特表 2023-514064 ヒトマイクロバイオームメタセクレトームタンパク質に由来する薬剤候補の同定及び合成

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-04-05

(54)【発明の名称】ヒトマイクロバイオームメタセクレトームタンパク質に由来する薬剤候補の同定及び合成

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/31 20060101AFI20230329BHJP

   C40B 40/02 20060101ALI20230329BHJP

   C07K 14/195 20060101ALI20230329BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230329BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20230329BHJP

   A61P 5/00 20060101ALI20230329BHJP

   A61K 38/19 20060101ALI20230329BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20230329BHJP

   A61K 38/18 20060101ALI20230329BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20230329BHJP

   A61K 38/22 20060101ALI20230329BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20230329BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20230329BHJP

   G16B 30/00 20190101ALI20230329BHJP

   C07K 1/00 20060101ALI20230329BHJP

   C40B 40/10 20060101ALI20230329BHJP

   C40B 40/08 20060101ALI20230329BHJP

【ＦＩ】

C12N15/31

C40B40/02 ZNA

C07K14/195

A61K48/00

A61P37/02

A61P5/00

A61K38/19

A61K38/20

A61K38/18

A61K38/16

A61K38/22

G01N33/50 P

G01N33/68

G16B30/00

C07K1/00

C40B40/10

C40B40/08

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022544650

(86)(22)【出願日】2021-01-22

(85)【翻訳文提出日】2022-08-12

(86)【国際出願番号】 EP2021051523

(87)【国際公開番号】W WO2021148650

(87)【国際公開日】2021-07-29

(31)【優先権主張番号】20305060.4

(32)【優先日】2020-01-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519122286

【氏名又は名称】エンテローム エスエー

(74)【代理人】

【識別番号】100107766

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠重

(74)【代理人】

【識別番号】100107515

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100070150

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠彦

(72)【発明者】

【氏名】シェーヌ，ローラン

(72)【発明者】

【氏名】ストロッツィ，フランチェスコ

(72)【発明者】

【氏名】ボニー，クリストフ

【テーマコード（参考）】

2G045

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

2G045AA40

2G045DA13

2G045DA14

2G045DA36

2G045FB02

2G045FB03

4C084AA13

4C084BA44

4C084CA04

4C084DA01

4C084DA12

4C084DB01

4C084DB52

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZB071

4C084ZB072

4C084ZC211

4C084ZC212

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA11

4H045EA20

(57)【要約】

本発明は、ヒトマイクロバイオームメタセクレトームのタンパク質に関する疾患の治療に関し、マイクロバイオーム相互作用、特に、マイクロバイオーム－宿主間相互作用に関する。特に、本発明は、ヒトマイクロバイオームの分泌されたペプチド及びタンパク質を同定するための方法に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を提供するための方法であって、以下の工程：
（ｉ）複数のヒトマイクロバイオータタンパク質配列及び／又は複数のヒトマイクロバイオータタンパク質をコードする複数の核酸配列を提供することと；
（ｉｉ）前記工程（ｉ）で提供された前記配列において、ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補の１以上の配列を同定することと；
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）で同定された前記配列を有する、又は前記工程（ｉｉ）で同定された前記配列によってコードされる１以上のヒトマイクロバイオータタンパク質を調製することと、を含み、
前記工程（ｉｉ）における、前記ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補の前記配列が、以下の基準：
－ シグナルペプチドを有する配列、又はシグナルペプチドを有するタンパク質をコードする配列である；
－ ２０～５００アミノ酸長を有する配列、又は２０～５００アミノ酸長を有するタンパク質をコードする配列である；及び
－ 少なくとも２つのシステイン残基及び／又は立体構造的に剛性な構造を与える一次及び／又は二次構造エレメントを含む配列、又は少なくとも２つのシステイン残基及び／又は立体構造的に剛性な構造を与える一次及び／又は二次構造エレメントを含むタンパク質をコードする配列である、
にしたがって選択されることを特徴とする、方法。

【請求項2】

前記マイクロバイオータが、胃腸管マイクロバイオータ、肺マイクロバイオータ、唾液マイクロバイオータ、精液マイクロバイオータ、皮膚マイクロバイオータ、及び膣マイクロバイオータからなる群から選択されるマイクロバイオータである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記マイクロバイオータが、腸マイクロバイオータ及び口腔マイクロバイオータから選択される胃腸管マイクロバイオータである、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記ヒトマイクロバイオータタンパク質が、細菌タンパク質、古細菌タンパク質、原生生物タンパク質、真菌タンパク質、ウイルスタンパク質、及び／又はファージタンパク質である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。

【請求項5】

前記ヒトマイクロバイオータタンパク質が、細菌タンパク質、好ましくは、ヒトの胃腸管マイクロバイオータメタセクレトームのものである、請求項１から４のいずれかに記載の方法。

【請求項6】

前記ヒトマイクロバイオータタンパク質が、ヒトの胃腸管マイクロバイオータの細菌タンパク質である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。

【請求項7】

前記工程（ｉ）において、ヒトマイクロバイオータタンパク質配列のデータベース及び／又はヒトマイクロバイオータタンパク質をコードする核酸配列のデータベースが提供される、請求項１から６のいずれかに記載の方法。

【請求項8】

前記マイクロバイオータのデータベースが、複数の宿主個体のマイクロバイオータ配列を含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記マイクロバイオータのデータベースが、複数の宿主個体のマイクロバイオータデータではなく、単一の宿主個体のマイクロバイオータデータを含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記工程（ｉ）が、以下のサブ工程を含む、請求項７から９のいずれかに記載の方法。
（ｉ－ａ）任意に、単一又は複数の個体のサンプルから、マイクロバイオータタンパク質配列又は核酸配列を同定すること、及び
（ｉ－ｂ）単一又は複数の個体のマイクロバイオータタンパク質配列又は核酸配列を含むデータベースを編集すること。

【請求項11】

前記工程（ｉ－ａ）におけるサンプルが、便サンプルである、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記工程（ｉｉ）におけるシグナルペプチドの同定が、インシリコで行われる、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。

【請求項13】

前記工程（ｉｉ）におけるシグナルペプチドの同定が、２つの異なる方法を用いることによって行われ、両方の方法にしたがうシグナルペプチドを有する配列又はコードする配列が選択される、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。

【請求項14】

前記工程（ｉｉ）におけるシグナルペプチドの同定が、Ｐｈｏｂｉｕｓ及び／又はＳｉｇｎａｌＰを用いることによって行われる、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。

【請求項15】

前記ヒトマイクロバイオータタンパク質が、２０～３５０アミノ酸長を有する、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。

【請求項16】

前記ヒトマイクロバイオータタンパク質が、少なくとも２つのシステイン残基を含む、請求項１から１５のいずれかに記載の方法。

【請求項17】

前記システイン残基が、前記ヒトマイクロバイオータタンパク質の総アミノ酸の４％超を占める、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記ヒトマイクロバイオータタンパク質が、偶数個のシステイン残基を含み、例えば、少なくとも１つ又は２つのシステイン対を形成する、請求項１６又は１７に記載の方法。

【請求項19】

前記ヒトマイクロバイオータタンパク質のシステイン含量が、ＫＡＰＰＡを使用して同定される、請求項１６から１８のいずれかに記載の方法。

【請求項20】

前記立体構造的に剛性な構造を与える一次及び／又は二次構造エレメントが、システインモチーフ、ジスルフィド架橋、ロイシンリッチリピート、アルファヘリックス、ベータシート、及びコイルからなる群から選択される、請求項１から１９のいずれかに記載の方法。

【請求項21】

前記立体構造的に剛性な構造を与える一次及び／又は二次構造エレメントが、ジスルフィド架橋である、請求項１から２０のいずれかに記載の方法。

【請求項22】

前記ヒトマイクロバイオータタンパク質が、２０～２００アミノ酸長を有し、且つ少なくとも２つのシステイン残基を含み、例えば、少なくとも１つのシステイン対を形成する、請求項１から２１のいずれかに記載の方法。

【請求項23】

前記ヒトマイクロバイオータタンパク質が、５０～１５０アミノ酸長を有し、且つ少なくとも４つのシステイン残基を含み、例えば、少なくとも２つのシステイン対を形成する、請求項１から２２のいずれかに記載の方法。

【請求項24】

前記ヒトマイクロバイオータタンパク質が、２０～５０アミノ酸長を有し、且つアルファヘリックス、ベータシート、及びコイルからなる群から選択される二次構造エレメントを含む、請求項１から２２のいずれかに記載の方法。

【請求項25】

前記工程（ｉｉ）において、シグナルペプチドを有する又はコードする配列の同定が、以下の前に行われる、請求項１から２４のいずれかに記載の方法。
－ ２０～５００アミノ酸長を有する配列又は２０～５００アミノ酸長を有する配列をコードする配列の同定；及び／又は
－ 少なくとも２つのシステイン残基及び／又は立体構造的に剛性な構造を与える一次及び／又は二次構造エレメントを含む配列の同定。

【請求項26】

前記シグナルペプチドの配列が、以下に含まれない、請求項２５に記載の方法。
－ ２０～５００アミノ酸長を有する配列又は２０～５００アミノ酸長を有する配列をコードする配列の同定；及び／又は
－ 少なくとも２つのシステイン残基及び／又は立体構造的に剛性な構造を与える一次及び／又は二次構造エレメントを含む配列の同定。

【請求項27】

前記工程（ｉｉ）において、未知の機能を有するタンパク質又は核酸配列を、好ましくはインシリコ法を用いて、アノテートする、請求項１から２６のいずれかに記載の方法。

【請求項28】

前記配列を、ＨＭＭＳＣＡＮ及び／又はＰＦＡＭを用いて、アノテートする、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記工程（ｉｉ）において、冗長な配列が、同定され除去される、請求項１から２８のいずれかに記載の方法。

【請求項30】

前記工程（ｉｉ）において、別の配列と、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも７５％の配列同一性を有する配列が、同定され除去される、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

ＣＤ－ＨＩＴを使用して冗長な配列を同定する、請求項２９又は３０に記載の方法。

【請求項32】

前記工程（ｉｉ）において、分泌タンパク質のシグナルペプチドが、グラム陰性菌のリポタンパク質と区別される、請求項１から３１のいずれかに記載の方法。

【請求項33】

分泌タンパク質のシグナルペプチドを、グラム陰性菌のリポタンパク質から区別する工程が、ＬｉｐｏＰを用いて行われる、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記ヒトマイクロバイオータタンパク質が、ヒト宿主タンパク質の模倣物又は分泌促進物質（ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅ）であり、例えば、サイトカイン、インターロイキン、ケモカイン、成長因子、神経ペプチド、及びペプチドホルモンからなる群から選択される、請求項１から３３のいずれかに記載の方法。

【請求項35】

前記ヒトマイクロバイオータタンパク質が、分泌促進物質である、請求項１から３４のいずれかに記載の方法。

【請求項36】

前記分泌促進物質が、ヒト免疫細胞によるインターロイキン－１０（ＩＬ－１０）の分泌を誘導する、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

同定された前記タンパク質が、免疫調節性である、請求項１から３６のいずれかに記載の方法。

【請求項38】

前記ヒトマイクロバイオータタンパク質が、前記工程（ｉｉｉ）において、化学合成によって調製される、請求項１から３７のいずれかに記載の方法。

【請求項39】

前記ヒトマイクロバイオータタンパク質が、前記工程（ｉｉｉ）において、インビトロ合成（無細胞発現）又は組換え過剰発現によって調製される、請求項１から３８のいずれかに記載の方法。

【請求項40】

核酸分子が、前記タンパク質を調製するためのテンプレートとして使用され、前記方法が、以下の工程を含む、請求項３９に記載の方法。
－前記核酸配列の開始コドンと終止コドンを同定すること。

【請求項41】

前記工程（ｉｉｉ）で調製された前記ヒトマイクロバイオータタンパク質が、前記工程（ｉｉ）で同定された前記シグナルペプチドなしで合成される、請求項１から４０のいずれかに記載の方法。

【請求項42】

前記タンパク質の調製前に、前記シグナルペプチドをインシリコで除去する、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記方法が、（得られた）タンパク質の少なくとも１つの生物学的活性、特に、ヒト宿主との相互作用に関する生物学的活性、を決定する更なる工程（ｉｖ）を含む、請求項１から４２のいずれかに記載の方法。

【請求項44】

前記生物学的活性が、インシリコで試験される、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記ヒトマイクロバイオータタンパク質の構造が決定され、ヒト宿主分子、特に、ヒト宿主タンパク質の構造と比較される、請求項４３又は４４に記載の方法。

【請求項46】

前記生物学的活性が、インビトロ又はインビボで試験される、請求項４３から４５のいずれかに記載の方法。

【請求項47】

生物学的活性試験が、共免疫沈降、二分子蛍光補完、アフィニティ電気泳動、ラベルトランスファー、ファージディスプレイ、タンデムアフィニティ精製、光反応性アミノ酸類似体（インビボ）、ＳＰＩＮＥ、ノックダウンと組み合わせた定量的免疫沈降（ＱＵＩＣＫ）、バイオレイヤー干渉法、二重分極干渉法（ＤＰＩ）、静的光散乱（ＳＬＳ）、動的光散乱（ＤＬＳ）、表面プラズモン共鳴、蛍光分極／異方性、蛍光相関分光法、蛍光相互相関分光法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｒｏｓｓ－ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）（ＦＣＣＳ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、ＮＭＲ、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）、回転セルベースリガンド結合アッセイ（Ｒｏｔａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）、単色反射率測定（ＳＣＯＲＥ）、マイクロアレイ、特に、ペプチドアレイ及びタンパク質アレイ、並びにペプチドファージディスプレイ、酵母表面ディスプレイ、酵母ツーハイブリッド及び細菌ツーハイブリッドスクリーンなどのディスプレイ法からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

得られた前記タンパク質の、代謝、免疫、又は細胞完全性などの生物学的メカニズムへの関与を調べるために、前記生物学的活性をスクリーニング法によって試験する、請求項４３から４７のいずれかに記載の方法。

【請求項49】

得られた前記タンパク質を、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）専用のアッセイを用いて試験する、請求項４３から４８のいずれかに記載の方法。

【請求項50】

得られた前記タンパク質を、ヒト細胞からのカルシウム放出の誘導に関するアッセイを用いて試験する、請求項４３から４９のいずれかに記載の方法。

【請求項51】

得られた前記タンパク質を、任意に、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）などのヒト免疫細胞、又はヒト免疫細胞の選択されたサブセットを伴う、免疫に関するアッセイを用いて試験する、請求項４３から５０のいずれかに記載の方法。

【請求項52】

得られた前記タンパク質に曝露されたヒト細胞からのサイトカイン放出を決定する、請求項４３から５１のいずれかに記載の方法。

【請求項53】

請求項１から５２のいずれかに記載の方法によって得ることができることを特徴とする、ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補のライブラリー。

【請求項54】

ヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質を同定するための方法であって、以下の工程：
（ｉ）複数のヒトマイクロバイオータタンパク質配列及び／又は複数のヒトマイクロバイオータタンパク質をコードする複数の核酸配列を提供することと；
（ｉｉ）前記工程（ｉ）で提供された前記配列において、ヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質の１以上の配列を同定することと、を含み、
前記ヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質の前記配列が、以下の基準：
－ シグナルペプチドを有する配列、又はシグナルペプチドを有するタンパク質をコードする配列である；
－ ２０～５００アミノ酸長を有する配列、又は２０～５００アミノ酸長を有するタンパク質をコードする配列である；及び
－ 少なくとも２つのシステイン残基及び／又は立体構造的に剛性な構造を与える一次及び／又は二次構造エレメントを含む配列、又は少なくとも２つのシステイン残基及び／又は立体構造的に剛性な構造を与える一次及び／又は二次構造エレメントを含むタンパク質をコードする配列である、
にしたがって選択されることを特徴とする、方法。

【請求項55】

請求項２から３７のいずれかに定義されるように行われる、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

請求項５４又は５５に記載の複数のヒトマイクロバイオータメタセクレトーム配列の同定を含むことを特徴とする、ヒトマイクロバイオータメタセクレトーム配列データベースを生成するための方法。

【請求項57】

前記工程（ｉ）において、複数のヒトマイクロバイオータタンパク質配列及び／又は複数のヒトマイクロバイオータタンパク質をコードする複数の核酸配列が提供され、データベースに編集され、その後の工程が、前記データベース又は前記データベースに含まれる配列に対して行われる、請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

請求項５４又は５５に記載の、複数のヒトマイクロバイオータメタセクレトームタンパク質配列及び／又は複数のヒトマイクロバイオータタンパク質をコードする複数の核酸配列の同定と、それに続く以下の工程とを含むことを特徴とする、ヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質を調製するための方法。
－ ヒトマイクロバイオータメタセクレトームの１以上のタンパク質を、これまでに同定された配列に基づいて調製すること。

【請求項59】

ヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質を調製するための方法であって、前記タンパク質が、請求項３８から４２のいずれかで定義されるように調製されることを特徴とする、方法。

【請求項60】

ヒト宿主分子と相互作用するヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質を同定及び／又は提供するための方法であって、
－ 請求項５４又は５５に記載の、複数のヒトマイクロバイオータメタセクレトームタンパク質配列及び／又は複数のヒトマイクロバイオータタンパク質をコードする複数の核酸配列の同定と、
－ 任意に、請求項５８又は５９に記載の、ヒトマイクロバイオータメタセクレトームの１以上のタンパク質の調製と、
続いて、前記ヒトマイクロバイオータメタセクレトームの同定／調製されたタンパク質の、ヒト宿主分子、特に、ヒト宿主タンパク質との相互作用を試験する工程とを含むことを特徴とする、方法。

【請求項61】

請求項４４から５２のいずれかに定義されるように、生物学的活性を試験する、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

医学における使用のための、請求項１から５２及び５８から６１のいずれかに記載の方法によって得ることができることを特徴とする、ヒトマイクロバイオータメタセクレトームタンパク質。

【請求項63】

配列番号１～１０のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項６２にしたがって使用するためのヒトマイクロバイオータメタセクレトームタンパク質。

【請求項64】

以下の工程を含むことを特徴とする、疾患の予防及び／又は治療のための薬剤を調製するための方法。
（ａ）請求項１から５２及び５４から６１のいずれかにしたがって、ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を提供すること；
（ｂ）以下を含む医薬組成物を調製すること：
（１）前記ヒトマイクロバイオータメタセクレトームの前記タンパク質、又はその機能的断片若しくは配列変異体；
（２）（１）に記載の前記タンパク質をコードする核酸分子；
（３）（１）に記載の前記タンパク質を発現する又は（２）に記載の前記核酸分子を含む細胞；
（４）（１）に記載の前記タンパク質に結合する抗体；
（５）（４）に記載の前記抗体をコードする核酸分子；
（６）（４）に記載の前記抗体を発現する又は（５）に記載の前記核酸分子を含む細胞；
（７）（１）に記載の前記タンパク質と相互作用する化合物；又は
（８）（１）に記載の前記タンパク質の、前記ヒト宿主分子との相互作用（結合）に干渉する化合物、
及び、任意に、薬学的に許容される担体及び／又はアジュバント。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、マイクロバイオーム（ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ）相互作用、特に、マイクロバイオーム－宿主間相互作用だけでなく、細菌－細菌間相互作用などの他の相互作用にも関する。特に、本発明は、薬剤候補となり得るヒトマイクロバイオームの分泌ペプチド及びタンパク質の同定及び任意に、それらの合成のための方法に関する。本発明はまた、ヒトマイクロバイオームメタセクレトーム（ｍｅｔａｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）タンパク質配列のデータベースを生成するための方法に関する。更に、本発明は、ヒトマイクロバイオームメタセクレトームのタンパク質を調製するための方法、及び医学におけるかかるタンパク質の使用に関する。ヒトマイクロバイオームメタセクレトームのタンパク質は、様々な疾患に関与するヒトタンパク質と相互作用することができ、したがって、かかる疾患の治療のための薬剤候補となり得る。

【背景技術】

【0002】

ヒトの腸のマイクロバイオータ（ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ）（ＨＩＭ）は、ヒトの胃腸管（ＧＩＴ）にコロニーを形成する、１０^１４個の細菌の巨大で複雑なコミュニティーであり、現在では、ヒトの隠れた器官と考えられている。ＨＩＭは、腸の恒常性を維持すること、病原体の増殖を阻害すること、抗微生物化合物を生成すること、及び腸のバリア機能を改善することなどの重要な機能を有する。多くの証拠によって、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、刺激性腸症候群、非アルコール性脂肪肝炎、アルコール性肝疾患、更には脳の活性（腸脳軸（ｇｕｔ ｂｒａｉｎ ａｘｉｓ））などのいくつかの胃腸障害が、腸のマイクロバイオータのバランス変化（ディスバイオシス）の結果であるという事実が裏付けられている。より最近の報告では、ヒトマイクロバイオータの組成が、化学療法及びチェックポイント阻害剤治療としての抗腫瘍治療の有効性とも関連するとされている。したがって、有益な細菌種と、中性又は攻撃的な細菌種との比の変化は、通常、宿主と相互作用する代謝物及び細菌成分のレベルに変化をもたらし、かかる疾患又は治療的治療で観察される腸の恒常性に変化をもたらす。

【0003】

更に、根底にあるメカニズムの多くは未だ特定されていないものの、ヒトマイクロバイオームは、宿主の炎症と免疫調節応答に重要な役割を果たす。例えば、最近の研究では、特定の細菌種が宿主の免疫応答を活性化又は阻害する可能性があることが示された（非特許文献１）。この研究では、５３種類のヒトマイクロバイオーム細菌種が、無菌マウスの単コロニー形成後に明確な免疫調節作用を有することが特定されている。

【0004】

宿主に対するヒトマイクロバイオームの前記した効果及び記載した相互作用は、マイクロバイオームそれ自体によって生成及び分泌される分子の集合体によって仲介され、これは、ヒト宿主細胞、特に免疫系受容体と直接相互作用することができる。Ｒａｔｎｅｒら、２０１７（非特許文献２）に記載されるように、特定の病原性細菌によって産生される分泌タンパク質は、この免疫調節作用において重要な役割を果たす。Ｒａｔｎｅｒらは、分泌系を介した活性化と阻害との間に微妙なバランスが存在し、その結果、生じ得る感染の炎症制御、クリアランス、又は拡散の正味の活性化がもたらされることを提案している。共生、延いてはヒトマイクロバイオームが受ける選択圧を考慮すると、これらの細菌が更に細かい調節、及び宿主免疫系との相互作用に関与していることは驚くべきことではない。結果として、マイクロバイオームと宿主との間のこれらの相互作用は、多くの疾患と免疫応答の調節における重要な要素である（非特許文献３）。

【0005】

宿主との相互作用を仲介する共生分子は、主に代謝物とタンパク質であり、これらは宿主の受容体に作用し、ヒト細胞で特定のシグナル伝達を引き起こす。しかし、この分野の大部分の研究は、これまでのところ、免疫系の恒常性又は全体的な宿主代謝をサポートする共生代謝物の同定に着目していた（非特許文献４～７）。

【0006】

これらの代謝物の同定は、メタボロミクスツールと、全糞便サンプル又は培養細菌における研究によってサポートされている新たな分野である。しかし、治療効果に関連し得る代謝物の同定及び使用は、化合物の合成及び完全な構造決定の困難性など、ＨＰＬＣ、ＬＣ－ＭＳ、及びＮＭＲなどの分析ツールを必要とし且つ長時間かかることがあるという、いくつかのハードルを伴う（非特許文献８及び非特許文献９）。

【0007】

微生物代謝物とは別に、微生物タンパク質も宿主と相互作用する分子とみなされる（非特許文献１０～１２）。微生物タンパク質は、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）、キナーゼ受容体、トランスポーターなどの多くのヒト受容体と相互作用できる可能性があり、免疫監視、代謝、細胞完全性などの様々な機能に関与する多くの異なるシグナル伝達経路に影響を与え得る。最近、ヒトと微生物タンパク質との間の分子模倣が、多くの細菌タンパク質の作用メカニズムとして提案された。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのタンパク質分解マルチシャペロン系のメンバーであるＣｌｐＢは、アルファＭＳＨを模倣することが報告された（非特許文献１３）；Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ＣａｇＡは、ヒト腫瘍抑制剤ＴＰ５３ＢＰ２と相互作用することが示された（非特許文献１４）；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓのＳＬＰＡは、ＤＣ及びＴ細胞機能の調節に機能的に関与するＤＣ－ＳＩＧＮリガンドであると報告された；Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓのＰ４０は、若年成体マウス結腸上皮細胞及びヒト結腸上皮細胞株で、ＥＧＦＲを活性化することが示された；ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍのタンパク質ＦＡｐ２は、腫瘍が発現したＧａｌ－ＧａｌＮＡｃに結合することにより、ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍの結腸直腸腺癌の濃縮を仲介し、ＴＩＧＩＴ受容体に結合することが示された（非特許文献１５）。したがって、共生細菌に由来する多くの異なるタンパク質は、宿主タンパク質を模倣する能力を有しており、いくつかの細胞経路にアゴナイズ又はアンタゴナイズする能力を有する。更に、ヒトマイクロバイオームに由来する様々なタンパク質は、宿主タンパク質の分泌を上昇させ得る（分泌促進物質、即ち、他の（ヒトの）物質の分泌を引き起こす（マイクロバイオームの）物質）。

【0008】

したがって、かかる微生物タンパク質は、様々な治療用途において有用であり得る。例えば、特定の状態又は疾患でのタンパク質の発現レベル及び発現の調節は、宿主に対する生物学的効果を示唆し得る。同定すれば、微生物タンパク質は、次いで、適切な細胞アッセイ、リガンド結合アッセイ、並びに生化学的及び酵素的アッセイに対する生物学的効果に関して、試験及び検証することができる。

【0009】

従来、微生物の培養、及び所望の表現型を有する個々の株のスクリーニングが広く使用されている。しかし、新たな培養方法が出現した（非特許文献１６）にもかかわらず、ヒトの腸の複雑な微生物コミュニティーは、標準的な実験技術では培養できない。したがって、機能的メタゲノミクスとして知られる、培養に依存しないアプローチは、ヒトマイクロバイオームを評価するための主要ツールである。ハイスループットシークエンシング及び関するメタゲノム技術の近年の発展は、この複雑なコミュニティーを理解し始めるための新たな機会を開いている。ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）技術は、培養不可能な微生物を含む、生態学的ニッチに属する全ての微生物の全ゲノムの分析を可能にする。

【0010】

治療用途において有用であり得る、ヒト宿主と相互作用する、かかる微生物タンパク質（又は細菌－細菌間相互作用などの、関心のある他の相互作用）を同定するために、ヒト宿主と相互作用する可能性を有する、全マイクロバイオームのタンパク質を含むデータベース／ライブラリーが望まれている。したがって、共生細菌に由来するタンパク質の大規模なライブラリー／データベースが必要である。かかるライブラリー／データベースは、次いで、例えば、ＧＰＣＲなどの選択されたヒト受容体に結合することができるタンパク質、又は、より一般的には、代謝、免疫、又は細胞完全性に対する特定の生物学的作用を引き起こすことができるタンパク質について、専用のリードアウトを用いることによって、スクリーニングされることができる。

【0011】

ヒトの腸のマイクロバイオームに対処する多様なメタゲノミクスアプローチにもかかわらず、かかるヒトの腸のマイクロバイオームタンパク質、特に、ヒト宿主と潜在的に相互作用して、治療用途のための標的及び／又は薬剤候補を提供するタンパク質に着目したライブラリー又はデータベースは存在しない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】Ｇｅｖａ－Ｚａｔｏｒｓｋｙ Ｎ， Ｓｅｆｉｋ Ｅ， Ｋｕａ Ｌ， Ｐａｓｍａｎ Ｌ， Ｔａｎ ＴＧ， Ｏｒｔｉｚ－Ｌｏｐｅｚ Ａ， Ｙａｎｏｒｔｓａｎｇ ＴＢ， Ｙａｎｇ Ｌ， Ｊｕｐｐ Ｒ， Ｍａｔｈｉｓ Ｄ， Ｂｅｎｏｉｓｔ Ｃ， Ｋａｓｐｅｒ ＤＬ． Ｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｕｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ． Ｃｅｌｌ． ２０１７ Ｆｅｂ ２３；１６８（５）：９２８－９４３．ｅ１１

【非特許文献2】Ｒａｔｎｅｒ， Ｄ．， Ｏｒｎｉｎｇ， Ｍ． Ｐ． Ａ．， ＆ Ｌｉｅｎ， Ｅ． （２０１７）． Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １０１（１）， １６５－１８１

【非特許文献3】Ｋｉｎｒｏｓｓ， Ｊ． Ｍ．， Ｄａｒｚｉ， Ａ． Ｗ．， ＆ Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ， Ｊ． Ｋ． （２０１１）． Ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ－ｈｏｓｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ３（３）， １４

【非特許文献4】Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ＪＫ， Ｈｏｌｍｅｓ Ｅ， Ｋｉｎｒｏｓｓ Ｊ， Ｂｕｒｃｅｌｉｎ Ｒ， Ｇｉｂｓｏｎ Ｇ， Ｊｉａ Ｗ， Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ Ｓ． Ｈｏｓｔ－ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２０１２ Ｊｕｎ ８；３３６（６０８６）：１２６２－７

【非特許文献5】Ｌｅｖｙ Ｍ， Ｔｈａｉｓｓ ＣＡ， Ｅｌｉｎａｖ Ｅ． Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ： ｍｅｓｓｅｎｇｅｒｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ２０１６ Ｊｕｌ １５；３０（１４）：１５８９－９７

【非特許文献6】Ｇｕｏ ＣＪ， Ｃｈａｎｇ ＦＹ， Ｗｙｃｈｅ ＴＰ， Ｂａｃｋｕｓ ＫＭ， Ａｃｋｅｒ ＴＭ， Ｆｕｎａｂａｓｈｉ Ｍ， Ｔａｋｅｔａｎｉ Ｍ， Ｄｏｎｉａ ＭＳ， Ｎａｙｆａｃｈ Ｓ， Ｐｏｌｌａｒｄ ＫＳ， Ｃｒａｉｋ ＣＳ， Ｃｒａｖａｔｔ ＢＦ， Ｃｌａｒｄｙ Ｊ， Ｖｏｉｇｔ ＣＡ， Ｆｉｓｃｈｂａｃｈ ＭＡ． Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｔｈａｔ Ｉｎｈｉｂｉｔ Ｈｏｓｔ Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ． Ｃｅｌｌ． ２０１７ Ｊａｎ ２６；１６８（３）：５１７－５２６．ｅ１８

【非特許文献7】Ｃｏｈｅｎ ＬＪ， Ｋａｎｇ ＨＳ， Ｃｈｕ Ｊ， Ｈｕａｎｇ ＹＨ， Ｇｏｒｄｏｎ ＥＡ， Ｒｅｄｄｙ ＢＶ， Ｔｅｒｎｅｉ ＭＡ， Ｃｒａｉｇ ＪＷ， Ｂｒａｄｙ ＳＦ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｅｎｄａｍｉｄｅ， ａ ＧＰＣＲ Ｇ２Ａ／１３２ ａｇｏｎｉｓｔ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２０１５ Ｓｅｐ １；１１２（３５）：Ｅ４８２５－３４

【非特許文献8】Ｓｈａｒｏｎ Ｇ， Ｇａｒｇ Ｎ， Ｄｅｂｅｌｉｕｓ Ｊ， Ｋｎｉｇｈｔ Ｒ， Ｄｏｒｒｅｓｔｅｉｎ ＰＣ， Ｍａｚｍａｎｉａｎ ＳＫ． Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｃｅｌｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ． ２０１４；２０（５）：７１９－７３０

【非特許文献9】Ｗｉｌｓｏｎ ＭＲ， Ｚｈａ Ｌ， Ｂａｌｓｋｕｓ ＥＰ． Ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２０１７ Ｍａｙ ２６；２９２（２１）：８５４６－８５５２

【非特許文献10】Ｗｅｉｇｅｌｅ ＢＡ， Ｏｒｃｈａｒｄ ＲＣ， Ｊｉｍｅｎｅｚ Ａ， Ｃｏｘ ＧＷ， Ａｌｔｏ ＮＭ． Ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１７ Ｓｅｐ １４；８（１）：５３２

【非特許文献11】Ｄｅｖｉｎ Ｋ． Ｓｃｈｗｅｐｐｅ， Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｈａｒｄｉｎｇ， Ｊｕａｎ Ｄ． Ｃｈａｖｅｚ， Ｘｉａ Ｗｕ， Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ Ｒａｍａｇｅ， Ｐｒａｄｅｅｐ Ｋ． Ｓｉｎｇｈ， Ｃｏｌｉｎ Ｍａｎｏｉｌ， Ｊａｍｅｓ Ｅ． Ｂｒｕｃｅ， Ｈｏｓｔ－Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｄｕｒｉｎｇ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２０１５， ２２（１１）：１５２１－１５３０

【非特許文献12】Ｇｕｖｅｎ－Ｍａｉｏｒｏｖ Ｅ， Ｔｓａｉ ＣＪ， Ｎｕｓｓｉｎｏｖ Ｒ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｈｏｓｔ－ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｎｅｔｗｏｒｋｓ． ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ． ２０１７ Ｏｃｔ １２；１３（１０）：ｅ１００５５７９

【非特許文献13】Ｂｒｅｔｏｎ Ｊ， Ｔｅｎｎｏｕｎｅ Ｎ， Ｌｕｃａｓ Ｎ， Ｆｒａｎｃｏｉｓ Ｍ， Ｌｅｇｒａｎｄ Ｒ， Ｊａｃｑｕｅｍｏｔ Ｊ， Ｇｏｉｃｈｏｎ Ａ， Ｇｕｅｒｉｎ Ｃ， Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｊ， Ｐｅｓｔｅｌ－Ｃａｒｏｎ Ｍ， Ｃｈａｎ Ｐ， Ｖａｕｄｒｙ Ｄ， ｄｏ Ｒｅｇｏ ＪＣ， Ｌｉｅｎａｒｄ Ｆ，Ｐｅｎｉｃａｕｄ Ｌ， Ｆｉｏｒａｍｏｎｔｉ Ｘ， Ｅｂｅｎｅｚｅｒ ＩＳ， Ｈｏｋｆｅｌｔ Ｔ， Ｄｅｃｈｅｌｏｔｔｅ Ｐ， Ｆｅｔｉｓｓｏｖ ＳＯ． Ｇｕｔ Ｃｏｍｍｅｎｓａｌ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｃｔｉｖａｔｅ Ｈｏｓｔ Ｓａｔｉｅｔｙ Ｐａｔｈｗａｙｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ． Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ． ２０１６ Ｆｅｂ ９；２３（２）：３２４－３４

【非特許文献14】Ｂｕｔｉ Ｌ， Ｓｐｏｏｎｅｒ Ｅ， Ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｅｎ ＡＧ， Ｒａｐｐｕｏｌｉ Ｒ， Ｃｏｖａｃｃｉ Ａ， Ｐｌｏｅｇｈ ＨＬ． Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ Ａ （ＣａｇＡ） ｓｕｂｖｅｒｔｓ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｐ５３ （ＡＳＰＰ２） ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｏｓｔ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２０１１ Ｍａｙ ３１；１０８（２２）：９２３８－４３

