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特表2023-514038ナノプラスチック及びマイクロプラスチックの設計、作製及び特性評価
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-05
(54)【発明の名称】ナノプラスチック及びマイクロプラスチックの設計、作製及び特性評価
(51)【国際特許分類】
G01N 21/64 20060101AFI20230329BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20230329BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20230329BHJP
【ＦＩ】
G01N21/64 F
G01N33/543 541Z
C12Q1/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022542088
(86)(22)【出願日】2021-02-19
(85)【翻訳文提出日】2022-08-30
(86)【国際出願番号】 US2021018695
(87)【国際公開番号】W WO2021168191
(87)【国際公開日】2021-08-26
(31)【優先権主張番号】62/978,499
(32)【優先日】2020-02-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/089,210
(32)【優先日】2020-10-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507021506
【氏名又は名称】リサーチ トライアングル インスティテュート
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100173473
【弁理士】
【氏名又は名称】高井良 克己
(72)【発明者】
【氏名】ニネル モルテンセン
(72)【発明者】
【氏名】リア ジョンソン
(72)【発明者】
【氏名】ジェフリー メシャム
【テーマコード（参考）】
2G043
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G043AA01
2G043AA04
2G043BA14
2G043CA04
2G043DA02
2G043EA01
2G043FA02
2G043KA02
2G043LA03
2G043NA01
4B063QA01
4B063QQ03
4B063QQ08
4B063QQ16
4B063QQ18
4B063QQ19
4B063QR66
4B063QX02
(57)【要約】
本発明概念又はナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子、ナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子を含む参照標準物質、その使用方法、及びその調製方法を提供する。本発明概念のナノプラスチック粒子及び／又はマイクロプラスチック粒子の用途は、環境系及び／又は生体系並びに環境内に存在する生物におけるナノプラスチック粒子及び／又はマイクロプラスチック粒子の分散／分布の追跡を含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下：ナノプラスチックポリマー若しくはマイクロプラスチックポリマー、ポリマー複合体又はポリマーマトリックス；及び
蛍光性タグ又は放射性タグ
を含む、ナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子。
【請求項2】
前記マイクロプラスチックポリマー、ポリマー複合体又はポリマーマトリックスは、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレン（ＰＥ）、高密度ＰＥ（ＨＤＰＥ）、低密度ＰＥ（ＬＤＰＥ）、線形低密度ポリエチレン（ＬＬＤＰＥ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリアミド（ＰＡ）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリオキシメチレン（ＰＯＭ）、ポリウレタン（ＰＵＲ）、シリコン、ナイロン又はアクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）のうちの少なくとも一つである、請求項１に記載のナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子。
【請求項3】
前記ナノプラスチック粒子又は、マイクロプラスチック粒子は蛍光タグを含み、前記蛍光タグは、ローダミン、フルオレセイン、アレクサ蛍光化合物、ナイルレッド、Ｒ－フィコエリトリン、パシフィックブルー、カスケードブルー、テキサスレッド、Ｃｙ５、Ｃｙ３、Ｃｙ７、ヒドロキシクマリン、アミノクマリン又はメトキシクマリンのうちの少なくとも一つである、請求項１又は２に記載のナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子。
【請求項4】
前記ナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子は、蛍光タグを含み、前記蛍光タグは、バイオコンジュゲートを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子。
【請求項5】
前記ナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子は、ポリマーマトリックス及び蛍光タグを含み、前記蛍光タグは、前記ポリマーマトリックスの全体に分布している、請求項１から４のいずれか一項に記載のナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子。
【請求項6】
前記ナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子は、機能性表面及び蛍光タグを含み、前記蛍光タグは前記機能性表面に関連付けられている、請求項１から５のいずれか一項に記載のナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子。
【請求項7】
前記機能性表面は、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＯ－、－ＮＨ３
＋、－ＮＨ２、－ＯＨ、ＰＥＧ、ストレプトアビジン、ストレプトアビジン－ビオチン複合体、及び抗体コンジュゲートよりなる群から選択される化学基を含む、請求項６に記載のナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子。
【請求項8】
粒径は、約１ミクロン未満である、請求項１から７のいずれか一項に記載のナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子。
【請求項9】
粒径は、約５００ｎｍ未満である、請求項１から８のいずれか一項に記載のナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子。
【請求項10】
粒径は、約１００ｎｍ未満である、請求項１から９のいずれか一項に記載のナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子。
【請求項11】
ナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子を含む参照標準物質であって、前記ナノプラスチック粒子又は前記マイクロプラスチック粒子は、以下：ナノプラスチック若しくはマイクロプラスチックポリマー、ポリマー複合体、又はポリマーマトリックス；及び
蛍光性タグ又は放射性タグ
を含む、前記参照標準物質。
【請求項12】
前記ナノプラスチック粒子又は前記マイクロプラスチック粒子は、環境中に見出される粒度分布を代表するサイズにされる、請求項１１に記載の参照標準物質。
【請求項13】
ナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子の環境分散を監視するための方法であって、以下：請求項１１又は１２に記載の参照標準物質を環境に提供するステップ；及び
前記環境における前記参照物質の分散を監視するステップ
を含み、
前記参照物質の分散を監視するステップは、前記環境からの少なくとも１つのサンプル中における前記参照物質の存在を検出することを含む、
上記方法。
【請求項14】
前記環境は、海洋環境、淡水環境、又は陸上環境を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記環境は、海洋生体系、淡水生体系、又は陸上生体系を含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項16】
前記環境は、水道水、飲料水、及び／又は飲料を含む、請求項請求項１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記環境は、食品を含む、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記食品は、蜂蜜である、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
対象中におけるナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子の分散を監視する方法であって、以下：前記対象を請求項１１又は１２に記載の参照標準物質に曝露するステップ；及び
前記対象中における前記参照物質の分散を監視するステップ
を含み、
前記参照物質の分散を監視するステップは、前記対象からの少なくとも１つのサンプル中における前記参照標準物質の存在を検出することを含む、
上記方法。
【請求項20】
前記方法は、前記参照標準物質の存在を検出するためのインビトロ、インサイチュ、インビボ、又はエクスビボの方法を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記対象は海洋生物、淡水生物、又は陸上生物である、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項22】
前記対象は、貝類、軟体動物及び魚類よりなる群から選択される海洋生物である、請求項１９から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記対象は、哺乳類生命体である、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項24】
前記哺乳類生命体は、ヒト生命体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
サンプル中におけるナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子の存在を監視するための方法であって、以下：ポリマー、ポリマー複合体又はポリマーマトリックスと、及び蛍光タグ又は放射性タグとを含む、前記ナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子を含む参照標準物質を環境に提供するステップ；及び
前記環境から得られたサンプルに前記参照物質が存在するか否かを判断するステップ
を含む、上記方法。
【請求項26】
前記サンプル中における前記参照物質の存在を、蛍光タグによる蛍光の発光によって判断する、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記サンプルは、海洋環境、淡水環境若しくは陸上環境、又は海洋生体系、淡水生体系若しくは陸上生体系から得られる、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項28】
前記サンプルは、海洋生物から得られる、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記海洋生物は、貝類、軟体動物及び魚類よりなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記サンプルは、海塩から得られる、請求項２５から２７に記載の方法。
【請求項31】
前記サンプルは、水道水、飲料水及び／又は飲料から得られる、請求項２５から２７に記載の方法。
【請求項32】
前記サンプルは、食品から得られる、請求項２５から２９に記載の方法。
【請求項33】
前記食品は、蜂蜜を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記食品は、魚介類を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項35】
ナノプラスチック粒子及び／又はマイクロプラスチック粒子を調製する方法であって、以下：プラスチックを第１溶媒に溶解してプラスチック溶液を提供するステップ；
前記プラスチック溶液を第２溶媒中に沈殿させるステップ；及び
前記第１溶媒を蒸発させて、前記第２溶媒中に前記ナノプラスチック粒子又は前記マイクロプラスチック粒子の分散液を提供するステップ
を含む、上記方法。
【請求項36】
