、依然としてやや互換的に使用されている。プロピオニバクテリウム属細胞増殖に最適なｐＨ及び温度は、それぞれ約６．０～７．０及び約３０～３７℃である（Ａｈｍａｄｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。中性ｐＨで開始された発酵槽はｐＨ４．４に達する可能性があるが、細胞増殖は約５．０未満のｐＨで阻害される（Ｒｅｈｂｅｒｇｅｒ及びＧｌａｔｚ，１９９８）。Ａｈｍａｄｉ ｅｔ ａｌ．は、文献（Ａｈｍａｄｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７）に報告されているように、プロピオニバクテリウム属のさまざまな種によるいくつかの炭素源でのＰＡ産生の概要を提供しており、これを本明細書に援用する。 ＰＡはまた、他の嫌気性細菌、例えば、アネロビブリオ属、バクテロイデス属、クロストリジウム属、フソバクテリウム属、メガスファエラ属、プロピオニスピラ属、セレノモナス属、及びベイロネラ属の特定種によって産生され得る。
【0033】
好ましい態様では、有機酸産生微生物は酸耐性であり、例えば５～７．５のｐＨで増殖することができ、プロピオン酸を産生する。いくつかの態様では、酸産生微生物は、ＡＴＣＣにＰＴＡ－１２５８９５として寄託された、ＷＯ２０１９／２４５９８５号に記載されているような高酸耐性プロピオン酸菌（ＮＦＳ－２０１８）である。いくつかの態様では、酸産生微生物はアシディプロピオニバクテリウム・シャーマニイ（ＡＴＣＣ ３９３９３）ではない（ＥＰ０１４１６４２Ａ１号参照）。
【0034】
いくつかの態様では、有機酸産生微生物は野生型である。いくつかの態様では、有機酸産生微生物は操作されている。
乳酸産生微生物
本方法は、乳酸産生微生物、例えば乳酸産生菌（ＬＡＢ）の使用を包含する。いくつかの態様では、微生物はラクトバシラス属、例えばラクトバチルス・カゼイに由来する。
乳酸産生微生物
本方法は、乳酸産生微生物、例えば乳酸産生菌（ＬＡＢ）の使用を包含する。いくつかの態様では、微生物はラクトバシラス属、例えばラクトバチルス・カゼイに由来する。
【0035】
いくつかの態様では、乳酸産生微生物は、乳酸菌（ＬＡＢ）、バシラス属、大腸菌、コリネバクテリウム・グルタミカム、及びそれらの組合せから選択される。例えば、Ａｂｄｅｌ－Ｒａｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｌａｃｔｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ ３１：８７７－９０２（２０１３）参照。
【0036】
いくつかの態様では、ＬＡＢはホモ発酵性である。いくつかの態様では、ＬＡＢはヘテロ発酵性である。例えば、Ｅｉｔｍａｎ及びＲａｍａｌｉｎｇａｍ，“Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｃｔｉｃ Ａｃｉｄ，”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３７：９５５－７２（２０１５）参照。
【0037】
いくつかの態様では、本方法は、ＬＡＢの混合物の使用を包含する。いくつかの態様では、混合物はホモ発酵性及びヘテロ発酵性ＬＡＢの両方を包含する。
いくつかの態様では、乳酸産生微生物は野生型である。いくつかの態様では、乳酸産生微生物は操作されている。
炭素源
グルコース、フルクトース、マルトース、スクロース、キシロース、ラクトース、グリセロール、ラクテート、小麦粉加水分解物、糖蜜、乳清、及びそれらの組合せを含む、いくつかの炭素源が微生物ＰＡ産生に使用されてきた。
いくつかの態様では、乳酸産生微生物は野生型である。いくつかの態様では、乳酸産生微生物は操作されている。
炭素源
グルコース、フルクトース、マルトース、スクロース、キシロース、ラクトース、グリセロール、ラクテート、小麦粉加水分解物、糖蜜、乳清、及びそれらの組合せを含む、いくつかの炭素源が微生物ＰＡ産生に使用されてきた。
【0038】
いくつかの態様では、加水分解された小麦粉を炭素源として使用する。小麦粉の加水分解方法は当技術分野において公知であり、例えば、Ｋａｇｌｉｗａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１３に記載されているように、酵素加水分解の使用を包含することができる。いくつかの態様では、酵素加水分解は、９０℃／ｐＨ６．０で細菌α－アミラーゼ、次いで６０℃／ｐＨ７．０でグルコアミラーゼ及びプロテアーゼを使用することを包含する。
【0039】
いくつかの態様では、炭素源としてトウモロコシ又は他のデンプンが使用される。
いくつかの態様では、乳製品炭素源、例えばチーズ生産からの乳清が使用される。
いくつかの態様では、供給源の混合物が炭素供給源として使用される。いくつかの態様では、炭素源の混合物は、グルコース炭素源及びラクトース炭素源を含む。
いくつかの態様では、乳製品炭素源、例えばチーズ生産からの乳清が使用される。
いくつかの態様では、供給源の混合物が炭素供給源として使用される。いくつかの態様では、炭素源の混合物は、グルコース炭素源及びラクトース炭素源を含む。
【0040】
いくつかの態様では、グルコース炭素源は、植物炭素源、例えば加水分解された穀物及び／又はマメに由来する。
いくつかの態様では、ラクトース炭素源は、乳製品源、例えばチーズ生産からの乳清に由来する。
窒素源
