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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-04
(54)【発明の名称】トマト灰色かび病抵抗性の向上のための遺伝子の使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/29 20060101AFI20230328BHJP
A01H 1/00 20060101ALI20230328BHJP
A01H 6/82 20180101ALI20230328BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20230328BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20230328BHJP
【ＦＩ】
C12N15/29 ZNA
A01H1/00 A
A01H6/82
C12N15/113 Z
C12N15/09 110
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022520494
(86)(22)【出願日】2021-04-19
(85)【翻訳文提出日】2022-04-01
(86)【国際出願番号】 CN2021087986
(87)【国際公開番号】W WO2022151607
(87)【国際公開日】2022-07-21
(31)【優先権主張番号】202110058943.X
(32)【優先日】2021-01-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520465253
【氏名又は名称】浙江師範大学
【氏名又は名称原語表記】ＺＨＥＪＩＡＮＧ ＮＯＲＭＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．６８８ Ｙｉｎｇｂｉｎ Ｒｏａｄ， Ｗｕｃｈｅｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｊｉｎｈｕａ， Ｚｅｊｉａｎｇ ３２１００４ Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100102532
【弁理士】
【氏名又は名称】好宮 幹夫
(74)【代理人】
【識別番号】100194881
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 俊弘
(74)【代理人】
【識別番号】100215142
【弁理士】
【氏名又は名称】大塚 徹
(72)【発明者】
【氏名】陳 析豊
(72)【発明者】
【氏名】沈 淑容
(72)【発明者】
【氏名】許 以霊
(72)【発明者】
【氏名】馬 伯軍
【テーマコード（参考）】
2B030
【Ｆターム（参考）】
2B030AA02
2B030AB03
2B030AD04
2B030AD05
2B030CA14
2B030CA19
(57)【要約】
本発明は、トマト灰色かび病抵抗性の向上のための遺伝子の使用に関するものであり、作物の耐病性育種分野に属する。本発明では、トマトにおいて遺伝子Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００をノックアウトすることにより、トマトの葉の灰色かび病菌に対する抵抗性が効果的に向上されるトマト遺伝子Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００の使用が開示されている。さらに、本発明では、トマトにおいて遺伝子Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００をノックアウトする方法も開示されている。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヌクレオチド配列が配列番号１で示されることを特徴とする、トマトの遺伝子Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００。
【請求項2】
トマトにおいて遺伝子Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００をノックアウトすることにより、トマトの葉の灰色かび病菌に対する抵抗性が効果的に向上されることを特徴とする、請求項１に記載のトマトの遺伝子Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００の使用。
【請求項3】
ｍｕ－１のＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号２で示され、ｍｕ－２のＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号３で示されることを特徴とする、請求項２に記載のトマトの遺伝子Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００の使用。
【請求項4】
以下のステップを含むことを特徴とする、トマトにおいて変異遺伝子Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００をノックアウトする方法。１）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集における標的配列ｓｇＲＮＡ：５’－ＧＴＴＧＴＴＣＡＡＣＡＴＧＡＧＣＡＧＡＧ－３’を設計するステップ、
２）、ステップ１）で得られた配列でプライマーを合成し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを構築するステップ、
３）、ステップ２）で得られたベクターでトマトを形質転換して、相応のＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子がノックアウトされたトマト植物であるトランスジェニックトマト植物ｍｕ－１とｍｕ－２を得るステップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、トマト灰色かび病抵抗性の向上のための遺伝子の使用に関するものであり、作物の耐病性育種分野に属する。
