知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-05
(54)【発明の名称】ウイルス封入のためのプログラム可能な殻
(51)【国際特許分類】
C12N 15/00 20060101AFI20230329BHJP
C12N 7/00 20060101ALI20230329BHJP
【ＦＩ】
C12N15/00 100Z
C12N7/00 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022550176
(86)(22)【出願日】2021-02-22
(85)【翻訳文提出日】2022-10-14
(86)【国際出願番号】 EP2021054307
(87)【国際公開番号】W WO2021165528
(87)【国際公開日】2021-08-26
(31)【優先権主張番号】20158577.5
(32)【優先日】2020-02-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517068553
【氏名又は名称】テクニッシェ ウニベルシタット ミュンヘン
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(72)【発明者】
【氏名】ヘンドリック ディーツ
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA95X
4B065CA23
4B065CA44
(57)【要約】
本発明は、ウイルス又はウイルス粒子を封入するための、ＤＮＡに基づくナノ構造などの、高分子に基づくナノ構造、本発明によるこのような高分子に基づくナノ構造によって封入されたウイルス又はウイルス粒子を含む組成物、及びこのような高分子に基づくナノ構造を用いることによりウイルス又はウイルス粒子を封入する方法に関する。
【選択図】図２７
【選択図】図２７
【特許請求の範囲】
【請求項1】
高分子に基づくナノ構造であって、前記高分子に基づくナノ構造は、ＤＮＡに基づく構築ブロックを自己組織化することにより形成されるＤＮＡに基づくナノ構造であり、
前記ナノ構造は、空洞にアクセスするための開口を有する殻であり、
前記自己組織化するＤＮＡに基づく構築ブロックの各々は、１本の一本鎖ＤＮＡテンプレート鎖及び前記一本鎖ＤＮＡテンプレートと相補的な一組のオリゴヌクレオチドにより形成され、
前記オリゴヌクレオチドの各々は、前記一本鎖ＤＮＡテンプレートの１つの近接ＤＮＡ配列区間か少なくとも２個の非近接ＤＮＡ配列区間のいずれかと相補的であり、
前記自己組織化するＤＮＡに基づく構築ブロックの各々は、三角形及び／又は四角形角柱、特に三角形角柱であり、並びに
１～１０か所の抗体に基づく結合部位が前記高分子に基づくナノ構造によって形成された前記空洞の内側部位に付着している、
高分子に基づくナノ構造。
【請求項2】
少なくとも１ＭＤａの分子量を有し、ウイルス又はウイルス粒子を封入するための少なくとも２０ｎｍの直径の空洞を包む、高分子に基づくナノ構造であって、前記高分子に基づくナノ構造は特にＤＮＡに基づくナノ構造である、高分子に基づくナノ構造。
【請求項3】
前記高分子に基づくナノ構造は、ＤＮＡに基づく構築ブロックを自己組織化することにより形成されるＤＮＡに基づくナノ構造であり、特に自己組織化する前記ＤＮＡに基づく構築ブロックの各々は、１本の一本鎖ＤＮＡテンプレート鎖及び前記一本鎖ＤＮＡテンプレートと相補的な一組のオリゴヌクレオチドにより形成され、前記オリゴヌクレオチドの各々は、前記一本鎖ＤＮＡテンプレートの１つの近接ＤＮＡ配列区間か又は少なくとも２個の非近接ＤＮＡ配列区間のいずれかと相補的である、請求項２に記載の高分子に基づくナノ構造。
【請求項4】
前記高分子に基づくナノ構造は、封入される前記ウイルス又はウイルス粒子の存在下その場で形成される、特に封入される前記ウイルス又はウイルス粒子の存在下で前記自己組織化するＤＮＡに基づく構築ブロックからその場で形成される、閉じた三次元幾何学的形状、特に球形、球面円柱形、及び多面体、特に四面体、八面体又は正二十面体から選択される閉じた三次元幾何学的形状である、請求項２又は３に記載の高分子に基づくナノ構造。
【請求項5】
前記高分子に基づくナノ構造は、前記空洞にアクセスするための開口を有する殻である、請求項２又は３に記載の高分子に基づくナノ構造。
【請求項6】
前記高分子に基づくナノ構造は、それぞれ第１及び第２の内部空洞にアクセスするための開口を有する第１及び第２の殻の組み合わせであり、前記第１及び第２の内部空洞はともに、前記空洞を形成し、特に前記第１及び第２の殻は、少なくとも１つのリンカーにより結合される、請求項２又は３に記載の高分子に基づくナノ構造。
【請求項7】
前記高分子に基づくナノ構造は、正二十面体構造に基づく、請求項２～６のいずれか一項に記載の高分子に基づくナノ構造。
【請求項8】
前記高分子に基づくナノ構造は、ＤＮＡに基づく構築ブロックを自己組織化することにより形成されるＤＮＡに基づくナノ構造であり、前記自己組織化するＤＮＡに基づく構築ブロックの各々は、三角形及び／又は四角形の角柱、特に三角形の角柱である、請求項７に記載の高分子に基づくナノ構造。
【請求項9】
各前記三角形及び／又は四角形の角柱は、それぞれｍ個の三角形、又は四角形の平面から形成され、ｍは、４、５、６、７及び８から独立して選択される、特に５、６及び７から独立して選択される整数であり、さらに特に前記整数は６であり、前記ｍ個の平面の各々の、それぞれ３個、又は４個の辺は、ＤＮＡ二重らせんのｎ個の平行区間により形成され、ｎは、１、２、３、４、５及び６から独立して選択される、特に２、３、４及び５から独立して選択される、さらに特に３及び４から独立して選択される整数であり、
各平面は、前記平面上の平面及び／又は前記平面下の平面と、（ｉ）前記平面を形成する前記ＤＮＡ二重らせん間のスタッキング相互作用により、及び（ｉｉ）前記平面の少なくとも２個を架橋する前記ＤＮＡに基づく構築ブロックを形成する前記一本鎖ＤＮＡテンプレート及び／又は前記オリゴヌクレオチド内部のＤＮＡ区間により部分的に結合され、並びに
それぞれ前記３個又は４個の側部の台形のうち少なくとも２個は、前記自己組織化するＤＮＡに基づく構築ブロックの別の１つの側部の台形上の相補的パターンと特異的相互作用をするための欠損した又は追加のＤＮＡ二重らせん区間により形成される特定のパターンのくぼみ及び／又は突出を含む、
請求項１又は８に記載の高分子に基づくナノ構造。
【請求項10】
前記自己組織化するＤＮＡに基づく構築ブロックの少なくとも一部については、前記ｍ個の平面の各々の少なくとも１つの辺の長さは、第１の平面から第ｍの平面まで減少しており、その結果前記第１の平面に垂直な平面と前記ｍ個の辺によって形成される台形平面の各々との間に斜角が生じる、請求項９に記載の高分子に基づくナノ構造。
【請求項11】
それぞれ全ての３個、又は４個の側部の台形は、前記自己組織化するＤＮＡに基づく構築ブロックの別の１つの側部の台形上の相補的パターンと特異的相互作用をするための欠損した又は追加のＤＮＡ二重らせん区間により形成される特定パターンのくぼみ及び／又は突出を含む、請求項９又は１０に記載の高分子に基づくナノ構造。
【請求項12】
前記殻の、又は前記第１及び第２の殻のそれぞれの縁を形成する自己組織化するＤＮＡに基づく構築ブロックの側部の台形は、前記自己組織化するＤＮＡに基づく構築ブロックの別の１つの側部の台形上の相補的パターンと特異的相互作用をするための欠損した又は追加のＤＮＡ二重らせん区間により形成される特定パターンのくぼみ及び／又は突出を含まない、請求項９又は１０に記載の高分子に基づくナノ構造。
【請求項13】
前記高分子に基づくナノ構造は、ＤＮＡに基づくナノ構造であり、前記ＤＮＡに基づくナノ構造は、（ａ）１組の４コピーの三角形切頭体から成る、半分の八面体であって、前記三角形切頭体の三角形の辺の１つに対する塩基対スタッキングが、鎖短縮によるか不対のチミジンを加えることによるかのいずれかにより不活性化される、半分の八面体、
（ｂ）各々の場合において２組の５コピーの２種類の異なる三角形切頭体から成る、半分のＴ＝１殻であって、第１の組の５コピーが閉じた５量体を形成し、そして第２の組の５コピーが前記５量体の辺上に結合する、半分のＴ＝１殻、及び
（ｃ）各々の場合において３組の５コピーの３種類の異なる三角形切頭体から成る、五角形の１つの頂点が欠けた「捕捉」Ｔ＝１殻であって、第１の組の５コピーが閉じた５量体を形成し、第２の組の５コピーが前記５量体の辺上に結合し第２の組の５コピーが前記５量体の辺上に結合し、そして第３の組の５コピーが前記第２の組の５コピー間の間隙へと結合する、「捕捉」Ｔ＝１殻
から選択される殻である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の高分子に基づくナノ構造。
【請求項14】
（ａ）１つ又は複数の種類のＤＮＡブリック構築物であって、このようなＤＮＡブリック構築物の各々の種類は、前記ＤＮＡに基づくナノ構造の外面上の三角形又は四角形切頭体の平面上に存在する１つ又は複数の相補的相互作用部位との辺対辺のスタッキング接触による特異的相互作用をするための１つ又は複数の相互作用部位によって特徴づけられ、前記ＤＮＡブリック構築物は、前記平面のそれぞれ３個、又は４個の辺間の自遊空間を覆う、１つ又は複数の種類のＤＮＡブリック構築物、（ｂ）前記三角形又は四角形切頭体の１つの内部の、及び／若しくは前記三角形及び／若しくは四角形切頭体のうち２個の間の１つ又は複数の架橋結合、並びに／又は
（ｃ）前記ウイルス又はウイルス粒子と特異的に相互作用する少なくとも１つの部分
をさらに含む、請求項８～１３のいずれか一項に記載の高分子に基づくナノ構造。
【請求項15】
請求項１～１４のいずれか一項に記載の高分子に基づくものによって封入されたウイルス又はウイルス粒子を含む組成物。
【請求項16】
ウイルス又はウイルス粒子を封入する方法であって、請求項１～１４のいずれか一項に記載の高分子に基づくナノ構造を提供するステップ、及び前記高分子に基づくナノ構造を前記ウイルス又はウイルス粒子を含む、又は含むと疑われる培養液と接触させるステップを含む、ウイルス又はウイルス粒子を封入する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ウイルス又はウイルス粒子を封入するための、ＤＮＡに基づくナノ構造などの、高分子に基づくナノ構造と、本発明によるこのような高分子に基づくナノ構造などによって封入されたウイルス又はウイルス粒子を含む組成物、及びこのような高分子に基づくナノ構造を用いることによりウイルス又はウイルス粒子を封入する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ウイルス感染症は、世界的に毎年数百万人の死亡や、計り知れない苦痛及び罹患率を引き起こし、社会及び経済に医療費の巨額の失費を課し、休業や、そして両親、子供、及び介護者を亡くすこと又は非難と結びつくメンタルヘルスの問題などの他の容易に測定できない負担を引き起こしている。気候変動及び世界規模の移動が、ウイルスの大流行の脅威を増大させると予想されるのは、従来寒すぎて生き延びることができなかった地域にも媒介物が伝搬するからである。ウイルス感染症の負担は、ヒトによる生息地の浸食、人口密度の増加による都会化及び巨大都市、地方的だけでなく遠方への旅行の増加、並びに疾患出現の多数の他の推進物によりさらに増えるだろう（１）。ウイルスは、その短い世代時間及び遺伝的変動が急速な進化を助けるため、新しい環境条件にとても適応しやすい病原体クラスである（２）。大多数のウイルス性疾患では（現在のＷＨＯ記載ウイルスの～７０％）、有効な治療が得られない。少数の現存している抗ウイルス療法は、ほとんど独占的に特定のウイルスを標的にし、新しく出現する病原体に対する適用はない。加えて、抗ウイルス療法は典型的には、効果的であるためには感染後早急に、ウイルス量が高くなりすぎて病徴を引き起こす前に開始される必要があるという課題に直面している。新興のウイルスの脅威には、迅速な応答が必要とされるが、広く適用できる既製の抗ウイルス薬は存在しない。
【0003】
これに関して、現代の抗ウイルス療法の働き方がどのようになっているかを最初に検討するのは有用である。現存している抗ウイルス薬は、ウイルスの複製及び伝播を可能とするウイルス特異的タンパク質、主にポリメラーゼ、又は必須ウイルス又は細胞構造のいずれかを標的とする。ウイルス増殖サイクルにおける主要な標的とすることができるステップは、（１）ウイルス粒子が宿主細胞の細胞膜に結合すること；（２）宿主細胞への取り込み；（３）ウイルスカプシドの細胞質への放出及びウイルスゲノムの複製スポットへの輸送；（４）ウイルス核酸及びタンパク質の合成並びにウイルスタンパク質の翻訳後プロセシング；（５）ウイルス成分の新しいウイルス粒子への集合；（６）新しく形成されたウイルスの感染細胞からの放出である。多くの臨床的に利用可能な抗ウイルス薬は、ある一定のウイルス酵素に特異的であるポリメラーゼ阻害剤である。例としては、単純ヘルペスウイルス及び水痘・帯状疱疹ウイルスに対して活性がある、アシクロビル（３）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）及びＨＩＶに対して活性がある、テノホビル及びＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対して活性がある、ソホスブビルが挙げられる。ウイルス生活環の異なる段階を標的とする薬物の例は、ＨＩＶ融合（段階２）を阻害する、エンフビルチド（４）、Ａ型インフルエンザウイルス脱穀（段階３）を阻害する、アマンタジン（５）又は宿主細胞からのインフルエンザウイルス放出（段階６）を妨害する（６）、ノイラミニダーゼ阻害剤オセルタミビル（６）である。これらの薬物は、しかしながら、ウイルスが増殖し、伝播している場合にのみ作用することができるが、ウイルスを死滅させたり中和したりすることはできない。これらの抗ウイルス薬で広く適用できるものはない。
【0004】
近年、星型デザイナーＤＮＡナノ構造が、空間パターン認識特性を有する複数の結合モチーフを示すためのテンプレートとして示されており、これはデング熱（ＤＥＮＶ）ウイルス表面を感知し、ウイルス抑制能力を与える（Ｋｗｏｎら、（５６））。分子プラットフォーム設計戦略は、カスタマイズされたＤＮＡナノ構造に基づいて必要なリガンドパターンを作成することにより他の疾患発症性の病原体を検出し、戦うよう適合される可能性があると述べられるが、必要とされるヘアピン相互作用が形成されるのを防ぐための最適な形状同一性がなければ、感知及び抑制能力が低下するので、正確で、多価のパターン認識特性を有する既定のＤＮＡナノ構造が必要とされるとも述べられる。したがって、この提案は、このごろコロナウイルスで見られる、新しいウイルスが出現する場合に必要とされるなどの、異なる又はまだ性質不明のウイルス粒子を標的とする一般的に適用できる手法を提供しないように思われる。その上、いくぶん開いた構造のナノ構造は、ウイルスカプシドタンパク質がまだ突出できるかもしれず、免疫学的に活性である及び／又はウイルス感染プロセスの引き金を引くことができるかもしれない危険を帯びる。
【0005】
従来特定の空洞を含有する多くのさらなるオリゴヌクレオチドに基づくナノ構造が開発されてきた。中国特許第１１０ ２７２ ９８０号明細書は、三叉神経（ｔｒｉｇｅｍｉｎａｌ）構造を有するＤＮＡモノマーから作製されたコア殻構造を記載し、作成された球状構造は、ｍｉＲＮＡ分子を検出するために用いられる。米国特許第２０１８／０１６５６９号明細書は、空洞、いわゆるナノケージを含むＤＮＡに基づくナノ構造を記載する。国際出願２０１７／０４９１３６号明細書は、核酸又はペプチド用の結合配列を含む空洞を有する球形状を有する、円柱状核酸ナノ構造を記載する。国際出願２０１３／１４８１８６号明細書は、治療薬を封入するために用いられる脂質コーティングを有する完全な核酸コアナノ構造を記載する。国際出願２０１７／１８９８７０号明細書は、さまざまな幾何学的形状を有する核酸ナノ構造を記載する。Ｌｉら（５７）は、ＤＮＡの球状ナノ構造を記載する。これらの全ての場合において、これらの構造に含まれる空洞は、はるかに小さすぎてウイルスを完全に首尾よく封入することを可能にしない及び／又は構造が開きすぎて、その結果ウイルスの表面タンパク質がまだ宿主の標的細胞構造と相互作用できるかもしれない。
【0006】
過去の２、３週間でＣｏｖｉｄ－１９のゲノムなどの、ウイルスのゲノムは頻繁に変異を示すことが分かり、ワクチン接種などの治療選択肢の成功が減少する、又は潜在的に消滅しさえすることができる。したがって、例えば一定のウイルスの感染力に関して新しい新興の発生に対する迅速な適応を可能にする治療介入の必要性が高い。上で述べた手法はいずれも、ウイルスの変異的変化に対する構造の迅速な適応を可能にするのに充分モジュール式かつ柔軟ではない。
【0007】
したがって、今までウイルス感染症の治療のためのさまざまな戦略が開発され、提案されてきたが、多様なウイルス病原体を標的とする一般的な抗ウイルス薬プラットフォームの概念の開発に対する必要性がまだある。特に、標的ウイルスの遺伝学及び特性についての事前の詳細な知識に依存しない概念は非常に望まれる。
【発明の概要】
【0008】
ウイルス又はウイルス粒子の封入を可能にする構築物を提供することが、本発明の目的である。この問題の解決策、すなわち、ＤＮＡに基づくナノ構造などの、高分子の構築ブロックの使用は、従来技術によってまだ教授されておらず、提案されていない。
【0009】
したがって、１つの態様において、本開示は、ウイルス又はウイルス粒子を封入するための少なくとも２０ｎｍの直径を有する空洞を囲む高分子に基づくナノ構造を提供する。
【0010】
特定の実施形態において、本開示は、ＤＮＡに基づくナノ構造である、高分子に基づくナノ構造を提供する。
【0011】
別の態様において、本開示は、本発明による高分子に基づくナノ構造によって封入されるウイルス又はウイルス粒子を含む組成物を提供する。
【0012】
さらに別の態様において、本開示は、ウイルス又はウイルス粒子を封入する方法であって、この方法は、本発明による高分子に基づくナノ構造を提供するステップ、及びこの高分子に基づくナノ構造をこのウイルス又はウイルス粒子を含む、又は含むと疑われる培養液と接触させるステップを含む、方法を提供する。
【0013】
本開示は、前述の態様及び／又は実施形態のいずれか１つ又は複数の全ての組み合わせ、並びに詳細な説明及び実施例に記載されている実施形態のいずれか１つ又は複数との組み合わせを想定する。
【0014】
本明細書の組成物及び方法の他の特徴、目的及び利点は、説明及び図面から、及び請求項から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】図１は、設計原理を示す。（Ａ）正二十面体殻の三角形分割数。各々の有色の三角形は、正二十面体を形成する２０個の面の１つを表す。小さな三角形は、三角形の構築ブロックを表す。（ｈ，ｋ）は、殻内部の５量体の位置を示す。（Ａａ）ウイルスカプシドを封入する正二十面体殻。（Ｂ）自然の正二十面体ウイルス殻。左、同一のサブユニットから構築されたＴ＝１殻（ＭＶＭ）（２２）。右、３種類の様々なサブユニットの複数のコピーから構築されたＴ＝３殻（ＣＣＭＶ）（２３）。（Ｃ）シミュレーションの開始時（左）及び終了時（右）の例示的な殻サブユニット設計プロトタイプのＥＮＲＧ－ＭＤシミュレーション（３８）。（Ｄ及びＥ）。ＤＮＡオリガミ三角形の円柱モデル及び対応する殻。三角形の側部は、突出（明）及びくぼみ（暗）で修飾される。矢印は、形状相補的な側部を示す。各殻の設計については、２０個の正二十面体の面の１つが置換されている（（Ａ）を参照）。αは、側部の斜角であり、＃は、殻を構築するＤＮＡオリガミ三角形の数である（設計の詳細は、図３６～３９を参照）
【図2】図２は、殻及び殻サブユニットの構造を示す。（Ａ）独立した氷中の（Ｏ，Ｔ＝１）及び炭素サポートを備えるレースカーボングリッド上の（Ｔ＝３，Ｔ＝４）集合した殻のＣｒｙｏ－ＥＭ顕微鏡写真。（Ｂ～Ｅ）殻サブユニット及び完全に集合した殻のＣｒｙｏ－ＥＭ再構成画像（八面体からＴ＝４殻）。二次元クラス平均は、様々な配向からの集合した殻を示す。（Ｆ）Ｔ＝９殻設計のＥＭ検証。左上、３個の三角形をＴ＝９殻に集合したｃｒｙｏ－ＥＭ再構成画像。右上、集合した殻のネガティブ染色ＥＭ顕微鏡写真。下、モデル殻によるスライスのＥＭ傾斜シリーズから算出した断層像のスライスに対する比較。矢印は、殻内部の５量体の位置を示す。
【図3】図３は、殻の収率及び安定性を示す。（Ａ）様々な時点でモノマー濃度５ｎＭ、４０℃での八面体、Ｔ＝１、Ｔ＝３及びＴ＝４殻の集合体を示す０．５％アガロースゲルのレーザー走査蛍光画像。実線は、１ｄサンプルからの断面レーン強度プロファイルを示す。（Ｂ）三角形変換実験。シアン：ＦＲＥＴペア標識Ｔ＝１殻。オレンジ：非標識の殻。記号は、測定されたＦＲＥＴシグナル対指示された濃度のＭｇ２＋の存在下のインキュベーション時間を示す。エラーバーは、２回測定値のＳＥＭである（設計詳細は図４４を参照）。（Ｃ）左：塩基対スタッキング部位に配置されたＣＮＶＫ部分を用いた殻の共有結合的安定化の模式図。右：殻サンプルを、殻不安定化条件下（低い塩、５ｍＭ Ｍｇ２＋）で電気泳動した０．５％アガロースゲルのレーザー走査蛍光画像。左から右：マーカーレーン、非照明Ｔ＝１殻（分解）、３６５ｎｍ光で３０分間照明したサンプル（未変化のまま）、共有結合を元に戻すために３１０ｎｍ光で１分間さらに照明した３６５照明サンプル（分解）。Ｓ＝サブユニット。Ｃ＝完全な殻。Ｐ＝ポケット。（Ｄ）オリゴリジンとオリゴリジン－ＰＥＧの１：１混合物でコーティングされ、３７℃の５５％マウス血清中で１時間及び２４時間インキュベートされた八面体殻のネガティブ染色ＴＥＭ画像。
【図4】図４は、部分的殻集合体のプログラミング及びウイルスカプシドの捕捉を示す（ここで：Ｂ型肝炎ウイルスコア粒子（ＨＢＶ））。（Ａ～Ｃ）ＤＮＡオリガミ三角形の円柱モデル及び対応する部分的殻。三角形の側部は、突出及びくぼみで修飾される。矢印は、形状相補的な側部を示す。白い十字形は、不活性化された相互作用部位を示す。（Ｄ～Ｆ）五角形の１つの頂点を取り除いた半分の八面体（Ｄ）、半分のＴ＝１殻（Ｅ）及びＴ＝１殻（Ｆ）のＣｒｙｏ－ＥＭ３Ｄ再構成画像。矢印は、ウイルス結合部分を取り付けるための固定部位から生じる密度を示す。（Ｇ）ＨＢＶコア粒子のＣｒｙｏ－ＥＭ再構成画像（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ識別子ＥＭＤ－０２７１）。（Ｈ）左：ＨＢＶコア粒子が捕捉された八面体ＤＮＡ殻のｃｒｙｏ ＥＭマップの切断。ＨＢＶコア粒子周囲の密度は、ＨＢＶコア粒子を八面体殻に結合する抗体の層に起因する。右：捕捉されたＢ型肝炎ウイルス粒子を配位する２個の八面体半分の殻のＣｒｙｏ－ＥＭ再構成画像。（Ｉ）左：（Ｈ）と同様のマップの切断。電子密度の閾値が異なり、これにより半分の八面体に捕捉された場合と比較して、Ｔ＝１半分の殻中のＨＢＶコア粒子は厚く見える。右：ＨＢＶコア粒子を飲み込む半分のＴ＝１殻のＣｒｙｏ－ＥＭ再構成画像。最大３個のＨＢＶコア粒子を飲み込む五角形の１つの頂点が欠けたＴ＝１殻のネガティブ染色ＴＥＭ画像。（Ｋ）あらかじめ集合された１ｎＭオリゴヌクレオチド結合捕捉抗体と様々な濃度の半分のＴ＝１殻の混合物とインキュベートした２．５ｐＭ ＨＢＶコア粒子の生体外ウイルス遮断ＥＬＩＳＡ実験。エラーバーは、３回の実験の標準偏差である。
【図5-1】図５は、三角形サブユニットの設計原理を示す。（Ａ）斜角αを有するＴ＝１三角形設計の模式図。（Ｂ）斜角無し（左）及び有り（右）での正方格子充填の４ｘ６らせんから成る三角形側部の断面図。側部は、「０」で示される最長らせん周囲に回転される。Ｄは、２個の隣接するらせん（２．６ｎｍ）の中心間の距離であり、ｘはいずれかのらせんとらせん「０」とのラジアル距離である。塩基対のｎｍを変換するために、塩基対あたり０．３４ｎｍの増加を用いた。（Ｃ及びＤ）らせん長の計算を示す模式図。左、三角形の円柱モデル。中央、らせん「０」までの距離ｘに応じた三角形内部の様々ならせんの長さａ（ｘ）及びｂ（ｘ）の模式図。右、個別のらせんの長さの差を計算するための公式。（Ｅ）三角形構造を経由するスキャフォールド。左、スキャフォールドは、次の層に結合する前に三角形全体周りにループを形成する。右、各角は、特定のスキャフォールドドメインによって構築され（様々な青）、１回のクロスオーバーによってのみ隣接する角に結合される（赤）。（Ｆ）（４６）による初期折り畳み選別を示す０．５ｘＴＢＥ緩衝液及び５．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する１．５％アガロースゲル。（Ｇ）（Ｂ）において点線の四角によって示される２個のレーンの統合レーン特性。Ｔ＝１ｌｏｏｐは、多くの凝集体を形成し、三角形はあまり良く形成されない。スキャフォールドをＴ＝１ｃｏｒｎｅｒを経由するよう変更すると、折り畳み収率が明白に改善される。したがって、本研究で示される全ての三角形は、Ｔ＝１ｃｏｒｎｅｒを経由させてスキャフォールドを改善して設計される。Ａ：奇形の凝集体、Ｍ：正しく折り畳まれたモノマー。（Ｈ）＋（Ｉ）第１の４個のらせんのためにスキャフォールド鎖を例示的に経由するＴ＝１三角形の円柱モデル。（Ｈ）スキャフォールドは、次のらせんに結合する前に三角形全体周りにループを形成する。（Ｉ）各角は、特定のスキャフォールドドメインによって構築され（様々な青）、１回のクロスオーバーによってのみ隣接する角に結合される（赤）。
【図5-2】図５は、三角形サブユニットの設計原理を示す。（Ａ）斜角αを有するＴ＝１三角形設計の模式図。（Ｂ）斜角無し（左）及び有り（右）での正方格子充填の４ｘ６らせんから成る三角形側部の断面図。側部は、「０」で示される最長らせん周囲に回転される。Ｄは、２個の隣接するらせん（２．６ｎｍ）の中心間の距離であり、ｘはいずれかのらせんとらせん「０」とのラジアル距離である。塩基対のｎｍを変換するために、塩基対あたり０．３４ｎｍの増加を用いた。（Ｃ及びＤ）らせん長の計算を示す模式図。左、三角形の円柱モデル。中央、らせん「０」までの距離ｘに応じた三角形内部の様々ならせんの長さａ（ｘ）及びｂ（ｘ）の模式図。右、個別のらせんの長さの差を計算するための公式。（Ｅ）三角形構造を経由するスキャフォールド。左、スキャフォールドは、次の層に結合する前に三角形全体周りにループを形成する。右、各角は、特定のスキャフォールドドメインによって構築され（様々な青）、１回のクロスオーバーによってのみ隣接する角に結合される（赤）。（Ｆ）（４６）による初期折り畳み選別を示す０．５ｘＴＢＥ緩衝液及び５．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する１．５％アガロースゲル。（Ｇ）（Ｂ）において点線の四角によって示される２個のレーンの統合レーン特性。Ｔ＝１ｌｏｏｐは、多くの凝集体を形成し、三角形はあまり良く形成されない。スキャフォールドをＴ＝１ｃｏｒｎｅｒを経由するよう変更すると、折り畳み収率が明白に改善される。したがって、本研究で示される全ての三角形は、Ｔ＝１ｃｏｒｎｅｒを経由させてスキャフォールドを改善して設計される。Ａ：奇形の凝集体、Ｍ：正しく折り畳まれたモノマー。（Ｈ）＋（Ｉ）第１の４個のらせんのためにスキャフォールド鎖を例示的に経由するＴ＝１三角形の円柱モデル。（Ｈ）スキャフォールドは、次のらせんに結合する前に三角形全体周りにループを形成する。（Ｉ）各角は、特定のスキャフォールドドメインによって構築され（様々な青）、１回のクロスオーバーによってのみ隣接する角に結合される（赤）。
【図6】図６は、八面体三角形のｃｒｙｏ－ＥＭ再構成画像を示す。（Ａ）独立した氷中の八面体三角形のＣｒｙｏ－ＥＭ顕微鏡写真。（Ｂ）様々な配向を示す二次元クラス平均。（Ｃ）解像度推定のために用いられた異なるＦＳＣ曲線を示すグラフ。（Ｄ）様々な視野角から示される電子密度マップ。
【図7】図７は、Ｔ＝１三角形のｃｒｙｏ－ＥＭ再構成画像を示す。（Ａ）独立した氷中のＴ＝１三角形のＣｒｙｏ－ＥＭ顕微鏡写真。（Ｂ）様々な配向を示す二次元クラス平均。（Ｃ）解像度推定のために用いられた異なるＦＳＣ曲線を示すグラフ。（Ｄ）様々な視野角から示される電子密度マップ。
【図8】図８は、Ｔ＝３三角形のｃｒｙｏ－ＥＭ再構成画像を示す。（Ａ）独立した氷中のＴ＝３三角形のＣｒｙｏ－ＥＭ顕微鏡写真。（Ｂ）様々な配向を示す二次元クラス平均。（Ｃ）解像度推定のために用いられた異なるＦＳＣ曲線を示すグラフ。（Ｄ）様々な視野角から示される電子密度マップ。
【図9】図９は、Ｔ＝４三角形Ｔｅｑｕｉのｃｒｙｏ－ＥＭ再構成画像を示す。（Ａ）独立した氷中のＴｅｑｕｉ三角形のＣｒｙｏ－ＥＭ顕微鏡写真。（Ｂ）様々な配向を示す二次元クラス平均。（Ｃ）解像度推定のために用いられた異なるＦＳＣ曲線を示すグラフ。（Ｄ）様々な視野角から示される電子密度マップ。
【図10】図１０は、Ｔ＝４三角形Ｔｉｓｏのｃｒｙｏ－ＥＭ再構成画像を示す。（Ａ）独立した氷中のＴｉｓｏ三角形のＣｒｙｏ－ＥＭ顕微鏡写真。（Ｂ）様々な配向を示す二次元クラス平均。（Ｃ）解像度推定のために用いられた異なるＦＳＣ曲線を示すグラフ。（Ｄ）様々な視野角から示される電子密度マップ。
【図11】図１１は、Ｔ＝９三角形Ｔｐｅｎｔのｃｒｙｏ－ＥＭ再構成画像を示す。（Ａ）独立した氷中のＴｐｅｎｔ三角形のＣｒｙｏ－ＥＭ顕微鏡写真。（Ｂ）様々な配向を示す二次元クラス平均。（Ｃ）解像度推定のために用いられた異なるＦＳＣ曲線を示すグラフ。（Ｄ）様々な視野角から示される電子密度マップ。
【図12】図１２は、Ｔ＝９三角形Ｔｈｅｘ１のｃｒｙｏ－ＥＭ再構成画像を示す。（Ａ）独立した氷中のＴｈｅｘ１三角形のＣｒｙｏ－ＥＭ顕微鏡写真。（Ｂ）様々な配向を示す二次元クラス平均。（Ｃ）解像度推定のために用いられた異なるＦＳＣ曲線を示すグラフ。（Ｄ）様々な視野角から示される電子密度マップ。
【図13】図１３は、Ｔ＝９三角形Ｔｈｅｘ２のｃｒｙｏ－ＥＭ再構成画像を示す。（Ａ）独立した氷中のＴｈｅｘ２三角形のＣｒｙｏ－ＥＭ顕微鏡写真。（Ｂ）様々な配向を示す二次元クラス平均。（Ｃ）解像度推定のために用いられた異なるＦＳＣ曲線を示すグラフ。（Ｄ）様々な視野角から示される電子密度マップ。
【図14】図１４は、Ｔｈｅｘ１の折り畳み欠陥の修正を示す。（Ａ）角を固定したＴｈｅｘ１三角形の設計図。（Ｂ）設計図の２個のバージョン間の差を示す壊れた角の位置での拡大図。（Ｃ及びＤ）２個のＴｈｅｘ１三角形のバージョンのＣｒｙｏ－ＥＭマップ。矢印は、壊れた角の位置を示す。（Ｅ）Ｔｐｅｎｔ及びＴｈｅｘ１三角形の二量化を示す異なるＭｇＣｌ２濃度の１．５％アガロースゲル。２個の三角形の結合に関与しない全ての側部は、スタッキング接触でポリＴ伸長により不動態化された。壊れた角は、スタッキング接触の欠損により２個の三角形が互いに結合するのを妨げたが、角を修復した三角形はＴｐｅｎｔと結合し、二量体に集合する。レーン１：Ｔｐｅｎｔ＋Ｔｈｅｘ１（壊れた角）、レーン２：Ｔｐｅｎｔ＋Ｔｈｅｘ１（修復した角）。Ｄ：二量体、Ｍ：モノマー。
【図15】図１５は、１７．５ｍＭ ＭｇＣｌ２で集合した八面体のＣｒｙｏ－ＥＭ再構成画像を示す。（Ａ）１７．５ｍＭ ＭｇＣｌ２での独立した氷中の八面体のＣｒｙｏ－ＥＭ顕微鏡写真。（Ｂ）様々な配向を示す二次元クラス平均。（Ｃ）解像度推定のために用いられた異なるＦＳＣ曲線を示すグラフ。（Ｄ）ｒｅｌｉｏｎ３での３ｄ分類後のクラス。（Ｅ）いかなる対称性も使用しない（Ｃ１）微調整。（Ｆ）４回、３回及び２回対称軸（左から右）から示される電子密度マップ。
【図16】図１６は、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２でのＴ＝１殻のＣｒｙｏ－ＥＭ再構成画像を示す。（Ａ）独立した氷中のＴ＝１殻のＣｒｙｏ－ＥＭ顕微鏡写真。（Ｂ）様々な配向を示す二次元クラス平均。（Ｃ）解像度推定のために用いられた異なるＦＳＣ曲線を示すグラフ。（Ｄ）ｒｅｌｉｏｎ３での３ｄ分類後のクラス。（Ｅ）いかなる対称性も使用しない（Ｃ１）微調整。（Ｆ）５回、３回及び２回対称軸（左から右）から示される電子密度マップ。