微生物によるＰＡ産生には、いくつかの窒素源が使用されている。いくつかの態様では、窒素源は酵母エキスである。いくつかの態様では、窒素源は、酵母エキス、ペプチド、硫酸アンモニア、水酸化アンモニア、アミノ酸、及びそれらの組合せから選択される。
培地及び増殖条件
本方法で使用するための代表的な簡易培地は、グルコース、酵母エキス、ＭｇＳＯ４、ＮａＰＯ４、ビタミンＢ１２、及びＫＰＯ４を包含することができ、出発培地は、約６のｐＨを有する。
いくつかの態様では、ラクトース炭素源は、乳製品源、例えばチーズ生産からの乳清に由来する。
窒素源
微生物によるＰＡ産生には、いくつかの窒素源が使用されている。いくつかの態様では、窒素源は酵母エキスである。いくつかの態様では、窒素源は、酵母エキス、ペプチド、硫酸アンモニア、水酸化アンモニア、アミノ酸、及びそれらの組合せから選択される。
培地及び増殖条件
本方法で使用するための代表的な簡易培地は、グルコース、酵母エキス、ＭｇＳＯ４、ＮａＰＯ４、ビタミンＢ１２、及びＫＰＯ４を包含することができ、出発培地は、約６のｐＨを有する。
【0041】
いくつかの態様では、培地は約５．５～約６．９のｐＨを有する。いくつかの態様では、培地は、約５．５～約６．８、約５．５～約６．７、約５．５～約６．６、約５．５～約６．５、約５．５～約６．４、約５．５～約６．３、約５．５～約６．２、約５．５～約６．１、約５．５～約６．０、約５．５～約５．９、約５．５～約５．８、約５．５～約５．７、約５．５～約５．６、約５．６～約６．９、５．６～約６．８、約５．６～約６．７、約５．６～約６．６、約５．６～約６．５、約５．６～約６．４、約５．６～約６．３、約５．６～約６．２、約５．６～約６．１、約５．６～約６．０、約５．６～約５．９、約５．６～約５．８、約５．６～約５．７、約５．７～約６．９、５．７～約６．８、約５．７～約６．７、約５．７～約６．６、約５．７～約６．５、約５．７～約６．４、約５．７～約６．３、約５．７～約６．２、約５．７～約６．１、約５．７～約６．０、約５．７～約５．９、約５．７～約５．８、約５．８～約６．９、５．８～約６．８、約５．８～約６．７、約５．８～約６．６、約５．８～約６．５、約５．８～約６．４、約５．８～約６．３、約５．８～約６．２、約 ５．８～約６．１、約５．８～約６．０、約５．８～約５．９、約５．９～約６．９、５．９～約６．８、 約５．９～約６．７、約５．９～約６．６、約５．９～約６．５、約５．９～約６．４、約５．９～約６．３、約５．９～約６．２、約５．９～約６．１、約５．９～約６．０、約６．０～約６．９、６．０～約６．８、約６．０～約６．７、約６．０～約６．６、約６．０～約６．５、約６．０～約６．４、約６．０～約６．３、約６．０～約６．２、約６．０～約６．１、約６．１～約６．９、６．１～約６．８、約６．１～約６．７、約６．１～約６．６、約６．１～約６．５、約６．１～約６．４、約６．１～約６．３、約６．１～約６．２、約６．２～約６．９、６．２～約６．８、約６．２～約６．７、約６．２～約６．６、約６．２～約６．５、約６．２～約６．４、約６．２～約６．３、約６．３～約６．９、６．３～約６．８、約６．３～約６．７、約６．３～約６．６、約６．３～約６．５、約６．３～約６．４、約６．４～約６．９、６．４～約６．８、約６．４～約６．７、約６．４～約６．６、約６．４～約６．５、約６．５～約６．９、６．５～約６．８、約６．５～約６．７、約６．５～約６．６、６．６～約６．９、６．６～約６．８、約６．６～約６．７、約６．７～約６．９、６．７～約６．８、又は約６．８～約６．９のｐＨを有する。
【0042】
いくつかの態様では、培地は、約１～約１０重量／体積％の炭素源、例えばグルコースを含む。いくつかの態様では、培地は、約１～約１０、約１～約９．５、約１～約９、約１～約８．５、約１～約８、約１～約７．５、約１～約７、約１～約６．５、約１～約６、約１～約５．５、約１～約５、約１～約４．５、約１～約４、約１～約３．５、約１～約３、約１～約２．５、約１～約２、約１～約１．５、約１．５～約１０、約１．５～約９．５、約１．５～約９、約１．５～約８．５、約１．５～約８、約１．５～約７．５、約１．５～約７、約１．５～約６．５、約１．５～約６．０、約１．５～約５．５、約１．５～約５、約１．５～約４．５、約１．５～約４、約１．５～約３．５、約１．５～約３、約１．５～約２．５、約１．５～約２、約２～約１０、約２～約９．５、約２～約９、約２～約８．５、約２～約８、約２～約７．５、約２～約７、約２～約６．５、約２～約６、約２～約５．５、約２～約５、約２～約４．５、約２～約４、約２～約３．５、約２～約３、約２～約２．５、約２．５～約１０、約２．５～約９．５、約２．５～約９、約２．５～約８．５、約２．５～約８、約２．５～約７．５、約２．５～約７、約２．５～約６．５、約２．５～約６、約２．５～約５．５、約２．５～約５、約２．５～約４．５、約２．５～約４、約２．５～約３．５、約２．５～約３、約３～約１０、約３～約９．５、約３～約９、約３～約８．５、約３～約８、約３～約７．５、約３～約７、約３～約６．５、約３～約６、約３～約５．５、約３～約５．０、約３～約４．５、約３～約４、約３～約３．５、約３．５～約１０、約３．５～約９．５、約３．５～約９、約２．５～約８．５、約３．５～約８、約３．５～約７．５、約３．５～約７、約３．５～約６．５、約３．５～約６、約３．５～約５．５、約３．５～約５、約３．５～約４．５、約３．５～約４、約４～約１０、約４～約９．５、約４～約９、約４～約８．５、約４～約８、約４～約７．５、約４～約７、約４～約６．