【背景技術】
【0002】
トマトは、食用、薬用、及び経済的価値が高いため、世界で重要な果菜類作物となっている。灰色かび病は、トマトにおいて一般的かつ被害が深刻な真菌病であり、植物の茎、葉、花、果実のいずれも発病する可能性がある。通常、病菌は植物の傷や老化組織から侵入し、徐々に他の健康な部分に広がり、トマトの収量や品質に多大なる影響を与える。作物の病害を防除するために耐病性遺伝子を使用することは、最も経済的で効果的な方法である。近年、トマトの耐病性に関連する遺伝子がますます多く発見されている。例えば、Ｙｕら（２０１８）は、エチレン応答因子ＳｌＥＲＦ２が灰色かび病に対するトマトの防御制御に関与し、ＳｌＥＲＦ２の過剰発現により、トマト果実の灰色かび病抵抗性が向上されることを発見した；Ｓｕｎら（２０１７）は、トマトにおけるＤＮＤ１遺伝子のサイレンシングにより、対照植物に比べて、サイレンシング植物は、灰色かび病の病斑の直径が顕著に減少し、葉における灰色かび病菌の分生子の数が顕著に低下し、菌糸成長が抑制されたことを発見した。これにより、植物の耐病性に関連するより多くの遺伝子を発見するための遺伝子編集技術の使用は、作物の抵抗性の向上や経済的損失の低減のための効果的な手段であることが分かる。
【発明の概要】
【0003】
本発明の解決しようとする課題は、如何にトマト灰色かび病抵抗性を効果的に向上させるかである。
【0004】
上記課題を解決するために、本発明は、ヌクレオチド配列が配列番号１で示されるトマトの遺伝子Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００を提供する。
【0005】
また、本発明は、トマトにおいてＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子をノックアウトすることにより、トマトの葉の灰色かび病抵抗性が効果的に向上される前記遺伝子の使用、及び
ｍｕ－１のＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号２で示され、ｍｕ－２のＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号３で示される、本発明のトマト遺伝子Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００の使用の改良を提供する。
ｍｕ－１のＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号２で示され、ｍｕ－２のＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号３で示される、本発明のトマト遺伝子Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００の使用の改良を提供する。
【0006】
さらに、本発明は、以下のステップを含む、トマトにおいて変異遺伝子Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００をノックアウトする方法を提供する。
１）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集における標的配列ｓｇＲＮＡ：５’－ＧＴＴＧＴＴＣＡＡＣＡＴＧＡＧＣＡＧＡＧ－３’を設計するステップ、
２）、ステップ１）で得られた配列でプライマーを合成し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを構築するステップ、
３）、ステップ２）で得られたベクターでトマト（野生型トマト品種ＭｉｃｒｏＴｏｍ）を形質転換して、相応のＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子がノックアウトされたトマト植物であるトランスジェニックトマト植物ｍｕ－１とｍｕ－２を得る（前記トランスジェニックトマト植物からＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子の変異が生じた植物が同定される）ステップ。
１）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集における標的配列ｓｇＲＮＡ：５’－ＧＴＴＧＴＴＣＡＡＣＡＴＧＡＧＣＡＧＡＧ－３’を設計するステップ、
２）、ステップ１）で得られた配列でプライマーを合成し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを構築するステップ、
３）、ステップ２）で得られたベクターでトマト（野生型トマト品種ＭｉｃｒｏＴｏｍ）を形質転換して、相応のＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子がノックアウトされたトマト植物であるトランスジェニックトマト植物ｍｕ－１とｍｕ－２を得る（前記トランスジェニックトマト植物からＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子の変異が生じた植物が同定される）ステップ。
【0007】
遺伝子Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００の配列が既にデータベースに登録されているが、現在、当該遺伝子に関する機能や作用について研究も報告もされていないため、当該遺伝子がトマトの灰色かび病菌に対して抵抗性があることは、本発明が初めて発見したことである。
【0008】