【図17】図１７は、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２でのＴ＝１殻のＣｒｙｏ－ＥＭ再構成画像を示す。（Ａ）炭素サポートを備えるレースカーボングリッド上のＴ＝１殻のＣｒｙｏ－ＥＭ顕微鏡写真。（Ｂ）様々な配向を示す二次元クラス平均。（Ｃ）解像度推定のために用いられた異なるＦＳＣ曲線を示すグラフ。（Ｄ）５回、３回及び２回対称軸（それぞれ、左から右）から示される電子密度マップ。
【図18】図１８は、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２でのＴ＝３殻のＣｒｙｏ－ＥＭ再構成画像を示す。（Ａ）炭素サポートを備えるレースカーボングリッド上のＴ＝３殻のＣｒｙｏ－ＥＭ顕微鏡写真。（Ｂ）様々な配向を示す二次元クラス平均。（Ｃ）解像度推定のために用いられた異なるＦＳＣ曲線を示すグラフ。（Ｄ）５回、３回及び２回対称軸（左から右）から示される電子密度マップ。
【図19】図１９は、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２でのＴ＝４殻のＣｒｙｏ－ＥＭ再構成画像を示す。（Ａ）炭素サポートを備えるレースカーボングリッド上のＴ＝４殻のＣｒｙｏ－ＥＭ顕微鏡写真。（Ｂ）様々な配向を示す二次元クラス平均。（Ｃ）解像度推定のために用いられた異なるＦＳＣ曲線を示すグラフ。（Ｄ）５回、３回及び２回対称軸（左から右）から示される電子密度マップ。
【図20】図２０は、斜角－５°でのＴ＝１三角形のネガティブ染色ＥＭ断層像を示す。（Ａ）左上：両方向に５°斜角を修正した（最初の斜角２０．９°）Ｔ＝１三角形設計の模式図。右上：全ての３種類の設計変異体の殻集合反応物が電気泳動したアガロースゲルのレーザー走査画像。下：殻集合産物の例示的なネガティブ染色ＴＥＭ顕微鏡写真及び二次元クラス平均。（Ｂ）３５ｍＭ ＭｇＣｌ２での斜角を－５°小さくした集合したＴ＝１三角形のネガティブ染色ＴＥＭ画像。点線の四角は、断層像が（Ｃ）及び（Ｄ）に示される集合体を示す。（Ｃ）集合したＴ＝１殻の断層像の４枚のスライス。白い矢印は、誤った斜角のために蓄積された応力解放の位置を示す。（Ｄ）完全に閉じていない集合体の断層像の４枚のスライス。
【図21】図２１は、Ｔ＝１、Ｔ＝３及びＴ＝９殻のＴＥＭ及びＨＩＭデータを示す。（Ａ）０．５ｘ ＴＢＥ緩衝液及び２０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する０．５％アガロースゲル。ゲルを９０Ｖバイアス電圧で１．５時間電気泳動した。４５分後に緩衝液を交換した。八面体三角形は三角形折り畳み反応中、全ての試験したＭｇＣｌ２濃度で殻に集合するが、Ｔ＝１三角形は２０ｍＭ以上のＭｇＣｌ２でのみ閉じた殻に集合する。溶液中にステープル鎖があるのは、三角形がスキャフォールド鎖より４倍過剰なステープルで折り畳むからであり、それらをアガロースゲルにロードする前は精製しない。折り畳み反応混合物は、様々な量のＭｇＣｌ２（１５～３０ｍＭ）を含有し、１時間あたり１℃で温度を減少させて６０℃から４５℃の熱的アニーリング勾配を受けた。ｓｃ：スキャフォールド基準ｐａｓ：不動態化された三角形、１５－３０：折り畳み反応物に存在するｍＭ単位のＭｇＣｌ２濃度、Ｐ：ポケット、Ｃ：殻、Ｍ：モノマー、Ｓ：過剰ステープル。（Ｂ）それぞれ２０及び２５ｍＭ ＭｇＣｌ２で三角形の折り畳み反応中に集合した八面体及びＴ＝１殻のネガティブ染色ＴＥＭ画像。一本鎖過剰ステープル鎖は全て目に見える。（Ｃ）２５ｍＭ ＭｇＣｌ２で集合した集合したＴ＝１三角形のネガティブ染色ＴＥＭ画像。（Ｄ）５ｎｍ層のＡｕＰｄでコーティングしたＴ＝３殻のＨＩＭ画像。（Ｅ）集合したＴ＝９殻のネガティブ染色ＴＥＭ画像。上：完全に又は部分的に集合した殻の例示的な画像。白い矢印は、集合体内部の５量体の正しい位置を示す。下：３個の完全に集合したＴ＝９殻を示す断層像の４枚のスライス。
【図22】図２２は、アガロースゲルから完全な殻の収量を抽出する例示的な手順を示す（Ｉｇｏｒ Ｐｒｏ ７で行った）。サンプルを含有するレーン（オレンジ）並びにバックグラウンドシグナルを取得するための空のレーン（青）のレーンプロファイルを抽出した。その後、バックグラウンドを減算し、グラフを正規化し、そしてＧａｕｓｓｉａｎを殻のピークにフィットした。ガウス曲線下の面積は、完成した殻の収量である。
【図23】図２３は、サブユニット交換実験を示す。サブユニット交換実験のＦＲＥＴ比を抽出するためにアガロースゲルを用いた。ゲルを２５ｍＭ（Ａ）、２２．５ｍＭ（Ｂ）及び２０ｍＭ ＭｇＣｌ２（Ｃ）で電気泳動した。全てのゲルは、様々なＭｇＣｌ２濃度を有し、０．５ｘ ＴＢＥ緩衝液を含有する０．５％アガロースゲルであり、９０Ｖバイアス電圧で１．５時間電気泳動した。４５分後に緩衝液を交換した。同一のゲルをＣｙ３（左）及びＦＲＥＴ（右）チャネルでスキャンした。適切な位置にＣｙ３及びＣｙ５標識オリゴヌクレオチドを有する三角形（図４３を参照）並びに非標識の三角形を、集合した殻を混合し、ＭｇＣｌ２濃度を調整する前に２５ｍＭ ＭｇＣｌ２で別々に集合した。混合物を４０℃で最大１４日インキュベートした。指示された時点でアリコートを取り、液体窒素で凍結し、－２０℃で保存した。完全に交換されたサブユニットの基準として、標識した及び非標識の三角形を２５ｍＭ ＭｇＣｌ２で１：１の比率で集合した（混合した）。
【図24】図２４は、半分の殻の三角形サブユニットの設計原理を示す。半分の八面体（Ａ＋Ｄ）、半分のＴ＝１殻（Ｂ＋Ｅ）又は五角形の１つの頂点を欠いたＴ＝１殻（Ｃ＋Ｆ）に集合するＤＮＡオリガミ三角形の円柱モデル。三角形の側部は、突出（明）及びくぼみ（暗）で修飾される。矢印は、形状相補的な側部を示す。特定の側部の活性化に依存して、三角形は様々な種類の集合体を形成する。三角形の結合に関与しない全ての側部をスタッキング接触でポリＴ伸長により不動態化された。
【図25】図２５は、半分の八面体殻のｃｒｙｏ－ＥＭ再構成画像を示す。（Ａ）独立した氷中の半分の八面体殻のＣｒｙｏ－ＥＭ顕微鏡写真。（Ｂ）様々な配向を示す二次元クラス平均。（Ｃ）解像度推定のために用いられた異なるＦＳＣ曲線を示すグラフ。（Ｄ）ｒｅｌｉｏｎ３での３ｄ分類後のクラス。（Ｅ）いかなる対称性も使用しない（Ｃ１）精密化。（Ｆ）Ｃ４対称性で再構築された半分の八面体殻の電子密度マップ。
【図26】図２６は、半分のＴ＝１殻のｃｒｙｏ－ＥＭ再構成画像を示す。（Ａ）独立した氷中の半分のＴ＝１殻のＣｒｙｏ－ＥＭ顕微鏡写真。（Ｂ）様々な配向を示す二次元クラス平均。（Ｃ）ｒｅｌｉｏｎ３での３ｄ分類後のクラス。（Ｄ）いかなる対称性も使用しない（Ｃ１）微調整。（Ｅ）Ｃ５対称性を用いる精密化。（Ｆ）ｒｅｌｉｏｎ３中色で示される６個のボディーを用いたＭｕｌｔｉｂｏｄｙ精密化。
【図27】図２７は、五角形の１つの頂点を欠いたＴ＝１殻のｃｒｙｏ－ＥＭ再構成画像を示す。（Ａ）独立した氷中の五角形の１つの頂点を欠いたＴ＝１殻のＣｒｙｏ－ＥＭ顕微鏡写真。（Ｂ）様々な配向を示す二次元クラス平均。（Ｃ）解像度推定のために用いられた異なるＦＳＣ曲線を示すグラフ。（Ｄ）ｒｅｌｉｏｎ３での３ｄ分類後のクラス。（Ｅ）いかなる対称性も使用しない（Ｃ１）精密化。（Ｆ）Ｃ５対称性で再構築された五角形の１つの頂点を欠いたＴ＝１殻の電子密度マップ。
【図28】図２８は、半分の八面体（Ａ）、半分のＴ｀＝１殻（Ｂ）及び五角形の１つの頂点を欠いたＴ＝１殻（Ｃ）を用いて封入されたＨＢＶコア粒子のネガティブ染色ＥＭ画像を示す。全ての殻を３０ｍＭ ＭｇＣｌ２で集合し、ＤＮＡを修飾した１７Ｈ７抗体と共に一晩インキュベートし、その後１～４時間又は一晩ＨＢＶ粒子と共にインキュベートした。
【図29】図２９は、ＨＢＶ結合のネガティブコントロールを示す。（Ａ）ＨＢＶコア粒子及び１７Ｈ７抗体が存在しない半分のＴ＝１殻のネガティブ染色画像。（Ｂ）４Ｄ０６ ＨＢｓＡｇ抗体を備えた半分のＴ＝１殻及びＨＢＶコア粒子のネガティブ染色画像。
【図30】図３０は、捕捉されたＨＢＶコア粒子を含む半分の八面体殻のｃｒｙｏ－ＥＭ再構成画像を示す。（Ａ）独立した氷中のＨＢＶコア粒子を含む半分の八面体殻のＣｒｙｏ－ＥＭ顕微鏡写真。（Ｂ）様々な配向を示す二次元クラス平均。（Ｃ）ｒｅｌｉｏｎ３での３ｄ分類後のクラス。クラス１及びクラス２の２分の１は、第２の半分の殻の複数の立体構造を平均したため、明確ではない。（Ｄ）（Ｃ）のクラス３及びクラス４の粒子を用いる３個のボディー（２個の半分の殻及びＨＢＶコア粒子）でのＭｕｌｔｉｂｏｄｙ精密化。（Ｅ）第２の半分の殻の回転運動を示すＭｕｌｔｉｂｏｄｙ精密化の第１の固有ベクトル。（Ｆ）第２の半分の殻のスライド運動を示すＭｕｌｔｉｂｏｄｙ精密化の第２の固有ベクトル。
【図31】図３１は、捕捉されたＨＢＶコア粒子を含む半分のＴ＝１殻のｃｒｙｏ－ＥＭ再構成画像を示す。（Ａ）独立した氷中の捕捉されたＨＢＶコア粒子を含む半分のＴ＝１殻のＣｒｙｏ－ＥＭ顕微鏡写真。（Ｂ）様々な配向を示す二次元クラス平均。（Ｃ）解像度推定のために用いられた異なるＦＳＣ曲線を示すグラフ。（Ｄ）ｒｅｌｉｏｎ３での３ｄ分類後のクラス。（Ｅ）Ｃ５対称性を用いない（左）及び用いる（右）精密化。
【図32】図３２は、生体外ウイルス遮断ＥＬＩＳＡを示す。（Ａ）生体外遮断ＥＬＩＳＡの模式図。ＨＢＶコア粒子は独力で固定化されたＣＡｇＨＢ抗体と結合することができ、その後ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合した抗ＣＡｇＨＢを流すことにより可視化することができる。ＨＢＶコア粒子を半分のＴ＝１粒子により飲み込む場合、殻はコア粒子が表面に結合するのを立体的に妨害し、ＨＲＰのシグナルは低下する。（Ｂ）１ｎＭ オリゴヌクレオチド結合捕捉抗体と様々な濃度の半分のＴ＝１殻のあらかじめ集合した混合物でインキュベートした２．５ｐＭ ＨＢＶコア粒子の生体外ウイルス遮断ＥＬＩＳＡ実験。エラーバーは、３回の実験の標準偏差である。（Ｃ）（Ｂ）の番号によって示される生体外遮断ＥＬＩＳＡから選択されたサンプルのネガティブ染色ＴＥＭ画像。半分のＴ＝１殻濃度は、（１）３．１ｐＭ、（２）１２．５ｐＭ、（３）５０ｐＭ、（４）１００ｐＭだった。
【図33】図３３は、設計戦略Ｔ＝１三角形及び三角形ブリック構造を示す。（Ａ）上面図及び側面図中の突出したブリック（青で示される）を備えるＴ＝１三角形二量体化（オレンジで示される）の略図。各円柱は、２本鎖ＤＮＡらせんを表す。三角形内部の赤で色付けされた円柱及び尾部内部の濃青色で色付けされた円柱は、２個の対象を結合するそれらのらせんを示す。２個の構造間の薄い線は、三角形からブリック様構造に延びる一本鎖ＤＮＡ粘着末端を示す。（Ｂ）二量体化構造のネガティブ染色ＴＥＭ画像の視野（左）及び上面図及び側面図中の２量体の二次元クラス平均（右）。
【図34】図３４は、三角形ブリックのｃｒｙｏ－ＥＭ再構成画像を示す。（Ａ）５ｍＭ ＭｇＣｌ２での独立した氷中の三角形ブリックのＣｒｙｏ－ＥＭ顕微鏡写真。（Ｂ）様々な配向を示す二次元クラス平均。（Ｃ）解像度推定のために用いられた異なるＦＳＣ曲線を示すグラフ。（Ｄ）様々な視野角から示される電子密度マップ。
【図35】図３５は、２２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２でのスパイク付きの殻のｃｒｙｏ－ＥＭ再構成画像を示す。（Ａ）２２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２での独立した氷中のスパイク付きの殻のＣｒｙｏ－ＥＭ顕微鏡写真。（Ｂ）様々な配向を示す二次元クラス平均。（Ｃ）解像度推定のために用いられた異なるＦＳＣ曲線を示すグラフ。（Ｄ）５回、２回及び３回回転軸（それぞれ左から右）から示される電子密度マップ。（Ｅ）（Ｄ）に示される電子マップの切断。
【図36】図３６は、ｃａＤＮＡｎｏ ｖ０．１で調製したＯｃｔａ及びＴ＝１三角形の設計図を示す。２個の異なる側部を結合するオリゴヌクレオチドは、角に５個の追加の一本鎖チミジンを有する。 この文脈において、図３６～４３及び５０に関して、これらの図面はナノ構造を形成する異なるオリゴヌクレオチドの複合体配置の模式図を示すことに注目すべきである。図３６～４３及び５０に示されるこれらのナノ構造を形成するのに用いられる全てのオリゴヌクレオチドは、表１に記載され、配列表に含まれる。したがって、表１は、例示の目的のみで含まれる、図３６～４３及び５０に模式的に示されるナノ構造を生成するために必要とされる全ての配列情報を含む。それらの図面には追加の配列情報は含まれない。
【図37】図３７は、ｃａＤＮＡｎｏ ｖ０．１で調製された斜角が変わったＴ＝１三角形及びＴ＝３三角形の設計図を示す。２個の異なる側部を結合するオリゴヌクレオチドは、角に５個の追加の一本鎖チミジンを有する。
【図40】図４０は、ｃａＤＮＡｎｏ ｖ０．１で調製された半分の殻のＴ＝１三角形の設計図を示す。（Ａ）＋（Ｂ）Ｔｐｅｎｔ三角形は、半分のＴ＝１殻をＴｒｉｎｇ三角形と共に集合するために又は五角形の１つの頂点を欠いたＴ＝１殻をＴｒｉｎｇ１及びＴｒｉｎｇ２三角形と共に集合するために用いることができる（図４２）。２個の異なる側部を結合するオリゴヌクレオチドは、角に５個の追加の一本鎖チミジンを有する。全ての側部は、抗体を付着するための３個のハンドルを備える（配列：ＧＣＡＧＴＡＧＡＧＴＡＧＧＴＡＧＡＧＡＴＴＡＧＧＣＡ－オリゴヌクレオチド）。（Ｃ）＋（Ｄ）（Ａ）及び（Ｂ）中のＴｐｅｎｔ及びＴｒｉｎｇ三角形のくぼみ及び突出の拡大。くぼみを構築する６個のオリゴは、結合強度を高める目的で突出のスキャフォールドの部分に相補的なオーバーハングで修飾された。
【図41】図４１は、ｃａＤＮＡｎｏ ｖ０．１で調製されたＯｃｔａ及びＴ＝１半分の殻の設計図を示す。２個の異なる側部を結合するオリゴヌクレオチドは、角に５個の追加の一本鎖チミジンを有する。全ての側部は、抗体を付着するための３個のハンドルを備える（配列．：ＧＣＡＧＴＡＧＡＧＴＡＧＧＴＡＧＡＧＡＴＴＡＧＧＣＡ－オリゴ）。Ｔｒｉｎｇ１及びＴｒｉｎｇ２三角形は、Ｔｐｅｎｔ三角形と共に五角形の１つの頂点を欠いたＴ＝１殻を集合することができる（図４０）。
【図42】図４２は、ｃａＤＮＡｎｏ ｖ０．１で調製された修飾されたＴ＝１殻の設計図を示す。（Ａ）突出するオリゴヌクレオチドを有するＴ＝１三角形。（Ｂ）結合部位を有する三角形ブリック構造。（Ｃ）三角形（灰色）用の２０個のハンドル及びＣｙ５（赤）付着用の１つのハンドルを備える一本鎖スキャフォールド。
【図44】図４４は、正二十面体カンバス上の彫刻を示す。（ａ－ｅ）様々な部分的殻の三角形ネット投影及び模式図：半分の八面体殻（ａ）、５量体（ｂ）、半分のＴ＝１殻（ｃ）、リング（ｄ）及び五角形の１つの頂点を欠いたＴ＝１殻（ｅ）。（ｉ～ｋ）図４（Ａ～Ｃ）に示される部分的殻のＣｒｙｏ－ＥＭ ３Ｄ再構成画像。挿入図は、様々な配向からの集合した殻を示す典型的な二次元クラス平均を示す。
【図45】図４５は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コア粒子の捕捉を示す。（ａ）半分の八面体殻に捕捉されたＨＢＶコア粒子のネガティブ染色ＴＥＭ画像。挿入図：捕捉されたＨＢＶコア粒子（赤）を有する抗体（シアン）を備えた２個の半分の八面体殻（灰色）の模式的表現。（ｂ）半分のＴ＝１殻に捕捉されたＨＢＶコア粒子のネガティブ染色ＴＥＭ画像。挿入図：半分のＴ＝１殻を有する（Ａ）と同じ。（ｃ）テンプレートとしてのＨＢＶコア粒子周囲に自己組織化した９個の抗体で修飾されたＴ＝１三角形のネガティブ染色ＴＥＭ画像。挿入図：単一の三角形を有する（Ａ）と同じ。（ｄ）左：二次元ＥＭクラス平均。中央：捕捉されたＢ型肝炎ウイルス粒子を配位する２個の八面体の半分の殻のＣｒｙｏ－ＥＭ再構成画像。右：ＨＢＶコア粒子が捕捉された八面体－ＤＮＡ殻のｃｒｙｏ ＥＭマップの切断。ＨＢＶコア粒子周囲の密度は、ＨＢＶコア粒子を八面体殻に結合する抗体から生じる。赤い矢印：ＨＢＶコア粒子。シアンの矢印：殻をＨＢＶコア粒子に結合する抗体。（ｅ）半分のＴ＝１殻に対して（ｄ）と同じ。電子密度の閾値が異なり、これにより半分の八面体（右）と比較して、Ｔ＝１半分の殻中のＨＢＶコア粒子は厚く見える。（ｆ）最大３個のＨＢＶコア粒子を飲み込む五角形の１つの頂点が欠けたＴ＝１殻のネガティブ染色ＴＥＭ画像。（ｇ）生体外ウイルス遮断ＥＬＩＳＡ実験。上：ＥＬＩＳＡ実験の模式的表現。下：全ての実験は、抗体（Ａｂ）対ＨＢＶ比４００：１でなされる。半分の殻は、９０か所の抗体結合部位を有する。中身が充填された点は、１ｎＭ オリゴヌクレオチド結合捕捉抗体と様々な濃度の半分のＴ＝１殻のあらかじめ集合された混合物でインキュベートされた２．５ｐＭ ＨＢＶコア粒子を示す。挿入図（ｉ）は、抗体が半分の殻の結合部位を飽和させ、過剰な抗体が溶液中にある低濃度の半分の殻を示す。挿入図（ｉｉ）は、抗体濃度が半分の殻の結合部位の濃度と等しく、そして半分の殻は、抗体を溶液中にほとんど残さずに、抗体で飽和される場合を示す。挿入図（ｉｉｉ）は、半分の殻あたり平均して４個の抗体が結合する場合を示す。半分の殻の濃度の機能としてウイルス遮断効率を定量化するために、４００：１ Ａｂ：ＨＢＶの同じ化学量論比（ｓｔｏｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ ｒａｔｉｏ）で２回のコントロールを実行した。白丸は、ＨＢＶコア粒子、抗体及び機能を持たせていないＴ＝１半分の殻の混合物を示す。白い四角は、半分の殻無しのＨＢＶ＋抗体を表す。緑色の点は、Ａｂ：半分の殻比がわずか５：１で約８０％の遮断効率を示す。エラーバーは、３回の実験の標準偏差である。
【図46】図４６は、ＤＮＡ－オリガミ半分の殻によるＡＡＶ２の中和を示す。（ａ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＡＡＶ２で首尾よく感染させるとｅＧＦＰが発現するが、ＤＮＡ半分の殻に捕捉されたＡＡＶ２に曝露した細胞はｅＧＦＰを発現しないことを示す模式図。黄色い円＝ＡＡＶ２、青いＹ＝抗ＡＡＶ２ ＩｇＧ抗体、灰色の斜めのブロック：ＤＮＡ半分の殻。（ｂ）ＡＡＶ２ウイルス粒子のＤＮＡ－オリガミ半分の殻内部への捕捉を実証するＴＥＭ画像。血清及びＢＳＡの存在下で、捕捉は成功した。血清の細片をＴＥＭ画像中に見ることができる。（ｃ）条件：ＡＡＶ２のみ、ＩＣ５０濃度（１ｎＭ）で適用される抗ＡＡＶ２、及び内部に抗ＡＡＶ２が結合したＤＮＡ－オリガミ半分の殻でのフローサイトメトリーによる感染細胞の定量化。抗ＡＡＶ２及びＤＮＡ半分の殻をそれぞれ、ＡＡＶ２とあらかじめインキュベートした。半分の殻を、殻あたり～３６個のン抗体、及びウイルス粒子あたり～７個の半分の殻の、抗ＡＡＶ２のみの条件と全体的に見て同一の抗体濃度で用いた。フローサイトメトリーを用いてデータを定量化し、平均±ｓ．ｄ．、ｎ＝３回の生物学的に独立した実験として表した。コントロールと比較した有意な抑制を調べるために１元配置分散分析（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を実行し、抗ＡＡＶ２単独と半分の殻オリガミ＋抗ＡＡＶ２の両方がＡＡＶ２のみのコントロールと比較して有意な中和を示した（ｐ≦０．０００１）。抗ＡＡＶ２をＤＮＡ－オリガミ半分の殻に結合すると、遊離抗ＡＡＶ２より著しく高い中和能力を示した（ｐ≦０．００１）。（ｄ）感染細胞によるｅＧＦＰの発現を実証する代表的な落射蛍光顕微鏡画像。条件の各々について、ｅＧＦＰ発現（緑）、細胞核（青）及びオーバーレイを示す。スケールバーは、１００μｍを表す。
【図47】図４７は、八面体及びＴ＝１殻の三角形折り畳み反応中のワンポット集合を示す。（Ａ）０．５ｘ ＴＢＥ緩衝液及び２０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する０．５％アガロースゲル。ゲルを９０Ｖバイアス電圧で１．５時間電気泳動した。４５分後に緩衝液を交換した。八面体三角形は三角形折り畳み反応中、全ての試験したＭｇＣｌ２濃度で閉じた殻に集合するが、Ｔ＝１三角形は２０ｍＭ以上のＭｇＣｌ２でのみ閉じた殻に集合する。溶液中にステープル鎖があるのは、三角形がスキャフォールド鎖より４倍過剰なステープルで折り畳むからであり、それらをアガロースゲルにロードする前は精製しない。折り畳み反応混合物は、様々な量のＭｇＣｌ２（１５～３０ｍＭ）を含有し、１時間あたり１℃で温度を減少させて６０℃から４５℃の熱的アニーリング勾配を受けた。ｓｃ：スキャフォールド基準ｐａｓ：不動態化された三角形、１５－３０：折り畳み反応物に存在するｍＭ単位のＭｇＣｌ２濃度、Ｐ：ポケット、Ｃ：殻、Ｍ：モノマー、Ｓ：過剰ステープル。（Ｂ）それぞれ２０及び２５ｍＭ ＭｇＣｌ２で三角形の折り畳み反応中に集合した八面体及びＴ＝１殻のネガティブ染色ＴＥＭ画像。一本鎖過剰ステープル鎖は全て目に見える。（Ｃ）４０℃で２日間、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２でＰＥＧ精製三角形から集合したＴ＝１殻のネガティブ染色ＴＥＭ画像。ＤＮＡオリガミ三角形を精製するためにゲル精製を用いる代わりに、以前（１）に記載したＰＥＧ精製を用いた。
【図48】図４８は、Ｔｒｉｎｇ１及びＴｒｉｎｇ２のネガティブ染色ＴＥＭ画像を示す。（Ａ）１０個の三角形を含有するＤＮＡ－オリガミリングの円柱モデル。（Ｂ）４０℃で１日間集合したＴｒｉｎｇ１及びＴｒｉｎｇ２によって形成されるリングのネガティブ染色画像（ｃｔｒｉａｎｇｌｅ＝１０ｎＭ，ｃＭｇＣｌ２＝２５ｍＭ）。白い数字は、リング内部の三角形の数を示す。（Ｃ）８、１０又は１２個の三角形を有するリング並びに完全に閉じていないリングを示す例示的な粒子。
【図49】図４９は、中和能力及び細胞生存率の用量反応特性。遊離抗体（抗ＡＡＶ２、Ａ）及びオリガミ半分の殻＋抗ＡＡＶ２（Ｂ）の両方の完全なＩＣ５０曲線。（Ｂ）の半分の殻＋抗ＡＡＶ２の濃度を抗ＡＡＶ２の濃度に対して正規化する。オリガミ緩衝液のみ及び半分の殻のみの条件では抗ＡＡＶ２は含まれないが、可視化を容易にするためにそれぞれのデータ点を配置した。半分の殻のみの濃度は、最高の半分の殻＋抗ＡＡＶ２条件で用いられるものと同一である。以下の各々のグラフは、ＡＡＶ２ウイルス粒子あたりの抗ＡＡＶ２抗体のおよその数、及び半分の殻の数である。全ての比率は、ウイルスの総数に基づく。（Ｃ）Ｃ１～Ｃ８と表される、ＩＣ５０曲線の濃度の各々についての（Ａ及びＢ）、抗ＡＡＶ２抗体のオリガミ半分の殻に対する結合によって達成される中和能力の倍の増加。（Ｄ）抗ＡＡＶ２が結合していないオリガミ半分の殻に対して感染した細胞によるｅＧＦＰの発現を実証する代表的な落射蛍光画像。スケールバーは、１００μｍを表す。（Ｅ）半分の殻のオリガミ構造に２４時間及び４８時間曝露したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の生存率。半分の殻の濃度は、ＩＣ５０特性（Ｂ）に用いられたものと同一である。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＤＮＡオリガミ半分の殻に曝露しても用量反応毒性は生じなかった。データは、平均±ｓ．ｄ．、ｎ＝３回の生物学的に独立した実験として表した。
【図50】図５０は、環状ｓｓＤＮＡ及び金ナノ粒子のＴ＝１殻中への封入。（Ａ）左から、ｓｓＤＮＡハンドルを備える修飾したＴ＝１モノマーの模式図。中央、相補的なハンドルが付着し、ＣＹ５でタグされた環状ｓｓＤＮＡ。右、Ｔ＝１殻に封入されたｓｓＤＮＡ。図解は半分の殻を示すが、完全な殻を意味する。（Ｂ）左から、空の殻、封入された環状ｓｓＤＮＡ、封入された単一の金ナノ粒子、及び封入された金で標識された環状ｓｓＤＮＡの模式図。（Ｃ）（Ｂ）の各殻のネガティブ染色ＴＥＭ断層像のスライス。（Ｄ）カーゴの有り無し両方の、Ｔ＝１殻のレーザー走査蛍光ゲル。両方のゲル画像は、同じゲルから取得されるが、異なる波長で取得される。ゲルの各カラムは、セクション（Ｃ）及び（Ｄ）の対応する粒子で色分けされる。左のゲル画像は、スキャフォールド及び集合した殻用のバンドを見るＳＹＢＲ ｓａｆｅ発光を示す。右のゲルについては、ＣＹ５の発光により、カーゴが集合した殻と同じ位置にあることが示される。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本開示は、ウイルス又はウイルス粒子の封入を可能とする構築物を提供する。
【0017】
別段の規定がない限り、本明細書で用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当該技術分野において当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【0018】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は本明細書で、別段の注記がないかぎり、オープンエンド（ｏｐｅｎ－ｅｎｄｅｄ）及び非限定的な意味で用いられる。このような後者の具体的表現に関して、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」にはしたがって、範囲の狭い用語「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」が含まれる。
【0019】
用語「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」及び「１つの（ｔｈｅ）」並びに本発明を記載する文脈における（特に以下の特許請求の範囲の文脈における）類似する言及は、本明細書で別段の指示がない限り又は文脈によって明確に否定されない限り、単数及び複数の両方を含むと解釈されるべきである。例えば、用語「１つの細胞」には、細胞の混合物を含む、複数の細胞が含まれる。複数形が化合物、塩、及び同種のものに用いられる場合、これは単数の化合物、塩、又は同種のものも表すと考えられる。
【0020】
したがって、１つの態様において、本開示は、ウイルス又はウイルス粒子を封入するための少なくとも２０ｎｍの直径の空洞を包む高分子に基づくナノ構造を提供する。
【0021】
本開示の文脈において、用語「高分子に基づくナノ構造」とは、一組の高分子によって形成されるナノ構造を指し、この高分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質及びこれらのハイブリッド、特にＤＮＡ－（タンパク質リンカー）－ＤＮＡハイブリッドを含む、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド及びＤＮＡ－タンパク質ハイブリッドから選択されるハイブリッドから選択される。
【0022】
本開示の文脈において、用語「ＤＮＡ」とは、ヌクレオチドと呼ばれる一本鎖のモノマーユニットから成るデオキシリボ核酸を指し、各ヌクレオチドは、窒素含有核酸塩基、２－デオキシリボース糖部分、及びリン酸基から成り、それぞれのヌクレオチドは、２－デオキシリボース糖部分の５’位のＯＨ基を隣接する２－デオキシリボース糖部分の３’位のＯＨ基をと結合するリン酸基によって一本鎖に結合される。特定の実施形態において、窒素含有核酸塩基は、シトシン［Ｃ］、グアニン［Ｇ］、アデニン［Ａ］及びチミン［Ｔ］から独立して選択される。特定の実施形態において、１つ又は複数の核酸塩基は、特に、具体的にはＮ６－カルバモイル－メチルアデニン又はＮ６－メチルアデニンである、修飾アデノシン；具体的には７－デアザグアニン又は７－メチルグアニンである、修飾グアニン；Ｎ４－メチルシトシン、５－カルボキシルシトシン、５－ホルミルシトシン、５－グリコシルヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシシトシン、又は５－メチルシトシンである、修飾シトシン；具体的には、α－グルタミルチミジン又はα－プトレシニルチミンである、修飾チミジン；具体的にはウラシル、ｂａｓｅ Ｊ、５－ジヒドロキシペンタウラシル、又は５－ヒドロキシメチルデオキシウラシルなどのウラシル又はその修飾体；デオキシアルカエオシン及び２，６－ジアミノプリンのリストから選択される非標準塩基である、非標準塩基である。ＤＮＡの一本鎖の区間は、相補的な核酸塩基の相互作用によりＤＮＡの相補的な区間と相互作用してよく、シトシン及びグアニン、並びにアデニン及びチミンは、核酸塩基間に２個（Ａ／Ｔ）及び３個（Ｇ／Ｃ）の水素結合を形成することにより、それぞれ互いに相補的である。ゲノムＤＮＡの場合のように、２本の一本鎖のＤＮＡは互いに完全に相補的であってよく、又は一本の一本鎖のＤＮＡが２本以上の他の一本鎖ＤＮＡ鎖と部分的に相補的である状況を含んで、互いに部分的に相補的であってよい。２本の相補的な一本鎖ＤＮＡ配列の相互作用は、２本鎖ＤＮＡ二重らせんを形成する。
【0023】
周知のように、ＤＮＡは本来、タンパク質をコードする遺伝情報のキャリアとして進化してきた。ＤＮＡはさらに、調節機能を有する領域を含む非翻訳領域を含む。したがって、全てのＤＮＡに基づく応用は通常、特定のＤＮＡ配列に決定的に依存し、ほとんどいつも特定のＤＮＡ配列を指名することによりのみ可能となる。対照的に、本発明の文脈において、根底にあるＤＮＡ配列は、望ましい配列の二重らせんサブユニットを形成するように設計され、そして選択されるだけなので、このようなコード及び／又は調節機能は、いかなる役割も果たさず、存在してもしなくてもよい。したがって、１つの実施形態において、自然起源のＤＮＡ（バクテリオファージのＤＮＡなど）であろうと合成的に作製されたＤＮＡであろうと、任意の形状の長い一本鎖ＤＮＡ配列をテンプレートとして選択してよく、且つ一組の短い一本鎖ＤＮＡ配列を設計してよく、この場合各配列はテンプレートの１つ又は複数の異なる部位と相補的であり、したがって１つ又は複数の二重らせん区分を形成する。まとめると、全てのこのような二重らせん区分は、フルセットの短い一本鎖ＤＮＡ配列のテンプレートとの相互作用により作製され、望ましい三次元配列を形成する。ある一定の一本鎖テンプレート配列から始め、一組の相補的配列の設計を、例えば、構造的に明確な３Ｄ形状を有するメガダルトンスケールの別々の物体の合成用に記載された方法（１８，２４－３５）などの、既知の技術を用いて組み立てることができる。特に弾性ネットワーク誘導分子動力学シミュレーション（３８）と対にされるｃａＤＮＡｎｏ（３７）による反復設計を用いることができる。
【0024】
水素結合による一本鎖ＤＮＡの異なる区間の相補的核酸塩基の相互作用に加えて、２本の二本鎖ＤＮＡらせんの平滑末端間のスタッキング相互作用を含む、異なるＤＮＡ鎖間のさらなる相互作用が可能であり（３６）、したがって二重らせんサブユニットの形状相補性を介した複雑なＤＮＡに基づくナノ構造の設計及び形成が可能となる。したがって、前の段落により形成された２個の三次元配列は、例えば、図７～１３Ｄに示される、相補的な突出及びくぼみ（又はノブ及びへこみ）を有する２個の三次元配列間の特異的相互作用を含む、２個の三次元配列上に存在する二重らせんサブユニット間のスタッキング相互作用により互いに相互作用してよい。
【0025】
本開示の文脈において、用語「ＲＮＡ」とは、ヌクレオチドと呼ばれる一本鎖のモノマーユニットから成るリボ核酸を指し、各ヌクレオチドは、窒素含有核酸塩基、リボース糖部分、及びリン酸基から成り、それぞれのヌクレオチドはリボース糖部分の５’位のＯＨ基を隣接するリボース糖部分の３’位のＯＨ基と結合するリン酸基によって一本鎖に結合される。特定の実施形態において、窒素含有核酸塩基は、シトシン［Ｃ］、グアニン［Ｇ］、アデニン［Ａ］及びウラシル［Ｕ］から独立して選択される。特定の実施形態において、１つ又は複数の核酸塩基は、特にプソイドウリジン、リボチミジン、及びイノシンのリストから選択される非標準塩基である、非標準塩基である。ＤＮＡとは異なって、ＲＮＡはほとんどの場合一本鎖形だが、相補的な核酸塩基の相互作用により二本鎖形の形成も可能であり、この場合核酸塩基間に２個（Ａ／Ｕ）及び３個（Ｇ／Ｃ）の水素結合を形成することにより、シトシン及びグアニン、並びにアデニン及びウラシルがそれぞれ互いに相補的である。特定の実施形態において、本開示は、高分子に基づくナノ構造を提供し、これはＲＮＡに基づくナノ構造である。
