特表 2023-514416 フルＡＡＶカプシドから空のＡＡＶカプシドを分離又は枯渇させる方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-04-05

(54)【発明の名称】フルＡＡＶカプシドから空のＡＡＶカプシドを分離又は枯渇させる方法

(51)【国際特許分類】

   B01D 15/08 20060101AFI20230329BHJP

   B01J 20/281 20060101ALI20230329BHJP

   B01J 20/34 20060101ALI20230329BHJP

   C12N 7/02 20060101ALI20230329BHJP

【ＦＩ】

B01D15/08

B01J20/22 D

B01J20/34 G

C12N7/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022550244

(86)(22)【出願日】2021-02-22

(85)【翻訳文提出日】2022-08-22

(86)【国際出願番号】 EP2021054337

(87)【国際公開番号】W WO2021165537

(87)【国際公開日】2021-08-26

(31)【優先権主張番号】20158833.2

(32)【優先日】2020-02-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】20164752.6

(32)【優先日】2020-03-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521262714

【氏名又は名称】ザルトリウス ビーアイエー セパレーションズ ディー．オー．オー．

(74)【代理人】

【識別番号】110001519

【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】チェルニゴイ、ウルフ

(72)【発明者】

【氏名】ゴリツァル、ブラジュ

(72)【発明者】

【氏名】ドーレンク、ダルコ

(72)【発明者】

【氏名】ギャニオン、ピーター エス．

【テーマコード（参考）】

4B065

4D017

4G066

【Ｆターム（参考）】

4B065AA95X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065BD14

4B065CA24

4B065CA44

4D017AA09

4D017BA07

4D017CA14

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4D017CB03

4D017CB05

4D017DA03

4G066AB09B

4G066AC11C

4G066BA03

4G066BA09

4G066BA16

4G066BA36

4G066CA54

4G066DA07

4G066EA01

4G066GA11

(57)【要約】

空のＡＡＶカプシド及びフルＡＡＶカプシドを含む水性混合物中のフルＡＡＶカプシドから空のＡＡＶカプシドを分離又は枯渇させる方法であって、混合物を、第１アルカリ性環境中、第一級アミノ基を担持する固相表面と接触させることによって、（ｉ）フルＡＡＶカプシドを固相表面に結合させる一方、空のＡＡＶカプシドの少なくとも一部を固相表面に結合させない、又は（ｉｉ）フルＡＡＶカプシド及び空のＡＡＶカプシドをどちらとも固相表面に結合させ、続いて、空のＡＡＶカプシドの少なくとも一部を第１アルカリ性環境のｐＨ値よりも高いｐＨ値の第２アルカリ性環境によって溶出させる、但し、第２アルカリ性環境は固相表面からフルＡＡＶカプシドを溶出させない、方法。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

空のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシド及びフルＡＡＶカプシドを含む水性混合物中のフルＡＡＶカプシドから空のＡＡＶカプシドを分離又は枯渇させる方法であって、前記混合物を、第１アルカリ性環境中、第一級アミノ基を担持する固相表面（a primary amino groups bearing solid phase surface）と接触させることによって、
（ｉ）フルＡＡＶカプシドを前記固相表面に結合させる一方、空のＡＡＶカプシドの少なくとも一部を前記固相表面に結合させず、結合した場合の空のＡＡＶカプシドの少なくとも一部を前記第１アルカリ性環境のｐＨ値よりも高いｐＨ値の第２アルカリ性環境によって溶出させる、但し、前記第２アルカリ性環境は前記固相表面からフルＡＡＶカプシドを溶出させない、
又は
（ｉｉ）フルＡＡＶカプシド及び空のＡＡＶカプシドをどちらとも前記固相表面に結合させ、続いて、空のＡＡＶカプシドの少なくとも一部を前記第１アルカリ性環境のｐＨ値よりも高いｐＨ値の第２アルカリ性環境によって溶出させる、但し、前記第２アルカリ性環境は前記固相表面からフルＡＡＶカプシドを溶出させない、
方法。

【請求項2】

前記第１アルカリ性環境のｐＨ値が、ｐＨ７を超え８以下である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

空のＡＡＶカプシドの少なくとも一部を前記第２環境によって溶出させた後、前記固相表面を前記第２環境のｐＨ値よりも高いｐＨ値を有する第３アルカリ性環境と接触させる、請求項１又は請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記固相表面を、前記第３アルカリ性環境のｐＨ値又は前記第２アルカリ性環境のｐＨ値よりも低いｐＨ値を有し、前記第１アルカリ性環境の塩濃度、前記第２アルカリ性環境の塩濃度、又は前記第３アルカリ性環境の塩濃度に比して高い塩濃度を有する第４アルカリ性環境と接触させる、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記第２アルカリ性環境のｐＨ値が、ｐＨ８．０～ｐＨ９．０の範囲、ｐＨ８．１～ｐＨ８．９の範囲、ｐＨ８．２～ｐＨ８．８の範囲、ｐＨ８．３～ｐＨ８．７の範囲、又はｐＨ８．４～ｐＨ８．６の範囲である、請求項１～請求項４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記第３アルカリ性環境のｐＨ値が、ｐＨ８．５～ｐＨ１０．５の範囲、又はｐＨ８．５～１０．０の範囲、又はｐＨ８．５～９．５の範囲である、請求項１～請求項５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記第１アルカリ性環境、前記第２アルカリ性環境、前記第３アルカリ性環境及び／又は前記第４アルカリ性環境が、ＮａＣｌ等のアルカリ金属塩１Ｍ以下の濃度、特に、１ｍＭ～１，０００ｍＭの濃度又は２．５ｍＭ～２５０ｍＭの濃度に相当する塩濃度を含む、請求項１～請求項６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記アルカリ性環境が、１．０ｍＭ～５．０ｍＭの範囲、特に、１．５ｍＭ～３．０ｍＭの範囲又は２．０ｍＭ～２．５ｍＭの範囲の濃度でマグネシウムイオンを含む、請求項１～請求項７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

フルＡＡＶカプシド及び空のＡＡＶカプシドがいずれかの血清型に属しており、特に、天然又は組換え血清型、キメラ、混合、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１～請求項８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記第一級アミノ基を担持する固相表面が、クロマトグラフィー装置内に配置される、請求項１～請求項９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記第一級アミノ基を担持する固相表面が、モノリス、充填粒子のカラム、充填ナノファイバーのカラム、膜吸着体、又はヒドロゲルである、請求項１～請求項１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

空のＡＡＶカプシド及びフルＡＡＶカプシドを含む水性混合物中の空のＡＡＶカプシドを分離又は枯渇させるための、第一級アミノ基を担持する固相表面（a solid phase surface bearing primary amino groups）を有する固相抽出材料の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、固相抽出を用いてフルＡＡＶカプシドから空のＡＡＶカプシドを分離又は枯渇させる方法に関する。

【背景技術】

【0002】

組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の調製物は、一般に２種のカプシドの亜集団で占められている。所望のカプシドは、目的とする治療用ＤＮＡペイロード（therapeutic DNA payload）で適切に満たされている。これらはフルカプシド（full capsids）と呼ばれる。純粋でない調製物は、目的とするＤＮＡロードで満たされていないカプシドも含有する。これらは空のカプシド（empty capsids）と呼ばれる。９０％以上の空のカプシドを含む調製物もあれば、５０％未満の調製物もある。現行の臨床ガイドラインは、空のＡＡＶカプシドの含有量を１０％未満に減らすことを推奨している。これは超遠心分離法によって達成できるが、装置とプロセスのスケールアップが難しく、作業者の些細な誤りによって不具合が生じる傾向にある。クロマトグラフィー法は遠心分離よりも有利であると考える者が多い。

【0003】

空のＡＡＶカプシドをフルＡＡＶカプシドから分離するためのクロマトグラフィー法が知られている［１－３］。強陰イオン交換体（strong anion exchangers）を用いてアルカリ性ｐＨでの塩勾配（salt gradient）で溶出させると、多くのＡＡＶ血清型について空のＡＡＶカプシドが適切に減少することが証明されている。しかしながら、１又は複数の点で結果が不十分な場合がある。第１に、分離度が制限される傾向にある。ベースライン分割が達成されるケース、つまり、空のＡＡＶカプシドとフルＡＡＶカプシドにそれぞれ対応するピークが完全に分離されることが知られているものの、これは例外的である。一般に各溶出ピークは互いにある程度オーバーラップし、場合によってほぼ完全にオーバーラップする。これにより、空のカプシドを十分に除去するために空のＡＡＶカプシドとオーバーラップするフルＡＡＶカプシドを犠牲にする必要がある。したがってフルカプシドの回収に支障をきたす（compromised）。

【0004】

関連する支障はまた強陰イオン交換体では分離が制限されることに関係し、当該技術の産業スケールでの使用に負担がかかる。多くの使用者は、大スケールのクロマトグラフィー技術で段階勾配溶出（step gradient elution）を採用することを好む。この技術はより単純で、機器、緩衝液調製、画分の回収及び分析にかかる費用を節約できるからである。段階勾配は残念なことに、プロセス毎の変数（every single process variable）が処理ロット間で不変でなければならないため、再現性に問題がある。変数の中でも特に、緩衝液はｐＨと導電率の両方に関して正確に同一の組成（composition）でなければならず、クロマトグラフィー媒体は正確に同一の組成でなければならず、処理温度は同一でなければならない。これらのパラメーターは実際にはどれも不変ではなく、フルＡＡＶカプシドの回収及び／又は空のＡＡＶカプシドの除去の程度に関して結果が必然的に変わってしまう。

