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特表2023-514446遺伝子療法のためのＡＡＶ２をベースとするウイルスベクター粒子
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-05
(54)【発明の名称】遺伝子療法のためのＡＡＶ２をベースとするウイルスベクター粒子
(51)【国際特許分類】
C12N 15/864 20060101AFI20230329BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20230329BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20230329BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20230329BHJP
A61P 9/04 20060101ALI20230329BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20230329BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20230329BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230329BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230329BHJP
【ＦＩ】
C12N15/864 100Z
C12N7/01 ZNA
A61K35/76
A61P9/00
A61P9/04
A61P9/10
A61P21/00
A61P43/00 105
A61K48/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022550865
(86)(22)【出願日】2021-02-22
(85)【翻訳文提出日】2022-09-27
(86)【国際出願番号】 EP2021054347
(87)【国際公開番号】W WO2021165544
(87)【国際公開日】2021-08-26
(31)【優先権主張番号】20158633.6
(32)【優先日】2020-02-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】515195668
【氏名又は名称】メディツィーニシェ・ホーホシューレ・ハノーファー
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ Ｈｏｃｈｓｃｈｕｌｅ Ｈａｎｎｏｖｅｒ
(74)【代理人】
【識別番号】100069556
【弁理士】
【氏名又は名称】江崎 光史
(74)【代理人】
【識別番号】100111486
【弁理士】
【氏名又は名称】鍛冶澤 實
(74)【代理人】
【識別番号】100139527
【弁理士】
【氏名又は名称】上西 克礼
(74)【代理人】
【識別番号】100164781
【弁理士】
【氏名又は名称】虎山 一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100221981
【弁理士】
【氏名又は名称】石田 大成
(72)【発明者】
【氏名】トゥム・トーマス
(72)【発明者】
【氏名】ビュニング・ヒルデガルト
(72)【発明者】
【氏名】ザンター・ラウラ
(72)【発明者】
【氏名】ベーア・クリスティアン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA95X
4B065AA95Y
4B065AB01
4B065BA01
4B065CA44
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZA361
4C084ZA941
4C084ZB211
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BC83
4C087CA08
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZA36
4C087ZA94
4C087ZB21
(57)【要約】
本発明は、ＡＡＶ２をベースとするウイルスベクター粒子であって、そのカプシドタンパク質（ＣＡＰ）において、心筋細胞への指向性を与える挿入されたアミノ酸区画を含有する、ＡＡＶ２をベースとするウイルスベクター粒子を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
エフェクター分子のための核酸構築物を含むＡＡＶ２ウイルスベクター粒子であって、配列番号５６のＣＡＰの野生型アミノ酸配列のアミノ酸５８７番または５８８番または４５３番のＣ末端に配列番号１～配列番号５３から選択されるアミノ酸配列のうちの１つを含む挿入されたアミノ酸区画を含有するカプシドタンパク質（ＣＡＰ）を含むことを特徴とする、ＡＡＶ２ウイルスベクター粒子。
【請求項2】
１～４個のアミノ酸のリンカー配列が、ＣＡＰのＮ末端区画のアミノ酸５８７番または５８８番または４５３番と、前記の挿入されたアミノ酸区画のＮ末端アミノ酸との間に配置されていることを特徴とする、請求項１に記載のＡＡＶ２ウイルスベクター粒子。
【請求項3】
１～３個のアミノ酸のリンカー配列が、前記の挿入されたアミノ酸区画のＣ末端と、ＣＡＰの残りのＣ末端部分のＮ末端アミノ酸との間に配置されていることを特徴とする、請求項１または２に記載のＡＡＶ２ウイルスベクター粒子。
【請求項4】
前記のＣＡＰの残りのＣ末端部分が、配列番号５６のアミノ酸５８８～７３５、またはアミノ酸５８９～７３５、またはアミノ酸４５４～７３５であることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一つに記載のＡＡＶ２ウイルスベクター粒子。
【請求項5】
突然変異Ｒ５８５Ａ（アミノ酸５８５がＡｒｇからＡｌａへ）およびＲ５８８Ａ（アミノ酸５８８がＡｒｇからＡｌａへ）を特徴とする、請求項１～４のいずれか一つに記載のＡＡＶ２ウイルスベクター粒子。
【請求項6】
心筋細胞の疾患もしくは欠陥の処置における、または筋肉筋細胞もしくは骨格筋細胞の疾患もしくは欠陥の処置における使用のための、請求項１～５のいずれか一つに記載のＡＡＶ２ウイルスベクター粒子。
【請求項7】
前記ベクター粒子が、エフェクター配列を含む核酸構築物を含有することを特徴とする、請求項６に記載の心筋細胞の疾患または欠陥の処置における使用のためのＡＡＶ２ウイルスベクター粒子。
【請求項8】
前記エフェクター配列が、エフェクター分子をコードする発現カセットであることを特徴とする、請求項６または７に記載の心筋細胞の疾患または欠陥の処置における使用のためのＡＡＶ２ウイルスベクター粒子。
【請求項9】
前記疾患または欠陥が、心肥大、心筋梗塞、心毒性または心不全である、請求項６～８のいずれか一つに記載の心筋細胞の疾患または欠陥の処置における使用のためのＡＡＶ２ウイルスベクター粒子。
【請求項10】
前記処置が、心筋細胞のｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ形質導入である、請求項６～９のいずれか一つに記載の心筋細胞の疾患または欠陥の処置における使用のためのＡＡＶ２ベクター粒子。
【請求項11】
前記ウイルスベクター粒子を受容する人が、野生型ＡＡＶ２を中和する抗体を有し、および／またはＡＡＶ９を中和する抗体を有する、請求項６～１０のいずれか一つに記載の心筋細胞の疾患または欠陥の処置における使用のためのＡＡＶ２ウイルスベクター粒子。
【請求項12】
培養真核細胞におけるＡＡＶベクター産生のための成分の送達、それに続く細胞溶解ならびに細胞成分およびプラスミドＤＮＡの除去、ならびにＡＡＶウイルスベクター粒子のさらなる精製による、ＡＡＶ２ウイルスベクター粒子を産生するための方法であって、前記ＡＡＶ２ウイルスベクター粒子が、ＣＡＰの野生型アミノ酸配列のアミノ酸５８７番のＣ末端に、またはアミノ酸５８８番のＣ末端に、またはアミノ酸４５３番のＣ末端に、配列番号１～配列番号５３から選択されるアミノ酸配列のうちの１つを含む挿入されたアミノ酸区画を含有するカプシドタンパク質（ＣＡＰ）を含むことを特徴とする、ＡＡＶ２ウイルスベクター粒子を産生するための方法。
【請求項13】
請求項１～１１のいずれか一つに記載のＡＡＶ２ベクター粒子を、心疾患または心臓欠陥を有すると診断されている患者に投与することを含む、心臓欠陥を含む心疾患の処置方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、遺伝子療法における使用のための、とりわけ心臓欠陥を含む心疾患の治療における使用のための、例えば心臓欠陥を含む心疾患の遺伝子治療における使用のための、アデノ随伴ウイルス血清型２（ＡＡＶ２）をベースとするウイルスベクター粒子に関する。心疾患または心臓欠陥は、好ましくは、心筋細胞の疾患または欠陥である。心疾患または心臓欠陥は、例えば心過負荷と関連付けられる医学的状態、または心不全であり、例えば、前記ウイルスベクター粒子は、以下の医療適用の処置における使用のためである：心筋梗塞、心肥大後の、または心不全の処置のための、心筋細胞において治療効果を呈する導入遺伝子の送達。