前記プラスチックは、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレン（ＰＥ）、高密度ＰＥ（ＨＤＰＥ）、低密度ＰＥ（ＬＤＰＥ）、線状低密度ポリエチレン（ＬＬＤＰＥ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリアミド（ＰＡ）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリオキシメチレン（ＰＯＭ）、ポリウレタン（ＰＵＲ）、シリコン、ナイロン、及びアクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）よりなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
前記プラスチックは、ＰＥＴである、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記第１溶媒は、フェノール、ＤＭＳＯ、ニトロベンゼン、ｏ－クロロフェノール、ｏ－クレゾール、ジフェニルアミン、ジクロロメタン及びＨＦＩＰ、又はそれらの任意の組み合わせよりなる群から選択される、請求項３５から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
前記第１溶媒は、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）である、請求項３５から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項40】
前記プラスチック溶液は、約０．１～約５重量％のプラスチックを含む、請求項３５から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項41】
前記第２溶媒は、水である、請求項３８に記載の方法。
【請求項42】
前記プラスチック溶液を０．１～５ｍＬ／分の速度で前記第２溶媒に添加することによって、前記プラスチック溶液を前記第２溶媒中に沈殿させる、請求項３５から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項43】
前記プラスチック溶液を約１ｍＬ／分の速度で前記第２溶媒第２溶媒に添加することによって、前記プラスチック溶液を前記第２溶媒中に沈殿させる、請求項４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項44】
前記プラスチック溶液は、約１０ｍＬの量を有し、前記第２溶媒は、約５０ｍＬから約５０００ｍＬの間の量を有する、請求項３５から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
前記第２溶媒は、約０℃から約２０℃の間の温度を有する、請求項３５から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項46】
前記プラスチックを、蛍光タグを有する前記第１溶媒に溶解する、請求項３５から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項47】
前記蛍光タグは、ローダミン、フルオレセイン、アレクサ蛍光化合物、ナイルレッド、Ｒ－フィコエリトリン、パシフィックブルー、カスケードブルー、テキサスレッド、Ｃｙ５、Ｃｙ３、Ｃｙ７、ヒドロキシクマリン、アミノクマリン及びメトキシクマリンよりなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
前記調製されたナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子は、約１ミクロン未満の平均サイズを有する、請求項３５から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項49】
前記調製されたナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子は、約５００ｎｍ未満の平均サイズを有する、請求項３５から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項50】
前記調製されたナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子は、約１５０ｎｍ未満の平均サイズを有する、請求項３５から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項51】
前記調製されたナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子は、約１００ｎｍ未満の平均サイズを有する、請求項３５から５０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２０年２月１９日に出願された米国仮出願シリアル番号６２／９７８，４９９及び２０２０年１０月８日に出願された米国仮出願シリアル番号６３／０８９，２１０の優先権を主張するものであり、その内容全体を、ここに参照のために取り込む。
本出願は、２０２０年２月１９日に出願された米国仮出願シリアル番号６２／９７８，４９９及び２０２０年１０月８日に出願された米国仮出願シリアル番号６３／０８９，２１０の優先権を主張するものであり、その内容全体を、ここに参照のために取り込む。
【背景技術】
【0002】
環境中及び生体系におけるナノプラスチック及びマイクロプラスチックの存在及び下流への影響を評価することは、非常に重要なニーズである。この問題は深刻化しているにもかかわらず、商業的に入手可能で十分に特性評価されたナノプラスチック及びマイクロプラスチックは極めて限られており（例えば、主にポリスチレン）、このことは人間の健康及び環境への影響を理解する上で重要な前進を阻んでいる。例えば、ナノテクノロジー、医学及び毒性学において、十分に特性評価された基準の重要性は、１０年以上にわたって文献で強調されてきた１－５。
【0003】
社会のプラスチックへの依存度は、２０１６年に３億３，０００万トン以上に達した世界の生産量からも明らかである。プラスチックが有益であることは否定できないものの、幅広い利用の結果、ナノプラスチック及びマイクロプラスチックを含む意図しないプラスチック破片が環境中に大量に存在するという、予期せぬ問題が生じている。２０１０年中に世界の海に流入したプラスチック破片は４８０万～１２７０万トンと推定されている。２０１７年９月には、米国で検査した水道水サンプルの９４％からマイクロプラスチックが報告され、２０１８年３月には検査したボトル水サンプルの９３％から検出された。
【0004】
ナノプラスチック及びマイクロプラスチックは、多くの場合は検出されずに、環境を通して生体系及び製品に浸透することができる。マイクロプラスチックは、貝類、ムール貝、魚、並びに蜂蜜及び海塩を含む製品、さらに飲料水及び飲料にも含まれていることが確認されている。また、これらのナノプラスチック及びマイクロプラスチックからは、製剤添加物及び未反応のモノマーなどの外来化学物質が溶出する可能性がある。飲料水及び食品から見つかる多くのプラスチック関連化学物質は、人間の健康への毒性が知られており、ナノプラスチック、マイクロプラスチック及び関連化学物質に意図せずにさらされた人間の健康へのリスクは不明である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
そのため、生物及び環境中におけるナノプラスチック及びマイクロプラスチックを追跡するための組成物／材料、及びそのような組成物／材料の使用方法の開発が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明概念の一態様によれば、ナノプラスチックポリマー若しくはマイクロプラスチックポリマー、ポリマー複合体又はポリマーマトリックスと、及び蛍光タグ又は放射性タグと、を含むナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子を提供する。
【0007】
本発明概念の別の態様によれば、ナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子を含む参照標準物質を提供する、前記ナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子は、ナノプラスチックポリマー若しくはマイクロプラスチックポリマー、ポリマー複合体又はポリマーマトリックスと、及び蛍光タグ又は放射性タグと、を含む。
【0008】
本発明概念のさらに別の態様によれば、ナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子の環境分散を監視する方法を提供する、前記方法は、本発明概念の参照標準物質を環境に提供するステップと、及び前記標準物質の前記環境中における分散を監視するステップと、を含む、ここで、前記標準物質の分散を監視するステップは、環境からの少なくとも一つのサンプルにおける前記標準物質の存在を検出することを含む。
【0009】
本発明概念のさらに別の態様によれば、対象におけるナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子の分散を監視する方法を提供する、前記方法は、前記対象を本発明概念の参照標準物質に曝露するステップと、及び前記対象における前記標準物質の分散を監視するステップと、を含む、ここで、前記標準物質の分散を監視するステップは、前記対象からの少なくとも一つのサンプルにおける前記標準物質の存在を検出することを含む。
【0010】
本発明概念のさらに別の態様によれば、サンプルにおけるナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子の存在を監視する方法を提供する、前記方法は、ポリマー、ポリマー複合体又はポリマーマトリックス、及び蛍光タグ又は放射性タグを含む、前記ナノプラスチック粒子又は前記マイクロプラスチック粒子を含む標準物質を環境に提供するステップと、及び前記環境から得られたサンプルに前記標準物質が存在するか否かを判断するステップと、を含む。
【0011】
本発明概念のさらに別の態様によれば、ナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子の調製方法を提供する、前記方法は、プラスチックを第１溶媒に溶解してプラスチック溶液を提供するステップと、前記プラスチック溶液を第２溶媒に沈殿させるステップと、及び、前記第１溶媒を蒸発させて前記第２溶媒中に前記ナノプラスチック粒子又は前記マイクロプラスチック粒子の分散液を提供するステップと、を含む。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】ナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子の構造（Ａ）固体、（Ｂ）マトリックス、（Ｃ－Ｄ）トレーサーで機能化されたコアシェル（Ｃ）、又は化学基（Ｄ）を示す。
【図2】本発明概念の実施形態によるポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）ナノプラスチック粒子（１４８ｎｍ）のＳＥＭを示す。
【図3】ローダミンＢ（ＲＢ）を含むＰＥＴナノプラスチック（パネルＡ）及びフルオレセインを含むＰＥＴナノプラスチック（パネルＢ）をＢｅＷｏ栄養膜細胞ｂ３０細胞上（核は青色に染色）で可視化した蛍光画像を示す。
【図4】ＰＥＴ－ＲＢ及びポリスチレン（ＰＳ）アレクサ蛍光体（ＡＦ）４８８ナノ粒子をＢｅＷｏ栄養膜細胞ｂ３０細胞上（核は青色に染色）で可視化した蛍光画像を示す。
【図5】ＰＥＴナノプラスチック粒子及びＰＳナノプラスチック粒子の細胞毒性を調べるＭＴＳアッセイを示す。ＰＥＴナノプラスチックは、代謝活性を測定するＭＴＳアッセイにより、細胞毒性を示すと判断された。
【図6】実施例３に記載されるように調製された例示的なＰＥＴナノプラスチック粒子を示す。
【図7】ＰＥＴ－ＲＢ ＮＰのＳＥＭ画像（パネルＡ）、ＴＥＭ画像（パネルＢ）、及びＤＬＳ曲線（パネルＣ）を示す。
【図8】ＰＥＴ ＮＰ（上）及びＰＥＴ－ＲＢ ＮＰ（下）のＦＴ－ＩＲスペクトルを示す。
【図9】膜統合性（ＬＨＤ放出）（パネルＡ）及び代謝活性（ＭＴＳアッセイ）（パネルＢ）で試験したＰＥＴ－ＮＰ（黒）及びＰＥＴ－ＲＢ ＮＰ（灰色）の細胞毒性を示す。グラフは、平均値±標準偏差を示す。１つのアスタリスクはＰ値 ＜ ０．０５を示し、２つのアスタリスクはＰ値 ＜ ０．００１を示す。
【図10】コントロール（パネルＡ＋Ｅ）、０．００５ｍｇ／ｍＬ（パネルＢ＋Ｆ）、０．０５ｍｇ／ｍＬ（パネルＣ＋Ｇ）、及び０．５ｍｇ／ｍＬのＰＥＴ－ＲＢ ＮＰ（パネルＤ＋Ｈ）に暴露したＲＡＷ２６４．７細胞の明視野（パネルＡ－Ｄ）及び蛍光顕微鏡写真（パネルＥ－Ｈ）を示す。個々の蛍光チャンネルからの画像を、図１４に示す。細胞核を青色チャンネルに、細胞の細胞質を緑色チャンネルに、及びＰＥＴ－ＲＢ ＮＰを赤色チャンネルに、それぞれ表示する。
【図11】ＰＥＴ出発原料のＦＴ－ＩＲスペクトルを示す。
【図12】ＰＥＴ ＮＰ及びＰＥＴ－ＲＢ ＮＰのＢＳＡ０．５ｍｇ／ｍＬ中におけるラマンスペクトルを示す。
【図13】ＰＥＴ－ＮＰ（中）及びＰＥＴ－ＲＢ ＮＰ（下）の作製に使用したＰＥＴ繊維（上）の熱分解ＧＣ／ＭＳクロマトグラムを示す。特徴的なピークのうち４つは、（１）安息香酸ビニル、（２）安息香酸、（３）テレフタル酸ジビニル、及び（４）４－（安息香酸ビニロキシカルボニル）であることが確認された。
【図14】ＰＥＴ－ＲＢ ＮＰに曝露したＲＡＷ２６４．７細胞の蛍光顕微鏡写真であって、コントロール（パネルＡ＋Ｅ＋Ｉ＋Ｍ）、０．００５ｍｇ／ｍＬのＰＥＴ－ＲＢ ＮＰ（パネルＢ＋Ｆ＋Ｊ＋Ｎ）、０．０５ｍｇ／ｍＬのＰＥＴ－ＲＢ ＮＰ（パネルＣ＋Ｇ＋Ｋ－Ｏ）、０．５ｍｇ／ｍＬのＰＥＴ－ＲＢ ＮＰ（パネルＤ＋Ｈ＋Ｌ＋Ｐ）における３つの蛍光チャネル（パネルＡ～Ｄ）、ＰＥＴ－ＲＢ ＮＰ（パネルＥ～Ｈ）、細胞の細胞質（パネルＩ～Ｌ）、及び核（パネルＭ～Ｐ）の重畳画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【0013】
