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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-12
(54)【発明の名称】ＩＬ４Ｒに結合する抗体とその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230405BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20230405BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20230405BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230405BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230405BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230405BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230405BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230405BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20230405BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20230405BHJP
A61P 11/02 20060101ALI20230405BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20230405BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230405BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230405BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230405BHJP
A61K 31/57 20060101ALI20230405BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230405BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230405BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20230405BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/28 ZNA
C07K16/46
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61P37/08
A61P17/00
A61P11/02
A61P11/06
A61P43/00 121
A61P35/00
A61P43/00 111
A61K45/00
A61K31/57
A61K39/395 N
A61K39/395 T
A61K48/00
A61K35/76
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022551774
(86)(22)【出願日】2021-02-25
(85)【翻訳文提出日】2022-10-03
(86)【国際出願番号】 CN2021077784
(87)【国際公開番号】W WO2021170020
(87)【国際公開日】2021-09-02
(31)【優先権主張番号】62/982,521
(32)【優先日】2020-02-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】516089784
【氏名又は名称】チア タイ ティエンチン ファーマシューティカル グループ カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｃｈｉａ Ｔａｉ Ｔｉａｎｑｉｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．３６９ Ｙｕｚｈｏｕ Ｓｏｕｔｈ Ｒｄ．，Ｌｉａｎｙｕｎｇａｎｇ，Ｊｉａｎｇｓｕ ２２２０６２ Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110001195
【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】チェン，ミンジュ
(72)【発明者】
【氏名】タン，ウェイ
(72)【発明者】
【氏名】ヂョン，キャシー・シアオイエン
(72)【発明者】
【氏名】マ，マーク・ヂーチン
(72)【発明者】
【氏名】シア，シューカイ
(72)【発明者】
【氏名】ヂャン，ヂョンピン
(72)【発明者】
【氏名】シュ，ホンジアン
(72)【発明者】
【氏名】ルー，ヂージエン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA91Y
4B065AA93Y
4B065AB01
4B065AB05
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4C084AA13
4C084AA19
4C084MA02
4C084MA17
4C084MA21
4C084MA22
4C084MA23
4C084MA24
4C084MA52
4C084MA55
4C084MA56
4C084MA59
4C084MA60
4C084MA63
4C084MA66
4C084NA05
4C084ZA341
4C084ZA342
4C084ZA621
4C084ZA891
4C084ZB131
4C084ZB132
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZC021
4C084ZC132
4C084ZC412
4C084ZC751
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C085BB36
4C085CC23
4C085EE01
4C085EE03
4C085GG01
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG08
4C086AA01
4C086AA02
4C086DA10
4C086MA17
4C086MA21
4C086MA22
4C086MA23
4C086MA24
4C086MA52
4C086MA55
4C086MA56
4C086MA59
4C086MA60
4C086MA63
4C086MA66
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZA34
4C086ZA62
4C086ZA89
4C086ZB13
4C086ZB26
4C086ZC02
4C086ZC75
4C087AA01
4C087AA02
4C087CA12
4C087MA02
4C087MA17
4C087MA21
4C087MA22
4C087MA23
4C087MA24
4C087MA52
4C087MA55
4C087MA56
4C087MA59
4C087MA60
4C087MA66
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZA34
4C087ZA62
4C087ZA89
4C087ZB13
4C087ZB26
4C087ZC02
4C087ZC75
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA76
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、ヒトＩＬ４Ｒαに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を提供する。本発明はまた、抗体又はその抗原結合部位をコードする核酸分子、抗体又はその抗原結合部位を発現するための発現ベクター、宿主細胞、及び方法を提供する。本発明はさらに、抗体又はその抗原結合部位を含む二重特異性分子、腫瘍溶解性ウイルス、及び医薬組成物、ならびに本発明の抗ＩＬ４Ｒα抗体又はその抗原結合部位を使用する治療方法を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
インターロイキン４受容体アルファサブユニット（ＩＬ４Ｒα）に結合する単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部位であって、重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、（１）それぞれ配列番号１、５及び１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（２）それぞれ配列番号１、６及び１１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（３）それぞれ配列番号２、７及び１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（４）それぞれ配列番号３、８及び１３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（５）それぞれ配列番号４、８及び１３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；又は（６）それぞれ配列番号３、９及び１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列が含まれる、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部位。
【請求項2】
前記重鎖可変領域は、配列番号３２、３３（Ｘ１＝Ｗ、Ｘ２＝Ｓ；Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ａ；Ｘ１＝Ｗ、Ｘ２＝Ａ）、３４、３８、４０、４１（Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｋ、Ｘ３＝Ｖ、Ｘ４＝Ｈ；Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｋ、Ｘ３＝Ｖ、Ｘ４＝Ｈ；Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｑ、Ｘ３＝Ｖ、Ｘ４＝Ｈ；Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｋ、Ｘ３＝Ｍ、Ｘ４＝Ｈ；Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｋ、Ｘ３＝Ｖ、Ｘ４＝Ｙ；Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｋ、Ｘ３＝Ｍ、Ｘ４＝Ｈ）、４２（Ｘ１＝Ｒ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ｓ、Ｘ４＝Ｎ；Ｘ１＝Ｋ、Ｘ２＝Ｖ、Ｘ３＝Ｓ、Ｘ４＝Ｎ；Ｘ１＝Ｋ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ｔ、Ｘ４＝Ｎ；Ｘ１＝Ｋ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ｓ、Ｘ４＝Ｄ；Ｘ１＝Ｒ、Ｘ２＝Ｖ、Ｘ３＝Ｔ、Ｘ４＝Ｎ）、４３、４４、４７、４９、５１又は５３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列が含まれる、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部位。
【請求項3】
軽鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、（１）それぞれ配列番号１５、２２及び２６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（２）それぞれ配列番号１６、２２及び２７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（３）それぞれ配列番号１７、２３及び２８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（４）それぞれ配列番号１８、２４及び２９に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（５）それぞれ配列番号１９、２４及び３０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（６）それぞれ配列番号２０、２５及び３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；又は（７）それぞれ配列番号２１、２５及び３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列が含まれる、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部位。
【請求項4】
前記軽鎖可変領域は、配列番号３５、３６（Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ｉ；Ｘ１＝Ｆ、Ｘ２＝Ｖ；Ｘ１＝Ｆ、Ｘ２＝Ｉ）、３７、３９、４５、４６、４８、５０、５２又は５４に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列が含まれる、請求項３に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部位。
【請求項5】
前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、（１）それぞれ配列番号１、５、１０、１５、２２及び２６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（２）それぞれ配列番号１、６、１１、１６、２２及び２７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（３）それぞれ配列番号２、７、１２、１７、２３及び２８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（４）それぞれ配列番号３、８、１３、１８、２４及び２９に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（５）それぞれ配列番号４、８、１３、１９、２４及び３０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（６）それぞれ配列番号３、９、１４、２０、２５及び３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；又は（７）それぞれ配列番号３、９、１４、２１、２５及び３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列が含まれる、請求項３に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部位。
【請求項6】
前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、（１）それぞれ配列番号３２及び３５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（２）それぞれ配列番号３３（Ｘ１＝Ｗ、Ｘ２＝Ｓ）及び３６（Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ｉ；Ｘ１＝Ｆ、Ｘ２＝Ｖ；Ｘ１＝Ｆ、Ｘ２＝Ｉ）に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（３）それぞれ配列番号３３（Ｘ１＝Ｗ、Ｘ２＝Ｓ）及び３７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（４）それぞれ配列番号３４及び３６（Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ｉ；Ｘ１＝Ｆ、Ｘ２＝Ｖ；Ｘ１＝Ｆ、Ｘ２＝Ｉ）に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（５）それぞれ配列番号３４及び３７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（６）それぞれ配列番号３３（Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ａ）及び３６（Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ｉ；Ｘ１＝Ｆ、Ｘ２＝Ｖ；Ｘ１＝Ｆ、Ｘ２＝Ｉ）に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（７）それぞれ配列番号３３（Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ａ）及び３７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（８）それぞれ配列番号３３（Ｘ１＝Ｗ、Ｘ２＝Ａ）及び３６（Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ｉ；Ｘ１＝Ｆ、Ｘ２＝Ｖ；Ｘ１＝Ｆ、Ｘ２＝Ｉ）に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（９）それぞれ配列番号３３（Ｘ１＝Ｗ、Ｘ２＝Ａ）及び３７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（１０）それぞれ配列番号３８及び３９に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（１１）それぞれ配列番号４０及び４５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（１２）それぞれ配列番号４１（Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｋ、Ｘ３＝Ｖ、Ｘ４＝Ｈ；Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｋ、Ｘ３＝Ｖ、Ｘ４＝Ｈ；Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｑ、Ｘ３＝Ｖ、Ｘ４＝Ｈ；Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｋ、Ｘ３＝Ｍ、Ｘ４＝Ｈ；Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｋ、Ｘ３＝Ｖ、Ｘ４＝Ｙ；Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｋ、Ｘ３＝Ｍ、Ｘ４＝Ｈ）及び４６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（１３）それぞれ配列番号４２（Ｘ１＝Ｒ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ｓ、Ｘ４＝Ｎ；Ｘ１＝Ｋ、Ｘ２＝Ｖ、Ｘ３＝Ｓ、Ｘ４＝Ｎ；Ｘ１＝Ｋ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ｔ、Ｘ４＝Ｎ；Ｘ１＝Ｋ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ｓ、Ｘ４＝Ｄ；Ｘ１＝Ｒ、Ｘ２＝Ｖ、Ｘ３＝Ｔ、Ｘ４＝Ｎ）及び４６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（１４）それぞれ配列番号４３及び４６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（１５）それぞれ配列番号４４及び４６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（１６）それぞれ配列番号４７及び４８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（１７）それぞれ配列番号４９及び５０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（１８）それぞれ配列番号５１及び５２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；又は（１９）それぞれ配列番号５３及び５４に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列が含まれる、請求項５に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部位。
【請求項7】
前記重鎖可変領域に連結された重鎖定常領域、及び前記軽鎖可変領域に連結された軽鎖定常領域を含み、前記重鎖定常領域は、配列番号５５に示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖定常領域は、配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部位。
【請求項8】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合部位は、（ａ）ヒトＩＬ４Ｒαに結合する；（ｂ）サルＩＬ４Ｒαに結合する；（ｃ）ＩＬ４Ｒα－ＩＬ４相互作用を遮断する；及び（ｄ）ＩＬ４Ｒα－ＩＬ１３－ＩＬ１３Ｒα１相互作用を遮断する、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部位。
【請求項9】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合部位は、マウス抗体、ヒト抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部位。
【請求項10】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合部位は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４アイソタイプである、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部位。
【請求項11】
請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部位をコードするヌクレオチド。
【請求項12】
請求項１１に記載のヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項13】
請求項１１に記載のヌクレオチド又は請求項１２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項14】
請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部位、請求項１１に記載のヌクレオチド、請求項１２に記載の発現ベクター又は請求項１３に記載の宿主細胞、ならびに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項15】
さらに、抗アレルギー剤又は抗腫瘍剤を含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項16】
前記抗アレルギー剤は、抗ヒスタミン剤、コルチコステロイド、β－アドレナリン受容体作動薬、ｃｙｃ－ＬＴｓを標的とする薬物又はＩｇＥを標的とする薬物である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項17】
過剰なＩＬ４及び／又はＩＬ１３シグナル伝達に関連するアレルギー性疾患を治療する方法であって、治療有効量の請求項１４又は１６に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む前記方法。
【請求項18】
前記アレルギー性疾患は、アトピー性皮膚炎、アレルギー反応、アレルギー性鼻炎又はアレルギー性喘息である、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
対象におけるＳＴＡＴ６活性化の増加に関連する腫瘍を治療する方法であって、治療有効量の請求項１４に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む前記方法。
【請求項20】
前記腫瘍は、固形腫瘍である、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年２月２７日に出願された米国仮出願Ｎｏ.６２／９８２,５２１に基づく優先権を主張する。
本出願は、２０２０年２月２７日に出願された米国仮出願Ｎｏ.６２／９８２,５２１に基づく優先権を主張する。
【0002】
前述出願及び本出願で引用される又は審査されているすべての文献（「出願で引用される文献」）、本出願で引用される又は参照されるすべての文献（本出願で引用されるすべての文献、特許、公開された特許出願を含むがこれらに限定されない）（「本出願で引用される文献」）及び本出願で引用される文献中で引用される又は参照されるすべての文献は、本明細書で言及されている製品又は本明細書で参照により組み込まれている文献で言及されている製品の製造業者の指示、説明、製品仕様、及び製品シートとともに、本明細書で参照により本発明の実施に組み込まれ、使用することができる。より具体的には、すべての参照された文献は、個々の文献が参照によって組み込まれるように具体のかつ個別に示された場合と同じ程度に、参照によって組み込まれる。本発明で言及されるすべてのＧｅｎｂａｎｋ配列は、本発明の最も早い有効な出願日の配列であるように、Ｇｅｎｂａｎｋ配列の援用により組み込まれる。
【0003】
技術領域
本発明は、高い親和力及び機能性でヒトＩＬ４Ｒ、特にＩＬ４Ｒαに結合する、単離されたモノクローナル抗体、特にマウス、キメラ又はヒト化のモノクローナル抗体又はそれらの抗原結合部位に関する。本発明はまた、本発明の抗体又はその抗原結合部位をコードする核酸分子、本発明の抗体又はその抗原結合部位を発現させるための発現ベクター、宿主細胞及び方法を提供する。本発明はさらに、本発明の抗体又はその抗原結合部位を含む二重特異性分子、免疫複合体、キメラ抗原受容体、腫瘍溶解性ウイルス及び医薬組成物、ならびに本発明の抗ＩＬ４Ｒα抗体又はその抗原結合部位を使用する治療方法を提供する。
本発明は、高い親和力及び機能性でヒトＩＬ４Ｒ、特にＩＬ４Ｒαに結合する、単離されたモノクローナル抗体、特にマウス、キメラ又はヒト化のモノクローナル抗体又はそれらの抗原結合部位に関する。本発明はまた、本発明の抗体又はその抗原結合部位をコードする核酸分子、本発明の抗体又はその抗原結合部位を発現させるための発現ベクター、宿主細胞及び方法を提供する。本発明はさらに、本発明の抗体又はその抗原結合部位を含む二重特異性分子、免疫複合体、キメラ抗原受容体、腫瘍溶解性ウイルス及び医薬組成物、ならびに本発明の抗ＩＬ４Ｒα抗体又はその抗原結合部位を使用する治療方法を提供する。
【0004】
背景技術
アトピー性皮膚炎、過敏症、アレルギー性鼻炎、アレルギー性喘息などの２型炎症に関連するアレルギー性疾患は、世界中で３０億以上の人々を苦しめ、その発生率は増加し続けている。衛生仮説によると、発生率が高いのは、生活水準が向上するにつれて感染症への曝露が減少し、免疫系が特定の無害なアレルゲンをより処理できるようになるためである（Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｊ. Ｇａｌｌｉ ｅｔ ａｌ.,(２００８)Ｎａｔｕｒｅ ４５４(７２０３)：４４５-４５４）。２型免疫の中心となる２つの要因は、インターロイキン-４（ＩＬ-４）とＩＬ-１３である。それらは、例えば、免疫グロブリンＥ産生、及び炎症部位への先天性細胞動員など２型炎症に関連する主要な特徴のほとんどを推進するために必要である。（Ｇｒｕｎｉｎｇ Ｇ ｅｔ ａｌ.,(１９９８)Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：２２６１-２２６３； Ｒａｎｋｉｎ ＪＡ ｅｔ ａｌ.,(１９９６)Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３：７８２１-７８２５； Ｗｉｌｌｓ-Ｋａｒｐ Ｍ ｅｔ ａｌ.,(１９９８)Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：２２５８-２２６１）。
