知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-13
(54)【発明の名称】原発性免疫不全症の検出方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6869 20180101AFI20230406BHJP
G16H 50/00 20180101ALI20230406BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6869 Z
G16H50/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022547751
(86)(22)【出願日】2021-02-05
(85)【翻訳文提出日】2022-10-03
(86)【国際出願番号】 AU2021050095
(87)【国際公開番号】W WO2021155442
(87)【国際公開日】2021-08-12
(31)【優先権主張番号】2020900337
(32)【優先日】2020-02-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＨＵＮＤＥＲＢＯＬＴ
２．ＨＤＭＩ
３．ＢＬＵＥＴＯＯＴＨ
４．ＡＮＤＲＯＩＤ
５．ＵＮＩＸ
６．Ｌｉｎｕｘ
７．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522310111
【氏名又は名称】イミュノシス ピーティーワイ リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】グリーン，サイモン
(72)【発明者】
【氏名】コックス，ベンジャミン
【テーマコード（参考）】
4B063
5L099
【Ｆターム（参考）】
4B063QA13
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ08
4B063QQ28
4B063QQ53
5L099AA04
(57)【要約】
本発明は、対象が原発性免疫不全症（ＰＩＤ）を有するかどうか、又はＰＩＤを発症し易いかどうかを決定する方法であって、ＰＩＤを有する及び有しない参照対象の参照トランスクリプトームプロファイルセットから生成されるトランスクリプトーム関係行列を線形混合モデルに当てはめることによって作成したＰＩＤ予測方程式に、線形混合モデルを用いて対象のトランスクリプトームプロファイルを当てはめることを含む方法に関し、ここで予測方程式の結果により、対象がＰＩＤを有するかどうか、又はＰＩＤに罹り易いかどうかが指示される。本発明は、対象がＰＩＤを有するかどうか、又はＰＩＤを発症し易いかどうかを決定するための原発性免疫不全症（ＰＩＤ）予測方程式を作成する方法であって、ＰＩＤを有する及び有しない参照対象の参照トランスクリプトームプロファイルセットから生成されるトランスクリプトーム関係行列を線形混合モデルに当てはめてＰＩＤ予測方程式を作成することを含む方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象が原発性免疫不全症（ＰＩＤ）を有するかどうか、又はＰＩＤを発症し易いかどうかを決定する方法であって、ＰＩＤを有する及び有しない参照対象の参照トランスクリプトームプロファイルセットから生成されるトランスクリプトーム関係行列を線形混合モデルに当てはめることによって作成したＰＩＤ予測方程式に、線形混合モデルを用いて前記対象のトランスクリプトームプロファイルを当てはめることを含む方法において、前記予測方程式の結果により、前記対象がＰＩＤを有するかどうか、又はＰＩＤに罹り易いかどうかが指示される、方法。
【請求項2】
対象がＰＩＤを有するかどうか、又はＰＩＤを発症し易いかどうかを決定するための原発性免疫不全症（ＰＩＤ）予測方程式を作成する方法であって、ＰＩＤを有する及び有しない参照対象の参照トランスクリプトームプロファイルセットから生成されるトランスクリプトーム関係行列を線形混合モデルに当てはめて前記ＰＩＤ予測方程式を作成することを含む方法。
【請求項3】
前記対象のトランスクリプトームプロファイルを測定することを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記参照対象の前記トランスクリプトームプロファイルを測定することを更に含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記線形混合モデルが、最良線形不偏予測（ＢＬＵＰ）、ＢａｙｅｓＲ、又は機械学習手法である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記参照セットがＲＮＡ配列突然変異プロファイルを更に含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
ＰＩＤ又はＰＩＤへの罹り易さの決定が行われることになる前記対象のＲＮＡ配列突然変異プロファイルを測定することを更に含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記参照セットがＲＮＡ配列突然変異プロファイルを更に含み、前記線形混合モデルを用いて前記対象の前記トランスクリプトームプロファイル及びＲＮＡ配列突然変異プロファイルを前記ＰＩＤ予測方程式に当てはめる、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記参照セットがＤＮＡ配列突然変異プロファイルを更に含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
ＰＩＤ又はＰＩＤへの罹り易さの決定が行われることになる前記対象のＤＮＡ配列突然変異プロファイルを測定すること、又はそれを決定することを更に含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記参照セットがＤＮＡ配列突然変異プロファイルを更に含み、前記線形混合モデルを用いて前記対象の前記トランスクリプトームプロファイル及びＤＮＡ配列突然変異プロファイルを前記ＰＩＤ予測方程式に当てはめる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記突然変異プロファイルが、ａ）ＰＩＤを引き起こす既知の突然変異を含むＰＩＤ遺伝子のＲＮＡ配列；
ｂ）その突然変異がＰＩＤを引き起こす既知の遺伝子によってコードされるタンパク質の構造又は機能に影響を及ぼす新規突然変異、任意選択でフレームシフト突然変異、終止コドン又はアミノ酸変化；
ｃ）ＰＩＤを引き起こす、一方のアレルにおける優性突然変異；
ｄ）ＰＩＤを引き起こす、同じ遺伝子にあるが、２つの異なるアレル上にある２つの異なる突然変異；
ｅ）ＰＩＤを引き起こす突然変異についての共起マーカーとの連関によって推測又はインピュートされるＲＮＡ中の既知の突然変異；
ｆ）調節欠陥又は不安定化突然変異を指示するものである、非ＰＩＤ対象で通常発現する遺伝子の発現の欠如；
ｇ）スプライシング欠陥を指示するものである、欠陥のあるエクソン構造；
ｈ）ＰＩＤを引き起こす１個以上、任意選択で１～３個の追加的な突然変異；又は
ｉ）ＰＩＤ重症度に寄与する２つ以上の他の遺伝子の配列、又は２つ以上の他の遺伝子のインピュートされる配列
を含む、請求項６～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記参照セットがメタゲノムプロファイルを更に含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
ＰＩＤ又はＰＩＤへの罹り易さの決定が行われることになる前記対象のメタゲノムプロファイルを測定すること、又はそれを決定することを更に含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記参照セットがメタゲノムプロファイルを更に含み、前記線形混合モデルを用いて前記対象の前記トランスクリプトームプロファイル及びメタゲノムプロファイルを前記ＰＩＤ予測方程式に当てはめる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記トランスクリプトームプロファイル又は配列突然変異プロファイルが、喀痰、血液、羊水、血漿、精液、骨髄、組織、尿、腹水、又は胸水から入手され、任意選択で細針生検によって入手される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記血液が末梢血単核球を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記メタゲノムプロファイルが、口腔スワブ、鼻スワブ、咽頭スワブ、唾液、糞便、又は皮膚から入手される、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項19】
前記対象がヒトである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
ＰＩＤ又はＰＩＤへの罹り易さの決定が行われることになる前記対象の前記プロファイルが、前記対象から予め入手された生体試料を分析することから決定される、又は測定される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
ゲノム情報を処理するためのコンピュータ実装された方法であって、前記ゲノム情報が対象トランスクリプトームプロファイルを含み、各参照対象が原発性免疫不全症（ＰＩＤ）を有するか、又は有しないかのいずれかである参照対象の参照トランスクリプトームプロファイルセットにアクセスすること；
前記参照トランスクリプトームプロファイルセットからトランスクリプトーム関係行列を生成すること；
前記トランスクリプトーム関係行列を線形混合モデルに当てはめてＰＩＤ予測方程式を生成すること；及び
前記対象トランスクリプトームプロファイルを前記ＰＩＤ予測方程式に当てはめること
を含む方法。
【請求項22】
原発性免疫不全症（ＰＩＤ）予測方程式を生成するためのコンピュータ実装された方法であって、各参照対象が原発性免疫不全症（ＰＩＤ）を有するか、又は有しないかのいずれかである参照対象の参照トランスクリプトームプロファイルセットにアクセスすること；
前記参照トランスクリプトームプロファイルセットからトランスクリプトーム関係行列を生成すること；及び
前記トランスクリプトーム関係行列を線形混合モデルに当てはめて前記ＰＩＤ予測方程式を生成すること
を含む方法。
【請求項23】
前記対象のトランスクリプトームプロファイルを測定することを更に含む、請求項２１又は２２に記載のコンピュータ実装された方法。
【請求項24】
前記参照対象のトランスクリプトームプロファイルを測定することを更に含む、請求項２１～２３のいずれか一項に記載のコンピュータ実装された方法。
【請求項25】
前記線形混合モデルが、最良線形不偏予測（ＢＬＵＰ）、ＢａｙｅｓＲ、ランダムフォレスト又は機械学習手法である、請求項２１～２４のいずれか一項に記載のコンピュータ実装された方法。
【請求項26】
前記参照セットがＲＮＡ配列突然変異プロファイルを更に含む、請求項２１～２５のいずれか一項に記載のコンピュータ実装された方法。
【請求項27】
前記参照セットがＲＮＡ配列突然変異プロファイルを更に含み、前記線形混合モデルを用いて前記対象の前記トランスクリプトームプロファイル及びＲＮＡ配列突然変異プロファイルを前記ＰＩＤ予測方程式に当てはめる、請求項２１に記載のコンピュータ実装された方法。
【請求項28】
前記参照セットがＤＮＡ配列突然変異プロファイルを更に含む、請求項２１～２５のいずれか一項に記載のコンピュータ実装された方法。
【請求項29】
前記参照セットがＤＮＡ配列突然変異プロファイルを更に含み、前記線形混合モデルを用いて前記対象の前記トランスクリプトームプロファイル及びＤＮＡ配列突然変異プロファイルを前記ＰＩＤ予測方程式に当てはめる、請求項２１～２８のいずれか一項に記載のコンピュータ実装された方法。
【請求項30】
前記参照セットがメタゲノムプロファイルを更に含む、請求項２１～２９のいずれか一項に記載のコンピュータ実装された方法。
【請求項31】
前記参照セットがメタゲノムプロファイルを更に含み、前記線形混合モデルを用いて前記対象の前記トランスクリプトームプロファイル及びメタゲノムプロファイルを前記ＰＩＤ予測方程式に当てはめる、請求項２１～２９のいずれか一項に記載のコンピュータ実装された方法。
【請求項32】
命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体であって、前記命令が、プロセッサによって実行されると、各参照対象が原発性免疫不全症（ＰＩＤ）を有するか、又は有しないかのいずれかである参照対象の参照トランスクリプトームプロファイルセットにアクセスすること；
前記参照トランスクリプトームプロファイルセットからトランスクリプトーム関係行列を生成すること；
前記トランスクリプトーム関係行列を線形混合モデルに当てはめてＰＩＤ予測方程式を生成すること；
対象トランスクリプトームプロファイルを受け取ること；及び
前記対象トランスクリプトームプロファイルを前記ＰＩＤ予測方程式に当てはめること
を前記プロセッサに行わせる、命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項33】
命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体であって、前記命令が、プロセッサによって実行されると、各参照対象が原発性免疫不全症（ＰＩＤ）を有するか、又は有しないかのいずれかである参照対象の参照トランスクリプトームプロファイルセットにアクセスすること；
前記参照トランスクリプトームプロファイルセットからトランスクリプトーム関係行列を生成すること；及び
前記トランスクリプトーム関係行列を線形混合モデルに当てはめてＰＩＤ予測方程式を生成すること