５、約４～約６、約４～約５．５、約４～約５、約４～約４．５、約４．５～約１０、約４．５～約９．５、約４．５～約９、約４．５～約８．５、約４．５～約８、約４．５～約７．５、約４．５～約７、約４．５～約６．５、約４．５～約６、約４．５～約５．５、約４．５～約５、約５～約１０、約５～約９．５、約５～約９、約５～約８．５、約５～約８、約５～約７．５、約５～約７、約５～約６．５、約５～約６、約５～約１０、約５～約９．５、約５～約９、約５～約８．５、約５～約８、約５～約７．５、約５～約７、約５～約６．５、約５～約６、約５～約５．５、約５．５～約１０、約５．５～約９．５、約５．５～約９、約５．５～約８．５、約５．５～約８、約５．５～約７．５、約５．５～約７、約５．５～約６．５、約５．５～約６、約６～約１０、約６～約９．５、約６～約９、約６～約８．５、約６～約８、約６～約７．５、約６～約７、約６～約６．５、約６．５～約１０、約６．５～約９．５、約６．５～約９、約６．５～約８．５、約６．５～約８、約６．５～約７．５、約６．５～約７、約７～約１０、約７～約９．５、約７～約９、約７～約８．５、約７～約８、約７～約７．５、約７．５～約１０、約７．５～約９．５、約７．５～約９、約７．５～約８．５、約７．５～約８、約８～約１０、約８～約９．５、約８～約９、約８～約８．５、約８．５～約１０、約８．５～約９．５、約８．５～約９、約９～約１０、約９～約９．５、又は約９．５～約１０重量／体積％の炭素源、例えばグルコースを含む。
【0043】
いくつかの態様では、培地は、約１～約２．５重量／体積％の窒素源、例えば酵母エキスを含む。いくつかの態様では、培地は、約１～約２．４、約１～約２．３、約１～約２．２、約１～約２．１、約１～約２、約１～約１．９、約１～約１．８、約１～約１．７、約１～約１．６、約１～約１．５、約１～約１．４、約１～約１．３、約１～約１．２、約１～約１．１、約１．１～約２．５、約１．１～約２．４、約１．１～約２．３、約１．１～約２．２、約１．１～約２．１、約１．１～約２、約１．１～約１．９、約１．１～約１．８、約１．１～約１．７、約１．１～約１．６、約１．１～約１．５、約１．１～約１．４、約１．１～約１．３、約１．１～約１．２、約１．２～約２．５、約１．２～約２．４、約１．２～約２．３、約１．２～約２．２、約１．２～約２、約１．２～約１．９、約１．２～約１．８、約１．２～約１．７、約１．２～約１．６、約１．２～約１．５、約１．２～約１．４、約１．２～約１．３、約１．３～約２．５、約１．３～約２．４、約１．３～約２．３、約１．３～約２．２、約１．３～約２．１、約１．３～約２、約１．３～約１．９、約１．３～約１．８、約１．３～約１．７、約１．３～約１．６、約１．３～約１．５、約１．３～約１．４、約１．４～約２．５、約１．４～約２．４、約１．４～約２．３、約１．４～約２．２、約１．４～約２．１、約１．４～約２、約１．４～約１．９、約１．４～約１．８、約１．４～約１．７、約１．４～約１．６、約１．４～約１．５、約１．５～約２．５、約１．５～約２．４、約１．５～約２．３、約１．５～約２．２、約１．５～約２．１、約１．５～約２、約１．５～約１．９、約１．５～約１．８、約１．５～約１．７、約１．５～約１．６、約１．６～約２．５、約１．６～約２．４、約１．６～約２．３、約１．６～約２．２、約１．６～約２．１、約１．６～約２、約１．６～約１．９、約１．６～約１．８、約１．６～約１．７、約１．７～約２．５、約１．７～約２．４、約１．７～約２．３、約１．７～約２．２、約１．７～約２．１、約１．７～約２、約１．７～約１．９、約１．７～約１．８、約１．８～約２．５、約１．８～約２．４、約１．８～約２．３、約１．８～約２．２、約１．８～約２．１、約１．８～約２、約１．８～約１．９、約１．９～約２．５、約１．９～約２．４、約１．９～約２．３、約１．９～約２．２、約１．９～約２．１、約１．９～約２、約２～約２．５、約２～約２．４、約２～約２．３、約２～約２．２、約２～約２．１、約２．１～約２．５、約２．１～約２．４、約２．１～約２．３、約２．１～約２．２、約２．２～約２．５、約２．２～約２．４、約２．２～約２．３、約２．３～約２．５、約２．３～約２．４、又は約２．４～約２．５重量／体積％の窒素源、例えば酵母エキスを含む。いくつかの態様では、培地は、約２重量／体積％の窒素源、例えば酵母エキスを含む。
【0044】
いくつかの態様では、培地は、約０．２～約０．８ｇ／ＬのＭｇＳＯ４を含む。いくつかの態様では、培地は、約０．２～約０．７、約０．２～約０．６、約０．２～約０．５、約０．２～約０．４、約０．２～約０．３、約０．３～約０．８、約０．３～約０．７、約０．３～約０．６、約０．３～約０．５、約０．３～約０．４、約０．４～約０．８、約０．４～約０．７、約０．４～約０．６、約０．４～約０．５、約０．５～約０．８、約０．５～約０．７、約０．５～約０．６、約０．６～約０．８、約０．６～約０．７、又は約０．７～約０．８ｇ／ＬのＭｇＳＯ４を含む。いくつかの態様では、培地は約０．４ｇ／ＬのＭｇＳＯ４を含む。
【0045】
いくつかの態様では、培地は、約０．５～約３．０ｇ／ＬのＮａＰＯ４を含む。いくつかの態様では、培地は、約０．５～約２．５、約０．５～約２、約０．５～約１．５、約０．５～約１、約１～約３、約１～約２．５、約１～約２、約１～約１．５、約１．５～約３、約１．５～約２．５、約１．５～約２、約２～約２．５、又は約２．５～約３ｇ／ＬのＮａＰＯ４を含む。いくつかの態様では、培地は約１ｇ／ＬのＮａＰＯ４を含む。