【0026】
特定の実施形態において、この空洞は、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１５０ｎｍ、少なくとも２００ｎｍ又は少なくとも２５０ｎｍの直径を有する。
【0027】
特定の実施形態において、この空洞は、多くとも１，０００ｎｍの直径を有する。
【0028】
本発明の文脈において、用語「直径」とは、高分子に基づくナノ構造の面によって取り囲まれる最小円の直径を指す。明確さのために、カプセル形（又は球面円柱形）の高分子に基づくナノ構造の場合、直径は、半球状端部の直径及び／又は円柱状中央部の直径である。
【0029】
特定の実施形態において、高分子に基づくナノ構造は、少なくとも１ＭＤａ、具体的には少なくとも１０ＭＤａ、具体的には少なくとも２０ＭＤａ、より具体的には少なくとも３０ＭＤａの分子量を有する。他の特定の実施形態において、ＤＮＡに基づくナノ構造は、少なくとも５０ＭＤａ、少なくとも８０ＭＤａ、少なくとも１００ＭＤａ、少なくとも２００ＭＤａ、又は少なくとも５００ＭＤａの分子量を有する。特定の実施形態において、ＤＮＡに基づくナノ構造は、多くとも１，５００ＭＤａの分子量を有する。
【0030】
特定の実施形態において、高分子に基づくナノ構造の分子量の数値（ＭＤａ）とこの高分子に基づくナノ構造によって包まれる空洞の容積の数値（ｎｍ３）との間の比は、１０，０００未満、特に９，０００未満である。特定の実施形態において、この比は、１，０００～１０，０００の値、特に２，０００～９，０００の値を有する。例えば、特定の八面体ナノ構造の場合、分子量は、約４０ＭＤａであり、包まれる容積は、約１１３，０００ｎｍ３であり、この比は、約２，８００である。
【0031】
特定の実施形態において、高分子に基づくナノ構造を形成する高分子によっておおわれる高分子に基づくナノ構造の外面とこの高分子によっておおわれない外面（殻形の高分子に基づくナノ構造の開口の面積を除く）との比は、少なくとも１、具体的には少なくとも２、具体的には少なくとも４、具体的には少なくとも６、具体的には少なくとも８である。他の特定の実施形態において、比は、少なくとも１０である。特定の実施形態において、比は、１～２０、具体的には２～１８、４～１６、６～１４、及びより具体的には８～１２である。例えば、高分子に基づくナノ構造が半球形の殻である場合、開口の面積、すなわち、半球形の平らな面の面積でなく、湾曲した面の面積のみがこの比を算出するために用いられる。
【0032】
特定の実施形態において、本発明は、ＤＮＡに基づくナノ構造に関する。
【0033】
特定の実施形態において、ＤＮＡに基づくナノ構造は、ＤＮＡに基づく構築ブロックを自己組織化することにより形成される。
【0034】
特定の実施形態において、この自己組織化するＤＮＡに基づく構築ブロックの各々は、一本鎖ＤＮＡテンプレート鎖及びこの一本鎖ＤＮＡテンプレートと相補的な一組のオリゴヌクレオチドによって形成され、このオリゴヌクレオチドの各々は、この一本鎖ＤＮＡテンプレート上の１つの近接ＤＮＡ配列区間か少なくとも２個の非近接ＤＮＡ配列区間のいずれかと相補的である。
【0035】
特定の実施形態において、各自己組織化するＤＮＡに基づく構築ブロックの分子量は、４．５～５．５ＭＤａである。
【0036】
特定の実施形態において、各自己組織化するＤＮＡに基づく構築ブロックは、７，５００～８，５００塩基対を含む。
【0037】
特定の実施形態において、ＤＮＡに基づくナノ構造は、４～１８０個のこのような自己組織化するＤＮＡに基づく構築ブロックから成る。
【0038】
特定の実施形態において、この一本鎖ＤＮＡテンプレートは、糸状バクテリオファージの一本鎖ＤＮＡである、又は糸状バクテリオファージの一本鎖ＤＮＡに由来する。
【0039】
本発明の文脈において、用語「繊維状バクテリオファージ」とは、ある種類のバクテリオファージ、又はバクテリアのウイルスを指し、これは、通常環状一本鎖ＤＮＡのゲノムを含有する繊維状形状によって特徴づけられ、且つグラム陰性細菌に感染する。繊維状ファージは、Ｍ１３、ｆ１及びｆｄ１ファージなどのＦｆファージ、及びＰｆ１ファージを含む。
【0040】
特定の実施形態において、この一本鎖ＤＮＡテンプレートは、配列番号１（Ｍ１３ ８０６４）及び２（Ｍ１３ ７２４９）から選択される配列を有する（表１を参照）。特定の実施形態において、この一本鎖ＤＮＡは、環状である。
【0041】
本発明の文脈において、「繊維状バクテリオファージの一本鎖ＤＮＡに由来する」一本鎖ＤＮＡテンプレートとは、（ｉ）環状構造の直鎖状配列への開口；（ｉｉ）１つ又は複数のヌクレオチドの欠失；（ｉｉｉ）１つ又は複数のヌクレオチドの挿入；（ｉｉｉ）１つ又は複数のヌクレオチドの置換；（ｉｖ）１つ又は複数のヌクレオチドの追加；及び（ｖ）１つ又は複数のヌクレオチドの修飾の１つ又は複数による繊維状バクテリオファージの自然起源の公表されたＤＮＡ配列に由来するＤＮＡ構築物を指す。任意のこのような変動は、バクテリオファージの生物学、感染力及び増殖能力に対して有害な、又は少なくともある程度予想外な効果を有してよいが、上述したように、この一本鎖ＤＮＡテンプレートは、いかなる機能特性を有するいかなる要件もない裸のテンプレートとしてのみ用いられ、この自己組織化するＤＮＡに基づく構築ブロックの３次元形状の正確な形成などの、全ての構造的側部は、この一組の相補的オリゴヌクレオチドの適切な選択によって実行されるので、このような効果は本発明の文脈において、いかなる役割も果たさない。
【0042】
特定の実施形態において、この一本鎖ＤＮＡテンプレートは、特にＭ１３、ｆ１又はｆｄ１ファージに対する、繊維状バクテリオファージの自然起源の又は公表された配列の配列、特に配列番号１（Ｍ１３ ８０６４）及び２（Ｍ１３ ７２４９）に対して少なくとも８０％、具体的には少なくとも９０％、より具体的には少なくとも９５％の配列相同性を有する。
【0043】
特定の実施形態において、ＤＮＡに基づくナノ構造は、包まれるこのウイルス又はウイルス粒子の存在下この自己組織化するＤＮＡに基づく構築ブロックからその場で形成される、球形、球面円柱形、及び多面体、特に四面体、八面体又は正二十面体から選択される閉じた三次元幾何学的形状である、閉じた三次元幾何学的形状である。
【0044】
別の特定の実施形態において、ＤＮＡに基づくナノ構造は、この空洞にアクセスするための開口を有する殻である。
【0045】
本発明の文脈において、用語「殻」とは、閉じた三次元幾何学的形状、特に球形、球面円柱形、及び多面体、特に四面体又は八面体から選択される閉じた三次元幾何学的形状の一部である構造を指す。
【0046】
さらに別の実施形態において、ＤＮＡに基づくナノ構造は、それぞれ第１及び第２の内部空洞にアクセスするための開口を有する第１及び第２の殻の組み合わせであり、この第１及び第２の内部空洞はともに、この空洞を形成する。
【0047】
特定の実施形態において、この第１及び第２の殻は、少なくとも１つのリンカーにより結合される。
【0048】
特定の実施形態において、このリンカーは、ＤＮＡリンカー、ＲＮＡリンカー、ポリペプチドリンカー、タンパク質リンカー及び化学リンカーから選択されるリンカーである。
【0049】
本発明の文脈において、用語「ＤＮＡリンカー」とは、ＤＮＡから形成されるリンカーを指し、このＤＮＡリンカーの配列は、この一本鎖ＤＮＡテンプレートのＤＮＡ又はこの一本鎖ＤＮＡテンプレートに相補的なこの一組のオリゴヌクレオチドのいずれかと相補的でなく、このＤＮＡリンカーは、一方の終端でこの第１の殻の自己組織化するＤＮＡに基づく構築ブロックを形成するＤＮＡ配列と結合し、且つ他方の終端でこの第２の殻の自己組織化するＤＮＡに基づく構築ブロックを形成するＤＮＡ配列と結合する。
【0050】
本発明の文脈において、用語「ポリペプチドリンカー」とは、ペプチド結合によって結合された少なくとも２個、具体的には少なくとも５個、少なくとも１０個、又は少なくとも２０個のアミノ酸残基から形成されるリンカーを指し、このポリペプチドは、一方の終端でこの第１の殻の自己組織化するＤＮＡに基づく構築ブロックを形成するＤＮＡ配列と結合し、且つ他方の終端でこの第２の殻の自己組織化するＤＮＡに基づく構築ブロックを形成するＤＮＡ配列と結合する。
【0051】
本発明の文脈において、用語「タンパク質リンカー」とは、ペプチド結合により結合された少なくとも２０個、具体的には少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個のアミノ酸残基、少なくとも５００個のアミノ酸残基、又は少なくとも１，０００個のアミノ酸残基、具体的には１，５００個未満のアミノ酸残基から形成されるリンカーを指し、このポリペプチドは、三次及び／又は四次構造を有し、このタンパク質リンカーは、一方の終端でこの第１の殻の自己組織化するＤＮＡに基づく構築ブロックを形成するＤＮＡ配列と結合し、他方の終端でこの第２の殻の自己組織化するＤＮＡに基づく構築ブロックを形成するＤＮＡ配列と結合する。特定の実施形態において、このタンパク質リンカーは、このＤＮＡ配列と共有結合的に結合される。特定の他の実施形態において、このタンパク質リンカーは、このＤＮＡ配列と非共有結合的に結合され、特にこのタンパク質リンカーは、特に二重特異性抗体及びＩｇＧ抗体を含む、完全抗体から選択される、抗体に基づくタンパク質リンカーである。
【0052】
本発明の文脈において、用語「化学リンカー」とは、その骨格が１～３０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個の原子であり、したがって、本発明の文脈において、用語「間（ｂｅｔｗｅｅｎ）」は、言及される境界が含まれるように用いられる）個の原子の連続鎖を指し、すなわち、リンカーの長さは、この化学リンカーによって結合される２個のＤＮＡ配列間の原子又は結合の数によって測定される最短の結合として定義される。本発明の文脈において、化学リンカーは好ましくは、Ｃ１～２０－アルキレン、Ｃ１～２０－ヘテロアルキレン、Ｃ２～２０－アルケニレン、Ｃ２～２０－ヘテロアルケニレン、Ｃ２～２０－アルキニレン、Ｃ２～２０－ヘテロアルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アラルキレン、又はヘテロアラルキレン基であり、これらは任意選択的に置換されてよい。リンカーは、カルボキサミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、尿素、チオ尿素、炭化水素部分及び同種のものなどの１つ又は複数の構造用を含んでよい。リンカーは、これらの構造要素の２つ以上の組み合わせを含んでよい。これらの構造要素の各々の１つは、このリンカーに１回超、例えば、２回、３回、４回、５回、又は６回存在してよい。いくつかの実施形態において、リンカーは、ジスルフィド結合を含んでよい。リンカーは、この化学リンカーによって結合された２個のＤＮＡ配列に１回のステップか２回以上の続くステップのいずれかで結合される必要があることが理解される。その目標に向かって、あるべきリンカーは、２個の基を好ましくは近位端及び遠位端に保有し、これは、（ｉ）結合される予定の２個のＤＮＡ配列の一方に存在する基に対して共有結合を形成することができる、又は（ｉｉ）２個のＤＮＡ配列の一方との共有結合である又は共有結合の形成を活性化することができる。
【0053】
特定の実施形態において、ＤＮＡに基づくナノ構造は、正二十面体構造に基づく。
【0054】
特定の実施形態において、この自己組織化するＤＮＡに基づく構築ブロックの各々は、角柱である。
【0055】
本発明の文脈において、用語「角柱」とは、全ての頂点が２個の平行な平面に位置する、多面体を指す。
【0056】
特定の実施形態において、この角柱は、三角形の角柱である。他の実施形態において、この角柱は、四角形の角柱である。
【0057】
特定の実施形態において、ＤＮＡに基づくナノ構造は、三角形及び四角形の角柱の混合物に基づく。
【0058】
特定の実施形態において、本発明は、ＤＮＡに基づくナノ構造であって、
各々のこの三角形、又はこの四角形の角柱は、それぞれｍ個の三角形、又は四角形の平面から形成され、ｍは、４、５、６、７及び８から独立して選択される、特に５、６及び７から独立して選択される整数であり、さらに特にこの整数は６であり、
このｍ個の平面の各々の、それぞれ３個、又は４個の辺は、ＤＮＡ二重らせんのｎ個の平行区間により形成され、ｎは、１、２、３、４、５及び６から独立して選択される、特に２、３、４及び５から独立して選択される、さらに特に３及び４から独立して選択される整数であり、
各平面は、この平面上の平面及び／又は下の平面と、（ｉ）この平面を形成するこのＤＮＡ二重らせん間のスタッキング相互作用により、及び（ｉｉ）この平面の少なくとも２個を架橋するこのＤＮＡに基づく構築ブロックを形成するこの一本鎖ＤＮＡテンプレート及び／又はこのオリゴヌクレオチド内部のＤＮＡ区間により部分的に結合され、そして
それぞれ３個又は４個の側部の台形のうち少なくとも２個は、この自己組織化するＤＮＡに基づく構築ブロックの別の１つの側部の台形上の相補的パターンと特異的相互作用をするための欠損した又は追加のＤＮＡ二重らせん区間により形成される特定のパターンのくぼみ及び／又は突出を含む、
ＤＮＡに基づくナノ構造に関する。
各々のこの三角形、又はこの四角形の角柱は、それぞれｍ個の三角形、又は四角形の平面から形成され、ｍは、４、５、６、７及び８から独立して選択される、特に５、６及び７から独立して選択される整数であり、さらに特にこの整数は６であり、
このｍ個の平面の各々の、それぞれ３個、又は４個の辺は、ＤＮＡ二重らせんのｎ個の平行区間により形成され、ｎは、１、２、３、４、５及び６から独立して選択される、特に２、３、４及び５から独立して選択される、さらに特に３及び４から独立して選択される整数であり、
各平面は、この平面上の平面及び／又は下の平面と、（ｉ）この平面を形成するこのＤＮＡ二重らせん間のスタッキング相互作用により、及び（ｉｉ）この平面の少なくとも２個を架橋するこのＤＮＡに基づく構築ブロックを形成するこの一本鎖ＤＮＡテンプレート及び／又はこのオリゴヌクレオチド内部のＤＮＡ区間により部分的に結合され、そして
それぞれ３個又は４個の側部の台形のうち少なくとも２個は、この自己組織化するＤＮＡに基づく構築ブロックの別の１つの側部の台形上の相補的パターンと特異的相互作用をするための欠損した又は追加のＤＮＡ二重らせん区間により形成される特定のパターンのくぼみ及び／又は突出を含む、
ＤＮＡに基づくナノ構造に関する。
【0059】
特定の実施形態において、それぞれ三角形又は四角形の角柱のｍ個の平面中のＤＮＡ二重らせんのｎ個の区間の各々の平均長は、８０～２００塩基対である。
【0060】
特定の実施形態において、この三角形の角柱は、三角形切頭体である。特定の実施形態において、この四角形の角柱は、四角形切頭体である。
【0061】
本発明の文脈において、用語「三角形切頭体」とは、三角錐形の三次元幾何学的形状を指し、用語「四角形切頭体」とは、四角錐形の三次元幾何学的形状を指し、錐体の先端は除去されており、上端に錐体の基礎と平行な平面を生じる。
【0062】
特定の実施形態において、この自己組織化するＤＮＡに基づく構築ブロックの少なくとも一部については、このｍ個の平面の各々の少なくとも１つの辺の長さは、第１の平面から第ｍの平面まで減少しており、その結果この第１の平面に垂直な平面とｋのｍ個の辺によって形成される台形平面の各々との間に斜角が生じる（図５を参照）。特定の実施形態において、それぞれ全ての３個、又は４個の台形平面は、斜角を示す。
【0063】
特定の実施形態において、斜角は、１６°～２６°、具体的には１８°～２４°、より具体的には２０°～２２°、最も好ましくは約２０．９°である。
【0064】
特定の実施形態において、このＤＮＡに基づくナノ構造は、少なくとも１組の自己組織化するＤＮＡに基づく構築ブロックを備え、それぞれ全ての３個、又は４個の側部の台形は、この自己組織化するＤＮＡに基づく構築ブロックの別の１つの側部の台形上の相補的パターンと特異的相互作用をするための欠損した又は追加のＤＮＡ二重らせん区間により形成される特定のパターンのくぼみ及び／又は突出を備える。
【0065】
特定の実施形態において、特にＤＮＡに基づくナノ構造が閉じた三次元幾何学的形状を形成する場合、全てのこの自己組織化するＤＮＡに基づく構築ブロックは、同一である。
【0066】
特定の実施形態において、このＤＮＡに基づくナノ構造は、２個以上の組の自己組織化するＤＮＡに基づく構築ブロックを備える。
【0067】
特定の実施形態において、このＤＮＡに基づくナノ構造は、桿状である。
【0068】
特定の実施形態において、このＤＮＡに基づくナノ構造は、２個以上の組の自己組織化するＤＮＡに基づく構築ブロックを備える。
【0069】
特定のこのような実施形態において、この桿状のＤＮＡに基づくナノ構造は、少なくとも第１及び第２の組の自己組織化するＤＮＡに基づく構築ブロックを備え、この第１及び第２の組は、少なくとも斜角に関して異なる。特定の実施形態において、少なくとも一方の組は、２個のみの斜角を示す自己組織化するＤＮＡに基づく構築ブロックから成る。特定の実施形態において、この少なくとも一方の組は、２個の対向する台形の各々に斜角を含む、四角形の切頭体から成る。
【0070】
特定の実施形態において、この殻の、又はこの第１及び第２の殻のそれぞれの縁を形成する側部の台形は、この自己組織化するＤＮＡに基づく構築ブロックの別の１つの側部の台形上の相補的パターンと特異的相互作用をするための欠損した又は追加のＤＮＡ二重らせん区間により形成される特定パターンのくぼみ及び／又は突出を含まない。
【0071】
特定の実施形態において、このＤＮＡに基づくナノ構造は、
（ｉ）１組の４コピーの三角形切頭体から成る、半分の八面体であって（図４Ａ）、三角形切頭体の三角形の辺の１つに対する塩基対スタッキングが、鎖短縮によるか不対のチミジンを加えることによるかのいずれかにより不活性化される、半分の八面体（図４Ａ、図２４Ａ、Ｄを参照。）
（ｉｉ）各々の場合において２組の５コピーの２種類の異なる三角形切頭体から成る、半分のＴ＝１殻であって（図４Ｂ）、第１の組の５コピーが閉じた５量体を形成し、そして第２の組の５コピーが前記５量体の辺上に結合する、半分のＴ＝１殻（図４Ｂ、図２４Ｂ、Ｅを参照）、及び
（ｉｉｉ）各々の場合において３組の５コピーの３種類の異なる三角形切頭体から成る、五角形の１つの頂点が欠けた「捕捉」Ｔ＝１殻であって（図４Ｃ）、第１の組の５コピーが閉じた５量体を形成し、第２の組の５コピーが前記５量体の辺上に結合し第２の組の５コピーが前記５量体の辺上に結合し、そして第３の組の５コピーが前記第２の組の５コピー間の間隙へと結合する、「捕捉」Ｔ＝１殻（図４Ｃ、図２４Ｃ、２４Ｆを参照）から選択される殻である。
（ｉ）１組の４コピーの三角形切頭体から成る、半分の八面体であって（図４Ａ）、三角形切頭体の三角形の辺の１つに対する塩基対スタッキングが、鎖短縮によるか不対のチミジンを加えることによるかのいずれかにより不活性化される、半分の八面体（図４Ａ、図２４Ａ、Ｄを参照。）
（ｉｉ）各々の場合において２組の５コピーの２種類の異なる三角形切頭体から成る、半分のＴ＝１殻であって（図４Ｂ）、第１の組の５コピーが閉じた５量体を形成し、そして第２の組の５コピーが前記５量体の辺上に結合する、半分のＴ＝１殻（図４Ｂ、図２４Ｂ、Ｅを参照）、及び
（ｉｉｉ）各々の場合において３組の５コピーの３種類の異なる三角形切頭体から成る、五角形の１つの頂点が欠けた「捕捉」Ｔ＝１殻であって（図４Ｃ）、第１の組の５コピーが閉じた５量体を形成し、第２の組の５コピーが前記５量体の辺上に結合し第２の組の５コピーが前記５量体の辺上に結合し、そして第３の組の５コピーが前記第２の組の５コピー間の間隙へと結合する、「捕捉」Ｔ＝１殻（図４Ｃ、図２４Ｃ、２４Ｆを参照）から選択される殻である。
【0072】
特定の実施形態において、本発明は、１つ又は複数の種類のＤＮＡブリック構築物をさらに含むＤＮＡに基づくナノ構造であって、このようなＤＮＡブリック構築物の各々の種類は、このＤＮＡに基づくナノ構造の外面上の、それぞれこの三角形又は四角形切頭体の平面上に存在する１つ又は複数の相補的相互作用部位との辺対辺のスタッキング接触による特異的相互作用をするための１つ又は複数の相互作用部位によって特徴づけられ、このＤＮＡブリック構築物は、この平面のそれぞれ３個、又は４個の辺間の自遊空間を覆う、ＤＮＡに基づくナノ構造に関する。
【0073】
特定の実施形態において、本発明は、それぞれこの三角形又は四角形切頭体の１つの内部の、及び／又はそれぞれこの三角形又は四角形切頭体のうち２個の間の１つ又は複数の架橋結合をさらに含むＤＮＡに基づくナノ構造に関する。
【0074】
本発明の文脈において、用語「架橋結合」とは、それぞれこの三角形、又は四角形切頭体の１つの内部の、及び／又はそれぞれこの三角形、又は四角形切頭体のうち２個の間の任意の永久の又は断続的な結合を指す。任意のこのような結合は、組立て前に事前に自己組織化するＤＮＡに基づく構築ブロックを形成するために用いられているオリゴヌクレオチドのうち２個を結合することにより、又は事前に三次元ナノ構造の異なる部分間に結合を化学的又は光化学的に加えることにより達成されてよい。永久の結合は、例えば、共有結合性シクロブタン型ピリミジンダイマー（ＣＰＤ）結合（４１）の形成下この構造に適切に位置した光化学的に架橋するＴ残基によって作製されてよく、且つ断続的な結合は、例えば、第１の平滑末端に位置する３－シアノビニルカルバゾール（ｃｎｖＫ）部分と他の平滑末端に位置するチミン残基（Ｔ）の間の２個の二重らせんサブユニットの平滑末端を光化学的に架橋することにより作製されてよい。
【0075】
特定の実施形態において、本発明は、このウイルス又はウイルス粒子と特異的に相互作用する少なくとも１つの部分をさらに含む高分子に基づくナノ構造に関する。
【0076】
特定の実施形態において、この高分子に基づくナノ構造は、本発明によるＤＮＡに基づくナノ構造であり、この少なくとも１つの部分は、ＤＮＡに基づくナノ構造を形成するそれぞれこの三角形、又は四角形角柱の１つと、この少なくとも１つの部分がこのＤＮＡに基づくナノ構造の内部上に位置し、且つこのＤＮＡに基づくナノ構造によって形成される空洞を指すように、結合する。
【0077】
特定の実施形態において、この少なくとも１つの部分は、このウイルス又はウイルス粒子と特異的に結合することができることによりこのウイルス又はウイルス粒子と特異的に相互作用している。特定の実施形態において、この少なくとも１つの部分は、抗体又は抗体の少なくとも１つの抗原結合部位、具体的には抗体の少なくとも１つのＶＨ領域又は抗体のＶＨとＶＬ領域との少なくとも１つの組み合わせ、を含む抗体に基づく結合部分である。
【0078】
特定の実施形態において、この少なくとも１つの部分は、不活性化されたこのウイルス又はウイルス粒子と結合することができることにより、このウイルス又はウイルス粒子と特異的に相互作用している。
【0079】
特定の実施形態において、この高分子に基づくナノ構造は、平均的に、この高分子に基づくナノ構造によって形成される空洞の内側部位に結合した０～１０か所の抗体に基づく結合部位、具体的には４～１０か所の、具体的には４，５，６，７，８，９，又は１０か所の実施形態の、抗体に基づく結合部位を含む。
【0080】
特定のこのような実施形態において、この抗体に基づく結合部位は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片である。
【0081】
特定のこのような実施形態において、この高分子に基づくナノ構造は、オリゴヌクレオチドに基づくナノ構造であり、この抗体に基づく結合部位、具体的にはこのｓｃＦｖ断片は、このオリゴヌクレオチドに基づくナノ構造によって形成された空洞の内側に存在するオリゴヌクレオチド区間と相補的である、又は部位特異的相互作用に入ることができる配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドと結合する。
【0082】
別の態様において、本開示は、本発明による高分子に基づくナノ構造によって封入されたウイルス又はウイルス粒子を含む組成物を提供する。
【0083】
特定の実施形態において、この組成物は、このウイルス又はウイルス粒子をこのウイルス又はウイルス粒子を含有する培養液から除去するプロセス中で形成される。特定の他の実施形態において、この組成物は、カーゴとしてのこのウイルス又はウイルス粒子をこの高分子に基づくナノ構造に組み込むプロセス中で形成される。
【0084】
別の態様において、本開示は、ウイルス又はウイルス粒子と異なるカーゴを含む組成物を提供し、複合高分子などの、このカーゴは、本発明による高分子に基づくナノ構造によって封入される。
【0085】
さらに別の態様において、本開示は、ウイルス又はウイルス粒子を封入する方法であって、この方法は、本発明による高分子に基づくナノ構造を提供するステップ、及びこの高分子に基づくナノ構造をこのウイルス又はウイルス粒子を含む、又は含むと疑われる培養液と接触させるステップを含む、方法を提供する。
【0086】
特定の実施形態において、この方法は、このウイルス又はウイルス粒子をこの培養液から除去するためである。特定の実施形態において、この方法は、このウイルス又はウイルス粒子を輸送する目的でこのウイルス又はウイルス粒子を封入するためである。
【0087】
さらに別の態様において、本開示は、複合高分子などの、ウイルス又はウイルス粒子と異なるカーゴを封入する方法であって、この方法は、本発明による高分子に基づくナノ構造を提供するステップ、及びこの高分子に基づくナノ構造を、このカーゴを含む、又は含むと疑われる培養液と接触させるステップを含む、方法を提供する。
【0088】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表1-5】
【表1-6】
【表1-7】
【表1-8】
【表1-9】
【表1-10】
【表1-11】
【表1-12】
【表1-13】
【表1-14】
【0089】
明確にするために、別々の実施形態の文脈において記載される、本発明の特定の特徴はまた単一の実施形態における組み合わせで提供されてよい。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈において記載される、本発明の種々の特徴はまた、別々に、又は任意の適したサブコンビネーションで提供されてよい。本発明に属する実施形態の全ての組み合わせは、本発明によって特異的に包含され、あたかも各々及び全ての組み合わせが個々に且つ明瞭に開示されるように本明細書に開示される。さらに、これらの種々の実施形態及び構成要素の全てのサブコンビネーションはまた、本発明によって特異的に包含され、あたかも各々及び全てのこのようなサブコンビネーションが個々に且つ明瞭に本明細書に開示されるように本明細書に開示される。
【0090】
本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態によってある範囲に限定されるものではない。それどころか、本明細書に記載されるものに加えて本発明の種々の変形は、前述の記載から当業者にとって明らかになるだろう。このような変形は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
【0091】
それぞれの特許庁の下で可能な範囲で、本明細書で引用される全ての特許、出願、公開公報、試験方法、文献、及び他の試料は、本明細書に参照により援用される。
【0092】
以下の実施例は、上述した本発明を説明するが、いずれの方法でも本発明の範囲を限定することは意図されない。関連技術分野の当業者などに既知の他の試験モデルはまた、特許請求される発明の有利な効果を判断することができる。
【実施例】
【0093】
序論
幅広いファミリーのウイルスの大きさの正二十面体殻に自己組織化する自然によって呼び起こされた一式の分子構築ブロックの好結果の計画を報告する。ＤＮＡオリガミから構築されたブロックは、正二十面体殻あたりの異なる結合の最小数を規定する対称性原理にしたがって設計され、プログラム可能な鍵と鍵穴相互作用パターン及び強度を有する。これらのプログラム可能な殻は、ウイルスと宿主細胞との間の分子的相互作用を効果的に遮断するためにあらかじめ設計された高分子殻中にウイルス全体を捕捉する概念を仮定すると、ウイルス非活性化の新規経路を提供できる可能性がある。この殻は、低温電子顕微鏡法及び電気泳動移動度シフト解析（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙｓ）で検証すると、欠陥がほとんどなく、且つ高収率で、頑強に形成される。ウイルス補足及び相互作用遮断概念の実現可能性を実証するために、Ｂ型肝炎ウイルスコア粒子を用いた。ウイルス感染症と戦う新規方法の将来性を実現することには、現在治療不能なウイルス性疾患によって引き起こされる疾患、医療費を低減し、経済的負担を軽減する可能性がある。そのうえ、発明者らの方法はいかなる特定のウイルス構造又は宿主―ウイルス相互作用にも依存しないので、発明者らの方法には、新たに出現し、且つまだ記述されていないウイルスに対する特別な可能性がある。「洗練された」抗原応答薬を創作する目的で殻の機能性をさらに拡張するための実施例を示す。抗ウイルス薬に加えて、これらの殻の潜在的な応用には、ワクチン接種、薬物送達担体、保護的貯蔵容器及び合成オルガネラ用の抗原担体として使用するための構築物区画化システムが含まれる。
幅広いファミリーのウイルスの大きさの正二十面体殻に自己組織化する自然によって呼び起こされた一式の分子構築ブロックの好結果の計画を報告する。ＤＮＡオリガミから構築されたブロックは、正二十面体殻あたりの異なる結合の最小数を規定する対称性原理にしたがって設計され、プログラム可能な鍵と鍵穴相互作用パターン及び強度を有する。これらのプログラム可能な殻は、ウイルスと宿主細胞との間の分子的相互作用を効果的に遮断するためにあらかじめ設計された高分子殻中にウイルス全体を捕捉する概念を仮定すると、ウイルス非活性化の新規経路を提供できる可能性がある。この殻は、低温電子顕微鏡法及び電気泳動移動度シフト解析（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙｓ）で検証すると、欠陥がほとんどなく、且つ高収率で、頑強に形成される。ウイルス補足及び相互作用遮断概念の実現可能性を実証するために、Ｂ型肝炎ウイルスコア粒子を用いた。ウイルス感染症と戦う新規方法の将来性を実現することには、現在治療不能なウイルス性疾患によって引き起こされる疾患、医療費を低減し、経済的負担を軽減する可能性がある。そのうえ、発明者らの方法はいかなる特定のウイルス構造又は宿主―ウイルス相互作用にも依存しないので、発明者らの方法には、新たに出現し、且つまだ記述されていないウイルスに対する特別な可能性がある。「洗練された」抗原応答薬を創作する目的で殻の機能性をさらに拡張するための実施例を示す。抗ウイルス薬に加えて、これらの殻の潜在的な応用には、ワクチン接種、薬物送達担体、保護的貯蔵容器及び合成オルガネラ用の抗原担体として使用するための構築物区画化システムが含まれる。
【0094】