【0002】
本発明のウイルスベクター粒子は、野生型ＡＡＶ血清型２および９（ＡＡＶ２およびＡＡＶ９）と比較した場合、心筋細胞により特異的であり、かつ非標的細胞、例えば肝細胞に形質導入することにおいてはより効率的でなく、心筋細胞においてウイルスベクター粒子にコードされる導入遺伝子の発現を可能にするという利点を有する。
【背景技術】
【0003】
最先端技術
Ｐｅｒａｂｏら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、第８巻、１号、１５１～１５７頁（２００３）（非特許文献１）は、ＡＡＶ２ビリオンのＶＰ１カプシドタンパク質と称されるカプシドタンパク質の５８７位へ７つのアミノ酸のランダム配列を挿入することと、アデノウイルスと共感染させたヒト巨核球細胞株Ｍ－０７ｅまたはＢ細胞慢性リンパ性白血病細胞株Ｍｅｃ１からＡＡＶ２突然変異体を選択することとを説明している。その結果、ウイルスベクターに、細胞特異性ではないが、受容体特異性を与える突然変異体カプシドタンパク質の配列が、同定された。
Ｐｅｒａｂｏら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、第８巻、１号、１５１～１５７頁（２００３）（非特許文献１）は、ＡＡＶ２ビリオンのＶＰ１カプシドタンパク質と称されるカプシドタンパク質の５８７位へ７つのアミノ酸のランダム配列を挿入することと、アデノウイルスと共感染させたヒト巨核球細胞株Ｍ－０７ｅまたはＢ細胞慢性リンパ性白血病細胞株Ｍｅｃ１からＡＡＶ２突然変異体を選択することとを説明している。その結果、ウイルスベクターに、細胞特異性ではないが、受容体特異性を与える突然変異体カプシドタンパク質の配列が、同定された。
【0004】
Ｙｉｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １７、９８０～９９０頁（２０１０）（非特許文献２）は、ＡＡＶ２ライブラリーをマウスに注射し、その３日後にマウスから心組織スライスを単離し、培養条件において心組織スライスにＡｄ５をｉｎ ｖｉｔｒｏで重感染させることによって、心組織に対して増加した特異性を有するベクターを選択するための、ＡＡＶ２ディスプレイペプチドライブラリーの３ラウンドのスクリーニングを説明している。心組織に高い特異性を示す２つのＡＡＶ２バリアントが同定されたが、これらのバリアントからのレポーター遺伝子発現は、野生型ＡＡＶ９ウイルスベクター粒子からの発現よりも低かった。
【0005】
Ｗａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ３５８～３７８頁（２０１９）（非特許文献３）は、組換えＡＡＶ（ＡＡＶベクター粒子またはＡＡＶベクター）がそれらの一本鎖ＤＮＡにおいて、ウイルスＩＴＲに両側を挟まれた非ウイルス配列からなり得、唯一のウイルス配列がＩＴＲであることを示す。ＡＡＶのＩＴＲは、ゲノム複製のため、およびベクター産生中のパッケージングシグナルとして働く。
【0006】
Ｒｏｃｋｍａｎら、ＰＮＡＳ ８８：８２７７～８２８１頁（１９９１）（非特許文献４）は、心肥大のマウスモデルを生成するための、マウスにおける心圧過負荷の誘導を説明している。
【0007】
Ｚｈａｎｇら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１２８４～１２９６頁、ｄｏｉ： １０．１０８９／ｈｕ．２０１９／０２７ （２０１９）（非特許文献５）は、カプシドバリアントのＡＡＶベクター粒子のクローニングおよび生成における使用のための、ＡＡＶ２のｒｅｐおよびｃａｐタンパク質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するｐＲＣ’９９と呼ばれるプラスミドを説明している。
【0008】
Ｚｉｎｃａｒｅｌｌｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、第１６巻、６号、１０７３～１０８０頁（２００８）（非特許文献６）は、ＡＡＶの天然に存在する血清型の中で、ＡＡＶ９が、マウスにおいて全身性注射後に心臓における最も高い導入遺伝子発現を示すことを示した。
ＨａｊｊａｒおよびＩｓｈｉｋａｗａ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓ、第１２０巻、１号、３３～３５頁（２０１７）（非特許文献７）によって概略される通り、ＡＡＶ９は、高い心指向性を有するベクターとして出現し、したがって、それは、典型的に、遺伝子療法研究において心臓をターゲティングするために使用される。
ＨａｊｊａｒおよびＩｓｈｉｋａｗａ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓ、第１２０巻、１号、３３～３５頁（２０１７）（非特許文献７）によって概略される通り、ＡＡＶ９は、高い心指向性を有するベクターとして出現し、したがって、それは、典型的に、遺伝子療法研究において心臓をターゲティングするために使用される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Ｐｅｒａｂｏら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、第８巻、１号、１５１～１５７頁（２００３）
【非特許文献2】Ｙｉｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １７、９８０～９９０頁（２０１０）
【非特許文献3】Ｗａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ３５８～３７８頁（２０１９）
【非特許文献4】Ｒｏｃｋｍａｎら、ＰＮＡＳ ８８：８２７７～８２８１頁（１９９１）
【非特許文献5】Ｚｈａｎｇら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１２８４～１２９６頁、ｄｏｉ： １０．１０８９／ｈｕ．２０１９／０２７ （２０１９）
【非特許文献6】Ｚｉｎｃａｒｅｌｌｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、第１６巻、６号、１０７３～１０８０頁（２００８）
【非特許文献7】ＨａｊｊａｒおよびＩｓｈｉｋａｗａ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓ、第１２０巻、１号、３３～３５頁（２０１７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
発明の目的
例えば野生型血清型ＡＡＶ２と比較して、およびとりわけＡＡＶ９と比較して、マウスおよびヒト心筋細胞に対する指向性とも呼ばれる特異性の改善と、肝組織へのより低い親和性とを有するＡＡＶ２、とりわけＡＡＶ２のカプシドタンパク質をベースとする代替ウイルスベクター粒子を提供することが本発明の目的である。遺伝子療法における使用のために、心筋細胞への優れた特異性を有する当該ウイルスベクター粒子は、心筋細胞において、ウイルスベクター粒子に含有される核酸コード配列の発現を可能にするはずである。
例えば野生型血清型ＡＡＶ２と比較して、およびとりわけＡＡＶ９と比較して、マウスおよびヒト心筋細胞に対する指向性とも呼ばれる特異性の改善と、肝組織へのより低い親和性とを有するＡＡＶ２、とりわけＡＡＶ２のカプシドタンパク質をベースとする代替ウイルスベクター粒子を提供することが本発明の目的である。遺伝子療法における使用のために、心筋細胞への優れた特異性を有する当該ウイルスベクター粒子は、心筋細胞において、ウイルスベクター粒子に含有される核酸コード配列の発現を可能にするはずである。
【課題を解決するための手段】
【0011】
発明の説明
