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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-12
(54)【発明の名称】α－シンヌクレイン沈着物のＭＲＩのための標的造影剤
(51)【国際特許分類】
C07D 333/22 20060101AFI20230405BHJP
A61K 47/59 20170101ALI20230405BHJP
A61K 31/381 20060101ALI20230405BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20230405BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20230405BHJP
A61K 47/28 20060101ALI20230405BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230405BHJP
A61K 33/244 20190101ALI20230405BHJP
A61B 5/055 20060101ALI20230405BHJP
G01T 1/161 20060101ALI20230405BHJP
A61K 49/06 20060101ALI20230405BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20230405BHJP
A61K 31/192 20060101ALI20230405BHJP
A61K 31/122 20060101ALI20230405BHJP
【ＦＩ】
C07D333/22 CSP
A61K47/59
A61K31/381
A61K9/127
A61K47/24
A61K47/28
A61P25/00
A61K33/244
A61B5/055 383
G01T1/161 B
G01T1/161 A
A61K49/06
A61P25/16
A61K31/192
A61K31/122
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022548474
(86)(22)【出願日】2021-02-12
(85)【翻訳文提出日】2022-10-05
(86)【国際出願番号】 US2021017986
(87)【国際公開番号】W WO2021163585
(87)【国際公開日】2021-08-19
(31)【優先権主張番号】62/975,265
(32)【優先日】2020-02-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522007587
【氏名又は名称】テキサス チルドレンズ ホスピタル
(71)【出願人】
【識別番号】521324735
【氏名又は名称】アルゼカ バイオサイエンシズ、エルエルシー
(71)【出願人】
【識別番号】522299001
【氏名又は名称】タニフム、エリック エイ．
(71)【出願人】
【識別番号】522316135
【氏名又は名称】スン、シエンウェイ
(71)【出願人】
【識別番号】522299023
【氏名又は名称】アンナプラガダ、アナンス ブイ．
(71)【出願人】
【識別番号】522316146
【氏名又は名称】メディチ、カルロ
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】タニフム、エリック、エイ．
(72)【発明者】
【氏名】スン、シエンウェイ
(72)【発明者】
【氏名】アンナプラガダ、アナンス、ブイ．
(72)【発明者】
【氏名】メディチ、カルロ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C085
4C086
4C096
4C188
4C206
【Ｆターム（参考）】
4C076AA19
4C076AA95
4C076CC41
4C076DD63
4C076DD70
4C076EE26
4C076EE59
4C085HH07
4C085JJ05
4C085KA32
4C085KB12
4C085LL13
4C086AA01
4C086AA02
4C086BB02
4C086HA05
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA13
4C086ZC78
4C096AA11
4C096AD19
4C096FC14
4C188EE02
4C188EE25
4C188FF04
4C188FF07
4C206AA01
4C206AA02
4C206CB24
4C206MA01
4C206MA04
4C206NA13
4C206ZC78
(57)【要約】
リポソーム組成物（「ＡＤｘ－００３」）が提供され、ＡＤｘ－００３は、第１のリン脂質と、リポソーム組成物を安定化することができる立体的にかさ高い賦形剤と、第１のポリマーで誘導体化された第２のリン脂質と、大環状ガドリニウム系造影剤と、第２のポリマーで誘導体化された第３のリン脂質であって、第２のポリマーが標的化リガンドにコンジュゲート化されており、標的化リガンドが、式Ｉ：
【化１】
（式中、Ｘは、－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨＯ－又は－Ｏ－ＣＯ－であり、Ｙは、－ＣＨ－ＣＨ＝ＣＨ－又は
【化２】
であり、Ａ及びＢは、独立して、Ｃ及びＮから選択され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、独立して、－Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ及び－ＣＨ３から選択され、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、独立して、－Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－ＮＯ２、－Ｎ（ＣＨ３）２、Ｃ１～Ｃ６アルキル又は置換若しくは非置換Ｇ４～Ｃ６アリール基から選択され、但し、Ａ及び／又はＢがＮである場合、隣接するＲ５及び／又はＲ７は－Ｈである）又はその薬学的に許容される塩によって表される、第３のリン脂質とを含む。
【化１】
（式中、Ｘは、－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨＯ－又は－Ｏ－ＣＯ－であり、Ｙは、－ＣＨ－ＣＨ＝ＣＨ－又は
【化２】
であり、Ａ及びＢは、独立して、Ｃ及びＮから選択され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、独立して、－Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ及び－ＣＨ３から選択され、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、独立して、－Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－ＮＯ２、－Ｎ（ＣＨ３）２、Ｃ１～Ｃ６アルキル又は置換若しくは非置換Ｇ４～Ｃ６アリール基から選択され、但し、Ａ及び／又はＢがＮである場合、隣接するＲ５及び／又はＲ７は－Ｈである）又はその薬学的に許容される塩によって表される、第３のリン脂質とを含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式Ｉによる化合物：【化1】
（式中、
Ｘは、－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨＯ－又は－Ｏ－ＣＯ－であり、
Ｙは、－ＣＨ－ＣＨ＝ＣＨ－又は
【化2】
であり、
Ａ及びＢは、独立して、Ｃ及びＮから選択され、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、独立して、－Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ及び－Ｍｅから選択され、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、独立して、－Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＯＭｅ、－ＮＯ２、－ＮＭｅ２、Ｃ１～Ｃ６アルキル又は置換若しくは非置換Ｃ４～Ｃ６アリール基から選択され、但し、Ａ及び／又はＢがＮである場合、隣接するＲ５及び／又はＲ７は－Ｈである）、又はその薬学的に許容される塩。
【請求項2】
前記化合物が、以下の構造【化3】
を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項3】
前記化合物が、以下の構造【化4】
を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項4】
前記化合物が、以下の構造【化5】
を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項5】
リン脂質－ポリマー－標的化リガンドコンジュゲートであって、前記リン脂質－ポリマーは、
【化6】
（式中、変数ｎは、約７０～約９０の任意の整数であり、変数ｍは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８のうちの１つである）を含み、
前記標的化リガンドは、式Ｉによる化合物：
【化7】
（式中、
Ｘは、－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨＯ－又は－Ｏ－ＣＯ－であり、
Ｙは、－ＣＨ－ＣＨ＝ＣＨ－又は
【化8】
であり、
Ａ及びＢは、独立して、Ｃ及びＮから選択され、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、独立して、－Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ及び－Ｍｅから選択され、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、独立して、－Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＯＭｅ、－ＮＯ２、－ＮＭｅ２、Ｃ１～Ｃ６アルキル又は置換若しくは非置換Ｃ４～Ｃ６アリール基から選択され、但し、Ａ及び／又はＢがＮである場合、隣接するＲ５及び／又はＲ７は－Ｈである）、又はその薬学的に許容される塩を含む、
リン脂質－ポリマー－標的化リガンドコンジュゲート。
【請求項6】
ｎが７７又は７９である、【化9】
を含む、請求項５に記載のリン脂質－ポリマー－標的化リガンドコンジュゲート。
【請求項7】
ｎが７７又は７９である、【化10】
を含む、請求項５に記載のリン脂質－ポリマー－標的化リガンドコンジュゲート。
【請求項8】
ｎが７７又は７９である、【化11】
を含む、請求項５に記載のリン脂質－ポリマー－標的化リガンドコンジュゲート。
【請求項9】
リポソーム組成物であって、第１のリン脂質と、
リポソーム組成物を安定化することができる立体的にかさ高い賦形剤と、
第１のポリマーで誘導体化された第２のリン脂質と、
大環状ガドリニウム系造影剤と、
第２のポリマーで誘導体化された第３のリン脂質であって、前記第２のポリマーが標的化リガンドにコンジュゲート化されており、前記標的化リガンドが、式Ｉによる化合物：
【化12】
（式中、
Ｘは、－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨＯ－又は－Ｏ－ＣＯ－であり、
Ｙは、－ＣＨ－ＣＨ＝ＣＨ－又は
【化13】
であり、
Ａ及びＢは、独立して、Ｃ及びＮから選択され、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、独立して、－Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ及び－Ｍｅから選択され、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、独立して、－Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＯＭｅ、－ＮＯ２、－ＮＭｅ２、Ｃ１～Ｃ６アルキル又は置換若しくは非置換Ｃ４～Ｃ６アリール基から選択され、但し、Ａ及び／又はＢがＮである場合、隣接するＲ５及び／又はＲ７は－Ｈである）、又はその薬学的に許容される塩によって表される第３のリン脂質と
を含む、リポソーム組成物。
【請求項10】
前記第１のリン脂質が、水素添加大豆Ｌ－α－ホスファチジルコリン（「ＨＳＰＣ」）を含む、請求項９に記載のリポソーム組成物。
【請求項11】
前記リポソーム組成物を安定化することができる前記立体的にかさ高い賦形剤が、コレステロール（「Ｃｈｏｌ」）を含む、請求項９に記載のリポソーム組成物。
【請求項12】
第１のポリマーで誘導体化されている前記第２のリン脂質が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００）（「ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ２０００」）を含む、請求項９に記載のリポソーム組成物。
【請求項13】
前記大環状ガドリニウム系造影剤が、【化14】
を含む、請求項９に記載のリポソーム組成物。
【請求項14】
前記大環状ガドリニウム系造影剤が、第４のリン脂質にコンジュゲートされ、【化15】
又はその塩を含み、式中、変数ｘは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８のうちの１つである、請求項９に記載のリポソーム組成物。
【請求項15】
前記変数ｘが、１６である（コンジュゲート：「Ｇｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ－ＤＳＰＥ」）、請求項１４に記載のリポソーム組成物。
【請求項16】
前記標的化リガンドが、【化16】
を含む、請求項９に記載のリポソーム組成物。
【請求項17】
前記標的化リガンドが、【化17】
を含む、請求項９に記載のリポソーム組成物。
【請求項18】
前記標的化リガンドが、【化18】
を含む、請求項９に記載のリポソーム組成物。
【請求項19】
第２のポリマーで誘導体化された前記第３のリン脂質が、【化19】
又はその塩を含み、式中、変数ｎは、約７０～約９０の任意の整数であり、変数ｍは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８のうちの１つである、請求項９に記載のリポソーム組成物。
【請求項20】
前記第３のリン脂質、前記第２のポリマー及び前記標的化リガンドの前記コンジュゲートが、【化20】
を含み、
式中、ｎは７７又は７９である、請求項９に記載のリポソーム組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年２月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／９７５，２６５号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年２月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／９７５，２６５号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
パーキンソン病（「ＰＤ」）及びアルツハイマー病（「ＡＤ」）などの神経変性障害は、脳の異なる位置におけるミスフォールドタンパク質凝集体の病理学的沈着物を特徴とする。これらのミスフォールドタンパク質凝集体としては、ＰＤにおけるレビー小体（「ＬＢ」）及びレビー神経突起（「ＬＮ」）の形態のα－シヌクレイン（「α－ｓｙｎ」）凝集体並びにＡＤにおけるアミロイドβ（「Ａβ」）プラーク及び過剰リン酸化τタングルが挙げられる。ＰＤは、ＡＤに続いて２番目に一般的な神経変性疾患であり、運動緩慢、硬直、振戦、及び姿勢不安定性を含む運動症状を臨床的に特徴とする。運動症状は、黒質のドーパミン作動性ニューロンの変性によって引き起こされ、レビー病変の細胞質沈着を伴う。ＰＤの死後研究におけるα－ｓｙｎの領域分布は、レビー病変が嗅球及び下部脳幹に由来し、中枢神経系の他の領域に徐々に広がることを示唆している。高レベルのＬＢ及びＬＮが、ＰＤ関連運動症状の患者発現の前に、延髄／橋被蓋及び前嗅構造（Ｂｒａａｋステージ１及び２）で観察される。ＰＤ関連運動症状は、病状が中脳及び前脳の基底部内の黒質及び他の核に拡大した中間段階（Ｂｒａａｋステージ３及び４）でのみ現れ始める。ＰＤとは別に、ＰＤ認知症（「ＰＤＤ」）、ＬＢを伴う認知症（「ＤＬＢ」）及び多系統萎縮症（「ＭＳＡ」）を含むいくつかの他の神経変性障害（「シヌクレイノパチー」と総称される）の病因もまた、ミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体を特徴とする。
【0003】
黒質線条体変性、認知障害、及び運動機能障害を伴う剖検研究からのレビー病変の相関関係は、α－ｓｙｎ凝集体の非侵襲的検出及び定量化を可能にし得る技術が、生存個体におけるＬＢ障害の早期診断及び臨床評価のための貴重なツールであることを示唆している。早期検出は、臨床試験、疾患逆転療法の評価、及び新しい薬物候補の治療有効性の検証のための豊富な患者コホートの動員のより良い機会を提供することができる。しかし、ＬＢ障害は複数のタンパク質障害を呈することが多い。例えば、認知症を発症したＰＤ患者に焦点を当てた研究は、新皮質におけるα－ｓｙｎ蓄積とは別に、患者の約６０％において広範囲のＡβ蓄積もあることを明らかにした。また、約３％の症例がα－ｓｙｎ、Ａβと共にτ蓄積を示した。
【0004】
いくつかのＡβ陽電子放射断層撮影（「ＰＥＴ」）造影剤の最近の承認により、ＡＤ薬物臨床試験のためのコホートの充実度が大幅に改善された。また、これにより、他のタンパク質異常症（τ及びシヌクレイノパチー）のための類似の薬剤の探索が活発になった。α－ｓｙｎフィブリルに対する中程度から高い結合親和性を有する様々な分子足場（図１）が過去１０年間にわたって報告されているが、Ａβフィブリルに対するα－ｓｙｎの選択性が低いことに少なくとも部分的に起因して、臨床解釈に成功したものはない。実際、α－ｓｙｎ病態のインビボ検出のための造影剤の開発は、いくつかの課題に直面しており、その１つは、インビトロスクリーニングアッセイのためのα－ｓｙｎフィブリルに対する高い親和性及び選択性を有する多様な分子足場の欠如である。
【0005】
更に、そのような足場が磁気共鳴画像法（「ＭＲＩ」）での使用に適している場合、（ＰＥＴと比較して）アクセスの容易さ及び低コストのために結果は変化する可能性がある。高いＴ１緩和能、アミロイド標的化リポソーム－ガドリニウム（Ｇｄ）ナノ粒子造影剤（リン脂質並びにリポソーム二重層の内面及び外面にコンジュゲートした、（３＋）２－［４，７，１０－トリス（カルボキシラトメチル）－１，４，７，１０－テトラザシクロドデカ－１－イル］酢酸ガドリニウム（「ガドテラート」又は「Ｇｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ」）を含む非常に安定な大環状ガドリニウム系造影剤を含有する）により、ＡＤのトランスジェニックマウスモデルにおけるアミロイド斑のインビボＭＲＩが可能となった。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第１７／１６２，１２６号を参照されたい。
【0006】
α－ｓｙｎ沈着物のＭＲＩのための安定な標的化リポソームＧｄ造影剤が緊急に必要とされている。
【発明の概要】
【0007】
一態様では、リポソーム組成物（「ＡＤｘ－００３」）が提供され、ＡＤｘ－００３は、第１のリン脂質、リポソーム組成物を安定化することができる立体的にかさ高い賦形剤、第１のポリマーで誘導体化された第２のリン脂質、大環状ガドリニウム系造影剤、及び第２のポリマーで誘導体化された第３のリン脂質であって、第２のポリマーが標的化リガンドにコンジュゲート化されており、標的化リガンドが、式Ｉ、
（式中、Ｘは、－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨＯ－又は－Ｏ－ＣＯ－であり、Ｙは、－ＣＨ－ＣＨ＝ＣＨ－又は