抗ウイルス概念を発展させるために、哺乳類の免疫防御が侵入するウイルス病原からどのように発明者らを保護することができるかを検討した。他方で、抗体を中和することは、ウイルス上の特定の抗原に結合する抗体で現れることができ、例えば、ウイルスと宿主細胞受容体との相互作用を抑制することにより、又はゲノムの脱殻を抑制するためにウイルスカプシドに結合することにより、感染症を阻止することができる。残念ながら、病原体に応答して発明者らの体内で発生する抗体の多くは、中和活性を有していない。そのうえ、宿主が有効な中和抗体を産生するには時間がかかる。この期間中に、ウイルスは野放しで増幅し、伝搬するか又は持続性さえ確率することができ、且つ他の個人に伝染してよい。ウイルス侵入者には、抗体中和を回避する機構を進化させてきたものもある。例えば、ＨＩＶは、柔軟なタンパク質鎖によって感受性表面領域を遮蔽し、そしてＨＣＶは自身を脂質中に飲み込ませる（７、８）。
【0095】
抗体はウイルスよりずっと小さく、概して抗体当たりウイルスの表面上の小部分しか覆わない。他方、哺乳類細胞も、インターフェロン及び、ＨＩＶ－１レトロウイルスカプシド全体を囲む六角形殻に集合する、自然の抑制因子ＴＲＩＭ５αによって例示される（９、１０）、ウイルスの侵入を阻止することができる（レトロ）ウイルス抑制因子を産生することができる。ＴＲＩＭ５αの例は、ウイルス封入は原則として有効な治療方針となる可能性があるが、自然のＴＲＩＭ５α格子は特異性が高く、容易に改変することができず、異なるウイルスに適合することもできない。
【0096】
ウイルス不活性化の手段は、中和抗体及びＴＲＩＭ５αなどの格子形成する自然の抑制因子のものの機能的側部を合成的に再形成し、統合することを前提とする。ウイルスと宿主細胞との分子的相互作用を効果的に遮断する目的で高面積のウイルス表面を覆うために、ウイルスを新規に設計された高分子殻中に補足することを想定する。内部が、ウイルスに釣り合った対称性でウイルス認識部分をモジュール方式で非常に多価に結合できる殻を想定する。同じ種類の殻「プラットフォーム」を、多様なウイルスを標的とするようモジュール式に用いることもある。形成される結合の数が増えるにつれ、親和性は指数関数的に増加するので（１１）、多価結合は、ウイルスを、個々に弱いウイルス結合分子で機能を持たせた殻内に効果的に捕捉するアビディティーの活用を可能とする。結合される予定のウイルス結合分子として、抗体、抗体断片又はアプタマーを想定し、これらの全てを、原則として標的ウイルスについての詳細な知識なしで作製することができ、これらはいずれも事前のいかなるウイルス中和機能も必要としない。これは、発明者らの概念では、ウイルスに直接接触する部分よりむしろ、殻材料がウイルス表面への接近を阻止するからである。したがって、発明者らの概念を用いると、非中和抗体、弱く結合するアプタマー、又は幅広い様々はウイルスクラスと結合するヘパリンなどの他の分子を含む、任意のウイルスバインダーを効果的な抗ウイルス薬を作製するために殻上の内部コーティングとして利用することができる。
【0097】
ここで、ウイルス全体を収容することができる使用者が定義する大きさの厚くて頑強な高分子殻を作製する設計原理を報告する。このような人工的なウイルスサイズの高分子殻の構築を構造的品質高く、高収率で成し遂げた。標的ウイルスを飲み込むための開口を特徴とする既定の部分的殻を構築するために発明者らの計画をさらに修正した。ウイルスを捕捉し、且つ相互作用を遮断する概念の実現可能性を実証するためにＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コア粒子を用いた。本論文ではまた、「より洗練された」抗原応答薬を創出するために殻の機能性をさらに拡張する手段も記載する。
【0098】
手短に言えば、発明者らの高分子殻の構築は、いくつかの理論的概念に依存している。第１に、ウイルスカプシドなどの分子複合体の自己組織化は典型的には、外部からの誘導又はエネルギーの投入なしで進行する。したがって、望まれた標的殻についての全ての情報は、殻サブユニットの形状によって、及びそれらの間の局所的相互作用によってコードされる必要がある（１３）。タンパク質の設計者は以前、適したオリゴマー化対称性を示す自然の非ウイルスタンパク質スキャフォールドを組み合わせ、修正することにより人工的高分子ケージを創出することに成功した（１４～１７）。しかしながら、これらの人工的に設計されたタンパク質ケージは、大多数の自然のウイルスよりずっと小さく、容易に修正することができず、したがって発明者らの目的に適していない。ＤＮＡナノ加工の技術者は以前、頂角を変えることにより異なるワイヤフレーム多面体に集合するようプログラムされた、頂点を第１に構築することによりＤＮＡオリガミ法に基づく多様な多面体構造を作製した（１８）。収率は低かったが、その理由は頂点の柔軟性により標的構造への特異性が制限されたからであった。経時的により強固な頂点及びより大きな高次のワイヤフレーム多面体に経時的に集合するブロックを構築した（１９）。ブロック及び生じる多面体についての収率は高かったが、経時的で段階的な集合は長ったらしく、生じるワイヤフレーム多面体はいまだにあまりにも骨格のようであり、穴だらけすぎてウイルスの表面を効果的に覆うことはできない。本研究においては、精巧な制御可能性、ウイルスに釣り合った大きさ及び対称性、並びに高収率の集合を実証する人工的なＤＮＡに基づく殻を構築することについに成功し、したがってウイルスなどの大きな自然の高分子集合体と干渉する強力なプラットフォームを提供する。
【0099】
実施例１：殻設計原理
Ｃａｓｐａｒ及びＫｌｕｇは１９６２年、１２個の６回対称頂点と５回対称頂点との系統的置換により、タンパク質位置の２Ｄ三角形分割ネットを正の曲率を有する３Ｄ表面にマッピングすることにより自然のウイルスカプシドの構造を決定する幾何学的原理を解明した（２０）。近年拡張されたＣａｓｐｅｒ及びＫｌｕｇの理論によると（２１）、正二十面体カプシド内のタンパク質によって占有される別々の環境の数は、ウイルスの三角形分割数（Ｔ－ｎｕｍｂｅｒ）によって説明され、これを正二十面体カプシド内の５量体及び６量体の配置の三角形ネット投影によって計算することができる（Ｔ＝ｈ２＋ｈｋ＋ｋ２、図１Ａ）。自然のカプシドを構築するために必要とされるタンパク質の総数は、Ｔ×６０である。この理由は、自然のタンパク質サブユニットは初期値で非対称であり、２０個の三角形の面を有する正二十面体殻に集合することができる３回対称サブユニットを構築するためのホモ三量体形成は必要最小限だからである（図１Ｂ、左：Ｔ＝１マウスの微小ウイルス（２２））。大きなゲノムを収容するための大きなカプシドを構築するために、ウイルスは異なる立体構造をとることができる１つ超のカプシドタンパク質又は複数のカプシドタンパク質を使用する。例えば、ササゲクロロティックモトルウイルス（ｃｏｗｐｅａ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ）カプシド（２３）は、合計１８０個の同一配列のタンパク質からこのタンパク質が３個の異なる立体構造で生じるＴ＝３カプシドに集合する（図１Ｂ、右）。
Ｃａｓｐａｒ及びＫｌｕｇは１９６２年、１２個の６回対称頂点と５回対称頂点との系統的置換により、タンパク質位置の２Ｄ三角形分割ネットを正の曲率を有する３Ｄ表面にマッピングすることにより自然のウイルスカプシドの構造を決定する幾何学的原理を解明した（２０）。近年拡張されたＣａｓｐｅｒ及びＫｌｕｇの理論によると（２１）、正二十面体カプシド内のタンパク質によって占有される別々の環境の数は、ウイルスの三角形分割数（Ｔ－ｎｕｍｂｅｒ）によって説明され、これを正二十面体カプシド内の５量体及び６量体の配置の三角形ネット投影によって計算することができる（Ｔ＝ｈ２＋ｈｋ＋ｋ２、図１Ａ）。自然のカプシドを構築するために必要とされるタンパク質の総数は、Ｔ×６０である。この理由は、自然のタンパク質サブユニットは初期値で非対称であり、２０個の三角形の面を有する正二十面体殻に集合することができる３回対称サブユニットを構築するためのホモ三量体形成は必要最小限だからである（図１Ｂ、左：Ｔ＝１マウスの微小ウイルス（２２））。大きなゲノムを収容するための大きなカプシドを構築するために、ウイルスは異なる立体構造をとることができる１つ超のカプシドタンパク質又は複数のカプシドタンパク質を使用する。例えば、ササゲクロロティックモトルウイルス（ｃｏｗｐｅａ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ）カプシド（２３）は、合計１８０個の同一配列のタンパク質からこのタンパク質が３個の異なる立体構造で生じるＴ＝３カプシドに集合する（図１Ｂ、右）。
【0100】
正二十面体殻に必要とされる局所的対称性に適応するために、ＤＮＡオリガミの方法を用いて強固な擬対称性三角形サブユニットを作製した（図１Ｃ、左）（２４～２９）。ＤＮＡオリガミは、構造的に明確な３Ｄ形状を有するメガダルトンスケールの別々の物体を作製することができる生体分子設計法である（３０、３１）。生じる物体は、高次多面体（１８）、及び格子（３２～３５）へのハイブリッド形成により集合することができる。発明者らのサブユニットは、ハイブリッド形成の代わりに塩基対スタッキング（３６）を用いる側部辺対辺相互作用を介して高次物体に自己組織化するよう設計され、これによりタンパク質の鍵と鍵穴相互作用を模倣する。側部辺対辺塩基対スタッキング相互作用は、モジュール式に活性化及び不活性化することができ、部分的殻を構築する能力を活用した。作製した三角形サブユニットの全ての側部は、自然のカプシドの１つのタンパク質サブユニットに相当する。殻形状全体は、三角形サブユニットによって提供される幾何学的命令により制御される。これらの命令は、各三角形の辺の特定の長さの選択により、一組の異なる三角形ユニット内の対での辺対辺相互作用を制御するための辺当たりの固有の形態的パターンにより、及び辺の斜角の特定の選択により与えられ、これが殻の有効曲率を制御することとなる。頂点の三角形の辺のらせん状結合性を調整することにより標的斜角を実現し、これにはデフォルトの多層ＤＮＡオリガミ結合規則からの大幅な逸脱が必要とされた。望まれる幾何学的仕様を満たした候補設計解決法を生み出すために、弾性ネットワーク誘導分子動力学シミュレーション（３８）と対にされるｃａＤＮＡｎｏ（３７）による反復設計を用いた（図１Ｃ）。
【0101】
発明者らのシステムにおいては、各三角形の辺は、１つのタンパク質を表すので、Ｃａｓｐｅｒ及びＫｌｕｇの三角形分割数は、特定の殻を構築するために必要とされる固有の三角形の辺の数を示す。したがって、Ｔ＝１及びＴ＝３殻はともに、Ｔ＝１のための３個の同一の辺（図１Ｄ、右）及びＴ＝３殻のための３個の異なる辺（図１Ｅ、左）を有する単一の三角形で構築されてよい。Ｔ＝４殻は、例えば、３個の固有の辺を有する一方の三角形及び３個の同一の辺を有する別のものなどの、２個の別々の三角形サブユニットを必要とする（図１Ｅ、中央）。Ｔ＝９殻は、各々が３個の固有の辺を有する、３個の異なる三角形を必要とする（図１Ｅ、右）。Ｔ数が大きくなるにつれ、２０Ｔで与えられる、標的殻あたりの三角形の総数も大きくなる。特定の標的殻のための全ての三角形の斜角が同一である設計解決法を用いた。Ｔ＝９は発明者らが構築しようとした最大の殻だったが、小さな八面体容器（「Ｏ」）のための三角形サブユニットも設計した（図１Ｄ、左）。
【0102】
実施例２：サブユニット及び殻構造
ＤＮＡ配列に異なる三角形設計をコードし（以下の方法を参照）、対応する一組のオリゴヌクレオチドを産生し、そして以前記載した手順にしたがってワンポット混合物の三角形変異体を自己組織化した（３９）。ゲル電気泳動折りたたみ品質解析から、三角形サブユニット集合体の収率を改善するために何回か設計反復が必要だった（図５）。設計された三角形の３Ｄ構造を確認するために、低温透過型電子顕微鏡（ｃｒｙｏ－ＥＭ）単粒子解析を用いて全ての三角形サブユニットを調べた（図２）。生じる３Ｄ電子マップは、１３～２２オングストローム（Å）に及ぶ解像度を有し（図６～１３）、これにより全体の３Ｄ形状、斜角、全てのらせんの正確な位置決め、辺対辺ドッキング用の設計された側方突出及びくぼみの正確な形状、並びに系統的な折りたたみ欠陥の発生を評価できた。例えば、Ｔ＝９殻（Ｔｈｅｘ１）のための三角形の１つは、頂点の１つで側部辺対辺相互作用を形成する能力を低下させる系統的な構造欠陥を有した（図１４）。ｃｒｙｏ－ＥＭデータに基づいて、設計を洗練させ、欠陥を除去した。
ＤＮＡ配列に異なる三角形設計をコードし（以下の方法を参照）、対応する一組のオリゴヌクレオチドを産生し、そして以前記載した手順にしたがってワンポット混合物の三角形変異体を自己組織化した（３９）。ゲル電気泳動折りたたみ品質解析から、三角形サブユニット集合体の収率を改善するために何回か設計反復が必要だった（図５）。設計された三角形の３Ｄ構造を確認するために、低温透過型電子顕微鏡（ｃｒｙｏ－ＥＭ）単粒子解析を用いて全ての三角形サブユニットを調べた（図２）。生じる３Ｄ電子マップは、１３～２２オングストローム（Å）に及ぶ解像度を有し（図６～１３）、これにより全体の３Ｄ形状、斜角、全てのらせんの正確な位置決め、辺対辺ドッキング用の設計された側方突出及びくぼみの正確な形状、並びに系統的な折りたたみ欠陥の発生を評価できた。例えば、Ｔ＝９殻（Ｔｈｅｘ１）のための三角形の１つは、頂点の１つで側部辺対辺相互作用を形成する能力を低下させる系統的な構造欠陥を有した（図１４）。ｃｒｙｏ－ＥＭデータに基づいて、設計を洗練させ、欠陥を除去した。
【0103】
その後反復して改善した三角形変異体を、ｃｒｙｏ－ＥＭを用いる直接画像化（ｄｉｒｅｃｔ ｉｍａｇｉｎｇ）により確認した、予想される寸法を有する閉じた殻に首尾よく集合した（図２Ａ、追加画像については図１５～１９を参照）。２Ｄクラスの平均（図２Ｂ～Ｆ）及び個別の粒子（図２Ａ）の検査から、粒子が設計された対称性を示すことが明らかになった。例えば、八面体（４回、３回、２回、図２Ｂ）及びＴ＝１殻（５回、３回、２回、図２Ｃ）の３個の対称軸を明瞭に見ることができる。Ｔ数が大きい殻の粒子は、粒子あたりの三角形の数が多いので、より環状の外観を有し、且つＣａｓｐａｒ及びＫｌｕｇの表現から予測される根底にある三角形ネットが明瞭に見えるようになった（図２Ｄ～Ｆ）。個別の粒子は設計された対称性を示したので、それぞれの対称性を課すことにより殻の３Ｄマップを再構築した（図２Ｂ～Ｅ）。生じるマップは、２０～４０オングストローム（Å）に及ぶ解像度を有した。この八面体及びＴ＝１殻マップの解像度は、個別のＤＮＡ二重らせんを見分けるのに充分だった。Ｔ＝１殻については、いかなる事前の対称性も課さない３Ｄマップも計算し、このマップは低い解像度だが、充分に正二十面体であり、対称性を課して再構築した同系統のものと良く重なった。本研究により、正二十面体対称性の概念が首尾よく証明された（図１６Ｅ）。
【0104】
サブユニットーサブユニット相互作用の配向特異性の効果を解明するために、Ｔ＝１サブユニットの斜角を理想的な幾何学（α＝２０．９°）から変化させた。斜角を正二十面体の理想的なものから＋５°又は－５°偏向したＴ＝１三角形の２個の追加の変異体を設計した。斜角を減少又は増加させると、Ｔ＝１殻又は八面体に加えて、それぞれ大きな殻様構造の外観が生じた（図２０）。これらのデータに基づいて、発明者らは正しい標的斜角は、＋－５°の範囲内に適合する必要があると結論付ける。
【0105】
発明者らはまた、対称性を課すことの有無の両方で八面体ｃｒｙｏ ＥＭマップを首尾よく構築した（図１５Ｅ）。１つ又は複数の三角形を欠いた殻マップを別々に再構築し（図１５Ｄ、１６Ｄ）、標的品質の定量評価を可能にし、且つ設計された対称性全体も表示した。ネガティブ染色ＥＭ断層撮影法で最大のＴ＝９殻を調べた（図２Ｆ、図２１Ｅ）。集合したＴ＝９殻の断層像による断面から、充分に閉じた殻、並びに設計されたＴ数にしたがった５量体の正しい配置が示される（図２Ｆ及び図２１Ｅの矢印）。示される一組の殻は、～５０ｎｍから～２８０ｎｍに及ぶ内部空洞を有する。この大きさの範囲は、多くのウイルス病原体の寸法に対応する。
【0106】
実施例３：殻の収率及び安定性
低密度電気泳動移動度シフト解析（Ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）（図３Ａ、図２２）から、三角形モノマーの消失により進行された殻集合体オリゴマー化学種の存在を示すスメアの出現、その後主要な高強度のバンドの出現が明らかになり、これらは全ての場合において完全に形成された殻に対応した。八面体及びＴ＝１殻は、それぞれ１５分及び６０分以内に形成され、これは、これらの殻をワンポット三角形折り畳み反応中に直接自己組織化することを可能にするのに充分速い（図２４）。八面体は、～９５％の最終的な完全な殻収率で生じた。Ｔ＝１殻は、最大７０％の収率で生じた。Ｔ＝３及びＴ＝４殻は、約４０％の収率で生じた（図３Ａ）。全体として、分子量が４３～９２５メガダルトンに及ぶ場合（設計に応じて、８～１８０個の三角形サブユニット）、殻集合体は、任意の他の以前報告されたワンポットで集合した既定の大きさの人工高分子集合体よりかなり大きかっただけでなく、発明者らの殻はまた、以前構築された核酸多面体と比較して桁で改善された収率で生じた（１８，１９）。
低密度電気泳動移動度シフト解析（Ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）（図３Ａ、図２２）から、三角形モノマーの消失により進行された殻集合体オリゴマー化学種の存在を示すスメアの出現、その後主要な高強度のバンドの出現が明らかになり、これらは全ての場合において完全に形成された殻に対応した。八面体及びＴ＝１殻は、それぞれ１５分及び６０分以内に形成され、これは、これらの殻をワンポット三角形折り畳み反応中に直接自己組織化することを可能にするのに充分速い（図２４）。八面体は、～９５％の最終的な完全な殻収率で生じた。Ｔ＝１殻は、最大７０％の収率で生じた。Ｔ＝３及びＴ＝４殻は、約４０％の収率で生じた（図３Ａ）。全体として、分子量が４３～９２５メガダルトンに及ぶ場合（設計に応じて、８～１８０個の三角形サブユニット）、殻集合体は、任意の他の以前報告されたワンポットで集合した既定の大きさの人工高分子集合体よりかなり大きかっただけでなく、発明者らの殻はまた、以前構築された核酸多面体と比較して桁で改善された収率で生じた（１８，１９）。
【0107】
蛍光標識したサブユニットでのサブユニット交換実験から、殻に好都合な条件下で閉じた殻に組み込まれた三角形は、溶媒と交換しない（図３Ｂ、図２３Ａ、Ｂ）。平衡条件下（図３Ｂ、図２３Ｃ）、三角形は交換する。意図した応用では、殻は、サブユニットが生理液中に回転せず安定であるべきであり、これを集合後安定化により達成した。例えば、最初に殻を塩基対スタッキングが効果的なイオン強度が高い条件で集合し、その後三角形サブユニットの辺に位置する戦略的に配置されたシアノビニルカルバゾール（ＣＮＶＫ）部分を用いて辺対辺スタッキング接触を共有結合的な光架橋を行い、これにより３６５ｎｍ光での照明時に共有結合的な三角形間架橋が形成される（図３Ｃ）（４０）。ＵＶで照明し、ＣＮＶＫで就職した殻の電気泳動移動度シフト解析（Ｇｅｌ－ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）から、非照明の殻は低塩電気泳動条件下でばらばらに壊れたが、照明した殻は安定したままであることが明らかになり、したがって三角形間共有結合を確信させた（図３Ｃ）。生理的条件に移動するために、以前記載したＵＶ点溶接による内部共有結合を有する殻三角形サブユニットを安定化することも首尾よく調べた（４１）。その上、この殻をオリゴリジンとＰＥＧオリゴリジンの混合物でコーティングすると（４２）、殻が未変化のままの条件で、殻をマウスの血清に移動させることができる（図３Ｄ）。
【0108】
実施例４：ウイルスを捕捉し、中和する
発明者らの殻システムが、ウイルス表面が潜在的なウイルス細胞相互作用することを阻止する複数の戦略を想定する。１つの戦略は、三角形構築ブロックから保護殻をウイルスの表面上に自己組織化することにある。第２の戦略は、ウイルスが中央にあるままで、２個の対向する半分の殻により単一のウイルスに配位する又は飲み込むことである。第３の戦略は、嚢状葉植物が餌食を捕獲する方法と同様に、充分大きな侵入門を特徴とするあらかじめ作られた殻内部にウイルスを飲み込むことにある。後者の２個の戦略を実証する。この課題を達成する目的で、自己集合体を、半分の八面体（図４Ａ）、半分のＴ＝１殻（図４Ｂ）、及び五角形の頂点を欠いた「捕捉」Ｔ＝１殻（図４Ｃ）を含む、使用者が規定する殻断片を形成することに導くよう三角形サブユニットの新規な変異体を設計した。完全な八面体の代わりに半分を調製するために、鎖短縮か不対のチミジンを加えることのいずれかにより対応するサブユニットの三角形の辺の１つ上の塩基対スタッキング接触を不活性化した（図４Ａ、図２４Ａ、Ｄを参照）。半分のＴ＝１殻を作製するために、閉じた５量体を形成する一方のもの、及び５量体の辺上に結合する別のものの、２個の三角形サブユニットが必要とされる（図４Ｂ、図２４Ｂ、Ｅを参照）。五角形の頂点を欠いたＴ＝１殻変異体を構築するためには、３種類の三角形サブユニット変異体が必要とされる（図４Ｃ、図２４Ｃ、Ｆを参照）。修飾した殻は、ｃｒｙｏ ＥＭ溶液構造によって検証され、三角形構築ブロックから首尾よく自己組織化した（図４Ｄ～Ｆ、図２５～２７を参照）。生じる２Ｄクラス平均及び３Ｄ電子密度マップから、期待される構造特徴が明らかにされた。発明者らは既に、ｃｒｙｏ ＥＭマップ中で「突起物（ｓｐｉｋｅｓ）」として現れた、ウイルス結合部分を修飾した殻サブユニット上に固定するための三角形の辺あたり９か所の部位を含んでいたこと記述する（図４Ｄ、Ｅ、矢印）。
発明者らの殻システムが、ウイルス表面が潜在的なウイルス細胞相互作用することを阻止する複数の戦略を想定する。１つの戦略は、三角形構築ブロックから保護殻をウイルスの表面上に自己組織化することにある。第２の戦略は、ウイルスが中央にあるままで、２個の対向する半分の殻により単一のウイルスに配位する又は飲み込むことである。第３の戦略は、嚢状葉植物が餌食を捕獲する方法と同様に、充分大きな侵入門を特徴とするあらかじめ作られた殻内部にウイルスを飲み込むことにある。後者の２個の戦略を実証する。この課題を達成する目的で、自己集合体を、半分の八面体（図４Ａ）、半分のＴ＝１殻（図４Ｂ）、及び五角形の頂点を欠いた「捕捉」Ｔ＝１殻（図４Ｃ）を含む、使用者が規定する殻断片を形成することに導くよう三角形サブユニットの新規な変異体を設計した。完全な八面体の代わりに半分を調製するために、鎖短縮か不対のチミジンを加えることのいずれかにより対応するサブユニットの三角形の辺の１つ上の塩基対スタッキング接触を不活性化した（図４Ａ、図２４Ａ、Ｄを参照）。半分のＴ＝１殻を作製するために、閉じた５量体を形成する一方のもの、及び５量体の辺上に結合する別のものの、２個の三角形サブユニットが必要とされる（図４Ｂ、図２４Ｂ、Ｅを参照）。五角形の頂点を欠いたＴ＝１殻変異体を構築するためには、３種類の三角形サブユニット変異体が必要とされる（図４Ｃ、図２４Ｃ、Ｆを参照）。修飾した殻は、ｃｒｙｏ ＥＭ溶液構造によって検証され、三角形構築ブロックから首尾よく自己組織化した（図４Ｄ～Ｆ、図２５～２７を参照）。生じる２Ｄクラス平均及び３Ｄ電子密度マップから、期待される構造特徴が明らかにされた。発明者らは既に、ｃｒｙｏ ＥＭマップ中で「突起物（ｓｐｉｋｅｓ）」として現れた、ウイルス結合部分を修飾した殻サブユニット上に固定するための三角形の辺あたり９か所の部位を含んでいたこと記述する（図４Ｄ、Ｅ、矢印）。
【0109】
ウイルス捕捉能力を実証するために、上述した殻変異体の各々の内部にＢ型肝炎ウイルスコア粒子（図４Ｇ）を捕捉した。特異性を与えるために、ｓｓＤＮＡ標識抗体の三角形サブユニット上の一組の固定点へのハイブリッド形成により粒子状ウイルスカプシドを殻の内部に結合し、認識する抗ＨＢｃ １７Ｈ７（アイソタイプＩｇＧ－２ｂ）抗体を結合し、これにより殻の内部が標的ウイルスにとって特異的に粘着性になると予想した。実際に、ＨＢＶコア粒子をこのように調製したＤＮＡ殻と約１：１の化学量論でインキュベートすると、ネガティブ染色ＴＥＭ撮像法によって見られるように、全ての遊離ウイルス粒子は殻粒子により効果的に取り込まれた（図２８）。殻内部に結合したＨＢＶ抗体の非存在下では、いかなるＨＢＶ結合も観察せず（図２９Ａ）、他の標的に特異的な抗体の存在下でも観察しなかった（図２９Ｂ）。殻に標的ウイルスが適当に捕捉されたことを確かめるために低温電子顕微鏡観察を実行し、捕捉されたＨＢＶコア粒子を含む八面体及びＴ＝１殻の３Ｄマップを再構築した（図４Ｈ、Ｉ、図３０、３１を参照）。発明者らの見解ではこれらのマップは提案したウイルス補足システムの実現可能性を鮮やかに実証する。
【0110】
半分の八面体の変異体では、大部分の粒子は単一のＨＢＶコア粒子を配位する２個の半分の八面体から成る（図４Ｈ）。共通のＨＢＶコア粒子上に多様な相対的立体構造の２個の半分の八面体殻を観察する（図３０）。ｃｒｙｏ－ＥＭマップはまた、ＤＮＡ殻を捕捉されたＨＢＶコア粒子と結合する抗体の痕跡も明らかにする（図４Ｈ、左）。同様の抗体の痕跡は、高密度の閾値ではあるが、半分のＴ＝１殻－ＨＢＶ複合体を有するマップ中にも見出すことができる（図４Ｉ、左）。五角形の頂点を欠いたＴ＝１殻に捕捉されたＨＢＶコア粒子のｃｒｙｏ－ＥＭマップを再構築できなかったのは、ＨＢＶコア粒子の位置がばらつき過ぎていたからである。代わりに、ネガティブ染色ＴＥＭ画像から、これらの「嚢状葉植物」様殻変異体が１個超のＨＢＶコア粒子でさえ飲み込む能力があることが立証される（図４Ｊ、図２８Ｅ、Ｆを参照）。
【0111】
そして、殻のウイルス表面相互作用―抑制能力の概念実証として、ＨＢＶ結合抗体を細胞表面を模倣する固相上に固定化して生体外ウイルス遮断アッセイを実行した（図４Ｋ、図３２）。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合した直交ＨＢＶコア特異的レポーター抗体の結合を介してＨＢＶコア粒子が固相に結合する程度を評価した。従来の酵素結合免疫吸着測定法と同様に、表面に結合し、且つ結合に利用できる残留ＨＢＶコア粒子が比色シグナルのＨＲＰ触媒産生により検出されることになる。ウイルスを飲み込む殻（半分のＴ＝１殻）の存在下、ウイルスの固相との相互作用は、最大９９％遮断され、したがって殻のＨＢＶコアに対する強い結合及び殻の望ましい相互作用―抑制能力が確認された。ＨＢＶ捕捉抗体（抗ＨＢｃ １７Ｈ７）なしの殻及び殻なしで捕捉抗体（抗ＨＢｃ １７Ｈ７）で直接インキュベートしたＨＢＶコア粒子のコントロールは全て、０％のウイルス遮断率を表す裸のＨＢＶコア粒子により生成されたシグナルと比較して最小限のウイルス遮断率にしかならなかった。注目すべきことに、殻あたりたった４個の捕捉抗体で８０％を超えるウイルス遮断効率を達成し、発明者らの殻が立体的妨害によりウイルスを外部から遮蔽する能力が示される。
【0112】
実験例５：殻の機能性を拡張する
現在の殻変異体は、捕捉されたウイルス粒子周囲に～１５ｎｍ厚さのＤＮＡ層を加え（ウイルスバインダーの層によって作成された内部空間は計数しない）、このような厚いエンベロープを介してどのように細胞―ウイルス相互作用がまだ起こることができるのか想像するのは難しい。しかしながら、発明者らの現在の設計は、特に三角形サブユニットの空洞である、いくつかの開口を特徴とし、これにより残留相互作用が許容されることができる。三角形サブユニットの空洞を密封する手段の証明として、殻サブユニット中の三角形の空洞の寸法におよそ一致する三角形断面を有するＤＮＡブリックを構築した。複数の付着点を介してこのブリックをＴ＝１殻三角形の外面に固定し（設計の詳細については図３３、ブリックのｃｒｙｏ－ＥＭ溶液構造については図３４を参照）、このブリックを殻サブユニット中の空洞に部分的にはめ込んだ。ブリックはまた、細胞表面を殻に捕捉されたウイルスの表面からもう４０ｎｍさらに分離するスペーサーとして働くこともできる。ブリックをすでに集合した殻に加えることができ、あるいは三角形及びブリックユニットを最初に二量体化し、その後殻の集合を引き起こすこともできる。両方の手段は、未修飾のＴ＝１殻と同一の条件下で完全に集合した「スパイク付きの（ｓｐｉｋｙ）」Ｔ＝１殻をもたらす。ｃｒｙｏ－ＥＭ単粒子解析を用いてスパイク付きのＴ＝１殻の構造を解析した（図５Ａ、図３５）。生じたマップは未修飾のＴ＝１殻のマップと容易に重なるが、三角形殻サブユニットの中心開口は今では加えたチャネルモジュールにより封鎖されている（図３５Ｅ）。ＤＮＡブリックによる空洞―はめ込みが容易に働いたという事実から、殻の頑強さ及び構造的モジュール方式が実証される。ブリックはまた前述したＤＮＡに基づく膜チャネル（４３）又は殻に結合したいと望む任意の他の機能モジュールの模倣物とみなされてよい。
現在の殻変異体は、捕捉されたウイルス粒子周囲に～１５ｎｍ厚さのＤＮＡ層を加え（ウイルスバインダーの層によって作成された内部空間は計数しない）、このような厚いエンベロープを介してどのように細胞―ウイルス相互作用がまだ起こることができるのか想像するのは難しい。しかしながら、発明者らの現在の設計は、特に三角形サブユニットの空洞である、いくつかの開口を特徴とし、これにより残留相互作用が許容されることができる。三角形サブユニットの空洞を密封する手段の証明として、殻サブユニット中の三角形の空洞の寸法におよそ一致する三角形断面を有するＤＮＡブリックを構築した。複数の付着点を介してこのブリックをＴ＝１殻三角形の外面に固定し（設計の詳細については図３３、ブリックのｃｒｙｏ－ＥＭ溶液構造については図３４を参照）、このブリックを殻サブユニット中の空洞に部分的にはめ込んだ。ブリックはまた、細胞表面を殻に捕捉されたウイルスの表面からもう４０ｎｍさらに分離するスペーサーとして働くこともできる。ブリックをすでに集合した殻に加えることができ、あるいは三角形及びブリックユニットを最初に二量体化し、その後殻の集合を引き起こすこともできる。両方の手段は、未修飾のＴ＝１殻と同一の条件下で完全に集合した「スパイク付きの（ｓｐｉｋｙ）」Ｔ＝１殻をもたらす。ｃｒｙｏ－ＥＭ単粒子解析を用いてスパイク付きのＴ＝１殻の構造を解析した（図５Ａ、図３５）。生じたマップは未修飾のＴ＝１殻のマップと容易に重なるが、三角形殻サブユニットの中心開口は今では加えたチャネルモジュールにより封鎖されている（図３５Ｅ）。ＤＮＡブリックによる空洞―はめ込みが容易に働いたという事実から、殻の頑強さ及び構造的モジュール方式が実証される。ブリックはまた前述したＤＮＡに基づく膜チャネル（４３）又は殻に結合したいと望む任意の他の機能モジュールの模倣物とみなされてよい。
【0113】
ウイルス捕捉実験において（図４）三角形あたり最大９個の抗体を取り付けた、すなわち、半分のＴ＝１殻は潜在的に、９０個のウイルス結合部分を特徴とすることができる。ずっと多い結合部位を作製することも可能であるが、９０はすでに非常に大きな数である。これらの部位のいくつかを、特異性を高める目的で追加のウイルス結合部分を取り付けるために、又は捕捉されたウイルスの表面タンパク質をそり落とすことにより殻にさらなる殺ウイルス活性を与えることもある、トリプシン又はプロテイナーゼＫなどのタンパク質分解活性を有する分子を結合するために用いることもできる。
【0114】
実施例６：ウイルス捕捉
ウイルスを、充分に大きな開口を特徴とするあらかじめ集合した正二十面体殻セグメント中に捕捉、又はこれによって配位することができる（図４５ａ、４５ｂ、図２８）。あるいは、保護殻をウイルス粒子の表面に直接形成することができる（図４５ｃ）。両方の手段を、Ｂ型肝炎ウイルスコア粒子（ＨＢＶ）を用いて実行した実験で説明する（図４５ａ～ｃ挿入図、赤）。ＨＢＶに対する特異性を与えるために、ｓｓＤＮＡ標識抗体の三角形サブユニット上の一組の固定点へのハイブリッド形成により抗ＨＢｃ １７Ｈ７（アイソタイプＩｇＧ－２ｂ）をＤＮＡ殻に結合した（図４５ａ～ｃ挿入図、シアン）。ＨＢＶ抗体の非存在下ではいかなるＨＢＶ結合も観察せず（図２９）、他の標的に特異的な抗体の存在下でも観察しなかった（図２９）。
