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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-04
(54)【発明の名称】ＤＮＡ増幅方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/861 20060101AFI20230328BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230328BHJP
【ＦＩ】
C12N15/861 Z ZNA
C12N5/10
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022547121
(86)(22)【出願日】2021-02-03
(85)【翻訳文提出日】2022-09-30
(86)【国際出願番号】 GB2021050237
(87)【国際公開番号】W WO2021156611
(87)【国際公開日】2021-08-12
(31)【優先権主張番号】2001484.1
(32)【優先日】2020-02-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518305392
【氏名又は名称】オックスフォード ジェネティクス リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＯＸＦＯＲＤ ＧＥＮＥＴＩＣＳ ＬＩＭＩＴＥＤ
(71)【出願人】
【識別番号】507226592
【氏名又は名称】オックスフォード ユニヴァーシティ イノヴェーション リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000040
【氏名又は名称】弁理士法人池内アンドパートナーズ
(72)【発明者】
【氏名】ケイウッド、ライアン
(72)【発明者】
【氏名】スー、ウェイヘン
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA95X
4B065AA95Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA44
(57)【要約】
本発明は、宿主細胞中のＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結するＤＮＡ分子を増幅する方法に関する。前記方法は、前記ＤＮＡ分子と作動可能に連結したＣＡＲＥエレメントと、Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と、ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子と、場合によっては１つ以上のさらなる核酸分子とを含む宿主細胞を培養する工程を含む。本発明はまた、異種プロモーターに作動可能に連結した、Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードする核酸分子；ウイルス遺伝子に作動可能に連結したＣＡＲＥエレメントをコードする核酸分子；アデノウイルスベクターおよび宿主細胞を製造するプロセス；および、宿主細胞中でウイルス粒子、より好ましくはＡＡＶ粒子を産生するプロセスに関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
宿主細胞中においてＤＮＡ分子を増幅する方法であって、前記ＤＮＡ分子は、ＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結し、
前記宿主細胞は、
（ａ）ＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結している前記ＤＮＡ分子を含む第１の核酸分子と、
（ｂ）Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と作動可能に関連する異種プロモーターを含む第２の核酸分子と、
（ｃ）ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列を含む第３の核酸分子とを、
含み、
場合によってはこれらに加えて、
（ｄ）１つ以上のアデノウイルス初期遺伝子産物と作動可能に関連している１つ以上のプロモーターを含む１つ以上のさらなる核酸分子を、
含む宿主細胞であって、
前記方法は、前記宿主細胞を、前記第２および第３の核酸分子、ならびに場合によって追加された１つ以上の前記さらなる核酸分子が発現するような条件下で培養し、前記ＤＮＡ分子の増幅を促進する工程を含む、ＤＮＡ分子増幅方法。
【請求項2】
前記第１、第２、第３、および（存在する場合に）さらなる核酸分子は、それぞれ独立して、前記宿主細胞中で、（ｉ）アデノウイルスベクター中に存在するか、
（ｉｉ）前記宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれて存在するか、または
（ｉｉｉ）エピソームベクターまたはエピソームプラスミド中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＤＮＡ分子は、治療ポリペプチドまたはウイルスポリペプチドをコードする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＤＮＡ分子は、隣接するＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含む、ｒｅｐ遺伝子配列、および／またはｃａｐ遺伝子配列、および／または、ウイルストランスファーベクター、またはその断片をコードする、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
ウイルス粒子を産生するためのプロセスであって、前記プロセスが、下記（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）を含むプロセス。（ａ）宿主細胞にアデノウイルスベクターを導入する工程。
ここで、前記アデノウイルスベクターは、
（ｉ）Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と作動可能に関連する異種プロモーターを含む核酸分子と、
（ｉｉ）導入遺伝子に隣接する５’－ウイルスＩＴＲおよび３’－ウイルスＩＴＲを含むトランスファープラスミドと、
（ｉｉｉ）ウイルストランスファープラスミドをパッケージするための十分なヘルパー遺伝子とを含み、
前記宿主細胞が、下記（ｉ）及び（ｉｉ）と作動可能に連結するＣＡＲＥエレメントを含む。
（ｉ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、
（ｉｉ）ウイルスＲｅｐポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、好ましくは前記ヌクレオチド配列が機能的プロモーターと作動可能に関連していない核酸分子、
（ｂ）ウイルス粒子が前記宿主細胞内で集合するような条件下で、前記宿主細胞を培養する工程。
（ｃ）パッケージされたウイルス粒子を、前記宿主細胞から回収するか、または前記培養培地から回収する工程。
【請求項6】
ウイルス粒子を産生するためのプロセスであって、前記プロセスが、下記（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）を含むプロセス。（ａ）宿主細胞にアデノウイルスベクターを導入する工程。
ここで、前記アデノウイルスベクターは、
（ｉ）Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と作動可能に関連する異種プロモーターを含む核酸分子と、
（ｉｉ）ウイルスＲｅｐポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、好ましくは前記ヌクレオチド配列が機能的プロモーターと作動可能に関連していない核酸分子と、
（ｉｉｉ）ウイルストランスファープラスミドをパッケージするための十分なヘルパー遺伝子と、
を含み、
前記宿主細胞は、下記（ｉ）及び（ｉｉ）を、前記宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれた状態で含む。
（ｉ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子と作動可能に連結しているＣＡＲＥエレメント
（ｉｉ）導入遺伝子に隣接する５’－ウイルスＩＴＲおよび３’－ウイルスＩＴＲを含むトランスファープラスミドであって、前記ＣＡＲＥエレメントと作動可能に連結していてもしていなくてもよいトランスファープラスミド
（ｂ）ウイルス粒子が前記宿主細胞内で集合するような条件下で、前記宿主細胞を培養する工程。
（ｃ）パッケージされたウイルス粒子を、前記宿主細胞から回収するか、または前記培養培地から回収する工程。
【請求項7】
前記ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子が、アデノウイルスベクター内にコードされたポリペプチドによって活性化されるプロモーターの制御下で、前記宿主細胞ゲノムに組み込まれる、請求項５または６に記載のプロセス。
【請求項8】
前記アデノウイルスベクターが抑制可能な主要後期プロモーター（ＭＬＰ）を含み、好ましくは、前記ＭＬＰがアデノウイルス後期遺伝子の転写を調節または制御することのできる１つ以上のリプレッサーエレメントを含み、かつ前記リプレッサーエレメントの１つ以上がＭＬＰ ＴＡＴＡボックスの下流に挿入される、請求項５～７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項9】
前記ウイルスＲｅｐポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、Ｅ１／Ｅ３欠失アデノウイルスベクターのＥ１領域に挿入されている、請求項５～８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項10】
前記ウイルスＲｅｐポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列を含む前記核酸分子が、機能的ｐ５プロモーターまたは機能的ｐ１９プロモーターを含まず、かつ、前記核酸分子がその他のいずれの機能的プロモーターとも作動可能に関連せず、前記Ｒｅｐポリペプチドコーディング配列のベースラインまたは最小限のみの転写が得られる、請求項５～９のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項11】
改変された宿主細胞を製造するためのプロセスであって、前記プロセスは、下記工程（ａ）及び／又は（ｂ）、さらに場合によっては下記工程（ｃ）を含み、（ａ）第１の核酸分子を宿主細胞に導入する工程であって、前記第１の核酸分子は、ＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結しているＡＡＶ ｃａｐ遺伝子をコードするＤＮＡ分子を含む、工程；
（ｂ）Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と作動可能に関連する異種プロモーターを含む第２の核酸分子を、前記宿主細胞に導入する工程；
（ｃ）ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列を含む第３の核酸分子を、前記宿主細胞に導入する工程；
前記導入は、前記第１、第２、および第３（存在する場合）の核酸分子は、それぞれ独立して、
（ｉ）前記宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれるか、または、
（ｉｉ）前記宿主細胞内にエピソーマルに存在する
ように行う、プロセス。
【請求項12】
改変されたアデノウイルスベクターを製造するためのプロセスであって、前記プロセスは、
（ａ）Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と作動可能に関連する異種プロモーターを含む核酸分子を、前記アデノウイルスベクターに導入する工程を含み、
場合によっては、
（ｂ）ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を前記アデノウイルスベクターに導入する工程を含む、ここで、前記アデノウイルスベクターにおいて、前記ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチドをコードする核酸分子は機能的プロモーターと作動可能に関連していない、プロセス。
【請求項13】
アデノウイルスＬ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子であって、前記Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードする配列が異種プロモーターと作動可能に関連している、ＤＮＡ分子。
【請求項14】
下記（ａ）を含む宿主細胞であって、（ａ）Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と作動可能に関連する異種プロモーターを含む核酸分子、
前記核酸分子は、前記宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれているか、またはエピソームプラスミドもしくはエピソームベクター中に存在する、宿主細胞。
【請求項15】
下記（ａ）を含む宿主細胞であって、（ａ）ＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結しているＤＮＡ分子を含む核酸分子であって、前記ＤＮＡ分子は、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のうちの１つ以上をコードし、
（ｉ）ＡＡＶ Ｃａｐポリペプチド、
（ｉｉ）ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチド、
（ｉｉｉ）ＡＡＶトランスファーベクター、
前記核酸分子は、前記宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれているか、またはエピソームプラスミド中に存在する、宿主細胞。
【請求項16】
アデノウイルスＬ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードする核酸分子を含むアデノウイルスベクターであって、前記Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードする配列が異種プロモーターと作動可能に関連している、アデノウイルスベクター。
【請求項17】
（ｉ）前記異種プロモーターが、前記Ｌ４ ２２Ｋ遺伝子が生来的に関連しているわけではないプロモーターであるか、（ｉｉ）前記異種プロモーターが、アデノウイルス主要後期プロモーターではないプロモーターであるか、または、
（ｉｉｉ）前記異種プロモーターが、哺乳類プロモーターまたは細菌プロモーターである、
請求項１～４のいずれか一項に記載の方法、請求項５～１２のいずれか一項に記載のプロセス、請求項１３に記載のＤＮＡ分子、請求項１４に記載の宿主細胞、または請求項１６に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項18】
（Ａ）宿主細胞と、（Ｂ）アデノウイルスベクターとを含むキットであって、（Ａ）前記宿主細胞は、
（ａ）ＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結しているＤＮＡ分子を含む第１の核酸分子を含み、前記ＤＮＡ分子は、（ｉ）及び（ｉｉ）のうちの１つ以上をコードし、
（ｉ）ＡＡＶ Ｃａｐポリペプチド、
（ｉｉ）ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチド、
前記第１の核酸分子は、前記宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれているか、またはエピソームプラスミド中に存在し、
（Ｂ）前記アデノウイルスベクターは、
（ｉ）アデノウイルスＬ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードする核酸分子であって、Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードする配列が前記アデノウイルスＭＬＰと作動可能に関連していない核酸分子と、
（ｉｉ）ＡＡＶトランスファーベクターをコードする核酸分子と、
を含む、
キット。
【請求項19】
（Ａ）宿主細胞と、（Ｂ）アデノウイルスベクターとを含むキットであって、（Ａ）前記宿主細胞は、
（ａ）ＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結しているＤＮＡ分子を含む第１の核酸分子を含み、
前記ＤＮＡ分子は、
（ｉ）ＡＡＶ Ｃａｐポリペプチドをコードし、
場合によっては
（ｉｉ）ＡＡＶトランスファーベクターをコードし、
前記第１の核酸分子は、前記宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれているか、またはエピソームプラスミド中に存在し、
（Ｂ）前記アデノウイルスベクターは、
（ｉ）アデノウイルスＬ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードする核酸分子であって、Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードする配列が前記アデノウイルスＭＬＰと作動可能に関連していない核酸分子と、
（ｉｉ）ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチドをコードする核酸分子と、
を含み、好ましくは、前記核酸分子は機能的プロモーターと作動可能に関連していない、
キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、宿主細胞中のＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結するＤＮＡ分子を増幅する方法に関する。前記方法は、ＤＮＡ分子と作動可能に連結したＣＡＲＥエレメントと、Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と、ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子と、場合によっては１つ以上のさらなる核酸分子と、を含む宿主細胞を培養する工程を含む。
【0002】
本発明はまた、異種プロモーターに作動可能に連結した、Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードする核酸分子；ウイルス遺伝子に作動可能に連結したＣＡＲＥエレメントをコードする核酸分子；アデノウイルスベクターおよび宿主細胞を産生するプロセス；および、宿主細胞中でウイルス粒子、より好ましくはＡＡＶ粒子を産生するプロセスに関する。
【0003】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科に属する単鎖ＤＮＡウイルスである。このウイルスは、分裂細胞および非分裂細胞の両方を含む広い範囲の宿主細胞に感染することができる。また、このウイルスは、ほとんどの患者において限定的な免疫応答のみを引き起こす、非病原性ウイルスである。
【0004】
ここ数年間、ＡＡＶ由来のベクターが、遺伝子送達の非常に有用かつ有望な形態として浮上している。これは、これらのベクターの下記の特性による。
- ＡＡＶは、小さいノンエンベロープのウイルスであり、その内在遺伝子は２つのみ（ｒｅｐおよびｃａｐ）である。したがって、様々な遺伝子療法用のベクターを開発するために容易に操作できる。これは、ＡＡＶゲノム中のｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子の除去によって、また、これらの配列を患者に治療効果を提供しうる外因性配列に置き換えることによって、達成される。
- ＡＡＶ粒子は、剪断力、酵素、または溶媒によって容易に分解されない。このことは、これらのウイルスベクターの精製および最終製剤化を容易にする。
- ＡＡＶは非病原性であり、免疫原性が低い。これらのベクターを使用することにより、好ましくない炎症反応のリスクをさらに低減する。レンチウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノウイルスなどの他のウイルスベクターとは違い、ＡＡＶは害がなく、なんらかのヒトの疾患を起こす原因となるとは考えられていない。
- ＡＡＶベクターを使用して、患者に約４５００ｂｐ以下の遺伝子配列を送達することができる。
- 野生型ＡＡＶベクターはヒト染色体１９へ遺伝物質を挿入する時があることが示されている一方で、この特性は、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をウイルスゲノムから取り除くことにより、ＡＡＶ遺伝子治療ベクターから一般的には除去されている。かかる場合に、前記ウイルスは、宿主細胞内でエピソーム形態のままである。これらのエピソームは非分裂細胞中で保全されるが、分裂細胞中では細胞分裂の間に失われる。
- ＡＡＶは、小さいノンエンベロープのウイルスであり、その内在遺伝子は２つのみ（ｒｅｐおよびｃａｐ）である。したがって、様々な遺伝子療法用のベクターを開発するために容易に操作できる。これは、ＡＡＶゲノム中のｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子の除去によって、また、これらの配列を患者に治療効果を提供しうる外因性配列に置き換えることによって、達成される。
- ＡＡＶ粒子は、剪断力、酵素、または溶媒によって容易に分解されない。このことは、これらのウイルスベクターの精製および最終製剤化を容易にする。
- ＡＡＶは非病原性であり、免疫原性が低い。これらのベクターを使用することにより、好ましくない炎症反応のリスクをさらに低減する。レンチウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノウイルスなどの他のウイルスベクターとは違い、ＡＡＶは害がなく、なんらかのヒトの疾患を起こす原因となるとは考えられていない。
- ＡＡＶベクターを使用して、患者に約４５００ｂｐ以下の遺伝子配列を送達することができる。
- 野生型ＡＡＶベクターはヒト染色体１９へ遺伝物質を挿入する時があることが示されている一方で、この特性は、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をウイルスゲノムから取り除くことにより、ＡＡＶ遺伝子治療ベクターから一般的には除去されている。かかる場合に、前記ウイルスは、宿主細胞内でエピソーム形態のままである。これらのエピソームは非分裂細胞中で保全されるが、分裂細胞中では細胞分裂の間に失われる。
【0005】
前記天然型ＡＡＶゲノムは、それぞれが複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする、ｒｅｐ遺伝子とｃａｐ遺伝子との２つの遺伝子を含み、ｒｅｐ遺伝子は、ウイルスゲノムの非構造タンパク質の、ＡＡＶのライフサイクルおよび部位特異的な組み込みに必要な非構造的タンパク質をコードし、ｃａｐ遺伝子は構造カプシドタンパク質をコードする。
【0006】
また、これらの２つの遺伝子の両側には、ヘアピン構造を構成する能力がある１４５個の塩基からなる末端逆位反復配列（ＩＴＲ）がある。これらのヘアピン配列は、第２のＤＮＡ鎖のプライマーゼ独立性合成と、ウイルスＤＮＡの宿主細胞ゲノムへの組み込みとのために必要である。
【0007】
ウイルスの組み込み能力を除去するために、組み換えＡＡＶベクターはウイルスゲノムのＤＮＡからｒｅｐおよびｃａｐを除去する。かかるベクターを製造するために、導入遺伝子（単数または複数）の転写を駆動するためのプロモーターとともに、所望の導入遺伝子（単数または複数）が、末端逆位反復配列（ＩＴＲ）の間に挿入され、前記ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子がトランスに提供される。アデノウイルスＥ４遺伝子、アデノウイルスＥ２ａ遺伝子、およびアデノウイルスＶＡ遺伝子などのヘルパー遺伝子も提供される。ｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子、およびヘルパー遺伝子は、細胞にトランスフェクトされた追加のプラスミド上に提供されてもよい。
【0008】
従来、ＡＡＶベクターの産生は異なる多数の経路から達成されている。当初、ＡＡＶは野生型（ＷＴ）アデノウイルス血清型５を用い、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子とＡＡＶゲノムとをコードするプラスミドを細胞にトランスフェクトして生成された。これにより、ＷＴアデノウイルスがウイルス複製を容易にする数多くの因子をトランスに提供できるようになった。しかしこの手法には数多くの限界があった。たとえば、ＡＡＶの各バッチは純粋な生成物を提供するためには製造後にＡｄ５粒子から分離しなければならないが、全てのＡｄ５の除去を確実にすることは困難である。さらに、製造中に、細胞が、ＡＡＶよりむしろアデノウイルス粒子の産生に膨大なリソースを充当していることも望ましくない。
【0009】
他の系では、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を発現する安定的なパッケージ細胞株が使用されてきた。かかる系では、前記ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子は細胞ゲノムに組み込まれ、したがってプラスミドベースのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子が不要になる。しかしながら、これらの遺伝子は、通常、その固有の毒性のせいで、組み込まれる頻度が低い（たとえば、細胞あたり１～２コピー）。これらの系はアデノウイルスベクターの感染を必要とする。
【0010】