であり、Ａ及びＢは、独立して、Ｃ及びＮから選択され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、独立して、－Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ及び－ＣＨ３から選択され、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、独立して、－Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－ＮＯ２、－Ｎ（ＣＨ３）２、Ｃ１～Ｃ６アルキル又は置換若しくは非置換Ｃ４～Ｃ６アリール基から選択され、但し、Ａ及び／又はＢがＮである場合、隣接するＲ５及び／又はＲ７は－Ｈである）又はその薬学的に許容される塩によって表される、第３のリン脂質を含む。
【化1】
（式中、Ｘは、－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨＯ－又は－Ｏ－ＣＯ－であり、Ｙは、－ＣＨ－ＣＨ＝ＣＨ－又は
【化2】
であり、Ａ及びＢは、独立して、Ｃ及びＮから選択され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、独立して、－Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ及び－ＣＨ３から選択され、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、独立して、－Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－ＮＯ２、－Ｎ（ＣＨ３）２、Ｃ１～Ｃ６アルキル又は置換若しくは非置換Ｃ４～Ｃ６アリール基から選択され、但し、Ａ及び／又はＢがＮである場合、隣接するＲ５及び／又はＲ７は－Ｈである）又はその薬学的に許容される塩によって表される、第３のリン脂質を含む。
【0008】
更なる態様では、第１のリン脂質は、水素添加大豆Ｌ－α－ホスファチジルコリン（「ＨＳＰＣ」）を含み、リポソーム組成物を安定化することができる立体的にかさ高い賦形剤は、コレステロール（「Ｃｈｏｌ」）を含み、第１のポリマーで誘導体化された第２のリン脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００）（「ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ２０００」）を含み、大環状ガドリニウム系造影剤は、Ｇｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡを含み、第４のリン脂質、例えば、
又はその塩（例えば、ナトリウム塩）にコンジュゲートされる。いくつかの態様では、変数ｘは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８のうちの１つであってもよい。一態様では、変数ｘは、１６である（コンジュゲート：「Ｇｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ－ＤＳＰＥ」）。
【化3】
又はその塩（例えば、ナトリウム塩）にコンジュゲートされる。いくつかの態様では、変数ｘは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８のうちの１つであってもよい。一態様では、変数ｘは、１６である（コンジュゲート：「Ｇｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ－ＤＳＰＥ」）。
【0009】
いくつかの態様では、第２のポリマーで誘導体化され、第２のポリマーが標的化リガンドにコンジュゲートされている第３のリン脂質は、
又はその塩（例えば、リン酸アンモニウム塩）を含むことができる。いくつかの態様では、変数ｎは、約１０～約１００の任意の整数、例えば、約６０～約１００、約７０～約９０、約７５～約８５、約７７、又は約７９であってもよい。変数ｍは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８のうちの１つであってもよい。例えば、ｎは７７であってもよく、ｍは１４であってもよく、ｎは７９であってもよく、ｍは１４であってもよく、ｎは７７であってもよく、ｍは１６であってもよく、ｎは７９であってもよく、ｍは１６であってもよい。
【化4】
又はその塩（例えば、リン酸アンモニウム塩）を含むことができる。いくつかの態様では、変数ｎは、約１０～約１００の任意の整数、例えば、約６０～約１００、約７０～約９０、約７５～約８５、約７７、又は約７９であってもよい。変数ｍは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８のうちの１つであってもよい。例えば、ｎは７７であってもよく、ｍは１４であってもよく、ｎは７９であってもよく、ｍは１４であってもよく、ｎは７７であってもよく、ｍは１６であってもよく、ｎは７９であってもよく、ｍは１６であってもよい。
【0010】
一態様では、リン脂質－ポリマー－標的化リガンドコンジュゲートの標的化リガンド態様は、
を含む。
【化5】
を含む。
【0011】
一態様では、ｎは７７であり、ｍは１６であり（「ＤＳＰＥ－ＰＥＧ３４００」）、リン脂質－ポリマー－標的化リガンドコンジュゲートは、
を含む（「ＤＳＰＥ－ＰＥＧ３４００－ＸＷ－０１－１１コンジュゲート」）。
【化6】
を含む（「ＤＳＰＥ－ＰＥＧ３４００－ＸＷ－０１－１１コンジュゲート」）。
【0012】
或いは、ｎは７９であり、ｍは１６であり（「ＤＳＰＥ－ＰＥＧ３５００」）、リン脂質－ポリマー－標的化リガンドコンジュゲートは、
を含む（「ＤＳＰＥ－ＰＥＧ３５００－ＸＷ－０１－１１コンジュゲート」）。
【化7】
を含む（「ＤＳＰＥ－ＰＥＧ３５００－ＸＷ－０１－１１コンジュゲート」）。
【0013】
一態様では、対象のα－ｓｙｎ沈着物を画像化する方法が提供される。この方法は、検出可能な量のリポソーム組成物を対象に導入することを含むことができる。この方法は、リポソーム組成物が１つ又は複数のα－ｓｙｎ沈着物と会合するのに十分な時間を与えることを含むことができる。この方法は、１つ又は複数のα－ｓｙｎ沈着物と会合したリポソーム組成物を検出することを含むことができる。
【0014】
一態様では、対象におけるα－ｓｙｎ沈着物を画像化する方法のリポソーム組成物は、ＡＤｘ－００３を含むことができる。一態様では、対象におけるα－ｓｙｎ沈着物を画像化する方法のリポソーム組成物は、Ｇｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ－ＤＳＰＥ及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ３４００－ＸＷ－０１－１１コンジュゲート又はＤＳＰＥ－ＰＥＧ３５００－ＸＷ－０１－１１コンジュゲートを含むことができる。一態様では、対象におけるα－ｓｙｎ沈着物を画像化する方法のリポソーム組成物は、ＨＳＰＣ、Ｃｈｏｌ、ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ２０００、Ｇｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ－ＤＳＰＥ、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ３４００－ＸＷ－０１－１１コンジュゲート又はＤＳＰＥ－ＰＥＧ３５００－ＸＷ－０１－１１コンジュゲートを含むことができる。
【0015】
一態様では、リポソーム組成物は、患者のα－ｓｙｎ沈着物の画像化における使用に適しており、この使用は、検出可能な量のリポソーム組成物を患者に導入すること、リポソーム組成物が１つ又は複数のα－ｓｙｎ沈着物と会合するために十分な時間を与えること、及び１つ又は複数のα－ｓｙｎ沈着物と会合したリポソーム組成物を検出することを含む。一態様では、検出することは、ＭＲＩを使用して検出することを含む。
【0016】
一態様では、この使用は、１つ又は複数のα－ｓｙｎ沈着物と会合したリポソーム組成物を検出することによって、患者をＰＤを有すると同定することを更に含む。
【0017】
一態様では、リン脂質－ポリマー－標的化リガンドコンジュゲートが提供され、リン脂質－ポリマー－標的化リガンドコンジュゲートのリン脂質－ポリマー態様は、
又はその塩（例えば、リン酸アンモニウム塩）を含む。いくつかの態様では、変数ｎは、約１０～約１００の任意の整数、例えば、約６０～約１００、約７０～約９０、約７５～約８５、約７７、又は約７９であってもよい。変数ｍは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８のうちの１つであってもよい。例えば、ｎは７７であってもよく、ｍは１４であってもよく、ｎは７９であってもよく、ｍは１４であってもよく、ｎは７７であってもよく、ｍは１６であってもよく、ｎは７９であってもよく、ｍは１６であってもよい。
【化8】
又はその塩（例えば、リン酸アンモニウム塩）を含む。いくつかの態様では、変数ｎは、約１０～約１００の任意の整数、例えば、約６０～約１００、約７０～約９０、約７５～約８５、約７７、又は約７９であってもよい。変数ｍは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８のうちの１つであってもよい。例えば、ｎは７７であってもよく、ｍは１４であってもよく、ｎは７９であってもよく、ｍは１４であってもよく、ｎは７７であってもよく、ｍは１６であってもよく、ｎは７９であってもよく、ｍは１６であってもよい。
【0018】
一態様では、リン脂質－ポリマー－標的化リガンドコンジュゲートの標的化リガンド態様は、
（式中、Ｘは、－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨＯ－又は－Ｏ－ＣＯ－であり、Ｙは、－ＣＨ－ＣＨ＝ＣＨ－又は
であり、Ａ及びＢは、独立して、Ｃ及びＮから選択され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、独立して、－Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ及び－ＣＨ３から選択され、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、独立して、－Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－ＮＯ２、－Ｎ（ＣＨ３）２、Ｃ１～Ｃ６アルキル又は置換若しくは非置換Ｃ４～Ｃ６アリール基から選択され、但し、Ａ及び／又はＢがＮである場合、隣接するＲ５及び／又はＲ７は－Ｈである）又はその薬学的に許容される塩によって表される。
【化9】
（式中、Ｘは、－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨＯ－又は－Ｏ－ＣＯ－であり、Ｙは、－ＣＨ－ＣＨ＝ＣＨ－又は
【化10】
であり、Ａ及びＢは、独立して、Ｃ及びＮから選択され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、独立して、－Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ及び－ＣＨ３から選択され、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、独立して、－Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－ＮＯ２、－Ｎ（ＣＨ３）２、Ｃ１～Ｃ６アルキル又は置換若しくは非置換Ｃ４～Ｃ６アリール基から選択され、但し、Ａ及び／又はＢがＮである場合、隣接するＲ５及び／又はＲ７は－Ｈである）又はその薬学的に許容される塩によって表される。
【0019】
一態様では、リン脂質－ポリマー－標的化リガンドコンジュゲートは、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ３４００－ＸＷ－０１－１１コンジュゲート又はＤＳＰＥ－ＰＥＧ３５００－ＸＷ－０１－１１コンジュゲートを含む。
【0020】
一態様では、
（式中、Ｘは、－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨＯ－又は－Ｏ－ＣＯ－であり、Ｙは、－ＣＨ－ＣＨ＝ＣＨ－又は
であり、Ａ及びＢは、独立して、Ｃ及びＮから選択され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、独立して、－Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ及び－ＣＨ３から選択され、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、独立して、－Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－ＮＯ２、－Ｎ（ＣＨ３）２、Ｃ１～Ｃ６アルキル又は置換若しくは非置換Ｃ４～Ｃ６アリール基から選択され、但し、Ａ及び／又はＢがＮである場合、隣接するＲ５及び／又はＲ７は－Ｈである）を含む化合物、又はその薬学的に許容される塩が提供される。
【化11】
（式中、Ｘは、－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨＯ－又は－Ｏ－ＣＯ－であり、Ｙは、－ＣＨ－ＣＨ＝ＣＨ－又は
【化12】
であり、Ａ及びＢは、独立して、Ｃ及びＮから選択され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、独立して、－Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ及び－ＣＨ３から選択され、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、独立して、－Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－ＮＯ２、－Ｎ（ＣＨ３）２、Ｃ１～Ｃ６アルキル又は置換若しくは非置換Ｃ４～Ｃ６アリール基から選択され、但し、Ａ及び／又はＢがＮである場合、隣接するＲ５及び／又はＲ７は－Ｈである）を含む化合物、又はその薬学的に許容される塩が提供される。
【0021】
一態様では、化合物は、構造
を有する。
【化13】
を有する。
【0022】
別の態様では、α－ｓｙｎ凝集体を検出する方法が提供される。この方法は、
（式中、Ｘは、－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨＯ－又は－Ｏ－ＣＯ－であり、Ｙは、－ＣＨ－ＣＨ＝ＣＨ－又は
であり、Ａ及びＢは、独立して、Ｃ及びＮから選択され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、独立して、－Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ及び－ＣＨ３から選択され、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、独立して、－Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－ＮＯ２、－Ｎ（ＣＨ３）２、Ｃ１～Ｃ６アルキル又は置換若しくは非置換Ｃ４～Ｃ６アリール基から選択され、但し、Ａ及び／又はＢがＮである場合、隣接するＲ５及び／又はＲ７は－Ｈである）を含む化合物、又はその薬学的に許容される塩の有効量を試料又は対象に導入すること、化合物が試料又は対象中のα－ｓｙｎ凝集体と会合するのに十分な時間を与えること、及び試料又は対象中のα－ｓｙｎ凝集体と会合した化合物を検出することを含む。
【化14】
（式中、Ｘは、－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨＯ－又は－Ｏ－ＣＯ－であり、Ｙは、－ＣＨ－ＣＨ＝ＣＨ－又は
【化15】
であり、Ａ及びＢは、独立して、Ｃ及びＮから選択され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、独立して、－Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ及び－ＣＨ３から選択され、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、独立して、－Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－ＮＯ２、－Ｎ（ＣＨ３）２、Ｃ１～Ｃ６アルキル又は置換若しくは非置換Ｃ４～Ｃ６アリール基から選択され、但し、Ａ及び／又はＢがＮである場合、隣接するＲ５及び／又はＲ７は－Ｈである）を含む化合物、又はその薬学的に許容される塩の有効量を試料又は対象に導入すること、化合物が試料又は対象中のα－ｓｙｎ凝集体と会合するのに十分な時間を与えること、及び試料又は対象中のα－ｓｙｎ凝集体と会合した化合物を検出することを含む。
【0023】
本発明は、以下の図を参照することによってより容易に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】α－ｓｙｎ凝集体結合リガンドの先行技術の代表例の化学構造を提供する図である。
【0025】
【図2】α－ｓｙｎ沈着物のＭＲＩのための標的造影剤を含むリポソームの例示的な断面図を提供する図である。
【0026】
【図3】１－インダノニル－、１，３－インダンジオニル－、α－テトラロニル－、及び４－オキソクマリニル－ジエン誘導体を含む新規なα－ｓｙｎ配位子の化学構造を提供する図である。
【0027】
【図4】新規なα－ｓｙｎ配位子の分子設計の概略図を提供する図である。
【0028】
【図5】１－インダノニル－、１，３－インダンジオニル－、α－テトラロニル－、及び４－オキソクマリニル－ジエン誘導体を含む新規なα－ｓｙｎ配位子の合成式を提供する図である。
【0029】
【図6】ジエン誘導体のＥ，Ｅ配置における核オーバーハウザー効果（「ＮＯＥ」）の概略図を提供する図である。
【0030】
【図7】１－インダノニル－及び１，３－インダンジオニル－ジエン誘導体を含む新規なα－ｓｙｎ配位子の合成式を提供する図である。
【0031】
【図8】チオフェンがジエン架橋に挿入された１－インダノニル－及び１，３－インダンジオニル－ジエン誘導体を含む新規なα－ｓｙｎ配位子の化学構造を提供する図である。
【0032】
【図9】化合物３６、４５及び４８におけるＮＯＥ相互作用の概略図を提供する図である。
【0033】
【図10】化合物内の剛性を高めるために架橋ジエンの二重結合の一方が環系内でマスクされている種々の誘導体の合成式を提供する図である。
【0034】
【図11】架橋ジエンの第二の二重結合がマスクされた種々の誘導体を含む、新規なα－ｓｙｎ配位子の化学構造を提供する図である。
【0035】
【図12】新規なα－ｓｙｎリガンドの発光スペクトル及び結合親和性（Ｋｄ）データの表（表１）を示す。
【0036】
【図13】リガンド８（ＸＷ－０１－１１）及び３２（ＸＷ－０１－６４）を使用した、遊離リガンド対α－ｓｙｎ又はＡβフィブリルに結合したリガンドの代表的な吸収／発光スペクトルを示す図である。
【0037】
【図14】新規なα－ｓｙｎ配位子によるフィブリル結合時の、観察された蛍光及び発光最大値の深色シフト、蛍光の増加、並びに蛍光量子収率の表（表２）を示す。
【0038】
【図15】α－ｓｙｎフィブリルと比較した、Ａβフィブリルに対する新規なα－ｓｙｎリガンドの解離定数を比較した表（表３）を示す。
【0039】
【図16】抗α－ｓｙｎ抗体並びにリガンド８（ＸＷ－０１－１１）及び３２（ＸＷ－０１－６４）で共染色したＰＤ脳組織切片の共焦点顕微鏡画像を示す図である。
【0040】
【図17】抗α－ｓｙｎ抗体及びリガンド８（ＸＷ－０１－１１）で共染色したＰＤ脳組織切片の共焦点顕微鏡画像を示す図である。
【0041】
【図18】リガンド８（ＸＷ－０１－１１）及びそれぞれの抗α－ｓｙｎ対抗Ａβ抗体で共染色したＰＤ及びＡＤ脳組織切片の比較共焦点顕微鏡画像を示す図である。