【0005】

線形勾配溶出（linear gradient elution）は再現性を向上させる。溶出プロファイルは物質又は条件の変化によりわずかに変動することがあるが、溶出するフルカプシドのピークと空のカプシドのピークの相対的な関係は物質又は条件の変化とは無縁であり、分離が維持される。しかしながら、線形勾配溶出を担うスケール機器（scale equipment）の製造が段階勾配に比べて高価であり、また、多くのトレーニング、多くの緩衝液、多くの画分の分析、及び多くの時間を要する。

【0006】

３つめの制限は、強陰イオン交換体で空とフルの分離（empty-full separation）を行う際の極端な化学的条件に関係する。要求されるｐＨは多くの場合ｐＨ９．０以上であり、場合によって最大ｐＨ１０．０又はそれ以上である［１－３］。多くの場合、ｐＨが高いほど分離が良好である。しかし、ｐＨ９．０超のｐＨ値によって生じる化学的なストレスは多くのバイオ医薬品（biologics）の安定性を低下させることが残念ながら知られており、ｐＨが９．０を超えて高いほど化学的なストレスのレベルが高くなる。十分に精製されたＡＡＶカプシドのクロマトグラムは、多くの場合、部分的に解離したカプシドと遊離のカプシドタンパク質をそれぞれ表すと解される空のＡＡＶカプシドとフルＡＡＶカプシドに加えて、別のピークを示す。損傷がなかったフルＡＡＶカプシドへのダメージにより放出されたＤＮＡがはっきり表れることもある。

【0007】

強陰イオン交換体という用語は、第四級アミンリガンドを担持するクロマトグラフィー媒体に関連すると理解される。「強（strong）」という形容詞は、特に、約ｐＨ２．０～ｐＨ１２．０等の広いｐＨ値範囲において完全な帯電（full electrostatic charge）を維持する能力を指す。市販の製品名は一般にＱ、ＱＡ、ＱＡＥを含み、それぞれ第四級、第四級アミン、第四級アミノエチルを指す。強陰イオン交換体の他の名称は、ＴＥＡＥ（トリエチルアミノエチル）又はＴＭＡＥ（トリメチルアミノエチル）を含み、これらは同程度のアミン誘導体化に対応するが、命名規則が異なる。ＴＥＡＥ及びＴＭＡＥはやはり第四級アミンリガンドを表している。

【0008】

さほど誘導体化されていないアミノクロマトグラフィーリガンドの例は、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）等の名称で広く知られている。ＤＥＡＥは第三級アミノリガンドを表す。第三級アミノリガンドは、比較的限定されたｐＨ値範囲において完全な電荷を維持するため、いわゆる弱陰イオン交換体（weak anion exchangers）の例である。ＤＥＡＥリガンドは、７．５ほどの低ｐＨ値で電荷を失い始める。ＤＥＡＥリガンドは、ｐＨ９．０で大部分の電荷を失い、ｐＨ１２で本質的にすべての電荷を失う。ｐＨ９．０での電荷が低いと、ＡＡＶのための容量が低くなり生産性が低下する。また、第二級アミノリガンド又は第一級アミノリガンド等のより弱い陰イオン交換リガンドは、第四級アミノリガンドに比べて好ましくない結果をもたらす可能性が高いことも示唆される。この点で、ＤＥＡＥのような弱交換体は空のＡＡＶカプシドとフルＡＡＶカプシドの分離において殆ど検討されていないことは注目に値する。

【0009】

陰イオン交換体は、通常、例えば塩化ナトリウムの濃度を上昇させることによって生じる塩勾配を使用して、一定のｐＨ（fixed pH）で溶出される。陰イオン交換体は、低下するｐＨ勾配に伴い溶出されることもある。強交換体の電荷は約２～１２の範囲内では一定であるが、タンパク質の電荷は変化する。タンパク質の電気陰性度はｐＨの低下とともに弱くなり、タンパク質の電気陽性度は強くなる。電気陰性度の低下は、正に帯電した陰イオン交換表面への引力の低下を意味する。電気陽性度の増加は、正に帯電した陰イオン交換表面に対する反発力の増加を意味する。２つの現象が協奏的に起こりｐＨの低下に伴う溶出を実現する。強陰イオン交換体を上昇するｐＨ勾配にさらすと、結合している成分が更に強く結合する。

【0010】

陽イオン交換体はＡＡＶ精製に広く使用されているが、殆どの場合、空のＡＡＶカプシドとフルＡＡＶカプシドを単一のピークで一緒に溶出させる塩勾配溶出を使用する。それらはｐＨ勾配でも溶出できるが、陰イオン交換体が正に帯電するのに対して陽イオン交換体は負に帯電するため、陽イオン交換体の勾配溶出にはｐＨを上昇させることが必要である。上昇するｐＨ勾配での陽イオン交換体の溶出は、空のＡＡＶカプシドとフルＡＡＶカプシドをある程度分離可能にするが、その分離度は強陰イオン交換体の塩溶出によってもたらされる分離よりも劣る。

【発明の概要】

【0011】

本発明は、空のＡＡＶカプシドからのフルＡＡＶカプシドの分離が第一級アミノ基で修飾された固相によって達成できるという驚くべき知見に基づいている。本発明の方法は、一定のアルカリ性ｐＨで上昇する塩勾配で溶出される強（第四級アミン）陰イオン交換体を使用して空のＡＡＶカプシドを除去する既知の方法に関連するいくつかの実用上の制限を克服することができる［１－３］。本発明の方法を可能にする主要な特徴は、過剰な塩が存在しないにも関わらず、ｐＨをアルカリ性の範囲で上昇させることにより空のＡＡＶカプシドの大部分を選択的に除去できるという驚くべき知見である。これは、過剰な塩が存在しないアルカリ性ｐＨではカプシド結合が強く［１－３］、より高いｐＨ値ではカプシド結合が更に強くなるという、既知の陰イオン交換法における空のＡＡＶカプシドの振る舞いとは逆である。ここでいう「過剰な塩（excess salt）」という用語は、操作溶液（operating solutions）のｐＨを制御するために使用される緩衝液成分を超える塩、例えば、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、又は、トリス緩衝液若しくはビス－トリス－プロパン緩衝液若しくは結合した成分の溶出を達成するための他の緩衝液に添加され得る他の塩を指す。

【0012】

本発明は、全般的な態様では、固相抽出を使用してフルＡＡＶカプシド及び空のＡＡＶカプシドを含む水性混合物において空のＡＡＶカプシドからフルＡＡＶカプシドを分離又は枯渇させる方法であって、フルＡＡＶカプシド及び空のＡＡＶカプシドを含む水性混合物を、第一級アミノ基を担持する固相（primary amino group bearing solid phase）と接触させる方法に関する。

【0013】

本発明は、別の態様では、空のＡＡＶカプシド及びフルＡＡＶカプシドを含む水性混合物中のフルＡＡＶカプシドから空のＡＡＶカプシドを分離又は枯渇させるための方法であって、混合物を、第１アルカリ性環境中、第一級アミノ基を担持する固相表面と接触させることによって、
（ｉ）フルＡＡＶカプシドを固相表面に結合させる一方、空のＡＡＶカプシドの少なくとも一部を固相表面に結合させない、
又は
（ｉｉ）フルＡＡＶカプシド及び空のＡＡＶカプシドをどちらとも固相表面に結合させ、続いて、空のＡＡＶカプシドの少なくとも一部を第１アルカリ性環境のｐＨ値よりも高いｐＨ値の第２アルカリ性環境によって溶出させる、但し、第２アルカリ性環境は固相表面からフルＡＡＶカプシドを溶出させない、
方法に関する。

【0014】

本発明の一実施形態では、第１アルカリ性環境のｐＨ値がｐＨ７超であり得、特に、ｐＨ７を超え８以下であり得る。

【0015】

本発明の別の実施形態では、第２アルカリ性環境のｐＨ値は、第１アルカリ性環境のｐＨ値よりも高い値であり得る。本発明の更に別の実施形態では、空のＡＡＶカプシドの少なくとも一部を溶出させた後、固相表面を第２アルカリ性環境のｐＨ値よりも高いｐＨ値を有する第３アルカリ性環境と接触させてもよい。

【0016】

本発明の更に別の実施形態では、空のＡＡＶカプシドの少なくとも一部を溶出させた後、固相表面を、第３アルカリ性環境のｐＨ値又は第２アルカリ性環境のｐＨ値よりも低いｐＨ値を有し、第１アルカリ性環境の塩濃度、第２アルカリ性環境の塩濃度、又は第３アルカリ性環境の塩濃度に比して高い塩濃度を有する第４アルカリ性環境と接触させてもよい。

【0017】

本発明によれば、第２アルカリ性環境のｐＨ値は、特に、ｐＨ８．０～ｐＨ９．０の範囲、ｐＨ８．１～ｐＨ８．９の範囲、ｐＨ８．２～ｐＨ８．８の範囲、ｐＨ８．３～ｐＨ８．７の範囲、又はｐＨ８．４～ｐＨ８．６の範囲であってもよい。

【0018】

本発明によれば、第３アルカリ性環境のｐＨ値は、特に、ｐＨ８．５～ｐＨ１０．５の範囲、又はｐＨ８．５～ｐＨ１０．０の範囲、又はｐＨ８．５～ｐＨ９．５の範囲であってもよい。

【0019】

第１ｐＨ値、第２ｐＨ値、又は第３ｐＨ値のｐＨ範囲の重複は実質上（virtual）のものである。もし第１アルカリ性環境のｐＨ値がｐＨ８（ｐＨ７を超えｐＨ８以下の範囲）となるように選択され、第２アルカリ性環境の各ｐＨ値がｐＨ８．０～ｐＨ９．０となるように選択された場合、第２アルカリ性環境のｐＨ値は当該ｐＨ範囲の最低値、つまりｐＨ８であってはならず、これより高い値、例えば８．１又は８．２でなければならないことを意味しており、当業者はこのことを容易に理解することができる。第２アルカリ性環境のｐＨ範囲と第３アルカリ性環境のｐＨ範囲の実質上の重複に関しても同様の考察が当てはまる。

