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▶ エスケープ・セラピューティクス・インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-05
(54)【発明の名称】黒色腫治療薬
(51)【国際特許分類】
A61K 38/08 20190101AFI20230329BHJP
A61K 38/06 20060101ALI20230329BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230329BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20230329BHJP
C07K 5/117 20060101ALI20230329BHJP
C07K 7/06 20060101ALI20230329BHJP
【ＦＩ】
A61K38/08
A61K38/06
A61P35/00
A61P17/00
C07K5/117
C07K7/06
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022548935
(86)(22)【出願日】2021-02-16
(85)【翻訳文提出日】2022-10-05
(86)【国際出願番号】 US2021018247
(87)【国際公開番号】W WO2021163701
(87)【国際公開日】2021-08-19
(31)【優先権主張番号】62/976,255
(32)【優先日】2020-02-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519350742
【氏名又は名称】エスケープ・セラピューティクス・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＥＳＣＡＰＥ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】ハンタッシュ，バジル エム．
【テーマコード（参考）】
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA01
4C084AA02
4C084AA07
4C084BA01
4C084BA15
4C084BA17
4C084MA02
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZA89
4C084ZB26
4H045AA10
4H045BA12
4H045BA14
4H045EA28
4H045FA33
4H045FA57
(57)【要約】
２つの治療薬、オリゴペプチドＰ５およびＰ１４は、インビトロで複数の黒色腫細胞株に向けられる選択的細胞毒性であることが証明されている。これらのオリゴペプチドは、すべてのタイプの病原性メラノサイトおよび黒色腫の病期のための効果的な処置、ならびに皮膚癌の発症のリスクが高いすべての個体に費用効果的な予防薬を提供する。加えて、これらのオリゴペプチドは、高リスク群において発症する可能性がある任意の前癌病変または異形成母斑に対する予防薬として作用するために日焼け止め剤に処方することができる。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
突然変異メラノサイト、前癌性メラノサイト、および黒色腫細胞を含む病理学的メラノサイトの細胞毒性を誘導することにより被験者を処置する方法であって、有効量の１つまたは複数のオリゴペプチドを含む組成物を、それを必要とする被験者に投与することを含み、前記１つまたは複数のオリゴペプチドが、【化1】
および
【化2】
【請求項2】
前記病理学的メラノサイトが、哺乳動物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記病理学的メラノサイトが、ヒト細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
【化3】
からなる、オリゴペプチド。
【請求項5】
【化4】
【請求項6】
【化5】
【化6】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、引用されているすべての他の参考文献とともに本出願に参照により組み込まれる、２０２０年２月１３日付けで出願された米国特許出願第６２／９７６，２５５号の優先権を主張する。
本出願は、引用されているすべての他の参考文献とともに本出願に参照により組み込まれる、２０２０年２月１３日付けで出願された米国特許出願第６２／９７６，２５５号の優先権を主張する。