【0042】
【図19】ＤＳＰＥ－ＰＥＧ３４００－ＸＷ－０１－１１コンジュゲートを調製するための例示的な合成スキームを示す図である。
【0043】
【図20】α－ｓｙｎフィブリルとインキュベートした場合のリガンド８（ＸＷ－０１－１１）標識リポソームナノ粒子対対照リポソームの動的光散乱（「ＤＬＳ」）グラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【0044】
新規なα－ｓｙｎ標的化リポソーム－Ｇｄ造影剤ＡＤｘ－００３が、非常に安定な大環状Ｇｄ－ＤＯＴＡ画像化部分に基づいて開発された。ＡＤｘ－００３は、図２に断面形態で示されているように一般的に理解することができる。
【0045】
したがって、一態様では、ＡＤｘ－００３は、第１のリン脂質、リポソーム組成物を安定化することができる立体的にかさ高い賦形剤、第１のポリマーで誘導体化された第２のリン脂質、大環状ガドリニウム系造影剤、及び第２のポリマーで誘導体化された第３のリン脂質であって、第２のポリマーが標的化リガンドにコンジュゲートされている、第３のリン脂質を含む。大環状ガドリニウム系造影剤は、第４のリン脂質にコンジュゲートされてもよい。
【0046】
リン脂質
いくつかの態様では、適切なリン脂質としては、２つの炭化水素鎖が約１４～約２４個の炭素原子の長さであり、様々な不飽和度を有するものが挙げられる。いくつかの態様では、適切なリン脂質としては、ＨＳＰＣ、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（「ＤＰＰＣ」）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（「ＤＳＰＣ」）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（「ＤＳＰＥ」）、及びそれらの２つ以上の混合物が挙げられる。適切なリン脂質は、天然に存在するものであってもよく、又は合成のものであってもよい。
いくつかの態様では、適切なリン脂質としては、２つの炭化水素鎖が約１４～約２４個の炭素原子の長さであり、様々な不飽和度を有するものが挙げられる。いくつかの態様では、適切なリン脂質としては、ＨＳＰＣ、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（「ＤＰＰＣ」）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（「ＤＳＰＣ」）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（「ＤＳＰＥ」）、及びそれらの２つ以上の混合物が挙げられる。適切なリン脂質は、天然に存在するものであってもよく、又は合成のものであってもよい。
【0047】
いくつかの態様では、適切なリン脂質としては、国際公開第２００５１０７８２０号に列挙されているもののいずれかを挙げることができ、その段落［００３１］～［００３３］の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0048】
ポリマー－誘導体化リン脂質
いくつかの態様では、リポソーム組成物のリポソームは、可撓性の水溶性（親水性）ポリマー鎖を含有するか、又は可撓性の水溶性（親水性）ポリマー鎖でコーティングされた表面を含むことができる。これらのポリマー鎖は、リポソームと血漿成分との間の相互作用を防止することができ、血漿成分は、血液の細胞によるリポソームの取り込み及び血液からのリポソームの除去において役割を果たす。リポソームは、単核食細胞系の器官、主に肝臓及び脾臓（細網内皮系）による取り込みを回避することができる。
いくつかの態様では、リポソーム組成物のリポソームは、可撓性の水溶性（親水性）ポリマー鎖を含有するか、又は可撓性の水溶性（親水性）ポリマー鎖でコーティングされた表面を含むことができる。これらのポリマー鎖は、リポソームと血漿成分との間の相互作用を防止することができ、血漿成分は、血液の細胞によるリポソームの取り込み及び血液からのリポソームの除去において役割を果たす。リポソームは、単核食細胞系の器官、主に肝臓及び脾臓（細網内皮系）による取り込みを回避することができる。
【0049】
一態様では、誘導体化リン脂質中のポリマーは、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）であってもよい。ＰＥＧは、様々な分子量のいずれかを有することができる。一例では、ＰＥＧ鎖は、約１，０００～１０，０００ダルトンの分子量を有することができる。リポソームが形成されると、ＰＥＧ鎖は、そのようなコーティングの非存在と比較して、リポソームの血液循環時間を延長するのに十分な親水性鎖の表面コーティングを提供することができる。
【0050】
いくつかの態様では、第１のポリマーで誘導体化された第２のリン脂質は、ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ２０００を含む。いくつかの態様では、第２のポリマーで誘導体化され、第２のポリマーが標的化リガンドにコンジュゲートされている第３のリン脂質は、
又はその塩（例えば、リン酸アンモニウム塩）を含み、式中、変数ｎは、約１０～約１００の任意の整数、例えば、約６０～約１００、約７０～約９０、約７５～約８５、約７７、又は約７９であってもよい。変数ｍは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８のうちの１つであってもよい。例えば、ｎは７７であってもよく、ｍは１４であってもよく、ｎは７９であってもよく、ｍは１４であってもよく、ｎは７７であってもよく、ｍは１６であってもよく、ｎは７９であってもよく、ｍは１６であってもよい。いくつかの態様では、第２のポリマーで誘導体化された第３のリン脂質は、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ３４００又はＤＳＰＥ－ＰＥＧ３５００を含む。
【化16】
又はその塩（例えば、リン酸アンモニウム塩）を含み、式中、変数ｎは、約１０～約１００の任意の整数、例えば、約６０～約１００、約７０～約９０、約７５～約８５、約７７、又は約７９であってもよい。変数ｍは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８のうちの１つであってもよい。例えば、ｎは７７であってもよく、ｍは１４であってもよく、ｎは７９であってもよく、ｍは１４であってもよく、ｎは７７であってもよく、ｍは１６であってもよく、ｎは７９であってもよく、ｍは１６であってもよい。いくつかの態様では、第２のポリマーで誘導体化された第３のリン脂質は、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ３４００又はＤＳＰＥ－ＰＥＧ３５００を含む。
【0051】
いくつかの態様では、適切なポリマーとしては、国際公開第２００５１０７８２０号に列挙されているもののいずれかを挙げることができ、その段落［００３４］～［００３８］の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの態様では、ポリマーによって誘導体化されたリン脂質は、国際公開第２０１６０５７８１２号及び米国特許出願第１７／１６２，１２６号に開示されている組み合わせのいずれかであってもよく、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0052】
立体的にかさ高い賦形剤
いくつかの態様では、リポソームは、安定化賦形剤を含むことができる。例えば、リポソーム組成物は、Ｃｈｏｌを含むように製剤化することができる。他の態様では、リポソーム組成物は、脂肪アルコール、脂肪酸、コレステロールエステル、他の薬学的に許容される賦形剤、及びそれらの混合物を含むことができる。
いくつかの態様では、リポソームは、安定化賦形剤を含むことができる。例えば、リポソーム組成物は、Ｃｈｏｌを含むように製剤化することができる。他の態様では、リポソーム組成物は、脂肪アルコール、脂肪酸、コレステロールエステル、他の薬学的に許容される賦形剤、及びそれらの混合物を含むことができる。
【0053】
大環状ガドリニウム系造影剤
リポソーム組成物は、大環状Ｇｄ系造影剤を含む。いくつかの態様では、大環状ガドリニウム系造影剤は、リン脂質にコンジュゲートされたＧｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ、例えば、
又はその塩（例えば、ナトリウム塩）を含む。いくつかの態様では、変数ｘは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８のうちの１つであってもよい。一態様では、変数ｘは１６であり、コンジュゲートはＧｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ－ＤＳＰＥである。Ｇｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ－ＤＳＰＥの調製は、米国特許出願第１７／１６２，１２６号に記載されている。
リポソーム組成物は、大環状Ｇｄ系造影剤を含む。いくつかの態様では、大環状ガドリニウム系造影剤は、リン脂質にコンジュゲートされたＧｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ、例えば、
【化17】
又はその塩（例えば、ナトリウム塩）を含む。いくつかの態様では、変数ｘは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８のうちの１つであってもよい。一態様では、変数ｘは１６であり、コンジュゲートはＧｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ－ＤＳＰＥである。Ｇｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ－ＤＳＰＥの調製は、米国特許出願第１７／１６２，１２６号に記載されている。
【0054】
他の態様では、大環状ガドリニウム系造影剤は、
を含む。
【化18】
を含む。
【0055】
リン脂質－ポリマー－標的化リガンドコンジュゲート
本発明の別の態様は、式ＩＩ：
ＰＬ－ＡＬ－ＨＰ－Ｘ－ＴＬ
ＩＩ
による構造を有するリン脂質－ポリマー－標的化リガンドコンジュゲートを提供する。
本発明の別の態様は、式ＩＩ：
ＰＬ－ＡＬ－ＨＰ－Ｘ－ＴＬ
ＩＩ
による構造を有するリン脂質－ポリマー－標的化リガンドコンジュゲートを提供する。
【0056】
式中、ＰＬはリン脂質であり、ＡＬは脂肪族結合であり、ＨＰは親水性ポリマーであり、Ｘは、結合、－Ｏ－、－ＲｉＯ－、－ＲｉＯ（Ｃ＝Ｏ）、Ｒｉ－Ｎ（Ｒｉｉ）Ｏ（Ｃ＝Ｏ）、Ｒｉ－Ｎ（Ｒｉｉ）（Ｃ＝Ｏ）－、又はＲｉ－Ｎ（Ｒｉｉ）であり、ＴＬは式Ｉによる構造を有する標的化リガンドである。
【0057】
リン脂質－ポリマー－標的化リガンドコンジュゲートは、リポソーム中に存在するものなどの膜へのコンジュゲートの組み込みを容易にするリン脂質－ポリマー領域を含む。リン脂質は、その構造が当業者に公知である両親媒性化合物である。いくつかの態様では、リン脂質－ポリマー－標的化リガンドコンジュゲート中のリン脂質（ＰＬ）は、以下の構造式
によって表される。
【化19】
によって表される。
【0058】
式は、リン脂質中に一般的に存在する親水性リン酸基及び２つの疎水性脂肪酸鎖を示す。変数ｓは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８のうちの１つであってもよい。例えば、ｓは、１４又は１６であってもよい。様々な態様では、リン脂質－ポリマー－標的化リガンドコンジュゲート中のリン脂質基は、ＨＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＥ、ＤＳＰＣ、又はＤＰＰＥのうちの１つであってもよい。適切なリン脂質及びポリマー誘導体化リン脂質としてはまた、本明細書に別途開示されるものを挙げることができる。
【0059】
コンジュゲートはまた、親水性ポリマー（ＨＰ）を含む。親水性ポリマーは、それらを水に可溶性にする極性又は荷電官能基を含有するポリマーである。親水性ポリマーの例としては、ポリアクリルアミド、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、及びポリアルキレンオキシドが挙げられる。いくつかの態様では、親水性ポリマーは、ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーである。親水性ポリ（アルキレンオキシド）は、約１０～約１００個の繰り返し単位を含むことができ、例えば、５００～１０，０００ダルトンの範囲の分子量を有することができる。親水性のポリ（アルキレンオキシド）としては、例えば、ＰＥＧ、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（プロピレンオキシド）などが挙げられる。親水性ポリマーＨＰは、本明細書中に記載されるように、アミド基又はカルバマート基を介してリン脂質部分にコンジュゲートすることができる。リン脂質－ポリマー－標的化リガンドコンジュゲート中のＨＰは、アミド、カルバマート、ポリ（アルキレンオキシド）、トリアゾール、それらの組み合わせなどを介して芳香族部分にコンジュゲートすることができる。
【0060】
いくつかの態様では、親水性ポリマー（ＨＰ）は、以下の構造式
のうちの１つによって表される。
【化20】
のうちの１つによって表される。
【0061】
いくつかの態様では、変数ｒは、約１０～約１００の任意の整数、例えば、約６０～約１００、約７０～約９０、約７５～約８５、約７７、又は約７９であってもよい。
【0062】
いくつかの態様では、リン脂質－ポリマー－標的化リガンドコンジュゲート中のリン脂質－ポリマー部分ＰＬ－ＨＰ－は、以下の構造式
のうちの１つによって表すことができる。
【化21】
のうちの１つによって表すことができる。
【0063】
いくつかの態様では、変数ｒは、約１０～約１００の任意の整数、例えば、約６０～約１００、約７０～約９０、約７５～約８５、約７７、又は約７９であってもよい。変数ｓは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８のうちの１つであってもよい。例えば、ｒは７７であってもよく、ｓは１４であってもよく、ｒは７９であってもよく、ｓは１４であってもよく、ｒは７７であってもよく、ｓは１６であってもよく、ｒは７９であってもよく、ｓは１６であってもよい。
【0064】
本明細書で使用される場合、ＡＬによって表される「脂肪族結合」は、リン脂質ＰＬと親水性ポリマーＨＰとの間の結合に有用な任意の脂肪族基を含む。そのような脂肪族結合は、例えば、アミド、カルバマートなどの１つ又は複数の部分を介したヘテロ原子を含むことができるＣ２～Ｃ１０アルキレン基を含むことができる。例えば、以下のコンジュゲート
では、脂肪族結合ＡＬである－ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２Ｏ－は、アミド部分を含む。更に、例えば、以下のコンジュゲート
では、脂肪族結合ＡＬである－ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－は、カルバマート部分を含む。ＡＬは、コハク酸などのジカルボン酸から誘導される脂肪族結合を含むことができ、２つのアミド、２つのカルバマート、アミド及びカルバマートなどを含むことができる。
【化22】
では、脂肪族結合ＡＬである－ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２Ｏ－は、アミド部分を含む。更に、例えば、以下のコンジュゲート
【化23】
では、脂肪族結合ＡＬである－ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－は、カルバマート部分を含む。ＡＬは、コハク酸などのジカルボン酸から誘導される脂肪族結合を含むことができ、２つのアミド、２つのカルバマート、アミド及びカルバマートなどを含むことができる。
【0065】
そのような脂肪族結合は、リン脂質と親水性ポリマーとを結合させるために当該分野で公知であり、例えば、リン脂質－ＰＥＧ化合物及び官能化リン脂質－ＰＥＧコンジュゲーション前駆体の市販の供給源に見出すことができ、これはＰＬ－ＡＬ－ＰＥＧ－ＮＨ２、ＰＬ－ＡＬ－ＰＥＧ－ＣＯ２Ｈなどとして表すことができる。脂肪族結合の存在が暗示される場合、脂肪族結合に言及せずにそのような化合物を簡略化した形で呼ぶことは、当技術分野及び商業的供給源において一般的である。例えば、脂肪族連結基がアミド含有基－ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２Ｏ－である１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］ＣＡＳ番号１４７８６７－６５－０は、当技術分野で通称、商業的に「ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ－２０００」と呼ばれる。「ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ－２０００」などの従来の簡略化された様式で本明細書に列挙される市販の材料は、対応する脂肪族結合を含むと理解されるべきである。
【0066】
したがって、様々な態様では、ＡＬによって表される脂肪族リンカーは、カルバマート又はアミドを含むことができる。本明細書に記載されるリポソーム、方法及びコンジュゲートは、ＡＬがカルバマート、アミド又はそのようなコンジュゲートの混合物を含むリン脂質－ポリマー－標的化リガンドコンジュゲートを含むことができる。
【0067】
特定の一態様では、リン脂質－ポリマー－標的化リガンドコンジュゲートが提供され、リン脂質－ポリマー－標的化リガンドコンジュゲートのリン脂質－ポリマー態様は、
又はその塩（例えば、リン酸アンモニウム塩）を含む。いくつかの態様では、変数ｎは、約１０～約１００の任意の整数、例えば、約６０～約１００、約７０～約９０、約７５～約８５、約７７、又は約７９であってもよい。変数ｍは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８のうちの１つであってもよい。例えば、ｎは７７であってもよく、ｍは１４であってもよく、ｎは７９であってもよく、ｍは１４であってもよく、ｎは７７であってもよく、ｍは１６であってもよく、ｎは７９であってもよく、ｍは１６であってもよい。いくつかの態様では、リン脂質－ポリマー－標的化リガンドコンジュゲートのリン脂質－ポリマー態様は、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ３４００又はＤＳＰＥ－ＰＥＧ３５００を含む。
【化24】
又はその塩（例えば、リン酸アンモニウム塩）を含む。いくつかの態様では、変数ｎは、約１０～約１００の任意の整数、例えば、約６０～約１００、約７０～約９０、約７５～約８５、約７７、又は約７９であってもよい。変数ｍは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８のうちの１つであってもよい。例えば、ｎは７７であってもよく、ｍは１４であってもよく、ｎは７９であってもよく、ｍは１４であってもよく、ｎは７７であってもよく、ｍは１６であってもよく、ｎは７９であってもよく、ｍは１６であってもよい。いくつかの態様では、リン脂質－ポリマー－標的化リガンドコンジュゲートのリン脂質－ポリマー態様は、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ３４００又はＤＳＰＥ－ＰＥＧ３５００を含む。
【0068】
式ＩＩのリン脂質－ポリマー－標的化リガンドコンジュゲートはまた、以下で論じられる標的化リガンド（ＴＬ）を含む。
【0069】
標的化リガンド