【0020】

本発明の方法の別の実施形態では、ＮａＣｌ等のアルカリ金属塩１Ｍ以下の濃度、特に、１ｍＭ～１，０００ｍＭの濃度、又は２．５ｍＭ～２５０ｍＭの濃度、例えば２．５ｍＭの濃度、又は５ｍＭの濃度、又は１２．５ｍＭの濃度、又は２５ｍＭの濃度、又は５０ｍＭの濃度、又は１００ｍＭの濃度、又は１５０ｍＭの濃度、又は２００ｍＭの濃度、又は２５０ｍＭの濃度に相当する塩濃度を含む、

【0021】

本発明の特定の実施形態では、アルカリ性環境が、１．０ｍＭ～５．０ｍＭの範囲、特に、１．５ｍＭ～３．０ｍＭの範囲又は２．０ｍＭ～２．５ｍＭの範囲のマグネシウムイオン濃度でマグネシウム塩を含んでいてもよい。

【0022】

本発明の有利な態様は、フルＡＡＶカプシド及び空のＡＡＶカプシドがいずれかの血清型に属していてもよく、特に、天然又は組換え血清型、キメラ（混合）、及びそれらの組み合わせからなる群より選択されてもよいという事である。

【0023】

本発明の方法は、当技術分野で通例の任意の装置に適用することができ、例えば、第一級アミノ基を担持する固相表面（primary amino groups bearing solid phase surface）をクロマトグラフィー装置内に配置させることができる。典型的には、第一級アミノ基を担持する固相表面は、モノリス、充填粒子のカラム、充填ナノファイバーのカラム、膜吸着体、又はヒドロゲルであり得る。

【0024】

本発明の主題はまた、空のＡＡＶカプシド及びフルＡＡＶカプシドを含む水性混合物中の空のＡＡＶカプシドを分離又は枯渇させるための、第一級アミノ基を担持する固相表面を有する固相抽出材料の使用である。

【0025】

本発明の方法を追加の処理ステップの後、前、又は前後とすることで、それらの追加の処理ステップのいずれか単独で達成され得るよりも大幅に空のカプシド含有量を減らし得る。空のカプシドの量を減らすための実用性をもたらすことが現在既知の追加の処理ステップは、第四級アミンイオン交換体を用いたイオン交換クロマトグラフィー及び密度勾配超遠心分離（density gradient ultracentrifugation）を含む。一実施形態では、本発明と第四級陰イオン交換体によるイオン交換クロマトグラフィーとを組み合わせることにより、空のカプシドを除去するために追加の処理を必要としない空のカプシドの濃度が十分に低いフルカプシドの画分を生み出す可能性がある。２つの工程は任意の順序で実行されてよい。別の実施形態では、本発明の方法の後に密度勾配超遠心分離を行うことができる。別の実施形態では、本発明と第四級アミン陰イオン交換体によるイオン交換クロマトグラフィーの組み合わせの後に、密度勾配超遠心分離を行うことができる。

【0026】

本発明が機能する特定のメカニズム（specific mechanism or mechanisms）に関する理論はまだ構築されていないが；本発明は既知の陽イオン交換クロマトグラフィー又は陰イオン交換クロマトグラフィーとは根本的に違っており、本発明は、強陰イオン交換体による塩溶出を基準に比べると、フルＡＡＶカプシドからの空のＡＡＶカプシドの優れた分離を達成する。分離の優位性とは、次の３つの特性の任意の組み合わせを指す：フルカプシドの安定性の維持に有利なより穏やかな化学的条件下で分離を行うことができる、及び／又は空のＡＡＶカプシドとフルＡＡＶカプシドの分離度を向上させる、及び／又は分離度が段階勾配溶出を実行可能な手法とするのに十分である。

【0027】

本方法（the method）は、分析又は調製用途を実行する目的で使用され得る。本方法は、すべてのＡＡＶ血清型に適用できる。特定のクロマトグラフィー条件、及び空のＡＡＶカプシドとフルＡＡＶカプシドの分離度は、血清型間で又は血清型内の異なる組換え構築物間で異なることがある。これは、イオン交換クロマトグラフィーの既知の方法で実施される空－フル分離（empty-full separation）においてよく知られた特徴であり、異なるＡＡＶ血清型間のカプシドの表面化学における本質的な変化を単純に反映している。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】図１は、塩溶出によるフルＡＡＶカプシドからの空のＡＡＶカプシドの分離を第四級アミノ固相と第一級アミノ固相とで比較した結果を示す。

【図2】図２は、塩溶出によるフルＡＡＶカプシドからの空のＡＡＶカプシドの分離を第四級アミノ固相と上昇するｐＨ勾配の第一級アミノ固相とで比較した結果を示す。

【図3】図３は、空のＡＡＶカプシドとフルＡＡＶカプシドがどちらとも結合し、空のＡＡＶカプシドを第２洗浄ステップで除去し、フルＡＡＶカプシドを上昇するｐＨ勾配で溶出させる条件下での第一級アミンカラムの平衡化とローディングの結果を示す。

【図4】図４は、空のＡＡＶカプシドが結合せず、続いてｐＨを低下させつつ塩を増加させてフルＡＡＶカプシドを段階勾配溶出させる条件下での第一級アミンカラムの平衡化及びサンプルローディングの結果を示す。

【図5】図５～図１０は一連の実験結果を示す。空のＡＡＶ８カプシドとフルＡＡＶ８カプシドを含むサンプルを、第一級アミノ基を担持する固相にｐＨ８．０で付与した。各実験では、ロードされたカラムをより高いｐＨの緩衝液で洗浄し、上昇するｐＨ勾配で溶出させ、ｐＨ９．５で終了した。

【図6】図５～図１０は一連の実験結果を示す。空のＡＡＶ８カプシドとフルＡＡＶ８カプシドを含むサンプルを、第一級アミノ基を担持する固相にｐＨ８．０で付与した。各実験では、ロードされたカラムをより高いｐＨの緩衝液で洗浄し、上昇するｐＨ勾配で溶出させ、ｐＨ９．５で終了した。

【図7】図５～図１０は一連の実験結果を示す。空のＡＡＶ８カプシドとフルＡＡＶ８カプシドを含むサンプルを、第一級アミノ基を担持する固相にｐＨ８．０で付与した。各実験では、ロードされたカラムをより高いｐＨの緩衝液で洗浄し、上昇するｐＨ勾配で溶出させ、ｐＨ９．５で終了した。

【図8】図５～図１０は一連の実験結果を示す。空のＡＡＶ８カプシドとフルＡＡＶ８カプシドを含むサンプルを、第一級アミノ基を担持する固相にｐＨ８．０で付与した。各実験では、ロードされたカラムをより高いｐＨの緩衝液で洗浄し、上昇するｐＨ勾配で溶出させ、ｐＨ９．５で終了した。

【図9】図５～図１０は一連の実験結果を示す。空のＡＡＶ８カプシドとフルＡＡＶ８カプシドを含むサンプルを、第一級アミノ基を担持する固相にｐＨ８．０で付与した。各実験では、ロードされたカラムをより高いｐＨの緩衝液で洗浄し、上昇するｐＨ勾配で溶出させ、ｐＨ９．５で終了した。

【図10】図５～図１０は一連の実験結果を示す。空のＡＡＶ８カプシドとフルＡＡＶ８カプシドを含むサンプルを、第一級アミノ基を担持する固相にｐＨ８．０で付与した。各実験では、ロードされたカラムをより高いｐＨの緩衝液で洗浄し、上昇するｐＨ勾配で溶出させ、ｐＨ９．５で終了した。

【図11】図１１は、勾配による空のＡＡＶカプシドとフルＡＡＶカプシドの相対的な回収率をグラフで示す。

【図12】図１２は、空のＡＡＶカプシドとフルＡＡＶカプシドの溶出に対するマグネシウムイオンの影響とマグネシウムイオン不在による影響を比較クロマトグラムで示す。

【発明を実施するための形態】

【0029】

「第一級アミンを担持する固相（primary amine-bearing solid phase）」という用語は、その表面に第一級アミンリガンドを主に担持するか又はそれだけを担持する固相を指し、第一級アミノリガンドという用語は、一重の共有結合（single covalent bond）によって２つの水素原子各々に結合し、一重の共有結合によって炭素原子にも結合している窒素原子を表す。第二級アミンは、固相表面に存在しないか又は存在しても少数であろう。第三級アミン及び第四級アミンは、存在しないか又は存在してもごく少数であろう。負に帯電した残基は存在しないであろう。荷電していない疎水性残基又は水素結合残基が存在する場合がある。第一級アミノリガンドは、リガンドの炭素原子を介して固相に直接共有結合していてもよい。或いは、第一級アミノリガンドは、固相に共有結合している所謂スペーサーアームへのリガンドの炭素原子の共有結合により、固相に間接的に結合していてもよい。第一級アミノリガンドは、固相に共有結合したポリマー構造の一部であってもよい。固相は、１種若しくは複数種の多孔質膜、１種若しくは複数種の繊維、１種若しくは複数種の多孔質粒子、又は１種若しくは複数種の非多孔質粒子の形態のクロマトグラフィー固相、或いは、単一のポリマー混合物から合成されたモノリス、又はまずマクロ骨格として合成され当該骨格上に合成された二次リガンドを担持するポリマー相（a secondary ligand-bearing polymer phase）を有するモノリスを含むモノリシック固相であってもよい。上記固相物質はいずれも、クロマトグラフィーの実施を容易にするためにハウジング内に提供されてもよい。ハウジング内のクロマトグラフィー固相は一般にクロマトグラフィー装置と呼ばれ、多くの場合カラムと呼ばれる。