【背景技術】
【0002】
本発明は、黒色腫の治療薬に関する。
【0003】
悪性黒色腫（ＭＭ）の発生率は、世界的に大変な速度で増加しており、米国では公衆衛生上の大きな問題となっている。２０１９年に、黒色腫の９６，４８０の新規症例が診断されると予想されている。アメリカ癌協会は、２０１９年に黒色腫が７２３０人の死亡の原因となると推定している。
【0004】
米国単独では、黒色腫の疾病率および死亡率の直接の費用が、２０１９年には８１億ドルを超えると推定されている。これは、家族に対する予想できない心理社会的影響、ならびに若年層を苦しめる黒色腫の能力を考慮した場合の生産性の全体的な損失を含んでいない。黒色腫の主な処置の選択肢が外科手術であり、患者に対する心理社会的影響は計り知れない。太陽紫外線放射への曝露、色白の皮膚、異形成母斑症候群、ならびに黒色腫の個人歴および家族歴は、黒色腫発症の主要な危険因子である。今日まで、日光への曝露を回避すること、ＳＰＦ１５以上の日焼け止めの使用、および任意の皮膚の異常の定期的な検査の推奨以外に高リスク群に提供される処置はない。
【0005】
ほとんどの場合、外科手術による治癒的アプローチを用いる非黒色腫皮膚癌（ＮＭＳＣ）の高度に効果的な処置の選択肢とは対照的に、黒色腫における治療効果は、表在性腫瘍の早期認識に完全に依存し、悪性腫瘍および腫瘍形成の分子挙動の知識および理解の高まりにより触発された、より良好な戦略およびより効果的な治療薬で前進するための基本的な重要性を強調する。
【0006】
そのため、黒色腫の改善された治療薬の必要性がある。
【発明の概要】
【0007】
２つの治療薬、オリゴペプチドＰ５およびＰ１４は、インビトロで複数の黒色腫細胞株に向けられる選択的細胞毒性であることが証明されている。これらのオリゴペプチドは、すべてのタイプの病原性メラノサイトおよび黒色腫の病期のための効果的な処置、ならびに皮膚癌の発症のリスクが高いすべての個体に費用効果的な予防薬を提供する。加えて、これらのオリゴペプチドは、高リスク群において発症する可能性がある任意の前癌病変または異形成母斑に対する予防薬として作用するために日焼け止め剤に処方することができる。
【0008】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明および添付の図面の検討で明らかになり、同様の参照指定は、図面全体で同様の特徴を表す。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図10】図１０～図１２は、図１０における表皮角化細胞、図１１におけるメラノサイト、および図１２における線維芽細胞のような健康で正常な皮膚細胞に向けられるＨＱの無差別的な毒性と比較したＰ５およびＰ１４の選択的細胞毒性を示す。
【発明を実施するための形態】
【0010】
序論
悪性黒色腫（ＭＭ）の発生率は、世界的に大変な速度で増加しており、米国では公衆衛生上の大きな問題となっている。２０１９年に、黒色腫の９６，４８０の新規症例が診断されると予想されている。アメリカ癌協会は、２０１９年に黒色腫が７２３０人の死亡の原因となると推定している。米国単独では、黒色腫の疾病率および死亡率の直接の費用が、２０１９年には８０億ドルを超えると推定されている。これは、多くの場合、主な処置の選択肢である手術の不確実性および不安を管理している家族および患者に対する予想できない心理社会的影響を含んでいない。さらに、若年層を苦しめる黒色腫の能力を考慮した場合の生産性の実質的な損失がある。黒色腫は、メラノサイトに由来し、皮膚で最も一般的である。紫外線放射（ＵＶＲ）への曝露は、皮膚免疫系の抑制、メラノサイト細胞分裂の誘導、フリーラジカル産生、およびメラノサイトＤＮＡの損傷を含む、多くの機構を通じて黒色腫の最も大きい誘導因子であるように思われる。
悪性黒色腫（ＭＭ）の発生率は、世界的に大変な速度で増加しており、米国では公衆衛生上の大きな問題となっている。２０１９年に、黒色腫の９６，４８０の新規症例が診断されると予想されている。アメリカ癌協会は、２０１９年に黒色腫が７２３０人の死亡の原因となると推定している。米国単独では、黒色腫の疾病率および死亡率の直接の費用が、２０１９年には８０億ドルを超えると推定されている。これは、多くの場合、主な処置の選択肢である手術の不確実性および不安を管理している家族および患者に対する予想できない心理社会的影響を含んでいない。さらに、若年層を苦しめる黒色腫の能力を考慮した場合の生産性の実質的な損失がある。黒色腫は、メラノサイトに由来し、皮膚で最も一般的である。紫外線放射（ＵＶＲ）への曝露は、皮膚免疫系の抑制、メラノサイト細胞分裂の誘導、フリーラジカル産生、およびメラノサイトＤＮＡの損傷を含む、多くの機構を通じて黒色腫の最も大きい誘導因子であるように思われる。