次に、本発明の前述及び他の態様を、本明細書に記載された他の実施形態に関してより詳細に説明する。本発明は、異なる形態で具現化することができ、本明細書に記載された実施形態に限定されると解釈すべきではないことを理解されたい。むしろ、これらの実施形態は、本開示が徹底的かつ完全なものとなり、当業者に本発明の範囲を完全に伝えるように提供されるものである。
【0014】
本明細書の発明の説明で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のみで使用され、本発明を限定することを意図するものではない。本発明の説明及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数形も含むことが意図される。さらに、本明細書で使用される場合、用語「及び／又は」は、関連する列挙された項目の１つ以上の任意及びすべての組み合わせを含み、「／」と略記する場合がある。
【0015】
本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、その通常の意味に加えて、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」及び／又は「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」という表現を含むこともでき、いくつかの実施形態では特にそのように言及することもできる。したがって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という表現は、いくつかの実施形態において、請求項に含まれる具体的に列挙された要素であってさらなる要素を含まないもの、及び、請求項に含まれる具体的に列挙された要素がさらなる要素を包含してもよい及び／又は包含する実施形態、又は特許請求の範囲に記載された要素が、特許請求の範囲に記載された基本的かつ新規な特性に重大な影響を与えないさらなる要素を包含する可能性がある実施形態も指し得る。例えば、組成物、調合、方法、システムなど、特許請求の範囲に記載された要素がリストされた要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」ということはまた、例えば、組成物、調合、方法、キットなどの特許請求の範囲に記載された要素がさらなる要素を含まない「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という意味と、及び組成物、調合、方法、キットなどの特許請求の範囲に記載された要素が、特許請求の範囲に記載された要素の基本的かつ新規的特性（複数可）に実質的に影響を与えないさらなる要素を含むことができる「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という意味と、を含包する。
【0016】
「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、一般に、記載された数値と同等である、又は同じ機能若しくは結果を有すると当業者が考える数値の範囲を指す。例えば、「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、記載された数値と同等である、又は同じ機能若しくは結果を有すると当業者が考えるであろう数値に応じて、示された数値の±１％、±２％、±５％、±１０％、±１５％又は±２０％の範囲を指す場合がある。さらに、いくつかの実施形態では、「約（ａｂｏｕｔ）」という用語によって修飾された数値は、言及された数値「ちょうど（ｅｘａｃｔｌｙ）」である数値も場合がある。また、修飾されずに提示されたいずれの数値も、言及された数値の「約（ａｂｏｕｔ）」の数値及び言及された数値「ちょうど（ｅｘａｃｔｌｙ）」である数値を含むことが理解されるであろう。同様に、「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」という用語は、完全にではないが大部分は同じ形態、方法又は程度を意味し、特定の要素は、当業者が同じ機能又は結果を有すると考えるような構成の範囲を有するであろう。特定の要素が「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」という用語の使用によって近似的に表現される場合、その特定の要素は別の実施形態を形成することが理解されるであろう。
【0017】
本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、他に定義されない限り、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者が一般に理解するものと同じ意味を有する。
【0018】
（組成物）
本発明概念の実施形態には、化学的に設計され、参照標準物質として使用できる形状に加工された人工ナノプラスチック粒子及び／又はマイクロプラスチック粒子が含まれる。我々は、これらの材料が生体内で使用できることを実証した。
本発明概念の実施形態には、化学的に設計され、参照標準物質として使用できる形状に加工された人工ナノプラスチック粒子及び／又はマイクロプラスチック粒子が含まれる。我々は、これらの材料が生体内で使用できることを実証した。
【0019】
前記ナノプラスチック粒子及びマイクロプラスチック粒子の材料は、ポリマー、ポリマー複合体又はポリマーマトリックスであり得る。いくつかの実施形態では、前記ナノプラスチック粒子及び／又はマイクロプラスチック粒子は、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレン（ＰＥ）、高密度ＰＥ（ＨＤＰＥ）、低密度ＰＥ（ＬＤＰＥ）、線状低密度ポリエチレン（ＬＬＤＰＥ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリアミド（ＰＡ）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリオキシメチレン（ＰＯＭ）、ポリウレタン（ＰＵＲ）、シリコン、ナイロン又はアクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）を含む。いくつかの実施形態では、前記ポリマー、ポリマー複合体又はポリマーマトリックスは、ＰＥＴを含む。いくつかの実施形態では、前記ポリマー、ポリマー複合体又はポリマーマトリックスは、ＰＳを含む。
【0020】
いくつかの実施形態では、前記ナノプラスチック粒子及びマイクロプラスチック粒子は、ボトムアップアプローチによって調製される。いくつかの実施形態では、前記ナノプラスチック粒子及びマイクロプラスチック粒子は、トップダウンアプローチによって調製される。ナノプラスチック粒子及びマイクロプラスチック粒子を調製する方法には、自己集合、凝縮、核形成、コロイド法、ゾル－ゲル処理、油－水のマイクロマルジョン、水熱合成、ポリオール法、ソノケミカル法、乳化重合、分散重合、及びマイクロエマルジョンポリマーが含まれるが、これらに限定されるものではない。特定の実施形態では、前記粒子は、連鎖成長重合によって調製される。粒子を調製するための連鎖成長重合の非限定的な例としては、ラジカル連鎖重合、アニオン連鎖重合、及びカチオン連鎖重合を含む。１つの非限定的な例では、前記粒子の材料は、１つ以上のアクリレート又はビニル官能基を含むモノマーのラジカル連鎖重合を使用して調製される。
【0021】
前記粒子は、化学的プロセス、物理化学的プロセス、物理機械的プロセス、又はそれらの組合せを用いて調製することができる。粒子を調製するための化学的プロセスの非限定的な例には、懸濁重合、乳化重合、分散重合、重縮合重合、及びそれらの組み合わせが含まれる。粒子を調製するための物理化学的プロセスの非限定的な例には、コアセルベーション、レイヤーバイレイヤーアセンブリ、ゾルゲルカプセル化、超臨界ＣＯ２カプセル化、及びそれらの組み合わせが含まれる。粒子を調製するための物理機械的プロセスの非限定的な例には、噴霧乾燥、多重ノズル乾燥、流動層コーティング、遠心分離技術、真空カプセル化、静電カプセル化、及びこれらの組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態では、コア－シェル粒子は、コアと周囲の溶液との間の界面における２つの非混和性モノマー間の界面反応によって形成される。
【0022】
本発明概念のナノプラスチック粒子及び／又はマイクロプラスチック粒子の調製方法は、プラスチックを第１溶媒に溶解してプラスチック溶液を提供するステップと、前記プラスチック溶液を第２溶媒に沈殿させるステップと、及び、前記第１溶媒を蒸発させて前記第２溶媒中にナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子の分散液を提供するステップと、を含んでもよい。溶解、沈殿及び／又は蒸発の方法／技術は特に限定されず、当業者に理解され得る任意の方法／技術を使用して実施してよい。
【0023】
いくつかの実施形態において、前記プラスチックは、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレン（ＰＥ）、高密度ＰＥ（ＨＤＰＥ）、低密度ＰＥ（ＬＤＰＥ）、線状低密度ポリエチレン（ＬＬＤＰＥ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリアミド（ＰＡ）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリオキシメチレン（ＰＯＭ）、ポリウレタン（ＰＵＲ）、シリコン、ナイロン、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、又はそれらの任意の組合せのうちの１つであってよいが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記プラスチックはＰＥＴである。いくつかの実施形態において、前記第１溶媒は、フェノール、ＤＭＳＯ、ニトロベンゼン、ｏ－クロロフェノール、ｏ－クレゾール、ジフェニルアミン、ジクロロメタン、ＨＦＩＰ、又はそれらの任意の組み合わせのいずれかであってよいが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記溶媒はＨＦＩＰである。いくつかの実施形態において、前記プラスチック溶液は、約０．１重量％～約０．５重量％の間の濃度／量でプラスチックを含んでもよいが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、第２溶媒は、水であってよいが、これに限定されない。
【0024】
前記プラスチック溶液の沈殿は、例えば、前記プラスチック溶液を、例えば、約０．１ｍＬ／分及び約５ｍＬ／分の速度で前記第２溶媒に加えることによって、前記第２溶媒中で前記プラスチック溶液を沈殿させることで行ってもよいが、この速度に限定されるものではない。いくつかの実施形態では、前記プラスチック溶液は、約１ｍＬ／分の速度で前記第２溶媒に添加される。
【0025】
本発明概念のナノプラスチック粒子及び／又はマイクロプラスチック粒子を調製する方法に従って溶解及び／又は沈殿させる際に用いられる前記溶液／溶媒の量及び温度は、本発明概念の方法を実行するために当業者によって想定される任意の量及び／又は温度であってよい。例えば、前記プラスチック溶液は約１０ｍＬの量を有していてもよく、前記第２溶媒は約５０ｍＬ～約５０００ｍＬの量を有していてもよく、前記第２溶媒は約０℃～約２０℃の温度を有していてもよい。
【0026】
本発明概念の粒子は、生物学的材料を通した前記粒子の監視を可能にするように改変することができる。いくつかの実施形態では、前記プラスチック粒子は、ポリマーマトリックスを通して分散された蛍光タグを含む。蛍光タグの非限定的な例としては、ローダミンＢ（ＲＢ）などのローダミン、フルオレセイン、アレクサ蛍光化合物、ナイルレッド、Ｒ－フィコエリトリン、パシフィックブルー、カスケードブルー、テキサスレッド、Ｃｙ５、Ｃｙ３、Ｃｙ７、ヒドロキシクマリン、アミノクマリン、メトキシクマリンなどが含まれる。１つの非限定的な例では、前記蛍光化合物は、バイオコンジュゲートである。他の実施形態では、前記粒子は、例えば、１４Ｃ又は３Ｈなどの放射性タグ又はラベルを有していてもよいが、これらに限定されるものではない。本明細書に記載されるように改変された本発明概念の粒子は、例えば、本明細書に記載されるような蛍光タグを有する第１溶媒にプラスチックを溶解させることによって調製することができる。
【0027】
標識粒子システムの構造には、固体、マトリックス、又は表面機能化が含まれる（図１）。１つの非限定的な例では、前記ナノプラスチック粒子は、ポリマーマトリックス全体に分散された蛍光トレーサーを有するマトリックス様式である。別の非限定的な例では、前記ナノプラスチック粒子は表面機能化されており、前記粒子の前記表面と関連する蛍光トレーサーを有する。表面機能化はまた、化学基を含むことができる。そのような化学基の非限定的な例は、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＯ－、－ＮＨ３
＋、－ＮＨ２、－ＯＨ、－ＰＥＧ、ストレプトアビジン、ストレプトアビジン・ビオチン複合体、抗体などである。本発明概念の実施形態によるナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子の形態の非限定的な例には、球体、繊維、ロッド及びデンドリマーが含まれる。
【0028】