本発明の技術案は、以下のとおりである。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術により、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）に基づき、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子を特異的に標的とするｓｇＲＮＡ配列を合成し、相応のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを構築し、野生型トマト品種ＭｉｃｒｏＴｏｍを遺伝形質転換し、ゲノム内のＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子を指向性編集し、トランスジェニック植物を得て、これらのトランスジェニック植物内のＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子に対してＰＣＲ増幅と配列決定を行い、同定した結果、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子の２種のタイプの異なる変異株ｍｕ－１とｍｕ－２（図１）が得られた。ｍｕ－１植物内のＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子の変異配列は配列番号２であり、ｍｕ－２植物内のＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子の変異配列は配列番号３である。トマトの灰色かび病菌を接種した後、野生型対照品種ＭｉｃｒｏＴｏｍが発病したのに対し、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子の変異が生じた２つの株は、いずれも耐病性が向上し（図２）、葉における病斑の面積が対照品種ＭｉｃｒｏＴｏｍに比べて顕著に小さい（図３）。トマトにおけるＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子の変異は、トマトの灰色かび病抵抗性を効果的に向上させることができることが明らかとなった。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術により、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）に基づき、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子を特異的に標的とするｓｇＲＮＡ配列を合成し、相応のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを構築し、野生型トマト品種ＭｉｃｒｏＴｏｍを遺伝形質転換し、ゲノム内のＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子を指向性編集し、トランスジェニック植物を得て、これらのトランスジェニック植物内のＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子に対してＰＣＲ増幅と配列決定を行い、同定した結果、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子の２種のタイプの異なる変異株ｍｕ－１とｍｕ－２（図１）が得られた。ｍｕ－１植物内のＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子の変異配列は配列番号２であり、ｍｕ－２植物内のＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子の変異配列は配列番号３である。トマトの灰色かび病菌を接種した後、野生型対照品種ＭｉｃｒｏＴｏｍが発病したのに対し、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子の変異が生じた２つの株は、いずれも耐病性が向上し（図２）、葉における病斑の面積が対照品種ＭｉｃｒｏＴｏｍに比べて顕著に小さい（図３）。トマトにおけるＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子の変異は、トマトの灰色かび病抵抗性を効果的に向上させることができることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【0009】
以下、図面を参照しながら、本発明の具体的な実施形態を更に詳細に説明する。
【図1】トマトＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子変異体のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的部位のシーケンス解析である。 ＭｉｃｒｏＴｏｍ：野生型対照品種；ｍｕ－１とｍｕ－２：Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子の２種のタイプの異なる変異株。
【図2】トマトＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子変異植物と野生型対照ＭｉｃｒｏＴｏｍとの、灰色かび病菌が接種された葉の表現型の対比図である。
【発明を実施するための形態】
【0010】
以下、具体的な実施例を参照しながら、本発明を更に説明するが、本発明の保護範囲はそれらに限定されない。
【0011】
実施例１：
ステップ１、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子ノックアウトベクターの構築
Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子のコード配列（配列番号１）に基づき、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的部位解析ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／）により、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子に対してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集におけるｓｇＲＮＡ配列：５’－ＧＴＴＧＴＴＣＡＡＣＡＴＧＡＧＣＡＧＡＧ－３’を設計し、当該配列に基づいて相応のプライマーを合成した。