【0046】
いくつかの態様では、培地は、約０．００１５～約０．００４ｇ／Ｌのビタミン源、例えばビタミンＢ１２を含む。いくつかの態様では、培地は、約０．００２０～約０．００４０、約０．００２０～約０．００３５、約０．００２０～約０．００３０、約０．００２０～約０．００２５、約０．００２５～約０．００４０、約０．００２５～約０．００３５、約０．００２５～約０．００３０、約０．００３０～約０．００４０、約０．００３０～約０．００３５、又は約０．００３５～約０．００４０ｇ／Ｌのビタミン源、例えばビタミンＢ１２を含む。
【0047】
いくつかの態様では、培地は、約０．５～約３．０ｇ／ＬのＫＰＯ４を含む。いくつかの態様では、培地は、約０．５～約２．５、約０．５～約２、約０．５～約１．５、約０．５～約１、約１～約３、約１～約２．５、約１～約２、約１～約１．５、約１．５～約３、約１．５～約２．５、約１．５～約２、約２～約２．５、又は約２．５～約３ｇ／ＬのＫＰＯ４を含む。いくつかの態様では、培地は約１ｇ／ＬのＫＰＯ４を含む。
【0048】
培地の調製方法は当技術分野において公知であり、本明細書において提供される。
いくつかの態様では、生物を培養する培地は、リン酸水素二カリウム；リン酸二水素カリウム；硫酸第一鉄；５，６ジアミノベンゾイミダゾール（diamenobenzimidazole）；塩化コバルト；硫酸マンガン（mangenese）；酵素；プロテアーゼ；又は炭酸カルシウムのうちの１以上、例えばすべてを包含しない。
いくつかの態様では、生物を培養する培地は、リン酸水素二カリウム；リン酸二水素カリウム；硫酸第一鉄；５，６ジアミノベンゾイミダゾール（diamenobenzimidazole）；塩化コバルト；硫酸マンガン（mangenese）；酵素；プロテアーゼ；又は炭酸カルシウムのうちの１以上、例えばすべてを包含しない。
【0049】
いくつかの態様では、培地には、約１～約１０体積／体積％の有機酸産生微生物、例えばプロピオン酸産生微生物、例えばプロピオン酸菌、例えばプロピオン酸菌（ＮＦＳ－２０１８）の培養物を接種する。いくつかの態様では、培地に、約１～約９、約１～約８、約１～約７、約１～約６、約１～約５、約１～約４、約１～約３、約１～約２、約２～約１０、約２～約９、約２～約８、約２～約７、約２～約６、約２～約５、約２～約４、約２～約３、約３～約１０、約３～約９、約３～約８、約３～約７、約３～約６、約３～約５、約３～約４、約４～約１０、約４～約９、約４～約８、約４～約７、約４～約６、約４～約５、約５～約１０、約５～約９、約５～約８、約５～約７、約５～約６、約６～約１０、約６～約９、約６～約８、約６～約７、約７～約１０、約７～約９、約７～約８、約８～約１０、約８～約９、又は約９～約１０体積／体積％の有機酸産生微生物、例えばプロピオン酸産生微生物、例えばプロピオン酸菌、例えばプロピオン酸菌（ＮＦＳ－２０１８）の培養物を接種する。
【0050】
いくつかの態様では、有機酸産生微生物、例えばプロピオン酸産生微生物、例えばプロピオン酸菌、例えばプロピオン酸菌（ＮＦＳ－２０１８）の培養物は、約５～約７ＯＤ／ｍＬ（光学濃度）の細胞を含む。いくつかの態様では、有機酸産生微生物、例えばプロピオン酸産生微生物、例えばプロピオン酸菌、例えばプロピオン酸菌（ＮＦＳ－２０１８）の培養物は、約５～約６．８、約５～約６．６、約５～約６．４、約５～約６．２、約５～約６、約５～約５．８、約５～約５．６、約５～約５．４、約５～約５．２、約５．２～約７、約５．２～約６．８、約５．２～約６．６、約５．２～約６．４、約５．２～約６．２、約５．２～約６、約５．２～約５．８、約５．２～約５．６、約５．２～約５．４、約５．４～約７、約５．４～約６．８、約５．４～約６．６、約５．４～約６．４、約５．４～約６．２、約５．４～約６、約５．４～約５．８、約５．４～約５．６、約５．６～約７、約５．６～約６．８、約５．６～約６．６、約５．６～約６．４、約５．６～約６．２、約５．６～約６、約５．６～約５．８、約５．８～約７、約５．８～約６．８、約５．８～約６．６、約５．８～約６．４、約５．８～約６．２、約５．８～約６、約６～約７、約６～約６．８、約６～約６．６、約６～約６．４、約６～約６．２、約６．２～約７、約６．２～約６．８、約６．２～約６．６、約６．２～約６．４、約６．４～約７、約６．４～約６．８、約６．４～約６．６、約６．６～約７、約６．６～約６．８、又は約６．８～約７ＯＤ／ｍＬ（光学濃度）の有機酸産生微生物、例えばプロピオン酸産生微生物、例えばプロピオン酸菌、例えばプロピオン酸菌（ＮＦＳ－２０１８）を含む。
【0051】
いくつかの態様では、培地には、約１～約１０体積／体積％の乳酸産生微生物、例えば乳酸菌、例えばラクトバチルス・カゼイの培養物を接種する。いくつかの態様では、培地に、約１～約９、約１～約８、約１～約７、約１～約６、約１～約５、約１～約４、約１～約３、約１～約２、約２～約１０、約２～約９、約２～約８、約２～約７、約２～約６、約２～約５、約２～約４、約２～約３、約３～約１０、約３～約９、約３～約８、約３～約７、約３～約６、約３～約５、約３～約４、約４～約１０、約４～約９、約４～約８、約４～約７、約４～約６、約４～約５、約５～約１０、約５～約９、約５～約８、約５～約７、約５～約６、約６～約１０、約６～約９、約６～約８、約６～約７、約７～約１０、約７～約９、約７～約８、約８～約１０、約８～約９、又は約９～約１０体積／体積％の乳酸産生微生物、例えば乳酸菌、例えばラクトバチルス・カゼイを接種する。
