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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-04
(54)【発明の名称】組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
A61K 38/16 20060101AFI20230328BHJP
C07K 14/33 20060101ALI20230328BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20230328BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20230328BHJP
A61K 47/60 20170101ALI20230328BHJP
A61K 8/64 20060101ALN20230328BHJP
【ＦＩ】
A61K38/16
C07K14/33 ZNA
A61P21/00
A61K47/64
A61K47/60
A61K8/64
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022547181
(86)(22)【出願日】2021-02-03
(85)【翻訳文提出日】2022-09-30
(86)【国際出願番号】 AU2021050078
(87)【国際公開番号】W WO2021155427
(87)【国際公開日】2021-08-12
(31)【優先権主張番号】2020900283
(32)【優先日】2020-02-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521048060
【氏名又は名称】スノーレトックス リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】マクリーン，トーマス
(72)【発明者】
【氏名】スムーカー，ピーター
(72)【発明者】
【氏名】ノーブリー，ルーク
(72)【発明者】
【氏名】コロエ，ピーター
(72)【発明者】
【氏名】コンジット，ラッセル
(72)【発明者】
【氏名】サッセ，アンソニー
【テーマコード（参考）】
4C076
4C083
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA99
4C076BB11
4C076CC09
4C076CC41
4C076EE59
4C076FF67
4C083AD411
4C083AD412
4C083CC01
4C083EE09
4C083FF01
4C084AA02
4C084AA03
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA23
4C084BA44
4C084CA04
4C084DA33
4C084MA05
4C084MA66
4C084NA06
4C084NA07
4C084ZA94
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA57
4H045CA11
4H045DA83
4H045EA20
4H045FA10
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、（ｉ）酸分解性連結を介して、又は（ｉｉ）マスキングポリペプチドを含む、少なくとも1つのマスキング部分にコンジュゲートした破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）を
含む、破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）コンジュゲートに関する。本発明は又、ＴｅＮＴコンジュゲートを含む組成物、及び対象の筋緊張低下症を治療するための、又は筋力及び／又は筋緊張及び／又は筋治癒及び／又はスポーツのパフォーマンスを向上させるための、ＴｅＮＴコンジュゲート又は組成物の治療上の使用に関する。
含む、破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）コンジュゲートに関する。本発明は又、ＴｅＮＴコンジュゲートを含む組成物、及び対象の筋緊張低下症を治療するための、又は筋力及び／又は筋緊張及び／又は筋治癒及び／又はスポーツのパフォーマンスを向上させるための、ＴｅＮＴコンジュゲート又は組成物の治療上の使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
酸分解性連結を介して少なくとも1つのマスキング部分にコンジュゲートした破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）を含む、破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）コンジュゲート。
【請求項2】
前記マスキング部分が、ＰＥＧ及び/又はマスキングポリペプチドを含む、請求項１に記載の破傷風神経毒素コンジュゲート。
【請求項3】
少なくとも1つのマスキング部分にコンジュゲートしたＴｅＮＴを含み、前記マスキング部分がマスキングポリペプチドを含む、破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）コンジュゲート。
【請求項4】
酸分解性連結を介して少なくとも１つのマスキング部分にコンジュゲートした、請求項３に記載の破傷風神経毒素コンジュゲート。
【請求項5】
前記マスキング部分が、前記ＴｅＮＴのリジン又はシステイン残基にコンジュゲートされている、請求項１～４のいずれか一項に記載の破傷風神経毒素コンジュゲート。
【請求項6】
前記システインが導入アミノ酸である、請求項５に記載の破傷風神経毒素コンジュゲート。
【請求項7】
前記破傷風神経毒素が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の破傷風神経毒素コンジュゲート。
【請求項8】
前記導入システインが、配列番号１に対するセリンからシステインへのアミノ酸置換である、請求項７に記載の破傷風神経毒素コンジュゲート。
【請求項9】
前記酸分解性連結がヒドラゾンを含む、請求項１、２又は４～７のいずれか一項に記載の破傷風神経毒素コンジュゲート。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか一項に記載の破傷風神経毒素コンジュゲートを含む組成物。
【請求項11】
請求項１～９のいずれか一項に記載の破傷風神経毒素コンジュゲート又は請求項１０に記載の組成物を投与することを含む、対象における筋緊張低下症の治療方法。
【請求項12】
請求項１～９のいずれか一項に記載の破傷風神経毒素コンジュゲート又は請求項１０に記載の組成物を投与することを含む、対象の筋力及び／又は筋緊張及び／又は筋治癒及び／又はスポーツパフォーマンスを向上させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）コンジュゲート、又はＴｅＮＴコンジュゲートを含む組成物に関する。本開示は又、ＴｅＮＴコンジュゲート又は組成物の治療的使用に関する。
【背景技術】
【0002】
破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）は、クロストリジウム・テタニによって産生される。ＴｅＮＴは脊髄に作用し、抑制性神経伝達物質であるγアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）及びグリシンの脊髄抑制性介在ニューロンにおける放出をブロックする。そのため、ＴｅＮＴは痙性麻痺を引き起こす。ＴｅＮＴは、複数の血清型では発生しない。
【0003】
ＴｅＮＴの生物学的特性、又は少なくともＴｅＮＴの断片を治療に利用することが提案されている。しかしながら、タンパク質治療剤を使った長期治療の場合、標的免疫反応を引き起こす傾向がある。ＴｅＮＴの血清型は１つしか知られていないため、血清型を切り替えて免疫を回避しようとすることは、ＴｅＮＴ系治療の選択肢にはならない。さらに、多くの人々がＴｅＮＴに対してワクチンを接種しているため、ＴｅＮＴに基づく治療は不可能である。
【0004】
米国特許出願公開第２００２／０１９７２７８（Ａ１）明細書には、不適切な筋収縮の障害を治療するためにＰＥＧ化ボツリヌス毒素を使用することが開示されている。米国特許出願公開第２００２／０１９７２７８（Ａ１）明細書には又、不適切な筋収縮の障害、例えば偏頭痛又は斜視を治療するためにＰＥＧ化されたＴｅＮＴを使用することが提案されている。しかしながら、上述のように、ＴｅＮＴは筋収縮を引き起こすので、ＰＥＧ化されているか否かにかかわらず、不適切な筋収縮の障害治療には使用されていない。
【0005】
Ｗａｎら（Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０１７） ５２：１８３－
１９１）は、ＰＥＧ化タンパク質の投与によって生じる抗ＰＥＧ免疫応答に対するＰＥＧ化の効果を開示しているが、その知見はいかなる治療にも生かされていない。
１９１）は、ＰＥＧ化タンパク質の投与によって生じる抗ＰＥＧ免疫応答に対するＰＥＧ化の効果を開示しているが、その知見はいかなる治療にも生かされていない。
【0006】
国際公開第２０１６／００１７６２（Ａ１）号パンフレットには、筋肉量を増加させるためにＰＥＧ化ＴｅＮＴフラグメントｃ（ｃ）を使用することが開示されている。フラグメントｃ（５０ｋＤａ）は、ＴｅＮＴをパパインにより酵素反応的に切断した際に生成し、ＴｅＮＴ重鎖のＣ末端の４５１アミノ酸に相当する。フラグメントｃは、未消化のＴｅＮＴの結合、内在化及び経シナプス輸送能力を保持するが、いかなる神経細胞プロセスも破壊せず、したがって非毒性である。
【0007】
破傷風トキソイドの免疫性を与えられた対象向けの、既存の抗ＴｅＮＴ免疫反応を回避するＴｅＮＴ系の治療が必要とされている。
【0008】
本明細書中でいかなる先行技術文献が参照されたとしても、そのような参照により、当該文献がオーストラリア又は他の国における一般技術知識の一部として認められるものではないことが理解されるであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明者らは、タンパク質治療剤の投与時に抗体反応が起こり、そのためにタンパク質治療剤の効力を減少させる適応免疫系があるがゆえに、ＴｅＮＴの利用が十分に実現され
ていないことを理解している。適応免疫応答を、ＴｅＮＴに対して免疫性を与えられた多くの集団によって実証されたように、ワクチン接種の結果として、意図的に発現させる場合がある。あるいは、適応免疫反応は、タンパク質治療薬に繰り返し曝されることによって生じる、意図的でない場合もある。
ていないことを理解している。適応免疫応答を、ＴｅＮＴに対して免疫性を与えられた多くの集団によって実証されたように、ワクチン接種の結果として、意図的に発現させる場合がある。あるいは、適応免疫反応は、タンパク質治療薬に繰り返し曝されることによって生じる、意図的でない場合もある。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、これらの問題に対処する改良型ＴｅＮＴｓのファミリーと治療レジメンを作製した。
【0011】
具体的には、本発明は、ＴｅＮＴが中枢神経系の活性部位に到達するまで、それぞれが免疫系を回避するＰＥＧ化ＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴｓ）又はペプチドマスク化ＴｅＮＴ（Ｐｅｐ－ＴｅＮＴｓ）の一ファミリーを提供する。ＴｅＮＴとマスキング部分（例えば、ＰＥＧや繰り返しペプチド）の間に酸分解性連結を組み込むことで、輸送小胞内のｐＨが低下により、抑制性介在ニューロンの細胞質基質に入る際にマスキング剤がＴｅＮＴから解離するまで免疫反応から保護される。このシステムにより、中枢神経系（ＣＮＳ）に取り込まれる前に、免疫反応を回避した高活性ＴｅＮＴを中枢神経系に送達することが可能となり、保護抗体反応を有する個々人の筋緊張低下の治療に有効である。
【0012】
第１の態様では、酸分解性連結を介して少なくとも1つのマスキング部分にコンジュゲ
ートした破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）を含む、破傷風神経毒素コンジュゲートが提供される。
ートした破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）を含む、破傷風神経毒素コンジュゲートが提供される。
【0013】
第１の態様の一実施形態では、マスキング部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
【0014】
第１の態様の一実施形態では、マスキング部分は、マスキングポリぺプチドである。
【0015】
第２の態様では、マスキングポリぺプチドを含む少なくとも１つのマスキング部分にコンジュゲートしたＴｅＮＴを含み、前記マスキング部分がマスキングポリぺプチドを含む、破傷風神経毒素コンジュゲートが提供される。
【0016】
一実施形態では、マスキングポリペプチドは、短い繰り返しペプチド配列を含む。一実施形態では、短い繰り返しペプチド配列は、グリシン及びスレオニンを含む。
【0017】
第２の態様の一実施形態では、破傷風神経毒素コンジュゲートは、酸分解性連結を介して少なくとも１つのマスキング部分にコンジュゲートされる。
【0018】
一実施形態では、マスキング部分は、ＴｅＮＴ軽鎖（ＬＣ）、又はＴｅＮＴ重鎖（ＨＣ）、又はＴｅＮＴフラグメントｃ（ｃ）に連結されている。
【0019】
一実施形態では、ＴｅＮＴ軽鎖（ＬＣ）がＰＥＧ化されている、ＴｅＮＴ重鎖（ＨＣ）がＰＥＧ化されている、又はＴｅＮＴフラグメントｃ（ｃ）がＰＥＧ化されている。一実施形態では、ＬＣがＰＥＧ化されるとともにＨＣがＰＥＧ化される（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）、又はＬＣがＰＥＧ化されるとともにｃがＰＥＧ化される（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ）。
【0020】
一実施形態では、ＰＥＧは、ＴｅＮＴのリジン残基にコンジュゲートされている。別の実施形態では、ＰＥＧは、ＴｅＮＴのシステイン残基にコンジュゲートされている。一実施形態では、ＰＥＧは、ＴｅＮＴのシステイン残基にコンジュゲートされ、ここで、システイン残基は、既存するか、又は、任意選択で、配列番号１に対してセリン残基の代わり
に置換することにより導入される。
に置換することにより導入される。
【0021】
一実施形態では、ＰＥＧは、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ、又は約２０ｋＤａ、又は約３０ｋＤａの分子量を有する。
【0022】
一実施形態において、マスキングポリペプチドは、ＴｅＮＴのリジン残基にコンジュゲートされている。別の実施形態では、マスキングポリぺプチドは、ＴｅＮＴのシステイン残基にコンジュゲートされている。一実施形態では、マスキングポリぺプチドは、ＴｅＮＴのシステイン残基にコンジュゲートされ、ここで、システイン残基は、既存するか、又は、任意選択で、配列番号１に対してセリン残基の代わりに置換することにより導入される。
【0023】
一実施形態では、マスキングポリぺプチドは、短い反復アミノ酸配列を含み、ＴｅＮＴのリジン残基にコンジュゲートされている。別の実施形態では、マスキングポリぺプチドは、短い、繰り返しアミノ酸配列を含み、そしてＴｅＮＴのシステイン残基にコンジュゲートされている。一実施形態では、マスキングポリぺプチドは、短い、繰り返しアミノ酸配列を含み、そしてＴｅＮＴのシステイン残基にコンジュゲートされるが、システイン残基は、既存するか、又は、任意選択で、配列番号１に対してセリン残基の代わりに置換することにより導入される。
【0024】
一実施形態では、マスキングポリペプチドは、約２ｋＤａ、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ、又は約２０ｋＤａ、又は約３０ｋＤａの分子量を有する。
【0025】
第３の態様では、第１又は第２の態様の破傷風神経毒素コンジュゲートを含む組成物が提供される。
【0026】
第４の態様では、以下の（ａ）及び（ｂ）を含む組成物が提供される。
（ａ）以下を含む第1の破傷風コンジュゲート。
（ｉ）酸分解性連結を介して少なくとも１つのマスキング部分にコンジュゲートされた破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）又はそのフラグメント；もしくは
（ｉｉ）非酸分解性連結を介して少なくとも１つのマスキングポリペプチドにコンジュゲートされた破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）又はそのフラグメント；及び
（ｂ）破傷風神経毒素又は第２の破傷風神経毒素コンジュゲート。
（ａ）以下を含む第1の破傷風コンジュゲート。
（ｉ）酸分解性連結を介して少なくとも１つのマスキング部分にコンジュゲートされた破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）又はそのフラグメント；もしくは
（ｉｉ）非酸分解性連結を介して少なくとも１つのマスキングポリペプチドにコンジュゲートされた破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）又はそのフラグメント；及び
（ｂ）破傷風神経毒素又は第２の破傷風神経毒素コンジュゲート。
【0027】
一実施形態では、本組成物は、治療用組成物である。
【0028】
別の実施形態では、本組成物は、化粧品組成物である。
【0029】
第５の態様では、筋緊張低下症を治療する方法が提供され、この方法には、第１もしくは第２の態様の破傷風神経毒素コンジュゲート、又は第３もしくは第４の態様の組成物を対象に投与することが含まれる。
【0030】
第５の態様では、代わりに、筋緊張低下症の治療に使用する、第１もしくは第２の態様の破傷風神経毒素コンジュゲート、又は第３もしくは第４の態様の組成物；又は筋緊張低下症を治療する医薬品の製造における、第１もしくは第２の態様の破傷風神経毒素コンジュゲート、又は第３もしくは第４の態様の組成物の使用、が提供される。
【0031】
第６の態様では、対象における筋緊張低下症を治療する方法が提供され、この方法には、第１又は第２の態様の破傷風神経毒素コンジュゲート、及び破傷風神経毒素、又は第４の態様の組成物を対象に投与することが含まれる。
【0032】
第６の態様では、代わりに、対象における筋緊張低下症の治療に使用する、第１又は第２の態様の破傷風神経毒素コンジュゲート、及び破傷風神経毒素、又は第４の態様の組成物；又は対象における筋緊張低下症を治療する医薬の製造における、第１又は第２の態様の破傷風神経毒素コンジュゲート、及び破傷風神経毒素、又は第４の態様の組成物の使用が提供される。
【0033】
一実施形態では、筋緊張低下症は、閉塞性睡眠時無呼吸症候群である。
【0034】
第７の態様では、筋緊張、筋力、筋治癒及び／又はスポーツパフォーマンスを高める方法が提供され、この方法では、第１又は第２の態様の破傷風神経毒素コンジュゲート、又は第３又は第４の態様の組成物を対象に投与することが含まれる。
【0035】
第７の態様では、代わりに、筋緊張、筋力、筋治癒及び／又はスポーツパフォーマンスを増強するために使用する、第１もしくは第２の態様の破傷風神経毒素コンジュゲート、又は第３もしくは第４の態様の組成物；又は筋緊張、筋力、筋治癒及び／又はスポーツパフォーマンスを高める医薬の製造における、第１もしくは第２の態様の破傷風神経毒素コンジュゲート、又は第３もしくは第４の態様の組成物の使用、が提供される。
【0036】
一実施形態では、第１のＴｅＮＴコンジュゲート又は第２のＴｅＮＴコンジュゲートは、ＰＥＧ化ＴｅＮＴ軽鎖（ＬＣ）、ＰＥＧ化ＴｅＮＴ重鎖（ＨＣ）、ＰＥＧ化ＴｅＮＴ重鎖（ＨＣ）及びＰＥＧ化ＴｅＮＴ軽鎖（ＬＣ）、又はＰＥＧ化ＴｅＮＴフラグメントｃ（ｃ）を含む。一実施形態では、第１のＴｅＮＴコンジュゲート又は第２のＴｅＮＴコンジュゲートは、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを含んでなる。
【0037】
他の実施形態では、第１のＴｅＮＴコンジュゲート又は第２のＴｅＮＴコンジュゲートは、ＰＥＧ化ＨＣを含んでなるＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣである。この実施形態では、ＬＣはＰＥＧ化されていない。他の実施形態では、第１のＴｅＮＴコンジュゲート又は第２のＴｅＮＴコンジュゲートは、ＰＥＧ化ＬＣ及びＰＥＧ化ｃを含んでなるＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃであり、この実施形態では、ＨＮはＰＥＧ化されていない。
【0038】
さらなる実施形態において、第１のＴｅＮＴコンジュゲートは、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣであり、第２のＴｅＮＴコンジュゲートは、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃである。
【0039】
一実施形態では、治療することには、対象に以下を投与することが含まれる：有効性が低下するまでのＰＥＧ化ｃを含むＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ）；次に、有効性が低下するまでのＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ及びＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃを含む組成物；次にＰＥＧ化ＬＣ及びＰＥＧ化ＨＣを含むＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）。
【0040】
一実施形態では、治療することには、対象に以下を投与し対応することが含まれる：ＰＥＧ化ｃを含むＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ）；次にＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ及びＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃを含む組成物；次にＰＥＧ化ＬＣ及びＰＥＧ化ＨＣを含むＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）を投与し、対象の抗ＴｅＮＴ抗体の免疫学的プロファイルを決定し、そのプロファイルに基づいてＴｅＮＴコンジュゲートの有効組成物を決定する。
【0041】
一実施形態では、治療することには、ＰＥＧ化ＨＣを含む第１のＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ）と、ＰＥＧ化ＬＣ及びＰＥＧ化ｃを含む第２のＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ）を対象に投与することが含まれる。
【0042】
他の実施形態では、治療することには、ＰＥＧ化ｃを含むＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ）；並びに／又はＰＥＧ化ＨＣを含む第１のＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ）及びＰＥＧ化ＬＣ－ｃを含む第２のＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ）；並びに／又はＰＥＧ化ＨＣとＰＥＧ化ＬＣとを含むＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）、を対象に投与することが含まれる。
【0043】
一実施形態では、治療することには対象に以下を投与することが含まれる：ＰＥＧ化ｃを含むＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ）をその有効性が低下するまで投与する。その後、治療することには対象に以下を投与することが含まれいてもよい：ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ及びＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃをそれらの有効性が低下するまで投与する。その後、治療することには対象に以下を投与することが含まれもよい：ＰＥＧ化ＬＣ及びＰＥＧ化ＨＣを含むＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）を投与する。
【0044】
一実施形態では、治療することには対象に以下を投与することが含まれる：有効性が低下するまでのＰＥＧ化ｃを含むＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ）；次に有効性が低下するまでのＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ及びＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ；次にＰＥＧ化ＬＣ及びＰＥＧ化ＨＣを含むＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）。
【0045】