【0011】
日焼け歴がある人々における黒色腫発症のリスクは、そのような日焼け歴がない人々の２倍である。さらに、日焼けが生じる年齢は重要であると思われ、幼児期に発生した日焼けが最も高いリスクをもたらす。色素性乾皮症（ＤＮＡ修復機構の欠損およびＵＶＲ損傷に対する対応する過敏症により特徴づけられる遺伝子疾患）を有する患者は、特に日光に曝露した皮膚において黒色腫を発症するリスクが実質的に高い。日焼け用ベッドおよび太陽ランプなどの太陽以外のＵＶＲの他の源は、皮膚黒色腫を発症するリスクの上昇に関連している。
【0012】
症例の約２５％において、黒色腫は、先存する母斑に関連して発生する。リスクは、１１個から２５個の母斑を有する人々において約１．５倍高く（１０個以下の母斑と比較して）、母斑が２５個増加するごとに２倍になる。ほとんどの場合、外科的治癒が達成される、非黒色腫皮膚癌（ＮＭＳＣ）についての非常に効果的な処置選択肢とは対照的に、黒色腫における治療効果は、表在性腫瘍の早期認識に依存しており、早期検出の重要性およびより効果的な処置選択肢の必要性を強調している。
【0013】
過去１０年間、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路の改善された知識および癌発症におけるその意味は、Ｂ－ＲＡＦ、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）、およびＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ（ＭＥＫ）などの発癌性キナーゼの突然変異型を標的化する試みに繋がっている。Ｂ－ＲＡＦは、ＲＡＦキナーゼファミリーのメンバーであり、細胞の増殖、分化、および生存の調節に関与するＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路において作用する。３つのＲＡＦキナーゼ（Ａ－ＲＡＦ、Ｂ－ＲＡＦおよびＣ－ＲＡＦ）のうち、Ｂ－ＲＡＦのみが種々の癌において頻繁に突然変異する。エクソン１５のコドン６００でバリンをグルタミン酸に変更（Ｖ６００Ｅ）する単一塩基ミスセンス置換（ヌクレオチド１，７９９でのＴからＡ）は、メラノーマ腫瘍内の全ＢＲＡＦ突然変異の９０％を占める。この突然変異の結果は、野生型に対してキナーゼ活性における５００倍の増加であり、ＥＲＫシグナル伝達の構成的なアップレギュレーションおよびそれに続く無秩序な細胞増殖、細胞形質転換、および最終的な腫瘍開始に繋がる。
【0014】
現在まで、日光への曝露を回避すること、ＳＰＦ１５以上の日焼け止めの使用および定期的な検査の推奨以外に高リスク群に提供される予防的処置はない。この緊急の満たされていない医学的必要性を満たすために、インシリコでの分子モデリングを使用して両方のキナーゼＢ－ＲＡＦＶ６００ＥおよびＣ－ＲＡＦについて高親和性を有する一連の新規オリゴペプチドをスクリーニングし、それらを既知のキナーゼ阻害剤ソラフェニブおよびＰＬＸ４０３２と比較した。
【0015】
本明細書において、我々は、インビトロで複数の黒色腫細胞株に向けられる選択的細胞毒性であることが証明されている２つのオリゴペプチド、Ｐ５およびＰ１４の同定を説明する。我々の最終的な目標は、黒色腫のすべての病期のための効果的な処置、および皮膚癌の発症のリスクが高いすべての個体に費用効果的な予防薬を提供することである。加えて、これらのオリゴペプチドは、高リスク群において発症する可能性がある任意の前癌病変または異形成母斑に対する予防薬として作用するために日焼け止め剤に処方することができる。
【0016】
材料および方法
オリゴペプチドＰ５、Ｐ１４、およびＰ１５（図１）は、Ｂｉｏ Ｂａｓｉｃ，Ｉｎｃ．（オンタリオ、カナダ）により、固相ＦＭＯＣ化学を使用して合成された。
オリゴペプチドＰ５、Ｐ１４、およびＰ１５（図１）は、Ｂｉｏ Ｂａｓｉｃ，Ｉｎｃ．（オンタリオ、カナダ）により、固相ＦＭＯＣ化学を使用して合成された。
【0017】
【化1】
【0018】
ヒドロキノンをシグマ－アルドリッチ（セントルイス、ＭＯ）から購入した。
【0019】
ＢＲＡＦＶ６００ＥおよびＣＲＡＦ阻害剤の分子モデリング