いくつかの実施形態では、粒子径又は平均粒子径は、約１ミクロン未満、約０．９ミクロン未満、約０．８ミクロン未満、約０．７ミクロン未満、約０．６ミクロン未満、約０．５ミクロン未満、約０．４ミクロン未満、約０．３ミクロン未満、約０．２ミクロン未満、又は約０．１ミクロン未満である。いくつかの実施形態では、前記粒子径又は平均粒子径は、５００ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、前記粒子径又は平均粒子径は、２００ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、前記粒子径又は平均粒子径は、１５０ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、前記粒子径又は平均粒子径は、１００ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、本発明概念の粒子は、環境中に見出されるナノプラスチック粒子及び／又はマイクロプラスチック粒子の粒径分布を代表するサイズにされる。
【0029】
いくつかの実施形態では、作製されたナノプラスチック粒子及び／又はマイクロプラスチック粒子、例えば、ＰＥＴナノプラスチック粒子を提供する。本発明概念のＰＥＴ粒子システムは、生体系での使用を可能にする水性懸濁液に留まることができる。
【0030】
（方法）
本発明概念の他の実施形態では、例えば、環境、生体系及び／又は生命体に分散したナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子などのナノプラスチック又はマイクロプラスチックの存在及び／又は分散を監視するための方法を提供する。本方法の性質は特に限定されず、当業者によって理解され得る任意の監視方法であってよい。例えば、ナノプラスチック又はマイクロプラスチックを監視する方法は、本開示の精神から逸脱することなく、インビトロ、インサイチュ、インビボ、又はエクスビボの方法であってよい。ナノプラスチック又はマイクロプラスチックの存在及び／又は分散を監視することは、サンプルを提供すること又は環境又は生体系からサンプルを取得すること、及びナノプラスチック又はマイクロプラスチックが前記サンプルに存在するかどうかを定性的又は定量的に決定／検出することを含んでもよい。
本発明概念の他の実施形態では、例えば、環境、生体系及び／又は生命体に分散したナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子などのナノプラスチック又はマイクロプラスチックの存在及び／又は分散を監視するための方法を提供する。本方法の性質は特に限定されず、当業者によって理解され得る任意の監視方法であってよい。例えば、ナノプラスチック又はマイクロプラスチックを監視する方法は、本開示の精神から逸脱することなく、インビトロ、インサイチュ、インビボ、又はエクスビボの方法であってよい。ナノプラスチック又はマイクロプラスチックの存在及び／又は分散を監視することは、サンプルを提供すること又は環境又は生体系からサンプルを取得すること、及びナノプラスチック又はマイクロプラスチックが前記サンプルに存在するかどうかを定性的又は定量的に決定／検出することを含んでもよい。
【0031】
前記環境系又は生体系の性質は、特に限定されない。例えば、前記環境系又は生体系は、海洋、淡水、又は陸上の環境であってもよく、若しくは海洋、淡水、又は陸上の生体系であってもよい。前記生体系には、生物学的生命体が含まれてもよく、例えば、海洋性、淡水性、又は陸上性の生命体であってもよい。前記生命体は、本発明概念の範囲から逸脱することなく、単細胞又は多細胞であってもよく、植物生命体又は動物生命体であってもよい。いくつかの実施形態では、前記動物生命体は、哺乳類生命体であってもよく、例えば、げっ歯類、霊長類、又はヒトの生命体であってもよいが、これらに限定されない。ナノプラスチック又はマイクロプラスチックの存在及び／又は分散は、当業者に理解されるであろう任意の、例えばインビトロ、インサイチュ、インビボ、若しくはエクスビボの方法、又はそれらの任意の組み合わせによって監視してもよい。いくつかの実施形態では、生命体から採取されるサンプルは、ナノプラスチック及び／又はマイクロプラスチックの存在及び／又は分散について分析可能な糞便又は廃棄物サンプル、器官又は組織サンプル及び／又は胎盤サンプルを含み得るが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、前記環境又は生体系は、サンプルが採取できてナノプラスチック及び／又はマイクロプラスチックの存在及び／又は分散について分析可能な土壌、堆積物又は水を含んでもよい。いくつかの実施形態では、食品及び／又は消費者製品からサンプルを採取して、ナノプラスチック及び／又はマイクロプラスチックの存在及び／又は分散について分析してもよい。
【0032】
ナノプラスチック及び／又はマイクロプラスチックの存在及び／又は分散を監視する方法は、例えば、高分解能熱分解ＧＣ－ＭＳ等の分析方法を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ナノプラスチック及び／又はマイクロプラスチックの存在及び／又は分散の監視は、本明細書に記載のように、蛍光標識されたナノプラスチック及び／又はマイクロプラスチック参照標準物質によって放射される蛍光を追跡することを含んでもよい。他の実施形態では、ナノプラスチック及び／又はマイクロプラスチックの存在及び／又は分散の監視は、本明細書に記載されるように、放射性標識されたナノプラスチック及び／又はマイクロプラスチック参照標準物質によって放射された放射能を追跡することを含んでもよい。
【0033】
本発明の様々な態様を説明してきたが、これらを以下の実施例においてさらに詳細に説明する。これらの実施例は、説明のためにのみ本明細書に含まれ、本発明を限定することを意図していない。
【0034】
（実施例１）
（ＰＥＴナノプラスチック粒子の作製）
ＰＥＴ繊維及びヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）から、ＰＥＴ溶液を作製した。次に、前記溶液を、ビーカー内の０℃に冷却した純水（すなわち、非溶媒と溶媒の比率が７：１）中に沈殿させた。その後、沈殿容器の全内容を３７℃の真空下で回転蒸発させて、残存するすべてのＨＦＩＰを蒸留除去した。その水分散したＰＥＴナノプラスチック粒子を、遠心分離によって回収した。ナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子を、ＳＥＭ又は明視野顕微鏡で画像化した。流体力学的直径を、動的光散乱（ＤＬＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ－ＺＳ， Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製）によって特性評価した。マイクロプラスチック粒子の直径を、Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ ２０００（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ－ＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製）を使用して測定した。本明細書に記載される方法で調製した１４８ｎｍのＰＥＴナノプラスチック粒子の走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）を、図２に例示する。
（ＰＥＴナノプラスチック粒子の作製）
ＰＥＴ繊維及びヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）から、ＰＥＴ溶液を作製した。次に、前記溶液を、ビーカー内の０℃に冷却した純水（すなわち、非溶媒と溶媒の比率が７：１）中に沈殿させた。その後、沈殿容器の全内容を３７℃の真空下で回転蒸発させて、残存するすべてのＨＦＩＰを蒸留除去した。その水分散したＰＥＴナノプラスチック粒子を、遠心分離によって回収した。ナノプラスチック粒子又はマイクロプラスチック粒子を、ＳＥＭ又は明視野顕微鏡で画像化した。流体力学的直径を、動的光散乱（ＤＬＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ－ＺＳ， Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製）によって特性評価した。マイクロプラスチック粒子の直径を、Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ ２０００（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ－ＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製）を使用して測定した。本明細書に記載される方法で調製した１４８ｎｍのＰＥＴナノプラスチック粒子の走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）を、図２に例示する。
【0035】
（実施例２）
（蛍光トレーサーを内包したＰＥＴナノプラスチック粒子の作製）
ＰＥＴ繊維及びヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）からＰＥＴ溶液を作製した。製剤は、微量のフルオレセイン又はローダミンＢを含んでいた。前記溶液を、ビーカー内の０℃に冷却した純水（すなわち、非溶媒と溶媒の比率が７：１）中に沈殿させた。その後、沈殿容器の全内容を３７℃の真空下で回転蒸発させて、残存するすべてのＨＦＩＰを蒸留除去した。その水分散したＰＥＴナノプラスチック粒子を、遠心分離によって回収した。前記ＰＥＴナノプラスチック粒子を、蛍光顕微鏡によって画像化する（図３）。
（蛍光トレーサーを内包したＰＥＴナノプラスチック粒子の作製）
ＰＥＴ繊維及びヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）からＰＥＴ溶液を作製した。製剤は、微量のフルオレセイン又はローダミンＢを含んでいた。前記溶液を、ビーカー内の０℃に冷却した純水（すなわち、非溶媒と溶媒の比率が７：１）中に沈殿させた。その後、沈殿容器の全内容を３７℃の真空下で回転蒸発させて、残存するすべてのＨＦＩＰを蒸留除去した。その水分散したＰＥＴナノプラスチック粒子を、遠心分離によって回収した。前記ＰＥＴナノプラスチック粒子を、蛍光顕微鏡によって画像化する（図３）。
【0036】
（実施例３）
（ナノプラスチック及びマイクロプラスチックの人間の健康に関する生物学的影響）
マイクロプラスチックは、貝類、ムール貝、魚、及び蜂蜜並びに海塩を含む製品、さらには飲料水及び飲料にも含まれていることが確認されている。環境及び消費者製品に存在するマイクロプラスチックの健康への影響は不明である。
（ナノプラスチック及びマイクロプラスチックの人間の健康に関する生物学的影響）
マイクロプラスチックは、貝類、ムール貝、魚、及び蜂蜜並びに海塩を含む製品、さらには飲料水及び飲料にも含まれていることが確認されている。環境及び消費者製品に存在するマイクロプラスチックの健康への影響は不明である。
【0037】
（目的）
本プロジェクトの目的は、摂取されたナノプラスチック粒子及びマイクロプラスチック粒子（ＮＭＰｓ）、並びにその粒子から放出された付随するプラスチック関連の外因性化学物質（例えば、可塑剤及び汚染物質）が、インビトロ及びインビボでどのように生体系と相互作用するかを調査することである。目標は、これらの複合材料への曝露に関連する人間の健康へのリスクを調査することである。我々は、ＮＭＰｓ及び放出されたプラスチック関連化学物質の両方が、摂取後に生体系に影響を及ぼすと仮定している。したがって、ＮＭＰｓの暴露研究は、他のナノ材料及びマイクロ材料の暴露研究と異なるが、これは、粒子の結末と関連化学物質の結末とを同等に考慮する必要があるためである。
本プロジェクトの目的は、摂取されたナノプラスチック粒子及びマイクロプラスチック粒子（ＮＭＰｓ）、並びにその粒子から放出された付随するプラスチック関連の外因性化学物質（例えば、可塑剤及び汚染物質）が、インビトロ及びインビボでどのように生体系と相互作用するかを調査することである。目標は、これらの複合材料への曝露に関連する人間の健康へのリスクを調査することである。我々は、ＮＭＰｓ及び放出されたプラスチック関連化学物質の両方が、摂取後に生体系に影響を及ぼすと仮定している。したがって、ＮＭＰｓの暴露研究は、他のナノ材料及びマイクロ材料の暴露研究と異なるが、これは、粒子の結末と関連化学物質の結末とを同等に考慮する必要があるためである。
【0038】
（方法）
（ＰＥＴナノプラスチック粒子の作製）
０．２５ｇのＰＥＴ繊維及び１５ｍＬのヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ，ＣＡＳ＃９２０－６６－１）を０．５インチの撹拌子を有するシンチレーションバイアル内にて混合することによって、１．６７％（ｖ：ｖ）のＰＥＴ溶液を調製した。フルオレセイン又はローダミンＢを含む製剤を同じ方法で調製して、さらに０．０００１重量％の濃度で色素を添加した。次に、前記製剤を６００ｒｐｍで１０分間撹拌して、透明な溶液、又は色素が含まれている場合には着色された溶液を得た。次に、各溶液を、５００ｍＬビーカー内の０℃の冷却したＤＩ水１０５ｍＬ（すなわち、非溶媒と溶媒の比率が７：１）中に沈殿させた。前記冷却したＤＩ水を２インチの磁気撹拌子で急速に撹拌し、ＨＦＩＰ溶液を滴下して、粒子の白濁した分散液を生成した。その後、沈殿容器の全内容を３７℃の真空下で回転蒸発させて、全ての残存するＨＦＩＰを蒸留除去した。その水分散ＰＥＴナノ粒子を、４０００ｇで１０分間遠心分離して、５０ｍｌの遠心チューブの底に密集した微粒子のペレットを得た。その後、水の大部分をデカンテーションで取り除き、そのスラリーを走査型電子顕微鏡及びＤＬＳ分析で分析して、粒子径及び多分散性を判断した。上記のように調製されたＰＥＴナノプラスチック粒子を図６に示す。