一実施形態において、治療することには、対象に以下を投与することが含まれる：有効性が低下するまでの約５ｋＤａの分子量を有するＰＥＧを含むＰＥＧ化ｃ、を含むＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ）；次に、有効性が低下するまでの約１０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧを含むＰＥＧ化ｃを含む、ＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ）；次に、有効性が低下するまでの約２０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧを含むＰＥＧ化ｃを含む、ＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ）。その後、治療することには、対象に以下を投与することが含まれていてもよい：有効性が低下するまでの、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ及びＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃのいずれか又は両方が、５ｋＤａの分子量を有するＰＥＧを含むもの；次に、有効性が低下するまでの、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ及びＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃのいずれか又は両方が、１０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧを含んでいるもの：そして次に、有効性が低下するまでの、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ及びＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃのいずれか又は両方が、２０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧを含んでいるもの。その後、治療することには、対象に以下を投与することが含まれていてもよい：有効性が低下するまでの、ＰＥＧ化ＬＣ及びＰＥＧ化ＨＣのいずれか又は両方が５ｋＤａの分子量を有するＰＥＧを含む、ＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）；次に、ＰＥＧ化ＬＣ及びＰＥＧ化ＨＣのいずれか又は両方が１０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧ含む、ＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）；そして次に、ＰＥＧ化ＬＣ及びＰＥＧ化ＨＣのいずれか又は両方が２０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧを含む、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）。
【0046】
一実施形態では、治療することは、対象に：ＰＥＧ化ｃを含むＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ）；次にＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ及びＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃを含む組成物；次にＰＥＧ化ＬＣ及びＰＥＧ化ＨＣを含むＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）、を投与して対象の抗ＮＴ抗体の免疫学的プロファイルを決定し、そのプロファイルに基づいてＴｅＮＴコンジュゲートの有効組成物を決めることが含まれる。
【0047】
一実施形態では、治療することには、まずＨＣにコンジュゲートされたマスキングポリペプチドを含む第１のＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＨＣ）を対象に投与し、そしてＬＣにコンジュゲートされたマスキングポリペプチド及びフラグメントｃにコンジュゲートされたマスキングポリペプチドを含む第２のＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ）を対象に投与することが含まれる。
【0048】
別の実施形態では、治療することには、対象に以下を投与し対応することが含まれる：フラグメントcにコンジュゲートしたマスキングポリペプチドを含むＴｅＮＴコンジュゲ
ート（ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ｃ）；並びに／又はＨＣにコンジュゲートしたマスキングポリペプチドを含む第1のＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＨＣ）及びＬＣ－ｃ
にコンジュゲートしたマスキングポリペプチドを含む第２のＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ）；並びに／又は、ＨＣにコンジュゲートしたマスキングポリペプチド及びＬＣにコンジュゲートしたマスキングポリペプチドを含むＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）。
ート（ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ｃ）；並びに／又はＨＣにコンジュゲートしたマスキングポリペプチドを含む第1のＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＨＣ）及びＬＣ－ｃ
にコンジュゲートしたマスキングポリペプチドを含む第２のＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ）；並びに／又は、ＨＣにコンジュゲートしたマスキングポリペプチド及びＬＣにコンジュゲートしたマスキングポリペプチドを含むＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）。
【0049】
一実施形態では、治療することには、有効性が低下するまで、ｃにコンジュゲートしたマスキングポリペプチドを含むＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ｃ）を対象に投与することが含まれる。その後、治療することには、有効性が低下するまで、ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＨＣ及びＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃを対象に投与することが含まれていてもよい。その後、治療することには、ＬＣにコンジュゲートしたマスキングポリペプチド及びＨＣにコンジュゲートしたマスキングポリペプチドとを含むＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）を対象に投与することが含まれていてもよい。
【0050】
一実施形態では、治療することには、対象に以下を投与することが含まれる：有効性が低下するまでのｃにコンジュゲートしたマスキングポリペプチドを含むＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ｃ）；次に有効性が低下するまでのＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＨＣ及びＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ；次にＬＣにコンジュゲートしたマスキングポリペプチド及びＨＣにコンジュゲートしたマスキングポリペプチドを含むＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）。
【0051】
一実施形態において、治療することには、対象に以下を投与することが含まれる。マスキングポリペプチドにコンジュゲートしたフラグメントｃを含むＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ｃ）であって、マスキングポリペプチドが、約５ｋＤａの分子量を有する短い、繰り返しアミノ酸配列のペプチドを含むものを、有効性が低下するまで投与する。次に、マスキングポリペプチドにコンジュゲートしたフラグメントｃを含むＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ｃ）であり、マスキングポリペプチドが、約１０ｋＤａの分子量を有する短い、繰り返しアミノ酸配列のペプチドを含むものをその有効性が低下するまで投与する。次に、マスキングポリペプチドにコンジュゲートしたフラグメントｃを含むＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ｃ）であって、マスキングポリペプチドが、約２０ｋＤａの分子量を有する短い、繰り返しアミノ酸配列のペプチドを含むものをその有効性が低下するまで投与する。その後は、治療することには、対象に以下を投与することが含まれていてもよい。ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＨＣ及びＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃのいずれか又は両方であって、約５ｋＤａの分子量を有する短い、繰り返しアミノ酸配列のペプチドを含むものを、それらの有効性が低下するまで投与する；次にＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＨＣ及びＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃのいずれか又は両方であって、約１０ｋＤａの分子量を有するＰＥＰを含むものを、それらの有効性が低下するまで投与する；次に、ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＨＣ及びＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃのいずれかまたは両方のうちの、約２０ｋＤａの分子量を有する短い、繰り返しアミノ酸配列のペプチドを含むものを、それらの有効性が低下するまで投与する。その後、治療することには、対象に以下を投与することが含まれていてもよい。ＬＣにコンジュゲートしたマスキングポリペプ
チドとＨＣにコンジュゲートしたマスキングポリペプチドを含むＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）であって、マスキングポリペプチドの一方又は両方が約５ｋＤａの分子量を有する短い繰り返しアミノ酸配列のペプチドを含むものを、その有効性が低下するまで投与する。次に、ＬＣにコンジュゲートしたマスキングポリペプチドとＨＣにコンジュゲートしたマスキングポリペプチドを含むＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）であって、これらのコンジュゲートのいずれか又は両方が、約１０ｋＤａの分子量を有するマスキングポリペプチドを含むものを、それらの有効性が低下するまで投与する。次に、ＬＣにコンジュゲートしたマスキングポリペプチドとＨＣにコンジュゲートしたマスキングポリペプチドを含むＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）であって、それらマスキングペプチドの一方又は両方が約２０ｋＤａの分子量を有する短い、繰り返しアミノ酸配列のペプチドを含んでいるものを投与する。
チドとＨＣにコンジュゲートしたマスキングポリペプチドを含むＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）であって、マスキングポリペプチドの一方又は両方が約５ｋＤａの分子量を有する短い繰り返しアミノ酸配列のペプチドを含むものを、その有効性が低下するまで投与する。次に、ＬＣにコンジュゲートしたマスキングポリペプチドとＨＣにコンジュゲートしたマスキングポリペプチドを含むＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）であって、これらのコンジュゲートのいずれか又は両方が、約１０ｋＤａの分子量を有するマスキングポリペプチドを含むものを、それらの有効性が低下するまで投与する。次に、ＬＣにコンジュゲートしたマスキングポリペプチドとＨＣにコンジュゲートしたマスキングポリペプチドを含むＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）であって、それらマスキングペプチドの一方又は両方が約２０ｋＤａの分子量を有する短い、繰り返しアミノ酸配列のペプチドを含んでいるものを投与する。
【0052】
一実施形態において、治療することには、対象に、ｃにコンジュゲートしたマスキングポリペプチドを含むＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ｃ）；次にＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＨＣ及びＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃを含む組成物；次にＬＣにコンジュゲートしたマスキングポリペプチド及びＨＣにコンジュゲートしたマスキングポリペプチドを含むＴｅＮＴコンジュゲート（ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）を投与することによって、対象の抗ＴｅＮＴ抗体の免疫学的プロファイルを決定し、そのプロファイルに基づいてＴｅＮＴコンジュゲートの有効組成物を決定する、ことが含まれる。
【0053】
第１０の態様では、第１又は第２の態様のＴｅＮＴ、第３又は第４の態様の組成物を含むキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【0054】
【図1-1】図１は、ヒドラゾンＰＥＧ化、ＰＥＰ化及びヒドラゾンＰＥＰ化後のＴｅＮＴｓの図式表現図である。（Ａ）ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ｃ;（Ｂ）ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＨＣ;（Ｃ）ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ;（Ｄ）ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ；（Ｅ）ＰＥＰ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ；（Ｆ）ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ｃ；（Ｇ）ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＨＣ；（Ｈ）ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ；（Ｉ）ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ。
【図1-2】同上。
【図1-3】同上。
【図7-2】同上。
【図8】図８は、ＴｅＮＴをエンコードするベクターｐＲＳＥＴ－ＴｅＮＴのマップである。ＴｅＮＴはＮ－末端Ｈｉｓ６－ｔａｇで発現している。この核酸を、ｐＲＳＥＴ－Ａベクターのマルチプルクローニング部位（ＭＣＳ）内に挿入し、Ｔ７プロモーターの制御下で発現させた。
【図11】図１１は、配列番号１に対して、表面セリンからシステインへのアミノ酸置換Ｓ８１Ｃ、Ｓ１２０Ｃ、Ｓ１４４Ｃ、Ｓ２４８Ｃ、Ｓ３３５Ｃ、Ｓ４２８Ｃ、Ｓ６００Ｃ、Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、及びＳ１１８７Ｃを含む、１３１４アミノ酸成熟ＴｅＮＴのアミノ酸配列（配列番号５）である。
【図12-2】同上。
【図13】図１３は、図１１の表面セリンからシステイン置換した成熟ＴｅＮＴ（配列番号５）をエンコードする図１２のベクターｐＲＳＥＴ－ＴｅＮＴ（配列番号６）のマップである。表面セリンからシステイン置換のＴｅＮＴは、Ｎ－末端Ｈｉｓ６－タグで発現する。この核酸をｐＲＳＥＴ－ＡベクターのＭＣＳ内に挿入し、Ｔ７プロモーターの制御下で発現させた。
【図14】図１４は、ＬＣ及びｃ領域において、配列番号１に対して、表面セリンからシステインへのアミノ酸置換Ｓ８１Ｃ、Ｓ１２０Ｃ、Ｓ１４４Ｃ、Ｓ２４８Ｃ、Ｓ３３５Ｃ、Ｓ４２８Ｃ、Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、及びＳ１１８７Ｃを含む、１３１４アミノ酸成熟ＴｅＮＴのアミノ酸配列（配列番号７）である。
【図15-2】同上。
【図15-3】同上。
【図16】図１６は、図１４の表面セリンからシステイン置換成熟ＴｅＮＴ（配列番号７）をエンコードする図１５のベクターｐＲＳＥＴ－ＴｅＮＴ（配列番号８）のマップである。表面セリンからシステインに置換したＴｅＮＴは、Ｎ－末端Ｈｉｓ６－タグで発現する。この核酸をｐＲＳＥＴ－ＡベクターのＭＣＳ内に挿入し、Ｔ７プロモーターの制御下で発現させた。
【図17-1】図１７は、配列番号１に対する、ＨＣ表面セリンからシステインへのアミノ酸置換Ｓ６００Ｃ、Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、及びＳ１１８７Ｃを含む、ＴｅＮＴのアミノ酸配列（配列番号９）である。
【図17-2】同上。
【図18-2】同上。
【図19】図１９は、図１７の表面セリンからシステイン置換したＴｅＮＴ（配列番号９）をエンコードする１８ベクターｐＲＳＥＴ－ＴｅＮＴ（配列番号１０）のマップである。表面セリンからシステインに置換したＴｅＮＴは、Ｎ－末端Ｈｉｓ６－タグで発現する。この核酸をｐＲＳＥＴ－ＡベクターのＭＣＳ内に挿入し、Ｔ７プロモーターの制御下で発現させた。
【図20】図２０は、ＬＣ及びｃ領域において、配列番号１に対して、表面セリンからシステインへのアミノ酸置換Ｓ８１Ｃ、Ｓ１２０Ｃ、Ｓ１４４Ｃ、Ｓ２４８Ｃ、Ｓ３３５Ｃ、Ｓ４２８Ｃ、Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、及びＳ１１８７Ｃを含む、１３１４アミノ酸成熟ＴｅＮＴのアミノ酸配列（配列番号１１）である。
【図21-2】同上。
【図21-3】同上。
【図22】図２２は、図２０の表面セリンからシステイン置換成熟ＴｅＮＴ（配列番号１１）をエンコードする図２１のベクターｐＲＳＥＴ－ＴｅＮＴ（配列番号１２）のマップである。表面セリンからシステインに置換されたＴｅＮＴは、Ｎ－末端Ｈｉｓ６－タグで発現する。この核酸をｐＲＳＥＴ－ＡベクターのＭＣＳ内に挿入し、Ｔ７プロモーターの制御下で発現させた。
【図23-1】図２３は、配列番号１に対して、ＨＣ表面セリンからシステインへのアミノ酸置換Ｓ６００Ｃ、Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、及びＳ１１８７Ｃを含む、ＴｅＮＴのアミノ酸配列（配列番号１３）である。
【図23-2】同上。
【図24-2】同上。
【図25】図２５は、図２３の表面セリンからシステイン置換ＴｅＮＴ（配列番号１３）をエンコードする図２４のベクターｐＲＳＥＴ－ＴｅＮＴ（配列番号１４）のマップである。表面セリンからシステインに置換されたＴｅＮＴは、Ｎ－末端Ｈｉｓ６－タグで発現する。核酸をｐＲＳＥＴ－ＡベクターのＭＣＳ内に挿入し、Ｔ７プロモーターの制御下で発現させた。
【発明を実施するための形態】
【0055】
本発明は、一の形態として、酸性環境において放出される免疫マスキング部分を含む免疫回避ＴｅＮＴコンジュゲートに関するものである。又、本発明は、免疫回避ＴｅＮＴコンジュゲートを含む組成物、並びにそれらの治療上及び化粧品としての使用に関する。マスキング部分はＴｅＮＴがニューロンへ取り込まれるのに先立って機能し、ＣＮＳ抑制性介在ニューロンへ取り込まれた後にコンジュゲートから放出され、その結果、ＣＮＳの活性部位に活性ＴｅＮＴを放出する。理論に縛られることを望まないが、本発明者らの理解では、このことは、マスクされたＴｅＮＴが末梢神経からＣＮＳに輸送される小胞で起こる。小胞が抑制性神経細胞に入ると、小胞は酸性化する。すると、ＴｅＮＴはコンフォメーション変化を起こし、活性なＴｅＮＴを細胞質基質内に放出する。一実施形態では、本発明者らは、酸感受性マスキングを使用してこれを利用した。
【0056】
一実施形態において、本発明は、筋緊張低下症の治療に関して、任意選択で閉塞性睡眠時無呼吸症候群を治療することに関する。
【0057】
本明細書中では、破傷風トキソイドに対する保護免疫反応を示す対象の筋緊張低下症を治療するＴｅＮＴコンジュゲートの使用について説明する。その目的を達成するために、活性ＴｅＮＴは、酸分解性連結を介して、ＰＥＧ又はマスキングポリペプチドのようなマスキング部分にコンジュゲートされる。抑制性神経細胞内の酸性条件下、酸分解性連結は加水分解又は切断され、活性ＴｅＮＴを放出する。したがって、本明細書に記載のＴｅＮＴコンジュゲートは、活性破傷風ニューロトロキシンの投与が有用である任意の機能系に使用することができる。例えば、コンジュゲートは、破傷風免疫患者などの対象における筋緊張を増強させるのに使用され得る。
【0058】
本明細書に記載のＴｅＮＴコンジュゲートは、コンジュゲートの単位規定用量、又はその組成物の投与によって活性化し、それと同じ単位用量では、ＴｅＮＴはワクチン接種した対象においては活性を示さないか又はその活性が低下する。いくつかの実施形態では、マスキング部分の結合のために、変異体をＴｅＮＴに導入する。ＴｅＮＴの三次元構造の分析に基いて、ポリペプチド又はＰＥＧ分子などのマスキング部分を指向性結合させるために表面に特定の変異体を導入することによって、ワクチン接種された対象に対して防御抗体反応によって標的化されることが知られている、特定のＴｅＮＴエピトープをマスキングすることができる。ｐＨ不依存性ＰＥＧ化、ポリペプチドコンジュゲーション、及び部位指向性変異の組み合わせにより、ワクチン接種された哺乳類モデルにおける筋緊張を増強させるその分子の効果は、ＴｅＮＴの等価単位投与と比較して、大幅に増加した。
【0059】
本発明者らはさらに、筋緊張の増強により、筋肉の回復及び治癒、筋力及び筋緊張、並びに最終的に強化されたスポーツパフォーマンスを高めることを想定している。したがって、又、本明細書に記載されることは、筋肉の回復、筋肉のパワー及び筋緊張、そしてスポーツパフォーマンスを高めるためのＴｅＮＴコンジュゲートを使用することである。
【0060】
米国特許出願公開第２００２／０１９７２７８号明細書では、不適切な筋収縮の障害を治療する一連のＰＥＧ化ボツリヌス毒素が開示され、ＴｅＮＴがボツリヌス毒素の代替物として使用され得ることが示唆された。しかし、ＴｅＮＴは筋収縮の治療に使用することはできない。さらに、その開示の方法には、エピトープの部位指向性マスキングについては含まれておらず、本発明者らの知る限り、米国特許出願公開第２００２／０１９７２７８号明細書の優先日において、ＴｅＮＴエピトープの意図的マスキングに必要となるエピトープの三次元構造の解明及び同定はできなかったため、米国特許出願公開第２００２／０１９７２７８号明細書で主張される発明内容は有効ではないようである。
【0061】
Ｗａｎらは、ＰＥＧ化タンパク質の投与から生じる抗ＰＥＧ免疫応答に対するＰＥＧ化の効果について検討しているが、いかなる治療にもその知見は活かすされていない。Ｗａｎらは、ＰＥＧ化破傷風トキソイドが、非ＰＥＧ化破傷風トキソイドと比較して免疫原性が減少することを開示しているが、Ｗａｎらは、治療関連の分子又は製剤を提示していない。さらに、破傷風トキソイドのＰＥＧ化は、活性ＴｅＮＴの変性とは関係ない。これは、破傷風トキソイドが、ワクチン接種に用いられる生物学的に不活性なＴｅＮＴであり、ＴｅＮＴのホルムアルデヒド架橋によって生成され得るからである。すなわち、ＰＥＧ化されていようがいまいが、破傷風トキソイドは、活性型ＴｅＮＴの、酵素活性、結合活性、及び転位活性を組み合わせで持ち合わせていない。
【0062】
当業者は、ＴｅＮＴをＰＥＧ化することは、本開示のマスキングとは異なるプロセスであると理解するであろう。なぜならＰＥＧ化では、標的分子、例えばＴｅＮＴの活性を保持する必要がないためである。これに対して、本開示では、ＴｅＮＴの活性を保持しつつ免疫原性を低下させる方法でマスキングすることが求められる。当業者であれば、後者が前者よりも困難であることを理解するであろう。
【0063】
国際公開第２０１６／００１７６２（Ａ１）号パンフレットには、ＴｅＮＴ ｃ－フラグメント単体に関し記載されているが、これは、神経伝達物質と結合して神経細胞に入る以上の特定の活性を有しない分子である。
【0064】
破傷風トキソイドが免疫化された対象に対して、既存の抗ＴｅＮＴ免疫を回避する、ＴｅＮＴ系を使った新たな治療を行う必要がある。本明細書で開示されるのは、通常酸分解性連結を介して、マスキング部分にコンジュゲートしたＴｅＮＴを含む、マスキングされて、活性な、治療関連のＴｅＮＴコンジュゲートである。
【0065】
破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）