アトピー性皮膚炎、過敏症、アレルギー性鼻炎、アレルギー性喘息などの２型炎症に関連するアレルギー性疾患は、世界中で３０億以上の人々を苦しめ、その発生率は増加し続けている。衛生仮説によると、発生率が高いのは、生活水準が向上するにつれて感染症への曝露が減少し、免疫系が特定の無害なアレルゲンをより処理できるようになるためである（Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｊ. Ｇａｌｌｉ ｅｔ ａｌ.,(２００８)Ｎａｔｕｒｅ ４５４(７２０３)：４４５-４５４）。２型免疫の中心となる２つの要因は、インターロイキン-４（ＩＬ-４）とＩＬ-１３である。それらは、例えば、免疫グロブリンＥ産生、及び炎症部位への先天性細胞動員など２型炎症に関連する主要な特徴のほとんどを推進するために必要である。（Ｇｒｕｎｉｎｇ Ｇ ｅｔ ａｌ.,(１９９８)Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：２２６１-２２６３； Ｒａｎｋｉｎ ＪＡ ｅｔ ａｌ.,(１９９６)Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３：７８２１-７８２５； Ｗｉｌｌｓ-Ｋａｒｐ Ｍ ｅｔ ａｌ.,(１９９８)Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：２２５８-２２６１）。
【0005】
ＩＬ-４とＩＬ-１３は、ヒトの５番染色体上で互いに隣接しており、調節要素を共有している可能性がある。ｔ－ヘルパー２細胞（ＴＨ２）では、これら２つのサイトカインの協調的及び非協調的発現の両方が観察される（Ｋａｔｈｅｒｉｎｅ Ｂａｏ ｅｔ ａｌ.,(２０１５)Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ７５(１)：２５-３７）。２つのサイトカインは細胞表面受容体に結合して細胞機能を調節し、転写機構を活性化する。具体のには、ＩＬ-４は最初にピコモル親和性でＩＬ-４Ｒα鎖に結合し、ＩＬ-２Ｒγ γｃ鎖を動員してＩ型受容体複合体を形成するか、あるいはＩＬ-１３Ｒα１を動員してＩＩ型受容体複合体を形成する。ＩＬ-２Ｒγ γｃ及びＩＬ-１３Ｒα１のレベル又は可用性によって、受容体複合体形成でどちらを動員するかが決まる。非造血細胞は、ＩＬ-２Ｒγ γｃを発現しないか、低発現するが、ＩＬ-１３Ｒα１を高発現することに対し、リンパ球では逆のことが発見されている。骨髄細胞はこれら２種類の細胞の間にある。ＩＩ型ＩＬ-４受容体複合体の形成は、ＩＬ-１３がＩＬ-１３Ｒα１鎖（ナノモル親和性結合）に結合することによって開始され、ＩＬ-４Ｒα鎖をさらに動員することもできる。ＩＩ型ＩＬ-４受容体に加え、ＩＬ-１３はＩＬ-１３Ｒα２にピコモル親和性で結合することができ、これはおとり受容体と考えられている（Ｉｒｉｎａ Ｇ. Ｌｕｚｉｎａ ｅｔ ａｌ.,(２０１２)Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ ９２(４)：７５３-７６４）。ＩＬ-４受容体複合体が組み立てられると、細胞内シグナル伝達分子が活性化され、その中のＳＴＡＴ６及びＩＲＳシグナル伝達は、Ｉ型ＩＬ-４受容体の活性化に応答するが、ＩＩ型ＩＬ-４受容体はＩＲＳを有意に活性化できない（Ｈｅｌｌｅｒ ＮＭ ｅｔ ａｌ.,(２００８)Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ １(５１)：ｒａ１７-ｒａ１７）。ＳＴＡＴ６シグナル伝達はＴＨ２細胞の分化とＩＬ-４産生に重要であり、ＩＲＳ分子はＰＩ３ＫやｍＴＯＲなどのシグナル伝達経路を活性化する（Ｇａｄａｎｉ ＳＰ ｅｔ ａｌ.,(２０１２)Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８９：４２１３-４２１９）。
【0006】
研究者らは、過剰なＩＬ-４／ＩＬ-１３シグナル伝達がアレルギー性疾患を引き起こす可能性があることを示唆しており、したがって、ＩＬ-４及びＩＬ-１３を介したシグナル伝達を改変するためのいくつかの治療用抗体が開発されている。例えば、ＩＬ-１３に結合するＬｅｐｒｉｋｉｚｕｍａｂ、ＡｎｒｕｋｉｎｚｕｍａｂとＴｒａｌｏｋｉｎｕｍａｂ、及びＩＬ-４を標的するＰａｓｃｏｌｉｚｕｍａｂである。ＤｕｐｉｌｕｍａｂとＰｉｔｒａｋｉｎｒａはＩＬ-４Ｒα拮抗剤であり、ＰｉｔｒａｋｉｎｒａとＩＬ-４Ｒαに結合するとＩ型とＩＩ型の両方のＩＬ-４受容体を遮断する（Ａｎｔｏｎｉｕ ＳＡ(２０１０)Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ １１：１２８６-１２９４）。そして、ＳＴＡＴ６阻害剤は前立腺癌細胞の増殖を阻害することがわかっており、ＩＬ-４／ＩＬ-１３を標的とすることががん治療に役立つ可能性があることを示唆している（Ｎａｐｐｏ Ｇ ｅｔ ａｌ.,(２０１７)Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ ２０１７, ６(５)：ｅ３４２）。したがって、より望ましい治療特性を備えた、ＩＬ－４、ＩＬ－１３及びそれらの受容体（特にＩＬ-４Ｒα）を標的とするより多くの抗体が望まれる。
【0007】
発明の概要
本発明は、従来技術の例えば、Ｄｕｐｉｌｕｍａｂなどの抗ＩＬ４Ｒα抗体と比較して、ヒト及び／又はサルＩＬ４Ｒαと同等以上の結合親和性／能力、及びＩＬ４Ｒα-ＩＬ４／ＩＬ１３-ＩＬ１３Ｒα１相互作用及び対応する細胞内シグナル伝達に対する同等以上の遮断活性を有する、ＩＬ４Ｒα（例えば、ヒトＩＬ４Ｒα）に結合する例えば、マウス、ヒト、キメラ又はヒト化のモノクローナル抗体である単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を提供する。
本発明は、従来技術の例えば、Ｄｕｐｉｌｕｍａｂなどの抗ＩＬ４Ｒα抗体と比較して、ヒト及び／又はサルＩＬ４Ｒαと同等以上の結合親和性／能力、及びＩＬ４Ｒα-ＩＬ４／ＩＬ１３-ＩＬ１３Ｒα１相互作用及び対応する細胞内シグナル伝達に対する同等以上の遮断活性を有する、ＩＬ４Ｒα（例えば、ヒトＩＬ４Ｒα）に結合する例えば、マウス、ヒト、キメラ又はヒト化のモノクローナル抗体である単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を提供する。
【0008】
本発明の抗体又はその抗原結合部位は、ＩＬ４Ｒαタンパク質の検出、ならびにアレルギー性疾患及びがんなどのＩＬ４、ＩＬ１３又はＩＬ４Ｒ関連疾患の治療及び予防を含む、様々な用途に使用することができる。
【0009】
したがって、一側面では、本発明は、単離されたモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体）又はその抗原結合部位を提供する。前記モノクローナル抗体又はその抗原結合部位はＩＬ４Ｒαに結合し、重鎖可変領域を含む。前記重鎖可変領域はＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域を含む。ここで、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域は、（１）それぞれ配列番号１、５及び１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（２）それぞれ配列番号１、６及び１１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（３）それぞれ配列番号２、７及び１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（４）それぞれ配列番号３、８及び１３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（５）それぞれ配列番号４、８及び１３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；又は（６）それぞれ配列番号３、９及び１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列が含まれる。
【0010】
一側面では、本発明の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部位は、重鎖可変領域を含む。前記重鎖可変領域は、配列番号３２、３３（Ｘ１＝Ｗ、Ｘ２＝Ｓ；Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ａ；Ｘ１＝Ｗ、Ｘ２＝Ａ）、３４、３８、４０、４１（Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｋ、Ｘ３＝Ｖ、Ｘ４＝Ｈ；Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｋ、Ｘ３＝Ｖ、Ｘ４＝Ｈ；Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｑ、Ｘ３＝Ｖ、Ｘ４＝Ｈ；Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｋ、Ｘ３＝Ｍ、Ｘ４＝Ｈ；Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｋ、Ｘ３＝Ｖ、Ｘ４＝Ｙ；Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｋ、Ｘ３＝Ｍ、Ｘ４＝Ｈ）、４２（Ｘ１＝Ｒ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ｓ、Ｘ４＝Ｎ；Ｘ１＝Ｋ、Ｘ２＝Ｖ、Ｘ３＝Ｓ、Ｘ４＝Ｎ；Ｘ１＝Ｋ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ｔ、Ｘ４＝Ｎ；Ｘ１＝Ｋ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ｓ、Ｘ４＝Ｄ；Ｘ１＝Ｒ、Ｘ２＝Ｖ、Ｘ３＝Ｔ、Ｘ４＝Ｎ）、４３、４４、４７、４９、５１又は５３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列が含まれる。ここで、前記抗体又はその抗原結合部位はＩＬ４Ｒαに結合する。配列番号３２に示されるアミノ酸配列列は、配列番号５９又は６０に示されるヌクレオチド配列によってコードされ得る。配列番号４０に示されるアミノ酸配列は、配列番号６５又は６６に示されるヌクレオチド配列によってコードされ得る。配列番号３３（Ｘ１＝Ｗ、Ｘ２＝Ａ）及び４１（Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｋ、Ｘ３＝Ｍ、Ｘ４＝Ｈ）に示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号６１又は６７に示されるヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【0011】
一側面では、本発明の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部位はＩＬ４Ｒαに結合する。前記モノクローナル抗体又はその抗原結合部位は、軽鎖可変領域を含む。前記軽鎖可変領域はＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域を含む。ここで、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域は、（１）それぞれ配列番号１５、２２及び２６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（２）それぞれ配列番号１６、２２及び２７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（３）それぞれ配列番号１７、２３及び２８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（４）それぞれ配列番号１８、２４及び２９に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（５）それぞれ配列番号１９、２４及び３０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（６）それぞれ配列番号２０、２５及び３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；又は（７）それぞれ配列番号２１、２５及び３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列が含まれる。
【0012】
一側面では、本発明の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部位は、軽鎖可変領域を含む。前記軽鎖可変領域は、配列番号３５、３６（Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ｉ；Ｘ１＝Ｆ、Ｘ２＝Ｖ；Ｘ１＝Ｆ、Ｘ２＝Ｉ）、３７、３９、４５、４６、４８、５０、５２又は５４に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列が含まれる。ここで、前記抗体又はその抗原結合部位はＩＬ４Ｒαに結合する。配列番号３５に示されるアミノ酸配列は、配列番号６２又は６３に示されるヌクレオチド配列によってコードされ得る。配列番号４５に示されるアミノ酸配列は、配列番号６８又は６９に示されるヌクレオチド配列によってコードされ得る。配列番号３６（Ｘ１＝Ｆ、Ｘ２＝Ｖ）及び４６に示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号６４又は７０に示されるヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【0013】
一側面では、本発明の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部位は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はそれぞれＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域を含む。ここで、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３及び軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、（１）それぞれ配列番号１、５、１０、１５、２２及び２６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（２）それぞれ配列番号１、６、１１、１６、２２及び２７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（３）それぞれ配列番号２、７、１２、１７、２３及び２８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（４）それぞれ配列番号３、８、１３、１８、２４及び２９に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（５）それぞれ配列番号４、８、１３、１９、２４及び３０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（６）それぞれ配列番号３、９、１４、２０、２５及び３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；又は（７）それぞれ配列番号３、９、１４、２１、２５及び３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列が含まれる。ここで、前記抗体又はその抗原結合部位はＩＬ４Ｒαに結合する。
【0014】
一側面では、本発明の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部位は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、（１）それぞれ配列番号３２及び３５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（２）それぞれ配列番号３３（Ｘ１＝Ｗ、Ｘ２＝Ｓ）及び３６（Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ｉ；Ｘ１＝Ｆ、Ｘ２＝Ｖ；Ｘ１＝Ｆ、Ｘ２＝Ｉ）に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（３）それぞれ配列番号３３（Ｘ１＝Ｗ、Ｘ２＝Ｓ）及び３７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（４）それぞれ配列番号３４及び３６（Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ｉ；Ｘ１＝Ｆ、Ｘ２＝Ｖ；Ｘ１＝Ｆ、Ｘ２＝Ｉ）に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（５）それぞれ配列番号３４及び３７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（６）それぞれ配列番号３３（Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ａ）及び３６（Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ｉ；Ｘ１＝Ｆ、Ｘ２＝Ｖ；Ｘ１＝Ｆ、Ｘ２＝Ｉ）に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（７）それぞれ配列番号３３（Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ａ）及び３７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（８）それぞれ配列番号３３（Ｘ１＝Ｗ、Ｘ２＝Ａ）及び３６（Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ｉ；Ｘ１＝Ｆ、Ｘ２＝Ｖ；Ｘ１＝Ｆ、Ｘ２＝Ｉ）に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（９）それぞれ配列番号３３（Ｘ１＝Ｗ、Ｘ２＝Ａ）及び３７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（１０）それぞれ配列番号３８及び３９に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（１１）それぞれ配列番号４０及び４５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（１２）それぞれ配列番号４１（Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｋ、Ｘ３＝Ｖ、Ｘ４＝Ｈ；Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｋ、Ｘ３＝Ｖ、Ｘ４＝Ｈ；Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｑ、Ｘ３＝Ｖ、Ｘ４＝Ｈ；Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｋ、Ｘ３＝Ｍ、Ｘ４＝Ｈ；Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｋ、Ｘ３＝Ｖ、Ｘ４＝Ｙ；Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｋ、Ｘ３＝Ｍ、Ｘ４＝Ｈ）及び４６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（１３）それぞれ配列番号４２（Ｘ１＝Ｒ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ｓ、Ｘ４＝Ｎ；Ｘ１＝Ｋ、Ｘ２＝Ｖ、Ｘ３＝Ｓ、Ｘ４＝Ｎ；Ｘ１＝Ｋ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ｔ、Ｘ４＝Ｎ；Ｘ１＝Ｋ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ｓ、Ｘ４＝Ｄ；Ｘ１＝Ｒ、Ｘ２＝Ｖ、Ｘ３＝Ｔ、Ｘ４＝Ｎ）及び４６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（１４）それぞれ配列番号４３及び４６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（１５）それぞれ配列番号４４及び４６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（１６）それぞれ配列番号４７及び４８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（１７）それぞれ配列番号４９及び５０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；（１８）それぞれ配列番号５１及び５２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列；又は（１９）それぞれ配列番号５３及び５４に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列が含まれる。ここで、前記抗体又はその抗原結合部位はＩＬ４Ｒαに結合する。
【0015】
いくつかの実施形態において、本発明の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部位は、重鎖及び軽鎖を含む。前記重鎖及び軽鎖は、ジスルフィド結合によって連結されており、前記重鎖は、重鎖可変領域及び重鎖定常領域を含み、前記軽鎖は、軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を含む。ここで、重鎖可変領域のＣ末端は、重鎖定常領域のＮ末端に連結されており、軽鎖可変領域のＣ末端は、軽鎖定常領域のＮ末端に連結されている。ここで、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、前述のアミノ酸配列を含み、且つ前記抗体又はその抗原結合部位はＩＬ４Ｒαに結合する。重鎖定常領域は、配列番号５５に示されるアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ４定常領域であり得る。軽鎖定常領域は、配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有するヒトκ定常領域であり得る。配列番号５５及び５６に示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７１及び７２に示されるヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【0016】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、２本の重鎖及び２本の軽鎖を含むか、又は２本の重鎖と２本の軽鎖で構成されている。ここで、各重鎖は、上記の重鎖定常領域、上記の重鎖可変領域又はＣＤＲ配列を含み、各軽鎖は、上記の軽鎖定常領域、上記の軽鎖可変領域又はＣＤＲ配列を含む。ここで、前記抗体はＩＬ４Ｒαに結合する。本発明の抗体は、完全長抗体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４アイソタイプ完全長抗体、好ましくは弱いＡＤＣＣ活性を有するＩｇＧ４アイソタイプ完全長抗体であり得る。軽鎖定常領域は、κ定常領域であり得る。その他の実施形態において、本発明の抗体は、一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）抗体、又は抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ又はＦ(ａｂ’)２フラグメントであり得る。
【0017】
例えば、Ｄｕｐｉｌｕｍａｂなどの従来技術の抗ＩＬ４Ｒα抗体と比較して、本発明の抗体、又はその抗原結合部位は、ヒトＩＬ４Ｒα及び／又はサルＩＬ４Ｒαに対して、同等の（高くない場合）結合親和性／能力を有する。そして、ＩＬ４Ｒα-ＩＬ４／ＩＬ１３-ＩＬ１３Ｒα１相互作用及び対応する細胞内シグナル伝達に対して同等の（高くない場合）遮断活性を持っている。
【0018】
本発明はまた、前記抗体又はその抗原結合部位とは異なる結合特異性を有する第２の機能的分子（例えば、第２の抗体）に連結された、本発明の抗体又はその抗原結合部位を含む二重特異性分子を提供する。本発明は、例えば、抗体薬物コンジュゲートなどの本発明の抗体又はその抗原結合部位を含む免疫複合体さらにを提供する。ここで、前記抗体又はその抗原結合部位は、治療剤（例えば、細胞毒素）に連結されている。他の一側面で、本発明の抗体又はその抗原結合部位は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の一部であり得る。本発明は、キメラ抗原受容体を含むＴ細胞などの免疫細胞をさらに提供する。本発明の抗体又はその抗原結合部位は、腫瘍溶解性ウイルスによってコードされるか、又は腫瘍溶解性ウイルスと共に使用され得る。
【0019】
本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合部位、免疫複合体、二重特異性分子、腫瘍溶解性ウイルス、ＣＡＲ又はＣＡＲ－Ｔ細胞、及び薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、抗アレルギー剤又は抗腫瘍剤をさらに含み得る。
【0020】
本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合部位をコードする核酸分子、ならびに前記核酸分子を含む発現ベクター及び前記発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明は、（ｉ）宿主細胞において抗体を発現すること、及び（ｉｉ）宿主細胞又はその細胞培養物から抗体を単離することを含む、発現ベクターを含む宿主細胞による抗ＩＬ４Ｒα抗体又はその抗原結合部位を調製する方法を提供する。
【0021】
他の一側面で、ＩＬ４／ＩＬ１３シグナル伝達を低減する方法を提供する。ＩＬ４はＩＬ-４Ｒα及びγＣを含む受容体を介してシグナルを伝達し、ＩＬ１３はＩＬ-４Ｒα及びＩＬ１３Ｒα１を含む受容体を介してシグナルを伝達する。ＩＬ４／ＩＬ１３シグナル伝達の非限定的な例には、Ｂ細胞、好酸球、マクロファージ（例えば、活性化マクロファージ）の活性化及び／又は増殖、線維芽細胞の増殖、及び気道平滑筋などの平滑筋の増殖が含まれる。
【0022】
他の一側面で、本発明は、過剰なＩＬ４／ＩＬ１３シグナル伝達に関連する疾患を治療する方法を提供し、前記方法は、治療有効量の本発明の抗体又はその抗原結合部位を対象に投与することを含む。
【0023】
前記疾患は、アレルギー性疾患であり得る。前記アレルギー性疾患は、アトピー性皮膚炎、アレルギー反応、アレルギー性鼻炎又はアレルギー性喘息であり得る。いくつかの実施形態において、アレルギー性疾患を治療する方法は、本発明の組成物、二重特異性分子、又は抗体をコードするか又は保有する腫瘍溶解性ウイルス、あるいは対象において前述同じものを発現することができる核酸分子又はベクターを前記対象に投与することを含み得る。この方法はまた、抗アレルギー剤を投与することを含み得る。前記抗アレルギー剤は、抗ヒスタミン剤、コルチコステロイド、ベータアドレナリン受容体作動薬、ｃｙｃ-ＬＴを標的とする薬剤、又はＩｇＥを標的とする薬剤であり得る。
【0024】
前記疾患は、腫瘍疾患であり得る。前記腫瘍は、固形腫瘍又は非固形腫瘍であり得る。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は前立腺がんである。いくつかの実施形態において、前記方法は、本発明の組成物、二重特異性分子、抗体薬物コンジュゲートなどの免疫複合体、ＣＡＲ－Ｔ細胞、又は抗体をコードするか又は保有する腫瘍溶解性ウイルス、あるいは対象において前述同じものを発現することができる核酸分子又はベクターを前記対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの追加の抗癌抗体、例えば、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＰＤ-１抗体、抗ＰＤ-Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ-３抗体、抗ＣＴＬＡ-４抗体、抗ＴＩＭ ３抗体、抗ＳＴＡＴ３抗体及び／又は抗ＲＯＲ１抗体を、本発明の抗体又はその抗原結合部位と共に投与することができる。別の実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合部位は、サイトカイン（例えば、ＩＬ-２、ＩＬ-２１及び／又はＧＭ-ＣＳＦ）又は共刺激抗体（例えば、抗ＣＤ１３７抗体及び／又は抗ＧＩＴＲ抗体）と共に投与することができる。本発明の抗体は、例えば、マウス抗体、ヒト抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体であり得る。
【0025】
他の一側面で、本発明は、治療有効量の本発明の抗体又はその抗原結合部位を対象に投与することを含む、タイプ２免疫応答を低減する方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記方法は、本発明の組成物、二重特異性分子、又は抗体をコードするか又は保有する腫瘍溶解性ウイルス、又は対象において前述同じものを発現することができる核酸分子又はベクターを前記対象に投与することを含む。