リポソーム組成物は、ポリマーで誘導体化された少なくとも１つのリン脂質を含み、ポリマーは標的化リガンドにコンジュゲートされている。したがって、いくつかの態様では、リン脂質は、スペーサー鎖を含むように修飾される。スペーサー鎖は、親水性ポリマーであってもよい。親水性ポリマーは、典型的には、標的化リガンドにカップリングするために末端官能化されていてもよい。官能化された末端基は、例えば、マレイミド基、ブロモアセトアミド基、ジスルフィド基、活性化エステル又はアルデヒド基であってもよい。ヒドラジド基は、多くの生物学的に関連する化合物で生成することができるアルデヒドに対して反応性である。ヒドラジドはまた、活性エステル又はカルボジイミド活性化カルボキシル基によってアシル化することができる。アシル化種として反応性のアシルアジド基は、ヒドラジドから容易に得ることができ、アミノ含有リガンドの結合を可能にする。
リポソーム組成物は、ポリマーで誘導体化された少なくとも１つのリン脂質を含み、ポリマーは標的化リガンドにコンジュゲートされている。したがって、いくつかの態様では、リン脂質は、スペーサー鎖を含むように修飾される。スペーサー鎖は、親水性ポリマーであってもよい。親水性ポリマーは、典型的には、標的化リガンドにカップリングするために末端官能化されていてもよい。官能化された末端基は、例えば、マレイミド基、ブロモアセトアミド基、ジスルフィド基、活性化エステル又はアルデヒド基であってもよい。ヒドラジド基は、多くの生物学的に関連する化合物で生成することができるアルデヒドに対して反応性である。ヒドラジドはまた、活性エステル又はカルボジイミド活性化カルボキシル基によってアシル化することができる。アシル化種として反応性のアシルアジド基は、ヒドラジドから容易に得ることができ、アミノ含有リガンドの結合を可能にする。
【0070】
いくつかの態様では、標的化リガンドは、リポソームの表面からアクセス可能であってもよく、例えば、１つ又は複数の分子又は抗原に特異的に結合又は付着することができる。これらの標的化リガンドは、リポソームを特定の細胞又は組織、例えばα－ｓｙｎプラークに指向又は標的化することができ、細胞又は組織上の若しくは細胞又は組織と会合した分子又は抗原に結合することができる。
【0071】
一態様では、式（Ｉ）による化合物であって、
式中、Ｘは、－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨＯ－又は－Ｏ－ＣＯ－であり、Ｙは、－ＣＨ－ＣＨ＝ＣＨ－又は
であり、Ａ及びＢは、独立して、Ｃ及びＮから選択され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、独立して、－Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ及び－ＣＨ３から選択され、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、独立して、－Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－ＮＯ２、－Ｎ（ＣＨ３）２、Ｃ１～Ｃ６アルキル又は置換若しくは非置換Ｃ４～Ｃ６アリール基から選択され、但し、Ａ及び／又はＢがＮである場合、隣接するＲ５及び／又はＲ７は－Ｈである化合物、又はその薬学的に許容される塩が提供される。式Ｉの化合物は、本明細書では「標的化リガンド」及び「結合リガンド」と互換的に呼ばれることがある。標的化リガンドは、α－ｓｙｎ、特にミスフォールドα－ｓｙｎ、例えば沈着物（本明細書ではプラークとも呼ばれる）又はフィブリルに見られるものに対する高い親和性結合を示す。
【化25】
式中、Ｘは、－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨＯ－又は－Ｏ－ＣＯ－であり、Ｙは、－ＣＨ－ＣＨ＝ＣＨ－又は
【化26】
であり、Ａ及びＢは、独立して、Ｃ及びＮから選択され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、独立して、－Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ及び－ＣＨ３から選択され、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、独立して、－Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－ＮＯ２、－Ｎ（ＣＨ３）２、Ｃ１～Ｃ６アルキル又は置換若しくは非置換Ｃ４～Ｃ６アリール基から選択され、但し、Ａ及び／又はＢがＮである場合、隣接するＲ５及び／又はＲ７は－Ｈである化合物、又はその薬学的に許容される塩が提供される。式Ｉの化合物は、本明細書では「標的化リガンド」及び「結合リガンド」と互換的に呼ばれることがある。標的化リガンドは、α－ｓｙｎ、特にミスフォールドα－ｓｙｎ、例えば沈着物（本明細書ではプラークとも呼ばれる）又はフィブリルに見られるものに対する高い親和性結合を示す。
【0072】
式Ｉに含まれる化合物は、位置Ｘで変化して、異なる複素環式化合物を提供することができる。いくつかの態様では、Ｘは、１－インダノン複素環基を提供する－ＣＨ２－である。いくつかの態様では、Ｘは、テトラロン複素環基を提供する－ＣＨ２－ＣＨ２－である。いくつかの態様では、Ｘは、１，３－インダンジオン複素環基を提供する－ＣＨＯ－である。いくつかの態様では、Ｘは、４－ヒドロキシクマリン複素環基を提供する－Ｏ－ＣＯ－である。この複素環基は、本明細書では「第１の芳香族基」と呼ばれることがある。
【0073】
式Ｉに含まれる化合物は、位置Ｙで異なり、異なるジエンを提供することができる。したがって、一態様では、Ｙは、－ＣＨ－ＣＨ＝ＣＨ－であり、ジエン架橋が提供される。一態様では、ジエン架橋は、Ｅ，Ｅ配置を有する。他の態様では、Ｙは
であり、それによって電子リッチなチオフェン基の形態のジエンを実現する。
【化27】
であり、それによって電子リッチなチオフェン基の形態のジエンを実現する。
【0074】
いくつかの態様では、化合物の第２の（右端の）芳香族基を修飾することができる。環内の修飾は、第２の芳香族基としてピリジンを提供するために、Ａ又はＢ位のメチルダインを窒素原子で置換することを含むことができ、又は、それは、第２の芳香族基としてピリミジンを提供するために、位置Ａ及びＢのメチルダインを窒素原子で置換することを含むことができる。位置Ａ、Ｂ、又はその両方が窒素で置換されている場合、置換を受ける位置は環の外側に置換基を有さない。
【0075】
式Ｉに含まれる化合物はまた、１つ又は複数の置換基が第１及び／又は第２の芳香環の周りに付加された化合物を含むことができる。適切な置換基の例としては、ハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、ニトロ、ジメチルアミン及び低級アルキル又はアリール部分が挙げられる。例えば、いくつかの態様では、第２の芳香環の円周に沿った水素原子は、パラ置換フェニル基で置換されている。
【0076】
式Ｉに含まれる適切な化合物としては、例えば、図３及び図８を参照すると、化合物８である（（Ｅ）－２－（（Ｅ）－３－（４－ヒドロキシ－３－メトキシフェニル）アリリデン）－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－インデン－１－オン）、３２である（４’－（（Ｅ）－３－（（Ｅ）－６－ヒドロキシ－１－オキソ－１，３－ジヒドロ－２Ｈ－インデン－２－イリデン）プロパ－１－エン－１－イル）－［１，１’－ビフェニル］－４－カルボン酸）、及び３７である（（Ｚ）－２－（（５－（４－（ヒドロキシメチル）フェニル）チオフェン－２－イル）メチレン）－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－インデン－１－オン）を挙げることができる。
【0077】
いくつかの態様では、化合物は化合物８：
である。
【化28】
である。
【0078】
式Ｉの結合リガンドとしては、沈着物及びフィブリル中に存在するα－ｓｙｎなどの、α－ｓｙｎに対して高い親和性を有する化合物が挙げられる。特に、フィブリル及び沈着物中に存在するα－ｓｙｎは典型的には凝集したα－ｓｙｎであるので、結合リガンドは凝集したα－ｓｙｎに対して高い親和性を有する。いくつかの態様では、化合物はα－ｓｙｎ特異的である。いくつかの態様では、化合物は、Ａβよりもα－ｓｙｎに対して高い親和性を有する。α－Ｓｙｎ特異的は、本明細書で使用される場合、造影剤が、ミスフォールドタンパク質の疾患及び障害に関連する他のタンパク質と比較して、排他的又は優先的にα－ｓｙｎに結合するという事実を指す。本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」という用語は、結合リガンドと第２の化学種との相互作用を指し、相互作用は化学種上の特定の構造（例えば、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存する。例えば、標的化リガンドは、一般に、タンパク質ではなくα－ｓｙｎの特定のタンパク質構造を認識して結合する。
【0079】
式Ｉの範囲内の化合物は、α－ｓｙｎ（例えば、凝集したα－ｓｙｎ）に対して様々な異なる結合親和性を有する。いくつかの態様では、化合物は、約５００ｎＭ以下のＫｄで凝集したα－ｓｙｎに対する結合親和性を有する。いくつかの態様では、化合物は、約２００ｎＭ以下のＫｄで凝集したα－ｓｙｎに対する結合親和性を有する。他の態様では、化合物は、約１００ｎＭ以下のＫｄで凝集したα－ｓｙｎに対する結合親和性を有する。更なる態様では、化合物は、約５０ｎＭ以下のＫｄで凝集したα－ｓｙｎに対する結合親和性を有する。
【0080】
いくつかの態様では、化合物は放射性標識を更に含む。放射性標識化合物は、放射性核種で置換された１つ又は複数の原子を有する。放射性標識の例としては、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１２１Ｉ、１１２Ｉｎ、９９ｍＴｃが挙げられる。化合物は、１８Ｆ、１１Ｃ、及び１５Ｏなどの陽電子放射断層撮影に有用な原子を含むように修飾することもできる。
【0081】
式Ｉに含まれる適切な化合物は、薬学的に許容される塩、例えば、有機酸及び無機酸で形成されたものを含む酸付加塩として存在することができる。そのような酸付加塩は、通常、薬学的に許容される。しかし、薬学的に許容されない塩の塩は、問題の化合物の調製及び精製において有用であってもよい。塩基性付加塩も形成することができ、薬学的に許容される。
【0082】
「薬学的に許容される塩」という用語は、本明細書で使用される場合、本明細書で定義される水溶性又は油溶性又は分散性であり、治療的に許容される、式Ｉに含まれる化合物の塩又は双性イオン形態を表す。塩は、化合物の最終的な単離及び精製中に、又は遊離塩基の形態の適切な化合物を適切な酸と反応させることによって別々に調製することができる。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、Ｌ－アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩（ベシル酸塩）、硫酸水素塩、酪酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、ジグルコン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、ゲンチシン酸塩、グルタル酸塩、グリセロリン酸塩、グリコール酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、馬尿酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩（イセチオン酸塩）、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、ＤＬ－マンデル酸塩、メシチレンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフチレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、ホスホン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ピログルタミン酸塩、コハク酸塩、スルホン酸塩、酒石酸塩、Ｌ－酒石酸塩、トリクロロ酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、リン酸塩、グルタミン酸塩、炭酸水素塩、パラ－トルエンスルホン酸塩（ｐ－トシル酸塩）、及びウンデカン酸塩が挙げられる。化合物中の塩基性基は、メチル、エチル、プロピル、及びブチル塩化物、臭化物、及びヨウ化物、ジメチル、ジエチル、ジブチル、及びジアミル硫酸塩、デシル、ラウリル、ミリスチル及びステリル塩化物、臭化物、及びヨウ化物、並びにベンジル及びフェネチル臭化物で四級化されてもよい。治療的に許容される付加塩を形成するために使用することができる酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸及びリン酸などの無機酸、並びにシュウ酸、マレイン酸、コハク酸及びクエン酸などの有機酸が挙げられる。塩はまた、化合物とアルカリ金属又はアルカリ土類イオンとの配位によっても形成することができる。したがって、式Ｉの化合物のナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩及びカルシウム塩が企図される。
【0083】
リポソーム
「リポソーム」は、一般に、内部空洞を含む球状又はほぼ球状の粒子を指す。リポソームの壁は、脂質の二重層を含むことができる。これらの脂質はリン脂質であってもよい。多数の脂質及び／又はリン脂質を、リポソームを作製するために使用することができる。一例は、疎水性部分及び極性頭部基部分を有する両親媒性脂質であり、これは、リン脂質によって例示されるように、水中の二重層小胞に自発的に形成することができるか、又は脂質二重層に安定に組み込まれることができ、その疎水性部分は、二重層膜の内部の疎水性領域と接触し、その極性頭部基部分は、膜の外部の極性表面に向けられている。リポソームは、本明細書の例、並びにそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第１７／１６２，１２６号、国際公開第２０１６０５７８１２号及び国際公開第２０１２１３９０８０号に記載されているものを含む、任意の既知の方法によって調製することができる。図２は、α－ｓｙｎ沈着物のＭＲＩのための標的造影剤を含むリポソームの例示的な断面図を提供する。
「リポソーム」は、一般に、内部空洞を含む球状又はほぼ球状の粒子を指す。リポソームの壁は、脂質の二重層を含むことができる。これらの脂質はリン脂質であってもよい。多数の脂質及び／又はリン脂質を、リポソームを作製するために使用することができる。一例は、疎水性部分及び極性頭部基部分を有する両親媒性脂質であり、これは、リン脂質によって例示されるように、水中の二重層小胞に自発的に形成することができるか、又は脂質二重層に安定に組み込まれることができ、その疎水性部分は、二重層膜の内部の疎水性領域と接触し、その極性頭部基部分は、膜の外部の極性表面に向けられている。リポソームは、本明細書の例、並びにそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第１７／１６２，１２６号、国際公開第２０１６０５７８１２号及び国際公開第２０１２１３９０８０号に記載されているものを含む、任意の既知の方法によって調製することができる。図２は、α－ｓｙｎ沈着物のＭＲＩのための標的造影剤を含むリポソームの例示的な断面図を提供する。
【0084】
一態様では、ＡＤｘ－００３は、ＨＳＰＣ、Ｃｈｏｌ、ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ３４００－ＸＷ－０１－１１コンジュゲート、及びＧｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ－ＤＳＰＥを含む。一態様では、ＡＤｘ－００３は、ＨＳＰＣ、Ｃｈｏｌ、ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ３５００－ＸＷ－０１－１１コンジュゲート、及びＧｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ－ＤＳＰＥを含む。いくつかの態様では、第１のリン脂質は、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、又はＤＰＰＣとＤＳＰＣとの混合物を含むことができる。一態様では、ＡＤｘ－００３中の脂質組成及び成分のモル比（％）は、ＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ２０００：Ｇｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ－ＤＳＰＥ：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ３４００／３５００－式Ｉコンジュゲート＝約３１．５：約４０：約２．５：約２５：約１である。いくつかの態様では、ＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ２０００：Ｇｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ－ＤＳＰＥ：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ３４００／３５００－式Ｉコンジュゲートのいずれか１つのモル比は、最大１０％、したがって、３１．５±１０％：４０±１０％：２．５±１０％：２５±１０％：１±１０％調整することができる。一態様では、ＡＤｘ－００３中の脂質組成及び成分のモル比（％）は、ＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ２０００：Ｇｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ－ＤＳＰＥ：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ３４００／３５００－式Ｉコンジュゲート＝約３２．５：約４０：約２：約２５：約０．５である。一態様では、ＡＤｘ－００３中の脂質組成及び成分のモル比（％）は、ＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ２０００：Ｇｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ－ＤＳＰＥ：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ３４００／３５００－式Ｉコンジュゲート＝約３２：約４０：約２．５：約２５：約０．５である。
【0085】
一態様では、ＡＤｘ－００３中のＨＳＰＣ含有量は、約２４ｍｇ／ｍＬ～約３２ｍｇ／ｍＬ（総脂質）である。一態様では、ＡＤｘ－００３中のＣｈｏｌ含有量は、約１４ｍｇ／ｍＬ～約１９ｍｇ／ｍＬである。一態様では、ＡＤｘ－００３中のＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ２０００含有量は、約５ｍｇ／ｍＬ～約７ｍｇ／ｍＬである。一態様では、ＡＤｘ－００３中のＧｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ－ＤＳＰＥ含有量は、３０ｍｇ／ｍＬ～４５ｍｇ／ｍＬである。一態様では、ＡＤｘ－００３中のＤＳＰＥ－ＰＥＧ３４００／３５００－式Ｉコンジュゲート含有量は、約２ｍｇ／ｍＬ～約３ｍｇ／ｍＬである。一態様では、ＡＤｘ－００３中の遊離ガドリニウム含有量は、２．５μｇ／ｍＬ未満を含めて、１００μｇ／ｍＬ以下である。
【0086】
一態様では、リポソーム組成物のｐＨは６．４～８．４である。更なる態様では、リポソームの重量オスモル濃度は、２００～４００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇである。更なる態様では、リポソームの小胞サイズ（Ｚ平均）は、動的光散乱によって測定される場合、１５０ｎｍ（Ｄ５０）未満、約１４０ｎｍ（Ｄ５０）、及び約１２０ｎｍ（Ｄ５０）を含めて、約２００ｎｍ（Ｄ５０）未満である。
【0087】