ＴｅＮＴは約１５０ｋＤａであり、ｔｅｔＸ遺伝子から発現される。ｔｅｔＸのコード領域に対応するが開始メチオニンコドンを欠く、コドン最適化核酸配列は、図３のベクター配列（配列番号２）にて提供されている。ＴｅＮＴは、翻訳後切断される１つのタンパク質として発現される－まず開始剤メチオニンを除去し、次に２つの部分：未切断タンパク質のＮ末端由来の５０ｋＤａ軽鎖（ＬＣ又はＡ鎖）及び未切断タンパク質のＣ末端由来の１００ｋＤａ重鎖（ＨＣ又はＢ鎖）に切断される。この２本の鎖は鎖間ジスルフィド結合でつながっており、神経毒性に必須である。成熟型ＴｅＮＴの１３１４アミノ酸配列は図２（配列番号１）に示されている。
ＴｅＮＴは約１５０ｋＤａであり、ｔｅｔＸ遺伝子から発現される。ｔｅｔＸのコード領域に対応するが開始メチオニンコドンを欠く、コドン最適化核酸配列は、図３のベクター配列（配列番号２）にて提供されている。ＴｅＮＴは、翻訳後切断される１つのタンパク質として発現される－まず開始剤メチオニンを除去し、次に２つの部分：未切断タンパク質のＮ末端由来の５０ｋＤａ軽鎖（ＬＣ又はＡ鎖）及び未切断タンパク質のＣ末端由来の１００ｋＤａ重鎖（ＨＣ又はＢ鎖）に切断される。この２本の鎖は鎖間ジスルフィド結合でつながっており、神経毒性に必須である。成熟型ＴｅＮＴの１３１４アミノ酸配列は図２（配列番号１）に示されている。
【0066】
ＬＣは亜鉛エンドペプチダーゼ活性を持ち、小胞が膜と融合する上で必要となる小胞関連膜タンパク質（ＶＡＭＰ）を攻撃し、神経伝達物質の放出を阻害する。
【0067】
パパインで消化する際に、ＨＣは、それぞれが５０ｋＤａの２つのドメインに切断され得る：ＨＮと名付けられたＮ末端の転位ドメイン；及びフラグメントｃ（ｃ）と名付けられたＣ末端のガングリオシド（膜）結合ドメインである。ｃを欠くＴｅＮＴは、本明細書においてＬＣ－ＨＮと称す。
【0068】
ｃは２つのポリシアロガングリオシド結合部位を持ち、神経細胞膜上のポリシアロガングリオシド（ＧＤ２ ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ）に結合する。したがって、ｃは、末梢運動軸索のシナプス前膜へのＴｅＮＴの結合を媒介し、その膜を越えてニューロンへのＴｅＮＴの移動を補助する。
【0069】
開始剤メチオニンを欠くＴｅＮＴアミノ酸配列は、図６（配列番号１）に示す。
ＨＣのアミノ酸配列は、図９（配列番号３）に示す。
ｃのアミノ酸配列は、図１０（配列番号４）に示す；及び
開始剤メチオニンを欠くＴｅＮＴをエンコードするベクターのコドン最適化核酸配列及びそのベクターマップは、図７（配列番号２）及び図８に示す；本明細書中、「ＴｅＮＴ」は、重鎖及び軽鎖からなる完全なＴｅＮＴ分子に関して使用される。サブドメイン及びフラグメントは、本明細書ではそれらの略語で呼ばれる：軽鎖「ＬＣ」；重鎖「ＨＣ」；重鎖Ｎ末端ドメイン「ＨＮ」；重鎖フラグメントｃ「ｃ」；軽鎖プラス重鎖Ｎ末端ドメイン「ＬＣ－ＨＮ」（すなわち、ｃを欠くＴｅＮＴ分子）。任意のサブドメイン又はフラグメントがＰＥＧ化されている場合、接頭辞ＰＥＧが使用される。ＰＥＧ－ＬＣ；ＰＥＧ－ＨＣ；ＰＥＧ－ＨＮ；ＰＥＧ－Ｃ；ＰＥＧ－ＬＣ－ＨＮ。ＰＥＧ化されたフラグメント又はサブドメインを含む完全なＴｅＮＴ分子では、接頭辞ＰＥＧが使用され、ＰＥＧ化されたサブドメイン又はフラグメントが示される：ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ；ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ；ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ；ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＮ；ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ；ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ；ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＮなどのように示される。
ＨＣのアミノ酸配列は、図９（配列番号３）に示す。
ｃのアミノ酸配列は、図１０（配列番号４）に示す；及び
開始剤メチオニンを欠くＴｅＮＴをエンコードするベクターのコドン最適化核酸配列及びそのベクターマップは、図７（配列番号２）及び図８に示す；本明細書中、「ＴｅＮＴ」は、重鎖及び軽鎖からなる完全なＴｅＮＴ分子に関して使用される。サブドメイン及びフラグメントは、本明細書ではそれらの略語で呼ばれる：軽鎖「ＬＣ」；重鎖「ＨＣ」；重鎖Ｎ末端ドメイン「ＨＮ」；重鎖フラグメントｃ「ｃ」；軽鎖プラス重鎖Ｎ末端ドメイン「ＬＣ－ＨＮ」（すなわち、ｃを欠くＴｅＮＴ分子）。任意のサブドメイン又はフラグメントがＰＥＧ化されている場合、接頭辞ＰＥＧが使用される。ＰＥＧ－ＬＣ；ＰＥＧ－ＨＣ；ＰＥＧ－ＨＮ；ＰＥＧ－Ｃ；ＰＥＧ－ＬＣ－ＨＮ。ＰＥＧ化されたフラグメント又はサブドメインを含む完全なＴｅＮＴ分子では、接頭辞ＰＥＧが使用され、ＰＥＧ化されたサブドメイン又はフラグメントが示される：ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ；ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ；ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ；ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＮ；ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ；ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ；ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＮなどのように示される。
【0070】
マスキングポリペプチドを含む完全なＴｅＮＴ分子又はサブドメインに対しては、接頭辞ＰＥＰが使用され、ＰＥＰ化されたサブドメイン又はフラグメントが示される：ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ；ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＨＣ；ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ；ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＨＮ；ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ｃ；ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ；ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＮ等である。
【0071】
サブドメイン及びフラグメントは、それぞれ特定の機能を持つので、完全なＴｅＮＴに対して互換できないことが理解されよう。
【0072】
本明細書に開示のＴｅＮＴは、活性であっても不活性であってもよい。活性なＴｅＮＴは、元々のＴｅＮＴと同じ生物学的活性を有する。不活性なＴｅＮＴは、元々のＴｅＮＴにある１つ以上の活性を欠く。一実施形態では、不活性なＴｅＮＴは、抑制性神経伝達物質の放出をブロックしない。不活性なＴｅＮＴは、破傷風トキソイドを含む。一実施形態では、不活性なＴｅＮＴは、本明細書に開示するような不活性なＴｅＮＴである。不活性ＴｅＮＴは、適応免疫系に対してデコイとして作用するために、本開示の活性ＴｅＮＴの活性を向上させることができる。
【0073】
一実施形態では、２つ以上のＴｅＮＴがコンジュゲートされてもよい。
【0074】
別の実施形態では、ＴｅＮＴは、コンジュゲートされていない。本明細書に開示の組成物、方法及び使用の一実施形態では、第１のＰＥＧ－ＴｅＮＴは、第２のＴｅＮＴとコンジュゲートしていない
【0075】
理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、本開示のＴｅＮＴには、コンジュゲートされないことで、少なくとも１つの明確かつ重要な利点が存在すると考える。
具体的には、使用における一実施形態では、本組成物は、対象の適応免疫応答からＰＥＧ化又はペプチドによってマスクされる１つの活性ＴｅＮＴと、同時に適応免疫応答を引きつける、不活性でマスクされないデコイＴｅＮＴと組み合わせて提供される。これらのＴｅＮＴがコンジュゲートされた場合、適応免疫応答により、マスクされた活性ＴｅＮＴの存在にもかかわらず、マスクされていないデコイＴｅＮＴの貢献により、そのコンジュゲートは不活性化されるだろう。したがって、一実施形態では、２つのＴｅＮＴがコンジュゲートされてないことが保証されることで、本組成物が活性であることが保証される。
具体的には、使用における一実施形態では、本組成物は、対象の適応免疫応答からＰＥＧ化又はペプチドによってマスクされる１つの活性ＴｅＮＴと、同時に適応免疫応答を引きつける、不活性でマスクされないデコイＴｅＮＴと組み合わせて提供される。これらのＴｅＮＴがコンジュゲートされた場合、適応免疫応答により、マスクされた活性ＴｅＮＴの存在にもかかわらず、マスクされていないデコイＴｅＮＴの貢献により、そのコンジュゲートは不活性化されるだろう。したがって、一実施形態では、２つのＴｅＮＴがコンジュゲートされてないことが保証されることで、本組成物が活性であることが保証される。
【0076】
すなわち、一実施形態において、２つの機能が所望される場合、それぞれ機能は独立していることが意図され、よって本発明のＴｅＮＴはコンジュゲートされない。
【0077】
理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、２つのＴｅＮＴをコンジュゲートすることにより、活性ＴｅＮＴ又は活性ＴｅＮＴの活性は、おそらくコンジュゲートのサイズに基づく免疫応答を引き起こすことで、損なわれかもしれないと考察している。
【0078】
これらの利点を認識した上ではあるが、一実施形態では、２つ以上のＴｅＮＴが互いにコンジュゲートされ得る。
【0079】
本明細書に開示され、図１に描かれている免疫回避ＰＥＧ－ＴｅＮＴ及びＰＥＰ－ＴｅＮＴは、以下を含む。
ヒドラゾンＰＥＧ化フラグメントｃ（ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ｃ）を有するＴｅＮＴ（図１Ａ）（実施例１）。
ＰＥＰ化重鎖（ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＨＣ）を有するＴｅＮＴ（図１Ｂ）（実施例９）。
ＰＥＰ化軽鎖及びフラグメントｃ（ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ）を有するＴｅＮＴ（図１Ｃ）（実施例１０）。
ＰＥＰ化された軽鎖及び重鎖（ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）を有するＴｅＮＴ（図１Ｄ）（実施例１１）。
ヒドラゾンＰＥＰ化軽鎖及び重鎖（ＰＥＰ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）を有するＴｅＮＴ(図１Ｅ)(実施例１１);
ＰＥＰ化フラグメントｃ（ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ｃ）を有するＴｅＮＴ（図１Ｆ）（実施例８）。
ヒドラゾンＰＥＧ化重鎖（ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＨＣ）を有するＴｅＮＴ(図1Ｇ)(実施例２);
ヒドラゾンＰＥＧ化軽鎖及びＰＥＧ化フラグメントｃ（ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ）を有するＴｅＮＴ（図1Ｈ）（実施例３）；及び
完全ヒドラゾンＰＥＧ化されたもの（ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）ＴｅＮＴ（図１Ｉ）（実施例５）。
ヒドラゾンＰＥＧ化フラグメントｃ（ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ｃ）を有するＴｅＮＴ（図１Ａ）（実施例１）。
ＰＥＰ化重鎖（ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＨＣ）を有するＴｅＮＴ（図１Ｂ）（実施例９）。
ＰＥＰ化軽鎖及びフラグメントｃ（ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ）を有するＴｅＮＴ（図１Ｃ）（実施例１０）。
ＰＥＰ化された軽鎖及び重鎖（ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）を有するＴｅＮＴ（図１Ｄ）（実施例１１）。
ヒドラゾンＰＥＰ化軽鎖及び重鎖（ＰＥＰ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）を有するＴｅＮＴ(図１Ｅ)(実施例１１);
ＰＥＰ化フラグメントｃ（ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ｃ）を有するＴｅＮＴ（図１Ｆ）（実施例８）。
ヒドラゾンＰＥＧ化重鎖（ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＨＣ）を有するＴｅＮＴ(図1Ｇ)(実施例２);
ヒドラゾンＰＥＧ化軽鎖及びＰＥＧ化フラグメントｃ（ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ）を有するＴｅＮＴ（図1Ｈ）（実施例３）；及び
完全ヒドラゾンＰＥＧ化されたもの（ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）ＴｅＮＴ（図１Ｉ）（実施例５）。
【0080】
ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ｃは、ワクチン接種された対象における適応免疫系の既存の免疫応答を回避するので有利である。一実施形態では、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃにより、有効性が低下するまで使用されることになる第一層の治療が提供される。
【0081】
ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ及びＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃは、ワクチン接種された対象における適応免疫系の既存の免疫応答を回避するか、又はＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃへの反復曝露によって誘発される適応免疫系の免疫応答を回避するので有利である。
【0082】
一実施形態では、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ及びＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃは一緒になって、それらの有効性が低下するまで使用されることになる第２層治療を提供する。
【0083】
ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣは、ワクチン接種された対象における適応免疫系の既存の免疫応答を回避し、及びＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ及びＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ、さらにＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃへの反復曝露によって誘発される適応免疫系の免疫応答も回避するので有利である。
【0084】
一実施形態では、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣにより、その有効性が低下するまで使用されることになる第３層の治療が提供される。
【0085】
又、ＰＥＧ化軽鎖（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ）を有するＴｅＮＴ、ＰＥＧ化ＬＣ及びＨＮ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＮ）を有するＴｅＮＴ、及びＰＥＧ化ＨＮ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＮ）を有するＴｅＮＴが開示される。
【0086】
当業者によれば、ＰＥＧ－ＴｅＮＴの特定の組み合わせ及びそれらのＰＥＧ－ＴｅＮＴの組み合わせによる処理の順序を変更できることが理解されるであろう。
【0087】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
ＰＥＧを、酸分解性連結を介して以下のものにコンジュゲートしてもよく、それに該当するものとして、例えば、リジン（例えば、アミノ－ＰＥＧ化）、システイン（例えば、チオール－ＰＥＧ化及び橋渡しＰＥＧ化）、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン（例えばＮ－糖ＰＥＧ化）、グルタミン酸、グルタミン（例えば、トランスグルタミナーゼ媒介ＰＥＧ化）、セリン（例えば、Ｏ－糖ＰＥＧ化）、スレオニン（例えば、Ｏ－糖ＰＥＧ化）、又はＴｅＮＴのチロシン残基が挙げられる。ＰＥＧ化の例には、Ｎ末端ＰＥＧ化及びＣ末端ＰＥＧ化も含まれる。
ＰＥＧを、酸分解性連結を介して以下のものにコンジュゲートしてもよく、それに該当するものとして、例えば、リジン（例えば、アミノ－ＰＥＧ化）、システイン（例えば、チオール－ＰＥＧ化及び橋渡しＰＥＧ化）、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン（例えばＮ－糖ＰＥＧ化）、グルタミン酸、グルタミン（例えば、トランスグルタミナーゼ媒介ＰＥＧ化）、セリン（例えば、Ｏ－糖ＰＥＧ化）、スレオニン（例えば、Ｏ－糖ＰＥＧ化）、又はＴｅＮＴのチロシン残基が挙げられる。ＰＥＧ化の例には、Ｎ末端ＰＥＧ化及びＣ末端ＰＥＧ化も含まれる。
【0088】
ＰＥＧ化は、ＰＥＧをヒドロキシル反応性である官能基、例えば無水物、酸塩化物、クロロホルメート及び炭酸塩と反応させることにより行ってもよい。あるいは、ＰＥＧ化は
、アルデヒド、エステル、及びアミドのような官能基により行ってもよい。
、アルデヒド、エステル、及びアミドのような官能基により行ってもよい。
【0089】
ＰＥＧは直鎖状であっても分岐状であってもよい。
【0090】
ＰＥＧは、例えば、ポリ［オリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート］（ＰＯＥＧＭＡ）等の変性ＰＥＧであってもよい。
【0091】
ＰＥＧ化とは、部位特異的ＰＥＧ化であってもよい。
【0092】
一実施形態では、ＴｅＮＴ又はＴｅＮＴフラグメントの表面セリン残基を、免疫原性エピトープにおける指向性ＰＥＧコンジュゲーションを促進するために、表面システイン残基へと変異させる。この文脈では、変異は置換と同義であり、例えば、セリンからシステインへの置換が挙げられる。そのような変異、又は置換は、任意の組み合わせであってよく、Ｓ８１Ｃ；Ｓ１２０Ｃ；Ｓ１４４Ｃ；Ｓ２４８Ｃ；Ｓ３３５Ｃ；Ｓ４２８Ｃ；Ｓ６００Ｃ；Ｓ９６３Ｃ；Ｓ１０４１Ｃ；Ｓ１１５５Ｃ；及びＳ１１８７Ｃのうちの１つ以上が含まれる。
【0093】
ヘテロ二官能性ＰＥＧの官能基としては、マレイミド、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、アミン、カルボン酸、ＮＨＳエステルが挙げられる。
【0094】
一実施形態では、ＰＥＧは、カルボジイミド－ＥＤＣ及びスルホ－ＮＨＳを用いたカルボキシル－アミン架橋によりＴｅＮＴにコンジュゲートされる。
【0095】
本発明では、ＴｅＮＴの異なるサブドメイン又は断片にコンジュゲートされた、異なる分子量のＰＥＧを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴも考えられる。
【0096】
例えば、ＰＥＧを本開示のＴｅＮＴに、４℃～２５℃で２～６時間、コンジュゲート又は結合させることができる。一実施形態では、ＰＥＧをＴｅＮＴに、室温で６時間、コンジュゲートさせた。
【0097】
マスキングポリペプチド（ＰＥＰ）
マスキングポリペプチドを以下のものにコンジュゲートしてもよい。その例としては、リジン（例えば、アミノ－ＰＥＰ化）、システイン（例えば、チオール－ＰＥＰ化及び橋渡しＰＥＰ化）、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン（例えば、Ｎ－糖ＰＥＰ化）、グルタミン酸、グルタミン（例えば、トランスグルタミナーゼ媒介ＰＥＰ化）、セリン（例えば、Ｏ－グリ－ＰＥＰ化）、スレオニン（例えば、Ｏ－糖ＰＥＰ化）、又はＴｅＮＴのチロシン残基が挙げられる。ＰＥＰ化の例には、Ｎ－末端ＰＥＰ化及びＣ－末端ＰＥＰ化も含まれる。
マスキングポリペプチドを以下のものにコンジュゲートしてもよい。その例としては、リジン（例えば、アミノ－ＰＥＰ化）、システイン（例えば、チオール－ＰＥＰ化及び橋渡しＰＥＰ化）、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン（例えば、Ｎ－糖ＰＥＰ化）、グルタミン酸、グルタミン（例えば、トランスグルタミナーゼ媒介ＰＥＰ化）、セリン（例えば、Ｏ－グリ－ＰＥＰ化）、スレオニン（例えば、Ｏ－糖ＰＥＰ化）、又はＴｅＮＴのチロシン残基が挙げられる。ＰＥＰ化の例には、Ｎ－末端ＰＥＰ化及びＣ－末端ＰＥＰ化も含まれる。
【0098】
ＰＥＰ化は、ＰＥＰをヒドロキシル反応性である官能基、例えば無水物、酸塩化物、クロロホルメート及び炭酸塩と反応させることによって行われてもよい。あるいは、ＰＥＧ化は、アルデヒド、エステル、及びアミドのような官能基を用いて行われてもよい。
【0099】
ＰＥＰは、直鎖状であっても分岐状であってもよい。
【0100】
ＰＥＰは、Ｏ－連結グリコシル化を伴う又は伴わない、グリシンとスレオニンの繰り返し（ＧＴ－ＰＥＰ）又はランダムな配列であってもよい。
【0101】
ＰＥＰ化は、部位特異的なＰＥＰ化であってもよい。
【0102】
一実施形態では、ＴｅＮＴ又はＴｅＮＴ断片の表面セリン残基を表面システイン残基に変異させ、免疫原性エピトープにおける指向性ＰＥＰコンジュゲーションを容易にする。この文脈では、変異は置換と同義であり、例えば、セリンからシステインへの置換が挙げられる。そのような変異、又は置換には、Ｓ８１Ｃ；Ｓ１２０Ｃ；Ｓ１４４Ｃ；Ｓ２４８Ｃ；Ｓ３３５Ｃ；Ｓ４２８Ｃ；Ｓ６００Ｃ；Ｓ９６３Ｃ；Ｓ１０４１Ｃ；Ｓ１１５５Ｃ；及びＳ１１８７Ｃのうちの１つ以上の任意の組み合わせが含まれる。
【0103】
ヘテロ二官能性ＰＥＰの官能基としては、マレイミド、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、アミン、カルボン酸、ＮＨＳエステルなどが挙げられる。
【0104】
一実施形態において、ＰＥＰは、カルボジイミド－ＥＤＣ及びスルホ－ＮＨＳを用いたカルボキシル－アミン架橋を使用してＴｅＮＴにコンジュゲートされる。
【0105】
本発明では又、ＴｅＮＴの異なるサブドメイン又は断片にコンジュゲートされた異なる分子量のＰＥＰを含むＰＥＰ－ＴｅＮＴが考えられる。
【0106】
ＰＥＰは、例えば、４℃～２５℃の間で２～６時間、本開示のＴｅＮＴにコンジュゲート又は結合させることができる。一実施形態では、ＰＥＰを室温で６時間、ＴｅＮＴにコンジュゲートした。
【0107】
理論に拘束されることを望まないが、本発明者らが考えるには、ＰＥＰは、ＰＥＧよりも免疫原性が低く、ＰＥＧにアレルギーがある対象において特に有用であり得、ＰＥＰは、例えば、ＴｅＮＴの内因性溶解度付近での溶解度を維持し、及び／又は膜相互作用を最小化することによって、ＰＥＧよりもＴｅＮＴ活性に対する有害性が低くあり得る。
【0108】
ヒドラゾン連結
ヒドラゾン連結は、ＰＥＧ分子とＴｅＮＴとの間、又はマスキングポリペプチドとＴｅＮＴとの間に導入してもよく、ここでＰＥＧ又はポリペプチドは以下のものにコンジュゲートさせてもよい：それに該当するものとして、例えば、リジン（例えば、アミノ－ＰＥＧ化、アミノ－ＰＥＰ化）、システイン（例えば、チオール－ＰＥＧ化及び橋渡しＰＥＧ化、チオール－ＰＥＧ化及び橋渡しＰＥＧ化）、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン（例えば、Ｎ－糖ＰＥＧ化）、グルタミン酸、グルタミン（例えば、トランスグルタミナーゼを介したＰＥＧ化）、セリン（例えばＯ－糖ＰＥＧ化）、スレオニン（例えばＯ－糖ＰＥＧ化）、又はＴｅＮＴのチロシン残基が挙げられる。ヒドラゾンは、ヘテロ二官能性架橋剤、例えば、スクシンイミジル６－ヒドラジノニコチンアミドアセトンヒドラジン（ＳＡＮＨ）、スクシンイミジル６－ヒドラジニウムニコチン塩酸塩（ＳＨＮＨ）、Ｎ－（β－マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド（ＢＭＰＨ）、Ｎ－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）又はＮ－κ－マレイミドウンデカン酸ヒドラジド（ＫＭＵＨ）と、ＴｅＮＴ上の表面リジン又はシステイン及びＰＥＧ又はペプチド上のアルデヒド基とを反応させることにより導入してもよい。ヒドラゾンは、ＴｅＮＴの表面リジンやシステインにニコチンアミド基を導入し、ＰＥＧやペプチドのカルボニル基と連結することによる、化学的手法で導入することができる。ＰＥＧ化の例としては、Ｎ末端ＰＥＧ化、Ｃ末端ＰＥＧ化も含まれる。ヒドラゾンは、グリコールペプチド上の酸化された炭水化物のカルボニル基とヒドラジドを反応させ、その後に、その後に、ヘテロ二官能性クロスリンカーでＴｅＮＴ上のシステイン残基に架橋する。