本発明は、特許請求の範囲の特徴によって目的を達成し、とりわけ、ＡＡＶ２をベースとするウイルスベクター粒子を提供し、そのウイルスベクター粒子は、そのカプシドタンパク質（ＣＡＰ）においてＣＡＰの野生型アミノ酸配列のアミノ酸５８７番のＣ末端に、および／またはアミノ酸５８８番のＣ末端に、および／またはアミノ酸４５３番のＣ末端に、配列番号１～５３から選択される以下のアミノ酸配列のうちの１つ、好ましくは配列番号１または配列番号１１のうちの１つを含むかまたはそれからなる挿入されたアミノ酸区画を含有する。本発明のＣＡＰは、Ｎ末端からＣ末端へ、野生型ＣＡＰのアミノ酸１～５８７を含むかまたはそれらからなるＣＡＰのＮ末端区画と、任意選択的にリンカー配列と、挿入されたアミノ酸区画と、任意選択的にリンカー配列と、アミノ酸５８７番のＣ末端への挿入のために野生型ＣＡＰのアミノ酸５８８～７３５を含むかもしくはそれらからなる、アミノ酸５８８番のＣ末端への挿入のために野生型ＣＡＰのアミノ酸５８９～７３５を含むかもしくはそれらからなる、またはアミノ酸４５３番のＣ末端への挿入のために野生型ＣＡＰのアミノ酸４５４～７３５を含むかもしくはそれらからなる、ＣＡＰのＣ末端区画とを含むかまたはそれらからなる。したがって、一実施形態における挿入されたアミノ酸区画は、野生型ＣＡＰアミノ酸配列のアミノ酸Ｎ５８７とＲ５８８との間に挿入されている。あるいは、挿入されたアミノ酸配列は、野生型ＣＡＰアミノ酸配列のアミノ酸Ｒ５８８と５８９との間に挿入されており、またそれは本明細書において代替的に、野生型ＣＡＰアミノ酸配列のＮ５８７とＲ５８８との間の挿入によって記載され、および／またはＩ４５６とアミノ酸４５４との間の挿入によって記載され、本明細書および特許請求の範囲からのすべての特徴は、野生型ＣＡＰアミノ酸配列のＮ５８７とＲ５８８との間の挿入に適用され、Ｒ５８８と５８９との間の挿入に適用され、アミノ酸Ｉ４５３と４５４との間の挿入に適用され、各アミノ酸は、野生型ＣＡＰアミノ酸配列について番号付けられている。これらの挿入部位の各々について、とりわけ挿入されたアミノ酸区画が野生型ＣＡＰアミノ酸配列のアミノ酸４５３番と４５４番との間に挿入されている実施形態において、ＣＡＰアミノ酸配列は、Ｒ５８５Ａ（アミノ酸５８５ ＡｒｇからＡｌａへ）およびＲ５８８Ａ（アミノ酸５８８ ＡｒｇからＡｌａへ）へさらに突然変異されることが好ましい。これらの好ましい追加の突然変異は、野生型ＣＡＰのヘパリン硫酸（ｈｅｐａｒｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ）プロテオグリカン結合部位を妨げる。
本発明は、特許請求の範囲の特徴によって目的を達成し、とりわけ、ＡＡＶ２をベースとするウイルスベクター粒子を提供し、そのウイルスベクター粒子は、そのカプシドタンパク質（ＣＡＰ）においてＣＡＰの野生型アミノ酸配列のアミノ酸５８７番のＣ末端に、および／またはアミノ酸５８８番のＣ末端に、および／またはアミノ酸４５３番のＣ末端に、配列番号１～５３から選択される以下のアミノ酸配列のうちの１つ、好ましくは配列番号１または配列番号１１のうちの１つを含むかまたはそれからなる挿入されたアミノ酸区画を含有する。本発明のＣＡＰは、Ｎ末端からＣ末端へ、野生型ＣＡＰのアミノ酸１～５８７を含むかまたはそれらからなるＣＡＰのＮ末端区画と、任意選択的にリンカー配列と、挿入されたアミノ酸区画と、任意選択的にリンカー配列と、アミノ酸５８７番のＣ末端への挿入のために野生型ＣＡＰのアミノ酸５８８～７３５を含むかもしくはそれらからなる、アミノ酸５８８番のＣ末端への挿入のために野生型ＣＡＰのアミノ酸５８９～７３５を含むかもしくはそれらからなる、またはアミノ酸４５３番のＣ末端への挿入のために野生型ＣＡＰのアミノ酸４５４～７３５を含むかもしくはそれらからなる、ＣＡＰのＣ末端区画とを含むかまたはそれらからなる。したがって、一実施形態における挿入されたアミノ酸区画は、野生型ＣＡＰアミノ酸配列のアミノ酸Ｎ５８７とＲ５８８との間に挿入されている。あるいは、挿入されたアミノ酸配列は、野生型ＣＡＰアミノ酸配列のアミノ酸Ｒ５８８と５８９との間に挿入されており、またそれは本明細書において代替的に、野生型ＣＡＰアミノ酸配列のＮ５８７とＲ５８８との間の挿入によって記載され、および／またはＩ４５６とアミノ酸４５４との間の挿入によって記載され、本明細書および特許請求の範囲からのすべての特徴は、野生型ＣＡＰアミノ酸配列のＮ５８７とＲ５８８との間の挿入に適用され、Ｒ５８８と５８９との間の挿入に適用され、アミノ酸Ｉ４５３と４５４との間の挿入に適用され、各アミノ酸は、野生型ＣＡＰアミノ酸配列について番号付けられている。これらの挿入部位の各々について、とりわけ挿入されたアミノ酸区画が野生型ＣＡＰアミノ酸配列のアミノ酸４５３番と４５４番との間に挿入されている実施形態において、ＣＡＰアミノ酸配列は、Ｒ５８５Ａ（アミノ酸５８５ ＡｒｇからＡｌａへ）およびＲ５８８Ａ（アミノ酸５８８ ＡｒｇからＡｌａへ）へさらに突然変異されることが好ましい。これらの好ましい追加の突然変異は、野生型ＣＡＰのヘパリン硫酸（ｈｅｐａｒｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ）プロテオグリカン結合部位を妨げる。
【0012】
【表1】
【0013】
その中で、ＣＡＰのアミノ酸５８７番、もしくはＣＡＰのアミノ酸５８８、もしくはＣＡＰのアミノ酸４５３それぞれと、挿入されたアミノ酸区画のＮ末端アミノ酸との間に、追加のアミノ酸は、存在しなくてもよく、そのため、挿入されたアミノ酸配列は、直接的にＣＡＰのアミノ酸５８７番に隣接するか、別にＣＡＰのアミノ酸５８８番に隣接するか、もしくは別にＣＡＰのアミノ酸４５４番に隣接するか、またはあるいは１～５個のアミノ酸の、例えば１～４個のアミノ酸のリンカー配列を、ＣＡＰのアミノ酸５８７番、別にＣＡＰのアミノ酸５８８番、もしくは別にＣＡＰのアミノ酸４５４番と、挿入されたアミノ酸区画との間に配置してもよく、かつ／または挿入されたアミノ酸区画のＣ末端とＣＡＰの残りのＣ末端部分との間に、追加のアミノ酸は存在しなくてもよく、そのため、挿入されたアミノ酸配列は、直接的にＣＡＰのＣ末端部分のアミノ酸に隣接し、かつ／または１～４個のアミノ酸の、例えば１～３個のアミノ酸のリンカー配列を、挿入されたアミノ酸区画のＣ末端と、ＣＡＰの残りのＣ末端部分のＮ末端アミノ酸との間に配置してもよい。
【0014】
アミノ酸５８７番のＣ末端への挿入のために、ＣＡＰの残りのＣ末端部分のＮ末端アミノ酸は、好ましくは野生型ＣＡＰのアミノ酸５８８番である。好ましくは、挿入されたアミノ酸区画のＣ末端に隣接する、ＣＡＰのＣ末端部分は、任意選択的に、挿入されたアミノ酸区画のＣ末端とＣＡＰのＣ末端部分との間のリンカー配列を伴い、配列番号５６のアミノ酸５８８番～７３５番のアミノ酸配列を有する。
【0015】
アミノ酸５８８番のＣ末端への挿入のために、ＣＡＰの残りのＣ末端部分のＮ末端アミノ酸は、好ましくは野生型ＣＡＰのアミノ酸５８９番である。好ましくは、挿入されたアミノ酸区画のＣ末端に隣接する、ＣＡＰのＣ末端部分は、任意選択的に、挿入されたアミノ酸区画のＣ末端とＣＡＰのＣ末端部分との間のリンカー配列を伴い、配列番号５６のアミノ酸５８９番～７３５番のアミノ酸配列を有する。
【0016】
アミノ酸４５４番のＣ末端への挿入のために、ＣＡＰの残りのＣ末端部分のＮ末端アミノ酸は、好ましくは野生型ＣＡＰのアミノ酸４５５番である。好ましくは、挿入されたアミノ酸区画のＣ末端に隣接する、ＣＡＰのＣ末端部分は、任意選択的に、挿入されたアミノ酸区画のＣ末端とＣＡＰのＣ末端部分との間のリンカー配列を伴い、配列番号５６のアミノ酸４５５番～７３５番のアミノ酸配列を有する。
【0017】
挿入されたアミノ酸区画は、ＣＡＰの野生型アミノ酸配列のアミノ酸５８７番のＣ末端に直接的に隣接するか、別にアミノ酸５８８番のＣ末端に直接的に隣接するか、もしくは別にアミノ酸４５５番のＣ末端に直接的に隣接してもよく、または例えば１～５個のアミノ酸の、好ましくは３個のアミノ酸の、リンカー配列を、ＣＡＰの野生型アミノ酸配列のアミノ酸５８７番、別にアミノ酸５８８番、もしくは別にアミノ酸４５３番と、挿入されたアミノ酸区画との間に配置してもよい。挿入されたアミノ酸は、ＣＡＰの野生型アミノ酸配列のアミノ酸５８８番、別にアミノ酸５８９番、もしくは別にアミノ酸４５４番のＮ末端に直接的に隣接してもよく、または１～４個のアミノ酸の、好ましくは２個のアミノ酸の、リンカー配列を、挿入されたアミノ酸区画と、ＣＡＰの野生型アミノ酸配列のアミノ酸５８８番、別にアミノ酸５８９番、もしくは別にアミノ酸４５４番のＮ末端との間に配置してもよい。ＣＡＰの野生型アミノ酸配列のアミノ酸５８８番、別にアミノ酸５８９番、または別にアミノ酸４５４番と、挿入されたアミノ酸区画のＮ末端との間の配置のための例示的なリンカー配列は、ＡＳＡであり、ＣＡＰの野生型アミノ酸配列のアミノ酸５８８番、別にアミノ酸５８９番、または別にアミノ酸４５４番と、挿入されたアミノ酸区画のＣ末端との間の配置のための例示的なリンカー配列は、ＡＡである。好ましくは、挿入されたアミノ酸区画は、そのＮ末端のリンカー配列およびそのＣ末端のリンカー配列と合わせて、１６～７個のアミノ酸、例えば１４～７個のアミノ酸、より好ましくは１２個のアミノ酸からなる。
【0018】
各場合におけるリンカー区画は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕおよび／またはＳｅｒから選択されるアミノ酸のうちの少なくとも１つを含むかまたはそれらからなることができ、これらのアミノ酸は、各リンカー区画において互いに異なっていても、またはすべて同じであってもよい。
【0019】