【非特許文献15】Ｇｕｒ Ｃ， Ｉｂｒａｈｉｍ Ｙ， Ｉｓａａｃｓｏｎ Ｂ， Ｙａｍｉｎ Ｒ， Ａｂｅｄ Ｊ， Ｇａｍｌｉｅｌ Ｍ， Ｅｎｋ Ｊ， Ｂａｒ－Ｏｎ Ｙ， Ｓｔａｎｉｅｔｓｋｙ－Ｋａｙｎａｎ Ｎ， Ｃｏｐｐｅｎｈａｇｅｎ－Ｇｌａｚｅｒ Ｓ， Ｓｈｕｓｓｍａｎ Ｎ， Ａｌｍｏｇｙ Ｇ， Ｃｕａｐｉｏ Ａ， Ｈｏｆｅｒ Ｅ， Ｍｅｖｏｒａｃｈ Ｄ， Ｔａｂｉｂ Ａ， Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ Ｒ， Ｍａｒｋｅｌ Ｇ， Ｍｉｋｌｉｃ Ｋ， Ｊｏｎｊｉｃ Ｓ， Ｂｒｅｎｎａｎ ＣＡ， Ｇａｒｒｅｔｔ ＷＳ， Ｂａｃｈｒａｃｈ Ｇ， Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ Ｏ． Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｆａｐ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＴＩＧＩＴ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｔｕｍｏｒｓ ｆｒｏｍ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ａｔｔａｃｋ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ． ２０１５ Ｆｅｂ １７；４２（２）：３４４－３５５

【非特許文献16】Ｓｏｍｍｅｒ ＭＯ． Ａｄｖａｎｃｉｎｇ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｕｓｉｎｇ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２０１５ Ｏｃｔ；２７：１２７－３２

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

前記に鑑みて、本発明の目的は、ヒトマイクロバイオームタンパク質、特に、ヒト宿主と相互作用するタンパク質のデータベース、例えば、ヒト宿主と相互作用するヒトの腸のマイクロバイオームタンパク質のデータベースなどを生成するための方法を提供することである。特に、本発明の目的は、ヒトの腸のマイクロバイオームメタセクレトームを含む、ヒトマイクロバイオームメタセクレトームのペプチド又はタンパク質を同定するための方法を提供することである。更に、本発明の目的は、また、かかるタンパク質を（インビトロで）合成するための方法を提供すること、及び医療用途のためのかかるタンパク質を提供することである。

【0014】

これらの目的は、以下及び添付の特許請求の範囲に示す発明主題によって達成される。

【0015】

以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は、本明細書に記載の特定の方法、プロトコル、及び試薬に、これらは変わる可能性があるので、限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用する用語は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。特段の断りがない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。

【0016】

以下に、本発明の要素について説明する。これら要素は、具体的な実施形態と共に列挙されるが、これらを任意の方式で任意の数組み合わせて更なる実施形態を生み出すことができることを理解すべきである。様々に記載される実施例及び好ましい実施形態は、本発明を明示的に記載される実施形態に限定することを意図するものではない。この記載は、明示的に記載された実施形態を任意の数の開示された及び／又は好ましい要素と組み合わせる実施形態をサポート及び包含すると理解すべきである。更に、特に指定しない限り、本願におけるすべての記載された要素の任意の入れ換え及び組合せが本願の記載によって開示されるとみなすべきである。

【0017】

本明細書及びその後に続く特許請求の範囲全体を通して、特に必要としない限り、用語「含む」並びに「含み」及び「含んでいる」などの変形は、指定されている部材、整数、又は工程を含むが、任意の他の指定されていない部材、整数、又は工程を除外するものではないことを意味すると理解される。用語「からなる」は、任意の他の指定されていない部材、整数、又は工程が除外される、用語「含む」の具体的な実施形態である。本発明において、用語「含む」は、用語「からなる」を包含する。したがって、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、Ｘのみからなっていてもよく、追加の何かを含んでいてもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ）。

【0018】

用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」、並びに本発明の説明（特に、特許請求の範囲）において使用される同様の参照は、本明細書に指定されているか又は文脈上明示的に否定されていない限り、単数及び複数の両方を網羅すると解釈すべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、範囲内の各別個の値を個別に参照する簡易的な方法として機能することを意図する。本明細書において特に指定しない限り、各個別の値は、本明細書に個々に列挙されているかのように明細書に組み込まれる。明細書中のいずれの言語も、本発明の実施に必須の任意の請求されていない要素を示すと解釈されるべきではない。

【0019】

用語「実質的に」は、「完全に」を除外するものではなく、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含んでいなくてもよい。必要な場合、用語「実質的に」は、本発明の定義から省略されることもある。

【0020】

数値ｘに関する用語「約」は、ｘ±１０％を意味する。

【0021】

本発明の項目
本発明は、特に、以下の項目を提供する。
１．ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を提供するための方法であって、以下の工程：
（ｉ）複数のヒトマイクロバイオータタンパク質配列及び／又は複数のヒトマイクロバイオータタンパク質をコードする複数の核酸配列を提供することと；
（ｉｉ）前記工程（ｉ）で提供された前記配列において、ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補の１以上の配列を同定することと；
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）で同定された前記配列を有する、又は前記工程（ｉｉ）で同定された前記配列によってコードされる１以上のヒトマイクロバイオータタンパク質を調製することと、を含み、
前記工程（ｉｉ）における、前記ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補の前記配列が、以下の基準にしたがって選択されることを特徴とする、方法。
－ シグナルペプチドを有する配列、又はシグナルペプチドを有するタンパク質をコードする配列である；
－ ２０～５００アミノ酸長を有する配列、又は２０～５００アミノ酸長を有するタンパク質をコードする配列である；及び
－ 少なくとも２つのシステイン残基及び／又は立体構造的に剛性な構造を与える一次及び／又は二次構造エレメントを含む配列、又は少なくとも２つのシステイン残基及び／又は立体構造的に剛性な構造を与える一次及び／又は二次構造エレメントを含むタンパク質をコードする配列である。
２．前記マイクロバイオータが、胃腸管マイクロバイオータ、肺マイクロバイオータ、唾液マイクロバイオータ、精液マイクロバイオータ、皮膚マイクロバイオータ、及び膣マイクロバイオータからなる群から選択されるマイクロバイオータである、項目１に記載の方法。
３．前記マイクロバイオータが、腸マイクロバイオータ及び口腔マイクロバイオータから選択される胃腸管マイクロバイオータである、項目１又は２に記載の方法。
４．前記ヒトマイクロバイオータタンパク質が、細菌タンパク質、古細菌タンパク質、原生生物タンパク質、真菌タンパク質、ウイルスタンパク質、及び／又はファージタンパク質である、項目１から３のいずれかに記載の方法。
５．前記ヒトマイクロバイオータタンパク質が、細菌タンパク質、好ましくは、ヒトの胃腸管マイクロバイオータメタセクレトームのものである、項目１から４のいずれかに記載の方法。
６．前記ヒトマイクロバイオータタンパク質が、ヒトの胃腸管マイクロバイオータの細菌タンパク質である、項目１から４のいずれかに記載の方法。
７．前記工程（ｉ）において、ヒトマイクロバイオータタンパク質配列のデータベース及び／又はヒトマイクロバイオータタンパク質をコードする核酸配列のデータベースが提供される、項目１から６のいずれかに記載の方法。
８．前記マイクロバイオータのデータベースが、複数の宿主個体のマイクロバイオータ配列を含む、項目７に記載の方法。
９．前記マイクロバイオータのデータベースが、複数の宿主個体のマイクロバイオータデータではなく、単一の宿主個体のマイクロバイオータデータを含む、項目８に記載の方法。
１０．前記工程（ｉ）が、以下のサブ工程を含む、項目７から９のいずれかに記載の方法。
（ｉ－ａ）任意に、単一又は複数の個体のサンプルから、マイクロバイオータタンパク質配列又は核酸配列を同定すること、及び
（ｉ－ｂ）単一又は複数の個体のマイクロバイオータタンパク質配列又は核酸配列を含むデータベースを編集すること。
１１．前記工程（ｉ－ａ）におけるサンプルが、便サンプルである、項目１０に記載の方法。
１２．前記工程（ｉｉ）におけるシグナルペプチドの同定が、インシリコで行われる、項目１から１１のいずれかに記載の方法。
１３．前記工程（ｉｉ）におけるシグナルペプチドの同定が、２つの異なる方法を用いることによって行われ、両方の方法にしたがうシグナルペプチドを有する配列又はコードする配列が選択される、項目１から１２のいずれかに記載の方法。
１４．前記工程（ｉｉ）におけるシグナルペプチドの同定が、Ｐｈｏｂｉｕｓ及び／又はＳｉｇｎａｌＰを用いることによって行われる、項目１から１３のいずれかに記載の方法。
１５．前記ヒトマイクロバイオータタンパク質が、２０～３５０アミノ酸長を有する、項目１から１４のいずれかに記載の方法。
１６．前記ヒトマイクロバイオータタンパク質が、少なくとも２つのシステイン残基を含む、項目１から１５のいずれかに記載の方法。
１７．前記システイン残基が、前記ヒトマイクロバイオータタンパク質の総アミノ酸の４％超を占める、項目１６に記載の方法。
１８．前記ヒトマイクロバイオータタンパク質が、偶数個のシステイン残基を含み、例えば、少なくとも１つ又は２つのシステイン対を形成する、項目１６又は１７に記載の方法。
１９．前記ヒトマイクロバイオータタンパク質のシステイン含量が、ＫＡＰＰＡを使用して同定される、項目１６から１８のいずれかに記載の方法。
２０．前記立体構造的に剛性な構造を与える一次及び／又は二次構造エレメントが、システインモチーフ、ロイシンリッチリピート、アルファヘリックス、ベータシート、及びコイルからなる群から選択される、項目１から１９のいずれかに記載の方法。
２１．前記立体構造的に剛性な構造を与える一次及び／又は二次構造エレメントが、ジスルフィド架橋である、項目１から２０のいずれかに記載の方法。
２２．前記ヒトマイクロバイオータタンパク質が、２０～２００アミノ酸長を有し、且つ少なくとも２つのシステイン残基を含み、例えば、少なくとも１つのシステイン対を形成する、項目１から２１のいずれかに記載の方法。
２３．前記ヒトマイクロバイオータタンパク質が、５０～１５０アミノ酸長を有し、且つ少なくとも４つのシステイン残基を含み、例えば、少なくとも２つのシステイン対を形成する、項目１から２２のいずれかに記載の方法。
２４．前記ヒトマイクロバイオータタンパク質が、２０～５０アミノ酸長を有し、且つアルファヘリックス、ベータシート、及びコイルからなる群から選択される二次構造エレメントを含む、項目１から２２のいずれかに記載の方法。
２５．前記工程（ｉｉ）において、シグナルペプチドを有する又はコードする配列の同定が、以下の前に行われる、項目１から２４のいずれかに記載の方法。
－ ２０～５００アミノ酸長を有する配列又は２０～５００アミノ酸長を有する配列をコードする配列の同定；及び／又は
－ 少なくとも２つのシステイン残基及び／又は立体構造的に剛性な構造を与える一次及び／又は二次構造エレメントを含む配列の同定。
２６．前記シグナルペプチドの配列が、以下に含まれない、項目２５に記載の方法。
－ ２０～５００アミノ酸長を有する配列又は２０～５００アミノ酸長を有する配列をコードする配列の同定；及び／又は
－ 少なくとも２つのシステイン残基及び／又は立体構造的に剛性な構造を与える一次及び／又は二次構造エレメントを含む配列の同定。
２７．前記工程（ｉｉ）において、未知の機能を有するタンパク質又は核酸配列を、好ましくはインシリコ法を用いて、アノテートする、項目１から２６のいずれかに記載の方法。
２８．前記配列を、ＨＭＭＳＣＡＮ及び／又はＰＦＡＭを用いて、アノテートする、項目２７に記載の方法。
２９．前記工程（ｉｉ）において、冗長な配列が、同定され除去される、項目１から２８のいずれかに記載の方法。
３０．前記工程（ｉｉ）において、別の配列と、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも７５％の配列同一性を有する配列が、同定され除去される、項目２９に記載の方法。
３１．ＣＤ－ＨＩＴを使用して冗長な配列を同定する、項目２９又は３０に記載の方法。
３２．前記工程（ｉｉ）において、分泌タンパク質のシグナルペプチドが、グラム陰性菌のリポタンパク質と区別される、項目１から３１のいずれかに記載の方法。
３３．分泌タンパク質のシグナルペプチドを、グラム陰性菌のリポタンパク質から区別する工程が、ＬｉｐｏＰを用いて行われる、項目３２に記載の方法。
３４．前記ヒトマイクロバイオータタンパク質が、ヒト宿主タンパク質の模倣物又は分泌促進物質（ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅ）であり、例えば、サイトカイン、インターロイキン、ケモカイン、成長因子、神経ペプチド、及びペプチドホルモンからなる群から選択される、項目１から３３のいずれかに記載の方法。
３５．前記ヒトマイクロバイオータタンパク質が、分泌促進物質である、項目１から３４のいずれかに記載の方法。
３６．前記分泌促進物質が、ヒト免疫細胞によるインターロイキン－１０（ＩＬ－１０）の分泌を誘導する、項目３５に記載の方法。
３７．同定された前記タンパク質が、免疫調節性である、項目１から３６のいずれかに記載の方法。
３８．前記ヒトマイクロバイオータタンパク質が、前記工程（ｉｉｉ）において、化学合成によって調製される、項目１から３７のいずれかに記載の方法。
３９．前記ヒトマイクロバイオータタンパク質が、前記工程（ｉｉｉ）において、インビトロ合成（無細胞発現）又は組換え過剰発現によって調製される、項目１から３８のいずれかに記載の方法。
４０．核酸分子が、前記タンパク質を調製するためのテンプレートとして使用され、前記方法が、以下の工程を含む、項目３９に記載の方法。
－前記核酸配列の開始コドンと終止コドンを同定すること。
４１．前記工程（ｉｉｉ）で調製された前記ヒトマイクロバイオータタンパク質が、前記工程（ｉｉ）で同定された前記シグナルペプチドなしで合成される、項目１から４０のいずれかに記載の方法。
４２．前記タンパク質の調製前に、前記シグナルペプチドをインシリコで除去する、項目４１に記載の方法。
４３．前記方法が、（得られた）タンパク質の少なくとも１つの生物学的活性、特に、ヒト宿主との相互作用に関する生物学的活性、を決定する更なる工程（ｉｖ）を含む、項目１から４２のいずれかに記載の方法。
４４．前記生物学的活性が、インシリコで試験される、項目４３に記載の方法。
４５．前記ヒトマイクロバイオータタンパク質の構造が決定され、ヒト宿主分子、特に、ヒト宿主タンパク質の構造と比較される、項目４３又は４４に記載の方法。
４６．前記生物学的活性が、インビトロ又はインビボで試験される、項目４３から４５のいずれかに記載の方法。
４７．生物学的活性試験が、共免疫沈降、二分子蛍光補完、アフィニティ電気泳動、ラベルトランスファー、ファージディスプレイ、タンデムアフィニティ精製、光反応性アミノ酸類似体（インビボ）、ＳＰＩＮＥ、ノックダウンと組み合わせた定量的免疫沈降（ＱＵＩＣＫ）、バイオレイヤー干渉法、二重分極干渉法（ＤＰＩ）、静的光散乱（ＳＬＳ）、動的光散乱（ＤＬＳ）、表面プラズモン共鳴、蛍光分極／異方性、蛍光相関分光法、蛍光相互相関分光法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｒｏｓｓ－ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）（ＦＣＣＳ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、ＮＭＲ、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）、回転セルベースリガンド結合アッセイ（Ｒｏｔａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）、単色反射率測定（ＳＣＯＲＥ）、マイクロアレイ、特に、ペプチドアレイ及びタンパク質アレイ、並びにペプチドファージディスプレイ、酵母表面ディスプレイ、酵母ツーハイブリッド及び細菌ツーハイブリッドスクリーンなどのディスプレイ法からなる群から選択される、項目４６に記載の方法。
４８．得られた前記タンパク質の、代謝、免疫、又は細胞完全性などの生物学的メカニズムへの関与を調べるために、前記生物学的活性をスクリーニング法によって試験する、項目４３から４７のいずれかに記載の方法。
４９．得られた前記タンパク質を、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）専用のアッセイを用いて試験する、項目４３から４８のいずれかに記載の方法。
５０．得られた前記タンパク質を、ヒト細胞からのカルシウム放出の誘導に関するアッセイを用いて試験する、項目４３から４９のいずれかに記載の方法。
５１．得られた前記タンパク質を、任意に、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）などのヒト免疫細胞、又はヒト免疫細胞の選択されたサブセットを伴う、免疫に関するアッセイを用いて試験する、項目４３から５０のいずれかに記載の方法。
５２．得られた前記タンパク質に曝露されたヒト細胞からのサイトカイン放出を決定する、項目４３から５１のいずれかに記載の方法。
５３．項目１から５２のいずれかに記載の方法によって得ることができることを特徴とする、ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補のライブラリー。
５４．ヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質を同定するための方法であって、以下の工程：
（ｉ）複数のヒトマイクロバイオータタンパク質配列及び／又は複数のヒトマイクロバイオータタンパク質をコードする複数の核酸配列を提供することと；
（ｉｉ）前記工程（ｉ）で提供された前記配列において、ヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質の１以上の配列を同定することと、を含み、
前記ヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質の前記配列が、以下の基準にしたがって選択されることを特徴とする、方法。
－ シグナルペプチドを有する配列、又はシグナルペプチドを有するタンパク質をコードする配列である；
－ ２０～５００アミノ酸長を有する配列、又は２０～５００アミノ酸長を有するタンパク質をコードする配列である；及び
－ 少なくとも２つのシステイン残基及び／又は立体構造的に剛性な構造を与える一次及び／又は二次構造エレメントを含む配列、又は少なくとも２つのシステイン残基及び／又は立体構造的に剛性な構造を与える一次及び／又は二次構造エレメントを含むタンパク質をコードする配列である。
５５．項目２から３７のいずれかに定義されるように行われる、項目５４に記載の方法。
５６．項目５４又は５５に記載の複数のヒトマイクロバイオータメタセクレトーム配列の同定を含むことを特徴とする、ヒトマイクロバイオータメタセクレトーム配列データベースを生成するための方法。
５７．前記工程（ｉ）において、複数のヒトマイクロバイオータタンパク質配列及び／又は複数のヒトマイクロバイオータタンパク質をコードする複数の核酸配列が提供され、データベースに編集され、その後の工程が、前記データベース又は前記データベースに含まれる配列に対して行われる、項目５６に記載の方法。
５８．項目５４又は５５に記載の、複数のヒトマイクロバイオータメタセクレトームタンパク質配列及び／又は複数のヒトマイクロバイオータタンパク質をコードする複数の核酸配列の同定と、それに続く以下の工程とを含むことを特徴とする、ヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質を調製するための方法。
－ ヒトマイクロバイオータメタセクレトームの１以上のタンパク質を、これまでに同定された配列に基づいて調製すること。
５９．ヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質を調製するための方法であって、前記タンパク質が、項目３８から４２のいずれかで定義されるように調製されることを特徴とする、方法。
６０．ヒト宿主分子と相互作用するヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質を同定及び／又は提供するための方法であって、
－ 項目５４又は５５に記載の、複数のヒトマイクロバイオータメタセクレトームタンパク質配列及び／又は複数のヒトマイクロバイオータタンパク質をコードする複数の核酸配列の同定と、
－ 任意に、項目５８又は５９に記載の、ヒトマイクロバイオータメタセクレトームの１以上のタンパク質の調製と、
続いて、前記ヒトマイクロバイオータメタセクレトームの同定／調製されたタンパク質の、ヒト宿主分子、特に、ヒト宿主タンパク質との相互作用を試験する工程とを含むことを特徴とする、方法。
６１．項目４４から５２のいずれかに定義されるように、生物学的活性を試験する、項目６０に記載の方法。
６２．医学における使用のための、項目１から５２及び５８から６１のいずれかに記載の方法によって得ることができることを特徴とする、ヒトマイクロバイオータメタセクレトームタンパク質。
６３．配列番号１～１０のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、項目６２にしたがって使用するためのヒトマイクロバイオータメタセクレトームタンパク質。
６４．以下の工程を含むことを特徴とする、疾患の予防及び／又は治療のための薬剤を調製するための方法。
（ａ）項目１から５２及び５４から６１のいずれかにしたがって、ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を提供すること；
（ｂ）以下を含む医薬組成物を調製すること：
（１）前記ヒトマイクロバイオータメタセクレトームの前記タンパク質、又はその機能的断片若しくは配列変異体；
（２）（１）に記載の前記タンパク質をコードする核酸分子；
（３）（１）に記載の前記タンパク質を発現する又は（２）に記載の前記核酸分子を含む細胞；
（４）（１）に記載の前記タンパク質に結合する抗体；
（５）（４）に記載の前記抗体をコードする核酸分子；
（６）（４）に記載の前記抗体を発現する又は（５）に記載の前記核酸分子を含む細胞；
（７）（１）に記載の前記タンパク質と相互作用する化合物；又は
（８）（１）に記載の前記タンパク質の、前記ヒト宿主分子との相互作用（結合）に干渉する化合物、
及び、任意に、薬学的に許容される担体及び／又はアジュバント。

【0022】

本発明、特に上で概説した項目について、以下、より詳細に説明する。

【0023】

ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を提供するための方法
第１の態様において、本発明は、ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を提供するための方法を提供し、前記方法は、以下の工程：
（ｉ）複数のヒトマイクロバイオータタンパク質配列及び／又は複数のヒトマイクロバイオータタンパク質をコードする複数の核酸配列を提供することと；
（ｉｉ）前記工程（ｉ）で提供された前記配列において、ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補の１以上の配列を同定することと；
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）で同定された前記配列を有する、又は前記工程（ｉｉ）で同定された前記配列によってコードされる１以上のヒトマイクロバイオータタンパク質を調製することと、を含み、
前記工程（ｉｉ）における、前記ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補の前記配列が、以下の基準にしたがって選択される。
－ シグナルペプチドを有する配列、又はシグナルペプチドを有するタンパク質をコードする配列である；
－ ２０～５００アミノ酸長を有する配列、又は２０～５００アミノ酸長を有するタンパク質をコードする配列である；及び
－ 少なくとも２つのシステイン残基及び／又は立体構造的に剛性な構造を与える一次及び／又は二次構造エレメントを含む配列、又は少なくとも２つのシステイン残基及び／又は立体構造的に剛性な構造を与える一次及び／又は二次構造エレメントを含むタンパク質をコードする配列である。

【0024】

いかなる理論にも拘束されるものではないが、本発明者らは、共生マイクロバイオータ、特に、ヒトマイクロバイオームのマイクロバイオータが、数千世代に亘る細菌の進化、特に、活性、バイオアベイラビリティ、毒性などに関する細菌の進化によって、特にそれらの（ヒトの）宿主だけでなく、細菌－細菌間相互作用などのマイクロバイオータコミュニティーを含む、環境との相互作用／コミュニケーションのための分泌タンパク質を最適化していると仮定している。前記に鑑みると、ヒトマイクロバイオームメタセクレトームのタンパク質は、様々な（ヒトの）疾患の予防及び治療のための理想的な薬剤候補である。したがって、ヒト宿主に存在するマイクロバイオータによって発現される多くのタンパク質の中から、ヒト宿主と相互作用するタンパク質を同定するために、本発明者らは、ヒトマイクロバイオータのメタセクレトームに着目した。ヒトマイクロバイオータとヒト宿主との間のクロストークは、直接的な細胞－細胞間接触又は細胞によって分泌される低分子によって仲介されると想定されている。したがって、細胞表面に位置する、又は分泌されるマイクロバイオータタンパク質は、マイクロバイオータ－宿主間相互作用などの相互作用に関与している。

【0025】

前記に鑑みると、「ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補」は、ヒトマイクロバイオームのマイクロバイオータ、即ち、ヒトマイクロバイオームのメタセクレトームによって発現される（又は発現されると予測される）微生物タンパク質である。したがって、本明細書においては、しばしば、「ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補」を、「ヒトマイクロバイオータ（メタセクレトーム）タンパク質」又は「ヒトマイクロバイオータ（メタセクレトーム）のタンパク質」などとも称する。

【0026】

本発明において、即ち、本願全体を通して、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」、及びこれらの用語の変形は、好ましくは通常のペプチド結合によって、或いは、イソステリックペプチド（ｉｓｏｓｔｅｒｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）の場合などのように、修飾されたペプチド結合によって互いに結合された少なくとも２つのアミノ酸を含むペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質を意味する。特に、用語「タンパク質」は、それらの長さに関係なく、ペプチド及びタンパク質を意味する。したがって、用語「タンパク質」は、特に、短いペプチド（例えば、オリゴペプチド）並びに長い（より長い）ポリペプチド及びタンパク質を含む。

【0027】

用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」は、非ペプチド構造要素を含むペプチド類似体として定義される「ペプチド模倣物」も含むことができ、これらのペプチドは、天然の親ペプチドの生物学的作用を模倣する又はそれに拮抗することができる。ペプチド模倣体は、酵素で切断可能なペプチド結合などの古典的なペプチド特性を欠く。特に、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質は、遺伝暗号によって定義された２０個のアミノ酸以外のアミノ酸を、これらのアミノ酸に加えて含むことができ、又は遺伝暗号によって定義された２０個のアミノ酸以外のアミノ酸から構成されることができる。特に、本発明におけるペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質は、翻訳後成熟プロセスなどの天然プロセス又は化学プロセスによって修飾されたアミノ酸から等しく構成することができ、これらは当業者によく知られている。かかる修飾は、文献に十分詳述されている。これらの修飾は、ポリペプチドの任意の箇所に現れることがあり、即ち、ペプチド骨格中、アミノ酸鎖中、更にはカルボキシ又はアミノ末端に現れることがある。特に、ペプチド又はポリペプチドは、ユビキチン化に続いて分岐する、又は分岐の有無にかかわらず環状であり得る。このタイプの修飾は、当業者によく知られた天然又は合成の翻訳後プロセスの結果であり得る。本発明における用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」は、特に、修飾されたペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質も含む。例えば、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ－リボシル化、アミド化、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合固定、脂質又は脂質誘導体の共有結合固定、ホスファチジルイノシトールの共有結合固定、共有結合又は非共有結合の架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、ＰＥＧ化を含むグリコシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセス、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セネロイル化、硫酸化（ｓｕｌｆａｔａｔｉｏｎ）、アルギニル化又はユビキチン化などのアミノ酸付加などを含むことができる。かかる修飾は、文献に十分に詳述されている（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（１９９３）２ｎｄ Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８３）Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６－６４６ ａｎｄ Ｒａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，６６３：４８－６２）。したがって、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」は、好ましくは、リポペプチド、リポタンパク質、糖ペプチド、糖タンパク質などを含む。

【0028】

いくつかの実施形態においては、本発明に係るヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質は、「古典的」（ポリ）ペプチド又はタンパク質であり、それにより「古典的」（ポリ）ペプチド／タンパク質は、典型的には、遺伝暗号によって定義される２０種のアミノ酸から選択されるアミノ酸が、通常のペプチド結合により互いに結合されて構成される。

【0029】

本明細書で使用される用語「マイクロバイオータ」は、これまでに植物から動物に至るまで研究されたあらゆる多細胞生物中又は上に存在する、片利共生微生物、相利共生微生物、及び病原微生物を意味する。特に、マイクロバイオータは、宿主の免疫学的、ホルモン的、代謝的恒常性にとって重要であることが分かっている。マイクロバイオータは、細菌、古細菌、原生生物、真菌、ウイルス、及びファージを含む。したがって、ヒトマイクロバイオータタンパク質は、細菌タンパク質、古細菌タンパク質、原生生物タンパク質、真菌タンパク質、ウイルスタンパク質、及び／又はファージタンパク質であり得る。好ましくは、ヒトマイクロバイオータタンパク質は、細菌タンパク質又は古細菌タンパク質である。より好ましくは、マイクロバイオータタンパク質は、細菌タンパク質である。

【0030】

解剖学的には、マイクロバイオータは、胃腸管、特に、腸（及び口腔、特に、口腔粘膜）、皮膚、結膜、乳腺、膣、胎盤、精液、子宮、卵巣濾胞、肺、及び唾液を含む、多くの組織及び体液のいずれかの上又は中に存在する。したがって、マイクロバイオータは、胃腸管マイクロバイオータ、肺マイクロバイオータ、唾液マイクロバイオータ、精液マイクロバイオータ、皮膚マイクロバイオータ、及び膣マイクロバイオータからなる群から選択することができる。いくつかの実施形態においては、マイクロバイオータは、腸マイクロバイオータ及び口腔マイクロバイオータから選択される胃腸管マイクロバイオータである。したがって、ヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質は、ヒトの胃腸管に存在するマイクロバイオータ、即ち、「ヒトの胃腸管マイクロバイオータ」によって発現される微生物タンパク質であり得る。これは、例えば、腸内及び／又はヒトの口腔内に存在するマイクロバイオータによって発現されるタンパク質を含む。他の実施形態では、ヒトマイクロバイオータタンパク質のタンパク質は、胃腸管以外の（胃腸管の外側の）組織及び体液、例えば、皮膚又は生殖器系（特に、膣）に存在するマイクロバイオータによって発現される微生物タンパク質である。好ましくは、前記タンパク質は、ヒト腸マイクロバイオータメタセクレトームなどのヒト胃腸管マイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質、即ち、ヒトの胃腸管、特に、ヒトの腸に存在するマイクロバイオータによって発現される微生物タンパク質である。より好ましくは、前記タンパク質は、ヒトの腸内細菌メタセクレトームのタンパク質、即ち、ヒトの腸内に存在する細菌によって発現される細菌タンパク質である。

【0031】

本発明は、特に、ヒトの内部及びヒトの表面に存在するマイクロバイオータに関する。かかるマイクロバイオータを、本明細書では「ヒトマイクロバイオータ」とも称する（ここで、ヒトという用語は、具体的に、マイクロバイオータの局在／所在を意味する）。

【0032】

本明細書においては、用語「メタセクレトーム」は、前記したヒトの組織及び／又は体液上又はその内部、例えば、ヒトの胃腸管に存在する微生物コミュニティーなどの、環境の（微生物の）コミュニティー（マイクロバイオーム）からの分泌タンパク質、外表面タンパク質、内表面タンパク質、及び膜貫通タンパク質の集合体を意味する。したがって、「ヒトマイクロバイオータメタセクレトーム」という表現は、ヒト宿主内に（又はその上に）存在するマイクロバイオータからの分泌タンパク質、外表面タンパク質、及び膜貫通タンパク質の集合体を意味する。いかなる理論にも拘束されるものではないが、メタセクレトームのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、総メタゲノムの僅か１０％～３０％を構成すると想定される。用語「セクレトーム」は、膜貫通タンパク質（ＴＭ）、外表面タンパク質、内表面タンパク質、及び細胞によって細胞外環境／空間に分泌されるタンパク質からなるタンパク質の集合体を意味する。いくつかの実施形態においては、メタセクレトームタンパク質は、分泌タンパク質である。換言すれば、いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は、マイクロバイオータ（前記タンパク質を発現する）から、特に、細胞外環境／空間に放出され、前記マイクロバイオータ（又はその外表面）に結合しない。

【0033】

一般に、本発明においては、ヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質は、そのタンパク質配列（アミノ酸配列）に基づいて、又はそのタンパク質配列をコードする核酸配列に基づいて同定することができる。したがって、本発明に係る方法のいずれの工程も、タンパク質配列（アミノ酸配列）及び／又は前記タンパク質配列をコードする核酸配列に対して行うことができる。したがって、本明細書で使用される用語「配列／複数の配列」は、タンパク質配列（アミノ酸配列）及び／又は（前記タンパク質配列をコードする）核酸配列を意味する。

【0034】

一般に、用語「核酸」又は「核酸分子」は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、発現エレメントを含む又は含まない相補的ＲＮＡ／ＤＮＡ配列、ミニ遺伝子、遺伝子断片、調節エレメント、プロモーター、及びそれらの組合せから好ましくは選択される、一本鎖、二本鎖、又は部分二本鎖核酸などの任意の核酸を含む。核酸（分子）及び／又はポリヌクレオチドの更なる例としては、例えば、組換えポリヌクレオチド、ベクター、オリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ分子、又は前記したＤＮＡ分子が挙げられる。したがって、核酸（分子）は、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子であることができ、好ましくは、ゲノムＤＮＡ；ｃＤＮＡ；ｍＲＮＡ；発現エレメント、調節エレメント、及び／又はプロモーターを含む又は含まないＲＮＡ及び／又はＤＮＡ配列；ベクター；及びそれらの組合せであることができる。

【0035】

複数のヒトマイクロバイオータタンパク質配列の提供
本発明に係るヒトマイクロバイオータのタンパク質を同定するための方法の工程（ｉ）において、複数のヒトマイクロバイオータタンパク質配列及び／又は複数のヒトマイクロバイオータタンパク質をコードする複数の核酸配列が提供される。

【0036】

用語「ヒトマイクロバイオータタンパク質配列」は、予測されるタンパク質配列を含むことが理解される。したがって、ヒトマイクロバイオータタンパク質をコードする「核酸配列」は、予測されるマイクロバイオータタンパク質をコードする核酸配列、又はマイクロバイオータタンパク質をコードすると予測される核酸配列であり得る。