ウイルスを、充分に大きな開口を特徴とするあらかじめ集合した正二十面体殻セグメント中に捕捉、又はこれによって配位することができる（図４５ａ、４５ｂ、図２８）。あるいは、保護殻をウイルス粒子の表面に直接形成することができる（図４５ｃ）。両方の手段を、Ｂ型肝炎ウイルスコア粒子（ＨＢＶ）を用いて実行した実験で説明する（図４５ａ～ｃ挿入図、赤）。ＨＢＶに対する特異性を与えるために、ｓｓＤＮＡ標識抗体の三角形サブユニット上の一組の固定点へのハイブリッド形成により抗ＨＢｃ １７Ｈ７（アイソタイプＩｇＧ－２ｂ）をＤＮＡ殻に結合した（図４５ａ～ｃ挿入図、シアン）。ＨＢＶ抗体の非存在下ではいかなるＨＢＶ結合も観察せず（図２９）、他の標的に特異的な抗体の存在下でも観察しなかった（図２９）。
【0115】
捕捉されたＨＢＶコア粒子を有する八面体及びＴ＝１半分２０３殻の３Ｄ ｃｒｙｏ ＥＭマップを測定した（図４５ｄ、４５ｅ、図３０～３１）。半分の八面体変異体では、大部分の粒子は、中央に単一のＨＢＶコア粒子を配位する２個の対向する半分の八面体から成る（図４５ｄ、図３０）。顕微鏡写真及びｃｒｙｏ ＥＭマップはまた、ＤＮＡ殻を捕捉されたＨＢＶコア粒子に連結する抗体を示す痕跡も明らかにする（図４５ｄ、右）。同様の抗体の痕跡を半分のＴ＝１殻－ＨＢＶ複合体での画像データに見出すことができる（図４５ｅ、右）。内部空洞に複数のＨＢＶ粒子を収容することができる（図４５ｆ、図２８）５量体の頂点を欠いた大きなＴ＝１殻変異体中にもＨＢＶコア粒子を捕捉した（図４５ｆ）。
【0116】
捕捉されたウイルスが表面との相互作用を受けるのを防ぐ殻の能力を調べるために、ＨＢＶ結合抗体を固体表面上に固定化して生体外ウイルス遮断アッセイを実行した（図４５ｇ、図３２）。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合した直交ＨＢＶコア特異的レポーター抗体の結合を介してＨＢＶコア粒子が表面に結合する程度を定量化した。表面に結合する残留ＨＢＶコア粒子が比色シグナルのＨＲＰ触媒産生により検出される。
【0117】
ウイルスを飲み込む殻（半分のＴ＝１殻）の存在下では、ウイルスの表面との相互作用は最大９９％遮断され（図４５ｇ下）、したがって殻の相互作用―抑制能力が確認された。ＨＢＶ捕捉抗体を欠いた殻でのコントロール実験は、ベースラインのウイルス遮断率０％を表す裸のＨＢＶコア粒子により生成されたシグナルと比較して最小限のウイルス遮断率にしかならなかった。
【0118】
抗体と直接インキュベートされたが、殻が存在しないＨＢＶコア粒子は、表面との結合をごくわずかしか遮断しなかった。この知見から、たとえ抗体をＨＢＶ粒子より４００倍過剰に加えたとしても、抗体単独ではＨＢＶカプシド表面を充分に不動態化しないことが示される。しかしながら、対照的に、平均してわずか５個の抗体で機能を持たせた殻を用いると、８０％を超えるウイルス遮断効率を達成した。殻に５個超の抗体を用いると、遮断はほとんど完全だった（最大９９％）。したがってこのデータから、殻捕捉法は、ウイルス表面と周囲の殻との間にわずか少数の物理的相互作用しか形成されなかった場合でさえも、非常に有効であってよいことが示される。発明者らのデータから、殻内部にウイルスを保持するために用いられる抗体ではなく、殻が立体的妨害によりウイルスを外部から遮蔽することが示される。
【0119】
実施例７：ヒト細胞中のウイルスの中和
発明者らは、顕微鏡法とフローサイトメトリーを用いて、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）発現カセット（５９）を保有するアデノ随伴ウイルス血清型２（ＡＡＶ２）（４６）ウイルス粒子を用いてＤＮＡ－オリガミ半分八面体殻の中和能力を調べた（図４６ａ）。ＤＮＡ殻を上述したＵＶ点溶接及びＰＥＧ２４２―オリゴリジン／オリゴリジンで安定化した。ＴＥＭでの直接画像化（ｄｉｒｅｃｔ ｉｍａｇｉｎｇ）により見られるように、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下血清中で、殻内部を抗ＡＡＶ２抗体で機能を持たせたＤＮＡ半分殻中にＡＡＶ２粒子を首尾よく捕捉した（図４６ｂ）。ＡＡＶはＨＢＶと全く異なるウイルスファミリーに属するので、このデータはまた、異なる種類のウイルスを捕捉するウイルス結合部分を交換することにより、殻のモジュール方式も確立する。
発明者らは、顕微鏡法とフローサイトメトリーを用いて、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）発現カセット（５９）を保有するアデノ随伴ウイルス血清型２（ＡＡＶ２）（４６）ウイルス粒子を用いてＤＮＡ－オリガミ半分八面体殻の中和能力を調べた（図４６ａ）。ＤＮＡ殻を上述したＵＶ点溶接及びＰＥＧ２４２―オリゴリジン／オリゴリジンで安定化した。ＴＥＭでの直接画像化（ｄｉｒｅｃｔ ｉｍａｇｉｎｇ）により見られるように、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下血清中で、殻内部を抗ＡＡＶ２抗体で機能を持たせたＤＮＡ半分殻中にＡＡＶ２粒子を首尾よく捕捉した（図４６ｂ）。ＡＡＶはＨＢＶと全く異なるウイルスファミリーに属するので、このデータはまた、異なる種類のウイルスを捕捉するウイルス結合部分を交換することにより、殻のモジュール方式も確立する。
【0120】
半分の殻あたり平均して３６個の抗ＡＡＶ２抗体で機能を持たせたＤＮＡ半分殻及び基準としての遊離抗ＡＡＶ２抗体の用量反応曲線を測定することによりウイルス中和の有効性を定量化した（図４９）。ｅＧＦＰ陽性細胞の数は、フローサイトメトリー解析を用いた感染有効性の読み取りとして役立った。ＤＮＡ半分殻は、ＡＡＶ２を推定最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）～０．３ｎＭで中和した（図４９）。発明者らの条件では、ＩＣ５０は感染性ウイルス粒子あたり約２．５個の半分殻に対応した。ＤＮＡ半分殻の中和能力は、遊離抗ＡＡＶ２の活性と比較して増加した（図４６ｃ、４６ｄ、図４９）。この中和の強化は、蛍光顕微鏡画像で最も良く認められ（図４６ｄ）、ｅＧＦＰ陽性細胞はＡＡＶ２捕捉ＤＮＡ半分殻を含むサンプル中にはほとんど残っていないが、溶媒中に遊離している同一用量の抗ＡＡＶ２抗体に曝露されたサンプル中には多くのｅＧＦＰ陽性細胞が見える。この実験から、殻は生細胞を含む生理的条件で機能することが実証される。この実験からはまた、殻は既にかなり強力な抗ＡＡＶ２抗体の中和能力をさらに増大させることができることも示される。
【0121】
上の図４の生体外ＨＢＶ遮断実験で説明したのと同様に、中和能力の増強は、殻がウイルスを多価で捕捉し、殻材料はさらにウイルス表面妨害剤として寄与することを示唆する。
【0122】
結合した抗体がないＤＮＡオリガミ半分殻が効果を有するかどうかも調べて、試験した最高オリガミ濃度で低いが無視できない中和活性を見出した（図４９）。この活性は、ＰＥＧ－オリゴリジン／オリゴリジンコーティングＤＮＡ殻とＡＡＶ２粒子との間の静電相互作用から生じることを示唆する。そして、ＤＮＡ半分殻への曝露が細胞生存率に効果を有するかを調べ、本研究で用いられた濃度のいずれにもわたり有意な効果は見出されなかった（図４９）。
【0123】
考察
高収率及び高い忠実度で様々な大きさのウイルス様殻を自己組織化するための対称性に基づく手法を首尾よく実験的に実証した。この能力は、幾何学をサブナノメートルの精度で設計し、実現することができる特異的な鍵穴と鍵の相互作用を特徴とするパッチ状の粒子（４４）に相当する強固な構築ブロックによって可能となる。殻の構築ブロックを精巧にプログラムできると、侵入門を有する半分殻又は殻などの、規定サイズの部分的な殻をさらに構築することができ、このものを、ウイルスを捕捉し、不活性化するためのウイルス中和剤として提案する。この概念をモデルウイルス粒子としてのＨＢＶコア粒子で、試験し、そして発明者らの実験において、ＨＢＶを周囲の殻で飲み込むことにより最大９９％の不活性化を達成した。
高収率及び高い忠実度で様々な大きさのウイルス様殻を自己組織化するための対称性に基づく手法を首尾よく実験的に実証した。この能力は、幾何学をサブナノメートルの精度で設計し、実現することができる特異的な鍵穴と鍵の相互作用を特徴とするパッチ状の粒子（４４）に相当する強固な構築ブロックによって可能となる。殻の構築ブロックを精巧にプログラムできると、侵入門を有する半分殻又は殻などの、規定サイズの部分的な殻をさらに構築することができ、このものを、ウイルスを捕捉し、不活性化するためのウイルス中和剤として提案する。この概念をモデルウイルス粒子としてのＨＢＶコア粒子で、試験し、そして発明者らの実験において、ＨＢＶを周囲の殻で飲み込むことにより最大９９％の不活性化を達成した。
【0124】
発明者らの概念においては、全ての認識要素は、複数の拡散する構成成分間のカスケード反応に頼るよりナノ粒子上に統合される。これにより発明者らの概念は、潜在的な将来の生物医学的応用の重大な要件である、希釈の影響を受けない。ウイルスを捕捉し、不活性化するためのウイルス中和剤としての提案された応用以外に、発明者らの殻の変異体はまた、ワクチン接種用の抗原キャリア、遺伝子治療又は遺伝子改変用のＤＮＡ又はＲＮＡキャリア、薬物送達担体、保護的貯蔵容器として、又は合成オルガネラなどの区画化されたシステムを構築するために用いられることもある。殻は広範な内部空洞寸法を覆い、また例えば、一般的な遺伝子治療ベクターである、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（４５，４６）で送達することができるゲノム情報よりもずっと大きいものを収容することができる別の遺伝子導入ベクターとしての機会を提供してよい。送達される核酸を、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓに基づく遺伝子サイレンシング又は遺伝子改変手法をより安全で効率的にするタンパク質又はタンパク質複合体と結合することもある。
【0125】
自然のウイルスはタンパク質サブユニットから構築されるが、発明者らは純粋にＤＮＡから成る正二十面体殻を構築し、これによりウイルス構築原理をタンパク質化学から核酸の領域に取った。核酸は、耐久性があり、市販されており、且つやはり本研究で示したように容易に機能を持たせ、且つ改変される。ウイルス病原体を飲み込むために核酸を用いることにより、ウイルスの脅威と戦う薬物を開発する新しい領域を開拓してきた。核酸に基づく薬剤を用いると、タンパク質構造を標的とする自然及び適応免疫系の経路による中和、食作用及び分解を避ける利点を潜在的に与える。最近、規模を拡大してＤＮＡに基づく物体を作製する方法（４７）が現れた。これらの方法は、ウイルス性疾患と戦うための発明者らの概念を臨床用の候補治療法に変えるのに役立つことができる。
【0126】
方法
１．殻サブユニットの自己組織化
全ての自己組織化実験は、ｐＨ８の５ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＮａＣｌに加えてｘｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する標準「折り畳み緩衝液」（ＦｏＢｘ）中で実行された。単一スキャフォールド鎖状ＤＮＡオリガミ物体を、５０ｎＭ スキャフォールドＤＮＡ及び２００ｎＭの各ステープル鎖を含有するワンポット折り畳み反応で自己組織化した。多数のスキャフォールドを含有するＤＮＡオリガミ物体を、１０ｎｍ濃度の各スキャフォールドＤＮＡ及び２００ｎＭの各ステーブル鎖を使用して自己組織化した。個々のスキャフォールドは配列直交であり、以前記載したように設計され作製される（４８，４９）。ｘ＝２０ｍＭ ＭｇＣｌ２の折り畳み緩衝液（ＦｏＢ２０）を用いた。全ての反応混合物は、Ｔｅｔｒａｄ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）熱サイクル機器中で表２に記載される熱的アニーリング勾配を受けた。ステープル鎖は、ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から購入した。
１．殻サブユニットの自己組織化
全ての自己組織化実験は、ｐＨ８の５ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＮａＣｌに加えてｘｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する標準「折り畳み緩衝液」（ＦｏＢｘ）中で実行された。単一スキャフォールド鎖状ＤＮＡオリガミ物体を、５０ｎＭ スキャフォールドＤＮＡ及び２００ｎＭの各ステープル鎖を含有するワンポット折り畳み反応で自己組織化した。多数のスキャフォールドを含有するＤＮＡオリガミ物体を、１０ｎｍ濃度の各スキャフォールドＤＮＡ及び２００ｎＭの各ステーブル鎖を使用して自己組織化した。個々のスキャフォールドは配列直交であり、以前記載したように設計され作製される（４８，４９）。ｘ＝２０ｍＭ ＭｇＣｌ２の折り畳み緩衝液（ＦｏＢ２０）を用いた。全ての反応混合物は、Ｔｅｔｒａｄ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）熱サイクル機器中で表２に記載される熱的アニーリング勾配を受けた。ステープル鎖は、ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から購入した。
【0127】
【表2】
【0128】
２．殻サブユニットの精製及び殻の自己組織化
全ての殻サブユニットをゲル精製を用いて精製し、必要な場合、サブユニットを殻に自己組織化する前に限外濾過（分子量１００ｋＤａカットオフのアミコンウルトラ（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ））で濃縮した。両手順は、以下を変更して、以前記載したように実行した（３９）：ゲル精製については、０．５ｘＴＢＥ及び５．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する１．５％アガロースゲルを用いた。限外濾過についてはフィルターから回収される対象の濃度を増加させるために、同一のフィルターをゲル精製したサンプルで複数回満たした（約２～５回、ステップ毎に～４００μｌ）。このフィルターを新しいフィルターチューブに逆さまに載せる前に、殻集合体に対して明確に定義された緩衝液条件を達成するために１ｘＦｏＢ５（～４００μｌ）で２回の洗浄ステップを実行した。精製した（及び濃縮した）殻サブユニットを殻に集合させるために、適切な量の１ｘＦｏＢ５及び１．７３５Ｍ ＭｇＣｌ２を加えることにより、サブユニット及びＭｇＣｌ２濃度を調整した。典型的なサブユニット濃度は、５ｎＭ～最大１００ｎＭの範囲だった（ｃｒｙｏ－ＥＭ測定で、表３を参照）。殻自己組織化のための典型的なＭｇＣｌ２濃度は、１０～４０ｍＭの範囲だった。殻自己組織化は、４０°Ｃで実行した。反応時間は、殻の種類に応じて変わった（図３Ａを参照）。全ての殻サブユニット及び集合した殻の両方は、室温で数か月保存することができる。
全ての殻サブユニットをゲル精製を用いて精製し、必要な場合、サブユニットを殻に自己組織化する前に限外濾過（分子量１００ｋＤａカットオフのアミコンウルトラ（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ））で濃縮した。両手順は、以下を変更して、以前記載したように実行した（３９）：ゲル精製については、０．５ｘＴＢＥ及び５．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する１．５％アガロースゲルを用いた。限外濾過についてはフィルターから回収される対象の濃度を増加させるために、同一のフィルターをゲル精製したサンプルで複数回満たした（約２～５回、ステップ毎に～４００μｌ）。このフィルターを新しいフィルターチューブに逆さまに載せる前に、殻集合体に対して明確に定義された緩衝液条件を達成するために１ｘＦｏＢ５（～４００μｌ）で２回の洗浄ステップを実行した。精製した（及び濃縮した）殻サブユニットを殻に集合させるために、適切な量の１ｘＦｏＢ５及び１．７３５Ｍ ＭｇＣｌ２を加えることにより、サブユニット及びＭｇＣｌ２濃度を調整した。典型的なサブユニット濃度は、５ｎＭ～最大１００ｎＭの範囲だった（ｃｒｙｏ－ＥＭ測定で、表３を参照）。殻自己組織化のための典型的なＭｇＣｌ２濃度は、１０～４０ｍＭの範囲だった。殻自己組織化は、４０°Ｃで実行した。反応時間は、殻の種類に応じて変わった（図３Ａを参照）。全ての殻サブユニット及び集合した殻の両方は、室温で数か月保存することができる。
【0129】
３．半分の殻及びＨＢＶコアの結合
三角形の内部上の９個のステープルを５’末端の２６個の一本鎖塩基（配列：‘ＧＣＡＧＴＡＧＡＧＴＡＧＧＴＡＧＡＧＡＴＴＡＧＧＣＡ－オリゴヌクレオチド’、設計の詳細については、図４０、４１、表１及び配列表を参照）を有するハンドルで修飾した。三角形を精製し、上述したとおり集合した。ハンドル配列に相補的で３’末端をチオール基で修飾したオリゴヌクレオチドをＳｕｌｆｏ－ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル－４－［Ｎ－マレイミドメチル］シクロヘキサン－１－カルボン酸）架橋剤を用いてＨＢｃｏｒｅ １７Ｈ７抗体と結合した。産物をその後Ｄｙｎａｍｉｃ ＢｉｏｓｅｎｓｏｒｓのｐｒｏＦＩＲＥ（登録商標）を用いて精製した。ＤＮＡ修飾抗体を集合した殻に加え、２５℃で一晩インキュベートした。ＨＢＶコア粒子を修飾した殻ととともに２５℃で１～４時間インキュベートした。
三角形の内部上の９個のステープルを５’末端の２６個の一本鎖塩基（配列：‘ＧＣＡＧＴＡＧＡＧＴＡＧＧＴＡＧＡＧＡＴＴＡＧＧＣＡ－オリゴヌクレオチド’、設計の詳細については、図４０、４１、表１及び配列表を参照）を有するハンドルで修飾した。三角形を精製し、上述したとおり集合した。ハンドル配列に相補的で３’末端をチオール基で修飾したオリゴヌクレオチドをＳｕｌｆｏ－ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル－４－［Ｎ－マレイミドメチル］シクロヘキサン－１－カルボン酸）架橋剤を用いてＨＢｃｏｒｅ １７Ｈ７抗体と結合した。産物をその後Ｄｙｎａｍｉｃ ＢｉｏｓｅｎｓｏｒｓのｐｒｏＦＩＲＥ（登録商標）を用いて精製した。ＤＮＡ修飾抗体を集合した殻に加え、２５℃で一晩インキュベートした。ＨＢＶコア粒子を修飾した殻ととともに２５℃で１～４時間インキュベートした。
【0130】
４．八面体のオリゴリジンによる安定化
八面体殻を３５ｍＭ ＭｇＣｌ２で集合し、（４１）に記載されるようにＡｓａｈｉ Ｓｐｅｃｔｒａ Ｘｅｎｏｎ Ｌｉｇｈｔ ｓｏｕｒｃｅ ３００Ｗ ＭＡＸ－３０３を用いて１時間ＵＶ架橋した。（４２）に記載されるのと同様に室温で１時間、殻をＫ１０オリゴリジンとＫ１０－ＰＥＧ５Ｋオリゴリジン（１：１）の混合物と比率０．６：１でインキュベートした。
八面体殻を３５ｍＭ ＭｇＣｌ２で集合し、（４１）に記載されるようにＡｓａｈｉ Ｓｐｅｃｔｒａ Ｘｅｎｏｎ Ｌｉｇｈｔ ｓｏｕｒｃｅ ３００Ｗ ＭＡＸ－３０３を用いて１時間ＵＶ架橋した。（４２）に記載されるのと同様に室温で１時間、殻をＫ１０オリゴリジンとＫ１０－ＰＥＧ５Ｋオリゴリジン（１：１）の混合物と比率０．６：１でインキュベートした。
【0131】
５．Ｔ＝１殻の外側の修飾
Ｔ＝１三角形及び三角形ブリック（図５Ａ）をＴ＝１三角形から突出する一本鎖ＤＮＡ粘着末端を用いて二量体化した。突出配列は、柔軟性のための３個のチミジン及びブリックの一本鎖スキャフォールドドメインと直接相補的な７塩基長の配列モチーフを含有した（図４２）。二量体化反応は、１１ｍＭ ＭｇＣｌ２の存在下モノマー濃度４０ｎＭを用いて室温で一晩実行した。
Ｔ＝１三角形及び三角形ブリック（図５Ａ）をＴ＝１三角形から突出する一本鎖ＤＮＡ粘着末端を用いて二量体化した。突出配列は、柔軟性のための３個のチミジン及びブリックの一本鎖スキャフォールドドメインと直接相補的な７塩基長の配列モチーフを含有した（図４２）。二量体化反応は、１１ｍＭ ＭｇＣｌ２の存在下モノマー濃度４０ｎＭを用いて室温で一晩実行した。
【0132】
６．ゲル電気泳動
折り畳み反応又は殻集合体のサイズ分布を、アガロース電気泳動を用いて調べた。殻サブユニットのみを含む溶液については、０．５ｘＴＢＥ緩衝液（２２．２５ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、２２．２５ｍＭホウ酸、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）及び５．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する１．５％アガロースゲルを用いた。殻などのオリゴマー集合体を含む溶液については、アガロース濃度０．５％を用いた。ゲル電気泳動を、殻をインキュベートした溶液と同じＭｇＣｌ２濃度で補充した０．５ｘＴＢＥ緩衝液中で実行した。１５ｍＭより大きいＭｇＣｌ２濃度では、ゲルを冷却するために周囲の氷水浴を用いた。ゲル電気泳動を、９０Ｖバイアス電圧で１．５～２時間実行した。アガロースゲルを画素サイズ５０μｍ／ｐｉｘのＴｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ ９５００レーザースキャナー（ＧＥヘルスケア）でスキャンした。
折り畳み反応又は殻集合体のサイズ分布を、アガロース電気泳動を用いて調べた。殻サブユニットのみを含む溶液については、０．５ｘＴＢＥ緩衝液（２２．２５ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、２２．２５ｍＭホウ酸、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）及び５．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する１．５％アガロースゲルを用いた。殻などのオリゴマー集合体を含む溶液については、アガロース濃度０．５％を用いた。ゲル電気泳動を、殻をインキュベートした溶液と同じＭｇＣｌ２濃度で補充した０．５ｘＴＢＥ緩衝液中で実行した。１５ｍＭより大きいＭｇＣｌ２濃度では、ゲルを冷却するために周囲の氷水浴を用いた。ゲル電気泳動を、９０Ｖバイアス電圧で１．５～２時間実行した。アガロースゲルを画素サイズ５０μｍ／ｐｉｘのＴｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ ９５００レーザースキャナー（ＧＥヘルスケア）でスキャンした。
【0133】
７．ネガティブ染色ＴＥＭ
サンプルを、構造及びＭｇＣｌ２に応じて３０～１２０秒間グロー放電コロジオン支持炭素コーティングＣｕ４００ＴＥＭグリッド（社内生産）上にインキュベートした。グリッドを２５ｍＭ水酸化ナトリウムを含有する２％ギ酸ウラニル（ｕｒａｎｙｌ ｆｏｒｍｉａｔｅ）水溶液で染色した。１００００ｘ～４２０００ｘの倍率で画像化を実行した。Ｔ＝３三角形を、ＡＭＴ ４Ｍｐｘ ＣＣＤカメラを備えたＰｈｉｌｌｉｐｓ ＣＭ１００で画像化した。他の全てのネガティブ染色データをＴｉｅｔｚ ＴＥＭＣＡＭ－Ｆ４１６カメラと共に１２０ｋＶで操作されるＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｔ１２顕微鏡で取得した。ＴＥＭ顕微鏡写真を高域フィルター処理して長距離の染色勾配を除去し、コントラストを自動平均化した（Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標） ＣＳ６）。個別の粒子の詳細な情報を取得する、及び成功した封入を調べるために、可視化技術としてネガティブ染色ＥＭ断層撮像を用いた。上述したグリッドを調製し、傾斜シリーズをＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ １２０を用いて１５０００ｘ～３００００ｘの倍率で取得した。ステージを－５０°～５０°傾斜させ、顕微鏡写真を２°きざみで取得した。
サンプルを、構造及びＭｇＣｌ２に応じて３０～１２０秒間グロー放電コロジオン支持炭素コーティングＣｕ４００ＴＥＭグリッド（社内生産）上にインキュベートした。グリッドを２５ｍＭ水酸化ナトリウムを含有する２％ギ酸ウラニル（ｕｒａｎｙｌ ｆｏｒｍｉａｔｅ）水溶液で染色した。１００００ｘ～４２０００ｘの倍率で画像化を実行した。Ｔ＝３三角形を、ＡＭＴ ４Ｍｐｘ ＣＣＤカメラを備えたＰｈｉｌｌｉｐｓ ＣＭ１００で画像化した。他の全てのネガティブ染色データをＴｉｅｔｚ ＴＥＭＣＡＭ－Ｆ４１６カメラと共に１２０ｋＶで操作されるＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｔ１２顕微鏡で取得した。ＴＥＭ顕微鏡写真を高域フィルター処理して長距離の染色勾配を除去し、コントラストを自動平均化した（Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標） ＣＳ６）。個別の粒子の詳細な情報を取得する、及び成功した封入を調べるために、可視化技術としてネガティブ染色ＥＭ断層撮像を用いた。上述したグリッドを調製し、傾斜シリーズをＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ １２０を用いて１５０００ｘ～３００００ｘの倍率で取得した。ステージを－５０°～５０°傾斜させ、顕微鏡写真を２°きざみで取得した。
【0134】
断層像を取得するために全ての傾斜シリーズを引き続きＩＭＯＤ（５０）で処理した。連続する傾斜シリーズ画像の相互相関を計算することにより顕微鏡写真を互いに整列させた。その後フィルター補正逆投影法を用いて断層像を生成した。ガウスフィルターは、０．２５～０．５のカットオフ及び０．０３５のフォールオフを用いた。
【0135】
８．低温電子顕微鏡（Ｃｒｙｏ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）
ｃｒｙｏ－ＥＭグリッドを調製するために用いられるＤＮＡオリガミ濃度を表３に要約する。１００ｎＭより高い濃度のサンプルは、グロー放電Ｃ－ｆｌａｔ１．２／１．３又は２／１厚さのグリッド（Ｐｒｏｔｏｃｈｉｐ）に適用した。モノマー濃度３０ｎＭ未満の殻を含有するサンプルを４００ｍｅｓｈ銅グリッド（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ）上にレースカーボンフィルムによって支持された超薄カーボンフィルムを備えたグロー放電グリッド上でインキュベートした。ＰＥＧ沈殿すると全ての単一の三角形の濃度は５００ｎＭ以上に増加した（３９）。折り畳み反応１ｍｌ（～５０ｎＭモノマー濃度）をＰＥＧ１ｍｌと混合し、２１ｋ ｒｃｆで２５分間遠心分離し、５０～１００μｌの１ｘＦｏＢ５に再懸濁した。殻を集合するために用いられるＤＮＡオリガミ三角形を全て生成させ、ＭｇＣｌ２濃度を増加させる前に上述したように限外濾過で濃縮させた。液体エタン中でのプランジ凍結を２２°Ｃ、湿度９５％下ｂｌｏｔ ｔｉｍｅ１．５～２秒、ｂｌｏｔ ｆｏｒｃｅ－１及びｄｒａｉｎ ｔｉｍｅ０秒でＦＥＩ Ｖｉｔｒｏｂｏｔ Ｍａｒｋ Ｖにより実行した。モノマー濃度１００ｎＭ未満のサンプルをブロッティング前に６０～９０秒間支持層上にインキュベートした。全てのｃｒｙｏ－ＥＭ画像は、３００ｋＶで操作され、Ｆａｌｃｏｎ ＩＩＩ ４ｋ 電子直接検出カメラ（ｄｉｒｅｃｔ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｄｅｔｅｃｔｏｒ） （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を備えた収差補正Ｔｉｔａｎ Ｋｒｉｏｓ Ｇ２電子顕微鏡（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により取得された。自動単粒子取得用のＥＰＵソフトウェアを用いた。全ての個別のデータセットの顕微鏡設定については表３を参照する。全ての取得のためのデフォーカスを－２μｍに設定した。画像処理は、最初にＲＥＬＩＯＮ－２（５１）で、その後ＲＥＬＩＯＮ－３（５２）で行った。記録された動画は、動画アラインメントについてはＭｏｔｉｏｎＣｏｒ２（５３）を、且つＣＴＦ推定についてはＣＴＦＦＩＮＤ４．１（５４）を受けた。参照像無しでの２Ｄクラス分類後、目視検査で判断された、最良の２Ｄクラス平均をさらなる処理のために選択した。初期モデルを計算するためにこれらの粒子のサブセットを用いた。１～２回の３Ｄ分類後、最も多くの特徴又は完全に集合した殻を示す分類を３Ｄ自動微調整（ａｕｔｏ－ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）及び後処理（ｐｏｓｔ－ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）用に選択した。対応する殻については、八面体（Ｏ）又は正二十面体（Ｉ１）対称性を最後の２個のステップに用いた。
ｃｒｙｏ－ＥＭグリッドを調製するために用いられるＤＮＡオリガミ濃度を表３に要約する。１００ｎＭより高い濃度のサンプルは、グロー放電Ｃ－ｆｌａｔ１．２／１．３又は２／１厚さのグリッド（Ｐｒｏｔｏｃｈｉｐ）に適用した。モノマー濃度３０ｎＭ未満の殻を含有するサンプルを４００ｍｅｓｈ銅グリッド（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ）上にレースカーボンフィルムによって支持された超薄カーボンフィルムを備えたグロー放電グリッド上でインキュベートした。ＰＥＧ沈殿すると全ての単一の三角形の濃度は５００ｎＭ以上に増加した（３９）。折り畳み反応１ｍｌ（～５０ｎＭモノマー濃度）をＰＥＧ１ｍｌと混合し、２１ｋ ｒｃｆで２５分間遠心分離し、５０～１００μｌの１ｘＦｏＢ５に再懸濁した。殻を集合するために用いられるＤＮＡオリガミ三角形を全て生成させ、ＭｇＣｌ２濃度を増加させる前に上述したように限外濾過で濃縮させた。液体エタン中でのプランジ凍結を２２°Ｃ、湿度９５％下ｂｌｏｔ ｔｉｍｅ１．５～２秒、ｂｌｏｔ ｆｏｒｃｅ－１及びｄｒａｉｎ ｔｉｍｅ０秒でＦＥＩ Ｖｉｔｒｏｂｏｔ Ｍａｒｋ Ｖにより実行した。モノマー濃度１００ｎＭ未満のサンプルをブロッティング前に６０～９０秒間支持層上にインキュベートした。全てのｃｒｙｏ－ＥＭ画像は、３００ｋＶで操作され、Ｆａｌｃｏｎ ＩＩＩ ４ｋ 電子直接検出カメラ（ｄｉｒｅｃｔ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｄｅｔｅｃｔｏｒ） （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を備えた収差補正Ｔｉｔａｎ Ｋｒｉｏｓ Ｇ２電子顕微鏡（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により取得された。自動単粒子取得用のＥＰＵソフトウェアを用いた。全ての個別のデータセットの顕微鏡設定については表３を参照する。全ての取得のためのデフォーカスを－２μｍに設定した。画像処理は、最初にＲＥＬＩＯＮ－２（５１）で、その後ＲＥＬＩＯＮ－３（５２）で行った。記録された動画は、動画アラインメントについてはＭｏｔｉｏｎＣｏｒ２（５３）を、且つＣＴＦ推定についてはＣＴＦＦＩＮＤ４．１（５４）を受けた。参照像無しでの２Ｄクラス分類後、目視検査で判断された、最良の２Ｄクラス平均をさらなる処理のために選択した。初期モデルを計算するためにこれらの粒子のサブセットを用いた。１～２回の３Ｄ分類後、最も多くの特徴又は完全に集合した殻を示す分類を３Ｄ自動微調整（ａｕｔｏ－ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）及び後処理（ｐｏｓｔ－ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）用に選択した。対応する殻については、八面体（Ｏ）又は正二十面体（Ｉ１）対称性を最後の２個のステップに用いた。