本発明のウイルスベクター粒子は、例えば各々の野生型ＣＡＰを有するＡＡＶ２およびＡＡＶ９と比較して、心筋細胞への指向性または特異性が増大していること、心筋細胞以外の細胞種についての指向性が低減していること、とりわけ肝組織についての指向性が低減していること、ならびに心筋細胞において、ウイルスベクター粒子に含有される核酸配列を発現すること、例えばＡＡＶ９からの同じ導入遺伝子の発現レベルと同等のレベルおよびＡＡＶ２からの同じ導入遺伝子の発現レベルよりもはるかに高いレベルで導入遺伝子を発現することという利点を有する。心筋細胞は、心組織の一部分であり、ウイルスベクター粒子は、医学的使用のため、例えば心疾患または心臓欠陥の処置における使用のため、例えばヒト患者への投与のためであり得る。さらに、ウイルスベクター粒子は、細胞における高タイターでのその産生を可能にする利点を有する。
【0020】
さらに、本発明によるウイルスベクター粒子は、大部分の人に存在する抗体であり、野生型ＡＡＶ粒子を中和することが公知であるヒト静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）によって、有意により低い程度だけ中和されることが見出された。このことは、処置における使用のための本発明によるウイルスベクター粒子は、ＡＡＶに対する天然に存在する抗体による中和を回避するという利点を有することを示す。
【0021】
野生型ＣＡＰのアミノ酸５８７番とアミノ酸５８８番との間に挿入された、および／または野生型ＣＡＰのアミノ酸５８８番とアミノ酸５８９番との間に挿入された、および／または野生型ＣＡＰのアミノ酸４５３番とアミノ酸４５４番との間に挿入された配列番号１～配列番号５３の挿入されたアミノ酸区画のうちの１つ、好ましくは配列番号１または配列番号１１のうちの１つを含むＣＡＰを含有するウイルスベクター粒子は、例えば導入遺伝子をコードする同じ核酸配列を含有するＡＡＶ９ウイルスベクター粒子よりも、心筋細胞への高い指向性を有し、心筋細胞における、粒子に含有される核酸配列の発現、および肝組織における有意により低い発現を可能にする。
【0022】
したがって目下、挿入されたアミノ酸区画のうちの１つを含有するＣＡＰを有するウイルス粒子は、標的分子として作用する同じ心筋細胞表面分子への親和性を有すると考えられる。
【0023】
野生型ＣＡＰのアミノ酸５８７番とアミノ酸５８８番との間、すなわち、野生型ＣＡＰのアミノ酸５８７番のＣ末端へ挿入されたアミノ酸区画は、配列番号１の好ましい挿入されたアミノ酸区画について、配列番号５４において野生型ＣＡＰにおける挿入物として含有され、配列番号１１の好ましい挿入されたアミノ酸区画は、配列番号５５において野生型ＣＡＰにおける挿入物として含有され、各挿入されたアミノ酸区画について、アミノ酸ＡＳＡのリンカー配列は、野生型ＣＡＰのＮ末端区画の間、すなわち、アミノ酸５８７番の間に配置され、アミノ酸ＡＡのリンカー配列は、挿入されたアミノ酸区画とＣＡＰのＣ末端区画との間、すなわち、挿入されたアミノ酸区画と野生型ＣＡＰのアミノ酸５８８との間に配置される。野生型ＣＡＰは、ＡＡＶ２ ｃａｐ ＯＲＦによってコードされる（コード配列は配列番号５６）。ＡＳＡの代替として、野生型ＣＡＰのＮ末端区画の間、すなわち、野生型ＣＡＰのアミノ酸５８７番と挿入されたアミノ酸区画との間に配置されたリンカーは、アミノ酸配列ＡＡＡを有し得る。
【0024】
ウイルスベクター粒子は、ＡＡＶ２の末端ＩＴＲ配列間にエフェクター配列を含むかまたはそれからなる核酸構築物、例えば一本鎖ＤＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖を含有する。エフェクター配列は、エフェクター分子をコードする、例えば機能的非コードＲＮＡまたはタンパク質コードＲＮＡをコードする発現カセットであってもよく、エフェクター分子は、心筋細胞においてベクター構築物から発現され得、それによって、心筋細胞においておよびしたがってまた心臓全体にとって治療的有益機能を呈する。
【0025】
本明細書において、心筋細胞の形質導入は、心筋細胞へのウイルスベクター粒子による核酸の導入であり、このプロセスは、また、とりわけ心筋細胞の処置におけるウイルスベクター粒子の使用について、ウイルスベクター粒子による感染と称することができる。概して、前記ウイルスベクター粒子は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでの、心筋細胞の処置における使用のため、例えば心筋細胞の遺伝的欠陥の処置のため、とりわけ心筋細胞の形質導入のためであり得る。
【0026】
例示的なエフェクター分子は、例えばウイルスベクター粒子のレシピエントの欠損遺伝子を補完することにおける使用のために、任意の野生型配列から選択することができる。例示的なエフェクター分子は、任意の種からの遺伝子、好ましくはヒト遺伝子を含む、天然遺伝子である。
【0027】
特定の実施形態において、核酸分子を含有しない空のウイルス粒子が提供される。これらの空のウイルス粒子は、例えば機能的分子の心組織への送達のための機能的分子と関連付けることができる。機能的分子は、例えば治療剤もしくはインジケーター化合物、例えば色素もしくは薬学的に許容可能な診断造影剤、またはこれらのうちの少なくとも２つの組合せであってもよい。空のウイルス粒子は、ＨＥＫ２９３細胞において産生することができる。当該プロセスは、ＡＡＶ空カプシド産生のためにＨＥＫ２９３細胞において各々のヘルパープラスミド（野生型ＡＡＶ２のｃａｐ遺伝子（適用可能である場合挿入されたアミノ酸区画を伴う）、およびｒｅｐ遺伝子を含有する）ならびにアデノウイルスヘルパープラスミド（ＡＡＶベクター産生に必要とされるアデノウイルスヘルパー機能を含有する）をトランスフェクトするステップを含み（発現カセットの両側にあるＩＴＲを含有するベクターゲノムプラスミドは、この特定の場合には使用されない）、続いてイオジキサノール勾配遠心分離による空のカプシド粒子の精製を伴った。
【0028】
概して、本発明によるＡＡＶウイルスベクター粒子を産生するためのプロセスは、送達によって、例えば、ヘルパーウイルス共感染を伴うかまたは伴わない、ＡＡＶベクター産生に必要なすべての成分のプラスミドトランスフェクションによって、例えばＩＴＲにより両側を挟まれた導入遺伝子発現カセット、ＡＡＶｒｅｐおよびＡＡＶｃａｐ遺伝子ならびにＡＡＶ粒子産生に必要な他のウイルスヘルパー遺伝子を含有するベクターゲノムから、例えばアデノウイルスからであってもよい。当該プロセスは、培養真核宿主細胞において行って、続いて、例えば酵素消化、濾過および／または遠心分離ならびにさらなる精製、例えばＡＡＶウイルスベクター粒子の勾配密度遠心分離および／またはクロマトグラフィーによるさらなる精製によって、細胞を溶解し、細胞成分およびプラスミドＤＮＡを除去してもよい。前記プロセスにより得られるＡＡＶウイルスベクター粒子は、ＣＡＰの野生型アミノ酸配列のアミノ酸５８７番のＣ末端に、配列番号１～配列番号５３から選択されるアミノ酸配列のうちの１つを含む挿入されたアミノ酸区画を含有するカプシドタンパク質（ＣＡＰ）を含む。
【0029】
ウイルスベクター粒子は、注射のために、例えば心組織への直接的注射のために、または全身性注射、例えば静脈内（ｉ．ｖ．）注射のために、製剤化され得る。
【0030】
本発明は、ここで、例により、かつ図面を参照して説明される。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【図1】本発明の挿入されたアミノ酸区画を伴うＣＡＰを同定するために使用される選択プロセスのスキームである。
【図2】全身性注射後に実験動物の様々な細胞タイプに存在するウイルスベクター粒子のコピー数を示す。
【図3】本発明によるウイルスベクター粒子の形質導入効率および特異性を示す。
【図4A】ヒト静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）による、本発明によるウイルスベクター粒子の中和を測定した結果を示す。
【図4B】ヒト静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）による、本発明によるウイルスベクター粒子の中和を測定した結果を示す。
【実施例】
【0032】
例：心筋細胞に対する特異性を有するＡＡＶ２ウイルスベクター粒子の同定
概して、ＣＡＰに挿入されたランダムアミノ酸区画を含有する、ＡＡＶ２カプシド突然変異体のウイルス粒子の初期ライブラリーを生成した。挿入されたアミノ酸区画は、ＣＡＰをコードする野生型遺伝子において野生型配列のアミノ酸５８７番をコードする区画と５８８番をコードする区画との間に配置される核酸構築物によりコードされた。野生型ＣＡＰのアミノ酸５８７についてのコドンとアミノ酸５８８についてのコドンとの間に、核酸構築物は５’から３’へ、リンカー配列としてのＡＡＡのコード配列と、挿入されるアミノ酸配列としてのランダムな７ｍｅｒと、リンカー配列としてのＡＡのコード配列とからなる挿入されるアミノ酸配列をコードし、Ｎ末端からＣ末端へ各々のコードされたアミノ酸配列の配置を生じた。