【0026】
他の一側面で、本発明は、診断のための方法、組成物及びキットを提供する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、細胞又は組織におけるＩＬ４Ｒαの存在及び発現を決定するために使用され、予後及び適切な治療及びフォローアップを決定する。
【0027】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び実施例から明らかになるであろうが、これらは限定と解釈されるべきではない。本出願で引用されたすべての文書、Ｇｅｎｂａｎｋの記録、特許、及び公開された特許出願の内容は、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
附図説明
附図説明
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1A】図１Ａ-１Ｃは、マウス抗体Ｂ１Ｄ２Ｆ７Ｄ３Ｂ５（Ａ）、Ｂ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８及びＢ９Ｄ１Ｄ１１Ｆ８Ｄ８（Ｂ）、Ｃ２Ｃ１Ａ１Ａ１及びＣ２Ｂ２Ｆ７Ｂ７（Ｃ）のヒトＩＬ４Ｒαへの結合能力を示す。
【図1B】図１Ａ-１Ｃは、マウス抗体Ｂ１Ｄ２Ｆ７Ｄ３Ｂ５（Ａ）、Ｂ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８及びＢ９Ｄ１Ｄ１１Ｆ８Ｄ８（Ｂ）、Ｃ２Ｃ１Ａ１Ａ１及びＣ２Ｂ２Ｆ７Ｂ７（Ｃ）のヒトＩＬ４Ｒαへの結合能力を示す。
【図1C】図１Ａ-１Ｃは、マウス抗体Ｂ１Ｄ２Ｆ７Ｄ３Ｂ５（Ａ）、Ｂ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８及びＢ９Ｄ１Ｄ１１Ｆ８Ｄ８（Ｂ）、Ｃ２Ｃ１Ａ１Ａ１及びＣ２Ｂ２Ｆ７Ｂ７（Ｃ）のヒトＩＬ４Ｒαへの結合能力を示す。
【図2A】図２Ａ-２Ｄは、マウス抗体Ｂ１Ｄ２Ｆ７Ｄ３Ｂ５（Ａ）、Ｂ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８（Ｂ）、Ｂ９Ｄ１Ｄ１１Ｆ８Ｄ８（Ｃ）、Ｃ２Ｃ１Ａ１Ａ１及びＣ２Ｂ２Ｆ７Ｂ７（Ｄ）の細胞表面ヒトＩＬ４Ｒαへの結合能力を示す。
【図2B】図２Ａ-２Ｄは、マウス抗体Ｂ１Ｄ２Ｆ７Ｄ３Ｂ５（Ａ）、Ｂ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８（Ｂ）、Ｂ９Ｄ１Ｄ１１Ｆ８Ｄ８（Ｃ）、Ｃ２Ｃ１Ａ１Ａ１及びＣ２Ｂ２Ｆ７Ｂ７（Ｄ）の細胞表面ヒトＩＬ４Ｒαへの結合能力を示す。
【図2C】図２Ａ-２Ｄは、マウス抗体Ｂ１Ｄ２Ｆ７Ｄ３Ｂ５（Ａ）、Ｂ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８（Ｂ）、Ｂ９Ｄ１Ｄ１１Ｆ８Ｄ８（Ｃ）、Ｃ２Ｃ１Ａ１Ａ１及びＣ２Ｂ２Ｆ７Ｂ７（Ｄ）の細胞表面ヒトＩＬ４Ｒαへの結合能力を示す。
【図2D】図２Ａ-２Ｄは、マウス抗体Ｂ１Ｄ２Ｆ７Ｄ３Ｂ５（Ａ）、Ｂ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８（Ｂ）、Ｂ９Ｄ１Ｄ１１Ｆ８Ｄ８（Ｃ）、Ｃ２Ｃ１Ａ１Ａ１及びＣ２Ｂ２Ｆ７Ｂ７（Ｄ）の細胞表面ヒトＩＬ４Ｒαへの結合能力を示す。
【図4A】図４Ａ-４Ｂは、ヒトＩＬ４Ｒα-ＩＬ４相互作用に対するマウス抗体Ｂ１Ｄ２Ｆ７Ｄ３Ｂ５、Ｂ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８及びＢ９Ｄ１Ｄ１１Ｆ８Ｄ８（Ａ）、Ｃ２Ｃ１Ａ１Ａ１及びＣ２Ｂ２Ｆ７Ｂ７（Ｂ）の遮断能力を示す。
【図4B】図４Ａ-４Ｂは、ヒトＩＬ４Ｒα-ＩＬ４相互作用に対するマウス抗体Ｂ１Ｄ２Ｆ７Ｄ３Ｂ５、Ｂ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８及びＢ９Ｄ１Ｄ１１Ｆ８Ｄ８（Ａ）、Ｃ２Ｃ１Ａ１Ａ１及びＣ２Ｂ２Ｆ７Ｂ７（Ｂ）の遮断能力を示す。
【図5A】図５Ａ-５Ｂは、ヒトＩＬ４と参照との結合に対するマウス抗体Ｂ１Ｄ２Ｆ７Ｄ３Ｂ５、Ｂ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８及びＢ９Ｄ１Ｄ１１Ｆ８Ｄ８（Ａ）、Ｃ２Ｃ１Ａ１Ａ１及びＣ２Ｂ２Ｆ７Ｂ７（Ｂ）の遮断能力を示す。
【図5B】図５Ａ-５Ｂは、ヒトＩＬ４と参照との結合に対するマウス抗体Ｂ１Ｄ２Ｆ７Ｄ３Ｂ５、Ｂ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８及びＢ９Ｄ１Ｄ１１Ｆ８Ｄ８（Ａ）、Ｃ２Ｃ１Ａ１Ａ１及びＣ２Ｂ２Ｆ７Ｂ７（Ｂ）の遮断能力を示す。
【図6A】図６Ａ-６Ｃは、ヒトＩＬ４と細胞表面ヒトＩＬ４Ｒαとの相互作用に対するマウス抗体Ｂ１Ｄ２Ｆ７Ｄ３Ｂ５及びＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８（Ａ）、Ｂ９Ｄ１Ｄ１１Ｆ８Ｄ８（Ｂ）、Ｃ２Ｃ１Ａ１Ａ１及びＣ２Ｂ２Ｆ７Ｂ７（Ｃ）の遮断能力を示す。
【図6B】図６Ａ-６Ｃは、ヒトＩＬ４と細胞表面ヒトＩＬ４Ｒαとの相互作用に対するマウス抗体Ｂ１Ｄ２Ｆ７Ｄ３Ｂ５及びＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８（Ａ）、Ｂ９Ｄ１Ｄ１１Ｆ８Ｄ８（Ｂ）、Ｃ２Ｃ１Ａ１Ａ１及びＣ２Ｂ２Ｆ７Ｂ７（Ｃ）の遮断能力を示す。
【図6C】図６Ａ-６Ｃは、ヒトＩＬ４と細胞表面ヒトＩＬ４Ｒαとの相互作用に対するマウス抗体Ｂ１Ｄ２Ｆ７Ｄ３Ｂ５及びＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８（Ａ）、Ｂ９Ｄ１Ｄ１１Ｆ８Ｄ８（Ｂ）、Ｃ２Ｃ１Ａ１Ａ１及びＣ２Ｂ２Ｆ７Ｂ７（Ｃ）の遮断能力を示す。
【図7】図７は、マウス抗体Ｂ１Ｄ２Ｆ７Ｄ３Ｂ５、Ｂ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８、Ｂ９Ｄ１Ｄ１１Ｆ８Ｄ８、Ｃ２Ｃ１Ａ１Ａ１及びＣ２Ｂ２Ｆ７Ｂ７の、ＨＥＫ２９３Ｔ-ＩＬ４Ｒα-ＳＴＡＴ６-ＳＴＡＴ６ＬＵＣ-ＬＢ２ 細胞における ＩＬ４ 誘導 ＳＴＡＴ６ リン酸化に対する阻害活性を示す。
【図8】図８は、マウス抗体Ｂ１Ｄ２Ｆ７Ｄ３Ｂ５、Ｂ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８、Ｂ９Ｄ１Ｄ１１Ｆ８Ｄ８、Ｃ２Ｃ１Ａ１Ａ１及びＣ２Ｂ２Ｆ７Ｂ７の、ＨＥＫ２９３Ｔ-ＩＬ４Ｒα-ＳＴＡＴ６-ＳＴＡＴ６ＬＵＣ-ＬＢ２細胞におけるＩＬ１３誘導 ＳＴＡＴ６ リン酸化に対する阻害活性を示す。
【図12】図１２は、キメラ抗体Ｂ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８及びＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１の、ＨＥＫ２９３Ｔ-ＩＬ４Ｒα-ＳＴＡＴ６-ＳＴＡＴ６ＬＵＣ-ＬＢ２ 細胞における ＩＬ４ 誘導 ＳＴＡＴ６ リン酸化に対する阻害活性を示す。
【図13】図１３は、キメラ抗体Ｂ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８及びＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１の、ＨＥＫ２９３Ｔ-ＩＬ４Ｒα-ＳＴＡＴ６-ＳＴＡＴ６ＬＵＣ-ＬＢ２細胞におけるＩＬ１３誘導 ＳＴＡＴ６ リン酸化に対する阻害活性を示す。
【図14A】図１４Ａ-１４Ｂは、ヒト化抗体ｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ２、ｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ４及びｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ１４（Ａ）、ｈｕＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１-Ｖ１４及びｈｕＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１-Ｖ１５（Ｂ）のヒトＩＬ４Ｒαへの結合能力を示す。
【図14B】図１４Ａ-１４Ｂは、ヒト化抗体ｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ２、ｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ４及びｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ１４（Ａ）、ｈｕＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１-Ｖ１４及びｈｕＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１-Ｖ１５（Ｂ）のヒトＩＬ４Ｒαへの結合能力を示す。
【図15A】図１５Ａ-１５Ｂは、ヒト化抗体ｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ２、ｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ４及びｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ１４（Ａ）、ｈｕＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１-Ｖ１４及びｈｕＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１-Ｖ１５（Ｂ）のカニクイザルＩＬ４Ｒαへの結合能力を示す。
【図15B】図１５Ａ-１５Ｂは、ヒト化抗体ｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ２、ｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ４及びｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ１４（Ａ）、ｈｕＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１-Ｖ１４及びｈｕＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１-Ｖ１５（Ｂ）のカニクイザルＩＬ４Ｒαへの結合能力を示す。
【図16A】図１６Ａ-１６Ｂは、ヒト化抗体ｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ２、ｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ４及びｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ１４（Ａ）、ｈｕＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１-Ｖ１４及びｈｕＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１-Ｖ１５（Ｂ）のｃａｌ－ＩＬ４Ｒαへの結合能力を示す。
【図16B】図１６Ａ-１６Ｂは、ヒト化抗体ｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ２、ｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ４及びｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ１４（Ａ）、ｈｕＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１-Ｖ１４及びｈｕＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１-Ｖ１５（Ｂ）のｃａｌ－ＩＬ４Ｒαへの結合能力を示す。
【図17A】図１７Ａ-１７Ｂは、ヒト化抗体ｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ２、ｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ４及びｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ１４（Ａ）、ｈｕＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１-Ｖ１４及びｈｕＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１-Ｖ１５（Ｂ）の細胞表面ヒトＩＬ４Ｒαへの結合能力を示す。
【図17B】図１７Ａ-１７Ｂは、ヒト化抗体ｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ２、ｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ４及びｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ１４（Ａ）、ｈｕＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１-Ｖ１４及びｈｕＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１-Ｖ１５（Ｂ）の細胞表面ヒトＩＬ４Ｒαへの結合能力を示す。
【図18A】図１８Ａ-１８Ｂは、ヒトＩＬ４とヒトＩＬ４Ｒαを発現する２９３Ｆ細胞との相互作用に対するヒト化抗体ｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ２、ｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ４及びｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ１４（Ａ）、ｈｕＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１-Ｖ１４及びｈｕＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１-Ｖ１５（Ｂ）の遮断能力を示す。
【図18B】図１８Ａ-１８Ｂは、ヒトＩＬ４とヒトＩＬ４Ｒαを発現する２９３Ｆ細胞との相互作用に対するヒト化抗体ｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ２、ｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ４及びｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ１４（Ａ）、ｈｕＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１-Ｖ１４及びｈｕＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１-Ｖ１５（Ｂ）の遮断能力を示す。
【図19A】図１９Ａ-１９Ｂは、ヒトＩＬ４Ｒα-ＩＬ４相互作用に対するヒト化抗体ｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ２、ｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ４及びｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ１４（Ａ）、ｈｕＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１-Ｖ１４及びｈｕＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１-Ｖ１５（Ｂ）の遮断能力を示す。
【図19B】図１９Ａ-１９Ｂは、ヒトＩＬ４Ｒα-ＩＬ４相互作用に対するヒト化抗体ｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ２、ｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ４及びｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ１４（Ａ）、ｈｕＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１-Ｖ１４及びｈｕＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１-Ｖ１５（Ｂ）の遮断能力を示す。
【図20A】図２０Ａ-２０Ｂは、ヒトＩＬ４と参照との結合に対するヒト化抗体ｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ２、ｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ４及びｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ１４（Ａ）、ｈｕＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１-Ｖ１４及びｈｕＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１-Ｖ１５（Ｂ）の遮断能力を示す。
【図20B】図２０Ａ-２０Ｂは、ヒトＩＬ４と参照との結合に対するヒト化抗体ｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ２、ｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ４及びｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ１４（Ａ）、ｈｕＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１-Ｖ１４及びｈｕＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１-Ｖ１５（Ｂ）の遮断能力を示す。
【0029】
例として与えられた以下の詳細な説明及び添付の図面は、最もよく理解され得るが、本発明は、記載された特定の実施形態に限定されるべきではない。
【0030】
発明詳述
本発明をよりよく理解するために、いくつかの用語を最初に定義する。その他の定義は、詳細な説明全体に記載されている。
本発明をよりよく理解するために、いくつかの用語を最初に定義する。その他の定義は、詳細な説明全体に記載されている。
【0031】
「ＩＬ４Ｒα」という用語は、インターロイキン４受容体のαサブユニットを指す。「ＩＬ４Ｒα」という用語には、バリアント、サブタイプ、ホモログ、オルソログ、及びパラログが含まれる。例えば、ヒトＩＬ４Ｒαタンパク質に特異的な抗体は、ある場合には、ヒト以外の種（例えば、サル）由来のＩＬ４Ｒαタンパク質と交差反応することがある。その他の実施形態において、ヒトＩＬ４Ｒαタンパク質に特異的な抗体は、ヒトＩＬ４Ｒαタンパク質に完全に特異的であり、他の種又は他のタイプに対して交差反応性を示さないか、又は特定の他の種由来のＩＬ４Ｒαと交差反応するが、他のすべてではなく交差反応する可能性がある。
【0032】
「ヒトＩＬ４Ｒα」という用語は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿００１２４４３３５．１を有するヒトＩＬ４Ｒαのアミノ酸配列など、ヒト由来のアミノ酸配列を有するＩＬ４Ｒαタンパク質を指す。「カニクイザルＩＬ４Ｒα」及び「マーモセットサルＩＬ４Ｒα」という用語は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＥＨＨ６０２６５．１及びＮＰ＿００１２４４１６１．１のアミノ酸配列をそれぞれ有するＩＬ４Ｒα配列を指す。
【0033】
本明細書で言及される「抗体」という用語は、完全長抗体及び任意の抗原結合フラグメント（即ち、「抗原結合部位」）又はその一本鎖を含む。完全長抗体は、ジスルフィド結合によって相互連結された２つの重(Ｈ)鎖と２つの軽(Ｌ)鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略される）及び重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３つのドメインから構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）及び軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬで構成されている。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化することができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端まで、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。重鎖と軽鎖の可変領域には、抗原と相互作用する結合ドメインが含まれている。抗体の定常領域は、免疫系のさまざまな細胞(例えば、エフェクター細胞)及び古典的な補体系の第１の成分(Ｃ１ｑ)を含む宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
【0034】
抗体の「抗原結合部位」(又は単に「抗体部位」)という用語は、本明細書で使用される場合、抗原(例えば、ＩＬ４Ｒαタンパク質)に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ又は複数のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のフラグメントによって実行できることが示されている。抗体の「抗原結合部位」という用語に含まれる結合フラグメントの例には、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ(ａｂ')２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つの Ｆａｂ フラグメントを含む二価フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１からなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体のシングルアームのＶＬ及びＶＨからなるＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ.,(１９８９)Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４-５４６）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；及び（ｖｉｉ）ナノ抗体、単一の可変ドメインと２つの定常ドメインを含む重鎖可変領域；が含まれる。そして、Ｆｖフラグメントの ２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは別々の遺伝子によってコードされているが、組換え法を使用して、それらを一本鎖タンパク質として作成できるようにする合成リンカーによって結合することができる。ここで、ＶＬ及びＶＨが対になって一価分子を形成する（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）といわれる；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ.,(１９８８)Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３-４２６；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ.,(１９８８)Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ ８５：５８７９-５８８３）を参照する。そのような一本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部位」という用語に包含されることを意図している。これらの抗体フラグメントは、当業者に知られている従来の技術を使用して得られ、フラグメントは完全長抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。
【0035】
本明細書で使用される「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことを意図している(例えば、ＩＬ４Ｒαタンパク質に特異的に結合する単離された抗体は、ＩＬ４Ｒαタンパク質以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない)。しかしながら、ヒトＩＬ４Ｒαタンパク質に特異的に結合する単離された抗体は、他の種からのＩＬ４Ｒαタンパク質などの他の抗原に対して交差反応性を有する可能性がある。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【0036】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示す。
【0037】
本明細書で使用される「マウス抗体」という用語は、フレームワーク及びＣＤＲ領域の両方がマウス生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことを意図する。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域もマウス生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本発明のマウス抗体は、マウス生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含むことができる（例えば、インビトロでのランダム又は部位特異的突然変異誘発によって、又はインビボでの体細胞突然変異によって導入された突然変異）。しかし、本明細書で使用する「マウス抗体」という用語は、別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がマウスフレームワーク配列に移植された抗体を含むことを意図していない。
【0038】
「キメラ抗体」という用語は、ヒト以外の源からの遺伝物質をヒトからの遺伝物質と組み合わせることによって産生された抗体を指す。又は、より一般的には、キメラ抗体は、特定の種からの遺伝物質と別の種からの遺伝物質を有する抗体である。
【0039】
本明細書で使用される「ヒト化抗体」という用語は、ヒトで天然に産生される抗体変異体との類似性を高めるためにタンパク質配列が改変された非ヒト種由来の抗体を指す。
【0040】
「アイソタイプ」という用語は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス(例えば、ＩｇＭ又はＩｇＧ１)を指す。
【0041】
「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」、「抗原に対して特異性を有する抗体」という用語は、本明細書では「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と交換可能に使用される。
【0042】
本明細書で使用される場合、「ヒトＩＬ４Ｒαに特異的に結合する」抗体は、ヒトＩＬ４Ｒαタンパク質(及びおそらく１つ又は複数の非ヒト種由来のＩＬ４Ｒαタンパク質)に結合するが、非ヒトＩＬ４Ｒαタンパク質には実質的に結合しない抗体を指す。好ましくは、抗体は「高親和性」でヒトＩＬ４Ｒαタンパク質に結合する。即ち、５．０×-８Ｍ以下、好ましくは１．０×１０-８Ｍ以下、より好ましくは７．０×１０-９Ｍ以下のＫＤでヒトＩＬ４Ｒαタンパク質に結合する。
【0043】
本明細書で使用されるタンパク質又は細胞に「実質的に結合しない」という用語は、本明細書で使用される場合、タンパク質又は細胞に結合しないか、又は高親和性で結合しないこと、即ち、１．０×１０－６Ｍ以上、より好ましくは１．０×１０－５Ｍ以上、より好ましくは１．０×１０－４Ｍ以上、より好ましくは１．０×１０－３Ｍ以上、さらに好ましくは１．０×１０－２Ｍ以上のＫＤでタンパク質又は細胞に結合することを意味する。
【0044】
ＩｇＧ抗体に対する「高親和性」という用語は、標的抗原に対して１．０×１０－６Ｍ以下、より好ましくは５．０×１０－８Ｍ以下、さらにより好ましくは１．０×１０－８Ｍ以下、さらにより好ましくは、７．０×１０－９Ｍ以下、さらに好ましくは１．０×１０－９Ｍ以下のＫＤを有する抗体を指す。ただし、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプでは異なる場合がある。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対する「高親和性」結合は、１．０×１０-６ Ｍ以下、好ましくは１．０×１０-７ Ｍ以下、より好ましくは１．０×１０-８ Ｍ以下のＫＤを有する抗体を指す。
【0045】