【0052】
いくつかの態様では、乳酸産生微生物、例えば乳酸菌、例えばラクトバチルス・カゼイの培養物は、約５～約７ＯＤ／ｍＬ（光学濃度）の乳酸産生微生物、例えば乳酸菌、例えばラクトバチルス・カゼイを含む。いくつかの態様では、乳酸産生微生物、例えば乳酸菌、例えばラクトバチルス・カゼイの培養物は、約５～約６．８、約５～約６．６、約５～約６．４、約５～約６．２、約５～約６、約５～約５．８、約５～約５．６、約５～約５．４、約５～約５．２、約５．２～約７、約５．２～約６．８、約５．２～約６．６、約５．２～約６．４、約５．２～約６．２、約５．２～約６、約５．２～約５．８、約５．２～約５．６、約５．２～約５．４、約５．４～約７、約５．４～約６．８、約５．４～約６．６、約５．４～約６．４、約５．４～約６．２、約５．４～約６、約５．４～約５．８、約５．４～約５．６、約５．６～約７、約５．６～約６．８、約５．６～約６．６、約５．６～約６．４、約５．６～約６．２、約５．６～約６、約５．６～約５．８、約５．８～約７、約５．８～約６．８、約５．８～約６．６、約５．８～約６．４、約５．８～約６．２、約５．８～約６、約６～約７、約６～約６．８、約６～約６．６、約６～約６．４、約６～約６．２、約６．２～約７、約６．２～約６．８、約６．２～約６．６、約６．２～約６．４、約６．４～約７、約６．４～約６．８、約６．４～約６．６、約６．６～約７、約６．６～約６．８、又は約６．８～約７ＯＤ／ｍＬ（光学濃度）の乳酸産生微生物、例えば乳酸菌、例えばラクトバチルス・カゼイを含む。
【0053】
いくつかの態様では、乳酸産生微生物、例えば乳酸菌、例えばラクトバチルス・カゼイは、有機酸産生微生物、例えばプロピオン酸産生微生物、例えばプロピオン酸菌、例えばプロピオン酸菌（ＮＦＳ－２０１８）と同時に培地に接種される。いくつかの態様では、乳酸産生微生物、例えば乳酸菌、例えばラクトバチルス・カゼイは、有機酸産生微生物、例えばプロピオン酸産生微生物、例えばプロピオン酸菌、例えばプロピオン酸菌（ＮＦＳ－２０１８）の後に培地に接種される。いくつかの態様では、乳酸産生微生物、例えば乳酸菌、例えばラクトバチルス・カゼイは、有機酸産生微生物、例えばプロピオン酸産生微生物、例えばプロピオン酸菌、例えばプロピオン酸菌（ＮＦＳ－２０１８）の約６～約３６時間後に培地に接種される。
【0054】
いくつかの態様では、乳酸産生微生物、例えば乳酸菌、例えばラクトバチルス・カゼイは、有機酸産生微生物、例えばプロピオン酸産生微生物、例えばプロピオン酸菌、例えばプロピオン酸菌（ＮＦＳ－２０１８）の約６～約３６、約６～約３０、約６～約２４、約６～約１８、約６～約１２、約１２～約３６、約１２～約３０、約１２～約２４、約１２～約１８、約１８～約３６、約１８～約３０、約１８～約２４、約２４～約３６、約２４～約３０、又は約３０～約３６時間後に培地に接種される。
【0055】
いくつかの態様では、発酵は、約３０～約３７℃で実施される。いくつかの態様では、発酵は、約３０～約３６、約３０～約３５、約３０～約３４、約３０～約３３、約３０～約３２、約３０～約３１、約３１～約３７、約３１～約３６、約３１～約３５、約３１～約３４、約３１～約３３、約３１～約３２、約３２～約３７、約３２～約３６、約３２～約３５、約３２～約３４、約３２～約３３、約３３～約３７、約３３～約３７、約３３～約３６、約３３～約３５、約３３～約３４、約３４～約３７、約３４～約３６、約３４～約３５、約３５～約３７、約３５～約３６、又は約３６～約３７℃で実施される。
【0056】
いくつかの態様では、発酵は、約１～約１８９，０００Ｌの容量で実施される。いくつかの態様では、発酵は、約１～約１８０，０００、約１～約１７０，０００、約１～約１６０，０００、約１～約１５０，０００、約１～約１４０，０００、約１～約１３０，０００、約１～約１２０，０００、約１～約１１０，０００、約１～約１００，０００、約１～約９０，０００、約１～約８０，０００、約１～約７０，０００、約１～約６０，０００、約１～約５０，０００、約１～約４０，０００、約１～約３０，０００、約１～約２０，０００、約１～約１０，０００、約１０，０００～約１８９，０００、約１０，０００～約１８０，０００、約１０，０００～約１７０，０００、約１０，０００～約１６０，０００、約１０，０００～約１５０，０００、約１０，０００～約１４０，０００、約１０，０００～約１３０，０００、約１０，０００～約１２０，０００、約１０，０００～約１１０，０００、約１０，０００～約１００，０００、約１０，０００～約９０，０００、約１０，０００～約８０，０００、約１０，０００～約７０，０００、約１０，０００～約６０，０００、約１０，０００～約５０，０００、約１０，０００～約４０，０００、約１０，０００～約３０，０００、約１０，０００～約２０，０００、約２０，０００～約１８９，０００、約２０，０００～約１８０，０００、約２０，０００～約１７０，０００、約２０，０００～約１６０，０００、約２０，０００～約１５０，０００、約２００００～約１４０，０００、約２０，０００～約１３０，０００、約２０，０００～約１２０，０００、約２０，０００～約１１０，０００、約２０，０００～約１００，０００、約２０，０００～約９０，０００、約２０，０００～約８０，０００、約２０，０００～約７０，０００、約２０，０００～約６０，０００、約２０，０００～約５０，０００、約２０，０００～約４０，０００、約２０，０００～約３０，０００、約３０，０００～約１８９，０００、約３０