概して、ＣＡＰに挿入されたランダムアミノ酸区画を含有する、ＡＡＶ２カプシド突然変異体のウイルス粒子の初期ライブラリーを生成した。挿入されたアミノ酸区画は、ＣＡＰをコードする野生型遺伝子において野生型配列のアミノ酸５８７番をコードする区画と５８８番をコードする区画との間に配置される核酸構築物によりコードされた。野生型ＣＡＰのアミノ酸５８７についてのコドンとアミノ酸５８８についてのコドンとの間に、核酸構築物は５’から３’へ、リンカー配列としてのＡＡＡのコード配列と、挿入されるアミノ酸配列としてのランダムな７ｍｅｒと、リンカー配列としてのＡＡのコード配列とからなる挿入されるアミノ酸配列をコードし、Ｎ末端からＣ末端へ各々のコードされたアミノ酸配列の配置を生じた。
【0033】
心筋細胞特異的ウイルスベクター粒子の選択のために、２～４匹のマウス（雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、６～８週齢）を使用し、ここでは、Ｒｏｃｋｍａｎら、ＰＮＡＳ ８８：８２７７～８２８１頁（１９９１）（非特許文献４）により説明される通りに、２６ゲージの針を使用して心圧過負荷を人工的に誘導し、これらのマウスは、ＴＡＣ術マウスとも称される。結果としての大動脈縮窄術（ＴＡＣ）による大動脈弁狭窄症を、心エコーにより確認し、その後、ウイルス／ベクター粒子を注射した。マウスを、ウイルス０．６６ｘ１０１１～１ｘ１０１１個／ベクター粒子による尾静脈注射により１回処置した。
【0034】
このマウスモデルとしてのｉｎ ｖｉｖｏ選択プロセスにおけるＴＡＣ術マウスの使用は、とりわけ肥大性心筋細胞についての指向性の増大をもたらす挿入されたアミノ酸区画をＣＡＰ内に含有するＡＡＶ２のカプシド突然変異体ウイルスベクター粒子の同定を支持したと考えられる。したがって、このウイルスベクター粒子は、心組織の処置における使用に、とりわけ肥大疾患段階において心筋細胞をターゲティングするために好適である。同時に、マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ選択は、肝臓についての指向性の低減ならびにしたがってより効率的な心筋細胞特異的導入遺伝子送達および導入遺伝子発現、例えば野生型ＡＡＶ９と比較して増大した心筋細胞特異的導入遺伝子送達および導入遺伝子発現をもたらすカプシド突然変異体ＡＡＶ粒子を同定することを可能にする。このプロセスにおいて、初期ライブラリーについて、ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を含有するウイルス粒子を使用し、さらなる選択プロセスにおいて、Ｒｅｐコード配列をＥＧＦＰ ＤＮＡの発現カセットにより置換した。
【0035】
代表的な導入遺伝子として、ＥＧＦＰ（高感度緑色蛍光タンパク質）のコード配列を使用した。
【0036】
プラスミドプールから、ＨＥＫ２９３細胞のリン酸カルシウムトランスフェクション、続いてウイルスベクター粒子のイオジキサノール勾配精製により、ウイルスベクター粒子のＡＡＶライブラリーを産生した。ベクター粒子タイターを、ｃａｐ特異的またはＥＧＦＰ特異的プライマーを使用する定量的ＰＣＲにより決定した。
【0037】
ｉｎ ｖｉｖｏ選択プロセスは、３つの連続選択ステップからなった。第１の選択ステップにおいて、ウイルス粒子の初期ライブラリーを、マウスに、ＴＡＣ術の５３日後に注射した。３日後、心組織を分画して、心筋細胞を単離した。このために、マウスを吸入チャンバーにおいて酸素中の４％イソフルランにより麻酔した。動物を、ホットプレート（３７℃）上で仰臥位にて固定し、麻酔を呼吸マスク（酸素中の２％イソフルラン）により維持した。皮膚を切開し、２つの気管柵状織間に切開を施し、これを通してカニューレを挿入した。その後、管を糸で固定し、人工換気システムに接続した。胸部の消毒後、皮膚を肋骨のアーチに並行して２～３ｃｍの長さに沿って切断し、腹部および胸部を開放し、出血はすべて軽く拭き取った。次に、大動脈の位置を特定し、持ち上げ、静かに切断した。穴を通して鈍端カニューレを挿入し、糸で固定した。心臓は、マウスにおいて、事前に温めた灌流緩衝液（１１３ｍＭ ＮａＣｌ、４．７ｍＭ ＫＣｌ、０．６ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．６ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４－７Ｈ２Ｏ、０．０３２ｍＭフェノールレッド、１２ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ ＫＨＣＯ３、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３０ｍＭタウリン、０．１％グルコース、１０ｍＭ ２，３－ブタンジオンモノオキシム）により即座に逆行性灌流を３分間行い、その後マウスから除去し、灌流緩衝液によりさらなる３分間灌流し、続いて事前に温めた消化緩衝液（１１３ｍＭ ＮａＣｌ、４．７ｍＭ ＫＣｌ、０．６ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．６ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４－７Ｈ２Ｏ、０．０３２ｍＭフェノールレッド、１２ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ ＫＨＣＯ３、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３０ｍＭタウリン、０．１％グルコース、１０ｍＭ ２，３－ブタンジオンモノオキシム、１２．５μＭ ＣａＣｌ２、７００Ｕ／ｍｌコラゲナーゼＩＩ）により１０分間灌流した。心房を除去し、心室を、２．５ｍｌの温かい消化緩衝液中で切断し、１ｍｌシリンジを通して剪断することにより機械的に分離した。コラゲナーゼＩＩ消化を、２．５ｍｌの停止緩衝液（１１３ｍＭ ＮａＣｌ、４．７ｍＭ ＫＣｌ、０．６ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．６ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４－７Ｈ２Ｏ、０．０３２ｍＭフェノールレッド、１２ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ ＫＨＣＯ３、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３０ｍＭタウリン、０．１％グルコース、１０ｍＭ ２，３－ブタンジオンモノオキシム、１２．５μＭ ＣａＣｌ２、１０％ＦＢＳ）を細胞懸濁液に添加することにより停止した。得られた細胞懸濁液を、１００μｍの細胞こし器を通して濾過し、フィルターを１～２ｍｌのＡＭＣＦ培地（ＮＥＡＡを含む１０．８ｇ／ｌ ＭＥＭ ＨＢＳ（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ）、４．２ｍＭ ＮａＨＣＯ３、２ｎｇ／ｍｌビタミンＢ１２、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ；１００μｇ／ｍｌ）、１０％ＦＢＳ、ｐＨ７．３）により洗浄した。顕微鏡下で、棒状の心筋細胞の外観を評価した。心筋細胞を室温（ＲＴ）において１０分間沈殿させた。心筋細胞沈殿ペレット（ＣＭＣ画分）を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄し、９００ｘｇにおいて４℃にて５分間遠心分離し、液体窒素中で凍結し、－８０℃において保存した。残りの上清を、３０ｘｇにおいて室温にて３分間遠心分離して残留の心筋細胞を除去した。残留の心筋細胞を含有する細胞ペレットを捨て、残りの他の心臓細胞種を含有する上清をさらに処理した。ライブラリー選択中、他の特定の心臓細胞種、例えば、線維芽細胞または内皮細胞が必要とされなかった場合、上清を４３０ｘｇにおいて遠心分離してすべての非心筋細胞をペレット化し、ペレットを液体窒素中で凍結し、－８０℃において保存した。また、心臓線維芽細胞および内皮細胞が必要とされた場合（個々のベクターバリアントのベクターコピーおよび発現解析のために）、代わりに非筋細胞画分を含有する細胞ペレットをＡＭＣＦ培地（ＮＥＡＡを含む１０．８ｇ／ｌ ＭＥＭ ＨＢＳ（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ）、４．２ｍＭ ＮａＨＣＯ３、２ｎｇ／ｍｌビタミンＢ１２、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ；１００μｇ／ｍｌ）、１０％ＦＢＳ、ｐＨ７．３）中に溶解し、１０ｃｍペトリ皿上に事前播種し、１％ＣＯ２インキュベーター内に１時間置いた。付着した細胞（心臓線維芽細胞）をＰＢＳにより２回洗浄し、その後、２ｍｌのＰＢＳを皿に添加し、細胞を細胞スクレーパーにより回収し、９００ｘｇにおいて４℃にて５分間遠心分離した。ペレットを液体窒素中で凍結し、－８０℃において保存した。非筋細胞を含有する事前播種ステップの上清である非線維芽細胞画分を、次に４３０ｘｇにおいて４℃にて５分間遠心分離した。得られた細胞ペレットを８０μｌのＭＡＣＳ緩衝液（ａｕｔｏ－ＭＡＣＳすすぎ溶液中に１：２０希釈したＭＡＣＳウシ血清アルブミンストック溶液、両方ともＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）中に再懸濁し、２０μｌのＣＤ１４６ ＭＡＣＳビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）と混合し、４℃において１５分間インキュベートした。後に、２ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液を添加し、細胞懸濁液を完全に混合し、４３０ｘｇにおいて４℃にて５分間遠心分離した。細胞ペレットを、ＭＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、事前洗浄したＭＡＣＳ分離カラムに移した。ＭＡＣＳ緩衝液による３回の洗浄ステップ後、分離カラムを磁場から除去した。カラムを５００μｌのＭＡＣＳ緩衝液により３回すすぐことによりＥＣ画分を回収し、９００ｘｇにおいて４℃にて５分間遠心分離した。ペレットを液体窒素中で凍結し、－８０℃において保存した。