明確にするために、数字と組み合わせた「約」という用語は、その数字の±１０％を含むことを意図している。これは、「約」が独立した数字を変更することであるか、又は数字の範囲の両端のいずれか或いは両方で数字を変更することであるかにかかわらず当てはまる。言い換えると、「約１０」は９～１１を意味する。同様に、「約１０～約２０」は、９～２２及び１１～１８を意図する。「約」という用語がない場合、正確な数が意図される。言い換えると、「１０」は１０を意味する。
【0088】
α－Ｓｙｎの検出方法
α－ｓｙｎ（例えば、凝集したα－ｓｙｎ）を検出するための方法が提供される。この方法は、有効量の式Ｉによる化合物：
（式中、Ｘは、－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨＯ－又は－Ｏ－ＣＯ－であり、Ｙは、－ＣＨ－ＣＨ＝ＣＨ－又は
であり、Ａ及びＢは、独立して、Ｃ及びＮから選択され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、独立して、－Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ及び－ＣＨ３から選択され、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、独立して、－Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－ＮＯ２、－Ｎ（ＣＨ３）２、Ｃ１～Ｃ６アルキル又は置換若しくは非置換Ｃ４～Ｃ６アリール基から選択され、但し、Ａ及び／又はＢがＮである場合、隣接するＲ５及び／又はＲ７は－Ｈである）、又はその薬学的に許容される塩を、試料又は対象に導入することを含む。この方法はまた、化合物が試料又は対象中のα－ｓｙｎと会合するのに十分な時間を提供する工程、及び試料又は対象中のα－ｓｙｎと会合した化合物を検出する工程を含む。
α－ｓｙｎ（例えば、凝集したα－ｓｙｎ）を検出するための方法が提供される。この方法は、有効量の式Ｉによる化合物：
【化29】
（式中、Ｘは、－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨＯ－又は－Ｏ－ＣＯ－であり、Ｙは、－ＣＨ－ＣＨ＝ＣＨ－又は
【化30】
であり、Ａ及びＢは、独立して、Ｃ及びＮから選択され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、独立して、－Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ及び－ＣＨ３から選択され、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、独立して、－Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－ＮＯ２、－Ｎ（ＣＨ３）２、Ｃ１～Ｃ６アルキル又は置換若しくは非置換Ｃ４～Ｃ６アリール基から選択され、但し、Ａ及び／又はＢがＮである場合、隣接するＲ５及び／又はＲ７は－Ｈである）、又はその薬学的に許容される塩を、試料又は対象に導入することを含む。この方法はまた、化合物が試料又は対象中のα－ｓｙｎと会合するのに十分な時間を提供する工程、及び試料又は対象中のα－ｓｙｎと会合した化合物を検出する工程を含む。
【0089】
本明細書で使用される場合、α－ｓｙｎは、全長の１４０アミノ酸のα－シヌクレインタンパク質、例えば「α－ｓｙｎ－１４０」を指す。他のアイソフォーム又はフラグメントは、例えばエクソン３の欠失に起因して残基４１～５４を欠く「α－ｓｙｎ－１２６」、α－シヌクレイン－１２６、及び例えば、エクソン５の欠失に起因して残基１０３～１３０を欠く「α－ｓｙｎ－１１２」、α－シヌクレイン－１１２を含むことができる。
【0090】
α－Ｓｙｎ凝集体は、ＰＤ、ＤＬＢ、及びＭＳＡなどのＬＢを特徴とする病理学的状態で不溶性フィブリルを形成する。α－Ｓｙｎは、ＬＢフィブリルの主要な構造成分である。α－Ｓｙｎは、ＰＤに罹患しているか又はＰＤを有すると疑われる個体の脳に存在し得る。様々なα－ｓｙｎペプチドが、ＰＤに関連するニューロン損傷に関連し得る。疾患に関連する様々なα－ｓｙｎアイソフォームとしては、α－ｓｙｎ－１４０、α－ｓｙｎ－１２６及びα－ｓｙｎ－１１２が挙げられるが、これらに限定されない。
【0091】
検出方法で使用される化合物は、式Ｉによるα－ｓｙｎ標的化リガンドのいずれかであってもよい。例えば、いくつかの態様では、標的化リガンドは、Ｙが－ＣＨ－ＣＨ＝ＣＨ－である式Ｉの化合物であり、更なる態様では、標的化リガンドは、Ａ及びＢが両方とも炭素原子である式Ｉの化合物である。更なる態様では、標的化リガンドは、図３及び図８の化合物８、化合物３２、及び化合物３７から選択され、なお更なる態様では、化合物は以下の構造、
を有する。
【化31】
を有する。
【0092】
いくつかの態様では、検出方法で使用される化合物をリン脂質－ポリマーに連結して、式ＩＩのリン脂質－ポリマー－標的化リガンドコンジュゲートを形成する。リン脂質－ポリマー－標的化リガンドコンジュゲートは、本明細書中に記載されるリン脂質（ＰＬ）及び親水性ポリマー（ＨＰ）のいずれかを含むことができる。リン脂質－ポリマー－標的化リガンドコンジュゲートは、リポソームに組み込むことができる。式Ｉの化合物は、蛍光によって直接検出することができるか、放射性標識化合物を含むように修飾することができるか、又は他の手段によって検出することができるが、化合物をリポソームに組み込むことは、検出の選択肢を増加させることができる。
【0093】
この方法は、式Ｉによる化合物の有効量を試料又は対象に導入する工程を含む。試料は、α－ｓｙｎを含み得る組織の一部、例えば対象から得られた組織試料（例えば、神経組織試料）であってもよく、この場合、この方法はエクスビボ分析に使用される。化合物を試料に導入することは、単に、試料を化合物と接触させることを指す。或いは、インビボ分析を実施するために、化合物を対象に導入してもよい。本明細書で使用される「対象」は、任意の動物であってもよく、患者とも呼ぶことができる。対象は、脊椎動物、哺乳動物、例えば、研究動物（例えば、マウス又はラット）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ）、又はペット（例えば、犬、猫）であってもよい。いくつかの態様では、対象はヒトである。
【0094】
この方法はまた、化合物が試料又は対象中のα－ｓｙｎ（例えば、凝集したα－ｓｙｎ）と会合するのに十分な時間を提供する工程を含むことができる。式Ｉの結合リガンドは、α－ｓｙｎ、特に凝集したα－ｓｙｎに対して親和性を有し、したがって、試料又は対象中に存在するα－ｓｙｎと会合する。化合物がα－ｓｙｎと会合するのに必要な時間の量は、試料の性質、投与方法、及び使用される化合物の親和性などのいくつかの変数に応じて変化し得る。化合物がα－ｓｙｎと会合するのに十分な時間の量は、当業者によって容易に決定することができる。例えば、化合物が試料又は対象中でα－ｓｙｎと会合するのに十分な時間は、少なくとも２分、５分、１０分、１５分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、又は少なくとも８時間であってもよい。
【0095】
この方法は、試料又は対象中のα－ｓｙｎに関連する化合物（例えば、凝集したα－ｓｙｎ）を検出する工程を含むことができる。いくつかの態様では、検出することは、ＭＲＩを使用して検出することを含むことができる。別の例では、検出することは、蛍光イメージング（「ＦＩ」）によって検出することを含むことができる。検出することは、放射性造影剤を使用するＳＰＥＣＴイメージング及び／又はＰＥＴイメージングによる検出を含むことができる。放射性造影剤としては、例えば、米国国立衛生研究所のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒａｓｔ Ａｇｅｎｔ ＤａｔａｂａｓｅのＳＰＥＣＴイメージング及び／又はＰＥＴイメージングでの使用に適切であると考えられる薬剤を挙げることができる。ＰＥＴイメージングを含むがこれに限定されない、当業者に公知の任意の他の適切なタイプのイメージング方法論が企図される。
【0096】
いくつかの態様では、対象において検出されたα－ｓｙｎ（例えば、凝集したα－ｓｙｎ）の位置を示す画像が生成される。したがって、いくつかの態様では、有効量の造影剤（すなわち、標的化リガンド又はリン脂質－ポリマー－標的化リガンドコンジュゲート）を対象に投与し、造影剤が分配された対象の組織領域の画像を生成することによって、対象の組織領域の画像を生成する方法が提供される。組織領域の画像を生成するためには、検出可能に有効な量の造影剤が目的の組織領域に到達する必要があるが、造影剤が単独でこの領域に局在する必要はない。しかし、いくつかの態様では、造影剤は、主に目的の組織領域に存在するように標的化又は局所投与される。画像としては、２次元断面図や３次元画像が挙げられる。いくつかの態様では、視覚画像を生成するために、コンピュータを使用して、造影剤によって生成されたデータを分析する。画像を生成する方法の一例はＭＲＩである。ＭＲＩスキャナは、強い磁場、磁場勾配、及び電波を使用して体内の器官の画像を生成する。
【0097】
イメージングシステムは、典型的には、３つの基本的な構成要素である（１）撮像剤の励起を誘導するための適切な供給源を、（２）造影剤からの発光を分離又は区別するためのシステム、及び（３）検出システムを含む。検出システムは、手持ち式であってもよく、又は術中顕微鏡などの他の有用なイメージング装置に組み込まれてもよい。例示的な検出システムとしては、内視鏡、カテーテル、断層撮影システム、手持ち式イメージングシステム、又は術中顕微鏡が挙げられる。
【0098】
標的化リガンドの多くは、α－ｓｙｎ（例えば、凝集したα－ｓｙｎ）に対して、Ａβ又はτタンパク質などのタンパク質ミスフォールディング障害に関与する他のタンパク質よりも高い親和性を示す。このより高い親和性のために、結合リガンドは、単独で、又はリン脂質－ポリマー－標的化リガンドコンジュゲート中に存在する場合、α－ｓｙｎのレベルをミスフォールディングを受けやすい他のタンパク質のレベルと区別することができる。特に、凝集したα－ｓｙｎのレベルを凝集したＡβのレベルから区別することに関心がある。したがって、いくつかの態様では、α－ｓｙｎは、Ａβの検出よりも高い特異性で検出される。他の態様では、α－ｓｙｎは、Ａβの検出よりも１．５倍以上、Ａβの検出よりも２倍以上、Ａβの検出よりも３倍以上、Ａβの検出よりも５倍以上、又はＡβの検出よりも１０倍以上高い特異性で検出される。
【0099】
いくつかの態様では、試料又は対象におけるα－ｓｙｎ（例えば、凝集したα－ｓｙｎ）を検出及び／又は画像化するための方法は、対象がミスフォールドしたα－ｓｙｎに関連する疾患を有するかどうかを診断するために、又は対象における疾患の進行を評価するために使用することができる。いくつかの態様では、対象は、ＰＤを発症するか、ＰＤを有するか、又はＰＤの処置を受けるリスクがある可能性があり、ＭＳＡなどのα－ｓｙｎの調節不全、ミスフォールディング、凝集又は処分に関連する疾患を有するリスクがある可能性があり、α－ｓｙｎの調節不全、ミスフォールディング、凝集又は処分に関連する疾患を有する可能性があり、α－ｓｙｎの調節不全、ミスフォールディング、凝集又は処分に関連する疾患の治療中などであってもよい。
【0100】
この方法は、α－ｓｙｎタンパク質（例えば、凝集したα－ｓｙｎ）の検出に基づいて対象のＰＤを診断することを含むことができる。α－Ｓｙｎのミスフォールディング及び凝集は、ＰＤ病因に関連することが示されている。ＰＤの診断はまた、画像又は検出されたα－ｓｙｎタンパク質の量を、対照試料又は健常対象から採取した画像と比較することを含むことができる。この方法は、試料又は対象中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の存在に従って、対象中のα－ｓｙｎ凝集に関連する疾患の存在を決定又は診断することを含むことができる。この方法は、試料又は対象中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の存在に従って、対象中のＭＳＡの存在を決定又は診断することを含むことができる。
【0101】
いくつかの態様では、この方法は、α－ｓｙｎ凝集に関連する疾患を有すると診断された対象をα－ｓｙｎ調節療法で治療することを含む。様々な機構を介してα－ｓｙｎ恒常性を標的とするいくつかの新規な治療法が現在開発中である。α－ｓｙｎ調節療法は、例えば、適切な阻害剤、能動又は受動免疫療法アプローチなどを用いて、α－ｓｙｎの産生を阻害すること、α－ｓｙｎの凝集を阻害することを含むことができる。α－ｓｙｎ恒常性を標的とする治療アプローチとしては、ＰＤ０１Ａ＋若しくはＰＤ０３Ａ＋などの能動免疫、又はＰＲＸ００２などの受動免疫を挙げることができる。可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎの存在を検出するための本明細書に記載の方法を使用して、どの患者をα－ｓｙｎ調節療法で治療することができるかを決定することができる。現在、ＰＤの治療法はないが、レボドパ、ドーパミンアゴニスト及びモノアミンオキシダーゼＢ阻害剤などの様々な薬物がＰＤの運動症状の治療に有用である。
【0102】
造影剤を含むリン脂質－ポリマー－標的化リガンド化合物は、薬学的に許容される担体と共に投与することができる。注射用途に適した医薬形態としては、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射溶液又は分散液を即時に調製するための滅菌粉末が挙げられる。全ての場合において、形態は無菌でなければならず、容易な注射能力が存在する程度に流動性でなければならない。これは、製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール）、それらの適切な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒であってもよい。
【0103】
α－Ｓｙｎ検出用キット
本発明の別の態様は、対象中のα－ｓｙｎ（例えば、凝集したα－ｓｙｎ）を検出及び／又は画像化するためのキットを提供する。キットは、一般に、標的化リガンド並びに他の成分及び試薬を保持する１つ又は複数の容器を有するパッケージを、１つ又は複数の別個の組成物として、又は任意選択的に、試薬の互換性が許す限り混合物として含む。キットは、説明書及びリポソーム組成物を含むことができる。説明書は、検出可能な量のリポソーム組成物を試料又は対象に導入するように使用者に指示することができる。説明書は、リポソーム組成物がα－ｓｙｎと会合するのに十分な時間を与えるように使用者に指示することができる。説明書は、α－ｓｙｎに関連するリポソーム組成物を検出するように使用者に指示することができる。キットは、式Ｉの標的化リガンド及び／又は式ＩＩによって表されるリン脂質－ポリマー－標的化コンジュゲートを含むことができる。
本発明の別の態様は、対象中のα－ｓｙｎ（例えば、凝集したα－ｓｙｎ）を検出及び／又は画像化するためのキットを提供する。キットは、一般に、標的化リガンド並びに他の成分及び試薬を保持する１つ又は複数の容器を有するパッケージを、１つ又は複数の別個の組成物として、又は任意選択的に、試薬の互換性が許す限り混合物として含む。キットは、説明書及びリポソーム組成物を含むことができる。説明書は、検出可能な量のリポソーム組成物を試料又は対象に導入するように使用者に指示することができる。説明書は、リポソーム組成物がα－ｓｙｎと会合するのに十分な時間を与えるように使用者に指示することができる。説明書は、α－ｓｙｎに関連するリポソーム組成物を検出するように使用者に指示することができる。キットは、式Ｉの標的化リガンド及び／又は式ＩＩによって表されるリン脂質－ポリマー－標的化コンジュゲートを含むことができる。
【0104】
キットに含まれる説明書は、包装材料に添付することができ、又は添付文書として含めることができる。説明書は、通常、書面又は印刷物であるが、これらに限定されない。このような説明書を記憶し、それらをエンドユーザに伝達することができる任意の媒体が、本開示によって企図される。そのような媒体としては、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ－ＲＯＭ）などが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「説明書」という用語は、説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含むことができる。
【0105】
キットの成分は、異なる物理的状態にあってもよい。例えば、いくつかの成分は凍結乾燥されてもよく、いくつかは水溶液中であってもよい。凍結しているものもある。個々の成分は、キット内に別々に包装されてもよい。本発明の方法又は関連する試験、治療、若しくは較正を行うための他の有用なツールもキットに含むことができ、これらには、緩衝液、酵素、蛍光試薬、ＭＲＩ用の増強剤（例えば、常磁性イオン）、ゲル、プレート、検出可能な標識、容器などが含まれる。キットはまた、対象から生物学的試料を得るためのサンプリング装置、例えばシリンジ又は針も含むことができる。
【0106】
「有効量」という用語は、関連する方法を実施するのに有効な化合物（例えば、α－ｓｙｎ標的化リガンド）の数又は量を限定することを意図している。例えば、有効量のα－ｓｙｎ標的化リガンド、又はα－ｓｙｎ標的化リガンドを含むコンジュゲートが、検出可能なレベルで試料又は対象中に存在するα－ｓｙｎと会合する。対象において使用される場合、有効量は、投与に関連する望ましくない副作用を最小限に抑えるのに十分低い場合がある。治療有効量は、１つ又は複数の用量で投与することができる。
【0107】
本発明は、異性体（例えば、ジアステレオマー及びエナンチオマー）、互変異性体、塩、溶媒和物、多形、プロドラッグなどを含む、その薬学的に許容される形態のいずれかで本明細書に記載される化合物を含む。特に、化合物が光学活性である場合、本発明は具体的には、化合物のエナンチオマーのそれぞれ並びにエナンチオマーのラセミ混合物を含む。「化合物」という用語は、明示的に述べられているか否かにかかわらず、（時には、「塩」が明示的に述べられているが）そのような形態のいずれか又は全てを含む。
【0108】
「診断」という用語は、対象が疾患を発症する可能性又は対象における疾患の存在若しくは性質を決定することを包含することができる。診断という用語はまた、一般に予後と呼ばれる、疾患又は疾患のエピソードの重症度及び可能性のある転帰、又は回復の見込みを決定することを包含する。「診断」はまた、合理的な治療の文脈における診断を包含することができ、診断は、治療の初期選択、治療の修正（例えば、用量又は投薬計画の調整）などを含む治療の指針となる。
【0109】
値の範囲が提供される場合、文脈上明確に指示されない限り、下限の単位の１０分の１まで、その範囲の上限と下限との間の各介在値、及びその記載された範囲内の任意の他の記載値又は介在値は、本発明に包含される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立してより小さい範囲に含まれてもよく、また、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限界を条件として、本発明に包含される。記載された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界の一方又は両方を除外した範囲も本発明に含まれる。
【0110】
本出願で使用される全て科学用語及び技術用語は、特に明記しない限り、当技術分野で一般的に使用される意味を有する。本明細書で提供される定義は、本明細書で頻繁に使用される特定の用語の理解を容易にするためのものであり、本出願の範囲を限定することを意味するものではない。
【0111】
本発明を以下の例によって説明する。特定の例、材料、量、及び手順は、本明細書に記載の本発明の範囲及び精神に従って広く解釈されるべきである。
【0112】
例