を前記プロセッサに行わせる、命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項34】
前記線形混合モデルが、最良線形不偏予測（ＢＬＵＰ）、ＢａｙｅｓＲ、ランダムフォレスト又は機械学習手法である、請求項３２又は３３に記載の命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項35】
前記参照セットがＲＮＡ配列突然変異プロファイルを更に含む、請求項３２～３４のいずれか一項に記載の命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項36】
前記参照セットがＲＮＡ配列突然変異プロファイルを更に含み、前記線形混合モデルを用いて前記対象の前記トランスクリプトームプロファイル及びＲＮＡ配列突然変異プロファイルを前記ＰＩＤ予測方程式に当てはめる、請求項３２に記載の命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項37】
前記参照セットがＤＮＡ配列突然変異プロファイルを更に含む、請求項３２～３６のいずれか一項に記載の命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項38】
前記参照セットがＤＮＡ配列突然変異プロファイルを更に含み、前記線形混合モデルを用いて前記対象の前記トランスクリプトームプロファイル及びＤＮＡ配列突然変異プロファイルを前記ＰＩＤ予測方程式に当てはめる、請求項３２～３６のいずれか一項に記載の命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項39】
前記参照セットがメタゲノムプロファイルを更に含む、請求項３２～３８のいずれか一項に記載の命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項40】
前記参照セットがメタゲノムプロファイルを更に含み、前記線形混合モデルを用いて前記対象の前記トランスクリプトームプロファイル及びメタゲノムプロファイルを前記ＰＩＤ予測方程式に当てはめる、請求項３２～３９のいずれか一項に記載の命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、対象が原発性免疫不全症（ＰＩＤ）を有するかどうか、又はＰＩＤを発症し易いかどうかを決定する方法に関する。
本発明は、対象が原発性免疫不全症（ＰＩＤ）を有するかどうか、又はＰＩＤを発症し易いかどうかを決定する方法に関する。
【0002】
先行出願の相互参照
本願は、豪国特許出願公開第２０２０９００３３７号からの優先権を主張するものであり、この内容は全て、全体として参照により援用される。
本願は、豪国特許出願公開第２０２０９００３３７号からの優先権を主張するものであり、この内容は全て、全体として参照により援用される。
【背景技術】
【0003】
発明の背景
原発性免疫不全症（ＰＩＤ）は、先天的な免疫系の欠陥によって引き起こされる一群の疾患であり、２００もの異なる原因突然変異が知られている。ＰＩＤは、生命を脅かし得る重症感染症の反復を特徴とする。ＰＩＤに対しては、造血幹細胞移植、遺伝子療法、酵素補充療法及び静注免疫グロブリンを含めた有効な治療が利用可能である。疾患関連の罹患率、治療費の低減、及び患者アウトカムの向上には、早期診断が決定的に重要である。ＰＩＤにおけるますます多くの免疫学的欠陥について詳細にわたる臨床表現型及び分子基盤が明らかになってきたものの、実際の臨床では、時宜を得た正確な診断がなおも必要とされている。
原発性免疫不全症（ＰＩＤ）は、先天的な免疫系の欠陥によって引き起こされる一群の疾患であり、２００もの異なる原因突然変異が知られている。ＰＩＤは、生命を脅かし得る重症感染症の反復を特徴とする。ＰＩＤに対しては、造血幹細胞移植、遺伝子療法、酵素補充療法及び静注免疫グロブリンを含めた有効な治療が利用可能である。疾患関連の罹患率、治療費の低減、及び患者アウトカムの向上には、早期診断が決定的に重要である。ＰＩＤにおけるますます多くの免疫学的欠陥について詳細にわたる臨床表現型及び分子基盤が明らかになってきたものの、実際の臨床では、時宜を得た正確な診断がなおも必要とされている。
【0004】
ＰＩＤの臨床症状は多岐にわたり、及び現在の診断手順は複雑であるため、発症から診断までに平均５年を要する。現在の診断手順には、リンパ球増殖及び細胞傷害性アッセイ、フローサイトメトリー、血清免疫グロブリン値の測定、全血球計算、好中球機能検査、及び補体アッセイを含め、無数の特殊化した、費用のかかる面倒な機能検査が関わる。
【0005】
ＰＩＤの診断を助けるため、幾つものＤＮＡシーケンシング手法が探索されている。ターゲットサンガー又は他の遺伝子エクソンシーケンシング又は遺伝子タイピングは、ＰＩＤ分類の確立及び最適な治療戦略の考案に用いられている。検査する候補遺伝子の選択に際しては、多くの場合に各患者の個別の臨床的及び免疫学的特徴が指針となる。しかしながら、概して単一遺伝子疾患ではあるものの、２００を超える異なる原因突然変異が報告されており、更に数百あるものと見られ、どの遺伝子（又は具体的な突然変異）を評価すべきかの決定は必ずしも明確でない。更に、異なる遺伝子の突然変異が似かよった表現型として現れることもあり（遺伝子座異質性）、一方で、同じ遺伝子の異なる部分の突然変異が別個の表現型として現れることもある（アレル異質性）。
【0006】
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）は、全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）又は全エクソームシーケンシング（ＷＥＳ）を含め、単一の対象からの何百万ものＤＮＡ断片の増幅及び塩基配列決定を同時に数日のうちに行うことを可能にしている。しかしながら、原因突然変異の同定は、測定すべきヌクレオチド変異体が数多くあること、及びＮＧＳによって検出される新規変異体は、それが多くの場合に十分な特徴付けがなされていない遺伝子に関係するか、又はタンパク質機能に与える生物学的影響が予測不可能であるため解釈が困難であることに起因して、難しい問題であり得る。
【0007】
ＤＮＡシーケンシングの限界として認識されているのは、ＰＩＤ診断にも必要な鍵となる情報である免疫系の性能に関する機能情報が提供されないことである。
【0008】
遺伝子発現解析は、ＰＩＤ突然変異の機能的影響に関する洞察を提供し得る［１］。Salem et al 2014は、ＰＩＤ突然変異ＩＲＦ８Ｋ１０８Ｅを有する患者から得た血液細胞のＲＮＡシーケンシングにより、ＩＲＦ８の調節を受ける標的遺伝子の発現減少並びに血球減少を指示するものである細胞型特異的転写物の少なさが明らかになったと報告した［１］。遺伝子発現解析は、研究ツールとして有用であるものの、それ単独でＰＩＤの直接的な診断手法として用いられること、又はそうと考えられることはなく、現在の診断手法は、免疫系の組成及び性能に関する細胞ベースの機能情報に頼るものであり、決定が可能であるならば、原因突然変異の知識とそれを組み合わせる。遺伝子発現解析から得られる機能的洞察は、その発現がＰＩＤを指示するものである、及びその発現によって免疫系の他の障害を有する個体を含めた免疫適格性の個体とＰＩＤを区別し得る遺伝子のセットの同定を可能にする。
【0009】
重要なことに、複合表現型分析としての患者の遺伝子発現レベルの包括的分析がＰＩＤの直接的な診断手法として用いられたこと、又はそうと考えられたことはない。ＲＮＡシーケンシングには、免疫細胞組成及び活性の尺度を提供することが可能であるという利点があり、潜在的に診断能力がある。
【0010】
上述のとおり、ＰＩＤを定義付ける特徴は、免疫系が微生物の定着及び侵入を管理できないことによる反復性感染症である。具体的な病原体の同定は有用であり、場合によっては治療についての情報を与え得るが、片利共生微生物群集の組成をモニタすることもまた、ＰＩＤの管理に有用な情報を提供し得る。微生物群集は、免疫系との機能的相互作用があると示されることが増えつつあり［２］、それにはＰＩＤ患者の皮膚におけるものも含まれ［３］、これらの患者は何らかの根本的な違いを呈するように見える。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
低いコストで展開することのできる効率的で正確なＰＩＤ診断方法が必要とされている。これは、治療法の決定に影響を与えて患者の生存及びクオリティ・オブ・ライフを向上させるとともに、診断の速度及び適時性が増し、ひいては患者の医療費が大幅に低下すること、及び高価な病理検査サービスの需要低下により、公衆衛生上、大きな影響を与えるであろう。
【0012】
本明細書における任意の先行技術への言及は、その先行技術がいずれかの法域で技術常識の一部を成すこと、又はその先行技術が当業者によって理解され、関連性があると見なされ、及び／又は他の先行技術部分と組み合わされると合理的に予想され得ることを承諾又は示唆するものではない。
【課題を解決するための手段】
【0013】
発明の概要
本発明者らは、対象がＰＩＤを有するかどうか、又はＰＩＤを発症し易いかどうかを決定する方法を提供する。本方法は、遺伝子発現、即ちトランスクリプトーム、及び任意選択で遺伝子配列突然変異のＲＮＡ解析（ＲＮＡｓｅｑ）を含み、更に、ＲＮＡ発現レベル（配列又はＳＮＰでなく）を入力とする線形混合モデルを用いて、トランスクリプトームに反映される免疫系の機能欠如を検出すること、及び任意選択で、具体的なＰＩＤ配列突然変異の検出を含む。加えて、本発明者らは、片利共生微生物群集構造の尺度としてのメタゲノムプロファイリングをＲＮＡシーケンシング混合モデル分析と組み合わせて用いることにより、対象がＰＩＤを有するかどうか、又はＰＩＤを発症し易いかどうかを決定する方法を提供する。
本発明者らは、対象がＰＩＤを有するかどうか、又はＰＩＤを発症し易いかどうかを決定する方法を提供する。本方法は、遺伝子発現、即ちトランスクリプトーム、及び任意選択で遺伝子配列突然変異のＲＮＡ解析（ＲＮＡｓｅｑ）を含み、更に、ＲＮＡ発現レベル（配列又はＳＮＰでなく）を入力とする線形混合モデルを用いて、トランスクリプトームに反映される免疫系の機能欠如を検出すること、及び任意選択で、具体的なＰＩＤ配列突然変異の検出を含む。加えて、本発明者らは、片利共生微生物群集構造の尺度としてのメタゲノムプロファイリングをＲＮＡシーケンシング混合モデル分析と組み合わせて用いることにより、対象がＰＩＤを有するかどうか、又はＰＩＤを発症し易いかどうかを決定する方法を提供する。
【0014】
従って、一態様において本発明は、対象が原発性免疫不全症（ＰＩＤ）を有するかどうか、又はＰＩＤを発症し易いかどうかを決定する方法であって、
－ＰＩＤを有する及び有しない参照対象の参照トランスクリプトームプロファイルセットから生成されるトランスクリプトーム関係行列を線形混合モデルに当てはめることによって作成したＰＩＤ予測方程式に、線形混合モデルを用いて対象のトランスクリプトームプロファイルを当てはめること
を含む方法を提供し、
ここで予測方程式の結果により、対象がＰＩＤを有するかどうか、又はＰＩＤに罹り易いかどうかが指示される。
－ＰＩＤを有する及び有しない参照対象の参照トランスクリプトームプロファイルセットから生成されるトランスクリプトーム関係行列を線形混合モデルに当てはめることによって作成したＰＩＤ予測方程式に、線形混合モデルを用いて対象のトランスクリプトームプロファイルを当てはめること
を含む方法を提供し、
ここで予測方程式の結果により、対象がＰＩＤを有するかどうか、又はＰＩＤに罹り易いかどうかが指示される。
【0015】
別の態様において本発明は、対象が原発性免疫不全症（ＰＩＤ）を有するかどうか、又はＰＩＤを発症し易いかどうかを決定する方法であって、
－試料からトランスクリプトームプロファイルを生成すること；及び
－ＰＩＤを有する及び有しない参照対象の参照トランスクリプトームプロファイルセットから生成されるトランスクリプトーム関係行列を線形混合モデルに当てはめることによって作成したＰＩＤ予測方程式に、線形混合モデルを用いて対象のトランスクリプトームプロファイルを当てはめること
を含む方法を提供し、
ここで予測方程式の結果により、対象がＰＩＤを有するかどうか、又はＰＩＤに罹り易いかどうかが指示される。
－試料からトランスクリプトームプロファイルを生成すること；及び
－ＰＩＤを有する及び有しない参照対象の参照トランスクリプトームプロファイルセットから生成されるトランスクリプトーム関係行列を線形混合モデルに当てはめることによって作成したＰＩＤ予測方程式に、線形混合モデルを用いて対象のトランスクリプトームプロファイルを当てはめること
を含む方法を提供し、
ここで予測方程式の結果により、対象がＰＩＤを有するかどうか、又はＰＩＤに罹り易いかどうかが指示される。
【0016】
更なる態様において本発明は、対象が原発性免疫不全症（ＰＩＤ）を有するかどうか、又はＰＩＤを発症し易いかどうかを決定する方法であって、
－対象から試料を入手すること；
－試料からトランスクリプトームプロファイルを生成すること；及び
－ＰＩＤを有する及び有しない参照対象の参照トランスクリプトームプロファイルセットから生成されるトランスクリプトーム関係行列を線形混合モデルに当てはめることによって作成したＰＩＤ予測方程式に、線形混合モデルを用いて対象のトランスクリプトームプロファイルを当てはめること
を含む方法を提供し、
ここで予測方程式の結果により、対象がＰＩＤを有するかどうか、又はＰＩＤに罹り易いかどうかが指示される。
－対象から試料を入手すること；
－試料からトランスクリプトームプロファイルを生成すること；及び
－ＰＩＤを有する及び有しない参照対象の参照トランスクリプトームプロファイルセットから生成されるトランスクリプトーム関係行列を線形混合モデルに当てはめることによって作成したＰＩＤ予測方程式に、線形混合モデルを用いて対象のトランスクリプトームプロファイルを当てはめること