本明細書で使用される「Ｋａｓｓｏｃ」又は「Ｋａ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の会合速度を指すことを意図しているのに対し、本明細書で使用される「Ｋｄｉｓ」又は「Ｋｄ」という用語は、 特定の抗体-抗原相互作用の解離速度を指すことを意図している。本明細書で使用される「ＫＤ」という用語は、ＫｄのＫａに対する比率（即ち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される解離定数を指すことを意図している。抗体のＫＤ値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定することができる。抗体のＫＤを決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を使用することによるものであり、好ましくはＢｉａｃｏｒｅＴＭシステムなどのバイオセンサーシステムを使用することによるものである。
【0046】
「ＥＣ５０」という用語は、半数影響量としても知られ、特定の暴露時間後にベースラインと最大値の中間で応答を誘発する抗体の濃度を指す。
【0047】
「ＩＣ５０」という用語は、半数阻害濃度としても知られ、特定の生物学的又は生化学的機能を、抗体の非存在に比べて５０％阻害する抗体の濃度を指す。
【0048】
「対象」という用語は、あらゆるヒト又はヒト以外の動物を含む。「ヒト以外の動物」という用語は、哺乳類及び非哺乳類であるすべての脊椎動物を含み、例えば、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類及び爬虫類が含まれるが、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマなどの哺乳類が好ましい。
【0049】
「治療有效量」という用語は、疾患又は状態（がんなど）に関連する症状を予防又は改善する、及び／又は疾患又は状態の重症度を軽減するのに十分な本発明の抗体の量を意味する。治療有効量は、治療される状態に関連していると理解され、実際の有効量が当業者によって容易に識別されるものである。
【0050】
本発明で使用される用語「同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列間又は２つのポリペプチド間の配列類似性を指す。２つの配列間の配列比較とパーセント同一性決定は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｗｅｂ サイトで入手可能な ＢＬＡＳＴＮ／ＢＬＡＳＴＰ アルゴリズムのデフォルト設定で実行できる。
【0051】
本発明の態様を以下により詳細に説明する。
【0052】
ヒトＩＬ４Ｒαに対する結合親和性が向上し、ＩＬ４／ＩＬ１３シグナル伝達遮断活性が向上した抗ＩＬ４Ｒα抗体
本発明の抗体、又はその抗原結合部位は、以前に記載された抗ＩＬ４Ｒα抗体（Ｄｕｐｉｌｕｍａｂなど）と比較して、（高くない場合）同等の結合親和性／能力でヒトＩＬ４Ｒαに特異的に結合する。
本発明の抗体、又はその抗原結合部位は、以前に記載された抗ＩＬ４Ｒα抗体（Ｄｕｐｉｌｕｍａｂなど）と比較して、（高くない場合）同等の結合親和性／能力でヒトＩＬ４Ｒαに特異的に結合する。
【0053】
本発明の抗体又はその抗原結合部位は、ＩＬ４ＲαのＩＬ４又はＩＬ１３-ＩＬ１３Ｒα１への結合を遮断することができ、それにより対応する細胞内シグナル伝達を遮断することができ、これは報告された抗ＩＬ４Ｒα抗体(Ｄｕｐｉｌｕｍａｂなど) と比較して同等又はより高い遮断活性を有する。
【0054】
好ましくは、本発明の抗体はヒト化モノクローナル抗体である。さらに、あるいは、本発明の抗体は、例えば、キメラモノクローナル抗体であってもよい。
【0055】
抗ＩＬ４Ｒαモノクローナル抗体
本発明の抗体は、以下及び実施例に記載されるように、構造的及び化学的に特徴付けられるモノクローナル抗体である。抗体の重鎖／軽鎖可変領域のアミノ酸配列ＩＤは、以下の表１にまとめて、いくつかの抗体は同じＶＨ又はＶＬを持っている。抗体の重鎖定常領域は、配列番号５５に示されるアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ４重鎖定常領域であり得る。また抗体の軽鎖定常領域は、配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有するヒトκ定常領域であり得る。
本発明の抗体は、以下及び実施例に記載されるように、構造的及び化学的に特徴付けられるモノクローナル抗体である。抗体の重鎖／軽鎖可変領域のアミノ酸配列ＩＤは、以下の表１にまとめて、いくつかの抗体は同じＶＨ又はＶＬを持っている。抗体の重鎖定常領域は、配列番号５５に示されるアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ４重鎖定常領域であり得る。また抗体の軽鎖定常領域は、配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有するヒトκ定常領域であり得る。
【0056】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【0057】
表１の重鎖可変領域ＣＤＲｓ及び軽鎖可変領域ＣＤＲｓは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって定義されている。しかし、当技術分野でよく知られているように、ＣＤＲ領域は、重鎖／軽鎖可変領域配列に基づくＣｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、ＡｂＭ又はＣｏｎｔａｃｔ番号付けシステム／方法などの他の番号付けシステムによって決定することもできる。
【0058】
ヒトＩＬ４Ｒαに結合する他の抗ＩＬ４Ｒα抗体のＶＨ及びＶＬ配列（又はＣＤＲ配列）は、本発明の抗ＩＬ４Ｒα抗体のＶＨ及びＶＬ配列（又はＣＤＲ配列）と「混合及び対形成」することができる。好ましくは、ＶＨ及びＶＬ鎖（又はこれらの鎖のＣＤＲ）が混合されて対になる場合、特定のＶＨ／ＶＬ対からのＶＨ配列は、構造的に類似したＶＨ配列によって置換される。同様に、好ましくは、特定のＶＨ／ＶＬ対からのＶＬ配列は、構造的に類似したＶＬ配列で置換される。
【0059】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合部位は、以下のものを含む：
（ａ）表１に列挙されたアミノ酸配列が含まれる重鎖可変領域；及び
（ｂ）表１に列挙されたアミノ酸配列が含まれる軽鎖可変領域、又はヒトＩＬ４Ｒαに特異的に結合する別の抗ＩＬ４Ｒα抗体のＶＬ。
別の実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合部位は、以下のものを含む：
（ａ）表１に列挙された重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；及び
（ｂ）表１に列挙された軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、又はヒトＩＬ４Ｒαに特異的に結合する別の抗ＩＬ４Ｒα抗体のＣＤＲ。
（ａ）表１に列挙されたアミノ酸配列が含まれる重鎖可変領域；及び
（ｂ）表１に列挙されたアミノ酸配列が含まれる軽鎖可変領域、又はヒトＩＬ４Ｒαに特異的に結合する別の抗ＩＬ４Ｒα抗体のＶＬ。
別の実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合部位は、以下のものを含む：
（ａ）表１に列挙された重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；及び
（ｂ）表１に列挙された軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、又はヒトＩＬ４Ｒαに特異的に結合する別の抗ＩＬ４Ｒα抗体のＣＤＲ。
【0060】
別の実施形態において、本発明の抗体、又はその抗原結合部位は、抗ＩＬ４Ｒα抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２ならびにヒトＩＬ４Ｒαに結合する他の抗体のＣＤＲｓ、例えば、別の抗ＩＬ４Ｒα抗体由来の重鎖可変領域のＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ３、ならびに／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３を含む。
【0061】
さらに、ＣＤＲ３ドメインは、ＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２ドメインとは独立して、単独で相同的な抗原に対する抗体の結合特異性を決定することができ、共通のＣＤＲ３配列に基づいて同じ結合特異性を有する複数の抗体を予測可能に生成することができる。例えば、Ｋｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ.,, Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ. ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ８３(２)：２５２-２６０(２０００)；Ｂｅｉｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ.,, Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ. ２９６：８３３-８４９(２０００)；Ｒａｄｅｒ ｅｔ ａｌ.,, Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. Ｕ.Ｓ.Ａ. ９５：８９１０-８９１５(１９９８)；Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ.,, Ｊ. Ａｍ. Ｃｈｅｍ. Ｓｏｃ. １１６：２１６１-２１６２(１９９４)；Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ.,, Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. Ｕ.Ｓ.Ａ. ９２：２５２９-２５３３(１９９５)；Ｄｉｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ.,, Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. １５７：７３９-７４９(１９９６)；Ｂｅｒｅｚｏｖ ｅｔ ａｌ.,, ＢＩＡｊｏｕｒｎａｌ ８： Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｖｉｅｗ ８(２００１)；Ｉｇａｒａｓｈｉ ｅｔ ａｌ.,, Ｊ. Ｂｉｏｃｈｅｍ(Ｔｏｋｙｏ)１１７：４５２-７(１９９５)；Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ ｅｔ ａｌ.,, Ｊ. Ｖｉｒｏｌ ７２：８０７-１０(１９９８)；Ｌｅｖｉ ｅｔ ａｌ.,, Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. Ｕ.Ｓ.Ａ. ９０：４３７４-８(１９９３)；Ｐｏｌｙｍｅｎｉｓ ａｎｄ Ｓｔｏｌｌｅｒ, Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. １５２：５２１８-５３２９(１９９４)及びＸｕ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ, Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：３７-４５(２０００)を参照してください。また、米国特許ＮＯｓ. ６,９５１,６４６；６,９１４,１２８；６,０９０,３８２；６,８１８,２１６；６,１５６,３１３；６,８２７,９２５；５,８３３,９４３；５,７６２,９０５及び５,７６０,１８５を参照できる これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0062】
したがって、別の実施形態において、本発明の抗体は、抗ＩＬ４Ｒα抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２と、少なくとも抗ＩＬ４Ｒα抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ３又は別の抗ＩＬ４Ｒα抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ３とを含み、かつ当該抗体がヒトＩＬ４Ｒαに特異的に結合する。これらの抗体は、好ましくは、（ａ）ＩＬ４Ｒαへの結合について本発明の抗ＩＬ４Ｒα抗体と競合する；（ｂ）機能的特性を保持する；（ｃ）同じエピトープに結合する；及び／又は（ｄ）同様の結合親和性を有する。別の実施形態において、本発明の抗体はまた、抗ＩＬ４Ｒα抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、又は別の抗ＩＬ４Ｒα抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２を含んでもよく、当該抗体はヒトＩＬ４Ｒαに特異的に結合する。別の実施形態において、本発明の抗体は、抗ＩＬ４Ｒα抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１、又は別の抗ＩＬ４Ｒα抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１をさらに含み得、当該抗体はヒトＩＬ４Ｒαに特異的に結合する。
【0063】
保守的修飾
別の実施形態において、本発明の抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３をそれぞれ含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含み、当該ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列は、本発明の抗ＩＬ４Ｒα抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列とは異なる。当該「異なる」は、１つ又は複数の保守的修飾によるものです。特定の保存的配列修飾が抗原結合を無効にしないことは、当技術分野において理解されている。例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ.,(１９９３)Ｂｉｏｃｈｅｍ ３２：１１８０-８；ｄｅ Ｗｉｌｄｔ ｅｔ ａｌ.,(１９９７)Ｐｒｏｔ. Ｅｎｇ. １０：８３５-４１；Ｋｏｍｉｓｓａｒｏｖ ｅｔ ａｌ.,(１９９７)Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ. ２７２：２６８６４-２６８７０；Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ.,(１９９２)Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. １４９：１６０５-１２；Ｋｅｌｌｅｙ ａｎｄ Ｏ'Ｃｏｎｎｅｌｌ(１９９３)Ｂｉｏｃｈｅｍ.３２：６８６２-３５；Ａｄｉｂ-Ｃｏｎｑｕｙ ｅｔ ａｌ.,(１９９８)Ｉｎｔ. Ｉｍｍｕｎｏｌ.１０：３４１-６及びＢｅｅｒｓ ｅｔ ａｌ.,(２０００)Ｃｌｉｎ. Ｃａｎ. Ｒｅｓ. ６：２８３５-４３を参照ください。
別の実施形態において、本発明の抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３をそれぞれ含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含み、当該ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列は、本発明の抗ＩＬ４Ｒα抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列とは異なる。当該「異なる」は、１つ又は複数の保守的修飾によるものです。特定の保存的配列修飾が抗原結合を無効にしないことは、当技術分野において理解されている。例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ.,(１９９３)Ｂｉｏｃｈｅｍ ３２：１１８０-８；ｄｅ Ｗｉｌｄｔ ｅｔ ａｌ.,(１９９７)Ｐｒｏｔ. Ｅｎｇ. １０：８３５-４１；Ｋｏｍｉｓｓａｒｏｖ ｅｔ ａｌ.,(１９９７)Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ. ２７２：２６８６４-２６８７０；Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ.,(１９９２)Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. １４９：１６０５-１２；Ｋｅｌｌｅｙ ａｎｄ Ｏ'Ｃｏｎｎｅｌｌ(１９９３)Ｂｉｏｃｈｅｍ.３２：６８６２-３５；Ａｄｉｂ-Ｃｏｎｑｕｙ ｅｔ ａｌ.,(１９９８)Ｉｎｔ. Ｉｍｍｕｎｏｌ.１０：３４１-６及びＢｅｅｒｓ ｅｔ ａｌ.,(２０００)Ｃｌｉｎ. Ｃａｎ. Ｒｅｓ. ６：２８３５-４３を参照ください。
【0064】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含む。その中で、
（ａ）重鎖可変領域のＣＤＲ１は、表１に列挙された配列、及び／又はその保存的修飾を含む；及び／又は
（ｂ）重鎖可変領域のＣＤＲ２は、表１に列挙された配列、及び／又はその保存的修飾を含む；及び／又は
（ｃ）重鎖可変領域のＣＤＲ３は、表１に列挙された配列、及び／又はその保存的修飾を含む；及び／又は
（ｄ）軽鎖可変領域のＣＤＲ１、及び／又はＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３は、表１に列挙された配列、及び／又はその保存的修飾を含む；及び
（ｅ）この抗体は、ヒトＩＬ４Ｒαに特異的に結合する。
（ａ）重鎖可変領域のＣＤＲ１は、表１に列挙された配列、及び／又はその保存的修飾を含む；及び／又は
（ｂ）重鎖可変領域のＣＤＲ２は、表１に列挙された配列、及び／又はその保存的修飾を含む；及び／又は
（ｃ）重鎖可変領域のＣＤＲ３は、表１に列挙された配列、及び／又はその保存的修飾を含む；及び／又は
（ｄ）軽鎖可変領域のＣＤＲ１、及び／又はＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３は、表１に列挙された配列、及び／又はその保存的修飾を含む；及び
（ｅ）この抗体は、ヒトＩＬ４Ｒαに特異的に結合する。
【0065】
本発明の抗体は、ヒトＩＬ４Ｒαへの高親和性結合、及びＩＬ４Ｒα-ＩＬ４結合又はＩＬ４Ｒα-ＩＬ１３-ＩＬ１３Ｒα１結合に対する遮断活性などの機能特性の１つ又は複数を有する。
【0066】
いくつかの実施形態において、抗体は、例えば、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体であり得る。
【0067】
本明細書で使用される場合、「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意な影響を及ぼさない、又は変更しないアミノ酸改変を指すことを意図している。そのような保守的修飾には、アミノ酸の置換、付加及び欠失が含まれる。修飾は、点突然変異及びＰＣＲ媒介突然変異などの当技術分野で知られている標準的な技術によって、本発明の抗体に導入することができる。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基を類似の側鎖を持つアミノ酸残基で置換することを指す。類似の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは当技術分野で知っているものである。これらのアミノ酸残基ファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンなど）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸など）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファンなど)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、β-分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸が含まれる。したがって、本発明の抗体のＣＤＲ領域内の１つ又は複数のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置換することができ、変更された抗体が、本明細書に記載の機能アッセイを使用して、保持された機能（即ち、上記の機能）について試験することができる。
【0068】
エンジニアリング及び修飾された抗体
本発明の抗体は、本発明の抗ＩＬ４Ｒα抗体のＶＨ／ＶＬ配列の１つ又は複数を有する抗体を出発物質として使用して、工学的に修飾抗体を調製することができる。抗体は、一方又は両方の可変領域（即ち、ＶＨ及び／又はＶＬ）内（例えば、１つ又は複数のＣＤＲ領域内及び／又は１つ又は複数のフレームワーク領域内）の１つ又は複数の残基を改変することによって工学的改変することができる。
本発明の抗体は、本発明の抗ＩＬ４Ｒα抗体のＶＨ／ＶＬ配列の１つ又は複数を有する抗体を出発物質として使用して、工学的に修飾抗体を調製することができる。抗体は、一方又は両方の可変領域（即ち、ＶＨ及び／又はＶＬ）内（例えば、１つ又は複数のＣＤＲ領域内及び／又は１つ又は複数のフレームワーク領域内）の１つ又は複数の残基を改変することによって工学的改変することができる。
【0069】
ある特定の実施形態において、ＣＤＲ移植は、抗体の可変領域を変更するために使用できる。抗体は、主に重鎖と軽鎖の ６ つの相補性決定領域(ＣＤＲ)にあるアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。したがって、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲ外のアミノ酸配列よりも様々な抗体の間でより多様である。ＣＤＲ 配列はほとんどの抗体-抗原相互作用の原因であるため、特定の天然抗体のＣＤＲ配列を特性相異な抗体のフレームワーク配列へ移植できる発現ベクターを構築することにより、特定の天然抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ.,(１９９８)Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３-３２７；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ.,(１９８６)Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２-５２５；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ.,(１９８９)Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄを参照ください。さらに、Ｕ.Ｓ.Ａ. ８６：１００２９-１００３３；米国特許ＮＯｓ.５,２２５,５３９；５,５３０,１０１；５,５８５,０８９；５,６９３,７６２及び６,１８０,３７０を参照ください）。
【0070】
したがって、本発明の別の実施形態は、重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部位に関する。前記重鎖可変領域は、本発明の上記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、本発明の上記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。これらの抗体は、本発明のモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬ ＣＤＲ配列を含むが、異なるフレームワーク配列を含み得る。
【0071】
このようなフレームワーク配列は、生殖細胞抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベース又は公開された参考文献から入手できる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース（インターネットでｗｗｗ.ｍｒｃ-ｃｐｅ.ｃａｍ.ａｃ.ｕｋ／ｖｂａｓｅで入手可能）；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ.,(１９９１)上記どおり；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ.,(１９９２)Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ. ２２７：７７６-７９８；及びＣｏｘ ｅｔ ａｌ.,(１９９４)Ｅｕｒ. Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. ２４：８２７-８３６から入手でき、それらは参照により明示的に本明細書に組み込まれる。別の実施形態において、ヒト重鎖可変領域遺伝子及びヒト軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースで入手可能である。例えば、ＨＣｏ７ ＨｕＭＡｂマウスからの次の重鎖生殖系列配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ 登録番号は１-６９(ＮＧ--００１０１０９、ＮＴ--０２４６３７ ＆ ＢＣ０７０３３３)、３-３３(ＮＧ--００１０１０９ ＆ ＮＴ--０２４６３７))及び ３-７(ＮＧ--００１０１０９ ＆ ＮＴ--０２４６３７)である。別の実施形態において、ＨＣｏ１２ ＨｕＭＡｂマウスからの次の重鎖生殖系列配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ 登録番号は１-６９（ＮＧ--００１０１０９, ＮＴ--０２４６３７ ＆ ＢＣ０７０３３３）、５-５１（ＮＧ--００１０１０９ ＆ ＮＴ--０２４６３７）、４-３４（ＮＧ--００１０１０９ ＆ ＮＴ--０２４６３７）、３-３０．３（ＣＡＪ５５６６４４）及び３-２３（ＡＪ４０６６７８）である。
【0072】
抗体タンパク質配列は、当業者に周知のＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔ ａｌ.,（１９９７）、上記どおり）と呼ばれる配列類似性検索法を使用して、コンパイルされたタンパク質配列データベースと比較される。
【0073】
本発明で使用される抗体フレームワーク配列は、好ましくは、本発明の抗体フレームワーク配列に構造的に類似するものである。ＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列は、フレームワーク配列が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子と同じ配列を有するフレームワーク領域に移植することができる。あるいは、ＣＤＲ配列は、生殖系列配列と比較して１つ又は複数の変異を含むフレームワーク領域に移植することができる。例えば、抗体の抗原結合能力を維持又は増強するために、フレームワーク領域の残基を変異させることが有益な場合がある。（例えば、米国特許ＮＯｓ.５,５３０,１０１；５,５８５,０８９；５,６９３,７６２及び６,１８０,３７０を参照ください）。
【0074】
可変領域修飾の別のタイプは、ＶＨ及び／又はＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を変異させ、それによって目的の抗体の１つ又は複数の結合特性(例えば、親和性)を改善することである。部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲ媒介突然変異誘発を実施して突然変異を導入することができ、抗体結合又は関心のある他の機能的特性に対する効果を、当技術分野で知られているようにインビトロ又はインビボアッセイで評価することができる。好ましくは、（当技術分野で知られている）保存的改変が導入される。突然変異は、アミノ酸の置換、付加又は欠失であり得るが、好ましくは置換である。さらに、典型的には、ＣＤＲ領域内の１つ、２つ、３つ、４つ又は５つ以下の残基が変更される。
【0075】
したがって、別の実施形態において、本発明は、以下を含む、重鎖可変領域を含む単離された抗ＩＬ４Ｒαモノクローナル抗体、又はその抗原結合部位を提供する；（ａ）本発明のＶＨ ＣＤＲ１配列、又は１、２、３、４又は５個のアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列が含まれるＶＨ ＣＤＲ１領域；（ｂ）本発明のＶＨ ＣＤＲ２配列、又は１、２、３、４又は５個のアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列が含まれるＶＨ ＣＤＲ２領域；（ｃ）本発明のＶＨ ＣＤＲ３配列、又は１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列が含まれるＶＨ ＣＤＲ３領域；（ｄ）本発明のＶＬ ＣＤＲ１配列、又は１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列が含まれるＶＬ ＣＤＲ１領域；（ｅ）本発明のＶＬ ＣＤＲ２配列、又は１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列が含まれるＶＬ ＣＤＲ２領域；及び（ｆ）本発明のＶＬ ＣＤＲ３配列、又は１、２、３、４又は５個のアミノ酸置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列が含まれるＶＬ ＣＤＲ３領域。