全ての試薬は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＴＣＩ、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ又はＡｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓから入手し、更に精製することなく使用した。プロトン核磁気共鳴（１Ｈ ＮＭＲ）を、Ｂｒｕｋｅｒ６００又は５００ＮＭＲ分光計で６００ＭＨｚ又は５００ＭＨｚで記録した。炭素核磁気共鳴（１３Ｃ ＮＭＲ）を、それぞれＢｒｕｋｅｒ３００又は５００ＮＭＲ分光計で７５ＭＨｚ又は１２５ＭＨｚで記録した。１Ｈ ＮＭＲについては、アセトン（２．０５ｐｐｍ）、クロロホルム（７．２６ｐｐｍ）又はジメチルスルホキシド（２．５０ｐｐｍ）の内部標準からの化学シフトを百万分率（ｐｐｍ）で報告し、１３Ｃ ＮＭＲについては、残留アセトン（２０６．２６ｐｐｍ）、クロロホルム（７７．００ｐｐｍ）又はジメチルスルホキシド（３９．５２ｐｐｍ）のいずれかの内部標準からの化学シフトを百万分率（ｐｐｍ）で報告する。ＮＭＲピーク多重度は以下の、ｓ（一重項）、ｄ（二重項）、ｔ（三重項）、ｑ（四重項）、ｄｄ（二重項の二重項）、ｔｄ（三重項の二重項）、ｄｔ（二重項の三重項）及びｍ（多重項）のように表される。結合定数（Ｊ）は、ヘルツ（Ｈｚ）で与えられる。高分解能質量スペクトルは、Ｔｈｅ Ｏｈｉｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙから得た。ＴＬＣを、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｃ．からのシリカゲル６０ Ｆ２５４プレートで行い、成分を、紫外光（２５４ｎｍ）及び／又はエタノール中２０重量％リンモリブデン酸溶液によって可視化した。全てのカラムクロマトグラフィーにＳｉｌｉＦｌａｓｈシリカゲル（２３０～４００メッシュ）を使用した。
全ての試薬は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＴＣＩ、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ又はＡｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓから入手し、更に精製することなく使用した。プロトン核磁気共鳴（１Ｈ ＮＭＲ）を、Ｂｒｕｋｅｒ６００又は５００ＮＭＲ分光計で６００ＭＨｚ又は５００ＭＨｚで記録した。炭素核磁気共鳴（１３Ｃ ＮＭＲ）を、それぞれＢｒｕｋｅｒ３００又は５００ＮＭＲ分光計で７５ＭＨｚ又は１２５ＭＨｚで記録した。１Ｈ ＮＭＲについては、アセトン（２．０５ｐｐｍ）、クロロホルム（７．２６ｐｐｍ）又はジメチルスルホキシド（２．５０ｐｐｍ）の内部標準からの化学シフトを百万分率（ｐｐｍ）で報告し、１３Ｃ ＮＭＲについては、残留アセトン（２０６．２６ｐｐｍ）、クロロホルム（７７．００ｐｐｍ）又はジメチルスルホキシド（３９．５２ｐｐｍ）のいずれかの内部標準からの化学シフトを百万分率（ｐｐｍ）で報告する。ＮＭＲピーク多重度は以下の、ｓ（一重項）、ｄ（二重項）、ｔ（三重項）、ｑ（四重項）、ｄｄ（二重項の二重項）、ｔｄ（三重項の二重項）、ｄｔ（二重項の三重項）及びｍ（多重項）のように表される。結合定数（Ｊ）は、ヘルツ（Ｈｚ）で与えられる。高分解能質量スペクトルは、Ｔｈｅ Ｏｈｉｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙから得た。ＴＬＣを、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｃ．からのシリカゲル６０ Ｆ２５４プレートで行い、成分を、紫外光（２５４ｎｍ）及び／又はエタノール中２０重量％リンモリブデン酸溶液によって可視化した。全てのカラムクロマトグラフィーにＳｉｌｉＦｌａｓｈシリカゲル（２３０～４００メッシュ）を使用した。
【0113】
例１：標的化リガンドの分子設計
従来技術の化合物１を、α－ｓｙｎ凝集体に対する高い親和性及び選択性を有する新規な構造の開発に向けた構造活性相関（「ＳＡＲ」）研究の足場として選択した。分子設計（図４）は、分子の３つの部分である第１の芳香族基（Ａ）、架橋（Ｂ）、及び第２の芳香族基（Ｃ）を対象とした。（Ａ）については、１－インダノン及び１，３－インダンジオンを新規な誘導体の出発点として選択した。（Ｂ）については、いくつかの誘導体においてジエンを維持した。分子内の電子密度を増加させるために、二重結合の１つが電子リッチなチオフェン部分で置き換えられた誘導体も導入した。更に、分子内の剛性が全体的に増加した誘導体は、２つの異なる環系で第２の二重結合を「ロック」することによって導入された。第２の芳香族基（Ｃ）の周りの誘導体化は、電子リッチな芳香環及び電子が不足した芳香環の両方、並びに複素環を含んでいた。
従来技術の化合物１を、α－ｓｙｎ凝集体に対する高い親和性及び選択性を有する新規な構造の開発に向けた構造活性相関（「ＳＡＲ」）研究の足場として選択した。分子設計（図４）は、分子の３つの部分である第１の芳香族基（Ａ）、架橋（Ｂ）、及び第２の芳香族基（Ｃ）を対象とした。（Ａ）については、１－インダノン及び１，３－インダンジオンを新規な誘導体の出発点として選択した。（Ｂ）については、いくつかの誘導体においてジエンを維持した。分子内の電子密度を増加させるために、二重結合の１つが電子リッチなチオフェン部分で置き換えられた誘導体も導入した。更に、分子内の剛性が全体的に増加した誘導体は、２つの異なる環系で第２の二重結合を「ロック」することによって導入された。第２の芳香族基（Ｃ）の周りの誘導体化は、電子リッチな芳香環及び電子が不足した芳香環の両方、並びに複素環を含んでいた。
【0114】
例２：標的化リガンドの化学合成
図５を参照して、環Ａが１－インダノニル－（図３に示すように、化合物７～１５を生成するための式ｉ）、１，３－インダジオニル－（図３に示すように、化合物１６～２２を生成するための式ｉｉ）、α－テラロニル－（図３に示すように、化合物２３～２４を生成するための式ｉｉｉ）又はクマリニル－（図３に示すように、化合物２５～２８を生成するための式ｉｖ）部分のいずれかで置き換えられている第１の一連の誘導体を、ジエン架橋（Ｂ）を維持しながら、所望のケト基質と対応するシンナムアルデヒド誘導体との酸又は塩基触媒アルドール縮合反応によって入手した。
図５を参照して、環Ａが１－インダノニル－（図３に示すように、化合物７～１５を生成するための式ｉ）、１，３－インダジオニル－（図３に示すように、化合物１６～２２を生成するための式ｉｉ）、α－テラロニル－（図３に示すように、化合物２３～２４を生成するための式ｉｉｉ）又はクマリニル－（図３に示すように、化合物２５～２８を生成するための式ｉｖ）部分のいずれかで置き換えられている第１の一連の誘導体を、ジエン架橋（Ｂ）を維持しながら、所望のケト基質と対応するシンナムアルデヒド誘導体との酸又は塩基触媒アルドール縮合反応によって入手した。
【0115】
したがって、酢酸（１０ｍＬ）中のアルデヒド（１．０当量）及びインドリノン（１．０当量）の溶液に、３７％ＨＣｌ（０．５ｍＬ）をゆっくり添加した。反応混合物を１１０℃で一晩撹拌し、室温に冷却した。冷却した溶媒を氷水に注ぎ、濾別した。固体をメタノールで再結晶した。
【0116】
或いは、ジクロロメタン／メタノール（１：２、１０ｍＬ）中のアルデヒド（１．０当量）及びインドリノン（１．０当量）の溶液に、エチレンジアミン二塩酸塩（０．２５ｍｍｏｌ）をゆっくり添加した。反応混合物を室温で５時間撹拌した。固体を濾別し、メタノールで再結晶した。
【0117】
特に、化合物８、（Ｅ）－２－（（Ｅ）－３－（４－ヒドロキシ－３－メトキシフェニル）アリリデン）－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－インデン－１－オンに関して、化合物を、１－インダノン（２５０ｍｇ、１．８９ｍｍｏｌ）及び４－ヒドロキシ－３－メトキシシンナムアルデヒド（３３７ｍｇ、１．８９ｍｍｏｌ）を用いて酸性プロトコルによって調製して、所望の生成物（８）を赤色固体として得た（４３６ｍｇ、収率７９％）。１Ｈ ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ９．５２（ｓ，１Ｈ），７．７４（ｄ，Ｊ＝７．８ Ｈｚ，１Ｈ），７．６９（ｔｄ，Ｊ１＝１．２ Ｈｚ，Ｊ２＝７．２ Ｈｚ，１Ｈ），７．６４（ｄ，Ｊ＝７．８ Ｈｚ，１Ｈ），７．４７（ｔ，Ｊ＝７．２ Ｈｚ，１Ｈ），７．２９（ｄｔ，Ｊ１＝１．８ Ｈｚ，Ｊ２＝１０．２ Ｈｚ，１Ｈ），７．２８（ｓ，１Ｈ），７．１３（ｄ，Ｊ＝１５．６ Ｈｚ，１Ｈ），７．０９（ｄｔ，Ｊ１＝１０．２ Ｈｚ，Ｊ２＝１５．６ Ｈｚ，１Ｈ），７．０６（ｄ，Ｊ＝８．４ Ｈｚ，１Ｈ），６．８１（ｄ，Ｊ＝８．４ Ｈｚ，１Ｈ），３．９３（ｓ，２Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １９２．９，１４９．６，１４８．９，１４８．４，１４３．３，１３９．３，１３５．１，１３４．９，１３４．２，１２８．４，１２７．９，１２７．１，１２３．７，１２２．６，１２２．５，１１６．１，１１１．０，５６．２，３０．７．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１９Ｈ１７Ｏ３ ［Ｍ＋Ｈ］＋２９３．１１７２，ｆｏｕｎｄ，２９３．１１７１．
【0118】
初期の実験では、モノ－ケト基質が酸性条件下でより清浄な反応生成物及びより良好な収率をもたらし、一方、ジ－ケト基質は塩基性条件を好ましいことが示唆された。したがって、これらの基質を含む後続の反応を同様の反応条件下で行った。得られたジエンの１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは両方とも、単一の生成物と一致するピークを示し、２つの可能な異性体（Ｅ，Ｅ又はＺ，Ｅ）のうちの１つのみが形成されたことが示唆された。異核多結合相関（「ＨＭＢＣ」）及びＮＯＥスペクトルの更なる分析は、単離された生成物が、強調されたプロトン間で観察されたＮＯＥ増強のために、Ｅ，Ｅ配置を有することを示唆した（図６）。
【0119】
架橋ジエン系の二重結合の１つが電子リッチなチオフェン部分で置き換えられて分子内の電子密度を増加させる誘導体を、式ｖｉｉ～ｉｘに示すように２段階で合成した（図７）。最初に、５－ブロモ－２－チオフェンカルボキシアルデヒドを、アルドール縮合反応条件下で１－インダノン（又は６－ヒドロキシル－１－インダノン）に曝露して、チオブロモ中間体３６を得て、これを鈴木カップリング反応条件下で種々のアリールボロン酸エステルに曝露して（式ｖｉｉ）、化合物３７～４４を生成した。同様に、この系列の他の誘導体を、１－インダノン（式ｖｉｉ及びｖｉｉｉ）及びα－テトラロンと、それぞれ４－ブロモ－２－チオフェンカルボキシアルデヒド及び５－ブロモ－２－チオフェンカルボキシアルデヒドとのアルドール縮合から調製して、対応するチオブロミド中間体４５及び４８を生成した。次いで、これらの中間体を異なるアリールボロン酸エステルに曝露して、それぞれ化合物４６及び４７並びに化合物４９～５１を得た。
【0120】
より具体的には、図７及び図８を参照して、第２の一連の１－インダノニル－及び１，３－インダンジオニル－ジエン誘導体を、それぞれのアリールボロン酸エステルの鈴木カップリングを介して１－インダノニル－ジエンブロミド（７及び１１）及び１，３－インダンジオニル－ジエンブロミド（１７）に第２の環を付加することによって生成して、式ｖ及びｖｉに示すように化合物２９～３５を生成した。したがって、１，４－ジオキサン／Ｈ２Ｏ（４：１、１０ｍＬ）中のインドリノン誘導体（１．０当量）、ボロン酸誘導体（２．０当量）及びＫ２ＣＯ３（１．０当量）の溶液をアルゴンによって２０分間脱気し、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（０．１当量）を添加した。反応混合物を再び脱気し（５分）、１１０℃で一晩撹拌した。反応混合物を水（５ｍＬ）でクエンチし、水層を酢酸エチル（３０ｍＬ）で抽出し、飽和ＮａＨＣＯ３（１０ｍＬ）で洗浄し、ブライン（１０ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーによって精製した。
【0121】
化合物３６、４５、及び４８のＮＯＥ（図９）及びＨＭＢＣスペクトルの分析は、それぞれのアルドール縮合反応から生じる二重結合が全てＺ配座を有することを示した。
【0122】
図１０に示すように、架橋ジエンの二重結合の一方が環系内でマスクされて、分子内の剛性を高めために種々の誘導体にアクセスした。この系列の全てのメンバーは、それぞれのケト誘導体と対応するアルデヒドとの間の単一のアルドール縮合反応でアクセスされた。図１１は、種々の誘導体の化学構造を示す。
【0123】
全ての化合物の構造解明は、１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲ、並びに各個々の化合物の高分解能質量スペクトルの分析によって達成された。全ての化合物のＵＶ／ＶＩＳ吸収及び発光スペクトルをリン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）中で記録した。蛍光顕微鏡研究に適した蛍光特性を有する全ての化合物を合成フィブリル結合研究のために選択した。
【0124】
例３：合成α－Ｓｙｎフィブリルに対する結合親和性（Ｋｄ）
合成された全ての化合物（１９及び２８を除く）は、ＰＢＳ中で良好な発光スペクトルを示した（図１２、表１）。結合親和性を決定した。結合親和性は、単一の生体分子とそのリガンド／結合パートナーとの間の結合相互作用の強さである。結合親和性は、二分子相互作用の強度を評価及び順位づけるために使用される平衡解離定数（Ｋｄ）によって測定及び報告される。Ｋｄ値が小さいほど、その標的に対するリガンドの結合親和性が大きくなる。Ｋｄ値が大きいほど、標的分子とリガンドがより弱く引き寄せられ、互いに結合する。
合成された全ての化合物（１９及び２８を除く）は、ＰＢＳ中で良好な発光スペクトルを示した（図１２、表１）。結合親和性を決定した。結合親和性は、単一の生体分子とそのリガンド／結合パートナーとの間の結合相互作用の強さである。結合親和性は、二分子相互作用の強度を評価及び順位づけるために使用される平衡解離定数（Ｋｄ）によって測定及び報告される。Ｋｄ値が小さいほど、その標的に対するリガンドの結合親和性が大きくなる。Ｋｄ値が大きいほど、標的分子とリガンドがより弱く引き寄せられ、互いに結合する。
【0125】
α－Ｓｙｎフィブリル形成
以下の手順により、Ｒ－ｐｅｐｔｉｄｅから購入したペプチド（１ｍｇ、ｃａｔ＃Ｓ－１００１－２、モル重量１４４６０）からフィブリルを作成した。０．５ｍｇのα－ｓｙｎをセントリコン（１００００ＭＷＣＯ）中の０．２ｍｌの水に懸濁した。この懸濁液に０．２ｍＬリン酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．５）を添加した。遠心分離機（１８０００ｇ／ｓ）で５分間スピニングすることによって可溶性材料を除去した。このプロセスを４回繰り返した。４回目の後、ペプチドをマイクロチューブ（２００μｌ）に移し、２．５μｌの３００ｍＭ ＭｎＣｌ（水中で作成）を添加した。得られた混合物をインキュベーター中４０℃で５～７日間撹拌した（溶液は濁った）。形成されたフィブリルを２１，０００ｇ／ｓで６分間スピンダウンした。上清を廃棄し、フィブリルペレットを２００μｌのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４）に再懸濁した。
以下の手順により、Ｒ－ｐｅｐｔｉｄｅから購入したペプチド（１ｍｇ、ｃａｔ＃Ｓ－１００１－２、モル重量１４４６０）からフィブリルを作成した。０．５ｍｇのα－ｓｙｎをセントリコン（１００００ＭＷＣＯ）中の０．２ｍｌの水に懸濁した。この懸濁液に０．２ｍＬリン酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．５）を添加した。遠心分離機（１８０００ｇ／ｓ）で５分間スピニングすることによって可溶性材料を除去した。このプロセスを４回繰り返した。４回目の後、ペプチドをマイクロチューブ（２００μｌ）に移し、２．５μｌの３００ｍＭ ＭｎＣｌ（水中で作成）を添加した。得られた混合物をインキュベーター中４０℃で５～７日間撹拌した（溶液は濁った）。形成されたフィブリルを２１，０００ｇ／ｓで６分間スピンダウンした。上清を廃棄し、フィブリルペレットを２００μｌのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４）に再懸濁した。
【0126】
α－ｓｙｎフィブリル／リガンド結合アッセイ
ＰＢＳ（ｐＨ＝７．５、１９７μＬ）中の０．１ｎＭ～１０μＭの様々な濃度のリガンド溶液を、α－ｓｙｎフィブリル（３μＬ、２．５μＭの最終濃度）を含有するマイクロチューブに添加した。混合物を振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。混合物を２１，０００ｇ／ｓで１５分間スピンダウンしてフィブリルを分離した。沈殿物をＴｒｉｓ－ＨＣｌで２回洗浄し、２００μＬの緩衝液に再懸濁した。蛍光は、分子の励起及び発光最大値を使用してＳｐｅｃｔｒａＭａｘ－３８４プレートリーダで測定した。全てのデータ点を３連で実施した。結合部位のＫｄ及び最大数（Ｂｍａｘ）の値は、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）ソフトウェア（Ｒ２０１９Ｂ）を使用した非線形回帰によって、データを式Ｙ＝Ｂｍａｘ×Ｘ／（Ｘ＋Ｋｄ）にフィッティングすることによって決定した。
ＰＢＳ（ｐＨ＝７．５、１９７μＬ）中の０．１ｎＭ～１０μＭの様々な濃度のリガンド溶液を、α－ｓｙｎフィブリル（３μＬ、２．５μＭの最終濃度）を含有するマイクロチューブに添加した。混合物を振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。混合物を２１，０００ｇ／ｓで１５分間スピンダウンしてフィブリルを分離した。沈殿物をＴｒｉｓ－ＨＣｌで２回洗浄し、２００μＬの緩衝液に再懸濁した。蛍光は、分子の励起及び発光最大値を使用してＳｐｅｃｔｒａＭａｘ－３８４プレートリーダで測定した。全てのデータ点を３連で実施した。結合部位のＫｄ及び最大数（Ｂｍａｘ）の値は、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）ソフトウェア（Ｒ２０１９Ｂ）を使用した非線形回帰によって、データを式Ｙ＝Ｂｍａｘ×Ｘ／（Ｘ＋Ｋｄ）にフィッティングすることによって決定した。
【0127】
Ｋｄ値≧２μＭを示した全ての化合物（化合物７、１１、１６～１８、２８、５２～５４及び５６）は、不十分な結合剤と考えられ、結合なし（「ＮＢ」）と報告された。
【0128】
一般に、１－インダノン－ジエン誘導体は、８対２０及び１０対２２によって例示されるように、対応する１，３－インダンジオン－ジエンよりも良好な結合剤であると考えられた。１－インダノン－ジエン部分上の任意の芳香族置換（活性化、１３又は非活性化、１４及び１５）は、それぞれ非置換誘導体１０及び８と比較して結合親和性を低下させる。α－テトラロン－ジエン及びクマリン－ジエン誘導体は全て、８、２０、２３及び２５に例示されるように、対応する１－インダノン－ジエン及び１，３－インダノン－ジエン誘導体と比較して劣った結合を示した。Ｋｄが１８．８ｎＭの化合物３２とは別に、第２の芳香族基（Ｃ）に第２の環を付加することは、１－インダノン－ジエン又は１，３－インダンジオン－ジエン系のいずれの結合親和性も改善しないと考えられる。同様に、ジエン架橋中の二重結合の１つを電子リッチなチオペニル部分で置き換えること（化合物８対３９）は、いくつかの中程度のＫｄ値（化合物３７、３９、及び４２）を除いて、α－ｓｙｎフィブリルに対するリガンドの結合親和性にプラスの影響を及ぼさない。架橋ジエンの第２の二重結合をＣ（化合物５２～５８）との縮合環にマスキングすることによって系をより剛性にすると、結合が低くなり、結合がなくなる。
【0129】
例４：α－Ｓｙｎフィブリル対Ａβフィブリルに対する蛍光特性及びリガンド結合選択性