（ＰＥＴナノプラスチック粒子の作製）
０．２５ｇのＰＥＴ繊維及び１５ｍＬのヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ，ＣＡＳ＃９２０－６６－１）を０．５インチの撹拌子を有するシンチレーションバイアル内にて混合することによって、１．６７％（ｖ：ｖ）のＰＥＴ溶液を調製した。フルオレセイン又はローダミンＢを含む製剤を同じ方法で調製して、さらに０．０００１重量％の濃度で色素を添加した。次に、前記製剤を６００ｒｐｍで１０分間撹拌して、透明な溶液、又は色素が含まれている場合には着色された溶液を得た。次に、各溶液を、５００ｍＬビーカー内の０℃の冷却したＤＩ水１０５ｍＬ（すなわち、非溶媒と溶媒の比率が７：１）中に沈殿させた。前記冷却したＤＩ水を２インチの磁気撹拌子で急速に撹拌し、ＨＦＩＰ溶液を滴下して、粒子の白濁した分散液を生成した。その後、沈殿容器の全内容を３７℃の真空下で回転蒸発させて、全ての残存するＨＦＩＰを蒸留除去した。その水分散ＰＥＴナノ粒子を、４０００ｇで１０分間遠心分離して、５０ｍｌの遠心チューブの底に密集した微粒子のペレットを得た。その後、水の大部分をデカンテーションで取り除き、そのスラリーを走査型電子顕微鏡及びＤＬＳ分析で分析して、粒子径及び多分散性を判断した。上記のように調製されたＰＥＴナノプラスチック粒子を図６に示す。
【0039】
（ナノプラスチック粒子及びマイクロプラスチック粒子の特性評価）
ナノプラスチック粒子及びマイクロプラスチック粒子を、ＳＥＭ又は蛍光顕微鏡によって画像化した。その流体力学的直径を、動的光散乱（ＤＬＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ－ＺＳ， Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製）によって特性評価した。マイクロプラスチック粒子の直径を、Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ ２０００（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ－ＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製）を使用して測定した。
ナノプラスチック粒子及びマイクロプラスチック粒子を、ＳＥＭ又は蛍光顕微鏡によって画像化した。その流体力学的直径を、動的光散乱（ＤＬＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ－ＺＳ， Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製）によって特性評価した。マイクロプラスチック粒子の直径を、Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ ２０００（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ－ＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製）を使用して測定した。
【0040】
（結果）
ナノプラスチック粒子及びマイクロプラスチック粒子のライブラリの作成を、材料の製造及び調達によって開始した。各材料を特性評価して、実験動物への経口投与に適したビヒクルに配合した。図４は、ＢｅＷｏのｂ３０細胞上のＰＥＴ－ＲＢ ＮＰの画像を示す。図５は、ＰＥＴナノプラスチック粒子及びＰＳナノプラスチック粒子に曝露された栄養膜細胞における代謝活性を測定するＭＴＳアッセイを示す。ＰＥＴナノプラスチック粒子は、細胞毒性反応を誘導することが観察されたが、ＰＳナノプラスチック粒子はこれを誘導しなかった。
ナノプラスチック粒子及びマイクロプラスチック粒子のライブラリの作成を、材料の製造及び調達によって開始した。各材料を特性評価して、実験動物への経口投与に適したビヒクルに配合した。図４は、ＢｅＷｏのｂ３０細胞上のＰＥＴ－ＲＢ ＮＰの画像を示す。図５は、ＰＥＴナノプラスチック粒子及びＰＳナノプラスチック粒子に曝露された栄養膜細胞における代謝活性を測定するＭＴＳアッセイを示す。ＰＥＴナノプラスチック粒子は、細胞毒性反応を誘導することが観察されたが、ＰＳナノプラスチック粒子はこれを誘導しなかった。
【0041】
（結論）
（ＰＥＴの作製及びプラスチック粒子ライブラリ）
・ 造影剤添加及び非添加のＰＥＴナノプラスチック粒子及びナノプラスチック繊維の作製に成功した。
（ＰＥＴの作製及びプラスチック粒子ライブラリ）
・ 造影剤添加及び非添加のＰＥＴナノプラスチック粒子及びナノプラスチック繊維の作製に成功した。
【0042】
・ ベンチマークとなる標準物質の生命力を捉えるためのプラスチック粒子ライブラリを開始した。
【0043】
（ナノプラスチック粒子及び関連化学物質の生物学的影響）
・ 蛍光顕微鏡画像は、ＰＥＴナノプラスチック粒子及びＰＳナノプラスチック粒子が栄養膜細胞によって取り込まれることを示す（図４）。
・ 蛍光顕微鏡画像は、ＰＥＴナノプラスチック粒子及びＰＳナノプラスチック粒子が栄養膜細胞によって取り込まれることを示す（図４）。
【0044】
・ ＰＥＴナノプラスチック粒子は、栄養膜細胞において細胞毒性反応を誘発したが、ＰＳナノプラスチック粒子はこれを誘発しなかった（図５）。
【0045】
（意義）
ナノプラスチック及びマイクロプラスチック、並びにそれらの健康への影響の可能性に対する連邦政府及び国民の関心は急速に高まっている。連邦政府機関は、ナノプラスチック及びマイクロプラスチックの有効な検出方法、特性評価方法並びに基準の必要性を強調している。
ナノプラスチック及びマイクロプラスチック、並びにそれらの健康への影響の可能性に対する連邦政府及び国民の関心は急速に高まっている。連邦政府機関は、ナノプラスチック及びマイクロプラスチックの有効な検出方法、特性評価方法並びに基準の必要性を強調している。
【0046】
・ 海洋環境保護の科学的側面に関する合同専門家グループ（ＧＥＳＡＭＰ）、２０１０年：マイクロプラスチックの分布及び結末に関する知識は、明らかになり始めたばかりである。１
【0047】
・ 欧州食品安全機関（ＥＦＳＡ）、２０１６年：報告書”Ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏｐｌａｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｎａｎｏｐｌａｓｔｉｃｓ ｉｎ ｆｏｏｄ， ｗｉｔｈ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ ｆｏｃｕｓ ｏｎ ｓｅａｆｏｏｄ（特に魚介類に注目した、食品中のマイクロプラスチック及びナノプラスチックの存在）”を発表して、ヒトの消化（ＧＩ）管におけるマイクロプラスチックの分解及びナノプラスチック形成の可能性に関する研究と同様に、ＧＩ管における局所的な影響に関する研究を含むトキシコキネティクス及び毒性に関する研究が必要である、と結論付けている。２
【0048】
・ 米国環境保護庁（ＥＰＡ）、２０１７年：２０１７年６月に、１）方法のニーズ、２）マイクロプラスチックの発生源、輸送、結末のニーズ、３）生態評価のニーズ、４）人間の健康評価のニーズ、の４つの分野に焦点を当てたマイクロプラスチック専門家ワークショップを開催した。３
【0049】
・ 世界保健機関（ＷＨＯ）、２０１９年：「世界保健機関（ＷＨＯ）は本日、飲料水中のマイクロプラスチックに関する現在の研究の分析の発表を受け、環境中のマイクロプラスチック及びその人間の健康への影響の可能性についてさらなる評価を行うよう求める」４
【0050】
・ Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ （ＮＳＦ） － Ｔｏｐｉｃｓ ｆｏｒ ＦＹ ２０２０ Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ （ＮＳＦ １９－５９９）， ２０１９： “Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｄ－ｏｆ－Ｌｉｆｅ Ｐｌａｓｔｉｃｓ （Ｅ３Ｐ）： …Ｔｈｅｉｒ ｉｎｈｅｒｅｎｔ ｄｕｒａｂｉｌｉｔｙ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｅｖｅｒ－ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｌａｎｄｆｉｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ， ｗｈｅｒｅ ｔｈｅｙ ｅｖｅｎｔｕａｌｌｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｎｔｏ ｍｉｃｒｏｐｌａｓｔｉｃｓ ｔｈａｔ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅ ｗａｔｅｒｗａｙｓ， ｗｉｌｄｌｉｆｅ， ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｂｏｄｉｅｓ．（全米科学財団（ＮＳＦ）－２０２０年度の研究及びイノベーションの新領域 （ＮＳＦ １９－５９９）のトピックス、２０１９年：「使用済みプラスチックをなくす技術（Ｅ３Ｐ）：・・・その固有の耐久性は、埋立地及び環境での蓄積をますます増大させ、最終的にはマイクロプラスチックに断片化して、水路、野生生物及び人体を汚染する。」）
【0051】
・ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒａｍ （ＮＴＰ， ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ａｔ ｗｏｒｋｓｈｏｐ） Ｏｃｔ． ２０１９： Ｗｈａｔ ｎａｎｏｐｌａｓｔｉｃｓ ａｒｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｐｌａｓｔｉｃｓ．（米国国家毒性プログラム（ＮＴＰ、ワークショップでの発表）２０１９年１０月：環境中に存在するナノプラスチック及びマイクロプラスチックとは。）
【0052】
・ 食品医薬品局（ＦＤＡ ｗｈａｔ ａｒｅ ｗｅ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ？ Ｉｆ ｗｅ ｃａｎ ｄｅｔｅｃｔ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｅ ｎａｎｏｐｌａｓｔｉｃｓ ｗｅ ｃａｎ ｄｅｔｅｃｔ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｅ， ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ａｔ ＮＳＦ ｗｏｒｋｓｈｏｐ）Ｄｅｃ． ２０１９： Ｔｈｅｒｅ ｉｓ ａ ｎｅｅｄ ｆｏｒ ｖａｌｉｄａｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｐｌａｓｔｉｃｓ．（（ＦＤＡ、私たちは何にさらされているのか？ナノプラスチックの検出及び分析ができれば、検出及び分析ができる。ＮＳＦワークショップでの発表）２０１９年１２月：マイクロプラスチックの検出及び特性評価における有効な方法及び基準が必要である。）
【0053】
現在、ベンチマークとなるナノプラスチック及びマイクロプラスチックが不足しており、このことは有効な検出方法及び特性評価方法の開発という課題を提起している。この限界は、本明細書に記載されているナノプラスチック粒子及びマイクロプラスチック粒子を作製することによって対応される。
【0054】
参考文献
１．ＧＥＳＡＭＰ， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＧＥＳＡＭＰ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｏｎ Ｍｉｃｒｏｐｌａｓｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ａ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ， ｂｉｏａｃｃｕｍｕｌａｔｉｎｇ ａｎｄ ｔｏｘｉｃ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｏｃｅａｎ． ２０１０， Ｔｈｅ Ｊｏｉｎｔ Ｇｒｏｕｐ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｔｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｍａｒｉｎｅ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ
２．ＥＦＳＡ， Ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏｐｌａｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｎａｎｏｐｌａｓｔｉｃｓ ｉｎ ｆｏｏｄ， ｗｉｔｈ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ ｆｏｃｕｓ ｏｎ ｓｅａｆｏｏｄ． ＥＦＳＡ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０１６． １４（６）： ｐ． ４５０１．