【0076】
本発明のエンジニアリング抗体には、例えば、抗体特性を改善するために、ＶＨ及び／又はＶＬのフレームワーク領域残基が修飾られたものが含まれる。一般に、そのようなフレームワーク領域の修飾は、抗体の免疫原性を低下させるために使用することができる。例えば、１つ又は複数のフレームワーク領域残基が、対応する生殖系列配列に「復帰突然変異」される。より具体的には、体細胞変異を受ける抗体は、抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含む可能性がある。そのような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖系列配列と比較することによって同定することができる。
【0077】
別の種類のフレームワーク修飾は、フレームワーク領域内、又は １つ又は複数のＣＤＲ領域内の １つ又は複数の残基を変異させて、Ｔ 細胞エピトープを除去し、それによって抗体の潜在的な免疫原性を低下させる。この方法は「脱免疫化」とも呼ばれ、米国特許公開第２００３０１５３０４３号にさらに詳細に記載されている。
【0078】
さらに、又はフレームワーク又はＣＤＲ領域内で行われる改変の代替として、本発明の抗体は、典型的には抗体の１つ又は複数の機能特性、例えば、血清半減期、補体固定、Ｆｃ 受容体結合、及び／又は抗原依存性細胞傷害などを変更するために、Ｆｃ領域内に改変を含むように操作することができる。さらに、本発明の抗体は、化学的に修飾することができ（例えば、１つ又は複数の化学部分を抗体に結合させることができる）、又は修飾してそのグリコシル化を変更し、再び抗体の１つ又は複数の機能特性を変更することができる。
【0079】
いくつかの実施形態において、ＣＨ１-ヒンジ領域は、ヒンジ領域内のシステイン残基の数が変更（例えば、増加又は減少する）されるように改変される。この方法については、米国特許ＮＯｓ．５，６７７，４２5号にさらに記載されている。ＣＨ１-ヒンジ領域のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖と重鎖の組み立てを促進するため、又は抗体の安定性を増加又は減少させるために変更される。
【0080】
別の実施形態において、抗体のＦｃヒンジ領域を突然変異させて、抗体の生物学的半減期を減少させる。より具体的には、天然のＦｃヒンジドメインと比較してブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）との結合を損なうように、１つ又は複数のアミノ酸変異がＦｃヒンジフラグメントのＣＨ２-ＣＨ３ドメイン界面領域に導入される。この方法は、米国特許ＮＯｓ.Ｎｏ.６,１６５,７４５号にさらに詳細に記載されている。
【0081】
別の実施形態において、抗体のグリコシル化が改変される。例えば、グリコシル化抗体を産生することができる（即ち、抗体はグリコシル化を欠いている）。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を高めるために変更することができる。そのようなグリコシル化修飾は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１つ又は複数の部位を変更することによって達成することができる。例えば、１つ又は複数のアミノ酸置換を行うことで、１つ又は複数の可変領域フレームワークにおけるグリコシル化部位の除去をもたらし、それによってその部位でのグリコシル化を除去することができる。このようなアグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）は、抗原に対する抗体の親和性を高める可能性がある。例えば、米国特許ＮＯｓ.５,７１４,３５０号及び第６,３５０,８６１号を参照ください。
【0082】
さらに、あるいは、フコシル残基の量が減少した低フコシル化抗体又はバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造が増加した抗体など、グリコシル化のタイプが変更された抗体を産生することができる。そのような変化したグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増加又は減少させることが実証されている。このようなグリコシル化修飾は、例えば、改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞において抗体を発現させることによって達成することができる。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は、当技術分野において記載されており、本発明の組換え抗体を発現する宿主細胞として使用して、それによって改変されたグリコシル化を有する抗体を産生することができる。例えば、細胞株Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９は、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８（α（１，６）－フコシルトランスフェラーゼ）を欠いているため、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９細胞株で発現される抗体は、それらの糖鎖がフコースを欠いている。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及び Ｍｓ７０９ ＦＵＴ８-／- 細胞株は、２つの置換ベクターを使用して、ＣＨＯ／ＤＧ４４ 細胞内の目的とするＦＵＴ８ 遺伝子の破壊によって作成されました(米国特許公開番号第２００４０１１０７０４号及び Ｙａｍａｎｅ-Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ.,(２００４ )Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８７： ６１４-２２)を参照ください。別の例として、ＥＰ １, １７６, １９５には、フコシルトランスフェラーゼをコードする機能的に破壊されたＦＵＴ８ 遺伝子を有する細胞株が記載されており、そのような細胞株で発現した抗体は、α-１,６結合関連酵素を減少又は除去することにより低フコシル化を示す。ＥＰ １,１７６,１９５はまた、抗体のＦｃ領域に結合するＮ-アセチルグルコサミンにフコースを付加するための酵素活性が低下したかまたは消えた細胞株、例えば、ラット骨髄腫細胞株ＹＢ２／０(ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２）を記載している。ＰＣＴ公開ＷＯ ０３／０３５８３５ は、Ａｓｎ(２９７)-結合糖鎖にフコースを結合する能力が低下し、その宿主細胞で発現される抗体の低フコシル化ももたらす変異型 ＣＨＯ 細胞株であるＬｅｃ１３細胞を記載している（さらに、Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ.,(２００２)Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ. ２７７：２６７３３-２６７４０を参照ください。）。改変されたグリコシル化プロファイルを有する抗体は、ＰＣＴ公開ＷＯ ０６／０８９２３１に記載されているように、ニワトリの卵でも産生することができる。あるいは、改変されたグリコシル化プロファイルを有する抗体は、ウキクサなどの植物細胞で産生することができる。植物系で抗体を産生する方法は、２００６年８月１１日に出願されたＡｌｓｔｏｎ ＆ Ｂｉｒｄ ＬＬＰの弁護士整理番号０４０９８９／３１４９１１に対応する米国特許出願に開示されている。抗体のフコース残基は、フコシダーゼ酵素を使用して切断することができる。例えば、α-Ｌ-フコシダーゼは、抗体からフコシル残基を除去する（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ.,(１９７５)Ｂｉｏｃｈｅｍ. １４：５５１６-２３）。
【0083】
本発明の抗体の別の修飾は、ＰＥＧ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）である。抗体は、例えば、抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を増加させるためにＰＥＧ化することができる。抗体をＰＥＧ化するために、典型的には、抗体又はそのフラグメントを、１つ又は複数のＰＥＧ基が抗体又は抗体フラグメントに結合する条件下で、ＰＥＧの活性エステル又はアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール(ＰＥＧ)と反応させる。好ましくは、ＰＥＧ化は、活性ＰＥＧ分子（又は類似の活性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応を介して実施される。本明細書で使用されるという用語「ポリエチレングリコール」は、モノ(Ｃ１-Ｃ１０)アルコキシ-又はアリールオキシ - ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール-マレイミドなどの他のタンパク質を誘導体化するために使用されてきたＰＥＧの任意の形態を包含することを意図している。ある特定の実施形態において、ＰＥＧ化される抗体は、非グリコシル化抗体である。タンパク質をＰＥＧ化する方法は当技術分野で知られており、本発明の抗体に適用することができる。例えば、ＥＰ０１５４３１６及びＥＰ０４０１３８４を参照してください。
【0084】
抗体の物理的特性
本発明の抗体は、クラスを検出及び／又は区別するために、それらの様々な物理的特性によって特徴付けることができる。
本発明の抗体は、クラスを検出及び／又は区別するために、それらの様々な物理的特性によって特徴付けることができる。
【0085】
例えば、抗体は、軽鎖又は重鎖可変領域のいずれかに１つ又は複数のグリコシル化部位を含むことができる。このようなグリコシル化部位は、抗体の免疫原性の増加、又は抗原結合の変化による抗体のｐＫの変化をもたらす可能性がある。（Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ(１９７２)Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ４１：６７３-７０２；Ｇａｌａ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ(２００４)Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７２：５４８９-９４；Ｗａｌｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ(１９８８)Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６８：１０９９-１０９； Ｓｐｉｒｏ(２００２)Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １２：４３Ｒ-５６Ｒ；Ｐａｒｅｋｈ ｅｔ ａｌ(１９８５)Ｎａｔｕｒｅ ３１６：４５２-７；Ｍｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ.,(２０００)Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３７：６９７-７０６）。グリコシル化は、Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ 配列を含むモチーフで起こることが知られている。場合によっては、可変領域グリコシル化を含まない抗ＩＬ４Ｒα抗体が好ましい。これは、可変領域にグリコシル化モチーフを含まない抗体を選択するか、グリコシル化領域内の残基を変異させることによって達成できる。
【0086】
好ましい実施形態において、抗体はアスパラギン異性化部位を含まない。アスパラギンの脱アミド化は、Ｎ-Ｇ又はＤ-Ｇ 配列で発生し、ポリペプチド鎖に架橋（ｌｉｎｋ）を導入してその安定性を低下させるイソアスパラギン酸残基の生成をもたらす(イソアスパラギン酸効果)。
【0087】
各抗体は固有の等電点(ｐＩ)を持ち、一般に６～９．５のｐＨ範囲にある。ＩｇＧ１抗体の ｐＩ は通常、ｐＨ範囲７～９．５にあり、ＩｇＧ４抗体の ｐＩ は通常、ｐＨ範囲６～８にある。正常範囲外のｐＩを持つ抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏ 条件下でいくらかのアンフォールディングと不安定性がある可能性があるという推測がある。したがって、正常範囲内のｐＩ値を含む抗ＩＬ４Ｒα抗体を有することが好ましい。これは、正常範囲のｐＩを持つ抗体を選択するか、荷電した表面残基を変異させることによって達成できる。
【0088】
本発明の抗体をコードする核酸分子
他の一側面で、本発明は、本発明の抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域、又はＣＤＲをコードする核酸分子を提供する。核酸は、細胞全体、細胞溶解物に存在する；又は部分的に精製されたもしくは実質的に純粋な形態で存在することができる。核酸は、標準的な技術によって、他の細胞成分又は他の夾雑物、例えば、他の細胞の核酸又はタンパク質から精製されると、「単離される」又は「実質的に純粋になる」ものである。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得、イントロン配列を含んでも含まなくてもよい。好ましい実施形態において、核酸はｃＤＮＡ分子である。
他の一側面で、本発明は、本発明の抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域、又はＣＤＲをコードする核酸分子を提供する。核酸は、細胞全体、細胞溶解物に存在する；又は部分的に精製されたもしくは実質的に純粋な形態で存在することができる。核酸は、標準的な技術によって、他の細胞成分又は他の夾雑物、例えば、他の細胞の核酸又はタンパク質から精製されると、「単離される」又は「実質的に純粋になる」ものである。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得、イントロン配列を含んでも含まなくてもよい。好ましい実施形態において、核酸はｃＤＮＡ分子である。
【0089】
本発明の核酸は、標準的な分子生物学技術を使用して得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、以下でさらに説明するヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスから調製されたハイブリドーマ）によって発現される抗体については、ハイブリドーマによって産生された抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡクローニング技術によって得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから（例えば、ファージディスプレイ技術を使用して）得られた抗体については、そのような抗体をコードする核酸を遺伝子ライブラリーから回収することができる。
【0090】
好ましくは、本発明の核酸分子には、ＩＬ４Ｒαモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬ配列又はＣＤＲをコードするものが含まれる。ＶＨ及びＶＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントが得られると、これらのＤＮＡフラグメントは、例えば、可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂフラグメント遺伝子又はｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、標準的な組換えＤＮＡ技術によってさらに操作することができる。これらの操作において、ＶＨ又はＶＬをコードするＤＮＡフラグメントは、別のタンパク質をコードする別のＤＮＡフラグメントに抗体定常領域又は柔軟なリンカーで作動可能に連結される。この場合で使用される用語「作動可能に連結された」は、２つのＤＮＡフラグメントによってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように、２つのＤＮＡフラグメントが連結されることを意味することを意図する。
【0091】
ＶＨ領域をコードするＤＮＡは、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、ＶＨをコードする単離されたＤＮＡを全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で知られており、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域であり得るが、最も好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ４定常領域である。Ｆａｂフラグメント重鎖遺伝子の場合、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することができる。
【0092】
ＶＬ領域をコードするＤＮＡは、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、ＶＬをコードする単離されたＤＮＡを全長軽鎖遺伝子(及びＦａｂ軽鎖遺伝子)に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で知られており、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。好ましい実施形態において、軽鎖定常領域は、κ又はλ定常領域であり得る。
【0093】
ｓｃＦｖ遺伝子を調製するために、ＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡフラグメントを、柔軟なリンカーをコードする別のフラグメント、たとえばアミノ酸配列(Ｇｌｙ４-Ｓｅｒ)３をコードする別のフラグメントに作動可能に連結し、ＶＨ及びＶＬ配列を連続した単鎖タンパク質として発現できるようにする。ＶＬ領域とＶＨ領域がこの柔軟なリンカーによって連結されている（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ.,(１９８８)Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３-４２６；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ.,(１９８８)Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ ８５：５８７９-５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ.,,(１９９０)Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２-５５４を参照ください）。
【0094】
本発明のモノクローナル抗体の産生
本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ(１９７５)Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５の周知の体細胞ハイブリダイゼーション（ハイブリドーマ）技術を使用して産生され得る。モノクローナル抗体を産生するための他の実施形態には、Ｂリンパ球のウイルス又は発癌性形質転換及びファージディスプレイ技術が含まれる。キメラ抗体又はヒト化抗体も当技術分野で周知である。例えば、米国特許ＮＯｓ.ＮＯｓ.４,８１６,５６７；５,２２５,５３９；５,５３０,１０１；５,５８５,０８９；５,６９３,７６２及び６,１８０,３７０に記載されており、これらの内容は参照により全体が本明細書に具体的に組み込まれる。
本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ(１９７５)Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５の周知の体細胞ハイブリダイゼーション（ハイブリドーマ）技術を使用して産生され得る。モノクローナル抗体を産生するための他の実施形態には、Ｂリンパ球のウイルス又は発癌性形質転換及びファージディスプレイ技術が含まれる。キメラ抗体又はヒト化抗体も当技術分野で周知である。例えば、米国特許ＮＯｓ.ＮＯｓ.４,８１６,５６７；５,２２５,５３９；５,５３０,１０１；５,５８５,０８９；５,６９３,７６２及び６,１８０,３７０に記載されており、これらの内容は参照により全体が本明細書に具体的に組み込まれる。
【0095】
本発明のモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの生成
本発明の抗体は、例えば、当技術分野で周知の組換えＤＮＡ技術と遺伝子トランスフェクション法の組み合わせを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマで産生することもできる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ, Ｓ.(１９８５)Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２）。いくつかの実施形態において、標準的な分子生物学技術によって得られた部分的又は完全長の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡは、遺伝子が転写及び翻訳調節配列に作動可能に連結されるように、１つ又は複数の発現ベクターに挿入される。この場合では、「機能的に連結された」という用語は、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節するという規定機能を果たすように、抗体遺伝子がベクターに連結されることを意味することを意図している。
本発明の抗体は、例えば、当技術分野で周知の組換えＤＮＡ技術と遺伝子トランスフェクション法の組み合わせを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマで産生することもできる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ, Ｓ.(１９８５)Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２）。いくつかの実施形態において、標準的な分子生物学技術によって得られた部分的又は完全長の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡは、遺伝子が転写及び翻訳調節配列に作動可能に連結されるように、１つ又は複数の発現ベクターに挿入される。この場合では、「機能的に連結された」という用語は、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節するという規定機能を果たすように、抗体遺伝子がベクターに連結されることを意味することを意図している。
【0096】
調節配列」という用語は、抗体遺伝子の転写又は翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図している。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５, Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ, Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ, Ｃａｌｉｆ.(１９９０)）に記載されている。哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列には、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））及びポリオーマウイルスに由来するプロモーター及び／又はエンハンサーに由来する、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルス要素が含まれる。あるいは、ユビキチンプロモーター又はβグロビンプロモーターなどの非ウイルス調節配列を使用することができる。さらに、調節エレメントは、ＳＶ４０初期プロモーターからの配列とヒトＴ細胞白血病ウイルス １ 型の長い末端反復配列を含む ＳＲαプロモーター系など、さまざまな起源の配列で構成されている（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ.,(１９８８)Ｍｏｌ. Ｃｅｌｌ. Ｂｉｏｌ. ８：４６６-４７２）。発現ベクター及び発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。
【0097】
抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は、同じ又は別個の発現ベクターに挿入することができる。好ましい実施形態において、ＶＨセグメントをベクター内のＣＨセグメントに作動可能に連結され、ＶＬセグメントをベクター内のＣＬセグメントに作動可能に連結されているように、可変領域を、所望のアイソタイプの重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をコードしている発現ベクターへ挿入することによって、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を作成できる。さらに、あるいは、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、抗体鎖遺伝子をベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド（即ち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であり得る。
【0098】
軽鎖及び重鎖の発現のために、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターは、標準的な技術によって宿主細胞にトランスフェクトされる。「トランスフェクション」という用語のさまざまな形態は、原核又は真核宿主細胞への外因性ＤＮＡの導入に一般的に使用される多種多様な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ-デキストラントランスフェクションなどを包含することを意図している。原核宿主細胞又は真核宿主細胞のいずれかで本発明の抗体を発現させることは理論的に可能であるが、真核細胞、及び最も好ましくは哺乳動物宿主細胞における抗体の発現が最も好ましい。真核細胞、特に哺乳動物細胞は、原核細胞よりも抗体を構築し、適切に折り畳まれた免疫適格抗体を分泌する可能性が高いためである。
【0099】
本発明の組換え抗体を発現するための好ましい哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（ＤＨＦＲ 選択マーカーで使用するための ｄｈｆｒ-ＣＨＯ 細胞を含み、Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ,(１９８０)Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ ７７：４２１６-４２２０に記載されており、ＤＨＦＲ選択マーカーは、例えば、Ｒ. Ｊ. Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｐ. Ａ. Ｓｈａｒｐ(１９８２)Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ. １５９：６０１-６２１に記載されている）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞が含まれる。特にＮＳＯミエローマ細胞で使用する場合、別の好ましい発現系は、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６及びＥＰ３３８,８４１に開示されているＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入された後、宿主細胞内で抗体を発現させるのに十分な時間、又は好ましくは宿主細胞が増殖する培地に抗体を分泌させるのに十分な時間、宿主細胞を培養することによって抗体が調製される。抗体は、標準的なタンパク質精製法を使用して培地から回収できる。