【0136】
【表3-1】
【表3-2】
【0137】
９．生体外ウイルス遮断ＥＬＩＳＡ
種々の濃度の集合した半分のＴ１殻を室温で一晩、ＦｏＢ３０－Ｔ（ＦｏＢ３０＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０）中の２ｎＭオリゴヌクレオチド結合捕捉抗体（抗ＨＢｃ １７Ｈ７、アイソタイプＩｇＧ－２ｂ）とともにインキュベートした。次の日、あらかじめインキュベートした混合物を５ｐＭ ＨＢＶコア粒子に加え、室温で一晩インキュベートし、１ｎＭ捕捉抗体、２．５ｐＭ ＨＢＶコア粒子及び０～２００ｐＭ半分のＴ＝１殻を得た。平底透明９６穴マイクロプレート（Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ）を４℃で一晩、１００μｌ／穴抗ＣＡｇＨＢ抗体（ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌ）で処理した。２００μｌ／穴ＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０）で４回洗浄後、穴の表面を室温で２時間、ＰＢＳ中の２００μｌ／穴５％ウシ血清アルブミンでインキュベートすることによりブロックした。２００μｌ／穴ＦｏＢ３０－Ｔで４回洗浄後、あらかじめインキュベートしたサンプル９０μｌを穴に加え、室温で２時間インキュベートし、その後洗浄し、引き続き１時間、１００μｌ／穴ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合検出抗体（ＦｏＢ３０－Ｔ中抗ＣＡｇＨＢ－ＨＲＰ）でインキュベートした。ＦｏＢ３０－Ｔで洗浄号、１００μｌ／穴のＨＲＰ基質（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加え、産物の形成を、あらかじめ３０℃に平衡したプレートリーダー（ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ， ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）中６５０ｎｍの吸収を６０秒間隔で測定することにより時間内に監視した。線形回帰勾配を速度データの線形領域（典型的には最初の５分）にフィットさせることによりＨＲＰ活性を算出した。ＨＢＶコア粒子のみのコントロール及び空測定に対するウイルス遮断効率を算出した。全ての実験を三通り行った。ＥＬＩＳＡに用いられた抗体は親切にも、キューバのＣｅｎｔｒｏ Ｄｅ Ｉｎｇｅｎｉｅｒｉａ Ｇｅｎｅｔｉｃａ ｙ Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ ｄｅ ｓａｎｃｔｉ ｓｐｉｒｉｔｕｓにより提供された。
種々の濃度の集合した半分のＴ１殻を室温で一晩、ＦｏＢ３０－Ｔ（ＦｏＢ３０＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０）中の２ｎＭオリゴヌクレオチド結合捕捉抗体（抗ＨＢｃ １７Ｈ７、アイソタイプＩｇＧ－２ｂ）とともにインキュベートした。次の日、あらかじめインキュベートした混合物を５ｐＭ ＨＢＶコア粒子に加え、室温で一晩インキュベートし、１ｎＭ捕捉抗体、２．５ｐＭ ＨＢＶコア粒子及び０～２００ｐＭ半分のＴ＝１殻を得た。平底透明９６穴マイクロプレート（Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ）を４℃で一晩、１００μｌ／穴抗ＣＡｇＨＢ抗体（ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌ）で処理した。２００μｌ／穴ＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０）で４回洗浄後、穴の表面を室温で２時間、ＰＢＳ中の２００μｌ／穴５％ウシ血清アルブミンでインキュベートすることによりブロックした。２００μｌ／穴ＦｏＢ３０－Ｔで４回洗浄後、あらかじめインキュベートしたサンプル９０μｌを穴に加え、室温で２時間インキュベートし、その後洗浄し、引き続き１時間、１００μｌ／穴ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合検出抗体（ＦｏＢ３０－Ｔ中抗ＣＡｇＨＢ－ＨＲＰ）でインキュベートした。ＦｏＢ３０－Ｔで洗浄号、１００μｌ／穴のＨＲＰ基質（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加え、産物の形成を、あらかじめ３０℃に平衡したプレートリーダー（ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ， ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）中６５０ｎｍの吸収を６０秒間隔で測定することにより時間内に監視した。線形回帰勾配を速度データの線形領域（典型的には最初の５分）にフィットさせることによりＨＲＰ活性を算出した。ＨＢＶコア粒子のみのコントロール及び空測定に対するウイルス遮断効率を算出した。全ての実験を三通り行った。ＥＬＩＳＡに用いられた抗体は親切にも、キューバのＣｅｎｔｒｏ Ｄｅ Ｉｎｇｅｎｉｅｒｉａ Ｇｅｎｅｔｉｃａ ｙ Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ ｄｅ ｓａｎｃｔｉ ｓｐｉｒｉｔｕｓにより提供された。
【0138】
１０．ヘリウムイオン顕微鏡像（ＨＩＭ）
画像化は、ＯＲＩＯＮ Ｎａｎｏｆａｂ （Ｚｅｉｓｓ）中のＱｕｏｒｕｍ Ｑ１５０Ｔスパッタコーターを用いて５ｎｍ層のＡｕＰｄでコーティングされたネガティブ染色ＴＥＭグリッドで実行された。加速電圧３０ｋＶ及びビーム電流０．３～０．４ｐＡを用いた。画像は、Ｅｖｅｒｈａｒｔ－Ｔｈｏｒｎｌｅｙ ２ｋ検出器の走査モードで取得した。
画像化は、ＯＲＩＯＮ Ｎａｎｏｆａｂ （Ｚｅｉｓｓ）中のＱｕｏｒｕｍ Ｑ１５０Ｔスパッタコーターを用いて５ｎｍ層のＡｕＰｄでコーティングされたネガティブ染色ＴＥＭグリッドで実行された。加速電圧３０ｋＶ及びビーム電流０．３～０．４ｐＡを用いた。画像は、Ｅｖｅｒｈａｒｔ－Ｔｈｏｒｎｌｅｙ ２ｋ検出器の走査モードで取得した。
【0139】
１１．ＨＢＶコア粒子の作製
遺伝子型Ｄ（サブタイプａｙｗ２）のＢ型肝炎ウイルスコア粒子をＥ．ｃｏｌｉ Ｋ８０２及びＢＬ２１細胞（Ｌａｔｖｉａｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｓｔｕｄｙ Ｃｅｎｔｒｅ， Ｒｉｇａ， Ｌａｔｖｉａから購入）中組換えで作製した。手短に言えば、粒子を細菌タンパク質抽出物の超音波処理及び清澄により取得し、硫安沈殿並びにその後記載された陰イオン交換及び分子ふるいクロマトグラフィーによって精製した（５５）。最終製品を従来のＰＢＳ（０．０５％ＮａＮ３、１ｍＭ ＤＴＴを含む）中暗がりで常に４℃に保った。
遺伝子型Ｄ（サブタイプａｙｗ２）のＢ型肝炎ウイルスコア粒子をＥ．ｃｏｌｉ Ｋ８０２及びＢＬ２１細胞（Ｌａｔｖｉａｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｓｔｕｄｙ Ｃｅｎｔｒｅ， Ｒｉｇａ， Ｌａｔｖｉａから購入）中組換えで作製した。手短に言えば、粒子を細菌タンパク質抽出物の超音波処理及び清澄により取得し、硫安沈殿並びにその後記載された陰イオン交換及び分子ふるいクロマトグラフィーによって精製した（５５）。最終製品を従来のＰＢＳ（０．０５％ＮａＮ３、１ｍＭ ＤＴＴを含む）中暗がりで常に４℃に保った。
【0140】
１２．抗ＨＢｃ抗体の作製
抗ＨＢＶコア（抗ＨＢｃ）抗体１７Ｈ７（アイソタイプＩｇＧ－２ｂ）をミュンヘンのＨｅｌｍｈｏｌｔｚ Ｚｅｎｔｒｕｍ ＭｕｎｃｈｅｎのＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＨＭＧＵ）で作製した。手短に言えば、マウスＨＢｃ認識Ｂ細胞を一般的なハイブリドーマ技術によって作製した。マウスにペプチドＮＬＥＤＰＡＳＲＤＬＶＶＣ（ＨＢＶ ｃｏｒｅのａａ７５－８６）を曝露した。マウスハイブリドーマクローンを選択し、分泌された抗体をＨＢｃＡｇの免疫染色及び沈殿並びに天然抗原認識用のＥＬＩＳＡにより、並びに変性抗原の検出用のウエスタンブロット解析により解析した。最終１７Ｈ７製品をタンパク質Ａ／Ｇカラムを用いる標準的なアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、０．８ｍｇ／ｍｌ（５．３３μＭ）のタンパク質に濃縮し、従来のＰＢＳ（１３７ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸塩、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）中暗がりで４℃に保った。
抗ＨＢＶコア（抗ＨＢｃ）抗体１７Ｈ７（アイソタイプＩｇＧ－２ｂ）をミュンヘンのＨｅｌｍｈｏｌｔｚ Ｚｅｎｔｒｕｍ ＭｕｎｃｈｅｎのＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＨＭＧＵ）で作製した。手短に言えば、マウスＨＢｃ認識Ｂ細胞を一般的なハイブリドーマ技術によって作製した。マウスにペプチドＮＬＥＤＰＡＳＲＤＬＶＶＣ（ＨＢＶ ｃｏｒｅのａａ７５－８６）を曝露した。マウスハイブリドーマクローンを選択し、分泌された抗体をＨＢｃＡｇの免疫染色及び沈殿並びに天然抗原認識用のＥＬＩＳＡにより、並びに変性抗原の検出用のウエスタンブロット解析により解析した。最終１７Ｈ７製品をタンパク質Ａ／Ｇカラムを用いる標準的なアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、０．８ｍｇ／ｍｌ（５．３３μＭ）のタンパク質に濃縮し、従来のＰＢＳ（１３７ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸塩、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）中暗がりで４℃に保った。
【0141】
１３．Ｔ＝１殻中のカーゴ封入
Ｔ＝１殻サブユニットの９個のステープルを５’末端に１６個の塩基を加えることにより修飾した。これらの９個の修飾されたステープル及び未修飾のＴ＝１ステープルをｐ８０６４スキャフォールドとともに折り畳んで９個のｓｓＤＮＡ「ハンドル」を有するＴ＝１三角形を作製する（図５０Ａ、左）。１６塩基のｓｓＤＮＡハンドルをモノマーの殻の内側に面する面に配置する。それらの９本の鎖のうち８本はモノマーの内側に向かって内側に面して配向し、したがってカーゴに接近できなかったかもしれない。一本鎖ＤＮＡカーゴを、ステープル鎖を殻サブユニット上のハンドルと相補的である１６塩基長のオーバーハングを有するｐ８０６４ ｓｓＤＮＡ環状スキャフォールドに付着させることにより調製した。ＣＹ５色素を含有するオリゴも、アガロースゲルのレーザー走査による蛍光読み取りを可能とするためにハイブリッド形成した（図５０Ａ、中央及び図４２Ｃ）。モノマーを不動態化するであろう、カーゴ溶液中に非結合のステープルを有することを避けるために、２０種類の異なるステープルをスキャフォールドと１：２の比率で混合する。ステープルを環状ｓｓＤＮＡにアニーリングするために、ＦＯＢ１５緩衝液を６５°Ｃで１５分間、６０℃から４４°Ｃで１時間／１℃の温度傾斜で用いる。金ナノ粒子を封入するために、モノマーのハンドルの相補的なハンドルを直径３０ｎｍの金ナノ粒子に付着した（Ｃｙｔｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， ＯｌｉｇｏＲＥＡＤＹ Ｇｏｌｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）。模式的なネガティブ染色ＴＥＭ断層像のスライスを図５０、Ｂ及びＣに示す。ＴＥＭ画像の封入された環状ｓｓＤＮＡの可視度を高めるために、直径２０ｎｍの金ナノ粒子（Ｃｙｔｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， ＯｌｉｇｏＲＥＡＤＹ Ｇｏｌｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を環状ｓｓＤＮＡスキャフォールドに付着した（模式的なネガティブ染色ＴＥＭを図５０、Ｂ及びＣの右から最後の画像に示す）。カーゴ有り無しの両方の、Ｔ＝１殻を４０℃で３日間、１ｘＦｏＢ２０緩衝液中で集合させた。集合前に殻サブユニットをゲル精製した。三角形の濃度は１６ｎＭだった。カーゴ（全ての種類の）の濃度は、０．８ｎＭだった。
Ｔ＝１殻サブユニットの９個のステープルを５’末端に１６個の塩基を加えることにより修飾した。これらの９個の修飾されたステープル及び未修飾のＴ＝１ステープルをｐ８０６４スキャフォールドとともに折り畳んで９個のｓｓＤＮＡ「ハンドル」を有するＴ＝１三角形を作製する（図５０Ａ、左）。１６塩基のｓｓＤＮＡハンドルをモノマーの殻の内側に面する面に配置する。それらの９本の鎖のうち８本はモノマーの内側に向かって内側に面して配向し、したがってカーゴに接近できなかったかもしれない。一本鎖ＤＮＡカーゴを、ステープル鎖を殻サブユニット上のハンドルと相補的である１６塩基長のオーバーハングを有するｐ８０６４ ｓｓＤＮＡ環状スキャフォールドに付着させることにより調製した。ＣＹ５色素を含有するオリゴも、アガロースゲルのレーザー走査による蛍光読み取りを可能とするためにハイブリッド形成した（図５０Ａ、中央及び図４２Ｃ）。モノマーを不動態化するであろう、カーゴ溶液中に非結合のステープルを有することを避けるために、２０種類の異なるステープルをスキャフォールドと１：２の比率で混合する。ステープルを環状ｓｓＤＮＡにアニーリングするために、ＦＯＢ１５緩衝液を６５°Ｃで１５分間、６０℃から４４°Ｃで１時間／１℃の温度傾斜で用いる。金ナノ粒子を封入するために、モノマーのハンドルの相補的なハンドルを直径３０ｎｍの金ナノ粒子に付着した（Ｃｙｔｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， ＯｌｉｇｏＲＥＡＤＹ Ｇｏｌｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）。模式的なネガティブ染色ＴＥＭ断層像のスライスを図５０、Ｂ及びＣに示す。ＴＥＭ画像の封入された環状ｓｓＤＮＡの可視度を高めるために、直径２０ｎｍの金ナノ粒子（Ｃｙｔｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， ＯｌｉｇｏＲＥＡＤＹ Ｇｏｌｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を環状ｓｓＤＮＡスキャフォールドに付着した（模式的なネガティブ染色ＴＥＭを図５０、Ｂ及びＣの右から最後の画像に示す）。カーゴ有り無しの両方の、Ｔ＝１殻を４０℃で３日間、１ｘＦｏＢ２０緩衝液中で集合させた。集合前に殻サブユニットをゲル精製した。三角形の濃度は１６ｎＭだった。カーゴ（全ての種類の）の濃度は、０．８ｎＭだった。
【0142】
１４．半分の殻とＨＢＶコアの結合
抗ＨＢＶコア（抗ＨＢｃ）抗体１７Ｈ７（アイソタイプＩｇＧ－２ｂ）をミュンヘンのＨｅｌｍｈｏｌｔｚ Ｚｅｎｔｒｕｍ ＭｕｎｃｈｅｎのＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＨＭＧＵ）で作製した。手短に言えば、マウスＨＢｃ認識Ｂ細胞を一般的なハイブリドーマ技術によって作製した。マウスにペプチドＮＬＥＤＰＡＳＲＤＬＶＶＣ（ＨＢＶ ｃｏｒｅのａａ ７５－８６）を曝露した。マウスハイブリドーマクローンを選択し、分泌された抗体をＨＢｃＡｇの免疫染色及び沈殿並びに天然抗原認識用のＥＬＩＳＡにより、並びに変性抗原の検出用のウエスタンブロット解析により解析した。最終１７Ｈ７製品をタンパク質Ａ／Ｇカラムを用いる標準的なアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、０．８ｍｇ／ｍｌ（５．３３μＭ）のタンパク質に濃縮し、従来のＰＢＳ（１３７ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸塩、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）中暗がりで４℃に保った。
抗ＨＢＶコア（抗ＨＢｃ）抗体１７Ｈ７（アイソタイプＩｇＧ－２ｂ）をミュンヘンのＨｅｌｍｈｏｌｔｚ Ｚｅｎｔｒｕｍ ＭｕｎｃｈｅｎのＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＨＭＧＵ）で作製した。手短に言えば、マウスＨＢｃ認識Ｂ細胞を一般的なハイブリドーマ技術によって作製した。マウスにペプチドＮＬＥＤＰＡＳＲＤＬＶＶＣ（ＨＢＶ ｃｏｒｅのａａ ７５－８６）を曝露した。マウスハイブリドーマクローンを選択し、分泌された抗体をＨＢｃＡｇの免疫染色及び沈殿並びに天然抗原認識用のＥＬＩＳＡにより、並びに変性抗原の検出用のウエスタンブロット解析により解析した。最終１７Ｈ７製品をタンパク質Ａ／Ｇカラムを用いる標準的なアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、０．８ｍｇ／ｍｌ（５．３３μＭ）のタンパク質に濃縮し、従来のＰＢＳ（１３７ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸塩、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）中暗がりで４℃に保った。
【0143】
１５．殻オリゴリジン安定化
完全な八面体殻を３５ｍＭ ＭｇＣｌ２で集合し、（３３）に記載されるように朝日分光キセノン光源３００Ｗ ＭＡＸ－３０３を用いて波長３１０ｎｍで１時間ＵＶ架橋した。この殻を（３４）に記載されるのと同様に室温で１時間、Ｋ１０オリゴリジンとＫ１０－ＰＥＧ５Ｋオリゴリジン（１：１）の混合物と共に比率０．６：１のＮ：Ｐ中でインキュベートした。八面体を５５％マウス血清中３７℃で１時間及び２４時間インキュベートした。ネガティブ染色での画像化を可能にするために、ネガティブ染色グリッドに適用する直前にサンプルをＰＢＳで最終マウス血清濃度５％に希釈した。
完全な八面体殻を３５ｍＭ ＭｇＣｌ２で集合し、（３３）に記載されるように朝日分光キセノン光源３００Ｗ ＭＡＸ－３０３を用いて波長３１０ｎｍで１時間ＵＶ架橋した。この殻を（３４）に記載されるのと同様に室温で１時間、Ｋ１０オリゴリジンとＫ１０－ＰＥＧ５Ｋオリゴリジン（１：１）の混合物と共に比率０．６：１のＮ：Ｐ中でインキュベートした。八面体を５５％マウス血清中３７℃で１時間及び２４時間インキュベートした。ネガティブ染色での画像化を可能にするために、ネガティブ染色グリッドに適用する直前にサンプルをＰＢＳで最終マウス血清濃度５％に希釈した。
【0144】
生体内ウイルス中和実験に用いられる部分的な殻を、６０ｍＭ ＭｇＣｌ２で集合し、（３３）に記載されるように朝日分光キセノン光源３００Ｗ ＭＡＸ－３０３を用いて３０分間ＵＶ架橋した。全てのスタッキング接触で３種類の塩基長の粘着性オーバーハングを導入し、三角形サブユニットを共有結合的に架橋するために両オリゴヌクレオチドの末端に１つのチミジンを加えた（図５１を参照）。粘着性オーバーハングは、ＵＶ点溶接のためのチミジンの添加によって誘導される平滑末端スタッキングの減少を補償するために必要だった。殻を（３４）に記載されるのと同様に室温で１時間、Ｋ１０オリゴリジンとＫ１０－ＰＥＧ５Ｋオリゴリジン（１：１）の混合物と共に比率０．６：１のＮ：Ｐ中でインキュベートした。ＤＮＡ改変抗体を集合した殻に加え、室温で一晩インキュベートした。
【0145】
１６．細胞培養及び中和アッセイ
ＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト胎児腎細胞株、ＤＳＭＺ）細胞を１０％熱失活ウシ胎児血清（ＦＢＳ， Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， ｃａｔ． ｎｏ． Ｆ９６６５）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ， Ｇｉｂｃｏ， ｃａｔ． ｎｏ． ３１９６６０４７）中で培養した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で加湿インキュベーター中で常に培養した。形質導入実験のためにｅＧＦＰを保有するＡＡＶ２（Ｂｉｏｃａｔ， ｃａｔ． ｎｏ． ＡＡ００２－ＧＶＯ－ＧＣ）を利用し、感染粒子の濃度は、製造業者のプロトコルにより滴定により測定した。手短に言えば、形質導入の１６～２４時間前に細胞を８０，０００細胞ｍＬ－１で２４穴プレートに播種し、形質導入の７２時間後にフローサイトメトリーによる形質導入効率の定量化のために収集した。ＡｔｔｕｎｅＴＭ ＮｘＴフローサイトメーター及びソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）をそれぞれ用いてサンプルを取得し、分析した。側方散乱面積対高さでゲーティングした、２０，０００個の単一細胞イベントを解析用に記録した。ｅＧＦＰを４８８ｎｍレーザーによって励起し、発光を５３０／３０ｎｍバンドパスフィルタで測定した。ネガティブコントロールとして未処理の細胞を用いた。感染粒子の濃度は、１．２３×１０９ ＩＦＵ ｍＬ－１であると測定された。ＡＡＶ２ウイルス粒子の総数は、製造業者のプロトコルによりＥＬＩＳＡにより測定し（Ｐｒｏｇｅｎ， ｃａｔ． Ｎｏ． ＰＲＡＴＶ）、２．２４×１０１２ ＶＰ ｍＬ－１であると測定された。中和実験については、細胞を上のように培養した。４８穴プレートをポリ－Ｌ－リジンでコーティングし（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ． ｎｏ． Ｐ２６３６， ０．１ｍｇ ｍＬ－１，１０分間室温でインキュベーション）、Ｈ２０で２回、ついでＰＢＳで洗浄した。形質導入の１６～２４時間前にＨＥＫ２９３Ｔ細胞を８０，０００細胞ｍＬ－１で播種した。結合した抗ＡＡＶ２を半分の殻オリガミに一晩結合させるための原液を調製した。０．１ｍｇｍＬ－１ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下結合が生じた。同様に結合した抗ＡＡＶ２及び抗体なしの半分の殻も同一の方法で調製した。次の日、半分の殻を２時間の室温インキュベーションによりＰＥＧ－オリゴリジン／６６４オリゴリジンでコーティングした。次に、異なる滴定条件の各々を調製し、ＰＢＳで条件当たり合計３３．５μＬに希釈した。４μＬの希釈したＡＡＶ－２サンプル（１／１００、ＰＢＳ中）を加え、混合し、そしてサンプルをインキュベートしたままにした（２時間、室温）。細胞をＰＢＳで洗浄し、２％ＦＢＳを含む６２．５μＬのＤＭＥＭを各穴に加えた。混合物（３７．５μＬ）を各穴に滴加した。１８％ＦＢＳ及び１×抗生物質／抗真菌薬を含む１００μＬのＤＭＥＭを加える前に、細胞を２時間インキュベートした。培地を除去する前に細胞をさらに２２時間インキュベートし、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、そして１０％ＦＢＳ及び１×抗生物質／抗真菌薬を含む２５０μＬのＤＭＥＭを加えた。形質導入後４８時間で、細胞をトリプシン処理し、フローサイトメトリーのために調製した。形質導入効率を上のように定量化し、代表的なゲートを表５２に示す。統計解析をＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）で実行した。落射蛍光撮像法については、手順は細胞を８部屋の穴のスライド（ＮｕｎｃＴＭ Ｌａｂ－ＴｅｋＴＭ， Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）に播種したことを除いて上と同一だった。合計４８時間後の時点で、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定した。細胞を再度洗浄し（１×ＰＢＳ）、細胞核を染色した（Ｈｏｅｓｃｈｔ ３３４２、ＰＢＳで希釈、５分間、室温）。細胞をＰＢＳで洗浄し、このサンプルをＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ－Ｇ水溶性封入剤を用いて乗せた。サンプルを、Ｔｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ２－Ｅ倒立顕微鏡を用いて、１０×対物レンズを用いて撮像した。画像をＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＡＲソフトウェアを用いて収集し、ＩｍａｇｅＪを用いて処理した。
ＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト胎児腎細胞株、ＤＳＭＺ）細胞を１０％熱失活ウシ胎児血清（ＦＢＳ， Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， ｃａｔ． ｎｏ． Ｆ９６６５）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ， Ｇｉｂｃｏ， ｃａｔ． ｎｏ． ３１９６６０４７）中で培養した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で加湿インキュベーター中で常に培養した。形質導入実験のためにｅＧＦＰを保有するＡＡＶ２（Ｂｉｏｃａｔ， ｃａｔ． ｎｏ． ＡＡ００２－ＧＶＯ－ＧＣ）を利用し、感染粒子の濃度は、製造業者のプロトコルにより滴定により測定した。手短に言えば、形質導入の１６～２４時間前に細胞を８０，０００細胞ｍＬ－１で２４穴プレートに播種し、形質導入の７２時間後にフローサイトメトリーによる形質導入効率の定量化のために収集した。ＡｔｔｕｎｅＴＭ ＮｘＴフローサイトメーター及びソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）をそれぞれ用いてサンプルを取得し、分析した。側方散乱面積対高さでゲーティングした、２０，０００個の単一細胞イベントを解析用に記録した。ｅＧＦＰを４８８ｎｍレーザーによって励起し、発光を５３０／３０ｎｍバンドパスフィルタで測定した。ネガティブコントロールとして未処理の細胞を用いた。感染粒子の濃度は、１．２３×１０９ ＩＦＵ ｍＬ－１であると測定された。ＡＡＶ２ウイルス粒子の総数は、製造業者のプロトコルによりＥＬＩＳＡにより測定し（Ｐｒｏｇｅｎ， ｃａｔ． Ｎｏ． ＰＲＡＴＶ）、２．２４×１０１２ ＶＰ ｍＬ－１であると測定された。中和実験については、細胞を上のように培養した。４８穴プレートをポリ－Ｌ－リジンでコーティングし（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ． ｎｏ． Ｐ２６３６， ０．１ｍｇ ｍＬ－１，１０分間室温でインキュベーション）、Ｈ２０で２回、ついでＰＢＳで洗浄した。形質導入の１６～２４時間前にＨＥＫ２９３Ｔ細胞を８０，０００細胞ｍＬ－１で播種した。結合した抗ＡＡＶ２を半分の殻オリガミに一晩結合させるための原液を調製した。０．１ｍｇｍＬ－１ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下結合が生じた。同様に結合した抗ＡＡＶ２及び抗体なしの半分の殻も同一の方法で調製した。次の日、半分の殻を２時間の室温インキュベーションによりＰＥＧ－オリゴリジン／６６４オリゴリジンでコーティングした。次に、異なる滴定条件の各々を調製し、ＰＢＳで条件当たり合計３３．５μＬに希釈した。４μＬの希釈したＡＡＶ－２サンプル（１／１００、ＰＢＳ中）を加え、混合し、そしてサンプルをインキュベートしたままにした（２時間、室温）。細胞をＰＢＳで洗浄し、２％ＦＢＳを含む６２．５μＬのＤＭＥＭを各穴に加えた。混合物（３７．５μＬ）を各穴に滴加した。１８％ＦＢＳ及び１×抗生物質／抗真菌薬を含む１００μＬのＤＭＥＭを加える前に、細胞を２時間インキュベートした。培地を除去する前に細胞をさらに２２時間インキュベートし、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、そして１０％ＦＢＳ及び１×抗生物質／抗真菌薬を含む２５０μＬのＤＭＥＭを加えた。形質導入後４８時間で、細胞をトリプシン処理し、フローサイトメトリーのために調製した。形質導入効率を上のように定量化し、代表的なゲートを表５２に示す。統計解析をＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）で実行した。落射蛍光撮像法については、手順は細胞を８部屋の穴のスライド（ＮｕｎｃＴＭ Ｌａｂ－ＴｅｋＴＭ， Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）に播種したことを除いて上と同一だった。合計４８時間後の時点で、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定した。細胞を再度洗浄し（１×ＰＢＳ）、細胞核を染色した（Ｈｏｅｓｃｈｔ ３３４２、ＰＢＳで希釈、５分間、室温）。細胞をＰＢＳで洗浄し、このサンプルをＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ－Ｇ水溶性封入剤を用いて乗せた。サンプルを、Ｔｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ２－Ｅ倒立顕微鏡を用いて、１０×対物レンズを用いて撮像した。画像をＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＡＲソフトウェアを用いて収集し、ＩｍａｇｅＪを用いて処理した。
【0146】
１７．生存率アッセイ
細胞傷害性を、細胞を半分の殻の混合物と２４又は４８時間インキュベーションした後細胞生存率により定量化した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をポリ－Ｌ－リジン処理９６穴プレートに８０，０００細胞ｍＬ－１で播種した。細胞を一晩定着させ、培地を除去し、中和（ｎｅｕｔｒａｌｉｓａｔｉｏｎ）アッセイと同一の手順で細胞を半分の殻の混合物に曝露した。細胞をさらに２４時間又は４８時間、半分の殻の溶液とインキュベートし、アラマーブルー試薬ｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、穴あたり１０μＬ）を加えた。プレートを混合し、プレートリーダー（ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ）で読み取る前に４時間インキュベートした。製造業者のプロトコルにより５７０ｎｍ及び６００ｎｍでの吸光度読みを行った。測定値を、同様に処理されたが、オリガミ構造を含まないＰＢＳを受けた、コントロール穴に対して正規化した。全ての条件を少なくとも三通り測定した。
［参考文献］
１． Ｃ． Ｇｏｒｔａｚａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｏｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ ｂａｒｒｉｅｒ： ｏｐｅｎｉｎｇ ｔｈｅ ｄｏｏｒ ｔｏ ｚｏｏｎｏｔｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ． ＰＬｏＳ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ １０， ｅ１００４１２９ （２０１４）．
２． Ｓ． Ｓ． Ｍｏｒｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｘｔ ｐａｎｄｅｍｉｃ ｚｏｏｎｏｓｉｓ． Ｌａｎｃｅｔ ３８０， １９５６－１９６５ （２０１２）．
３． Ｊ． Ｊ． Ｏ’Ｂｒｉｅｎ， Ｄ． Ｍ． Ｃａｍｐｏｌｉ－Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ａｃｙｃｌｏｖｉｒ． Ａｎ ｕｐｄａｔｅｄ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｉｔｓ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｉｃａｃｙ． Ｄｒｕｇｓ ３７， ２３３－３０９ （１９８９）．
４． Ｊ． ＬａＢｏｎｔｅ， Ｊ． Ｌｅｂｂｏｓ， Ｐ． Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ， Ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ２， ３４５－３４６ （２００３）．
５． Ｗ． Ｌ． Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ １－Ａｄａｍａｎｔａｎａｍｉｎｅ （Ａｍａｎｔａｄｉｎｅ）． Ｓｃｉｅｎｃｅ １４４， ８６２－８６３ （１９６４）．
６． Ｙ． Ｋ． Ｇｕｐｔａ， Ｍ． Ｍｅｅｎｕ， Ｐ． Ｍｏｈａｎ， Ｔｈｅ Ｔａｍｉｆｌｕ ｆｉａｓｃｏ ａｎｄ ｌｅｓｓｏｎｓ ｌｅａｒｎｔ． Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ４７， １１－１６ （２０１５）．
７． Ｊ． Ｍ． Ｓｔｅｉｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ａ ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ＨＩＶ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｆ ｂｒｏａｄｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６６， （２０１９）．
８． Ｋ． Ｏ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｂ ｃｅｌｌ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６６， （２０１９）．
９． Ｂ． Ｋ． Ｇａｎｓｅｒ－Ｐｏｒｎｉｌｌｏｓ， Ｏ． Ｐｏｒｎｉｌｌｏｓ， Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ－１ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ ＴＲＩＭ５． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １７， ５４６－５５６ （２０１９）．
１０． Ｋ． Ａ． Ｓｋｏｒｕｐｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｇｏｖｅｒｎｓ ＴＲＩＭ５ａｌｐｈａ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ－ １ ａｎｄ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｃａｐｓｉｄｓ． Ｓｃｉ Ａｄｖ ５， ｅａａｗ３６３１ （２０１９）．
１１． Ｍ． Ｍａｍｍｅｎ， Ｓ． Ｋ． Ｃｈｏｉ， Ｇ． Ｍ． Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ， Ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ： Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ Ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ． Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ３７， ２７５４－２７９４ （１９９８）．
１２． Ｖ． Ｃａｇｎｏ， Ｅ． Ｄ． Ｔｓｅｌｉｇｋａ， Ｓ． Ｔ． Ｊｏｎｅｓ， Ｃ． Ｔａｐｐａｒｅｌ， Ｈｅｐａｒａｎ Ｓｕｌｆａｔｅ Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ ａｎｄ Ｖｉｒａｌ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ： Ｔｒｕｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｏｒ Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ Ｂｉａｓ？ Ｖｉｒｕｓｅｓ １１， （２０１９）．
１３． Ｆ． Ｈ． Ｃｒｉｃｋ， Ｊ． Ｄ． Ｗａｔｓｏｎ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｖｉｒｕｓｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ １７７， ４７３－４７５ （１９５６）．
１４． Ｊ． Ｂ． Ｂａｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｃｕｒａｔｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｍｅｇａｄａｌｔｏｎ－ｓｃａｌｅ ｔｗｏ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｉｃｏｓａｈｅｄｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３， ３８９－３９４ （２０１６）．
１５． Ｎ． Ｐ． Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｃｕｒａｔｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｃｏ－ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ ｍｕｌｔｉ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ． Ｎａｔｕｒｅ ５１０， １０３－１０８ （２０１４）．
１６． Ｙ． Ｔ． Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃａｇｅ ｔｈａｔ ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｅｓ ｉｎｔｏ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｐｏｒｏｕｓ ｃｕｂｅ． Ｎａｔｕｒｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６， １０６５－１０７１ （２０１４）．
１７． Ｇ． Ｌ． Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ ｉｔｓ ｏｗｎ ＲＮＡ ｇｅｎｏｍｅ． Ｎａｔｕｒｅ ５５２， ４１５－４２０ （２０１７）．
１８． Ｒ． Ｉｉｎｕｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｏｌｙｈｅｄｒａ ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｆｒｏｍ ＤＮＡ ｔｒｉｐｏｄｓ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ３Ｄ ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４４， ６５－６９ （２０１４）．
１９． Ｋ． Ｆ． Ｗａｇｅｎｂａｕｅｒ， Ｃ． Ｓｉｇｌ， Ｈ． Ｄｉｅｔｚ， Ｇｉｇａｄａｌｔｏｎ－ｓｃａｌｅ ｓｈａｐｅ－ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＤＮＡ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ ５５２， ７８－８３ （２０１７）．
２０． Ｄ． Ｌ． Ｃａｓｐａｒ， Ａ． Ｋｌｕｇ， Ｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｒ ｖｉｒｕｓｅｓ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｓｙｍｐｏｓｉａ ｏｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ２７， １－２４ （１９６２）．
２１． Ｒ． Ｔｗａｒｏｃｋ， Ａ． Ｌｕｑｕｅ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｕｚｚｌｅｓ ｉｎ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ｓｏｌｖｅｄ ｗｉｔｈ ａｎ ｏｖｅｒａｒｃｈｉｎｇ ｉｃｏｓａｈｅｄｒａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ． Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １０， ４４１４ （２０１９）．
２２． Ａ． Ｌ． Ｌｌａｍａｓ－Ｓａｉｚ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｎｕｔｅ ｖｉｒｕｓ ｏｆ ｍｉｃｅ． Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５３， ９３－１０２ （１９９７）．
２３． Ｊ． Ａ． Ｓｐｅｉｒ， Ｓ． Ｍｕｎｓｈｉ， Ｇ． Ｗａｎｇ， Ｔ． Ｓ． Ｂａｋｅｒ， Ｊ． Ｅ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎａｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｗｏｌｌｅｎ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｃｏｗｐｅａ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ Ｘ－ｒａｙ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ｃｒｙｏ－ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３， ６３－７８ （１９９５）．
２４． Ｐ． Ｗ． Ｋ． Ｒｏｔｈｅｍｕｎｄ， Ｆｏｌｄｉｎｇ ＤＮＡ ｔｏ ｃｒｅａｔｅ ｎａｎｏｓｃａｌｅ ｓｈａｐｅｓ ａｎｄ ｐａｔｔｅｒｎｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４４０， ２９７－３０２ （２００６）．
２５． Ｓ． Ｍ． Ｄｏｕｇｌａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎｔｏ ｎａｎｏｓｃａｌｅ ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｈａｐｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４５９， ４１４－４１８ （２００９）．
２６． Ｃ． Ｅ． Ｃａｓｔｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ａ ｐｒｉｍｅｒ ｔｏ ｓｃａｆｆｏｌｄｅｄ ＤＮＡ ｏｒｉｇａｍｉ． Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ８， ２２１－２２９ （２０１１）．
２７． Ｒ． Ｖｅｎｅｚｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｓｉｇｎｅｒ ｎａｎｏｓｃａｌｅ ＤＮＡ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｏｐ ｄｏｗｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５２， １５３４ （２０１６）．
２８． Ｅ． Ｂｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＤＮＡ ｒｅｎｄｅｒｉｎｇ ｏｆ ｐｏｌｙｈｅｄｒａｌ ｍｅｓｈｅｓ ａｔ ｔｈｅ ｎａｎｏｓｃａｌｅ． Ｎａｔｕｒｅ ５２３， ４４１－４４４ （２０１５）．
２９． Ｋ． Ｅ． Ｄｕｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｕｉｄｉｎｇ ｔｈｅ ｆｏｌｄｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ＤＮＡ ｏｒｉｇａｍｉ． Ｎａｔｕｒｅ ５２５， ８２－８６ （２０１５）．
３０． Ｘ． Ｃ． Ｂａｉ， Ｔ． Ｇ． Ｍａｒｔｉｎ， Ｓ． Ｈ． Ｓｃｈｅｒｅｓ， Ｈ． Ｄｉｅｔｚ， Ｃｒｙｏ－ＥＭ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ３Ｄ ＤＮＡ－ｏｒｉｇａｍｉ ｏｂｊｅｃｔ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０９， ２００１２－２００１７ （２０１２）．
３１． Ｊ． Ｊ． Ｆｕｎｋｅ， Ｈ． Ｄｉｅｔｚ， Ｐｌａｃｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｗｉｔｈ Ｂｏｈｒ ｒａｄｉｕｓ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ ｏｒｉｇａｍｉ． Ｎａｔｕｒｅ ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１， ４７－５２ （２０１６）．
３２． Ｒ． Ｊｕｎｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， ＤＮＡ ｏｒｉｇａｍｉ－ｂａｓｅｄ ｎａｎｏｒｉｂｂｏｎｓ： ａｓｓｅｍｂｌｙ， ｌｅｎｇｔｈ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ， ａｎｄ ｔｗｉｓｔ． Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２， ２７５３０１ （２０１１）．
３３． Ｗ． Ｌｉｕ， Ｈ． Ｚｈｏｎｇ， Ｒ． Ｗａｎｇ， Ｎ． Ｃ． Ｓｅｅｍａｎ， Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ＤＮＡ－ｏｒｉｇａｍｉ ａｒｒａｙｓ． Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ ５０， ２６４－２６７ （２０１１）．
３４． Ｙ． Ｓｕｚｕｋｉ， Ｍ． Ｅｎｄｏ， Ｈ． Ｓｕｇｉｙａｍａ， Ｌｉｐｉｄ－ｂｉｌａｙｅｒ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｏｒｉｇａｍｉ ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ６， ８０５２ （２０１５）．
３５． Ｙ． Ｋｅ ｅｔ ａｌ．， ＤＮＡ ｂｒｉｃｋ ｃｒｙｓｔａｌｓ ｗｉｔｈ ｐｒｅｓｃｒｉｂｅｄ ｄｅｐｔｈｓ． Ｎａｔｕｒｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６， ９９４－１００２ （２０１４）．
３６． Ｔ． Ｇｅｒｌｉｎｇ， Ｋ． Ｆ． Ｗａｇｅｎｂａｕｅｒ， Ａ． Ｍ． Ｎｅｕｎｅｒ， Ｈ． Ｄｉｅｔｚ， Ｄｙｎａｍｉｃ ＤＮＡ ｄｅｖｉｃｅｓ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ ｆｏｒｍｅｄ ｂｙ ｓｈａｐｅ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ， ｎｏｎ－ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ ３Ｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４７， １４４６－１４５２ （２０１５）．
３７． Ｓ． Ｍ． Ｄｏｕｇｌａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｒａｐｉｄ ｐｒｏｔｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ３Ｄ ＤＮＡ－ｏｒｉｇａｍｉ ｓｈａｐｅｓ ｗｉｔｈ ｃａＤＮＡｎｏ． Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３７， ５００１－５００６ （２００９）．
３８． Ｃ． Ｍａｆｆｅｏ， Ｊ． Ｙｏｏ， Ａ． Ａｋｓｉｍｅｎｔｉｅｖ， Ｄｅ ｎｏｖｏ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｏｒｉｇａｍｉ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｔｏｍｉｓｔｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ． Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ４４， ３０１３－３０１９ （２０１６）．
３９． Ｋ． Ｆ． Ｗａｇｅｎｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｈｏｗ ｗｅ ｍａｋｅ ＤＮＡ ｏｒｉｇａｍｉ． Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ ： ａ Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ， （２０１７）．
４０． Ｔ． Ｇｅｒｌｉｎｇ， Ｈ． Ｄｉｅｔｚ， Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔａｃｋｉｎｇ Ｃｏｎｔａｃｔｓ ｉｎ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ． Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ ５８， ２６８０－２６８４ （２０１９）．
４１． Ｔ． Ｇｅｒｌｉｎｇ， Ｍ． Ｋｕｂｅ， Ｂ． Ｋｉｃｋ， Ｈ． Ｄｉｅｔｚ， Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｂｏｎｄｉｎｇ ｏｆ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ＤＮＡ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ． Ｓｃｉ Ａｄｖ ４， ｅａａｕ１１５７ （２０１８）．
４２． Ｎ． Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ ｅｔ ａｌ．， Ｏｌｉｇｏｌｙｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｃｏａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ＤＮＡ ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｒｏｍ ｌｏｗ－ｓａｌｔ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ８， １５６５４ （２０１７）．
４３． Ｍ． Ｌａｎｇｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｉｐｉｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｆｏｒｍｅｄ ｂｙ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ＤＮＡ ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３８， ９３２－９３６ （２０１２）．
４４． Ｎ． Ｋｅｒｎ， Ｄ． Ｆｒｅｎｋｅｌ， Ｆｌｕｉｄ－ｆｌｕｉｄ ｃｏｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｉｎ ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｓｙｓｔｅｍｓ ｗｉｔｈ ｓｈｏｒｔ－ｒａｎｇｅｄ ｓｔｒｏｎｇｌｙ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ａｔｔｒａｃｔｉｏｎ． Ｊ Ｃｈｅｍ Ｐｈｙｓ １１８， ９８８２－９８８９ （２００３）．
４５． Ｍ． Ｆ． Ｎａｓｏ， Ｂ． Ｔｏｍｋｏｗｉｃｚ， Ｗ． Ｌ． Ｐｅｒｒｙ， ３ｒｄ， Ｗ． Ｒ． Ｓｔｒｏｈｌ， Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ （ＡＡＶ） ａｓ ａ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ． ＢｉｏＤｒｕｇｓ ３１， ３１７－３３４ （２０１７）．
４６． Ｄ． Ｗａｎｇ， Ｐ． Ｗ． Ｌ． Ｔａｉ， Ｇ． Ｇａｏ， Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ａｓ ａ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １８， ３５８－３７８ （２０１９）．
４７． Ｆ． Ｐｒａｅｔｏｒｉｕｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｓｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｏｒｉｇａｍｉ． Ｎａｔｕｒｅ ５５２， ８４－８７ （２０１７）．
４８． Ｆ． Ａ． Ｓ． Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｓｔｏｍ－Ｓｉｚｅ， Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ， ａｎｄ Ｄｕｒａｂｌｅ ＤＮＡ Ｏｒｉｇａｍｉ ｗｉｔｈ Ｄｅｓｉｇｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ． ＡＣＳ ｎａｎｏ， （２０１９）．
４９． Ｂ． Ｋｉｃｋ， Ｆ． Ｐｒａｅｔｏｒｉｕｓ， Ｈ． Ｄｉｅｔｚ， Ｄ． Ｗｅｕｓｔｅｒ－Ｂｏｔｚ， Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ－ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｐｈａｇｅ ＤＮＡ ａｓ Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ｏｒｉｇａｍｉ． Ｎａｎｏ ｌｅｔｔｅｒｓ， （２０１５）．
５０． Ｊ． Ｒ． Ｋｒｅｍｅｒ， Ｄ． Ｎ． Ｍａｓｔｒｏｎａｒｄｅ， Ｊ． Ｒ． ＭｃＩｎｔｏｓｈ， Ｃｏｍｐｕｔｅｒ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｉｍａｇｅ ｄａｔａ ｕｓｉｎｇ ＩＭＯＤ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ １１６， ７１－７６ （１９９６）．
５１． Ｄ． Ｋｉｍａｎｉｕｓ， Ｂ． Ｏ． Ｆｏｒｓｂｅｒｇ， Ｓ． Ｈ． Ｓｃｈｅｒｅｓ， Ｅ． Ｌｉｎｄａｈｌ， Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｃｒｙｏ－ＥＭ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐａｒａｌｌｅｌｉｓａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＧＰＵｓ ｉｎ ＲＥＬＩＯＮ－２． Ｅｌｉｆｅ ５， （２０１６）．
５２． Ｊ． Ｚｉｖａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｗ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｒｙｏ－ＥＭ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ＲＥＬＩＯＮ－３． Ｅｌｉｆｅ ７， （２０１８）．
５３． Ｓ． Ｑ． Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＭｏｔｉｏｎＣｏｒ２： ａｎｉｓｏｔｒｏｐｉｃ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅａｍ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｏｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｃｒｙｏ－ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ． Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ １４， ３３１－３３２ （２０１７）．
５４． Ａ． Ｒｏｈｏｕ， Ｎ． Ｇｒｉｇｏｒｉｅｆｆ， ＣＴＦＦＩＮＤ４： Ｆａｓｔ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｄｅｆｏｃｕｓ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ １９２， ２１６－２２１ （２０１５）．
５５． Ｓｏｍｉｎｓｋａｙａ Ｉ， Ｓｋｒａｓｔｉｎａ Ｄ， Ｐｅｔｒｏｖｓｋｉｓ Ｉ， Ｄｉｓｈｌｅｒｓ Ａ， Ｂｅｒｚａ Ｉ， ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ａ ＶＬＰ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｃｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ： ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ Ｔｈ１／Ｔｈ２ ｓｗｉｔｃｈ ｉｎ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ｍｉｃｅ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８： ｅ７５９３８．
５６． Ｐ． Ｓ． Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｓｉｇｎｅｒ ＤＮＡ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｏｆｆｅｒｓ ｐｒｅｃｉｓｅ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ｓｐａｔｉａｌ ｐａｔｔｅｒｎ－ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｆｏｒ ｖｉｒａｌ ｓｅｎｓｉｎｇ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ． Ｎａｔ． Ｃｈｅｍ． １２， ２６-３５ （２０２０）．
５７． Ｈ． ＬＩ ｅｔ ａｋ， Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ－ｂａｓｅｄ ｎａｎｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： ｎｏｖｅｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＩＮＴＥＲＦＡＣＥ ＦＯＣＵＳ １， ７７２－７２４ （２０１１）．
５８． Ｅ． Ｓｔａｈｌ， Ｔ． Ｇ． Ｍａｒｔｉｎ， Ｆ． Ｐｒａｅｔｏｒｉｕｓ， Ｈ． Ｄｉｅｔｚ， Ｆａｃｉｌｅ ａｎｄ ｓｃａｌａｂｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｒｅ ａｎｄ ｄｅｎｓｅ ＤＮＡ ｏｒｉｇａｍｉ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ． Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ ５３， １２７３５－１２７４０ （２０１４）．
５９． Ｐ． Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．， Ｒａｐｉｄ ＡＡＶ－Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ Ｃｅｌｌ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｓｓａｙ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １３， ４０－４６ （２０１９）．
細胞傷害性を、細胞を半分の殻の混合物と２４又は４８時間インキュベーションした後細胞生存率により定量化した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をポリ－Ｌ－リジン処理９６穴プレートに８０，０００細胞ｍＬ－１で播種した。細胞を一晩定着させ、培地を除去し、中和（ｎｅｕｔｒａｌｉｓａｔｉｏｎ）アッセイと同一の手順で細胞を半分の殻の混合物に曝露した。細胞をさらに２４時間又は４８時間、半分の殻の溶液とインキュベートし、アラマーブルー試薬ｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、穴あたり１０μＬ）を加えた。プレートを混合し、プレートリーダー（ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ）で読み取る前に４時間インキュベートした。製造業者のプロトコルにより５７０ｎｍ及び６００ｎｍでの吸光度読みを行った。測定値を、同様に処理されたが、オリガミ構造を含まないＰＢＳを受けた、コントロール穴に対して正規化した。全ての条件を少なくとも三通り測定した。