さらに最近では、アデノウイルスに基づく系は、ＡＡＶ産生に必要なアデノウイルスゲノムの部分をコードするプラスミドに置き換えられた。これにより、最終ウイルス調製物中に存在するアデノウイルス粒子に関する懸念の一部は解決したが、数多くの問題が残っている。その問題には、製造細胞株のトランスフェクションに十分なプラスミドを予め製造することが必要であることや、トランスフェクションのプロセスそれ自体が本質的に非効率であること、などがある。これらの系の収率も、Ａｄ５に基づく手法と比べて低い。
【0011】
ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子がＡＡＶベクターとともに染色体に組み込まれたＨｅＬａ細胞株の遺伝子導入およびアデノウイルス感染により、組み込まれたｒｅｐーｃａｐ配列が１００倍に増幅することが、これまでに報告されている（Tessier, J., et al. J. Virol. 2001; 375-383; Chadeuf, G., et al. J. Gene Med. 2000;2:260-268）。これらの増幅配列は、染色体外に存在する。アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）は、この増幅に必須であるといわれていた。
【0012】
この現象についてはさらにUS2004/0014031に記載され、そこではシス作用複製エレメント（cis-acting replication element、ＣＡＲＥ）が特定された。このＣＡＲＥエレメントは、ＡＡＶー２ゲノム（実施例１２）のヌクレオチド１９０～３６１に対応する１７１個のヌクレオチドの領域に位置するといわれ、これはＡＡＶ ｐ５プロモーターを含む。このＣＡＲＥエレメントは、「ＣＡＲＥ依存複製インデューサー」（「ＣＡＲＥ－ＤＲＩ」）によって結合すると言われている。かかるインデューサーは、（全）アデノウイルスおよびヘルペスウイルスを含むといわれている。より詳しくは、アデノウイルスＥ２ａ遺伝子によってコードされるＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）が、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子のＣＡＲＥ依存増幅の特定のインデューサーであると特定された（US2004/0014031、実施例４）。
【0013】
さらに、US2004/0014031には、ＣＡＲＥエレメントが、隣接した異種遺伝子の増幅を誘発することができる（実施例１１）、すなわち、前記ＣＡＲＥエレメントが複製起点として作用することができることが報告されている。
【0014】
US2004/0014031の「ＣＡＲＥ依存複製インデューサー（ＣＡＲＥ－ＤＲＩ）」が、ＣＡＲＥ依存複製に必要かつ十分であるという記載が正しいことが、現在判明している。US2004/0014031において、前記インデューサーは、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）、Ｅ２ａ発現カセットの遺伝子産物として記載されている。ＤＢＰがＣＡＲＥ依存複製に関与しているかもしれない一方で、その効果を媒介するには十分ではないことが、現在判明している。アデノウイルス後期遺伝子の１つの産物、すなわち、Ｌ４ ２２Ｋが、本来必要である。この２２Ｋタンパク質は、以前は、ウイルスのカプシド形成に関与するとしてのみ知られていた。
【0015】
この特定のインデューサーおよびその作用の正確なメカニズムは、ＣＡＲＥエレメントが並置された遺伝子を増幅する新規の方法を生み出すこと、すなわち、Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドの供給による該遺伝子の増幅方法の産出、を容易にする。
【0016】
したがって、本発明の１つの目的は、ＣＡＲＥエレメントが並置された増幅対象の遺伝子を増幅する方法を提供する。
【0017】
出願人の以前の出願の特許公開公報の１つ（WO2019/020992、その内容はすべて、特に本明細書に援用される）において、出願人は、後期アデノウイルス遺伝子の転写が、リプレッサーエレメントの主要後期プロモーターへの挿入により調節（阻害など）できることを開示している。アデノウイルス後期遺伝子の発現の「スイッチを切る」ことにより、細胞のタンパク質製造能力を所望の組み換えタンパク質またはＡＡＶ粒子の産生に転用することができる。
【0018】
さらに、アデノウイルス後期（すなわち、構造）タンパク質の産生の「スイッチを切る」能力は、このプロセス中にアデノウイルス粒子が産生されないか、またはほとんど産生されないことを意味する。その結果、精製物からアデノウイルス粒子を除去する必要性が低減されるので、経済的節約効果が得られうる。
【0019】
特に、その発明は、簡単で費用対効果の高いＡＡＶ粒子を製造方法であって、アデノウイルスゲノムの複製を維持することによってＡＡＶ粒子を産生するのに必要な高い発現レベルを提供するためにＡＡＶのＲｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質が細胞のゲノム内に組み込まれコードされ、一方で、最終的なＡＡＶ調製物中のアデノウイルス粒子の産生を防止する製造方法を提供できる可能性もあった。
【0020】
しかしながら、その後出願人らは、WO2019/020992に記載のように主要後期プロモーターを抑制することにより後期アデノウイルス遺伝子を阻害することは、ＣＡＲＥ依存複製メカニズムの阻害を介して宿主細胞からのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子のＤＮＡ増幅を阻害するという、望ましくない効果を有することを見出した。アデノウイルス後期遺伝子産物がＣＡＲＥ依存複製に関与しているという報告は無いため、この結果は全く予想外であった。
【0021】
Ｌ４ ２２ＫポリペプチドがＣＡＲＥエレメント誘導因子であると特定することにより、Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドがシスまたはトランスで供給されるWO2019/020992に記載の発明を利用するＡＡＶ産生システムの使用が可能になる。
【0022】
したがって、本発明のさらに別の目的は、高発現レベルのＲｅｐポリペプチドおよびＣａｐポリペプチドが得られ、ＡＡＶ粒子を形成するが、一方でアデノウイルス粒子の産生を阻害または抑制する、ＡＡＶ産生方法を提供することである。
【0023】
一実施形態において、本発明は、宿主細胞中においてＤＮＡ分子を増幅する方法であって、
前記ＤＮＡ分子は、ＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結し、
前記宿主細胞は、
（ａ）ＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結している前記ＤＮＡ分子を含む第１の核酸分子と、
（ｂ）Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と作動可能に関連する異種プロモーターを含む第２の核酸分子と、
（ｃ）ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列を含む第３の核酸分子とを、
含み、
場合によってはこれらに加えて、
（ｄ）１つ以上のアデノウイルス初期遺伝子産物と作動可能に関連している１つ以上のプロモーターを含む１つ以上のさらなる核酸分子を、
含む宿主細胞であって、
前記宿主細胞を、前記第２および第３の核酸分子、ならびに場合によって追加された１つ以上の前記さらなる核酸分子が発現するような条件下で培養し、前記ＤＮＡ分子の増幅を促進することを含む、ＤＮＡ分子の増幅方法を提供する。
前記ＤＮＡ分子は、ＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結し、
前記宿主細胞は、
（ａ）ＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結している前記ＤＮＡ分子を含む第１の核酸分子と、
（ｂ）Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と作動可能に関連する異種プロモーターを含む第２の核酸分子と、
（ｃ）ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列を含む第３の核酸分子とを、
含み、
場合によってはこれらに加えて、
（ｄ）１つ以上のアデノウイルス初期遺伝子産物と作動可能に関連している１つ以上のプロモーターを含む１つ以上のさらなる核酸分子を、
含む宿主細胞であって、
前記宿主細胞を、前記第２および第３の核酸分子、ならびに場合によって追加された１つ以上の前記さらなる核酸分子が発現するような条件下で培養し、前記ＤＮＡ分子の増幅を促進することを含む、ＤＮＡ分子の増幅方法を提供する。
【0024】
好ましくは、前記１つ以上のアデノウイルス初期遺伝子産物は、Ｅ２Ａ遺伝子産物、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子産物、およびＥ４遺伝子産物から選択される。
【0025】
前記第１、第２、第３、および（存在する場合に）さらなる核酸分子は、好ましくは前記宿主細胞中で、
（ｉ）アデノウイルスベクター中に存在するか、
（ｉｉ）前記宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれて存在するか、または
（ｉｉｉ）エピソームベクターまたはエピソームプラスミド中に存在する。
（ｉ）アデノウイルスベクター中に存在するか、
（ｉｉ）前記宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれて存在するか、または
（ｉｉｉ）エピソームベクターまたはエピソームプラスミド中に存在する。
【0026】
他の実施形態において、本発明は、ウイルス粒子を産生するためのプロセスを提供し、前記プロセスは、下記（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）を含む。
（ａ）宿主細胞にアデノウイルスベクターを導入する工程。
ここで、前記アデノウイルスベクターは、
（ｉ）Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と作動可能に関連する異種プロモーターを含む本発明の第２の核酸分子と、
（ｉｉ）導入遺伝子に隣接する５’－ウイルスＩＴＲおよび３’－ウイルスＩＴＲを含むトランスファープラスミドと、
（ｉｉｉ）ウイルストランスファープラスミドをパッケージするための十分なヘルパー遺伝子と
を含み、
前記宿主細胞は、下記（ｉ）及び（ｉｉ）と作動可能に連結するＣＡＲＥエレメントを含む。
（ｉ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、
（ｉｉ）ウイルスＲｅｐポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、好ましくは前記ヌクレオチド配列が機能的プロモーターと作動可能に関連していない核酸分子、
（ｂ）ウイルス粒子が前記宿主細胞内で集合するような条件下で、前記宿主細胞を培養する工程。
（ｃ）パッケージされたウイルス粒子を、前記細胞から回収するか、または前記培養培地から回収する工程。
（ａ）宿主細胞にアデノウイルスベクターを導入する工程。
ここで、前記アデノウイルスベクターは、
（ｉ）Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と作動可能に関連する異種プロモーターを含む本発明の第２の核酸分子と、
（ｉｉ）導入遺伝子に隣接する５’－ウイルスＩＴＲおよび３’－ウイルスＩＴＲを含むトランスファープラスミドと、
（ｉｉｉ）ウイルストランスファープラスミドをパッケージするための十分なヘルパー遺伝子と
を含み、
前記宿主細胞は、下記（ｉ）及び（ｉｉ）と作動可能に連結するＣＡＲＥエレメントを含む。
（ｉ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、
（ｉｉ）ウイルスＲｅｐポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、好ましくは前記ヌクレオチド配列が機能的プロモーターと作動可能に関連していない核酸分子、
（ｂ）ウイルス粒子が前記宿主細胞内で集合するような条件下で、前記宿主細胞を培養する工程。
（ｃ）パッケージされたウイルス粒子を、前記細胞から回収するか、または前記培養培地から回収する工程。
【0027】
好ましくは、前記宿主細胞はウイルスパッケージング細胞である。好ましくは、前記ウイルスはＡＡＶである。
【0028】
他の実施形態において、本発明は、ウイルス粒子を産生するためのプロセスを提供し、前記プロセスは、下記（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）を含む。
（ａ）宿主細胞にアデノウイルスベクターを導入する工程。
ここで、前記アデノウイルスベクターは、
（ｉ）Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と作動可能に関連する異種プロモーターを含む本発明の第２の核酸分子と、
（ｉｉ）ウイルスＲｅｐポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、好ましくは前記ヌクレオチド配列が機能的プロモーターと作動可能に関連していない核酸分子と、
（ｉｉｉ）ウイルストランスファープラスミドをパッケージするための十分なヘルパー遺伝子とを含み、
前記宿主細胞は、下記（ｉ）及び（ｉｉ）を、前記宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれた状態で含み、
（ｉ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子と作動可能に連結しているＣＡＲＥエレメント、
（ｉｉ）導入遺伝子に隣接する５’－ウイルスＩＴＲおよび３’－ウイルスＩＴＲを含むトランスファープラスミドであって、前記ＣＡＲＥエレメントと作動可能に連結していてもしていなくてもよいトランスファープラスミド、
（ｂ）ウイルス粒子が前記宿主細胞内で集合するような条件下で、前記宿主細胞を培養する工程。
（ｃ）パッケージされたウイルス粒子を、前記宿主細胞から回収するか、または前記培養培地から回収する工程。
（ａ）宿主細胞にアデノウイルスベクターを導入する工程。
ここで、前記アデノウイルスベクターは、
（ｉ）Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と作動可能に関連する異種プロモーターを含む本発明の第２の核酸分子と、
（ｉｉ）ウイルスＲｅｐポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、好ましくは前記ヌクレオチド配列が機能的プロモーターと作動可能に関連していない核酸分子と、
（ｉｉｉ）ウイルストランスファープラスミドをパッケージするための十分なヘルパー遺伝子とを含み、
前記宿主細胞は、下記（ｉ）及び（ｉｉ）を、前記宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれた状態で含み、
（ｉ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子と作動可能に連結しているＣＡＲＥエレメント、
（ｉｉ）導入遺伝子に隣接する５’－ウイルスＩＴＲおよび３’－ウイルスＩＴＲを含むトランスファープラスミドであって、前記ＣＡＲＥエレメントと作動可能に連結していてもしていなくてもよいトランスファープラスミド、
（ｂ）ウイルス粒子が前記宿主細胞内で集合するような条件下で、前記宿主細胞を培養する工程。
（ｃ）パッケージされたウイルス粒子を、前記宿主細胞から回収するか、または前記培養培地から回収する工程。
【0029】
一部の好ましい実施形態において、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、アデノウイルスベクター内にコードされたポリペプチドによって活性化されるプロモーターの制御下で、前記宿主細胞ゲノムに組み込まれる。
【0030】
前記ＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結している前記ＤＮＡ分子は、一般的に、増幅が望まれるいずれかのＤＮＡ分子であってもよい。
【0031】
ＣＡＲＥ増幅は、二方向であってもよい。前記ＤＮＡ分子はしたがってＣＡＲＥエレメントに対して５’または３’に位置していてもよい。一部の実施形態において、ＣＡＲＥエレメントの３’末端からＤＮＡ分子の３’末端までのヌクレオチド配列の長さは、１～５Ｋｂ、５～１０Ｋｂ、１０～１５Ｋｂ、１５～５０Ｋｂ、または５０～１００Ｋｂである。他の実施形態において、ＣＡＲＥエレメントの５'末端からＤＮＡ分子の５'末端までのヌクレオチド配列の長さは、１～５Ｋｂ、５～１０Ｋｂ、１０～１５Ｋｂ、１５～５０Ｋｂ、または５０～１００Ｋｂである。
【0032】
前記ＤＮＡ分子はコーディング配列であっても、非コーディング配列であってもよく、ゲノムＤＮＡであってもｃＤＮＡであってもよい。好ましくは、前記ＤＮＡ配列は、ポリペプチドまたはその断片をコードする。
好ましくは、ＤＮＡ分子は１つ以上の転写制御エレメントおよび／または翻訳制御エレメント（たとえば、エンハンサー配列、プロモーター配列、ターミネーター配列など）と作動可能に関連している。
好ましくは、ＤＮＡ分子は１つ以上の転写制御エレメントおよび／または翻訳制御エレメント（たとえば、エンハンサー配列、プロモーター配列、ターミネーター配列など）と作動可能に関連している。
【0033】
一部の実施形態において、前記ＤＮＡ分子は、治療ポリペプチドまたはその断片をコードする。好ましい治療ポリペプチドの例は、抗体、ＣＡＲ－Ｔ分子、ｓｃＦＶ、ＢｉＴＥｓ、ＤＡＲＰｉｎｓおよびＴ細胞受容体を含む。一部の実施形態においては、治療ポリペプチドは、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、たとえばＤＲＤ１などである。
一部の実施形態においては、治療ポリペプチドは、ヒトの視覚または網膜機能に関与する遺伝子の機能的コピーであり、たとえばＲＰＥ６５またはＲＥＰなどの機能的コピーである。一部の実施形態においては、治療ポリペプチドは、ヒトの血液生成に関与する遺伝子の機能的コピーであるか、または第ＩＸ因子などの血液成分であるか、またはβもしくはαサラセミアもしくは鎌形赤血球貧血に関与するものである。一部の実施形態においては、治療ポリペプチドは、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）またはアデノシンデアミナーゼ欠損症（ＡＤＡ－ＳＣＩＤ）におけるものなどの免疫機能に関与する遺伝子の機能的コピーである。
一部の実施形態においては、治療ポリペプチドは、ヒトの視覚または網膜機能に関与する遺伝子の機能的コピーであり、たとえばＲＰＥ６５またはＲＥＰなどの機能的コピーである。一部の実施形態においては、治療ポリペプチドは、ヒトの血液生成に関与する遺伝子の機能的コピーであるか、または第ＩＸ因子などの血液成分であるか、またはβもしくはαサラセミアもしくは鎌形赤血球貧血に関与するものである。一部の実施形態においては、治療ポリペプチドは、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）またはアデノシンデアミナーゼ欠損症（ＡＤＡ－ＳＣＩＤ）におけるものなどの免疫機能に関与する遺伝子の機能的コピーである。
【0034】
一部の実施形態においては、治療ポリペプチドは、細胞の増殖を増加／減少させるタンパク質、たとえば増殖因子受容体である。一部の実施形態においては、治療ポリペプチドはイオンチャネルポリペプチドである。一部の実施形態においては、治療ポリペプチドは免疫チェックポイント分子である。
好ましくは、免疫チェックポイント分子は、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、Ｌａｇ１、またはＧＩＴＲである。
好ましくは、免疫チェックポイント分子は、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、Ｌａｇ１、またはＧＩＴＲである。
【0035】
一部の好ましい実施形態においては、ＤＮＡ分子はＣＲＩＳＰＲ酵素（たとえば、Ｃａｓ９，ｄＣａｓ９、Ｃｐｆ１、またはその変異体もしくは誘導体）またはＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡをコードする。
【0036】
一部の実施形態において、前記ＤＮＡ分子は、哺乳動物に感染することが知られているウイルスからの遺伝子を含む。前記ＤＮＡ分子内にコードされる遺伝子は、ワクチンとして使用されてもよいしされなくてもよいウイルス状粒子に自己集合することが可能なポリペプチドをコードしてもよい。好ましい一実施形態において、前記ＤＮＡ分子はノロウイルスカプシドタンパク質をコードする。
【0037】
他の実施形態において、前記ＤＮＡ分子は、自己集合して多量体複合体になりうるワクチンとしてヒトにおいて免疫応答を誘導することが知られている１つ以上のポリペプチドをコードしてもよい。好ましい実施形態は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）五量体複合体に必要な５つの遺伝子をコードしうる。これは、ＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１を含む。
【0038】
他の実施形態において、前記遺伝子は、自己集合してウイルス状粒子になることがないワクチンとしてヒトにおいて免疫応答を誘導することが知られているタンパク質をコードしてもよい。好ましい実施形態は、エボラＦタンパク質、インフルエンザＦおよびＨタンパク質、コロナウイルスＳタンパク質、コロナウイルスＥタンパク質、またはコロナウイルスＭタンパク質をコードしうる。
【0039】
一部の実施形態において、前記ＤＮＡ分子は、レトロウイルスからの遺伝子を含み、より好ましくはレンチウイルスからの遺伝子を含む。かかる遺伝子には、Ｇａｇ－Ｐｏｌ遺伝子、Ｒｅｖ遺伝子、およびＥｎｖ遺伝子があるが、これらに限定されるわけではない
【0040】
一部の実施形態において、前記ＤＮＡ分子は、ラブドウイルスからの遺伝子を含み、より好ましくは水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）からの遺伝子を含む。かかる遺伝子には、ＶＳＶ糖タンパク質遺伝子（すなわち、ＶＳＶ Ｇ遺伝子）があるが、これに限定されるわけではない
【0041】
一部の実施形態において、前記ＤＮＡ分子は、遺伝子治療ウイルスベクターを集合させるために必要な遺伝子をコードするか、または遺伝子治療トランスファーベクターをコードする遺伝子をコードする、ウイルスパッケージング細胞株を作製するために必要な遺伝子を含む。
【0042】
一部の実施形態において、前記ＤＮＡ分子は、遺伝子治療ベクターを産生するために必要な遺伝子すべてとトランスファーベクターとをウイルス産生細胞株を作製するために必要な遺伝子を含む。
【0043】
さらに他の実施形態において、前記ＤＮＡ分子は、レンチウイルスベクターのための１つ以上の遺伝子（たとえば、Ｇａｇ－Ｐｏｌ、Ｒｅｖ、ＶＳＶーＧ、ＲＤ１１４）、またはアデノウイルスベクターのための１つ以上の遺伝子（たとえば、Ｈｅｘｏｎ、Ｆｉｂｒｅ、Ｐｅｎｔｏｎ、ｐＶＩＩ、またはｐＶＩ）を含んでもよい。
【0044】
一部の実施形態において、前記ＤＮＡ分子は、ｒｅｐ遺伝子配列、および／またはｃａｐ遺伝子配列、および／または隣接するＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含むトランスファーベクター、またはその断片を含む。好ましくは、前記ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子はＡＡＶ遺伝子である。
【0045】
他の実施形態において、前記ＤＮＡ分子は、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子配列を含んでいないか、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子配列を含んでいないか、またはＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含んでいない。他の実施形態において、前記ＤＮＡ分子は、ＡＡＶ配列を含んでいない。一部の実施形態において、前記ＣＡＲＥエレメントは、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子またはＡＡＶ ｃａｐ遺伝子に（近接で、または非近接で）連結していない。
【0046】
一部の実施形態において、ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列を含む第３の核酸分子は、必要ではない。
【0047】
本明細書において、「ｒｅｐ遺伝子」という用語は、１つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする遺伝子のことをいい、前記ＯＲＦの各々はＡＡＶ Ｒｅｐ非構造タンパク質またはその変異体もしくは誘導体をコードする。これらのＡＡＶ Ｒｅｐ非構造タンパク質（またはその変異体もしくは誘導体）は、ＡＡＶゲノム複製および／またはＡＡＶゲノムパッケージングに関与している。
【0048】