を含む方法を提供し、
ここで予測方程式の結果により、対象がＰＩＤを有するかどうか、又はＰＩＤに罹り易いかどうかが指示される。
【0017】
一態様において、本発明は、対象がＰＩＤを有するかどうか、又はＰＩＤを発症し易いかどうかを決定するための原発性免疫不全症（ＰＩＤ）予測方程式を作成する方法であって、
－ＰＩＤを有する及び有しない参照対象の参照トランスクリプトームプロファイルセットから生成されるトランスクリプトーム関係行列を線形混合モデルに当てはめてＰＩＤ予測方程式を作成すること
を含む方法を提供する。
－ＰＩＤを有する及び有しない参照対象の参照トランスクリプトームプロファイルセットから生成されるトランスクリプトーム関係行列を線形混合モデルに当てはめてＰＩＤ予測方程式を作成すること
を含む方法を提供する。
【0018】
別の態様において、本発明は、対象がＰＩＤを有するかどうか、又はＰＩＤを発症し易いかどうかを決定するための原発性免疫不全症（ＰＩＤ）予測方程式を作成する方法であって、
－参照対象から参照トランスクリプトームプロファイルを生成すること；
－参照トランスクリプトームプロファイルセットを生成すること；及び
－ＰＩＤを有する及び有しない参照対象の参照トランスクリプトームプロファイルセットから生成されるトランスクリプトーム関係行列を線形混合モデルに当てはめてＰＩＤ予測方程式を作成すること
を含む方法を提供する。
－参照対象から参照トランスクリプトームプロファイルを生成すること；
－参照トランスクリプトームプロファイルセットを生成すること；及び
－ＰＩＤを有する及び有しない参照対象の参照トランスクリプトームプロファイルセットから生成されるトランスクリプトーム関係行列を線形混合モデルに当てはめてＰＩＤ予測方程式を作成すること
を含む方法を提供する。
【0019】
別の態様において、本発明は、対象がＰＩＤを有するかどうか、又はＰＩＤを発症し易いかどうかを決定するための原発性免疫不全症（ＰＩＤ）予測方程式を作成する方法であって、
－ＰＩＤを有する及び有しない１例以上の対象から１つ又は複数の試料を入手すること；
－各対象から参照トランスクリプトームプロファイルを生成すること；
－参照トランスクリプトームプロファイルセットを生成すること；及び
－ＰＩＤを有する及び有しない参照対象の参照トランスクリプトームプロファイルセットから生成されるトランスクリプトーム関係行列を線形混合モデルに当てはめてＰＩＤ予測方程式を作成すること
を含む方法を提供する。
－ＰＩＤを有する及び有しない１例以上の対象から１つ又は複数の試料を入手すること；
－各対象から参照トランスクリプトームプロファイルを生成すること；
－参照トランスクリプトームプロファイルセットを生成すること；及び
－ＰＩＤを有する及び有しない参照対象の参照トランスクリプトームプロファイルセットから生成されるトランスクリプトーム関係行列を線形混合モデルに当てはめてＰＩＤ予測方程式を作成すること
を含む方法を提供する。
【0020】
上記の方法の任意の実施形態において、本方法は、ＰＩＤ又はＰＩＤへの罹り易さの決定が行われることになる対象のトランスクリプトームプロファイルを測定すること、又はそれを決定することを更に含む。
【0021】
任意の実施形態において、参照トランスクリプトームプロファイルセット及び／又はＰＩＤ若しくはＰＩＤへの罹り易さの決定が行われることになる対象のトランスクリプトームプロファイルは、表１、表２、又は表１及び表２に掲載される遺伝子の少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個、少なくとも２５０個、少なくとも３００個、少なくとも３５０個、少なくとも４００個、少なくとも４５０個、又は５００個全てを含む。
【0022】
本発明の好ましい実施形態において、線形混合モデルは、最良線形不偏予測（ＢＬＵＰ）、ＢａｙｅｓＲ、又は機械学習手法である。本発明の更なる実施形態において、機械学習手法は、エラスティックネット、リッジ回帰、ラッソ回帰、ランダムフォレスト、勾配ブースティングマシン、サポートベクターマシン、多層パーセプトロン（ＭＬＰ）又は畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）のうちの１つ。
【0023】
本発明のある実施形態において、ＰＩＤ予測方程式は絶対予測スコアを提供する。一実施形態において、０．２より大きい、０．４より大きい、０．６より大きい、又は約０．２、約０．４若しくは約０．６の絶対予測スコア。
【0024】
本発明のある実施形態において、ＰＩＤ予測方程式は相対予測スコアを提供し、ここで相対スコアは、患者スコア（診断しようとする対象の試料から決定される）から健常対照スコア（既知の健常対照対象の集団から決定される）を引き算することによって計算される。一実施形態において、相対予測スコアは０より大きく、０．１より大きく、及び０．２より大きく、又は約０、約０．１若しくは約０．２である。
【0025】
本発明のある実施形態において、既知のＰＩＤ遺伝子突然変異を検出する場合、１．０に近い、好ましくは１．０の絶対予測スコアを指定することができる。
【0026】
本発明の任意の実施形態において、ＰＩＤ予測方程式は、ＰＩＤ遺伝子突然変異のリードアウトを更に提供する。
【0027】
上記の方法の任意の実施形態において、参照セットは、ＲＮＡ配列突然変異プロファイルを更に含む。
【0028】
上記の方法の任意の実施形態において、本方法は、ＰＩＤ又はＰＩＤへの罹り易さの決定が行われることになる対象のＲＮＡ配列突然変異プロファイルを測定すること、又はそれを決定することを更に含む。
【0029】
上記の方法の任意の実施形態において、トランスクリプトームプロファイルは、ＰＩＤを有する対象の中での欠陥のある経路に関する更なる情報を提供するために用いられる。例えば、患者のＦｃ受容体シグナル伝達経路、補体経路又はインターフェロンシグナル伝達経路に不全があると述べるレポートが生成されてもよい。これは臨床医に、治療選択肢の処方を支援し得る情報を提供する。
【0030】
本発明の好ましい実施形態において、突然変異プロファイルは、
ａ）ＰＩＤと関連付けられる、それに関与する、又はその原因となる既知の突然変異を含むＰＩＤ遺伝子のＲＮＡ配列；
ｂ）ＰＩＤと関連付けられる、それに関与する、又はその原因となる既知の遺伝子突然変異によってコードされるタンパク質の構造又は機能に影響を及ぼす新規突然変異、任意選択で、フレームシフト突然変異若しくはアミノ酸を変化させるミスセンス突然変異、又はナンセンス終止コドン；
ｃ）ＰＩＤと関連付けられる、それに関与する、又はその原因となる、一方のアレルにおける優性突然変異；
ｄ）ＰＩＤと関連付けられる、それに関与する、又はその原因となる、同じ遺伝子にあるが、２つの異なるアレル上にある２つの異なる突然変異；
ｅ）ＰＩＤと関連付けられる、それに関与する、又はその原因となる突然変異についての共起マーカーとの連関によって推測又はインピュートされるＲＮＡ中の既知の突然変異；
ｆ）調節欠陥又は不安定化突然変異を指示するものである、非ＰＩＤ対象で通常発現する遺伝子の発現の欠如；
ｇ）スプライシング欠陥を指示するものである、欠陥のあるエクソン構造；
ｈ）ＰＩＤと関連付けられる、それに関与する、又はその原因となる１個以上、任意選択で１～３個の追加的な突然変異；又は
ｉ）ＰＩＤ重症度と関連付けられる、それに関与する、又はその原因となる２つ以上の他の遺伝子の配列、又は２つ以上の他の遺伝子のインピュートされる配列
を含む。
ａ）ＰＩＤと関連付けられる、それに関与する、又はその原因となる既知の突然変異を含むＰＩＤ遺伝子のＲＮＡ配列；
ｂ）ＰＩＤと関連付けられる、それに関与する、又はその原因となる既知の遺伝子突然変異によってコードされるタンパク質の構造又は機能に影響を及ぼす新規突然変異、任意選択で、フレームシフト突然変異若しくはアミノ酸を変化させるミスセンス突然変異、又はナンセンス終止コドン；
ｃ）ＰＩＤと関連付けられる、それに関与する、又はその原因となる、一方のアレルにおける優性突然変異；
ｄ）ＰＩＤと関連付けられる、それに関与する、又はその原因となる、同じ遺伝子にあるが、２つの異なるアレル上にある２つの異なる突然変異；
ｅ）ＰＩＤと関連付けられる、それに関与する、又はその原因となる突然変異についての共起マーカーとの連関によって推測又はインピュートされるＲＮＡ中の既知の突然変異；
ｆ）調節欠陥又は不安定化突然変異を指示するものである、非ＰＩＤ対象で通常発現する遺伝子の発現の欠如；
ｇ）スプライシング欠陥を指示するものである、欠陥のあるエクソン構造；
ｈ）ＰＩＤと関連付けられる、それに関与する、又はその原因となる１個以上、任意選択で１～３個の追加的な突然変異；又は
ｉ）ＰＩＤ重症度と関連付けられる、それに関与する、又はその原因となる２つ以上の他の遺伝子の配列、又は２つ以上の他の遺伝子のインピュートされる配列
を含む。
【0031】
上記の方法の任意の実施形態において、参照セットは、ＤＮＡ配列突然変異プロファイルを更に含む。
【0032】
上記の方法の任意の実施形態において、本方法は、ＰＩＤ又はＰＩＤへの罹り易さの決定が行われることになる対象のＤＮＡ配列突然変異プロファイルを測定すること、又はそれを決定することを更に含む。好ましくは、線形混合モデルを用いて対象のトランスクリプトームプロファイル及びＤＮＡ配列突然変異プロファイルをＰＩＤ予測方程式に当てはめる。
【0033】
上記の方法の任意の実施形態において、参照セットはメタゲノムプロファイルを更に含み、線形混合モデルを用いて対象のトランスクリプトームプロファイル及びメタゲノムプロファイルをＰＩＤ予測方程式に当てはめる。
【0034】
上記の方法の好ましい実施形態において、メタゲノムプロファイルは、口腔スワブ、鼻スワブ、咽頭スワブ、唾液、糞便、又は皮膚から入手される。
【0035】
更に好ましい実施形態において、対象はヒトである。
【0036】
本発明の更なる態様において、対象が原発性免疫不全症（ＰＩＤ）を有するかどうか、又はＰＩＤを発症し易いかどうかを決定する方法であって、ＰＩＤを有する及び有しない参照対象のメタゲノムプロファイルの参照セットから生成されるメタゲノム関係行列を線形混合モデルに当てはめることによって作成したＰＩＤ予測方程式に、線形混合モデルを用いて対象のメタゲノミクスプロファイルを当てはめることを含む方法、ここで予測方程式の結果により、対象がＰＩＤを有するかどうか、又はＰＩＤに罹り易いかどうかが指示される。
【0037】
トランスクリプトームプロファイル又は配列突然変異プロファイルは、喀痰、血液、羊水、血漿、精液、骨髄、組織、尿、腹水、又は胸水から入手され、任意選択で細針生検によって入手されることが理解されるであろう。
【0038】
更に、トランスクリプトームプロファイル又は配列（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）突然変異プロファイルはインビトロ又はエキソビボで生成されることが理解されるであろう。
【0039】
更に、トランスクリプトームプロファイル又は配列（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）突然変異プロファイルはインビトロ、エキソビボ、又はインシリコで生成されることが理解されるであろう。
【0040】
上記の方法の一部の実施形態において、本方法は、ヒト又は動物の身体には施行されない。
【0041】
上記の方法の一部の実施形態において、本方法は、ヒト又は動物の身体に施行される直接的データ収集のいかなるセットも除外する。
【0042】
上記の方法の好ましい実施形態において、血液は末梢血単核球を含む。
【0043】
任意の態様又は実施形態において、トランスクリプトーム、配列（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）突然変異プロファイル及びメタゲノムプロファイルは、対象から予め入手された試料から決定される。
【0044】
別の態様において、本発明は、対象が原発性免疫不全症（ＰＩＤ）を有するかどうか、又はＰＩＤを発症し易いかどうかを決定する方法であって、ＰＩＤを有する及び有しない参照対象の参照トランスクリプトームプロファイルセットから生成されるトランスクリプトーム関係行列を線形混合モデルに当てはめることによって作成したＰＩＤ予測方程式に、線形混合モデルを用いて対象のトランスクリプトームプロファイルを当てはめることを含む方法を提供し、ここで予測方程式の結果により、対象がＰＩＤを有するかどうか、又はＰＩＤに罹り易いかどうかが指示される。
【0045】
別の態様において、本発明は、原発性免疫不全症（ＰＩＤ）を有する又はＰＩＤを発症し易い対象の原発性免疫不全症（ＰＩＤ）を治療する方法であって、
－本明細書に記載されるとおりの方法を実施することによるか、又は実施したことにより、対象がＰＩＤを有するかどうか、又はＰＩＤに罹り易いかどうかを決定すること；及び
－ここで対象がＰＩＤを有する場合、又はＰＩＤに罹り易い場合、そのとき対象にＰＩＤに特異的な療法を投与すること
を含む方法を提供する。
－本明細書に記載されるとおりの方法を実施することによるか、又は実施したことにより、対象がＰＩＤを有するかどうか、又はＰＩＤに罹り易いかどうかを決定すること；及び
－ここで対象がＰＩＤを有する場合、又はＰＩＤに罹り易い場合、そのとき対象にＰＩＤに特異的な療法を投与すること
を含む方法を提供する。
【0046】
別の態様において、本発明は、原発性免疫不全症（ＰＩＤ）を有する又はＰＩＤを発症し易い対象の原発性免疫不全症（ＰＩＤ）を治療する方法であって、
－ＰＩＤを有する及び有しない参照対象の参照トランスクリプトームプロファイルセットから生成されるトランスクリプトーム関係行列を線形混合モデルに当てはめることによって作成したＰＩＤ予測方程式に、線形混合モデルを用いて対象のトランスクリプトームプロファイルを当てはめることにより、対象がＰＩＤを有するかどうかを決定することであって、予測方程式の結果により、対象がＰＩＤを有するかどうか、又はＰＩＤに罹り易いかどうかが指示されること、