【0037】

（ヒト）マイクロバイオームの分野では、マイクロバイオームタンパク質の同定は、ショットガン次世代シークエンシング法などの現代のハイスループットシークエンシングで通常取得される、利用可能な核酸配列に基づくコード化タンパク質の予測によって広く行われている。例えば、腸のマイクロバイオームに関しては、糞便サンプルのマイクロバイオータが、しばしば、全ゲノムショットガン次世代シークエンシング（ＮＧＳ）を用いて、腸のマイクロバイオータの代わりとして分析される。これにより、短い核酸セグメントの配列（「リード」）が得られ、複数の重複するリードを連続配列（「コンティグ」）にアセンブルすることができる。マイクロバイオームコンティグは、当技術分野で知られている方法で取得することができる、又はＮＩＨ Ｈｕｍａｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｈｍｐｄａｃｃ．ｏｒｇ／ｈｍａｓｍ２／）の「ＨＭＡＳＭ２－Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅｓ」などの公開ライブラリーからダウンロードすることができる。かかる配列中のマイクロバイオーム遺伝子及びタンパク質を同定するために、原核生物遺伝子検出ツールを使用することができる。原核生物の遺伝子検出ツールの非限定的な例としては、以下が挙げられる。
－ ＧｅｎｅＭａｒｋファミリーのツール（ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｅｘｏｎ．ｇａｔｅｃｈ．ｅｄｕ／ＧｅｎｅＭａｒｋ／）、例えば、ＧｅｎｅＭａｒｋＳ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｅｘｏｎ．ｇａｔｅｃｈ．ｅｄｕ／ＧｅｎｅＭａｒｋ／ｇｅｎｅｍａｒｋｓ．ｃｇｉ； Ｊｏｈｎ Ｂｅｓｅｍｅｒ， Ａｌｅｘａｎｄｒｅ Ｌｏｍｓａｄｚｅ ａｎｄ Ｍａｒｋ Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ， ＧｅｎｅＭａｒｋＳ： ａ ｓｅｌｆ－ｔｒａｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｓｔａｒｔｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｇｅｎｏｍｅｓ． Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｆｉｎｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｍｏｔｉｆｓ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｇｉｏｎｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （２００１） ２９， ｐｐ ２６０７－２６１８）；ＧｅｎｅＭａｒｋ．ｈｍｍ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｅｘｏｎ．ｇａｔｅｃｈ．ｅｄｕ／ＧｅｎｅＭａｒｋ／ｇｍｈｍｍｐ．ｃｇｉ；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｌｕｋａｓｈｉｎ ａｎｄ Ｍａｒｋ Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ， ＧｅｎｅＭａｒｋ．ｈｍｍ： ｎｅｗ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｆｉｎｄｉｎｇ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （１９９８） ２６， ｐｐ １１０７－１１１５）； ＭｅｔａＧｅｎｅＭａｒｋ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｅｘｏｎ．ｇａｔｅｃｈ．ｅｄｕ／ＧｅｎｅＭａｒｋ／ｍｅｔａ＿ｇｍｈｍｍｐ．ｃｇｉ； Ｗｅｎｈａｎ Ｚｈｕ， Ａｌｅｘ Ｌｏｍｓａｄｚｅ ａｎｄ Ｍａｒｋ Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ， Ａｂ ｉｎｉｔｉｏ ｇｅｎｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （２０１０） ３８， ｅ１３２）；及びＧｅｎｅＭａｒｋＳ２ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｅｘｏｎ．ｇａｔｅｃｈ．ｅｄｕ／ＧｅｎｅＭａｒｋ／ｇｅｎｅｍａｒｋｓ２．ｃｇｉ； Ｌｏｍｓａｄｚｅ Ａ， Ｇｅｍａｙｅｌ Ｋ， Ｔａｎｇ Ｓ， Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ Ｍ， Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｌｅａｄｅｒｌｅｓｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ａｔｙｐｉｃａｌ ｇｅｎｅｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｍｏｒｅ ａｃｃｕｒａｔｅ ｇｅｎｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ， ２０１８， ２９（７）， ｐｐ １０７９－１０８９）；
－ ＧＬＩＭＭＥＲ（Ｇｅｎｅ Ｌｏｃａｔｏｒ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｐｏｌａｔｅｄ Ｍａｒｋｏｖ ＭｏｄｅｌＥＲ）、ＧＬＩＭＭＥＲ ３．０が、現在、最新バージョンである（ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｃｃｂ．ｊｈｕ．ｅｄｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｇｌｉｍｍｅｒ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ； Ｓ． Ｓａｌｚｂｅｒｇ， Ａ． Ｄｅｌｃｈｅｒ， Ｓ． Ｋａｓｉｆ， ａｎｄ Ｏ． Ｗｈｉｔｅ． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｇｅｎｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｉｎｔｅｒｐｏｌａｔｅｄ Ｍａｒｋｏｖ ｍｏｄｅｌｓ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２６：２ （１９９８）， ５４４－５４８； Ａ．Ｌ． Ｄｅｌｃｈｅｒ， Ｋ．Ａ． Ｂｒａｔｋｅ， Ｅ．Ｃ． Ｐｏｗｅｒｓ， ａｎｄ Ｓ．Ｌ． Ｓａｌｚｂｅｒｇ． Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｅｎｄｏｓｙｍｂｉｏｎｔ ＤＮＡ ｗｉｔｈ Ｇｌｉｍｍｅｒ， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３：６ （２００７）， ６７３－６７９）；及び
－ ＰＲＯＤＩＧＡＬ（Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ｄｙｎａｍｉｃ Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ Ｇｅｎｅｆｉｎｄｉｎｇ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）及びＭｅｔａＰｒｏｄｉｇａｌ（ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｃｏｄｅ．ｇｏｏｇｌｅ．ｃｏｍ／ｐ／ｐｒｏｄｉｇａｌ／； Ｈｙａｔｔ Ｄ， Ｃｈｅｎ ＧＬ， Ｌｏｃａｓｃｉｏ ＰＦ， Ｌａｎｄ ＭＬ， Ｌａｒｉｍｅｒ ＦＷ， Ｈａｕｓｅｒ ＬＪ， Ｐｒｏｄｉｇａｌ： ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ． ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ１１ （１）：１１９ （２０１０）； Ｈｙａｔｔ Ｄ， ＬｏＣａｓｃｉｏ ＰＦ， Ｈａｕｓｅｒ ＬＪ， Ｕｂｅｒｂａｃｈｅｒ ＥＣ． Ｇｅｎｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２０１２；２８（１７）：２２２３－３０）．

【0038】

これらの遺伝子検出ツールのうち、ＧｅｎｅＭａｒｋファミリー、特に、ＧｅｎｅＭａｒｋＳ２が好ましい。

【0039】

複数のヒトマイクロバイオータタンパク質配列及び／又は複数のヒトマイクロバイオータタンパク質をコードする複数の核酸配列は、好ましくは、データベースに基づいて提供される。したがって、工程（ｉ）において、好ましくは、ヒトマイクロバイオータタンパク質配列のデータベース及び／又はヒトマイクロバイオータタンパク質をコードする、又はコードすると予測される核酸配列のデータベースが提供される。用語「データベース」は、（組織化された）データの集合を意味する。したがって、ヒトマイクロバイオータデータ又は核酸配列データの任意の集合は、複数のヒトマイクロバイオータタンパク質配列及び／又は複数のヒトマイクロバイオータタンパク質をコードする複数の核酸配列を提供するための出発点となり得る。

【0040】

本明細書においては、用語「複数」は、通常、１超、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれ以上、例えば、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、又はそれ以上の項目（配列）を意味する。特に、複数の項目は異なっている。したがって、「複数のヒトマイクロバイオータタンパク質／タンパク質配列」という表現は、少なくとも２つの異なるヒトマイクロバイオータタンパク質／タンパク質配列を意味し、「複数の核酸配列」という表現は、少なくとも２つの異なる核酸配列を意味する。

【0041】

好ましくは、複数のヒトマイクロバイオータタンパク質配列及び／又は核酸配列は、（マイクロバイオータ）（配列）データベースに基づいて、工程（ｉ）で提供される。かかるデータベースは、好ましくは、複数のヒト個体（宿主個体；ヒト対象）のヒトマイクロバイオータ配列を含む。

【0042】

かかるデータベースの好ましい例は、「Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ」（ｖｅｒｓｉｏｎ １．０， Ｍａｒｃｈ ２０１４； Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， ＭｅｔａＨＩＴ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ． Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１４ Ａｕｇ；３２（８）：８３４－４１； ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｍｅｔａ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｃｎ／ｍｅｔａ／ｈｏｍｅ）であり、これは、主要なヒトマイクロバイオームプロファイリングの取り組み、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ （ＮＩＨ－ＨＭＰ）、及びＥｕｒｏｐｅａｎ Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｔｒａｃｔ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ （ＭｅｔａＨＩＴ）からのデータを含む。

【0043】

かかるデータベースの別の好ましい例は、Ｕｎｉｆｉｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｇｅｎｏｍｅ（ＵＨＧＧ）の集合であり、ヒトの腸からの４，６４４種の原核生物種に対応する２８６，９９７ゲノムを組み合わせたリソースである（Ａｌｅｘａｎｄｒｅ Ａｌｍｅｉｄａ， Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｎａｙｆａｃｈ， Ｍｉｇｕｅｌ Ｂｏｌａｎｄ， Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ Ｓｔｒｏｚｚｉ， Ｍａｒｔｉｎ Ｂｅｒａｃｏｃｈｅａ， Ｚｈｏｕ Ｊａｓｏｎ Ｓｈｉ， Ｋａｔｈｅｒｉｎｅ Ｓ． Ｐｏｌｌａｒｄ， Ｄｏｎｏｖａｎ Ｈ． Ｐａｒｋｓ， Ｐｈｉｌｉｐ Ｈｕｇｅｎｈｏｌｔｚ， Ｎｉｃｏｌａ Ｓｅｇａｔａ， Ｎｉｋｏｓ Ｃ． Ｋｙｒｐｉｄｅｓ， Ｒｏｂｅｒｔ Ｄ． Ｆｉｎｎ． Ａ ｕｎｉｆｉｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ ｏｖｅｒ ２８０，０００ ｇｅｎｏｍｅｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ． ｂｉｏＲｘｉｖ ７６２６８２； １９ Ｓｅｐ ２０１９， ｄｏｉ： ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／７６２６８２）。これらのゲノムは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｃａｔａｌｏｇｕｅの２倍を超える腸タンパク質クラスター数の集合である、Ｕｎｉｆｉｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＵＨＧＰ）カタログを生成するために使用される６億２５００万を超えるタンパク質配列を含む。

【0044】

更に、別の好ましい例は、より大きなデータベースからヒトマイクロバイオータ配列を選択することによって編集されるデータベースである。例えば、ヒトの腸管に存在することが知られているマイクロバイオータ種を、（例えば、当業者に知られている文献に基づいて）選択することができ、それらの選択されたマイクロバイオータ種の（利用可能な全ての）配列を、より大きなマイクロバイオータデータベース、例えば、Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｂａｃｔｅｒｉａデータベース（ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｂａｃｔｅｒｉａ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ； Ｐ．Ｊ． Ｋｅｒｓｅｙ， Ｊ．Ｅ． Ａｌｌｅｎ， Ａ． Ａｌｌｏｔ， Ｍ． Ｂａｒｂａ， Ｓ． Ｂｏｄｄｕ， Ｂ．Ｊ． Ｂｏｌｔ， Ｄ． Ｃａｒｖａｌｈｏ－Ｓｉｌｖａ， Ｍ． Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， Ｐ． Ｄａｖｉｓ， Ｃ． Ｇｒａｂｍｕｅｌｌｅｒ， Ｎ． Ｋｕｍａｒ， Ｚ． Ｌｉｕ， Ｔ． Ｍａｕｒｅｌ， Ｂ． Ｍｏｏｒｅ， Ｍ． Ｄ． ＭｃＤｏｗａｌｌ， Ｕ． Ｍａｈｅｓｗａｒｉ， Ｇ． Ｎａａｍａｔｉ， Ｖ． Ｎｅｗｍａｎ， Ｃ．Ｋ． Ｏｎｇ， Ｄ．Ｍ． Ｂｏｌｓｅｒ．， Ｎ． Ｄｅ Ｓｉｌｖａ， Ｋ．Ｌ． Ｈｏｗｅ， Ｎ． Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ， Ｇ． Ｍａｓｌｅｎ， Ｄ．Ｍ． Ｓｔａｉｎｅｓ， Ａ． Ｙａｔｅｓ． Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｇｅｎｏｍｅｓ ２０１８： ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｏｍｉｃｓ ｉｎｆｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｎｏｎ－ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１８ ４６（Ｄ１） Ｄ８０２－Ｄ８０８）から取得することができる。いくつかの実施形態においては、前記データベースは、例えば、選択された障害の治療のためにヒト宿主と相互作用する微生物タンパク質を同定するために、選択された疾患又は障害に関して編集することができる。この文脈においては、前記データベースは、前記障害に関する、例えば、胃腸管の、ヒトの微生物種の配列に着目することができる。更に、かかるデータベースは、例えば、便サンプルなどの、選択された疾患／障害と診断された患者及び／又は選択された疾患／障害に対して耐性／免疫性を有する対象のサンプル中で同定された配列を含むことができる。

【0045】

したがって、データベースは、ヒトマイクロバイオータを含む（便）サンプルのシークエンシングによって編集することもできる。

【0046】

いくつかの実施形態においては、複数のヒトマイクロバイオータ配列は、関心のある１以上のヒトマイクロバイオータ種を選択し、選択されたヒトマイクロバイオータ種のタンパク質及び／又は遺伝子配列を得ることによって提供することができる。例えば、免疫調節性及び／又は炎症関連薬剤候補が関心の対象である場合、免疫調節及び炎症反応制御におけるそれらの役割に関して、ヒトマイクロバイオータ種を選択することができる。かかるヒトマイクロバイオータ種の非限定的な例としては、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｓｈａｈｉｉ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａ ｉｎｔｅｓｔｉｎｉｈｏｍｉｎｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｉｒａｅ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍが挙げられる。選択されたヒトマイクロバイオータ種の（タンパク質及び／又は遺伝子）配列は、例えば、Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｂａｃｔｅｒｉａデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｂａｃｔｅｒｉａ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ； Ｐ．Ｊ． Ｋｅｒｓｅｙ， Ｊ．Ｅ． Ａｌｌｅｎ， Ａ． Ａｌｌｏｔ， Ｍ． Ｂａｒｂａ， Ｓ． Ｂｏｄｄｕ， Ｂ．Ｊ． Ｂｏｌｔ， Ｄ． Ｃａｒｖａｌｈｏ－Ｓｉｌｖａ， Ｍ． Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， Ｐ． Ｄａｖｉｓ， Ｃ． Ｇｒａｂｍｕｅｌｌｅｒ， Ｎ． Ｋｕｍａｒ， Ｚ． Ｌｉｕ， Ｔ． Ｍａｕｒｅｌ， Ｂ． Ｍｏｏｒｅ， Ｍ． Ｄ． ＭｃＤｏｗａｌｌ， Ｕ． Ｍａｈｅｓｗａｒｉ， Ｇ． Ｎａａｍａｔｉ， Ｖ． Ｎｅｗｍａｎ， Ｃ．Ｋ． Ｏｎｇ， Ｄ．Ｍ． Ｂｏｌｓｅｒ．， Ｎ． Ｄｅ Ｓｉｌｖａ， Ｋ．Ｌ． Ｈｏｗｅ， Ｎ． Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ， Ｇ． Ｍａｓｌｅｎ， Ｄ．Ｍ． Ｓｔａｉｎｅｓ， Ａ． Ｙａｔｅｓ． Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｇｅｎｏｍｅｓ ２０１８： ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｏｍｉｃｓ ｉｎｆｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｎｏｎ－ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１８ ４６（Ｄ１） Ｄ８０２－Ｄ８０８）などの公開データベースから取得することができる。

【0047】

いくつかの実施形態においては、例えば前記したような様々なデータベースをプールして、可能な限り多くのヒトマイクロバイオータ配列を含むデータベースを得ることができる。

【0048】

いくつかの例においては、前記データベースは、複数のヒト個体（宿主個体）のヒトマイクロバイオータ配列ではなく、単一のヒト個体（宿主個体）のヒトマイクロバイオータ配列を含んでもよい。かかるデータベースは、例えば、パーソナライズされた医学的アプローチにおいて有利であり得る。複数の個体のマイクロバイオータデータではなく、単一の個体のマイクロバイオータデータを含むデータベースは、例えば、個体の１以上の便サンプルを使用することによって編集することができる。例えば、微生物の（特に、細菌の）核酸（ＤＮＡなど）又は（ポリ）ペプチドを、便サンプルから抽出し、当技術分野で知られた方法によってシークエンシングすることができる。次いで、前記配列を、マイクロバイオータデータのみ、特に、配列を含むデータベースに編集することができる。例えば、便サンプルから抽出したＤＮＡのシークエンシングは、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑでは、例えば、４，０００万個のペアエンドリードで行うことができる。配列は、例えば、ヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質（例えば、細菌ペプチド）を発現する候補細菌のゲノム部分を同定するためのバイオインフォマティクスパイプラインを用いて分析することができる。

【0049】

本発明に係るヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を提供するための方法の工程（ｉ）は、任意に、以下のサブ工程を含んでもよい。
（ｉ－ａ）任意に、単一又は複数の個体のサンプルから、マイクロバイオータタンパク質配列又は核酸配列を同定すること、及び
（ｉ－ｂ）単一又は複数の個体のマイクロバイオータタンパク質配列又は核酸配列を含むデータベースを編集すること。

【0050】

工程（ｉ－ａ）のサンプルは、便サンプルであることができる。編集されるデータベースが単一又は複数の個体に関するかどうかに応じて、単一又は複数の個体の１以上の便サンプルを用いることができる。同定工程（ｉ－ａ）は、好ましくは、例えば、前記したように、サンプル、特に、便サンプルからの微生物の（特に、細菌の）核酸（ＤＮＡなど）又は（ポリ）ペプチドの抽出及びそのシークエンシングを含む。任意に、配列を、前記したように分析することができる。

【0051】

ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補の同定
本発明に係るヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を提供するための方法の工程（ｉｉ）において、薬剤候補は、工程（ｉ）において提供されるマイクロバイオータ配列の中から同定される。この薬剤候補は、ヒトマイクロバイオータタンパク質（即ち、ヒトマイクロバイオームによって発現される、又は発現されると予測される微生物タンパク質）であり、以下の３つの重要な基準を満たす：
－（未切断（プロドラッグ）バージョンに）シグナルペプチドを含む；
－２０～５００アミノ酸長を有する；及び
－（ａ）少なくとも２つのシステイン残基、及び／又は（ｂ）立体構造的に剛性な構造を与える一次及び／又は二次構造エレメントを含む。
したがって、かかるタンパク質配列、又はかかるタンパク質配列をコードする（コードすると予測される）核酸配列は、工程（ｉ）で提供される配列の中から、工程（ｉｉ）において同定及び選択される。

【0052】

本発明者らは、潜在的なマイクロバイオータ薬剤候補について前記３つの基準を特定した。その理由は、それらが、シグナルペプチド、及び公知の相互作用分子、例えば、サイトカイン（インターロイキンなど）、ケモカイン、成長因子、神経ペプチド、ペプチドホルモンなどのサイズに対応する比較的小さなサイズによって反映される、マイクロバイオータタンパク質が宿主との相互作用に関与することを示すためである。更に、立体構造的に剛性な構造を与えるシステイン又は他の構造エレメントは、マイクロバイオータタンパク質を適切なコンフォメーションに「拘束」し、受容体又は他の相互作用タンパク質などの適切な（ヒト）標的に結合できるようにする。したがって、前記３つの基準を満たすヒトマイクロバイオータタンパク質は、後に調製でき且つ任意に以下に説明される関連するインビトロ又はインビボアッセイを行うことにより、それらの生物学的作用を試験できるタンパク質薬剤候補を、最も高い確率で表す。

【0053】

工程（ｉ）で得られた配列を、工程（ｉｉ）における前記３つの選択基準について任意の順序で試験することができる。例えば、
－まず、シグナルペプチドについて試験し、その後、長さについて試験し、次いで、システイン又は剛性な構造を与える他のエレメントについて試験する、
－まず、シグナルペプチドについて試験し、その後、システイン又は剛性な構造を与える他のエレメントについて試験し、次いで、長さについて試験する、
－まず、長さについて試験し、その後、シグナルペプチドについて試験し、次いで、システイン又は剛性な構造を与える他のエレメントについて試験する、
－まず、長さについて試験し、その後、システイン又は剛体な構造を与える他のエレメントについて試験し、次いで、シグナルペプチドについて試験する、
－まず、システイン又は剛性な構造を与える他のエレメントについて試験し、その後、長さについて試験し、次いで、シグナルペプチドについて試験する、又は、
－まず、システイン又は剛性な構造を与える他のエレメントについて試験し、その後、シグナルペプチドをテストし、次いで、長さについて試験する。

【0054】

好ましくは、工程（ｉ）で提供された配列における、シグナルペプチドを含む（又はコードする／コードするように予測される）配列は、（コードされた）タンパク質の長さ及び／又はシステイン含量（又は立体構造的に剛性な構造を与える構造エレメント）を決定する前に、同定される。次いで、シグナルペプチドの配列は、例えば、（コードされた）タンパク質の長さ及び／又はシステイン含量（又は立体構造的に剛性な構造を与える構造エレメント）を決定する前に、除去（「切断」、例えば、インシリコで）することができる。シグナルペプチドの長さ又はシグナルペプチドにおけるシステイン含量（又は他の構造エレメント）は、通常、「成熟した」マイクロバイオータタンパク質の宿主相互作用にとって重要ではない。その理由は、シグナルペプチドは、（例えば、マイクロバイオータ細胞の外側への）タンパク質の輸送／「放出」後に、切断されることが多いからである。したがって、工程（ｉｉ）では、好ましくは、（コードされた）タンパク質の長さ及び／又はシステイン含量（又は立体構造的に剛性な構造を与える構造エレメント）が決定される前に、シグナルペプチドの存在が決定される。シグナルペプチドを含まない配列は、「削除」されることがある、即ち、更なる分析において考慮されない。いくつかの実施形態においては、シグナルペプチドは、シグナルペプチドを（元々）含む（又はコードする）選択された配列から除去される（「切断される」、例えば、インシリコで）ので、シグナルペプチドは、更なる分析において考慮されない。

【0055】

したがって、工程（ｉｉ）において、シグナルペプチドを有する又はコードする配列の同定が、以下の前に行われることが好ましい。
－２０～５００アミノ酸長を有する配列又は２０～５００アミノ酸長を有する配列をコードする配列の同定；及び／又は
－システイン残基、又は立体構造的に剛性な構造を与える一次及び／又は二次構造エレメントを含む配列の同定。

【0056】

更に、前記シグナルペプチドの配列が、以下に含まれないことが好ましい。
－２０～５００アミノ酸長を有する配列又は２０～５００アミノ酸長を有する配列をコードする配列の同定；及び／又は
－システイン残基、又は立体構造的に剛性な構造を与える一次及び／又は二次構造エレメントを含む配列の同定。

【0057】

いくつかの実施形態においては、ＳｉｇｎａｌＰからのＹスコアによって与えられる切断部位を使用して、シグナルペプチドを除去することができる。いくつかの場合においては、ＳｉｇｎａｌＰの２つの予測モード、グラム陽性とグラム陰性の両方が、タンパク質上の陽性シグナルペプチドを予測できるが、切断位置は異なる。かかる場合、ソフトウェアがシグナルペプチドの終端を示す、２つのＳｉｇｎａｌＰ予測間のタンパク質配列の最小座標として定義される、より小さな切断部位を考慮することができる。

【0058】

更に、シグナルペプチド切断部位を同定するためのバイオインフォマティクスツール（ソフトウェア）の更に好ましい例としては、以下が挙げられる。
－ ＥＭＢＯＳＳ ＳｉｇＣｌｅａｖｅ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｅｍｂｏｓｓ／ｓｉｇｃｌｅａｖｅ； ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ， Ｇ． “Ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅｓ” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．： １４：４６８３ （１９８６）； ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ， Ｇ． “Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ｔｒｅａｓｕｒｅ Ｔｒｏｖｅ ｏｒ Ｔｒｉｖｉａｌ Ｐｕｒｓｕｉｔ” （Ａｃａｄ． Ｐｒｅｓｓ， （１９８７）， １１３－１１７））； Ｐｅｔｅｒ Ｍ． Ｒｉｃｅ，Ｐｅｔｅｒ Ｍ． Ｒｉｃｅ， Ａｌａｎ Ｊ． Ｂｌｅａｓｂｙ， Ｊｏｎ Ｃ． Ｉｓｏｎ，Ａｌａｎ Ｊ． Ｂｌｅａｓｂｙ，Ｊｏｎ Ｃ． Ｉｓｏｎ： ＥＭＢＯＳＳ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ： Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， １ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｊｕｎｅ ２０１１）；
－ ＳｉｇｎａｌＣＦ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｓｂｉｏ．ｓｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｂｉｏｉｎｆ／Ｓｉｇｎａｌ－ＣＦ／； Ｋｕｏ－Ｃｈｅｎ Ｃｈｏｕ ａｎｄ Ｈｏｎｇ－Ｂｉｎ Ｓｈｅｎ， Ｓｉｇｎａｌ－ＣＦ： Ａ ｓｕｂｓｉｔｅ－ｃｏｕｐｌｅｄ ａｎｄ ｗｉｎｄｏｗ－ｆｕｓｉｎｇ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ， ２００７，３５７： ６３３－６４０）；
－ ＳＰＥＰｌｉｐ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｇｐｃｒ．ｂｉｏｃｏｍｐ．ｕｎｉｂｏ．ｉｔ／ｃｇｉ／ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ／ｓｐｅｐ／ｐｒｅｄ＿ｓｐｅｐｃｇｉ．ｃｇｉ； Ｐｉｅｒｏ Ｆａｒｉｓｅｌｌｉ， Ｇｉａｃｏｍｏ Ｆｉｎｏｃｃｈｉａｒｏ， Ｒｉｔａ Ｃａｓａｄｉｏ； ＳＰＥＰｌｉｐ： ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅｓ， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， Ｖｏｌｕｍｅ １９， Ｉｓｓｕｅ １８， １２ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００３， Ｐａｇｅｓ ２４９８－２４９９）；
－ ＰｒｅｄｉＳｉ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｅｄｉｓｉ．ｄｅ／； Ｈｉｌｌｅｒ Ｋ， Ｇｒｏｔｅ Ａ， Ｓｃｈｅｅｒ Ｍ， Ｍｕｎｃｈ Ｒ， Ｊａｈｎ Ｄ． ＰｒｅｄｉＳｉ： ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｌｅａｖａｇｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００４ Ｊｕｌ １；３２（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ）：Ｗ３７５－９））；及び
－ ＡＮＴＨＥＰＲＯＴ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ａｎｔｈｅｐｒｏｔ－ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｓｉｇｎａｌ＿ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ； Ｄｅｌｅａｇｅ Ｇ， Ｃｏｍｂｅｔ Ｃ， Ｂｌａｎｃｈｅｔ Ｃ， Ｇｅｏｕｒｊｏｎ Ｃ． ＡＮＴＨＥＰＲＯＴ： ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｗｉｔｈ ｃｌｉｅｎｔ／ｓｅｒｖｅｒ ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ． Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ． ２００１；３１：２５９－２６７）。

【0059】

いくつかの実施形態においては、（コードされた）マイクロバイオータタンパク質の長さが、（コードされた）タンパク質のシステイン含量（又は立体構造的に剛性な構造を与える構造エレメント）が決定される前に、２０～５００アミノ酸であるかどうか決定することができる。例えば、システイン含量は、パーセンテージで表すことができる（システイン：総アミノ酸）。かかる場合、システインのパーセンテージを計算するために、タンパク質の長さが必要である。

【0060】

前記を考慮すると、以下の順序で前記３つの基準を試験することが有利であり得る：
１．（未切断（プレタンパク質／プロドラッグ）バージョンで）シグナルペプチドを含むタンパク質を選択する；
２．２０～５００アミノ酸長のタンパク質を選択する；及び
３．少なくとも２つのシステイン残基及び／又は立体構造的に剛性な構造を与える一次及び／又は二次構造エレメントを含むタンパク質を選択する。

【0061】

前記基準の３つ全ては満たさないマイクロバイオータタンパク質の配列（又はマイクロバイオータタンパク質をコードする核酸配列）は、更なる分析において無視される（「削除される」）。換言すれば、３つの基準の全てを満たし、ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補となる、マイクロバイオータタンパク質のかかる配列（又はマイクロバイオータタンパク質をコードする核酸配列）のみが、前記方法の更なる工程に選択される。

【0062】

シグナルペプチド
工程（ｉｉ）において、シグナルペプチドを有する複数の配列が同定される。シグナルペプチドを有さない配列は、除去／消去され得る。

【0063】

本明細書においては、用語「シグナルペプチド」は、細胞質膜を横切る移行のためのカーゴタンパク質を標的とする遍在タンパク質選別シグナルを意味する。通常、シグナルペプチドは短いペプチド（例えば、１６～３０アミノ酸長）であり、通常、新たに合成され、分泌されるタンパク質のＮ末端に位置する。したがって、シグナルペプチドの存在は、タンパク質が分泌されることを示す。用語「シグナルペプチド」は、「シグナルアンカー配列」と称されることもあるシグナルペプチドとして機能する膜貫通ドメインも含み得る。

【0064】

原核生物では、シグナルペプチドは、新たに合成されたタンパク質を、原形質膜に存在するＳｅｃＹＥＧタンパク質伝達チャネルに向ける。Ｓｅｃ経路は、グラム陽性菌とグラム陰性菌の両方に存在する古典的経路であり、通常、折り畳まれていないタンパク質の輸送に用いられる。別のタンパク質標的経路は、Ｔａｔ経路であり、これは、ごく一部のタンパク質にのみ用いられる（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの分泌タンパク質の６％）。Ｔａｔ経路は、通常、より長く、既に折り畳まれた、通常、ペリプラズマに送達されるタンパク質の輸送に用いられる。Ｔａｔ経路も、タンパク質のＮ末端の非常に類似したシグナルペプチドに基づくが、更に２つのアルギニンモチーフを有している。

【0065】

シグナルペプチドは、共通の構造モチーフによって認識され得る。各種タンパク質からのシグナルペプチドの共通構造は、通常、単一のアルファヘリックスを形成する傾向があり、「ｈ領域」とも称される、疎水性アミノ酸の長い領域（ｓｔｒｅｔｃｈ）（約５～１６残基長）を含む疎水性コアによって特徴付けられる。多くのシグナルペプチドは、短い正に帯電したアミノ酸の領域で始まる。これは、ポジティブインサイド規則として知られているものによって、移行中にポリペプチドの適切なトポロジーを強制するのに役立ち得る。Ｎ末端近傍に位置することから、「ｎ領域」と称される。更に、多くのシグナルペプチドは、Ｃ末端に、中性であるが極性の「ｃ領域」を含む。シグナルペプチドは、通常、輸送プロセスの最後に切断される。（－３、－１）規則は、切断が正しく行われるためには、（切断部位に対して）－３位及び－１位の残基が小さく、中性である必要がることを述べている。しかし、この切断部位は、通常、シグナルペプチドとして機能する膜貫通ドメインには存在しない。シグナルペプチダーゼは、移行中又は移行完了後に切断されて、遊離シグナルペプチド及び成熟タンパク質を生成し得る。

【0066】

更に、多数のシグナルペプチド配列が当技術分野で知られており、例えば、シグナルペプチドデータベースで利用可能である。かかるシグナルペプチドデータベースの例としては、シグナルペプチドのウェブサイト（ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ．ｄｅ／）、ＳＰｄｂ（ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｌｉｎｅ．ｂｉｃ．ｎｕｓ．ｅｄｕ．ｓｇ／ｓｐｄｂ／； Ｃｈｏｏ ＫＨ， Ｔａｎ ＴＷ， Ｒａｎｇａｎａｔｈａｎ Ｓ． ＳＰｄｂ－－ａ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄａｔａｂａｓｅ． ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２００５ Ｏｃｔ １３；６：２４９）、及びＬｏｃＳｉｇＤＢ（ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｎｍｃ．ｅｄｕ／ＬｏｃＳｉｇＤＢ／； Ｓｉｍａｒｊｅｅｔ Ｎｅｇｉ， Ｓａｎｊｉｔ Ｐａｎｄｅｙ， Ｓａｔｉｓｈ Ｍ． Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ， Ａｋｒａｍ Ｍｏｈａｍｍｅｄ， Ｃｈｉｔｔｉｂａｂｕ Ｇｕｄａ； ＬｏｃＳｉｇＤＢ： ａ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌｓ， Ｄａｔａｂａｓｅ， Ｖｏｌｕｍｅ ２０１５， １ Ｊａｎｕａｒｙ ２０１５， ｂａｖ００３）が挙げられる。更に、シグナルペプチドは、タンパク質データベース、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ（ＵＲＬ： ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／； Ｔｈｅ ＵｎｉＰｒｏｔ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ． ＵｎｉＰｒｏｔ： ｔｈｅ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ４５： Ｄ１５８－Ｄ１６９ （２０１７））でのアノテーションから取得することができる。

【0067】

更に、シグナルペプチドは、バイオアッセイに基づいて決定することができる。例えば、タンパク質を発現させることができ、その位置（例えば、細胞の内側又は外側、膜内又は膜上）を調べることができる。この目的のために、タンパク質を、ラベル化又はタグ付けすることができる。更に、変異分析を行うことができる。

【0068】

しかし、好ましくは、シグナルペプチドの同定は、インシリコで行われる。いくつかの実施形態においては、シグナルペプチドは、膜貫通ヘリックスの非常に類似した疎水性領域とシグナルペプチドのそれとを区別することができるバイオインフォマティックツールを使用することによって同定することができる。更に、Ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌｓ又はＮｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋベースのソフトウェアを用いるバイオインフォマティックツールを使用することもできる。

【0069】

シグナルペプチドを同定するための好ましいバイオインフォマティクスツール（ソフトウェア）の例としては、以下が挙げられる。
－ Ｐｈｏｂｉｕｓ （Ａ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｏｐｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ， Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｒｅ； ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｐｈｏｂｉｕｓ．ｓｂｃ．ｓｕ．ｓｅ／； Ｌｕｋａｓ Ｋａｌｌ， Ａｎｄｅｒｓ Ｋｒｏｇｈ ａｎｄ Ｅｒｉｋ Ｌ． Ｌ． Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ． Ａ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ Ｔｏｐｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｓｉｇｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ３３８（５）：１０２７－１０３６， Ｍａｙ ２００４； Ｌｕｋａｓ Ｋａｌｌ， Ａｎｄｅｒｓ Ｋｒｏｇｈ ａｎｄ Ｅｒｉｋ Ｌ． Ｌ． Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ． Ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｏｐｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ－－ｔｈｅ Ｐｈｏｂｉｕｓ ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ３５：Ｗ４２９－３２， Ｊｕｌｙ ２００７）；
－ ＳｉｇｎａｌＰ （ｃｕｒｒｅｎｔ ｖｅｒｓｉｏｎ： ４．１； Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｅｎｍａｒｋ ＤＴＵ； ＵＲＬ： ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ； Ｈｅｎｒｉｋ Ｎｉｅｌｓｅｎ， Ｊａｃｏｂ Ｅｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ， Ｓｏｒｅｎ Ｂｒｕｎａｋ ａｎｄ Ｇｕｎｎａｒ ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ａｎｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅｓ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， １０：１－６， １９９７； Ｔｈｏｍａｓ Ｎｏｒｄａｈｌ Ｐｅｔｅｒｓｅｎ， Ｓｏｒｅｎ Ｂｒｕｎａｋ， Ｇｕｎｎａｒ ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ ＆ Ｈｅｎｒｉｋ Ｎｉｅｌｓｅｎ． ＳｉｇｎａｌＰ ４．０： ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｇｉｏｎｓ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ８：７８５－７８６， ２０１１）：
－ ＰＳＯＲＴ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐｓ：／／ｐｓｏｒｔ．ｈｇｃ．ｊｐ／； Ｎａｋａｉ， Ｋ． ａｎｄ Ｈｏｒｔｏｎ， Ｐ．， ＰＳＯＲＴ： ａ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｏｒｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｔｈｅｉｒ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ， ２４（１） ３４－３５ （１９９９））；
－ ＳｉｇｎａｌＣＦ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｓｂｉｏ．ｓｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｂｉｏｉｎｆ／Ｓｉｇｎａｌ－ＣＦ／； Ｋｕｏ－Ｃｈｅｎ Ｃｈｏｕ ａｎｄ Ｈｏｎｇ－Ｂｉｎ Ｓｈｅｎ， Ｓｉｇｎａｌ－ＣＦ： Ａ ｓｕｂｓｉｔｅ－ｃｏｕｐｌｅｄ ａｎｄ ｗｉｎｄｏｗ－ｆｕｓｉｎｇ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ， ２００７，３５７： ６３３－６４０）；
－ Ｓｉｇｎａｌ－３Ｌ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｓｂｉｏ．ｓｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｂｉｏｉｎｆ／Ｓｉｇｎａｌ－３Ｌ／； Ｙｉ－Ｚｅ Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｈｏｎｇ－Ｂｉｎ Ｓｈｅｎ， “Ｓｉｇｎａｌ－３Ｌ ２．０： Ａ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｍｉｘｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ ｒｅｓｉｄｕｅ－ｄｏｍａｉｎ ｃｒｏｓｓ ｌｅｖｅｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ， ２０１７， ５７： ９８８－９９９； Ｈｏｎｇ－Ｂｉｎ Ｓｈｅｎ ａｎｄ Ｋｕｏ－Ｃｈｅｎ Ｃｈｏｕ， “Ｓｉｇｎａｌ－３Ｌ： ａ ３－ｌａｙｅｒ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ”， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ２００７， ３６３： ２９７－３０３）；
－ Ｓｉｇｎａｌ－ＢＬＡＳＴ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｓｉｇｐｅｐ．ｓｅｒｖｉｃｅｓ．ｃａｍｅ．ｓｂｇ．ａｃ．ａｔ／ｓｉｇｎａｌｂｌａｓｔ．ｈｔｍｌ； Ｋａｒｌ Ｆｒａｎｋ； Ｍａｎｆｒｅｄ Ｊ． Ｓｉｐｐｌ： Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｓｉｇｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， ２４， ｐｐ． ２１７２－２１７６ （２００８）；
－ ＰｒｅｄｉＳｉ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｅｄｉｓｉ．ｄｅ／； Ｈｉｌｌｅｒ Ｋ， Ｇｒｏｔｅ Ａ， Ｓｃｈｅｅｒ Ｍ， Ｍｕｎｃｈ Ｒ， Ｊａｈｎ Ｄ． ＰｒｅｄｉＳｉ： ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｌｅａｖａｇｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００４ Ｊｕｌ １；３２（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ）：Ｗ３７５－９））；
－ ＯＣＴＯＰＵＳ／ＳＰＯＣＴＯＰＵＳ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｏｃｔｏｐｕｓ．ｃｂｒ．ｓｕ．ｓｅ／； Ｖｉｋｌｕｎｄ Ｈ， Ｅｌｏｆｓｓｏｎ Ａ． ＯＣＴＯＰＵＳ： ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｏｐｏｌｏｇｙ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｗｏ－ｔｒａｃｋ ＡＮＮ－ｂａｓｅｄ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｃｏｒｅｓ ａｎｄ ａｎ ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌ ｇｒａｍｍａｒ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２００８ Ａｕｇ １；２４（１５）：１６６２－８； Ｖｉｋｌｕｎｄ Ｈ， Ｂｅｒｎｓｅｌ Ａ， Ｓｋｗａｒｋ Ｍ， Ｅｌｏｆｓｓｏｎ Ａ． ＳＰＯＣＴＯＰＵＳ： ａ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ ｏｆ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏｐｏｌｏｇｙ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２００８ Ｄｅｃ １５；２４（２４）：２９２８－９）；
－ Ｐｈｉｌｉｕｓ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｒｃ．ｏｒｇ／ｐｈｉｌｉｕｓ； Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ＳＭ， Ｋａｌｌ Ｌ， Ｒｉｆｆｌｅ ＭＥ， Ｂｉｌｍｅｓ ＪＡ， Ｎｏｂｌｅ ＷＳ （２００８） Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ Ｔｏｐｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｓｉｇｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｄｙｎａｍｉｃ Ｂａｙｅｓｉａｎ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ． ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ ４（１１）： ｅ１０００２１３）；
－ ＡＮＴＨＥＰＲＯＴ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ａｎｔｈｅｐｒｏｔ－ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｓｉｇｎａｌ＿ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ； Ｄｅｌｅａｇｅ Ｇ， Ｃｏｍｂｅｔ Ｃ， Ｂｌａｎｃｈｅｔ Ｃ， Ｇｅｏｕｒｊｏｎ Ｃ． ＡＮＴＨＥＰＲＯＴ： ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｗｉｔｈ ｃｌｉｅｎｔ／ｓｅｒｖｅｒ ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ． Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ． ２００１；３１：２５９－２６７）；
－ ＳＯＳＵＩｓｉｇｎａｌ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｈａｒｒｉｅｒ．ｎａｇａｈａｍａ－ｉ－ｂｉｏ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉ／ｓｏｓｕｉｓｉｇｎａｌ／ｓｏｓｕｉｓｉｇｎａｌ＿ｓｕｂｍｉｔ．ｈｔｍｌ； Ｇｏｍｉ Ｍ．， Ｓｏｎｏｙａｍａ Ｍ．， ａｎｄ Ｍｉｔａｋｕ Ｓ．， Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ： ＳＯＳＵＩｓｉｇｎａｌ． Ｃｈｅｍ－Ｂｉｏ Ｉｎｆｏ． Ｊ．， ４ １４２－１４７ （２００４））；
－ ＴＭＨＭＭ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ／； Ｋｒｏｇｈ Ａ， Ｌａｒｓｓｏｎ Ｂ， ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ Ｇ， Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ ＥＬ． Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏｐｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ ａ ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ ｍｏｄｅｌ： ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅｓ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２００１；３０５（３）：５６７－８０； ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｈｅｌｉｃｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）；及び
－ ＳＰＥＰｌｉｐ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｇｐｃｒ．ｂｉｏｃｏｍｐ．ｕｎｉｂｏ．ｉｔ／ｃｇｉ／ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ／ｓｐｅｐ／ｐｒｅｄ＿ｓｐｅｐｃｇｉ．ｃｇｉ； Ｐｉｅｒｏ Ｆａｒｉｓｅｌｌｉ， Ｇｉａｃｏｍｏ Ｆｉｎｏｃｃｈｉａｒｏ， Ｒｉｔａ Ｃａｓａｄｉｏ； ＳＰＥＰｌｉｐ： ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅｓ， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， Ｖｏｌｕｍｅ １９， Ｉｓｓｕｅ １８， １２ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００３， Ｐａｇｅｓ ２４９８－２４９９）。