野生型Ｂ－ＲＡＦ（ＰＤＢ ＩＤ：１ＵＷＨ、鎖Ａ）、突然変異Ｂ－ＲＡＦＶ６００Ｅ（ＰＤＢ ＩＤ：３Ｃ４Ｄ、鎖Ａ）およびＣ－ＲＡＦ（ＰＤＢ ＩＤ：３ＬＢ７、鎖Ａ）の酵素３－Ｄ Ｘ線結晶学構造を、ＰＤＢから得、ＡｕｔｏＤｏｃｋバージョン４．２．２．１およびＡｕｔｏＤｏｃｋ Ｖｉｎａバージョン１．０．３を使用してオリゴペプチドを酵素のＡＴＰ結合ポケットにドッキングした。ドッキング用に、不足している水素を置き換えること、水、ＮＯ３＋およびＣａ２＋イオンを除去すること、コールマン電荷を加えることならびにスイス－Ｐｄｂビュワーバージョン４．０．１およびＡｕｔｏＤｏｃｋＴｏｏｌｓバージョン１．５．４を使用してガスタイガー電荷を計算することにより、酵素を調製した。ＰｕｂＣｈｅｍ化合物データベースからソラフェニブおよびＰＬＸ４０３２構造を得た。ＰｙＭＯＬバージョン１．１ベータ３またはＡｖｏｇａｄｒｏバージョン１．０．０を使用して、ペプチドリガンドを作成し、「．ｐｄｂ」ファイルとして保存した。その後、Ｄｕｎｄｅｅ ＰＲＯＤＲＧ２サーバおよびＡｕｔｏＤｏｃｋＴｏｏｌｓを使用してリガンドを処理し、電荷およびねじれを決定した。各ペプチドには、すべての可能なねじれが許容されていた。これらの阻害剤のＢ－ＲＡＦＶ６００ＥおよびＣ－ＲＡＦへの結合モードを、分子ドッキングを通じて分析し、構造－活性関係が導き出された。
野生型Ｂ－ＲＡＦ（ＰＤＢ ＩＤ：１ＵＷＨ、鎖Ａ）、突然変異Ｂ－ＲＡＦＶ６００Ｅ（ＰＤＢ ＩＤ：３Ｃ４Ｄ、鎖Ａ）およびＣ－ＲＡＦ（ＰＤＢ ＩＤ：３ＬＢ７、鎖Ａ）の酵素３－Ｄ Ｘ線結晶学構造を、ＰＤＢから得、ＡｕｔｏＤｏｃｋバージョン４．２．２．１およびＡｕｔｏＤｏｃｋ Ｖｉｎａバージョン１．０．３を使用してオリゴペプチドを酵素のＡＴＰ結合ポケットにドッキングした。ドッキング用に、不足している水素を置き換えること、水、ＮＯ３＋およびＣａ２＋イオンを除去すること、コールマン電荷を加えることならびにスイス－Ｐｄｂビュワーバージョン４．０．１およびＡｕｔｏＤｏｃｋＴｏｏｌｓバージョン１．５．４を使用してガスタイガー電荷を計算することにより、酵素を調製した。ＰｕｂＣｈｅｍ化合物データベースからソラフェニブおよびＰＬＸ４０３２構造を得た。ＰｙＭＯＬバージョン１．１ベータ３またはＡｖｏｇａｄｒｏバージョン１．０．０を使用して、ペプチドリガンドを作成し、「．ｐｄｂ」ファイルとして保存した。その後、Ｄｕｎｄｅｅ ＰＲＯＤＲＧ２サーバおよびＡｕｔｏＤｏｃｋＴｏｏｌｓを使用してリガンドを処理し、電荷およびねじれを決定した。各ペプチドには、すべての可能なねじれが許容されていた。これらの阻害剤のＢ－ＲＡＦＶ６００ＥおよびＣ－ＲＡＦへの結合モードを、分子ドッキングを通じて分析し、構造－活性関係が導き出された。
【0020】
細胞培養
ヒトおよびマウスの黒色腫細胞株および線維芽細胞を、Ｌ－グルタミン、１０パーセントＦＢＳおよび１パーセントＰ／Ｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、ＮＹ）を有するＤＭＥＭを使用して培養した。ヒトメラノサイトを、ｍｅｄｉｕｍ２５４（サーモフィッシャーサイエンティフィック、ＮＹ）を使用して培養し、加湿５パーセントＣＯ２チャンバ内、摂氏３７度でインキュベートした。
ヒトおよびマウスの黒色腫細胞株および線維芽細胞を、Ｌ－グルタミン、１０パーセントＦＢＳおよび１パーセントＰ／Ｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、ＮＹ）を有するＤＭＥＭを使用して培養した。ヒトメラノサイトを、ｍｅｄｉｕｍ２５４（サーモフィッシャーサイエンティフィック、ＮＹ）を使用して培養し、加湿５パーセントＣＯ２チャンバ内、摂氏３７度でインキュベートした。
【0021】
ヒト新生児表皮角化細胞を、６０μＭの塩化カルシウムを含むＥｐｉｌｉｆｅ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック、ＮＹ）で培養した。すべての細胞培養物を、摂氏３７度および５パーセントＣＯ２の加湿チャンバ内でインキュベートした。
【0022】
生存率または増殖および細胞毒性アッセイ
ＴＡＣＳ（登録商標）ＭＴＴ細胞増殖キット（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ミネソタ）を使用して増殖率を測定した。摂氏３７度で５パーセントＣＯ２の加湿雰囲気中、細胞を１ウェルあたり２．５×１０４で９６ウェルプレートに播種した。２４時間後、オリゴペプチドまたはヒドロキノンを各種濃度（０．０３、０．１、０．３、１、および３ミリモル濃度（ｍＭ））で対応するウェルに添加し、培養物を７２時間インキュベートした。残りの手順は、メーカーのプロトコルに従って実行された。