α－ｓｙｎ凝集体は、ＰＤ及び他のシヌクレイノパチーで遭遇する最も優勢なミスフォールドタンパク質凝集体を表すが、いくつかの研究は、Ａβ及びτ凝集体がα－ｓｙｎと重複することが多いことを示唆している。インビボ適用のための潜在的なα－ｓｙｎ剤は、そのような場合の偽陽性を最小限に抑えるために、（特にＡβに対して）高感度及び高選択性の両方でなければならない。１１のリガンドの予備的なα－ｓｙｎフィブリル結合研究は、高い親和性から中程度の親和性（Ｋｄ≦１００ｎＭ）を示した。Ａβフィブリルと比較して、α－ｓｙｎに対するこれらのリガンドの蛍光特性及び結合親和性を更に評価した。遊離配位子の、α－ｓｙｎ又はＡβフィブリルのいずれかの存在下での吸収及び発光最大値並びに蛍光量子収率を決定した。リガンド８（ＸＷ－０１－１１）及び３２（ＸＷ－０１－６４）のデータによって例示されるように（図１３）、リガンドは全て、水性媒体中で≦０．５μＭの濃度で最小の蛍光を示すが、これはα－ｓｙｎ又はＡβフィブリルのいずれかを添加すると著しく増加した。
α－ｓｙｎ凝集体は、ＰＤ及び他のシヌクレイノパチーで遭遇する最も優勢なミスフォールドタンパク質凝集体を表すが、いくつかの研究は、Ａβ及びτ凝集体がα－ｓｙｎと重複することが多いことを示唆している。インビボ適用のための潜在的なα－ｓｙｎ剤は、そのような場合の偽陽性を最小限に抑えるために、（特にＡβに対して）高感度及び高選択性の両方でなければならない。１１のリガンドの予備的なα－ｓｙｎフィブリル結合研究は、高い親和性から中程度の親和性（Ｋｄ≦１００ｎＭ）を示した。Ａβフィブリルと比較して、α－ｓｙｎに対するこれらのリガンドの蛍光特性及び結合親和性を更に評価した。遊離配位子の、α－ｓｙｎ又はＡβフィブリルのいずれかの存在下での吸収及び発光最大値並びに蛍光量子収率を決定した。リガンド８（ＸＷ－０１－１１）及び３２（ＸＷ－０１－６４）のデータによって例示されるように（図１３）、リガンドは全て、水性媒体中で≦０．５μＭの濃度で最小の蛍光を示すが、これはα－ｓｙｎ又はＡβフィブリルのいずれかを添加すると著しく増加した。
【0130】
蛍光の増加は、遊離分子からリガンド－フィブリル複合体への吸光度及び発光最大値の両方の深色シフトを伴い、α－ｓｙｎフィブリルへのリガンド結合時の蛍光量子収率の８～１５倍の増加及びＡβフィブリルへの結合時の更なる２～３倍の増加を伴う（図１４、表２）。
【0131】
これらのリガンドによるフィブリル結合時の蛍光及び発光最大値の観察された深色シフト、蛍光の増加、並びに蛍光量子収率は、βシート結合リガンドの他の観察結果と一致する。
【0132】
Ａβフィブリルに対する結合親和性を飽和結合アッセイで評価した。
【0133】
Ａβフィブリル形成
β－アミロイド（１～４０）ペプチドは、Ｒ－Ｐｅｐｔｉｄｅ（ジョージア州ボガート）から購入した。フィブリルは、Ｅｒｉｃ ｅｔ ａｌ．（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１２，７（１０），ｅ４８５１５）によって概説されたプロトコルに従って調製した。Ａβ（１～４０）をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解して、４３３μｇ／ｍｌ（１００μＭ）の最終濃度にした。溶液を、マグネチックスターラを使用して室温で４日間７００ｒｐｍで撹拌して、フィブリルの形成を促進した。ストック溶液を等分し、将来の使用のために－８０℃で保存した。フィブリルの均一な懸濁液を維持するために、ストック溶液を十分に撹拌した後、結合アッセイのためのアリコートを除去した。
β－アミロイド（１～４０）ペプチドは、Ｒ－Ｐｅｐｔｉｄｅ（ジョージア州ボガート）から購入した。フィブリルは、Ｅｒｉｃ ｅｔ ａｌ．（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１２，７（１０），ｅ４８５１５）によって概説されたプロトコルに従って調製した。Ａβ（１～４０）をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解して、４３３μｇ／ｍｌ（１００μＭ）の最終濃度にした。溶液を、マグネチックスターラを使用して室温で４日間７００ｒｐｍで撹拌して、フィブリルの形成を促進した。ストック溶液を等分し、将来の使用のために－８０℃で保存した。フィブリルの均一な懸濁液を維持するために、ストック溶液を十分に撹拌した後、結合アッセイのためのアリコートを除去した。
【0134】
Ａβフィブリル／リガンド結合アッセイ
ＰＢＳ（ｐＨ＝７．５、１８０μＬ）中の１ｎＭ～１００μＭの様々な濃度のリガンド溶液を、β－アミロイドフィブリル（２０μＬ、１０μＭの最終濃度）を含有するマイクロチューブに加えた。混合物を振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。混合物を２１，０００ｇ／ｓで１２分間スピンダウンしてフィブリルを分離した。沈殿物をＴｒｉｓ－ＨＣｌで２回洗浄し、２００μＬの緩衝液に再懸濁した。蛍光は、分子の励起及び発光最大値を使用してＳｐｅｃｔｒａＭａｘ－３８４プレートリーダで測定した。全てのデータ点を３連で実施した。結合部位のＫｄ及び最大数（Ｂｍａｘ）の値は、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）ソフトウェア（Ｒ２０１９Ｂ）を使用した非線形回帰によって、データを式Ｙ＝Ｂｍａｘ×Ｘ／（Ｘ＋Ｋｄ）にフィッティングすることによって決定した。
ＰＢＳ（ｐＨ＝７．５、１８０μＬ）中の１ｎＭ～１００μＭの様々な濃度のリガンド溶液を、β－アミロイドフィブリル（２０μＬ、１０μＭの最終濃度）を含有するマイクロチューブに加えた。混合物を振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。混合物を２１，０００ｇ／ｓで１２分間スピンダウンしてフィブリルを分離した。沈殿物をＴｒｉｓ－ＨＣｌで２回洗浄し、２００μＬの緩衝液に再懸濁した。蛍光は、分子の励起及び発光最大値を使用してＳｐｅｃｔｒａＭａｘ－３８４プレートリーダで測定した。全てのデータ点を３連で実施した。結合部位のＫｄ及び最大数（Ｂｍａｘ）の値は、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）ソフトウェア（Ｒ２０１９Ｂ）を使用した非線形回帰によって、データを式Ｙ＝Ｂｍａｘ×Ｘ／（Ｘ＋Ｋｄ）にフィッティングすることによって決定した。
【0135】
結果（図１５、表３）は、化合物２９を除いて、他の全ての化合物が、二桁のα－ｓｙｎフィブリルと比較して、ナノモル範囲のＡβフィブリルへの三桁の解離定数を有することを示す。２つのタンパク質凝集体間の各化合物のＫｄ値の比較は、最も高い親和性（Ｋｄ＝９．７ｎＭ）を有する化合物８が、Ａβに対して１４．４倍の選択性を有することを示唆している。わずかにより中程度のα－ｓｙｎ結合剤である化合物３２（Ｋｄ＝１８．８ｎＭ）は、Ａβに対して２６倍の選択性を有する。中程度のα－ｓｙｎ結合剤でもある化合物３７（Ｋｄ＝３４．９ｎＭ）は、Ａβに対して１１．２倍の選択性を有する。
【0136】
例５：蛍光ヒトＰＤ及びＡＤ組織染色
α－ｓｙｎ凝集体に対する十分な蛍光特性、高親和性、及び選択性を考慮して、それぞれ１４．４倍、２６倍、及び１１．２倍のＡβ選択性に対するα－ｓｙｎ選択性を有するリガンド８、３２、及び３７を、ヒトＰＤ及びＡＤ患者の神経病理学的に検証された死後脳試料のインビトロ蛍光染色で更に評価した。ＰＤ脳の脳橋及び前頭皮質からの切片を透過処理し、抗体［抗α－シヌクレイン（ａａ１２１－１２５）抗体、クローンＳｙｎ２１１］及び各化合物の１μＭ溶液で順次処理し、共焦点顕微鏡法によって可視化した。図１６のＩ列は、細胞核を強調する蛍光ヘキスト染色を示し、それによって組織内の細胞体の斜視図を提供する。ＩＩ列はリガンド蛍光を示す。ＩＩＩ列は抗体からの蛍光を示す。ＩＶ列は、最初の３つの画像を混合することによって作成された合成画像である。行Ａは、化合物８（ＸＷ－０１－１１）で処理したＰＤ脳の前頭皮質の切片から得られた画像を示す。画像に見られるように、リガンドは組織内のレビー病変を強力に標識する。パターン及び標識強度は、抗体チャネルにおいて類似しているように見える。合成画像は、リガンド及び抗体シグナルの共局在を示し、それらが同じ病理に結合することを確認する。同様に、行Ｂのリガンド３２（ＸＷ－０１－６４）で処理した切片は、リガンドによるレビー病変の強力な標識を示し、これは抗体の染色パターン及び強度によって裏付けられる。リガンド８で観察されるように、リガンド３２と抗体画像との混合から画像化された複合体はまた、両方のシグナルの共局在化を示し、死後のヒトＰＤ脳切片におけるレビー病変の標識化におけるこれらのリガンドの効率を確認する。処理された組織の近接したＺ積層画像（Ｃ行）では、病変はリガンド及び抗体チャネルの暗孔（矢印）を取り囲むように見える。核染色、リガンド、及び抗体シグナルを混合することによって作成された合成画像は、リガンド及び抗体チャネルの暗点が、実際には、高倍率（行Ｄ）でより顕著な核によって占有されたスポットであることを示す。核の近接及び位置は、予想されるように、観察された病状が細胞質封入体であり、細胞外凝集体ではないことを示唆している。
α－ｓｙｎ凝集体に対する十分な蛍光特性、高親和性、及び選択性を考慮して、それぞれ１４．４倍、２６倍、及び１１．２倍のＡβ選択性に対するα－ｓｙｎ選択性を有するリガンド８、３２、及び３７を、ヒトＰＤ及びＡＤ患者の神経病理学的に検証された死後脳試料のインビトロ蛍光染色で更に評価した。ＰＤ脳の脳橋及び前頭皮質からの切片を透過処理し、抗体［抗α－シヌクレイン（ａａ１２１－１２５）抗体、クローンＳｙｎ２１１］及び各化合物の１μＭ溶液で順次処理し、共焦点顕微鏡法によって可視化した。図１６のＩ列は、細胞核を強調する蛍光ヘキスト染色を示し、それによって組織内の細胞体の斜視図を提供する。ＩＩ列はリガンド蛍光を示す。ＩＩＩ列は抗体からの蛍光を示す。ＩＶ列は、最初の３つの画像を混合することによって作成された合成画像である。行Ａは、化合物８（ＸＷ－０１－１１）で処理したＰＤ脳の前頭皮質の切片から得られた画像を示す。画像に見られるように、リガンドは組織内のレビー病変を強力に標識する。パターン及び標識強度は、抗体チャネルにおいて類似しているように見える。合成画像は、リガンド及び抗体シグナルの共局在を示し、それらが同じ病理に結合することを確認する。同様に、行Ｂのリガンド３２（ＸＷ－０１－６４）で処理した切片は、リガンドによるレビー病変の強力な標識を示し、これは抗体の染色パターン及び強度によって裏付けられる。リガンド８で観察されるように、リガンド３２と抗体画像との混合から画像化された複合体はまた、両方のシグナルの共局在化を示し、死後のヒトＰＤ脳切片におけるレビー病変の標識化におけるこれらのリガンドの効率を確認する。処理された組織の近接したＺ積層画像（Ｃ行）では、病変はリガンド及び抗体チャネルの暗孔（矢印）を取り囲むように見える。核染色、リガンド、及び抗体シグナルを混合することによって作成された合成画像は、リガンド及び抗体チャネルの暗点が、実際には、高倍率（行Ｄ）でより顕著な核によって占有されたスポットであることを示す。核の近接及び位置は、予想されるように、観察された病状が細胞質封入体であり、細胞外凝集体ではないことを示唆している。
【0137】
リガンド及び抗体Ｓｙｎ２１１組織染色実験によって標識された部位を更に特徴付けるために、隣接する皮質切片を化合物８で処理し、次いで、Ｓｙｎ２１１又はＳｙｎ３０３のいずれかで処理した。予想通り、化合物８及びＳｙｎ２１１（図１７、１行目）で処理した切片は、合成画像において共局在する同一のリガンド及び抗体標識パターンを示す。リガンド及び抗体の両方が、組織上に存在する全ての形態の病理を標識すると考えられる。一方、リガンド及び抗体Ｓｙｎ３０３（図１７、２行目）で処理した組織切片は、リガンドチャネルでは小さい神経突起（上の矢印）の両方が効果的に標識されるが、抗体チャネルでは成熟レビー小体のみ（下の矢印）が標識される。これらの所見は、標識された病理がα－ｓｙｎであり、リガンドが病理の全ての立体配座を標識することを示唆する。
【0138】
ヒト組織中の凝集物上のα－ｓｙｎ対Ａβフィブリル結合で観察された選択性を評価するために、等モル濃度のリガンド８、３２、及び３７を、ＡＤ患者の神経病理学的に検証された死後脳試料からの皮質切片と一緒に、上記のようにＰＤ組織上で更に評価した。図１８は、α－ｓｙｎ対Ａβに対して１４．４倍の選択性を有するトップの結合剤（８）からのデータを示す。行Ａで観察され得るように、ＰＤ組織は、病理の大きな沈着物と細かい沈着物の両方の強力な標識を示す（ＩＩ列）。同様の標識パターン及び効率が抗体チャネル（ＩＩＩ列）で観察される。両方のシグナルをヘキストシグナルと混合することによって生成された合成画像（ＩＶ列）は、リガンド及び抗体シグナルの共局在を示す。ＰＤ組織とは異なり、ＡＤ組織からの蛍光画像（Ｂ行）は、リガンドチャネル（ＩＩ列）においてほとんどが高密度コアＡβプラークを示すが、拡散プラークからなるより微細な凝集体は示さない。抗体、抗βアミロイド、１７－２４抗体（４Ｇ８）は、高密度コア及びびまん性Ａβ病理の両方を強調している（ＩＩＩ列）。両方のシグナルをヘキストシグナルと混合することによって生成された合成画像は、高密度コアプラークからのリガンド及び抗体シグナルの重複を示す（ＩＶ列）。このデータは、リガンドがフィブリルＡβよりも高い効率でフィブリルα－ｓｙｎを標識することを示唆している。処理されたＡＤ組織からの高倍率画像（列Ｃ）は、予想されるように、観察されたＡβ病変は、ＰＤ組織で観察された細胞内レビー病変とは異なり、細胞外であることを示す。
【0139】
ヒト組織の取得
ヒトＰＤ脳組織及びＡＤ脳組織を、ＮＩＨ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｂａｎｋから得た。
ヒトＰＤ脳組織及びＡＤ脳組織を、ＮＩＨ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｂａｎｋから得た。
【0140】
ヒトＰＤ脳組織におけるα－ｓｙｎ病理の標識化
中脳組織（前頭皮質５４６９）をＴｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ Ｏ．Ｃ．Ｔ．で包埋した。化合物を液体窒素中に３０分間保持した。－２０℃下でＬｅｃｉａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｒｙｏｓｔａｔを用いて、包埋された組織を厚さ３０μｍの切片にスライスし、予備洗浄した顕微鏡スライドに取り付けた。切片を１×ＰＢＳＴで２回洗浄し、１０％ホルマリン溶液を２０分間ロードした。切片を１×ＰＢＳで３回洗浄し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００で１０分間透過処理した。切片を１×ＰＢＳで２回洗浄し、２％正常ロバ血清と共に室温で１時間インキュベートした。切片を抗α－シヌクレイン（ａａ１２１－１２５）抗体、クローンＳｙｎ２１１（Ａｓｃｉｔｅｓ ｆｒｅｅ）（１％ロバ血清中１：１０００）と共に４℃で一晩インキュベートし、１×ＰＢＳで３回洗浄した。切片を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８（ＰＢＳ中１：２００）で標識した蛍光二次抗体と室温で２時間インキュベートした。切片を１×ＰＢＳＴで３回洗浄し、試験する化合物で処理した。各組織切片を、ＰＢＳに溶解した５μＭの試験化合物と共に室温で３０分間インキュベートした。切片を１×ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＴｒｕｅＢｌａｃｋ Ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎ Ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（エタノール中１：２０）を２分間ロードした。切片を１×ＰＢＳで３回洗浄し、カバーガラスを被せた。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７用の標準的な励起／発光フィルターを使用して、Ｌｅｃｉａ ＤＭｉ８電動蛍光顕微鏡で組織を画像化した。
中脳組織（前頭皮質５４６９）をＴｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ Ｏ．Ｃ．Ｔ．で包埋した。化合物を液体窒素中に３０分間保持した。－２０℃下でＬｅｃｉａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｒｙｏｓｔａｔを用いて、包埋された組織を厚さ３０μｍの切片にスライスし、予備洗浄した顕微鏡スライドに取り付けた。切片を１×ＰＢＳＴで２回洗浄し、１０％ホルマリン溶液を２０分間ロードした。切片を１×ＰＢＳで３回洗浄し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００で１０分間透過処理した。切片を１×ＰＢＳで２回洗浄し、２％正常ロバ血清と共に室温で１時間インキュベートした。切片を抗α－シヌクレイン（ａａ１２１－１２５）抗体、クローンＳｙｎ２１１（Ａｓｃｉｔｅｓ ｆｒｅｅ）（１％ロバ血清中１：１０００）と共に４℃で一晩インキュベートし、１×ＰＢＳで３回洗浄した。切片を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８（ＰＢＳ中１：２００）で標識した蛍光二次抗体と室温で２時間インキュベートした。切片を１×ＰＢＳＴで３回洗浄し、試験する化合物で処理した。各組織切片を、ＰＢＳに溶解した５μＭの試験化合物と共に室温で３０分間インキュベートした。切片を１×ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＴｒｕｅＢｌａｃｋ Ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎ Ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（エタノール中１：２０）を２分間ロードした。切片を１×ＰＢＳで３回洗浄し、カバーガラスを被せた。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７用の標準的な励起／発光フィルターを使用して、Ｌｅｃｉａ ＤＭｉ８電動蛍光顕微鏡で組織を画像化した。
【0141】
ヒトＡＤ脳組織におけるβアミロイドプラークの染色
中脳組織（前頭皮質５５９０）をＴｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ Ｏ．Ｃ．Ｔ．で包埋した。化合物を液体窒素中に３０分間保持した。－２０℃下でＬｅｃｉａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｒｙｏｓｔａｔを用いて、包埋された組織を厚さ３０μｍの切片にスライスし、予備洗浄した顕微鏡スライドに取り付けた。切片を１×ＰＢＳＴで２回洗浄し、次いで、１０％ホルマリン溶液に２０分間ロードした。切片を１×ＰＢＳで３回洗浄し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００で１０分間透過処理した。切片を１×ＰＢＳで２回洗浄し、２％正常ロバ血清と共に室温で１時間インキュベートした。切片を精製抗βアミロイド、１７－２４抗体（４Ｇ８）（１％ロバ血清中１：５００）と共に４℃で一晩インキュベートし、１×ＰＢＳで３回洗浄した。切片を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８（ＰＢＳ中１：２００）で標識した蛍光二次抗体と室温で２時間インキュベートした。切片を１×ＰＢＳＴで３回洗浄し、試験する化合物で処理した。各組織切片を、ＰＢＳに溶解した５μＭの試験化合物と共に室温で３０分間インキュベートした。切片を１×ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＴｒｕｅＢｌａｃｋ Ｌｉｎｐｏｆｕｓｃｉｎ Ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（エタノール中１：２０）を２分間ロードした。切片を１×ＰＢＳで３回洗浄し、カバーガラスを被せた。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７用の標準的な励起／発光フィルターを使用して、Ｌｅｃｉａ ＤＭｉ８電動蛍光顕微鏡で組織を画像化した。