ヒドラゾン連結は、ＰＥＧ分子とＴｅＮＴとの間、又はマスキングポリペプチドとＴｅＮＴとの間に導入してもよく、ここでＰＥＧ又はポリペプチドは以下のものにコンジュゲートさせてもよい：それに該当するものとして、例えば、リジン（例えば、アミノ－ＰＥＧ化、アミノ－ＰＥＰ化）、システイン（例えば、チオール－ＰＥＧ化及び橋渡しＰＥＧ化、チオール－ＰＥＧ化及び橋渡しＰＥＧ化）、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン（例えば、Ｎ－糖ＰＥＧ化）、グルタミン酸、グルタミン（例えば、トランスグルタミナーゼを介したＰＥＧ化）、セリン（例えばＯ－糖ＰＥＧ化）、スレオニン（例えばＯ－糖ＰＥＧ化）、又はＴｅＮＴのチロシン残基が挙げられる。ヒドラゾンは、ヘテロ二官能性架橋剤、例えば、スクシンイミジル６－ヒドラジノニコチンアミドアセトンヒドラジン（ＳＡＮＨ）、スクシンイミジル６－ヒドラジニウムニコチン塩酸塩（ＳＨＮＨ）、Ｎ－（β－マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド（ＢＭＰＨ）、Ｎ－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）又はＮ－κ－マレイミドウンデカン酸ヒドラジド（ＫＭＵＨ）と、ＴｅＮＴ上の表面リジン又はシステイン及びＰＥＧ又はペプチド上のアルデヒド基とを反応させることにより導入してもよい。ヒドラゾンは、ＴｅＮＴの表面リジンやシステインにニコチンアミド基を導入し、ＰＥＧやペプチドのカルボニル基と連結することによる、化学的手法で導入することができる。ＰＥＧ化の例としては、Ｎ末端ＰＥＧ化、Ｃ末端ＰＥＧ化も含まれる。ヒドラゾンは、グリコールペプチド上の酸化された炭水化物のカルボニル基とヒドラジドを反応させ、その後に、その後に、ヘテロ二官能性クロスリンカーでＴｅＮＴ上のシステイン残基に架橋する。
【0109】
糖ペプチド
ペプチドは、炭水化物をＮ－連結型グリコシル化又はＯ－連結型グリコシル化によってペプチドに結合される真核生物宿主系において発現させることによって、糖ペプチドとして産生され得る。糖ペプチドを、マスキング剤として直接、たとえば以下のＴｅＮＴにコン
ジュゲートさせてもよい。その例としては、リジン（例えば、アミノ－ＰＥＧ化、アミノ－ＰＥＰ化）、システイン（例えば、チオール－ＰＥＧ化及び橋渡しＰＥＧ化、チオール－ＰＥＧ化及び橋渡しＰＥＧ化）、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン（例えば、Ｎ－糖ＰＥＧ化）、グルタミン酸、グルタミン（例えば、トランスグルタミナーゼ媒介ＰＥＧ化）、セリン（例えば、Ｏ－糖ＰＥＧ化）、スレオニン（例えば、Ｏ－糖ＰＥＧ化）、又はＴｅＮＴのチロシン残基が挙げられる。ＰＥＧ化の例としては、Ｎ末端ＰＥＧ化及びＣ末端ＰＥＧ化も挙げられる。糖タンパク質の炭水化物残基を酸化して、ＴｅＮＴに直接糖ペプチドをコンジュゲートさせるのに使用するカルボニル基を導入してもよく、又は糖ペプチドとＴｅＮＴの間にｐＨ分解性リンカーを導入してもよい。
ペプチドは、炭水化物をＮ－連結型グリコシル化又はＯ－連結型グリコシル化によってペプチドに結合される真核生物宿主系において発現させることによって、糖ペプチドとして産生され得る。糖ペプチドを、マスキング剤として直接、たとえば以下のＴｅＮＴにコン
ジュゲートさせてもよい。その例としては、リジン（例えば、アミノ－ＰＥＧ化、アミノ－ＰＥＰ化）、システイン（例えば、チオール－ＰＥＧ化及び橋渡しＰＥＧ化、チオール－ＰＥＧ化及び橋渡しＰＥＧ化）、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン（例えば、Ｎ－糖ＰＥＧ化）、グルタミン酸、グルタミン（例えば、トランスグルタミナーゼ媒介ＰＥＧ化）、セリン（例えば、Ｏ－糖ＰＥＧ化）、スレオニン（例えば、Ｏ－糖ＰＥＧ化）、又はＴｅＮＴのチロシン残基が挙げられる。ＰＥＧ化の例としては、Ｎ末端ＰＥＧ化及びＣ末端ＰＥＧ化も挙げられる。糖タンパク質の炭水化物残基を酸化して、ＴｅＮＴに直接糖ペプチドをコンジュゲートさせるのに使用するカルボニル基を導入してもよく、又は糖ペプチドとＴｅＮＴの間にｐＨ分解性リンカーを導入してもよい。
【0110】
効能・効果
本明細書で使用される場合、「筋緊張低下」とは、抑制性神経伝達物質、例えばＧＡＢＡ又はグリシンを抑制することによって治療され得る、不随意の筋力低下を含む任意の障害を意味する。このように、「筋緊張低下症」には、神経駆動の低下、又は筋緊張、筋力、若しくは神経駆動の低下又は不具合を引き起こす他の原因や状態に伴う筋緊張の低下を含む。したがって、一実施形態では、筋緊張低下症は、神経性筋緊張低下症であってもよい。一実施形態では、筋緊張低下症は睡眠誘発性であってもよく、すなわち、筋肉が、覚醒期間中の同じ筋肉と比較して、睡眠中に低緊張性であってもよい。
本明細書で使用される場合、「筋緊張低下」とは、抑制性神経伝達物質、例えばＧＡＢＡ又はグリシンを抑制することによって治療され得る、不随意の筋力低下を含む任意の障害を意味する。このように、「筋緊張低下症」には、神経駆動の低下、又は筋緊張、筋力、若しくは神経駆動の低下又は不具合を引き起こす他の原因や状態に伴う筋緊張の低下を含む。したがって、一実施形態では、筋緊張低下症は、神経性筋緊張低下症であってもよい。一実施形態では、筋緊張低下症は睡眠誘発性であってもよく、すなわち、筋肉が、覚醒期間中の同じ筋肉と比較して、睡眠中に低緊張性であってもよい。
【0111】
本開示に係るＴｅＮＴコンジュゲート、組成物又は方法により治療され得る筋緊張低下症としては、閉塞性睡眠時無呼吸、無呼吸、いびき、眼瞼下垂、ホルネル症候群、筋萎縮、神経学的障害筋、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、運動ニューロン疾患、任意の筋疾患、多発性硬化、重症筋無力症、顔面筋緊張の低下、任意の眼瞼外反、あらゆる原因による任意の骨格筋又は平滑筋の弛緩性麻痺又は弱化、後に人工呼吸器不全を伴う、あらゆる原因による呼吸筋肉弱化、外傷による筋力低下又は筋弛緩による不良姿勢、骨盤底筋弛緩又は弱化、又は鼻又は上気道弛緩、を挙げることができる。
【0112】
本開示に係るＴｅＮＴコンジュゲート、組成物又は方法により治療され得る他の障害としては、筋萎縮、又は筋肉量の減少を挙げることができる。
【0113】
本開示に係る治療されるべき障害が筋緊張低下症それ自体ではない場合、本開示のＴｅＮＴで治療することによって筋緊張を増強させ、障害の症状を緩和することができる。
【0114】
本明細書に記載のＴｅＮＴコンジュゲートの化粧品用途としては、腹筋の引き締め、大胸筋の引き締め、大殿筋の引き締め、骨格筋の引き締め、又は筋肉の弛緩によって引き起こされる顔の垂れ下がりの治療を挙げることができる。
【0115】
本開示のＴｅＮＴコンジュゲート、本開示に係る組成物又は方法により治療され得る平滑筋、骨格筋、組織又は器官としては、上部食道、食道壁、食道括約筋、下部食道括約筋、肛門括約筋、膀胱、膀胱括約筋、膣括約筋、幽門括約筋、オディ括約筋、回盲部括約筋、骨盤底筋、前立腺、顎下腺、耳下腺、舌下腺、口腔粘膜の小唾液腺、声帯、喉頭筋、表情筋、顎筋、顎挙筋、咀嚼筋、頭皮筋、胸筋、背筋、上肢筋、前腕筋、下肢筋、手筋、足筋、胃壁筋、大腸壁筋、頸部筋、咽頭拡張筋、咬筋、内側翼突筋、外側翼突筋、オトガイ舌骨筋、オトガイ舌筋、口蓋垂筋、口蓋帆張筋、茎突咽頭筋、顎舌骨筋、茎突舌骨筋、舌骨舌筋、顎二腹筋、胸鎖乳突筋、僧帽筋、側頭筋、輪状咽頭筋、子宮筋・子宮頸部、胃神経供給部、鼻内粘膜、肺粘膜、皮膚、胸腺、骨、冠動脈、肺平滑筋、心筋を挙げることができる。
【0116】
一実施形態では、喉頭片麻痺、再発性喉頭神経障害又はローラー症候群を、本開示のＴｅＮＴコンジュゲートにより治療してもよい。これらの兆候は、ウマ科又はイヌ科の対象
、特にウマ又はイヌにおいて治療されてもよい。
、特にウマ又はイヌにおいて治療されてもよい。
【0117】
本明細書に記載のＴｅＮＴコンジュゲートは、筋緊張、筋力、筋治癒及び／又はスポーツのパフォーマンスを高めるために使用することもできる。
【0118】
組成物及び投与
本開示の組成物は、治療用組成物又は化粧用組成物であってよい。すなわち、組成物を治療目的に又は化粧品用に使用してもよい。
本開示の組成物は、治療用組成物又は化粧用組成物であってよい。すなわち、組成物を治療目的に又は化粧品用に使用してもよい。
【0119】
本明細書中、用語「治療用組成物」又は「化粧用組成物」は、本明細書に記載の対象における筋緊張低下症を抑制又は治療するＴｅＮＴを含む組成物を意味する。組成物は、対象へ投与するために製剤化されている。一実施形態では、組成物は、無菌である。一実施形態では、組成物は、パイロジェンフリーである。組成物は、薬剤的に許容可能な担体を含んでいてもよい。好ましくは、組成物は、ＧＬＰ（Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）又はＧＭＰ（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）に従って製造される。
【0120】
本開示のＴｅＮＴコンジュゲートは、１０ｍｇ／ｋｇまで又はそれ以上投与してもよい。本開示のＴｅＮＴコンジュゲートは、約１ｆｇ／ｋｇ、約５ｆｇ／ｋｇ、約１０ｆｇ／ｋｇ、約５０ｆｇ／ｋｇ、約１００ｆｇ／ｋｇ、約５００ｆｇ／ｋｇ、約１ｐｇ／ｋｇ、約５ｐｇ／ｋｇ、約１０ｐｇ／ｋｇ、約５０ｐｇ／ｋｇ、約１００ｐｇ／ｋｇ、約５００ｐｇ／ｋｇ、約１ｎｇ／ｋｇ、約２ｎｇ／ｋｇ、約３ｎｇ／ｋｇ、約４ｎｇ／ｋｇ、約５ｎｇ／ｋｇ、約６ｎｇ／ｋｇ、約７ｎｇ／ｋｇ、約８ｎｇ／ｋｇ、約9ｎｇ／ｋｇ、約１
０ｎｇ／ｋｇ、約１１ｎｇ／ｋｇ、約１２ｎｇ／ｋｇ、約１３ｎｇ／ｋｇ、約１４ｎｇ／ｋｇ、約１５ｎｇ／ｋｇ、約１６ｎｇ／ｋｇ、約１７ｎｇ／ｋｇ、約１８ｎｇ／ｋｇ、約１９ｎｇ／ｋｇ、約２０ｎｇ／ｋｇ、約３０ｎｇ／ｋｇ、約４０ｎｇ／ｋｇ、約５０ｎｇ／ｋｇ、約６０ｎｇ／ｋｇ、約７０ｎｇ／ｋｇ、約８０ｎｇ／ｋｇ、約９０ｎｇ／ｋｇ、約１００ｎｇ／ｋｇ、約２００ｎｇ／ｋｇ、約 ３００ｎｇ／ｋｇ、約４００ｎｇ／ｋｇ
、約５００ｎｇ／ｋｇ、約６００ｎｇ／ｋｇ、約７００ｎｇ／ｋｇ、約８００ｎｇ／ｋｇ、約９００ｎｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ、約５μｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ、約５０μｇ／ｋｇ、約１００μg／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ又は約１０ｍｇ／
ｋｇ、の量を投与してもよい。本開示のＴｅＮＴコンジュゲートは、上記の用量のいずれかの範囲内で投与され得る。
０ｎｇ／ｋｇ、約１１ｎｇ／ｋｇ、約１２ｎｇ／ｋｇ、約１３ｎｇ／ｋｇ、約１４ｎｇ／ｋｇ、約１５ｎｇ／ｋｇ、約１６ｎｇ／ｋｇ、約１７ｎｇ／ｋｇ、約１８ｎｇ／ｋｇ、約１９ｎｇ／ｋｇ、約２０ｎｇ／ｋｇ、約３０ｎｇ／ｋｇ、約４０ｎｇ／ｋｇ、約５０ｎｇ／ｋｇ、約６０ｎｇ／ｋｇ、約７０ｎｇ／ｋｇ、約８０ｎｇ／ｋｇ、約９０ｎｇ／ｋｇ、約１００ｎｇ／ｋｇ、約２００ｎｇ／ｋｇ、約 ３００ｎｇ／ｋｇ、約４００ｎｇ／ｋｇ
、約５００ｎｇ／ｋｇ、約６００ｎｇ／ｋｇ、約７００ｎｇ／ｋｇ、約８００ｎｇ／ｋｇ、約９００ｎｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ、約５μｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ、約５０μｇ／ｋｇ、約１００μg／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ又は約１０ｍｇ／
ｋｇ、の量を投与してもよい。本開示のＴｅＮＴコンジュゲートは、上記の用量のいずれかの範囲内で投与され得る。
【0121】
本開示のＴｅＮＴコンジュゲートは、１０００ＩＵ／ｋｇまで又はそれ以上投与してもよい。本開示のＴｅＮＴコンジュゲートは、約０．１ＩＵ／ｋｇ、約０．２ＩＵ／ｋｇ、約０．３ＩＵ／ｋｇ、約０．４ＩＵ／ｋｇ、約０．５ＩＵ／ｋｇ、約０．６ＩＵ／ｋｇ、約０．７ＩＵ／ｋｇ、約０．８ＩＵ／ｋｇ、約０.９ＩＵ／ｋｇ、約１ＩＵ／ｋｇ、約２
ＩＵ／ｋｇ、約３ＩＵ／ｋｇ、約４ＩＵ／ｋｇ、約５ＩＵ／ｋｇ、約６ＩＵ／ｋｇ、約７ＩＵ／ｋｇ、約８ＩＵ／ｋｇ、約９ＩＵ／ｋｇ、約１０ＩＵ／ｋｇ、約１１ＩＵ／ｋｇ、約１２ＩＵ／ｋｇ、約１３ＩＵ／ｋｇ、約１４ＩＵ／ｋｇ、約１５ＩＵ／ｋｇ、約１６ＩＵ／ｋｇ、約１７ＩＵ／ｋｇ、約１８ＩＵ／ｋｇ、約１９ＩＵ／ｋｇ、約２０ＩＵ／ｋｇ、約３０ＩＵ／ｋｇ、約４０ＩＵ／ｋｇ、約５０ＩＵ／ｋｇ、約６０ＩＵ／ｋｇ、約７０ＩＵ／kg、約８０ＩＵ／ｋｇ、約９０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ、約３００ＩＵ／ｋｇ、約４００ＩＵ／ｋｇ、約５００ＩＵ／ｋｇ、約６００ＩＵ／ｋｇ、約７００ＩＵ／ｋｇ、約８００ＩＵ／ｋｇ、約９００ＩＵ／ｋｇ、約１０００ＩＵ／ｋｇ、の量を投与してもよい。本開示のＴｅＮＴコンジュゲートは、上記の用量のいずれかの範囲内で投与され得る。
ＩＵ／ｋｇ、約３ＩＵ／ｋｇ、約４ＩＵ／ｋｇ、約５ＩＵ／ｋｇ、約６ＩＵ／ｋｇ、約７ＩＵ／ｋｇ、約８ＩＵ／ｋｇ、約９ＩＵ／ｋｇ、約１０ＩＵ／ｋｇ、約１１ＩＵ／ｋｇ、約１２ＩＵ／ｋｇ、約１３ＩＵ／ｋｇ、約１４ＩＵ／ｋｇ、約１５ＩＵ／ｋｇ、約１６ＩＵ／ｋｇ、約１７ＩＵ／ｋｇ、約１８ＩＵ／ｋｇ、約１９ＩＵ／ｋｇ、約２０ＩＵ／ｋｇ、約３０ＩＵ／ｋｇ、約４０ＩＵ／ｋｇ、約５０ＩＵ／ｋｇ、約６０ＩＵ／ｋｇ、約７０ＩＵ／kg、約８０ＩＵ／ｋｇ、約９０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ、約３００ＩＵ／ｋｇ、約４００ＩＵ／ｋｇ、約５００ＩＵ／ｋｇ、約６００ＩＵ／ｋｇ、約７００ＩＵ／ｋｇ、約８００ＩＵ／ｋｇ、約９００ＩＵ／ｋｇ、約１０００ＩＵ／ｋｇ、の量を投与してもよい。本開示のＴｅＮＴコンジュゲートは、上記の用量のいずれかの範囲内で投与され得る。
【0122】
２つのＴｅＮＴコンジュゲートを含む組成物において、例えば、ＴｅＮＴ－ＨＣがＰＥ
Ｇ化されている（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ）第１のＴｅＮＴコンジュゲートと、ＴｅＮＴ－ＬＣがＰＥＧ化されており及びＴｅＮＴ－ｃがＰＥＧ化されている（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ）、第２のＴｅＮＴコンジュゲートを含む組成物では、第１のＴｅＮＴコンジュゲートの第２のＴｅＮＴコンジュゲートに対する割合は変化させることができる。例えば、第１のＴｅＮＴコンジュゲートの第２のＴｅＮＴコンジュゲートに対する比は、約１０００：１、約５００：１、約１００：１、約５０：１、約１０：１、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、約１：１；約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：１０、約１：５０、約１：１００、約１：５００又は約１：１０００であってもよい。
Ｇ化されている（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ）第１のＴｅＮＴコンジュゲートと、ＴｅＮＴ－ＬＣがＰＥＧ化されており及びＴｅＮＴ－ｃがＰＥＧ化されている（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ）、第２のＴｅＮＴコンジュゲートを含む組成物では、第１のＴｅＮＴコンジュゲートの第２のＴｅＮＴコンジュゲートに対する割合は変化させることができる。例えば、第１のＴｅＮＴコンジュゲートの第２のＴｅＮＴコンジュゲートに対する比は、約１０００：１、約５００：１、約１００：１、約５０：１、約１０：１、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、約１：１；約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：１０、約１：５０、約１：１００、約１：５００又は約１：１０００であってもよい。
【0123】
組成物は、ＴｅＮＴコンジュゲートの任意の組み合わせを含んでいてもよく、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣとＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃの組み合わせに限定されるものではない。組成物は以下のものを含む：ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ及びＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ；ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ及びＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ；ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ及びＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ；そしてＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃとＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを含む。又、以下を含む組成物も開示される。ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ及びＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ；ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ及びＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ；ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ、及びＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ；ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ及びＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ；並びにＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ及びＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣである。組成物において、任意のＴｅＮＴが置換されてもよく、任意の組成物は、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＮ、及び／又はＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＮをさらに含んでいてもよい。
【0124】
組成物は、以下を含んでいてもよい。ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ｃ及びＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＨＣ；ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ｃ及びＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ；ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ｃ及びＰＥＰ－ＴＥＮＴ－ＬＣ－ＨＣ；ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＨＣ及びＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ；及びＰＥＰ－ＴＥＮＴ－ＬＣ－Ｃ及びＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを含む。又、以下を含む組成物も開示される。ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－Ｃ、ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＨＣ及びＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ；ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ｃ、ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＨＣ及びＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ；ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ｃ、ＰＥＰ－ＴＥＮＴ－ＬＣ－ｃ及びＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ；ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＨＣ、ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ及びＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ；並びにＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ｃ、ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＨＣ、ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ及びＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ。
【0125】
本開示のＴｅＮＴコンジュゲート又は組成物は、週に１回、２回又は３回、月に１回、２回又は３回、四半期に１回、２回又は３回、６ヶ月に１回、２回又は３回、又は年に１回、２回又は３回投与されうる。
【0126】
ＴｅＮＴコンジュゲート又は組成物は、単回投与、分割投与、又は複数回投与で投与することができる。筋肉が対として存在する場合、ＰＥＧ－ＴｅＮＴは、対の一方の筋肉の片側に投与されてもよく、又は対の両方の筋肉の両側に投与されてもよい。
【0127】
本開示の２つ以上のＰＥＧ－ＴｅＮＴを含む組成物の代わるものとして、係る２つ以上のＴｅＮＴコンジュゲート又はその組成物を、順次又は同時に又組み合わせて投与してもよい。
【0128】
ＴｅＮＴコンジュゲート又は組成物を、任意の適切な方法、例えば、注射、外科的移植、局所適用、又は鼻腔内投与によって、対象に局所的に投与してもよい。一実施形態では、ＴｅＮＴコンジュゲートは、罹患した筋肉への注射によって筋肉内に投与される。
【0129】
ＴｅＮＴコンジュゲート又は組成物は、良好な医療行為に準ずる様式で処方、投薬、および投与される。この文脈で考慮すべき要因としては、治療される特定のタイプの筋緊張低下症、治療される特定の対象、対象の臨床状態、投与部位、投与方法、投与のスケジュール、及び歯科を含む医療従事者に既知の他の要因が挙げられる。投与されるＴｅＮＴコンジュゲートの治療上有効な量は、そのような考慮事項によって決められるであろう。
【0130】
ＴｅＮＴコンジュゲート又は組成物は、当業者に知られているようなサステイン放出製剤に配合することができる。
【0131】
薬剤的に許容可能な担体としては、水、緩衝水、例えば、正常生理食塩水又はハンクス液若しくはアール液のようなバランスのとれた溶液などの生理食塩水、グリシン、及びヒアルロン酸が挙げられる。
【0132】
ＴｅＮＴコンジュゲート又は組成物は、筋肉内投与用に製剤化してもよい。筋肉内投与用の組成物は、薬剤的に許容可能な滅菌水性又は非水性溶液、分散液、懸濁液又はエマルション、並びに滅菌注射用溶液又は分散液に再構成するための滅菌粉末を含んでいてもよい。適切な水性及び非水性担体、溶媒、希釈剤又はビヒクルの例としては、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、カルボキシメチルセルロース及びその混合物、植物油（オリーブオイルなど）、注射用有機エステル（オレイン酸エチルなど）が挙げられる。
【0133】
本組成物は、ＴｅＮＴのデリバリーを加速するために浸透性エンハンサーを含んでいてもよい。浸透増強剤としては、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレリン酸、リクリン酸、モノオレイン、ジラウリン、カプリン酸、アラキドン酸、グリセリル1モノカプリン酸、モ
ノ及びジグリセリドなどの脂肪酸並びにその生理学上許容可能な塩が挙げられる。
ノ及びジグリセリドなどの脂肪酸並びにその生理学上許容可能な塩が挙げられる。
【0134】
本組成物は、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えば、サリチル酸ナトリウム、５－メトキシサリチル酸塩、ホモバニレート）などのキレート剤をさらに含んでもよい。