【0038】
ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツから得た）を使用して製造業者の使用説明書に従って、細胞画分からＤＮＡを単離した。心筋細胞内に蓄積されたウイルス粒子のＣＡＰ遺伝子の挿入されたアミノ酸配列を再クローニングするために、挿入されたアミノ酸配列のコード配列の両側に位置するプライマー（フォワードプライマー配列番号５７、リバースプライマー配列番号５８）を使用するＰＣＲにより、ウイルスベクターＤＮＡを増幅し、これらの再クローニングしたＣＡＰ遺伝子配列からウイルスベクター粒子の二次ライブラリーを生成した。
【0039】
第２の選択ステップのために、二次ライブラリーにおいて、ｒｅｐ遺伝子を、ＥＧＦＰをコードする発現カセットにより置換し、二次ライブラリーのウイルスベクター粒子の産生中に、ｒｅｐタンパク質コード配列を、プラスミドトランスフェクションによりｔｒａｎｓで供給した。ｒｅｐコードヌクレオチド配列を、別のプラスミドで提供し、これはさらにＡＡＶベクター産生のためのトランスフェクション中に使用した。パッケージングのために、二次ライブラリーのベクターゲノムは、両側にＡＡＶ２の末端逆位配列（ＩＴＲ）を有した。二次ライブラリーのウイルスベクター粒子を、ＴＡＣ術の４２日後に注射し、心筋細胞および非筋細胞を２週間後に収集し、続いて、心筋細胞内にさらに蓄積された、挿入されたアミノ酸配列をコードする核酸配列を再クローニングするために次なるＤＮＡ増幅を行った。再クローニングしたアミノ酸配列を使用して、以前の第２の選択ラウンドと同じ方法で選択した三次ライブラリーを生成した。
【0040】
選択プロセスを図１に示し、ここで、標的細胞は心筋細胞であり、心筋細胞に対する特異性を査定するために、ＡＡＶベクターの主要なオフターゲット組織として肝組織を解析した。
【0041】
３ラウンドの選択後、心筋細胞画分から、非筋細胞心臓画分から、および肝組織からサブライブラリーを単離した。３回の選択ラウンド後のこのサブライブラリーのＤＮＡを、４５４パイロシークエンシングプラットホーム（ＧＳ Ｊｕｎｉｏｒ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）での次世代シークエンシングによりｃａｐ特異的プライマー（配列番号５７のフォワードプライマー）を使用して解析した。シークエンシングデータは、ｃａｐ遺伝子内において配列番号１～配列番号５３の挿入されたアミノ酸配列をコードする心筋細胞富化バリアントのコード配列を同定した。
【0042】
以前に行ったＡＡＶペプチドディスプレイライブラリーの選択から選択した個々のカプシド改変ベクター粒子の産生のために、挿入されたアミノ酸配列および隣接部分をコードするオリゴヌクレオチドを使用して、挿入されたアミノ酸配列のうちの１つを含有するｃａｐタンパク質を有するウイルスベクター粒子を個々に生成した。挿入されたアミノ酸配列のうちの１つをコードする個々のｃａｐ遺伝子についてのオリゴヌクレオチドを、Ｚｈａｎｇら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１２８４～１２９６頁（２０１９）（非特許文献５）により説明される通りに、ヘルパープラスミドｐＲＣ’９９にクローニングした。
【0043】
配列番号１の挿入されたアミノ酸区画を有するＣＡＰを含有する本発明によるウイルスベクター粒子は、配列番号５４のＣＡＰを有し、配列番号１１の挿入されたアミノ酸区画を有するＣＡＰは、配列番号５５のＣＡＰを有した。
【0044】
野生型、および本発明による挿入されたアミノ酸区画を有するＣＡＰを含むカプシド改変バリアントの両方のＡＡＶウイルスベクター粒子、ならびにまた野生型ＡＡＶ９粒子を、ＨＥＫ２９３細胞のリン酸カルシウムトランスフェクションにより産生し、続いてイオジキサノール勾配精製によりウイルスベクター粒子を精製した。各々挿入されたアミノ酸配列のうちの１つを含有する個々のウイルスベクターを、自己相補的ゲノムコンフォメーションにおいてＣＭＶプロモーターの制御下でＥＧＦＰをコードするウイルスベクターとして産生した（ｓｃＥＧＦＰ）。要するに、当該プロセスは、ＡＡＶベクター産生のためにＨＥＫ２９３細胞においてベクターゲノムプラスミド（ＡＡＶ２ ＩＴＲにより両側を挟まれた、ＣＭＶプロモーターおよびＥＧＦＰコード配列）、各々のヘルパープラスミド（野生型ＡＡＶ２のｃａｐ遺伝子（適用可能である場合挿入されたアミノ酸区画を伴う）、およびｒｅｐ遺伝子を含有する）ならびにアデノウイルスヘルパープラスミド（ＡＡＶベクター産生に必要とされるアデノウイルスヘルパー機能を含有する）をトランスフェクトするステップを含み、続いてイオジキサノール勾配遠心分離によるベクター粒子の精製を伴った。
【0045】
ベクター産生のゲノムタイターを、ＥＧＦＰコード配列に特異的なプライマーを使用する定量的ＰＣＲによって決定した。
【0046】
配列番号１または配列番号１１の挿入されたアミノ酸区画を含有するＣＡＰの例についての、実験動物の様々な組織に存在するウイルスベクター粒子のコピー数は、本発明によるＣＡＰを含有するウイルスベクター粒子が、例えば野生型ＡＡＶ９と比較して、特に肝細胞との関係において、心筋細胞に対して高い特異性を有することを示す。
【0047】
ＡＡＶベクターコピー数解析を、絶対標準曲線法を使用して、心臓細胞試料および器官組織におけるｑＰＣＲにより、それぞれ、Ｐｔｂｐ２（ポリピリミジントラクト結合タンパク質２；二倍体ゲノム当たり２コピー）およびＥＧＦＰの絶対遺伝子コピー数を決定することにより行った。マルチプレックスＴａｑＭａｎプローブベースのｑＰＣＲ検出を、３８４ウェルフォーマットにおいて、ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＴａｑＭａｎ Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ ＥＧＦＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ＦＡＭ蛍光標識済み）、Ｐｔｂｐ２プライマー（フォワード：ＴＣＴＣＣＡＴＴＣＣＣＴＡＴＧＴＴＣＡＴＧＣ（配列番号５９）、リバース：ＧＴＴＣＣＣＧＣＡＧＡＡＴＧＧＴＧＡＧＧＴＧ（配列番号６０））およびＪＯＥ蛍光標識Ｐｔｂｐ２プローブ（５’［ＪＯＥ］－ＡＴＧＴＴＣＣＴＣＧＧＡＣＣＡＡＣＴＴＧ－［ＢＨＱ１］３’（配列番号６１））を使用して行った。各ｑＰＣＲ反応は、１０μｌの総体積中に、１ｘＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、１ｘＥＧＦＰ ＴａｑＭａｎ Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ａｓｓａｙ、１５０ｎＭ Ｐｔｂｐ２ ＴａｑＭａｎプローブ、３３０ｎＭプライマー（フォワードおよびリバース）の最終濃度ならびに２μｌのＤＮＡ試料を含有した。ＤＮＡ試料は、絶対コピー数標準曲線（分子５ｘ１０５、５ｘ１０４、５ｘ１０３、５ｘ１０２、５ｘ１０１個／μｌ）のための直鎖状プラスミドＤＮＡ（１つのプラスミド当たりＰｔｂｐ２およびＥＧＦＰのうちの１つのコピーを含有する）、または１５ｎｇ／μｌの濃度の事前希釈したＤＮＡのいずれかを包含した。
【0048】
ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において以下のプロトコールを使用してｑＰＣＲを行った：５０℃で２分間および９５℃で２０秒間の初回活性化、続いて、９５℃で５秒間の変性と、５６℃で２０秒間のプライマー／プローブアニーリングおよび伸長と、６５℃で２０秒間の蛍光シグナルの検出とを４０周期。二倍体細胞におけるベクターコピー数（ＶＣＮ）を以下の式によって計算した：ＶＣＮ＝量（ＥＧＦＰ）／量（Ｐｔｂｐ２）ｘ２。
【0049】