ＴＡＣＳ（登録商標）ＭＴＴ細胞増殖キット（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ミネソタ）を使用して増殖率を測定した。摂氏３７度で５パーセントＣＯ２の加湿雰囲気中、細胞を１ウェルあたり２．５×１０４で９６ウェルプレートに播種した。２４時間後、オリゴペプチドまたはヒドロキノンを各種濃度（０．０３、０．１、０．３、１、および３ミリモル濃度（ｍＭ））で対応するウェルに添加し、培養物を７２時間インキュベートした。残りの手順は、メーカーのプロトコルに従って実行された。
【0023】
細胞毒性
トリパンブルー色素排除アッセイを使用して、細胞毒性を測定した。細胞を６ウェルプレート中、１ウェルあたり４×１０５の細胞密度で培養した。各ウェルは、異なる濃度のオリゴペプチドまたはＨＱ（０．０３、０．１、０．３、１、および３ミリモル濃度）を受けた。プレートを加湿５パーセントＣＯ２チャンバ内、摂氏３７度でインキュベートした。２４時間後、アリコートを採取し、血球計算盤を使用して細胞を数えた。細胞毒性を、以下の式：
トリパンブルー色素排除アッセイを使用して、細胞毒性を測定した。細胞を６ウェルプレート中、１ウェルあたり４×１０５の細胞密度で培養した。各ウェルは、異なる濃度のオリゴペプチドまたはＨＱ（０．０３、０．１、０．３、１、および３ミリモル濃度）を受けた。プレートを加湿５パーセントＣＯ２チャンバ内、摂氏３７度でインキュベートした。２４時間後、アリコートを採取し、血球計算盤を使用して細胞を数えた。細胞毒性を、以下の式：
【0024】
【数1】
【0025】
にしたがって測定した。
【0026】
インキュベーションの３日後および６日後に、同じ手順を繰り返した。
【0027】
結果：
ＰＬＸ４０３２およびソラフェニブは、我々の内部生成オリゴペプチドライブラリのインシリコスクリーニングのためのベンチマークとして作用した。結果としてキナーゼの立体構造変化および過剰活性化を誘導するＢ－ＲＡＦにおけるＶ６００Ｅ突然変異を包含する領域（活性化ループ）は、緑色で強調している（図２Ａおよび図２Ｂ）。図２はまた、ＡＴＰ結合ポケットを有するオリゴペプチドＰ１４（図２Ａ）とＰＬＸ４０３２（図２Ｂ）との重要な相互作用類似性にも関わらず、Ｐ１４が、活性化ループとのより密接な相互作用を示したことを示す。Ｐ１４は、いくらかの水素結合を形成し、疎水性相互作用と組み合わせて、ＡＴＰ結合ポケット内の重要な残基から２～３オングストローム内にそれを引き寄せた（図２Ｃ）一方で、ＰＬＸ４０３２の場合は３～４オングストロームであった（図２Ｄ）。
ＰＬＸ４０３２およびソラフェニブは、我々の内部生成オリゴペプチドライブラリのインシリコスクリーニングのためのベンチマークとして作用した。結果としてキナーゼの立体構造変化および過剰活性化を誘導するＢ－ＲＡＦにおけるＶ６００Ｅ突然変異を包含する領域（活性化ループ）は、緑色で強調している（図２Ａおよび図２Ｂ）。図２はまた、ＡＴＰ結合ポケットを有するオリゴペプチドＰ１４（図２Ａ）とＰＬＸ４０３２（図２Ｂ）との重要な相互作用類似性にも関わらず、Ｐ１４が、活性化ループとのより密接な相互作用を示したことを示す。Ｐ１４は、いくらかの水素結合を形成し、疎水性相互作用と組み合わせて、ＡＴＰ結合ポケット内の重要な残基から２～３オングストローム内にそれを引き寄せた（図２Ｃ）一方で、ＰＬＸ４０３２の場合は３～４オングストロームであった（図２Ｄ）。
【0028】
図３は、Ｃ－ＲＡＦのＡＴＰ結合ポケットとのＰ１４およびソラフェニブの分子ドッキング相互作用を示す。Ｐ１４は、ソラフェニブにより示されたもの（図３Ａ）と比較して、好ましい立体構造および強化された触媒ポケットへの結合（図３Ｂ）を示した。この利点は、好ましい水素結合および疎水性相互作用により促進される。我々の予備的な分子モデリングデータにより、２つのベンチマークであるソラフェニブおよびＰＬＸ４０３２と比較して、提案されたオリゴペプチドが突然変異Ｂ－ＲＡＦおよび野生型Ｃ－ＲＡＦの両方に匹敵するか改善されている親和性を保持しており、潜在的な開発候補としてさらなる研究を正当化することが示唆される。
【0029】
次に、我々は、ＭＴＴアッセイを実行し、Ｖ６００Ｅ ＢＲＡＦ突然変異を保持していることが以前示されているマウス黒色腫細胞およびヒト転移性黒色腫株の生存率および増殖に対するオリゴペプチドの効果について試験した。図４は、３ミリモル濃度のＰ５またはＰ１４との３日間のインキュベーションが、ＨＱの同じ期間のインキュベーション後で９０パーセントの細胞毒性と比較して、それぞれ４４パーセントまたは４９パーセントの細胞死となったことを示す。オリゴペプチドＰ１５は、３日間のインキュベーション後のわずかな細胞毒性効果のみを示した。