ここで対象が原発性免疫不全症（ＰＩＤ）を有する場合、又はＰＩＤを発症し易い場合、そのとき対象にＰＩＤに特異的な療法を投与すること
を含む方法を提供する。
－ＰＩＤを有する及び有しない参照対象の参照トランスクリプトームプロファイルセットから生成されるトランスクリプトーム関係行列を線形混合モデルに当てはめることによって作成したＰＩＤ予測方程式に、線形混合モデルを用いて対象のトランスクリプトームプロファイルを当てはめることにより、対象がＰＩＤを有するかどうかを決定することであって、予測方程式の結果により、対象がＰＩＤを有するかどうか、又はＰＩＤに罹り易いかどうかが指示されること、
ここで対象が原発性免疫不全症（ＰＩＤ）を有する場合、又はＰＩＤを発症し易い場合、そのとき対象にＰＩＤに特異的な療法を投与すること
を含む方法を提供する。
【0047】
別の態様において、本発明は、原発性免疫不全症（ＰＩＤ）を有する又はＰＩＤを発症し易い対象の原発性免疫不全症（ＰＩＤ）の治療用医薬の製造における原発性免疫不全症（ＰＩＤ）に特異的な療法の使用を提供し、ここで対象は、本明細書に記載されるとおりの方法によって診断される。
【0048】
別の態様において、本発明は、対象におけるＰＩＤ療法の有効性を決定する方法であって、
－ＰＩＤ療法を受ける前に対象から入手した第１の試料を提供すること；
－ＰＩＤ療法を受けている最中、又は受けた後に対象から入手した第２の試料を提供すること；
－ＰＩＤを有する及び有しない参照対象の参照トランスクリプトームプロファイルセットから生成されるトランスクリプトーム関係行列を線形混合モデルに当てはめることによって作成したＰＩＤ予測方程式に、線形混合モデルを用いて対象の第１及び第２の試料のトランスクリプトームプロファイルを当てはめることであって、ここで予測方程式の結果により、対象がＰＩＤを有するかどうか、又はＰＩＤに罹り易いかどうかが指示されること
を含む方法を提供し、
ここで第１及び第２の試料からのトランスクリプトームプロファイルの変化により、対象におけるＰＩＤ療法の有効性が指示される。
－ＰＩＤ療法を受ける前に対象から入手した第１の試料を提供すること；
－ＰＩＤ療法を受けている最中、又は受けた後に対象から入手した第２の試料を提供すること；
－ＰＩＤを有する及び有しない参照対象の参照トランスクリプトームプロファイルセットから生成されるトランスクリプトーム関係行列を線形混合モデルに当てはめることによって作成したＰＩＤ予測方程式に、線形混合モデルを用いて対象の第１及び第２の試料のトランスクリプトームプロファイルを当てはめることであって、ここで予測方程式の結果により、対象がＰＩＤを有するかどうか、又はＰＩＤに罹り易いかどうかが指示されること
を含む方法を提供し、
ここで第１及び第２の試料からのトランスクリプトームプロファイルの変化により、対象におけるＰＩＤ療法の有効性が指示される。
【0049】
上記の方法の一実施形態において、ＰＩＤ療法は、静注免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）投与である。更なる実施形態において、静注免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）は、２００～８００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。更なる実施形態において、静注免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）の用量は、３～４週間毎に投与される。
【0050】
上記の方法の別の実施形態において、ＰＩＤ療法は、皮下免疫グロブリン（ＳＣＩＧ）投与である。更なる実施形態において、皮下（ＳＣＩＧ）は、毎日、毎週又は隔週（２週間毎）のいずれかで、各患者について製造者の指示に従いその免疫グロブリントラフ濃度及び前回のＩＶＩＧ用量を考慮に入れて計算される用量で投与される。
【0051】
上記の方法の任意の実施形態において、原発性免疫不全症は、以下のタイプ：抗体産生不全症、複合免疫不全症、食細胞機能不全症、免疫調節異常、又は補体欠損症のいずれか１つから選択され得る。好ましくは、原発性免疫不全症は抗体産生不全症である。
【0052】
上記の方法の任意の実施形態において、原発性免疫不全症は、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、分類不能型免疫不全症、選択的免疫グロブリン欠損症、ウィスコット・オールドリッチ症候群、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）、ディジョージ症候群、毛細血管拡張性運動失調症（ataxia-telangectasia）、慢性肉芽腫症、乳児期一過性低ガンマグロブリン血症、無ガンマグロブリン血症、補体欠損症、選択的ＩｇＡ欠損症、ＩＬ－１２受容体欠損症、ＩＬ－１２ｐ４０欠損症、ＩＦＮ－γ受容体欠損症、ＳＴＡＴ１欠損症、γｃ欠損症、Ｊａｋ３欠損症、ＲＡＧ １／２欠損症、ＡＤＡ欠損症、Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群、ＭＨＣクラスＩＩ欠損症、チェディアック・東症候群、古典経路の初期成分（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ４）の欠陥、代替経路の初期成分（Ｄ因子、Ｐ因子）の欠陥、膜侵襲成分（Ｃ５～Ｃ９）の欠陥、アデノシンデアミナーゼ欠損症、自己免疫性多腺性内分泌障害症候群１型（ＡＰＥＣＥＤ）、ブルーム症候群、軟骨毛髪形成不全、慢性肉芽腫症、家族性非定型抗酸菌症、高免疫グロブリンＤ症候群、リンパ増殖性疾患、Ｘ連鎖性ナイミーヘン染色体不安定症候群（Nijmogen breakage syndrome）、プロペルジン欠損症、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ欠損症、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症、又は本明細書に記載される任意の他の原発性免疫不全症からなる群から選択され得る。
【0053】
一態様において本発明は、ゲノム情報を処理するためのコンピュータ実装された方法であって、ゲノム情報が対象トランスクリプトームプロファイルを含み、
－各参照対象が原発性免疫不全症（ＰＩＤ）を有するか、又は有しないかのいずれかである参照対象の参照トランスクリプトームプロファイルセットにアクセスすること；
－参照トランスクリプトームプロファイルセットからトランスクリプトーム関係行列を生成すること；
－トランスクリプトーム関係行列を線形混合モデルに当てはめてＰＩＤ予測方程式を生成すること；及び
－対象トランスクリプトームプロファイルをＰＩＤ予測方程式に当てはめること
を含む方法を提供する。
－各参照対象が原発性免疫不全症（ＰＩＤ）を有するか、又は有しないかのいずれかである参照対象の参照トランスクリプトームプロファイルセットにアクセスすること；
－参照トランスクリプトームプロファイルセットからトランスクリプトーム関係行列を生成すること；
－トランスクリプトーム関係行列を線形混合モデルに当てはめてＰＩＤ予測方程式を生成すること；及び
－対象トランスクリプトームプロファイルをＰＩＤ予測方程式に当てはめること
を含む方法を提供する。
【0054】
別の態様において本発明は、原発性免疫不全症（ＰＩＤ）予測方程式を生成するためのコンピュータ実装された方法であって、
－各参照対象が原発性免疫不全症（ＰＩＤ）を有するか、又は有しないかのいずれかである参照対象の参照トランスクリプトームプロファイルセットにアクセスすること；
－参照トランスクリプトームプロファイルセットからトランスクリプトーム関係行列を生成すること；及び
－トランスクリプトーム関係行列を線形混合モデルに当てはめてＰＩＤ予測方程式を生成すること
を含む方法を提供する。
－各参照対象が原発性免疫不全症（ＰＩＤ）を有するか、又は有しないかのいずれかである参照対象の参照トランスクリプトームプロファイルセットにアクセスすること；
－参照トランスクリプトームプロファイルセットからトランスクリプトーム関係行列を生成すること；及び
－トランスクリプトーム関係行列を線形混合モデルに当てはめてＰＩＤ予測方程式を生成すること
を含む方法を提供する。
【0055】
上記の方法の任意の実施形態において、ＰＩＤ又はＰＩＤへの罹り易さの決定が行われることになる対象のトランスクリプトームプロファイルを測定すること、又はそれを決定することを更に含む。
【0056】
本発明の好ましい実施形態において、線形混合モデルは、最良線形不偏予測（ＢＬＵＰ）、ＢａｙｅｓＲ、ランダムフォレスト又は本明細書に定義するとおりのものを含めた機械学習手法である。
【0057】
上記の方法の任意の実施形態において、参照セットは、ＲＮＡ配列突然変異プロファイルを更に含む。
【0058】
上記の方法の任意の実施形態において、本方法は、ＰＩＤ又はＰＩＤへの罹り易さの決定が行われることになる対象のＲＮＡ配列突然変異プロファイルを測定すること、又はそれを決定することを更に含む。
【0059】
上記の方法の任意の実施形態において、参照セットは、ＤＮＡ配列突然変異プロファイルを更に含む。
【0060】
上記の方法の任意の実施形態において、本方法は、ＰＩＤ又はＰＩＤへの罹り易さの決定が行われることになる対象のＤＮＡ配列突然変異プロファイルを測定すること、又はそれを決定することを更に含む。好ましくは、線形混合モデルを用いて対象のトランスクリプトームプロファイル及びＤＮＡ配列突然変異プロファイルをＰＩＤ予測方程式に当てはめる。
【0061】
上記の方法の任意の実施形態において、参照セットはメタゲノムプロファイルを更に含み、線形混合モデルを用いて対象のトランスクリプトームプロファイル及びメタゲノムプロファイルをＰＩＤ予測方程式に当てはめる。
【0062】
本発明の更なる態様において、対象が原発性免疫不全症（ＰＩＤ）を有するかどうか、又はＰＩＤを発症し易いかどうかを決定する方法であって、ＰＩＤを有する及び有しない参照対象の参照メタゲノムプロファイルセットから生成されるメタゲノム関係行列を線形混合モデルに当てはめることによって作成したＰＩＤ予測方程式に、線形混合モデルを用いて対象のメタゲノミクスプロファイルを当てはめることを含む方法、ここで予測方程式の結果により、対象がＰＩＤを有するかどうか、又はＰＩＤに罹り易いかどうかが指示される。
【0063】
別の態様において本発明は、命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体であって、命令が、プロセッサによって実行されると、
－各参照対象が原発性免疫不全症（ＰＩＤ）を有するか、又は有しないかのいずれかである参照対象の参照トランスクリプトームプロファイルセットにアクセスすること；
－参照トランスクリプトームプロファイルセットからトランスクリプトーム関係行列を生成すること；
－トランスクリプトーム関係行列を線形混合モデルに当てはめてＰＩＤ予測方程式を生成すること；
－対象トランスクリプトームプロファイルを受け取ること；及び
－対象トランスクリプトームプロファイルをＰＩＤ予測方程式に当てはめること
をプロセッサに行わせる、命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体を提供する。
－各参照対象が原発性免疫不全症（ＰＩＤ）を有するか、又は有しないかのいずれかである参照対象の参照トランスクリプトームプロファイルセットにアクセスすること；
－参照トランスクリプトームプロファイルセットからトランスクリプトーム関係行列を生成すること；
－トランスクリプトーム関係行列を線形混合モデルに当てはめてＰＩＤ予測方程式を生成すること；
－対象トランスクリプトームプロファイルを受け取ること；及び
－対象トランスクリプトームプロファイルをＰＩＤ予測方程式に当てはめること
をプロセッサに行わせる、命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体を提供する。
【0064】
別の態様において本発明は、命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体であって、命令が、プロセッサによって実行されると、
－各参照対象が原発性免疫不全症（ＰＩＤ）を有するか、又は有しないかのいずれかである参照対象の参照トランスクリプトームプロファイルセットにアクセスすること；
－参照トランスクリプトームプロファイルセットからトランスクリプトーム関係行列を生成すること；及び
－トランスクリプトーム関係行列を線形混合モデルに当てはめてＰＩＤ予測方程式を生成すること
をプロセッサに行わせる、命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体を提供する。
－各参照対象が原発性免疫不全症（ＰＩＤ）を有するか、又は有しないかのいずれかである参照対象の参照トランスクリプトームプロファイルセットにアクセスすること；
－参照トランスクリプトームプロファイルセットからトランスクリプトーム関係行列を生成すること；及び
－トランスクリプトーム関係行列を線形混合モデルに当てはめてＰＩＤ予測方程式を生成すること
をプロセッサに行わせる、命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体を提供する。
【0065】
本発明の好ましい実施形態において、線形混合モデルは、最良線形不偏予測（ＢＬＵＰ）、ＢａｙｅｓＲ、又は本明細書に定義するとおりのものを含めた機械学習手法である。本発明の更なる実施形態において、機械学習手法は、エラスティックネット、リッジ回帰、ラッソ回帰、ランダムフォレスト、勾配ブースティングマシン、サポートベクターマシン、多層パーセプトロン（ＭＬＰ）又は畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）のうちの１つである。
【0066】