，０００～約１８０，０００、約３０，０００～約１７０，０００、約３０，０００～約１６０，０００、約３０，０００～約１５０，０００、約３０，０００～約１４０，０００、約３０，０００～約１３０，０００、約３０，０００～約１２０，０００、約３０，０００～約１１０，０００、約３０，０００～約１００，０００、約３０，０００～約９０，０００、約３０，０００～約８０，０００、約３０，０００～約７０，０００、約３０，０００～約６０，０００、約３０，０００～約５０，０００、約３０，０００～約４０，０００、約４０，０００～約１８９，０００、約４０，０００～約１８０，０００、約４０，０００～約１７０，０００、約４０，０００～約１６０，０００、約５０，０００～約１６０，０００、約５０，０００～約１５０，０００、約５００００～約１４０，０００、約５０，０００～約１３０，０００、約５０，０００～約１２０，０００、約５０，０００～約１１０，０００、約５０，０００～約１００，０００、約５０，０００～約９０，０００、約５０，０００～約８０，０００、約５０，０００～約７０，０００、約５０，０００～約６０，０００、約６０，０００～約１８９，０００、約６０，０００～約１８０，０００、約６０，０００～約１７０，０００、約６０，０００～約１６０，０００、約６０，０００～約１５０，０００、約６０，０００～約１４０，０００、約６０，０００～約１３０，０００、約６０，０００～約１２０，０００、約６０，０００～約１１０，０００、約６０，０００～約１００，０００、約６０，０００～約９０，０００、約６０，０００～約８０，０００、約６０，０００～約７０，０００、約７００００～約１８９，０００、約７０，０００～約１８０，０００、約７０，０００～約１７０，０００、約７０，０００～約１６０，０００、約７０，０００～約１５０，０００、約７０，０００～約１４０，０００、約７０，０００～約１３０，０００、約７０，０００～約１２０，０００、約７０，０００～約１１０，０００、約７０，０００～約１００，０００、約７０，０００～約９０，０００、約７０，０００～約８０，０００、約８０，０００～約１８９，０００、約８０，０００～約１８０，０００、約８０，０００～約１７０，０００、約８０，０００～約１６０，０００、約８０，０００～約１５０，０００、約８０，０００～約１４０，０００、約８０，０００～約１３０，０００、約８０，０００～約１２０，０００、約８０，０００～約１１０，０００、約８０，０００～約１００，０００、約８０，０００～約９０，０００、約９０，０００～約１８９，０００、約９０，０００～約１８０，０００、約９０，０００～約１７０，０００、約９０，０００～約１６０，０００、約９０，０００～約１５０，０００、約９０，０００～約１４０，０００、約９０，０００～約１３０，０００、約９０，０００～約１２０，０００、約９０，０００～約１１０，０００、約９０，０００～約１００，０００、約１００，０００～約１８９，０００、約１００，０００～約１８０，０００、約１００，０００～約１７０，０００、約１００，０００～約１６０，０００、約１００，０００～約１５０，０００、約１００，０００～約１４０，０００、約１００，０００～約１３０，０００、約１００，０００～約１２０，０００、約１００，０００～約１１０，０００、約１１０，０００～約１８９，０００、約１１０，０００～約１８０，０００、約１１０，０００～約１７０，０００、約１１０，０００～約１６０，０００、約１１０，０００～約１５０，０００、約１１０，０００～約１４０，０００、約１１０，０００～約１３０，０００、約１１０，０００～約１２０，０００、約１２０，０００～約１８９，０００、約１２０，０００～約１８０，０００、約１２０，０００～約１７０，０００、約１２０，０００～約１６０，０００、約１２０，０００～約１５０，０００、約１２０，０００～約１４０，０００、約１２０，０００～約１３０，０００、約１３０，０００～約１８９，０００、約１３０，０００～約１８０，０００、約１３０，０００～約１７０，０００、約１３０，０００～約１６０，０００、約１３０，０００～約１５０，０００、約１３０，０００～約１４０，０００、約１４０，０００～約１８９，０００、約１４０，０００～約１８０，０００、約１４０，０００～約１７０，０００、約１４０，０００～約１６０，０００、約１４０，０００～約１５０，０００、約１５０，０００～約１８９，０００、約１５０，０００～約１８０，０００、約１５０，０００～約１７０，０００、約１５０，０００～約１６０，０００、約１６０，０００～約１８９，０００、約１６０，０００～約１８０，０００、約１６０，０００～約１７０，０００、約１７０，０００～約１８９，０００、約１７０，０００～約１８０，０００、又は約１８０，０００～約１８９，０００Ｌの容量で実施される。
【0057】
以下の表は、本方法で使用することができる培地及び培養物についての一般的なパラメーターを示す。
【0058】
【表1】
【0059】
発酵アプローチ
いくつかの異なる発酵アプローチが当技術分野で公知であり、本明細書に記載する方法に使用することができる。
いくつかの異なる発酵アプローチが当技術分野で公知であり、本明細書に記載する方法に使用することができる。
【0060】
いくつかの態様では、発酵は、バッチ式、流加式、逐次バッチ式、反復バッチ式、又は連続バッチ式発酵である。