中脳組織（前頭皮質５５９０）をＴｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ Ｏ．Ｃ．Ｔ．で包埋した。化合物を液体窒素中に３０分間保持した。－２０℃下でＬｅｃｉａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｒｙｏｓｔａｔを用いて、包埋された組織を厚さ３０μｍの切片にスライスし、予備洗浄した顕微鏡スライドに取り付けた。切片を１×ＰＢＳＴで２回洗浄し、次いで、１０％ホルマリン溶液に２０分間ロードした。切片を１×ＰＢＳで３回洗浄し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００で１０分間透過処理した。切片を１×ＰＢＳで２回洗浄し、２％正常ロバ血清と共に室温で１時間インキュベートした。切片を精製抗βアミロイド、１７－２４抗体（４Ｇ８）（１％ロバ血清中１：５００）と共に４℃で一晩インキュベートし、１×ＰＢＳで３回洗浄した。切片を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８（ＰＢＳ中１：２００）で標識した蛍光二次抗体と室温で２時間インキュベートした。切片を１×ＰＢＳＴで３回洗浄し、試験する化合物で処理した。各組織切片を、ＰＢＳに溶解した５μＭの試験化合物と共に室温で３０分間インキュベートした。切片を１×ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＴｒｕｅＢｌａｃｋ Ｌｉｎｐｏｆｕｓｃｉｎ Ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（エタノール中１：２０）を２分間ロードした。切片を１×ＰＢＳで３回洗浄し、カバーガラスを被せた。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７用の標準的な励起／発光フィルターを使用して、Ｌｅｃｉａ ＤＭｉ８電動蛍光顕微鏡で組織を画像化した。
【0142】
ヒト脳組織ＨＲＰ－ＤＡＢ染色
中脳組織（前頭皮質５４６９又は前頭皮質５５９０）をＴｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ Ｏ．Ｃ．Ｔ．で固定した。化合物を液体窒素中に３０分間保持した。－２０℃下でＬｅｃｉａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｒｙｏｓｔａｔを用いて、冷凍した組織を厚さ３０μｍの切片にスライスし、予備洗浄した顕微鏡スライドに取り付けた。切片を１×ＰＢＳＴで２回洗浄し、１０％ホルマリン溶液を２０分間ロードした。切片を１×ＰＢＳで３回洗浄し、５０μｌの過酸化物Ｂｌｏｃｋを各切片に適用し、室温で１０分間インキュベートした。切片を１×ＰＢＳで２回洗浄し、２％正常ロバ血清と共に室温で１時間インキュベートした。切片を抗α－シヌクレイン（ａａ１２１－１２５）抗体、クローンＳｙｎ２１１（Ａｓｃｉｔｅｓ ｆｒｅｅ）（１％ロバ血清中１：１０００）又は精製抗β－アミロイド、１７－２４抗体（４Ｇ８）（１％ロバ血清中１：５００）と共に４℃で一晩インキュベートし、１×ＰＢＳで３回洗浄した。切片をビオチン化二次抗体と室温で２時間インキュベートし、１×ＰＢＳＴで３回洗浄した。切片をストレプトアビジン／ＨＲＰ標識と３０分間インキュベートし、１×ＰＢＳＴで３回洗浄した。切片を蒸留水と１０分間インキュベートし、ＤＡＢ Ｃｈｒｏｍａｇｅｎ（５０μＬのＤＡＢ Ｃｈｒｏｍａｇｅｎを１ｍｌのＤＡＢ基質と組み合わせる）とインキュベートした。切片を蒸留水で３回洗浄し、アルコールを通して１０分間脱水した。最後に、切片をキシレンでカバースリップまで洗浄し、室温で２日間保存し、明視野顕微鏡で画像化した。
中脳組織（前頭皮質５４６９又は前頭皮質５５９０）をＴｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ Ｏ．Ｃ．Ｔ．で固定した。化合物を液体窒素中に３０分間保持した。－２０℃下でＬｅｃｉａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｒｙｏｓｔａｔを用いて、冷凍した組織を厚さ３０μｍの切片にスライスし、予備洗浄した顕微鏡スライドに取り付けた。切片を１×ＰＢＳＴで２回洗浄し、１０％ホルマリン溶液を２０分間ロードした。切片を１×ＰＢＳで３回洗浄し、５０μｌの過酸化物Ｂｌｏｃｋを各切片に適用し、室温で１０分間インキュベートした。切片を１×ＰＢＳで２回洗浄し、２％正常ロバ血清と共に室温で１時間インキュベートした。切片を抗α－シヌクレイン（ａａ１２１－１２５）抗体、クローンＳｙｎ２１１（Ａｓｃｉｔｅｓ ｆｒｅｅ）（１％ロバ血清中１：１０００）又は精製抗β－アミロイド、１７－２４抗体（４Ｇ８）（１％ロバ血清中１：５００）と共に４℃で一晩インキュベートし、１×ＰＢＳで３回洗浄した。切片をビオチン化二次抗体と室温で２時間インキュベートし、１×ＰＢＳＴで３回洗浄した。切片をストレプトアビジン／ＨＲＰ標識と３０分間インキュベートし、１×ＰＢＳＴで３回洗浄した。切片を蒸留水と１０分間インキュベートし、ＤＡＢ Ｃｈｒｏｍａｇｅｎ（５０μＬのＤＡＢ Ｃｈｒｏｍａｇｅｎを１ｍｌのＤＡＢ基質と組み合わせる）とインキュベートした。切片を蒸留水で３回洗浄し、アルコールを通して１０分間脱水した。最後に、切片をキシレンでカバースリップまで洗浄し、室温で２日間保存し、明視野顕微鏡で画像化した。
【0143】
例６：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ３４００－ＸＷ－０１－１１コンジュゲートの合成
図１９を参照して、ブロモ酢酸エチル（２．３ｇ、１３．５ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の６－ヒドロキシ－１－インダノン（１．０ｇ、６．８ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（２．８ｇ、２０．２ｍｍｏｌ）及びＫＩ（１１２ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）の溶液に一度に添加した。反応混合物を９０℃で一晩撹拌した。この時点で、ＴＬＣ（シリカ、１：３ＥｔＯＡｃ－ヘキサン）は、反応が完了したことを示した。反応混合物を室温に冷却し、溶離液として酢酸エチル（５０ｍＬ）を使用してセライトパッドで濾過し、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーによって精製して、所望の生成物（１．４ｇ、９０％）を白色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．３８（ｄ，Ｊ＝８．４ Ｈｚ，１Ｈ），７．２６（ｄｄ，Ｊ１＝２．４ Ｈｚ，Ｊ２＝８．４ Ｈｚ，１Ｈ），７．１０（ｄ，Ｊ＝２．５ Ｈｚ，１Ｈ），４．６４（ｓ，２Ｈ），４．２６（ｑ，Ｊ＝７．８ Ｈｚ，２Ｈ），３．０６（ｔ，Ｊ＝６．０ Ｈｚ，２Ｈ），２．６９（ｔ，Ｊ＝６．０ Ｈｚ，２Ｈ），１．２９（ｔ，Ｊ＝７．８ Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ２０６．７，１６８．４，１５７．６，１４８．９，１３８．２，１２７．７，１２４．４，１０５．８，６５．３，６１．５，３６．９，２５．１，１４．１．
図１９を参照して、ブロモ酢酸エチル（２．３ｇ、１３．５ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の６－ヒドロキシ－１－インダノン（１．０ｇ、６．８ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（２．８ｇ、２０．２ｍｍｏｌ）及びＫＩ（１１２ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）の溶液に一度に添加した。反応混合物を９０℃で一晩撹拌した。この時点で、ＴＬＣ（シリカ、１：３ＥｔＯＡｃ－ヘキサン）は、反応が完了したことを示した。反応混合物を室温に冷却し、溶離液として酢酸エチル（５０ｍＬ）を使用してセライトパッドで濾過し、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーによって精製して、所望の生成物（１．４ｇ、９０％）を白色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．３８（ｄ，Ｊ＝８．４ Ｈｚ，１Ｈ），７．２６（ｄｄ，Ｊ１＝２．４ Ｈｚ，Ｊ２＝８．４ Ｈｚ，１Ｈ），７．１０（ｄ，Ｊ＝２．５ Ｈｚ，１Ｈ），４．６４（ｓ，２Ｈ），４．２６（ｑ，Ｊ＝７．８ Ｈｚ，２Ｈ），３．０６（ｔ，Ｊ＝６．０ Ｈｚ，２Ｈ），２．６９（ｔ，Ｊ＝６．０ Ｈｚ，２Ｈ），１．２９（ｔ，Ｊ＝７．８ Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ２０６．７，１６８．４，１５７．６，１４８．９，１３８．２，１２７．７，１２４．４，１０５．８，６５．３，６１．５，３６．９，２５．１，１４．１．
【0144】
３７％ＨＣｌ（０．２ｍＬ）を生成物（７００ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）及び酢酸（１０ｍＬ）中の４－ヒドロキシ－３－メトキシシンナムアルデヒド（５８８ｍｇ、３．３ｍｍｏｌ）の溶液にゆっくり添加した。反応混合物を１２０℃で一晩撹拌し、室温に冷却した。冷却した溶媒を氷水に注ぎ、濾別した。固体をメタノール中で再結晶させ、所望の生成物（７６８ｍｇ、７０％）を褐色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １３．０９（ｓ，１Ｈ），９．５２（ｓ，１Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝８．４ Ｈｚ，１Ｈ），７．３２－７．２４（ｍ，３Ｈ），７．１３（ｄｄ，Ｊ１＝６．０ Ｈｚ，Ｊ２＝９．０ Ｈｚ，１Ｈ），７．０８（ｄ，Ｊ＝５．４ Ｈｚ，１Ｈ），７．０６（ｔｄ，Ｊ１＝３．０ Ｈｚ，Ｊ２＝７．８ Ｈｚ，１Ｈ），６．８１（ｄ，Ｊ＝８．４ Ｈｚ，１Ｈ），４．７９（ｓ，２Ｈ），３．８５（ｓ，３Ｈ），３．８４（ｓ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １９２．７，１７０．６，１４８．４，１４２．６，１４０．４，１３５．８，１３４．２，１２７．９，１２３．７，１２２．４，１０６．３，６５．３，５６．２，２９．９．
【0145】
生成物（１２０ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）及び乾燥ＤＭＦ（８ｍＬ）中のＤＳＰＥ－ＰＥＧ３４００－ＮＨ２（５００ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＳＴＵ（１６０ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で２日間撹拌し、減圧下で濃縮した。残渣をメタノール／水混合物（１：１、８ｍｌ）で希釈し、２０００ＭＷＣＯ透析カセットにロードし、ＭＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、２×５リットル）で８時間透析し、水（３×５リットル）で２日間透析した。凍結乾燥により水分を除去し、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ３４００－ＸＷ－０１－１１（２４２ｍｇ、４８％）を黄色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．４５（ｄ，Ｊ＝８．４ Ｈｚ，１Ｈ），７．２３（ｄｄ，Ｊ１＝２．４ Ｈｚ，Ｊ２＝５．６ Ｈｚ，１Ｈ），７．１９－７．１７（ｍ，２Ｈ），７．１５（ｄ，Ｊ＝２．４ Ｈｚ，１Ｈ），７．０２－６．９９（ｍ，３Ｈ），６．７８（ｄｄ，Ｊ１＝８．４ Ｈｚ，Ｊ２＝１０．８ Ｈｚ，１Ｈ），５．０９（ｂｒｓ，１Ｈ），４．４８（ｓ，２Ｈ），４．３０（ｄｄ，Ｊ１＝２．４ Ｈｚ，Ｊ２＝１２．０ Ｈｚ，１Ｈ），４．１２－４．０６（ｍ，２Ｈ），４．０１（ｔ，Ｊ＝４．２ Ｈｚ，２Ｈ），３．９８（ｂｒｓ，２Ｈ），３．８１－３．７７（ｍ，５Ｈ），３．７３（ｓ，２Ｈ），３．４９（ｄｄ，Ｊ１＝２．４ Ｈｚ，Ｊ２＝７．８ Ｈｚ，２Ｈ），３．４８－３．４６（ｍ，３Ｈ），３．３５－３．３２（ｍ，４Ｈ），３．２０－３．１８（ｍ，２Ｈ），２．２１－２．１８（ｍ，４Ｈ），１．９３－１．９２（ｍ，４Ｈ），１．５０－１．４７（ｍ，４Ｈ），０．７６１（ｔ，Ｊ＝６．０ Ｈｚ，６Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２１９Ｈ４１０Ｎ２Ｏ９２Ｐ ［Ｍ＋Ｈ］＋４５７１．７２０３，ｆｏｕｎｄ，４５７１．７０６９．
【0146】
例７：化合物８（ＸＷ－０１－１１）標識リポソームの作製
ＨＳＰＣ：ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ２０００：Ｃｈｏｌ：Ｇｄ－ＤＯＴＡ－ＤＳＰＥ：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ３４００－ＸＷ－０１－１１を３２：２．５：４０：２５：０．５のモル比（％）で含む脂質混合物を６０～６５℃でエタノール（６００μＬ）に溶解した。エタノールに溶解したＤＨＰＥ－ローダミン（２００μＬ中１ｍｇ）を添加し、生じた溶液を、ヒスチジン緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）（１０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、約ｐＨ７．６）で６０～６５℃で４５分間水和させた。水和した脂質溶液を、高圧押出機（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ、カナダブリティッシュコロンビア州バンクーバー）を使用して、６０～６５℃で４００ｎｍ（５回通過）、続いて２００ｎｍ（８回通過）のヌクレオポア膜に連続的に押し出して、所望のサイズのリポソームを形成した（動的光散乱（ＤＬＳ）装置（米国ニューヨーク州ホルツビルのＢｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒｐ．）。リポソーム懸濁液を、３００ｋＤａの分子量カットオフ膜（米国カリフォルニア州のＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を使用してヒスチジン緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）に対して透析して、非カプセル化材料を除去した。対照リポソーム（非標的化リポソーム）を同じプロトコルを用いて調製したが、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ３４００－ＸＷ－０１－１１画分をｍＰＥＧ２０００で置き換えた。
ＨＳＰＣ：ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ２０００：Ｃｈｏｌ：Ｇｄ－ＤＯＴＡ－ＤＳＰＥ：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ３４００－ＸＷ－０１－１１を３２：２．５：４０：２５：０．５のモル比（％）で含む脂質混合物を６０～６５℃でエタノール（６００μＬ）に溶解した。エタノールに溶解したＤＨＰＥ－ローダミン（２００μＬ中１ｍｇ）を添加し、生じた溶液を、ヒスチジン緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）（１０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、約ｐＨ７．６）で６０～６５℃で４５分間水和させた。水和した脂質溶液を、高圧押出機（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ、カナダブリティッシュコロンビア州バンクーバー）を使用して、６０～６５℃で４００ｎｍ（５回通過）、続いて２００ｎｍ（８回通過）のヌクレオポア膜に連続的に押し出して、所望のサイズのリポソームを形成した（動的光散乱（ＤＬＳ）装置（米国ニューヨーク州ホルツビルのＢｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒｐ．）。リポソーム懸濁液を、３００ｋＤａの分子量カットオフ膜（米国カリフォルニア州のＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を使用してヒスチジン緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）に対して透析して、非カプセル化材料を除去した。対照リポソーム（非標的化リポソーム）を同じプロトコルを用いて調製したが、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ３４００－ＸＷ－０１－１１画分をｍＰＥＧ２０００で置き換えた。
【0147】
例８：α－Ｓｙｎフィブリルへの化合物８（ＸＷ－０１－１１）標的化リポソームの結合のインビトロ評価
図２０は、（ａ）本発明の標的化リポソームとα－ｓｙｎフィブリルとの間の反応を示す模式図、（ｂ）例７で調製したリガンド８（ＸＷ－０１－１１）標識リポソームの溶液が１９４ｎｍの平均流体力学的直径を有することを示すＤＬＳグラフ、（ｃ）例７の標的リポソームを１ｎＭのα－ｓｙｎフィブリルと１．５時間インキュベートした後の流体力学的直径（２３４６ｎｍ）の大きな増加を示すＤＬＳグラフであり、これはナノ粒子とフィブリルの間の凝集体の形成に起因し、フィブリルに対するＸＷ－０１－１１の高い親和性によって一緒に保持されたものである、ＤＬＳグラフ、（ｄ）非標的化ナノ粒子（すなわち、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ３４００－ＸＷ－０１－１１画分をｍＰＥＧ２０００に置き換えた）の例示的溶液が１６９ｎｍの平均流体力学的直径を有することを示すＤＬＳグラフ、（ｅ）非標的化ナノ粒子の例示的溶液を１ｎＭのα－ｓｙｎフィブリルと１．５時間インキュベートしても流体力学的直径＞５００ｎｍの粒子は得られず、非標的化ナノ粒子とα－ｓｙｎフィブリルとの間に相互作用がないことを示すＤＬＳグラフを示す。
図２０は、（ａ）本発明の標的化リポソームとα－ｓｙｎフィブリルとの間の反応を示す模式図、（ｂ）例７で調製したリガンド８（ＸＷ－０１－１１）標識リポソームの溶液が１９４ｎｍの平均流体力学的直径を有することを示すＤＬＳグラフ、（ｃ）例７の標的リポソームを１ｎＭのα－ｓｙｎフィブリルと１．５時間インキュベートした後の流体力学的直径（２３４６ｎｍ）の大きな増加を示すＤＬＳグラフであり、これはナノ粒子とフィブリルの間の凝集体の形成に起因し、フィブリルに対するＸＷ－０１－１１の高い親和性によって一緒に保持されたものである、ＤＬＳグラフ、（ｄ）非標的化ナノ粒子（すなわち、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ３４００－ＸＷ－０１－１１画分をｍＰＥＧ２０００に置き換えた）の例示的溶液が１６９ｎｍの平均流体力学的直径を有することを示すＤＬＳグラフ、（ｅ）非標的化ナノ粒子の例示的溶液を１ｎＭのα－ｓｙｎフィブリルと１．５時間インキュベートしても流体力学的直径＞５００ｎｍの粒子は得られず、非標的化ナノ粒子とα－ｓｙｎフィブリルとの間に相互作用がないことを示すＤＬＳグラフを示す。
【0148】
本明細書に引用された全ての特許、特許出願、及び刊行物、並びに電子的に利用可能な資料の完全な開示は、参照により組み込まれる。上記の詳細な説明及び例は、理解を明確にするためにのみ与えられている。そこから不必要な制限を受けることはないと理解される。本発明は、図示及び記載された正確な詳細に限定されず、当業者に明らかな変形例は、特許請求の範囲によって定義される本発明内に含まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【国際調査報告】