【0030】

第一級アミンを担持するクロマトグラフィー固相は知られており、商業的に入手可能である。一例は、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＮＨ２－７５０Ｆ（東ソーバイオサイエンス）という名称で販売されており、「ＮＨ２」は第一級アミンを指す［https://www.separations.eu.tosohbioscience.com/solutions/process-media-products/by-mode/ion-exchange/anion-exchange/toyopearl-nh2-750f］。販売資料には、第一級アミンリガンドがポリアミンの形態であることが示されており、これは、固相に共有結合で固定された繰り返し第一級アミンサブユニットを有するポリマーであることを意味する。別の例は、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ ＳＴＩＣ ＰＡ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）という名称で販売されており、「ＰＡ」は第一級アミンを指す

【0031】

【数1】

【0032】

販売資料には、第一級アミンリガンドがポリアミン、具体的にはポリアリルアミンの形態であり、固相に共有結合で固定された繰り返し第一級アミンサブユニットを有することが示されている。クロマトグラフィー固相の全主要メーカーは、表面にアミン誘導体を有する製品を製造しており、第一級アミンを担持する固相を日常的又は実験的に製造するための当分野で必要な知識とリソースを提示している。

【0033】

第一級アミンを担持するクロマトグラフィー固相はその組成を明らかにする方法で名称がつけられていない場合があることを考慮すると、ある製品が本発明を実施するのに適切な特性を持っているかどうかを判断するための分析方法を持つことが有用であろう。この判断を行う１つの簡便な方法は、当該クロマトグラフィー固相を１０ｍＭのトリス、１０ｍＭのビス－トリス－プロパン、１５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２等の緩衝液で平衡化し、等電点電気泳動（isoelectric focusing）用のタンパク質標準物からなるサンプルを付与し、固相を平衡化緩衝液で洗浄した後、平衡化緩衝液で開始して、１０ｍＭのトリス、１０ｍＭのビス－トリス－プロパン、１５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ９．５で終点となり、終点緩衝液で１０カラムボリューム（ＣＶ）ホールドである、５０ＣＶの線形勾配を適用する。線形勾配にわたるタンパク質の溶出が、当該固相が第一級アミンを担持する固相であることを示すであろう。第四級アミンを担持する固相からなる対照実験を並行して実行してもよい。タンパク質は溶出しないであろう。等電点電気泳動用のタンパク質標準物は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ、及びＳｅｒｖａを含む種々の供給会社から市販されている。

【0034】

場合によっては、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を担持する固相が上記適性試験に従ったアルカリ性等電点を持つタンパク質の溶出を可能にし、空のカプシドとフルカプシドのある程度の分離を可能にし得る。直鎖状ＰＥＩは、末端だけ第一級アミンで占められており、ポリマーの各繰り返しサブユニットは第二級アミンで占められているアミンを有するポリマーである。分岐ＰＥＩポリマーは分岐点に第三級アミンも有している。ＰＥＩ固相は、一部のタンパク質の下降ｐＨ勾配分離を可能にすることが知られているが、第四級アミン固相と同様に、上昇するｐＨ勾配溶出のみが知られている。

【0035】

「平衡化した（equilibrated）」又は「平衡化（equilibration）」という用語は、特定の化学環境を作り出すために固相及び／又はサンプルに対して施される化学的な調整ステップを指す。固相は通常、目的とするｐＨ、塩組成、及び塩濃度を具現化する緩衝液にさらすことによって調整される。サンプルは通常、ｐＨ滴定、又は場合により塩濃度を下げるための希釈、又は場合によりクロマトグラフィー、透析、タンジェンシャルフローフィルトレーション（tangential flow filtration）膜を用いたダイアフィルトレーション（diafilteration）を含む緩衝液交換技術によって調整される。この場合、平衡条件は、固相が空のＡＡＶカプシドとフルカプシドの両方と結合するように設定できる。或いは、空のカプシドの大部分又は全部を含み得る空のカプシドのサブセットがサンプルローディング中に固相に結合しないように設定できる。これらの手法のすべて及びそのうちどれを選択するかの基準は、何十年にもわたり当技術分野でよく知られている。

【0036】

どのサンプルのフルＡＡＶカプシドも空のＡＡＶカプシドも、キメラ（混合）及び新規血清型を含む天然又は組換え血清型を含むいかなる血清型に属していてもよい。異なる血清型のカプシドは、空のＡＡＶカプシドとフルカプシドの異なるレベルの電荷特性を含め、異なる電荷特性を有し、そのような違いは血清型内の異なる組換え構築物間にもみられる場合があることが理解されるであろう。これは、どの調製物の挙動も強陰イオン交換体によって変化することから第一級アミノ固相でも変化する可能性があるため、重要であるである。また、これは、強陰イオン交換体で塩勾配を用いて空のＡＡＶカプシドとフルＡＡＶカプシドを分離する既知の方法の場合と同様に、未試行のＡＡＶサンプルに本方法（the method）を適用する場合ある程度の最適化が必要になる可能性が高いことを意味する。サンプルは、細胞培養回収物、細胞溶解物、アフィニティークロマトグラフィーカラムからの溶出画分、イオン交換クロマトグラフィーカラムから溶出した部分的に精製された画分、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムから溶出した部分的に精製された画分、又はＡＡＶを処理するために使用される任意の他の精製方法又はそれらの組み合わせからのカプシド混合物等の部分的に精製された調製物の形態であってもよい。

【0037】

「ロードした（loaded）」という用語は、平衡化したサンプルを平衡化した第一級アミノ固相と接触させるプロセスを指す。これは通常、クロマトグラフィー装置を用いて、重力又はポンピング等の外力によってサンプルを装置に通過させることにより行われる。

【0038】

「吸着（adsorption）」という用語は、生物学的産物（biological product）を化学的に相補性のある表面に結合させるプロセスを指す。この場合の相補性とは静電荷を伴うものと理解される。ＡＡＶカプシドの表面の負の静電荷は、第一級アミン残基の共有結合による固定化によって正に帯電した固相表面への吸着を取りもつ。クロマトグラフィーに使用される固相への生物学的産物の吸着は、しばしば「結合（binding）」と呼ばれる。

【0039】

「選択的吸着（seletive adsorption）」という用語は、少なくとも１の種（species）の吸着を可能にしつつ、１又は複数の他の種（species）の吸着を防ぐ条件を適用することを指す。本願の場合（present case）では、操作ｐＨをアルカリ性範囲に調整して、所望のフルＡＡＶカプシドを吸着させつつ、望まない空のＡＡＶカプシドが吸着するのを防止することができる。

【0040】

「脱離（desorption）」という用語は、生物学的産物が吸着した化学的に相補性のある表面から当該生物学的産物を放出させるプロセスを指す。本願の場合、そのような脱離は、例えばｐＨを低下させることによって；又は固相の電気陽性度を低下させることによって（例えばｐＨを上昇させることによって）；又は塩等の競合物質の導入により静電相互作用を妨げることによって；又はこれらの手法の任意の組み合わせによって生物学的産物（ＡＡＶ）の電気陰性度を低下させることを含む様々な手段によって行うことができるが、これらに限定されない。クロマトグラフィー媒体からの生物学的産物の脱離はしばしば溶出と呼ばれる。

【0041】

「選択的脱離（selective desorption）」という用語は、吸着した１の種（species）が、１又は複数の追加の種（additional species）を吸着させたままにする条件変更によって固相表面から放出され、続いて、更に異なる条件のセットにより異なる種が放出される状況を指す。条件変更は段階的に行ってもよい。条件変更は連続的に行ってもよく、弱く結合した種は一連の中で（in the continuum）早期に脱離し、強く結合した種は一連の中で後半に溶出し、理想的には互いに十分に分離される。

【0042】

「洗浄した（washed）」という用語は、結合していない種を固相から置換する目的で、ロードされたカラムをきれいな緩衝液にさらすプロセスを指す。本明細書の文脈において、「リンスした（rinsed）」という用語は同じ意味を有する。最も基本的なケースでは、洗浄緩衝液は平衡化緩衝液と同じ処方である。より複雑な構成では、洗浄緩衝液は、所望の産物が溶出する前に弱く結合した不純物を除去できるように、当該不純物のサブセットを固相から置換する追加の役割を有していてもよい。或いは、１回目は平衡化緩衝液と同じ条件を使用し、２回目は弱く結合した不純物のサブセットを固相から置換する条件を使用して溶出前にそれら不純物を除去できるようにする、複数の洗浄ステップがあってもよい。

【0043】

「溶出（elution）」又は「溶出した（eluted）」という用語は、固体が存在する化学環境を変化させて、第一級アミノ固相と、ロード及び洗浄ステップ後に結合したままの種との間の相互作用を断ち切るプロセスを指す。

【0044】

空のＡＡＶカプシドが固相から除去されたら、さまざまな手法のいずれかによってフルＡＡＶカプシドを溶出することができる。上記のように、フルＡＡＶカプシドは、塩の不在下又は過剰な塩の存在下ｐＨを更に上昇させることによって溶出されてもよい。或いは、空のＡＡＶカプシドが除去されたら、フルＡＡＶカプシドは、塩の存在下ｐＨを上昇させることによって溶出されてもよい。或いは、空のＡＡＶカプシドが除去されたら、フルＡＡＶカプシドは、ｐＨを一定に保ちながら過剰な塩を導入することによって溶出されてもよい。或いは、空のＡＡＶカプシドが除去されたら、フルＡＡＶカプシドは、ｐＨを下げながら過剰な塩を導入することによって溶出されてもよい。