上記の命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体の任意の実施形態において、参照セットは、ＲＮＡ配列突然変異プロファイルを更に含む。
【0067】
上記の命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体の任意の実施形態において、参照セットは、ＤＮＡ配列突然変異プロファイルを更に含む。
【0068】
上記の命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体の任意の実施形態において、参照セットはメタゲノムプロファイルを更に含み、線形混合モデルを用いて対象のトランスクリプトームプロファイル及びメタゲノムプロファイルをＰＩＤ予測方程式に当てはめる。
【0069】
本明細書で使用されるとき、文脈上特に要求される場合を除き、用語「～を含む（comprise）」及びこの用語の変化形、例えば、「～を含んでいる（comprising）」、「～を含む（comprises）」及び「～を含んだ（comprised）」などは、更なる追加要素、構成要素、完全体又はステップを除外することを意図しない。
【0070】
本発明の更なる態様及び前出の段落に説明される態様の更なる実施形態が、例として添付の図面を参照して提供される以下の説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0071】
図面の簡単な説明
【図1】血液からのＲＮＡ抽出手順の図解的概略図。
【図2】ＲＮＡ配列ライブラリ生成手順の図解的概略図。
【図3】ＰＩＤ患者及び対応する正常対照の血中に発現する１９，５２１個の遺伝子を比較する遺伝子発現差解析。
【図4】リーブワンアウト予測手法を用いた予測モデルの適用。
【図5】受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線。
【図6】ＰＩＤにおいて調節に差がある、即ち上方又は下方調節される４つの個別の遺伝子。
【図7】本開示の例により生成されたＰＩＤ患者と年齢及び性別対応対照との間の特定の細菌集団における有意差の例を実証する分析。
【図8】１５例の患者における既知のＰＩＤ遺伝子の発現（平均値±標準偏差）。示されるＰＩＤ遺伝子は、既知の突然変異を有する本研究に組み入れた患者のものである。
【図9】全血ＲＮＡｓｅｑによる突然変異検出。ＰＩＤ患者が保有するアレルにおける優性ミスセンスＣＸＣＲ４遺伝子突然変異のＲＮＡｓｅｑによる検出。
【図10】本開示の様々な特徴を実施するように構成可能なコンピュータ処理システムのブロック図。
【発明を実施するための形態】
【0072】
詳細な説明
対象のＰＩＤを時宜を得て正確に決定し、検出し、又は診断することが必要とされている。本発明は、ＲＮＡｓｅｑ、及び任意選択でメタゲノム、及び線形混合モデルを利用して対象のＰＩＤを予測し、決定し、検出し、又は診断するかかる方法を提供する。
対象のＰＩＤを時宜を得て正確に決定し、検出し、又は診断することが必要とされている。本発明は、ＲＮＡｓｅｑ、及び任意選択でメタゲノム、及び線形混合モデルを利用して対象のＰＩＤを予測し、決定し、検出し、又は診断するかかる方法を提供する。
【0073】
本明細書で使用されるとおりの「原発性免疫不全症」には、限定はされないが、複合免疫不全障害など、複合免疫不全症；先天性血小板減少症など、随伴所見又は症候性所見を伴う複合免疫不全症；分類不能型免疫不全障害など、抗体産生不全優位型；Ｃ１ｑ欠損症など、補体欠損症；重症先天性好中球減少症など、食細胞の数、機能、又は両方の先天性不全症；免疫不全症を伴う無汗性外胚葉形成異常症、家族性地中海熱などの自己炎症性障害など、自然免疫の欠陥；及び家族性血球貪食性リンパ組織球症症候群など、免疫調節異常症が含まれる。
【0074】
ＲＮＡｓｅｑは、ＤＮＡ分析と比べて少なくとも以下の３つの利点を提供する。
【0075】
ａ）突然変異検出。ゲノムＤＮＡと比べたＲＮＡにおける突然変異検出の利点は、ＲＮＡ配列には発現した遺伝子のみが出現することである。この配列は、ゲノム配列のうち発現しない大部分（９８％）を含まないため、突然変異を同定するために必要な配列生成総量が減少する。これは、特に多量に発現するグロビン転写物を枯渇させる方法がシーケンシング前に適用される場合に、核酸の複雑さの大幅な減少（並びにスループット及び効率を増加させる情報密度の増加）をもたらす。血中の発現遺伝子配列はまた、そのコード配列を含めて発現した免疫遺伝子に関して集積されている。結果として、突然変異状態を決定するために入手すべき配列情報の総量が少なくて済む。発現し、及びスプライシングを受けた遺伝子のＲＮＡはゲノムからこのように集積されているため、入手する必要のある配列が減り、ひいてはシーケンシングコストが下がる。ＲＮＡから入手される配列情報は関連性が高く、集中的になり（それに伴い無関係な配列情報のレベルが低下する）、バイオインフォマティクス処理の信頼性及び効率も向上する。最近報告されたＰＩＤについてのゲノムシーケンス手法［４］を用いると、ＲＮＡ配列情報を確認し、又は補完することができる。
【0076】
ｂ）ＰＩＤ遺伝子転写物の完全性を測定することに関するＲＮＡシーケンシングの利点。ＲＮＡシーケンシングは、それを用いてＲＮＡ構造変異体、例えばスプライシング変異体及び誤った位置でのイントロン発現を同定することができる点で、ＤＮＡシーケンシングよりも有利である。ＲＮＡシーケンシングはまた、転写物の欠陥、不安定化突然変異、又は遺伝子発現を妨げる調節領域突然変異の同定が困難である結果として例えば血中で発現が異常に低いＰＩＤ遺伝子も同定することができる。ＲＮＡに現れる配列には、コードＲＮＡと非コードＲＮＡとが含まれ得る。ショートリードＮＧＳ技術はこれに良く適しているが、しかしながら転写物の存在及び完全性の測定には、Pacific-Biosciences（PacBio）SMRT及びOxford Nanoporeなどのロングリードシーケンシング技術が好適であり、有利である。
【0077】
ｃ）免疫細胞の組成及び活性を測定することに関するＲＮＡシーケンシングの利点。ＲＮＡシーケンシングは、ＰＩＤ決定、検出又は診断の一構成要素としての突然変異検出に関してＤＮＡシーケンシングよりも有利であることに加えて、遺伝子活性、この場合には血中の免疫細胞における遺伝子の活性の総合的尺度を含むため、機能情報（ＤＮＡ配列には含まれない）を提供する。血中又は血液由来細胞で測定される多くの遺伝子の発現から、免疫細胞集団及び免疫細胞機能の変化に付随して起こる遺伝子発現の欠損又は異常を同定できるため、遺伝子発現レベルの全体論的分析は、免疫不全の同定に役立ち得る。ＰＩＤ患者が感染症を克服できないというのは、血中のかかる免疫細胞集団及び免疫細胞機能が変化した直接的な結果であり、これらの変化はＲＮＡ転写物プロファイルに明瞭に見られるものと思われる。
【0078】
不全症には種々の細胞型が関わり、続いて又は二次的に多数の免疫遺伝子が影響を及ぼすため、ＳＮＰ情報（直接的な修正）よりむしろ、リード数又は変換リード数を用いるように修正した、最良線形不偏予測（ＢＬＵＰ）又はＢａｙｅｓＲ［５］などの包括的な混合モデル分析による全トランスクリプトーム手法が必要である。ＢＬＵＰ又はＢａｙｅｓＲでは、ＰＩＤ患者の区別となる特徴を全域にわたって評価する必要がある。ＲＮＡシーケンシングによって一段階で提供される免疫機能情報は（その情報が適切な分析で捕捉される場合には）、リンパ球増殖及び細胞傷害性アッセイ、フローサイトメトリー、血清免疫グロブリンレベルの測定、全血球計算、好中球機能検査、及び補体アッセイなど、ＰＩＤの決定、検出又は診断に通常必要とされる免疫学的状態アッセイの組み合わせと比べて、コスト、時間、及び分解能の点で利点をもたらす。
【0079】
ＲＮＡｓｅｑは調査目的に有用であるため、疾患研究において用いられるが、幾つもの難題が原因で、ＲＮＡｓｅｑが臨床セッティングにおいて決定、検出若しくは診断目的で、又はルーチンの疾患評価に用いられることはない［１］。全トランスクリプトームＲＮＡ発現情報を使用可能とするのが難題であるというのは、ＰＩＤなどの疾患の決定、検出又は診断のために発現レベルをモニタするには情報が複雑であり（何千個もの遺伝子に相当するデータ）、情報のうち関連性のある成分（特異的遺伝子及び経路など）についての知識が不足していることが原因である。その上、推定されるｍＲＮＡバイオマーカーを同定し、それを利用するのに好適な統計的分析手法が存在しない。ＲＮＡｓｅｑデータのｍＲＮＡバイオマーカーを同定することができたとしても、標準化されたＲＮＡ配列処理及び規定の統計分析がないため、臨床適用の可能性は限られている。
【0080】
ＤＮＡシーケンシングには、より開発の進んだ手法が存在し、免疫系の臨床情報を補完する突然変異検出のための一層確立された方針及び規格を提供している。発現した遺伝子配列における突然変異検出のためのＲＮＡシーケンシングは有用であるが、しかしながらトランスクリプトームサンプリングによって提供され得る機能情報もまた使用することができる。ＢＬＵＰ又はＢａｙｅｓＲ線形混合モデル手法は、それを診断法として直接用いることを可能にするＲＮＡＳｅｑデータ中の転写物存在量情報の分析を提供する。ＲＮＡ発現ＢＬＵＰ又はＢａｙｅｓＲ分析なしに、ＲＮＡシーケンシングを単独で用いることの限界は、発現した遺伝子配列の突然変異を検出することはできても、免疫系に関するＲＮＡ配列プロファイル／トランスクリプトームデータによって提供され得る機能情報の捕捉及び使用が完全でないことである。
【0081】
ＢＬＵＰ又はＢａｙｅｓＲモデルは、細胞及び経路における（免疫系の不全から生じる）小さい効果を含めた極めて多くの効果を診断のための分析及び評価に取り込むことを可能にする手法を提供する。この手法では、ＲＮＡレベルで広範囲の機能的影響を捕捉することができるため、免疫学的臨床検査の必要性がなくなり得る。診断発見のためにとられる手法（ＢａｙｅｓＲ又はＢＬＵＰを用いない）は、典型的には、免疫学的臨床検査の代わりに用いられる可能性のある機能マーカーとしての鍵遺伝子を（ＰＩＤ遺伝子に加えて）同定しようと試みるものとなるであろう。例えば、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ３、ＣＤ５６、及びＣＤ１９などの特異的マーカーの転写物を測定することにより、ＰＩＤにおける細胞組成変化が評価される可能性がある。同様に、ＰＩＤにおいて影響を受けることが分かっている他の特異的経路又は遺伝子ネットワークもまた、個別の検査か、検査の組み合わせとしてか、又はＲＮＡｓｅｑデータから個別の一組の遺伝子情報を導き出すことによるかのいずれかで用いられる可能性がある。ＢＬＵＰ及びＢａｙｅｓＲは、全ＲＮＡｓｅｑ情報を直接利用して適用することができ、従って影響を受ける多数の遺伝子を分析に取り込むことができるため、及びＰＩＤ突然変異の結果として起こると予想される多数の小さい効果を測定することができるため、解決法を提供する。
【0082】
本発明者らが提案するＢＬＵＰ及びＢａｙｅｓＲ手法は、それが遺伝子発現プロファイルからの最大限の情報を診断シグネチャとして直接用いるため（血中に発現する全ての遺伝子を分析に使用する）、他のより標的を絞り込んだ診断マーカー手法と比べて有利であり、これは、情報を与えるマーカー及び／又は既知のマーカーを（それらが発見されていて、ＰＩＤ診断適用への使用が可能であったとしても）一つだけ又はより限られた数だけ別個の遺伝子発現アッセイとして使用したり、又はＲＮＡｓｅｑデータから特定の情報を導き出したりするのとは対照的である。加えて、ＢＬＵＰ又はＢａｙｅｓＲ手法は直接的且つ効率的であり、人間の介入なしに単一の計算ステップで済み、又は分析方法を組み合わせる必要がない。トランスクリプトームＢＬＵＰ又はＢａｙｅｓＲ手法はまた、種々の患者における多岐にわたる原因突然変異からの疾患を反映した、ある範囲にわたる重複した免疫不全遺伝子発現パターンを同定することを可能とするのに最も適している。より限られた一組の診断用遺伝子マーカーでは（それらが利用可能であったとしても）、ある範囲にわたるＰＩＤ疾患の多様性を同定できない可能性がある。加えて、ＢＬＵＰ／ＢａｙｅｓＲ手法は、適切な罹患及び非罹患患者参照プロファイルで訓練したとき、診断のために測定される機能変化の全ての側面について具体的に分かっていなくても有効に実行され、従ってまだ解明されていない突然変異についての情報量のある結果を捕捉して診断に役立てることが可能である。
【0083】
本発明者らは、ＰＩＤの決定、検出、又は診断にシーケンシング及び全トランスクリプトームＢＬＵＰ／ＢａｙｅｓＲ方法論を提供することにより、難題を克服した。これは、ゲノム情報及び免疫細胞機能を分子的手段によって一段階で同時にアッセイする方法を提供することにより、ＰＩＤ診断に要求される機能検査の必要性をなくすものである。機能検査の改善に向けた道は、ほとんどが、抗体マーカー及びＦＡＣＳを用いて調べられる細胞型を拡大すること、並びに活性化条件下で検査される機能不全に関する細胞の調査を含む。
【0084】
ＲＮＡｓｅｑは、診断法として企図されるのでなく、免疫機能に関連する遺伝子及び経路を同定するための研究ツールとして用いられる。この場合、研究者であれば、免疫機能のモニタリング及び診断用の候補として様々な分析から特定の遺伝子を選択することから始めるであろう。例えば、他の疾患で採用されているＲＮＡｓｅｑ適用から同様に考えると、ＰＩＤ対象試料と正常対象試料とが様々な手段によって比較されることになる可能性があり、発現に差のある転写物が、ＰＩＤ対象と正常対象との試料間で差があると同定されることになる。DAVIDウェブサイト（https://david.ncifcrf.gov/）などのツールを用いて、遺伝子オントロジーエンリッチメント解析が実施されることになるであろう。遺伝子発現差プロファイルはまた、遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）をMSigDB公開免疫遺伝子シグネチャと共に用いる遺伝子セットエンリッチメント解析に供される可能性もある。研究者らは、研究目的でＲＮＡｓｅｑを実施し、典型的にはＲＮＡｓｅｑを血液細胞のサブセットに対して実行して、既知の遺伝子及び経路、又は既知の細胞マーカーについてＲＮＡｓｅｑデータを検索するものと思われる。全血からのＲＮＡｓｅｑに対するＢＬＵＰ手法は、既知の、及び十分に理解されていない未知の遺伝子ネットワークから情報を取り込むことが可能であり、ここでは直接的及び間接的な効果を捕捉することができるが、直接的な診断法として想定されたことはなく、及びある範囲にわたる細胞ベースのアッセイの代理として想定されたことはない。全血トランスクリプトームＢＬＵＰを診断法として直接用いて、ＰＩＤに対するものを含めた細胞及び免疫機能アッセイを置き換えることは、どこにも示唆されていない。