いくつかの態様では、発酵はバイオリアクター中で実施される。いくつかの態様では、バイオリアクターはＰＥＩ－Ｐｏｒａｖｅｒバイオリアクターである。いくつかの態様では、バイオリアクターは繊維床バイオリアクターである。いくつかの態様では、繊維床バイオリアクターは多点繊維床バイオリアクターである。いくつかの態様では、繊維床バイオリアクターは、植物繊維床バイオリアクターである。
いくつかの態様では、発酵はバイオリアクター中で実施される。いくつかの態様では、バイオリアクターはＰＥＩ－Ｐｏｒａｖｅｒバイオリアクターである。いくつかの態様では、バイオリアクターは繊維床バイオリアクターである。いくつかの態様では、繊維床バイオリアクターは多点繊維床バイオリアクターである。いくつかの態様では、繊維床バイオリアクターは、植物繊維床バイオリアクターである。
【0061】
いくつかの態様では、発酵は固定化細胞発酵である。
いくつかの態様では、発酵は、反応過程中に追加の培地及び／又は培地成分を添加する。
いくつかの態様では、発酵は、反応過程中に追加の培地及び／又は培地成分を添加する。
【0062】
いくつかの態様では、培地に、例えば本明細書に記載するような炭素源、窒素源、ビタミン源、硫酸マグネシウム、又は二リン酸ナトリウムのうちの１以上を添加する。
処理
本明細書に記載する方法は、本明細書に記載する発酵中に産生される有機酸、例えばプロピオン酸の処理及び／又は精製を包含することができる。いくつかの態様では、発酵を終了させ、有機酸を培養物から抽出する。いくつかの態様では、培養物の一部を、発酵が終了する前に処理のために取り出す。いくつかの態様では、発酵を、処理のために取り出された培養物の部分内で終了させる。
処理
本明細書に記載する方法は、本明細書に記載する発酵中に産生される有機酸、例えばプロピオン酸の処理及び／又は精製を包含することができる。いくつかの態様では、発酵を終了させ、有機酸を培養物から抽出する。いくつかの態様では、培養物の一部を、発酵が終了する前に処理のために取り出す。いくつかの態様では、発酵を、処理のために取り出された培養物の部分内で終了させる。
【0063】
いくつかの態様では、発酵を、加熱殺菌によって終了させる。いくつかの態様では、発酵を、例えば濾過又は他の物理的手段によって、培養培地から細胞を分離することによって終了させる。
【実施例】
【0064】
方法
増殖培地を１２１℃で１時間滅菌した後、放置して３０℃まで冷却した。滅菌後にビタミンＢ１２を添加し、ヘッドスペースは、３Ｌのバイオリアクターを使用する場合は窒素ガスで２時間置換し、３０Ｌの発酵槽を使用する場合は窒素ガスを４８時間散布した。あらかじめ４８時間増殖させたプロピオン酸菌を、発酵糖培地に０時間目に接種した。使用する場合、１２～２４時間後に乳酸菌を発酵槽に添加した。発酵を１６８時間実施した後、さらなる下流処理のために細胞を１時間にわたり加熱殺菌する。このプロセスは、乳酸菌を添加しないＮＦＳ－２０１８の単培養発酵にも使用した。
実施例１． プロピオン酸菌（ＮＦＳ－２０１８）のＰＡ産生－３０Ｌ反応
プロピオン酸菌（ＮＦＳ‐２０１８）を、２％グルコースを添加したＭ２４培地中、嫌気性条件下、３０℃で、凍結グリセロールストックから培養した。細胞を、新鮮なＭ２４培地１０ｍＬで開始し、次いで５０ｍＬ（２～３ＯＤ／ｍＬ）にて４８時間毎に継代培養して、１Ｌのバイオリアクター容器の種として使用した。
増殖培地を１２１℃で１時間滅菌した後、放置して３０℃まで冷却した。滅菌後にビタミンＢ１２を添加し、ヘッドスペースは、３Ｌのバイオリアクターを使用する場合は窒素ガスで２時間置換し、３０Ｌの発酵槽を使用する場合は窒素ガスを４８時間散布した。あらかじめ４８時間増殖させたプロピオン酸菌を、発酵糖培地に０時間目に接種した。使用する場合、１２～２４時間後に乳酸菌を発酵槽に添加した。発酵を１６８時間実施した後、さらなる下流処理のために細胞を１時間にわたり加熱殺菌する。このプロセスは、乳酸菌を添加しないＮＦＳ－２０１８の単培養発酵にも使用した。
実施例１． プロピオン酸菌（ＮＦＳ－２０１８）のＰＡ産生－３０Ｌ反応
プロピオン酸菌（ＮＦＳ‐２０１８）を、２％グルコースを添加したＭ２４培地中、嫌気性条件下、３０℃で、凍結グリセロールストックから培養した。細胞を、新鮮なＭ２４培地１０ｍＬで開始し、次いで５０ｍＬ（２～３ＯＤ／ｍＬ）にて４８時間毎に継代培養して、１Ｌのバイオリアクター容器の種として使用した。
【0065】
発酵は、４２Ｌの発酵槽中、３０Ｌの作業容量で行った。２５ＬのｄｄＨ２Ｏを含有する発酵槽に、撹拌しつつ以下を加えた：１．８ｋｇのデキストロース（６％）、２５０ｇ（１％）の酵母エキス＋２０ｇのＭｇＳＯ４（０．０８％）、０．１５ｇのＭｎＳＯ４（０．００１５％）、７５ｇのＮａＰＯ４（二塩基性：０．３％）、及び２５ｇのＫＰＯ４（二塩基性：０．１％）。完全に混合した後、１２１℃で１時間オートクレーブ処理した。温度を３０℃に低下させ、１５Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨを６に低下させた。ビタミンＢ１２溶液を最終濃度２ｍｇ／Ｌで発酵槽に添加した。発酵槽に、１．５Ｌ（５～７ＯＤ）のあらかじめ４８時間増殖させたプロピオン酸菌（ＮＦＳ－２０１８）を接種した。グルコース及び有機酸分析のために、ＹＳＩアナライザー及びＨＰＬＣをそれぞれ用いて、１２～２４時間毎に試料を取り出した。発酵試験期間全体にわたり、２～３％グルコースを適宜添加した。１６８時間後、８０℃で１時間の加熱殺菌により発酵を終了させた。ブロスは、さらなる下流処理のために回収した。
【0066】
結果は、発酵槽でＮＦＳ‐２０１８を単独で培養すると、最大ＰＡは１６８時間で５３ｇ／Ｌに達したことを示した。表１参照。