【0045】

下記一連の基本方法の選択枝の一般的で非限定的な説明は、各方法がどのように実行され得るかの変形例を示し、操作変数（operational variables）に関する詳細な議論のための基礎を提供するものである。これらの構想（senarios）のそれぞれで言及されている緩衝液条件は、各方法をどのように実施するかについての一般的な考え方を提供することを意図しており、異なる血清型からのカプシド混合物又は血清型内の異なる組換え構築物にも対応するためには緩衝液処方の最適化が必要であることが理解されるだろう。

【0046】

上昇するｐＨ勾配による溶出だけを利用する一実施形態では、モノリス等のクロマトグラフィー装置の形態の第一級アミノ固相が２０ｍＭのトリス、２０ｍＭのビス－トリス－プロパン、ｐＨ７．５±０．２等の中性に近いｐＨ値に平衡化される。空のＡＡＶカプシドとフルＡＡＶカプシドの混合物を含むサンプルは、緩衝液交換によって２０ｍＭのトリス、２０ｍＭのビス－トリス－プロパン、ｐＨ７．５±０．２に平衡化される。サンプルがクロマトグラフィー装置にロードされる。続いて、クロマトグラフィー装置は、平衡化緩衝液から２０ｍＭのトリス、２０ｍＭのビス－トリス－プロパン、ｐＨ９．５±０．２、２０装置ボリューム（device volume）以上、又は５０装置ボリューム以上、又は１００装置ボリューム以上の終点緩衝液までの線形ｐＨ勾配で溶出される。装置ボリュームの数は、勾配中にｐＨが変化する速度、つまり勾配スロープを調節する手段として用いられる。この手法は、全体の空のカプシドとフルカプシド集団が勾配内で溶出するため特に分析目的で使用され得る。また、分取の使用条件を開発するための出発点としても価値があるだろう。分取用にも使用できるが、この手法ではフルＡＡＶカプシドがさまざまなｐＨ値にさらされる可能性があり、カプシドの安定性に悪影響を与える可能性があることに留意されたい。

【0047】

上昇する塩勾配による溶出だけを利用する実施形態では、モノリス等のクロマトグラフィー装置の形態の第一級アミノ固相が２０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．５±０．２等のわずかにアルカリ性の値に平衡化される。空のＡＡＶカプシドとフルＡＡＶカプシドの混合物を含むサンプルが緩衝液交換によって同じ条件に平衡化される。サンプルがクロマトグラフィー装置にロードされる。続いて、クロマトグラフィー装置は、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５±０．２の平衡化緩衝液から２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５±０．２、２０装置ボリューム以上、又は５０装置ボリューム以上、又は１００装置ボリューム以上の終点緩衝液への線形塩化ナトリウム勾配で溶出される。装置ボリュームの数は、勾配中に塩濃度が変化する速度、つまり勾配スロープを調節する手段として用いられる。この手法は、上記のように空のカプシドとフルカプシドのすべてがサンプルロード中に第一級アミノ固相に結合するため、分析目的にも適し得る。空のＡＡＶカプシドとフルＡＡＶカプシドの分離度は、上昇するｐＨ勾配での溶出よりも一般に劣るが、固定したｐＨで塩勾配で溶出される強陰イオン交換体による分画よりは優れている。

【0048】

上昇する塩勾配による溶出だけを利用する密接に関連した実施形態では、モノリス等のクロマトグラフィー装置の形態の第一級アミノ固相が１０ｍＭのトリス、１０ｍＭのビス－トリス－プロパン、ｐＨ８．７±０．２等の弱アルカリ性のｐＨ値に平衡化される。空のＡＡＶカプシドとフルＡＡＶカプシドの混合物を含むサンプルが緩衝液交換によって同じ条件に平衡化され、固体表面に適用される。続いて、クロマトグラフィー装置は、１０ｍＭのトリス、１０ｍＭのビス－トリス－プロパン、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．７±０．２、２０装置ボリューム以上、又は５０装置ボリューム以上、又は１００装置ボリューム以上の平衡化緩衝液からの線形塩化ナトリウム勾配で溶出させる。装置ボリュームの数は、勾配中に塩濃度が変化する速度、つまり勾配スロープを調節する手段として用いられる。この手法は、上記のように空のカプシドとフルカプシドのすべてがサンプルロード中に第一級アミノ固相に結合するため、分析目的にも適し得る。空のＡＡＶカプシドとフルＡＡＶカプシドの分離度は、より低い固定したｐＨ値での塩勾配よりも良好であり、固定したｐＨでの塩勾配で溶出される強陰イオン交換体による分画よりも一般に優れているが、第一級アミノ固相での上昇するｐＨ勾配での溶出よりは一般に劣る。

【0049】

ｐＨ溶出と塩溶出の組み合わせ（mixed pH-salt elustion）を利用する実施形態では、モノリス等のクロマトグラフィー装置の形態の第一級アミノ固相が２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．０±０．２等の中性に近いｐＨ値に平衡化される。空のＡＡＶカプシドとフルＡＡＶカプシドの混合物を含むサンプルが緩衝液交換によって２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．０±０．２に平衡化される。サンプルがクロマトグラフィー装置にロードされる。これらの条件下では、空の粒子とフル粒子はどちらとも固相に結合する。装置が平衡化緩衝液で洗浄され、結合していない種が除去される。空のＡＡＶカプシドは、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．５±０．２等のより高いｐＨの緩衝液にさらすことで化学環境を変化させることにより、装置から洗浄／溶出される。この緩衝液は、カラムからの流出液のＵＶ吸光度がベースラインに達するまでクロマトグラフィー装置に流される。空のＡＡＶカプシドが装置から除去されたら、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０等のより低いｐＨで過剰な塩を含む緩衝液にさらすことで化学環境を再び変化させる。この手法は、フルカプシドの溶出の条件が穏やかなため分取に有利であり得る。これは段階勾配溶出構成（step gradient elution format）の例でもあり、一部の使用者はこの構成が有利であると考えるだろう。

【0050】

ｐＨ溶出と塩溶出の組み合わせを利用する別の実施形態では、モノリス等のクロマトグラフィー装置の形態の第一級アミノ固相が２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．５±０．２等のアルカリ性ｐＨに平衡化される。空のＡＡＶカプシドとフルＡＡＶカプシドの混合物を含むサンプルが緩衝液交換によって２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．５±０．２に平衡化される。サンプルがクロマトグラフィー装置にロードされる。これらの条件下では、フル粒子は固相に結合するが、空の粒子は固相に結合しない。空のＡＡＶカプシドが装置から除去されたら、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０等のより低いｐＨで少量の塩を含む緩衝液にさらすことで化学環境を再び変化させる。この手法は、前述した手法よりも手順が簡単であるため、分取目的において興味を引く。しかしながら、平衡化条件がフルカプシドの結合を妨げる閾値に近いため、フルＡＡＶカプシドの結合能力が低下する可能性がある。

【0051】

フルＡＡＶカプシドの溶出においてｐＨ及び塩を利用する別の方法で実施形態では、モノリス等のクロマトグラフィー装置の形態の第一級アミノ固相が２０ｍＭのビス－トリス－プロパン、ｐＨ８．５±０．２等の中性に近いｐＨ値に平衡化される。空のＡＡＶカプシドとフルＡＡＶカプシドの混合物を含むサンプルが緩衝液交換によって２０ｍＭのビス－トリス－プロパン、ｐＨ８．５に平衡化される。サンプルがクロマトグラフィー装置にロードされる。続いて、クロマトグラフィー装置は、平衡化緩衝液（ｐＨ７．５）から２０ｍＭのビス－トリス－プロパン、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５、２０装置ボリューム以上、又は５０装置ボリューム以上、又は１００装置ボリューム以上の終点緩衝液への線形塩勾配で溶出される。装置ボリュームの数は、勾配中に塩濃度が変化する速度、つまり勾配スロープを調節する手段として用いられる。予備データは、塩勾配によって、強陰イオン交換体に比べてより穏やかな条件下で当該強陰イオン交換体によって達成される空のＡＡＶカプシドとフルＡＡＶカプシドの分離と同様の分離がなされるものの、ｐＨ勾配に比べれば劣ることを示している。多くの場合、塩勾配のｐＨが高いほど、空のカプシドとフルカプシドの分離度（resolution）が向上する。

【0052】

上記基本構成のいずれか１つにおける１つ又は複数の要素が他の構成に適用されてもよいことは当業者にとって明白だろう。例えば、ｐＨと塩濃度の両方を同時に変化させ、両方のパラメーターを上昇させる溶出勾配、又は、ｐＨと塩濃度の両方を同時に変化させ、どちらかの（one or the other）パラメーターを上昇させつつ他方（the other）を低下させる溶出勾配を適用することができ；単段階溶出（single step elution）は多段階溶出（multiple step elution）に変形（converted）でき；線形勾配溶出は段階溶出に変形でき；線形勾配溶出は、依然として結合している分を大幅に減らすものの完全に排除し切れない段階の後に適用でき；線形勾配溶出は、空のＡＡＶカプシドの殆どを結合させない平衡化条件下でのローディング後に適用できる。これら変形例又は多くの他の変形例を本方法（the method）の特徴的要素及び本質を逸脱しない範囲で適用することができる。