［参考文献］
１． Ｃ． Ｇｏｒｔａｚａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｏｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ ｂａｒｒｉｅｒ： ｏｐｅｎｉｎｇ ｔｈｅ ｄｏｏｒ ｔｏ ｚｏｏｎｏｔｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ． ＰＬｏＳ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ １０， ｅ１００４１２９ （２０１４）．
２． Ｓ． Ｓ． Ｍｏｒｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｘｔ ｐａｎｄｅｍｉｃ ｚｏｏｎｏｓｉｓ． Ｌａｎｃｅｔ ３８０， １９５６－１９６５ （２０１２）．
３． Ｊ． Ｊ． Ｏ’Ｂｒｉｅｎ， Ｄ． Ｍ． Ｃａｍｐｏｌｉ－Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ａｃｙｃｌｏｖｉｒ． Ａｎ ｕｐｄａｔｅｄ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｉｔｓ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｉｃａｃｙ． Ｄｒｕｇｓ ３７， ２３３－３０９ （１９８９）．
４． Ｊ． ＬａＢｏｎｔｅ， Ｊ． Ｌｅｂｂｏｓ， Ｐ． Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ， Ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ２， ３４５－３４６ （２００３）．
５． Ｗ． Ｌ． Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ １－Ａｄａｍａｎｔａｎａｍｉｎｅ （Ａｍａｎｔａｄｉｎｅ）． Ｓｃｉｅｎｃｅ １４４， ８６２－８６３ （１９６４）．
６． Ｙ． Ｋ． Ｇｕｐｔａ， Ｍ． Ｍｅｅｎｕ， Ｐ． Ｍｏｈａｎ， Ｔｈｅ Ｔａｍｉｆｌｕ ｆｉａｓｃｏ ａｎｄ ｌｅｓｓｏｎｓ ｌｅａｒｎｔ． Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ４７， １１－１６ （２０１５）．
７． Ｊ． Ｍ． Ｓｔｅｉｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ａ ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ＨＩＶ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｆ ｂｒｏａｄｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６６， （２０１９）．
８． Ｋ． Ｏ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｂ ｃｅｌｌ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６６， （２０１９）．
９． Ｂ． Ｋ． Ｇａｎｓｅｒ－Ｐｏｒｎｉｌｌｏｓ， Ｏ． Ｐｏｒｎｉｌｌｏｓ， Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ－１ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ ＴＲＩＭ５． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １７， ５４６－５５６ （２０１９）．
１０． Ｋ． Ａ． Ｓｋｏｒｕｐｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｇｏｖｅｒｎｓ ＴＲＩＭ５ａｌｐｈａ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ－ １ ａｎｄ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｃａｐｓｉｄｓ． Ｓｃｉ Ａｄｖ ５， ｅａａｗ３６３１ （２０１９）．
１１． Ｍ． Ｍａｍｍｅｎ， Ｓ． Ｋ． Ｃｈｏｉ， Ｇ． Ｍ． Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ， Ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ： Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ Ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ． Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ３７， ２７５４－２７９４ （１９９８）．
１２． Ｖ． Ｃａｇｎｏ， Ｅ． Ｄ． Ｔｓｅｌｉｇｋａ， Ｓ． Ｔ． Ｊｏｎｅｓ， Ｃ． Ｔａｐｐａｒｅｌ， Ｈｅｐａｒａｎ Ｓｕｌｆａｔｅ Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ ａｎｄ Ｖｉｒａｌ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ： Ｔｒｕｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｏｒ Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ Ｂｉａｓ？ Ｖｉｒｕｓｅｓ １１， （２０１９）．
１３． Ｆ． Ｈ． Ｃｒｉｃｋ， Ｊ． Ｄ． Ｗａｔｓｏｎ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｖｉｒｕｓｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ １７７， ４７３－４７５ （１９５６）．
１４． Ｊ． Ｂ． Ｂａｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｃｕｒａｔｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｍｅｇａｄａｌｔｏｎ－ｓｃａｌｅ ｔｗｏ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｉｃｏｓａｈｅｄｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３， ３８９－３９４ （２０１６）．
１５． Ｎ． Ｐ． Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｃｕｒａｔｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｃｏ－ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ ｍｕｌｔｉ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ． Ｎａｔｕｒｅ ５１０， １０３－１０８ （２０１４）．
１６． Ｙ． Ｔ． Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃａｇｅ ｔｈａｔ ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｅｓ ｉｎｔｏ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｐｏｒｏｕｓ ｃｕｂｅ． Ｎａｔｕｒｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６， １０６５－１０７１ （２０１４）．
１７． Ｇ． Ｌ． Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ ｉｔｓ ｏｗｎ ＲＮＡ ｇｅｎｏｍｅ． Ｎａｔｕｒｅ ５５２， ４１５－４２０ （２０１７）．
１８． Ｒ． Ｉｉｎｕｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｏｌｙｈｅｄｒａ ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｆｒｏｍ ＤＮＡ ｔｒｉｐｏｄｓ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ３Ｄ ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４４， ６５－６９ （２０１４）．
１９． Ｋ． Ｆ． Ｗａｇｅｎｂａｕｅｒ， Ｃ． Ｓｉｇｌ， Ｈ． Ｄｉｅｔｚ， Ｇｉｇａｄａｌｔｏｎ－ｓｃａｌｅ ｓｈａｐｅ－ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＤＮＡ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ ５５２， ７８－８３ （２０１７）．
２０． Ｄ． Ｌ． Ｃａｓｐａｒ， Ａ． Ｋｌｕｇ， Ｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｒ ｖｉｒｕｓｅｓ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｓｙｍｐｏｓｉａ ｏｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ２７， １－２４ （１９６２）．
２１． Ｒ． Ｔｗａｒｏｃｋ， Ａ． Ｌｕｑｕｅ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｕｚｚｌｅｓ ｉｎ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ｓｏｌｖｅｄ ｗｉｔｈ ａｎ ｏｖｅｒａｒｃｈｉｎｇ ｉｃｏｓａｈｅｄｒａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ． Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １０， ４４１４ （２０１９）．
２２． Ａ． Ｌ． Ｌｌａｍａｓ－Ｓａｉｚ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｎｕｔｅ ｖｉｒｕｓ ｏｆ ｍｉｃｅ． Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５３， ９３－１０２ （１９９７）．
２３． Ｊ． Ａ． Ｓｐｅｉｒ， Ｓ． Ｍｕｎｓｈｉ， Ｇ． Ｗａｎｇ， Ｔ． Ｓ． Ｂａｋｅｒ， Ｊ． Ｅ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎａｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｗｏｌｌｅｎ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｃｏｗｐｅａ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ Ｘ－ｒａｙ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ｃｒｙｏ－ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３， ６３－７８ （１９９５）．
２４． Ｐ． Ｗ． Ｋ． Ｒｏｔｈｅｍｕｎｄ， Ｆｏｌｄｉｎｇ ＤＮＡ ｔｏ ｃｒｅａｔｅ ｎａｎｏｓｃａｌｅ ｓｈａｐｅｓ ａｎｄ ｐａｔｔｅｒｎｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４４０， ２９７－３０２ （２００６）．
２５． Ｓ． Ｍ． Ｄｏｕｇｌａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎｔｏ ｎａｎｏｓｃａｌｅ ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｈａｐｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４５９， ４１４－４１８ （２００９）．
２６． Ｃ． Ｅ． Ｃａｓｔｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ａ ｐｒｉｍｅｒ ｔｏ ｓｃａｆｆｏｌｄｅｄ ＤＮＡ ｏｒｉｇａｍｉ． Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ８， ２２１－２２９ （２０１１）．
２７． Ｒ． Ｖｅｎｅｚｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｓｉｇｎｅｒ ｎａｎｏｓｃａｌｅ ＤＮＡ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｏｐ ｄｏｗｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５２， １５３４ （２０１６）．
２８． Ｅ． Ｂｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＤＮＡ ｒｅｎｄｅｒｉｎｇ ｏｆ ｐｏｌｙｈｅｄｒａｌ ｍｅｓｈｅｓ ａｔ ｔｈｅ ｎａｎｏｓｃａｌｅ． Ｎａｔｕｒｅ ５２３， ４４１－４４４ （２０１５）．
２９． Ｋ． Ｅ． Ｄｕｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｕｉｄｉｎｇ ｔｈｅ ｆｏｌｄｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ＤＮＡ ｏｒｉｇａｍｉ． Ｎａｔｕｒｅ ５２５， ８２－８６ （２０１５）．
３０． Ｘ． Ｃ． Ｂａｉ， Ｔ． Ｇ． Ｍａｒｔｉｎ， Ｓ． Ｈ． Ｓｃｈｅｒｅｓ， Ｈ． Ｄｉｅｔｚ， Ｃｒｙｏ－ＥＭ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ３Ｄ ＤＮＡ－ｏｒｉｇａｍｉ ｏｂｊｅｃｔ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０９， ２００１２－２００１７ （２０１２）．
３１． Ｊ． Ｊ． Ｆｕｎｋｅ， Ｈ． Ｄｉｅｔｚ， Ｐｌａｃｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｗｉｔｈ Ｂｏｈｒ ｒａｄｉｕｓ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ ｏｒｉｇａｍｉ． Ｎａｔｕｒｅ ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１， ４７－５２ （２０１６）．
３２． Ｒ． Ｊｕｎｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， ＤＮＡ ｏｒｉｇａｍｉ－ｂａｓｅｄ ｎａｎｏｒｉｂｂｏｎｓ： ａｓｓｅｍｂｌｙ， ｌｅｎｇｔｈ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ， ａｎｄ ｔｗｉｓｔ． Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２， ２７５３０１ （２０１１）．
３３． Ｗ． Ｌｉｕ， Ｈ． Ｚｈｏｎｇ， Ｒ． Ｗａｎｇ， Ｎ． Ｃ． Ｓｅｅｍａｎ， Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ＤＮＡ－ｏｒｉｇａｍｉ ａｒｒａｙｓ． Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ ５０， ２６４－２６７ （２０１１）．
３４． Ｙ． Ｓｕｚｕｋｉ， Ｍ． Ｅｎｄｏ， Ｈ． Ｓｕｇｉｙａｍａ， Ｌｉｐｉｄ－ｂｉｌａｙｅｒ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｏｒｉｇａｍｉ ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ６， ８０５２ （２０１５）．
３５． Ｙ． Ｋｅ ｅｔ ａｌ．， ＤＮＡ ｂｒｉｃｋ ｃｒｙｓｔａｌｓ ｗｉｔｈ ｐｒｅｓｃｒｉｂｅｄ ｄｅｐｔｈｓ． Ｎａｔｕｒｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６， ９９４－１００２ （２０１４）．
３６． Ｔ． Ｇｅｒｌｉｎｇ， Ｋ． Ｆ． Ｗａｇｅｎｂａｕｅｒ， Ａ． Ｍ． Ｎｅｕｎｅｒ， Ｈ． Ｄｉｅｔｚ， Ｄｙｎａｍｉｃ ＤＮＡ ｄｅｖｉｃｅｓ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ ｆｏｒｍｅｄ ｂｙ ｓｈａｐｅ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ， ｎｏｎ－ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ ３Ｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４７， １４４６－１４５２ （２０１５）．
３７． Ｓ． Ｍ． Ｄｏｕｇｌａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｒａｐｉｄ ｐｒｏｔｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ３Ｄ ＤＮＡ－ｏｒｉｇａｍｉ ｓｈａｐｅｓ ｗｉｔｈ ｃａＤＮＡｎｏ． Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３７， ５００１－５００６ （２００９）．
３８． Ｃ． Ｍａｆｆｅｏ， Ｊ． Ｙｏｏ， Ａ． Ａｋｓｉｍｅｎｔｉｅｖ， Ｄｅ ｎｏｖｏ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｏｒｉｇａｍｉ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｔｏｍｉｓｔｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ． Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ４４， ３０１３－３０１９ （２０１６）．
３９． Ｋ． Ｆ． Ｗａｇｅｎｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｈｏｗ ｗｅ ｍａｋｅ ＤＮＡ ｏｒｉｇａｍｉ． Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ ： ａ Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ， （２０１７）．
４０． Ｔ． Ｇｅｒｌｉｎｇ， Ｈ． Ｄｉｅｔｚ， Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔａｃｋｉｎｇ Ｃｏｎｔａｃｔｓ ｉｎ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ． Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ ５８， ２６８０－２６８４ （２０１９）．
４１． Ｔ． Ｇｅｒｌｉｎｇ， Ｍ． Ｋｕｂｅ， Ｂ． Ｋｉｃｋ， Ｈ． Ｄｉｅｔｚ， Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｂｏｎｄｉｎｇ ｏｆ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ＤＮＡ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ． Ｓｃｉ Ａｄｖ ４， ｅａａｕ１１５７ （２０１８）．
４２． Ｎ． Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ ｅｔ ａｌ．， Ｏｌｉｇｏｌｙｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｃｏａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ＤＮＡ ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｒｏｍ ｌｏｗ－ｓａｌｔ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ８， １５６５４ （２０１７）．
４３． Ｍ． Ｌａｎｇｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｉｐｉｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｆｏｒｍｅｄ ｂｙ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ＤＮＡ ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３８， ９３２－９３６ （２０１２）．
４４． Ｎ． Ｋｅｒｎ， Ｄ． Ｆｒｅｎｋｅｌ， Ｆｌｕｉｄ－ｆｌｕｉｄ ｃｏｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｉｎ ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｓｙｓｔｅｍｓ ｗｉｔｈ ｓｈｏｒｔ－ｒａｎｇｅｄ ｓｔｒｏｎｇｌｙ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ａｔｔｒａｃｔｉｏｎ． Ｊ Ｃｈｅｍ Ｐｈｙｓ １１８， ９８８２－９８８９ （２００３）．
４５． Ｍ． Ｆ． Ｎａｓｏ， Ｂ． Ｔｏｍｋｏｗｉｃｚ， Ｗ． Ｌ． Ｐｅｒｒｙ， ３ｒｄ， Ｗ． Ｒ． Ｓｔｒｏｈｌ， Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ （ＡＡＶ） ａｓ ａ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ． ＢｉｏＤｒｕｇｓ ３１， ３１７－３３４ （２０１７）．
４６． Ｄ． Ｗａｎｇ， Ｐ． Ｗ． Ｌ． Ｔａｉ， Ｇ． Ｇａｏ， Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ａｓ ａ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １８， ３５８－３７８ （２０１９）．
４７． Ｆ． Ｐｒａｅｔｏｒｉｕｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｓｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｏｒｉｇａｍｉ． Ｎａｔｕｒｅ ５５２， ８４－８７ （２０１７）．
４８． Ｆ． Ａ． Ｓ． Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｓｔｏｍ－Ｓｉｚｅ， Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ， ａｎｄ Ｄｕｒａｂｌｅ ＤＮＡ Ｏｒｉｇａｍｉ ｗｉｔｈ Ｄｅｓｉｇｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ． ＡＣＳ ｎａｎｏ， （２０１９）．
４９． Ｂ． Ｋｉｃｋ， Ｆ． Ｐｒａｅｔｏｒｉｕｓ， Ｈ． Ｄｉｅｔｚ， Ｄ． Ｗｅｕｓｔｅｒ－Ｂｏｔｚ， Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ－ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｐｈａｇｅ ＤＮＡ ａｓ Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ｏｒｉｇａｍｉ． Ｎａｎｏ ｌｅｔｔｅｒｓ， （２０１５）．
５０． Ｊ． Ｒ． Ｋｒｅｍｅｒ， Ｄ． Ｎ． Ｍａｓｔｒｏｎａｒｄｅ， Ｊ． Ｒ． ＭｃＩｎｔｏｓｈ， Ｃｏｍｐｕｔｅｒ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｉｍａｇｅ ｄａｔａ ｕｓｉｎｇ ＩＭＯＤ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ １１６， ７１－７６ （１９９６）．
５１． Ｄ． Ｋｉｍａｎｉｕｓ， Ｂ． Ｏ． Ｆｏｒｓｂｅｒｇ， Ｓ． Ｈ． Ｓｃｈｅｒｅｓ， Ｅ． Ｌｉｎｄａｈｌ， Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｃｒｙｏ－ＥＭ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐａｒａｌｌｅｌｉｓａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＧＰＵｓ ｉｎ ＲＥＬＩＯＮ－２． Ｅｌｉｆｅ ５， （２０１６）．
５２． Ｊ． Ｚｉｖａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｗ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｒｙｏ－ＥＭ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ＲＥＬＩＯＮ－３． Ｅｌｉｆｅ ７， （２０１８）．
５３． Ｓ． Ｑ． Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＭｏｔｉｏｎＣｏｒ２： ａｎｉｓｏｔｒｏｐｉｃ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅａｍ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｏｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｃｒｙｏ－ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ． Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ １４， ３３１－３３２ （２０１７）．
５４． Ａ． Ｒｏｈｏｕ， Ｎ． Ｇｒｉｇｏｒｉｅｆｆ， ＣＴＦＦＩＮＤ４： Ｆａｓｔ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｄｅｆｏｃｕｓ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ １９２， ２１６－２２１ （２０１５）．
５５． Ｓｏｍｉｎｓｋａｙａ Ｉ， Ｓｋｒａｓｔｉｎａ Ｄ， Ｐｅｔｒｏｖｓｋｉｓ Ｉ， Ｄｉｓｈｌｅｒｓ Ａ， Ｂｅｒｚａ Ｉ， ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ａ ＶＬＰ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｃｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ： ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ Ｔｈ１／Ｔｈ２ ｓｗｉｔｃｈ ｉｎ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ｍｉｃｅ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８： ｅ７５９３８．
５６． Ｐ． Ｓ． Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｓｉｇｎｅｒ ＤＮＡ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｏｆｆｅｒｓ ｐｒｅｃｉｓｅ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ｓｐａｔｉａｌ ｐａｔｔｅｒｎ－ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｆｏｒ ｖｉｒａｌ ｓｅｎｓｉｎｇ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ． Ｎａｔ． Ｃｈｅｍ． １２， ２６-３５ （２０２０）．
５７． Ｈ． ＬＩ ｅｔ ａｋ， Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ－ｂａｓｅｄ ｎａｎｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： ｎｏｖｅｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＩＮＴＥＲＦＡＣＥ ＦＯＣＵＳ １， ７７２－７２４ （２０１１）．
５８． Ｅ． Ｓｔａｈｌ， Ｔ． Ｇ． Ｍａｒｔｉｎ， Ｆ． Ｐｒａｅｔｏｒｉｕｓ， Ｈ． Ｄｉｅｔｚ， Ｆａｃｉｌｅ ａｎｄ ｓｃａｌａｂｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｒｅ ａｎｄ ｄｅｎｓｅ ＤＮＡ ｏｒｉｇａｍｉ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ． Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ ５３， １２７３５－１２７４０ （２０１４）．
５９． Ｐ． Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．， Ｒａｐｉｄ ＡＡＶ－Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ Ｃｅｌｌ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｓｓａｙ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １３， ４０－４６ （２０１９）．
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26A】
【図26B】
【図26C】
【図26D】
【図26E】
【図26F】
【図27】
【図28A】
【図28B】
【図28C】
【図28D】
【図28E】
【図28F】
【図29A】
【図29B】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49】
【図50】
【図51】
【図52】
【配列表】
【国際調査報告】