【0085】
ＢＬＵＰは、試料をサブセットに分類するのに用いられており、調査研究の助けとなっているとともに、多遺伝子疾患の遺伝子診断（ＳＮＰ変異）を強化している。場合によっては、ＢＬＵＰを用いて多様な種類の臨床情報を組み合わせることにより、一層正確な予後判定を提供することができる。疾患分類へのＢＬＵＰの適用は、神経芽細胞腫で適用されている［６］。
【0086】
診断に役立てるため、上記に記載したＲＮＡベースの方法からの情報と組み合わせて、微生物定着情報を含めた他の臨床情報を用いることができる。感染症の記録及び管理は、場合によっては病原性の生物に対する微生物診断手法を含め、ＰＩＤ診断の重要な構成要素である。
【0087】
メタゲノムシーケンシングは、微生物群集活性の総合的尺度を含む情報により、微生物組成の分析を病原体を越えて拡張する。粘膜又は毛包における多くの生物の存在から、免疫細胞集団及び免疫細胞機能の変化に付随して起こる特定の生物の群集構造の欠損、又は異常、又は組み合わせを同定し得るため、微生物界面維持の全体論的分析は、免疫不全の同定に役立てることが可能であろう。
【0088】
本明細書で使用されるとき、「ＲＮＡｓｅｑ」又は「トランスクリプトーム」は、発現し、次にシーケンシングされる遺伝子であって、そのシーケンスリードがそのゲノムのエクソン配列又は参照トランスクリプトームデータベースとアラインメントされるものを指す。「トランスクリプトームプロファイル」は、シーケンスリードのカウントのベクトルであり、従って、試料中に発現した遺伝子の特徴付けとなる組成全体である。
【0089】
トランスクリプトーム関係行列は、実施例に説明するとおりトランスクリプトームプロファイルから生成されてもよく、本発明の方法の一部として生成されてもよく、又は既に存在していてもよい。
【0090】
本発明の一実施形態において、線形混合モデルはＢＬＵＰ又はＢａｙｅｓＲである。本明細書で使用されるとき、「線形混合モデル」は、「多層モデル」又は「階層モデル」とも呼ばれ、目的の独立変数によって説明されるばらつきと、目的の独立変数によって説明されないばらつき、即ち変量効果との両方を考慮する回帰モデルの一クラスを指す。線形混合モデルの例としては、限定はされないが、ＢａｙｅｓＲ及び最良線形不偏予測（ＢＬＵＰ）が挙げられる。当業者は、他の適切な線形混合モデルを認識しているであろう。
【0091】
一実施形態において、ＰＩＤ予測方程式は、実施例を含め、本明細書に記載されるいずれか１つである。
【0092】
生成される予測スコア（相対又は絶対のいずれも）は、ＰＩＤを有するリスクが高いか（例えば、値が高いほど高リスクである場合のスコア）又は低いか（例えば、値が低いほど低リスクである場合のスコア）について対象を分類するのに用いられ得る。例えば、絶対予測スコアを用いるとき、０．２より大きいスコアは、９３％の感度及び４７％の特異度でＰＩＤを検出する診断アッセイを提供する。０．４より大きいスコアは、７３％の感度及び７３％の特異度でＰＩＤを検出する診断アッセイを提供する。０．６より大きいスコアは、５３％の感度及び１００％の特異度でＰＩＤを検出する診断アッセイを提供する。対照的に、例えば、相対予測スコアを用いるとき（ここでは患者スコアから健常対照スコアを引き算することにより、対照群と対応させたときの各患者の相対予測スコアが決定される）、０より大きいスコア、０．１より大きいスコア及び０．２より大きいスコアは、それぞれ９３％、８０％及び７３％の感度でＰＩＤを検出する診断アッセイを提供する。
【0093】
本発明の一実施形態において、参照セットはＲＮＡ配列突然変異プロファイルを更に含む。本発明の更なる実施形態において、参照セットはＲＮＡ配列突然変異プロファイルを更に含み、線形混合モデルを用いて対象のトランスクリプトームプロファイル及びＲＮＡ配列突然変異プロファイルをＰＩＤ予測方程式に当てはめる。
【0094】
本発明の一実施形態において、参照セットはＤＮＡ配列突然変異プロファイルを更に含む。本発明の更なる実施形態において、参照セットはＤＮＡ配列突然変異プロファイルを更に含み、線形混合モデルを用いて対象のトランスクリプトームプロファイル及びＤＮＡ配列突然変異プロファイルをＰＩＤ予測方程式に当てはめる。
【0095】
本発明の一実施形態において、参照セットはメタゲノムプロファイルを更に含む。本発明の更なる実施形態において、参照セットはメタゲノムプロファイルを更に含み、線形混合モデルを用いて対象のトランスクリプトームプロファイル及びメタゲノムプロファイルをＰＩＤ予測方程式に当てはめる。
【0096】
用語「メタゲノム」は、本明細書で使用されるとき、試料の常在微生物又は「マイクロバイオーム」からのＤＮＡを含め、試料から回収される全ＤＮＡを指す。「メタゲノムプロファイル」は、本明細書で使用されるとき、試料中の微生物ＤＮＡの特徴付けとなる組成全体を指す。「マイクロバイオーム」は、本明細書で使用されるとき、試料中の全ての微生物を指す。
【0097】
本発明の方法の一実施形態において、メタゲノムプロファイルは、口腔スワブ、鼻スワブ、咽頭スワブ、唾液、糞便、皮膚、又は毛包から入手される。即ち、メタゲノムプロファイルは、口腔スワブ、鼻スワブ、咽頭スワブ、唾液、糞便試料、皮膚試料又は毛包試料からのマイクロバイオームを含む試料から入手される。
【0098】
用語「遺伝子配列突然変異」は、本明細書で使用されるとき、ＲＮＡ配列突然変異及びＤＮＡ配列突然変異の両方を包含し、１つ以上の核酸分子の野生型配列又は参照配列からの変化を指す。「突然変異」には、限定なしに、既知の配列の核酸分子との少なくとも１ヌクレオチドの塩基対置換、付加及び欠失が含まれる。突然変異した核酸は、遺伝子の一方のアレル（ヘテロ接合性）又は両方のアレル（ホモ接合性）から発現するか、又はそこに見出すことができ、体細胞系列又は生殖細胞系列であり得る。従って、「遺伝子配列突然変異プロファイル」は、試料中の遺伝子配列突然変異の特徴付けとなる組成全体である。
【0099】
遺伝子配列突然変異はまた、
ａ）ＰＩＤ遺伝子のＲＮＡ配列が、ＰＩＤを引き起こすかかる既知の突然変異を有すると示される場合；
ｂ）ＲＮＡ配列からの既知のＰＩＤ遺伝子に、タンパク質の予測される構造又は機能に影響を及ぼす新規突然変異（例えば、アミノ酸変化を引き起こすミスセンス突然変異又はフレームシフトを引き起こすナンセンス突然変異）が検出される場合；
ｃ）ＲＮＡ配列からの一方のアレルに優性突然変異が検出される場合；
ｄ）２つの異なる突然変異が同じ遺伝子に、但し２つの異なるアレル上に起こる場合；
ｅ）同じ遺伝子、又は染色体上の隣接する遺伝子から発現するＲＮＡに共起するハプロタイプマーカーとの連関からＲＮＡの既知の突然変異が推測又はインピュートされる場合；
ｆ）通常血中に発現するＰＩＤ遺伝子配列の発現が血液ＲＮＡに検出されない場合（重大な調節欠陥又は不安定化突然変異を指示している）；
ｇ）ＲＮＡｓｅｑによって決定される突然変異ＰＩＤ遺伝子のエクソン構造に欠陥がある場合（スプライシングの欠陥を指示している）；
ｈ）ＲＮＡ／ｃＤＮＡ配列から同じ患者に１個以上（１～３個）の追加的なＰＩＤ遺伝子突然変異が検出される場合；及び
ｉ）ＲＮＡプロファイルに検出される幾つかの他の遺伝子の配列、又は他の遺伝子のインピュートされる配列がＰＩＤ重症度に寄与する場合
も包含する。
ａ）ＰＩＤ遺伝子のＲＮＡ配列が、ＰＩＤを引き起こすかかる既知の突然変異を有すると示される場合；
ｂ）ＲＮＡ配列からの既知のＰＩＤ遺伝子に、タンパク質の予測される構造又は機能に影響を及ぼす新規突然変異（例えば、アミノ酸変化を引き起こすミスセンス突然変異又はフレームシフトを引き起こすナンセンス突然変異）が検出される場合；
ｃ）ＲＮＡ配列からの一方のアレルに優性突然変異が検出される場合；
ｄ）２つの異なる突然変異が同じ遺伝子に、但し２つの異なるアレル上に起こる場合；
ｅ）同じ遺伝子、又は染色体上の隣接する遺伝子から発現するＲＮＡに共起するハプロタイプマーカーとの連関からＲＮＡの既知の突然変異が推測又はインピュートされる場合；
ｆ）通常血中に発現するＰＩＤ遺伝子配列の発現が血液ＲＮＡに検出されない場合（重大な調節欠陥又は不安定化突然変異を指示している）；
ｇ）ＲＮＡｓｅｑによって決定される突然変異ＰＩＤ遺伝子のエクソン構造に欠陥がある場合（スプライシングの欠陥を指示している）；
ｈ）ＲＮＡ／ｃＤＮＡ配列から同じ患者に１個以上（１～３個）の追加的なＰＩＤ遺伝子突然変異が検出される場合；及び
ｉ）ＲＮＡプロファイルに検出される幾つかの他の遺伝子の配列、又は他の遺伝子のインピュートされる配列がＰＩＤ重症度に寄与する場合
も包含する。
【0100】
別の言い方をすれば、本発明の方法の一実施形態において、突然変異プロファイルは、
ａ）ＰＩＤを引き起こす既知の突然変異を含むＰＩＤ遺伝子のＲＮＡ配列；
ｂ）その突然変異がＰＩＤを引き起こす既知の遺伝子によってコードされるタンパク質の構造又は機能に影響を及ぼす新規突然変異、任意選択でフレームシフト突然変異；
ｃ）ＰＩＤを引き起こす、一方のアレルにおける優性突然変異；
ｄ）ＰＩＤを引き起こす、同じ遺伝子にあるが、２つの異なるアレル上にある２つの異なる突然変異；
ｅ）ＰＩＤを引き起こす突然変異についての共起マーカーとの連関によって推測又はインピュートされるＲＮＡ中の既知の突然変異；
ｆ）調節欠陥又は不安定化突然変異を指示するものである、非ＰＩＤ対象で通常発現する遺伝子の発現の欠如；
ｇ）スプライシング欠陥を指示するものである、欠陥のあるエクソン構造；
ｈ）ＰＩＤを引き起こす１個以上、任意選択で１～３個の追加的な突然変異；又は
ｉ）ＰＩＤ重症度に寄与する２つ以上の他の遺伝子の配列、又は２つ以上の他の遺伝子のインピュートされる配列
を含む。
ａ）ＰＩＤを引き起こす既知の突然変異を含むＰＩＤ遺伝子のＲＮＡ配列；
ｂ）その突然変異がＰＩＤを引き起こす既知の遺伝子によってコードされるタンパク質の構造又は機能に影響を及ぼす新規突然変異、任意選択でフレームシフト突然変異；
ｃ）ＰＩＤを引き起こす、一方のアレルにおける優性突然変異；
ｄ）ＰＩＤを引き起こす、同じ遺伝子にあるが、２つの異なるアレル上にある２つの異なる突然変異；
ｅ）ＰＩＤを引き起こす突然変異についての共起マーカーとの連関によって推測又はインピュートされるＲＮＡ中の既知の突然変異；
ｆ）調節欠陥又は不安定化突然変異を指示するものである、非ＰＩＤ対象で通常発現する遺伝子の発現の欠如；
ｇ）スプライシング欠陥を指示するものである、欠陥のあるエクソン構造；
ｈ）ＰＩＤを引き起こす１個以上、任意選択で１～３個の追加的な突然変異；又は
ｉ）ＰＩＤ重症度に寄与する２つ以上の他の遺伝子の配列、又は２つ以上の他の遺伝子のインピュートされる配列
を含む。
【0101】
本明細書で使用されるとき、「参照セット」又は「訓練セット」は、トランスクリプトーム関係行列の生成に使用され、続いてＰＩＤの予測に使用される、ＰＩＤを有する及び有しない対象、即ち「参照対象」から入手される一群のトランスクリプトームプロファイル、遺伝子配列突然変異プロファイル、又はメタゲノムプロファイルを指す。
【0102】
用語「マーカー」又は「バイオマーカー」は、本明細書で使用されるとき、二次的特徴、例えば、遺伝子型、表現型、病的状態、疾患又は病態の代理となる、従ってそれを指示／予測するものである生化学的、遺伝子的（ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれも）、又は分子的特徴を指す。
【0103】
本発明の一実施形態において、トランスクリプトームプロファイル又は配列突然変異プロファイルは、喀痰、血液、羊水、血漿、精液、骨髄、組織、尿、腹水、又は胸水から入手され、任意選択で細針生検によって入手される。更なる実施形態において、血液は末梢血単核球を含む。
【0104】
「対象」は、本明細書で使用されるとき、ヒト又は非ヒト動物、例えば、家畜、動物園動物、又は伴侶動物であり得る。一実施形態において、対象は哺乳類である。哺乳類は有蹄類であってもよく、及び／又は、例えば、ウマ科動物、ウシ科動物、ヒツジ科動物、イヌ科動物、又はネコ科動物であってもよい。一実施形態において、対象は霊長類である。一実施形態において、対象はヒトである。従って、本発明はヒト医学適用を有し、また、ウマ、ウシ及びヒツジなどの家畜、並びにイヌ及びネコなどの伴侶動物の治療を含めた、獣医学及び畜産適用も有する。
【0105】
本明細書の説明及び特許請求の範囲全体を通じて、語句「～を含む（comprise）」並びにこの語句の変化形、例えば「～を含んでいる（comprising）」及び「～を含む（comprises）」などは、「～を含むがそれに限定されない」を意味し、他の追加要素、構成要素、完全体又はステップを除外することを意図しない。
【0106】
本明細書で使用されるとき、「対象がＰＩＤを有するかどうか、又はＰＩＤを発症し易いかどうかを決定すること」とは、対象のＰＩＤを検出すること若しくは診断すること、又は対象がＰＩＤを発症する可能性が高いと予測すること若しくは予後判定することを指す。本発明はまた、対象のＰＩＤを検出すること又は対象のＰＩＤへの罹り易さを検出することも包含する。換言すれば、本発明は、対象のＰＩＤを決定、検出又は診断すること及び／又は対象のＰＩＤへの罹り易さを決定、検出又は診断することを包含する。