【0053】

一実施形態では、第一級アミノ固相及びサンプルがｐＨ５．５±０．２～ｐＨ８．５±０．２の範囲、又はｐＨ６．０±０．２～ｐＨ８．５±０．２の範囲、又はｐＨ６．５±０．２～ｐＨ８．５±０．２の範囲、又はｐＨ７．０±０．２～ｐＨ８．５±０．２の範囲、又はｐＨ７．５±０．２～ｐＨ８．５±０．２の範囲の操作ｐＨに平衡化される。正確な条件はＡＡＶ血清型によって変動し得、また、血清型内の異なる組換え構築物によっても変動し得ることは理解される。高いｐＨ範囲に耐えることが知られているサンプルの場合、ｐＨ範囲を更に高くしてもよい。一般に、上記範囲内でｐＨが高いほど、結合する空のＡＡＶカプシドは少なくなる。本質的にすべてのフルＡＡＶカプシドが結合しつつ空のＡＡＶカプシドは結合しないｐＨ値を特定するには、未検証のＡＡＶに対して簡単な実験が必要であろう。上記範囲内でｐＨが低いほど、フルＡＡＶカプシドは強く結合し、フルカプシドの結合容量が高くなる。しかしながら、空のＡＡＶカプシドがフルＡＡＶカプシドと結合スペースをめぐって競合する可能性があり、そのような競合がフルカプシドの結合容量を制限し得ることが熟練者にとって明らかであろう。これらは、あらゆる工業的精製法の開発中に検討される日常的なプロセス最適化の問題である。

【0054】

ｐＨ８．５±０．２で空のカプシド結合が懸濁（suspended）せず、カプシドの安定性を損なう可能性があるより高いｐＨ値の回避が特に望まれるいくつかの実施形態では、例えば２ｍＭのＮａＣｌ、又は５ｍＭのＮａＣｌ、又は１０ｍＭのＮａＣｌ、又は２０ｍＭのＮａＣｌ、又はそれらの中間の濃度、又はそれ以上の濃度の塩が平衡化緩衝液に添加されてもよい。中程度のｐＨで結合している空のカプシドの懸濁を達成する最低限の塩濃度が一般に最も有利である。空のＡＡＶカプシドを置換するために、３０ｍＭ、又は４０ｍＭ、又は５０ｍＭ、又は６０ｍＭ、又は７０ｍＭ、又はそれらの中間の濃度、又はそれ以上の濃度等のより高い濃度の使用を評価したい場合、迂闊な置換及びフルカプシドの損失を回避するよう注意しながら評価することができる。この手法は、特に酸性のｐＨ値、中性のｐＨ値、又は非常に弱アルカリ性のｐＨ値で結合する空のカプシド結合を減らすために必要に応じて検討することができる。

【0055】

サンプルをクロマトグラフィーカラムにロードするための条件に当該サンプルを平衡化させる多くの方法が当業者に知られている。これらの方法はいずれも、本方法（the method）の本質を変更しない範囲で用いることができる。これらの方法には、実験室スケールの透析法、タンジェンシャルフローフィルトレーション膜を用いたダイアフィルトレーション、及び緩衝液交換クロマトグラフィー法がある。場合により、サンプルを目的のｐＨに滴定し、必要に応じて水又は塩を少し含有する緩衝液又は塩を含有しない緩衝液でサンプルを希釈することにより、十分なサンプル平衡化が行われてもよい。

【0056】

平衡化は、空のＡＡＶカプシドによる結合を防ぐものであるが、そうする条件はフルＡＡＶカプシドの結合を弱め、フルカプシドに対する固相の容量を減らしてしまう可能性がある。分取分離の目標は所望のフルカプシドの最大の実用的なロードを提供することであるため、洗浄は溶出前の空のカプシドの含有量を最小限に抑えるための潜在的に支障が少ない手法を提供する。最も効果的な洗浄条件が用いられると、一般に中性か又はより低いｐＨで最小限の塩を用いるか又は更なる塩を用いない、所望のフルカプシドの高容量結合に有利な平衡化条件を選択することができる。

【0057】

一実施形態では、空のＡＡＶカプシドとフルＡＡＶカプシドの混合物がロードされた第一級アミン固相は、固相を平衡化するために使用した緩衝液と同じ組成の緩衝液で洗浄される。

【0058】

別の実施形態では、空のＡＡＶカプシドとフルＡＡＶカプシドの混合物をロードした第一級アミン固相が、平衡化緩衝液よりも高いｐＨを有する緩衝液で洗浄される。例えば、ｐＨ７．５で平衡化及びロードされた第一級アミン固相が、固相を平衡化するために使用される緩衝液と同じ組成の緩衝液で最初に洗浄され、続いて、ｐＨ８．０±０．２、又はｐＨ８．１±０．２、又はｐＨ８．２±０．２、又はｐＨ８．３±０．２、又はｐＨ８．４±０．２、又はｐＨ８．５±０．２、又はｐＨ８．６±０．２、又はｐＨ８．７±０．２等のより高いｐＨの緩衝液で再度洗浄されてもよい。正確な条件は、ＡＡＶ血清型によって変動し得、血清型内の異なる組換え構築物によって変動し得ることは理解される。ｐＨを上げても空のＡＡＶカプシドが完全に除去されない場合は、塩が添加されてもよい。例えば、ｐＨ８．５±０．２の緩衝液に対して、２ｍＭ、又は５ｍＭ、又は１０ｍＭ、又は２０ｍＭ、又はそれらの中間の濃度、又はそれ以上の濃度に相当する量のＮａＣｌが添加されてもよい。

【0059】

関連する実施形態では、サンプル平衡化のｐＨ条件とは異なる条件で洗浄する手法が、本方法全体（the overall nethod）を簡略化する別の方法で行われてもよい。サンプルとカラムは異なる条件で平衡化できる。具体的には、サンプルは、フルカプシドの最大容量の結合を後押しするｐＨ及び／又は塩濃度に平衡化することができ、一方でカラムは、フルカプシドの溶出ステップの前に空のＡＡＶカプシドを大幅に除去する条件に平衡化することができる。例えば、サンプルが５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５±０．２に平衡化され、カラムが５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．５±０．２に平衡化されてもよい。サンプルがカラムにロードされると、カラムを少なくとも部分的にサンプルの条件に再平衡化させる効果を有するだろう。サンプルのロードの最後に、より高いｐＨ条件の平衡化／洗浄緩衝液がサンプル付与中に結合した空のＡＡＶカプシドをすぐに置換し始める。２回目の洗浄ステップを含める必要はないであろう。緩衝液の調製と本方法全体が簡略化されるだろう。

【0060】

一実施形態では、ｐＨを上げることによってフルＡＡＶカプシドだけを溶出させる。これは、ＡＡＶカプシドの血清型に応じて、ｐＨ８．６±０．２、又は８．７±０．２、又は８．８±０．２、又は８．９±０．２、又は９．０±０．２、又は９．１±０．２、又は９．２±０．２、又は９．３±０．２、又は９．４±０．２、又は９．５±０．２、又はそれらより低い値、又はそれらの中間の値、又はそれらより高い値への単段階溶出（single elution step）、又は多段階勾配溶出（multiple step gradient elution）、又は線形勾配溶出（liner gradient elution）で構成されてもよい。

【0061】

ｐＨ値が９．０±０．２に近づきそれを超えることでフルＡＡＶカプシドが不安定化するリスクが高まることが認められたら、塩の添加によって溶出ｐＨを緩和させてもよい。例えば、ｐＨ９．５±０．２への段階又は勾配による溶出の代わりに、２ｍＭのＮａＣｌ、又は５ｍＭのＮａＣｌ、又は１０ｍＭのＮａＣｌ、又は１５ｍＭのＮａＣｌ、又は２５ｍＭのＮａＣｌ、又はこれらより低い値のＮａＣｌ、又はこれらの中間の値のＮａＣｌ、又はこれらより高い値のＮａＣｌの存在下、ｐＨ８．５±０．２への段階又は勾配による溶出が実施されてもよい。或いは、ｐＨ８．０±０．２、又はｐＨ７．５±０．２、又はｐＨ７．０±０．２、又はｐＨ６．５±０．２、又はｐＨ６．０±０．２、又はｐＨ５．５±０．２、又はこれらより低い値、又はこれらの中間の値、又は塩の添加によって高めたこれらより高い値で段階勾配又はｐＨ勾配が実施されてもよい。塩を多く添加するほどｐＨを低くできることは当業者にとって明らかであろう。必要であれば、任意のｐＨ値で添加される塩の量は、２．５ｍＭ～２５０ｍＭの範囲内、例えば２．５ｍＭ、又は５ｍＭ、又は１２．５ｍＭ、又は２５ｍＭ、又は５０ｍＭ、又は１００ｍＭ、又は１５０ｍＭ、又は２００ｍＭ、又は２５０ｍＭ、又はこれらより低い値、又はこれらの中間の値、又はこれらより高い値の任意の値に増やすことができる。

【0062】

上記実施形態はいずれもマグネシウム及び／又はカルシウム等の二価金属陽イオンの存在下で行われてもよく、濃度はいずれも０．１ｍＭ～１０ｍＭの範囲、又は０．５ｍＭ～５ｍＭの範囲、又は１．０ｍＭ～２．７５ｍＭの範囲、又は１．５ｍＭ～２．５ｍＭの範囲、又は１．７５ｍＭ～２．２５ｍＭの範囲、又は２．０ｍＭ±０．１ｍＭの範囲、又はこれらより高い値（例えば最大５ｍＭ）である。

【0063】

一実施形態では、マグネシウム及び／又はカルシウム等の二価金属カチオンは空のＡＡＶカプシドの完全性を維持するのに役立ち、空のカプシドを単一のピークとして溶出させる傾向にあるため、当該二価金属カチオンを含むことは分析の点で有利であり得る。これにより、所与のサンプル内の空のＡＡＶカプシドの総量と、空のＡＡＶカプシドとフルＡＡＶカプシドの相対的な量の測定がより簡単になる。