【0070】

これらの例示されたバイオインフォマティクスツール（ソフトウェア）の１以上を、本発明に係るヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を提供するための方法におけるシグナルペプチドの同定に用いることができる。

【0071】

好ましくは、本発明に係るヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を提供するための方法におけるシグナルペプチドの同定は、Ｐｈｏｂｉｕｓ及び／又はＳｉｇｎａｌＰなどのシグナルペプチドを予測するためのソフトウェアを使用することによって行われる。シグナルペプチドを予測するためのかかるソフトウェアは、デフォルト設定を適用することによって使用することができる。例えば、工程（ｉｉ）におけるシグナルペプチドの同定は、Ｐｈｏｂｉｕｓ及び／又はＳｉｇｎａｌＰを使用することによって行われる。

【0072】

いくつかの実施形態においては、本発明の方法は、シグナルペプチドを同定するための単一の工程を含み、シグナルペプチドを同定するための単一の方法（例えば、前記した単一のバイオインフォマティクスツール）が１度行われる。しかし、より好ましくは、工程（ｉｉ）におけるシグナルペプチドの同定は、２つの異なる方法を用いることによって行われ、両方の方法にしたがうシグナルペプチドを有する配列又はコードする配列が選択される。いくつかの実施形態においては、２つの異なるバイオインフォマティックツール（即ち、２つの異なる方法）が、シグナルペプチドの同定に使用され、シグナルペプチドを含む得られたタンパク質が、両方の方法によって同定されるタンパク質に対応する。これにより、アノテーションの信頼性が向上する。例えば、ＰｈｏｂｉｕｓとＳｉｇｎａｌＰを（組み合わせて）使用して、シグナルペプチドを含むタンパク質を同定することができる。いくつかの実施形態においては、Ｐｈｏｂｉｕｓが、シグナルペプチドを含むタンパク質を同定するために使用され、その後、ＳｉｇｎａｌＰが、シグナルペプチドを含むタンパク質を同定するために使用されて、シグナルペプチドを含む得られたタンパク質が、両方の方法によって同定されるタンパク質に対応する。他の実施形態においては、ＳｉｇｎａｌＰが、シグナルペプチドを含むタンパク質を同定するために使用され、その後、Ｐｈｏｂｉｕｓが、シグナルペプチドを含むタンパク質を同定するために使用されて、シグナルペプチドを含む得られたタンパク質が、両方の方法によって同定されるタンパク質に対応する。したがって、本発明の方法は、複数の、例えば、２つ又は３つのシグナルペプチドの同定工程を含むことができる。

【0073】

複数の、例えば、２つ又は３つのシグナルペプチドの同定工程は、互いに対してその直後に行うことができるが、２以上のシグナルペプチドの同定工程の間に他の工程を行うもできる。例えば、シグナルペプチドは、第１の方法によって決定することができ、その後、他の工程、例えば、配列のアノテーション及び／又は冗長な配列の除去を行うことができ、その後、選択されたペプチドを、シグナルペプチドを同定するための前記第１の方法とは異なる第２の方法によってシグナルペプチドについてチェックすることができる。

【0074】

また、（例えば、前記したように同定され得るＳｅｃシグナルペプチドに加えて）Ｔａｔシグナルペプチドが同定されることも好ましい。Ｔａｔシグナルペプチドは、Ｓｅｃターゲティング経路に使用されるものと同一の予測方法（即ち、前記予測方法）で検出することができる。また、ＴａｔＰ（ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴａｔＰ／； Ｊａｎｎｉｃｋ Ｄｙｒｌｏｖ Ｂｅｎｄｔｓｅｎ， Ｈｅｎｒｉｋ Ｎｉｅｌｓｅｎ， Ｄａｖｉｄ Ｗｉｄｄｉｃｋ， Ｔｒａｃｙ Ｐａｌｍｅｒ ａｎｄ Ｓｏｒｅｎ Ｂｒｕｎａｋ． Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｉｎ－ａｒｇｉｎｉｎｅ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ． ＢＭＣ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００５ ６： １６７）又はＳｉｇｎａｌ Ｆｉｎｄ Ｓｅｒｖｅｒ（ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｓｉｇｎａｌｆｉｎｄ．ｏｒｇ／）とＴＡＴＦＩＮＤ（ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｓｉｇｎａｌｆｉｎｄ．ｏｒｇ／ｔａｔｆｉｎｄ．ｈｔｍｌ； Ｒｏｓｅ， Ｒ．Ｗ．， Ｔ． Ｂｒｕｓｅｒ，． Ｊ． Ｃ． Ｋｉｓｓｉｎｇｅｒ， ａｎｄ Ｍ． Ｐｏｈｌｓｃｈｒｏｄｅｒ． ２００２． Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｔｏ ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｈｉｇｈ ｓａｌｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｗｉｎ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ． Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５： ９４３－９５０； Ｄｉｌｋｓ， Ｋ．， Ｗ． Ｒ． Ｒｏｓｅ， Ｅ． Ｈａｒｔｍａｎｎ， ａｎｄ Ｍ． Ｐｏｈｌｓｃｈｏｒｄｅｒ． ２００３． Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｗｉｎ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ： Ａ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｕｒｖｅｙ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８５：１４７８－１４８３）などの、専用のバイオインフォマティックツール／ソフトウェアによっても同定することができる。更に、ＰＦＡＭデータベース（ＰＦＡＭ ＰＦ１０５１８； ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｘｆａｍ．ｏｒｇ／ｆａｍｉｌｙ／ＴＡＴ＿ｓｉｇｎａｌ； Ｂｅｒｋｓ ＢＣ； Ａ ｃｏｍｍｏｎ ｅｘｐｏｒｔ ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ ｒｅｄｏｘ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ？ Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １９９６；２２：３９３－４０４）に存在するものなど、２つのアルギニンモチーフを検出する保存されたタンパク質モチーフ及びファミリーを検出できるソフトウェアを使用することができる。

【0075】

いくつかの実施形態においては、シグナルペプチドを有する配列を同定する工程は、分泌タンパク質のシグナルペプチド及び膜貫通ドメインを意味する。例えば、シグナルペプチドを予測するためのバイオインフォマティクスツール（ＳｉｇｎａｌＰなど）を、膜貫通ドメインを同定するためのバイオインフォマティクスツール（ＴＭＨＭＭなど）と組み合わせることができ、その結果、シグナルペプチド及び／又は膜貫通ドメイン（いずれか又は両方）を有すると予測されるタンパク質を選択することができる。他の実施形態においては、シグナルペプチドを有する配列を同定する工程は、分泌タンパク質についてのみに関するシグナルペプチドを意味する。

【0076】

いくつかの実施形態においては、ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補は、膜貫通ドメインを含まない。この目的のために、本発明に係るヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を提供するための方法の工程（ｉｉ）は、膜貫通ドメインを有するタンパク質を排除又は除去する任意のサブ工程を含むことができる。これは、前記したように、膜貫通ヘリックスの非常に類似した疎水性領域とシグナルペプチドのそれとを区別することができるバイオインフォマティックツールを使用することによって達成することができる。いくつかの実施形態においては、膜貫通ドメインを含むタンパク質は、（膜貫通ドメインの同定のための）専用のバイオインフォマティクスツールによって同定することができ、かかる膜貫通タンパク質を除去することができる。それにより、分泌タンパク質であるヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を得ることができる。本発明においては、ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補は、分泌タンパク質であることが好ましい。

【0077】

いくつかの実施形態においては、本発明に係るヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を提供するための方法の工程（ｉｉ）は、分泌タンパク質のシグナルペプチドをグラム陰性菌のリポタンパク質から区別する任意のサブ工程を更に含む。

【0078】

分泌タンパク質のシグナルペプチドをグラム陰性菌のリポタンパク質から区別するかかるサブ工程は、好ましくは、前記したようにシグナルペプチドの同定後に行われる。分泌タンパク質のシグナルペプチドをグラム陰性菌のリポタンパク質から区別するサブ工程は、シグナルペプチドの同定の直後に行うことができるが、例えば、シグナルペプチドの切断後及び／又はシステイン含量（又は剛性なタンパク質）の決定後などの後の段階で行うこともできる。

【0079】

グラム陰性菌のリポタンパク質のシグナルペプチドは、分泌タンパク質のシグナルペプチドに類似していることがある。したがって、これらの２つのグループ間を区別し（即ち、グラム陰性菌のリポタンパク質の配列を同定し）、グラム陰性菌のリポタンパク質の配列を除去する（又は、分泌タンパク質のシグナルペプチドを含むが、グラム陰性菌のリポタンパク質のシグナルペプチドを含まない配列のみを維持する）ことが有利であり得る。

【0080】

細菌のリポタンパク質を同定するためのバイオインフォマティクスツール（ソフトウェア）の好ましい例としては、以下が挙げられる。
－ ＬｉｐｏＰ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＬｉｐｏＰ／； Ｊｕｎｃｋｅｒ， Ａ． Ｓ．， Ｗｉｌｌｅｎｂｒｏｃｋ， Ｈ．， ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ， Ｇ．， Ｂｒｕｎａｋ， Ｓ．， Ｎｉｅｌｓｅｎ， Ｈ．， ＆ Ｋｒｏｇｈ， Ａ． （２００３）． Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｇｒａｍ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １２（８）， １６５２－１６６２； Ｏ． Ｒａｈｍａｎ， Ｓ． Ｐ． Ｃｕｍｍｉｎｇｓ， Ｄ． Ｊ． Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｉ． Ｃ． Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｎｃｏｄｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅｓ ｏｆ Ｇｒａｍ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ． Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４（１１）：２３７７－２３８２ （２００８））；
－ ＰＲＥＤ－ＬＩＰＯ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ．ｂｉｏｌ．ｕｏａ．ｇｒ／ＰＲＥＤ－ＬＩＰＯ／； Ｂａｇｏｓ ＰＧ， Ｔｓｉｒｉｇｏｓ ＫＤ， Ｌｉａｋｏｐｏｕｌｏｓ ＴＤ， Ｈａｍｏｄｒａｋａｓ ＳＪ． Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｇｒａｍ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗｉｔｈ ａ Ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌ． Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ． ２００８ Ｄｅｃ；７（１２）：５０８２－９３）；
－ ＤＯＬＯＰ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ－ｌｍｂ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ｄｏｌｏｐ／； Ｂａｂｕ ＭＭ， Ｐｒｉｙａ ＭＬ， Ｓｅｌｖａｎ ＡＴ， Ｍａｄｅｒａ Ｍ， Ｇｏｕｇｈ Ｊ， Ａｒａｖｉｎｄ Ｌ， Ｓａｎｋａｒａｎ Ｋ． Ａ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ （ＤＯＬＯＰ） ｗｉｔｈ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔｓ ｔｏ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ２００６ Ａｐｒ；１８８（８）：２７６１－７３）；
－ ＬＩＰＰＲＥＤ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｅｎｎｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ＬｉｐＰｒｅｄ／； Ｔａｙｌｏｒ ＰＤ， Ｔｏｓｅｌａｎｄ ＣＰ， Ａｔｔｗｏｏｄ ＴＫ， Ｆｌｏｗｅｒ ＤＲ． ＬＩＰＰＲＥＤ： Ａ ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒ ｆｏｒ ａｃｃｕｒａｔｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅｓ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ． ２００６；１（５）：１７６－１７９）；
－ ＬＩＰＯ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｓｅｒｖｉｃｅｓ．ｃｂｕ．ｕｉｂ．ｎｏ／ｔｏｏｌｓ／ｌｉｐｏ； Ｂｅｒｖｅｎ ＦＳ， Ｋａｒｌｓｅｎ ＯＡ， Ｓｔｒａｕｍｅ ＡＨ， Ｆｌｉｋｋａ Ｋ， Ｍｕｒｒｅｌｌ ＪＣ， Ｆｊｅｌｌｂｉｒｋｅｌａｎｄ Ａ， Ｌｉｌｌｅｈａｕｇ ＪＲ， Ｅｉｄｈａｍｍｅｒ Ｉ， Ｊｅｎｓｅｎ ＨＢ． Ａｎａｌｙｓｉｎｇ ｔｈｅ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｕｂｐｒｏｔｅｏｍｅ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ （Ｂａｔｈ） ｕｓｉｎｇ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ａｎｄ ｎｏｖｅｌ ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ｔｏｏｌｓ． Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００６ Ｆｅｂ；１８４（６）：３６２－７７）；及び
－ ＳＰＥＰｌｉｐ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｇｐｃｒ．ｂｉｏｃｏｍｐ．ｕｎｉｂｏ．ｉｔ／ｃｇｉ／ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ／ｓｐｅｐ／ｐｒｅｄ＿ｓｐｅｐｃｇｉ．ｃｇｉ； Ｐｉｅｒｏ Ｆａｒｉｓｅｌｌｉ， Ｇｉａｃｏｍｏ Ｆｉｎｏｃｃｈｉａｒｏ， Ｒｉｔａ Ｃａｓａｄｉｏ； ＳＰＥＰｌｉｐ： ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅｓ， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， Ｖｏｌｕｍｅ １９， Ｉｓｓｕｅ １８， １２ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００３， Ｐａｇｅｓ ２４９８－２４９９）。

【0081】

好ましくは、ＬｉｐｏＰは、分泌タンパク質のシグナルペプチドとグラム陰性菌のリポタンパク質のシグナルペプチドとを区別するために使用される。特に、ＬｉｐｏＰは、タンパク質配列に対して予測を行って、コードされたリポタンパク質シグナルペプチドのタイプを決定する。タイプＩ（ＳｐＩ）は、通常のシグナルペプチドであり、タイプＩＩ（ＳｐＩＩ）は、リポタンパク質シグナルペプチドであり、通常、ペリプラズム内に位置するタンパク質にみられる。

【0082】

分泌タンパク質のシグナルペプチドと、グラム陰性菌のリポタンパク質のシグナルペプチドとを区別するためのバイオインフォマティクスツールに加えて、配列の分類学的割り当てを考慮することも好ましい。該当タンパク質をコードする対応する遺伝子に分類学的割り当てが利用可能な場合、その割り当てを用いて、可能なリポタンパク質を区別することができる。ヒト腸内微生物遺伝子の分類学的アノテーションは、Ｌｉ Ｊ， Ｊｉａ Ｈ， Ｃａｉ Ｘ， Ｚｈｏｎｇ Ｈ， Ｆｅｎｇ Ｑ， Ｓｕｎａｇａｗａ Ｓ， Ａｒｕｍｕｇａｍ Ｍ， Ｋｕｌｔｉｍａ ＪＲ， Ｐｒｉｆｔｉ Ｅ， Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｔ， Ｊｕｎｃｋｅｒ ＡＳ， Ｍａｎｉｃｈａｎｈ Ｃ， Ｃｈｅｎ Ｂ， Ｚｈａｎｇ Ｗ， Ｌｅｖｅｎｅｚ Ｆ， Ｗａｎｇ Ｊ， Ｘｕ Ｘ， Ｘｉａｏ Ｌ， Ｌｉａｎｇ Ｓ， Ｚｈａｎｇ Ｄ， Ｚｈａｎｇ Ｚ， Ｃｈｅｎ Ｗ， Ｚｈａｏ Ｈ， Ａｌ－Ａａｍａ ＪＹ， Ｅｄｒｉｓ Ｓ， Ｙａｎｇ Ｈ， Ｗａｎｇ Ｊ， Ｈａｎｓｅｎ Ｔ， Ｎｉｅｌｓｅｎ ＨＢ， Ｂｒｕｎａｋ Ｓ， Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ Ｋ， Ｇｕａｒｎｅｒ Ｆ， Ｐｅｄｅｒｓｅｎ Ｏ， Ｄｏｒｅ Ｊ， Ｅｈｒｌｉｃｈ ＳＤ； ＭｅｔａＨＩＴ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ， Ｂｏｒｋ Ｐ， Ｗａｎｇ Ｊ； ＭｅｔａＨＩＴ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ． Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１４ Ａｕｇ；３２（８）：８３４－４１に記載される手順にしたがって行うことができる。

【0083】

タンパク質長
本発明に係るヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を提供するための方法の工程（ｉｉ）は、配列の長さを評価し、配列が所定長範囲の長さ、即ち、２０～５００アミノ酸を有する配列を選択するサブ工程を含む。タンパク質は、好ましくは２０～３５０アミノ酸長、より好ましくは２０～２００アミノ酸長を有する。

【0084】

したがって、この工程においては、タンパク質長の分布が評価され、長さのカットオフが、関心のあるタンパク質の特定グループ、例えば、短い非酵素的タンパク質及び／又は機能的活性を有するタンパク質をコードするより長い配列に応じて設定される。

【0085】

このサブ工程においては、２０アミノ酸以上のタンパク質をコードする配列又は２０アミノ酸以上のタンパク質の配列が選択される。いくつかの場合においては、２５以上、好ましくは３０以上、より好ましくは３５以上、更により好ましくは４０以上、更により好ましくは４５以上、最も好ましくは５０以上のアミノ酸長を有する、タンパク質をコードする配列又はタンパク質の配列が選択される。これにより、アノテーションの偏り及びアーチファクトに起因し得る小さなペプチドを避けることができる。

【0086】

更に、５００以下のアミノ酸長、好ましくは４５０以下のアミノ酸長、より好ましくは４００以下のアミノ酸長、更により好ましくは３５０以下のアミノ酸長、更により好ましくは３００以下のアミノ酸長、最も好ましくは２５０以下のアミノ酸長（例えば、２００アミノ酸長以下又は１５０アミノ酸長以下）を有するタンパク質をコードする配列又はタンパク質の配列が選択される。これにより、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、神経ペプチド、ペプチドホルモンなどの、相互作用分子に通常見られるサイズを有する比較的小さなタンパク質を選択するために、選択されるタンパク質の最大長が限定される。

【0087】

いくつかの実施形態においては、２５～４５０アミノ酸長、好ましくは３０～４００アミノ酸長、より好ましくは３５～３５０アミノ酸長、更により好ましくは４０～３００アミノ酸長、更に好ましくは４５～２５０アミノ酸長を有する、タンパク質をコードする配列又はタンパク質の配列が選択される。例えば、５０～２００アミノ酸長又は５０～１５０アミノ酸長を有するタンパク質をコードする配列又はタンパク質の配列が選択される。

【0088】

いくつかの実施形態においては、タンパク質長は、（その機能状態の）「成熟」タンパク質で評価される、即ち、成熟／機能タンパク質で除去されるシグナルペプチドなどの「補助的な」プレタンパク質配列は、タンパク質長に考慮されないことがある。この目的のために、シグナルペプチドは、前記したように同定及び除去（「切断」、例えば、適切なバイオインフォマティクスツールを用いたインシリコで）することができる。好ましくは、（シグナルペプチドを含まない）ヒトマイクロバイオータタンパク質の長さは、２０～５００アミノ酸長の（シグナルペプチドを含まない）タンパク質など、５００アミノ酸を超えない。例えば、（シグナルペプチドを含まない）タンパク質の最大長は、４００又は３５０アミノ酸であり得る。より好ましくは、（シグナルペプチドを含まない）マイクロバイオータタンパク質の最大長は、２５０アミノ酸を超えず、例えば、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、又は２０アミノ酸以下である。（シグナルペプチドを含まない）最小の長さは、通常、２０アミノ酸である。いくつかの実施形態においては、（シグナルペプチドを含まない）マイクロバイオータタンパク質は、２０～３５０アミノ酸長、好ましくは２０～３００アミノ酸長、より好ましくは２０～２５０アミノ酸長、更により好ましくは２０～２００アミノ酸長、更に好ましくは２０～１５０アミノ酸長、例えば、２０～４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、又は１４０アミノ酸長を有する。

【0089】

他の実施形態においては、タンパク質長は、「プレタンパク質」、即ち、シグナルペプチドを含んで評価される。好ましくは、（シグナルペプチドを含む）ヒトマイクロバイオータタンパク質の長さは、（シグナルペプチドを含まない）５０～５５０アミノ酸長のタンパク質など、５５０アミノ酸を超えない。例えば、（シグナルペプチドを含む）タンパク質の最大長は、５００アミノ酸又は４００アミノ酸であり得る。より好ましくは、（シグナルペプチドを含む）マイクロバイオータタンパク質の最大長は、３５０アミノ酸を超えない、例えば、３４０、３３０、３２０、３１０、２００、２９０、２８０、２７０、２６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、又は５０アミノ酸以下である。（シグナルペプチドを含む）最小の長さは、通常、５０アミノ酸である。いくつかの実施形態においては、（シグナルペプチドを含む）マイクロバイオータタンパク質は、５０～４００アミノ酸長、好ましくは５０～３５０アミノ酸長、より好ましくは５０～３００アミノ酸長、更により好ましくは５０～２５０アミノ酸長、更に好ましくは５０～２００アミノ酸長、例えば、５０～６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、又は１９０アミノ酸長である。

【0090】

システイン含量、及び立体構造的に剛性な構造を与える構造エレメント
本発明に係るヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を提供するための方法の工程（ｉｉ）において、かかるタンパク質配列又はかかるタンパク質をコードする核酸配列が同定及び選択され、前記タンパク質は、
（ａ）少なくとも２つのシステイン残基、及び／又は
（ｂ）立体構造的に剛性な構造を前記タンパク質に与える一次及び／又は二次構造エレメントを含む。
かかるタンパク質は、それらのコンフォメーションを容易には変更できない、即ち、タンパク質のコンフォメーションは拘束される。これにより、タンパク質は、標的（例えば、マイクロバイオータタンパク質のヒト標的）と相互作用する（例えば、結合する）ために必要なコンフォメーションを維持する。

【0091】

前記を考慮すると、少なくとも２つのシステイン残基（システイン対を形成し得る）を含むタンパク質を、同定及び選択することができる。システイン残基は、タンパク質を正しいコンフォメーションで安定化させる。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は、３、４、５、６、７、８、９、１０、またそれ以上のシステイン残基を含む。例えば、マイクロバイオータタンパク質は、２つ又は３つのシステイン残基（例えば、１つのシステイン対を形成する）、より好ましくは４つ又は５つのシステイン残基（例えば、２つのシステイン対を形成する）、更により好ましくは６つ又は７つのシステイン残基（例えば、３つのシステイン対を形成する）、更により好ましくは８つ又は９つのシステイン残基（例えば、４つのシステイン対を形成する）を含み得る。システイン残基、特に、システイン対間のジスルフィド結合は、タンパク質に剛性の高い構造を与える。したがって、システイン結合をもたらし得るシステインモチーフを含むタンパク質の配列が同定されることが好ましい。したがって、マイクロバイオータタンパク質は、好ましくは、偶数個のシステイン残基を含む。

【0092】

マイクロバイオータタンパク質のシステイン含量は、タンパク質長を考慮して計算することもできる。好ましくは、マイクロバイオータタンパク質は、少なくとも１％のシステイン含量を有する。より好ましくは、マイクロバイオータタンパク質は、少なくとも２％のシステイン含量を有する。更により好ましくは、マイクロバイオータタンパク質は、少なくとも３％のシステイン含量を有する。更により好ましくは、マイクロバイオータタンパク質は、少なくとも４％のシステイン含量を有する。最も好ましくは、マイクロバイオータタンパク質（又はその断片又は配列変異体）は、少なくとも５％のシステイン含量を有する。例えば、タンパク質（又はその断片又は配列変異体）は、約６～８％、例えば、約６．５～７％のシステイン含量を有することができる。

【0093】

マイクロバイオータタンパク質が、偶数個のシステイン残基を含むことも好ましい。これにより、タンパク質中の全てのシステイン残基が、ジスルフィド結合（「ジスルフィド架橋」とも称される）の形成に関与する可能性が高まる。しかし、システイン残基の数が偶数個ではないタンパク質も、３つ以上のシステイン残基を含む場合、ジスルフィド結合を含むことができることが理解される。

【0094】

いくつかの実施形態においては、タンパク質内のシステイン数が決定される（数えられる）。例えば、少なくとも２つのシステイン残基を含むタンパク質は、タンパク質中のシステイン残基数を数えることによって同定することができる。

【0095】

他の実施形態においては、タンパク質のシステイン含量は、ＫＡＰＰＡ（ｈｔｔｐ：／／ｋａｐｐａ－ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｅａｒｃｈ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ； Ｊｏｌｙ Ｖ， Ｍａｔｔｏｎ ＤＰ． ＫＡＰＰＡ， ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｅｆｉｎｅｄ ｂｙ ａ ｋｅｙ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｐａｔｔｅｒｎ： ａ ｃａｓｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２０１５ Ｊｕｎ １；３１（１１）：１７１６－２３）などのバイオインフォマティクスツールを使用して同定することができる。ＫＡＰＰＡは、システインモチーフとこれらのモチーフの類似性にしたがってタンパク質をグループ化するの追加情報を提供できる。したがって、ＫＡＰＰＡは、システイン数に加えて、分泌タンパク質内の特定のシステインモチーフの存在を同定するのに特に有用である。

【0096】

いくつかの実施形態においては、少なくとも２つのシステイン残基を含むタンパク質の同定及び選択は、シグナルペプチドのアミノ酸／配列を考慮せずに行われる。その理由は、シグナルペプチドが通常、切断され、成熟タンパク質はシグナルペプチドを含まないためである。したがって、少なくとも２つのシステイン残基を含むタンパク質の同定において、シグナルペプチドのアミノ酸／配列は、考慮しないことが好ましい。したがって、少なくとも２つのシステイン残基を含むタンパク質の同定及び選択に先立ち、シグナルペプチドの配列をタンパク質配列から除去（インシリコで切断）することが好ましい。シグナルペプチドの除去（「切断」）は、前記したように、例えば、切断部位を同定し、シグナルペプチドを除去（例えば、インシリコで）することによって行うことができる。

【0097】

好ましくは、ヒトマイクロバイオータタンパク質（特に、シグナルペプチドを考慮しない）は、２０～２００アミノ酸長を有し、少なくとも２つのシステイン残基を含む（例えば、１つのシステイン対を形成する）。例えば、マイクロバイオータタンパク質（特に、シグナルペプチドを考慮しない）は、５０～１５０アミノ酸長を有し、少なくとも４つのシステイン残基を含み得る（例えば、２つのシステイン対を形成する）；又はマイクロバイオータタンパク質は、７５～１５０アミノ酸長を有し、少なくとも６つのシステイン残基を含み得る（例えば、３つのシステイン対を形成する）。より好ましくは、マイクロバイオータタンパク質（特に、シグナルペプチドを考慮しない）は、（ｉ）２０～１００アミノ酸長を有し、少なくとも４つのシステイン残基を含む（例えば、２つのシステイン対を形成する）；（ｉｉ）５０～１５０アミノ酸長を有し、少なくとも６つのシステイン残基を含む（例えば、３つのシステイン対を形成する）；又は（ｉｉｉ）７５～２００アミノ酸長を有し、少なくとも８つのシステイン残基を含む（例えば、４つのシステイン対を形成する）。かかるタンパク質は、少なくとも４％のシステイン含量を有する。更により好ましくは、マイクロバイオータタンパク質（特に、シグナルペプチドを考慮しない）は、（ｉ）２０～７５アミノ酸長を有し、少なくとも４つのシステイン残基を含む（例えば、２つのシステイン対を形成する）；（ｉｉ）５０～１００アミノ酸長を有し、少なくとも６つのシステイン残基を含む（例えば、３つのシステイン対を形成する）；又は（ｉｉｉ）７５～１２５アミノ酸長を有し、少なくとも８つのシステイン残基を含む（例えば、４つのシステイン対を形成する）。かかるタンパク質は、５％を超えるシステイン含量を有する。

【0098】

マイクロバイオータタンパク質が、立体構造的に剛性な構造を与える一次及び／又は二次構造エレメントを含むことも好ましい。かかる一次及び／又は二次構造エレメントは、システインモチーフ、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）、アルファヘリックス（αヘリックス）、ベータシート（βシート）、及びコイルからなる群から選択することができる。例えば、立体構造的に剛性な構造を与える一次及び／又は二次構造エレメントは、ジスルフィド架橋である。

【0099】

或いは、剛性なタンパク質、即ち、立体構造的に剛性な構造を与える一次及び／又は二次構造エレメントを含むタンパク質は、特に、剛性なタンパク質の同定のためのバイオインフォマティクスツールを使用することによって、インシリコで同定することができる。剛性なタンパク質の同定のためのバイオインフォマティクスツールの例としては、以下が挙げられる。
－ ＰＳＩｐｒｅｄ （Ｐｒｅｄｉｃｔ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ） （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆ．ｃｓ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｐｓｉｐｒｅｄ／； Ｊｏｎｅｓ ＤＴ， Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐｏｓｉｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｃｅｓ， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １９９９ Ｓｅｐ １７；２９２（２）：１９５－２０２）；
－ ＨＨｂｌｉｔｓ （Ｒｅｍｍｅｒｔ Ｍ， Ｂｉｅｇｅｒｔ Ａ， Ｈａｕｓｅｒ Ａ， Ｓｏｄｉｎｇ Ｊ， ＨＨｂｌｉｔｓ： ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ－ｆａｓｔ ｉｔｅｒａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｂｙ ＨＭＭ－ＨＭＭ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｖｏｌｕｍｅ ９， １７３－１７５（２０１２）；
－ ＭＡＤＯＫＡ （Ｄｅｎｇ Ｌ， Ｚｈｏｎｇ Ｇ， Ｌｉｕ Ｃ， Ｌｕｏ Ｊ， Ｌｉｕ Ｈ， ＭＡＤＯＫＡ： ａｎ ｕｌｔｒａ－ｆａｓｔ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｓｅａｒｃｈｉｎｇ， ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２０１９ Ｄｅｃ ２４；２０（Ｓｕｐｐｌ １９）：６６２）；
－ ＪＰＲＥＤ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｏｍｐｂｉｏ．ｄｕｎｄｅｅ．ａｃ．ｕｋ／ｊｐｒｅｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ； Ｄｒｏｚｄｅｔｓｋｉｙ Ａ， Ｃｏｌｅ Ｃ， Ｐｒｏｃｔｅｒ Ｊ， Ｂａｒｔｏｎ ＧＪ． ＪＰｒｅｄ４： ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｓｅｒｖｅｒ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０１５ Ｊｕｌ １；４３（Ｗ１）：Ｗ３８９－９４）；
－ ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐｓ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／； Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ， Ａ．， Ｂｅｒｔｏｎｉ， Ｍ．， Ｂｉｅｎｅｒｔ， Ｓ．， Ｓｔｕｄｅｒ， Ｇ．， Ｔａｕｒｉｅｌｌｏ， Ｇ．， Ｇｕｍｉｅｎｎｙ， Ｒ．， Ｈｅｅｒ， Ｆ．Ｔ．， ｄｅ Ｂｅｅｒ， Ｔ．Ａ．Ｐ．， Ｒｅｍｐｆｅｒ， Ｃ．， Ｂｏｒｄｏｌｉ， Ｌ．， Ｌｅｐｏｒｅ， Ｒ．， Ｓｃｈｗｅｄｅ， Ｔ． ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ： ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ４６（Ｗ１）， Ｗ２９６－Ｗ３０３ （２０１８）； Ｂｅｒｔｏｎｉ， Ｍ．， Ｋｉｅｆｅｒ， Ｆ．， Ｂｉａｓｉｎｉ， Ｍ．， Ｂｏｒｄｏｌｉ， Ｌ．， Ｓｃｈｗｅｄｅ， Ｔ． Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｏｍｏ－ ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏ－ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ ｂｅｙｏｎｄ ｂｉｎａｒｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ｈｏｍｏｌｏｇｙ． Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ７ （２０１７））；
－ ＫＩＮＡＲＩ （ＫＩＮｅｍａｔｉｃｓ Ａｎｄ Ｒｉｇｉｄｉｔｙ） ａｎｄ Ｋｉｎａｒｉ－２ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｋｉｎａｒｉ．ｃｓ．ｕｍａｓｓ．ｅｄｕ／Ｓｉｔｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ； Ｎａｏｍｉ Ｆｏｘ， Ｆｉｌｉｐ Ｊａｇｏｄｚｉｎｓｋｉ， Ｙａｎｇ Ｌｉ， Ｉｌｅａｎａ Ｓｔｒｅｉｎｕ． ＫＩＮＡＲＩ－Ｗｅｂ： Ａ Ｓｅｒｖｅｒ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｉｇｉｄｉｔｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ３９ （Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ Ｉｓｓｕｅ）， ２０１１； Ｓｔｒｅｉｎｕ Ｉ． Ｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅ ｒｉｇｉｄｉｔｙ－ｂａｓｅｄ ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． Ｓｔｒｕｃｔ Ｄｙｎ． ２０１６；３（１）：０１２００５）；及び
－ ＰｒｅｄｙＦｌｅｘｙ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｓｉｍｂ．ｉｎｓｅｒｍ．ｆｒ／ｄｓｉｍｂ＿ｔｏｏｌｓ／ｐｒｅｄｙｆｌｅｘｙ／； ｄｅ Ｂｒｅｖｅｒｎ ＡＧ， Ｂｏｒｎｏｔ Ａ， Ｃｒａｖｅｕｒ Ｐ， Ｅｔｃｈｅｂｅｓｔ Ｃ， Ｇｅｌｌｙ ＪＣ． ＰｒｅｄｙＦｌｅｘｙ： ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｌｏｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｓｅｑｕｅｎｃｅ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０１２；４０（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ）：Ｗ３１７－Ｗ３２２）。