【0135】
提供されるものには、又、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ又はＴｅＮＴコンジュゲートを含む組成物を含んだ容器を含む、製造物品及び／又はキットが挙げられる。容器は、ＴｅＮＴコンジュゲート又は組成物を含むボトル、バイアル又はシリンジであってもよく、任意に単位投与形態であってもよい。例えば、ＴｅＮＴコンジュゲート又は組成物は、使い捨て容器、任意選択で注射器中の、注射可能な溶液の形態であってよい。製造品及び／又はキットは、本明細書に開示の方法に従って対象を治療することを示す、印刷された説明書及び／又はラベル等を更に含んでもよい。
【0136】
「治療上有効な量」という用語は、対象における筋緊張低下症を治療するのに有効なＴｅＮＴコンジュゲートの量を指す。
【0137】
「治療する」、「治療している」又は「治療」という用語は、治療的処置及び予防的又は防止的措置の両方を指し、その目的は、対象における筋緊張低下症を予防、低減、又は改善すること、又は対象における筋緊張低下症の進行を遅らせる（lessen）ことである。治療を必要とする対象には、筋緊張低下症を既に患っている対象だけでなく、筋緊張低下症を予防又は改善しようとする対象も含まれる。
【0138】
「予防している」、「予防」、「予防的」又は「予防的」という用語は、筋緊張低下症
の発生を抑えること、又は筋緊張低下症の発生を妨げること、それから防御すること、又はそれから保護することを意味する。予防を必要とする対象は、筋緊張低下症を発症しやすい場合がある。
の発生を抑えること、又は筋緊張低下症の発生を妨げること、それから防御すること、又はそれから保護することを意味する。予防を必要とする対象は、筋緊張低下症を発症しやすい場合がある。
【0139】
「改善する」又は「改善」という用語は、筋緊張低下症の減少、低減又は除去を意味する。
【0140】
筋緊張低下症は、定量化されてもよい。筋緊張低下症は、例えば０～５のような半定量的スケールで定量化されてもよく、ここで０は不在を表し、１～４は重症度を識別できるスケールを表し、５は最大の重症度を表す。あるいは、筋緊張低下を、二値事象、すなわち、存在又は不在、０又は１として定量化する場合もある。他の半定量的尺度は、当業者には容易に明らかであろう。別の実施形態では、筋緊張低下は、例えばフォースゲージを使用して、定量的スケールで定量化されてもよい。
【0141】
筋緊張低下症の定量化は、いずれも、コントロール、例えば、ＰＥＧ－ＴｅＮＴを投与されていない健常なコントロール対象、筋緊張低下症の治療を受けているがＴｅＮＴコンジュゲートによる治療を受けていない患部コントロール対象、又は集団と比較することができる。
【0142】
ＴｅＮＴコンジュゲートを投与して筋緊張低下症を治療した場合、筋緊張低下症の減少率は、約１％減少、約２％減少、約３％減少、約４％減少、約５％減少、約６％減少、約７％減少、約８％減少、約９％減少、約１０％減少、約２０％減少、約３０％減少、約４０％減少、約５０％減少、約６０％減少、約７０％減少、約８０％減少、約９０％減少又は約１００％の減少でありうる。
【0143】
本明細書中、用語「対象」は、哺乳類を指す場合がある。哺乳類は、霊長類、特にヒトであってもよく、又は家畜、動物園、又はコンパニオン動物であってもよい。本明細書に開示のＰＥＧ－ＴｅＮＴ、組成物及び方法により、特にヒトに対して医学的治療を行うことを考えているが、馬、牛及び羊などの家畜、犬及び猫などのコンパニオン動物、又はネコ科、イヌ科、ウシ科及びウマ科などの動物園にいる動物の治療を含む獣医的治療にも適用することが可能である。
【0144】
本明細書において他に定義されない限り、本明細書中の技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって、及び公開文章を参照することによって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【0145】
用語「ａ」又は「ａｎ」は、１つ又は複数を意味し、例えば、「ａ ＴｅＮＴ」は、１つ又は複数のＴｅＮＴを表すと理解されることに留意されたい。このように、用語「ａ」又は「ａｎ」、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書において互換的に使用され得る。
【0146】
これに続く特許請求の範囲及び本発明の説明において、文脈が明示的な言語で記載される場合又は不可欠な意味を含む場合を除き、単語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」又は「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」若しくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」等の変形は、包括的な意味で、即ち、記載した特徴の存在を特定するが、本発明の種々の実施形態におけるさらなる特徴の存在又は追加を排除しないという観点で使用される。
【0147】
本明細書中「約」という用語は、所与の数について、その数の大きさ±２５％の値の範囲を表すものとする。他の実施形態では、用語「約」は、その数値の±２０％、±１５％、±１０％、±５％、±４％、±３％、±２％、又は±１％の大きさの所定の数値の値の
範囲を設定する。例えば、一実施形態では、「約３グラム」は、２．７グラム～３．３グラム（すなわち、３グラム±１０％）等の値を示す。
範囲を設定する。例えば、一実施形態では、「約３グラム」は、２．７グラム～３．３グラム（すなわち、３グラム±１０％）等の値を示す。
【0148】
同様に、事象のタイミング又は持続時間は、少なくとも２５％変動させてもよい。例えば、特定のイベントが１日続くものとして一実施形態で開示されることがあるが、イベントは１日以上又は１日未満続くことがある。例えば、「１日」は、約１８時間～約３０時間の期間を含んでもよい。他の実施形態では、期間は、その期間の±２０％、±１５％、±１０％、±５％、±４％、±３％、±２％、又は±１％だけ変化してもよい。
【実施例】
【0149】
実施例１－ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ｃの調製（図１Ａ）
この実施例では、ＴｅＮＴ－ｃの表面セリン残基を表面システイン残基に変異させ、免疫原性エピトープでの指向性ＰＥＧコンジュゲーション化をし易くして、図１Ａの分子を生成させる。変異体は以下の通りである：Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、及びＳ１１８７Ｃである。
この実施例では、ＴｅＮＴ－ｃの表面セリン残基を表面システイン残基に変異させ、免疫原性エピトープでの指向性ＰＥＧコンジュゲーション化をし易くして、図１Ａの分子を生成させる。変異体は以下の通りである：Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、及びＳ１１８７Ｃである。
【0150】
表面セリンからシステインへの置換Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、及びＳ１１８７Ｃを有するＴｅＮＴの遺伝子は、商業プロバイダー、例えばＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成される。この遺伝子は、ベクターからの６ｘヒスチジンタグが変異体タンパク質のＮ末端に付加されるように、制限消化によりｐＲＳＥＴ－Ａ発現ベクターにサブクローニングされる。
【0151】
Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、及びＳ１１８７Ｃを含むＴｅＮＴを、実施例５に従って発現、ＰＥＧ化、精製し、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃを製造する。
【0152】
実施例２－ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＨＣ(図１Ｇ)の調製
この実施例では、ＴｅＮＴ－ＨＣの表面セリン残基を表面システイン残基に変異させ、免疫原性エピトープにおける指向性ＰＥＧコンジュゲーション化をし易くし、図１Ｇの分子を生成させる。変異体は以下の通りである。Ｓ６００Ｃ、Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、及びＳ１１８７Ｃ（図２４ 配列番号１６）である。
この実施例では、ＴｅＮＴ－ＨＣの表面セリン残基を表面システイン残基に変異させ、免疫原性エピトープにおける指向性ＰＥＧコンジュゲーション化をし易くし、図１Ｇの分子を生成させる。変異体は以下の通りである。Ｓ６００Ｃ、Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、及びＳ１１８７Ｃ（図２４ 配列番号１６）である。
【0153】
表面セリンからシステインへの置換体Ｓ６００Ｃ、Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、及びＳ１１８７Ｃを有するＴｅＮＴの遺伝子は、商業プロバイダー、例えばＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成される。この遺伝子は、ベクターからの６ｘヒスチジンタグが変異タンパク質のＮ末端に付加されるように、制限消化によってｐＲＳＥＴ－Ａ発現ベクター（図２５配列番号１７、図２６）にサブクローニングされる。
【0154】
Ｓ６００Ｃ、Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、及びＳ１１８７Ｃを含むＴｅＮＴを、実施例５に従って発現、ＰＥＧ化、精製し、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣを製造する。
【0155】
２．１－エンドトキシンの除去
実施例４に従って、ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体からエンドトキシンを除去した。
実施例４に従って、ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体からエンドトキシンを除去した。
【0156】
２．２－ＰＥＧ－ＨＺＮ－マレイミドの生成
１.モル過剰のＢＭＰＨ、ＥＭＣＨ又はＫＭＵＨを、約２ｋＤａ、約５ｋＤａ、約１０ｋ
Ｄａ又は約２０ｋＤａのＰＥＧ－プロピオンアルデヒドと、通常雰囲気、窒素雰囲気又はアルゴン雰囲気下で、ＰＢＳ（ｐＨ６．５～７．５）又は１０～１００％ＤＭＦ中で組み合わせる。
２.結合は、４～３７℃、１～１６時間の間で行う。
１.モル過剰のＢＭＰＨ、ＥＭＣＨ又はＫＭＵＨを、約２ｋＤａ、約５ｋＤａ、約１０ｋ
Ｄａ又は約２０ｋＤａのＰＥＧ－プロピオンアルデヒドと、通常雰囲気、窒素雰囲気又はアルゴン雰囲気下で、ＰＢＳ（ｐＨ６．５～７．５）又は１０～１００％ＤＭＦ中で組み合わせる。
２.結合は、４～３７℃、１～１６時間の間で行う。
【0157】
２．３－システイン残基へのＰＥＧ結合
１.約２ｋＤａ、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ又は約２０ｋＤａのＰＥＧを有するモル過剰
のＰＥＧ－ＨＺＮ－マレイミドを、ＰＢＳ又は＜１０％ＤＭＦ中、ｐＨ６．５～７．５でセリン変異体ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ（０．５－２ｍｇ／ｍＬ）と組み合わせた。
２.室温で６時間、結合を行った。
３.過剰なＰＥＧはサイズ排除クロマトグラフィーで除去した。
１.約２ｋＤａ、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ又は約２０ｋＤａのＰＥＧを有するモル過剰
のＰＥＧ－ＨＺＮ－マレイミドを、ＰＢＳ又は＜１０％ＤＭＦ中、ｐＨ６．５～７．５でセリン変異体ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ（０．５－２ｍｇ／ｍＬ）と組み合わせた。
２.室温で６時間、結合を行った。
３.過剰なＰＥＧはサイズ排除クロマトグラフィーで除去した。
【0158】
２．４－タンパク質のトリプシン消化活性化
ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体を活性化するトリプシン消化は、実施例４に従って行った。
ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体を活性化するトリプシン消化は、実施例４に従って行った。
【0159】
実施例３－ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃの調製(図１Ｈ)
この実施例では、ＬＣ及びｃの表面セリン残基を表面システイン残基に変異させ、免疫原性エピトープにおける指向性ＰＥＧコンジュゲーション化をし易くして、図１Ｈの分子を生成する。その変異体はＳ８１Ｃ、Ｓ１２０Ｃ、Ｓ１４４Ｃ、Ｓ２４８Ｃ、Ｓ３３５Ｃ、Ｓ４２８Ｃ、Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、及びＳ１１８７Ｃ（図２１ 配列番号１４）であった。
この実施例では、ＬＣ及びｃの表面セリン残基を表面システイン残基に変異させ、免疫原性エピトープにおける指向性ＰＥＧコンジュゲーション化をし易くして、図１Ｈの分子を生成する。その変異体はＳ８１Ｃ、Ｓ１２０Ｃ、Ｓ１４４Ｃ、Ｓ２４８Ｃ、Ｓ３３５Ｃ、Ｓ４２８Ｃ、Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、及びＳ１１８７Ｃ（図２１ 配列番号１４）であった。
【0160】
ＬＣ及びｃの表面セリンからシステインへの置換Ｓ８１Ｃ、Ｓ１２０Ｃ、Ｓ１４４Ｃ、Ｓ２４８Ｃ、Ｓ３３５Ｃ、Ｓ４２８Ｃ、Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ及びＳ１１８７Ｃを有するＴｅＮＴの遺伝子は、商業プロバイダーのＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成される。この遺伝子は、ベクターからの６ｘヒスチジンタグが変異タンパク質のN末端に付加されるように、制限消化によりｐＲＳ
ＥＴ－Ａ発現ベクター（図２２ 配列番号１５、図２３）にサブクローニング化される。
ＥＴ－Ａ発現ベクター（図２２ 配列番号１５、図２３）にサブクローニング化される。
【0161】
Ｓ８１Ｃ、Ｓ１２０Ｃ、Ｓ１４４Ｃ、Ｓ２４８Ｃ、Ｓ３３５Ｃ、Ｓ４２８Ｃ、Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、及びＳ１１８７Ｃを含むＴｅＮＴを、実施例５に従って発現、ＰＥＧ化および精製して、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃを生成させる。
【0162】
３．１－エンドトキシンの除去
実施例４に従って、エンドトキシンをＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体から除去する。
実施例４に従って、エンドトキシンをＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体から除去する。
【0163】
３．２－ＰＥＧ－ＨＺＮ－マレイミドの生成
１.モル過剰のＢＭＰＨ、ＥＭＣＨ又はＫＭＵＨを、約２ｋＤａ、約５ｋＤａ、約１０ｋ
Ｄａ又は約２０ｋＤａのＰＥＧ－プロピオンアルデヒドと、通常雰囲気、窒素雰囲気又はアルゴン雰囲気下で、ＰＢＳ（ｐＨ６．５～７．５）又は１０～１００％ＤＭＦ中で結合させる。
２.結合は、４℃～３７℃で１時間から１６時間行う。
１.モル過剰のＢＭＰＨ、ＥＭＣＨ又はＫＭＵＨを、約２ｋＤａ、約５ｋＤａ、約１０ｋ
Ｄａ又は約２０ｋＤａのＰＥＧ－プロピオンアルデヒドと、通常雰囲気、窒素雰囲気又はアルゴン雰囲気下で、ＰＢＳ（ｐＨ６．５～７．５）又は１０～１００％ＤＭＦ中で結合させる。
２.結合は、４℃～３７℃で１時間から１６時間行う。
【0164】
３．３－システイン残基へのＰＥＧの結合
１.約２ｋＤａ、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ又は約２０ｋＤａのＰＥＧを有するモル過剰
のＰＥＧ－ＨＺＮ－マレイミドを、ＰＢＳ又は＜１０％ＤＭＦ中、ｐＨ６．５～７．５でセリン変異体ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ（０．５－２ｍｇ／ｍＬ）と組み合わせる。
２.結合は、室温で６時間行う。
３.過剰なＰＥＧはサイズ排除クロマトグラフィーで除去する。
１.約２ｋＤａ、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ又は約２０ｋＤａのＰＥＧを有するモル過剰
のＰＥＧ－ＨＺＮ－マレイミドを、ＰＢＳ又は＜１０％ＤＭＦ中、ｐＨ６．５～７．５でセリン変異体ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ（０．５－２ｍｇ／ｍＬ）と組み合わせる。
２.結合は、室温で６時間行う。
３.過剰なＰＥＧはサイズ排除クロマトグラフィーで除去する。
【0165】
３．４－タンパク質のトリプシン消化活性化
ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体を活性化するトリプシン消化は、実施例４に従って行う
。
ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体を活性化するトリプシン消化は、実施例４に従って行う
。
【0166】
実施例４－ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣの調製（図１Ｉ）（方法１）
４．１－ＴｅＮＴの調製
１.大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３ ｐＬｙｓＳ株をｐＲＳＥＴ－ＴｅＮＴベクターで電気形質
転換し、３７℃で１時間、１ｍＬのＬＢ培地中に回収した。
２.前誘発培養液２００ｍＬに回収培養液を接種した。前誘発培養液 ｐＨ７．２－７．
４は、１．２％Ｔｒｙｐｔｏｎｅ；２．４％酵母エキス；２％グルコース；０．４％グリセロール；１７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４；７２ｍＭのＫ２ＨＰＯ４；及び選択抗生物質（アンピシリンとクロラムフェニコール）を含んでいた。
３.培養物を３０℃で一晩、高速振盪しながらインキュベートした。
４.４０００ｇ、１０分間の遠心分離により、一晩培養したものを回収した。
５.ペレットを、１．２％Ｔｒｙｐｔｏｎｅ；２．４％酵母エキス；０．４％グリセロー
ル；１ｍＭのＩＰＴＧ；１７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４；７２ｍＭのＫ２ＨＰＯ４；１００μｇ／ｍＬのアンピリシン;及び１０μＭのＺｎＣｌ２を含む、２００ｍＬの発現培養液（ｐ
Ｈ７．２－７．４）に再懸濁した。
６.３０℃で６時間、高速振盪しながらタンパク質を発現させた。
７.４５００ｇ、１５分間の遠心分離により細胞を回収し、ペレットを２０ｍＭのイミダ
ゾールを含む３０ｍＬのＴＢＳに再懸濁した（ｐＨ８）。
８.超音波処理により細胞を溶解した。
９.細胞溶解液を４５００ｇ、２０分間の遠心分離で清澄化し、０．４５μｍフィルター
で濾過した。
１０.ＡＫＴＡ ｐｕｒｅ ２５ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ）を用いたＨｉｓ－ｔａｇア
フィニティークロマトグラフィーにより、タンパク質を精製した。
１１.サイズ排除クロマトグラフィーでＰＢＳに対して緩衝液交換を行った後、Ｓｕｐｅ
ｒｄｅｘ ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラムを用いたＡＫＴＡ ｐｕｒｅ ２５ ＦＰＬＣでゲルろ過により２段階目の精製を行った。
４．１－ＴｅＮＴの調製
１.大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３ ｐＬｙｓＳ株をｐＲＳＥＴ－ＴｅＮＴベクターで電気形質
転換し、３７℃で１時間、１ｍＬのＬＢ培地中に回収した。
２.前誘発培養液２００ｍＬに回収培養液を接種した。前誘発培養液 ｐＨ７．２－７．
４は、１．２％Ｔｒｙｐｔｏｎｅ；２．４％酵母エキス；２％グルコース；０．４％グリセロール；１７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４；７２ｍＭのＫ２ＨＰＯ４；及び選択抗生物質（アンピシリンとクロラムフェニコール）を含んでいた。
３.培養物を３０℃で一晩、高速振盪しながらインキュベートした。
４.４０００ｇ、１０分間の遠心分離により、一晩培養したものを回収した。
５.ペレットを、１．２％Ｔｒｙｐｔｏｎｅ；２．４％酵母エキス；０．４％グリセロー
ル；１ｍＭのＩＰＴＧ；１７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４；７２ｍＭのＫ２ＨＰＯ４；１００μｇ／ｍＬのアンピリシン;及び１０μＭのＺｎＣｌ２を含む、２００ｍＬの発現培養液（ｐ
Ｈ７．２－７．４）に再懸濁した。
６.３０℃で６時間、高速振盪しながらタンパク質を発現させた。
７.４５００ｇ、１５分間の遠心分離により細胞を回収し、ペレットを２０ｍＭのイミダ
ゾールを含む３０ｍＬのＴＢＳに再懸濁した（ｐＨ８）。
８.超音波処理により細胞を溶解した。
９.細胞溶解液を４５００ｇ、２０分間の遠心分離で清澄化し、０．４５μｍフィルター
で濾過した。
１０.ＡＫＴＡ ｐｕｒｅ ２５ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ）を用いたＨｉｓ－ｔａｇア
フィニティークロマトグラフィーにより、タンパク質を精製した。
１１.サイズ排除クロマトグラフィーでＰＢＳに対して緩衝液交換を行った後、Ｓｕｐｅ
ｒｄｅｘ ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラムを用いたＡＫＴＡ ｐｕｒｅ ２５ ＦＰＬＣでゲルろ過により２段階目の精製を行った。
【0167】
４．２－エンドトキシンの除去
１.０．５ｍＬのエンドトキシン除去スピンカラムを室温へと平準化した。
２.カラム底部の栓を外し、カラムキャップを緩め、１５ｍＬのチューブに入れ、５００
ｇで１分間遠心分離し、カラムから溶液を除いた。溶液は廃棄した。
３.カラム底部のプラグを交換し、カラムキャップを外し、９５％エタノール中の０．２
ＮのＮａＯＨを樹脂に添加し、カラムキャップを取り換え、カラムを数回転倒させて樹脂を再懸濁し、室温で１～２時間インキュベートした。
４.カラム底栓を除去し、カラムキャップを緩め、カラムを１５ｍＬのチューブに入れ、
５００ｇで１分間遠心し、カラムから溶液を除去した。溶液は廃棄した。
５.カラム底部のプラグを交換し、カラムキャップを外し、エンドトキシンを含まない２
ＭのＮａＣｌを樹脂に添加し、カラムキャップを取り替えた後、カラムを数回転倒させて樹脂を再懸濁させた。
６.カラムの底栓を外し、カラムキャップを緩め、カラムを１５ｍＬのチューブに入れ、
５００ｇで１分間遠心分離し、カラムから溶液を除去した。溶液は廃棄した。
７.カラム底部のプラグを交換し、カラムキャップを外し、エンドトキシンを含まない超
純水を樹脂に加え、カラムキャップを交換し、カラムを数回倒して樹脂を再懸濁させた。８.カラム底栓を除去し、カラムキャップを緩め、カラムを１５ｍＬのチューブに入れ、
５００ｇで１分間遠心分離し、カラムから溶液を除去した。溶液は廃棄した。
９.カラム底部のプラグを交換し、カラムキャップを外し、エンドトキシンを含まないリ
ン酸緩衝液を樹脂に添加し、カラムキャップを取り替えた後、カラムを数回転倒させて樹脂を懸濁させた。
１０.カラム底栓を除去し、カラムキャップを緩め、カラムを１５ｍＬのチューブに入れ
、５００ｇで１分間遠心分離し、カラムから溶液を除去した。溶液は廃棄した。
１１．リン酸塩緩衝液でさらに２回カラムを洗浄し、溶出液を廃棄した。
１２.カラムの底栓を交換し、カラムキャップを外して、樹脂に試料を塗布し、カラムキ
ャップを交換し、カラムを数回倒して樹脂を再懸濁させた。
１３.カラムを４℃で少なくとも１時間、端から端まで混合しながらインキュベートした
。
１４.カラム底栓を外し、カラムキャップを緩め、カラムをエンドトキシンフリーの１５
ｍＬのチューブに入れ、５００ｇで１分間遠心分離し、カラムから溶液を除去した。サンプルは保持した。
１５.エンドトキシン除去手順を、すべての投与量に対して対象のキログラムあたり５Ｅ
Ｕ単位のエンドトキシンを含むように、サンプル中のエンドトキシンレベルがその量と同等又はより低いレベルになるまで、再生スピンカラムで繰り返し行った。
１.０．５ｍＬのエンドトキシン除去スピンカラムを室温へと平準化した。
２.カラム底部の栓を外し、カラムキャップを緩め、１５ｍＬのチューブに入れ、５００
ｇで１分間遠心分離し、カラムから溶液を除いた。溶液は廃棄した。
３.カラム底部のプラグを交換し、カラムキャップを外し、９５％エタノール中の０．２
ＮのＮａＯＨを樹脂に添加し、カラムキャップを取り換え、カラムを数回転倒させて樹脂を再懸濁し、室温で１～２時間インキュベートした。
４.カラム底栓を除去し、カラムキャップを緩め、カラムを１５ｍＬのチューブに入れ、
５００ｇで１分間遠心し、カラムから溶液を除去した。溶液は廃棄した。
５.カラム底部のプラグを交換し、カラムキャップを外し、エンドトキシンを含まない２
ＭのＮａＣｌを樹脂に添加し、カラムキャップを取り替えた後、カラムを数回転倒させて樹脂を再懸濁させた。