【0030】
図４はまた、細胞毒性効果が用量依存的であったことを示す。図５は、ヒト黒色腫細胞に対する細胞毒性効果を示す。１ミリモル濃度の濃度で、Ｐ５およびＰ１４は、ＨＱのほぼ８０パーセントの細胞毒性と比較して３６パーセントのほぼ類似の細胞毒性を示した。
【0031】
表１、２、および３は、ＨＱと比較したヒトメラノサイトおよび線維芽細胞の活力および生存率に対するＰ５およびＰ１４の効果を示す。１ミリモル濃度のＰ５およびＰ１４とのインキュベーションの７２時間後、細胞死はメラノサイトについてそれぞれ９パーセントおよび９パーセントであり、線維芽細胞についてそれぞれ３パーセントおよび６パーセントであった。他方で、１ミリモル濃度のＨＱでは、結果として、７２時間のインキュベーション後、メラノサイトおよび線維芽細胞の両方で、１００パーセントの細胞死となった。表は、オリゴペプチドＰ５およびＰ１４の選択的効果と比較してＨＱの無差別的な細胞毒性を明らかに示す。
【0032】
ＭＴＴアッセイにおいて観察された結果は、我々の予備的なインシリコモデリングデータと一致するように見えた。例えば、Ｐ１５は、Ｂ－ＲＡＦＶ６００ＥまたはＣ－ＲＡＦのいずれかのＡＴＰポケットにドッキングした場合、弱いインシリコ結合を、また黒色腫細胞の増殖および生存率に対する弱い効果を示した（図４および図５）。他方で、オリゴペプチドＰ５およびＰ１４は、ソラフェニブおよびＰＬＸ４０３２に匹敵する自由結合エネルギーを示した。まとめると、我々の知見は、インビトロでヒト転移性黒色腫株に向けられる潜在的な細胞毒性効果を有するオリゴペプチドを同定するためのスクリーニングツールとしての分子モデリングの使用を支持する。
【0033】
図６～図１１は、Ｐ５、Ｐ１４、およびＨＱがマウスおよびヒト黒色腫細胞に及ぼす細胞毒性効果を確認する。また一方、図１２～１４は、表皮角化細胞（図１２）、メラノサイト（図１３）、および線維芽細胞（図１４）のような健康で正常な皮膚細胞に向けられるＨＱの無差別的な細胞毒性と比較してＰ５およびＰ１４の選択的細胞毒性を示す。
【0034】
考察
オリゴペプチドＰ５およびＰ１４は、黒色腫細胞を選択的に死滅させることができるが、皮膚の主成分である正常なヒトメラノサイト、角化細胞、および線維芽細胞に向けられる非常に僅かから全くない細胞毒性を示す。他方でＨＱは、多くの細胞株に対して強力な非選択的細胞毒性剤である。我々は、いくらかの癌細胞株に対するその既知の細胞毒性効果のため、陽性対照としてＨＱを使用した。黒色腫細胞に対するＰ５およびＰ１４の選択性を強調するため、およびインシリコ分子モデリングのアウトプットを検証するために、オリゴペプチドＰ１５を陰性対照として使用した。Ｐ１５は、Ｂ－ＲＡＦＶ６００ＥまたはＣ－ＲＡＦのいずれかのＡＴＰポケットにドッキングした場合には弱いインシリコ結合を、Ｐ１５については弱い細胞毒性を示した（図４および図５）。他方で、オリゴペプチドＰ５およびＰ１４は、ソラフェニブおよびＰＬＸ４０３２に匹敵する自由結合エネルギーを示した。
オリゴペプチドＰ５およびＰ１４は、黒色腫細胞を選択的に死滅させることができるが、皮膚の主成分である正常なヒトメラノサイト、角化細胞、および線維芽細胞に向けられる非常に僅かから全くない細胞毒性を示す。他方でＨＱは、多くの細胞株に対して強力な非選択的細胞毒性剤である。我々は、いくらかの癌細胞株に対するその既知の細胞毒性効果のため、陽性対照としてＨＱを使用した。黒色腫細胞に対するＰ５およびＰ１４の選択性を強調するため、およびインシリコ分子モデリングのアウトプットを検証するために、オリゴペプチドＰ１５を陰性対照として使用した。Ｐ１５は、Ｂ－ＲＡＦＶ６００ＥまたはＣ－ＲＡＦのいずれかのＡＴＰポケットにドッキングした場合には弱いインシリコ結合を、Ｐ１５については弱い細胞毒性を示した（図４および図５）。他方で、オリゴペプチドＰ５およびＰ１４は、ソラフェニブおよびＰＬＸ４０３２に匹敵する自由結合エネルギーを示した。
【0035】
我々の知見は、インビトロでヒト転移性黒色腫株に向けられる潜在的な細胞毒性効果を有するオリゴペプチドを同定するためのスクリーニングツールとしての分子モデリングの使用を支持する。ＨＱとは異なり、Ｐ５およびＰ１４は、正常な皮膚細胞、メラノサイト、角化細胞、および線維芽細胞に向けられる最小の細胞毒性効果または全くない細胞毒性効果で、黒色腫細胞に向けられる選択的細胞毒性を示した。ＭＡＰＫ阻害は、アポトーシス促進性Ｂｃｌ－２ファミリーメンバー、Ｂａｄ、およびＢｉｍの脱リン酸化となることが示されている。これは、順に、カスパーゼ経路の活性化、最終的には、アポトーシスの誘導を通じた黒色腫細胞の死滅に繋がる。