エフェクター遺伝子を表すＥＧＦＰの発現レベルにより、本発明によるウイルスベクター粒子が、心筋細胞においてエフェクター遺伝子発現の高い特異性を有することが示される。導入遺伝子発現のレベルは、野生型ＡＡＶ９により送達された同じ導入遺伝子の発現レベルと同等である。しかしながら、ＡＡＶ９と比較して、本発明によるベクター粒子は、主要なオフターゲットである肝組織において発現の低減を示す。
【0050】
ウイルスベクターの注射の２週間後に収集した、心臓画分化によって得られた心臓細胞種および肝組織において、例示的な導入遺伝子ＥＧＦＰの発現を定量的逆転写ＰＣＲ（ｑｒｔＰＣＲ）により解析した。結果は、概して、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（Ｔｂｐ）の転写物に関するＲＮＡ入力について正規化した。詳細には、６５～５００ｎｇのトータルＲＮＡの逆転写を、Ｂｉｏｚｙｍ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｚｙｍ）を使用して製造業者の使用説明書に従い、行った。器官組織試料の場合、逆転写前に、５００ｎｇのトータルＲＮＡを、０．６８４μｌのＤＮアーゼ（１：１０希釈、ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔ（Ｑｉａｇｅｎ））、１．１５μｌのＲＤＤ緩衝液（ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔ（Ｑｉａｇｅｎ））および０．１４４μｌのＲＮａｓｉｎ Ｒｉｂｏｃｌｕｃｌｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と１１．５μｌの総体積において３７℃にて３０分間インキュベートすることによって、第２のＤＮアーゼ消化を直接的に行った。０．２３μｌの６２．５ｍＭ ＥＤＴＡを添加し、６５℃で５分間インキュベートすることにより反応を停止させた。６５～５００ｎｇのＲＮＡを含有する１１．５～１１．７３μｌのＲＮＡ希釈溶液（第２のＤＮアーゼ消化を伴うかまたは伴わない）を、４μｌの５ｘ ｃＤＮＡ合成緩衝液、２μｌのｄＮＴＰ Ｍｉｘ（各１０ｍＭ）、１μｌのヘキサマープライマー（２５μＭ）、０．５μｌのＲＮアーゼ阻害剤（４０Ｕ／μｌ）および１μｌの逆転写酵素を使用して逆転写した。反応混合物を３０℃で１０分間、続いて５５℃で６０分間インキュベートし、最後に、酵素を９９℃で５分間熱不活性化した。ｑＰＣＲ前に、ｃＤＮＡ試料を、２倍体積のヌクレアーゼ非含有Ｈ２Ｏにより希釈し（１：３希釈）、－２０℃において保存した。
【0051】
３８４ウェルフォーマットにおいてｉＱ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して製造業者の使用説明書に従い、ｑＰＣＲ測定を行った。５μｌのｉＱ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ、０．０５μｌのＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ １：５０希釈（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．０２５μｌのＰｒｅｃｉｓｉｏｎ ＢｌｕｅＴＭ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｙｅ（ＢｉｏＲａｄ）、０．５μｌの事前混合プライマー（１０μＭフォワードおよび１０μＭリバースプライマー）、２．４５μｌのヌクレアーゼ非含有Ｈ２Ｏおよび２μｌのｃＤＮＡ（ｃＤＮＡ合成後に１：３希釈）からなる反応混合物を混合し、ｑＰＣＲプロトコールをＶｉｉａＴＭ ７ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において以下のプロトコールを使用して行った：９５℃で３分間の初回活性化、９５℃で１５秒間の変性と、６０℃で３０秒間のプライマーアニーリングと、７２℃で４０秒間の伸長と、続いて単ＰＣＲアンプリコンの増幅を確実にするための９５℃から５５℃までの１０秒間の０．５℃毎の蛍光検出による融解曲線の生成とを４５周期。心臓細胞画分およびマウス器官におけるＥＧＦＰ発現を、相対標準法により解析した。プールしたＥＧＦＰ発現試料の同じ１：５連続希釈系を、すべてのｑＰＣＲ測定に含めて、すべての試料について相対標準値を得た。
【0052】
図２は、それぞれ、実験動物から単離した細胞および器官における、つまり、心筋細胞（ＣＭＣ）、肝臓、骨格筋（ｓｋ筋）における、腎臓および脾臓における、ウイルスベクター粒子の平均コピー数（ＶＣＮ）を示す。上～下に示されるウイルスベクター粒子は、グラフにおいて左～右に示される。動物は、偽手術（偽）としてか、手術により誘導した大動脈縮窄術（ＴＡＣ）を有するかが示される。結果から、挿入されたアミノ酸区画ＴＨＧＴＰＡＤ（配列番号１）を含有するＣＡＰ（ＡＡＶ２－ＴＨＧＴＰＡＤ）、および挿入されたアミノ酸区画ＮＬＰＧＳＧＤ（配列番号１１）を含有するＣＡＰ（ＡＡＶ２－ＮＬＰＧＳＧＤ）は、心筋細胞において野生型ＡＡＶ９（ＡＡＶ９）と同様のコピー数、および野生型ＡＡＶ２（ＡＡＶ２）よりも高いコピー数を与え、肝臓において野生型ＡＡＶ２およびＡＡＶ９よりも低いコピー数を与えることが示される。このことは、野生型ＡＡＶ血清型ＡＡＶ２およびＡＡＶ９に優る、心筋細胞についての、本発明による挿入されたアミノ酸区画を含有するＣＡＰの増加された特異性を示す。対照的に、配列ＬＰＳＲＰＳＬ（配列番号６２、比較用）を有する挿入されたアミノ酸区画を有するＣＡＰは、心筋細胞においてより低いコピー数、および肝臓においてより高いコピー数を有し、心筋細胞についてのより低い指向性を示す。
【0053】
本発明によるウイルスベクター粒子の形質導入効率および形質導入特異性を、配列番号１の挿入されたアミノ酸区画を有するＣＡＰ（配列番号５４のＣＡＰ）または配列番号１１の挿入されたアミノ酸区画を有するＣＡＰ（配列番号５５のＣＡＰ）を有するウイルスベクター、および比較のために野生型ＡＡＶ２もしくは野生型ＡＡＶ９または配列番号６２の挿入されたアミノ酸区画を含有するＣＡＰを導入することにより、解析した。ウイルスベクター粒子は、ＥＧＦＰの発現カセットを含有した。ウイルスベクター粒子を、偽手術マウスまたはＴＡＣ術マウス（各２～４匹の動物）に手術の６週間後に注射した。ウイルスベクター粒子注射の後、２週間後に、心組織から画分化した心筋細胞、心臓線維芽細胞（ＣＦ）および心臓内皮細胞（ＥＣ）において、骨格筋細胞（ｓｋ筋）において、肝臓、腎臓および脾臓において、ＥＧＦＰの発現をｑｒｔＰＣＲにより決定した。
【0054】
図３Ａは、解析プロセスを模式的に示す。図３Ｂは、各ベクター：野生型ＡＡＶ２（ＡＡＶ２）、野生型ＡＡＶ９（ＡＡＶ９）、配列番号１の挿入されたアミノ酸区画を含有するＣＡＰを有するウイルスベクター粒子（ＡＡＶ２－ＴＨＧＴＰＡＤ）、配列番号１１の挿入されたアミノ酸区画を含有するＣＡＰを有するウイルスベクター粒子（ＡＡＶ２－ＮＬＰＧＳＧＤ）、または配列番号６２の挿入されたアミノ酸区画を含有するＣＡＰを有する比較用ベクター粒子（ＡＡＶ２－ＬＰＳＲＰＳＬ）について別々に、偽手術マウス（偽）またはＴＡＣ術マウス（ＴＡＣ）についての、Ｔｂｐ発現について正規化したＥＧＦＰ発現（相対発現（ＥＧＦＰ／Ｔｂｐ））の検出結果を示す。これらの実験の組合せを、図３Ｂにおいて上～下へ２列で示し、この順序で左～右へ様々な細胞種について示す。結果から、心筋細胞における本発明によるベクター粒子は、偽手術およびＴＡＣ術マウスの心筋細胞において、野生型ＡＡＶ２よりも高い導入遺伝子発現、および野生型ＡＡＶ９と類似の発現を生成し、主要なオフターゲット器官である肝臓において野生型ＡＡＶ９よりも低い導入遺伝子発現を生成することが示される。
【0055】
図３Ｃは、ベクターＡＡＶ２、ＡＡＶ９、ＡＡＶ２－ＴＨＧＴＰＡＣおよびＡＡＶ２－ＮＬＰＧＳＧＤについて偽手術動物およびＴＡＣ術動物からの結果について組み合わせた、ならびに比較用の挿入されたアミノ酸区画配列番号６２を含有するＣＡＰ（ＡＡＶ２－ＬＰＳＲＰＳＬ）については偽およびＴＡＣについて別々の、肝臓における発現と比較した、心筋細胞（ＣＭＣ）における、Ｔｂｐ発現について正規化したＥＧＦＰ発現を示す。データは、ＡＡＶ２およびＡＡＶ９（野生型カプシド）について、ならびに配列番号１の挿入されたアミノ酸区画を含有するＣＡＰを有するウイルスベクター粒子（ＡＡＶ２－ＴＨＧＴＰＡＤ）および配列番号１１の挿入されたアミノ酸区画を含有するＣＡＰを有するベクター（ＡＡＶ２－ＮＬＰＧＳＧＤ）について、ならびに比較用ベクター（配列番号６２）について与えられる。挿入されたアミノ酸区画を含有する例示的なＣＡＰに基づいて、これは、本発明による挿入されたアミノ酸区画を有するＣＡＰを含有するＡＡＶ２をベースとするウイルスベクター粒子は、心筋細胞においてウイルスベクター粒子によりコードされるエフェクター分子の発現特異性の有意な増大、例えば野生型ＡＡＶ２およびＡＡＶ９と比較した有意な増大、ならびに配列番号６２の挿入されたアミノ酸区画を含む比較用ＣＡＰと比較した有意な増大をもたらすことを示す。
【0056】