３．ＥＰＡ， Ｍｉｃｒｏｐｌａｓｔｉｃｓ Ｅｘｐｅｒｔ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ Ｒｅｐｏｒｔ － Ｔｒａｓｈ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒｓ Ｄｉａｌｏｇｕｅ Ｍｅｅｔｉｎｇ． ２０１８．
４．ＷＨＯ， Ｍｉｃｒｏｐｌａｓｔｉｃｓ ｉｎ ｄｒｉｎｋｉｎｇ－ｗａｔｅｒ． ２０１９．
１．ＧＥＳＡＭＰ， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＧＥＳＡＭＰ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｏｎ Ｍｉｃｒｏｐｌａｓｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ａ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ， ｂｉｏａｃｃｕｍｕｌａｔｉｎｇ ａｎｄ ｔｏｘｉｃ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｏｃｅａｎ． ２０１０， Ｔｈｅ Ｊｏｉｎｔ Ｇｒｏｕｐ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｔｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｍａｒｉｎｅ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ
２．ＥＦＳＡ， Ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏｐｌａｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｎａｎｏｐｌａｓｔｉｃｓ ｉｎ ｆｏｏｄ， ｗｉｔｈ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ ｆｏｃｕｓ ｏｎ ｓｅａｆｏｏｄ． ＥＦＳＡ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０１６． １４（６）： ｐ． ４５０１．
３．ＥＰＡ， Ｍｉｃｒｏｐｌａｓｔｉｃｓ Ｅｘｐｅｒｔ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ Ｒｅｐｏｒｔ － Ｔｒａｓｈ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒｓ Ｄｉａｌｏｇｕｅ Ｍｅｅｔｉｎｇ． ２０１８．
４．ＷＨＯ， Ｍｉｃｒｏｐｌａｓｔｉｃｓ ｉｎ ｄｒｉｎｋｉｎｇ－ｗａｔｅｒ． ２０１９．
【0055】
（実施例４）
（哺乳類細胞での研究のための蛍光トレーサー付きポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）ナノ粒子の作製）
ここでは、簡単なボトムアップ作製アプローチを使用した、緻密なサイズ分布を有するＰＥＴＮＰの合成について報告する。さらに、ＮＰに蛍光トレーサーを組み込むことで、哺乳類細胞内におけるこれらのＰＥＴ ＮＰの可視化及び特性評価が可能になることを示す。
（哺乳類細胞での研究のための蛍光トレーサー付きポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）ナノ粒子の作製）
ここでは、簡単なボトムアップ作製アプローチを使用した、緻密なサイズ分布を有するＰＥＴＮＰの合成について報告する。さらに、ＮＰに蛍光トレーサーを組み込むことで、哺乳類細胞内におけるこれらのＰＥＴ ＮＰの可視化及び特性評価が可能になることを示す。
【0056】
（材料及び方法）
（ＰＥＴ ＮＰｓの作製）
磁気撹拌子を備えた４０ｍＬのシンチレーションバイアルで、ＰＥＴ繊維（ＩＺＯ Ｈｏｍｅ Ｇｏｏｄｓ）０．５８ｇ及びヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）３５ｍＬを混合して、ＰＥＴ溶液を調製した。前記ＰＥＴ溶液（１０ｍＬ）を、Ｐｏｕｌｔｅｎ ＆ Ｇｒａｆ ＧｍｂＨ社製Ｆｏｒｔｕｎａ（登録商標）Ｏｐｔｉｍａ（登録商標）１０－ｍＬガラスシリンジ付きシリンジポンプ（Ｍｏｄｅｌ ＃ ＮＥ－３００， Ｎｅｗ Ｅｒａ Ｐｕｍｐ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ社製、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ， ＮＹ， ＵＳＡ）を使用して室温で超純水（７５ｍＬ、抵抗力１８．２ＭΩ－ｃｍ）に１ｍＬ／ｍｉｎで滴下して、ＰＥＴ ＮＰｓを沈殿させた。沈殿槽の全内容物を２５０ｍＬの丸底フラスコに移し、５５℃の真空下で回転蒸発させて、残留するＨＦＩＰを除去した。丸底フラスコ内の容量を減らして（～３０ｍＬ）、超純水（～７５ｍＬ）を添加して、前記フラスコの２回目の回転蒸発を行った。粒子の濃縮懸濁液を２０ｍＬのシンチレーションバイアルにピペットで注入した。ローダミンＢ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）を含む粒子を、上記に規定されるものと同様のアプローチを使用して調合した。ＨＦＩＰ中のトレーサー溶液（０．０５ｍｇ／ｍＬ）を、１ｍｇ／ｍＬのストック溶液から調製した。次に、０．０５ｍｇ／ｍＬトレーサー溶液のアリコート（１ｍＬ）を、超純粋脱イオン水への沈殿の前にＰＥＴ溶液に添加した。
（ＰＥＴ ＮＰｓの作製）
磁気撹拌子を備えた４０ｍＬのシンチレーションバイアルで、ＰＥＴ繊維（ＩＺＯ Ｈｏｍｅ Ｇｏｏｄｓ）０．５８ｇ及びヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）３５ｍＬを混合して、ＰＥＴ溶液を調製した。前記ＰＥＴ溶液（１０ｍＬ）を、Ｐｏｕｌｔｅｎ ＆ Ｇｒａｆ ＧｍｂＨ社製Ｆｏｒｔｕｎａ（登録商標）Ｏｐｔｉｍａ（登録商標）１０－ｍＬガラスシリンジ付きシリンジポンプ（Ｍｏｄｅｌ ＃ ＮＥ－３００， Ｎｅｗ Ｅｒａ Ｐｕｍｐ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ社製、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ， ＮＹ， ＵＳＡ）を使用して室温で超純水（７５ｍＬ、抵抗力１８．２ＭΩ－ｃｍ）に１ｍＬ／ｍｉｎで滴下して、ＰＥＴ ＮＰｓを沈殿させた。沈殿槽の全内容物を２５０ｍＬの丸底フラスコに移し、５５℃の真空下で回転蒸発させて、残留するＨＦＩＰを除去した。丸底フラスコ内の容量を減らして（～３０ｍＬ）、超純水（～７５ｍＬ）を添加して、前記フラスコの２回目の回転蒸発を行った。粒子の濃縮懸濁液を２０ｍＬのシンチレーションバイアルにピペットで注入した。ローダミンＢ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）を含む粒子を、上記に規定されるものと同様のアプローチを使用して調合した。ＨＦＩＰ中のトレーサー溶液（０．０５ｍｇ／ｍＬ）を、１ｍｇ／ｍＬのストック溶液から調製した。次に、０．０５ｍｇ／ｍＬトレーサー溶液のアリコート（１ｍＬ）を、超純粋脱イオン水への沈殿の前にＰＥＴ溶液に添加した。
【0057】
残留するＨＦＩＰを除去するために、粒子の前記懸濁液を遠心分離して再懸濁させた。各洗浄ステップは、前記懸濁液を１３．１ｒｐｍにて５分間室温で遠心分離すること、上清を除去すること、及び懸濁液中の粒子の濃度を維持するために等量のＢｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ （ＢＳＡ） ０．５ｍｇ／ｍＬに再懸濁すること、とを含んだ。前記粒子を、３０秒間のボルテックスステップの後、カップホーンソニケーター（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｌｉｑｕｉｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ Ｓ－４００， Ｍｉｓｏｎｉｃ Ｉｎｃ社製、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ， ＮＹ）で合計８４０Ｊ／ｍＬの離散超音波処理を行って再懸濁させた。最初の洗浄ステップでは、最初の遠心分離ステップの前に、初期粒子懸濁液にＢＳＡを添加して、最終濃度を０．５ｍｇ／ｍＬにした。前記粒子を３回洗浄した。最後の再懸濁後、前記粒子の流体力学的直径を動的光散乱（ＤＬＳ）（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ－ＺＳ， Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製、Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ， ＭＡ）によって測定した。ゼータ電位（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ－ＺＳ， Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製、Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ， ＭＡ）を、使い捨てのＦｏｌｄｅｄ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｚｅｔａ Ｃｅｌｌｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製、Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ， ＭＡ）を使用して測定した。ＦＴ－ＩＲ及び熱分解ガスクロマトグラフィー／質量分析（Ｐｙｒｏ－ＧＣ／ＭＳ）に使用した粒子の懸濁液を、ＢＳＡ０．５ｍｇ／ｍＬの代わりに水を用いて洗浄した。粒子の濃度を判定するために、ＰＥＴ粒子のアリコート（１ｍＬ）を、テアード２ｍＬエッペンドルフチューブに移して、周囲条件下で真空オーブン内に一晩置いた。翌日、前記チューブの重量を測定して、乾燥粒子重量を判断した。前記粒子内のローダミンＢの濃度を判断するために、前記乾燥粒子をその後ＨＦＩＰ（１ ｍＬ）に溶解し、その蛍光をＳｙｎｅｒｇｙ ＭＸマルチモードプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｉｎｃ社製、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ， ＶＴ， ＵＳＡ）を使用して判断した。ＨＦＩＰ中のローダミンＢの検量線を、蛍光体の連続希釈によって得た（１．２５μｇ／ｍＬストック溶液、λｅｘ ＝ ５５０ｎｍ、λｅｍ ＝ ５８０ｎｍ）。
【0058】
（ＰＥＴ ＮＰの特性評価）
フーリエ変換赤外分光法（ＦＴ－ＩＲ）：乾燥したサンプルを、Ｓｍａｒｔ Ｏｒｂｉｔ（登録商標）シングルバウンスダイヤモンド結晶ＡＴＲアクセサリーを備えたＮｉｃｏｌｅｔ ６７００ ＦＴＩＲで分析した。本装置は、ＤＴＧＳ検出器及びＫＢｒビームスプリッターを備えている。メソッドパラメータを分解能４及び３２スキャンに設定し、４０００－４００ｃｍ－１の領域をスキャンした。各サンプルの前に、クリーニングされた結晶上でバックグラウンドを実行した。前記バックグラウンドの取得が完了した後、少量のサンプルをダイヤモンド結晶に加え、圧力をかけて、データを取得した。
フーリエ変換赤外分光法（ＦＴ－ＩＲ）：乾燥したサンプルを、Ｓｍａｒｔ Ｏｒｂｉｔ（登録商標）シングルバウンスダイヤモンド結晶ＡＴＲアクセサリーを備えたＮｉｃｏｌｅｔ ６７００ ＦＴＩＲで分析した。本装置は、ＤＴＧＳ検出器及びＫＢｒビームスプリッターを備えている。メソッドパラメータを分解能４及び３２スキャンに設定し、４０００－４００ｃｍ－１の領域をスキャンした。各サンプルの前に、クリーニングされた結晶上でバックグラウンドを実行した。前記バックグラウンドの取得が完了した後、少量のサンプルをダイヤモンド結晶に加え、圧力をかけて、データを取得した。
【0059】
１９Ｆ核磁気共鳴分光法（１９Ｆ－ＮＭＲ）：ＰＥＴ ＮＰ内の残留ヘキサフルオロ－２－プロパノールの存在を、１９Ｆ－ＮＭＲによって判断した。フッ素ＮＭＲ実験を、Ｎａｌｏｒａｃ Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ専用Ｈ－Ｆ観察プローブ（Ｍａｒｔｉｎｅｚ社製、ＣＡ）を備えたＶａｒｉａｎ Ｕｎｉｔｙ Ｉｎｏｖａ ５００ ｍＨｚ ＮＭＲ（ＰａｌｏＡｌｔｏ社製、ＣＡ）で実施した。１９Ｆ－ＮＭＲサンプルを、１０％のＤ２Ｏと混合した。総リサイクル時間は８秒であった。外部参照標準を使用して、０．０２ｍＭの検出限界を有するＡｇｉｌｅｎｔ ＶｎｍｒＪ ｖｅｒ． ４．２ソフトウェア（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ）で残留フッ素を校正及び定量化した。
【0060】
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）：ＰＥＴ ＮＰを、液体堆積のためのドロップマウント法を用いて調製した。ＰＥＴ ＮＰを、２００メッシュのカーボンコーティングされた銅製透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）グリッド上にピペッティングした。液体懸濁液を、ＨＥＰＡフィルター付きヒュームフード内の銅グリッド上で空気乾燥させた。１つのサンプルにつき２枚のＴＥＭグリッドを作成した。前記グリッドを、日立Ｈ－７０００透過電子顕微鏡を使用して分析した。ＡＭＴデジタルカメラを使用して、各サンプルの画像を複数枚撮影した。分析倍率は４０，０００倍から３００，０００倍の間であった。