野生型ｒｅｐ遺伝子は、ｐ５、ｐ１９、およびｐ４０という３つのプロモーターを含む。異なる長さの、２つの重複するメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）は、ｐ５から、およびｐ１９から、産生することができる。これらのｍＲＮＡの各々は、１つのスプライスドナー部位と２つの異なるスプライスアクセプター部位とを使用し、スプライスアウトできるイントロンを含むか、またはスプライスアウトできないイントロンを含む。このように、６つの異なるｍＲＮＡが形成でき、そのうち４つのみが機能的である。前記イントロンを除去していない前記２つのｍＲＮＡ（ｐ５から転写されたものと、ｐ１９から転写されたもの）は、共通ポリアデニル化ターミネーター配列まで読み取られ、かつＲｅｐ７８およびＲｅｐ５２をそれぞれコードする。前記イントロンの除去、および前記５’モストスプライスアクセプター部位（5'-most splice acceptor site）の使用は、なんらかの機能的なＲｅｐタンパク質の産生をもたらすわけではない－前記配列の残りのフレームがシフトするから正しいＲｅｐ６８タンパク質またはＲｅｐ４０タンパク質を産生できず、Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ５２のターミネーターがスプライスアウトされるのでそれらの正しいＣ末端を産生することもないだろう。逆に、前記イントロンの除去、および前記３'スプライスアクセプターの使用は、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ４０の正しいＣ末端を産生し、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２のターミネーターをスプライスアウトすることになるだろう。したがって、前記機能的スプライシングのみで、イントロンをまとめてスプライスアウトすることを回避する（Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２を産生する）か、または、前記３'スプライスアクセプターを使用する（Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ４０を産生する）かのどちらかになるだろう。その結果、重複した配列を持つ４つの異なる機能的Ｒｅｐタンパク質が、これらのプロモーターから合成できる。
【0049】
野生型ｒｅｐ遺伝子では、前記ｐ４０プロモーターは３'末端に位置する。Ｃａｐタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３）の転写は、野生型ＡＡＶゲノムでは、このプロモーターから開始される。
【0050】
前記４つの野生型Ｒｅｐタンパク質は、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０である。したがって、前記野生型ｒｅｐ遺伝子は、前記４つのＲｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０をコードする遺伝子である。本明細書において、「ｒｅｐ遺伝子」という用語は、野生型ｒｅｐ遺伝子およびその誘導体、ならびに、同等の機能を有する人工のｒｅｐ遺伝子を含む。
【0051】
一実施形態において、前記ｒｅｐ遺伝子は、機能的Ｒｅｐ７８ポリペプチド、機能的Ｒｅｐ６８ポリペプチド、機能的Ｒｅｐ５２ポリペプチド、および機能的Ｒｅｐ４０ポリペプチドをコードする。他の実施形態において、前記ｒｅｐ遺伝子は機能的Ｒｅｐ７８ポリペプチド、および機能的Ｒｅｐ６８ポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、前記ｒｅｐ遺伝子ｐ１９プロモーターは、非機能的である。他の実施形態において、前記ｒｅｐ遺伝子は、非機能的Ｒｅｐ５２ポリペプチド、および非機能的Ｒｅｐ４０ポリペプチドをコードする。
【0052】
前記野生型ＡＡＶ（血清型２）ｒｅｐ遺伝子ヌクレオチド配列は、配列番号１に記載されている。
【0053】
一実施形態において、前記「ｒｅｐ遺伝子」は、配列番号１に対する配列同一性が少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％であるヌクレオチド配列であって、１つ以上のＲｅｐ７８ポリペプチド、Ｒｅｐ６８ポリペプチド、Ｒｅｐ５２ポリペプチド、およびＲｅｐ４０ポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列のことをいう。
【0054】
本明細書において、「ｃａｐ遺伝子」という用語は、１つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする遺伝子のことをいい、前記ＯＲＦの各々はＡＡＶ Ｃａｐ構造タンパク質またはその変異体もしくは誘導体をコードする。これらのＡＡＶ Ｃａｐ構造タンパク質（またはその変異体もしくは誘導体）は、ＡＡＶカプシドを形成する。
【0055】
前記３つのＣａｐタンパク質は、好適な細胞に感染することができる感染ＡＡＶウイルス粒子の産生を可能にするよう機能しなければならない。
【0056】
前記３つのＣａｐタンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３であり、これらのサイズは、一般的にはそれぞれ８７ｋＤａ、７２ｋＤａ、および６２ｋＤａである。したがって、前記ｃａｐ遺伝子は、３つのＣａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする遺伝子である。
【0057】
野生型ＡＡＶにおいて、これらの３つのタンパク質はｐ４０プロモーターから翻訳され、１つのｍＲＮＡを形成する。このｍＲＮＡが合成されたのちに、長いイントロンまたは短いイントロンを切り取ることができ、その結果２．３ｋｂまたは２．６ｋｂのｍＲＮＡを形成する。
【0058】
前記ＡＡＶカプシドは、６０個のカプシドタンパク質サブユニット（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３）で構成され、前記サブユニットは、１：１：１０の比率の正二十面体対称で配置され、３．９ ＭＤａの推定サイズを有する。
【0059】
本明細書において、「ｃａｐ遺伝子」という用語は、野生型ｃａｐ遺伝子およびその誘導体、ならびに、同等の機能を有する人工のｃａｐ遺伝子を含む。前記ＡＡＶ（血清型２）ｃａｐ遺伝子ヌクレオチド配列およびＣａｐポリペプチド配列は、それぞれ、配列番号２および３に記載されている。
【0060】
本明細書において、「ｃａｐ遺伝子」という用語は、好ましくは、配列番号２に記載の配列を有するヌクレオチド配列、または配列番号３をコードするヌクレオチド配列のことをいう；または配列番号２に対する配列同一性が少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％であるか、または配列番号３をコードするヌクレオチド配列に対するヌクレオチド配列同一性が少なくとも８０％、９０％、９５％、または９９％であり、かつ、ＶＰ１ポリペプチド、ＶＰ２ポリペプチドおよびＶＰ３ポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列のことをいう。
【0061】
前記ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子は、好ましくはウイルス遺伝子であるか、またはウイルス遺伝子から由来する。より好ましくは、それらはＡＡＶ遺伝子であるか、またはＡＡＶ遺伝子から由来する。一部の実施形態において、前記ＡＡＶは、アデノ随伴デペンドパルボウイルスＡである。他の実施形態において、前記ＡＡＶは、アデノ随伴デペンドパルボウイルスＢである。
【0062】
１１の異なるＡＡＶ血清型が公知である。前記公知の血清型はすべて、多様な組織タイプからの細胞に感染することができる。組織特異性は、カプシド血清型によって決定される。
【0063】
前記ＡＡＶは、血清型１、血清型２、血清型３、血清型４、血清型５、血清型６、血清型７、血清型８、血清型９、血清型１０、または血清型１１由来であってもよい。好ましくは、前記ＡＡＶは、血清型１、血清型２、血清型５、血清型６、血清型７、血清型８、または血清型９であってもよい。最も好ましくは、前記ＡＡＶ血清型は５である（すなわち、ＡＡＶ５）。
【0064】
前記ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子（および、その中のタンパク質コーディングＯＲＦの各々）は、１つ以上の異なるウイルス（たとえば、２つ、３つ、または４つの異なるウイルス）由来であってもよい。たとえば、前記ｒｅｐ遺伝子がＡＡＶ２由来であってもよく、一方で前記ｃａｐ遺伝子がＡＡＶ５由来であってもよい。ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子が系統や分離株によって異なることは、当業者に認識されている。かかる系統や分離株のすべてから由来するこれらの遺伝子の配列が本明細書において含まれ、またそれらの誘導体も含まれる。
【0065】
本明細書において、「ＣＡＲＥ」エレメントという用語は、シス作用複製エレメント（Cis-Acting Replication Element）のことをいう。前記ＣＡＲＥエレメントは、作動可能に連結したＤＮＡ分子の複製を促進できるＤＮＡエレメントである。この複製は、アデノウイルスＬ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体の存在に依存し、および場合によってはＥ２Ａポリペプチドまたはその変異体の存在に依存する。理論に束縛されなければ、Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体が、１つ以上のｔｔｔｇモチーフでＣＡＲＥエレメントに結合してもよいと考えられる。
【0066】
ＣＡＲＥエレメントは、Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ；gcccgagtgagcacgc 配列番号４）とｔｒｓ状エレメントとを含む。
【0067】
野生型ＡＡＶ ＣＡＲＥエレメントは、ＡＡＶ ｐ５プロモーターを含む。前記ＣＡＲＥエレメント内のＴＡＴＡボックスが、ＣＡＲＥ増幅に必要であることが示されてきた。前記ＣＡＲＥエレメントは、好ましくはＡＡＶ ＣＡＲＥエレメントである。
【0068】
前記野生型ＡＡＶゲノムにおいて、前記ＣＡＲＥエレメントは、前記ＡＡＶ ｐ５プロモーター、Ｒｅｐ結合部位、前記ｔｒｓエレメント、およびＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５’部分を含む。かかるＣＡＲＥエレメントの例は、これまでにTessier, J., et al. J. Virol. 2001; 375-383; Chadeuf, G., et al. J. Gene Med. 2000; 2:260-268; and in US2004/0014031, inter aliaに記載されている。前記ＡＡＶ ＣＡＲＥエレメントは、野生型ＡＡＶ２のヌクレオチド１９０～５４０の間に位置すると報告されている（Nony, P. et al. J Virol. 2001).
【0069】
一部の好ましい実施形態において、前記ＣＡＲＥエレメントは、ＡＡＶー２ゲノムのヌクレオチド１９０～３６１に対応する１７１個のヌクレオチドである。好ましくは、前記ＣＡＲＥエレメントは、配列番号５に記載のようなヌクレオチド配列か、または、それに対する配列同一性が少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％であって、かつ、Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドの存在下において、場合によってはＬ４ ２２ＫポリペプチドおよびＥ２Ａポリペプチドの存在下において、作動可能に連結するＤＮＡ分子の増幅を促進することができる変異体を有する。
【0070】
ＣＡＲＥエレメント（またはその変異体）に対するＬ４ ２２Ｋポリペプチドの結合能力は、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイによって解析してもよい。ＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結するＤＮＡ分子の増幅を促進する、Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体の能力は、（本明細書において実施例３、５および６に記載されているように）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または定量的ＰＣＲによって解析されてもよい。配列番号５の変異体において、ＲＢＳ、ＴＡＴＡボックス、およびｔｒｓエレメントの配列が好ましくは維持される。
【0071】
本明細書において、「ＡＡＶゲノム」、「ＡＡＶトランスファーベクター」、および「トランスファープラスミド」という用語は、本明細書において交換可能に使用される。それらはすべて、導入遺伝子に隣接する５’－および３’－ウイルス性（好ましくはＡＡＶ）末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含むベクターのことをいう。
【0072】
前記ＣＡＲＥエレメントおよび前記ＤＮＡ分子は、作動可能に連結している。本明細書において、「作動可能に連結する」という用語は（前記ＣＡＲＥエレメントおよびＤＮＡ分子の文脈で）、Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドの存在下で、場合によってはさらにアデノウイルスＥ２Ａポリペプチドの存在下で、前記ＣＡＲＥエレメントが前記ＤＮＡ分子の増幅を促進するように、前記ＣＡＲＥエレメントとＤＮＡ分子とが連結することを意味する。これは、前記ＣＡＲＥエレメントおよび前記ＤＮＡ分子が、同じＤＮＡ分子に存在すること、たとえば、並ぶ、隣接する、または近接して連結していることを意味する。
【0073】
前記ＣＡＲＥエレメントは、増幅されるＤＮＡ分子の５’または３’に配置されてもよく、好ましくは５’に配置されてもよい。前記ＣＡＲＥエレメントの配列の向きは、その天然の（野生型の）環境に応じて画定される。ＣＡＲＥエレメントは正逆いずれかの向き（対象のＤＮＡ分子に対して上流または下流）で機能できればよい。前記ＣＡＲＥエレメントの３’末端と前記ＤＮＡ分子の５’末端との間の距離は、好ましくは１～１０００ヌクレオチド、より好ましくは１～５００ヌクレオチドである。一部の実施形態において、この距離は１０００ヌクレオチド未満のであり、好ましくは５０ヌクレオチド未満である。
【0074】
前記ＣＡＲＥエレメントは、宿主細胞内で、Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体に接し、および場合によってはさらにＥ２Ａポリペプチドまたはその変異体に接する。
【0075】
アデノウイルス遺伝子は、スプライシング現象の範囲から多数のタンパク質アイソフォームが産生され、初期（Ｅ１～Ｅ４）転写産物および後期（Ｌ１～Ｌ５）転写産物に分けられる。
【0076】
初期領域は、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４に分けられる。Ｅ１は、ウイルス複製を促す細胞周期の相に細胞を移行させ、アポトーシスを阻害し、細胞分裂を促進するのに不可欠である。Ｅ２領域はＤＮＡゲノムの複製の大半を担う。Ｅ２領域は、ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）をコードするＥ２Ａ領域と、主に末端タンパク質と、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ）と、ＩＶａ２タンパク質とをコードするＥ２Ｂ領域とを含む。Ｅ３は宿主応答の免疫調節に関与する遺伝子を含み、Ｅ４は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）などの細胞経路の調節およびｐ５３分解を媒介するＥ１Ｂ－５５Ｋとの複合体化に関与する幅広い遺伝子を含む。
【0077】
アデノウイルス後期遺伝子は、全て同じプロモーターである主要後期プロモーターから転写され、集合して三分節系リーダー配列を形成する３つのエクソンを含む同一の５'ｍＲＮＡ末端を全てが共有する。後期遺伝子は、ウイルス粒子の一部（ＨｅｘｏｎおよびＦｉｂｒｅなど）を形成するか、またはその構築に関与する（１００Ｋタンパク質など）約１３種類のタンパク質の発現を可能とする、一連のスプライシング事象によって発現する。
【0078】
Ｌ４系転写産物は、１００Ｋ、３３Ｋ、２２Ｋ、およびｐＶＩＩタンパク質をコードする。これらのタンパク質は幅広い機能に関与する。１００Ｋタンパク質はウイルスヘキソン構築の促進と核の移入に関与するが、細胞ｍＲＮＡの翻訳をｃａｐ独立性翻訳に切り替える際にも一定の役割を果たすこともある。本発明の一実施形態においては、１００Ｋタンパク質はウイルスゲノム内からではなく細胞内でトランスに提供されうる。２２Ｋタンパク質はウイルスのカプシド形成に関与することが知られている。Ｌ４遺伝子はウイルス構築の成功に必要とされるが、ゲノムＤＮＡ複製には必要とされない。
【0079】
Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドが、作動可能に連結したＤＮＡ分子のＣＡＲＥ依存的な増幅を促進することに関与することが、現在見出されている。
【0080】
本明細書において、「Ｌ４ ２２Ｋポリペプチド」という用語は、アデノウイルスＬ４ ２２Ｋ遺伝子、またはその変異体もしくは誘導体の遺伝子産物のことをいう。最も好ましくは、前記Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドは、アデノウイルスＬ４ ２２Ｋポリペプチドである。野生型アデノウイルスＬ４ ２２Ｋポリペプチドの分子量は、２２ｋＤａである。
【0081】
好ましくは、アデノウイルスは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧ群に由来するヒトアデノウイルスである。
より好ましくは、前記アデノウイルスは、ＢまたはＣまたはＤ群に由来するヒトアデノウイルスである。さらにより好ましくは、前記アデノウイルスは、ＢまたはＣ群に由来するヒトアデノウイルスである。Ａｄ５およびＡｄ２（どちらもＣ群）がＡＡＶ製造用のヘルパーウイルスとして一般的に使用されるため、Ｃ群が好ましい。Ａｄ５が最も好ましいアデノウイルスである。
より好ましくは、前記アデノウイルスは、ＢまたはＣまたはＤ群に由来するヒトアデノウイルスである。さらにより好ましくは、前記アデノウイルスは、ＢまたはＣ群に由来するヒトアデノウイルスである。Ａｄ５およびＡｄ２（どちらもＣ群）がＡＡＶ製造用のヘルパーウイルスとして一般的に使用されるため、Ｃ群が好ましい。Ａｄ５が最も好ましいアデノウイルスである。
【0082】
ヒトアデノウイルスＤ血清型９（ＨＡｄＶ－９）Ｌ４ ２２Ｋタンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢーＱ５ＴＪ００から入手でき、本明細書において配列番号６に記載されている。前記Ａｄ５ ＤＮＡ配列は、本明細書において配列番号７として記載されている。前記Ａｄ５アミノ酸配列は、配列番号８として記載されている。
【0083】
前記Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、好ましくは、配列番号７に記載のヌクレオチド配列、または配列番号６もしくは８のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；または配列番号７に対する配列同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％であるか、または配列番号６もしくは８のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対するヌクレオチド配列同一性が少なくとも８０％、９０％、９５％もしくは９９％であるヌクレオチド配列を有し、かつ、ＤＮＡ結合タンパク質をコードする、変異体である。
【0084】
好ましくは、前記Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドは、配列番号６または８に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号６もしくは８に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％であって、かつ、ＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結するＤＮＡ分子の増幅を促進することができる変異体を有する。
【0085】
一部の実施形態において、第２の核酸分子は、ベクターまたはプラスミドの形態で提供される。前記ベクターまたはプラスミドは、前記宿主細胞内に（エピソーマルに）存在してもよく、または前記宿主細胞に組み込まれてもよい。他の実施形態において、前記第２の核酸分子は、前記宿主細胞ゲノムに組み込まれる。他の実施形態において、前記第２の核酸分子は、ウイルスベクター、たとえばヘルペスウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター中に存在し、好ましくはアデノウイルスベクター中に存在する。前記ウイルスベクターは、前記宿主細胞内に存在してもよく、または前記宿主細胞に組み込まれてもよい。
【0086】
最も好ましくは、前記第２の核酸分子が、Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体の発現がアデノウイルス主要後期プロモーター（Major Late Promoter、ＭＬＰ）からほぼ独立している（すなわち、関連していない）アデノウイルスベクターに挿入されている。前記アデノウイルスベクターは、前記宿主細胞内に存在してもよく、または前記宿主細胞に組み込まれてもよい。
【0087】
好ましくは、Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と作動可能に関連する異種プロモーターを含む本発明の第２の核酸分子は、前記アデノウイルスベクター内の、Ｅ１領域もしくはＥ３領域に、またはＥ１／Ｅ３欠失領域に位置する。また、Ｌ５領域に挿入されてもよい。
【0088】
前記宿主細胞は、さらに、（ｄ）１つ以上のアデノウイルス初期遺伝子産物と作動可能に関連している１つ以上のプロモーターを含む１つ以上のさらなる核酸分子を含んでもよい。前記ＤＮＡ分子のＣＡＲＥ依存増幅を改善するために、１つ以上のアデノウイルス初期遺伝子産物を必要としてもよい。
【0089】
ＡＡＶの産生に関する本発明の実施形態において、ＡＡＶをパッケージングするという効果のために、１つ以上のアデノウイルス初期遺伝子産物を必要としてもよい。好ましくは、前記アデノウイルス初期遺伝子産物は、アデノウイルスＥ１Ａ、アデノウイルスＥ１Ｂ、アデノウイルスＥ２Ａ、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ、およびアデノウイルスＥ４から選択される。これらの遺伝子産物は、好ましくは宿主細胞内においてアデノウイルスベクター中に存在する。
【0090】
前記Ｅ２Ａポリペプチドは、ウイルスＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）をコードする。最も好ましくは、前記Ｅ２Ａポリペプチドは、アデノウイルスＥ２Ａポリペプチドである。
【0091】
好ましくは、アデノウイルスは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧ群に由来するヒトアデノウイルスである。より好ましくは、アデノウイルスはＢまたはＣまたはＤ群に由来するヒトアデノウイルスである。さらにより好ましくは、アデノウイルスベクターはＢまたはＣ群に由来するヒトアデノウイルスである。Ａｄ５およびＡｄ２（どちらもＣ群）がＡＡＶ製造用のヘルパーウイルスとして一般的に使用されるため、Ｃ群が好ましい。Ａｄ５が最も好ましいアデノウイルスである。
【0092】
好ましくは、Ｅ２Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号９に記載の配列を有する（アデノウイルスタイプ５）。好ましくは、前記Ｅ２Ａポリペプチドは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する（アデノウイルスタイプ５）。
【0093】
前記Ｅ２Ａポリペプチドをコードする核酸分子は、好ましくは、配列番号９に記載のヌクレオチド配列もしくは配列番号１０をコードするヌクレオチド配列；または配列番号９に対する配列同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％であるか、または配列番号１０をコードするヌクレオチド配列に対するヌクレオチド配列同一性が少なくとも８０％、９０％、９５％もしくは９９％であるヌクレオチド配列を有し、かつ、ＤＮＡ結合タンパク質をコードする、変異体である。
【0094】
好ましくは、前記Ｅ２Ａポリペプチドは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するか、または、配列番号１０に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％であって、かつ、ＤＮＡ結合タンパク質である変異体を有する。
【0095】
一部の実施形態において、Ｅ２Ａポリペプチドをコードする核酸分子はベクターまたはプラスミドの形態で提供される。前記ベクターまたはプラスミドは、前記宿主細胞内に（エピソーマルに）存在してもよく、または前記宿主細胞に組み込まれてもよい。他の実施形態において、Ｅ２Ａポリペプチドをコードする核酸分子は、前記宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれている。他の実施形態において、Ｅ２Ａポリペプチドをコードする前記核酸分子は、ウイルスベクター、たとえばヘルペスウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター中に存在し、好ましくはアデノウイルスベクター中に存在する。前記ウイルスベクターは、前記宿主細胞内に存在してもよく、または前記宿主細胞に組み込まれてもよい。
【0096】
好ましくは、Ｅ２Ａポリペプチドをコードする核酸分子は、アデノウイルスベクター中に提供され、より好ましくはその本来の位置に提供される。好ましくは、Ｅ２Ａポリペプチドをコードする核酸分子は、天然プロモーターと作動可能に関連しているか、または異種構成型プロモーターと作動可能に関連している。
【0097】
一部の実施形態において、前記第２の核酸分子およびさらなる核酸分子は、同じプラスミドもしくは同じベクター上に提供されるか、または、同じウイルスベクター中に存在する。
【0098】