ステップ１、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子ノックアウトベクターの構築
Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子のコード配列（配列番号１）に基づき、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的部位解析ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／）により、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子に対してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集におけるｓｇＲＮＡ配列：５’－ＧＴＴＧＴＴＣＡＡＣＡＴＧＡＧＣＡＧＡＧ－３’を設計し、当該配列に基づいて相応のプライマーを合成した。
【0012】
上流５’－ＴＧＡＴＴＧＴＴＧＴＴＣＡＡＣＡＴＧＡＧＣＡＧＡＧ－３’、
下流５’－ＡＡＡＣＣＴＣＴＧＣＴＣＡＴＧＴＴＧＡＡＣＡＡＣＡ－３’。
下流５’－ＡＡＡＣＣＴＣＴＧＣＴＣＡＴＧＴＴＧＡＡＣＡＡＣＡ－３’。
【0013】
次に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９キット（Ｂｉｏｇｌｅ，Ｃｈｉｎａ）で相応のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを構築した。構築方法は、製品の説明書に準じて行った。
【0014】
ステップ２、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子ノックアウトベクターのトマトへの遺伝形質転換
ステップ１で構築したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターでトマト品種ＭｉｃｒｏＴｏｍを遺伝形質転換した。トランスジェニック方法については、Ｋｉｍｕｒａらの方法（Ｋｉｍｕｒａ Ｓ ｅｔ ａｌ， ＣＨＳ Ｐｒｏｔｏｃ， ２００８）により、相応の一連の未同定のトランスジェニックトマト植物が得られた。
ステップ１で構築したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターでトマト品種ＭｉｃｒｏＴｏｍを遺伝形質転換した。トランスジェニック方法については、Ｋｉｍｕｒａらの方法（Ｋｉｍｕｒａ Ｓ ｅｔ ａｌ， ＣＨＳ Ｐｒｏｔｏｃ， ２００８）により、相応の一連の未同定のトランスジェニックトマト植物が得られた。
【0015】
ステップ３、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子ノックアウト植物の同定
トマトの葉０．１ｇを取り、液体窒素で粉砕した後、抽出液（Ｔｒｉｓ－ｃｌ １５．７６ｇ、Ｎａｃｌ ２９．２２ｇ、ＳＤＳ粉末１５．０ｇを超純水に添加して１Ｌに定容し、ｐＨ＝８．０となるように調節したもの）６００μｌを加え、６５℃で６０分インキュベートした。５Ｍ ＫＡＣ ２００μｌを加え、均一に混合した後、氷浴で１０分冷却した。更に、クロロホルム５００μｌを加え、均一に混合し、１００００ ｒｐｍで５分遠心した。上澄みを取り、イソプロパノール５００μｌを加え、均一に混合し、１２０００ ｒｐｍで３分遠心し、上澄みを捨てた。７５％エタノールで沈殿を洗浄し、１２０００ ｒｐｍで３分遠心し、上澄みを捨てた。室温で上下を反転させて置き、ＤＮＡを風乾した後、純水３０μｌを添加してＤＮＡを溶解した。
トマトの葉０．１ｇを取り、液体窒素で粉砕した後、抽出液（Ｔｒｉｓ－ｃｌ １５．７６ｇ、Ｎａｃｌ ２９．２２ｇ、ＳＤＳ粉末１５．０ｇを超純水に添加して１Ｌに定容し、ｐＨ＝８．０となるように調節したもの）６００μｌを加え、６５℃で６０分インキュベートした。５Ｍ ＫＡＣ ２００μｌを加え、均一に混合した後、氷浴で１０分冷却した。更に、クロロホルム５００μｌを加え、均一に混合し、１００００ ｒｐｍで５分遠心した。上澄みを取り、イソプロパノール５００μｌを加え、均一に混合し、１２０００ ｒｐｍで３分遠心し、上澄みを捨てた。７５％エタノールで沈殿を洗浄し、１２０００ ｒｐｍで３分遠心し、上澄みを捨てた。室温で上下を反転させて置き、ＤＮＡを風乾した後、純水３０μｌを添加してＤＮＡを溶解した。
【0016】
Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子のＰＣＲ増幅のプライマー（上流５’－ＧＣＣＴＣＴＡＴＴＡＡＴＧＡＣＡＴＣ－３’、下流５’－ＡＴＡＡＧＣＴＡＡＡＡＴＣＧＡＣＴＡ－３’）を合成し、トランスジェニックトマト植物およびその対照品種ＭｉｃｒｏＴｏｍのゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＧｏＴａｑ（商標登録） Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＵＳＡ）によりＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅系は、製品の説明書に準じて操作した。
【0017】
ＰＣＲ増幅プログラムにおいて、９４℃で５分初期変性を行い；９４℃での３０秒の変性、５５℃での３０秒のアニーリング、７２℃での３０秒の伸長を３５サイクル行い；７２℃で１０分伸長させる。
【0018】
ＰＣＲ増幅系を、２×Ｍｉｘ １０μｌ、上流プライマー０．５μｌ、下流プライマー０．５μｌ、テンプレート２μｌ、ｄｄＨ２Ｏ ７μｌのものとする。
【0019】
ＰＣＲ産物に対してシーケンス解析を行ったところ、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子の、ｍｕ－１とｍｕ－２という２種の変異タイプの同定に成功した。ｍｕ－１植物では、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子のコード領域に１つの塩基が挿入され（図１）、そのヌクレオチド配列は配列番号２である。ｍｕ－２植物では、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子のコード領域の３つの塩基が欠失し（図１）、そのヌクレオチド配列は配列番号３である。