【0100】

例えば、マイクロバイオータタンパク質（特に、シグナルペプチドを考慮しない）は、（ｉ）２０～５０アミノ酸長を有し、立体構造的に剛性な構造を与える一次及び／又は二次構造エレメントを含む；又は（ｉｉ）２０～５０アミノ酸長を有し、アルファヘリックス（αヘリックス）、ベータシート（βシート）、及びコイルからなる群から選択される二次構造エレメントを含む。

【0101】

追加の任意のサブ工程
前記３つの基準にしたがう配列の選択に加えて、工程（ｉｉ）の１以上の更なるサブ工程を行うことができる。かかる任意の追加サブ工程としては、配列のアノテーション及び／又は冗長な配列の除去が挙げられる。

【0102】

いくつかの実施形態においては、未知の機能を有するタンパク質又は核酸配列が、工程（ｉｉ）においてアノテートされる。したがって、本発明に係る方法は、未知の機能を有するヒトマイクロバイオータ配列を同定し、前記配列をアノテートするサブ工程を含み得る。

【0103】

本明細書においては、用語「アノテーション」又は「アノテートする」は、配列に対して、構造的及び／又は生物学的情報を付加することを意味する。特に、配列アノテーションは、構造又は機能に関する記述情報を使用して、核酸配列又はタンパク質配列における特定の特徴をマークするプロセスである。したがって、配列アノテーションは、翻訳後修飾、結合部位、酵素活性部位、局所的二次構造、又は他の特性など、タンパク質配列における関心のある領域又は部位を記述することができる。例えば、ゲノムコンテキスト情報、類似性スコア、実験データ、及び他のリソースの統合を使用して、配列アノテーションを提供することができる。

【0104】

アノテーションは、（予測された）分泌タンパク質の下流のフィルタリングと選択を容易にする。

【0105】

アノテーションは、前記したように、工程（ｉｉ）の他のサブ工程の前後又はそれらの間に行うことができる。いくつかの実施形態においては、アノテーションは、以下の後に行われる。
－ シグナルペプチドを有する配列、又はシグナルペプチドを有するタンパク質をコードする配列を選択すること；
－ ２０～５００アミノ酸長を有する配列、又は２０～５００アミノ酸長を有するタンパク質をコードする配列を選択すること；
－ 少なくとも２つのシステイン残基及び／又は立体構造的に剛性な構造を与える一次及び／又は二次構造エレメントを少なくとも含む配列、又は少なくとも２つのシステイン残基及び／又は立体構造的に剛性な構造を与える一次及び／又は二次構造エレメントを含むタンパク質をコードする配列を選択すること。

【0106】

アノテーションは、ヒトの専門知識を含む手動によるアノテーション、及び／又はコンピュータ分析によりアノテーションを行う自動アノテーションツールによって行うことができる。例えば、インシリコ法をアノテーションに使用することができる。いくつかの実施形態においては、これらのアプローチ（手動及び自動）は、例えば、相互に補完することによって、同一のアノテーションパイプラインで組み合わされる。

【0107】

アノテーションは、ＢＬＡＳＴなどの相同性ベースの検索ツールによって行われ、特定のデータベースにおける既知の構造／機能を有する相同遺伝子又はタンパク質を検索することができる。得られた情報は、次いで、核酸及び／又はタンパク質配列をアノテートするために使用される。

【0108】

一般に、アノテーションは、構造的及び／又は機能的情報を提供することができる。構造的アノテーションは、核酸又はタンパク質配列の構造的エレメント、例えば、ＯＲＦ、遺伝子構造、コーディング領域、及び核酸配列内の調節モチーフの位置の同定に関する。構造的アノテーションのより好ましい例は、タンパク質ドメイン及びモチーフの同定など、タンパク質レベル（タンパク質及び核酸配列の両方でアノテートされ得る）に関する構造的情報に関する。機能的アノテーションは、生化学的機能、生物学的機能、関与する調節及び相互作用、並びに発現に関する情報などの付加的生物学的情報に関する。本発明においては、アノテーションは、好ましくは、機能的アノテーションを含む又はからなる。より好ましくは、アノテーションは、機能に関する構造化ビューを提供する。

【0109】

一般に、機能的アノテーションは、好ましくは、相同性ベースの方法、配列モチーフベースの方法、ドメインベースの方法、構造ベースの方法、ゲノムコンテキストベースの方法、計算溶媒マッピング法、及び／又はネットワークベースの方法によって行われる。より好ましくは、これらの方法の２以上の組合せが用いられる。

【0110】

好ましくは、工程（ｉｉ）において、未知の機能を有するタンパク質又は核酸配列が、インシリコでアノテートされる。

【0111】

アノテーションは、レファレンスデータベース、例えば、Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ （ＫＥＧＧ）及び／又はＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ＮＣＢＩ） Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ （ＲｅｆＳｅｑ）に対する（ＢＬＡＳＴベースの）比較によって行うことができる。ＲｅｆＳｅｑは、ゲノムＤＮＡ、転写産物、タンパク質など、統合された非冗長な配列のセットを提供する。ＫＥＧＧでは、ＫＯ（ＫＥＧＧ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｙ）データベースに格納されている分子レベルの機能を用いることができる。これらの機能は、共通の祖先から進化した様々な種の遺伝子によってコードされるタンパク質を含む、オルソログのグループに分類される。

【0112】

Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅ （ＣＤＤ） （ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｄｄ／； Ｍａｒｃｈｌｅｒ－Ｂａｕｅｒ Ａ ｅｔ ａｌ． （２０１１）， “ＣＤＤ： ａ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９（Ｄ）２２５－９）は、保存されたドメインフットプリントの位置、及びこれらのフットプリントから推測される機能的部位による、タンパク質配列のアノテーションの代替データベースである。

【0113】

アノテーションに好ましいデータベースは、ＰＦＡＭ（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｘｆａｍ．ｏｒｇ／； Ｒ．Ｄ． Ｆｉｎｎ， Ｐ． Ｃｏｇｇｉｌｌ， Ｒ．Ｙ． Ｅｂｅｒｈａｒｄｔ， Ｓ．Ｒ． Ｅｄｄｙ， Ｊ． Ｍｉｓｔｒｙ， Ａ．Ｌ． Ｍｉｔｃｈｅｌｌ， Ｓ．Ｃ． Ｐｏｔｔｅｒ， Ｍ． Ｐｕｎｔａ， Ｍ． Ｑｕｒｅｓｈｉ， Ａ． Ｓａｎｇｒａｄｏｒ－Ｖｅｇａｓ， Ｇ．Ａ． Ｓａｌａｚａｒ， Ｊ． Ｔａｔｅ， Ａ． Ｂａｔｅｍａｎ： Ｔｈｅ Ｐｆａｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｄａｔａｂａｓｅ： ｔｏｗａｒｄｓ ａ ｍｏｒｅ ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ ｆｕｔｕｒｅ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （２０１６） Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ ４４： Ｄ２７９－Ｄ２８５； Ｅ． Ｌ． Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ， Ｓ． Ｒ． Ｅｄｄｙ， Ｒ． Ｄｕｒｂｉｎ： Ｐｆａｍ： ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｅｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ． Ｉｎ： Ｐｒｏｔｅｉｎｓ． ２８， １９９７， Ｓ． ４０５－４２０）である。

【0114】

アノテーションに好ましいバイオインフォマティクスツール（ソフトウェア）の更なる例としては、以下が挙げられる。
－ ＨＭＭＳＣＡＮ （ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｈｍｍｅｒ／ｓｅａｒｃｈ／ｈｍｍｓｃａｎ； Ｆｉｎｎ， Ｒ． Ｄ．， Ｃｌｅｍｅｎｔｓ， Ｊ． ＆ Ｅｄｄｙ， Ｓ． Ｒ． ＨＭＭＥＲ ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒ： ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｓｅａｒｃｈｉｎｇ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３９， Ｗ２９－３７， ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｒ３６７ （２０１１）； Ｅｄｄｙ， Ｓ． Ｒ． Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ Ｐｒｏｆｉｌｅ ＨＭＭ Ｓｅａｒｃｈｅｓ． ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ ７， ｅ１００２１９５， ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｃｂｉ．１００２１９５ （２０１１）； Ｒ．Ｄ．Ｆｉｎｎ， Ｊ．Ｃｌｅｍｅｎｔｓ， Ｗ．Ａｒｎｄｔ， Ｂ．Ｌ．Ｍｉｌｌｅｒ， Ｔ．Ｊ．Ｗｈｅｅｌｅｒ， Ｆ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ， Ａ．Ｂａｔｅｍａｎ ａｎｄ Ｓ．Ｒ．Ｅｄｄｙ： ＨＭＭＥＲ ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒ： ２０１５ ｕｐｄａｔｅ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （２０１５） Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ Ｉｓｓｕｅ ４３：Ｗ３０－Ｗ３８）；
－ ＨＡＭＡＰ ａｎｄ／ｏｒ ＨＡＭＡＰ－Ｓｃａｎ （ｈｔｔｐｓ：／／ｈａｍａｐ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／； ｈｔｔｐｓ：／／ｈａｍａｐ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｈａｍａｐ＿ｓｃａｎ．ｈｔｍｌ； Ｉｖｏ Ｐｅｄｒｕｚｚｉ， Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ Ｒｉｖｏｉｒｅ， Ａｎｄｒｅａ Ｈ． Ａｕｃｈｉｎｃｌｏｓｓ， Ｅｌｉｓａｂｅｔｈ Ｃｏｕｄｅｒｔ， Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ Ｋｅｌｌｅｒ， Ｅｄｏｕａｒｄ ｄｅ Ｃａｓｔｒｏ， Ｄｅｌｐｈｉｎｅ Ｂａｒａｔｉｎ， Ｂｅａｔｒｉｃｅ Ａ． Ｃｕｃｈｅ， Ｌｙｄｉｅ Ｂｏｕｇｕｅｌｅｒｅｔ， Ｓｙｌｖａｉｎ Ｐｏｕｘ， Ｎｉｃｏｌｅ Ｒｅｄａｓｃｈｉ， Ｉｏａｎｎｉｓ Ｘｅｎａｒｉｏｓ， Ａｌａｎ Ｂｒｉｄｇｅ； ＨＡＭＡＰ ｉｎ ２０１５： ｕｐｄａｔｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌｕｍｅ ４３， Ｉｓｓｕｅ Ｄ１， ２８ Ｊａｎｕａｒｙ ２０１５， Ｐａｇｅｓ Ｄ１０６４－Ｄ１０７０； Ｔａｎｉａ Ｌｉｍａ， Ａｎｄｒｅａ Ｈ． Ａｕｃｈｉｎｃｌｏｓｓ， Ｅｌｉｓａｂｅｔｈ Ｃｏｕｄｅｒｔ， Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ Ｋｅｌｌｅｒ， Ｋａｒｉｎｅ Ｍｉｃｈｏｕｄ， Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ Ｒｉｖｏｉｒｅ， Ｖｉｒｇｉｎｉｅ Ｂｕｌｌｉａｒｄ， Ｅｄｏｕａｒｄ ｄｅ Ｃａｓｔｒｏ， Ｃｏｒｉｎｎｅ Ｌａｃｈａｉｚｅ， Ｄｅｌｐｈｉｎｅ Ｂａｒａｔｉｎ， Ｉｓａｂｅｌｌｅ Ｐｈａｎ， Ｌｙｄｉｅ Ｂｏｕｇｕｅｌｅｒｅｔ， Ａｍｏｓ Ｂａｉｒｏｃｈ； ＨＡＭＡＰ： ａ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｓｅｔｓ ａｎｄ ｍａｎｕａｌｌｙ ｃｕｒａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｉｎ ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌｕｍｅ ３７， Ｉｓｓｕｅ ｓｕｐｐｌ＿１， １ Ｊａｎｕａｒｙ ２００９， Ｐａｇｅｓ Ｄ４７１－Ｄ４７８）；
－ ｉＰｔｇｘＤＢ （ｈｔｔｐｓ：／／ｉｐｔｇｘｄｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／； Ｕ． Ｏｍａｓｉｔｓ， Ａ． Ｒ． Ｖａｒａｄａｒａｊａｎ， ｅｔ ａｌ． Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｅｎｔｉｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｄｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｏｍｅｓ ｂｙ ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｏｍｉｃｓ． ２０１７． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２７： ２０８３－２０９５； Ａ． Ｉ． Ｎｅｓｖｉｚｈｓｋｉｉ． ２０１４． Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｏｍｉｃｓ： ｃｏｎｃｅｐｔｓ， ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１： １１１４－１１２５）；
－ ＯｒｔｈｏＤＢ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｒｔｈｏｄｂ．ｏｒｇ／； Ｚｄｏｂｎｏｖ ＥＭ， Ｔｅｇｅｎｆｅｌｄｔ Ｆ， Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖ Ｄ， Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ＲＭ， Ｓｉｍａｏ ＦＡ， Ｉｏａｎｎｉｄｉｓ Ｐ， Ｓｅｐｐｅｙ Ｍ， Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ Ａ， Ｋｒｉｖｅｎｔｓｅｖａ ＥＶ． ＯｒｔｈｏＤＢ ｖ９．１： ｃａｔａｌｏｇｉｎｇ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａｎｉｍａｌ， ｆｕｎｇａｌ， ｐｌａｎｔ， ａｒｃｈａｅａｌ， ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｎｄ ｖｉｒａｌ ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０１７ Ｊａｎ ４；４５（Ｄ１）：Ｄ７４４－Ｄ７４９）；
－ ＵｎｉＰｒｏｔ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／； Ｔｈｅ ＵｎｉＰｒｏｔ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ． ＵｎｉＰｒｏｔ： ｔｈｅ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ４５： Ｄ１５８－Ｄ１６９ （２０１７））；
－ ＣＡＴＨ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｔｈｄｂ．ｉｎｆｏ／； Ｉａｎ Ｓｉｌｌｉｔｏｅ， Ｔｏｎｙ Ｅ． Ｌｅｗｉｓ， Ａｌｉｓｏｎ Ｃｕｆｆ， Ｓａｙｏｎｉ Ｄａｓ， Ｐａｕｌ Ａｓｈｆｏｒｄ， Ｎａｔａｌｉｅ Ｌ． Ｄａｗｓｏｎ， Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｆｕｒｎｈａｍ， Ｒｏｍａｎ Ａ． Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ， Ｄａｖｉｄ Ｌｅｅ， Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｇ． Ｌｅｅｓ， Ｓｏｎｊａ Ｌｅｈｔｉｎｅｎ， Ｒｏｍａｉｎ Ａ． Ｓｔｕｄｅｒ， Ｊａｎｅｔ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ， Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ａ． Ｏｒｅｎｇｏ； ＣＡＴＨ： ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌｕｍｅ ４３， Ｉｓｓｕｅ Ｄ１， ２８ Ｊａｎｕａｒｙ ２０１５， Ｐａｇｅｓ Ｄ３７６－Ｄ３８１）；
－ ＰＡＮＴＨＥＲ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐａｎｔｈｅｒｄｂ．ｏｒｇ／； Ｔｈｏｍａｓ ＰＤ， Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＭＪ， Ｋｅｊａｒｉｗａｌ Ａ， Ｍｉ Ｈ， Ｋａｒｌａｋ Ｂ， Ｄａｖｅｒｍａｎ Ｒ， Ｄｉｅｍｅｒ Ｋ， Ｍｕｒｕｇａｎｕｊａｎ Ａ， Ｎａｒｅｃｈａｎｉａ Ａ． ＰＡＮＴＨＥＲ： ａ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ ａｎｄ ｓｕｂｆａｍｉｌｉｅｓ ｉｎｄｅｘｅｄ ｂｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ２００３ Ｓｅｐ；１３（９）：２１２９－４１； Ｍｉ Ｈ， Ｍｕｒｕｇａｎｕｊａｎ Ａ， Ｔｈｏｍａｓ ＰＤ． ＰＡＮＴＨＥＲ ｉｎ ２０１３： ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ， ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｇｅｎｅ ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ， ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｘｔ ｏｆ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０１３ Ｊａｎ；４１（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ３７７－８６）；
－ ＰＩＲＳＦ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐｓ：／／ｐｉｒ．ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ．ｅｄｕ／ｐｉｒｗｗｗ／ｄｂｉｎｆｏ／ｐｉｒｓｆ．ｓｈｔｍｌ； Ｎｉｋｏｌｓｋａｙａ ＡＮ， Ａｒｉｇｈｉ ＣＮ， Ｈｕａｎｇ Ｈ， Ｂａｒｋｅｒ ＷＣ， Ｗｕ ＣＨ． ＰＩＲＳＦ ｆａｍｉｌｙ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｅｖｏｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ Ｏｎｌｉｎｅ． ２００７ Ｆｅｂ １０；２：１９７－２０９； Ｗｕ ＣＨ， Ｎｉｋｏｌｓｋａｙａ Ａ， Ｈｕａｎｇ Ｈ， Ｙｅｈ ＬＳ， Ｎａｔａｌｅ ＤＡ， Ｖｉｎａｙａｋａ ＣＲ， Ｈｕ ＺＺ， Ｍａｚｕｍｄｅｒ Ｒ， Ｋｕｍａｒ Ｓ， Ｋｏｕｒｔｅｓｉｓ Ｐ， Ｌｅｄｌｅｙ ＲＳ， Ｓｕｚｅｋ ＢＥ， Ａｒｍｉｎｓｋｉ Ｌ， Ｃｈｅｎ Ｙ， Ｚｈａｎｇ Ｊ， Ｃａｒｄｅｎａｓ ＪＬ， Ｃｈｕｎｇ Ｓ， Ｃａｓｔｒｏ－Ａｌｖｅａｒ Ｊ， Ｄｉｎｋｏｖ Ｇ， Ｂａｒｋｅｒ ＷＣ． ＰＩＲＳＦ： ｆａｍｉｌｙ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ａｔ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００４ Ｊａｎ １；３２（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ１１２－４）；
－ ＰＲＩＮＴＳ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／１３０．８８．９７．２３９／ＰＲＩＮＴＳ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ； Ａｔｔｗｏｏｄ ＴＫ， Ｃｏｌｅｔｔａ Ａ， Ｍｕｉｒｈｅａｄ Ｇ， Ｐａｖｌｏｐｏｕｌｏｕ Ａ， Ｐｈｉｌｉｐｐｏｕ ＰＢ， Ｐｏｐｏｖ Ｉ， Ｒｏｍａ－Ｍａｔｅｏ Ｃ， Ｔｈｅｏｄｏｓｉｏｕ Ａ， Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ＡＬ． Ｔｈｅ ＰＲＩＮＴＳ ｄａｔａｂａｓｅ： ａ ｆｉｎｅ－ｇｒａｉｎｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｓｏｕｒｃｅ－－ｉｔｓ ｓｔａｔｕｓ ｉｎ ２０１２． Ｄａｔａｂａｓｅ （Ｏｘｆｏｒｄ）． ２０１２ Ａｐｒ １５；２０１２：ｂａｓ０１９； Ａｔｔｗｏｏｄ ＴＫ． Ｔｈｅ ＰＲＩＮＴＳ ｄａｔａｂａｓｅ： ａ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ． Ｂｒｉｅｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ． ２００２ Ｓｅｐ；３（３）：２５２－６３； Ａｔｔｗｏｏｄ ＴＫ， Ｂｅｃｋ ＭＥ， Ｂｌｅａｓｂｙ ＡＪ， Ｐａｒｒｙ－Ｓｍｉｔｈ ＤＪ． ＰＲＩＮＴＳ－－ａ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｔｉｆ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９４ Ｓｅｐ；２２（１７）：３５９０－６）；
－ ＰｒｏＤｏｍ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｄｏｍ．ｐｒａｂｉ．ｆｒ／ｐｒｏｄｏｍ／ｃｕｒｒｅｎｔ／ｈｔｍｌ／ｈｏｍｅ．ｐｈｐ； Ｋａｈｎ， Ｄ．， Ｒｅｚｖｏｙ， Ｃ． ａｎｄ Ｖｉｖｉｅｎ， Ｆ． （２００８） Ｐａｒａｌｌｅｌ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ １４ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｐａｒａｌｌｅｌ ａｎｄ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ８－１０， ２００８， Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ， ＩＥＥＥ， ｐｐ． ７２－７９； Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ Ｂｒｕ， Ｅｍｍａｎｕｅｌ Ｃｏｕｒｃｅｌｌｅ， Ｓｅｂａｓｔｉｅｎ Ｃａｒｒｅｒｅ， Ｙｏａｎｎ Ｂｅａｕｓｓｅ， Ｓａｎｄｒｉｎｅ Ｄａｌｍａｒ， ａｎｄ Ｄａｎｉｅｌ Ｋａｈｎ （２００５） Ｔｈｅ ＰｒｏＤｏｍ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ： ｍｏｒｅ ｅｍｐｈａｓｉｓ ｏｎ ３Ｄ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３３： Ｄ２１２－Ｄ２１５； ｏｒｐｅｔ Ｆ， Ｓｅｒｖａｎｔ Ｆ， Ｇｏｕｚｙ Ｊ， Ｋａｈｎ Ｄ （２０００） ＰｒｏＤｏｍ ａｎｄ ＰｒｏＤｏｍ－ＣＧ： ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｍａｉｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８：２６７－２６９）；
－ ＰＲＯＳＩＴＥ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐｓ：／／ｐｒｏｓｉｔｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／； Ｓｉｇｒｉｓｔ ＣＪ， ｄｅ Ｃａｓｔｒｏ Ｅ， Ｃｅｒｕｔｔｉ Ｌ， Ｃｕｃｈｅ ＢＡ， Ｈｕｌｏ Ｎ， Ｂｒｉｄｇｅ Ａ， Ｂｏｕｇｕｅｌｅｒｅｔ Ｌ， Ｘｅｎａｒｉｏｓ Ｉ． Ｎｅｗ ａｎｄ ｃｏｎｔｉｎｕｉｎｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ａｔ ＰＲＯＳＩＴＥ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０１３ Ｊａｎ；４１（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ３４４－７）；
－ ＳＭＡＲＴ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐｓ：／／ｓｍａｒｔ．ｅｍｂｌ．ｄｅ／； ｈｔｔｐ：／／ｓｍａｒｔ．ｅｍｂｌ－ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／； Ｉｖｉｃａ Ｌｅｔｕｎｉｃ， Ｐｅｅｒ Ｂｏｒｋ； ２０ ｙｅａｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＳＭＡＲＴ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｍａｉｎ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｒｅｓｏｕｒｃｅ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌｕｍｅ ４６， Ｉｓｓｕｅ Ｄ１， ４ Ｊａｎｕａｒｙ ２０１８， Ｐａｇｅｓ Ｄ４９３－Ｄ４９６； Ｌｅｔｕｎｉｃ Ｉ， Ｄｏｅｒｋｓ Ｔ， Ｂｏｒｋ Ｐ． ＳＭＡＲＴ： ｒｅｃｅｎｔ ｕｐｄａｔｅｓ， ｎｅｗ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｓｔａｔｕｓ ｉｎ ２０１５． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０１５ Ｊａｎ；４３（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２５７－６０； Ｉｖｉｃａ Ｌｅｔｕｎｉｃ， Ｓｕｐｒｉｙａ Ｋｈｅｄｋａｒ， Ｐｅｅｒ Ｂｏｒｋ， ＳＭＡＲＴ： ｒｅｃｅｎｔ ｕｐｄａｔｅｓ， ｎｅｗ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｓｔａｔｕｓ ｉｎ ２０２０， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌｕｍｅ ４９， Ｉｓｓｕｅ Ｄ１， ８ Ｊａｎｕａｒｙ ２０２１， Ｐａｇｅｓ Ｄ４５８－Ｄ４６０）；
－ ＳＵＰＥＲＦＡＭＩＬＹ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｓｕｐｆａｍ．ｃｓ．ｂｒｉｓ．ａｃ．ｕｋ／ＳＵＰＥＲＦＡＭＩＬＹ／； Ｊｕｌｉａｎ Ｇｏｕｇｈ， Ｋｅｖｉｎ Ｋａｒｐｌｕｓ， Ｒｉｃｈａｒｄ Ｈｕｇｈｅｙ， Ｃｙｒｕｓ Ｃｈｏｔｈｉａ （２００１）： Ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｔｏ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ ｍｏｄｅｌｓ ｔｈａｔ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｋｎｏｗｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ． Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｇ． Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ ３１３， Ｉｓｓｕｅ ４， Ｐａｇｅｓ ９０３－９１９； Ｄｅｒｅｋ Ｗｉｌｓｏｎ， Ｒａｌｐｈ Ｐｅｔｈｉｃａ， Ｙｉｄｕｏ Ｚｈｏｕ， Ｃｈａｒｌｅｓ Ｔａｌｂｏｔ， Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｖｏｇｅｌ， Ｍａｒｔｉｎ Ｍａｄｅｒａ， Ｃｙｒｕｓ Ｃｈｏｔｈｉａ， Ｊｕｌｉａｎ Ｇｏｕｇｈ； ＳＵＰＥＲＦＡＭＩＬＹ－ｓｏｐｈｉｓｔｉｃａｔｅｄ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ｄａｔａ ｍｉｎｉｎｇ， ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌｕｍｅ ３７， Ｉｓｓｕｅ ｓｕｐｐｌ＿１， １ Ｊａｎｕａｒｙ ２００９， Ｐａｇｅｓ Ｄ３８０－Ｄ３８６）；及び
－ ＴＩＧＲＦＡＭ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｃｖｉ．ｏｒｇ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｔｉｇｒｆａｍｓ／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉ； Ｄａｎｉｅｌ Ｈ． Ｈａｆｔ， Ｊｅｒｅｍｙ Ｄ． Ｓｅｌｅｎｇｕｔ， Ｏｗｅｎ Ｗｈｉｔｅ： Ｔｈｅ ＴＩＧＲＦＡＭｓ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００３ Ｊａｎ １； ３１（１）： ３７１－３７３； Ｄａｎｉｅｌ Ｈ． Ｈａｆｔ， Ｂｒｅｎｄａｎ， Ｊ． Ｌｏｆｔｕｓ， Ｄｅｌｗｏｏｄ Ｌ． Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ， Ｆａｎ Ｙａｎｇ， Ｊｏｎａｔｈａｎ， Ａ． Ｅｉｓｅｎ， Ｉａｎ Ｔ． Ｐａｕｌｓｅｎ， Ｏｗｅｎ Ｗｈｉｔｅ： ＴＩＧＲＦＡＭｓ： ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００１ Ｊａｎ １； ２９（１）： ４１－４３）。
これらの例示されたバイオインフォマティクスツール（ソフトウェア）の1以上を、配列のアノテーションに使用することができる。

【0115】

好ましくは、配列は、ＨＭＭＳＣＡＮ及び／又はＰＦＡＭを使用することによってアノテートされる。ＰＦＡＭは、タンパク質ファミリードメインの最大の公開データベースであり、ＨＭＭＳＣＡＮソフトウェアを使用して、これらのドメインについて、タンパク質配列を検索することができる。より好ましくは、配列は、ＳＭＡＲＴを使用することによってアノテートされる。

【0116】

いくつかの実施形態においては、ヒト宿主分子からの特定の機能的ドメインが、前記３つの基準の全てを満たすヒトマイクロバイオータタンパク質の配列内で検索される。ヒト宿主分子は、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、神経ペプチド、及びペプチドホルモンからなる群から選択され得る。

【0117】

代替的に又は追加的に、本発明に係るヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を提供するための方法は、冗長な配列が同定されるサブ工程を含むこともできる。次いで、任意に、同定された冗長な配列が除去される。特に、前記方法の工程（ｉｉ）において、冗長な配列を同定及び除去することができる。

【0118】

本明細書においては、用語「冗長な配列（ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、（データセット内に）２度含まれるタンパク質（アミノ酸）又は核酸配列を意味する。通常、配列が２重に存在しても、単一の配列の場合と比較して、更なる情報がデータセットに追加されない。したがって、かかる配列は、「冗長な」と称される。特に、用語「冗長性」は、１００％同一である配列を意味するだけでなく、大部分が同一である配列（少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも７５％の配列同一性を有する配列）も意味する。

【0119】

したがって、本発明に係る方法の工程（ｉｉ）において、別の配列と同一である全ての配列が同定され、除去される。これにより、得られたデータセットは、各配列を１回だけ含む。より好ましくは、本発明に係る方法の工程（ｉｉ）において、別の（選択された）配列に対して、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも７５％の同一性を有する配列が同定され、除去される。

【0120】

本発明においては、クエリ（レファレンス）アミノ酸配列に対して、少なくとも、例えば９５％の「配列同一性を共有する」アミノ酸配列は、対象のアミノ酸配列の配列がクエリアミノ酸配列の１００アミノ酸ごとに最大５つのアミノ酸変化を含み得ること以外は、対象のアミノ酸配列は、クエリ配列と同一であることを意味することが意図される。換言すれば、クエリアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性の配列を有するアミノ酸配列を得るためには、対象配列中のアミノ酸残基の最大５％（１００個のうち５個）を、好ましくは変異体又は断片の前記定義内で、挿入する、別のアミノ酸で置換する、又は欠失させることができる。言うまでもなく、同じことが、核酸配列にも同様に当てはまる。

【0121】

正確に対応していない（アミノ酸又は核酸）配列の場合、第１の配列（対象配列）の「％同一性」は、第２の配列（例えば、クエリ／レファレンス配列）に対して決定することができる。一般に、比較対象の２つの配列は、配列間に最大の相関関係がもたらされるようにアラインさせることができる。これは、アラインメントの程度を高めるために、一方又は両方の配列に「ギャップ」を挿入することを含み得る。次いで、比較される配列それぞれの全長に亘って（いわゆる、「グローバルアラインメント」）（同一又は同様な長さの配列に特に好適である）又はより短い決まった長さに亘って（いわゆる、「ローカルアラインメント」）（長さが等しくない配列により好適である）％同一性を決定することができる。

【0122】

２以上の配列の同一性（「類似性」又は「相同性」とも称されることがある）を比較するための方法は、当技術分野でよく知られている。２つ（又はそれ以上）の配列が同一であるパーセンテージは、例えば、数学的アルゴリズムを用いて決定することができる。好ましいが限定的ではない、使用可能な数学的アルゴリズムの例としては、Ｋａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）， ＰＮＡＳ ＵＳＡ， ９０：５８７３－５８７７のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴファミリーのプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴ又はＮＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５， ４０３－４１０ ｏｒ Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７）， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ２５：３３８９－３４０２も参照、ｗｏｒｌｄ ｗｉｄｅ ｗｅｂ ｓｉｔｅ ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖでＮＣＢＩのホームページからアクセス可能）及びＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ （１９９０）， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８３， ６３－９８； Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ （１９８８）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ ８５， ２４４４－２４４８．）に統合されている。別の配列と、ある程度同一な配列は、これらのプログラムによって同定することができる。更に、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ， ｖｅｒｓｉｏｎ ９．１（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ３８７－３９５）で利用可能なプログラム、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴ及びＧＡＰプログラムを、２つのポリヌクレオチド間の％同一性、及び２つのポリペプチド配列間の％同一性及び％相同性又は同一性を決定するために使用することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ （１９８１）， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １４７， １９５－１９７．）の「ローカルホモロジー」アルゴリズムを使用し、２つの配列間における類似性の最良の単一領域を見つける。