実施例２． ラクトバチルス・カゼイとの共培養を用いる場合のプロピオン酸菌（ＮＦＳ－２０１８）のＰＡ産生－１Ｌ反応
プロピオン酸菌（ＮＦＳ‐２０１８）及びラクトバチルス・カゼイを、２％グルコースを添加したＭ２４培地中、嫌気性条件下、３０℃で、凍結グリセロールストックから培養した。細胞を、新鮮なＭ２４培地１０ｍＬで開始し、次いで５０ｍＬ（２～３ＯＤ／ｍＬ）にて４８時間毎に継代培養して、１Ｌのバイオリアクター容器のための種として使用した。
実施例２． ラクトバチルス・カゼイとの共培養を用いる場合のプロピオン酸菌（ＮＦＳ－２０１８）のＰＡ産生－１Ｌ反応
プロピオン酸菌（ＮＦＳ‐２０１８）及びラクトバチルス・カゼイを、２％グルコースを添加したＭ２４培地中、嫌気性条件下、３０℃で、凍結グリセロールストックから培養した。細胞を、新鮮なＭ２４培地１０ｍＬで開始し、次いで５０ｍＬ（２～３ＯＤ／ｍＬ）にて４８時間毎に継代培養して、１Ｌのバイオリアクター容器のための種として使用した。
【0067】
発酵は、３Ｌの発酵槽中、１Ｌの容量で行った。１ＬのｄｄＨ２Ｏを含有する発酵槽に、攪拌しつつ以下を加えた：７０ｇのデキストロース、１０ｇ（１％）の酵母エキス＋０．４ｇのＭｇＳＯ４（０．０８％）、３ｇのＮａＰＯ４（二塩基性：０．３％）、及び１ｇのＫＰＯ４（二塩基性：０．１％）。完全に混合した後、１２１℃で１時間オートクレーブ処理した。温度を３０℃に低下させ、１５Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨを６に低下させた。ビタミンＢ１２溶液を最終濃度２ｍｇ／Ｌで発酵槽に添加した。０時間目に、発酵槽に、１．５Ｌ（５～７ＯＤ）のあらかじめ４８時間増殖させたプロピオン酸菌（ＮＦＳ－２０１８）を接種した。発酵２４時間の時点で、１．５Ｌのラクトバチルス・カゼイ（５～７ＯＤ／ｍＬ）をバイオリアクターに添加した。グルコース及び有機酸分析のために、ＹＳＩアナライザー及びＨＰＬＣをそれぞれ用いて、１２～２４時間毎に試料を取り出した。２～３％のグルコース及び別個の１％の酵母エキスを、発酵試験期間全体にわたり適宜添加した。１６８時間後、８０℃で１時間の加熱殺菌により発酵を終了させた。ブロスは、さらなる下流処理のために回収した。
【0068】
結果は、ＮＦＳ‐２０１８及びラクトバチルス・カゼイをバイオリアクターでの共培養として行った場合、最大ＰＡは１６８時間で６８ｇ／Ｌに達したことを示した。表１参照。
実施例３． ラクトバチルス・カゼイとの共培養を用いる場合のプロピオン酸菌（ＮＦＳ－２０１８）のＰＡ産生－３０Ｌ反応
プロピオン酸菌（ＮＦＳ‐２０１８）及びラクトバチルス・カゼイを、２％グルコースを添加したＭ２４培地中、嫌気性条件下、３０℃で、凍結グリセロールストックから培養した。細胞を、新鮮なＭ２４培地１０ｍＬで開始し、次いで５０ｍＬ（２～３ＯＤ／ｍＬ）にて４８時間毎に継代培養して、１Ｌのバイオリアクター容器のための種として使用した。
実施例３． ラクトバチルス・カゼイとの共培養を用いる場合のプロピオン酸菌（ＮＦＳ－２０１８）のＰＡ産生－３０Ｌ反応
プロピオン酸菌（ＮＦＳ‐２０１８）及びラクトバチルス・カゼイを、２％グルコースを添加したＭ２４培地中、嫌気性条件下、３０℃で、凍結グリセロールストックから培養した。細胞を、新鮮なＭ２４培地１０ｍＬで開始し、次いで５０ｍＬ（２～３ＯＤ／ｍＬ）にて４８時間毎に継代培養して、１Ｌのバイオリアクター容器のための種として使用した。
【0069】
発酵は、４２Ｌの発酵槽中、３０Ｌの容量で行った。２５ＬのｄｄＨ２Ｏを含有する発酵槽に、撹拌しつつ以下を加えた：１．８ｋｇのデキストロース（６％）、２５０ｇ（１％）の酵母エキス＋２０ｇ（０．０８％）のＭｇＳＯ４、０．１５ｇのＭｎＳＯ４（０．００１５％）、７５ｇのＮａＰＯ４（二塩基性：０．３％）、及び２５ｇのＫＰＯ４（二塩基性：０．１％）。完全に混合した後、１２１℃で１時間オートクレーブ処理した。温度を３０℃に低下させ、１５Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨを６．０に低下させた。ビタミンＢ１２溶液を最終濃度２ｍｇ／Ｌで発酵槽に添加した。０時間目に、発酵槽に、１．５Ｌ（５～７ＯＤ）のあらかじめ４８時間増殖させたプロピオン酸菌（ＮＦＳ－２０１８）を接種した。１２時間後に、１．５Ｌ（５～７ＯＤ）のあらかじめ４８時間増殖させたラクトバチルス・カゼイを添加した。グルコース及び有機酸分析のために、ＹＳＩアナライザー及びＨＰＬＣをそれぞれ用いて、１２～２４時間毎に試料を取り出した。発酵試験期間全体にわたり、２～３％グルコースを適宜添加した。１６８時間後、８０℃で１時間の加熱殺菌により発酵を終了させた。ブロスは、さらなる下流処理のために回収した。
【0070】
結果は、ＮＦＳ‐２０１８及びラクトバチルス・カゼイをバイオリアクターでの共培養として行った場合、最大ＰＡは１６８時間で６３ｇ／Ｌに達したことを示した。表１参照。
【0071】
【表2】
【0072】
参考文献
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３０． WO 85/04901
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３２． WO 2012/064883 A2
３３． WO 2017/055932 A2
【図1】
【図2】
【図3】
【国際調査報告】