【0064】

いくつかの実施形態では、マグネシウム及び／又はカルシウム等の二価金属カチオンの存在は、空のカプシドからのフルカプシドの分離を改善することが多く、それに加えてフルカプシドを安定化させるため、分取分離にも有利であり得る。

【0065】

マグネシウムの存在は一般にＡＡＶの純度及び／又は回収率に関してより望ましい結果をもたらすと期待されている。しかし、他の実施形態では、マグネシウム及び／又はカルシウム等の二価金属イオンが不足していてもよいし、又は不在でもよい。これは特に次の場合に当てはまる：選択された分離条件下でフルＡＡＶカプシドが十分な安定性を示す場合；及び、不純物が全体に分布し、二価金属陽イオン非存在下での分画でフルカプシド画分の分離が可能であり、二価金属陽イオンの存在下で分離を行った場合に比べて空のＡＡＶカプシドによる汚染を少ない場合。

【0066】

前述の実施形態はいずれも、フルカプシドを安定化させる目的で、及び／又はカプシドの溶解度を向上させる目的で、及び／又は分離効率を減少させ得る若しくはフルカプシドの回収率を減少させ得るカプシドと固相の非特異的な相互作用を抑制する目的で、及び／又は単に分離の過程における導電率を低減する目的で、アルギニン又はヒスチジンの存在下で実施されてもよい。

【0067】

いくつかの実施形態では、勾配分離を行うためにＮａＣｌ又は他の塩の代わりにアルギニン又はヒスチジンが直接用いられてもよい。アルギニンの水に対する溶解度（aqueous solubility）は約６００ｍＭに制限され、ヒスチジンの水に対する溶解度は約２００ｍＭに制限される。アルギニンは溶解度が高いため使うのにより便利であるが、溶解度がより制限されたヒスチジンでも多くの場合効果的に使うことができる。

【0068】

カプシドを溶出するのに十分なアルギニン濃度又はヒスチジン濃度を達成することができない実施形態では、いずれも塩と併用されてもよく、例えば、アルギニンと塩化ナトリウムの組み合わせ、又は、ヒスチジンと塩化ナトリウムの組み合わせが含まれる。いくつかのそのような実施形態では、アルギニンのベースラインレベル（baseline level）が平衡化緩衝液、洗浄緩衝液、及び／又は溶出緩衝液に、或いは、洗浄緩衝液及び溶出緩衝液だけに、或いは、溶出緩衝液だけに追加され得る。このようなベースラインレベルは、２５ｍＭ又は５０ｍＭ、又はその溶解度範囲内の中間の濃度又はそれ以上の濃度であってもよい。

【0069】

別の実施形態では、アルギニン又はヒスチジンは、例えば５ｍＭの濃度、又は１０ｍＭの濃度、又はその溶解度範囲内の中間の濃度又はそれ以上の濃度で、上昇するｐＨ勾配中にベースラインレベルで用いられてもよい。

【0070】

上記実施形態はいずれも、グリシン又はアラニン又はベタイン等の低分子量両性イオンの存在下で実施されてもよい。そのような添加剤は、導電率を増加させずにカプシドの溶解性及び安定性を向上させる効果を有し得る。そのような両性イオンは極性を高めるが、導電率には寄与しない。また、それら両性イオンはタンパク質表面から優先的に排除され、これにより安定化効果を付与することができる。このような添加剤は、低導電率という不溶解化効果（desolubilizing effect）を克服するためにｐＨ勾配と併用されることが特に有用であり得、ここで添加剤はピークの鋭さ及び／又はカプシドの安定性を改善する効果を有し得る。

【0071】

いくつかの実施形態では、ベタインはｐＨ５．０～ｐＨ１０．０で使用されてもよいが、アラニン及びグリシンは５．０～約８．５の範囲に制限される。ｐＨ８．５を超えると、グリシン又はアラニンの窒素原子は正電荷を失い始め、分子は全体で負に帯電する。これによりアラニン又はグリシンがサンプルの導電率に影響し、それらの両性イオンの形態における他の有益な効果も一時的に発揮されなくなる。ベタインの窒素原子は、約ｐＨ１２以下でその電荷を維持する第四級アミンであり、その範囲全体にわたり両性イオンの形態を保つ。

【0072】

操作ｐＨが８．５以下である一実施形態では、グリシン又はアラニンが最大２Ｍ以上（up to 2M or more）、又は０．５Ｍ～２．５Ｍ、又は１．０Ｍ～２．０Ｍ、又は１．２５Ｍ～１．７５Ｍ、又は１．４Ｍ～１．６Ｍ、又は約１．５Ｍ、又はこれらとは異なる範囲の濃度で含まれていてもよい。

【0073】

ｐＨが１０未満である一実施形態では、ベタインが最大２Ｍ以上（up to 2M or more）、又は０．５Ｍ～２．５Ｍ、又は１．０Ｍ～２．０Ｍ、又は１．２５Ｍ～１．７５Ｍ、又は１．４Ｍ～１．６Ｍ、又は約１．５Ｍ、又はこれらとは異なる範囲の濃度で含まれていてもよい。

【0074】

上記実施形態はいずれも、例えばフルカプシドを安定化することを意図として、糖類の存在下で実施されてもよい。例えば０．５％～２５％以上の範囲の濃度のスクロース、ソルビトール、キシロース、マンニトール、トレハロース、又は他の非イオン性の糖類が挙げられるが、これらに限定されない。

【0075】

上記実施形態はいずれも、例えばフルカプシドを安定化することを意図として、例えば０．５％～２５％以上の濃度のグリセロールの存在下で実施されてもよい。

【0076】

上記実施形態はいずれも、カプシドと第一級アミノ固相表面の非特異的な相互作用を最小限に抑えるために、有機添加剤の存在下で実施されてもよい。このような添加剤には、０．０１％～１．０％の範囲の濃度のノニオン性界面活性剤を含む界面活性剤が含まれる。このような添加剤には、１％～１０％の範囲の濃度のエチレングリコール又はプロピレングリコール等の物質（agent）も更に含まれる。

【0077】

本発明の方法は、第二級アミン、第三級アミン、又は第四級アミン等のより高度に誘導体化されたアミンを全く有さないか又は有するとしてもごく低割合の第一級アミノ基以外のリガンドに対して実施できることが当業界の熟練者に認識されるであろう。同様に、疎水性残基又はカプシドと固相の水素結合をより増強させる残基を含むことによって結果が改善し得ることも認識されるであろう。

【0078】

本明細書において引用されたすべての参考文献は、その取り込みが本明細書における明示的な教示と矛盾しない限り、参照により完全に取り込まれる。

【0079】

本発明を以下の非限定的な実施例によって更に説明する。

【実施例】

【0080】

実施例１
第四級アミノ固相と第一級アミノ固相の塩溶出による、フルＡＡＶカプシドからの空のＡＡＶカプシドの分離の比較。

【0081】

第一級アミン表面を担持する１００マイクロリットルのモノリスを、２０ｍＭのビス－トリス－プロパン、２ｍＭの塩化マグネシウム、ｐＨ８．８に平衡化した。陽イオン交換精製したＡＡＶ８のサンプルをカラムに付与し、平衡化緩衝液で洗浄した。続いてモノリスを、２０ｍＭのビス－トリス－プロパン、２ｍＭの塩化マグネシウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．８で終了する５０ベッドボリュームの線形勾配で溶出した。勾配終点の緩衝液中のＮａＣｌ濃度が２００ｍＭであることを除いて、第四級アミン（強陰イオン交換モノリス、ＣＩＭａｃ ＱＡ）について同様の基本操作を行った。どちらのカラムでも空のＡＡＶカプシドとフルＡＡＶカプシドの完全な分離は達成されなかったが、第一級アミン固相のほうがより良好な結果を達成した（図１）。

【0082】

実施例２
塩勾配を用いた強（第四級アミノ）陰イオン交換体と上昇するｐＨによって溶出を行う第一級アミノ固相による、空のカプシド／フルカプシドの分離の比較。

【0083】

第一級アミノ表面を担持する１００マイクロリットルのモノリスを、１０ｍＭのビス－トリス－プロパン、１０ｍＭのトリス、２ｍＭの塩化マグネシウム、ｐＨ８．０に平衡化した。陽イオン交換精製したＡＡＶ８のサンプルをカラムに付与し、平衡化緩衝液で洗浄した。続いて、カラムを、１０ｍＭのビス－トリス－プロパン、１０ｍＭのトリス、２ｍＭの塩化マグネシウム、ｐＨ９．５で終了する１００ベッドボリュームの線形勾配で溶出した。空のＡＡＶカプシドとフルＡＡＶカプシドの分離を、塩勾配で溶出を行った強陰イオン交換（第四級アミン）モノリスと比較した。強陰イオン交換モノリスを、２０ｍＭのビス－トリス－プロパン、２ｍＭ塩化のマグネシウム、ｐＨ９．０に平衡化した。陽イオン交換精製したＡＡＶ８のサンプルをカラムに付与し、平衡化緩衝液で洗浄した（第一級アミンカラムの実験に使用したものと同じサンプル）。続いて、カラムを、２０ｍＭのビス－トリス－プロパン、２ｍＭの塩化マグネシウム、２００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ９．０で終了する５０カラムボリュームの線形勾配で溶出した。比較結果を図２に示す。示されているように、過剰な塩を存在させずに上昇するｐＨ勾配を使用した第一級アミンカラムの溶出は、塩勾配を使用した強陰イオン交換体によって達成される分離よりも劇的に優れていた。空のカプシドとフルカプシドの優れた分離を示すことに加えて、他の不純物の溶出順序が強陰イオン交換体に比する第一級アミンカラムの根本的に異なる選択性を示している。強陰イオン交換体で空のＡＡＶカプシドよりも前に溶出した不純物は、第一級アミンカラムではフルＡＡＶカプシドよりも後に溶出し、当該フルＡＡＶカプシドからより良好に分離された。