一部の実施形態において、前記第１の核酸分子と前記第３の核酸分子とは、ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチドをコードするヌクレオチド配列がＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結する（したがって、ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が増幅される）ように連結している。
【0099】
前記第２の核酸分子は、Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と作動可能に関連する異種プロモーターを含む。本明細書において、「異種プロモーター」という用語は、Ｌ４ ２２Ｋ遺伝子が生来的に関連しているわけではないプロモーターのことをいう。野生型アデノウイルスにおいて、Ｌ４ ２２Ｋ遺伝子の発現は、主要後期プロモーターによって駆動される。前記の「異種プロモーター」という用語は、したがって、アデノウイルス主要後期プロモーターではないプロモーターのことをいう。
【0100】
一部の実施形態において、前記異種プロモーターはアデノウイルスプロモーターであり、ヘルペスウイルスプロモーターではなく、または、ウイルス性プロモーターでもない。一部の実施形態において、前記異種プロモーターは哺乳類プロモーターである。一部の実施形態において、前記異種プロモーターは、野生型アデノウイルス主要後期プロモーター（ＭＬＰ）に対する配列同一性が９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、または５０％未満であり、好ましくは配列番号１４のポリペプチドに対する配列同一性が９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、または５０％未満である。
【0101】
野生型Ａｄ５ ＭＬＰのヌクレオチド配列を以下に示す：
cgccctcttcggcatcaaggaaggtgattggtttgtaggtgtaggccacgtgaccgggtgttcctgaaggggggctataaaagggggtgggggcgcgttcgtcctca（配列番号14）
cgccctcttcggcatcaaggaaggtgattggtttgtaggtgtaggccacgtgaccgggtgttcctgaaggggggctataaaagggggtgggggcgcgttcgtcctca（配列番号14）
【0102】
ＴＡＴＡボックスは上記の配列において下線を付し、最終塩基（太字）は転写開始位置（すなわち＋１位）を表示する。
【0103】
一部の実施形態において、前記プロモーターは構成型プロモーターである。他の実施形態において、前記プロモーターは、誘導性または抑制性である。構成型プロモーターの例としては、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＰＧＫ（ヒトまたはマウス）、ＨＳＶ ＴＫ、ＳＦＦＶ、ユビキチン、伸長因子アルファ、ＣＨＥＦ－１、ＦｅｒＨ、Ｇｒｐ７８、ＲＳＶ、アデノウイルスＥ１Ａ、ＣＡＧ、もしくはＣＭＶベータグロブリンプロモーター、またはそれらから誘導されたプロモーターなどがある。好ましくは、前記プロモーターは、サイトメガロウイルス最初期（ＣＭＶ）プロモーター、もしくはそれから誘導されたプロモーター、または、ヒト細胞およびヒト細胞株（たとえばＨＥＫー２９３細胞）中のＣＭＶプロモーターと比較して同等の強度またはそれより大きい強度のプロモーターである。
【0104】
一部の実施形態において、前記プロモーターは、誘導性または抑制性の制御性（プロモーター）エレメントを含むことにより、誘導性または抑制性である。たとえば、前記プロモーターは、ドキシサイクリン、テトラサイクリン、ＩＰＴＧ、またはラクトースで誘導可能なものであってもよく、好ましくはテトラサイクリンであってもよい。
【0105】
一部の好ましい実施形態において、ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはｒｅｐ遺伝子は、機能的プロモーターと作動可能に関連していない。このように、Ｒｅｐポリペプチドの低レベルの発現が得られ、この発現レベルは、アデノウイルスの増殖を防止しない程度に十分低く、かつ、細胞に対して十分な毒性たとえばＡＡＶの産生を防止する程度の毒性があるわけではない。
【0106】
野生型ＡＡＶにおいて、前記ｒｅｐ遺伝子産物の発現が、ｐ５プロモーターおよびｐ１９プロモーターによって駆動される。本明細書において、「ｒｅｐ遺伝子が機能的プロモーターと作動可能に関連していない」という表現は、前記ｒｅｐ遺伝子が機能的ｐ５プロモーターまたは機能的ｐ１９プロモーターを含まず、かつ、前記ｒｅｐ遺伝子がその他のいずれの機能的プロモーターとも作動可能に関連しないこと、たとえばベースラインまたは最小限のみのｒｅｐ遺伝子の転写が得られるということを意味する。
【0107】
一部の好ましい実施形態において、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、前記アデノウイルスベクター内にコードされたポリペプチド（アクチベーター）によって活性化されることができるプロモーターの制御下で、前記宿主細胞ゲノムに組み込まれる。
【0108】
本発明のさらなる実施形態において、本発明のアデノウイルスベクターは、（遠隔）プロモーター、たとえば宿主細胞に存在するプロモーターを転写的に活性化することができるポリペプチドをコードする本発明の核酸分子を含む。好ましくは、前記宿主細胞中のプロモーターは、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子と作動可能に関連している（すなわち、その発現を駆動する）プロモーターである。
【0109】
一部の実施形態において、前記アデノウイルスベクターは、そのアデノウイルスベクター中に存在しないプロモーターを転写的に活性化することができるポリペプチドをコードする。
かかるアクチベーターの例としては、単純ヘルペスウイルス由来のＶＰ１６転写アクチベーター、およびｐ５３タンパク質由来のトランスアクチベータードメインなどがある。かかるアクチベーターは、ｃａｐ遺伝子プロモーター中のクメート（cumate）結合部位またはテトラサイクリン結合部位に結合するものなどのＤＮＡ結合ドメインに連結していてもよい。これによって、アデノウイルスベクターが宿主細胞内に存在する場合にのみｃａｐ遺伝子の転写が誘導され、アデノウイルスの製造中にＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を発現する負担を軽減する。
かかるアクチベーターの例としては、単純ヘルペスウイルス由来のＶＰ１６転写アクチベーター、およびｐ５３タンパク質由来のトランスアクチベータードメインなどがある。かかるアクチベーターは、ｃａｐ遺伝子プロモーター中のクメート（cumate）結合部位またはテトラサイクリン結合部位に結合するものなどのＤＮＡ結合ドメインに連結していてもよい。これによって、アデノウイルスベクターが宿主細胞内に存在する場合にのみｃａｐ遺伝子の転写が誘導され、アデノウイルスの製造中にＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を発現する負担を軽減する。
【0110】
前記宿主細胞は単離細胞であってもよく、たとえばそれらは生存する動物または生存する哺乳動物内に存在しない。好ましくは、前記宿主細胞は哺乳類細胞である。哺乳類細胞の例は、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、サル、ウサギ、ロバ、ウマ、ヒツジ、ウシおよび類人猿に由来する任意の臓器または組織に由来するものを含む。好ましくは、前記細胞はヒト細胞である。前記細胞は、初代細胞であってもよく、または不死化細胞であってもよい。
【0111】
好ましい細胞には、ＨＥＫ－２９３細胞株、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞株、ＨＥＫ－２９３Ｅ細胞株、ＨＥＫ－２９３ ＦＴ細胞株、ＨＥＫ－２９３Ｓ細胞株、ＨＥＫ－２９３ＳＧ細胞株、ＨＥＫ－２９３ ＦＴＭ細胞株、ＨＥＫ－２９３ＳＧＧＤ細胞株、ＨＥＫ－２９３Ａ細胞株、ＭＤＣＫ細胞株、Ｃ１２７細胞株、Ａ５４９細胞株、ＨｅＬａ細胞株、ＣＨＯ細胞株、マウス骨髄腫細胞株、ＰｅｒＣ６細胞株、９１１細胞株、およびＶｅｒｏ細胞株がある。ＨＥＫー２９３細胞はＥ１Ａタンパク質およびＥ１Ｂタンパク質を含むよう改変されており、このため、これらのタンパク質が、ヘルパープラスミドに供給されたり、本発明に使用されるアデノウイルスベクター内に存在したりする必要が無い。同様に、ＰｅｒＣ６細胞および９１１細胞はより小さな改変を含み、これもまた使用することができる。最も好ましくは、ヒト細胞は、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ａ、ＰｅｒＣ６、または９１１である。他の好ましい細胞には、Ｈｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞およびＶＥＲＯ細胞などがある。
【0112】
前記宿主細胞は、前記第２および第３の核酸分子、ならびにさらなる核酸分子が発現するような条件下で、（適切な培地で）培養される。宿主細胞のための好適な培養条件が当該技術分野においてよく知られている（たとえば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Fourth Edition), Green, MR and Sambrook, J., (updated 2014)）。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、培養培地で培養され、好ましくは液体培養培地で培養されうる。
【0113】
本発明のいくつかの実施形態において、前記第２の核酸分子は、アデノウイルスＬ４ ３３Ｋポリペプチド、アデノウイルスＬ４ １００Ｋポリペプチド、またはアデノウイルスｐＶＩＩＩポリペプチドの１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含んでいない。本発明のいくつかの実施形態において、前記さらなる核酸分子は、Ｅ２Ｂポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでいない。本発明のいくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスを含んでいない。
【0114】
前記ＣＡＲＥエレメントは、作動可能に連結したＤＮＡ分子の増幅を促進できる。この点において、前記ＣＡＲＥエレメントは複製起点として作用している。本明細書において、「増幅する」という用語は、複数のＤＮＡ分子の産生のことをいう。前記複数のＤＮＡ分子は、異なる長さのＤＮＡ分子を含みうる。前記複数のＤＮＡ分子のうちのそれぞれのＤＮＡ分子は、ＣＡＲＥエレメントのヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含み、好ましくは、ＣＡＲＥエレメントのヌクレオチド配列のすべてを含みうる。前記複数のＤＮＡ分子のうちのそれぞれのＤＮＡ分子は、作動可能に連結したＤＮＡ分子のすべてまたは一部を含むヌクレオチド配列を含みうる。一部の実施形態において、複数の（増幅された）ＤＮＡ分子は、５０～１０００の個別のＤＮＡ分子からなってもよく、またはそれ以上からなってもよい。
【0115】
前記複数の増幅されたＤＮＡ分子は、二本鎖ＤＮＡ分子である。前記複数の増幅されたＤＮＡ分子は、直鎖の染色体外分子である。
【0116】
一部の実施形態において、本発明の方法はさらに、前記増幅したＤＮＡ分子および／またはその遺伝子産物を単離および／または精製する工程を含む。たとえば、前記増幅されたＤＮＡ産物は、エタノールの存在下でシリカ樹脂を使用したＤＮＡ精製によって精製されてもよい。前記増幅されたＤＮＡ産物の遺伝子産物（たとえばポリペプチド）は、たとえばアフィニティクロマトグラフィなど特定の産物の精製に適した方法によって精製されてもよい。
【0117】
本発明のＤＮＡ分子、プラスミドおよびベクターは、なんらかの好適な技術によって作成されてもよい。本発明の核酸分子およびパッケージング細胞の産生ための組み換え方法は、当該技術分野においてよく知られている（たとえば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Fourth Edition), Green, MR and Sambrook, J., (updated 2014)）。本発明のＤＮＡ分子由来のｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子ならびにＬ４ ２２Ｋ遺伝子の発現は、なんらかの適したアッセイによって、たとえば、（本明細書の実施例に記載されているように）ｍｌあたりのゲノムコピーの数についてｑＰＣＲで解析することによって、解析してもよい。
【0118】
さらなる実施形態において、本発明は、宿主細胞中においてＤＮＡ分子を増幅する方法であって、
前記ＤＮＡ分子は、ＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結し、
前記宿主細胞は、
（ａ）ＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結している前記ＤＮＡ分子を含む第１の核酸分子であって、前記ＤＮＡ分子は、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含む、第１の核酸分子と、
（ｂ）Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と作動可能に関連する異種プロモーターを含む第２の核酸分子とを、
を含み、
場合によってはこれらに加えて、
（ｃ）１つ以上のアデノウイルス初期遺伝子産物と作動可能に関連している１つ以上のプロモーターを含む１つ以上のさらなる核酸分子を、
を含む宿主細胞であり、
前記宿主細胞を、前記第２の核酸分子、ならびに場合によって追加された１つ以上の前記さらなる核酸分子が発現するような条件下で培養し、前記ＤＮＡ分子の増幅を促進することを含むＤＮＡ分子の増幅方法を提供する。
前記ＤＮＡ分子は、ＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結し、
前記宿主細胞は、
（ａ）ＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結している前記ＤＮＡ分子を含む第１の核酸分子であって、前記ＤＮＡ分子は、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含む、第１の核酸分子と、
（ｂ）Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と作動可能に関連する異種プロモーターを含む第２の核酸分子とを、
を含み、
場合によってはこれらに加えて、
（ｃ）１つ以上のアデノウイルス初期遺伝子産物と作動可能に関連している１つ以上のプロモーターを含む１つ以上のさらなる核酸分子を、
を含む宿主細胞であり、
前記宿主細胞を、前記第２の核酸分子、ならびに場合によって追加された１つ以上の前記さらなる核酸分子が発現するような条件下で培養し、前記ＤＮＡ分子の増幅を促進することを含むＤＮＡ分子の増幅方法を提供する。
【0119】
一部の実施形態において、前記第２の核酸分子は、宿主細胞においてアデノウイルスベクター中に存在する。一部の実施形態において、前記アデノウイルスベクターは、さらにＡＡＶ トランスファープラスミドを含む。
【0120】
さらなる一実施形態において、本発明は、宿主細胞中においてＤＮＡ分子を増幅する方法であって、
前記ＤＮＡ分子は、ＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結し、
前記宿主細胞は、
（ａ）ＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結している前記ＤＮＡ分子を含む第１の核酸分子であって、前記ＤＮＡ分子は、ｃａｐ遺伝子、および場合によってはさらにＡＡＶトランスファープラスミドを含む、第１の核酸分子と、
（ｂ）Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と作動可能に関連する異種プロモーターを含む第２の核酸分子と、
（ｃ）ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列を含む第３の核酸分子とを、
含み、
場合によってはこれらに加えて、
（ｄ）１つ以上のアデノウイルス初期遺伝子産物と作動可能に関連している１つ以上のプロモーターを含む１つ以上のさらなる核酸分子を、
含む宿主細胞であり、
前記宿主細胞を、前記第２および第３の核酸分子、ならびに場合によって追加された１つ以上の前記さらなる核酸分子が発現するような条件下で培養し、前記ＤＮＡ分子の増幅を促進することを含むＤＮＡ分子の増幅方法を提供する。
前記ＤＮＡ分子は、ＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結し、
前記宿主細胞は、
（ａ）ＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結している前記ＤＮＡ分子を含む第１の核酸分子であって、前記ＤＮＡ分子は、ｃａｐ遺伝子、および場合によってはさらにＡＡＶトランスファープラスミドを含む、第１の核酸分子と、
（ｂ）Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と作動可能に関連する異種プロモーターを含む第２の核酸分子と、
（ｃ）ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列を含む第３の核酸分子とを、
含み、
場合によってはこれらに加えて、
（ｄ）１つ以上のアデノウイルス初期遺伝子産物と作動可能に関連している１つ以上のプロモーターを含む１つ以上のさらなる核酸分子を、
含む宿主細胞であり、
前記宿主細胞を、前記第２および第３の核酸分子、ならびに場合によって追加された１つ以上の前記さらなる核酸分子が発現するような条件下で培養し、前記ＤＮＡ分子の増幅を促進することを含むＤＮＡ分子の増幅方法を提供する。
【0121】
一部の実施形態において、前記第２の核酸分子および／または前記第３の核酸分子は、宿主細胞においてアデノウイルスベクター中に存在する。
【0122】
好ましくは、前記ｒｅｐ遺伝子は機能的プロモーターと作動可能に関連していない。好ましくは、前記ｒｅｐ遺伝子がＥ１／Ｅ３欠失アデノウイルスベクターのＥ１領域に挿入されている。好ましくは、前記ｒｅｐ遺伝子コーディング配列は、Ｅ１領域に位置する場合、Ｅ２Ｂ転写ユニット、Ｅ２Ａ転写ユニットおよびＥ４転写ユニットと同じＤＮＡ鎖にコードされている。
【0123】
さらなる実施形態においては、改変された宿主細胞（modified host cell）を生成するためのプロセスが提供され、
前記プロセスは、工程（ａ）及び／又は工程（ｂ）を含み、選択的に工程（ｃ）を含む。
（ａ）本発明の第１の核酸分子を宿主細胞に導入する工程：
ここで、前記第１の核酸分子は、ＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結しているＡＡＶ ｃａｐ遺伝子をコードするＤＮＡ分子を含む、
（ｂ）本発明の第２の核酸分子を宿主細胞に導入する工程：
（ｃ）本発明の第３の核酸分子を宿主細胞に導入する工程：
ここで、前記導入は、前記第１、第２、および第３（存在する場合）の核酸分子は、それぞれ独立して、
（ｉ）前記宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれるか、または
（ｉｉ）前記宿主細胞内にエピソーマルに存在する
ように行う。
前記プロセスは、工程（ａ）及び／又は工程（ｂ）を含み、選択的に工程（ｃ）を含む。
（ａ）本発明の第１の核酸分子を宿主細胞に導入する工程：
ここで、前記第１の核酸分子は、ＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結しているＡＡＶ ｃａｐ遺伝子をコードするＤＮＡ分子を含む、
（ｂ）本発明の第２の核酸分子を宿主細胞に導入する工程：
（ｃ）本発明の第３の核酸分子を宿主細胞に導入する工程：
ここで、前記導入は、前記第１、第２、および第３（存在する場合）の核酸分子は、それぞれ独立して、
（ｉ）前記宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれるか、または
（ｉｉ）前記宿主細胞内にエピソーマルに存在する
ように行う。
【0124】
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチド、および／または、Ｃａｐポリペプチド、および／または、ＡＡＶゲノムを発現するか、もしくは発現することができる宿主細胞である。
【0125】
たとえば、前記宿主細胞は、ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチド、および／または、Ｃａｐポリペプチド、および／または、ＡＡＶゲノムをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上のＤＮＡ分子が安定的に組み込まれた宿主細胞であってもよい。Ｒｅｐポリペプチド、および／または、Ｃａｐポリペプチド、および／または、ＡＡＶゲノムをコードする前記ヌクレオチド配列は、好ましくは、好適な調節エレメントと、たとえば誘導性プロモーターまたは構成型プロモーターと、作動可能に関連する。
【0126】
たとえば、前記宿主細胞は、ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチド、および／または、Ｃａｐポリペプチド、および／または、ＡＡＶゲノムをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上のＤＮＡプラスミドまたはＤＮＡベクターを含む宿主細胞であってもよい。Ｒｅｐポリペプチド、および／または、Ｃａｐポリペプチド、および／または、ＡＡＶゲノムをコードする前記ヌクレオチド配列は、好ましくは、好適な調節エレメント、たとえば誘導性プロモーターまたは構成型プロモーターと作動可能に関連する。
前記宿主細胞は、ＡＡＶパッケージング細胞またはＡＡＶ作成細胞であってもよい。
前記宿主細胞は、ＡＡＶパッケージング細胞またはＡＡＶ作成細胞であってもよい。
【0127】
さらなる実施形態においては、本発明はまた、改変されたアデノウイルスベクターを産生するためのプロセスを提供し、前記プロセスは、
（ａ）Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と作動可能に関連する異種プロモーターを含む核酸分子を、アデノウイルスベクターに導入する工程を含み、
場合によっては、
（ｂ）ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子をアデノウイルスベクターに導入する工程であって、前記アデノウイルス中で、前記ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチドをコードする核酸分子は機能的プロモーターと作動可能に関連していない工程を含む。
（ａ）Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と作動可能に関連する異種プロモーターを含む核酸分子を、アデノウイルスベクターに導入する工程を含み、
場合によっては、
（ｂ）ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子をアデノウイルスベクターに導入する工程であって、前記アデノウイルス中で、前記ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチドをコードする核酸分子は機能的プロモーターと作動可能に関連していない工程を含む。
【0128】
さらなる実施形態においては、本発明は、ウイルス粒子を産生するためのプロセスを提供し、前記プロセスは、下記工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む。
（ａ）導入遺伝子に隣接する５’－ウイルスＩＴＲおよび３’－ウイルスＩＴＲを含むトランスファープラスミドを宿主細胞に導入する工程：
ここで、前記宿主細胞は、
（ｉ）Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と作動可能に関連する異種プロモーターを含む本発明の第２の核酸分子と、
（ｉｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子であって、前記ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子は、パッケージング細胞内のエピソームプラスミド中に存在するか、または、前記パッケージング細胞ゲノムに組み込まれ、前記ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子はＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結する、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子と、
（ｉｉｉ）トランスファープラスミドをパッケージするのに十分なヘルパー遺伝子であって、前記ヘルパー遺伝子は前記細胞内のエピソームヘルパープラスミド中に存在するか、アデノウイルスベクター中に存在するか、または前記パッケージング細胞ゲノムに組み込まれる、ヘルパー遺伝子と
を含む。
（ｂ）ウイルス粒子が前記宿主細胞によって集合させられるような条件下で、前記宿主細胞を培養する工程：
（ｃ）パッケージされたウイルス粒子を前記宿主細胞から回収するか、または前記培養培地から回収する工程。
（ａ）導入遺伝子に隣接する５’－ウイルスＩＴＲおよび３’－ウイルスＩＴＲを含むトランスファープラスミドを宿主細胞に導入する工程：
ここで、前記宿主細胞は、
（ｉ）Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と作動可能に関連する異種プロモーターを含む本発明の第２の核酸分子と、
（ｉｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子であって、前記ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子は、パッケージング細胞内のエピソームプラスミド中に存在するか、または、前記パッケージング細胞ゲノムに組み込まれ、前記ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子はＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結する、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子と、
（ｉｉｉ）トランスファープラスミドをパッケージするのに十分なヘルパー遺伝子であって、前記ヘルパー遺伝子は前記細胞内のエピソームヘルパープラスミド中に存在するか、アデノウイルスベクター中に存在するか、または前記パッケージング細胞ゲノムに組み込まれる、ヘルパー遺伝子と
を含む。
（ｂ）ウイルス粒子が前記宿主細胞によって集合させられるような条件下で、前記宿主細胞を培養する工程：
（ｃ）パッケージされたウイルス粒子を前記宿主細胞から回収するか、または前記培養培地から回収する工程。
【0129】
前記培養培地は、前記宿主細胞を取り囲む培地である。好ましくは、前記ウイルスはＡＡＶである。好ましくは、前記宿主細胞はウイルスパッケージング細胞である。好ましくは、回収されたウイルス粒子はその後精製される。
【0130】
前記ヘルパー遺伝子は、好ましくは、（アデノウイルス）Ｅ１Ａ遺伝子、（アデノウイルス）Ｅ１Ｂ遺伝子、（アデノウイルス）Ｅ２Ａ遺伝子、（アデノウイルス）Ｅ４遺伝子、および（アデノウイルス）ＶＡ遺伝子の１つ以上から選択される。本発明の一部の実施形態において、前記ヘルパー遺伝子はさらにＥ２Ａ遺伝子を含む。他の実施形態において、前記ヘルパー遺伝子はＥ２Ａ遺伝子を含まない。
【0131】
本明細書において、１つ以上のプラスミドまたはベクターを細胞に「導入する」という用語は、形質転換を含み、特に、エレクトロポレーション、接合、感染、形質導入またはトランスフェクションのいずれの形態をも含む。かかる導入のプロセスは、当該技術分野において知られている（たとえば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995 Aug 1;92 (16):7297-301）。
【0132】
一部の好ましい実施形態においては、前記導入遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ酵素（たとえば、Ｃａｓ９，Ｃｐｆ１）またはＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡをコードする。他の実施形態において、前記導入遺伝子は、血友病に関与する遺伝子（たとえば、因子ＶＩＩＩまたは因子ＩＸ）である。
【0133】
ＷＯ２０１９／０２０９９２は、後期アデノウイルス遺伝子の転写が、リプレッサーエレメントの主要後期プロモーターへの挿入により調節（阻害など）できることを開示している。アデノウイルス後期遺伝子の発現の「スイッチを切る」ことにより、細胞のタンパク質製造能力を所望の組み換えタンパク質またはＡＡＶ粒子の産生に転用することができる。しかしながら、その後出願人らは、ＷＯ２０１９／０２０９９２に記載のように主要後期プロモーターを抑制することにより後期アデノウイルス遺伝子を阻害することは、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子が宿主細胞ゲノムに組み込まれる場合にはこれらの遺伝子のＣＡＲＥ依存複製を阻害するという、望ましくない効果を有することを見出した。Ｌ４ ２２ＫポリペプチドがＣＡＲＥエレメント誘導ポリペプチドであると特定することにより、Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドがシスまたはトランスで供給されるＷＯ２０１９／０２０９９２（その内容はすべて、特に本明細書に援用される）に記載の発明を利用するＡＡＶ産生システムの使用が可能になる。
【0134】
他の実施形態において、本発明は、ウイルス粒子を産生するためのプロセスを提供し、前記プロセスは、下記工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む。
（ａ）宿主細胞にアデノウイルスベクターを導入する工程：
ここで、前記アデノウイルスベクターは、
（ｉ）Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と作動可能に関連する異種プロモーターを含む本発明の第２の核酸分子と、
（ｉｉ）導入遺伝子に隣接する５’－ウイルスＩＴＲおよび３’－ウイルスＩＴＲを含むトランスファープラスミドと、
（ｉｉｉ）ウイルストランスファープラスミドをパッケージするための十分なヘルパー遺伝子と
を含み、
前記宿主細胞はＣＡＲＥエレメントを含み、前記ＣＡＲＥエレメントが、
（ｉ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子と、
（ｉｉ）ウイルスＲｅｐポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、好ましくは前記ヌクレオチド配列は機能的プロモーターと作動可能に関連していない核酸分子と
可能に連結する。
（ｂ）ウイルス粒子が前記宿主細胞内で集合するような条件下で、前記宿主細胞を培養する工程：
（ｃ）パッケージされたウイルス粒子を前記宿主細胞から回収するか、または前記培養培地から回収する工程。
（ａ）宿主細胞にアデノウイルスベクターを導入する工程：
ここで、前記アデノウイルスベクターは、
（ｉ）Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と作動可能に関連する異種プロモーターを含む本発明の第２の核酸分子と、
（ｉｉ）導入遺伝子に隣接する５’－ウイルスＩＴＲおよび３’－ウイルスＩＴＲを含むトランスファープラスミドと、
（ｉｉｉ）ウイルストランスファープラスミドをパッケージするための十分なヘルパー遺伝子と
を含み、
前記宿主細胞はＣＡＲＥエレメントを含み、前記ＣＡＲＥエレメントが、
（ｉ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子と、
（ｉｉ）ウイルスＲｅｐポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、好ましくは前記ヌクレオチド配列は機能的プロモーターと作動可能に関連していない核酸分子と
可能に連結する。
（ｂ）ウイルス粒子が前記宿主細胞内で集合するような条件下で、前記宿主細胞を培養する工程：
（ｃ）パッケージされたウイルス粒子を前記宿主細胞から回収するか、または前記培養培地から回収する工程。
【0135】
他の実施形態において、本発明は、ウイルス粒子を産生するためのプロセスを提供し、前記プロセスは、下記工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む。
（ａ）宿主細胞にアデノウイルスベクターを導入する工程：
ここで、前記アデノウイルスベクターは、
（ｉ）Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と作動可能に関連する異種プロモーターを含む本発明の第２の核酸分子と、
（ｉｉ）ウイルスＲｅｐポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、好ましくは前記ヌクレオチド配列が機能的プロモーターと作動可能に関連していない核酸分子と、
（ｉｉｉ）ウイルストランスファープラスミドをパッケージするための十分なヘルパー遺伝子と、
を含み、
前記宿主細胞が、
（ｉ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子と作動可能に連結しているＣＡＲＥエレメントと、
（ｉｉ）導入遺伝子に隣接する５’－ウイルスＩＴＲおよび３’－ウイルスＩＴＲを含むトランスファープラスミドであって、前記ＣＡＲＥエレメントと作動可能に連結していてもしていなくてもよいトランスファープラスミドと、
を、
前記宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれた状態で含む。
（ｂ）ウイルス粒子が前記宿主細胞内で集合するような条件下で、前記宿主細胞を培養する工程：
（ｃ）パッケージされたウイルス粒子を前記宿主細胞から回収するか、または前記培養培地から回収する工程。
（ａ）宿主細胞にアデノウイルスベクターを導入する工程：
ここで、前記アデノウイルスベクターは、
（ｉ）Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と作動可能に関連する異種プロモーターを含む本発明の第２の核酸分子と、
（ｉｉ）ウイルスＲｅｐポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、好ましくは前記ヌクレオチド配列が機能的プロモーターと作動可能に関連していない核酸分子と、
（ｉｉｉ）ウイルストランスファープラスミドをパッケージするための十分なヘルパー遺伝子と、
を含み、
前記宿主細胞が、
（ｉ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子と作動可能に連結しているＣＡＲＥエレメントと、
（ｉｉ）導入遺伝子に隣接する５’－ウイルスＩＴＲおよび３’－ウイルスＩＴＲを含むトランスファープラスミドであって、前記ＣＡＲＥエレメントと作動可能に連結していてもしていなくてもよいトランスファープラスミドと、
を、
前記宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれた状態で含む。
（ｂ）ウイルス粒子が前記宿主細胞内で集合するような条件下で、前記宿主細胞を培養する工程：
（ｃ）パッケージされたウイルス粒子を前記宿主細胞から回収するか、または前記培養培地から回収する工程。
【0136】
一部の好ましい実施形態において、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、アデノウイルスベクター内にコードされたポリペプチドによって活性化されるプロモーターの制御下で、前記宿主細胞ゲノムに組み込まれる。好ましくは、前記ウイルスはＡＡＶである。好ましくは、前記宿主細胞はウイルスパッケージング細胞である。
【0137】
好ましくは、前記アデノウイルスベクターは抑制可能な主要後期プロモーター（ＭＬＰ）を含み、より好ましくは、前記ＭＬＰがアデノウイルス後期遺伝子の転写を調節または制御することのできる１つ以上のリプレッサーエレメントを含み、かつ前記リプレッサーエレメントの１つ以上がＭＬＰ ＴＡＴＡボックスの下流に挿入される。
【0138】
好ましくは、前記ＣＡＲＥエレメント、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、およびトランスファープラスミドは、
（ｉ）前記宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれるか、または
（ｉｉ）前記宿主細胞においてエピソームプラスミド中、またはエピソームベクター中に存在する。
（ｉ）前記宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれるか、または
（ｉｉ）前記宿主細胞においてエピソームプラスミド中、またはエピソームベクター中に存在する。
【0139】
ウイルス（好ましくはＡＡＶ）粒子を産生するプロセスの好ましい特徴は、下記のものがある。
－ＭＬＰ ＴＡＴＡボックスと転写+１位との間に１つ以上のリプレッサーエレメントが挿入される。
－前記リプレッサーエレメントがリプレッサータンパク質と結合することのできるものである。
－リプレッサーエレメントと結合することのできるリプレッサータンパク質をコードする遺伝子がアデノウイルスゲノム内でコードされる。
－前記リプレッサータンパク質が前記ＭＬＰの制御下で転写される。
－前記リプレッサータンパク質がテトラサイクリンリプレッサー、ラクトースリプレッサーまたはエクジソンリプレッサーであり、好ましくはテトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）である。
－前記リプレッサーエレメントが配列番号１１に示す配列を含むかまたはこれからなるテトラサイクリンリプレッサー結合部位である。
－前記ＭＬＰのヌクレオチド配列が、配列番号12または配列番号13に示す配列を含むかまたはこれからなる。
－リプレッサーエレメントの存在はアデノウイルスＥ２Ｂタンパク質の産生に影響しない。
－前記アデノウイルスベクターがアデノウイルスＬ４ １００Ｋタンパク質をコードし、かつ前記Ｌ４ １００Ｋタンパク質は前記ＭＬＰの制御下にない。
－導入遺伝子が、アデノウイルス初期領域の１つの内に挿入され、好ましくはトランスファープラスミドの中の代わりにアデノウイルスＥ１領域の中に挿入される。
－前記導入遺伝子はその５'－ＵＴＲに三分節系リーダー（ＴＰＬ）を含む。
－前記導入遺伝子は治療ポリペプチドをコードする。
－前記導入遺伝子はウイルスタンパク質をコードし、好ましくは細胞の中または外に集まってウイルス様粒子を産生することができるタンパク質をコードし、好ましくは前記導入遺伝子はノロウイルスＶＰ１または肝炎Ｂ ＨＢｓＡＧをコードする。
－ＭＬＰ ＴＡＴＡボックスと転写+１位との間に１つ以上のリプレッサーエレメントが挿入される。
－前記リプレッサーエレメントがリプレッサータンパク質と結合することのできるものである。
－リプレッサーエレメントと結合することのできるリプレッサータンパク質をコードする遺伝子がアデノウイルスゲノム内でコードされる。
－前記リプレッサータンパク質が前記ＭＬＰの制御下で転写される。
－前記リプレッサータンパク質がテトラサイクリンリプレッサー、ラクトースリプレッサーまたはエクジソンリプレッサーであり、好ましくはテトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）である。
－前記リプレッサーエレメントが配列番号１１に示す配列を含むかまたはこれからなるテトラサイクリンリプレッサー結合部位である。
－前記ＭＬＰのヌクレオチド配列が、配列番号12または配列番号13に示す配列を含むかまたはこれからなる。
－リプレッサーエレメントの存在はアデノウイルスＥ２Ｂタンパク質の産生に影響しない。
－前記アデノウイルスベクターがアデノウイルスＬ４ １００Ｋタンパク質をコードし、かつ前記Ｌ４ １００Ｋタンパク質は前記ＭＬＰの制御下にない。
－導入遺伝子が、アデノウイルス初期領域の１つの内に挿入され、好ましくはトランスファープラスミドの中の代わりにアデノウイルスＥ１領域の中に挿入される。
－前記導入遺伝子はその５'－ＵＴＲに三分節系リーダー（ＴＰＬ）を含む。
－前記導入遺伝子は治療ポリペプチドをコードする。
－前記導入遺伝子はウイルスタンパク質をコードし、好ましくは細胞の中または外に集まってウイルス様粒子を産生することができるタンパク質をコードし、好ましくは前記導入遺伝子はノロウイルスＶＰ１または肝炎Ｂ ＨＢｓＡＧをコードする。
【0140】
他の実施形態において、本発明は、Ｌ４ ２２ ＫポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を提供し、
（ｉ）前記ＤＮＡ分子は、アデノウイルス主要後期プロモーターではないプロモーターと作動可能に関連し、
（ｉｉ）前記ＤＮＡ分子は、哺乳類プロモーターと作動可能に関連し、
（ｉｉｉ）前記ＤＮＡ分子は、アデノウイルスＬ４ １００ Ｋポリペプチド、アデノウイルスＬ４ ３３Ｋポリペプチド、またはアデノウイルスｐＶＩＩポリペプチドをさらにコードすることがなく、
（ｉｖ）前記ＤＮＡ分子は、ＣＭＶプロモーター、ＰＧＫプロモーター、またはＳＶ４０プロモーターと作動可能に関連している。
（ｉ）前記ＤＮＡ分子は、アデノウイルス主要後期プロモーターではないプロモーターと作動可能に関連し、
（ｉｉ）前記ＤＮＡ分子は、哺乳類プロモーターと作動可能に関連し、
（ｉｉｉ）前記ＤＮＡ分子は、アデノウイルスＬ４ １００ Ｋポリペプチド、アデノウイルスＬ４ ３３Ｋポリペプチド、またはアデノウイルスｐＶＩＩポリペプチドをさらにコードすることがなく、
（ｉｖ）前記ＤＮＡ分子は、ＣＭＶプロモーター、ＰＧＫプロモーター、またはＳＶ４０プロモーターと作動可能に関連している。
【0141】
他の実施形態において、本発明は宿主細胞を提供し、前記宿主細胞は、
（ａ）Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と作動可能に関連する異種プロモーターを含む、本発明の第２の核酸分子を含み、
前記核酸分子は、前記宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれているか、または、エピソームプラスミドもしくはエピソームベクター中に存在する。
（ａ）Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と作動可能に関連する異種プロモーターを含む、本発明の第２の核酸分子を含み、
前記核酸分子は、前記宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれているか、または、エピソームプラスミドもしくはエピソームベクター中に存在する。
【0142】
好ましくは、
（ｉ）前記異種プロモーターは、アデノウイルス主要後期プロモーターではない；
（ｉｉ）前記プロモーターは、哺乳類プロモーターである；
（ｉｉｉ）前記核酸分子は、アデノウイルスＬ４ １００ Ｋポリペプチド、アデノウイルスＬ４ ３３Ｋポリペプチド、またはアデノウイルスｐＶＩＩポリペプチドをさらにコードすることがない；または
（ｉｖ）前記ＤＮＡ分子は、ＣＭＶプロモーター、ＰＧＫプロモーター、またはＳＶ４０プロモーターと作動可能に関連している。
（ｉ）前記異種プロモーターは、アデノウイルス主要後期プロモーターではない；
（ｉｉ）前記プロモーターは、哺乳類プロモーターである；
（ｉｉｉ）前記核酸分子は、アデノウイルスＬ４ １００ Ｋポリペプチド、アデノウイルスＬ４ ３３Ｋポリペプチド、またはアデノウイルスｐＶＩＩポリペプチドをさらにコードすることがない；または
（ｉｖ）前記ＤＮＡ分子は、ＣＭＶプロモーター、ＰＧＫプロモーター、またはＳＶ４０プロモーターと作動可能に関連している。
【0143】
好ましくは、前記宿主細胞は本明細書において定義されたものである。
【0144】
一部の実施形態において、前記宿主細胞はさらに、
（ｂ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含み、前記ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子が、宿主細胞内のエピソームプラスミド中に存在するか、または、前記パッケージング細胞ゲノムに安定的に組み込まれ、前記ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子はＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結する。
（ｂ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含み、前記ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子が、宿主細胞内のエピソームプラスミド中に存在するか、または、前記パッケージング細胞ゲノムに安定的に組み込まれ、前記ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子はＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結する。
【0145】
さらに他の実施形態において、前記宿主細胞はさらに、
（ｃ）ＩＴＲが隣接する導入遺伝子を含むＡＡＶトランスファープラスミドと、
（ｄ）Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４およびＶＡ ＲＮＡから選択される１つ以上の遺伝子を含むＡＡＶ産生のためのアデノウイルスヘルパープラスミドとのうちの、１つまたは両方を含む。
（ｃ）ＩＴＲが隣接する導入遺伝子を含むＡＡＶトランスファープラスミドと、
（ｄ）Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４およびＶＡ ＲＮＡから選択される１つ以上の遺伝子を含むＡＡＶ産生のためのアデノウイルスヘルパープラスミドとのうちの、１つまたは両方を含む。
【0146】
かかる細胞は、一般的にパッケージング細胞として知られている。
【0147】
本発明の一部の実施形態において、前記ヘルパープラスミドはさらにＥ２Ａ遺伝子を含む。他の実施形態において、前記ヘルパープラスミドはＥ２Ａ遺伝子を含んでいない。後者の場合、Ｅ２Ａ遺伝子が無いために、ヘルパープラスミドに必要とされるＤＮＡの量がかなり削減される。
【0148】
他の実施形態において、本発明は宿主細胞を提供し、前記宿主細胞は、
（ａ）ＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結しているＤＮＡ分子を含む本発明の第１の核酸分子を含み、
前記ＤＮＡ分子は、
（ｉ）ＡＡＶ Ｃａｐポリペプチドと、
（ｉｉ）ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチドと、
（ｉｉｉ）ＡＡＶトランスファーベクターと
のうちの１つ以上をコードし、
前記第１の核酸分子は、前記宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれているか、またはエピソームプラスミド中に存在する。
（ａ）ＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結しているＤＮＡ分子を含む本発明の第１の核酸分子を含み、
前記ＤＮＡ分子は、
（ｉ）ＡＡＶ Ｃａｐポリペプチドと、
（ｉｉ）ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチドと、
（ｉｉｉ）ＡＡＶトランスファーベクターと
のうちの１つ以上をコードし、
前記第１の核酸分子は、前記宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれているか、またはエピソームプラスミド中に存在する。
【0149】
さらに他の実施形態において、前記発明は、アデノウイルスＬ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードする核酸分子を含むアデノウイルスベクターを提供し、前記Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードする配列は、前記アデノウイルスＭＬＰと作動可能に関連していない。
【0150】
かかる一部の実施形態において、天然型Ｌ４ ２２Ｋコーディング配列に加えて、新たなＬ４ ２２Ｋコーディング配列を、アデノウイルスベクターに挿入することが好ましい。
【0151】
かかる実施形態において、前記アデノウイルスベクターは、
（ｉ）アデノウイルスＬ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードする核酸分子であって、前記Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードする配列は、前記アデノウイルスＭＬＰと作動可能に関連していない核酸分子と、
（ｉｉ）アデノウイルスＬ４ ２２Ｋポリペプチドをコードする核酸分子と
を含み、
前記Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドコーディング配列は、前記アデノウイルスＭＬＰと作動可能に関連している。
（ｉ）アデノウイルスＬ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードする核酸分子であって、前記Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードする配列は、前記アデノウイルスＭＬＰと作動可能に関連していない核酸分子と、
（ｉｉ）アデノウイルスＬ４ ２２Ｋポリペプチドをコードする核酸分子と
を含み、
前記Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドコーディング配列は、前記アデノウイルスＭＬＰと作動可能に関連している。
【0152】
好ましくは、前記アデノウイルスＭＬＰは、（たとえば、本明細書において定義されているような）抑制可能ＭＬＰである。
【0153】
このましくは、前記アデノウイルスベクターは、ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含み、より好ましくは、前記核酸分子は機能的プロモーターと作動可能に関連していない。
【0154】
好ましくは、前記Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドコーディング配列は、前記アデノウイルスＥ１領域またはアデノウイルスＥ３領域に挿入される。
【0155】
本発明はまた、（Ａ）宿主細胞と、（Ｂ）アデノウイルスベクターを含むキットを提供し、
（Ａ）前記宿主細胞は、
（ａ）ＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結している前記ＤＮＡ分子を含む本発明の第１の核酸分子を含み、前記ＤＮＡ分子は、
（ｉ）ＡＡＶ Ｃａｐポリペプチドと、
（ｉｉ）ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチドと、
のうちの１つ以上をコードし、
前記第１の核酸分子は、前記宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれているか、または、エピソームプラスミド中に存在し、
（Ｂ）前記アデノウイルスベクターは、