【0100】
二重特異性分子
一方で、少なくとも２つの異なる結合部位への結合部位を生成するために、別のペプチド又はタンパク質などの少なくとも１つの他の機能分子（例えば、別の抗体又は受容体に対するリガンド）に連結された本発明の１つ又は複数の抗体を含む二重特異性分子を提供する。したがって、本発明で使用される「二重特異性分子」には、３つ以上の特異性を有する分子が含まれる。
一方で、少なくとも２つの異なる結合部位への結合部位を生成するために、別のペプチド又はタンパク質などの少なくとも１つの他の機能分子（例えば、別の抗体又は受容体に対するリガンド）に連結された本発明の１つ又は複数の抗体を含む二重特異性分子を提供する。したがって、本発明で使用される「二重特異性分子」には、３つ以上の特異性を有する分子が含まれる。
【0101】
いくつかの実施形態において、重特異性分子は、Ｆｃに対する結合特異性及びＩＬ４Ｒαに対する結合特異性に加えて、第３の特異性を有する。
【0102】
二重特異性分子は、多くの異なる形式とサイズである可能性がある。サイズスペクトルの一端では、二重特異性分子は従来の抗体フォーマットを保持するが、違いなのは、２つの結合アームが同じ特異性ではなく、異なる特異性を持っていることである。もう一方の端には、ペプチド鎖によって結合された２つの単鎖抗体フラグメント(ｓｃＦｖ'ｓ)からなる二重特異性分子、いわゆるＢｓ(ｓｃＦｖ)２構築物である。中間サイズの二重特異性分子には、ペプチジル リンカーによって連結された２つの異なるＦ(ａｂ)フラグメントが含まれる。これら及び他のフォーマットの二重特異性分子は、遺伝子工学、体細胞ハイブリダイゼーション、又は化学的方法によって調製することができる。例えば、Ｓｅｅ, ｅ.ｇ., Ｋｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ, ｃｉｔｅｄ ｓｕｐｒａ； Ｃａｏ ａｎｄ Ｓｕｒｅｓｈ, Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ, ９(６), ６３５-６４４(１９９８)； ｖａｎ Ｓｐｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ., Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ, ２１(８), ３９１-３９７(２０００)、及びそこで引用された参考文献を参照ください。
【0103】
免疫複合体
本発明の抗体は、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）などの免疫コンジュゲートを形成するために治療薬にコンジュゲートすることができる。適切な治療剤には、細胞毒素、アルキル化剤、ＤＮＡマイナーグルーブバインダー、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ架橋剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、核内輸送阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼＩ又はＩＩ阻害剤、熱ショックタンパク質阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗生物質、及び有糸分裂阻害剤が含まれる。ＡＤＣにおいて、抗体及び治療薬は、好ましくは、ペプチジル、ジスルフィド、又はヒドラゾンリンカーなどの切断可能なリンカーを介して結合される。より好ましいリンカーは、例えば、Ｖａｌ-Ｃｉｔ、Ａｌａ-Ｖａｌ、Ｖａｌ-Ａｌａ-Ｖａｌ、Ｌｙｓ-Ｌｙｓ、Ｐｒｏ-Ｖａｌ-Ｇｌｙ-Ｖａｌ-Ｖａｌ、Ａｌａ-Ａｓｎ-Ｖａｌ、Ｖａｌ-Ｌｅｕ-Ｌｙｓ、Ａｌａ-Ａｌａ-Ａｓｎ、Ｃｉｔ-Ｃｉｔ、Ｖａｌ-Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、Ｓｅｒ又はＧｌｕなどのペプチドリンカーである。ＡＤＣは、米国特許ＮＯｓ.７,０８７,６００；６,９８９,４５２；及び７,１２９,２６１；ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０９６９１０；ＷＯ０７／０３８,６５８；ＷＯ０７／０５１,０８１；ＷＯ０７／０５９,４０４；ＷＯ０８／０８３,３１２；及びＷＯ０８／１０３,６９３；米国特許公開第２００６００２４３１７；２００６０００４０８１；及び２００６０２４７２９５に従って作製することができ、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の抗体は、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）などの免疫コンジュゲートを形成するために治療薬にコンジュゲートすることができる。適切な治療剤には、細胞毒素、アルキル化剤、ＤＮＡマイナーグルーブバインダー、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ架橋剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、核内輸送阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼＩ又はＩＩ阻害剤、熱ショックタンパク質阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗生物質、及び有糸分裂阻害剤が含まれる。ＡＤＣにおいて、抗体及び治療薬は、好ましくは、ペプチジル、ジスルフィド、又はヒドラゾンリンカーなどの切断可能なリンカーを介して結合される。より好ましいリンカーは、例えば、Ｖａｌ-Ｃｉｔ、Ａｌａ-Ｖａｌ、Ｖａｌ-Ａｌａ-Ｖａｌ、Ｌｙｓ-Ｌｙｓ、Ｐｒｏ-Ｖａｌ-Ｇｌｙ-Ｖａｌ-Ｖａｌ、Ａｌａ-Ａｓｎ-Ｖａｌ、Ｖａｌ-Ｌｅｕ-Ｌｙｓ、Ａｌａ-Ａｌａ-Ａｓｎ、Ｃｉｔ-Ｃｉｔ、Ｖａｌ-Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、Ｓｅｒ又はＧｌｕなどのペプチドリンカーである。ＡＤＣは、米国特許ＮＯｓ.７,０８７,６００；６,９８９,４５２；及び７,１２９,２６１；ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０９６９１０；ＷＯ０７／０３８,６５８；ＷＯ０７／０５１,０８１；ＷＯ０７／０５９,４０４；ＷＯ０８／０８３,３１２；及びＷＯ０８／１０３,６９３；米国特許公開第２００６００２４３１７；２００６０００４０８１；及び２００６０２４７２９５に従って作製することができ、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【0104】
抗体をコードする、又は抗体を保有する腫瘍溶解性ウイルス
腫瘍溶解性ウイルスは、がん細胞に優先的に感染して殺す。本発明の抗体は、腫瘍溶解性ウイルスと共に使用することができる。あるいは、本発明の抗体をコードする腫瘍溶解性ウイルスをヒトに導入することができる。
腫瘍溶解性ウイルスは、がん細胞に優先的に感染して殺す。本発明の抗体は、腫瘍溶解性ウイルスと共に使用することができる。あるいは、本発明の抗体をコードする腫瘍溶解性ウイルスをヒトに導入することができる。
【0105】
キメラ抗原受容体
本発明はまた、本発明のＣＤＲ及び重鎖／軽鎖可変領域を含む抗ＩＬ４Ｒα ｓｃＦｖを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。
本発明はまた、本発明のＣＤＲ及び重鎖／軽鎖可変領域を含む抗ＩＬ４Ｒα ｓｃＦｖを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。
【0106】
抗ＩＬ４Ｒα ＣＡＲは、（ａ）抗ＩＬ４Ｒα ｓｃＦｖを含む細胞外抗原結合ドメイン；（ｂ）膜貫通ドメイン；（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。
【0107】
ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＮ末端に、新生受容体を小胞体に向けるシグナルペプチド、及び細胞外抗原結合ドメインのＮ末端に、受容体をより結合しやすくするヒンジペプチドを含み得る。好ましくは、ＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインにおいて、一次細胞内シグナル伝達ドメイン及び１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。一般的に使用され、最も強力な一次細胞内シグナル伝達ドメインはＩＴＡＭを含むＣＤ３-ｚｅｔａ細胞質ドメインであり、そのＩＴＡＭのリン酸化がＴ細胞の活性化につながる。共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０などの共刺激タンパク質に由来する。
【0108】
ＣＡＲは、サイトカイン及び共刺激リガンドなどの、Ｔ細胞増殖、持続性、及び抗腫瘍活性を増強する因子をさらに追加し得る。
【0109】
本明細書で提供されるＣＡＲを含む、エンジニアリング免疫エフェクター細胞も提供される。いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、又は胚性幹細胞である。いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞はＴ細胞である。
【0110】
医薬組成物
他の一側面で、本発明は、薬学的に許容される担体と一緒に製剤化された本発明の１つ又は複数の抗体（又はその抗原結合部位、又は二重特異性分子、ＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス又は免疫複合体）を含む医薬組成物を提供する。組成物が複数の抗体（又はその抗原結合部位、又は二重特異性分子、ＣＡＲ-Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫複合体）を含む場合、抗体（又はその抗原結合部位、又は二重特異性分子、ＣＡＲ-Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫複合体）を別々に投与することができる。組成物は、別の抗体、又は抗腫瘍薬もしくは抗アレルギー剤などの薬物など、１つ又は複数の追加の薬学的に活性な成分を任意に含むことができる。
他の一側面で、本発明は、薬学的に許容される担体と一緒に製剤化された本発明の１つ又は複数の抗体（又はその抗原結合部位、又は二重特異性分子、ＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス又は免疫複合体）を含む医薬組成物を提供する。組成物が複数の抗体（又はその抗原結合部位、又は二重特異性分子、ＣＡＲ-Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫複合体）を含む場合、抗体（又はその抗原結合部位、又は二重特異性分子、ＣＡＲ-Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫複合体）を別々に投与することができる。組成物は、別の抗体、又は抗腫瘍薬もしくは抗アレルギー剤などの薬物など、１つ又は複数の追加の薬学的に活性な成分を任意に含むことができる。
【0111】
医薬組成物は、任意の数の賦形剤を含むことができる。使用できる賦形剤には、ベクター、界面活性剤、増粘剤又は乳化剤、固体結合剤、分散剤又は懸濁剤、可溶化剤、着色剤、香味剤、コーティング剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、保存剤、等張剤、及びそれらの組み合わせが含まれる。適切な賦形剤の選択と使用は、Ｇｅｎｎａｒｏ, ｅｄ., Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ, ２０ｔｈ Ｅｄ.(Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ ２００３)に教示されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【0112】
好ましくは、医薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与（例えば、注射又は注入による）に適している。投与経路に応じて、有効成分を不活性化する可能性のある酸や他の自然条件の作用から保護するために、有効成分を材料でコーティングすることができます。本明細書で使用される「非経口投与」という用語は、経腸及び局所投与以外の投与様式を意味し、通常は注射によるものであり、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、被膜内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内注射及び注入が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、本発明の抗体は、例えば、鼻腔内、経口、膣内、直腸内、舌下又は局所などの局所、表皮又は粘膜投与経路などの非経口経路を介して投与することができる。
【0113】
医薬組成物は、滅菌水溶液又は分散液の形態であることができる。それらはまた、マイクロエマルション、リポソーム、又は高薬物濃度に適した他の秩序構造に処方することもできる。
【0114】
単一剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、治療される対象及び特定の投与様式に応じて変化し、一般に、治療効果を生み出す組成物の量である。当該量について、通常パーセンテージベースで、約０．０１％から約９９％、好ましくは約０．１％から約７０％、最も好ましくは約１％から約３０％の範囲である活性成分を、薬学的に許容される担体と組み合わせる。
【0115】
投薬レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調整される。例えば、単回ボーラス用量を投与してもよいし、複数の分割用量を経時的に投与してもよく、又は治療状況の緊急性によって示されるように、用量を比例的に減少又は増加させることができる。投与を容易にし、投与量を均一にするために、投与単位形態で非経口投与される組成物を処方することが特に有利である。本明細書で使用される投与単位形態は、治療される対象に対する単位投与量として適切な物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な薬学的ベクターと関連して所望の治療効果を生み出すように計算された所定の量を含む。あるいは、抗体は持続放出製剤として投与されてもよく、この場合、必要な投与頻度は少なくなる。
【0116】
組成物を投与する場合、投与量は、宿主の体重１ｋｇ当たり約０．０００１～１００ｍｇ、より通常は０．０１～５ｍｇの範囲であり得る。例えば、投与量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重、又は１０ｍｇ／ｋｇ体重、又は１～１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内であり得る。例示的な治療計画は、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１ヶ月に１回、３ヶ月に１回、又は３～６ヶ月に１回の投与を伴う。本発明の抗ＩＬ４Ｒα抗体の好ましい投与計画には、１ｍｇ／ｋｇ体重又は３ｍｇ／ｋｇ体重での静脈内投与が含まれ、抗体の投与は、以下の投薬レジメンの１つにて実施する：（ｉ）４週間ごとに６回、その後３ヶ月ごと；（ｉｉ）３週間ごと；（ｉｉｉ）３ ｍｇ／ｋｇ 体重で１ 回、その後は３週間ごとに１ ｍｇ／ｋｇ体重で投与する。いくつかの方法では、投薬量は、約１～１０００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を達成するように調整され、いくつかの方法では、約２５～３００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度が達成される。
【0117】
本発明の抗ＩＬ４Ｒα抗体又はその抗原結合部位、二重特異性分子、ＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス又は免疫複合体の「治療有効量」では、好ましくは、疾患の症状の重症度の軽減、疾患の無症候期間の頻度及び期間の増加、又は疾患の苦痛によって引き起こされる損傷又は障害の予防を引き起こすことができる。例えば、腫瘍対象の治療では、「治療有効量」は、未治療の対象と比較して、腫瘍増殖を好ましくは少なくとも約２０％阻害、好ましくは少なくとも約４０％阻害、より好ましくは少なくとも約６０％阻害、より好ましくは少なくとも約８８％阻害の量である。治療有効量の治療用抗体は、典型的にはヒトであるか、又は別の哺乳動物であり得る対象において、腫瘍サイズを減少させるか、さもなければ症状を改善することができる。
【0118】
薬学組成物は、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化された送達システムを含む制御放出製剤であり得る。エチレンビニルアセテート、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル、及びポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ, Ｊ. Ｒ. Ｒｏｂｉｎｓｏｎ, ｅｄ., Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ, Ｉｎｃ., Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ, １９７８を参照ください。
【0119】
医薬組成物は、例えば、（１）無針皮下注射装置（例えば、米国特許ＮＯｓ.５,３９９,１６３；５,３８３,８５１；５,３１２,３３５；５,０６４,４１３；４,９４１,８８０；４,７９０,８２４；及び４,５９６,５５６）；（２）マイクロインフュージョン ポンプ（米国特許Ｎｏ.４,４８７,６０３）；（３）経皮薬物送達デバイス（米国特許Ｎｏ.４,４８６,１９４）；（４）注入デバイス（米国特許ＮＯｓ.４,４４７,２３３及び４,４４７,２２４）；及び（５）浸透デバイス（米国特許ＮＯｓ.４,４３９,１９６及び４,４７５,１９６）などの医療装置によって投与することができ、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【0120】
ある特定の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、インビボでの適切な分布を確実にするように処方することができる。例えば、本発明の治療用抗体が血液脳関門を通過することを確実にするために、それらをリポソームに製剤化することができ、特定の細胞又は臓器への選択的輸送を増強するためのターゲティング部分をさらに含むことができる。例えば、米国特許ＮＯｓ.４,５２２,８１１；５,３７４,５４８；５,４１６,０１６；及び５,３９９,３３１；Ｖ. Ｖ. Ｒａｎａｄｅ(１９８９)Ｊ. Ｃｌｉｎ.Ｐｈａｒｍａｃｏｌ.２９：６８５；Ｕｍｅｚａｗａ ｅｔ ａｌ.,(１９８８)Ｂｉｏｃｈｅｍ. Ｂｉｏｐｈｙｓ. Ｒｅｓ. Ｃｏｍｍｕｎ. １５３：１０３８；Ｂｌｏｅｍａｎ ｅｔ ａｌ.,(１９９５)ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ.３５７：１４０；Ｍ. Ｏｗａｉｓ ｅｔ ａｌ.,(１９９５)Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ. Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ. ３９：１８０；Ｂｒｉｓｃｏｅ ｅｔ ａｌ.,(１９９５)Ａｍ. Ｊ. Ｐｈｙｓｉｏｌ. １２３３：１３４；Ｓｃｈｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ.,(１９９４)Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ. ２６９：９０９０；Ｋｅｉｎａｎｅｎ ａｎｄ Ｌａｕｋｋａｎｅｎ(１９９４)ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ. ３４６：１２３；及びＫｉｌｌｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ(１９９４)Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２７３を参照ください。
【0121】
本発明の用途及び方法
本発明の抗体もしくはその抗原結合部位、又は二重特異性、ＣＡＲ-Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫複合体を含む組成物は、例えば、過剰なＩＬ４及び／又はＩＬ１３シグナル伝達に関連するアレルギー疾患の治療に関与するなど、多数のインビトロおよびインビボ有用性を有する。
本発明の抗体もしくはその抗原結合部位、又は二重特異性、ＣＡＲ-Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫複合体を含む組成物は、例えば、過剰なＩＬ４及び／又はＩＬ１３シグナル伝達に関連するアレルギー疾患の治療に関与するなど、多数のインビトロおよびインビボ有用性を有する。
【0122】
本発明の抗ＩＬ４Ｒα抗体が、ＩＬ４ＲαとＩＬ４又はＩＬ１３-ＩＬ１３Ｒα１との結合を遮断して２型免疫を低下させる能力があることから、本発明は、対象に本発明の組成物を投与することを含む、２型免疫に関連するアレルギー疾患を治療する方法を提供する。アレルギー性疾患は、アトピー性皮膚炎、アレルギー反応、アレルギー性鼻炎又はアレルギー性喘息であり得る。
【0123】
他の一側面で、ＩＬ４又はＩＬ１３シグナル伝達はＳＴＡＴ６を活性化することができ、ＳＴＡＴ６阻害剤は癌細胞増殖を阻害することが見出されているので、本発明は対象における腫瘍細胞増殖を阻害する方法を提供する。前記方法は、対象に本発明の組成物を投与し、それによって対象の腫瘍増殖を阻害することを含む。本発明の抗体によって治療することができる腫瘍の非限定的な例には、黒色腫、肺がん、腎臓がん、前立腺がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、胃がん、膵臓がん、卵巣がん（varian cancer）、及び尿路上皮がんが含まれるが、これらに限定されない。
【0124】
他の一側面で、本発明は、ＩＬ-４又はＩＬ-１３に応答する細胞の活性化を低減又は阻害する方法を提供する。いくつかの実施形態において、活性化を阻害することは、サイトカインの産生又は分泌を阻害することを含む。いくつかの実施形態において、活性化を阻害することは、増殖を阻害することを含む。ハイブリッドＩＬ-４Ｒα／γＣ受容体の刺激を介してＩＬ-４に応答する細胞には、Ｂ細胞、好酸球、及びマクロファージが含まれるが、これらに限定されない。ハイブリッドＩＬ－４Ｒα／ＩＬ－３Ｒα１受容体の刺激を介してＩＬ－１３に応答する細胞には、線維芽細胞及び平滑筋細胞が含まれるが、これらに限定されない。したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、平滑筋細胞の増殖を阻害する方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、線維芽細胞増殖を阻害する方法を提供する。
【0125】
他の一側面で、本発明は、診断のための方法、組成物及びキットを提供する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、細胞又は組織におけるＩＬ４Ｒαの存在及び発現を決定するために使用される。いくつかの実施形態において、前記診断は、予後を示し、及び／又は治療及び／又はフォローアップをガイドする。例えば、ヒト膀胱癌におけるＩＬ４Ｒαの過剰発現は、疾患の病理学的グレード及び病期と相関することが見出されている。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、膀胱癌のグレード及び段階を診断するために使用される。ＩＬ-４Ｒαの高発現は、口腔がんの発生と複数回の再発と相関することが見出されている。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、予後ならびに適切な治療及び経過観察を決定するための口腔癌診断キット又は方法において使用される。腫瘍におけるＩＬ-４Ｒａ発現は、上皮性悪性胸膜中皮腫(ＭＰＭ)の外科的切除を受ける患者の生存率と逆相関している。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ＭＰＭの予後及び適切な治療及び／又はフォローアップを決定するための診断キット又は方法において使用される。
【0126】
併用療法
一側面では、本発明は、本発明の抗ＩＬ４Ｒα抗体又は抗原結合部位、二重特異性分子又は腫瘍溶解性ウイルスを、２型免疫関連アレルギー疾患を改善するのに有効な１つ又は複数の他の薬物と組み合わせることを含む併用療法を提供する。前記薬物は、アレルギー性鼻炎の治療に臨床的に使用される抗ヒスタミン薬（Ｈ１ヒスタミン受容体を標的とする）、又は喘息治療で臨床的に使用されるコルチコステロイド、ベータアドレナリン受容体作動薬及びｃｙｃ-ＬＴを標的とする薬剤であり得る。抗ＩｇＥ抗体であるオマリズマブも、本発明の抗体又はその抗原結合部位、二重特異性分子又は腫瘍溶解性ウイルスによるアレルギー性疾患の治療に使用することができる。ある特定の実施形態において、対象はヒトである。
一側面では、本発明は、本発明の抗ＩＬ４Ｒα抗体又は抗原結合部位、二重特異性分子又は腫瘍溶解性ウイルスを、２型免疫関連アレルギー疾患を改善するのに有効な１つ又は複数の他の薬物と組み合わせることを含む併用療法を提供する。前記薬物は、アレルギー性鼻炎の治療に臨床的に使用される抗ヒスタミン薬（Ｈ１ヒスタミン受容体を標的とする）、又は喘息治療で臨床的に使用されるコルチコステロイド、ベータアドレナリン受容体作動薬及びｃｙｃ-ＬＴを標的とする薬剤であり得る。抗ＩｇＥ抗体であるオマリズマブも、本発明の抗体又はその抗原結合部位、二重特異性分子又は腫瘍溶解性ウイルスによるアレルギー性疾患の治療に使用することができる。ある特定の実施形態において、対象はヒトである。
【0127】
他の一側面で、本発明は、本発明の抗ＩＬ４Ｒα抗体又はその抗原結合部位、二重特異性分子、ＣＡＲ-Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス又は免疫複合体を、対象における腫瘍増殖を阻害するのに有効な１つ又は複数の他の薬剤と組み合わせることによる併用療法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、抗ＩＬ４Ｒα抗体（又はその抗原結合部位、二重特異性分子、腫瘍溶解性ウイルス、ＣＡＲ－Ｔ細胞、又は免疫複合体）及び抗ＯＸ４０抗体、抗ＴＩＭ-３抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＬＡＧ-３抗体、抗ＰＤ-Ｌ１抗体及び抗ＰＤ-１抗体など１つの又はそれ以上の他の抗体を対象に投与することを含む、対象における腫瘍増殖を阻害する方法を提供する。ある特定の実施形態において、対象はヒトである。ＩＬ４Ｒα経路阻害剤は、がんの標準治療とさらに組み合わせることができる。例えば、ＩＬ４Ｒα経路阻害剤は、ＬＡＧ-３及び／又はＰＤ-１阻害剤及び化学療法レジメンと組み合わせることができる。抗ＩＬ４Ｒα抗体は、細胞毒性薬であり得る化学療法薬と共に投与することができる。例えば、エピルビシン、オキサリプラチン、及び５-フルオロウラシルは、抗ＩＬ４Ｒα療法を受けている患者に投与できる。必要に応じて、抗ＩＬ４Ｒαと１つ又は複数の他の抗体(例えば、抗ＬＡＧ-３及び／又は抗ＰＤ-１抗体)の組合せは、免疫原性物質とさらに組み合わせることができる。前記免疫原性物質は、例えば、癌細胞、精製された腫瘍抗原(組換えタンパク質、ペプチド、及び糖分子を含む)、及び免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子でトランスフェクトされた細胞である（Ｈｅ ｅｔ ａｌ.,(２００４)Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. １７３：４９１９-２８）。使用できる腫瘍ワクチンの非限定的な例には、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ-２、ＭＡＲＴ１及び／又はチロシナーゼなどのメラノーマ抗原ペプチド、又はサイトカインＧＭ-ＣＳＦを発現するようにトランスフェクトされた腫瘍細胞が含まれる。抗ＩＬ４Ｒα抗体と併用できる他の治療法には、インターロイキン-２(ＩＬ-２)投与、放射線、手術、又はホルモン遮断が含まれるが、これらに限定されない。
【0128】
本明細書で論じる治療剤の組み合わせは、薬学的に許容される担体中の単一の組成物として同時に、又は薬学的に許容される担体中の各薬剤との別個の組成物として同時に投与することができる。別の実施形態において、治療剤の組み合わせでは順次に実施できる。
【0129】