【0061】
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）：ＳＥＭを、Ｚｅｉｓｓ Ａｕｒｉｇａ電界放出型走査電子顕微鏡（ＦＥＳＥＭ）（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ社製、Ｗｈｉｔｅ Ｐｌａｉｎｓ， ＮＹ）を用いて、加速電圧５ｋＶ及びビーム電流１０μＡで行った。ＳＥＭ分析の前に、すべてのサンプルをスパッタリングにより金／パラジウムで被覆した。粒子径を、ＩｍａｇｅＪ （ＮＩＨ）を用いて測定した。
【0062】
Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）：Ｅｓｃａｌａｂ Ｘｉ＋ ＸＰＳ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）で測定を行った。すべてのスキャンを電荷補償した。サーベイスキャンを、パスエネルギー２００ｅＶ，ステップサイズ１．０ ｅＶ及び滞留時間１０ミリ秒で実施した。一方、単一元素スキャンを、パスエネルギー５０ｅＶ、ステップサイズ０．１ｅＶ及び滞留時間５０ミリ秒で行った。
【0063】
ラマン分光法：すべてのサンプルのスペクトルを、Ｈｏｒｉｂａ ＸｐｌｏＲＡ Ｒａｍａｎ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ （Ｈｏｒｉｂａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を用いて、波長励起５３２ｎｍ、１２００Ｌｍｍ－１グレーティングで室温にて測定した。
【0064】
紫外可視分光法（ＵＶ－ＶＩＳ）：サンプルを、ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓソフトウェアｖｅｒｓｉｏｎ １．０３（アトランタ、ＧＡ）を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ－２６００ ＵＶ－Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ， ＭＤ）を使用して、２００～８００ ｎｍの波長域で分析した。サンプルをＢＳＡで１：１０及び１：１００に希釈し、前記ＢＳＡをブランクとして使用した。スリット幅２ｎｍ及びデータ間隔０．５ｎｍを使用した。
【0065】
熱分解ガスクロマトグラフィー／質量分析（Ｐｙｒｏ－ＧＣ／ＭＳ）：熱分解を、Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）に結合したＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｔｒａｃｅ １３１０ ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈに接続したＣＤＳ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ５２５０－Ｔ Ｔｒａｐｐｉｎｇ Ｐｙｒｏｌｙｓｉｓ Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ（Ｏｘｆｏｒｄ， ＰＡ）で行った。サンプルバイアルを、上部ヘッドスペースが石英ウールで充填された石英管内の石英棒で構成した。サンプルをマイクログラム単位でバイアルに移して準備した。最初の熱脱着ステップを５０℃で６０秒間行い、それをＧＣ－ＭＳに送った。その後、３５０℃で２０秒間の洗浄ステップを行って、不要な物質がカラムに到達することを防ぐために、十分に揮発性のあるすべてのサンプル内容物を排気口に送った。最終ステップは５０℃で３秒間、その後１０℃／ミリ秒で７００℃まで昇温し、そして６０秒間保持する間にすべてのサンプルを分析のためにカラムに送った。データ解析を、Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウェアｖｅｒｓｉｏｎ４．１．３１．９（Ｔｈｅｒｍｏ）及びＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖｅｒｓｉｏｎ １７（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）ライブラリを用いて行い、対象のスペクトルピークの特定に役立てた。
【0066】
（哺乳類細胞での研究）
エンドトキシンアッセイ：グルコシールド再構成バッファー及びコントロール標準エンドトキシンを含むＰｙｒｏｃｈｒｏｍｅテストキット（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ Ｉｎｃ社製、Ｅａｓｔ Ｆａｌｍｏｕｔｈ， ＭＡ）を用いて、製造者のプロトコルに従ってエンドトキシンの検出及び定量を行った。ＰＥＴ－ＮＰ及びＰＥＴ－ＲＢ ＮＰの上清を、リムルスアメーバ細胞溶解物（ＬＡＬ）試薬水（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ Ｉｎｃ社製、Ｅａｓｔ Ｆａｌｍｏｕｔｈ， ＭＡ）で試験した。粒子の洗浄及び懸濁に使用されたＢＳＡ溶液もまた試験した。ＰＥＴ ＮＰがアッセイに干渉しないことを確実にするために、最終濃度０．５ＥＵ／ｍＬを含むポジティブプロダクトントロール（ＰＰＣ）を、同じ濃度で並行して試験した。２つのＰＥＴ ＮＰとアッセイとの間に干渉は検出されなかった。
エンドトキシンアッセイ：グルコシールド再構成バッファー及びコントロール標準エンドトキシンを含むＰｙｒｏｃｈｒｏｍｅテストキット（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ Ｉｎｃ社製、Ｅａｓｔ Ｆａｌｍｏｕｔｈ， ＭＡ）を用いて、製造者のプロトコルに従ってエンドトキシンの検出及び定量を行った。ＰＥＴ－ＮＰ及びＰＥＴ－ＲＢ ＮＰの上清を、リムルスアメーバ細胞溶解物（ＬＡＬ）試薬水（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ Ｉｎｃ社製、Ｅａｓｔ Ｆａｌｍｏｕｔｈ， ＭＡ）で試験した。粒子の洗浄及び懸濁に使用されたＢＳＡ溶液もまた試験した。ＰＥＴ ＮＰがアッセイに干渉しないことを確実にするために、最終濃度０．５ＥＵ／ｍＬを含むポジティブプロダクトントロール（ＰＰＣ）を、同じ濃度で並行して試験した。２つのＰＥＴ ＮＰとアッセイとの間に干渉は検出されなかった。
【0067】
細胞培養：ＰＥＴ ＮＰの毒性を、マウス肺胞マクロファージ細胞ＲＡＷ２６４．７（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ－７１（登録商標）， ＡＴＣＣ社製、Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）で試験した。ＲＡＷ２６４．７細胞を、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）及び１００Ｕペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）で補充したダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、ＮＹ）で培養した。前記細胞を、５％加湿ＣＯ２中で３７℃にて、１×１０４細胞／ｍＬの濃度で維持し、予め温めたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）で洗浄して週に２回継代した。ＲＡＷ２６４．７細胞は、継代番号４１～４５の間で使用した。
【0068】
細胞毒性アッセイ：ＲＡＷ２６４．７を１ ｘ１０５セル／ｍＬの濃度で９６ウェルプレートに播種し、２４時間インキュベートした。新鮮な培地に懸濁したＰＥＴ ＮＰを２倍希釈で０．０００５～０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で前記細胞に添加した。ＮＰを２４時間曝露した後、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出測定のために前記培地を回収した。ＬＤＨアッセイ（ＴＯＸ７、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、培地に放出されたＬＤＨのレベルを測定するために、製造業者のプロトコルに従って行った。簡単に説明すると、７５μＬの培地を分析して、細胞膜の完全性の関数として細胞生存率を評価した。ＬＤＨ測定のために培地を回収した後、単層をＰＢＳで洗浄し、ＭＴＳアッセイを用いて、細胞の生存率及び代謝活性を測定した。ＭＴＳ［３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム］アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を、メーカープロトコルに従って実施した。簡単に説明すると、細胞試薬溶液を前記細胞に加えて、生体代謝活性細胞が着色ホルマザンに還元するＭＴＳを比色測定することで代謝活性を測定した。データを、その代表的なコントロールに対するパーセンテージで表した。すべての研究を、生物学的二重記録及び少なくとも実験的三重記録で実施した。
【0069】
蛍光顕微鏡観察：細胞をガラス底ペトリ皿（ＭａｔＴｅｋ社製、Ａｓｈｌａｎｄ， ＭＡ）に１ｘ１０５セル／ｍＬの濃度で播種し、２４時間後に０．００５ ｍｇ／ｍＬ， ０．０５ ｍｇ／ｍＬ及び０．５ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＥＴ－ＲＢ ＮＰに１６時間曝露した。ＰＥＴ－ＲＢ ＮＰの曝露と同時にＣｅｌｌＬｉｇｈｔ Ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ－ＧＦＰ ＊ＢａｃＭａｍ ２．０＊（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）を細胞に加え、１つの細胞につき２５粒子の数でリソソームを染色した。その後、細胞を３％パラホルムアルデヒド及び０．１％グルタルアルデヒドで３０分間、室温で固定した。前記細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、前記細胞を１：２００ ＤＡＰＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）で室温にて１５分間染色した。前記細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、４０倍の対物レンズで明視野イメージング及び蛍光イメージングを行った。前記イメージングは、ＣＣＤ顕微鏡カメラ（ＩＮＦＩＮＩＴＹ３－３ＵＲＦ， ３．０ Ｍｅｇａｐｉｘｅｌ， ＣｏｏｌＬＥＤ社製）を備えたＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７１倒立顕微鏡を使用して行った。画像処理を、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を用いて行った。
【0070】
データ解析：データを、ソフトウェアＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ ７．４， ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製、 Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を用いて、平均値±標準偏差で表した。統計解析にはＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔを用い、統計的有意性はＰ ＜ ０．０５であった。
【0071】
（結果及び考察）
（ＰＥＴ ＮＰの作製及び特性評価）
ＰＥＴ ＮＰを、ＰＥＴ及びＨＦＩＰの溶液を超純水にゆっくりと添加してＮＰを形成させる沈殿法で作製した。ＮＰ製剤に残存するＨＦＩＰ溶媒を除去するために複数回の洗浄を行った結果、１９Ｆ－ＮＭＲでフッ素のシグナルは検出されなくなった。ＰＥＴ ＮＰを超純水で洗浄する際、粒子が凝集したため、前記粒子の分散を維持するために、０．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡタンパク質溶液を代わりに使用した。ここで、ＢＳＡの利用は、次のセクションで述べるように、その後の細胞培養での研究にも適合していた。しかし、これらのＮＰの安定化剤として、種特異的タンパク質又は代替界面活性剤を使用することは、調査中の生体系と整合するように要求される場合がある。細胞内のＰＥＴ ＮＰの検出を可能にするために、作製中にＮＰにトレーサーを組み込むことによって、前記粒子をローダミンＢ（ＰＥＴ－ＲＢ）で標識した。ＰＥＴ－ＲＢ ＮＰの丸い形態は、ＳＥＭ（図７、パネルＡ）及びＴＥＭ（図７、パネルＢ）で明らかであり、トレーサーなしのＰＥＴ ＮＰ（図１１）では形態上の違いは明らかではなかった。ＢＳＡ溶液で前記粒子を洗浄及び再懸濁した後、流体力学的直径は、ＰＥＴ－ＮＰｓで１７０ｎｍ±３ｎｍ、ＰＥＴ－ＲＢ ＮＰｓで１５８ｎｍ±２ｎｍであった（図７、パネルＣ、図１１）。ＢＳＡ溶液を用いた洗浄ステップは、未洗浄のサンプルと比較して、流体力学的直径をわずかに増加させたが、平均サイズ分布は２００ ｎｍ未満にとどまり、多分散性指数はＰＥＴについて０．２及びＰＥＴ－ＲＢについて０．１であった。また、ＳＥＭ画像から算出したＮＰの平均直径は、ＰＥＴ ＮＰが９５ｎｍ±１４ｎｍ、ＰＥＴ－ＲＢ ＮＰが８８ｎｍ±１４ｎｍであった。流体力学的直径とＳＥＭ画像から計算された直径との間の相違は予想されることで、粒子懸濁液中のＢＳＡコロナの存在に起因する可能性がある４３。ＢＳＡ溶液に懸濁したＮＰのゼータ電位は、ＰＥＴ ＮＰで－３７ｍＶ、ＰＥＴ－ＲＢ ＮＰで－３８ｍＶであり、前記粒子の高い分散性及び安定性を裏付けている。例えば、ＰＥＴ ＮＰでは室温で１ヶ月保存した後，１６４±４ ｎｍ （ＰＤＩ ０．２）を測定した。