【0123】

冗長性を低減する、及び／又は冗長な配列を同定及び除去するためのバイオインフォマティクスツール（ソフトウェア）の好ましい例としては、以下が挙げられる。
－ ＣＤ－ＨＩＴ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｃｄ－ｈｉｔ．ｏｒｇ； ｈｔｔｐ：／／ｗｅｉｚｈｏｎｇｌｉ－ｌａｂ．ｏｒｇ／ｃｄ－ｈｉｔ／； Ｗｅｉｚｈｏｎｇ Ｌｉ， Ｌｕｋａｓｚ Ｊａｒｏｓｚｅｗｓｋｉ ＆ Ａｄａｍ Ｇｏｄｚｉｋ． Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｔｏ ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ｓｉｚｅ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅｓ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ （２００１） １７：２８２－２８３； Ｗｅｉｚｈｏｎｇ Ｌｉ ＆ Ａｄａｍ Ｇｏｄｚｉｋ． Ｃｄ－ｈｉｔ： ａ ｆａｓｔ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｌａｒｇｅ ｓｅｔｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ （２００６） ２２：１６５８－１６５９； Ｗｅｉｚｈｏｎｇ Ｌｉ， Ｌｉｍｉｎ Ｆｕ， Ｂｅｉｆａｎｇ Ｎｉｕ， Ｓｉｔａｏ Ｗｕ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｏｏｌｅｙ． Ｕｌｔｒａｆａｓｔ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｆｏｒ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ｏｆ ＣＤ－ＨＩＴ－ＯＴＵ－ＭｉＳｅｑｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ ｉｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， （２０１２） １３ （６）： ６５６－６６８）；
－ Ｄｅｃｒｅａｓｅ Ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｄｅｃｒｅａｓｅ＿ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ／； Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ Ｅ， Ｇａｔｔｉｋｅｒ Ａ， Ｈｏｏｇｌａｎｄ Ｃ， Ｉｖａｎｙｉ Ｉ， Ａｐｐｅｌ ＲＤ， Ｂａｉｒｏｃｈ Ａ： ＥｘＰＡＳｙ： Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｓｅｒｖｅｒ ｆｏｒ ｉｎ－ｄｅｐｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００３ Ｊｕｌ １； ３１（１３）：３７８４－８）；
－ Ｐｉｓｃｅｓ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｄｕｎｂｒａｃｋ．ｆｃｃｃ．ｅｄｕ／ＰＩＳＣＥＳ．ｐｈｐ； Ｗａｎｇ Ｇ， Ｄｕｎｂｒａｃｋ ＲＬ Ｊｒ： ＰＩＳＣＥＳ： ｒｅｃｅｎｔ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｔｏ ａ ＰＤＢ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｕｌｌｉｎｇ ｓｅｒｖｅｒ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００５ Ｊｕｌ １； ３３（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ）：Ｗ９４－８； Ｗａｎｇ Ｇ， Ｄｕｎｂｒａｃｋ ＲＬ Ｊｒ： ＰＩＳＣＥＳ： ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｕｌｌｉｎｇ ｓｅｒｖｅｒ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２００３ Ａｕｇ １２； １９（１２）：１５８９－９１）；
－ ＢｌａｓｔＣｌｕｓｔ （ＢＬＡＳＴ； ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ； Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ， Ｇｉｓｈ Ｗ， Ｍｉｌｌｅｒ Ｗ， Ｍｙｅｒｓ ＥＷ， Ｌｉｐｍａｎ ＤＪ： Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １９９０ Ｏｃｔ ５； ２１５（３）：４０３－１０； Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｄ， ｅｔ ａｌ． ２００７）；
－ ＳｋｉｐＲｅｄｕｎｄａｎｔ （ＥＭＢＯＳＳ； ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｅｍｂｏｓｓ／ｓｋｉｐｒｅｄｕｎｄａｎｔ； Ｒｉｃｅ Ｐ， Ｌｏｎｇｄｅｎ Ｉ， Ｂｌｅａｓｂｙ Ａ： ＥＭＢＯＳＳ： ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． ２０００ Ｊｕｎ； １６（６）：２７６－７）；
－ ｋＣｌｕｓｔ （ＵＲＬ： ｆｔｐ：／／ｔｏｏｌｋｉｔ．ｌｍｂ．ｕｎｉ－ｍｕｅｎｃｈｅｎ．ｄｅ／ｐｕｂ／ｋＣｌｕｓｔ／； Ｈａｕｓｅｒ Ｍ， Ｍａｙｅｒ ＣＥ， Ｓｏｄｉｎｇ Ｊ． ｋＣｌｕｓｔ： ｆａｓｔ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ． ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２０１３；１４：２４８）；
－ ＵＣＬＵＳＴ （ＵＲＬ： ｄｒｉｖｅ５．ｃｏｍ／ｕｓｅａｒｃｈ／ｍａｎｕａｌ／ｕｃｌｕｓｔ＿ａｌｇｏ．ｈｔｍｌ； ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｒｉｖｅ５．ｃｏｍ／ｕｓｅａｒｃｈ／； Ｅｄｇａｒ， Ｒ． Ｃ． （２０１０）． “Ｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｒｄｅｒｓ ｏｆ ｍａｇｎｉｔｕｄｅ ｆａｓｔｅｒ ｔｈａｎ ＢＬＡＳＴ”． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２６ （１９）： ２４６０－２４６１）；及び
－ ＭＭＳｅｑｓ２ （Ｓｔｅｉｎｅｇｇｅｒ， Ｍ Ｓｏｄｉｎｇ， ＭＭｓｅｑｓ２ ｅｎａｂｌｅｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍａｓｓｉｖｅ ｄａｔａ ｓｅｔｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１７ Ｎｏｖ；３５（１１）：１０２６－１０２８．）。
これらの例示されたバイオインフォマティクスツール（ソフトウェア）の1以上を、冗長性を低減する、及び／又は冗長な配列を同定及び除去するために使用することができる。

【0124】

最も好ましくは、ＣＤ－ＨＩＴを用いて、本発明に係る方法において冗長な配列を除去する。ＣＤ－ＨＩＴは、最も広く使用されている配列クラスタリングソフトウェアであり、パブリックデータベース（Ｕｎｉｐｒｏｔなど）に日常的に適用されている。ＣＤ－ＨＩＴは、７０％以上、例えば、７５％又は８０％の同一性カットオフで使用されることが特に好ましい。

【0125】

冗長な配列の除去は、前記したように、工程（ｉｉ）の他のサブ工程の前後又はそれらの間に行うことができる。いくつかの実施形態においては、冗長な配列の除去は、以下の後に行われる。
－ シグナルペプチドを有する配列、又はシグナルペプチドを有するタンパク質をコードする配列を選択すること；
－ ２０～５００アミノ酸長を有する配列、又は２０～５００アミノ酸長を有するタンパク質をコードする配列を選択すること；
－ 少なくとも２つのシステイン残基及び／又は立体構造的に剛性な構造を与える一次及び／又は二次構造エレメントを含む配列、又は少なくとも２つのシステイン残基及び／又は立体構造的に剛性な構造を与える一次及び／又は二次構造エレメントを含むタンパク質をコードする配列を選択すること。
任意に、冗長な配列を同定し、除去する前に、アノテーションのサブ工程を行うこともできる。

【0126】

ヒトマイクロバイオータタンパク質（薬剤候補）の調製
本発明に係るヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を提供するための方法の工程（ｉｉｉ）において、薬剤候補、即ち、工程（ｉｉ）の選択プロセスにおいて得られたヒトマイクロバイオータタンパク質が調製される。

【0127】

特に、前記タンパク質は、組換え手段によって調製される（即ち、前記タンパク質は、人工的に調製される）。例えば、前記タンパク質は、化学合成によって、又は生物学的に、例えば、インビトロ（無細胞発現系など）で調製することができる、又は（配列が得られる生物以外）の宿主細胞又は別の生物によって発現させることができる。したがって、前記方法で得られるタンパク質は、特に、組換えタンパク質である。いくつかの実施形態においては、ヒトマイクロバイオータタンパク質は、化学合成によって工程（ｉｉｉ）で調製される。いくつかの実施形態においては、ヒトマイクロバイオータタンパク質は、工程（ｉｉｉ）において生物学的に、特に、インビトロ合成（無細胞発現）又は宿主細胞若しくは生物における組換え（過剰）発現によって調製される。好ましくは、タンパク質は、工程（ｉｉｉ）で生物学的に（例えば、宿主細胞又は無細胞発現系において）調製される。即ち、化学合成によってではなく調製される。生成後、タンパク質を精製してもよい。

【0128】

当業者は、アミノ酸配列又は核酸配列に基づいてタンパク質を調製するための様々な方法を知っている。例えば、前記タンパク質は、化学合成、インビトロ合成（無細胞発現）、又は（インビボ）組換え（過剰）発現によって調製することができる。

【0129】

インビトロタンパク質合成（「インビトロタンパク質発現」、「無細胞タンパク質発現」、及び「無細胞タンパク質合成」とも称される）は、細胞から抽出された生体分子翻訳機構を使用する溶液中での組換えタンパク質の生成である。インビトロタンパク質合成は、培養細胞内ではなく、細胞溶解物又は組換えタンパク質のカクテル中で生じるので、生細胞を使用せずに達成される。インビトロタンパク質合成環境は、細胞の生存能力を維持するために必要な細胞壁又はホメオスタシス条件によって制約されない。したがって、インビトロタンパク質合成は、翻訳環境への直接的なアクセス及び制御を可能にする。更に、この技術は、機能性タンパク質の迅速な発現と製造を可能にする。インビトロタンパク質合成は、タンパク質産生の最適化、タンパク質複合体の最適化、タンパク質合成の研究、非天然アミノ酸の取込み、ハイスループットスクリーニング、機能性分析、分子相互作用検出、分子構造及び局在化分析、並びに分子診断などの様々な用途に有用である。

【0130】

無細胞反応の共通成分は、組換えタンパク質又は細胞抽出物のカクテルなど、インビトロでの転写及び形質導入を達成するために必要なタンパク質を含む。更に、エネルギー源、アミノ酸の供給、発現されるタンパク質をコードする核酸、及び任意に、マグネシウムなどの補因子を添加することができる。インビトロタンパク質合成は、いくつかの種類及び種の細胞抽出物又は組換えタンパク質のカクテルを用いて達成することができる。細胞抽出物は、例えば、目的の細胞を溶解し、細胞壁、ＤＮＡゲノム、及び他の破片を遠心分離して、必要な細胞機構（リボソーム、アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼ、翻訳開始及び伸長因子、ヌクレアーゼなど）が残存するようにして得ることができる。例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＣＥ）、ウサギ網赤血球（ＲＲＬ）、コムギ胚芽（ＷＧＥ）、昆虫細胞（ＩＣＥ、例えば、ＳＦ９又はＳＦ２１）、及びヒト細胞から調製される細胞抽出物を挙げることができ、これらはいずれも市販されている。市販のインビトロタンパク質合成系の例としては、限定するものではないが、ＲＴＳ（５ ＰＲＩＭＥ）；Ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙ^ＴＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；Ｓ３０ Ｔ７ ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ）；Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｈｕｍａｎ ＩＶＴ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；ＷＥＰＲＯ（登録商標）（ＣｅｌｌＦｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）；ＴＮＴ（登録商標） ｃｏｕｐｌｅｄ （Ｐｒｏｍｅｇａ）；ＲＴＳ ＣＥＣＦ （５ ＰＲＩＭＥ）；ＴＮＴ（登録商標） Ｃｏｕｐｌｅｄ （Ｐｒｏｍｅｇａ）；Ｒｅｔｉｃ ｌｙｓａｔｅ ＩＶＴ^ＴＭ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ＴＮＴ（登録商標） Ｔ７ （Ｐｒｏｍｅｇａ）；ＥａｓｙＸｐｒｅｓｓ Ｉｎｓｅｃｔ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ／ＲｉＮ Ａ）；ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標） （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）；及びＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（登録商標） （ＢｉｏＣｏｍｂｅｒ））が挙げられる。いくつかの実施形態においては、ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いることができ、これは、インビトロでの転写及び形質導入を達成するために必要な組換えタンパク質のカクテルである。他の実施形態においては、細菌抽出物、特にＥＣＥ（Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物）は、（細菌タンパク質の発現に理想的な）細菌機構を提供し、通常、高収量を達成するので、使用することができる。細菌抽出物におけるインビトロでのタンパク質合成のより詳細な説明は、Ｈａｎｉ Ｓ． Ｚａｈｅｒ， Ｒａｃｈｅｌ Ｇｒｅｅｎ： Ｃｈａｐｔｅｒ Ｏｎｅ － Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｅｘｔｒａｃｔｓ， Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）： Ｊｏｎ Ｌｏｒｓｃｈ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｖｏｌ． ５３９， ２０１４， ｐ． ３－１５， ＩＳＳＮ ００７６－６８７９， ＩＳＢＮ ９７８０１２４２０１２００に見ることができる。

【0131】

インビトロでのタンパク質合成で使用される核酸は、好ましくはＲＮＡ又はＤＮＡである。例えば、インビボ又はインビトロで合成された単離ＲＮＡ（特に、ｍＲＮＡ）は、翻訳のためのテンプレートとして使用することができる。ＤＮＡ、特に、遺伝子／プラスミドベクター（ｃＤＮＡ）にクローン化されたＯＲＦなどの環状又は線状ＤＮＡ、又はＰＣＲで生成されたテンプレートなどの線状ＤＮＡテンプレートを使用することも好ましい。核酸は、コドン最適化することができる。いくつかの実施形態においては、ＤＮＡの直接合成が、好ましくはコドン最適化と共に用いられる。

【0132】

核酸、例えば、合成ＤＮＡ分子は、ベクターにサブクローニングすることができる。ベクターは、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質などの発現産物の産生に使用され得る発現ベクターであることができる。例えば、発現ベクターは、プロモーター配列（例えば、Ｔ７プロモーター）などの、ベクターの配列領域の転写に必要な配列を含むことができる。したがって、ベクターは、（Ｔ７）プロモーターを含むことができる。更に、必要に応じて、ベクターは、特定のタグを含むことができる。

【0133】

インビトロ／無細胞タンパク質合成は、好ましくは、最小２０アミノ酸長、好ましくは最小３０アミノ酸長、より好ましくは最小４０アミノ酸長、更により好ましくは最小４５アミノ酸長、更により好ましくは最小５０アミノ酸長を有するタンパク質に適用される。例えば、５０～３５０アミノ酸長又は５０～５００アミノ酸長（好ましくは、シグナルペプチドを含まない）を有するタンパク質は、前記したようにインビトロ／無細胞タンパク質合成によって合成される。

【0134】

或いは、タンパク質は、当技術分野で知られ、例えば、Ｆｉｅｌｄｓ ＧＢ． Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ２００２；Ｃｈａｐｔｅｒ １８：Ｕｎｉｔ－１８．１． ｄｏｉ：１０．１００２／０４７１１４０８６４．ｐｓ１８０１ｓ２６に記載される化学合成によって調製することができる。例えば、当技術分野で知られている固相技術（固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ））を、例えば、Ｆｍｏｃベースの化学を適用して使用することができる。ＳＰＰＳは、不溶性の多孔質支持体上でのアミノ酸誘導体の連続反応によって、ペプチド鎖の迅速な組み立てを可能にする。化学タンパク質及びペプチド合成の様々な商業的サプライヤーが利用可能であり、例えば、Ｐｅｐｓｃａｎ （Ｌｅｌｙｓｔａｄ， Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ （Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ， ＵＳＡ）、ＬｉｆｅＴｅｉｎ （Ｓｏｍｅｒｓｅｔ， ＮＪ， ＵＳＡ）、ＪＰＴ （Ｂｅｒｌｉｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）などが挙げられる。

【0135】

化学合成、例えば、ＳＰＰＳは、最大１００アミノ酸、好ましくは最大９０アミノ酸長、より好ましくは最大８０アミノ酸長、更により好ましくは最大７０又は６０アミノ酸長、更により好ましくは最大５０アミノ酸長を有するタンパク質に適用することができる。例えば、１５～５０アミノ酸長又は２０～５０アミノ酸長（好ましくは、シグナルペプチドを含まない）を有するタンパク質は、ＳＰＰＳなどの化学合成によって合成される。

【0136】

したがって、より長いタンパク質、例えば、前記した長さ（例えば、５０～３５０アミノ酸）を有するタンパク質は、インビトロ／無細胞タンパク質合成によって合成することができ、より短いタンパク質、例えば、前記した長さ（例えば、２０～５０アミノ酸）を有するタンパク質は、例えば、ＳＰＰＳなどの化学合成によって合成することができる。

【0137】

タンパク質はまた、インビボ組換え（過剰）発現によって調製することができる。これは通常、組換え核酸、特に組換え遺伝子を（大量に）発現するように、生物における遺伝子発現を操作することによって達成される。したがって、この方法は、生細胞及び細胞ベース系を伴う。このプロセスには、特に、組換えＤＮＡのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転写と、ｍＲＮＡのポリペプチド鎖への翻訳（ポリペプチド鎖は、機能性タンパク質に折り畳まれ得る）とを含む。次いで、タンパク質を、特定の細胞内又は細胞外の位置を標的にすることできる。

【0138】

本明細書においては、用語「過剰発現」は、（過度に）高レベルの遺伝子発現を意味し、これは、顕著な遺伝子に関連づけられた表現型を生じる可能性がある。組換え細胞ベースの発現系においては、外来核酸が発現のために細胞に導入される。外来核酸を細胞に導入する多くの方法が、当技術分野で知られている。核酸源及び送達メカニズムの例としては、ウイルス（バキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスなど）、プラスミド、人工染色体、及びバクテリオファージ（ラムダなど）が挙げられる。更に、当業者は、多くの異なる宿主系について知っている。例えば、細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓなど）、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなど）、糸状菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、及びＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ Ｃ１など）、昆虫細胞（ＳＦ９、ＳＦ２１、及びＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ株など）、及び哺乳動物細胞株（ＨｅＬａ、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、Ｃｒｕｃｅｌｌ’ Ｐｅｒ．Ｃ６、Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ、及びＣＥＶＥＣ）が挙げられる。

【0139】

細菌宿主細胞は、（細菌タンパク質の発現に理想的な）細菌機構を提供し、通常、高収量を達成するため、最も好ましい。細菌宿主の好ましい例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓが挙げられる。Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ及びＥ．ｃｏｌｉが最も好ましい。Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓは、代謝的に広用途の生物であり、ハイスループットスクリーニングと複雑なタンパク質の迅速な開発を可能にする。Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓは、高力価の活性の可溶性タンパク質を迅速且つ成功裏に生成する能力で最もよく知られている。Ｅ．ｃｏｌｉにおける過剰発現の技術は当技術分野でよく知られており、遺伝子のコピー数を増やす、又はプロモーター領域の結合強度を高めて転写を支援することによって機能する。ＤＮＡは、プラスミド発現ベクターを使用して導入することが好ましい。

【0140】

宿主細胞、特に、細菌細胞は、好ましくは、（組換え技術によって）発現させたタンパク質におけるジスルフィド結合形成を支援するようにエンジニアードされることができる。この目的のために、例えば、還元酵素を排除することができ、及び／又はペリプラズムのジスルフィド結合イソメラーゼ、ＤｓｂＣを増加させる、例えば、過剰発現させることができる。ＤｓｂＣは、複数のジスルフィド結合を有するタンパク質に作用して、誤って酸化された結合（ｍｉｓ－ｏｘｉｄｉｚｅｄ ｂｏｎｄｓ）を修正し、適切な折り畳みを促進する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）株（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）は、細胞質でのジスルフィド結合形成を特異的に支援する。この株では、グルタレドキシンレダクターゼとチオレドキシンレダクターゼの遺伝子（Δｇｏｒ ΔｔｒｘＢ）が欠失されて、ジスルフィド結合形成を可能にする。更に、ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）株は、シグナル配列を欠いた、ペリプラズムのジスルフィド結合イソメラーゼ、ＤｓｂＣのバージョンを発現し、それを細胞質に保持する。したがって、本発明に係るヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質を調製するための方法のいくつかの実施形態において、核酸分子は、タンパク質を調製するためのテンプレートとして使用される。この文脈においては、本発明に係るヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質を調製するための方法（特に、核酸分子がタンパク質を調製するためのテンプレートとして使用される場合）は、以下の工程：
－ 核酸配列の開始コドン及び終止コドンを特定すること、
を含むことができる。

【0141】

開始コドンは、リボソームによって翻訳されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の転写産物の最初のコドンである。開始コドンは、常に、真核生物ではメチオニンをコードし、原核生物では修飾Ｍｅｔ（ｆＭｅｔ）をコードする。最も一般的な開始コドンは、ＡＵＧ（又は対応するＤＮＡ配列におけるＡＴＧ）である。開始コドンの前には、しばしば、５’の非翻訳領域（５’ＵＴＲ）が存在する。原核生物では、５’ＵＴＲは、通常、リボソーム結合部位を含む。代替開始コドンは、標準的なＡＵＧコドンと異なり、原核生物（細菌）と真核生物との両方に見られる。代替開始コドンは、タンパク質の最初にＭｅｔとして翻訳される（コドンが、異なるアミノ酸をコードしている場合でも）。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、８３％がＡＵＧ（ＡＴＧ）、１４％がＧＵＧ（ＧＴＧ）、３％がＵＵＧ（ＴＴＧ）、及びその他の１つ又は２つの他のもの（例えば、ＡＵＵ（ＡＴＴ）及び場合によってはＣＵＧ（ＣＴＧ））を使用する。

【0142】

終止コドン（又は終結コドン）は、タンパク質への翻訳の終結をシグナリングするメッセンジャーＲＮＡ内のヌクレオチドトリプレットである。終止コドンは、リボソームサブユニットを分離させる放出因子に結合することによって、このプロセスの終結をシグナリングし、アミノ酸鎖が放出される。特に、終止コドンは、核酸配列ＵＡＡ（ＴＡＡ）、ＵＡＧ（ＴＡＧ）、又はＵＧＡ（ＴＧＡ）からなる。

【0143】

好ましくは、開始コドンの同定は、インシリコで行われる。バイオインフォマティクスプログラムは、通常、タンパク質コード遺伝子の検索時に、交番的な開始コドンと終止コドンとを可能にする。

【0144】

工程（ｉｉｉ）で調製されたヒトマイクロバイオータタンパク質は、工程（ｉｉ）で同定されたシグナルペプチドなしで合成されることも好ましい。したがって、特に、前記した工程（ｉｉ）において、まだ行われていない場合であっても、工程（ｉｉｉ）は、タンパク質又は核酸配列からシグナルペプチドを除去する工程を含むことができる（例えば、前記したように）。これは、更なる分析で成熟タンパク質のみが用いられることを確実にするためである。更に、特定の分析では、アミノ酸頻度の計算が必要であり、これは、通常、シグナルペプチドなしで行われ、正しい値に達する。

【0145】

シグナルペプチドの除去は、例えば、インビボ又はインシリコで行うことができる。いくつかの実施形態においては、シグナルペプチドは、インビボで、例えば、細胞ベースの組換え発現系で、送達／移行後の細胞の機構のために除去される。

【0146】

特にタンパク質の調製前に、シグナルペプチドをインシリコで除去することも好ましい。これにより、特に、インビトロタンパク質合成の場合に、タンパク質の正しい合成と折り畳みが確実になる。一般に、シグナルペプチドのインシリコでの除去／切断は、特に、前記したバイオインフォマティクスツールを使用することにより、前記したように行うことができる。

【0147】

いくつかの実施形態においては、本発明に係るヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質を調製するための方法は、以下の工程：
－ ヒトマイクロバイオータメタセクレトームの調製タンパク質をチェックすること、
を更に含むことができる。

【0148】

例えば、調製されたタンパク質が正しく折り畳まれているかどうか、及び／又は調製されたタンパク質が正しいサイズ及び／又はコンフォメーションを有するかどうかをチェックすることができる。

【0149】

調製されたタンパク質をチェックするための好ましい方法は、ウエスタンブロットである。ウエスタンブロットは、タンパク質のサイズに関する情報を提供し、例えば、ウエスタンブロットで使用される抗体がタンパク質に結合できるかどうかに関する情報を提供する（これにより、少なくともエピトープが、正しいコンフォメーションを有することが示される）。タンパク質が適切に折り畳まれているかどうかを確認する方法の他の例としては、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）、Ｘ線結晶学、蛍光分光法、円二色性、タンパク質の振動円形二色性、二重分極干渉法、及び原子力顕微鏡（ＡＦＭ）が挙げられる。タンパク質分解アッセイは、タンパク質の安定性を定量化するために使用できる。

【0150】

特に、調製されたタンパク質に、ジスルフィド結合を確認することができる。この目的のために、様々な方法が当技術分野で知られており、例えば、Ｘ線結晶学（例えば、Ｊｏｎｅｓ ＴＡ， Ｋｊｅｌｄｇａａｒｄ Ｍ． Ｅｌｅｃｔｒｏｎ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｍａｐ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １９９７；２７７：１７３－２０８． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｓ００７６－６８７９（９７）７７０１２－５に記載）；エドマンシークエンシング（例えば、Ｈａｎｉｕ Ｍ ｅｔ ａｌ． Ｄｉｒｅｃｔ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄｓ ｂｙ Ｅｄｍａｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ． Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． １９９４ Ｊａｎ；４３（１）：８１－６． ｄｏｉ： １０．１１１１／ｊ．１３９９－３０１１．１９９４．ｔｂ００３７８．ｘに記載）；及びＮＭＲ（例えば、Ｋｌａｕｓ Ｗ ｅｔ ａｌ． Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ ｂｏｎｄｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｌｏｃａｌ ａｎｄ ｇｌｏｂａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｄａｔａ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｆｌａｖｏｒｉｄｉｎ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １９９３ Ａｕｇ ５；２３２（３）：８９７－９０６． ｄｏｉ： １０．１００６／ｊｍｂｉ．１９９３．１４３８に記載)が、ジスルフィド結合を特定するために、当技術分野でよく知られている。更に、質量分析（ＭＳ）は、特に少量のタンパク質のジスルフィド結合をマッピングすることで知られている。

【0151】

調製されたタンパク質のジスルフィド結合を同定するための好ましい方法は、Ｃｕｉら、２０１８（Ｃｕｉ Ｃ， Ｌｉｕ Ｔ， Ｃｈｅｎ Ｔ， Ｌｕ Ｊ， Ｃａｓａｒｅｎ Ｉ， Ｌｉｍａ ＤＢ， Ｃａｒｖａｌｈｏ ＰＣ， Ｂｅｕｖｅ Ａ， Ｌｉ Ｈ． Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄｓ ｗｉｔｈ ｐｅｐｓｉｎ／ｔｒｙｐｓｉｎ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ， Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＨＣＤ ａｎｄ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍａｃｈｉｎｅ． Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． ２０１９ Ａｐｒ ３０；１９８：７８－８６． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｊｐｒｏｔ．２０１８．１２．０１０． Ｅｐｕｂ ２０１８ Ｄｅｃ １４）に記載されており、この文献全体を、参照により本明細書に援用する。簡潔に説明すれば、ペプシン／トリプシン消化の後に、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）／質量分析（ＭＳ）分析を行うことができる。例えば、ｐＨ１．３での４時間のペプシン消化と、それに続く、ｐＨ６．５での一晩のトリプシン消化を、サンプル調製に使用して、ＳＳスクランブリングを最小限に抑えながら非還元型タンパク質からのＳＳ含有ペプチドの放出を最大限にすることができる。ＨＰＬＣ／ＭＳ分析の場合、ＳＳ含有ペプチドは、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計で高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）を使用して効率的に断片化でき、その後の同定のためにＳＳを保存する。

【0152】

一般に、調製されたタンパク質のジスルフィド結合を決定するために、タンパク質は、好ましくは生物学的に調製される（例えば、宿主細胞又は無細胞発現系において）。いくつかの実施形態においては、タンパク質は、特に、（ｉ）ポリペプチド鎖の（化学的）合成、及び（ｉｉ）ジスルフィド結合の形成を得るための酸化によって、化学的に調製されないことがある。

【0153】

いくつかの実施形態においては、得られたタンパク質を、定量化することができる。例えば、得られたタンパク質は、６ＨＩＳ又はＨｉｂｉｔなどの適切なタグを含むことができ、タンパク質のレベルは、例えば、ＨＩＳｔａｇ－ｂｉｏｔｙｎプローブが競合する競合的定量アッセイによるａｌｐｈａｌｉｓａ又はＨＴＲＦなどの定量的方法を使用することによって決定することができる。Ｈｉｂｉｔを使用する場合、タンパク質のレベルは、Ｈｉｂｉｔルシフェラーゼアッセイを使用して決定することができる。

【0154】

特に宿主との相互作用に関する生物学的活性の決定
好ましくは、本発明に係るヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を提供するための方法は、特にヒト宿主との相互作用及び／又は細菌－細菌間相互作用などの関心のある任意の（他の）相互作用に関する、ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補の少なくとも１つの生物学的活性が決定される追加工程（ｉｖ）を含む。かかる工程（ｉｖ）は、前記タンパク質を調製する工程（ｉｉｉ）の直後又は別工程を介して行うことができる。

【0155】

本明細書においては、用語「相互作用」は、疎水性効果を含む静電力によって引き起こされる生化学的事象の結果として、２以上の（タンパク質）分子間に確立される高特異性の物理的接触を意味する。

【0156】

一般に、相互作用は、当技術分野で知られる様々な方法、例えば、インシリコ、インビトロ、インビボなどによって試験することができる。

【0157】

いくつかの実施形態においては、生物学的活性、例えば、相互作用は、インシリコで試験することができる。相互作用試験に適した多くのインシリコ法が、当技術分野で知られている。例えば、多くの構造タンパク質モチーフは当技術分野で知られており、適切なソフトウェア／バイオインフォマティクスツール、例えば、アノテーション用の前記したものなどによって予測することができる。

【0158】

インシリコ法の好ましい例としては、以下が挙げられる。
－ 系統発生プロファイリング（多数の種に亘って同様の存在又は不存在パターンを有するタンパク質ファミリーのペアを検出する；この方法は、タンパク質レベル又はタンパク質ドメインのレベルで適用できる）；
－ 類似の系統樹に基づく共進化タンパク質対の予測（タンパク質対の系統樹を使用して、目的のタンパク質の相同体を検索することによって、相互作用が存在するかどうかを判定する）；
－ ロゼッタストーン法（例えば、ＳＴＲＩＮＧによって使用される；Ｄａｔｅ ＳＶ． Ｔｈｅ Ｒｏｓｅｔｔａ ｓｔｏｎｅ ｍｅｔｈｏｄ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２００８；４５３：１６９－８０）；
－ 分類法（データを使用してプログラム（分類子）を訓練し、相互作用するタンパク質／ドメイン対の肯定的な例を、相互作用しない対の否定的な例で区別する）;
－ 同族体構造からの相互作用の干渉（既知のタンパク質複合体構造を使用して、クエリタンパク質配列間の相互作用を予測及び構造的にモデル化する）；
－ アソシエーション法（相互作用する対と相互作用しない対とを区別するのに役立つ特徴的な配列又はモチーフを探索する、即ち、偶然よりも高頻繁で一緒に見つかる配列特徴を探索する）；
－ 構造パターンの同定（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）から既知のタンパク質－タンパク質界面のライブラリーを構築し、前記界面は、関与する原子のファンデルワールス半径より僅かに大きい閾値を下回るポリペプチド断片の対として定義される）；
－ ベイジアンネットワークモデリング（実験結果と過去の計算予測の両方を含む様々なソースからのデータを統合し、これらの特徴を用いて、特定の潜在的なタンパク質相互作用が真のポジティブな結果である可能性を評価する）；及び
－ ドメイン対除外分析。

【0159】

ヒトマイクロバイオータメタセクレトームの同定／調製されたタンパク質の、ヒト宿主タンパク質との相互作用を予測/試験するためのバイオインフォマティクスツール／ソフトウェアの好ましい例としては、以下が挙げられる。
－ ＳＴＲＩＮＧ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐｓ：／／ｓｔｒｉｎｇ－ｄｂ．ｏｒｇ／； Ｓｚｋｌａｒｃｚｙｋ Ｄ， Ｍｏｒｒｉｓ ＪＨ， Ｃｏｏｋ Ｈ， Ｋｕｈｎ Ｍ， Ｗｙｄｅｒ Ｓ， Ｓｉｍｏｎｏｖｉｃ Ｍ， Ｓａｎｔｏｓ Ａ， Ｄｏｎｃｈｅｖａ ＮＴ， Ｒｏｔｈ Ａ， Ｂｏｒｋ Ｐ， Ｊｅｎｓｅｎ ＬＪ， ｖｏｎ Ｍｅｒｉｎｇ Ｃ． Ｔｈｅ ＳＴＲＩＮＧ ｄａｔａｂａｓｅ ｉｎ ２０１７： ｑｕａｌｉｔｙ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｎｅｔｗｏｒｋｓ， ｍａｄｅ ｂｒｏａｄｌｙ ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０１７ Ｊａｎ ４５：Ｄ３６２－６８； ｖｏｎ Ｍｅｒｉｎｇ Ｃ， Ｈｕｙｎｅｎ Ｍ， Ｊａｅｇｇｉ Ｄ， Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｓ， Ｂｏｒｋ Ｐ， Ｓｎｅｌ Ｂ． ＳＴＲＩＮＧ： ａ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００３ Ｊａｎ； ３１：２５８－６１）；
－ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｉｎ Ｔｗｏ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｗｉｓｓｒｅｇｕｌｏｎ．ｕｎｉｂａｓ．ｃｈ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ＴＣＳ．ｐｌ； Ｌｕｋａｓ Ｂｕｒｇｅｒ ａｎｄ Ｅｒｉｋ ｖａｎ Ｎｉｍｗｅｇｅｎ （２００８）： Ａｃｃｕｒａｔｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ａ Ｂａｙｅｓｉａｎ ｍｅｔｈｏｄ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４：１６５）；
－ Ｍｅｎｔｈａ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｍｅｎｔｈａ．ｕｎｉｒｏｍａ２．ｉｔ／； Ａｌｂｅｒｔｏ Ｃａｌｄｅｒｏｎｅ， Ｌｕｉｓａ Ｃａｓｔａｇｎｏｌｉ ＆ Ｇｉａｎｎｉ Ｃｅｓａｒｅｎｉ （２０１３）： ｍｅｎｔｈａ： ａ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｂｒｏｗｓｉｎｇ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｎｅｔｗｏｒｋｓ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０， ６９０）；
－ ＧＰＳ－Ｐｒｏｔ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｇｐｓｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ； Ｆａｈｅｙ ＭＥ， Ｂｅｎｎｅｔｔ ＭＪ， Ｍａｈｏｎ Ｃ， Ｊａｇｅｒ Ｓ， Ｐａｃｈｅ Ｌ， Ｋｕｍａｒ Ｄ， Ｓｈａｐｉｒｏ Ａ， Ｒａｏ Ｋ， Ｃｈａｎｄａ ＳＫ， Ｃｒａｉｋ ＣＳ， Ｆｒａｎｋｅｌ ＡＤ， Ｋｒｏｇａｎ ＮＪ． ＧＰＳ－Ｐｒｏｔ： ａ ｗｅｂ－ｂａｓｅｄ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｈｏｓｔ－ｐａｔｈｏｇｅｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｄａｔａ． ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２０１１ Ｊｕｌ ２２；１２：２９８）；
－ ＣＯＭＰＡＳＳ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｄａｔａ．ｓｗｍｅｄ．ｅｄｕ／ｃｏｍｐａｓｓ／ｃｏｍｐａｓｓ．ｐｈｐ； Ｒ．Ｉ． Ｓａｄｒｅｙｅｖ， Ｍ． Ｔａｎｇ， Ｂ． Ｋｉｍ ａｎｄ Ｎ．Ｖ． Ｇｒｉｓｈｉｎ （２００９） ＣＯＭＰＡＳＳ ｓｅｒｖｅｒ ｆｏｒ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ： ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ａｃｃｕｒａｃｙ， ｓｐｅｅｄ， ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｐ３６０）；
－ ＰＳＩＣＱＵＩＣ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｗｅｂｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｐｓｉｃｑｕｉｃ／ｖｉｅｗ／ｈｏｍｅ．ｘｈｔｍｌ； Ａｒａｎｄａ Ｂ， Ｂｌａｎｋｅｎｂｕｒｇ Ｈ， Ｋｅｒｒｉｅｎ Ｓ， Ｂｒｉｎｋｍａｎ ＦＳ， Ｃｅｏｌ Ａ， Ｃｈａｕｔａｒｄ Ｅ， Ｄａｎａ ＪＭ， Ｄｅ Ｌａｓ Ｒｉｖａｓ Ｊ， Ｄｕｍｏｕｓｓｅａｕ Ｍ， Ｇａｌｅｏｔａ Ｅ， Ｇａｕｌｔｏｎ Ａ， Ｇｏｌｌ Ｊ， Ｈａｎｃｏｃｋ ＲＥ， Ｉｓｓｅｒｌｉｎ Ｒ， Ｊｉｍｅｎｅｚ ＲＣ， Ｋｅｒｓｓｅｍａｋｅｒｓ Ｊ， Ｋｈａｄａｋｅ Ｊ， Ｌｙｎｎ ＤＪ， Ｍｉｃｈａｕｔ Ｍ， Ｏ’Ｋｅｌｌｙ Ｇ， Ｏｎｏ Ｋ， Ｏｒｃｈａｒｄ Ｓ， Ｐｒｉｅｔｏ Ｃ， Ｒａｚｉｃｋ Ｓ， Ｒｉｇｉｎａ Ｏ， Ｓａｌｗｉｎｓｋｉ Ｌ， Ｓｉｍｏｎｏｖｉｃ Ｍ， Ｖｅｌａｎｋａｒ Ｓ， Ｗｉｎｔｅｒ Ａ， Ｗｕ Ｇ， Ｂａｄｅｒ ＧＤ， Ｃｅｓａｒｅｎｉ Ｇ， Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ ＩＭ， Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ Ｄ， Ｋｌｅｙｗｅｇｔ ＧＪ， Ｏｖｅｒｉｎｇｔｏｎ Ｊ， Ｒｉｃａｒｄ－Ｂｌｕｍ Ｓ， Ｔｙｅｒｓ Ｍ， Ａｌｂｒｅｃｈｔ Ｍ， Ｈｅｒｍｊａｋｏｂ Ｈ． ＰＳＩＣＱＵＩＣ ａｎｄ ＰＳＩＳＣＯＲＥ： ａｃｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｓｃｏｒｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０１１ Ｊｕｎ ２９；８（７）：５２８－９）；
－ Ｓｔｒｕｃｔ２Ｎｅｔ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｃｂ．ｃｓａｉｌ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｂ／ｓｔｒｕｃｔ２ｎｅｔ／ｗｅｂｓｅｒｖｅｒ／； Ｒ． Ｈｏｓｕｒ， Ｊ． Ｐｅｎｇ， Ａ． Ｖｉｎａｙａｇａｍ， Ｕ． Ｓｔｅｌｚｌ， Ｊ． Ｘｕ， Ｎ． Ｐｅｒｒｉｍｏｎ， Ｊ． Ｂｅｉｎｋｏｗｓｋａ， ａｎｄ Ｂ． Ｂｅｒｇｅｒ． ２０１２． “Ｃｏｅｖ２Ｎｅｔ： ａ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｆｏｒ ｂｏｏｓｔｉｎｇ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｄａｔａｓｅｔｓ．” Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｄｏｉ：１０．１１８６／ｇｂ－２０１２－１３－８－ｒ７６； Ｒ． Ｓｉｎｇｈ， Ｄ． Ｐａｒｋ， Ｊ． Ｘｕ， Ｒ． Ｈｏｓｕｒ， ａｎｄ Ｂ． Ｂｅｒｇｅｒ． ２０１０． “Ｓｔｒｕｃｔ２Ｎｅｔ： ａ Ｗｅｂ－Ｓｅｒｖｉｃｅ ｔｏ Ｐｒｅｄｉｃｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈ．” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ４８１）；
－ ＡＰＩＤ （Ａｇｉｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅｓ Ｄａｔａｓｅｒｖｅｒ； ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｃｉｃｂｌａｄｅ．ｄｅｐ．ｕｓａｌ．ｅｓ：８０８０／ＡＰＩＤ／ｉｎｉｔ．ａｃｔｉｏｎ； Ａｌｏｎｓｏ－Ｌｏｐｅｚ Ｄ， Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ ＭＡ， Ｌｏｐｅｓ ＫＰ， Ｐｒｉｅｔｏ Ｃ， Ｓａｎｔａｍａｒｉａ Ｒ， Ｄｅ Ｌａｓ Ｒｉｖａｓ Ｊ． ＡＰＩＤ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅｓ： ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｏｍｅ－ｂａｓｅｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅｓ ｗｉｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｑｕａｌｉｔｙ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｔｗｏｒｋｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１６； ｄｏｉ： １０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｗ３６３； Ｐｒｉｅｔｏ Ｃ， Ｄｅ Ｌａｓ Ｒｉｖａｓ Ｊ． ＡＰＩＤ： Ａｇｉｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ＤａｔａＡｎａｌｙｚｅｒ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００６， ３４（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ）：Ｗ２９８－３０２）；
－ Ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ３Ｄ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐｓ：／／ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ３ｄ．ｉｒｂｂａｒｃｅｌｏｎａ．ｏｒｇ／； Ｍｏｓｃａ Ｒ， Ｃｅｏｌ Ａ， Ａｌｏｙ Ｐ， Ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ３Ｄ： ａｄｄｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｄｅｔａｉｌｓ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｎｅｔｗｏｒｋｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ （２０１３） １０（１）：４７－５３， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２２８９）；及び
－ ＩｎｔｅｒＰｒｅＴＳ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｕｓｓｅｌｌｌａｂ．ｏｒｇ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｔｏｏｌｓ／ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｓ．ｐｌ； Ａｌｏｙ Ｐ， Ｒｕｓｓｅｌｌ ＲＢ． ＩｎｔｅｒＰｒｅＴＳ： ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２００３ Ｊａｎ；１９（１）：１６１－２）。