【0020】
ステップ４、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子ノックアウト植物の灰色かび病菌に対する抵抗性の同定
上記で同定されたＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子変異株ｍｕ－１、ｍｕ－２および対照品種ＭｉｃｒｏＴｏｍを温室で植え、２５℃、１６時間光照射、８時間暗黒条件で培養した。約４５日間成長したのち、ｍｕ－１、ｍｕ－２および対照品種から３株を無作為に選択し、株あたり４枚の葉を取り、それらを０．８％の寒天（８ｇ寒天粉を超純水に加えて１Ｌに定容したもの）シャーレに固定させた。体積が約２ｍｌの灰色かび病菌を選択し、５ｍｌの１％ＳＭＢ（１０ｇカビ用ペプトン、４０ｇマルトースを超純水に加えて１Ｌに定容したもの）溶液に入れ、均一に振とうし、濾過して、濾液として胞子原液が得られた。２５×１６規格の血球計算盤で胞子原液の濃度を計算し、２５個の中ブロックのうちの各中ブロックに約１６個の胞子があるように１％ＳＭＢ溶液で希釈し、接種時にさらに４倍希釈した後、胞子懸濁液が得られた。胞子無しの１％ＳＭＢ溶液を対照とし、各一枚の葉に５μｌの胞子懸濁液を滴下し、蓋をし、トマトの成長に適した環境に置いた。２日後、菌が接種された葉を摘み取り、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアで病斑の面積を計算した。その結果、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子変異株ｍｕ－１、ｍｕ－２は、対照品種に比べて、葉の発病程度が低く（図２）、葉における病斑の面積が顕著に小さい（図３）ことが示された。
上記で同定されたＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子変異株ｍｕ－１、ｍｕ－２および対照品種ＭｉｃｒｏＴｏｍを温室で植え、２５℃、１６時間光照射、８時間暗黒条件で培養した。約４５日間成長したのち、ｍｕ－１、ｍｕ－２および対照品種から３株を無作為に選択し、株あたり４枚の葉を取り、それらを０．８％の寒天（８ｇ寒天粉を超純水に加えて１Ｌに定容したもの）シャーレに固定させた。体積が約２ｍｌの灰色かび病菌を選択し、５ｍｌの１％ＳＭＢ（１０ｇカビ用ペプトン、４０ｇマルトースを超純水に加えて１Ｌに定容したもの）溶液に入れ、均一に振とうし、濾過して、濾液として胞子原液が得られた。２５×１６規格の血球計算盤で胞子原液の濃度を計算し、２５個の中ブロックのうちの各中ブロックに約１６個の胞子があるように１％ＳＭＢ溶液で希釈し、接種時にさらに４倍希釈した後、胞子懸濁液が得られた。胞子無しの１％ＳＭＢ溶液を対照とし、各一枚の葉に５μｌの胞子懸濁液を滴下し、蓋をし、トマトの成長に適した環境に置いた。２日後、菌が接種された葉を摘み取り、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアで病斑の面積を計算した。その結果、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子変異株ｍｕ－１、ｍｕ－２は、対照品種に比べて、葉の発病程度が低く（図２）、葉における病斑の面積が顕著に小さい（図３）ことが示された。
【0021】
上記のことにより、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子がノックアウトされたトマト植物ｍｕ－１、ｍｕ－２は、葉の灰色かび病菌に対する抵抗性が効果的に向上したことが証明された。
【0022】
なお、上記で挙げたものは、本発明のいくつかの具体的な実施例にすぎない。本発明が上記の実施例に限定されず、多くの変形が可能であることは明らかである。当業者が本発明の開示内容に基づいて直接に導き出す、または想到する変形は、いずれも本発明の保護範囲に属する。
【図1】
【図2】
【図3】
【手続補正書】
【提出日】2022-04-01
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヌクレオチド配列が配列番号１で示されることを特徴とする、トマトの遺伝子Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００。
【請求項2】
トマトにおいて遺伝子Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００をノックアウトすることにより、トマトの葉の灰色かび病菌に対する抵抗性が効果的に向上されることを特徴とする、請求項１に記載のトマトの遺伝子Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００の使用。
【請求項3】
ｍｕ－１のＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号２で示され、ｍｕ－２のＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号３で示されることを特徴とする、請求項２に記載のトマトの遺伝子Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００の使用。
【請求項4】
以下のステップを含むことを特徴とする、トマトにおいて遺伝子Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００をノックアウトする方法。１）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集における標的配列ｓｇＲＮＡ：５’－ＧＴＴＧＴＴＣＡＡＣＡＴＧＡＧＣＡＧＡＧ－３’を設計するステップ、
２）、ステップ１）で得られた配列でプライマーを合成し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを構築するステップ、