６.カラムの底栓を外し、カラムキャップを緩め、カラムを１５ｍＬのチューブに入れ、
５００ｇで１分間遠心分離し、カラムから溶液を除去した。溶液は廃棄した。
７.カラム底部のプラグを交換し、カラムキャップを外し、エンドトキシンを含まない超
純水を樹脂に加え、カラムキャップを交換し、カラムを数回倒して樹脂を再懸濁させた。８.カラム底栓を除去し、カラムキャップを緩め、カラムを１５ｍＬのチューブに入れ、
５００ｇで１分間遠心分離し、カラムから溶液を除去した。溶液は廃棄した。
９.カラム底部のプラグを交換し、カラムキャップを外し、エンドトキシンを含まないリ
ン酸緩衝液を樹脂に添加し、カラムキャップを取り替えた後、カラムを数回転倒させて樹脂を懸濁させた。
１０.カラム底栓を除去し、カラムキャップを緩め、カラムを１５ｍＬのチューブに入れ
、５００ｇで１分間遠心分離し、カラムから溶液を除去した。溶液は廃棄した。
１１．リン酸塩緩衝液でさらに２回カラムを洗浄し、溶出液を廃棄した。
１２.カラムの底栓を交換し、カラムキャップを外して、樹脂に試料を塗布し、カラムキ
ャップを交換し、カラムを数回倒して樹脂を再懸濁させた。
１３.カラムを４℃で少なくとも１時間、端から端まで混合しながらインキュベートした
。
１４.カラム底栓を外し、カラムキャップを緩め、カラムをエンドトキシンフリーの１５
ｍＬのチューブに入れ、５００ｇで１分間遠心分離し、カラムから溶液を除去した。サンプルは保持した。
１５.エンドトキシン除去手順を、すべての投与量に対して対象のキログラムあたり５Ｅ
Ｕ単位のエンドトキシンを含むように、サンプル中のエンドトキシンレベルがその量と同等又はより低いレベルになるまで、再生スピンカラムで繰り返し行った。
【0168】
４．３－ｍＰＥＧ－ＨＺＮ－ＮＨＳの生成
１.モル過剰のＳＡＮＨ又はＳＨＮＨを、約２ｋＤａ、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ又は約
２０ｋＤａのＰＥＧを有するｍＰＥＧ－プロピオンアルデヒドと、通常雰囲気、窒素雰囲気又はアルゴン雰囲気下で、ＰＢＳ（ｐＨ６．５－７．５）又は１０－１００％ＤＭＦ中で組み合わせた。
２.結合は４℃～３７℃の間で１時間～１６時間行った。
１.モル過剰のＳＡＮＨ又はＳＨＮＨを、約２ｋＤａ、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ又は約
２０ｋＤａのＰＥＧを有するｍＰＥＧ－プロピオンアルデヒドと、通常雰囲気、窒素雰囲気又はアルゴン雰囲気下で、ＰＢＳ（ｐＨ６．５－７．５）又は１０－１００％ＤＭＦ中で組み合わせた。
２.結合は４℃～３７℃の間で１時間～１６時間行った。
【0169】
４．４－ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣの調製
１.総容量５００μＬの、ＰＢＳ ｐＨ７又は１０％ＤＭＦに、３μｍｏｌの精製ＴｅＮ
Ｔ及び０．５ｍｍｏｌのｍｐｅｇ－ＨＺＮ－ＮＨＳを、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ又は３０ｋＤａのＰＥＧと組み合わせた。
２.サンプルを室温で３時間混合した。
３.過剰のＰＥＧをサイズ排除クロマトグラフィーによって除去した。
１.総容量５００μＬの、ＰＢＳ ｐＨ７又は１０％ＤＭＦに、３μｍｏｌの精製ＴｅＮ
Ｔ及び０．５ｍｍｏｌのｍｐｅｇ－ＨＺＮ－ＮＨＳを、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ又は３０ｋＤａのＰＥＧと組み合わせた。
２.サンプルを室温で３時間混合した。
３.過剰のＰＥＧをサイズ排除クロマトグラフィーによって除去した。
【0170】
４．５－タンパク質のトリプシン消化による活性型への変換
１.タンパク質１ｍｇを０．５ｍＬの消化バッファー（０．１ＭのＮＨ４ＨＣＯ３バッフ
ァーを含む、ｐＨ８．０）又は０．１Ｍのトリスバッファー（ｐＨ８．５）に溶解させた。
２.０．１０ｍＬ～０．２５ｍＬの固定化ＴＰＣＫトリプシンを３×５００μＬの消化バ
ッファーで洗浄した。遠心分離により洗浄のたびにゲルをバッファーから分離した。
３.ゲルを約０．２ｍＬの消化用緩衝液に再懸濁した。
４.固定化ＴＰＣＫトリプシンをタンパク質サンプルに添加した。
５.反応混合物を３７℃で２時間～１８時間、高速で振盪するインキュベーターでインキ
ュベートした。
６.固定化ＴＰＣＫトリプシンを遠心分離により分離した。
１.タンパク質１ｍｇを０．５ｍＬの消化バッファー（０．１ＭのＮＨ４ＨＣＯ３バッフ
ァーを含む、ｐＨ８．０）又は０．１Ｍのトリスバッファー（ｐＨ８．５）に溶解させた。
２.０．１０ｍＬ～０．２５ｍＬの固定化ＴＰＣＫトリプシンを３×５００μＬの消化バ
ッファーで洗浄した。遠心分離により洗浄のたびにゲルをバッファーから分離した。
３.ゲルを約０．２ｍＬの消化用緩衝液に再懸濁した。
４.固定化ＴＰＣＫトリプシンをタンパク質サンプルに添加した。
５.反応混合物を３７℃で２時間～１８時間、高速で振盪するインキュベーターでインキ
ュベートした。
６.固定化ＴＰＣＫトリプシンを遠心分離により分離した。
【0171】
実施例５－ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ（図１Ｉ）の調製（方法２）。
この実施例では、ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣの表面セリン残基を表面システイン残基に変異させ（Ｓ→Ｃ変異体）、免疫原性エピトープにおける指向性ＰＥＧコンジュゲーション化を促進した。ＴｅＮＴの変異体は以下の通りである：配列番号１に対して、Ｓ８１Ｃ；Ｓ１２０Ｃ；Ｓ１４４Ｃ；Ｓ２４８Ｃ；Ｓ３３５Ｃ；Ｓ４２８Ｃ；Ｓ６００Ｃ；Ｓ９６３Ｃ；Ｓ１０４１Ｃ；Ｓ１１５５Ｃ；及びＳ１１８７Ｃであった。
この実施例では、ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣの表面セリン残基を表面システイン残基に変異させ（Ｓ→Ｃ変異体）、免疫原性エピトープにおける指向性ＰＥＧコンジュゲーション化を促進した。ＴｅＮＴの変異体は以下の通りである：配列番号１に対して、Ｓ８１Ｃ；Ｓ１２０Ｃ；Ｓ１４４Ｃ；Ｓ２４８Ｃ；Ｓ３３５Ｃ；Ｓ４２８Ｃ；Ｓ６００Ｃ；Ｓ９６３Ｃ；Ｓ１０４１Ｃ；Ｓ１１５５Ｃ；及びＳ１１８７Ｃであった。
【0172】
５．１－セリン変異体ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣの調製
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株を、ＳからＣへの変異を含む図１１（配列番号６）のアミノ酸配列をエンコードするベクターｐＲＳＥＴ－ＴｅＮＴ ＳＣ（図１２及び１３）で電気形質転換した。ＳからＣへの変異を含むＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを、工程１０と
１１の間に、０．５ｍＭのＤＴＴを使った１５分間の処理を行い、実施例４に従って発現及び精製した。
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株を、ＳからＣへの変異を含む図１１（配列番号６）のアミノ酸配列をエンコードするベクターｐＲＳＥＴ－ＴｅＮＴ ＳＣ（図１２及び１３）で電気形質転換した。ＳからＣへの変異を含むＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを、工程１０と
１１の間に、０．５ｍＭのＤＴＴを使った１５分間の処理を行い、実施例４に従って発現及び精製した。
【0173】
５．２－エンドトキシンの除去
実施例４に従って、ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣセリン変異体からエンドトキシンを除去した。
実施例４に従って、ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣセリン変異体からエンドトキシンを除去した。
【0174】
５．３－システイン残基へのＰＥＧ結合
１.約２ｋＤａ、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ又は約２０ｋＤａのＰＥＧを有するモル過剰
のＰＥＧ－ＨＺＮ－マレイミドを、ＰＢＳ中のセリン変異体ＴｅＮＴ－ＬＣ（０．５～２ｍｇ／ｍＬ)とｐＨ６．５－７．５で組み合わせる。
２.結合は、室温で２～１６時間行う。
３.過剰なＰＥＧはサイズ排除クロマトグラフィーによって除去する。
１.約２ｋＤａ、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ又は約２０ｋＤａのＰＥＧを有するモル過剰
のＰＥＧ－ＨＺＮ－マレイミドを、ＰＢＳ中のセリン変異体ＴｅＮＴ－ＬＣ（０．５～２ｍｇ／ｍＬ)とｐＨ６．５－７．５で組み合わせる。
２.結合は、室温で２～１６時間行う。
３.過剰なＰＥＧはサイズ排除クロマトグラフィーによって除去する。
【0175】
５．４－タンパク質のトリプシン消化活性化
ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣセリン変異体を活性化するトリプシン消化は、実施例４に従って行われる。
ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣセリン変異体を活性化するトリプシン消化は、実施例４に従って行われる。
【0176】
実施例６ ｍＰＥＧ－ＨＺＮ－ＮＨＳの合成
この例では、様々なサイズ（例えば、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ又は３０ｋＤａ）のメトキシ－ポリエチレングリコールを、ｐＨ分解性ヒドラゾン連結を介してスルホ－ＮＨＳ基と組み合わせた。ｍＰＥＧ－プロピオンアルデヒドを、ＰＢＳ、ＤＭＦ又はＤＭＳＯ中でモル過剰量のＳＡＮＨ又はＳＨＮＨクロスリンカーと組み合わせた。結合は、通常雰囲気、窒素雰囲気又はアルゴン雰囲気下で、室温で２～１６時間行われた。未反応の架橋剤は、１/１０モルのベンジルオキシベンジルアルデヒドビーズと室温で
４～８時間インキュベートすることにより除去することができる。
この例では、様々なサイズ（例えば、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ又は３０ｋＤａ）のメトキシ－ポリエチレングリコールを、ｐＨ分解性ヒドラゾン連結を介してスルホ－ＮＨＳ基と組み合わせた。ｍＰＥＧ－プロピオンアルデヒドを、ＰＢＳ、ＤＭＦ又はＤＭＳＯ中でモル過剰量のＳＡＮＨ又はＳＨＮＨクロスリンカーと組み合わせた。結合は、通常雰囲気、窒素雰囲気又はアルゴン雰囲気下で、室温で２～１６時間行われた。未反応の架橋剤は、１/１０モルのベンジルオキシベンジルアルデヒドビーズと室温で
４～８時間インキュベートすることにより除去することができる。
【0177】
実施例７ ｍＰＥＧ－ＨＺＮ－マレイミドの合成
この実施例では、様々なサイズ（例えば、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ又は３０ｋＤａ）のメトキシ-ポリエチレングリコールを、ｐＨ分解性ヒドラゾン連結を
介してマレイミド基と結合した。ＤＭＦ、ＤＭＳＯ又はＰＢＳ中でｍＰＥＧ－プロピオンアルデヒドをｎモル過剰のＢＭＰＨ（Ｎ－β-マレイミドプロピオン酸ヒドラジド）ＥＭ
ＣＨ又はＫＭＵＨクロスリンカーと組み合わせた。結合は、通常雰囲気、窒素雰囲気又はアルゴン雰囲気下、室温で１～１６時間行った。
この実施例では、様々なサイズ（例えば、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ又は３０ｋＤａ）のメトキシ-ポリエチレングリコールを、ｐＨ分解性ヒドラゾン連結を
介してマレイミド基と結合した。ＤＭＦ、ＤＭＳＯ又はＰＢＳ中でｍＰＥＧ－プロピオンアルデヒドをｎモル過剰のＢＭＰＨ（Ｎ－β-マレイミドプロピオン酸ヒドラジド）ＥＭ
ＣＨ又はＫＭＵＨクロスリンカーと組み合わせた。結合は、通常雰囲気、窒素雰囲気又はアルゴン雰囲気下、室温で１～１６時間行った。
【0178】
実施例８－ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ｃの調製(図１Ｆ)
この実施例では、ＴｅＮＴ－ｃの表面セリン残基を表面システイン残基に変異させ、免疫原性エピトープにおける指向性ＧＴ－ＰＥＰ結合を起こりやすくして、図１Ｆの分子を生成する。変異体は以下の通りである：Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、及びＳ１１８７Ｃである。
この実施例では、ＴｅＮＴ－ｃの表面セリン残基を表面システイン残基に変異させ、免疫原性エピトープにおける指向性ＧＴ－ＰＥＰ結合を起こりやすくして、図１Ｆの分子を生成する。変異体は以下の通りである：Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、及びＳ１１８７Ｃである。
【0179】
表面セリンからシステインへの置換体Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、及びＳ１１８７Ｃを有するＴｅＮＴの遺伝子は、商業プロバイダー、例えばＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成される。この遺伝子は、ベクターからの６ｘヒスチジンタグが変異体タンパク質のＮ末端に付加されるように、制限消化によってｐＲＳＥＴ－Ａ発現ベクターにサブクローニングされる。
【0180】
Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、及びＳ１１８７Ｃを含むＴｅＮＴは、実施例１１に従って発現、ＧＴ－ＰＥＰ化、精製して、ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ｃを製造する。
【0181】
実施例９－ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＨＣ（図１Ｂ）の調製
この実施例では、ＴｅＮＴ－ＨＣの表面セリン残基を表面システイン残基に変異させ、免疫原性エピトープにおける指向性ＰＥＧコンジュゲーション化を促進し、図１Ｂの分子を生成させる。変異体は以下の通りである：Ｓ６００Ｃ、Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、及びＳ１１８７Ｃ（図２４ 配列番号１６）である。
この実施例では、ＴｅＮＴ－ＨＣの表面セリン残基を表面システイン残基に変異させ、免疫原性エピトープにおける指向性ＰＥＧコンジュゲーション化を促進し、図１Ｂの分子を生成させる。変異体は以下の通りである：Ｓ６００Ｃ、Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、及びＳ１１８７Ｃ（図２４ 配列番号１６）である。
【0182】
表面セリンからシステインへの置換Ｓ６００Ｃ、Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、及びＳ１１８７Ｃを有するＴｅＮＴの遺伝子は、商業プロバイダー、例えばＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成される。この遺伝子は、ベクターからの６ｘヒスチジンタグが変異タンパク質のＮ末端に付加されるように、制限消化によってｐＲＳＥＴ－Ａ発現ベクター（図２５ 配列番号１７、図２６）にサブクローニングされる。
【0183】
Ｓ６００Ｃ、Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、及びＳ１１８７Ｃを含むＴｅＮＴは、実施例１１に従って発現、ＧＴ－ＰＥＰ化、精製し、ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＨＣを製造する。
【0184】
実施例１０－ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃの調製(図１Ｃ)
この実施例では、ＬＣ及びｃの表面セリン残基を表面システイン残基に変異させて、免疫原性エピトープにおける指向性ＰＥＧコンジュゲーション化を促進し、図１Ｃの分子を作製する。その変異体はＳ８１Ｃ、Ｓ１２０Ｃ、Ｓ１４４Ｃ、Ｓ２４８Ｃ、Ｓ３３５Ｃ、Ｓ４２８Ｃ、Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、及びＳ１１８７Ｃ（図２１ 配列番号１４）であった。
この実施例では、ＬＣ及びｃの表面セリン残基を表面システイン残基に変異させて、免疫原性エピトープにおける指向性ＰＥＧコンジュゲーション化を促進し、図１Ｃの分子を作製する。その変異体はＳ８１Ｃ、Ｓ１２０Ｃ、Ｓ１４４Ｃ、Ｓ２４８Ｃ、Ｓ３３５Ｃ、Ｓ４２８Ｃ、Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、及びＳ１１８７Ｃ（図２１ 配列番号１４）であった。
【0185】
ＬＣ及びｃの表面セリンからシステインへの置換Ｓ８１Ｃ、Ｓ１２０Ｃ、Ｓ１４４Ｃ、Ｓ２４８Ｃ、Ｓ３３５Ｃ、Ｓ４２８Ｃ、Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ及びＳ１１８７Ｃを有するＴｅＮＴの遺伝子は、商業プロバイダーのＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成される。この遺伝子は、ベクターからの６ｘヒスチジンタグが変異タンパク質のＮ末端に付加されるように制限消化によってｐＲＳＥＴ－Ａ発現ベクター（図２２ 配列番号１５、図２３）にサブクローン化される。
【0186】
Ｓ８１Ｃ、Ｓ１２０Ｃ、Ｓ１４４Ｃ、Ｓ２４８Ｃ、Ｓ３３５Ｃ、Ｓ４２８Ｃ、Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、及びＳ１１８７Ｃを含むＴｅＮＴを実施例１１に従って発現、ＧＴ－ＰＥＰ化及び精製して、ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃを製造する。
【0187】
１０．１－エンドトキシンの除去
エンドトキシンは、実施例４に従って、ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体から除去される。
エンドトキシンは、実施例４に従って、ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体から除去される。
【0188】
実施例１１－ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣの調製（図１Ｅ）（方法１）。
１１．１－ＴｅＮＴの調製
１.大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３ ｐＬｙｓＳ株をｐＲＳＥＴ－ＴｅＮＴ（配列番号２（図７
）ベクターで電気形質転換し、３７℃で1時間かけて１ｍＬのＬＢ培地中に回収する。
２.前誘発培養液２００ｍＬに回収培養液を接種する。前誘発培養液 ｐＨ７．２－７．
４は、１．２％トリプトン；２．４％酵母エキス；２％グルコース；０．４％グリセロール；１７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４；７２ｍＭのＫ２ＨＰＯ４；及び選択抗生物質（アンピシリンとクロラムフェニコール）を含んでいる。
３.培養物を３０℃で一晩、高速振盪しながらインキュベートする。
４.４０００ｇ、１０分間の遠心分離により、一晩培養したものを回収する。
５.ペレットを、１．２％Ｔｒｙｐｔｏｎｅ；２．４％酵母エキス；０．４％グリセロー
ル；１ｍＭのＩＰＴＧ；１７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４；７２ｍＭのＫ２ＨＰＯ４；１００μｇ
／ｍＬのアンピリシン;及び１０μＭのＺｎＣｌ２を含む、２００ｍＬの発現培養液（ｐ
Ｈ７．２－７．４）に再懸濁する。
６.３０℃で６時間、高速振盪しながらタンパク質を発現させる。
７.４５００ｇ、１５分間の遠心分離により細胞を回収し、ペレットを２０ｍＭのイミダ
ゾールを含む３０ｍＬのＴＢＳに再懸濁する（ｐＨ８）。
８.超音波処理により細胞を溶解する。
９.細胞溶解液を４５００ｇ、２０分間の遠心分離で清澄化し、０．４５μｍフィルター
で濾過する。
１０.ＡＫＴＡ ｐｕｒｅ ２５ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ）を用いたＨｉｓ－ｔａｇア
フィニティークロマトグラフィーにより、タンパク質を精製する。
１１.サイズ排除クロマトグラフィーでＰＢＳに緩衝液交換した後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ
２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラムを用いたＡＫＴＡ ｐｕｒｅ ２５ ＦＰＬＣでゲルろ過により２段階目の精製を行う。
１１．１－ＴｅＮＴの調製
１.大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３ ｐＬｙｓＳ株をｐＲＳＥＴ－ＴｅＮＴ（配列番号２（図７
）ベクターで電気形質転換し、３７℃で1時間かけて１ｍＬのＬＢ培地中に回収する。
２.前誘発培養液２００ｍＬに回収培養液を接種する。前誘発培養液 ｐＨ７．２－７．
４は、１．２％トリプトン；２．４％酵母エキス；２％グルコース；０．４％グリセロール；１７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４；７２ｍＭのＫ２ＨＰＯ４；及び選択抗生物質（アンピシリンとクロラムフェニコール）を含んでいる。
３.培養物を３０℃で一晩、高速振盪しながらインキュベートする。
４.４０００ｇ、１０分間の遠心分離により、一晩培養したものを回収する。
５.ペレットを、１．２％Ｔｒｙｐｔｏｎｅ；２．４％酵母エキス；０．４％グリセロー
ル；１ｍＭのＩＰＴＧ；１７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４；７２ｍＭのＫ２ＨＰＯ４；１００μｇ
／ｍＬのアンピリシン;及び１０μＭのＺｎＣｌ２を含む、２００ｍＬの発現培養液（ｐ
Ｈ７．２－７．４）に再懸濁する。
６.３０℃で６時間、高速振盪しながらタンパク質を発現させる。
７.４５００ｇ、１５分間の遠心分離により細胞を回収し、ペレットを２０ｍＭのイミダ
ゾールを含む３０ｍＬのＴＢＳに再懸濁する（ｐＨ８）。
８.超音波処理により細胞を溶解する。
９.細胞溶解液を４５００ｇ、２０分間の遠心分離で清澄化し、０．４５μｍフィルター
で濾過する。
１０.ＡＫＴＡ ｐｕｒｅ ２５ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ）を用いたＨｉｓ－ｔａｇア
フィニティークロマトグラフィーにより、タンパク質を精製する。
１１.サイズ排除クロマトグラフィーでＰＢＳに緩衝液交換した後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ
２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラムを用いたＡＫＴＡ ｐｕｒｅ ２５ ＦＰＬＣでゲルろ過により２段階目の精製を行う。
【0189】
１１．２－エンドトキシンの除去
１.０．５ｍＬのエンドトキシン除去スピンカラムを室温に平準化する。
２.カラム底部の栓を外し、カラムキャップを緩め、１５ｍＬのチューブに入れ、５００
ｇで１分間遠心分離し、カラムから溶液を除く。溶液は廃棄する。
３.カラム底部のプラグを交換し、カラムキャップを外し、９５％エタノール中の０．２
ＮのＮａＯＨを樹脂に添加し、カラムキャップを取り付け、カラムを数回転倒させて樹脂を再懸濁し、室温で１～２時間静置する。
４.カラム底栓を除去し、カラムキャップを緩め、カラムを１５ｍＬのチューブに入れ、
５００ｇで１分間遠心し、カラムから溶液を除去する。溶液は廃棄する。
５.カラム底部のプラグを交換し、カラムキャップを外し、エンドトキシンを含まない２
ＭのＮａＣｌを樹脂に添加し、カラムキャップを取り替えた後、カラムを数回転倒させて樹脂を再懸濁させる。
６.カラムの底栓を外し、カラムキャップを緩め、カラムを１５ｍＬのチューブに入れ、
５００ｇで１分間遠心分離し、カラムから溶液を除去する。溶液は廃棄する。
７.カラム底部のプラグを交換し、カラムキャップを外し、エンドトキシンを含まない超
純水を樹脂に加え、カラムキャップを交換し、カラムを数回反転させて樹脂を再懸濁させる。
８.カラム底栓を除去し、カラムキャップを緩め、カラムを１５ｍＬのチューブに入れ、
５００ｇで１分間遠心分離し、カラムから溶液を除去する。溶液は廃棄する。
９.カラム底部のプラグを交換し、カラムキャップを外し、エンドトキシンを含まないリ
ン酸緩衝液を樹脂に添加し、カラムキャップを取り替えた後、カラムを数回転倒させて樹脂を懸濁させる。
１０.カラム底栓を除去し、カラムキャップを緩め、カラムを１５ｍＬのチューブに入れ
、５００ｇで１分間遠心分離し、カラムから溶液を除去する。溶液は廃棄する。
１１．リン酸塩緩衝液でさらに２回カラムを洗浄し、溶出液を捨る。
１２.カラムの底栓を交換し、カラムキャップを外して樹脂に試料を塗布し、カラムキャ
ップを交換し、カラムを数回倒して樹脂を再懸濁させる。
１３.カラムを４℃で少なくとも１時間、端から端まで混合しながらインキュベートする
。
１４.カラム底栓を外し、カラムキャップを緩め、カラムをエンドトキシンフリーの１５
ｍＬのチューブに入れ、５００ｇで１分間遠心分離し、カラムから溶液を除去する。サンプルは保持する。
１５.エンドトキシン除去手順を、サンプル中のエンドトキシンレベルが、すべての投与
量に対して対象のキログラムあたり５ＥＵ単位のエンドトキシンを含むようなレベル又はより低いレベルになるまで、再生したスピンカラムを用いて繰り返し行う。