（ｉ）アデノウイルスＬ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードする核酸分子であって、Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードする配列が前記アデノウイルスＭＬＰと作動可能に関連していない核酸分子と、
（ｉｉ）ＡＡＶトランスファーベクターをコードする核酸分子と、
を含む。
（Ａ）前記宿主細胞は、
（ａ）ＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結している前記ＤＮＡ分子を含む本発明の第１の核酸分子を含み、前記ＤＮＡ分子は、
（ｉ）ＡＡＶ Ｃａｐポリペプチドと、
（ｉｉ）ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチドと、
のうちの１つ以上をコードし、
前記第１の核酸分子は、前記宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれているか、または、エピソームプラスミド中に存在し、
（Ｂ）前記アデノウイルスベクターは、
（ｉ）アデノウイルスＬ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードする核酸分子であって、Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードする配列が前記アデノウイルスＭＬＰと作動可能に関連していない核酸分子と、
（ｉｉ）ＡＡＶトランスファーベクターをコードする核酸分子と、
を含む。
【0156】
本発明はまた、（Ａ）宿主細胞と、（Ｂ）アデノウイルスベクターを含むキットを提供し、
（Ａ）前記宿主細胞は、
（ａ）ＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結している前記ＤＮＡ分子を含む本発明の第１の核酸分子を含み、前記ＤＮＡ分子は、
（ｉ）ＡＡＶ Ｃａｐポリペプチドと、
場合によっては、
（ｉｉ）ＡＡＶトランスファーベクターとのうちの１つ以上をコードし、
前記第１の核酸分子は、前記宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれているか、または、エピソームプラスミド中に存在し、
（Ｂ）前記アデノウイルスベクターは、
（ｉ）アデノウイルスＬ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードする核酸分子であって、Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードする配列が前記アデノウイルスＭＬＰと作動可能に関連していない核酸分子と、
（ｉｉ）ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチドをコードする核酸分子と、を含み、
好ましくは、前記核酸分子は機能的プロモーターと作動可能に関連していない。
（Ａ）前記宿主細胞は、
（ａ）ＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結している前記ＤＮＡ分子を含む本発明の第１の核酸分子を含み、前記ＤＮＡ分子は、
（ｉ）ＡＡＶ Ｃａｐポリペプチドと、
場合によっては、
（ｉｉ）ＡＡＶトランスファーベクターとのうちの１つ以上をコードし、
前記第１の核酸分子は、前記宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれているか、または、エピソームプラスミド中に存在し、
（Ｂ）前記アデノウイルスベクターは、
（ｉ）アデノウイルスＬ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードする核酸分子であって、Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードする配列が前記アデノウイルスＭＬＰと作動可能に関連していない核酸分子と、
（ｉｉ）ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチドをコードする核酸分子と、を含み、
好ましくは、前記核酸分子は機能的プロモーターと作動可能に関連していない。
【0157】
前記キットはまた、ＡＡＶ粒子の生成のための材料を含み、たとえば遠心管、イオジキサノール、透析バッファー、および透析カセットの１つ以上など、ウイルス粒子の密度バンディングおよび精製に関与するもの含む。
【0158】
２つのアミノ酸配列または核酸配列を整合するために利用できるアルゴリズムは、多数確立されている。典型的には、１つの配列が参照配列となり、参照配列に対して試験配列を比較すればよい。配列比較アルゴリズムは、試験配列の参照配列に対する百分率配列同一性を、指定されたプログラムパラメータに基づいて算出する。比較を目的としたアミノ酸配列または核酸配列の整合（alignment）は、たとえば、コンピュータ実行アルゴリズム（たとえば、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、またはＴＦＡＳＴＡ）、またはＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムなどによって実施されてもよい。
【0159】
百分率アミノ酸配列同一性および百分率ヌクレオチド配列同一性は、ＢＬＡＳＴ整合法を使用して判定してもよい（Altschul et al. (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; and http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）。好ましくは、標準またはデフォルトの整合パラメータを用いる。
【0160】
タンパク質データベース内の類似した配列を見つけるために、標準タンパク質-タンパク質ＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔｐ）を使用してもよい。他のＢＬＡＳＴプログラムと同様に、ｂｌａｓｔｐは類似した局所的な領域を発見することができるように設計されている。配列の類似性が全配列に及ぶ場合、ｂｌａｓｔｐは全般的整合も報告し、これはタンパク質同定の目的には好ましい結果である。好ましくは、標準またはデフォルトの整合パラメータを用いる。一部の場合では、「低複雑度フィルター」を外してもよい。
【0161】
ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施することもある。比較を目的としたギャップ整合を得るために、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389の記載に従ってギャップＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０に含まれる）を利用することができる。またその代わりに、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０に含まれる）を用いて、分子間の遠隔関係を検出する累次検索を実施することができる（Altschul et al. (1997)上記参照）。ＢＬＡＳＴ、ギャップＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータを用いてもよい。
【0162】
ヌクレオチド配列の比較については、ＭＥＧＡＢＬＡＳＴ、不連続ｍｅｇａｂｌａｓｔおよびｂｌａｓｔｎを用いてこの目標を達成してもよい。好ましくは、標準またはデフォルトの整合パラメータを用いる。ＭＥＧＡＢＬＡＳＴは、非常に類似した配列間で長い整合を効率よく発見するよう特に設計されている。不連続ＭＥＧＡＢＬＡＳＴを用いて、本発明の核酸と類似しているが、同一ではないヌクレオチド配列を発見することができる。
【0163】
ＢＬＡＳＴヌクレオチドアルゴリズムは、クエリをワードと呼ばれる短いサブ配列に分解することによって類似した配列を発見する。プログラムは、始めにクエリワードとの完全一致を特定する（ワードヒット）。次に、ＢＬＡＳＴプログラムはこれらのワードヒットを多段階で拡張し、最終ギャップ整合を生成する。一部の実施形態においては、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索はＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施することができる。
【0164】
ＢＬＡＳＴ検索の精度を支配する重要なパラメーターの１つはワードサイズである。ｂｌａｓｔｎがＭＥＧＡＢＬＡＳＴよりも感度が高い最も重要な理由は、より短いデフォルトワードサイズ（１１）を用いることである。このためｂｌａｓｔｎは、他の生物に由来する関連ヌクレオチド配列に対する整合発見において、ＭＥＧＡＢＬＡＳＴよりも優れている。ｂｌａｓｔｎではワードサイズを調節することが可能であり、デフォルト値より短縮して最小で７とし、検索感度を高めることができる。
【0165】
新たに導入された不連続ｍｅｇａｂｌａｓｔページを用いることにより、より感度の高い検索を遂行することができる（www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Newsltr/FallWinter02/blastlab.html）。このページでは、Ｍａら（Bioinformatics. 2002 Mar; 18(3): 440-5）によって報告されたものと同様のアルゴリズムを用いる。不連続ｍｅｇａｂｌａｓｔは、整合拡張のシードとして完全ワードマッチを必要とするのではなく、テンプレートのより長いウインドウ内で非連続ワードを用いる。コーディングモードでは、第１および第２コドン位置での一致の発見に注目する一方で、第３位の不一致を無視することにより、第３塩基のゆれを考慮に入れる。同じワードサイズを用いた不連続ＭＥＧＡＢＬＡＳＴにおける検索は、同じワードサイズを用いた標準的ｂｌａｓｔｎよりも感度および効率が高い。不連続ｍｅｇａｂｌａｓｔに固有のパラメーターは、ワードサイズ：１１または１２；テンプレート：１６、１８、または２１；テンプレートタイプ：コーディング（０）、非コーディング（１）、または両方（２）である。
【0166】
一部の実施形態においては、デフォルトパラメータを用いてＢＬＡＳＴＰ２．５．０＋アルゴリズム（ＮＣＢＩから入手できるものなど）を用いうる。
【0167】
他の実施形態においては、ギャップコスト：Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ １１およびＥｘｔｅｎｓｉｏｎ １による２つのタンパク質配列のＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ整合を用いたＢＬＡＳＴ Ｇｌｏｂａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔプログラムを用いうる（ＮＣＢＩから入手できるものなど）。
【0168】
本願に記載された各参照文献の開示はすべて、この参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【0169】
【0170】
実施例
本発明は以下の実施例によってさらに例示され、別段の言及がない限りその部および割合は重量によるものであり、温度は摂氏である。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示す一方で、例示を目的としてのみ提示されることを理解すべきである。上記の考察およびこれらの実施例により、当業者は本発明の本質的特性を確認し、その主旨および範囲を逸脱することなく、本発明に多様な変更および変法を行って多様な用途および条件に適合させることができる。したがって、本願に提示および記載するものに加えて、本発明の多様な変法が、先行する記述により当業者に明らかになるであろう。そのような変法もまた付属の請求項の範囲内となることを意図している。
本発明は以下の実施例によってさらに例示され、別段の言及がない限りその部および割合は重量によるものであり、温度は摂氏である。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示す一方で、例示を目的としてのみ提示されることを理解すべきである。上記の考察およびこれらの実施例により、当業者は本発明の本質的特性を確認し、その主旨および範囲を逸脱することなく、本発明に多様な変更および変法を行って多様な用途および条件に適合させることができる。したがって、本願に提示および記載するものに加えて、本発明の多様な変法が、先行する記述により当業者に明らかになるであろう。そのような変法もまた付属の請求項の範囲内となることを意図している。
【0171】
実施例１:アデノウイルスＬ４ー２２Ｋの発現が、ＨｅｌａＲＣ３２細胞株からのＡＡＶ２ベクターの産生に必要である。
感染の後期段階中にアデノウイルス主要後期プロモーターからＬ４ ２２Ｋが発現し、ＭＬＰの転写抑制がＨｅｌａＲＣ３２細胞からのＡＡＶ２産生を抑制した。対照アデノウイルスのＡｄ５ーＥ１およびＴＥＲＡ－Ｅ１（組み換え複製アデノウイルスであって、その改変された主要後期プロモーターが前記リプレッサータンパク質ＴｅｔＲを転写し、前記改変された主要後期プロモーターの転写が前記ＴｅｔＲによって抑制されたもの）が、分子クローニング法によって生成され、ＨＥＫ２９３細胞から産生された。プラスミドｐＳＦ－ＡＡＶーＥＧＦＰのトランスフェクションの前に、ＨＥＬＡＲＣ３２細胞を、９ｅ４細胞／ウェルで２４時間４８ウェル組織培養プレートに播種し、ドキシサイクリン０．５ｕｇ／ｍＬまたはＤＭＳＯの存在下で、Ａｄ５ーＥ１またはＴＥＲＡ－Ｅ１を感染させた。ＡＡＶ２粒子を産生後９６時間で回収し、ＱＰＣＲによって定量化した。その結果を図１に示す。
感染の後期段階中にアデノウイルス主要後期プロモーターからＬ４ ２２Ｋが発現し、ＭＬＰの転写抑制がＨｅｌａＲＣ３２細胞からのＡＡＶ２産生を抑制した。対照アデノウイルスのＡｄ５ーＥ１およびＴＥＲＡ－Ｅ１（組み換え複製アデノウイルスであって、その改変された主要後期プロモーターが前記リプレッサータンパク質ＴｅｔＲを転写し、前記改変された主要後期プロモーターの転写が前記ＴｅｔＲによって抑制されたもの）が、分子クローニング法によって生成され、ＨＥＫ２９３細胞から産生された。プラスミドｐＳＦ－ＡＡＶーＥＧＦＰのトランスフェクションの前に、ＨＥＬＡＲＣ３２細胞を、９ｅ４細胞／ウェルで２４時間４８ウェル組織培養プレートに播種し、ドキシサイクリン０．５ｕｇ／ｍＬまたはＤＭＳＯの存在下で、Ａｄ５ーＥ１またはＴＥＲＡ－Ｅ１を感染させた。ＡＡＶ２粒子を産生後９６時間で回収し、ＱＰＣＲによって定量化した。その結果を図１に示す。
【0172】
実施例２:ＴＥＲＡーＥ１の重複感染は、安定的なパッケージング細胞株ＨｅＬａＲＣ３２からのＡＡＶ２の産生を誘導することができない。
対照アデノウイルスのＡｄ５ーＥ１およびＴＥＲＡ－Ｅ１（組み換え複製アデノウイルスであって、その改変された主要後期プロモーターが前記リプレッサータンパク質ＴｅｔＲを転写し、前記改変された主要後期プロモーターの転写が前記ＴｅｔＲによって抑制されたもの）が、分子クローニング法によって生成され、ＨＥＫ２９３細胞から産生された。プラスミドｐＳＦ－ＡＡＶーＥＧＦＰのトランスフェクションの前に、ＨｅＬａＲＣ３２細胞を、９ｅ４細胞／ウェルで２４時間４８ウェル組織培養プレートに播種し、ドキシサイクリン０．５ｕｇ／ｍＬまたはＤＭＳＯの非存在下で、指示された多重感染度でＡｄ５ーＥ１またはＴＥＲＡ－Ｅ１を感染させた。ＡＡＶ２粒子を産生後９６時間で回収し、ＱＰＣＲによって定量化した。その結果を図２に示す。
対照アデノウイルスのＡｄ５ーＥ１およびＴＥＲＡ－Ｅ１（組み換え複製アデノウイルスであって、その改変された主要後期プロモーターが前記リプレッサータンパク質ＴｅｔＲを転写し、前記改変された主要後期プロモーターの転写が前記ＴｅｔＲによって抑制されたもの）が、分子クローニング法によって生成され、ＨＥＫ２９３細胞から産生された。プラスミドｐＳＦ－ＡＡＶーＥＧＦＰのトランスフェクションの前に、ＨｅＬａＲＣ３２細胞を、９ｅ４細胞／ウェルで２４時間４８ウェル組織培養プレートに播種し、ドキシサイクリン０．５ｕｇ／ｍＬまたはＤＭＳＯの非存在下で、指示された多重感染度でＡｄ５ーＥ１またはＴＥＲＡ－Ｅ１を感染させた。ＡＡＶ２粒子を産生後９６時間で回収し、ＱＰＣＲによって定量化した。その結果を図２に示す。
【0173】
実施例３：アデノウイルスからのＬ４ー２２Ｋの転写が、安定的に組み込まれたＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ Ｃａｐ遺伝子のＤＮＡ増幅に必要である。
ＴＥＲＡ－Ｅ１（組み換え複製アデノウイルスであって、その改変された主要後期プロモーターが前記リプレッサータンパク質ＴｅｔＲを転写し、前記改変された主要後期プロモーターの転写が前記ＴｅｔＲによって抑制されたもの）が、分子クローニング法によって生成され、ＨＥＫ２９３細胞から産生された。ＨＥＬＡＲＣ３２細胞を、９ｅ４細胞／ウェルで２４時間４８ウェル組織培養プレートに播種し、ドキシサイクリン０．５ｕｇ／ｍＬまたはＤＭＳＯの存在下で、多重感染度（ＭＯＩ）５０でＴＥＲＡ－Ｅ１を感染させた。感染後９６時間で総ＤＮＡを抽出し、ＡＡＶ Ｒｅｐ ＤＮＡおよびＡＡＶ Ｃａｐ ＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。アガロースゲル電気泳動により、ＡＡＶ Ｒｅｐ増幅産物ＤＮＡ、およびＡＡＶ Ｃａｐ増幅産物ＤＮＡを分離した。その結果を図3に示す。
ＴＥＲＡ－Ｅ１（組み換え複製アデノウイルスであって、その改変された主要後期プロモーターが前記リプレッサータンパク質ＴｅｔＲを転写し、前記改変された主要後期プロモーターの転写が前記ＴｅｔＲによって抑制されたもの）が、分子クローニング法によって生成され、ＨＥＫ２９３細胞から産生された。ＨＥＬＡＲＣ３２細胞を、９ｅ４細胞／ウェルで２４時間４８ウェル組織培養プレートに播種し、ドキシサイクリン０．５ｕｇ／ｍＬまたはＤＭＳＯの存在下で、多重感染度（ＭＯＩ）５０でＴＥＲＡ－Ｅ１を感染させた。感染後９６時間で総ＤＮＡを抽出し、ＡＡＶ Ｒｅｐ ＤＮＡおよびＡＡＶ Ｃａｐ ＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。アガロースゲル電気泳動により、ＡＡＶ Ｒｅｐ増幅産物ＤＮＡ、およびＡＡＶ Ｃａｐ増幅産物ＤＮＡを分離した。その結果を図3に示す。
【0174】
実施例４：アデノウイルス後期転写産物Ｌ４のｓｉＲＮＡノックダウンは、アデノウイルス２２Ｋをコードしており、安定的なパッケージング細胞株ＨｅＬａＲＣ３２におけるＡＡＶ２の複製を阻害する。
ＭＬＰ抑制可能アデノウイルスＴＥＲＡ－Ｅ１（組み換え複製アデノウイルスであって、その改変された主要後期プロモーターが前記リプレッサータンパク質ＴｅｔＲを転写し、前記改変された主要後期プロモーターの転写が前記ＴｅｔＲによって抑制されたもの）が、標準分子クローニング法によって生成され、ＨＥＫ２９３細胞から産生された。ＨＥＬＡＲＣ３２細胞を、１．５ｅ４細胞／ウェルで４８ウェル組織培養プレートに播種し、アデノウイルス一次ｍＲＮＡ転写産物Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、またはＬ５を標的としたｓｉＲＮＡを２４時間トランスフェクトした。ＨｅＬａＲＣ３２細胞にプラスミドｐＳＦーＡＡＶ－ＥＧＦＰをトランスフェクトし、ドキシサイクリン０．５ｕｇ／ｍＬまたはＤＭＳＯの存在下で、ＭＯＩ ５０でＴＥＲＡ－Ｅ１を感染させた。感染後９６時間でＱＰＣＲによりＡＡＶ２を定量化した。その結果を図4に示す。
ＭＬＰ抑制可能アデノウイルスＴＥＲＡ－Ｅ１（組み換え複製アデノウイルスであって、その改変された主要後期プロモーターが前記リプレッサータンパク質ＴｅｔＲを転写し、前記改変された主要後期プロモーターの転写が前記ＴｅｔＲによって抑制されたもの）が、標準分子クローニング法によって生成され、ＨＥＫ２９３細胞から産生された。ＨＥＬＡＲＣ３２細胞を、１．５ｅ４細胞／ウェルで４８ウェル組織培養プレートに播種し、アデノウイルス一次ｍＲＮＡ転写産物Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、またはＬ５を標的としたｓｉＲＮＡを２４時間トランスフェクトした。ＨｅＬａＲＣ３２細胞にプラスミドｐＳＦーＡＡＶ－ＥＧＦＰをトランスフェクトし、ドキシサイクリン０．５ｕｇ／ｍＬまたはＤＭＳＯの存在下で、ＭＯＩ ５０でＴＥＲＡ－Ｅ１を感染させた。感染後９６時間でＱＰＣＲによりＡＡＶ２を定量化した。その結果を図4に示す。
【0175】
実施例５：アデノウイルス後期タンパク質Ｌ４ー２２Ｋが、ＨｅＬａＲＣ３２細胞からのＡＡＶ Ｃａｐ遺伝子のＣＡＲＥ依存増幅を誘導する。
ＭＬＰ抑制可能アデノウイルスＴＥＲＡ－Ｅ１（組み換え複製アデノウイルスであって、その改変された主要後期プロモーターが前記リプレッサータンパク質ＴｅｔＲを転写し、前記改変された主要後期プロモーターの転写が前記ＴｅｔＲによって抑制されたもの）が、分子クローニング法によって生成され、ＨＥＫ２９３細胞から産生された。ＨｅＬａＲＣ３２細胞を、９．０ｅ４細胞／ウェルで２４時間４８ウェル組織培養プレートに播種し、その後、ＣＭＶプロモーターの制御下でアデノウイルスＬ４遺伝子を転写するプラスミドをトランスフェクトし、ＭＯＩ ５０でＴＥＲＡ－Ｅ１を感染させた。感染後９６時間で総ＤＮＡを抽出し、ＡＡＶ Ｃａｐ ＤＮＡをＱＰＣＲによって定量化した。結果を図５に示す。
ＭＬＰ抑制可能アデノウイルスＴＥＲＡ－Ｅ１（組み換え複製アデノウイルスであって、その改変された主要後期プロモーターが前記リプレッサータンパク質ＴｅｔＲを転写し、前記改変された主要後期プロモーターの転写が前記ＴｅｔＲによって抑制されたもの）が、分子クローニング法によって生成され、ＨＥＫ２９３細胞から産生された。ＨｅＬａＲＣ３２細胞を、９．０ｅ４細胞／ウェルで２４時間４８ウェル組織培養プレートに播種し、その後、ＣＭＶプロモーターの制御下でアデノウイルスＬ４遺伝子を転写するプラスミドをトランスフェクトし、ＭＯＩ ５０でＴＥＲＡ－Ｅ１を感染させた。感染後９６時間で総ＤＮＡを抽出し、ＡＡＶ Ｃａｐ ＤＮＡをＱＰＣＲによって定量化した。結果を図５に示す。
【0176】
実施例６：Ｌ４－１００Ｋ非存在下で、アデノウイルス後期タンパク質Ｌ４ー２２Ｋが、ＨｅＬａＲＣ３２細胞からのＡＡＶ Ｃａｐ遺伝子のＣＡＲＥ依存増幅を誘導する。
ＭＬＰ抑制可能アデノウイルスＴＥＲＡ－Ｅ１（組み換え複製アデノウイルスであって、その改変された主要後期プロモーターが前記リプレッサータンパク質ＴｅｔＲを転写し、前記改変された主要後期プロモーターの転写が前記ＴｅｔＲによって抑制されたもの）が、分子クローニング法によって生成され、ＨＥＫ２９３細胞から産生された。ＨｅＬａＲＣ３２細胞を、９．０ｅ４細胞／ウェルで２４時間４８ウェル組織培養プレートに播種し、その後、アデノウイルスＬ４ー２２Ｋを転写するＣＭＶプロモータープラスミドを、ＣＭＶ駆動Ｌ４ー１００ＫまたはスタッファーＤＮＡ（stuffer DNA）とともに共トランスフェクトし、ＭＯＩ ５０でＴＥＲＡ－Ｅ１を感染させた。感染後９６時間で総ＤＮＡを抽出し、ＡＡＶ Ｃａｐ ＤＮＡをＱＰＣＲによって定量化した。その結果を図６に示す。
ＭＬＰ抑制可能アデノウイルスＴＥＲＡ－Ｅ１（組み換え複製アデノウイルスであって、その改変された主要後期プロモーターが前記リプレッサータンパク質ＴｅｔＲを転写し、前記改変された主要後期プロモーターの転写が前記ＴｅｔＲによって抑制されたもの）が、分子クローニング法によって生成され、ＨＥＫ２９３細胞から産生された。ＨｅＬａＲＣ３２細胞を、９．０ｅ４細胞／ウェルで２４時間４８ウェル組織培養プレートに播種し、その後、アデノウイルスＬ４ー２２Ｋを転写するＣＭＶプロモータープラスミドを、ＣＭＶ駆動Ｌ４ー１００ＫまたはスタッファーＤＮＡ（stuffer DNA）とともに共トランスフェクトし、ＭＯＩ ５０でＴＥＲＡ－Ｅ１を感染させた。感染後９６時間で総ＤＮＡを抽出し、ＡＡＶ Ｃａｐ ＤＮＡをＱＰＣＲによって定量化した。その結果を図６に示す。
【0177】
SEQUENCES
SEQ ID NO: 1
Rep nucleotide sequence (AAV serotype 2)
atgccggggttttacgagattgtgattaaggtccccagcgaccttgacgagcatctgcccggcatttctgacagctttgtgaactgggtggccgagaaggaatgggagttgccgccagattctgacatggatctgaatctgattgagcaggcacccctgaccgtggccgagaagctgcagcgcgactttctgacggaatggcgccgtgtgagtaaggccccggaggcccttttctttgtgcaatttgagaagggagagagctacttccacatgcacgtgctcgtggaaaccaccggggtgaaatccatggttttgggacgtttcctgagtcagattcgcgaaaaactgattcagagaatttaccgcgggatcgagccgactttgccaaactggttcgcggtcacaaagaccagaaatggcgccggaggcgggaacaaggtggtggatgagtgctacatccccaattacttgctccccaaaacccagcctgagctccagtgggcgtggactaatatggaacagtatttaagcgcctgtttgaatctcacggagcgtaaacggttggtggcgcagcatctgacgcacgtgtcgcagacgcaggagcagaacaaagagaatcagaatcccaattctgatgcgccggtgatcagatcaaaaacttcagccaggtacatggagctggtcgggtggctcgtggacaaggggattacctcggagaagcagtggatccaggaggaccaggcctcatacatctccttcaatgcggcctccaactcgcggtcccaaatcaaggctgccttggacaatgcgggaaagattatgagcctgactaaaaccgcccccgactacctggtgggccagcagcccgtggaggacatttccagcaatcggatttataaaattttggaactaaacgggtacgatccccaatatgcggcttccgtctttctgggatgggccacgaaaaagttcggcaagaggaacaccatctggctgtttgggcctgcaactaccgggaagaccaacatcgcggaggccatagcccacactgtgcccttctacgggtgcgtaaactggaccaatgagaactttcccttcaacgactgtgtcgacaagatggtgatctggtgggaggaggggaagatgaccgccaaggtcgtggagtcggccaaagccattctcggaggaagcaaggtgcgcgtggaccagaaatgcaagtcctcggcccagatagacccgactcccgtgatcgtcacctccaacaccaacatgtgcgccgtgattgacgggaactcaacgaccttcgaacaccagcagccgttgcaagaccggatgttcaaatttgaactcacccgccgtctggatcatgactttgggaaggtcaccaagcaggaagtcaaagactttttccggtgggcaaaggatcacgtggttgaggtggagcatgaattctacgtcaaaaagggtggagccaagaaaagacccgcccccagtgacgcagatataagtgagcccaaacgggtgcgcgagtcagttgcgcagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacaggtaccaaaacaaatgttctcgtcacgtgggcatgaatctgatgctgtttccctgcagacaatgcgagagaatgaatcagaattcaaatatctgcttcactcacggacagaaagactgtttagagtgctttcccgtgtcagaatctcaacccgtttctgtcgtcaaaaaggcgtatcagaaactgtgctacattcatcatatcatgggaaaggtgccagacgcttgcactgcctgcgatctggtcaatgtggatttggatgactgcatctttgaacaaTAG