さらに、複数回の併用療法を順次に実施される場合、順次な投与の順序を各投与時点で逆にするか、同じ順序に維持することができ、順次な投与を同時投与と組み合わせることができ、又はそれらの任意の組み合わせを行うことができる。
【0130】
本発明は、さらなる限定として解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに説明される。本出願を通じて引用されるすべての図及びすべての参考文献、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許及び公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【実施例】
【0131】
実施例
実施例１：ハイブリドーマ技術を用いたマウス抗ＩＬ４Ｒαモノクローナル抗体の作製
免疫接種
Ｅ Ｈａｒｌｏｗ, Ｄ. Ｌａｎｅ, Ａｎｔｉｂｏｄｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ, Ｎ.Ｙ., １９９８に記載されている方法に従って、マウスを免疫した。組換えヒトＩＬ４Ｒα－ｈｉｓタンパク質（Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｃ.，カタログ番号１０４０２－Ｈ０８Ｈ）を免疫原として使用し、自家製のヒトＩＬ４Ｒα－ｈｉｓタンパク質（配列番号５７に示されるアミノ酸配列）を使用して、抗血清の力価の決定、及び抗原特異的抗体を分泌するハイブリドーマのスクリーニングに使用した。一次免疫及び追加免疫の免疫用量は、マウス１匹あたりの注射あたり２０μｇのヒトＩＬ４Ｒα-ｈｉｓタンパク質であった。免疫応答を高めるために、完全フロイント アジュバント及び不完全フロイント アジュバント（Ｓｉｇｍａ, Ｓｔ. Ｌｏｕｉｓ, Ｍｏ., ＵＳＡ）を、それぞれ初回免疫及び追加免疫に使用した。簡単に説明すると、アジュバントと免疫原との混合物は次のように調製された。まず、アジュバントをバイアル内でボルテックスによって穏やかに混合した。所望の量のアジュバントを、オートクレーブした１．５ｍＬマイクロ遠心チューブに移した。抗原は、０．２～０．３ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度になるようにＰＢＳ又は生理食塩水で調製した。次に、計算された量の抗原をアジュバントとともにマイクロ遠心分離管に加え、得られた混合物を２分間穏やかにボルテックスして混合し、油中水エマルジョンを生成した。次に、アジュバント-抗原エマルジョンを、動物注射用の適切な注射器に吸い込んだ。合計２０μｇの抗原を１５０～２００μｌの容量で注射した。各動物を免疫し、抗血清力価に応じて２～３回追加免疫した。力価がより良好な動物には、細胞融合前に腹腔内注射によって最終追加免疫を与えた。
実施例１：ハイブリドーマ技術を用いたマウス抗ＩＬ４Ｒαモノクローナル抗体の作製
免疫接種
Ｅ Ｈａｒｌｏｗ, Ｄ. Ｌａｎｅ, Ａｎｔｉｂｏｄｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ, Ｎ.Ｙ., １９９８に記載されている方法に従って、マウスを免疫した。組換えヒトＩＬ４Ｒα－ｈｉｓタンパク質（Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｃ.，カタログ番号１０４０２－Ｈ０８Ｈ）を免疫原として使用し、自家製のヒトＩＬ４Ｒα－ｈｉｓタンパク質（配列番号５７に示されるアミノ酸配列）を使用して、抗血清の力価の決定、及び抗原特異的抗体を分泌するハイブリドーマのスクリーニングに使用した。一次免疫及び追加免疫の免疫用量は、マウス１匹あたりの注射あたり２０μｇのヒトＩＬ４Ｒα-ｈｉｓタンパク質であった。免疫応答を高めるために、完全フロイント アジュバント及び不完全フロイント アジュバント（Ｓｉｇｍａ, Ｓｔ. Ｌｏｕｉｓ, Ｍｏ., ＵＳＡ）を、それぞれ初回免疫及び追加免疫に使用した。簡単に説明すると、アジュバントと免疫原との混合物は次のように調製された。まず、アジュバントをバイアル内でボルテックスによって穏やかに混合した。所望の量のアジュバントを、オートクレーブした１．５ｍＬマイクロ遠心チューブに移した。抗原は、０．２～０．３ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度になるようにＰＢＳ又は生理食塩水で調製した。次に、計算された量の抗原をアジュバントとともにマイクロ遠心分離管に加え、得られた混合物を２分間穏やかにボルテックスして混合し、油中水エマルジョンを生成した。次に、アジュバント-抗原エマルジョンを、動物注射用の適切な注射器に吸い込んだ。合計２０μｇの抗原を１５０～２００μｌの容量で注射した。各動物を免疫し、抗血清力価に応じて２～３回追加免疫した。力価がより良好な動物には、細胞融合前に腹腔内注射によって最終追加免疫を与えた。
【0132】
ハイブリドーマの融合とスクリーニング
融合の直前に、マウス骨髄腫細胞株（ＳＰ２／０-Ａｇ１４, ＡＴＣＣ#ＣＲＬ-１５８１）の細胞を培養して対数期に到達させた。免疫したマウスからの脾臓細胞を無菌的に調製し、Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ, ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ, "Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ," Ｎａｔｕｒｅ, ２５６： ４９５-４９７(１９７５)に記載の方法に従って骨髄腫細胞と融合させた。続いて、融合した「ハイブリッド細胞」を、ＤＭＥＭ／２０％ＦＣＳ／ＨＡＴ培地を入れた９６ウェルプレートに分注した。生存しているハイブリドーマのコロニーを、融合の７～１０日後に顕微鏡下で観察した。２週間後、各ウェルの上清を、組換えヒトＩＬ４Ｒα-ｈｉｓタンパク質を使用したＥＬＩＳＡベースのスクリーニングにかけた。簡単に説明すると、ＰＢＳ中のヒトＩＬ４Ｒα-ｈｉｓ タンパク質(２．０μｇ／ｍＬ)をＥＬＩＳＡプレートに６０μＬ／ウェルでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した後、２００μｌのブロッキングバッファー(５％ｗ／ｖスキムミルクを含むＰＢＳＴ中)でブロックした。希釈したハイブリドーマ上清（６０μｌ）を各ウェルに加え、３７℃で４０分間インキュベートした。次いでプレートを４回洗浄し、ＨＲＰヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ ｒｅｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５－０３６－０７１）を検出のために使用し、結合ＯＤ値を４５０ｎｍで観察した。次いで、ヒトＩＬ４Ｒα－ｈｉｓタンパク質と結合可能な抗体を分泌する陽性ハイブリドーマを選択し、２４ウェルプレートに移した。高い特異的ヒトＩＬ４Ｒα結合及びＩＬ４ＲαＩＬ４ 又はＩＬ４Ｒα-１３Ｒα１-ＩＬ１３遮断活性を示す抗体を産生するハイブリドーマ クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、細胞株のクローン性を確保した後、モノクローナル抗体を精製した。簡単に説明すると、プロテインＡセファロースカラム（ｂｅｓｔｃｈｒｏｍ(Ｓｈａｎｇｈａｉ)Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＡＡ０２７３)を５～１０倍カラム容量のＰＢＳバッファーを使用して洗浄した。細胞上清をカラムに通し、その後、タンパク質の吸光度がベースラインに達するまで、ＰＢＳバッフーを使用してカラムを洗浄した。カラムを溶出バッファー(０．１Ｍグリシン-ＨＣｌ、ｐＨ２．７)で溶出し、溶出液をすぐに１．５ｍＬチューブに集め、中和バッファー(１Ｍ トリス-ＨＣｌ、ｐＨ９．０)で中和した。免疫グロブリンを含む画分をプールし、４℃で一晩ＰＢＳで透析した。続いて、精製モノクローナル抗体のインビトロ機能活性を以下のように特徴付けた。
融合の直前に、マウス骨髄腫細胞株（ＳＰ２／０-Ａｇ１４, ＡＴＣＣ#ＣＲＬ-１５８１）の細胞を培養して対数期に到達させた。免疫したマウスからの脾臓細胞を無菌的に調製し、Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ, ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ, "Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ," Ｎａｔｕｒｅ, ２５６： ４９５-４９７(１９７５)に記載の方法に従って骨髄腫細胞と融合させた。続いて、融合した「ハイブリッド細胞」を、ＤＭＥＭ／２０％ＦＣＳ／ＨＡＴ培地を入れた９６ウェルプレートに分注した。生存しているハイブリドーマのコロニーを、融合の７～１０日後に顕微鏡下で観察した。２週間後、各ウェルの上清を、組換えヒトＩＬ４Ｒα-ｈｉｓタンパク質を使用したＥＬＩＳＡベースのスクリーニングにかけた。簡単に説明すると、ＰＢＳ中のヒトＩＬ４Ｒα-ｈｉｓ タンパク質(２．０μｇ／ｍＬ)をＥＬＩＳＡプレートに６０μＬ／ウェルでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した後、２００μｌのブロッキングバッファー(５％ｗ／ｖスキムミルクを含むＰＢＳＴ中)でブロックした。希釈したハイブリドーマ上清（６０μｌ）を各ウェルに加え、３７℃で４０分間インキュベートした。次いでプレートを４回洗浄し、ＨＲＰヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ ｒｅｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５－０３６－０７１）を検出のために使用し、結合ＯＤ値を４５０ｎｍで観察した。次いで、ヒトＩＬ４Ｒα－ｈｉｓタンパク質と結合可能な抗体を分泌する陽性ハイブリドーマを選択し、２４ウェルプレートに移した。高い特異的ヒトＩＬ４Ｒα結合及びＩＬ４ＲαＩＬ４ 又はＩＬ４Ｒα-１３Ｒα１-ＩＬ１３遮断活性を示す抗体を産生するハイブリドーマ クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、細胞株のクローン性を確保した後、モノクローナル抗体を精製した。簡単に説明すると、プロテインＡセファロースカラム（ｂｅｓｔｃｈｒｏｍ(Ｓｈａｎｇｈａｉ)Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＡＡ０２７３)を５～１０倍カラム容量のＰＢＳバッファーを使用して洗浄した。細胞上清をカラムに通し、その後、タンパク質の吸光度がベースラインに達するまで、ＰＢＳバッフーを使用してカラムを洗浄した。カラムを溶出バッファー(０．１Ｍグリシン-ＨＣｌ、ｐＨ２．７)で溶出し、溶出液をすぐに１．５ｍＬチューブに集め、中和バッファー(１Ｍ トリス-ＨＣｌ、ｐＨ９．０)で中和した。免疫グロブリンを含む画分をプールし、４℃で一晩ＰＢＳで透析した。続いて、精製モノクローナル抗体のインビトロ機能活性を以下のように特徴付けた。
【0133】
実施例２：ＢＩＡＣＯＲＥ 表面プラズモン共鳴を用いたマウス抗ＩＬ４Ｒαモノクローナル抗体の親和性測定
実施例１で生成された精製抗ＩＬ４Ｒαマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ、ＵＳＡ）によって結合親和性及び結合動力学について特徴付けられた。
実施例１で生成された精製抗ＩＬ４Ｒαマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ、ＵＳＡ）によって結合親和性及び結合動力学について特徴付けられた。
【0134】
簡単に説明すると、Ｂｉａｃｏｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ、ＵＳＡ）が提供する標準的なアミン カップリング キットを用いて、ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号 ＢＲ１００８３８、Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ)を第一級アミン基を介してＣＭ５チップ(カルボキシメチル化デキストラン被覆チップ)に共有結合させた。バイオセンサー表面の未反応部分は、エタノールアミンでブロックされた。次いで、６６．６７ｎＭの濃度の本発明の精製抗ＩＬ４Ｒα抗体及び１０μｇ／ｍｌの抗ＩＬ４Ｒαベンチマーク（Ｄｕｐｉｌｕｍａｂ(登録商標)，ＢＭとも呼ばれる）を、１０μＬ／分の流速でチップ上に流した。次に、ＨＢＳ ＥＰ バッファー（Ｂｉａｃｏｒｅから提供）中の組換えヒトＩＬ４Ｒα-ｈｉｓ（自社作成、配列番号５７に示すアミノ酸配列）、カニクイザル ＩＬ４Ｒα-ｈｉｓ タンパク質（Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｃ.,カタログ番号９０８９７-Ｃ０８Ｈ）、又はマーモセット ＩＬ４Ｒα-ｈｉｓ タンパク質(Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ.からの外注品、ｃａｌ-ＩＬ４Ｒα-ｈｉｓとも呼ばれる、アミノ酸配列は配列番号：５８に示される)の段階希釈品を、３０μＬ／分の流速でチップに流した。抗原抗体結合動態は２分間追跡し、解離動態は１０分間追跡した。ＢＩＡ評価ソフトウェアを使用して、結合及び解離曲線を１：１ラングミュア結合モデルに適合させた。ＫＤ、Ｋａ及びＫｄ値を決定し、以下の表２にまとめた。
【0135】
【表2】
【0136】
本発明のすべてのマウス抗体は、ヒトＩＬ４Ｒαに特異的に結合し、それらのほとんどは、ベンチマークと比較して同等又はより高い結合親和性を示した。
【0137】
実施例３：マウス抗ＩＬ４Ｒα抗体のＩＬ４Ｒα結合活性
本発明のマウス抗ＩＬ４Ｒα抗体のＩＬ４Ｒαへの結合活性は、Ｃａｐｔｕｒｅ ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）及び間接ＥＬＩＳＡによって決定された。
本発明のマウス抗ＩＬ４Ｒα抗体のＩＬ４Ｒαへの結合活性は、Ｃａｐｔｕｒｅ ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）及び間接ＥＬＩＳＡによって決定された。
【0138】
３．１ Ｃａｐｔｕｒｅ ＥＬＩＳＡ
簡単に言えば、ＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃγフラグメント特異的(Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５-００５-００８)を１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートにコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄バッファー(ＰＢＳ+０．０５％ｗ／ｖ Ｔｗｅｅｎ-２０、ＰＢＳＴ)で１回洗浄した後、２００μｌ／ウェルのブロッキングバッファー(５％ｗ／ｖスキムミルクを含むＰＢＳＴ)を加え、３７℃で２時間ブロックした。プレートを再度洗浄し、１００μｌ／ウェルの連続希釈(２．５％ｗ／ｖ脱脂乳含有ＰＢＳＴで５倍希釈、６６．７ｎＭ から開始)した本発明の抗ＩＬ４Ｒα抗体、ベンチマーク又は陰性対照ｈＩｇＧ(ヒト免疫グロブリン(ｐＨ４)静注用、Ｈｕａｌａｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｃ.)と共に３７℃で４０分間インキュベートし、プレートを再度４回洗浄した。１００μＬ／ウェルのビオチン標識ヒトＩＬ４Ｒα-ｈｉｓタンパク質（配列番号５７で自家製、ｉｎ ２．５％ｗ／ｖ脱脂乳含有ＰＢＳＴ、０．１４ｎＭ）を、捕捉された抗ＩＬ４Ｒα抗体を含む９６ウェルプレートに追加した。３７℃で４０分間インキュベートし、プレートを４回洗浄し、ＨＲＰ 標識ストレプトアビジン（ＰＢＳＴで １：１００００で希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号０１６-０３０-０８４）を１００μＬ／ウェル添加し、３７℃で４０分間インキュベートした。最後の洗浄後、１００μＬ／ウェルのＥＬＩＳＡ基質ＴＭＢ(Ｉｎｎｏｒｅａｇｅｎｔｓ、カタログ番号ＭＢ-Ｓ-００２)を追加し、インキュベーションした。１０分後、２５℃で１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を５０μＬ／ウェル加えて反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してデータを分析し、ＥＣ５０値を取得した。
簡単に言えば、ＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃγフラグメント特異的(Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５-００５-００８)を１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートにコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄バッファー(ＰＢＳ+０．０５％ｗ／ｖ Ｔｗｅｅｎ-２０、ＰＢＳＴ)で１回洗浄した後、２００μｌ／ウェルのブロッキングバッファー(５％ｗ／ｖスキムミルクを含むＰＢＳＴ)を加え、３７℃で２時間ブロックした。プレートを再度洗浄し、１００μｌ／ウェルの連続希釈(２．５％ｗ／ｖ脱脂乳含有ＰＢＳＴで５倍希釈、６６．７ｎＭ から開始)した本発明の抗ＩＬ４Ｒα抗体、ベンチマーク又は陰性対照ｈＩｇＧ(ヒト免疫グロブリン(ｐＨ４)静注用、Ｈｕａｌａｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｃ.)と共に３７℃で４０分間インキュベートし、プレートを再度４回洗浄した。１００μＬ／ウェルのビオチン標識ヒトＩＬ４Ｒα-ｈｉｓタンパク質（配列番号５７で自家製、ｉｎ ２．５％ｗ／ｖ脱脂乳含有ＰＢＳＴ、０．１４ｎＭ）を、捕捉された抗ＩＬ４Ｒα抗体を含む９６ウェルプレートに追加した。３７℃で４０分間インキュベートし、プレートを４回洗浄し、ＨＲＰ 標識ストレプトアビジン（ＰＢＳＴで １：１００００で希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号０１６-０３０-０８４）を１００μＬ／ウェル添加し、３７℃で４０分間インキュベートした。最後の洗浄後、１００μＬ／ウェルのＥＬＩＳＡ基質ＴＭＢ(Ｉｎｎｏｒｅａｇｅｎｔｓ、カタログ番号ＭＢ-Ｓ-００２)を追加し、インキュベーションした。１０分後、２５℃で１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を５０μＬ／ウェル加えて反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してデータを分析し、ＥＣ５０値を取得した。
【0139】
３．２ 細胞ベースの結合ＦＡＣＳ
２９３Ｆ-ＩＬ４Ｒα細胞表面に発現したＩＬ４Ｒαに対するマウス抗ＩＬ４Ｒα抗体の結合活性を、フローサイトメトリー(ＦＡＣＳ)により試験した。２９３Ｆ 細胞(Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｉｎｃ.、カタログ番号１１６２５０１９)に、ＥｃｏＲＩ とＸｂａＩとの間にヒトＩＬ４Ｒα(ｕｎｉｐｒｏｔ #Ｐ２４３９４-１ のアミノ酸残基 １-８２５)をコードするヌクレオチドを有するｐＣＭＶ-Ｔ-Ｐ プラスミド コンストラクトでトランスフェクトし、安定した細胞プール(２９３Ｆ-ＩＬ４Ｒαと命名される)を、その後の細胞ベースの結合ＦＡＣＳ 及び細胞ベースのリガンド 遮断ＦＡＣＳ分析のために選択した。２９３Ｆ-ＩＬ４Ｒα細胞を細胞培養フラスコから回収し、２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液(２％ ｖ／ｖウシ胎児血清を含むリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ))に再懸濁した。次に、ＦＡＣＳバッファーで段階希釈（８０ｎＭから開始、４倍連続希釈）した抗ＩＬ４Ｒα抗体又はコントロール物質を１００μＬ／ウェルで、２×１０５細胞／ウェルを含む９６ウェルプレートに添加し、４０分間氷浴した。細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した後、１００μＬ／ウェルの Ｒ-フィコエリトリン標識アフィニティー精製Ｆ(ａｂ')２断片化ヤギ抗マウスＩｇＧ(Ｈ+Ｌ)（(ＦＡＣＳ バッファーで１：１０００に希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５-１１６-１４６)。）を加えた。暗所で４℃で４０分間インキュベーションした後、細胞を３回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ-ＨＴＳを用いて蛍光値を測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してデータを分析し、ＥＣ５０値を取得した。
２９３Ｆ-ＩＬ４Ｒα細胞表面に発現したＩＬ４Ｒαに対するマウス抗ＩＬ４Ｒα抗体の結合活性を、フローサイトメトリー(ＦＡＣＳ)により試験した。２９３Ｆ 細胞(Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｉｎｃ.、カタログ番号１１６２５０１９)に、ＥｃｏＲＩ とＸｂａＩとの間にヒトＩＬ４Ｒα(ｕｎｉｐｒｏｔ #Ｐ２４３９４-１ のアミノ酸残基 １-８２５)をコードするヌクレオチドを有するｐＣＭＶ-Ｔ-Ｐ プラスミド コンストラクトでトランスフェクトし、安定した細胞プール(２９３Ｆ-ＩＬ４Ｒαと命名される)を、その後の細胞ベースの結合ＦＡＣＳ 及び細胞ベースのリガンド 遮断ＦＡＣＳ分析のために選択した。２９３Ｆ-ＩＬ４Ｒα細胞を細胞培養フラスコから回収し、２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液(２％ ｖ／ｖウシ胎児血清を含むリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ))に再懸濁した。次に、ＦＡＣＳバッファーで段階希釈（８０ｎＭから開始、４倍連続希釈）した抗ＩＬ４Ｒα抗体又はコントロール物質を１００μＬ／ウェルで、２×１０５細胞／ウェルを含む９６ウェルプレートに添加し、４０分間氷浴した。細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した後、１００μＬ／ウェルの Ｒ-フィコエリトリン標識アフィニティー精製Ｆ(ａｂ')２断片化ヤギ抗マウスＩｇＧ(Ｈ+Ｌ)（(ＦＡＣＳ バッファーで１：１０００に希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５-１１６-１４６)。）を加えた。暗所で４℃で４０分間インキュベーションした後、細胞を３回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ-ＨＴＳを用いて蛍光値を測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してデータを分析し、ＥＣ５０値を取得した。
【0140】
３．３ 間接ＥＬＩＳＡ
カニクイザルＩＬ４Ｒαタンパク質又はｃａｌ-ＩＬ４Ｒα-ｈｉｓタンパク質との抗ＩＬ４Ｒα抗体の交差反応を測定した。簡単に説明すると、炭酸／重炭酸緩衝液(ｐＨ９．６)中のカニクイザルＩＬ４Ｒα-ｈｉｓタンパク質（Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｃ.，カタログ番号９０８９７-Ｃ０８Ｈ）２μｇ／ｍＬ又は炭酸／重炭酸緩衝液(ｐＨ９．６)中のｃａｌ-ＩＬ４Ｒα-ｈｉｓ タンパク質(Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｃ. からの外注品、製品カタログ ＢＡＸ２)０．２μｇ／ｍＬを９６ウェルプレートに１００ μＬ／ウェルでコーティングし、３７℃で２時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファー（ＰＢＳ + ０．０５％ｗ／ｖＴｗｅｅｎ-２０、ＰＢＳＴ）で１回洗浄し、２００ μＬ／ウェルのブロッキングバッファー(５％ｗ／ｖ脱脂乳を含む ＰＢＳＴ)を加え、３７℃で２時間ブロックした。プレートを再度洗浄し、段階希釈した本発明の抗ＩＬ４Ｒα抗体又は対照物質（０．００４～６６．７ｎＭ、６６．７ｎＭから開始、２．５％ｗ／ｖスキムミルクを含むＰＢＳＴで５倍勾配で希釈）を１００μＬで各ウェルに添加し、３７℃で４０分間インキュベートした。プレートを４回洗浄した後、１００μＬ／ウェルのペルオキシダーゼ標識アフィニティー精製ヤギ抗マウスＩｇＧ(Ｆｃγ フラグメント特異的)(ＰＢＳＴバッファーで１：５０００に希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号：１１５-０３６-０７１)を３７℃で４０分間インキュベートした。最後の洗浄後、１００μＬ／ウェルのＴＭＢ(Ｉｎｎｏｒｅａｇｅｎｔｓ)を加え、インキュベーションした。３～１０分後、２５℃で１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を５０μＬ／ウェル添加することにより反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してデータを分析し、ＥＣ５０値を取得した。
カニクイザルＩＬ４Ｒαタンパク質又はｃａｌ-ＩＬ４Ｒα-ｈｉｓタンパク質との抗ＩＬ４Ｒα抗体の交差反応を測定した。簡単に説明すると、炭酸／重炭酸緩衝液(ｐＨ９．６)中のカニクイザルＩＬ４Ｒα-ｈｉｓタンパク質（Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｃ.，カタログ番号９０８９７-Ｃ０８Ｈ）２μｇ／ｍＬ又は炭酸／重炭酸緩衝液(ｐＨ９．６)中のｃａｌ-ＩＬ４Ｒα-ｈｉｓ タンパク質(Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｃ. からの外注品、製品カタログ ＢＡＸ２)０．２μｇ／ｍＬを９６ウェルプレートに１００ μＬ／ウェルでコーティングし、３７℃で２時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファー（ＰＢＳ + ０．０５％ｗ／ｖＴｗｅｅｎ-２０、ＰＢＳＴ）で１回洗浄し、２００ μＬ／ウェルのブロッキングバッファー(５％ｗ／ｖ脱脂乳を含む ＰＢＳＴ)を加え、３７℃で２時間ブロックした。プレートを再度洗浄し、段階希釈した本発明の抗ＩＬ４Ｒα抗体又は対照物質（０．００４～６６．７ｎＭ、６６．７ｎＭから開始、２．５％ｗ／ｖスキムミルクを含むＰＢＳＴで５倍勾配で希釈）を１００μＬで各ウェルに添加し、３７℃で４０分間インキュベートした。プレートを４回洗浄した後、１００μＬ／ウェルのペルオキシダーゼ標識アフィニティー精製ヤギ抗マウスＩｇＧ(Ｆｃγ フラグメント特異的)(ＰＢＳＴバッファーで１：５０００に希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号：１１５-０３６-０７１)を３７℃で４０分間インキュベートした。最後の洗浄後、１００μＬ／ウェルのＴＭＢ(Ｉｎｎｏｒｅａｇｅｎｔｓ)を加え、インキュベーションした。３～１０分後、２５℃で１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を５０μＬ／ウェル添加することにより反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してデータを分析し、ＥＣ５０値を取得した。
【0141】
【0142】
結果から、本発明のマウス抗ＩＬ４Ｒα抗体は、高い結合能力でヒトＩＬ４Ｒαに特異的に結合し、それらのいくつかはベンチマークよりも高い結合活性でサルＩＬ４Ｒαタンパク質に結合したことが分かった。
【0143】
【表3】
【0144】
実施例４：ＩＬ４Ｒα－ベンチマーク又はＩＬ４Ｒα－ＩＬ４相互作用に対するマウス抗ＩＬ４Ｒα抗体の遮断活性
４．１ リガンド遮断 ＥＬＩＳＡ
本発明の抗ＩＬ４Ｒα抗体がＩＬ４－ＩＬ４Ｒα相互作用をブロックする能力は、競合ＥＬＩＳＡによって決定された。簡単に説明すると、ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬの濃度のヒトＩＬ４Ｒα-ｈｉｓタンパク質(配列番号： ５７、自家調製)を１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートにコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ + ０．０５％ｗ／ｖＴｗｅｅｎ-２０、ＰＢＳＴ）で洗浄し、ＰＢＳＴ中の５％ｗ／ｖ脱脂乳で３７℃で２時間ブロッキングした。次いで、洗浄緩衝液を使用してプレートを再度洗浄した。
４．１ リガンド遮断 ＥＬＩＳＡ