１.０．５ｍＬのエンドトキシン除去スピンカラムを室温に平準化する。
２.カラム底部の栓を外し、カラムキャップを緩め、１５ｍＬのチューブに入れ、５００
ｇで１分間遠心分離し、カラムから溶液を除く。溶液は廃棄する。
３.カラム底部のプラグを交換し、カラムキャップを外し、９５％エタノール中の０．２
ＮのＮａＯＨを樹脂に添加し、カラムキャップを取り付け、カラムを数回転倒させて樹脂を再懸濁し、室温で１～２時間静置する。
４.カラム底栓を除去し、カラムキャップを緩め、カラムを１５ｍＬのチューブに入れ、
５００ｇで１分間遠心し、カラムから溶液を除去する。溶液は廃棄する。
５.カラム底部のプラグを交換し、カラムキャップを外し、エンドトキシンを含まない２
ＭのＮａＣｌを樹脂に添加し、カラムキャップを取り替えた後、カラムを数回転倒させて樹脂を再懸濁させる。
６.カラムの底栓を外し、カラムキャップを緩め、カラムを１５ｍＬのチューブに入れ、
５００ｇで１分間遠心分離し、カラムから溶液を除去する。溶液は廃棄する。
７.カラム底部のプラグを交換し、カラムキャップを外し、エンドトキシンを含まない超
純水を樹脂に加え、カラムキャップを交換し、カラムを数回反転させて樹脂を再懸濁させる。
８.カラム底栓を除去し、カラムキャップを緩め、カラムを１５ｍＬのチューブに入れ、
５００ｇで１分間遠心分離し、カラムから溶液を除去する。溶液は廃棄する。
９.カラム底部のプラグを交換し、カラムキャップを外し、エンドトキシンを含まないリ
ン酸緩衝液を樹脂に添加し、カラムキャップを取り替えた後、カラムを数回転倒させて樹脂を懸濁させる。
１０.カラム底栓を除去し、カラムキャップを緩め、カラムを１５ｍＬのチューブに入れ
、５００ｇで１分間遠心分離し、カラムから溶液を除去する。溶液は廃棄する。
１１．リン酸塩緩衝液でさらに２回カラムを洗浄し、溶出液を捨る。
１２.カラムの底栓を交換し、カラムキャップを外して樹脂に試料を塗布し、カラムキャ
ップを交換し、カラムを数回倒して樹脂を再懸濁させる。
１３.カラムを４℃で少なくとも１時間、端から端まで混合しながらインキュベートする
。
１４.カラム底栓を外し、カラムキャップを緩め、カラムをエンドトキシンフリーの１５
ｍＬのチューブに入れ、５００ｇで１分間遠心分離し、カラムから溶液を除去する。サンプルは保持する。
１５.エンドトキシン除去手順を、サンプル中のエンドトキシンレベルが、すべての投与
量に対して対象のキログラムあたり５ＥＵ単位のエンドトキシンを含むようなレベル又はより低いレベルになるまで、再生したスピンカラムを用いて繰り返し行う。
【0190】
１１．３－方法１
この例では、ＧＴ－ＰＥＰ－ＮＨＳを、ＴｅＮＴの表面のリジン残基上の一級アミン基に結合させて、図1Ｄからの分子を生成する。
１．約２ｋＤａ、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ又は約２０ｋＤａのＰＥＰを有するモル過剰のＧＴ－ＰＥＰ－ＮＨＳを、ＰＢＳ中、ｐＨ６．５～７．５でセリン変異体ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ（０．５～２ｍｇ／ｍＬ）と組み合わせる。
２.結合は、室温で６時間行う。
３.過剰なＰＥＧはサイズ排除クロマトグラフィーにより除去する。
この例では、ＧＴ－ＰＥＰ－ＮＨＳを、ＴｅＮＴの表面のリジン残基上の一級アミン基に結合させて、図1Ｄからの分子を生成する。
１．約２ｋＤａ、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ又は約２０ｋＤａのＰＥＰを有するモル過剰のＧＴ－ＰＥＰ－ＮＨＳを、ＰＢＳ中、ｐＨ６．５～７．５でセリン変異体ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ（０．５～２ｍｇ／ｍＬ）と組み合わせる。
２.結合は、室温で６時間行う。
３.過剰なＰＥＧはサイズ排除クロマトグラフィーにより除去する。
【0191】
１１．４－タンパク質のトリプシン消化活性化
ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣセリン変異体を活性化するトリプシン消化は、実施例４に従って行われる。
ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣセリン変異体を活性化するトリプシン消化は、実施例４に従って行われる。
【0192】
１１．５－タンパク質のトリプシン消化による活性型への変換
１.タンパク質１ｍｇを、０．５ｍＬの消化バッファー（０．１ＭのＮＨ４ＨＣＯ３バッ
ファーを含む、ｐＨ８．０）又は０．１Ｍのトリスバッファー（ｐＨ８．５）に溶解させる。
２.０．１０ｍＬ～０．２５ｍＬの固定化ＴＰＣＫトリプシンを３×５００μＬの消化バ
ッファーで洗浄した。洗浄ごとに、遠心分離によりゲルをバッファーから分離する。
３.ゲルを約０．２ｍＬの消化用緩衝液に再懸濁する。
４.固定化ＴＰＣＫトリプシンをタンパク質サンプルに添加する。
５.反応混合物を３７℃で２時間～１８時間、高速で振盪するインキュベーターでインキ
ュベートする。
６.固定化ＴＰＣＫトリプシンを遠心分離により分離する。
１.タンパク質１ｍｇを、０．５ｍＬの消化バッファー（０．１ＭのＮＨ４ＨＣＯ３バッ
ファーを含む、ｐＨ８．０）又は０．１Ｍのトリスバッファー（ｐＨ８．５）に溶解させる。
２.０．１０ｍＬ～０．２５ｍＬの固定化ＴＰＣＫトリプシンを３×５００μＬの消化バ
ッファーで洗浄した。洗浄ごとに、遠心分離によりゲルをバッファーから分離する。
３.ゲルを約０．２ｍＬの消化用緩衝液に再懸濁する。
４.固定化ＴＰＣＫトリプシンをタンパク質サンプルに添加する。
５.反応混合物を３７℃で２時間～１８時間、高速で振盪するインキュベーターでインキ
ュベートする。
６.固定化ＴＰＣＫトリプシンを遠心分離により分離する。
【0193】
１１．６－方法２
この例では、ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣの表面セリン残基を表面システイン残基に変異させ（Ｓ→Ｃ変異体）、免疫原性エピトープにおける指向性ＧＴ－ＰＥＰコンジュゲーション化を促進し、図１Ｄの分子を作製する。ＴｅＮＴの変異体は以下の通りである：配列番号１に対して、Ｓ８１Ｃ；Ｓ１２０Ｃ；Ｓ１４４Ｃ；Ｓ２４８Ｃ；Ｓ３３５Ｃ；Ｓ４２８Ｃ；Ｓ６００Ｃ；Ｓ９６３Ｃ；Ｓ１０４１Ｃ；Ｓ１１５５Ｃ；及びＳ１１８７Ｃであった。
１.約２ｋＤａ、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ又は約２０ｋＤａのＰＥＰを有するモル過剰
のＧＴ－ＰＥＰ－マレイミドを、ＰＢＳ中のセリン変異体ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ（０．５～２ｍｇ／ｍＬ）と組み合わせて、ｐＨ６．５－７．５とする。
２.結合は、室温で６時間行う。
３.過剰なＰＥＧはサイズ排除クロマトグラフィーによって除去する。
この例では、ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣの表面セリン残基を表面システイン残基に変異させ（Ｓ→Ｃ変異体）、免疫原性エピトープにおける指向性ＧＴ－ＰＥＰコンジュゲーション化を促進し、図１Ｄの分子を作製する。ＴｅＮＴの変異体は以下の通りである：配列番号１に対して、Ｓ８１Ｃ；Ｓ１２０Ｃ；Ｓ１４４Ｃ；Ｓ２４８Ｃ；Ｓ３３５Ｃ；Ｓ４２８Ｃ；Ｓ６００Ｃ；Ｓ９６３Ｃ；Ｓ１０４１Ｃ；Ｓ１１５５Ｃ；及びＳ１１８７Ｃであった。
１.約２ｋＤａ、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ又は約２０ｋＤａのＰＥＰを有するモル過剰
のＧＴ－ＰＥＰ－マレイミドを、ＰＢＳ中のセリン変異体ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ（０．５～２ｍｇ／ｍＬ）と組み合わせて、ｐＨ６．５－７．５とする。
２.結合は、室温で６時間行う。
３.過剰なＰＥＧはサイズ排除クロマトグラフィーによって除去する。
【0194】
１１．７－タンパク質のトリプシン消化活性化
ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体を活性化するトリプシン消化は、実施例４に従って行われる。
ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体を活性化するトリプシン消化は、実施例４に従って行われる。
【0195】
１１．８－タンパク質のトリプシン消化による活性型への変換
１.タンパク質１ｍｇを０．５ｍＬの消化バッファー（０．１ＭのＮＨ４ＨＣＯ３バッフ
ァーを含む、ｐＨ８．０）又は０．１Ｍのトリスバッファー（ｐＨ８．５）に溶解させる。
２.０．１０ｍＬ～０．２５ｍＬの固定化ＴＰＣＫトリプシンを３×５００μＬの消化バ
ッファーで洗浄した。洗浄のたびに、遠心分離によりゲルをバッファーから分離する。
３.ゲルを約０．２ｍＬの消化用緩衝液に再懸濁する。
４.固定化ＴＰＣＫトリプシンをタンパク質サンプルに添加する。
５.反応混合物を３７℃で２時間～１８時間、高速で振盪するインキュベーターでインキ
ュベートする。
６.固定化ＴＰＣＫトリプシンを遠心分離により分離する。
１.タンパク質１ｍｇを０．５ｍＬの消化バッファー（０．１ＭのＮＨ４ＨＣＯ３バッフ
ァーを含む、ｐＨ８．０）又は０．１Ｍのトリスバッファー（ｐＨ８．５）に溶解させる。
２.０．１０ｍＬ～０．２５ｍＬの固定化ＴＰＣＫトリプシンを３×５００μＬの消化バ
ッファーで洗浄した。洗浄のたびに、遠心分離によりゲルをバッファーから分離する。
３.ゲルを約０．２ｍＬの消化用緩衝液に再懸濁する。
４.固定化ＴＰＣＫトリプシンをタンパク質サンプルに添加する。
５.反応混合物を３７℃で２時間～１８時間、高速で振盪するインキュベーターでインキ
ュベートする。
６.固定化ＴＰＣＫトリプシンを遠心分離により分離する。
【0196】
実施例１２－ＧＴ－ＰＥＰ－ＮＨＳの合成
１.約２ｋＤａ～３０ｋＤａのＧＴ－ペプチドの遺伝子は、商業プロバイダーであるＩｎ
ｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成する。この遺伝子は、ベクターからの６ｘヒスチジンタグが変異タンパク質のＮ末端に付加されるように、又は付加されないように、制限消化によって２つの発現ベクターにサブクローニングされる。
２.大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３ ｐＬｙｓＳ株をＧＴ－ペプチドベクターで電気形質質転換
し、１ｍＬのＬＢ培地中、３７℃で1時間回収する。
３.前誘発培養液２００ｍＬに回収培養液を接種する。前誘発培養液 ｐＨ７．２－７．
４は、１．２％トリプトン；２．４％酵母エキス；２％グルコース；０．４％グリセロール；１７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４；７２ｍＭのＫ２ＨＰＯ４；及び選択抗生物質（アンピシリンとクロラムフェニコール）を含む。
４.培養物を３０℃で一晩、高速振盪しながらインキュベートする。
５.４０００ｇ、１０分間の遠心分離により、一晩培養したものを回収する。
６.ペレットを、１．２％トリプトン；２．４％酵母エキス；０．４％グリセロール；１
ｍＭのＩＰＴＧ；１７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４；７２ｍＭのＫ２ＨＰＯ４；１００μｇ／ｍＬのアンピリシンを含む、２００ｍＬの発現培養液（ｐＨ７．２－７．４）に再懸濁する。６．３０℃で6時間、高速振盪しながらタンパク質を発現させる。
７.４５００ｇ、１５分間の遠心分離により細胞を回収し、ペレットを２０ｍＭのイミダ
ゾールを含む３０ｍＬのＴＢＳに再懸濁する（ｐＨ８）。
８.超音波処理により細胞を溶解する。
９.細胞溶解液を４５００ｇ、２０分間の遠心分離で清澄化し、０．４５μｍフィルター
で濾過する。
１０.ＡＫＴＡ ｐｕｒｅ ２５ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ）を用いたＨｉｓ－ｔａｇア
フィニティークロマトグラフィーにより、タンパク質を精製する。又は硫安沈殿により精製する。
１１.精製されたタンパク質に対して、サイズ排除クロマトグラフィーによる緩衝液交換
とＰＢＳへの濃縮を行う。
１２.モル倍量のＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロカルボジイミド）
とＰＢＳ中のスルホ－ＮＨＳ（1-エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル)カルボジ
イミドを室温で２～８時間インキュベーションすることにより、スルホＮＨＳエステルをＧＴ－ペプチドのカルボキシル末端に付加させる。
１３．過剰なＥＤＣ及びスルホＨＮＳを、透析、脱塩又は緩衝液交換によって除去する。
１.約２ｋＤａ～３０ｋＤａのＧＴ－ペプチドの遺伝子は、商業プロバイダーであるＩｎ
ｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成する。この遺伝子は、ベクターからの６ｘヒスチジンタグが変異タンパク質のＮ末端に付加されるように、又は付加されないように、制限消化によって２つの発現ベクターにサブクローニングされる。
２.大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３ ｐＬｙｓＳ株をＧＴ－ペプチドベクターで電気形質質転換
し、１ｍＬのＬＢ培地中、３７℃で1時間回収する。
３.前誘発培養液２００ｍＬに回収培養液を接種する。前誘発培養液 ｐＨ７．２－７．
４は、１．２％トリプトン；２．４％酵母エキス；２％グルコース；０．４％グリセロール；１７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４；７２ｍＭのＫ２ＨＰＯ４；及び選択抗生物質（アンピシリンとクロラムフェニコール）を含む。
４.培養物を３０℃で一晩、高速振盪しながらインキュベートする。
５.４０００ｇ、１０分間の遠心分離により、一晩培養したものを回収する。
６.ペレットを、１．２％トリプトン；２．４％酵母エキス；０．４％グリセロール；１
ｍＭのＩＰＴＧ；１７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４；７２ｍＭのＫ２ＨＰＯ４；１００μｇ／ｍＬのアンピリシンを含む、２００ｍＬの発現培養液（ｐＨ７．２－７．４）に再懸濁する。６．３０℃で6時間、高速振盪しながらタンパク質を発現させる。
７.４５００ｇ、１５分間の遠心分離により細胞を回収し、ペレットを２０ｍＭのイミダ
ゾールを含む３０ｍＬのＴＢＳに再懸濁する（ｐＨ８）。
８.超音波処理により細胞を溶解する。
９.細胞溶解液を４５００ｇ、２０分間の遠心分離で清澄化し、０．４５μｍフィルター
で濾過する。
１０.ＡＫＴＡ ｐｕｒｅ ２５ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ）を用いたＨｉｓ－ｔａｇア
フィニティークロマトグラフィーにより、タンパク質を精製する。又は硫安沈殿により精製する。
１１.精製されたタンパク質に対して、サイズ排除クロマトグラフィーによる緩衝液交換
とＰＢＳへの濃縮を行う。
１２.モル倍量のＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロカルボジイミド）
とＰＢＳ中のスルホ－ＮＨＳ（1-エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル)カルボジ
イミドを室温で２～８時間インキュベーションすることにより、スルホＮＨＳエステルをＧＴ－ペプチドのカルボキシル末端に付加させる。
１３．過剰なＥＤＣ及びスルホＨＮＳを、透析、脱塩又は緩衝液交換によって除去する。
【0197】
実施例１３－ＧＴ－ＰＥＰ－マレイミドの合成
１.約２ｋＤａ～３０ｋＤａのＧＴ－ペプチドの遺伝子は、商業プロバイダーであるＩｎ
ｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成する。この遺伝子は、ベクターからの６ｘヒスチジンタグが変異タンパク質のＮ末端に付加されるように、又は付加されないように、制限消化によって２つの発現ベクターにサブクローニングされる。
２.大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３ ｐＬｙｓＳ株をＧＴ－ペプチドベクターで電気形質質転換
し、３７℃で1時間かけて１ｍＬのＬＢ培地に回収する。
３.前誘発培養液２００ｍＬに回収培養液を接種する。前誘発培養液 ｐＨ７．２－７．
４は、１．２％トリプトン；２．４％酵母エキス；２％グルコース；０．４％グリセロール；１７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４；７２ｍＭのＫ２ＨＰＯ４；及び選択抗生物質（アンピシリンとクロラムフェニコール）を含む。
４.培養物を３０℃で一晩、高速振盪しながらインキュベートする。
５.４０００ｇ、１０分間の遠心分離により、一晩培養したものを回収する。
６.ペレットを、１．２％トリプトン；２．４％酵母エキス；０．４％グリセロール；１
ｍＭのＩＰＴＧ；１７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４；７２ｍＭのＫ２ＨＰＯ４；１００μｇ／ｍＬのアンピリシンを含む、２００ｍＬの発現培養液（ｐＨ７．２－７．４）に再懸濁する。６．３０℃で6時間、高速振盪しながらタンパク質を発現させる。
７.４５００ｇ、１５分間の遠心分離により細胞を回収し、ペレットを２０ｍＭのイミダ
ゾールを含む３０ｍＬのＴＢＳに再懸濁する（ｐＨ８）。
８.超音波処理により細胞を溶解する。
９.細胞溶解液を４５００ｇ、２０分間の遠心分離で清澄化し、０．４５μｍフィルター
で濾過する。
１０.ＡＫＴＡ ｐｕｒｅ ２５ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ）を用いたＨｉｓ－ｔａｇア
フィニティークロマトグラフィーにより、タンパク質を精製する。又は硫安沈殿により精製する。
１１.精製されたタンパク質に対して、サイズ排除クロマトグラフィーによる緩衝液交換
とＰＢＳへの濃縮を行う。
１２．モル過剰の、ＰＢＳ中のスルホ－ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレート）と室温で２～８時間インキュベ
ートすることにより、マレイミド基をＧＴ－ペプチドのアミノ末端に結合させる。
１３．過剰なスルホ－ＳＭＣＣを、透析、脱塩又は緩衝液交換によって除去する。
１.約２ｋＤａ～３０ｋＤａのＧＴ－ペプチドの遺伝子は、商業プロバイダーであるＩｎ
ｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成する。この遺伝子は、ベクターからの６ｘヒスチジンタグが変異タンパク質のＮ末端に付加されるように、又は付加されないように、制限消化によって２つの発現ベクターにサブクローニングされる。
２.大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３ ｐＬｙｓＳ株をＧＴ－ペプチドベクターで電気形質質転換
し、３７℃で1時間かけて１ｍＬのＬＢ培地に回収する。
３.前誘発培養液２００ｍＬに回収培養液を接種する。前誘発培養液 ｐＨ７．２－７．
４は、１．２％トリプトン；２．４％酵母エキス；２％グルコース；０．４％グリセロール；１７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４；７２ｍＭのＫ２ＨＰＯ４；及び選択抗生物質（アンピシリンとクロラムフェニコール）を含む。
４.培養物を３０℃で一晩、高速振盪しながらインキュベートする。
５.４０００ｇ、１０分間の遠心分離により、一晩培養したものを回収する。
６.ペレットを、１．２％トリプトン；２．４％酵母エキス；０．４％グリセロール；１
ｍＭのＩＰＴＧ；１７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４；７２ｍＭのＫ２ＨＰＯ４；１００μｇ／ｍＬのアンピリシンを含む、２００ｍＬの発現培養液（ｐＨ７．２－７．４）に再懸濁する。６．３０℃で6時間、高速振盪しながらタンパク質を発現させる。
７.４５００ｇ、１５分間の遠心分離により細胞を回収し、ペレットを２０ｍＭのイミダ
ゾールを含む３０ｍＬのＴＢＳに再懸濁する（ｐＨ８）。
８.超音波処理により細胞を溶解する。
９.細胞溶解液を４５００ｇ、２０分間の遠心分離で清澄化し、０．４５μｍフィルター
で濾過する。
１０.ＡＫＴＡ ｐｕｒｅ ２５ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ）を用いたＨｉｓ－ｔａｇア
フィニティークロマトグラフィーにより、タンパク質を精製する。又は硫安沈殿により精製する。
１１.精製されたタンパク質に対して、サイズ排除クロマトグラフィーによる緩衝液交換
とＰＢＳへの濃縮を行う。
１２．モル過剰の、ＰＢＳ中のスルホ－ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレート）と室温で２～８時間インキュベ
ートすることにより、マレイミド基をＧＴ－ペプチドのアミノ末端に結合させる。
１３．過剰なスルホ－ＳＭＣＣを、透析、脱塩又は緩衝液交換によって除去する。
【0198】
実施例１４ 糖ＧＴ－ＨＺＮ－ＰＥＰ－ＮＨＳの合成
１４．１ ＧｌｙｃｏＧＴペプチドの生成
１.グリシンとトレオニンの繰り返し配列又はランダム配列をエンコードする遺伝子は、
市販合成品を使用し、酵母又は哺乳類の発現ベクターにクローニングする。
２.ペプチドを糖鎖形成酵母（サッカロマイセス・セレビシエなど）又は哺乳動物細胞（
チャイニーズハムスター卵巣細胞など）で発現させる。
３.ペプチドは、陰イオン交換やサイズエクスルージョンなどのクロマトグラフィー法に
より精製する。
１４．１ ＧｌｙｃｏＧＴペプチドの生成
１.グリシンとトレオニンの繰り返し配列又はランダム配列をエンコードする遺伝子は、
市販合成品を使用し、酵母又は哺乳類の発現ベクターにクローニングする。
２.ペプチドを糖鎖形成酵母（サッカロマイセス・セレビシエなど）又は哺乳動物細胞（
チャイニーズハムスター卵巣細胞など）で発現させる。
３.ペプチドは、陰イオン交換やサイズエクスルージョンなどのクロマトグラフィー法に
より精製する。
【0199】
１４．２ 糖鎖ペプチドへのアルデヒド基の付加
糖鎖残基上にアルデヒド基が存在するように、ＧＴ－糖ペプチドをグリシン又はグルタチオンで酸化する。
糖鎖残基上にアルデヒド基が存在するように、ＧＴ－糖ペプチドをグリシン又はグルタチオンで酸化する。
【0200】
１４．３ Ｇｌｙ－ＨＺＮ－ＮＨＳの合成
１.糖ＧＴ－ＰＥＰは、ｐＨ分解性ヒドラゾン連結を介してＮＨＳエステルに結合される
。
２.糖ＧＴ－ＰＥＰを、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ又はＰＢＳ中でｎモル過剰のＳＨＮＨ又はＳＡ
ＮＨ架橋剤と組み合わせる。
３.通常雰囲気、窒素雰囲気又はアルゴン雰囲気下、室温で１～１６時間程度結合が行わ
れる。
１.糖ＧＴ－ＰＥＰは、ｐＨ分解性ヒドラゾン連結を介してＮＨＳエステルに結合される
。
２.糖ＧＴ－ＰＥＰを、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ又はＰＢＳ中でｎモル過剰のＳＨＮＨ又はＳＡ
ＮＨ架橋剤と組み合わせる。
３.通常雰囲気、窒素雰囲気又はアルゴン雰囲気下、室温で１～１６時間程度結合が行わ
れる。
【0201】
実施例１５－糖ＧＴ－ＨＺＮ－ＰＥＰ－マレイミドの合成
１５．１ 糖ＧＴペプチドの生成
１.グリシンとトレオニンの繰り返し配列又はランダム配列をエンコードする遺伝子は、
市販合成品を使用し、酵母又は哺乳類の発現ベクターにクローニングする。
２.ペプチドを糖鎖形成酵母（サッカロマイセス・セレビシエなど）又は哺乳動物細胞（
チャイニーズハムスター卵巣細胞など）で発現させる。
３.ペプチドは、陰イオン交換やサイズエクスルージョンなどのクロマトグラフィー法に
より精製する。
１５．１ 糖ＧＴペプチドの生成
１.グリシンとトレオニンの繰り返し配列又はランダム配列をエンコードする遺伝子は、
市販合成品を使用し、酵母又は哺乳類の発現ベクターにクローニングする。
２.ペプチドを糖鎖形成酵母（サッカロマイセス・セレビシエなど）又は哺乳動物細胞（
チャイニーズハムスター卵巣細胞など）で発現させる。
３.ペプチドは、陰イオン交換やサイズエクスルージョンなどのクロマトグラフィー法に
より精製する。
【0202】
１５．２ 糖鎖ペプチドへのアルデヒド基の付加
糖残基上にアルデヒド基が存在するように、ＧＴ－糖ペプチドをグリシン又はグルタチオンで酸化する。
糖残基上にアルデヒド基が存在するように、ＧＴ－糖ペプチドをグリシン又はグルタチオンで酸化する。
【0203】
１５．３ Ｇｌｙ－ＨＺＮ－マレイミドの合成
１.糖ＧＴ－ＰＥＰは、ｐＨ分解性ヒドラゾン連結を介してマレイミド基に結合される。
２.糖ＧＴ－ＰＥＰを、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ又はＰＢＳ中のｎモル過剰のＢＭＰＨ（Ｎ－β
－マレイミドプロピオン酸ヒドラジド）ＥＭＣＨ（３，３’－Ｎ－［ε－マレイミドカプロン酸］ヒドラジド）又はＫＭＵＨ（Ｎ－κ－マレイミドウンデカン酸ヒドラジド）のクロスリンカーと組み合わせる。
３.結合は、通常雰囲気、窒素雰囲気又はアルゴン雰囲気下、室温で１～１６時間行う。
１.糖ＧＴ－ＰＥＰは、ｐＨ分解性ヒドラゾン連結を介してマレイミド基に結合される。