【0084】

実施例３
フルカプシドのｐＨ勾配溶出の前の洗浄工程による結合した空のＡＡＶカプシドの除去。

【0085】

第一級アミンモノリスを、１０ｍＭのビス－トリス－プロパン、１０ｍＭのトリス、２ｍＭの塩化マグネシウム、ｐＨ８．０に平衡化した。陽イオン交換精製したＡＡＶ８のサンプルをカラムに付与し、平衡化緩衝液で洗浄した（実施例２で使用したものと同じサンプル）。続いて、空のＡＡＶカプシドを、１０ｍＭのビス－トリス－プロパン、１０ｍＭのトリス、２ｍＭの塩化マグネシウム、ｐＨ８．７の洗浄ステップで除去した。続いて、カラムを元の平衡状態に戻し、１０ｍＭのビス－トリス－プロパン、１０ｍＭのトリス、２ｍＭの塩化マグネシウム、ｐＨ９．５で終了する４０ベッドボリュームの線形勾配で溶出した。結果を図３に示す。この実験は、第一級アミンカラムは弱アルカリ性のｐＨ（８．０）で空のＡＡＶカプシドとフルＡＡＶカプシドを両方とも結合させる能力を有することを示し、過剰な塩の存在させない上昇するｐＨ勾配（ｐＨ９．５まで）において空のＡＡＶカプシドが選択的に除去されることを支持する。

【0086】

実施例４
空のＡＡＶカプシドが結合しない条件下での平衡化の後、塩濃度の増加とｐＨの低下を同時に行う単段階によるフルＡＡＶカプシドの溶出。

【0087】

第一級アミンモノリスを、１０ｍＭのビス－トリス－プロパン、１０ｍＭのトリス、２ｍＭの塩化マグネシウム、ｐＨ８．５に平衡化した。陽イオン交換精製したＡＡＶ８のサンプルをカラムに付与し、平衡化緩衝液で洗浄した（実施例２及び実施例３で使用したものと同じサンプル）。空のＡＡＶカプシドはこれらの条件下ではほとんど結合せず、長い洗浄過程でほぼ完全に除去された。続いて、フルＡＡＶカプシドを、１０ｍＭのビス－トリス－プロパン、１０ｍＭのトリス、２ｍＭの塩化マグネシウム、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５までの段階でカラムから溶出させた。結果を図４に示す。この実験は特に、最も単純なクロマトグラフィー機器さえをも提供する非常に単純化された段階勾配手法を使用してフルＡＡＶカプシドから空のＡＡＶカプシドを分離する第一級アミンカラムの能力を示している。

【0088】

実施例５
以下の実施例は、ｐＨを上昇させることによって空のＡＡＶカプシドを分離するための様々な方法を採用した、ｐＨ８で開始する本発明の方法の方法論を説明する。

【0089】

異なる血清型のカプシドは同じ条件に対して異なる反応を示し、条件は製品ごとに個別に調整する必要があることが理解される。一連の図は、最も効果的な条件を得るために任意の血清型からのカプシドをどれくらい簡単にスクリーニングすることができるかを示す。

【0090】

一連の実験では、空のＡＡＶ８カプシドとフルＡＡＶ８カプシドを含むサンプルを、ｐＨ８．０（２０ｍＭのトリス、２０ｍＭのビス－トリス－プロパン）の第一級アミノ基を担持する固相に付与した。各実験では、ロードされたカラムをより高いｐＨの緩衝液（２０ｍＭのトリス、２０ｍＭのビス－トリス－プロパン）で洗浄し、続いて、ｐＨ９．５（２０ｍＭのトリス、２０ｍＭのビス－トリス－プロパン）で終了する上昇するｐＨ勾配で溶出した。元のクロマトグラムを図（図５～図１０）に示す。勾配による空のＡＡＶカプシドとフルＡＡＶカプシドの相対的な回収率を図１１にグラフで示す。

【0091】

図５。空のＡＡＶカプシドとフルＡＡＶカプシドはどちらともｐＨ８．０で結合している。どちらともｐＨ８．３での洗浄中は結合したままである。フルカプシドは、０．６８のＵＶ吸光度比によって示されるように、ｐＨ溶出勾配（pH elution gradient）の適用により直ちに溶出し始める。１．３２のはっきり異なる波長比を示す後で溶出するフルカプシドとは明らかに部分的に分離されている。

【0092】

図６。空のＡＡＶカプシドとフルＡＡＶカプシドはどちらともｐＨ８．０で結合している。空のＡＡＶカプシドの一部は、ｐＨ８．４での洗浄によって除去される。残りの空のＡＡＶカプシドはｐＨ溶出勾配の適用により直ちに溶出し始める。フルＡＡＶカプシドは結合したまま、ｐＨ勾配で溶出する。

【0093】

図７：空のＡＡＶカプシドとフルＡＡＶカプシドはどちらともｐＨ８．０で結合している。空のＡＡＶカプシドのほとんどは、ｐＨ８．５での洗浄によって除去される。残りの空のＡＡＶカプシドはｐＨ溶出勾配の適用により直ちに溶出し始める。フルＡＡＶカプシドは結合したまま、ｐＨ勾配で溶出する。

【0094】

図８：空のＡＡＶカプシドとフルＡＡＶカプシドはどちらともｐＨ８．０で結合している。空のＡＡＶカプシドのすべてが、ｐＨ８．６での洗浄によって除去される。フルＡＡＶカプシドは結合したまま、ｐＨ勾配で溶出する。

【0095】

図９：空のＡＡＶカプシドとフルＡＡＶカプシドはどちらともｐＨ８．０で結合している。空のＡＡＶカプシドのすべてがｐＨ８．７での洗浄によって除去されるが、一部のフルＡＡＶカプシドも洗浄中に溶出する。残りのフルＡＡＶカプシドは結合したままで、ｐＨ勾配で溶出する。

【0096】

図１０：空のＡＡＶカプシドとフルＡＡＶカプシドはどちらともｐＨ８．０で結合している。空のＡＡＶカプシドのすべてがｐＨ８．８での洗浄によって除去されるが、フルＡＡＶカプシドの大部分も除去される。残りのフルＡＡＶカプシドはｐＨ勾配で溶出する。

【0097】

図１１：グラフは、異なるのｐＨ値での洗浄ステップ後に勾配溶出するフルＡＡＶカプシドと空のＡＡＶカプシドの相対的な量を示す。影付きの垂直なバーは、空のＡＡＶカプシドを最も効果的に除去し、フルカプシドの回収が最大の洗浄ｐＨ域を示す。

【0098】

実施例６
マグネシウムイオンの含有又は不在による選択性の変化。

【0099】

図１２は、第一級アミンを担持する固相での２つのクロマトグラフィー実験の溶出プロファイルを比較している。一方のプロファイルは両勾配緩衝液（both gradient buffers）中２ｍＭのマグネシウムイオンを使用して作成し、もう一方のプロファイルはマグネシウムイオンの不在下で作成した。両実験に使用する緩衝液は同じにした。平衡化緩衝液は、１０ｍＭのトリス、１０ｍＭのビス－トリス－プロパン、１５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０（２ｍＭの塩化マグネシウムあり又はなし）とした。勾配終点は、１０ｍＭのトリス、１０ｍＭのビス－トリス－プロパン、１５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ９．５（２ｍＭの塩化マグネシウムあり又はなし）とした。マグネシウム存在下では、フルカプシドがｐＨ約８．７７（ピーク中央）で溶出した。マグネシウム不在下では、フルカプシドはｐＨ約９．２３（ピーク中央）で溶出し、マグネシウムが存在する場合よりもおよそ半ｐＨ単位（a half pH unit）高かった。空のカプシドとフルカプシドの分離もマグネシウム存在下でより明瞭になり、フルカプシドの回収率は約５０％高かった。

【0100】

参考文献
本明細書において引用されたすべての参考文献は、その取り込みが本明細書における明示的な教示と矛盾しない限り、参照により完全に取り込まれる。
［１］Ｍ．Ｌｏｃｋ、Ｍ．Ａｌｖｉｒａ、Ｊ．Ｗｉｌｓｏｎ、イオン交換クロマトグラフィーによる組換えアデノ随伴ウイルス血清型８ベクターの粒子含有量の分析、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｐａｒｔ Ｂ ２３（２０１２）５６－６４。
［２］Ｍ．Ｌｏｃｋ、Ｍ．Ａｌｖｉｒａ、ＡＡＶ９のスケーラブルな精製方法、米国特許出願公開第２０１９０００２８４２（Ａ１）号、米国仮特許出願第２０１５６２２６６３５７（Ｐ）号への優先権、国際公開第２０１７１６０３６０（Ａ９）号。
［３］Ｘ．Ｆｕ、ＷＣ．Ｃｈｅｎ、Ｃ．Ａｒｇｅｎｔｏ、Ｐ．Ｃｌａｒｎｅｒ、Ｖ．Ｂｈａｔｔ、Ｒ．Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ、Ｇ．Ｂｏｕ－Ａｓｓａｆ、Ｍ．Ｂａｈｓｈａｖｅｓｈｉ、Ｘ．Ｌｕ、Ｓ．Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ、Ｊ．Ｐｉｅｒａｃｃｉ、プロセス開発をサポートするアデノ随伴ウイルス空ＡＡＶカプシドの定量化のための分析戦略、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔ．３０（２０１９）１４４－１５２。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【国際調査報告】