【0107】
用語「生体試料」は、本明細書で使用されるとき、特定の「遺伝子発現プロファイル」、「遺伝子配列突然変異プロファイル」、「トランスクリプトームプロファイル」又は「配列突然変異プロファイル」（ここで配列突然変異プロファイルはＲＮＡ及び／又はＤＮＡの突然変異であり得る）に関して検査され得る試料を指す。試料は、生物（例えばヒト患者）から、又は生物の構成要素（例えば細胞）から入手され得る。試料は、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを含む任意の関連性のある生体組織又は体液のものであり得る。試料は、患者に由来する試料である「臨床試料」であり得る。かかる試料には、限定はされないが、喀痰、血液、血液細胞（例えば白血球）、羊水、血漿、精液、骨髄、及び組織又は細針生検試料、尿、腹水、及び胸水、又はこれらからの細胞が含まれる。生体試料にはまた、組織学的目的で採取される凍結切片などの組織切片も含まれ得る。生体試料はまた、「患者試料」とも称され得る。一実施形態において、本発明の方法は、ヒト又は動物の身体に対しては実施されず、例えば、検査プロファイルは、予め入手された生体試料を分析することによって決定され得る。
【0108】
用語「遺伝子」は、本明細書で使用されるとき、ポリペプチド又は前駆体の産生に必要なコード配列を含む核酸配列を指す。コード配列の発現を指図及び／又は制御する制御配列もまた、一部の例では、用語「遺伝子」に包含され得る。ポリペプチド又は前駆体は、完全長コード配列によるか、又はコード配列の一部分によってコードされ得る。遺伝子は、コード領域又は非翻訳領域のいずれかに、ポリペプチド若しくは前駆体の生物学的活性若しくは化学構造、発現率、又は発現制御様式に影響を及ぼす可能性のある１つ以上の修飾を含み得る。かかる修飾としては、限定はされないが、集団中に天然で起こる一塩基変異多型を含め、１ヌクレオチド以上の突然変異、挿入、欠失、及び置換が挙げられる。遺伝子は、途切れのないコード配列を構成してもよく、又はそれは１つ以上の部分配列を含んでもよい。
【0109】
用語「遺伝子発現レベル」又は「発現レベル」は、本明細書で使用されるとき、試料中の「遺伝子発現産物」又は「遺伝子産物」の量を指す。「遺伝子発現プロファイル」又は「遺伝子発現シグネチャ」は、本明細書で使用されるとき、特定の細胞型又は組織型によって産生される一群の「遺伝子発現産物」又は「遺伝子産物」であって、それらの遺伝子の発現がまとめて、又はかかる遺伝子の発現の差異が、免疫障害など、病的状態、疾患又は病態の指示となる及び／又は予測となるものを指す。「遺伝子発現プロファイル」は、定性的（例えば存在の有無）又は定量的（例えばレベル又はｍＲＮＡコピー数）のいずれであってもよい。従って、「遺伝子発現プロファイル」はまた、細胞型特異的「遺伝子発現産物」又は「遺伝子産物」の量に基づいた、血液試料中のＴ細胞数など、不均一な細胞試料中にある特定の細胞型の数の決定にも用いることができる。
【0110】
用語「遺伝子発現産物」又は「遺伝子産物」は、本明細書で使用されるとき、ｍＲＮＡを含めた、遺伝子のＲＮＡ転写産物（ＲＮＡ転写物）、及びかかるＲＮＡ転写物のポリペプチド翻訳産物を指す。「遺伝子発現産物」又は「遺伝子産物」は、例えば、ポリヌクレオチド遺伝子発現産物（例えば、スプライシングを受けていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、スプライス変異体ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、断片化したＲＮＡ）又はタンパク質発現産物（例えば、成熟ポリペプチド、スプライス変異体ポリペプチド）であり得る。
【0111】
用語「免疫細胞」は、本明細書で使用されるとき、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ及び単球を含めたリンパ球、樹状細胞又は直接的若しくは間接的な抗原刺激に応答して「免疫エフェクター分子」を産生する能力を有する他の任意の細胞などの細胞を指す。用語「免疫エフェクター分子」は、限定はされないが、インターフェロン（ＩＦＮ）、インターロイキン類（ＩＬ）、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１０又はＩＬ－１２など、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、顆粒球（Ｇ）－ＣＳＦ又は顆粒球マクロファージ（ＧＭ）－ＣＳＦなどのサイトカイン、補体及び補体経路内の成分を含めた、細胞活性化又は抗原による刺激に応答して産生される分子である。
【0112】
用語「免疫障害」は、本明細書で使用されるとき、免疫系の機能異常を特徴とする病的状態、疾患又は病態を指す。「免疫障害」としては、限定はされないが、強皮症などの自己免疫障害、アレルギー性鼻炎などのアレルギー、及び原発性免疫不全症などの免疫不全症が挙げられる。
【0113】
用語「正常な免疫系」は、本明細書で使用されるとき、正常な免疫細胞組成を有する、及び前記免疫細胞が機能異常でない免疫系を指す。「正常な」又は「健常な」対象とは、本明細書で使用されるとき、「正常な免疫系」を有する対象を指す。
【0114】
用語「核酸」は、本明細書で使用されるとき、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、及びヌクレオチド類似体を用いて生成されたＤＮＡ又はＲＮＡの類似体を指す。核酸分子は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、多重鎖ＤＮＡ、相補的ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、非コードＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ヘテロ核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）、又は低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり得る。
【0115】
本発明の方法は、ＰＩＤを有する又はＰＩＤに罹り易いと決定された対象のＰＩＤを治療する更なるステップを含み得る。
【0116】
従って、本発明の方法によってＰＩＤを有する又はＰＩＤに罹り易いと決定された対象におけるＰＩＤの治療もまた開示される。
【0117】
従って、本明細書には、対象のＰＩＤを治療する方法であって、
対象に抗生物質、免疫グロブリン、インターフェロン、成長因子、遺伝子療法、又は酵素補充療法を投与すること；又は
対象に造血幹細胞を移植すること
を含む方法が開示され、
ここで対象は、本発明の方法により、ＰＩＤを有する又はＰＩＤを発症し易いと決定される。
対象に抗生物質、免疫グロブリン、インターフェロン、成長因子、遺伝子療法、又は酵素補充療法を投与すること；又は
対象に造血幹細胞を移植すること
を含む方法が開示され、
ここで対象は、本発明の方法により、ＰＩＤを有する又はＰＩＤを発症し易いと決定される。
【0118】
また、対象のＰＩＤの治療用医薬の製造における、抗生物質、免疫グロブリン、インターフェロン、成長因子、酵素、遺伝子、又は造血幹細胞の使用も開示され、ここで対象は、本発明の方法により、ＰＩＤを有する又はＰＩＤを発症し易いと決定される。
【0119】
また、対象のＰＩＤを治療する方法における使用のための抗生物質、免疫グロブリン、インターフェロン、成長因子、酵素、遺伝子、又は造血幹細胞も開示され、ここで対象は、本発明の方法により、ＰＩＤを有する又はＰＩＤを発症し易いと決定される。
【0120】
ＰＩＤの決定、検出又は診断に際し、ＲＮＡｓｅｑは、突然変異検出及び免疫機能評価に関してＤＮＡシーケンシングに優る３つの主な利点を提供する：（ａ）発現した遺伝子においてのみ突然変異が検出される；（ｂ）ＰＩＤ遺伝子転写物の完全性；（ｃ）免疫細胞組成及び活性。
【0121】
一実施形態において、治療されることになるＰＩＤは、複合免疫不全障害など、複合免疫不全症；先天性血小板減少症など、随伴所見又は症候性所見を伴う複合免疫不全症；分類不能型免疫不全障害など、抗体産生不全優位型；Ｃ１ｑ欠損症など、補体欠損症；重症先天性好中球減少症など、食細胞の数、機能、又は両方の先天性不全症；免疫不全症を伴う無汗性外胚葉形成異常症、家族性地中海熱などの自己炎症性障害など、自然免疫の欠陥；及び家族性血球貪食性リンパ組織球症症候群など、免疫調節異常症から選択される。
【0122】
ＰＩＤの有効な治療には、感染症の管理、免疫系のブースト、造血幹細胞移植、遺伝子療法、及び酵素補充療法が含まれる。
【0123】
感染症の管理には、
・感染症を抗生物質で、通常は迅速且つ積極的に治療すること－不応性の感染症は、入院及び静脈内（ＩＶ）抗生物質が必要となり得る。
・感染症を例えば長期抗生物質治療で予防して、呼吸器感染症並びに関連する肺及び耳の永久的な損傷を予防すること、並びに経口ポリオ及び麻疹－ムンプス－風疹など、生ウイルスを含有するワクチンを使用したＰＩＤを有する小児のワクチン接種の回避。
・疼痛及び発熱に対するイブプロフェンなどの医薬物質、副鼻腔うっ血に対する鬱血除去薬、気道の薄い粘液に対する去痰薬、又は肺を清浄にするため胸部に重力及び軽打が適用される体位ドレナージの使用などを用いて症状を治療すること
が含まれる。
・感染症を抗生物質で、通常は迅速且つ積極的に治療すること－不応性の感染症は、入院及び静脈内（ＩＶ）抗生物質が必要となり得る。
・感染症を例えば長期抗生物質治療で予防して、呼吸器感染症並びに関連する肺及び耳の永久的な損傷を予防すること、並びに経口ポリオ及び麻疹－ムンプス－風疹など、生ウイルスを含有するワクチンを使用したＰＩＤを有する小児のワクチン接種の回避。
・疼痛及び発熱に対するイブプロフェンなどの医薬物質、副鼻腔うっ血に対する鬱血除去薬、気道の薄い粘液に対する去痰薬、又は肺を清浄にするため胸部に重力及び軽打が適用される体位ドレナージの使用などを用いて症状を治療すること
が含まれる。
【0124】
免疫系のブーストには、
・免疫グロブリン療法、通常は静脈内に数週間毎、又は皮下に週１回若しくは週２回。
・ウイルスと闘い、免疫細胞を刺激するγインターフェロン療法、通常は筋肉内に週３回、ほとんどの場合に慢性肉芽腫症の治療向け。
・白血球値を増加させるための成長因子療法
が含まれる。
・免疫グロブリン療法、通常は静脈内に数週間毎、又は皮下に週１回若しくは週２回。
・ウイルスと闘い、免疫細胞を刺激するγインターフェロン療法、通常は筋肉内に週３回、ほとんどの場合に慢性肉芽腫症の治療向け。
・白血球値を増加させるための成長因子療法
が含まれる。
【0125】
幹細胞移植は、幾つかの形態の生命を脅かすＰＩＤに対して永久的な治癒を提供する。
【0126】
当業者は、治療有効量の抗生物質、免疫グロブリン、インターフェロン、成長因子、造血幹細胞、遺伝子療法用の遺伝子、又は酵素補充療法用の酵素を対象に投与する正確な方法が、治療又は予防しようとするＰＩＤを基準とした医師の裁量によることになると理解するであろう。投与様式は、投薬量、他の薬剤との組み合わせ、投与のタイミング及び頻度などを含め、治療に対する対象の見込まれる反応性、並びに対象の状態及び病歴の影響を受け得る。
【0127】
抗生物質、免疫グロブリン、インターフェロン、成長因子、造血幹細胞、遺伝子療法用の遺伝子、又は酵素補充療法用の酵素は、優良医療規範に準拠する方式で製剤化され、用量設定され、及び投与されることになる。これに関連して考慮すべき要因としては、治療又は予防されるＰＩＤの詳細、治療される対象の詳細、対象の臨床状態、投与部位、投与方法、投与スケジュール、起こり得る副作用及び医師に公知の他の要因が挙げられる。投与される抗生物質、免疫グロブリン、インターフェロン、成長因子、造血幹細胞、遺伝子療法用の遺伝子、又は酵素補充療法用の酵素の治療有効量は、かかる考慮事項によって左右されることになる。
【0128】
抗生物質、免疫グロブリン、インターフェロン、成長因子、造血幹細胞、遺伝子療法用の遺伝子、又は酵素補充療法用の酵素は、全身又は末梢に、例えば、静脈内（ＩＶ）、動脈内、筋肉内（ＩＭ）、腹腔内、脳脊髄内（intracerobrospinal）、皮下（ＳＣ）、関節内、滑液嚢内、髄腔内、冠内、経心内膜、外科的移植、局所及び吸入（例えば肺内）を含めた経路によって投与されてもよい。
【0129】
用語「治療有効量」は、抗生物質、免疫グロブリン、インターフェロン、成長因子、造血幹細胞、遺伝子療法用の遺伝子、又は酵素補充療法用の酵素が対象のＰＩＤを治療するのに有効な量を指す。
【0130】
用語「治療する」、「治療すること」又は「治療」は、治療的処置及び予防的又は防御的方策の両方を指し、ここでその目標は、対象のＰＩＤを防止若しくは改善すること、又は対象のＰＩＤの進行を減速させる（小幅にする）ことである。治療を必要としている対象には、ＰＩＤを既に有する対象並びにＰＩＤを予防すべき対象が含まれる。
【0131】
用語「予防すること」、「予防」、「予防的（prevention）」又は「予防的（prophylactic）」は、異常又は症状を含め、ＰＩＤが発生しないように抑えること、又はその発生を妨げ、それから防御し、若しくはそれから保護することを指す。予防を必要としている対象は、ＰＩＤを発症し易い傾向があり得る。
【0132】
用語「改善する」又は「改善」は、異常又は症状を含めたＰＩＤの低下、減少又は消失を指す。改善を必要としている対象は、ＰＩＤを既に有していてもよく、又はＰＩＤを発症し易い傾向があってもよく、又はＰＩＤを予防すべき者であってもよい。
【0133】