（ＰＥＴ ＮＰの作製及び特性評価）
ＰＥＴ ＮＰを、ＰＥＴ及びＨＦＩＰの溶液を超純水にゆっくりと添加してＮＰを形成させる沈殿法で作製した。ＮＰ製剤に残存するＨＦＩＰ溶媒を除去するために複数回の洗浄を行った結果、１９Ｆ－ＮＭＲでフッ素のシグナルは検出されなくなった。ＰＥＴ ＮＰを超純水で洗浄する際、粒子が凝集したため、前記粒子の分散を維持するために、０．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡタンパク質溶液を代わりに使用した。ここで、ＢＳＡの利用は、次のセクションで述べるように、その後の細胞培養での研究にも適合していた。しかし、これらのＮＰの安定化剤として、種特異的タンパク質又は代替界面活性剤を使用することは、調査中の生体系と整合するように要求される場合がある。細胞内のＰＥＴ ＮＰの検出を可能にするために、作製中にＮＰにトレーサーを組み込むことによって、前記粒子をローダミンＢ（ＰＥＴ－ＲＢ）で標識した。ＰＥＴ－ＲＢ ＮＰの丸い形態は、ＳＥＭ（図７、パネルＡ）及びＴＥＭ（図７、パネルＢ）で明らかであり、トレーサーなしのＰＥＴ ＮＰ（図１１）では形態上の違いは明らかではなかった。ＢＳＡ溶液で前記粒子を洗浄及び再懸濁した後、流体力学的直径は、ＰＥＴ－ＮＰｓで１７０ｎｍ±３ｎｍ、ＰＥＴ－ＲＢ ＮＰｓで１５８ｎｍ±２ｎｍであった（図７、パネルＣ、図１１）。ＢＳＡ溶液を用いた洗浄ステップは、未洗浄のサンプルと比較して、流体力学的直径をわずかに増加させたが、平均サイズ分布は２００ ｎｍ未満にとどまり、多分散性指数はＰＥＴについて０．２及びＰＥＴ－ＲＢについて０．１であった。また、ＳＥＭ画像から算出したＮＰの平均直径は、ＰＥＴ ＮＰが９５ｎｍ±１４ｎｍ、ＰＥＴ－ＲＢ ＮＰが８８ｎｍ±１４ｎｍであった。流体力学的直径とＳＥＭ画像から計算された直径との間の相違は予想されることで、粒子懸濁液中のＢＳＡコロナの存在に起因する可能性がある４３。ＢＳＡ溶液に懸濁したＮＰのゼータ電位は、ＰＥＴ ＮＰで－３７ｍＶ、ＰＥＴ－ＲＢ ＮＰで－３８ｍＶであり、前記粒子の高い分散性及び安定性を裏付けている。例えば、ＰＥＴ ＮＰでは室温で１ヶ月保存した後，１６４±４ ｎｍ （ＰＤＩ ０．２）を測定した。
【0072】
ＮＰの組成を探るために、ＦＴ－ＩＲ分析を行った（図８）。ＮＰのＦＴ－ＩＲプロファイルは、ＰＥＴバルクポリマーの特徴的な吸収帯を示し（図１１）、また既報４４－４６の通り、１７１５ｃｍ－１（Ｃ ＝ Ｏ伸縮）、１５７８ｃｍ－１（環内Ｃ＝Ｃ伸縮）、１５０５ｃｍ－１（環内Ｃ－Ｈの面内曲げ；環内Ｃ＝Ｃ伸縮）、１２４０ｃｍ－１（Ｃ＝Ｏ面内曲げ、Ｃ－Ｃ伸縮、Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ伸縮）４６及び７２４ｃｍ－１（エステル基とベンゼン環の相互作用４４）を含んでいた。図８に示すように、顕著なＩＲ吸収帯は、ＰＥＴとＰＥＴ－ＲＢ ＮＰとの間で類似していた。興味深いことに、蛍光顕微鏡による蛍光トレーサーの検証にもかかわらず、１６９０ｃｍ－１（Ｃ－Ｃ伸縮）などのローダミンＢに関連する典型的な帯は、ＰＥＴ－ＲＢ ＮＰには存在しなかった。ＦＴ－ＩＲにローダミンＢの吸収帯がないことは、トレーサーの濃度が低く、ＩＲスペクトルでは検出されなかったためと考えられる。ラマン分光法を用いた追加の試験でも、ＰＥＴ及びＰＥＴ－ＲＢ ＮＰ内のさまざまな部位が確認された（図１２）。１６１２．９２ｃｍ－１の主ピークは、ＰＥＴ構造のベンゼン環に起因するラマン散乱に対応した。その他の副次的なピークは、１７２５．１６ｃｍ－１（カルボニル伸縮）、１４４６．２４及び１２８７．６０ｃｍ－１（弱いＣ－Ｃ結合）、並びに１１７７及び１１１６．９８ｃｍ－１（弱いＣ－Ｏ－Ｃ非対称伸縮振動）に位置していた。ＰＥＴ及びＰＥＴ－ＲＢ ＮＰのさらなる分析を、ｐｙｒｏ－ＧＣ－ＭＳで行った（図１３）。
【0073】
ローダミンＢを含む、及び含まないＢＳＡ中のＰＥＴ ＮＰの表面化学状態を、ＸＰＳ分析で調べた。表１は、サンプル中に存在する全元素の結合エネルギーを示す。Ｃ １ｓ， Ｎ １ｓ， Ｏ １ｓ， Ｚｎ ２ｐ及びＳ ２ｐスペクトルの結合エネルギーのシフトは、前記元素とＰＥＴ構造との相互作用の違いに対応する。Ｃ １ｓの２８４．４ｅＶを中心とするピークは両サンプルに存在し、ＰＥＴ構造のフェニル炭素と関連している。２９１ｅＶ付近を中心とするサテライトピークは、構造中の芳香環のπ－π＊揺らぎ過程に起因するものである。５３０．５ｅＶ付近を中心とするＯ １ｓスペクトルはＣ＝Ｏ結合に対応する。また、３９９．５ｅＶ付近を中心に存在するＮ １ｓのピークは、窒素と芳香族ＰＥＴ環のＣ－Ｎ結合によるものである。さらに、２ｐ３／２と２ｐ１／２の２つのスピン軌道分割を持つＺｎ ２ｐピークが観察され、その結合エネルギーの差は～２３ｅＶである。１０２１．３ｅＶを中心とする２ｐ３／２は、Ｚｎ＋２化学環境における亜鉛の存在を確認した。両サンプルとも結合エネルギーの顕著なシフトは観察されていない。最後に、Ｓ ２ｐスペクトルにおいて、両サンプルとも１６３ｅＶ付近にＳ ２ｐ３／２のピークがある。
【0074】
【表1】
【0075】
（哺乳類細胞におけるＰＥＴ ＮＰの評価）
哺乳類細胞での評価に先立って、ＰＥＴ ＮＰのエンドトキシン汚染の可能性を確認するために、動粘性濁度ＬＡＬアッセイを使用した。エンドトキシンのレベルは検出可能であったが、その値は低く、ＰＥＴ－ＮＰで０．１ＥＵ／ｍＬ、ＰＥＴ－ＲＢ ＮＰで０．０６４ＥＵ／ｍＬを示した。マウス肺胞マクロファージＲＡＷ２６４．７を用いて、ＰＥＴ ＮＰの細胞毒性及び取り込みを、用量反応的に評価した。細胞毒性を、細胞膜の完全性（ＬＨＤ放出量）及び代謝活性（ＭＴＳ）を判断することによって評価した（図９）。ＰＥＴ－ＮＰでは０．０６２５ｍｇ／ｍＬ（Ｐ値 ＝ ０．００１６）、ＰＥＴ－ＲＢ ＮＰでは０．００１０ｍｇ／ｍＬ（Ｐ値 ＝ ０．００３４）で、ＬＤＨ放出量の著しい増加が観察された。両ＰＥＴ ＮＰの０．１２５ｍｇ／ｍＬの濃度（ＰＥＴ ＮＰはコントロールの１６０±２７．５％、ＰＥＴ－ＲＢ ＮＰはコントロールの１７８±１８．３％）では、ＬＤＨ放出量は濃度の上昇とともに増加し続け、０．５ｍｇ／ｍＬのＬＤＨ放出量はＰＥＴ－ＮＰはコントロールの５０６±８５％、ＰＥＴ－ＲＢ ＮＰはコントロールの４４７±４６．１％となった。一方、ＭＴＳアッセイでは、ＰＥＴ ＮＰの最低濃度でわずかな増加が観察された。試験したＰＥＴ ＮＰｓの最高濃度である０．５ｍｇ／ｍＬにおいてのみ、ＭＴＳアッセイはミトコンドリア活性の低下を示した（ＰＥＴ－ＮＰはコントロールの８２．９±８．７７％、ＰＥＴ－ＲＢはコントロールの７１．３±２９．４％）。これらの知見を合わせると、ミトコンドリア活性が変化する前に、より低いＮＰ濃度で細胞膜の完全性が影響を受けていることを示唆している。
哺乳類細胞での評価に先立って、ＰＥＴ ＮＰのエンドトキシン汚染の可能性を確認するために、動粘性濁度ＬＡＬアッセイを使用した。エンドトキシンのレベルは検出可能であったが、その値は低く、ＰＥＴ－ＮＰで０．１ＥＵ／ｍＬ、ＰＥＴ－ＲＢ ＮＰで０．０６４ＥＵ／ｍＬを示した。マウス肺胞マクロファージＲＡＷ２６４．７を用いて、ＰＥＴ ＮＰの細胞毒性及び取り込みを、用量反応的に評価した。細胞毒性を、細胞膜の完全性（ＬＨＤ放出量）及び代謝活性（ＭＴＳ）を判断することによって評価した（図９）。ＰＥＴ－ＮＰでは０．０６２５ｍｇ／ｍＬ（Ｐ値 ＝ ０．００１６）、ＰＥＴ－ＲＢ ＮＰでは０．００１０ｍｇ／ｍＬ（Ｐ値 ＝ ０．００３４）で、ＬＤＨ放出量の著しい増加が観察された。両ＰＥＴ ＮＰの０．１２５ｍｇ／ｍＬの濃度（ＰＥＴ ＮＰはコントロールの１６０±２７．５％、ＰＥＴ－ＲＢ ＮＰはコントロールの１７８±１８．３％）では、ＬＤＨ放出量は濃度の上昇とともに増加し続け、０．５ｍｇ／ｍＬのＬＤＨ放出量はＰＥＴ－ＮＰはコントロールの５０６±８５％、ＰＥＴ－ＲＢ ＮＰはコントロールの４４７±４６．１％となった。一方、ＭＴＳアッセイでは、ＰＥＴ ＮＰの最低濃度でわずかな増加が観察された。試験したＰＥＴ ＮＰｓの最高濃度である０．５ｍｇ／ｍＬにおいてのみ、ＭＴＳアッセイはミトコンドリア活性の低下を示した（ＰＥＴ－ＮＰはコントロールの８２．９±８．７７％、ＰＥＴ－ＲＢはコントロールの７１．３±２９．４％）。これらの知見を合わせると、ミトコンドリア活性が変化する前に、より低いＮＰ濃度で細胞膜の完全性が影響を受けていることを示唆している。
【0076】
ＰＥＴ－ＲＢ ＮＰｓの細胞への取り込み及びその結果としてのＲＡＷ２６４．７細胞における形態変化が、明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡から明らかになった。低濃度の０．００５ｍｇ／ｍＬのＰＥＴ－ＲＢ ＮＰへの曝露後、個々の粒子が細胞質内で視認可能であったが（図１０、パネルＢ、パネルＦ）、０．０５ｍｇ／ｍＬ及び０．５ｍｇ／ｍＬのＰＥＴ－ＲＢ ＮＰの濃度では、細胞内におけるＮＰの大きなクラスタが明視野（図１０、パネルＡ～Ｄ）及び蛍光顕微鏡（図１０、パネルＥ～Ｈ）の両方で観察された。蛍光顕微鏡検査（図１０、パネルＥ～Ｈ）の個々の蛍光チャンネルを図１４に示す。細胞核（青色チャンネル）を図１４のパネルＭ～Ｐに示す、細胞の細胞質（緑色チャンネル）を図１４のパネルＩ～Ｌに示す、及びＰＥＴ－ＲＢ ＮＰ（赤色チャンネル）を図１４のパネルＥ～Ｈに示す。より大きなＮＰ凝集体の蛍光強度は、個々のＰＥＴ－ＲＢ ＮＰｓ粒子の可視化に必要な露出時間において過飽和になり、前記凝集体を明視野画像と比較して蛍光顕微鏡画像においてより大きく見せた。ＰＥＴ－ＲＢ ＮＰは、緑色の波長で低レベルの自発蛍光を示したため、ＰＥＴ－ＲＢ ＮＰがリソソームと関連しているかどうかを判断することはできなかった。０．０５ｍｇ／ｍＬのＰＥＴ－ＲＢ ＮＰでは、粒子は貪食体内で観察されたが、いくつかの細胞はＮＰの周りに堅いファゴソームを形成する一方で、より高い濃度ではＮＰの周りに大きな空隙を有する空胞が観察された。最高濃度では、ファゴソームが拡大し、細胞周辺に細長い三日月型の核が生じた。０．００５ｍｇ／ｍＬでは、気泡のような形態学的変化が観察され、細胞膜が皮質細胞骨格構造から剥離することを示した４７。これらの気泡は０．０５ｍｇ／ｍＬでは増加したが、０．５ｍｇ／ｍＬでは増加しなかった。０．５ｍｇ／ｍＬでは、核の凝縮と蛍光強度の増加が観察され、この濃度では多くの細胞が死滅していることを示す細胞毒性データを裏付けた。
【0077】
（結論）
高商品性ポリマーに由来する断片化したプラスチックの環境中での存在は、生体系及び人間の健康への影響が不明であることから、新たな懸念材料となっている。重要な高商品性ポリマー及びプラスチック廃棄物の原因として、ＰＥＴは、様々な報告で示されているように、小さな破片（すなわちマイクロプラスチック）の形態で飲料水、食品及び飲料に浸透している。現在の報告はミクロン単位のプラスチックに焦点が当てられているが、ナノ単位のＰＥＴにも環境汚染の可能性がある。
高商品性ポリマーに由来する断片化したプラスチックの環境中での存在は、生体系及び人間の健康への影響が不明であることから、新たな懸念材料となっている。重要な高商品性ポリマー及びプラスチック廃棄物の原因として、ＰＥＴは、様々な報告で示されているように、小さな破片（すなわちマイクロプラスチック）の形態で飲料水、食品及び飲料に浸透している。現在の報告はミクロン単位のプラスチックに焦点が当てられているが、ナノ単位のＰＥＴにも環境汚染の可能性がある。
【0078】
流体力学的直径が２００ｎｍ未満であるＰＥＴ ＮＰを合成した。細胞モデルでの研究を裏付けるために、ローダミンＢ蛍光トレーサーをＰＥＴ ＮＰに組み込み、ＲＡＷ２６４．７マクロファージ内の取り込みを測定した。その結果、マクロファージにＰＥＴ－ＲＢ ＮＰが用量反応的に取り込まれることが確認された。この発見は、マクロファージの細胞膜の完全性に影響を与えるために必要なＰＥＴ ＮＰの濃度（０．００１０ｍｇ／ｍＬ）は、ミトコンドリア活性を変化させるために必要なＰＥＴ ＮＰの濃度（０．５ｍｇ／ｍＬ）より低いことを示した。高濃度のＰＥＴ ＮＰ（０．５ｍｇ／ｍＬ）では明確な形態学的変化が起こり、拡大したファゴソームが核の伸長を引き起こし、おそらく細胞死を引き起こしたことが示された。本研究は、哺乳類のマクロファージ細胞がＰＥＴナノプラスチックによって影響を受けることを示すものである。
【0079】
参考文献、実施例４
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【0080】
本発明の様々な特徴は、単一の実施形態の文脈で説明される場合があるが、前記特徴はまた、別々に又は任意の適切な組み合わせで提供されることができる。逆に、本明細書では、明瞭性のために、本発明を別々の実施形態の文脈で説明する場合があるが、本発明は、単一の実施形態で実施することも可能である。
【0081】
上記は、本発明概念を例示するものであり、それを限定するものとして解釈されるものではない。本発明概念のさらなる実施形態は、以下の特許請求の範囲に例示され、その均等物は特許請求の範囲に含まれるものとする。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14A)】
【図14B)】
【図14C)】
【図14D)】
【図14E)】
【図14F)】
【図14G)】
【図14H)】
【図14I)】
【図14J)】
【図14K)】
【図14L)】
【図14M)】
【図14N)】
【図14O)】
【図14P)】
【国際調査報告】