２.糖ＧＴ－ＰＥＰを、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ又はＰＢＳ中のｎモル過剰のＢＭＰＨ（Ｎ－β
－マレイミドプロピオン酸ヒドラジド）ＥＭＣＨ（３，３’－Ｎ－［ε－マレイミドカプロン酸］ヒドラジド）又はＫＭＵＨ（Ｎ－κ－マレイミドウンデカン酸ヒドラジド）のクロスリンカーと組み合わせる。
３.結合は、通常雰囲気、窒素雰囲気又はアルゴン雰囲気下、室温で１～１６時間行う。
【0204】
実施例１６－ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴの分析
実施例４に従ってＴｅＮＴを調製し、ＰＥＧ化した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図２７）により分析し、（Ａ）クーマシーブルーを用いて、（Ｂ）ポリクローナル抗ＴｅＮＴ抗体を用いたウェスタンブロット、により検出した。図２７（Ｂ）は、抗体結合親和性がＰＥＧ分子量に比例していることを示している。
実施例４に従ってＴｅＮＴを調製し、ＰＥＧ化した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図２７）により分析し、（Ａ）クーマシーブルーを用いて、（Ｂ）ポリクローナル抗ＴｅＮＴ抗体を用いたウェスタンブロット、により検出した。図２７（Ｂ）は、抗体結合親和性がＰＥＧ分子量に比例していることを示している。
【0205】
実施例１７－ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴのＴｅＮＴに対する免疫原性の低下
異なる分子量ＰＥＧ（２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ及び２０ｋＤａ）をそれぞれ含む４つのＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴを実施例４に従って調製し、ＰＥＧ化する。次いで、ＰＥＧ－ＴｅＮＴを、ＴｅＮＴに対する競合ＥＬＩＳＡによってアッセイした。
異なる分子量ＰＥＧ（２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ及び２０ｋＤａ）をそれぞれ含む４つのＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴを実施例４に従って調製し、ＰＥＧ化する。次いで、ＰＥＧ－ＴｅＮＴを、ＴｅＮＴに対する競合ＥＬＩＳＡによってアッセイした。
【0206】
第１のアッセイ（図２９Ａ）において、ＴｅＮＴは、ＥＬＩＳＡプレートに吸着される。次いで、吸着されたＴｅＮＴは、４つのＰＥＧ－ＴｅＮＴ抗原（２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ及び２０ｋＤａ）の４つの濃度（１０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ及び０．０１μｇ／ｍＬ）のそれぞれでプレインキュベートしたポリクローナル抗ＴｅＮＴ抗体でプローブされる。このアッセイでは、応答（ＯＤ ４５０ｎｍ）が高いほど、ＴｅＮＴに対するより親和性が大きく、よって、ＰＥＧ－ＴｅＮＴの免疫原性が低下したことを示した。
【0207】
第２のアッセイ（図２９Ｂ）において、各ＰＥＧ－ＴｅＮＴは、別々のＥＬＩＳＡプレートに吸着される。吸着されたＴｅＮＴは、４つのＰＥＧ－ＴｅＮＴ抗原（２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ及び２０ｋＤａ）の４つの濃度（１０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ及び０．０１μｇ／ｍＬ）のそれぞれでプレインキュベートしたポリクローナル抗ＴｅＮＴ抗体でプローブされる。このアッセイでは、応答（ＯＤ ４５０ｎｍ）が低いほど、ＴｅＮＴに対する親和性が高く、したがってＰＥＧ－ＴｅＮＴの免疫原性が低下しことを示した。
【0208】
この実施例では、抗ＴｅＮＴ抗体がＴｅＮＴに優先的に結合し、ＰＥＧ化ＴｅＮＴがＴｅＮＴ（すなわち非ＰＥＧ化）と比較して免疫原性を低下させることが示唆される。
【0209】
実施例１８－ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ｃセリン変異体対ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体の免疫原性の低下
ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体は、実施例４に従って調製される。ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体の４つのサンプルを実施例４に従ってＰＥＧ化し、各サンプルは異なる分子量のＰＥＧ（２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ及び２０ｋＤａ）を含む。ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体は、ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体に対する競合ＥＬＩＳＡによってアッセイされる。
ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体は、実施例４に従って調製される。ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体の４つのサンプルを実施例４に従ってＰＥＧ化し、各サンプルは異なる分子量のＰＥＧ（２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ及び２０ｋＤａ）を含む。ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体は、ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体に対する競合ＥＬＩＳＡによってアッセイされる。
【0210】
最初のアッセイでは、ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体は、ＥＬＩＳＡプレートに吸着される。吸着されたＴｅＮＴセリン変異体は、次に、４つのＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ｃセリン変異体抗原（２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ及び２０ｋＤａ）の４つの濃度（１０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ及び０．０１μｇ／ｍＬ）のそれぞれにおいてプレインキュベートしたポリクローナル抗ＴｅＮＴ抗体でプローブされる。このアッセイでは、応答（ＯＤ ４５０ｎｍ）が高いほど、ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体に対する親和性が高く、したがってＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ｃセリン変異体の免疫原性が低下していることが示された。
【0211】
第２のアッセイにおいて、各ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体は、別々のＥＬＩＳＡプレートに吸着される。次に、吸着された各ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ｃセリン変異体（２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ及び２０ｋＤａ）は、各ＴｅＮＴ－ｃセリン変異体抗原の４つの濃度（１０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ及び０．０１μｇ／ｍＬ）のそれぞれにおいてプレインキュベートした、ポリクローナル抗ＴｅＮＴ抗体でプローブされることになる。このアッセイにおいて、応答（ＯＤ ４５０ｎｍ）が低いほど、ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体に対する親和性が大きく示し、したがってＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ｃセリン変異体の免疫原性が低下していることが示された。
【0212】
この実施例では、抗ＴｅＮＴ抗体がＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体に優先的に結合し、ＰＥＧ－ＨＺＮＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体がＴｅＮＴ－ＬＣ－Ｃセリン変異体（すなわち非ＰＥＧ化）に対して免疫原性を低下させることが示される。
【0213】
実施例１９－ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ対ＴｅＮＴの免疫原性の低下
ポリクローナル抗体を、過去１２ヶ月以内にブースター破傷風トキソイドワクチン接種を受けた１人以上の対象から採取したヒト血清に置き換えることを除いて、実施例９に従って競合ＥＬＩＳＡアッセイを実施する。血清中の抗体は、ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴに対して、ＴｅＮＴ（すなわち、非ＰＥＧ化ＴｅＮＴ）より大きな親和性を示す。
ポリクローナル抗体を、過去１２ヶ月以内にブースター破傷風トキソイドワクチン接種を受けた１人以上の対象から採取したヒト血清に置き換えることを除いて、実施例９に従って競合ＥＬＩＳＡアッセイを実施する。血清中の抗体は、ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴに対して、ＴｅＮＴ（すなわち、非ＰＥＧ化ＴｅＮＴ）より大きな親和性を示す。
【0214】
実施例２０－生体内モデル
ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを、ＰＥＧ（約２ｋＤａ、５ｋＤａ、約１０ｋＤａ又は約２０ｋＤａ）を実施例４に従って、組換えＴｅＮＴの表面露出リジン残基に結合させることにより調製する。
ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを、ＰＥＧ（約２ｋＤａ、５ｋＤａ、約１０ｋＤａ又は約２０ｋＤａ）を実施例４に従って、組換えＴｅＮＴの表面露出リジン残基に結合させることにより調製する。
【0215】
１５μＬのＰＢＳ中の１単位以上のＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを、雌のＣ５７ＢＬ／６マウスの後肢に注射する。各動物は、注射後４８時間以内に局所的な四肢のテタニーを示した。
【0216】
実施例２１－生体内モデル
ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを、ＧＴ－ペプチド（約２ｋＤａ、５ｋＤａ、約１０ｋＤａ又は約２０ｋＤａ）を実施例１１に従って、組換えＴｅＮＴ又は組換えＴｅＮＴセリン変異体の表面露出リジン残基又はシステイン残基に結合させることにより調製する。
ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを、ＧＴ－ペプチド（約２ｋＤａ、５ｋＤａ、約１０ｋＤａ又は約２０ｋＤａ）を実施例１１に従って、組換えＴｅＮＴ又は組換えＴｅＮＴセリン変異体の表面露出リジン残基又はシステイン残基に結合させることにより調製する。
【0217】
１５μＬのＰＢＳ中の１単位以上のＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを、雌のＣ５７ＢＬ／６マウスの後肢に注射する。各動物は、注射から４８時間以内に局所的な四肢のテタニーを示す。
【0218】
実施例２２
２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ又は２０ｋＤａのＰＥＧを含むＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを、５０～５０００００ｎｇ／ｋｇで、破傷風トキソイドで予め免疫化し
たマウスの後肢筋肉に投与する。筋収縮の増加が、注射された筋肉で３日間まで観察され、同じ単位のＴｅＮＴを投与したマウスで観察される効果より大きい。
２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ又は２０ｋＤａのＰＥＧを含むＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを、５０～５０００００ｎｇ／ｋｇで、破傷風トキソイドで予め免疫化し
たマウスの後肢筋肉に投与する。筋収縮の増加が、注射された筋肉で３日間まで観察され、同じ単位のＴｅＮＴを投与したマウスで観察される効果より大きい。
【0219】
実施例２３
２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ又は２０ｋＤａのＰＥＰを含むＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを、５０～５０００００ｎｇ／ｋｇの量、破傷風トキソイドで予め免疫化したマウスの後肢筋肉に筋肉内投与する。筋収縮の増加が、注射された筋肉で最大３日間観察され、同じ単位のＴｅＮＴを投与したマウスで観察される効果より大きい。
２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ又は２０ｋＤａのＰＥＰを含むＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを、５０～５０００００ｎｇ／ｋｇの量、破傷風トキソイドで予め免疫化したマウスの後肢筋肉に筋肉内投与する。筋収縮の増加が、注射された筋肉で最大３日間観察され、同じ単位のＴｅＮＴを投与したマウスで観察される効果より大きい。
【0220】
実施例２４
２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ又は２０ｋＤａのＰＥＰを含むＰＥＰ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを、５０～５０００００ｎｇ／ｋｇの量で、破傷風トキソイドで予め免疫化したマウスの後肢筋肉に筋肉内投与する。筋収縮の増加が、最大３日間、注射された筋肉で観察され、同じ単位のＴｅＮＴ又はＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを投与したマウスで観察される効果より大きい。
２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ又は２０ｋＤａのＰＥＰを含むＰＥＰ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを、５０～５０００００ｎｇ／ｋｇの量で、破傷風トキソイドで予め免疫化したマウスの後肢筋肉に筋肉内投与する。筋収縮の増加が、最大３日間、注射された筋肉で観察され、同じ単位のＴｅＮＴ又はＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを投与したマウスで観察される効果より大きい。
【0221】
実施例２５
２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ又は２０ｋＤａのＰＥＧを含む糖ＰＥＰ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを、５０～５０００００ｎｇ／ｋｇの量で、破傷風トキソイドで予め免疫化したマウスの後肢筋肉に筋肉内投与する。筋収縮の増加が、最大３日間、注射された筋肉で観察され、同じ単位のＴｅＮＴ又はＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを投与したマウスで観察される効果より大きい。
２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ又は２０ｋＤａのＰＥＧを含む糖ＰＥＰ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを、５０～５０００００ｎｇ／ｋｇの量で、破傷風トキソイドで予め免疫化したマウスの後肢筋肉に筋肉内投与する。筋収縮の増加が、最大３日間、注射された筋肉で観察され、同じ単位のＴｅＮＴ又はＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを投与したマウスで観察される効果より大きい。
【0222】
実施例２６
約３０ｋｇのブルドッグに、２０ｋＤａのＰＥＧを含むＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ｃを２５～５００００ｎｇ／ｋｇ、左右の殿筋に用量を分けて筋肉内投与する。投与後、ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ投与動物では、ビヒクル単独投与動物に比べて閉塞性睡眠時無呼吸症候群（ＯＳＡ）が減少することが確認された。ブルドッグは毎週ＯＳＡについて観察され、ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ｃの投与は、その有効性－ビヒクル単独で治療した動物の場合と同様、ＯＳＡが回復することでもって決める－が、低下するまで必要に応じて繰り返される。
約３０ｋｇのブルドッグに、２０ｋＤａのＰＥＧを含むＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ｃを２５～５００００ｎｇ／ｋｇ、左右の殿筋に用量を分けて筋肉内投与する。投与後、ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ投与動物では、ビヒクル単独投与動物に比べて閉塞性睡眠時無呼吸症候群（ＯＳＡ）が減少することが確認された。ブルドッグは毎週ＯＳＡについて観察され、ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ｃの投与は、その有効性－ビヒクル単独で治療した動物の場合と同様、ＯＳＡが回復することでもって決める－が、低下するまで必要に応じて繰り返される。
【0223】
その後、ブルドッグに、２０ｋＤａのＰＥＧを含むＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＨＣを２５～５００００ｎｇ／ｋｇの量で、又は２０ｋＤａのＰＥＧを含むＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃを２５～５００００ｎｇ／ｋｇの量で、それぞれ左右の蝶形骨に両側から分けて投与する。投与後、ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ投与動物では、ビヒクル単独投与動物に比べ、ＯＳＡが減少する。ブルドッグは、ＯＳＡについて毎週観察し、ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＨＣ及びＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃの投与は、それらの有効性－ビヒクル単独で治療した動物の場合と同様、ＯＳＡが回復することでもって決める－が、低下するまで必要に応じて繰り返される。
【0224】
その後、ブルドッグに、２０ｋＤａのＰＥＧを含むＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを２５～５００００ｎｇ／ｋｇの量で、左右の精巣に両側から分けて投与する。投与後、ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ投与動物では、ビヒクル単独投与動物に比べ、ＯＳＡが減少する。ブルドッグは毎週ＯＳＡを観察し、ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣの投与は、その有効性－ビヒクル単独で治療した動物の場合と同様、ＯＳＡが回復することでもって決める－が、低下するまで必要に応じて繰り返される。
【0225】
実施例２７
約３０ｋｇのブルドッグに、２０ｋＤａのＰＥＰを含む、ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ｃ又はＰＥ
Ｐ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ｃを、それぞれ２５～５００００ｎｇ／ｋｇの量で、左右の殿筋に両側に分けて投与する。投与後、ＰＥＰ－ＴｅＮＴ又はＰＥＰ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ投与動物では、ビヒクルのみで投与した動物と比較して閉塞性睡眠時無呼吸症候群（ＯＳＡ）が減少する。ブルドッグは毎週ＯＳＡを観察し、ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ｃの投与は、その有効性－ビヒクル単独で治療した動物の場合と同様、ＯＳＡが回復することでもって決める－が、低下するまで必要に応じて繰り返される。
約３０ｋｇのブルドッグに、２０ｋＤａのＰＥＰを含む、ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ｃ又はＰＥ
Ｐ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ｃを、それぞれ２５～５００００ｎｇ／ｋｇの量で、左右の殿筋に両側に分けて投与する。投与後、ＰＥＰ－ＴｅＮＴ又はＰＥＰ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ投与動物では、ビヒクルのみで投与した動物と比較して閉塞性睡眠時無呼吸症候群（ＯＳＡ）が減少する。ブルドッグは毎週ＯＳＡを観察し、ＰＥＧ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ｃの投与は、その有効性－ビヒクル単独で治療した動物の場合と同様、ＯＳＡが回復することでもって決める－が、低下するまで必要に応じて繰り返される。
【0226】
その後、ブルドッグに、２０ｋＤａのＰＥＰを含む、ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＨＣもしくはＰＥＰ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＨＣを２５～５００００ｎｇ／ｋｇの量で、又は２０ｋＤａのＰＥＰを含む、ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃもしくはＰＥＰ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃを２５～５００００ｎｇ／ｋｇの量で、それぞれ左右の殿筋に両側に分けて投与する。投与後、ＰＥＰ－ＴｅＮＴ又はＰＥＰ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴを投与した動物では、ビヒクルのみで投与した動物に比べ、ＯＳＡが減少する。ブルドッグは、ＯＳＡについて毎週観察し、ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＨＣ又はＰＥＰ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＨＣ及びＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ又はＰＥＰ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃの投与は、それらの有効性－ビヒクル単独で治療した動物の場合と同様、ＯＳＡが回復することでもって決める－が、低下するまで必要に応じて繰り返される。
【0227】
その後、ブルドッグに、２０ｋＤａのＰＥＰを含む、ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ又はＰＥＰ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを２５～５００００ｎｇ／ｋｇの量で、それぞれ左右の蝶形骨に両側から分けて投与する。投与後、ＰＥＰ－ＴｅＮＴ又はＰＥＰ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴを投与した動物では、ビヒクルのみで投与した動物と比較して、ＯＳＡが減少することが確認された。ブルドッグは、ＯＳＡについて毎週観察され、ＰＥＰ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ又はＰＥＰ－ＨＺＮ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣの投与は、それらの有効性－ビヒクル単独で治療した動物の場合と同様、ＯＳＡが回復することでもって決める－が、低下するまで必要に応じて繰り返される。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12-1】
【図12-2】
【図13】
【図14】
【図15-1】
【図15-2】
【図15-3】
【図16】
【図17-1】
【図17-2】
【図18-1】
【図18-2】
【図19】
【図20】
【図21-1】
【図21-2】
【図21-3】
【図22】
【図23-1】
【図23-2】
【図24-1】
【図24-2】
【図25】
【図26】
【図27】
【配列表】
【国際調査報告】