ヒト静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）を含有する血清における本発明によるウイルスベクター粒子の持続性を試験するために、ＩＶＩＧ血清の中和活性を試験した。本発明によるＣＡＰを含有するウイルスベクター粒子および野生型血清型ＡＡＶ２のベクター粒子を、１ｍＬのＤＭＥＭ細胞培養培地（１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充した）中のＩＶＩＧ血清の様々な希釈物とインキュベートした。ウイルスベクター粒子を、ＩＶＩＧの非存在下において、すなわち、細胞培養培地のみにおいて、細胞の３０～４０％をトランスフェクトしてＥＧＦＰを発現させる（細胞の３０～４０％がＥＧＦＰ陽性）濃度において使用し、これを陽性対照としても使用した。ウイルスベクター粒子を、ＩＶＩＧ血清と混合したまたは混合していない細胞培養培地において室温にて１時間インキュベートし、その後、１２ウェルプレートにおいて培養したＨＥＫ２９３細胞に添加した。細胞培養条件下での４８時間のインキュベーション後、ＨＥＫ２９３細胞を、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により解析して、ＥＧＦＰ陽性細胞のパーセントを決定した。
【0057】
図４Ａは、ＦＡＣＳ結果を示し、ここで、ＥＧＦＰ陽性細胞のパーセントは、陽性対照について決定されたパーセントについて正規化された（ｐｏｓ．ＣＲＬ）＝１。野生型ＡＡＶ２（ＡＡＶ２）および挿入されたアミノ酸区画として配列番号６２を有するＣＡＰを含有する比較用ウイルスベクター粒子（ＡＡＶ２－ＬＰＳ）は、例えば配列番号１の挿入されたアミノ酸区画を含有する（ＡＡＶ２－ＴＨＧ）または配列番号１１の挿入されたアミノ酸区画を含有する（ＡＡＶ２－ＮＬＰ）本発明のウイルスベクター粒子よりも、高度に希釈されたＩＶＩＧ血清において既に中和されていることが見出される。図４Ｂは、図４Ａのデータに由来するＩＣ５０値のグラフを示す。
【0058】
本発明によるウイルスベクター粒子の産生は、マウス組織における発現およびベクターコピー数解析について本明細書で説明される通りに行われた。
【0059】
図５Ａ～Ｄは、ＦＡＣＳ結果を示し、ここで、ＥＧＦＰ陽性細胞のパーセントは、陽性対照について決定されたパーセントについて正規化された（ｐｏｓ．ＣＲＬ）＝１。以前に野生型ＡＡＶ９を注射したマウスからのマウス血清（ＡＡＶ９）は、ＡＡＶ９を中和するのみであり、一方で、ＡＡＶ２および本発明のウイルスベクター粒子は、この血清の存在にかかわらず、細胞に形質導入されることが見出される。同様に、以前に野生型ＡＡＶ２を注射したマウスからのマウス血清（ＡＡＶ２）は、ＡＡＶ２を中和するのみであり、一方で、ＡＡＶ９および本発明のウイルスベクター粒子は、細胞に形質導入する能力を保持する。以前にＡＡＶ－ＮＬＰを注射したマウスの血清は乏しい中和能を示し、血清低希釈物でのみＡＡＶ２および本発明のウイルスベクター粒子の中和をもたらすことは注目に値する。同様に、以前にＡＡＶ－ＴＨＧを注射したマウスの血清は、乏しい中和能を示し、血清低希釈物で野生型ＡＡＶ２のみの弱い中和をもたらす。
【0060】
本発明のＡＡＶ２ウイルス粒子のｉｎ ｖｉｔｒｏでの特徴付けを、図６において示す。様々な量のベクターを、１２ウェルフォーマットのＨｅｋ２９３細胞の形質導入に使用した。このアッセイにおいて使用したベクターのゲノムタイターは、同等の範囲であった。形質導入効率を、形質導入の４８時間後にＥＧＦＰ陽性細胞についての蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって決定した（ｎ＝３）。図６Ａは、本発明のＡＡＶ２ウイルスベクターＡＡＶ２－ＴＨＧＴＰＡＤ（配列番号１の挿入されたアミノ酸区画を含有する）およびＡＡＶ２－ＮＬＰＧＳＧＤ（配列番号１１の挿入されたアミノ酸区画を含有する）、ならびに比較として野生型ＡＡＶ２およびＡＡＶ２－ＬＰＳＲＰＳＬ（配列番号６２の比較用の挿入されたアミノ酸区画を含有する）の形質導入効率を示す。図６Ａのデータに基づいて、図６Ｂは、ベクターゲノム当たりの感染性粒子（Ｈｅｋ２９３細胞についての）の計算された比を示し、ここで、ゲノムタイターはｑＰＣＲ（定量的ＰＣＲ）によって決定された。結果から、これらの細胞において、比較用ベクターＡＡＶ２－ＬＰＳＲＰＳＬは野生型ＡＡＶ２よりも低い感染性を示すこと、および本発明によるベクターはこれらの非標的細胞において著しく低減した感染性を示すことが示される。
【0061】
図６Ｃは、ヘパリン競合アッセイの結果を示し、ここで、ヘパリンは、ウイルスベクターの推定上の受容体であるＨＳＰＧの可溶性アナログを形成する。ＡＡＶベクターおよび野生型ＡＡＶ２をヘパリンと事前インキュベートし、その後Ｈｅｋ２９３細胞に形質導入して、ヘパリン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）依存性細胞進入を調査した。形質導入効率は、形質導入４８時間後にＥＧＦＰ陽性細胞についてのＦＡＣＳにより決定した（ｎ＝３）。結果から、ヘパリンは、本発明によるベクターによる形質導入に影響を及ぼさなかったが、比較用ベクターＡＡＶ２およびＡＡＶ２－ＬＰＳＲＰＳＬによる形質導入には影響を及ぼしたことが示される。このことは、本発明のベクターの細胞進入は、ＨＳＰＧとは独立して起こることを示唆する。
【0062】
ＡＡＶベクター粒子の熱安定性を、ベクター粒子を様々な温度に１５分間供し、その後、検出のために、インタクトなＡＡＶベクター粒子のアセンブルされたカプシドタンパク質の検出に特異的なＡ２０抗体を使用してドットブロッティングすることにより、アッセイした。結果を図６Ｄに示し、カプシドの安定性は、野生型ＡＡＶ２についてよりも、比較用ベクターＡＡＶ２－ＬＰＳＲＰＳＬおよび本発明のウイルスベクターの両方について低いことを示す。しかしながら、比較用ベクターＡＡＶ２－ＬＰＳＲＰＳＬが、５７．９℃での部分的な分解を示す最も安定でないバリアントである一方で、本発明のベクターは、６０．７℃で開始する部分的なカプシド分解と非常に類似する安定性を示し、バリアントカプシドの分解の開始は、６３．４℃でのみ開始した。
【0063】
図６Ｅは、交差種活性のアッセイ結果を示す。ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞（ｉＰＳＣ－ＣＭＣ）に、ｓｃＥＧＦＰを発現するＡＡＶベクターを、２ｘ１０３のベクター粒子対細胞比により形質導入した。ＥＧＦＰ発現を、形質導入７日後に蛍光顕微鏡（スケールバー＝１００μｍ）により査定した（ｎ＝３）。結果は、本発明のウイルスベクターは心筋細胞に形質導入されることを示す。
【0064】
以下のマウス実験データは、ＡＡＶ２－ＴＨＧＴＰＡＤおよびＡＡＶ２－ＮＬＰＧＳＧＤの例についての本発明のウイルスベクターの治療的有効性および肝臓脱ターゲティングを示す。長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）Ｈ１９のＡＡＶ９ベースの送達は、ＴＡＣマウス様式において病理学的心肥大を逆進させるという観察を利用して、図７Ａで模式的に示されるように、Ｈ１９をＡＡＶ９、ＡＡＶ２－ＴＨＧＴＰＡＤおよびＡＡＶ２－ＮＬＰＧＳＧＤへパッケージングし、ＴＡＣの誘導の４週間後にマウスに注射した。３．５５ｘ１０１０個のみのウイルスゲノム（ｖｇ）／マウスを注射したので、データから、改善された心筋細胞指向性のために、低用量のウイルスベクターが形質導入に十分であることが示される。ＡＡＶ処置の４週間後の心エコーによる機能査定は、ＡＡＶ９空対照群と比較して、ＡＡＶ２－ＴＨＧＴＰＡＤ－Ｈ１９およびＡＡＶ２－ＮＬＰＧＳＧＤ－Ｈ１９の両方について左心室駆出率における有意な救済を示したが、ＡＡＶ９－Ｈ１９については示さなかった（図７Ｂ）。これは、ＡＡＶ２－ＴＨＧＴＰＡＤ－Ｈ１９およびＡＡＶ２－ＮＬＰＧＳＧＤ－Ｈ１９処置マウスにおける、より低い左心室質量（図７Ｃ）および救済された心臓寸法（図７Ｄ、７Ｅ）ならびに脛骨長に対する、より低い心臓重量比（図７Ｆ）と同時に起きた。ＡＡＶ９－Ｈ１９処置群は、すべてのパラメーターについて治療的救済への明確な傾向を示したが、これは統計的優位性に達しなかった。心臓の解釈後のＨ１９発現解析は、ＡＡＶ２－ＴＨＧＴＰＡＤ－Ｈ１９、ＡＡＶ２－ＮＬＰＧＳＧＤ－Ｈ１９およびＡＡＶ９－Ｈ１９処置マウスにおける部分的にのみ救済された心肥大において、Ｈ１９の予測された低減を示した（図７Ｇ、おそらく、非心筋細胞の希釈効果に関連する低いベクター用量のため）。それにもかかわらず、Ｈ１９コピー数解析は、ＡＡＶ９空対照と比較して、すべてのバリアントについて強い増大を示した（図７Ｈ）。著しく、ＡＡＶ９－Ｈ１９が肝臓において強く蓄積した一方で、ＡＡＶ２－ＴＨＧＴＰＡＤ－Ｈ１９、ＡＡＶ２－ＮＬＰＧＳＧＤ－Ｈ１９処置マウスにおけるＨ１９コピー数は偽およびＡＡＶ９空対照群と同等であった（図７Ｉ）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】
【国際調査報告】