SEQ ID NO: 2
Cap nucleotide sequence (AAV serotype 2)
Cagttgcgcagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacaggtaccaaaacaaatgttctcgtcacgtgggcatgaatctgatgctgtttccctgcagacaatgcgagagaatgaatcagaattcaaatatctgcttcactcacggacagaaagactgtttagagtgctttcccgtgtcagaatctcaacccgtttctgtcgtcaaaaaggcgtatcagaaactgtgctacattcatcatatcatgggaaaggtgccagacgcttgcactgcctgcgatctggtcaatgtggatttggatgactgcatctttgaacaataaatgatttaaatcaggt atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacactctctctgaaggaataagacagtggtggaagctcaaacctggcccaccaccaccaaagcccgcagagcggcataaggacgacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctcggacccttcaacggactcgacaagggagagccggtcaacgaggcagacgccgcggccctcgagcacgacaaagcctacgaccggcagctcgacagcggagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgcggagtttcaggagcgccttaaagaagatacgtcttttgggggcaacctcggacgagcagtcttccaggcgaaaaagagggttcttgaacctctgggcctggttgaggaacctgttaagacggctccgggaaaaaagaggccggtagagcactctcctgtggagccagactcctcctcgggaaccggaaaggcgggccagcagcctgcaagaaaaagattgaattttggtcagactggagacgcagactcagtacctgacccccagcctctcggacagccaccagcagccccctctggtctgggaactaatacgatggctacaggcagtggcgcaccaatggcagacaataacgagggcgccgacggagtgggtaattcctcgggaaattggcattgcgattccacatggatgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgaacctgggccctgcccacctacaacaaccacctctacaaacaaatttccagccaatcaggagcctcgaacgacaatcactactttggctacagcaccccttgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcaaagactcatcaacaacaactggggattccgacccaagagactcaacttcaagctctttaacattcaagtcaaagaggtcacgcagaatgacggtacgacgacgattgccaataaccttaccagcacggttcaggtgtttactgactcggagtaccagctcccgtacgtcctcggctcggcgcatcaaggatgcctcccgccgttcccagcagacgtcttcatggtgccacagtatggatacctcaccctgaacaacgggagtcaggcagtaggacgctcttcattttactgcctggagtactttccttctcagatgctgcgtaccggaaacaactttaccttcagctacacttttgaggacgttcctttccacagcagctacgctcacagccagagtctggaccgtctcatgaatcctctcatcgaccagtacctgtattacttgagcagaacaaacactccaagtggaaccaccacgcagtcaaggcttcagttttctcaggccggagcgagtgacattcgggaccagtctaggaactggcttcctggaccctgttaccgccagcagcgagtatcaaagacatctgcggataacaacaacagtgaatactcgtggactggagctaccaagtaccacctcaatggcagagactctctggtgaatccgggcccggccatggcaagccacaaggacgatgaagaaaagttttttcctcagagcggggttctcatctttgggaagcaaggctcagagaaaacaaatgtggacattgaaaaggtcatgattacagacgaagaggaaatcaggacaaccaatcccgtggctacggagcagtatggttctgtatctaccaacctccagagaggcaacagacaagcagctaccgcagatgtcaacacacaaggcgttcttccaggcatggtctggcaggacagagatgtgtaccttcaggggcccatctgggcaaagattccacacacggacggacattttcacccctctcccctcatgggtggattcggacttaaacaccctcctccacagattctcatcaagaacaccccggtacctgcgaatccttcgaccaccttcagtgcggcaaagtttgcttccttcatcacacagtactccacgggacaggtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaaacgctggaatcccgaaattcagtacacttccaactacaacaagtctgttaatgtggactttactgtggacactaatggcgtgtattcagagcctcgccccattggcaccagatacctgactcgtaatctgtaA
SEQ ID NO: 3
Cap amino acid sequence (AAV serotype 2)
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL*
SEQ ID NO: 4
Rep binding site (RBS)
gcccgagtgagcacgc
SEQ ID NO: 5
CARE element AAV2
gtcctgtattagaggtcacgtgagtgttttgcgacattttgcgacaccatgtggtcacgctgggtatttaagcccgagtgagcacgcagggtctccattttgaagcgggaggtttgaacgcgcagccgccatgccggggttttacgagattgtgattaaggtccccagcgaccttgacgagcatctgcccggcatttctgacagctttgtgaactgggtggccgagaaggaatgggagttgccgccagattctgacatggatctgaatctgattgagcaggcacccctgaccgtggccgagaagctgcagcgcgactttctgacggaatggcgccgtgtgagtaaggccc
SEQ ID NO: 6 (UniProtKB - Q5TJ00)
L4 22K
Protein name: Human adenovirus D serotype 9 (HAdV-9)
MPRKKQEPLV EEMEEEWDSQ AEEDEWEEET EEEELEEVEE EQATEQPVAA
PSAPAAPAVT DTTSAAPAKP PRRWDRVKGD GKHERQGYRS WRAHKAAIIA
CLQDCGGNIA FARRYLLFHR GVNIPRNVLH YYRHLHS
SEQ ID NO: 7
Ad 5 L4 22K
atggcacccaaaaagaagctgcagctgccgccgccacccacggacgaggaggaatactgggacagtcaggcagaggaggttttggacgaggaggaggaggacatgatggaagactgggagagcctagacgaggaagcttccgaggtcgaagaggtgtcagacgaaacaccgtcaccctcggtcgcattcccctcgccggcgccccagaaatcggcaaccggttccagcatggctacaacctccgctcctcaggcgccgccggcactgcccgttcgccgacccaaccgtagatgggacaccactggaaccagggccggtaagtccaagcagccgccgccgttagcccaagagcaacaacagcgccaaggctaccgctcatggcgcgggcacaagaacgccatagttgcttgcttgcaagactgtgggggcaacatctccttcgcccgccgctttcttctctaccatcacggcgtggccttcccccgtaacatcctgcattactaccgtcatctctacagcccatactgcaccggcggcagcggcagcaacagcagcggccacacagaagcaaaggcgaccggatag
SEQ ID NO: 8
Ad 5 L4 22K
MAPKKKLQLPPPPTDEEEYWDSQAEEVLDEEEEDMMEDWESLDEEASEVEEVSDETPSPSVAFPSPAPQKSATGSSMATTSAPQAPPALPVRRPNRRWDTTGTRAGKSKQPPPLAQEQQQRQGYRSWRGHKNAIVACLQDCGGNISFARRFLLYHHGVAFPRNILHYYRHLYSPYCTGGSGSNSSGHTEAKATG*
SEQ ID NO: 9
E2A polypeptide nucleotide sequence (Adenovirus type 5)
ATGGCCAGTCGGGAAGAGGagcagcgcgaaaccacccccgagcgcggacgcggtgcggcgcgacgtcccccaaccatggaggacgtgtcgtccccgtccccgtcgccgccgcctccccgggcgcccccaaaaaagcggatgaggcggcgtatcgagtccgaggacgaggaagactcatcacaagacgcgctggtgccgcgcacacccagcccgcggccatcgacctcggcggcggatttggccattgcgcccaagaagaaaaagaagcgcccttctcccaagcccgagcgcccgccatcaccagaggtaatcgtggacagcgaggaagaaagagaagatgtggcgctacaaatggtgggtttcagcaacccaccggtgctaatcaagcatggcaaaggaggtaagcgcacagtgcggcggctgaatgaagacgacccagtggcgcgtggtatgcggacgcaagaggaagaggaagagcccagcgaagcggaaagtgaaattacggtgatgaacccgctgagtgtgccgatcgtgtctgcgtgggagaagggcatggaggctgcgcgcgcgctgatggacaagtaccacgtggataacgatctaaaggcgaacttcaaactactgcctgaccaagtggaagctctggcggccgtatgcaagacctggctgaacgaggagcaccgcgggttgcagctgaccttcaccagcaacaagacctttgtgacgatgatggggcgattcctgcaggcgtacctgcagtcgtttgcagaggtgacctacaagcatcacgagcccacgggctgcgcgttgtggctgcaccgctgcgctgagatcgaaggcgagcttaagtgtctacacggaagcattatgataaataaggagcacgtgattgaaatggatgtgacgagcgaaaacgggcagcgcgcgctgaaggagcagtctagcaaggccaagatcgtgaagaaccggtggggccgaaatgtggtgcagatctccaacaccgacgcaaggtgctgcgtgcacgacgcggcctgtccggccaatcagttttccggcaagtcttgcggcatgttcttctctgaaggcgcaaaggctcaggtggcttttaagcagatcaaggcttttatgcaggcgctgtatcctaacgcccagaccgggcacggtcaccttttgatgccactacggtgcgagtgcaactcaaagcctgggcacgcgccctttttgggaaggcagctaccaaagttgactccgttcgccctgagcaacgcggaggacctggacgcggatctgatctccgacaagagcgtgctggccagcgtgcaccacccggcgctgatagtgttccagtgctgcaaccctgtgtatcgcaactcgcgcgcgcagggcggaggccccaactgcgacttcaagatatcggcgcccgacctgctaaacgcgttggtgatggtgcgcagcctgtggagtgaaaacttcaccgagctgccgcggatggttgtgcctgagtttaagtggagcactaaacaccagtatcgcaacgtgtccctgccagtggcgcatagcgatgcgcggcaGAACCCCTTTGATTTTTAA
SEQ ID NO: 10
E2A polypeptide amino acid sequence(Adenovirus type 5)
MASREEEQRETTPERGRGAARRPPTMEDVSSPSPSPPPPRAPPKKRMRRRIESEDEEDSSQDALVPRTPSPRPSTSAADLAIAPKKKKKRPSPKPERPPSPEVIVDSEEEREDVALQMVGFSNPPVLIKHGKGGKRTVRRLNEDDPVARGMRTQEEEEEPSEAESEITVMNPLSVPIVSAWEKGMEAARALMDKYHVDNDLKANFKLLPDQVEALAAVCKTWLNEEHRGLQLTFTSNKTFVTMMGRFLQAYLQSFAEVTYKHHEPTGCALWLHRCAEIEGELKCLHGSIMINKEHVIEMDVTSENGQRALKEQSSKAKIVKNRWGRNVVQISNTDARCCVHDAACPANQFSGKSCGMFFSEGAKAQVAFKQIKAFMQALYPNAQTGHGHLLMPLRCECNSKPGHAPFLGRQLPKLTPFALSNAEDLDADLISDKSVLASVHHPALIVFQCCNPVYRNSRAQGGGPNCDFKISAPDLLNALVMVRSLWSENFTELPRMVVPEFKWSTKHQYRNVSLPVAHSDARQNPFDF
SEQ ID NO: 11
TetR binding site
tccctatcag tgatagaga
SEQ ID NO: 12
Modified MLP
cgccctcttc ggcatcaagg aaggtgattg gtttgtaggt gtaggccacg tgaccgggtg
ttcctgaagg ggggctataa aaggtcccta tcagtgatag agactca
SEQ ID NO: 13
Modified MLP
cgccctcttc ggcatcaagg aaggtgattg gtttgtaggt gtaggccacg tgactcccta
tcagtgatag agaactataa aaggtcccta tcagtgatag agactca
SEQ ID NO: 14
Nucleotide sequence of the wild-type Ad5 MLP
cgccctcttcggcatcaaggaaggtgattggtttgtaggtgtaggccacgtgaccgggtgttcctgaaggggggctataaaagggggtgggggcgcgttcgtcctca
Sequence Listing Free Text
<210> 1
<213> Rep nucleotide sequence (adeno-associated virus 2)
<210> 2
<213> Cap nucleotide sequence (adeno-associated virus 2)
<210> 3
<213> Cap amino acid sequence (adeno-associated virus 2)
<210> 4
<223> Rep binding site (RBS)
<210> 5
<213> CARE element (adeno-associated virus 2)
<210> 6
<223> L4 22K (Human adenovirus D serotype 9 (HAdV-9))
<210> 7
<223> Ad 5 L4 22K
<210> 8
<223> Ad 5 L4 22K
<210> 9
<223> E2A polypeptide nucleotide sequence (Adenovirus type 5)
<210> 10
<223> E2A polypeptide amino acid sequence (Adenovirus type 5)
<210> 11
<223> TetR binding site
<210> 12
<223> Modified MLP
<210> 13
<223> Modified MLP
<210> 14
<223> Nucleotide sequence of the wild-type Ad5 MLP
SEQ ID NO: 1
Rep nucleotide sequence (AAV serotype 2)
atgccggggttttacgagattgtgattaaggtccccagcgaccttgacgagcatctgcccggcatttctgacagctttgtgaactgggtggccgagaaggaatgggagttgccgccagattctgacatggatctgaatctgattgagcaggcacccctgaccgtggccgagaagctgcagcgcgactttctgacggaatggcgccgtgtgagtaaggccccggaggcccttttctttgtgcaatttgagaagggagagagctacttccacatgcacgtgctcgtggaaaccaccggggtgaaatccatggttttgggacgtttcctgagtcagattcgcgaaaaactgattcagagaatttaccgcgggatcgagccgactttgccaaactggttcgcggtcacaaagaccagaaatggcgccggaggcgggaacaaggtggtggatgagtgctacatccccaattacttgctccccaaaacccagcctgagctccagtgggcgtggactaatatggaacagtatttaagcgcctgtttgaatctcacggagcgtaaacggttggtggcgcagcatctgacgcacgtgtcgcagacgcaggagcagaacaaagagaatcagaatcccaattctgatgcgccggtgatcagatcaaaaacttcagccaggtacatggagctggtcgggtggctcgtggacaaggggattacctcggagaagcagtggatccaggaggaccaggcctcatacatctccttcaatgcggcctccaactcgcggtcccaaatcaaggctgccttggacaatgcgggaaagattatgagcctgactaaaaccgcccccgactacctggtgggccagcagcccgtggaggacatttccagcaatcggatttataaaattttggaactaaacgggtacgatccccaatatgcggcttccgtctttctgggatgggccacgaaaaagttcggcaagaggaacaccatctggctgtttgggcctgcaactaccgggaagaccaacatcgcggaggccatagcccacactgtgcccttctacgggtgcgtaaactggaccaatgagaactttcccttcaacgactgtgtcgacaagatggtgatctggtgggaggaggggaagatgaccgccaaggtcgtggagtcggccaaagccattctcggaggaagcaaggtgcgcgtggaccagaaatgcaagtcctcggcccagatagacccgactcccgtgatcgtcacctccaacaccaacatgtgcgccgtgattgacgggaactcaacgaccttcgaacaccagcagccgttgcaagaccggatgttcaaatttgaactcacccgccgtctggatcatgactttgggaaggtcaccaagcaggaagtcaaagactttttccggtgggcaaaggatcacgtggttgaggtggagcatgaattctacgtcaaaaagggtggagccaagaaaagacccgcccccagtgacgcagatataagtgagcccaaacgggtgcgcgagtcagttgcgcagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacaggtaccaaaacaaatgttctcgtcacgtgggcatgaatctgatgctgtttccctgcagacaatgcgagagaatgaatcagaattcaaatatctgcttcactcacggacagaaagactgtttagagtgctttcccgtgtcagaatctcaacccgtttctgtcgtcaaaaaggcgtatcagaaactgtgctacattcatcatatcatgggaaaggtgccagacgcttgcactgcctgcgatctggtcaatgtggatttggatgactgcatctttgaacaaTAG
SEQ ID NO: 2
Cap nucleotide sequence (AAV serotype 2)
Cagttgcgcagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacaggtaccaaaacaaatgttctcgtcacgtgggcatgaatctgatgctgtttccctgcagacaatgcgagagaatgaatcagaattcaaatatctgcttcactcacggacagaaagactgtttagagtgctttcccgtgtcagaatctcaacccgtttctgtcgtcaaaaaggcgtatcagaaactgtgctacattcatcatatcatgggaaaggtgccagacgcttgcactgcctgcgatctggtcaatgtggatttggatgactgcatctttgaacaataaatgatttaaatcaggt atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacactctctctgaaggaataagacagtggtggaagctcaaacctggcccaccaccaccaaagcccgcagagcggcataaggacgacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctcggacccttcaacggactcgacaagggagagccggtcaacgaggcagacgccgcggccctcgagcacgacaaagcctacgaccggcagctcgacagcggagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgcggagtttcaggagcgccttaaagaagatacgtcttttgggggcaacctcggacgagcagtcttccaggcgaaaaagagggttcttgaacctctgggcctggttgaggaacctgttaagacggctccgggaaaaaagaggccggtagagcactctcctgtggagccagactcctcctcgggaaccggaaaggcgggccagcagcctgcaagaaaaagattgaattttggtcagactggagacgcagactcagtacctgacccccagcctctcggacagccaccagcagccccctctggtctgggaactaatacgatggctacaggcagtggcgcaccaatggcagacaataacgagggcgccgacggagtgggtaattcctcgggaaattggcattgcgattccacatggatgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgaacctgggccctgcccacctacaacaaccacctctacaaacaaatttccagccaatcaggagcctcgaacgacaatcactactttggctacagcaccccttgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcaaagactcatcaacaacaactggggattccgacccaagagactcaacttcaagctctttaacattcaagtcaaagaggtcacgcagaatgacggtacgacgacgattgccaataaccttaccagcacggttcaggtgtttactgactcggagtaccagctcccgtacgtcctcggctcggcgcatcaaggatgcctcccgccgttcccagcagacgtcttcatggtgccacagtatggatacctcaccctgaacaacgggagtcaggcagtaggacgctcttcattttactgcctggagtactttccttctcagatgctgcgtaccggaaacaactttaccttcagctacacttttgaggacgttcctttccacagcagctacgctcacagccagagtctggaccgtctcatgaatcctctcatcgaccagtacctgtattacttgagcagaacaaacactccaagtggaaccaccacgcagtcaaggcttcagttttctcaggccggagcgagtgacattcgggaccagtctaggaactggcttcctggaccctgttaccgccagcagcgagtatcaaagacatctgcggataacaacaacagtgaatactcgtggactggagctaccaagtaccacctcaatggcagagactctctggtgaatccgggcccggccatggcaagccacaaggacgatgaagaaaagttttttcctcagagcggggttctcatctttgggaagcaaggctcagagaaaacaaatgtggacattgaaaaggtcatgattacagacgaagaggaaatcaggacaaccaatcccgtggctacggagcagtatggttctgtatctaccaacctccagagaggcaacagacaagcagctaccgcagatgtcaacacacaaggcgttcttccaggcatggtctggcaggacagagatgtgtaccttcaggggcccatctgggcaaagattccacacacggacggacattttcacccctctcccctcatgggtggattcggacttaaacaccctcctccacagattctcatcaagaacaccccggtacctgcgaatccttcgaccaccttcagtgcggcaaagtttgcttccttcatcacacagtactccacgggacaggtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaaacgctggaatcccgaaattcagtacacttccaactacaacaagtctgttaatgtggactttactgtggacactaatggcgtgtattcagagcctcgccccattggcaccagatacctgactcgtaatctgtaA
SEQ ID NO: 3
Cap amino acid sequence (AAV serotype 2)
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL*
SEQ ID NO: 4
Rep binding site (RBS)
gcccgagtgagcacgc
SEQ ID NO: 5
CARE element AAV2
gtcctgtattagaggtcacgtgagtgttttgcgacattttgcgacaccatgtggtcacgctgggtatttaagcccgagtgagcacgcagggtctccattttgaagcgggaggtttgaacgcgcagccgccatgccggggttttacgagattgtgattaaggtccccagcgaccttgacgagcatctgcccggcatttctgacagctttgtgaactgggtggccgagaaggaatgggagttgccgccagattctgacatggatctgaatctgattgagcaggcacccctgaccgtggccgagaagctgcagcgcgactttctgacggaatggcgccgtgtgagtaaggccc
SEQ ID NO: 6 (UniProtKB - Q5TJ00)
L4 22K
Protein name: Human adenovirus D serotype 9 (HAdV-9)
MPRKKQEPLV EEMEEEWDSQ AEEDEWEEET EEEELEEVEE EQATEQPVAA
PSAPAAPAVT DTTSAAPAKP PRRWDRVKGD GKHERQGYRS WRAHKAAIIA
CLQDCGGNIA FARRYLLFHR GVNIPRNVLH YYRHLHS
SEQ ID NO: 7
Ad 5 L4 22K
atggcacccaaaaagaagctgcagctgccgccgccacccacggacgaggaggaatactgggacagtcaggcagaggaggttttggacgaggaggaggaggacatgatggaagactgggagagcctagacgaggaagcttccgaggtcgaagaggtgtcagacgaaacaccgtcaccctcggtcgcattcccctcgccggcgccccagaaatcggcaaccggttccagcatggctacaacctccgctcctcaggcgccgccggcactgcccgttcgccgacccaaccgtagatgggacaccactggaaccagggccggtaagtccaagcagccgccgccgttagcccaagagcaacaacagcgccaaggctaccgctcatggcgcgggcacaagaacgccatagttgcttgcttgcaagactgtgggggcaacatctccttcgcccgccgctttcttctctaccatcacggcgtggccttcccccgtaacatcctgcattactaccgtcatctctacagcccatactgcaccggcggcagcggcagcaacagcagcggccacacagaagcaaaggcgaccggatag
SEQ ID NO: 8
Ad 5 L4 22K
MAPKKKLQLPPPPTDEEEYWDSQAEEVLDEEEEDMMEDWESLDEEASEVEEVSDETPSPSVAFPSPAPQKSATGSSMATTSAPQAPPALPVRRPNRRWDTTGTRAGKSKQPPPLAQEQQQRQGYRSWRGHKNAIVACLQDCGGNISFARRFLLYHHGVAFPRNILHYYRHLYSPYCTGGSGSNSSGHTEAKATG*
SEQ ID NO: 9
E2A polypeptide nucleotide sequence (Adenovirus type 5)
ATGGCCAGTCGGGAAGAGGagcagcgcgaaaccacccccgagcgcggacgcggtgcggcgcgacgtcccccaaccatggaggacgtgtcgtccccgtccccgtcgccgccgcctccccgggcgcccccaaaaaagcggatgaggcggcgtatcgagtccgaggacgaggaagactcatcacaagacgcgctggtgccgcgcacacccagcccgcggccatcgacctcggcggcggatttggccattgcgcccaagaagaaaaagaagcgcccttctcccaagcccgagcgcccgccatcaccagaggtaatcgtggacagcgaggaagaaagagaagatgtggcgctacaaatggtgggtttcagcaacccaccggtgctaatcaagcatggcaaaggaggtaagcgcacagtgcggcggctgaatgaagacgacccagtggcgcgtggtatgcggacgcaagaggaagaggaagagcccagcgaagcggaaagtgaaattacggtgatgaacccgctgagtgtgccgatcgtgtctgcgtgggagaagggcatggaggctgcgcgcgcgctgatggacaagtaccacgtggataacgatctaaaggcgaacttcaaactactgcctgaccaagtggaagctctggcggccgtatgcaagacctggctgaacgaggagcaccgcgggttgcagctgaccttcaccagcaacaagacctttgtgacgatgatggggcgattcctgcaggcgtacctgcagtcgtttgcagaggtgacctacaagcatcacgagcccacgggctgcgcgttgtggctgcaccgctgcgctgagatcgaaggcgagcttaagtgtctacacggaagcattatgataaataaggagcacgtgattgaaatggatgtgacgagcgaaaacgggcagcgcgcgctgaaggagcagtctagcaaggccaagatcgtgaagaaccggtggggccgaaatgtggtgcagatctccaacaccgacgcaaggtgctgcgtgcacgacgcggcctgtccggccaatcagttttccggcaagtcttgcggcatgttcttctctgaaggcgcaaaggctcaggtggcttttaagcagatcaaggcttttatgcaggcgctgtatcctaacgcccagaccgggcacggtcaccttttgatgccactacggtgcgagtgcaactcaaagcctgggcacgcgccctttttgggaaggcagctaccaaagttgactccgttcgccctgagcaacgcggaggacctggacgcggatctgatctccgacaagagcgtgctggccagcgtgcaccacccggcgctgatagtgttccagtgctgcaaccctgtgtatcgcaactcgcgcgcgcagggcggaggccccaactgcgacttcaagatatcggcgcccgacctgctaaacgcgttggtgatggtgcgcagcctgtggagtgaaaacttcaccgagctgccgcggatggttgtgcctgagtttaagtggagcactaaacaccagtatcgcaacgtgtccctgccagtggcgcatagcgatgcgcggcaGAACCCCTTTGATTTTTAA
SEQ ID NO: 10
E2A polypeptide amino acid sequence(Adenovirus type 5)
MASREEEQRETTPERGRGAARRPPTMEDVSSPSPSPPPPRAPPKKRMRRRIESEDEEDSSQDALVPRTPSPRPSTSAADLAIAPKKKKKRPSPKPERPPSPEVIVDSEEEREDVALQMVGFSNPPVLIKHGKGGKRTVRRLNEDDPVARGMRTQEEEEEPSEAESEITVMNPLSVPIVSAWEKGMEAARALMDKYHVDNDLKANFKLLPDQVEALAAVCKTWLNEEHRGLQLTFTSNKTFVTMMGRFLQAYLQSFAEVTYKHHEPTGCALWLHRCAEIEGELKCLHGSIMINKEHVIEMDVTSENGQRALKEQSSKAKIVKNRWGRNVVQISNTDARCCVHDAACPANQFSGKSCGMFFSEGAKAQVAFKQIKAFMQALYPNAQTGHGHLLMPLRCECNSKPGHAPFLGRQLPKLTPFALSNAEDLDADLISDKSVLASVHHPALIVFQCCNPVYRNSRAQGGGPNCDFKISAPDLLNALVMVRSLWSENFTELPRMVVPEFKWSTKHQYRNVSLPVAHSDARQNPFDF
SEQ ID NO: 11
TetR binding site
tccctatcag tgatagaga
SEQ ID NO: 12
Modified MLP
cgccctcttc ggcatcaagg aaggtgattg gtttgtaggt gtaggccacg tgaccgggtg
ttcctgaagg ggggctataa aaggtcccta tcagtgatag agactca
SEQ ID NO: 13
Modified MLP
cgccctcttc ggcatcaagg aaggtgattg gtttgtaggt gtaggccacg tgactcccta
tcagtgatag agaactataa aaggtcccta tcagtgatag agactca
SEQ ID NO: 14
Nucleotide sequence of the wild-type Ad5 MLP
cgccctcttcggcatcaaggaaggtgattggtttgtaggtgtaggccacgtgaccgggtgttcctgaaggggggctataaaagggggtgggggcgcgttcgtcctca
Sequence Listing Free Text
<210> 1
<213> Rep nucleotide sequence (adeno-associated virus 2)
<210> 2
<213> Cap nucleotide sequence (adeno-associated virus 2)
<210> 3
<213> Cap amino acid sequence (adeno-associated virus 2)
<210> 4
<223> Rep binding site (RBS)
<210> 5
<213> CARE element (adeno-associated virus 2)
<210> 6
<223> L4 22K (Human adenovirus D serotype 9 (HAdV-9))
<210> 7
<223> Ad 5 L4 22K
<210> 8
<223> Ad 5 L4 22K
<210> 9
<223> E2A polypeptide nucleotide sequence (Adenovirus type 5)
<210> 10
<223> E2A polypeptide amino acid sequence (Adenovirus type 5)
<210> 11
<223> TetR binding site
<210> 12
<223> Modified MLP
<210> 13
<223> Modified MLP
<210> 14
<223> Nucleotide sequence of the wild-type Ad5 MLP
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-10-11
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
宿主細胞中においてＤＮＡ分子を増幅する方法であって、前記ＤＮＡ分子は、ＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結し、
前記宿主細胞は、
（ａ）ＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結している前記ＤＮＡ分子を含む第１の核酸分子と、
（ｂ）Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と作動可能に関連する異種プロモーターを含む第２の核酸分子と、
（ｃ）ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列を含む第３の核酸分子とを、
含み、
場合によってはこれらに加えて、
（ｄ）１つ以上のアデノウイルス初期遺伝子産物と作動可能に関連している１つ以上のプロモーターを含む１つ以上のさらなる核酸分子を、
含む宿主細胞であって、
前記方法は、前記宿主細胞を、前記第２および第３の核酸分子、ならびに場合によって追加された１つ以上の前記さらなる核酸分子が発現するような条件下で培養し、前記ＤＮＡ分子の増幅を促進する工程を含む、ＤＮＡ分子増幅方法。
【請求項2】
前記第１、第２、第３、および（存在する場合に）さらなる核酸分子は、それぞれ独立して、前記宿主細胞中で、（ｉ）アデノウイルスベクター中に存在するか、
（ｉｉ）前記宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれて存在するか、または
（ｉｉｉ）エピソームベクターまたはエピソームプラスミド中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＤＮＡ分子は、治療ポリペプチドまたはウイルスポリペプチドをコードする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＤＮＡ分子は、隣接するＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含む、ｒｅｐ遺伝子配列、および／またはｃａｐ遺伝子配列、および／または、ウイルストランスファーベクター、またはその断片をコードする、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
ウイルス粒子を産生するためのプロセスであって、前記プロセスが、下記（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）を含むプロセス。（ａ）宿主細胞にアデノウイルスベクターを導入する工程。
ここで、前記アデノウイルスベクターは、
（ｉ）Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と作動可能に関連する異種プロモーターを含む核酸分子と、
（ｉｉ）導入遺伝子に隣接する５’－ウイルスＩＴＲおよび３’－ウイルスＩＴＲを含むトランスファープラスミドと、
（ｉｉｉ）ウイルストランスファープラスミドをパッケージするための十分なヘルパー遺伝子とを含み、
前記宿主細胞が、下記（ｉ）及び（ｉｉ）と作動可能に連結するＣＡＲＥエレメントを含む。
（ｉ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、
（ｉｉ）ウイルスＲｅｐポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、
（ｂ）ウイルス粒子が前記宿主細胞内で集合するような条件下で、前記宿主細胞を培養する工程。
（ｃ）パッケージされたウイルス粒子を、前記宿主細胞から回収するか、または前記培養培地から回収する工程。
【請求項6】
ウイルス粒子を産生するためのプロセスであって、前記プロセスが、下記（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）を含むプロセス。（ａ）宿主細胞にアデノウイルスベクターを導入する工程。
ここで、前記アデノウイルスベクターは、
（ｉ）Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と作動可能に関連する異種プロモーターを含む核酸分子と、
（ｉｉ）ウイルスＲｅｐポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子と、
（ｉｉｉ）ウイルストランスファープラスミドをパッケージするための十分なヘルパー遺伝子と、
を含み、
前記宿主細胞は、下記（ｉ）及び（ｉｉ）を、前記宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれた状態で含む。
（ｉ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子と作動可能に連結しているＣＡＲＥエレメント
（ｉｉ）導入遺伝子に隣接する５’－ウイルスＩＴＲおよび３’－ウイルスＩＴＲを含むトランスファープラスミドであって、前記ＣＡＲＥエレメントと作動可能に連結していてもしていなくてもよいトランスファープラスミド
（ｂ）ウイルス粒子が前記宿主細胞内で集合するような条件下で、前記宿主細胞を培養する工程。
（ｃ）パッケージされたウイルス粒子を、前記宿主細胞から回収するか、または前記培養培地から回収する工程。
【請求項7】
前記工程（ａ）において、前記ウイルスＲｅｐポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、機能的プロモーターと作動可能に関連していない、請求項５または６に記載のプロセス。
【請求項8】
前記ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子が、アデノウイルスベクター内にコードされたポリペプチドによって活性化されるプロモーターの制御下で、前記宿主細胞ゲノムに組み込まれる、請求項５～７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項9】
前記アデノウイルスベクターが抑制可能な主要後期プロモーター（ＭＬＰ）を含む、請求項５～８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項10】
前記ＭＬＰが、アデノウイルス後期遺伝子の転写を調節または制御することのできる１つ以上のリプレッサーエレメントを含み、かつ前記リプレッサーエレメントの１つ以上がＭＬＰ ＴＡＴＡボックスの下流に挿入される、請求項９に記載のプロセス。
【請求項11】
前記ウイルスＲｅｐポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、Ｅ１／Ｅ３欠失アデノウイルスベクターのＥ１領域に挿入されている、請求項５～１０のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項12】
前記ウイルスＲｅｐポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列を含む前記核酸分子が、機能的ｐ５プロモーターまたは機能的ｐ１９プロモーターを含まず、かつ、前記核酸分子がその他のいずれの機能的プロモーターとも作動可能に関連せず、前記Ｒｅｐポリペプチドコーディング配列のベースラインまたは最小限のみの転写が得られる、請求項５～１１のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項13】
改変された宿主細胞を製造するためのプロセスであって、前記プロセスは、下記工程（ａ）及び（ｂ）、さらに場合によっては下記工程（ｃ）を含み、（ａ）第１の核酸分子を宿主細胞に導入する工程であって、前記第１の核酸分子は、ＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結しているＡＡＶ ｃａｐ遺伝子をコードするＤＮＡ分子を含む、工程；
（ｂ）Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列と作動可能に関連する異種プロモーターを含む第２の核酸分子を、前記宿主細胞に導入する工程；
（ｃ）ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列を含む第３の核酸分子を、前記宿主細胞に導入する工程；
前記導入は、前記第１、第２、および第３（存在する場合）の核酸分子は、それぞれ独立して、
（ｉ）前記宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれるか、または、
（ｉｉ）前記宿主細胞内にエピソーマルに存在する
ように行う、プロセス。
【請求項14】
（Ａ）宿主細胞と、（Ｂ）アデノウイルスベクターとを含むキットであって、（Ａ）前記宿主細胞は、
（ａ）ＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結しているＤＮＡ分子を含む第１の核酸分子を含み、前記ＤＮＡ分子は、（ｉ）及び（ｉｉ）のうちの１つ以上をコードし、
（ｉ）ＡＡＶ Ｃａｐポリペプチド、
（ｉｉ）ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチド、
前記第１の核酸分子は、前記宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれているか、またはエピソームプラスミド中に存在し、
（Ｂ）前記アデノウイルスベクターは、
（ｉ）アデノウイルスＬ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードする核酸分子であって、Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードする配列が前記アデノウイルスＭＬＰと作動可能に関連していない核酸分子と、
（ｉｉ）ＡＡＶトランスファーベクターをコードする核酸分子と、
を含む、
キット。
【請求項15】
（Ａ）宿主細胞と、（Ｂ）アデノウイルスベクターとを含むキットであって、（Ａ）前記宿主細胞は、
（ａ）ＣＡＲＥエレメントに作動可能に連結しているＤＮＡ分子を含む第１の核酸分子を含み、
前記ＤＮＡ分子は、
（ｉ）ＡＡＶ Ｃａｐポリペプチドをコードし、
場合によっては
（ｉｉ）ＡＡＶトランスファーベクターをコードし、
前記第１の核酸分子は、前記宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれているか、またはエピソームプラスミド中に存在し、
（Ｂ）前記アデノウイルスベクターは、
（ｉ）アデノウイルスＬ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードする核酸分子であって、Ｌ４ ２２Ｋポリペプチドまたはその変異体をコードする配列が前記アデノウイルスＭＬＰと作動可能に関連していない核酸分子と、
（ｉｉ）ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチドをコードする核酸分子と、
を含む、
キット。
【請求項16】
前記核酸分子は機能的プロモーターと作動可能に関連していない、請求項１５に記載のキット。
【国際調査報告】