【0036】
第１のＲＡＦキナーゼ標的薬であるソラフェニブが臨床試験に達した場合、期待は高かったが、黒色腫患者における初期研究は期待外れであり、予想される単剤有効性を示さなかった。ソラフェニブおよび類似の開発候補物にある問題は、それらの特異性の欠如である。さらに、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異を保持するメラノーマ腫瘍が、ソラフェニブ処置に対して抵抗性があることが認められ、低Ｂ－ＲＡＦ活性を有する腫瘍のみが薬物に感受性であったことを暗示した。この現象は、これらの腫瘍が、ＭＥＫ活性およびＢ細胞リンパ腫２媒介細胞生存のためにＣ－ＲＡＦに依存していることに起因している。したがって、９０パーセントを超える黒色腫が、Ｂ－ＲＡＦ過剰活性化を示すので、ごく僅かな割合の腫瘍のみが、ソラフェニブに応答する。興味深いことに、ソラフェニブは、後で、Ｃ－ＲＡＦキナーゼをより強力に阻害することが示された。
【0037】
ごく最近になって、Ｂ－ＲＡＦ結晶構造の分解により、ＰＬＸ４０３２などのより特異的なＢ－ＲＡＦ阻害剤の開発に繋がっている。この薬物は、第Ｉ相試験において劇的な反応速度を誘導し、Ｂ－ＲＡＦが臨床的に妥当な標的として確認した。残念なことに、近年、上昇したＣＲＡＦ遺伝子発現が、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異体黒色腫細胞においてＢ－ＲＡＦ阻害剤への抵抗性を媒介することが示されている。さらに、ＲＡＳ突然変異体黒色腫細胞において、Ｂ－ＲＡＦではなくこのキナーゼを通じて腫瘍形成性ＲＡＳが合図するので、Ｃ－ＦＡＲは必須である。これらの知見は、高度に標的化された特異的なＢ－ＲＡＦ阻害剤が、高いＣ－ＲＡＦ活性を有するＲＡＳ突然変異体黒色腫およびＢＲＡＦ突然変異体黒色腫の両方に対して効果がない可能性があることを示唆する。換言すると、上記の知見は、汎ＲＡＦ阻害の必要性を指摘する。
【0038】
ＢＲＡＦＶ６００Ｅの阻害が、メラノサイト分化抗原（ＭＤＡ）のレベルを高め、結果として、抗原特異性Ｔリンパ球による改善された認識となる発見は、同様に重要なものである。これは、抗原発現の喪失が、免疫療法後に再発に繋がるという知見により支持される。メラノサイト細胞は、その系統に特異的な遺伝子のセットを発現する。しかし、免疫療法に関して、ＭＡＲＴ１およびｇｐ１００を含むいくらかのメラノサイト遺伝子産物が、細胞毒性Ｔリンパ球の標的抗原として機能することが直接的に示されている。これにより、数人の研究者が、黒色腫細胞により低下したＭＤＡ発現が、インビボでの腫瘍監視の回避を容易にするという仮説を立てることに繋がる。したがって、特異性ＢＲＡＦＶ６００Ｅ阻害剤を介したＭＡＰＫシグナル伝達の封鎖およびそれに続くＭＤＡ発現の上昇は、進行性黒色腫についての免疫療法的アプローチとして大きな可能性を保持している可能性がある。
【0039】
我々のデータおよび以前の研究に基づいて、我々は、オリゴペプチド処置が、Ｂ－ＲＡＦＶ６００ＥおよびＣ－ＲＡＦ依存性ＭＡＰＫシグナル伝達を阻害し、対立しないカスパーゼ活性およびそれに続くアポトーシスに繋がることにより、また、ＭＤＡ発現を上昇させ、結果としてＭＡＲＴ１特異性およびｇｐ１００特異性自家Ｔリンパ球による改善された認識の可能性をもたらすことにより黒色腫の死滅を強化すると仮説を立てる。さらに、黒色腫の効果的な予防的処置の緊急の必要性に対処するのを支援するために、我々のアプローチは、Ｐ５またはＰ１４で処方された非侵襲的で非外科的な予防的局所処置を用いて高リスク群を標的化することである。これらのペプチドは、初期段階の表皮内黒色腫（ステージ０黒色腫）、上皮内癌（基底および扁平上皮癌）および日光に曝露された皮膚領域の任意の新たな異形成母斑の除去に対する潜在的で、費用効果的で有効な処置を証明する可能性がある。
【0040】
【表1】
【0041】
【表2】
【0042】
【表3】
【0043】
【表4】
【0044】
【表5】
【0045】
【表6】
【0046】
【表7】
【0047】
【表8】
【0048】
【表9】
【0049】
【表10】
【0050】
【表11】
【0051】
【表12】
【0052】
【表13】
【0053】
【表14】
【0054】
【表15】
【0055】
【表16】
【0056】
【表17】
【0057】
【表18】
【0058】
表は、オリゴペプチドＰ５およびＰ１４の選択的効果と比較してＨＱの無差別的な細胞毒性を明らかに示す。
【0059】
図４～９は、Ｐ５、Ｐ１４、およびＨＱがマウスおよびヒト黒色腫細胞に対して及ぼす細胞毒性効果を実証的に確認する。