３）、ステップ２）で得られたベクターでトマトを形質転換して、相応のＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子がノックアウトされたトマト植物であるトランスジェニックトマト植物ｍｕ－１とｍｕ－２を得るステップ。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0002】
トマトは、食用、薬用、及び経済的価値が高いため、世界で重要な果菜類作物となっている。灰色かび病は、トマトにおいて一般的かつ被害が深刻な真菌病であり、植物の茎、葉、花、果実のいずれも発病する可能性がある。通常、病菌は植物の傷や老化組織から侵入し、徐々に他の健康な部分に広がり、トマトの収量や品質に多大なる影響を与える。作物の病害を防除するために耐病性遺伝子を使用することは、最も経済的で効果的な方法である。近年、トマトの耐病性に関連する遺伝子がますます多く発見されている。例えば、Ｙｕら（２０１８）（Ｙｕ ＷＱ， Ｚｈａｏ ＲＲ， Ｓｈｅｎｇ ＪＰ， ｅｔ ａｌ． ＳｌＥＲＦ２ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｍｅｔｈｙｌ Ｊａｓｍｏｎａｔｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｆｅｎｓｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ ｉｎ ｔｏｍａｔｏ ｆｒｕｉｔ． Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ， ２０１８， ６６（３８）： ９９２３－９９３２．）は、エチレン応答因子ＳｌＥＲＦ２が灰色かび病に対するトマトの防御制御に関与し、ＳｌＥＲＦ２の過剰発現により、トマト果実の灰色かび病抵抗性が向上されることを発見した；Ｓｕｎら（２０１７）（Ｓｕｎ Ｋ， Ｔｕｉｎｅｎ Ａ， ｖａｎ Ｋａｎ ＪＡ， ｅｔ ａｌ． Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ＤＮＤ１ ｉｎ ｐｏｔａｔｏ ａｎｄ ｔｏｍａｔｏ ｉｍｐｅｄｅｓ ｃｏｎｉｄｉａｌ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ， ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ａｎｄ ｈｙｐｈａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ． ＢＭＣ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ， ２０１７， １７（１）： ２３５．）は、トマトにおけるＤＮＤ１遺伝子のサイレンシングにより、対照植物に比べて、サイレンシング植物は、灰色かび病の病斑の直径が顕著に減少し、葉における灰色かび病菌の分生子の数が顕著に低下し、菌糸成長が抑制されたことを発見した。これにより、植物の耐病性に関連するより多くの遺伝子を発見するための遺伝子編集技術の使用は、作物の抵抗性の向上や経済的損失の低減のための効果的な手段であることが分かる。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0006】
さらに、本発明は、以下のステップを含む、トマトにおいて遺伝子Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００をノックアウトする方法を提供する。
１）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集における標的配列ｓｇＲＮＡ：５’－ＧＴＴＧＴＴＣＡＡＣＡＴＧＡＧＣＡＧＡＧ－３’を設計するステップ、
２）、ステップ１）で得られた配列でプライマーを合成し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを構築するステップ、
３）、ステップ２）で得られたベクターでトマト（野生型トマト品種ＭｉｃｒｏＴｏｍ）を形質転換して、相応のＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子がノックアウトされたトマト植物であるトランスジェニックトマト植物ｍｕ－１とｍｕ－２を得る（前記トランスジェニックトマト植物からＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子の変異が生じた植物が同定される）ステップ。
１）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集における標的配列ｓｇＲＮＡ：５’－ＧＴＴＧＴＴＣＡＡＣＡＴＧＡＧＣＡＧＡＧ－３’を設計するステップ、
２）、ステップ１）で得られた配列でプライマーを合成し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを構築するステップ、
３）、ステップ２）で得られたベクターでトマト（野生型トマト品種ＭｉｃｒｏＴｏｍ）を形質転換して、相応のＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子がノックアウトされたトマト植物であるトランスジェニックトマト植物ｍｕ－１とｍｕ－２を得る（前記トランスジェニックトマト植物からＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子の変異が生じた植物が同定される）ステップ。
【手続補正4】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0007】
遺伝子Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００の配列が既にデータベースに登録されているが、現在、当該遺伝子に関する機能や作用について研究も報告もされていないため、当該遺伝子がトマトの灰色かび病菌に対する抵抗性に関係することは、本発明が初めて発見したことである。
【国際調査報告】