【0160】

いくつかの実施形態においては、ヒトマイクロバイオータタンパク質の構造を（例えば、インシリコで）決定し、１以上のヒト宿主分子、特に、１以上のヒト宿主タンパク質の（既知の）構造と比較することができる。これにより、例えば、ヒト宿主分子のマイクロバイオーム模倣物を同定することができる。ヒト宿主分子は、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、神経ペプチド、ペプチドホルモンからなる群から選択することができる。いくつかの実施形態においては、ヒト宿主分子からの特定の機能ドメインは、前記３つの基準の全てを満たすヒトマイクロバイオータタンパク質の配列内で検索することができる。この目的のために、例えば、前記したように、ＳＭＡＲＴを用いることができる。

【0161】

好ましくは、ヒトマイクロバイオータメタセクレトームの同定／調製されたタンパク質と、ヒト宿主分子、特にヒト宿主タンパク質との相互作用を、インビトロ又はインビボで試験する。したがって、ヒトマイクロバイオータメタセクレトームの同定／調製されたタンパク質の生物学的活性（例えば、ヒト系、ヒト細胞、又はヒト分子との相互作用に基づく）を、インビトロ又はインビボで決定することができる。これに関連して、スクリーニング法を用いて、生物学的メカニズム（代謝、免疫、細胞完全性）における得られたタンパク質（例えば、タンパク質ライブラリー）の関与を調べることができる。

【0162】

例えば、得られたタンパク質（例えば、タンパク質ライブラリー）は、Ｇ－タンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）専用の試験、例えば、細胞へのｃＡＭＰ放出又はＩＰ３生成などの一般的なアッセイによって（例えば、競合アルファスクリーン又はＨｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｔｉｍｅ Ｒｅｓｏｌｖｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ＨＴＲＦ）法を使用することによって）スクリーニングすることができる。一般に、ＧＰＣＲ_ｓｉ経路を研究するために、様々なリードアウトを用いることができる。簡単に説明すれば、ＧＰＣＲ_ｓｉへのリガンドの結合は、アデニル酸シクラーゼの活性化とｃＡＭＰの生成をもたらす。ｃＡＭＰは、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）を含むいくつかのプロテインキナーゼを活性化する。ＰＫＡの活性化は、リン酸化カスケードを開始し、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）のリン酸化と、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）への固定をもたらす。次いで、ＣＲＥＢのＣＲＥへの固定は、標的遺伝子の制御をもたらす。この経路のリードアウトとして、例えば、ｃＡＭＰを用いることができる。ｃＡＭＰを定量化するためのキットが、いくつか市販されている。例えば、ＨＴＲＦ（ｃＡＭＰ－ＧＳ－Ｈｉｒａｎｇｅキットなど、Ｃｉｓｂｉｏ）、ＬＡＮＣＥ（ＬＡＮＣＥ Ｕｌｔｒａ ｃＡＭＰアッセイ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）又はＧｌｏアッセイ（ｃＡＭＰ－Ｇｌｏ^ＴＭ Ｍａｘアッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いることができる。いくつかの実施形態においては、ＣＲＥの活性化は、リードアウトとして用いることができる。その理由は、ＧＰＣＲ_ｓｉ経路の中心的なリードアウトであるからである。

【0163】

得られたタンパク質の生物学的活性の有用なリードアウトの別の例は、ヒト細胞からのカルシウム放出の誘導であることができる。

【0164】

いくつかの実施形態においては、得られたタンパク質の免疫に対する効果は、例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）などのヒト免疫細胞、又はヒト免疫細胞の選択されたサブセット（例えば、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、Ｔ細胞（例えば、サブタイプ特異的））を用いることによって試験することができる。この文脈において、例えば、得られたタンパク質に曝露されたヒト細胞からのサイトカイン放出を、Ｅｌｉｓａ、Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ、又はＨＴＲＦなどの方法によって決定することができる。

【0165】

いくつかの実施形態においては、生物学的活性は、生存能力及び経上皮／内皮抵抗（ＴＥＥＲ）を試験することによって、（ヒト）上皮細胞の損傷についてチェックすることによって試験することができる；ｑＰＣＲを使用する、又はプロモーターアッセイでスクリーニングすることによって、特定の標的遺伝子の発現についてチェックすることによって試験することができる；又は、例えば、ａｌｐｈａｌｉｓａ／ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ又はＨＴＲＦ技術に基づく市販のアッセイでＰＰＩアッセイを使用することによって、チェックポイント分子の潜在的なリガンド／モジュレーターをチェックすることによって試験することができる。

【0166】

（生物学的活性を試験すること；例えば、生物学的活性の試験後に）追加的に又は代替的に、ヒト系との相互作用は、タンパク質－タンパク質間相互作用（ＰＰＩ）、特に、（ｉ）ヒトマイクロバイオータメタセクレトームの同定された／得られたタンパク質及び（ｉｉ）ヒトタンパク質のタンパク質－タンパク質間相互作用（ＰＰＩ）を調べることによって試験することができる。例えば、タンパク質－タンパク質間相互作用を試験するための方法は、アフィニティ精製／質量分析、共免疫沈降、二分子蛍光補完、アフィニティ電気泳動、ラベルトランスファー、ファージディスプレイ、タンデムアフィニティ精製、光反応性アミノ酸類似体（インビボ）、ＳＰＩＮＥ、ノックダウンと組み合わせた定量的免疫沈降（ＱＵＩＣＫ）、バイオレイヤー干渉法、二重分極干渉法（ＤＰＩ）、静的光散乱（ＳＬＳ）、動的光散乱（ＤＬＳ）、表面プラズモン共鳴、蛍光分極／異方性、蛍光相関分光法、蛍光相互相関分光法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｒｏｓｓ－ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）（ＦＣＣＳ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、ＮＭＲ、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）、回転セルベースリガンド結合アッセイ（Ｒｏｔａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）、単色反射率測定（ＳＣＯＲＥ）、タンパク質断片補完アッセイ（ＰＣＡ）、マイクロアレイ、特に、ペプチドアレイ及びタンパク質アレイ、ファーウェスタンブロット分析、ペプチドファージディスプレイ、酵母表面ディスプレイ、酵母ツーハイブリッド及び細菌ツーハイブリッドスクリーンなどのディスプレイ法、並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択することができる。ペプチドマイクロアレイ、タンパク質アレイ、ペプチドファージディスプレイ、酵母表面ディスプレイ、酵母ツーハイブリッド及び細菌ツーハイブリッドスクリーンは、ハイスループットアプローチに特に好適である。

【0167】

例えば、前記したインシリコ技術を用いて、ヒトミクロバイオータメタセクレトームの同定／調製されたタンパク質と、ヒト宿主分子、特に、ヒト宿主タンパク質との相互作用を予測することができ、その後、この相互作用を（例えば、前記したように）実験的に試験することができる。例えば、生化学的又は生物学的実験、例えば、インビトロ又はインビボで試験することができる。

【0168】

好ましくは、本発明に係るヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を提供するための方法において、同定されたタンパク質は、ヒト細胞からの（目的の）物質、特に（免疫調節性）化合物の分泌を調節することができる。ヒト細胞から分泌される（免疫調節性）化合物は、当技術分野で知られており、例えば、サイトカイン（インターロイキンなど）、ケモカイン、成長因子、神経ペプチド、インクレチン、及びペプチドホルモンである。より好ましくは、ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補は、分泌促進物質である。分泌促進物質は、他の物質を分泌させる物質である。分泌される物質は、サイトカイン（インターロイキンなど）、ケモカイン、成長因子、神経ペプチド、及びペプチドホルモンからなる群から選択することができる。好ましくは、同定されたヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補は、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－３３、及び／又はＴＧＦ－ベータなどの（抗炎症性）インターロイキン；ＧＬＰ－１、ＧＬＰ－２、ＧＩＰ、グルカゴン、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、オキシントモジュリン、及び／又はグレリンなどのインクレチン；血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、又はコレシストキニン（ＣＣＫ）などの神経ペプチド；又はＴＮＦアルファ又はインターフェロンガンマなどの（炎症誘発性）サイトカインの（特に、ヒト細胞からの）分泌を誘導又は向上させることができる。いくつかの実施形態においては、同定されたヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補は、ヒト免疫細胞からのインターロイキン－１０（ＩＬ－１０）の分泌を誘導又は向上させる分泌促進物質であることができる。

【0169】

更に、本発明に係るヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を提供するための方法において、同定されたタンパク質は、ヒト細胞からの（通常は分泌される）物質の分泌を低減又は阻害することができる。例えば、同定されたヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補は、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、及び／又はＩＬ－１７などの（炎症誘発性）インターロイキン；ＩＬ－２及び／又はＩＬ－２２などの（抗炎症性）インターロイキン；又はＴＮＦアルファ若しくはインターフェロンガンマなどの（炎症誘発性）サイトカインの（特にヒト細胞から）分泌を低減又は阻害することができる。

【0170】

ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補が、ヒト細胞からの（免疫調節性）化合物などの、関心のある物質の分泌を誘発／向上又は低減／阻害するかどうかは、当技術分野で知られている様々なバイオアッセイで評価することができる。一般に、当業者は、関心のある物質（ヒト細胞からの分泌が調節される、即ち、誘導／向上又は低減／阻害される）に応じてアッセイを選択することができる。この目的のために、当業者は、関心のある物質を分泌できることが知られているヒト細胞の細胞型を選択することができる。例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）などのヒト免疫細胞によって、様々な免疫調節化合物が分泌され得る。ＰＢＭＣから分泌される免疫調節性化合物（関心のある潜在的物質）の例としては、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－２、ＩＬ－１７、ＴＮＦアルファ、ＩＦＮガンマ、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、及びＩＬ－３３が挙げられる。例えば、ヒト細胞からのＩＬ－８、ＩＬ－１０、及びＩＬ－３３の分泌はまた、Ｔ８４細胞又はＨＴ－２９細胞において評価することができる。関心のある物質の分泌に対するヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補の効果を評価するために、ヒト細胞をヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補に曝露し（例えば、ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を細胞培養物に添加することにより）、関心のある物質の分泌を測定することができる（そして、ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補に曝露されていない対照と比較することができる）。

【0171】

更に、同定されたヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補は、免疫調節性であることができる。

【0172】

本明細書においては、用語「免疫調節性」及び「免疫調節」は、免疫応答の変化（例えば、誘導、増幅、減衰、防止、又は低減）を意味する。これにより、この用語は、特に宿主の免疫応答、即ち、ヒトの免疫応答について言及される。

【0173】

ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補のライブラリー及びデータベース
更なる態様において、本発明はまた、前記したヒトミクロバイオータタンパク質薬剤候補を提供するための方法によって得られる、ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補のライブラリーを提供する。

【0174】

一般に、ライブラリーは、タンパク質ライブラリー、即ち、ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を含むライブラリー、又は核酸ライブラリー、特に、ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補をコードする核酸分子（例えば、クローン化されたＤＮＡ断片）を含むＤＮＡライブラリーであることができる。換言すれば、「ライブラリー」は単なる情報ではなく、分子（タンパク質及び／又は核酸分子）を含み、一方、「データベース」は、情報（配列情報など）を含むが、分子は含まない。いくつかの実施形態においては、ライブラリーは、ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を含むタンパク質ライブラリーである。他の実施形態においては、ライブラリーは、ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補をコードするＤＮＡ分子を含むＤＮＡライブラリーである。ＤＮＡライブラリーを得るために、ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補をコードするＤＮＡ分子を合成（又は抽出）し、適切なベクター（例えば、プラスミド又はバクテリオファージのゲノム）にクローン化することができる。

【0175】

したがって、本発明はまた、ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補のライブラリーを調製するための方法を提供する。ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補は、前記したように同定され、その後、ＤＮＡ又はタンパク質ライブラリーが調製される。これらのライブラリーは、調製されたタンパク質の収集によって、又は前記したように当技術分野で知られたＤＮＡライブラリーを調製することによって調製される。

【0176】

更に、本発明はまた、前記したヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を提供するための方法によって得られる、ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補のデータベースを提供する。

【0177】

一般に、データベースは、前記したヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を提供するための方法によって得られる、ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補のタンパク質及び／又は核酸配列を含む。更に、データベースは、例えば、アノテーション及び／又は生物学的活性に関する更なる情報も含むことができる。データベースは、前記したヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を提供するための方法の工程（ｉｉ）において、ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補として選択した配列に基づいて容易に得ることができる。

【0178】

したがって、本発明はまた、ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補のデータベースを調製するための方法を提供する。ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補は、前記したように同定／選択されて、データベースは、ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補のタンパク質及び／又は核酸配列のそれぞれの集合を提供する。

【0179】

ヒトマイクロバイオームメタセクレトームのタンパク質を同定するための方法
更なる態様において、本発明はまた、ヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質を同定するための方法を提供し、前記方法は、以下の工程：
（ｉ）複数のヒトマイクロバイオータタンパク質配列及び／又は複数のヒトマイクロバイオータタンパク質をコードする複数の核酸配列を提供することと；
（ｉｉ）前記工程（ｉ）で提供された前記配列において、ヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質の１以上の配列を同定することと、を含み、
前記ヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質の前記配列が、以下の基準にしたがって選択される。
－ シグナルペプチドを有する配列、又はシグナルペプチドを有するタンパク質をコードする配列である；
－ ２０～５００アミノ酸長を有する配列、又は２０～５００アミノ酸長を有するタンパク質をコードする配列である；及び
－ 少なくとも２つのシステイン残基を含む配列、又は立体構造的に剛性な構造を与える一次及び／又は二次構造エレメントを含む配列、又は立体構造的に剛性な構造を与える一次及び／又は二次構造エレメントを含むタンパク質をコードする配列である。

【0180】

ヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質を同定するための方法の工程（ｉ）及び（ｉｉ）は、前記した本発明のヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を提供するための方法の工程（ｉ）及び（ｉｉ）に正確に対応する。「ヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質」は、前記した方法で記載される「ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補」に対応する。したがって、本発明のヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を提供するための方法について上に概説した詳細な説明、実施形態、及び実施例が、同様に、ヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質を同定するための方法に適用される。これらの方法間の唯一の違いは、ヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質を同定するための方法では、タンパク質を調製する工程（ｉｉｉ）は必須ではないという点である（ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を提供するための前記方法の場合では必須であるが）。

【0181】

本発明に係るヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質を同定するための例示的な方法においては、工程（ｉｉ）は、以下のサブ工程を（好ましくは、記載された順序で）含むことができる。
１．シグナルペプチドを有する複数の配列を、Ｐｈｏｂｉｕｓを用いて同定する、
２．アノテーションを、ＨＭＭＳＣＡＮとＰＦＡＭを用いて行う、
３．冗長な配列の同定及び除去を、ＣＤ－ＨＩＴを用いて、好ましくは７５％の同一性カットオフで行う、
４．５０～３５０アミノ酸長のタンパク質をコードする配列、又は５０～３５０アミノ酸長のタンパク質の配列を選択する；
５．シグナルペプチドを有する配列を、ＳｉｇｎａｌＰを用いて同定する；及び
６．少なくとも２つのシステイン残基を含む配列、又は立体構造的に剛性な構造を与える一次及び／又は二次構造エレメントを含む配列、又は立体構造的に剛性な構造を与える一次及び／又は二次構造エレメントを含むタンパク質をコードする配列を選択する。

【0182】

上で概説したように、本発明のヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を提供するための方法の詳細な説明が、同様に適用される。

【0183】

更なる態様において、本発明はまた、ヒトマイクロバイオータメタセクレトーム配列データベースを生成するための方法を提供し、前記方法は、前記したように、即ち、本発明に係るヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質を同定するための方法による、複数のヒトマイクロバイオータメタセクレトーム（タンパク質及び／又は核酸）配列の同定を含む。

【0184】

特に、ヒトマイクロバイオータメタセクレトーム配列データベースを生成するための方法は、複数のヒトマイクロバイオータメタセクレトームタンパク質配列を編集する工程を含む。

【0185】

データベースは、メタセクレトームタンパク質をコードする核酸配列及び／又はタンパク質（アミノ酸）配列を含むことができる。好ましくは、データベースは、タンパク質（アミノ酸）配列を含む。より好ましくは、データベースは、タンパク質（アミノ酸）配列及び（対応する）核酸配列を含む。

【0186】

更に、データベースは、（ｉ）（例えば、ＥＮＳＥＭＢＬ、ＵｎｉＰｒｏｔなどの他のデータベースからの）元の配列と組み合わせて、及び／又は（ｉｉ）前記した本発明に係るヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質の同定のための方法におけるアノテーション工程を行うことによって好ましくは得られるアノテーション情報を含むことができる。

【0187】

本発明に係るヒトマイクロバイオータメタセクレトーム配列データベースを生成するための方法において、本発明に係るヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質を同定するための方法の工程（ｉ）においては、複数のヒトマイクロバイオータタンパク質配列及び／又は複数のヒトマイクロバイオータタンパク質をコードする複数の核酸配列が提供され、データベースに編集され、その後の工程（即ち、工程（ｉｉ）のサブ工程）が、データベース又はデータベースに含まれる配列に対して行われることが好ましい。

【0188】

換言すれば、第１のデータベースは、本発明に係るヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質を同定するための方法の工程（ｉ）で編集され、その後の工程のそれぞれが、データベース又はデータベースに含まれる配列に対して行われることが好ましい。

【0189】

好ましくは、リレーショナルデータベース管理システム（ＲＤＢＭＳ）が使用される。用語「リレーショナルデータベース管理システム（ＲＤＢＭＳ）」は、リレーショナルモデル（Ｃｏｄｄ Ｅ．Ｆ． （１９７０）： Ａ Ｒｅｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｄａｔａ ｆｏｒ Ｌａｒｇｅ Ｓｈａｒｅｄ Ｄａｔａ Ｂａｎｋｓ； Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡＣＭ； １３（６）： ３７７－３８７）に基づくデータベース管理システム（ＤＢＭＳ）を意味する。

【0190】

リレーショナルデータベース管理システムの好ましい例としては、以下が挙げられる。
－ ＭｙＳＱＬ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｙｓｑｌ．ｃｏｍ／； Ｏｒａｃｌｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ， ＵＳＡ）
－ Ｏｒａｃｌｅ Ｄａｔａｂａｓｅ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｏｒａｃｌｅ．ｃｏｍ／ｄａｔａｂａｓｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ； Ｏｒａｃｌｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ， ＵＳＡ）；
－ Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ＳＱＬ ｓｅｒｖｅｒ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ．ｃｏｍ／ｅｎ－ｕｓ／ｓｑｌ－ｓｅｒｖｅｒ； Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）；
－ ＰｏｓｔｇｒｅＳＱＬ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｏｓｔｇｒｅｓｑｌ．ｏｒｇ／； Ｔｈｅ ＰｏｓｔｇｒｅＳＱＬ Ｇｌｏｂａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｇｒｏｕｐ）；及び
－ ＩＢＭ ＤＢ２ （ＵＲＬ： ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｂｍ．ｃｏｍ／ａｎａｌｙｔｉｃｓ／ｕｓ／ｅｎ／ｄｂ２／； ＩＢＭ）。

【0191】

ヒトマイクロバイオームメタセクレトームのタンパク質を調製するための方法
更なる態様において、本発明はまた、前記した本発明に記載の、複数のヒトマイクロバイオータメタセクレトームタンパク質配列及び／又は複数のヒトマイクロバイオータタンパク質をコードする複数の核酸配列の同定と、それに続く以下の工程とを含む、ヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質を調製するための方法を提供する。
－ヒトマイクロバイオータメタセクレトームの１以上のタンパク質を、これまでに同定された配列に基づいて調製すること。

【0192】

この方法は、前記した本発明のヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を提供するための方法に対応する。即ち、複数のヒトマイクロバイオータメタセクレトームタンパク質配列及び／又は複数のヒトマイクロバイオータメタセクレトームタンパク質をコードする複数の核酸配列の同定は、前記した本発明のヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を提供するための方法の工程（ｉ）及び（ｉｉ）に対応する。これまでに同定された配列に基づいてヒトマイクロバイオータメタセクレトームの１以上のタンパク質を調製する工程は、前記した本発明のヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を提供するための方法の工程（ｉｉｉ）に対応する。「ヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質」は、前記した方法に記載される「ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補」に対応する。したがって、本発明のヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を提供するための方法について上に概説した詳細な説明、実施形態、及び実施例は、同様に、ヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質を調製するための方法に適用される。

【0193】

更なる態様において、本発明はまた、ヒト宿主分子と相互作用するヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質を同定及び／又は提供するための方法を提供し、前記方法は、
－前記した本発明に係る、複数のヒトマイクロバイオータメタセクレトームタンパク質配列及び／又は複数のヒトマイクロバイオータタンパク質をコードする複数の核酸配列の同定と、
－任意に、前記した本発明に係る、ヒトマイクロバイオータメタセクレトームの１以上のタンパク質の調製のための方法と、
続いて、前記ヒトマイクロバイオータメタセクレトームの同定／調製されたタンパク質の、ヒト宿主分子、特に、ヒト宿主タンパク質との相互作用を試験する工程を行うこととを含む。

【0194】

この方法の追加工程は、上記した本発明のヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を提供するための方法の工程（ｉｖ）に対応する。したがって、本発明のヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を提供するための方法について上に概説した詳細な説明、実施形態、及び実施例は、同様に、ヒト宿主分子と相互作用するヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質を同定及び／又は提供するための方法に適用される。

【0195】

更なる態様において、本発明はまた、医学における使用のための、前記した本発明に係る方法によって得ることができるヒトマイクロバイオータメタセクレトームタンパク質を提供する。かかるマイクロバイオータタンパク質は、通常、細胞表面に分泌される又は位置し、２０～５００アミノ酸長を有し、前記したように、少なくとも２つのシステイン残基及び／又は剛性な構造を有する。具体的な詳細、例えば、ヒトマイクロバイオータメタセクレトームタンパク質に関して本発明の方法の文脈で前記した好ましい実施形態は、同様に、本態様に適用される。

【0196】

即ち、前記した本発明の方法にしたがって得ることができるヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質は、ヒトにおける予防及び治療用途において有用である。このことは、マイクロバイオームタンパク質の発現レベルと、特定の状態又は疾患での発現の調節の、ヒト宿主に対する生物学的影響を示唆することを示す様々な報告によって裏付けられている。

【0197】

好ましい実施形態においては、ヒトマイクロバイオータメタセクレトームタンパク質が、ヒト宿主分子、特に、前記したヒト宿主タンパク質と相互作用することが予測及び／又は判明した。かかる相互作用は、マイクロバイオームタンパク質がヒトタンパク質の機能を模倣して、それに関連する医学用途に有用である得ることを示唆している。

【0198】

いくつかの実施形態においては、かかるタンパク質は、例えば、ヒト免疫細胞によるＩＬ－１０の分泌を誘導する分泌促進物質である。更に、タンパク質は、免疫調節性であることができる。

【0199】

したがって、ヒトマイクロバイオータタンパク質は、ヒト宿主タンパク質の模倣物又は分泌促進物質であることができ、これらは、例えば、サイトカイン、インターロイキン、ケモカイン、成長因子、神経ペプチド、及びペプチドホルモンからなる群から選択される。

【0200】

例示されたヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補は、本発明者らによって、前記したように、より詳細には、実施例セクションで同定された。それらの例示マイクロバイオータ薬剤候補のアミノ酸配列を、以下の表１に示す。

【表1】

表１：ヒト細胞からのＩＬ－１０分泌を誘導する及び／又は向上させる例示マイクロバイオータタンパク質の配列。

【0201】

したがって、配列番号１で表される配列を含むヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補が好ましい。更に、配列番号２で表される配列を含むヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補も好ましい。更に、配列番号３で表される配列を含むヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補も好ましい。更に、配列番号４で表される配列を含むヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補も好ましい。更に、配列番号５で表される配列を含むヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補も好ましい。更に、配列番号６で表される配列を含むヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補も好ましい。更に、配列番号７で表される配列を含むヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補も好ましい。更に、配列番号８で表される配列を含むヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補も好ましい。更に、配列番号９で表される配列を含むヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補も好ましい。更に、配列番号１０で表される配列を含むヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補も好ましい。最も好ましくは、ヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補は、配列番号１で表される配列を含む又はからなる。

【0202】

実施例１（図１）に示されるように、配列番号１～１０の例示マイクロバイオータタンパク質で刺激されたヒト細胞からのＩＬ－１０分泌は、Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物で刺激された同一タイプのヒト細胞からのＩＬ－１０分泌よりも高い。したがって、配列番号１～１０のヒトマイクロバイオータ薬剤候補は、ヒト細胞からのＩＬ－１０の分泌を誘導する及び／又は向上させる。したがって、配列番号１～１０のタンパク質は、炎症性疾患及び自己免疫障害の治療に有用であり得る。

【0203】

したがって、本発明はまた、配列番号１～１０のいずれかによるアミノ酸配列を含むヒトマイクロバイオータメタセクレトームタンパク質も提供する。

【0204】

薬剤を調製するための方法
更なる態様において、本発明はまた、疾患の予防及び／又は治療のための薬剤を調製するための方法を提供し、前記方法は、以下の工程を含む。
（ａ）前記したヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補を提供すること；
（ｂ）以下を含む医薬組成物を調製すること：
（１）前記ヒトマイクロバイオータメタセクレトームの前記タンパク質、又はその（機能的）断片若しくは配列変異体；
（２）（１）に記載の前記タンパク質をコードする核酸分子；
（３）（１）に記載の前記タンパク質を発現する又は（２）に記載の前記核酸分子を含む細胞；
（４）（１）に記載の前記タンパク質に結合する抗体；
（５）（４）に記載の前記抗体をコードする核酸分子；
（６）（４）に記載の前記抗体を発現する又は（５）に記載の前記核酸分子を含む細胞；
（７）（１）に記載の前記タンパク質と相互作用する化合物；又は
（８）（１）に記載の前記タンパク質の、前記ヒト宿主分子との相互作用（結合）に干渉する化合物、
及び、任意に、薬学的に許容される担体及び／又はアジュバント。

【0205】

更に、本発明は、疾患の予防及び／又は治療のための薬剤を調製するための方法を提供し、前記方法は、以下の工程を含む。
（ａ）前記した本発明に係る、ヒト宿主分子と相互作用するヒトマイクロバイオータのタンパク質の同定；
（ｂ）以下を含む医薬組成物を調製すること：
（１）前記ヒトマイクロバイオータメタセクレトームの前記タンパク質、又はその（機能的）断片若しくは配列変異体；
（２）（１）に記載の前記タンパク質をコードする核酸分子；
（３）（１）に記載の前記タンパク質を発現する又は（２）に記載の前記核酸分子を含む細胞；
（４）（１）に記載の前記タンパク質に結合する抗体；
（５）（４）に記載の前記抗体をコードする核酸分子；
（６）（４）に記載の前記抗体を発現する又は（５）に記載の前記核酸分子を含む細胞；
（７）（１）に記載の前記タンパク質と相互作用する化合物；又は
（８）（１）に記載の前記タンパク質の、前記ヒト宿主分子との相互作用（結合）に干渉する化合物、
及び、任意に、薬学的に許容される担体及び／又はアジュバント。

【0206】

本明細書においては、用語「配列変異体」は、レファレンス配列と類似している（特に、少なくとも５０％の配列同一性、以下を参照）が、（１００％）同一ではない配列を意味する。したがって、配列変異体は、レファレンス配列と比較して少なくとも１つの変更を含む。一般に、配列変異体は、特に、配列の全長に亘って、レファレンス配列と少なくとも５０％の配列同一性を共有し、配列同一性は、前記したように計算することができる。好ましくは、配列変異体は、特に、配列の全長に亘って、レファレンス配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を共有する（これは、前記したように計算することができる）。

【0207】

一般に、用語「配列変異体」は、ヌクレオチド配列変異体及びアミノ酸配列変異体を含む。例えば、アミノ酸配列変異体は、レファレンス配列と比較して、アミノ酸の１以上が欠失若しくは置換されている、又はレファレンスアミノ酸配列と比較して、アミノ酸の１以上が挿入されている、変更された配列を有する。変更の結果、アミノ酸配列変異体は、レファレンス配列と、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、更により好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％が同一である。例えば、少なくとも９０％同一である変異配列は、レファレンス配列の１００アミノ酸当たり１０以下の変更（即ち、欠失、挿入、又は置換の任意の組合せ）を有する。

【0208】

本明細書においては、マイクロバイオータタンパク質の「断片」は、マイクロバイオータタンパク質の少なくとも１０個の連続するアミノ酸、好ましくはマイクロバイオータタンパク質の少なくとも１５個の連続するアミノ酸、より好ましくはマイクロバイオータタンパク質の少なくとも２０個の連続するアミノ酸、より好ましくは、マイクロバイオータタンパク質の少なくとも２５個の連続するアミノ酸、更により好ましくはマイクロバイオータタンパク質の少なくとも３０個の連続するアミノ酸、特に好ましくはマイクロバイオータタンパク質の少なくとも３５個の連続するアミノ酸を含む。したがって、マイクロバイオータタンパク質の断片は、少なくとも１０アミノ酸長、好ましくは少なくとも１５アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸長、更により好ましくは少なくとも２５アミノ酸長、更により好ましくは少なくとも３０アミノ酸長、最も好ましくは少なくとも３５アミノ酸長を有する。例えば、マイクロバイオータタンパク質の断片は、マイクロバイオータタンパク質の１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、又はそれ以上の個数の連続するアミノ酸を含むことができる。マイクロバイオータタンパク質の断片は、いずれの場合でも、（完全長）マイクロバイオータタンパク質より短い（最も短い長さは、１０アミノ酸長である）ことが理解される。

【0209】

例えば、マイクロバイオータタンパク質の断片は、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、又はそれ以上、例えば、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又はそれ以上、完全長のマイクロバイオータタンパク質（１００％の「レファレンス」を表す）より短いことができる。

【0210】

好ましくは、配列変異体又は断片は、レファレンス配列の特定の機能を保持する。本発明の文脈において、この機能は、例えば、前記した（宿主）相互作用及び／又は生物学的活性に関するヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質の機能性である。

【0211】

本発明に係る、薬剤、特に、医薬組成物及びワクチンの調製の文脈において有用である製剤処理技術は、“Ｐａｒｔ ５ ｏｆ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ “Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”， ２２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２０１２， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ”に記載されている。

【0212】

更なる成分として、前記医薬組成物は、特に、薬学的に許容される担体及び／又はビヒクルを含むことができる。本発明の文脈においては、薬学的に許容される担体は、典型的には、本発明の医薬組成物の液体又は非液体ベースを含む。本発明の医薬組成物が液体形態で提供される場合、担体は、通常、パイロジェンフリー水、等張食塩水、又は緩衝（水）溶液、例えば、リン酸塩、クエン酸塩などの緩衝溶液である。特に本発明の医薬組成物の注射の場合には、水又は、好ましくは、ナトリウム塩、好ましくは少なくとも３０ｍＭのナトリウム塩、カルシウム塩、好ましくは少なくとも０．０５ｍＭのカルシウム塩、及び、任意に、カリウム塩、好ましくは少なくとも１ｍＭのカリウム塩を含む緩衝溶液、より好ましくは緩衝水溶液を用いることができる。好ましい実施形態によれば、ナトリウム塩、カルシウム塩、及び任意に、カリウム塩は、それらのハロゲニド（例えば、塩化物、ヨウ化物、又は臭化物の形態）、それらの水酸化物、炭酸塩、水素炭酸塩、又は硫酸塩などの形態で生じ得る。限定されるものではないが、ナトリウム塩の例としては、例えば、ＮａＣｌ、ＮａＩ、ＮａＢｒ、Ｎａ_２ＣＯ_３、ＮａＨＣＯ_３、Ｎａ_２ＳＯ_４が挙げられ、任意のカリウム塩の例としては、例えば、ＫＣｌ、ＫＩ、ＫＢｒ、Ｋ_２ＣＯ_３、ＫＨＣＯ_３、Ｋ_２ＳＯ_４が挙げられ、カルシウム塩の例としては、例えば、ＣａＣｌ_２、ＣａＩ_２、ＣａＢｒ_２、ＣａＣＯ_３、ＣａＳＯ_４、Ｃａ（ＯＨ）_２が挙げられる。更に、前記カチオンの有機アニオンが、緩衝溶液に含まれていてもよい。より好ましい実施形態によれば、上で定義される注射目的に適した緩衝溶液は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）、及び任意に、塩化カリウム（ＫＣｌ）から選択される塩を含むことができ、塩化物に加えて、更なるアニオンが存在してもよい。ＣａＣｌ_２は、ＫＣｌなどの別の塩に置き換えることもできる。通常、注射用緩衝溶液中の塩は、少なくとも３０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、少なくとも１ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）、及び少なくとも０．０５ｍＭの塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）で存在する。注射用緩衝溶液は、特定のレファレンス媒体に関して高張性、等張性、又は低張性であることができ、即ち、緩衝溶液は、特定のレファレンス媒体に関して、より高い、同一、又はより低い塩含量を有することができ、好ましくは、かかる濃度の前述の塩を用いることができ、この場合、浸透又は他の濃度効果による細胞損傷を引き起こさない。レファレンス媒体は、例えば、血液、リンパ液、細胞質液、又は他の体液などの「インビトロ」法で生じる液体、又は一般的な緩衝溶液若しくは液体など、「インビボ」法におけるレファレンス媒体として使用され得る液体などである。かかる一般的な緩衝溶液又は液体は、当業者に知られている。生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）及びリンゲルラクテート溶液は、液体ベースとして特に好ましい