【0060】
図４は、Ｐ５がマウス黒色腫に対して選択的細胞毒性である結果を示す。Ａにおいて、未処理のマウス黒色腫が示される。Ｂにおいて、３ミリモル濃度のＰ５で処理されたマウス黒色腫が示される。
【0061】
図５は、Ｐ５がヒト黒色腫に対して選択的細胞毒性である結果を示す。Ａにおいて、未処理のヒト黒色腫が示される。Ｂにおいて、３ミリモル濃度のＰ５で処理されたヒト黒色腫が示される。
【0062】
図６は、Ｐ１４がヒト黒色腫に対して選択的細胞毒性である結果を示す。Ａにおいて、未処理のヒト黒色腫が示される。Ｂにおいて、３ミリモル濃度のＰ１４で処理されたヒト黒色腫が示される。
【0063】
図７は、Ｐ１４がマウス黒色腫に対して選択的細胞毒性である結果を示す。Ａにおいて、未処理のマウス黒色腫が示される。Ｂにおいて、３ミリモル濃度のＰ１４で処理されたマウス黒色腫が示される。
【0064】
図８は、ＨＱがヒト黒色腫細胞に対して強力な非選択的細胞毒性剤である結果を示す。Ａにおいて、未処理のヒト黒色腫が示される。Ｂにおいて、３ミリモル濃度のＨＱで処理されたヒト黒色腫が示される。
【0065】
図９は、マウス黒色腫に向けられるＨＱの細胞毒性の結果を示す。Ａにおいて、未処理のＢ１６マウス黒色腫が示される。Ｂにおいて、１ミリモル濃度のＨＱで処理されたＢ１６マウス黒色腫が示される。
【0066】
図１０、図１１、および図１２は、それらが図１０における表皮角化細胞、図１１におけるメラノサイトおよび図１２における線維芽細胞のような健康で正常な皮膚細胞に向けられるＨＱの無差別的な毒性と比較してＰ５およびＰ１４の選択的細胞毒性を指摘しているので、極めて重要である。
【0067】
図１０は、ヒト表皮角化細胞に対するＰ５、Ｐ１４、およびＨＱの効果を示す。図は、３ミリモル濃度のＰ５を含むヒト表皮角化細胞、３ミリモル濃度のＰ１４を含むヒト表皮角化細胞、および３ミリモル濃度のＨＱを含むヒト表皮角化細胞を示す。
【0068】
図１１は、ヒドロキノンと比較したヒトメラノサイトに向けられるＰ５およびＰ１４の細胞毒性を示す。図は、ミリモル濃度のＰ５で処理されたヒトメラノサイト、３ミリモル濃度のＰ１４で処理されたヒトメラノサイト、およびミリモル濃度のＨＱで処理されたヒトメラノサイトを示す。
【0069】
図１２は、ヒドロキノンと比較したヒト線維芽細胞に向けられるＰ５およびＰ１４の細胞毒性を示す。図は、３ミリモル濃度のＰ５で処理されたヒト線維芽細胞、３ミリモル濃度のＰ１４で処理されたヒト線維芽細胞、および３ミリモル濃度のＨＱで処理されたヒト線維芽細胞を示す。
【0070】
上記の事実に基づいて、黒色腫の効果的な予防的処置の緊急の必要性に対処するのを支援するために、我々のアプローチは、黒色腫細胞株に向けられる選択的細胞毒性であることが証明されている我々のオリゴペプチド、Ｐ５およびＰ１４での非侵襲的で非外科的な予防的処置を用いて高リスク群を標的化することである。高リスク患者のスクリーニングは、費用効果的であり、生存率の改善に関連しているようである。色素性乾皮症、先天性巨大母斑、免疫抑制、家族性異型多発母斑黒色腫症候群、異常発現母斑、多数（５０を超える）母斑、変化する母斑、および黒色腫の家族歴を有する個体ならびに５０歳より高齢の男性は、医師による完全なベースラインおよび定期的なフォローアップ皮膚検査を受ける必要がある。
【0071】
さらに、これらのペプチドは、初期段階の表皮内黒色腫（ステージ０黒色腫）、上皮内癌（基底および扁平上皮癌）および日光に曝露された皮膚領域の任意の新たな異形成母斑の除去に対する潜在的で、費用効果的で有効な処置を証明する可能性がある。実施形態は、突然変異メラノサイト、前癌性メラノサイト、および黒色腫細胞を含む病理学的メラノサイトの細胞毒性を誘導するために使用することができる。
【0072】
本発明の本明細書は、図示および説明の目的で提示されている。それは、網羅的であること、または説明された正確な形態に本発明を限定することを意図しておらず、上記の教示に照らして多くの修正および変形が可能である。実施形態は、本発明の原理およびその実際の応用を最も良く説明するために選択され、説明された。本明細書は、他の当業者が特定の用途に適しているような種々の実施形態における、種々の修飾を有する本発明を最良に利用し、実行することを可能にする。本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲により定義される。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【国際調査報告】