本発明の抗ＩＬ４Ｒα抗体がＩＬ４－ＩＬ４Ｒα相互作用をブロックする能力は、競合ＥＬＩＳＡによって決定された。簡単に説明すると、ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬの濃度のヒトＩＬ４Ｒα-ｈｉｓタンパク質(配列番号： ５７、自家調製)を１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートにコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ + ０．０５％ｗ／ｖＴｗｅｅｎ-２０、ＰＢＳＴ）で洗浄し、ＰＢＳＴ中の５％ｗ／ｖ脱脂乳で３７℃で２時間ブロッキングした。次いで、洗浄緩衝液を使用してプレートを再度洗浄した。
【0145】
抗ＩＬ４Ｒα抗体又は対照物質を、２．５％ ｗ／ｖ脱脂乳含有ＰＢＳＴバッファーで段階希釈(８０ｎＭ から開始、４倍段階希釈)し、段階希釈した抗ＩＬ４Ｒα抗体又は対照物質をＩＬ４Ｒαコーティングプレートに１００μＬ／ウェルで添加し、ヒトＩＬ４Ｒα-ｈｉｓタンパク質とともに３７℃で４０分間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで４回洗浄し、その後、濃度０．５６ｎＭのビオチン標識ヒトＩＬ４タンパク質(Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ., カタログ番号１１８４６-ＨＮＡＥ）１００μＬを各ウェルに加え、３７℃で４０分間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで再度洗浄した。次に、１００μＬ／ウェルのＨＲＰ標識ストレプトアビジン(ＰＢＳＴバッファーで１：１００００に希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ ０１６-０３０-０８４)を加え、３７℃で４０分間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで再度洗浄した。最後に、ＴＭＢを加え、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止し、吸光度を４５０ｎｍで読み取りました。 Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してデータを分析し、ＩＣ５０値を取得した。
【0146】
４．２ ベンチマーク遮断ＥＬＩＳＡ
本発明の抗ＩＬ４Ｒα抗体がベンチマーク－ヒトＩＬ４Ｒα結合をブロックする能力を、競合ＥＬＩＳＡアッセイで測定した。簡単に説明すると、９６ウェルマイクロプレートに、ＰＢＳ中の２μｇ／ｍＬ濃度のベンチマークを１００μｌ／ウェルでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを洗浄バッファー(ＰＢＳ+０．０５％ｗ／ｖ Ｔｗｅｅｎ-２０、ＰＢＳＴ)で洗浄し、ＰＢＳＴ中の５％ｗ／ｖ無脂肪乳で３７℃で２時間ブロックした。プレートブロッキング中、本発明の抗ＩＬ４Ｒα抗体又は対照を、ビオチン標識ヒトＩＬ４Ｒα－ｈｉｓタンパク質(配列番号５７、社内作成、ＰＢＳＴ中の２．５％ｗ／ｖ無脂肪乳で０．５５ｎＭで調製)で１００ｎＭから開始の４倍連続希釈し、２５℃で４０分間インキュベートした。プレートの洗浄後、抗体／ＩＬ４Ｒα-－ｈｉｓ混合物をベンチマークコーティングプレートに１ウェルあたり１００μｌ添加した。３７℃で４０分間インキュベートした後、洗浄バッファーを使用してプレートを洗浄した。その後、１００μｌ／ウェルのＨＲＰ標識ストレプトアビジンをプレートに添加し、３７℃で４０分間インキュベートして、プレートに結合したビオチン標識ヒトＩＬ４Ｒα-ｈｉｓを検出した。プレートを洗浄バッファーで再度洗浄した。最後にＴＭＢを添加し、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してデータを分析し、ＩＣ５０値を取得した。
本発明の抗ＩＬ４Ｒα抗体がベンチマーク－ヒトＩＬ４Ｒα結合をブロックする能力を、競合ＥＬＩＳＡアッセイで測定した。簡単に説明すると、９６ウェルマイクロプレートに、ＰＢＳ中の２μｇ／ｍＬ濃度のベンチマークを１００μｌ／ウェルでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを洗浄バッファー(ＰＢＳ+０．０５％ｗ／ｖ Ｔｗｅｅｎ-２０、ＰＢＳＴ)で洗浄し、ＰＢＳＴ中の５％ｗ／ｖ無脂肪乳で３７℃で２時間ブロックした。プレートブロッキング中、本発明の抗ＩＬ４Ｒα抗体又は対照を、ビオチン標識ヒトＩＬ４Ｒα－ｈｉｓタンパク質(配列番号５７、社内作成、ＰＢＳＴ中の２．５％ｗ／ｖ無脂肪乳で０．５５ｎＭで調製)で１００ｎＭから開始の４倍連続希釈し、２５℃で４０分間インキュベートした。プレートの洗浄後、抗体／ＩＬ４Ｒα-－ｈｉｓ混合物をベンチマークコーティングプレートに１ウェルあたり１００μｌ添加した。３７℃で４０分間インキュベートした後、洗浄バッファーを使用してプレートを洗浄した。その後、１００μｌ／ウェルのＨＲＰ標識ストレプトアビジンをプレートに添加し、３７℃で４０分間インキュベートして、プレートに結合したビオチン標識ヒトＩＬ４Ｒα-ｈｉｓを検出した。プレートを洗浄バッファーで再度洗浄した。最後にＴＭＢを添加し、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してデータを分析し、ＩＣ５０値を取得した。
【0147】
４．３ 細胞ベースのリガンド遮断ＦＡＣＳ
上記で調製した２９３Ｆ-ＩＬ４Ｒα細胞を用いて、細胞表面ＩＬ４ＲαへのＩＬ４タンパク質の結合をブロックする抗ＩＬ４Ｒα抗体の活性をフローサイトメトリー(ＦＡＣＳ)によって評価した。
上記で調製した２９３Ｆ-ＩＬ４Ｒα細胞を用いて、細胞表面ＩＬ４ＲαへのＩＬ４タンパク質の結合をブロックする抗ＩＬ４Ｒα抗体の活性をフローサイトメトリー(ＦＡＣＳ)によって評価した。
【0148】
簡単に言えば、２９３Ｆ-ＩＬ４Ｒα細胞を細胞培養フラスコから回収し、２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液(２％ｖ／ｖウシ胎児血清を含むＰＢＳ)に再懸濁した。次に、ＦＡＣＳバッファーで段階希釈（８０ｎＭから開始、４倍段階希釈）した抗ＩＬ４Ｒα抗体又は対照物質を１００μＬ／ウェルで、１×１０５細胞／ウェルを含む９６ウェルプレートに添加し、４０分間氷浴した。プレートをＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１００μｌ／ウェルの１．６７ｎＭビオチン標識ヒトＩＬ４タンパク質（Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｃ.,カタログ番号１１８４６-ＨＮＡＥ）を添加し、暗所で４℃で４０分間インキュベートした。プレートをＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した後、１００μｌ／ウェルのＲ-フィコエリトリン・ストレプトアビジン(ＦＡＣＳバッファーで１：５００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号０１６-１１０-０８４)を添加し、暗所で４℃で４０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ-ＨＴＳ装置を使用して蛍光を測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してデータを分析し、ＩＣ５０値を取得した。
【0149】
３つの測定の結果を以下の表４と図４Ａ～４Ｂ、５Ａ～５Ｂ及び６Ａ～６Ｃに示した。
【0150】
表４及び図４Ａ～４Ｂから、本発明のすべての抗ＩＬ４Ｒα抗体が、ベンチマークに匹敵する遮断活性でヒトＩＬ４－ヒトＩＬ４Ｒα相互作用を遮断することができたことが分かった。
【0151】
図５Ａ及び５Ｂは、本発明の抗体のいくつかがヒトＩＬ４Ｒα－ベンチマーク結合を遮断することができたことを示し、それらがベンチマークと同じ又は類似のエピトープに結合する可能性があることを示唆している。
【0152】
さらに、表４及び図６Ａ～６Ｃに示すように、すべての抗ＩＬ４Ｒα抗体はＩＬ４の細胞表面ＩＬ４Ｒαへの結合をブロックすることができ、その遮断能力は参照製品の遮断能力に非常に近かった(ただし、ＩＣ５０値はベンチマークの値よりもわずかに高かった)。
【0153】
【表4】
【0154】
実施例５：マウス抗ＩＬ４Ｒα抗体の細胞ベースの機能測定
ＩＬ４とＩＬ１３はＩＬ４Ｒαに結合し、ＨＥＫ２９３Ｔ-ＩＬ４Ｒα-ＳＴＡＴ６-ＳＴＡＴ６ＬＵＣ-ＬＢ２細胞でＳＴＡＴ６のリン酸化を誘導することができた。リン酸化ステップはＩＬ４／ＩＬ１３シグナル伝達経路において重要である。
ＩＬ４とＩＬ１３はＩＬ４Ｒαに結合し、ＨＥＫ２９３Ｔ-ＩＬ４Ｒα-ＳＴＡＴ６-ＳＴＡＴ６ＬＵＣ-ＬＢ２細胞でＳＴＡＴ６のリン酸化を誘導することができた。リン酸化ステップはＩＬ４／ＩＬ１３シグナル伝達経路において重要である。
【0155】
簡単に説明すると、ｐｃＤＮＡ３．１-Ｐｕｒｏ（ＹｏｕＢｉｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｃ.,カタログ番号ＶＴ９２２２）プラスミド コンストラクト（ＢａｍＨＩ とＸｈｏＩ の間にヒトＩＬ４Ｒαをコードするヌクレオチドを含む）、ＳＴＡＴ６プラスミド（Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｃ.,カタログ番号ＨＧ１３１９０-ＮＨ）（ＫｐｎＩ とＸｂａＩ の間にヒトＳＴＡＴ６をコードするヌクレオチドを含む）、及びＳＴＡＴ６ルシフェラーゼ レポーター遺伝子プラスミドＳＴＡＴ６-Ｌｕｃ（Ｙｅａｓｅｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｃ.,カタログ番号１１５８８ＥＳ０３）を用いて、ＩＬ１３Ｒα１をネイティブに発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１１２６８）を安定的にトランスフェクトし、ＨＥＫ２９３Ｔ-ＩＬ４Ｒα-ＳＴＡＴ６-ＳＴＡＴ６ＬＵＣ-ＬＢ２細胞を社内で調製した。次に、単一細胞クローンＬＢ２を、その後のすべての機能アッセイのために選択した。
【0156】
本発明の抗ＩＬ４Ｒα抗体は、ＩＬ４及びＩＬ１３誘導ＳＴＡＴ６リン酸化に対する阻害効果について試験された。
【0157】
簡単に説明すると、対数期のＨＥＫ２９３Ｔ-ＩＬ４Ｒα-ＳＴＡＴ６-ＳＴＡＴ６ＬＵＣ-ＬＢ２細胞を培地(ＲＰＭＩ１６４０+１０％ ＦＢＳ)に再懸濁し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、各ウェルには５×１０５細胞が含まれた。次に、５０μＬの段階希釈した抗ＩＬ４Ｒα抗体又はコントロール(自社で調製した抗ＣＤ２２抗体を含む)(１００ｎＭから開始、５倍段階希釈)を各ウェルに加え、３７℃で３０分間インキュベートした。次に、５０μＬのＩＬ４タンパク質(６００ ｐｇ／ｍＬ、Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｃ．，カタログ番号１１８４６-ＨＮＡＥ)又はＩＬ１３タンパク質(５０ ｎｇ／ｍＬ、Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｃ．，カタログ番号１０３６９-ＨＮＡＣ)を各ウェルに加え、３７℃で２０分間インキュベートした。プレートを遠心分離し、染色バッファー(社内で調製、ＤＰＢＳ+０．５％ｗ／ｖＢＳＡ+２ ｍＭ ＥＤＴＡ)で２回洗浄した後、５０μＬの固定バッファー(ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎｃ．，カタログ５５４５６５５)を各ウェルに加え、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、２００μＬの透過化緩衝液（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎｃ．、カタログ番号５５８０５０）を各ウェルに添加し、３０分間氷浴した。プレートを染色緩衝液で３回洗浄した。その後、抗ｐＳＴＡＴ６抗体（ｐＳＴＡＴ６ストック溶液の２０倍希釈、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎｃ., カタログ番号５６２０７９）を添加し、氷上で６０分間静置した。最後に、プレートを２回洗浄し、染色バッファーに再懸濁した。Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ-ＨＴＳを用いて蛍光値を測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してデータを分析し、ＩＣ５０値を取得した。
【0158】
結果を以下の表５と図７、８に示した。
【0159】
結果は、すべての抗ＩＬ４Ｒα抗体が、ＨＥＫ２９３Ｔ－ＩＬ４Ｒα－ＳＴＡＴ６－ＳＴＡＴ６ＬＵＣ－ＬＢ２細胞におけるＩＬ４又はＩＬ１３誘導ＳＴＡＴ６リン酸化を、参照物質と同等以上の遮断活性で遮断できることを示している。
【0160】
【表5】
【0161】
実施例６：キメラ抗体の生成及び特徴付け
抗ＩＬ４Ｒαマウスモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を配列決定し、配列ＩＤを表１にまとめた。
抗ＩＬ４Ｒαマウスモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を配列決定し、配列ＩＤを表１にまとめた。
【0162】
抗ＩＬ４ＲαマウスｍＡｂモノクローナル抗体Ｃ２Ｃ１Ａ１Ａ１及びＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８の重鎖及び軽鎖の可変ドメインを、それぞれヒトＩｇＧ４重鎖定常領域（配列番号５５）を含むベクター及びヒトκ軽鎖定常領域（配列番号５６）を含むベクターにクローニングし、ここで可変領域のＣ末端は、対応する定常領域のＮ末端に連結される。
【0163】
ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域に連結した重鎖可変領域をコードするヌクレオチドを含むベクターと、ヒトκ軽鎖定常領域に連結した軽鎖可変領域をコードするヌクレオチドを含むベクターを、軽鎖コンストラクト：重鎖コンストラクトの６０％：４０％の比率で１ｍｇ／ｍＬ ＰＥＩで５０ｍＬ ２９３Ｆ懸濁細胞に一時的にトランスフェクトした。
【0164】
振盪フラスコ中で６日間培養した後に細胞上清を回収し、スピンダウンして細胞をペレット化し、免疫グロブリン分離のために０．２２μｍフィルターを通して濾過した。キメラ抗体はプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。簡単に説明すると、プロテインＡセファロースカラム（ｂｅｓｔｃｈｒｏｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから、カタログ番号ＡＡ０２７３）を、ＰＢＳ緩衝液を使用して５から１０倍カラム容積で洗浄した。細胞上清をプロテインＡセファロースカラムに通し、タンパク質の吸光度がベースラインに達するまでカラムをＰＢＳ緩衝液で洗浄した。カラムを溶出バッファー(０．１Ｍ グリシン-ＨＣｌ、ｐＨ２．７)で溶出し、すぐに中和バッファー(１Ｍ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ９．０)を含む１．５ｍｌチューブに集め、中和した。免疫グロブリンを含む画分をプールし、ＰＢＳで４℃で一晩透析した。
【0165】
精製された抗体は、Ｃａｐｔｕｒｅ ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ親和性試験、細胞ベースの結合ＦＡＣＳ、及び細胞ベースの機能測定において、上記の実施例のプロトコル（以下に記載するわずかな変更を加えた）に従って試験した。
【0166】
Ｃａｐｔｕｒｅ ＥＬＩＳＡでは、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃγフラグメント特異的）の代わりに、２μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ(アフィニティー精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ フラグメント特異的、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－００５－０９８)を１００μＬ／ウェルで使用した。
【0167】
間接ＥＬＩＳＡでは、ペルオキシダーゼ標識アフィニティー精製ヤギ抗マウスＩｇＧ(Ｆｃγ フラグメント特異的)の代わりに、ペルオキシダーゼ標識アフィニティー精製 Ｆ(ａｂ’)２断片化ヤギ抗ヒトＩｇＧ(Ｆｃγ フラグメント特異的、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ １０９-０３６-０９８)を１００μＬ／ウェルで使用した。
【0168】
ＢＩＡｃｏｒｅでは、ヤギ抗マウスＩｇＧの代わりにヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００８３９、Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ）を使用し、ＣＭ５チップに共有結合した。
【0169】
細胞ベースの結合ＦＡＣＳでは、Ｒ-フィコエリトリン標識アフィニティ精製Ｆ(ａｂ')２断片化ヤギ抗マウスＩｇＧ(Ｈ+Ｌ)の代わりに、Ｒ-フィコエリトリン標識アフィニティ精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγフラグメント特異的、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９-１１５-０９８）をＦＡＣＳバッファーで１：１０００に希釈し、１００μＬ／ウェルで使用した。
【0170】
結果を表６及び図９～１３に示した。データは、キメラ抗体がその親マウス抗体と同様の結合親和性／能力及び遮断活性を有することを示している。
【0171】
【表6】
【0172】
実施例７：抗ＩＬ４Ｒαモノクローナル抗体Ｂ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８及びＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１のヒト化
マウス抗ＩＬ４Ｒα抗体 Ｂ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８及びＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１をヒト化し、さらに特性を明らかにした。マウス抗体のヒト化は、確立されたＣＤＲグラフト法を使用して、以下に説明するように実行された。
マウス抗ＩＬ４Ｒα抗体 Ｂ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８及びＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１をヒト化し、さらに特性を明らかにした。マウス抗体のヒト化は、確立されたＣＤＲグラフト法を使用して、以下に説明するように実行された。
【0173】
マウス抗体Ｂ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８及びＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１のヒト化のためのアクセプターフレームワークを選択するために、各マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域配列をヒト免疫グロブリン遺伝子データベースに対してブラスト（ＢＬＡＳＴ）した。最高の相同性を持つヒトの生殖系列が、ヒト化のためのアクセプターフレームワークとして選択された。マウス抗体の重鎖／軽鎖可変領域ＣＤＲを選択したフレームワークに挿入し、フレームワークの残基をさらに復帰突然変異させて、より多くの候補の重鎖／軽鎖可変領域を取得した。合計１３個の例示的なヒト化Ｂ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８抗体、即ち、ｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ１からｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ１１、ｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ１３及びｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ１４まで、ならびに１６個の例示的なヒト化Ｃ２Ｃ１Ａ１Ａ１抗体、即ち、ｈｕＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１-Ｖ１からｈｕＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１-Ｖ１６までが得られ、その重鎖／軽鎖可変領域の配列ＩＤを表１に示した。
【0174】
ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域（配列番号５５）に連結されたヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチドを含むベクター、及びヒトκ軽鎖定常領域（配列番号５６）に連結されたヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチドを含むベクターを、軽鎖コンストラクト：重鎖コンストラクトの６０％：４０％の比率で１ｍｇ／ｍＬ ＰＥＩで５０ｍＬ ２９３Ｆ懸濁細胞に一時的にトランスフェクトした。
【0175】
振とうフラスコで６日間培養した後に細胞上清を回収し、上清中の細胞を遠心分離によってペレット化し、０．２２μｍフィルターでろ過して免疫グロブリンを分離した。抗体は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製された。簡単に説明すると、プロテインＡセファロースカラム（ｂｅｓｔｃｈｒｏｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから、カタログ番号ＡＡ０２７３）を、ＰＢＳ緩衝液を使用して５から１０倍カラム容積で洗浄した。細胞上清をプロテインＡセファロースカラムに通し、タンパク質の吸光度がベースラインに達するまでカラムをＰＢＳ緩衝液で洗浄した。カラムを溶出バッファー(０．１Ｍ グリシン-ＨＣｌ、ｐＨ２．７)で溶出し、すぐに中和バッファー(１Ｍ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ９．０)を含む１．５ｍｌチューブに集め、中和した。免疫グロブリンを含む画分をプールし、ＰＢＳで４℃で一晩透析した。
【0176】
実施例８：ヒト化抗体の特徴付け
【0177】
【表7】
【0178】
ヒトＩＬ４Ｒαに対するヒト化抗体の結合親和性は、前の実施例のプロトコルに従ってＢＩＡｃｏｒｅ技術によって評価された。測定Ｋａ、Ｋｄ及びＫＤ値を測定し、表７及び表８にまとめた。
【0179】
【表8】
【0180】
結果は、ヒト化抗体がヒトＩＬ４Ｒαに対してキメラ抗体と同様の結合親和性を有し、すべてのヒト化ｈｕＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１抗体が参照と比較してヒトＩＬ４Ｒαに対してより高い結合親和性を示すことが示されている。
【0181】
ヒト化抗体ｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ２、ｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ４、ｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ１４、ｈｕＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１-Ｖ１４及びｈｕＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１-Ｖ１５は、Ｂｉａｃｏｒｅ、ｃａｐａｔｕｒｅＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、細胞ベースの結合ＦＡＣＳ、競合ＥＬＩＳＡ及び細胞ベースの機能測定において、上記の実施例のプロトコル（以下に記載するわずかな変更を加えた）に従って試験した。
【0182】
Ｃａｐｔｕｒｅ ＥＬＩＳＡでは、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃγフラグメント特異的）の代わりに、２ μｇ／ｍＬヤギ抗ヒトＩｇＧ（アフィニティー精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγフラグメント特異的、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９-００５-０９８）を１００μＬ／ウェルで使用した。
【0183】
間接ＥＬＩＳＡでは、ペルオキシダーゼ標識アフィニティー精製ヤギ抗マウスＩｇＧ(Ｆｃγ フラグメント特異的)の代わりに、ペルオキシダーゼ標識アフィニティー精製 Ｆ(ａｂ’)２断片化ヤギ抗ヒト ＩｇＧ(Ｆｃγ フラグメント特異的、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ １０９-０３６-０９８)１００ μｌ／ウェルで使用した。
【0184】
ＢＩＡｃｏｒｅでは、ヤギ抗マウスＩｇＧの代わりに、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００８３８、Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ）を使用し、ＣＭ５チップに共有結合した。
【0185】
細胞ベースの結合ＦＡＣＳでは、Ｒ-フィコエリトリン標識アフィニティ精製Ｆ(ａｂ')２断片化ヤギ抗マウスＩｇＧ(Ｈ+Ｌ)の代わりに、Ｒ-フィコエリトリン標識アフィニティ精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγフラグメント特異的、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９-１１５-０９８）をＦＡＣＳバッファーで１：１０００に希釈し、１００μＬ／ウェルで使用した。
【0186】
ヒト化抗体ｈｕＢ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８-Ｖ１４及びｈｕＣ２Ｃ１Ａ１Ａ１-Ｖ１５の熱安定性も試験した。簡単に説明すると、ＧｌｏＭｅｌｔＴＭ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｈｉｆｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｔｉｕｍ、カタログ番号３３０２２-Ｔ、カタログ番号１８１２１４）を使用して、タンパク質サーマルシフトアッセイによってＴｍ（融解温度）を測定した。簡単に説明すると、ＧｌｏＭｅｌｔＴＭ色素を室温で解凍した。染料を含むバイアルをボルテックスし、遠心分離した。次に、５μＬ ２００×染料を９５μＬ ＰＢＳに添加して１０×染料を調製した。反応系に２μＬ １０×染料及び１０μｇヒト化抗体を加え、ＰＢＳに添加して総反応量が２０μＬにした。色素と抗体を含むマイクロ遠心チューブを簡単に遠心分離し、表９のパラメーターを使用して融解曲線プログラムを設定したリアルタイムＰＣＲサーマルサイクラー(Ｒｏｃｈｅ、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ＩＩ)に設置した。
【0187】
【表9】
【0188】
【0189】
【表10-1】
【0190】
【表10-2】
【0191】
【表10-3】
【0192】
データは、ヒト化Ｃ２Ｃ１Ａ１Ａ１抗体が、参照と比較して、ヒトＩＬ４Ｒαに対する同等（良くなければ）の結合親和性／活性、及びＩＬ４Ｒα-ＩＬ４／ＩＬ１３に対する遮断能力を示すが、ヒト化Ｂ８Ｇ１１Ｆ２Ｂ７Ｇ５Ｅ８抗体は、ＩＬ４／ＩＬ１３-ＩＬ１３Ｒα１-ＩＬ４Ｒα相互作用に対して有意に優れた遮断能力を示した。
【0193】
本発明は、１つ又は複数の実施形態に関連して上で説明されてきたが、本発明はそれらの実施形態に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲の精神及び範囲内に含まれるすべての代替物、修正物、及び等価物をカバーすることを意図していることを理解されたい。本明細書で引用されるすべての文書は、参照によりその全体が組み込まれる。
【0194】
この出願のシーケンス情報を次の表にまとめた。
【0195】
【表11-1】
【表11-2】
【表11-3】
【表11-4】
【表11-5】
【表11-6】
【表11-7】
【表11-8】
【表11-9】
【表11-10】
【表11-11】
【表11-12】
【表11-13】
【表11-14】
【表11-15】
【表11-16】
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図15A】
【図15B】
【図16A】
【図16B】
【図17A】
【図17B】
【図18A】
【図18B】
【図19A】
【図19B】
【図20A】
【図20B】
【図21】
【図22】
【配列表】
【国際調査報告】