【0213】

更に、１以上の相溶性のある固体状又は液体状のフィラー若しくは希釈剤又はカプセル化化合物も、治療対象への投与に適した本発明の医薬組成物に使用することができる。本明細書においては、用語「相溶性」は、本発明の医薬組成物のこれらの成分が、本明細書で定義されるヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質と、典型的な使用条件下において本発明の医薬組成物の実質的に医薬効果を低下させる相互作用が生じないように混合することができることを意味する。言うまでもなく、薬学的に許容される担体、フィラー、及び希釈剤は、治療対象への投与に適したものにするために、十分に高い純度及び十分に低い毒性を有している必要がある。薬学的に許容される担体、フィラー、又は構成成分として使用することができる化合物のいくつかの例は、例えば、ラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖；例えば、コーンスターチ又はポテトスターチなどのスターチ；例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロースなどの、セルロース及びその誘導体；トラガント末；麦芽；ゼラチン；獣脂；例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムなどの固体流動化剤；硫酸カルシウム；例えば、落花生油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、及びカカオ由来油などの植物油；例えば、ポリプロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコールなどのポリオール；アルギン酸である。

【0214】

本発明の医薬組成物に含まれ得る更なる添加剤は、例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）などの乳化剤；例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなどの湿潤剤；着色剤；矯味剤、医薬担体；錠剤形成剤；安定化剤；抗酸化剤；保存料である。

【0215】

例えば、薬剤は、ワクチンであってもよい。本発明の文脈においては、用語「ワクチン」は、典型的には特定の疾患に対して、先天性及び／又は適応性の免疫を与える生物学的製剤を意味する。したがって、ワクチンは、特に、治療対象の免疫系の生来の及び／又は適応性の免疫応答を支援する。ワクチンは、生来の免疫応答をもたらし得る又はそれを支援し得るアジュバントを更に含んでもよい。

【0216】

したがって、前記医薬組成物、特に、前記ワクチンは、その免疫原性を更に高めるために、１以上の補助物質、好ましくは前記したアジュバントを更に含むことができる。それによって、上で定義したヒトマイクロバイオータメタセクレトームのタンパク質と、前記した本発明のワクチンに任意に含まれ得る補助物質との相乗作用が達成されることが好ましい。様々な種類の補助物質に応じて、様々なメカニズムをこの点で考慮することができる。例えば、樹状細胞（ＤＣ）の成熟を可能にする化合物、例えば、リポ多糖、ＴＮＦ－α、又はＣＤ４０リガンドは、好適な補助物質の第１のクラスを形成する。一般に、「危険シグナル」（ＬＰＳ、ＧＰ９６、など）又はＧＭ－ＣＳＦなどのサイトカインのように、免疫系に影響を与える任意の剤を補助物質として使用することができ、これにより、本発明に係る免疫刺激アジュバントによる免疫応答が、標的化された方法で向上する及び／又は影響される。特に好ましい補助物質は、モノキン、リンフォカイン、インターロイキン、又はケモカインなどの、生来の免疫応答を更に促進するサイトカインであり、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－３０、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３３、ＩＦＮ－アルファ、ＩＦＮ－ベータ、ＩＦＮ－ガンマ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＬＴ－ベータ又はＴＮＦ－アルファ、ｈＧＨなどの成長因子である。

【0217】

本発明の医薬組成物はまた、ヒトのＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０に対する結合アフィニティ（リガンドとしての）により、又は齧歯類のＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２、又はＴＬＲ１３に対する結合アフィニティ（リガンドとしての）により、免疫刺激性であることが知られている任意の更なる化合物を更に含むことができる。

【0218】

この文脈において、本発明の医薬組成物、特に本発明のワクチンに添加することができる別のクラスの化合物は、ＣｐＧ核酸、特に、ＣｐＧ－ＲＮＡ又はＣｐＧ－ＤＮＡであることができる。ＣｐＧ－ＲＮＡ又はＣｐＧ－ＤＮＡは、一本鎖ＣｐＧ－ＤＮＡ（ｓｓ ＣｐＧ－ＤＮＡ）、二本鎖ＣｐＧ－ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＣｐＧ－ＲＮＡ（ｓｓ ＣｐＧ－ＲＮＡ）、又は二本鎖ＣｐＧ－ＲＮＡ（ｄｓ ＣｐＧ－ＲＮＡ）であることができる。ＣｐＧ核酸は、好ましくはＣｐＧ－ＲＮＡの形態であり、より好ましくは一本鎖ＣｐＧ－ＲＮＡ（ｓｓ ＣｐＧ－ＲＮＡ）の形態である。ＣｐＧ核酸は、好ましくは、少なくとも１以上の（分裂促進的な）シトシン／グアニンジヌクレオチド配列（ＣｐＧモチーフ）を含む。第１の好ましい代替案によれば、これらの配列に含まれる少なくとも１つのＣｐＧモチーフ、特に、ＣｐＧモチーフのＣ（シトシン）及びＧ（グアニン）は、メチル化されていない。これらの配列に任意に含まれる全ての更なるシトシン又はグアニンは、メチル化又は非メチル化のいずれかであり得る。しかし、更に好ましい代替案によれば、ＣｐＧモチーフのＣ（シトシン）及びＧ（グアニン）も、メチル化された形態で存在することができる。

【0219】

特に好ましいアジュバントは、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（「ポリＩ：Ｃ」とも称される）及び／又はその誘導体ポリＩＣＬＣである。ポリＩ：Ｃは、ミスマッチの二本鎖ＲＮＡで、一方の鎖はイノシン酸のポリマーであり、他方の鎖はシチジル酸のポリマーである。ポリＩ：Ｃは、ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）と相互作用することが知られている免疫刺激剤である。ポリＩ：Ｃは、ＴＬＲ３の「天然」刺激剤である二本鎖ＲＮＡと構造的に類似している。したがって、ポリＩ：Ｃは、二本鎖ＲＮＡの合成類似体とみなすことができる。ポリ－ＩＣＬＣは、カルボキシメチルセルロース、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、及びポリ－Ｌ－リジン二本鎖ＲＮＡの合成複合体である。ポリＩ：Ｃと同様に、ポリＩＣＬＣもＴＬＲ３のリガンドである。ポリＩ：Ｃ及びポリＩＣＬＣは、通常、細胞毒性サイトカインの放出を刺激する。ポリ－ＩＣＬＣの好ましい例は、Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）である。

【0220】

以下では、添付図面の簡単な説明が与えられる。これらの図面は、本発明をより詳細に説明することを意図している。しかし、これらの図面は、本発明の主題を何ら限定することを意図しない。

【図面の簡単な説明】

【0221】

【図1】図１は、実施例１に関し、Ｐｈｏｂｉｕｓで行った種ごとのシグナルペプチド予測の概要を示す。

【図2】図２は、例示的な実施形態のワークフローの概要を示す。

【図3】図３は、実施例４に関し、本発明に係る方法で同定された１０個のヒトマイクロバイオータ薬剤候補を用いた刺激による、ヒトＰＢＭＣからのＩＬ－１０分泌についてのＡｌｆａｌＬＩＳＡの結果を示す。

【実施例】

【0222】

以下に、本発明の様々な実施形態及び態様を説明する具体例を提示する。しかし、本発明は、本明細書に記載する特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。以下の調製及び実施例は、当業者が本発明をより明確に理解し、実施することができるように与えられるものである。しかし、本発明は、例示される実施形態によって範囲が限定されるものではなく、前記実施形態は、本発明の１つの態様を説明することのみを意図し、機能的に等価な方法は、本発明の範囲内である。実際、本明細書に記載するものに加えて本発明の様々な変形例は、上述の記載、添付図面、及び以下の実施例から当業者に容易に明らかになる。すべてのかかる変形例は、添付の特許請求の範囲の範囲内である。

【0223】

実施例１：ヒトマイクロバイオームの分泌タンパク質の同定
１．ヒトマイクロバイオームタンパク質のアノテーション及びシグナルペプチドを有するタンパク質の選択
第１の試験を行った。同試験では、処理及び選択するマイクロバイオーム遺伝子とゲノムを、ヒトの腸マイクロバイオームの一部であり、免疫調節活性においてそれらの役割が知られている単離された細菌ゲノムと、メタゲノムカタログに由来する遺伝子との組合せに基づいて選択した。

【0224】

種の第１のリストを編集した。同リストは、免疫調節と炎症応答制御における役割に基づいて選択された１２種類が含まれた。
・Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｓｈａｈｉｉ
・Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ
・Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ
・Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ
・Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａ ｉｎｔｅｓｔｉｎｉｈｏｍｉｎｉｓ
・Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ
・Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ
・Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ
・Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｉｒａｅ
・Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｒｉｕｍ
・Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ
・Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ

【0225】

選択された１２種類の細菌のタンパク質及び遺伝子配列を、Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｂａｃｔｅｒｉａデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｂａｃｔｅｒｉａ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ； Ｐ．Ｊ． Ｋｅｒｓｅｙ， Ｊ．Ｅ． Ａｌｌｅｎ， Ａ． Ａｌｌｏｔ， Ｍ． Ｂａｒｂａ， Ｓ． Ｂｏｄｄｕ， Ｂ．Ｊ． Ｂｏｌｔ， Ｄ． Ｃａｒｖａｌｈｏ－Ｓｉｌｖａ， Ｍ． Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， Ｐ． Ｄａｖｉｓ， Ｃ． Ｇｒａｂｍｕｅｌｌｅｒ， Ｎ． Ｋｕｍａｒ， Ｚ． Ｌｉｕ， Ｔ． Ｍａｕｒｅｌ， Ｂ． Ｍｏｏｒｅ， Ｍ． Ｄ． ＭｃＤｏｗａｌｌ， Ｕ． Ｍａｈｅｓｗａｒｉ， Ｇ． Ｎａａｍａｔｉ， Ｖ． Ｎｅｗｍａｎ， Ｃ．Ｋ． Ｏｎｇ， Ｄ．Ｍ． Ｂｏｌｓｅｒ．， Ｎ． Ｄｅ Ｓｉｌｖａ， Ｋ．Ｌ． Ｈｏｗｅ， Ｎ． Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ， Ｇ． Ｍａｓｌｅｎ， Ｄ．Ｍ． Ｓｔａｉｎｅｓ， Ａ． Ｙａｔｅｓ． Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｇｅｎｏｍｅｓ ２０１８： ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｏｍｉｃｓ ｉｎｆｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｎｏｎ－ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１８ ４６（Ｄ１） Ｄ８０２－Ｄ８０８）からダウンロードした。

【0226】

次いで、各遺伝子のタンパク質とヌクレオチド配列を、この試験用に構築したＭｙＳＱＬデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｙｓｑｌ．ｃｏｍ／； Ｏｒａｃｌｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ， ＵＳＡ）にインポートした。

【0227】

それぞれの種で利用可能なタンパク質の総数を、以下の表２に示す。
表２：Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｂａｃｔｅｒｉａデータベースから取得した、種ごとのタンパク質配列の総数

【表2】

【0228】

特に、種ごとのタンパク質数の違いは、公開データベースにおけるそれぞれの種のゲノム及び株の数によるものである。

【0229】

選択した１２種類に亘る７９１，６３８の利用可能なタンパク質を全て、Ｐｈｏｂｉｕｓソフトウェア（Ａ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｏｐｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ， Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｒｅ； ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｐｈｏｂｉｕｓ．ｓｂｃ．ｓｕ．ｓｅ／； Ｌｕｋａｓ Ｋａｌｌ， Ａｎｄｅｒｓ Ｋｒｏｇｈ ａｎｄ Ｅｒｉｋ Ｌ． Ｌ． Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ． Ａ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ Ｔｏｐｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｓｉｇｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ３３８（５）：１０２７－１０３６， Ｍａｙ ２００４； Ｌｕｋａｓ Ｋａｌｌ， Ａｎｄｅｒｓ Ｋｒｏｇｈ ａｎｄ Ｅｒｉｋ Ｌ． Ｌ． Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ． Ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｏｐｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ－－ｔｈｅ Ｐｈｏｂｉｕｓ ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ３５：Ｗ４２９－３２， Ｊｕｌｙ ２００７）を用いて処理し、シグナルペプチドの存在を予測した。７９１，６３８のタンパク質のうち、１５５，３３６のタンパク質がポジティブであることが分かった。各タンパク質のＰｈｏｂｉｕｓの結果を、ＭｙＳＱＬデータベースにインポートした。図１は、Ｐｈｏｂｉｕｓがシグナルペプチドを検出したタンパク質の数を示す。

【0230】

次に、ＨＭＭＳＣＡＮ（ＨｍｍｅｒＷｅｂ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．２１．０； ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｈｍｍｅｒ／ｓｅａｒｃｈ／ｈｍｍｓｃａｎ； Ｆｉｎｎ， Ｒ． Ｄ．， Ｃｌｅｍｅｎｔｓ， Ｊ． ＆ Ｅｄｄｙ， Ｓ． Ｒ． ＨＭＭＥＲ ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒ： ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｓｅａｒｃｈｉｎｇ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３９， Ｗ２９－３７， ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｒ３６７ （２０１１）； Ｅｄｄｙ， Ｓ． Ｒ． Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ Ｐｒｏｆｉｌｅ ＨＭＭ Ｓｅａｒｃｈｅｓ． ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ ７， ｅ１００２１９５， ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｃｂｉ．１００２１９５ （２０１１）； Ｒ．Ｄ．Ｆｉｎｎ， Ｊ．Ｃｌｅｍｅｎｔｓ， Ｗ．Ａｒｎｄｔ， Ｂ．Ｌ．Ｍｉｌｌｅｒ， Ｔ．Ｊ．Ｗｈｅｅｌｅｒ， Ｆ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ， Ａ．Ｂａｔｅｍａｎ ａｎｄ Ｓ．Ｒ．Ｅｄｄｙ： ＨＭＭＥＲ ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒ： ２０１５ ｕｐｄａｔｅ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （２０１５） Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ Ｉｓｓｕｅ ４３：Ｗ３０－Ｗ３８）及びＰＦＡＭデータベース（Ｖｅｒｓｉｏｎ ３１．０； ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｘｆａｍ．ｏｒｇ／； Ｒ．Ｄ．Ｆｉｎｎ， Ｐ．Ｃｏｇｇｉｌｌ， Ｒ．Ｙ．Ｅｂｅｒｈａｒｄｔ， Ｓ．Ｒ．Ｅｄｄｙ， Ｊ．Ｍｉｓｔｒｙ， Ａ．Ｌ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ， Ｓ．Ｃ．Ｐｏｔｔｅｒ， Ｍ．Ｐｕｎｔａ， Ｍ．Ｑｕｒｅｓｈｉ， Ａ．Ｓａｎｇｒａｄｏｒ－Ｖｅｇａｓ， Ｇ．Ａ．Ｓａｌａｚａｒ， Ｊ．Ｔａｔｅ， Ａ．Ｂａｔｅｍａｎ： Ｔｈｅ Ｐｆａｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｄａｔａｂａｓｅ： ｔｏｗａｒｄｓ ａ ｍｏｒｅ ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ ｆｕｔｕｒｅ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１６）Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ ４４： Ｄ２７９－Ｄ２８５； Ｅ． Ｌ． Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ， Ｓ． Ｒ． Ｅｄｄｙ， Ｒ． Ｄｕｒｂｉｎ： Ｐｆａｍ： ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｅｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ． Ｉｎ： Ｐｒｏｔｅｉｎｓ． ２８， １９９７， Ｓ． ４０５－４２０）を使用してタンパク質の完全なセットをアノテートし、下流のフィルタリングと、予測される分泌タンパク質の選択を容易にした。ＰＦＡＭドメインの結果はいずれも、タンパク質配列及びＰｈｏｂｉｕｓ予測と共に同一のＭｙＳＱＬデータベースにインポートした。

【0231】

２．冗長なタンパク質の除去及び長さフィルター
それぞれの種内の冗長性を低減するために、ＣＤ－ＨＩＴ（ｈｔｔｐ：／／ｃｄ－ｈｉｔ．ｏｒｇ； ｈｔｔｐ：／／ｗｅｉｚｈｏｎｇｌｉ－ｌａｂ．ｏｒｇ／ｃｄ－ｈｉｔ／； Ｗｅｉｚｈｏｎｇ Ｌｉ， Ｌｕｋａｓｚ Ｊａｒｏｓｚｅｗｓｋｉ ＆ Ａｄａｍ Ｇｏｄｚｉｋ． Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｔｏ ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ｓｉｚｅ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅｓ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ （２００１） １７：２８２－２８３； Ｗｅｉｚｈｏｎｇ Ｌｉ ＆ Ａｄａｍ Ｇｏｄｚｉｋ． Ｃｄ－ｈｉｔ： ａ ｆａｓｔ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｌａｒｇｅ ｓｅｔｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ （２００６） ２２：１６５８－１６５９； Ｗｅｉｚｈｏｎｇ Ｌｉ， Ｌｉｍｉｎ Ｆｕ， Ｂｅｉｆａｎｇ Ｎｉｕ， Ｓｉｔａｏ Ｗｕ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｏｏｌｅｙ． Ｕｌｔｒａｆａｓｔ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｆｏｒ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ｏｆ ＣＤ－ＨＩＴ－ＯＴＵ－ＭｉＳｅｑｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ ｉｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， （２０１２） １３ （６）： ６５６－６６８）を使用してＰｈｏｂｉｕｓでシグナルペプチド予測についてポジティブであることが分かったタンパク質のサブセットに対し、配列クラスタリングを行った。７５％の同一性カットオフを適用した。シグナルペプチドを有する、種ごとの非冗長なタンパク質の数を、以下の表３に示す。
表３：ＣＤ－ＨＩＴでクラスタリングした後の、種ごとのシグナルペプチド陽性及び非冗長なタンパク質配列の数

【表3】

【0232】

タンパク質配列の長さに追加のフィルターを適用して、５０～２５０アミノ酸長のタンパク質のみを選択した。このフィルタリングの理由は、この段階において、アノテーションの偏り又はアーチファクトに起因し得るより小さなペプチドを考慮することを避けると同時に、選択したタンパク質の最大長を制限して、この段階において、インビトロ合成及び下流の実験室試験に最も適したものとするためである。更に、２５０アミノ酸を超えるタンパク質は、通常、酵素であるが、ペプチドホルモン、成長因子、及びサイトカイン様タンパク質は、一般に、２５０アミノ酸よりも短く、これらのタイプのペプチドは、いくつかの細胞受容体上で、インビトロで直接試験して、それらの可能な調節作用を評価することができる。長さフィルター後の種ごとのタンパク質の数を、以下の表４に示す。
表４：Ｐｈｏｂｉｕｓ分析によるシグナルペプチドと、５０～２５０アミノ酸長を有する非冗長なタンパク質の数

【表4】

【0233】

したがって、５，０５５個のタンパク質のリストを編集した。

【0234】

３．個別のアルゴリズムに基づいてシグナルペプチドを含むタンパク質の選択、及び不完全な／トランケートされた配列の除去
追加のフィルタリング工程を行い、得られたタンパク質配列をＳｉｇｎａｌＰ ｖ４．１ソフトウェア（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｅｎｍａｒｋ ＤＴＵ； ＵＲＬ： ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ； Ｈｅｎｒｉｋ Ｎｉｅｌｓｅｎ， Ｊａｃｏｂ Ｅｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ， Ｓｏｒｅｎ Ｂｒｕｎａｋ ａｎｄ Ｇｕｎｎａｒ ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ａｎｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅｓ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， １０：１－６， １９９７； Ｔｈｏｍａｓ Ｎｏｒｄａｈｌ Ｐｅｔｅｒｓｅｎ， Ｓｏｒｅｎ Ｂｒｕｎａｋ， Ｇｕｎｎａｒ ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ ＆ Ｈｅｎｒｉｋ Ｎｉｅｌｓｅｎ． ＳｉｇｎａｌＰ ４．０： ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｇｉｏｎｓ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ８：７８５－７８６， ２０１１）で処理した。（ＳｉｇｎａｌＰによって用いられるグラム＋又はグラム－法のいずれかで）シグナルペプチドのポジティブな予測を示すタンパク質のみが維持された。

【0235】

その後、対応するヌクレオチド配列を、適切な開始コドンと終止コドンについて検索し、元の遺伝子が「完全」であることを確認した。これにより、不完全な遺伝子（及びトランケートされたタンパク質配列）をリストから除去した。

【0236】

前記フィルタリング工程と、Ｐｈｏｂｉｕｓ及びＳｉｇｎａｌＰ法による二重シグナルペプチド予測の後、この段階におけるタンパク質配列の最終的な数は、分泌されたヒトマイクロバイオームタンパク質の２，５７３配列を含んでいた。

【0237】

実施例２：シグナルペプチドのインシリコ切断
下流のタンパク質の合成と分析には、最終的な「リーダーレス」タンパク質のみが、例えば、正しく折り畳まれたタンパク質の取得、及び各配列におけるアミノ酸頻度の正しい計算に重要である。したがって、上で同定されたタンパク質配列では、シグナルペプチドを除去した。

【0238】

この目的のために、ＳｉｇｎａｌＰからの「Ｙスコア」によって与えられる切断部位を用いた。グラム＋とグラム－ＳｉｇｎａｌＰ予測の両方が同一配列に対してポジティブであった場合、より小さな切断部位を考慮した。

【0239】

実施例３：システインモチーフの同定
剛性な構造が増したタンパク質を同定するために、２，５７３個のタンパク質の最終リストを、システインがジスルフィド結合を形成するシステインリッチなタンパク質について検索した。

【0240】

この目的のために、ＫＡＰＰＡ（ｈｔｔｐ：／／ｋａｐｐａ－ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｅａｒｃｈ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ； Ｊｏｌｙ Ｖ， Ｍａｔｔｏｎ ＤＰ． ＫＡＰＰＡ， ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｅｆｉｎｅｄ ｂｙ ａ ｋｅｙ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｐａｔｔｅｒｎ： ａ ｃａｓｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２０１５ Ｊｕｎ １；３１（１１）：１７１６－２３）（重要なアミノ酸パターンによって定義されるタンパク質の発見とクラスタリングのための最近公開されたアルゴリズム）を用いて、シグナルペプチドのフィルタリング、二重シグナルペプチド予測、及びインシリコ切断の後に得られた２，５７３個の配列を処理した。ＫＡＰＰＡ分析では、共通のシステインモチーフを共有する２５個のタンパク質クラスターが同定された。以下の表は、ＫＡＰＰＡ実行の結果をまとめたものである。
表５：各ＫＡＰＰＡクラスターのタンパク質と、各クラスターのタンパク質当たりのシステインのメジアン数。

【表5】

【0241】

特に実施例１～３に記載の方法が行われた、例示実施形態のワークフローに関する概要を、図２に示す。

【0242】

実施例１～３で同定したヒトマイクロバイオータタンパク質薬剤候補は、本明細書に記載されるように製造した。

【0243】

実施例４：ヒト細胞からのＩＬ－１０放出を誘発するヒトマイクロバイオータ由来のタンパク質薬剤候補の同定
この試験の目的は、ヒト免疫細胞からのＩＬ－１０の分泌を誘導することができる、ヒトマイクロバイオータによって発現されるタンパク質を同定することとした。この目的のために、ヒトマイクロバイオータによって発現されるタンパク質のライブラリーを構築及びスクリーニングして、ヒト免疫細胞からのＩＬ－１０の分泌を誘導するタンパク質を同定した。

【0244】

実験手順：
ライブラリー：インシリコ法
腸内共生細菌からの分泌タンパク質の化合物ライブラリーを、インシリコベースのアプローチによって生成した。ライブラリーには、ヒト腸マイクロバイオームカタログ及び免疫調節における役割が知られている細菌種から予測された１２，０００を超えるタンパク質が含まれた。ライブラリーを得るために、５０～３５０アミノ酸長（シグナルペプチドを含むプレタンパク質の長さ）を有する細菌タンパク質を、バイオインフォマティックツールＰｈｏｂｉｕｓを使用して分泌シグナルペプチドの存在についてスクリーニングし、ＨＭＭＳＣＡＮ及びＰＦＡＭデータベースを用いてアノテートした。配列の冗長性を低減するために、７５％のカットオフを適用した。

【0245】

免疫調節における小さなシステインリッチタンパク質の関連性を考慮して、追加の選択基準を適用し、システインリッチタンパク質を同定した。ジスルフィド結合を形成するためには、少なくとも２つのシステインが存在する必要があった。インビトロでの正しい合成及び折り畳みを確実にするために、シグナルペプチドに対応するアミノ酸配列を除去した。

【0246】

ライブラリー：無細胞タンパク質の合成及び定量
タンパク質ライブラリーを、サプライヤーのプロトコルにしたがい、ジスルフィド結合の生成に適したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｃｅｌｌ Ｆｒｅｅ ｋｉｔ（ＲＴＳ １００ Ｅ． ｃｏｌｉ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｋｉｔ； Ｂｉｏｔｅｃｈｒａｂｂｉｔ， Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて生成した。無細胞系は、転写及び翻訳のための成分を含む反応コンパートメントと、アミノ酸及び他のエネルギー成分を含む供給チャンバーとの間の、半透膜を介した連続的な交換に基づく。

【0247】

Ｅ．ｃｏｌｉの転写機構を使用する異種タンパク質発現は、選択した全配列に適用されるコドン最適化アルゴリズム（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＵＳＡ）によって改善した。合成された全ＯＲＦは、Ｈｉｓタグ付きタンパク質の高収率無細胞発現用に特別に設計されたｐＩＶＥＸ ２．４ベクター（Ｂｉｏｔｅｃｈｒａｂｂｉｔ、Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にサブクローニングした。

【0248】

Ｈｉｓタグ付きタンパク質の検出のために、ＨＴＲＦ（登録商標）技術（Ｃｉｓｂｉｏ， Ｃｏｄｏｌｅｔ， Ｆｒａｎｃｅ）を用いる６Ｈｉｓ Ｃｈｅｃｋ ｋｉｔ Ｇｏｌｄを、サプライヤーのプロトコルにしたがって用いた。事前に１×ＰＢＳで１：２０に希釈したタンパク質を、無細胞合成に用いた溶解物中における段階希釈した（溶解物も１×ＰＢＳ中で１：２０に希釈した）０．１μｇ／ｍＬの６×Ｈｉｓ ＧＦＰ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＵＳＡ）の標準曲線に対して３８４ウェルプレートで定量した。

【0249】

組換えタンパク質のＥ．ｃｏｌｉ産生
ポジティブなヒット（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｈｉｔｓ）のＤＮＡを、Ｎ末端に６×Ｈｉｓ－Ｔａｇを有するｐＥＴ－２８ａベクター（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＵＳＡ）にサブクローニングし、次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）サーモコンピテントセル（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｐｓｗｉｃｈ， ＭＡ， ＵＳＡ）に形質転換した。組換えタンパク質の発現のために、ＢＬ２１（ＤＥ３）クローンの前培養を、ＬＢ培地中、３０℃で、振とう（１８０ｒｐｍ）条件下で行った。同一条件下で培養を行い、０．５ｍＭのＩＰＴＧを用いて、ＯＤ６００が０．４～０．８に達したときに誘導を開始した。各タンパク質の性質に応じて、誘導を２時間から一晩行った。

【0250】

培養物を、４℃、４５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットを－８０℃で凍結して細胞を破壊した。次いで、ペレットを解凍し、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＵＳＡ）及びリゾチーム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＵＳＡ）を添加した１×ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）（Ｎｏｖａｇｅｎ（登録商標）， Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ， Ｄａｒｍｓｔａｄｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に再懸濁した。サンプルを穏やかに振とうすることにより室温でインキュベートし、４℃、１５，０００ｇで３０分間遠心分離した。可溶性タンパク質を、サプライヤーのプロトコルにしたがい、上清からニッケル充填カラム（Ｐｒｏｔｉｎｏ（登録商標）， Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ， Ｄｕｒｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）上に精製した。封入体で生成されたタンパク質を、８Ｍ尿素を使用してペレットから可溶化した。タンパク質溶出に用いられるイミダゾール（２５０ｍＭ）を、３ｋＤａカットオフフィルター（Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）， Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｌｔｄ．， Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ， ＵＳＡ）を使用するバッファー交換により除去した。タンパク質を、１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓアクリルアミドゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＵＳＡ）上で、クマシーブルー（Ｉｍｐｅｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎ； ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＵＳＡ）で染色して可視化し、１：３０００で希釈した６×－ＨｉｓＴａｇモノクローナル抗体ＨＩＳ．Ｈ８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＵＳＡ）を用いるウエスタンブロットによって検出し、二次抗体であるヤギ抗マウスＩｇＧ Ｈ＋Ｌ ＷｅｓｔｅｒｎＤｏｔ６２５ （ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＵＳＡ）を用いて視覚化した。精製後タンパク質を、ブラッドフォードタンパク質アッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｍ （１９７６） Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｇｒａｍ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｄｙｅ ｂｉｎｄｉｎｇ． Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７２：２４８－２５４）によって定量した。

【0251】

ＩＬ１０スクリーニング
マイクロバイオータタンパク質ライブラリーのＩＬ－１０スクリーニングは、ＣＤ１４枯渇ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）で行った。この細胞モデルは、合成後（未精製）のタンパク質の無細胞合成キットの溶解物に存在し得る、細胞壁成分及びその他の細菌汚染物質によるバックグラウンドを低減するために選択した。

【0252】

ＣＤ１４枯渇ＰＢＭＣ：
ＰＢＭＣを、バフィーコートから、以下のように単離した。８０ｍｌのＰＢＳを５０ｍｌの血液に添加し；４ＳｅｐＭａｔｅ^ＴＭ－５０ＩＶＤチューブ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ， Ｃａｎａｄａ）を、１ドナー当たり１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ（登録商標）（Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標） Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ； Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＵＳＡ）で充填し、次いで、ＰＢＳで希釈した血液３０ｍｌを穏やかに添加した。サンプルを、１２００ｇ、室温で２０分間遠心分離し、ＰＢＳで３回洗浄した。赤血球を溶解するために、ペレットを赤血球溶解緩衝溶液１×（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に再懸濁し、室温で１０分間インキュベートした。次に、細胞をＭＡＣＳ緩衝溶液で洗浄し、カウントした。

【0253】

サプライヤーのプロトコルにしたがい、ＰＢＭＣ枯渇を、ＣＤ１４ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行った。枯渇させた単球を、１％のＬ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＵＳＡ）、１％のペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＵＳＡ）、及び１０％の熱不活化ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＵＳＡ）を添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ； ＧＩＢＣＯ^ＴＭ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＵＳＡ）に再懸濁した。

【0254】

ＩＬ１０スクリーニング：
スクリーニングは、最終体積６０μｌで、３８４ウェルプレートで行った。ＰＢＭＣを、マルチドロップ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｒｏｂｏｔｉｃｓ， Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ， Ｇｅｒｍａｎｙ）により、７２，０００細胞／ウェルで播種し、３７℃の加湿５％ＣＯ_２雰囲気にて、ＰＢＳで１：１０に事前希釈したライブラリー（タンパク質）の１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で７２時間刺激した。無細胞キットに含まれるＥ．ｃｏｌｉ溶解物を、陰性対照として使用した（ライブラリーと同じ希釈率で）。１０μｇ／ｍｌ（０．０８７μＭ）のフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を、陽性対照として使用した。技術的ロバスト性を保証するために、少なくとも２名の異なるドナーのＣＤ１４枯渇ＰＢＭＣに対してスクリーニングを行った。

【0255】

サプライヤーのプロトコルにしたがい、ＩＬ－１０の分泌を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）（ＩＬ１０ （ヒト） ＡｌｐｈａＬＩＳＡ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ； ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ， ＵＳＡ）によって、未希釈上清について測定した。結果は、ＡｌｐｈａＬＩＳＡシグナル（カウント）として表した。（２名のＰＢＭＣドナーの２つのシグナルのうちの）少なくとも１つの生データシグナルが、対応するプレート平均＋３ＳＤ（標準偏差）より高かった場合、又は（２名のＰＢＭＣドナーの２つのシグナルのうちの）両方の生データシグナルが、対応するプレート平均＋２ＳＤ（標準偏差）より高かった場合に、結果をポジティブなヒットとみなした。偽ポジティブを避けるために、一次スクリーニングによって得られた潜在的なヒットの濃度を、対応するプレート平均の濃度と比較した。

【0256】

次いで、潜在的なヒットを、無細胞合成の新たなラウンドと、数名のドナーのＣＤ１４枯渇ＰＢＭＣに対する試験によって検証した（前記した通り）。標的配列を含むｐＥＴ－２８ａベクターで形質転換された、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株で産生された組換えタンパク質について、更なる特性評価を行った（前記した通り、段落「組換えタンパク質のＥ．ｃｏｌｉ産生」を参照)。或いは、一部のタンパク質の無細胞産生は、商業的サプライヤー（Ｓｙｎｔｈｅｌｉｓ， Ｌａ Ｔｒｏｎｃｈｅ， Ｆｒａｎｃｅ）によって行われた。

【0257】

結果
スクリーニング
ヒトＰＢＭＣからのＩＬ－１０分泌を刺激することができるタンパク質を同定するために、ライブラリーの合計１１９０４個のタンパク質をＣＤ１４枯渇ＰＢＭＣでスクリーニングした。一次スクリーニングで得られた様々な潜在的なヒットから、これまでに、無細胞合成の第２ラウンドで１０個のタンパク質が確認された。ヒトＰＢＭＣからのＩＬ－１０分泌を刺激することができるこれらのマイクロバイオータタンパク質は、ＩＤ３１６６（配列番号１）；ＩＤ６３５９（配列番号２）；ＩＤ１８８８（配列番号３）；ＩＤ１８８９（配列番号４）；ＩＤ２６６１（配列番号５）；ＩＤ５６８２（配列番号６）；ＩＤ５１３８（配列番号７）；ＩＤ６０７７（配列番号８）；ＩＤ６２７４（配列番号９）；及びＩＤ６２９８（配列番号１０）を含む。

【0258】

無細胞合成の第２ラウンドのヒトＰＢＭＣからのＩＬ－１０分泌に対するＡｌｐｈａＬＩＳＡの結果を、図１に示す。データは、ヒトＰＢＭＣからのＩＬ－１０放出の刺激によるヒトマイクロバイオームメタセクレトームタンパク質ライブラリーのスクリーニングによって、１０個のＩＬ－１０分泌促進物質のタンパク質が同定されたことを示す。これらのマイクロバイオータタンパク質は、ヒト免疫細胞からのＩＬ－１０放出を誘発する。

【0259】

配列及び配列番号表（配列表）

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

2023514064000001.app

【国際調査報告】