図１０は、本明細書に記載される実施形態及び／又は特徴を実装するように構成可能なコンピュータ処理システム５００のブロック図を提供する。システム５００は、汎用コンピュータ処理システムである。図１０がコンピュータ処理システムの全ての機能的又は物理的構成要素を図示しているわけではないことは理解されるであろう。例えば、電源又は電源インターフェースは描かれていないが、しかしながらシステム５００は、電源を備えているか、又は電源に接続するように構成されているかのいずれか（又は両方）であることになる。また、コンピュータ処理システムの詳細な種類によって適切なハードウェア及びアーキテクチャが決まることになり、本開示の特徴を実装するのに好適な代替的なコンピュータ処理システムが、描かれているものと比べて追加的な、代替的な、又はより少数の構成要素を有し得ることも理解されるであろう。
【0134】
コンピュータ処理システム５００は、少なくとも１つの処理装置５０２－例えば、汎用又は中央処理装置、グラフィックス処理装置、又は代替的な計算デバイス）を含む。コンピュータ処理システム５００は、複数のコンピュータ処理装置を含み得る。一部の例では、コンピュータ処理システム５００が演算又は機能を実行するものとして記載される場合に、その演算又は機能の実行に必要な全ての処理が、処理装置５０２によって実行されることになる。他の場合には、その演算又は機能の実行に必要な処理はまた、システム５００がアクセス可能な、且つそれによる使用（共有方式又は専属方式のいずれか）が可能な遠隔処理デバイスによって実行されてもよい。
【0135】
処理装置５０２は、通信バス５０４を通じて１つ以上のコンピュータ可読記憶デバイスとデータ通信しており、この記憶デバイスが、処理システム５００の演算を制御するための命令及び／又はデータを記憶する。この例では、システム５００は、システムメモリ５０６（例えばＢＩＯＳ）、揮発性メモリ５０８（例えば、１つ以上のＤＲＡＭモジュールなどのランダムアクセスメモリ）、及び不揮発性（又は非一時的）メモリ５１０（例えば、１つ以上のハードディスク又は固体デバイス）を含む。かかるメモリデバイスはまた、コンピュータ可読記憶媒体とも称され得る。
【0136】
システム５００はまた、５１２によって略指示される１つ以上のインターフェースも含み、システム５００はこれを介して様々なデバイス及び／又はネットワークとインターフェースする。一般的に言えば、他のデバイスはシステム５００に統合されてもよく、又は別個であってもよい。あるデバイスがシステム５００と別個である場合、そのデバイスとシステム５００との間の接続は有線又は無線ハードウェア・通信プロトコルを介してもよく、直接的又は間接的な（例えばネットワーク化された）接続であってもよい。
【0137】
他のデバイス／ネットワークとの有線接続は、任意の適切な標準規格の又は所有権のあるハードウェア・接続プロトコル、例えば、ユニバーサル・シリアル・バス（ＵＳＢ）、eSATA、Thunderbolt、Ethernet、HDMI、及び／又は任意の他の有線接続ハードウェア／接続プロトコルによってもよい。
【0138】
他のデバイス／ネットワークとの無線接続も同様に、任意の適切な標準規格の又は所有権のあるハードウェア・通信プロトコル、例えば、赤外線、BlueTooth、WiFi；近距離無線通信（NFC）；汎欧州デジタル移動電話方式（GSM）、拡張データＧＳＭ環境（EDGE）、ロング・ターム・エボリューション（LTE）、符号分割多重アクセス（CDMA－及び／又はその変種）、及び／又は任意の他の無線ハードウェア／接続プロトコルによってもよい。
【0139】
一般的に言えば、問題のシステムの詳細に応じて、システム５００が接続するデバイスは－有線手段であれ無線手段であれ－、１つ以上の入力／出力デバイス（概して入力／出力デバイスインターフェース５１４によって指示される）を含む。入力デバイスは、処理装置５０２によって処理するためデータをシステム１００に入力するのに使用される。出力デバイスは、システム５００によるデータの出力を可能にする。例示的な入力／出力デバイスを以下に記載するが、しかしながら、全てのコンピュータ処理システムが言及されるデバイスを全て含むことになるわけではなく、言及されるものに追加される及びそれに代わるデバイスも同様に用いられ得ることが理解されるであろう。
【0140】
例えば、システム５００は、情報／データをシステム５００に入力するための（システム５００が受け取るための）１つ以上の入力デバイスを含んでもよく、又はそれに接続してもよい。かかる入力デバイスには、キーボード、マウス、トラックパッド（及び／又はタッチスクリーンディスプレイを含めた他のタッチセンサー式／接触センサー式デバイス）、マイクロホン、加速度計、近接センサー、ＧＰＳデバイス、タッチセンサー、及び／又は他の入力デバイスが含まれ得る。システム５００はまた、情報を出力するためのシステム５００によって制御される１つ以上の出力デバイスを含んでもよく、又はそれに接続してもよい。かかる出力デバイスには、ディスプレイ（例えば、ブラウン管ディスプレイ、液晶ディスプレイ、発光ダイオードディスプレイ、プラズマディスプレイ、タッチスクリーンディスプレイ）、スピーカー、振動モジュール、発光ダイオード／他のライト、及び他の出力デバイスなどのデバイスが含まれ得る。システム５００はまた、入力及び出力の両方のデバイスとして働き得るデバイス、例えば、システム５００がそこからデータを読み出し及び／又はそこにデータを書き込むことのできるメモリデバイス／コンピュータ可読媒体（例えば、ハードドライブ、固体ドライブ、ディスクドライブ、コンパクト・フラッシュ・カード、ＳＤカード、及び他のメモリ／コンピュータ可読媒体デバイス）、並びにデータの表示（出力）及びタッチ信号の受信（入力）の両方を行うことのできるタッチスクリーンディスプレイを含んでもよく、又はそれに接続してもよい。
【0141】
システム５００はまた、環境内のインターネット１００など、ネットワークと通信するための１つ以上の通信インターフェース５１６も含む。システム５００は、通信インターフェース５１６を介することで、それ自体が他のコンピュータ処理システムであり得るネットワーク化されたデバイスにデータを通信し、そこからデータを受け取ることができる。
【0142】
システム５００は、コンピュータアプリケーション（ソフトウェア又はプログラムとも称される）－即ち、処理装置５０２によって実行されると、データを受け取り、処理し、及び出力するようにシステム５００を構成するコンピュータ可読命令及びデータを記憶し、又はそれにアクセスする。命令及びデータは、システム５００がアクセス可能な非一時的コンピュータ可読媒体に記憶されることができる。例えば、命令及びデータは、非一時的メモリ５１０に記憶されてもよい。命令及びデータは、５１２などのインターフェース上の（例えば）有線又は無線ネットワーク接続によって可能となる伝送路のデータ信号によってシステム５００に伝送され／それが受信し得る。
【0143】
システム５００がアクセス可能なアプリケーションには、典型的には、Microsoft Windows（登録商標）、Apple OSX、Apple IOS、Android、Unix、又はLinuxなどのオペレーティングシステムアプリケーションが含まれることになる。
【0144】
場合によっては、所与のコンピュータ実装された方法の一部又は全部がシステム５００それ自体によって実行されることになり、一方、他の場合には、システム５００とデータ通信している他のデバイスによって処理が実行されてもよい。
【0145】
トランスクリプトームの差異が、疾患についての遺伝子シグネチャを成し、これは学習ソフトウェアアルゴリズム及び所有権のある参照データベースを用いて同定することができる。
【0146】
ゲノムアルゴリズムは、疾患を有する患者の同定に用いることのできる予測スコアを生成する。ソフトウェアの構成要素は、ＰＩＤの原因となることが既に確立されている特定の遺伝子突然変異を検索するバイオインフォマティクスパイプラインを含む。
【0147】
本発明は、本明細書に記載される方法及びＰＩＤの原因となる突然変異の検出に一組の既存のバイオインフォマティクスツール（トランスクリプトーム関係行列及びＢＬＵＰ予測用のR、及びGATKを含む）を利用することができるプログラムを含む。
【0148】
ここで、以下の非限定的な例を参照して本発明を説明することとする。
【実施例】
【0149】
実施例
原発性免疫不全症確定例の対象及び正常対象からの試料を用いた非盲検エキソビボ研究
研究の概要
２０例の原発性免疫不全症（ＰＩＤ）確定例の対象及び２０例の正常対象から採取した生体試料を用いた非盲検多施設エキソビボ研究。
原発性免疫不全症確定例の対象及び正常対象からの試料を用いた非盲検エキソビボ研究
研究の概要
２０例の原発性免疫不全症（ＰＩＤ）確定例の対象及び２０例の正常対象から採取した生体試料を用いた非盲検多施設エキソビボ研究。
【0150】
本研究では、以下を用いてＰＩＤを診断し得ることを実証した：
（ｉ）ＲＮＡシーケンシングによって入手される遺伝子発現データ、即ち、ＲＮＡｓｅｑ又はトランスクリプトーム；
（ｉｉ）遺伝子配列データと組み合わせた遺伝子発現データ、即ち、ＲＮＡｓｅｑ又はトランスクリプトーム；
（ｉｉｉ）ＰＩＤの診断に単独で用いることができる線形混合モデル予測手法を用いて及びターゲット又は非ターゲット超並列シーケンシングによって入手される、微生物メタゲノムデータと組み合わせた遺伝子発現データ、即ち、ＲＮＡｓｅｑ又はトランスクリプトーム；又は
（ｉｖ）微生物メタゲノムデータ、
ターゲット又は非ターゲット超並列シーケンシングによって及び線形混合モデル予測を用いて入手される。
（ｉ）ＲＮＡシーケンシングによって入手される遺伝子発現データ、即ち、ＲＮＡｓｅｑ又はトランスクリプトーム；
（ｉｉ）遺伝子配列データと組み合わせた遺伝子発現データ、即ち、ＲＮＡｓｅｑ又はトランスクリプトーム；
（ｉｉｉ）ＰＩＤの診断に単独で用いることができる線形混合モデル予測手法を用いて及びターゲット又は非ターゲット超並列シーケンシングによって入手される、微生物メタゲノムデータと組み合わせた遺伝子発現データ、即ち、ＲＮＡｓｅｑ又はトランスクリプトーム；又は
（ｉｖ）微生物メタゲノムデータ、
ターゲット又は非ターゲット超並列シーケンシングによって及び線形混合モデル予測を用いて入手される。
【0151】
除外基準
過去に造血幹細胞移植を受けた対象は、本研究から除外した。
過去に造血幹細胞移植を受けた対象は、本研究から除外した。
【0152】
試料採取
末梢静脈全血から、ＲＮＡ抽出用に血液細胞を採取した。口腔スワブ、鼻スワブ、咽頭スワブ、唾液、糞便試料、皮膚試料又は毛包試料から、ＤＮＡ抽出用に微生物試料を採取した。
末梢静脈全血から、ＲＮＡ抽出用に血液細胞を採取した。口腔スワブ、鼻スワブ、咽頭スワブ、唾液、糞便試料、皮膚試料又は毛包試料から、ＤＮＡ抽出用に微生物試料を採取した。
【0153】
トランスクリプトームプロファイルの決定
ＲＮＡシーケンシングを実施して、ＰＩＤを指示するものである遺伝子配列突然変異を同定し、正常対象との比較のためＰＩＤ対象の遺伝子発現プロファイルを決定した。
ＲＮＡシーケンシングを実施して、ＰＩＤを指示するものである遺伝子配列突然変異を同定し、正常対象との比較のためＰＩＤ対象の遺伝子発現プロファイルを決定した。
【0154】
ｉ）試料採取及びＲＮＡ抽出
PAXgene（商標）blood RNAチューブ（PAXgene Blood RNA Kit (50)－カタログ番号／ＩＤ：７６２１６４）を製造者の指示に従い使用して、末梢静脈全血から血液細胞を調製した。PAXgene Blood RNAチューブの試薬組成は、ＲＮＡ分子を分解から保護し、ヒト全血の細胞性ＲＮＡを１８～２５℃で最長３日まで、又は２～８℃で最長５日まで、又は－２０℃／－７０℃で８年の時点まで安定化させることができる。
PAXgene（商標）blood RNAチューブ（PAXgene Blood RNA Kit (50)－カタログ番号／ＩＤ：７６２１６４）を製造者の指示に従い使用して、末梢静脈全血から血液細胞を調製した。PAXgene Blood RNAチューブの試薬組成は、ＲＮＡ分子を分解から保護し、ヒト全血の細胞性ＲＮＡを１８～２５℃で最長３日まで、又は２～８℃で最長５日まで、又は－２０℃／－７０℃で８年の時点まで安定化させることができる。
【0155】
２．５ｍｌの抜き取った血液をPAXgene blood RNAチューブに採取し、室温で少なくとも２時間インキュベートすることにより、血液細胞の完全な溶解を確実にした。採血後にPAXgene Blood RNAチューブを２～８℃、－２０℃又は－７０℃で保存する場合、試料を初めに室温に平衡化させて、次に室温で２時間保存してから手順を開始した。緩衝液の調製後、以下のステップを行った：
（ｉ）PAXgene Blood RNAチューブを３０００～５０００×ｇで１０分間、スイングアウトローターを使用して遠心し、上清を除去する。
（ｉｉ）チューブに４ｍｌのＲＮアーゼフリー水を加え、キットに同梱されている新鮮なBD Hemogard Closureを使用してそれを閉じる。
（ｉｉｉ）ペレットの溶解を目視できるようになるまでボルテックスする。３０００～５０００×ｇで１０分間、スイングアウトローターを使用して遠心し、上清を完全に除去する。
（ｉｖ）３５０μｌBuffer BR1を加え、ペレットの溶解を目視できるようになるまでボルテックスする。
（ｖ）試料を１．５ｍｌエッペンドルフ試験管に取り出す。３００μｌbuffer BR2及び４０μｌプロテイナーゼＫを連続して加える。数秒間ボルテックスすることにより混合する。
（ｖｉ）シェーカーインキュベーターを使用して４００～１４００ｒｐｍで５５℃にて１０分間インキュベートする。
（ｖｉｉ）２ｍｌ採取チューブに入れたPAXgene Shredderスピンカラム（lilac）にライセートを直接ピペッティングし、最高速度で（但し、カラムが破損し得るため、２０，０００×ｇは超えないこと）３分間遠心する。
（ｖｉｉｉ）フロースルー画分の上清全体を、処理用チューブ内のペレットを乱さないようにして新鮮な１．５ｍｌチューブに慎重に移す。
（ｉｘ）３５０μｌエタノール（９６～１００％、純度グレードｐ．ａ．）を加える。ボルテックスすることにより混合し、軽く遠心して、チューブの蓋の内側の液滴を取り除く。
（ｘ）２ｍｌ処理用チューブに入れたPAXgene RNAスピンカラム（赤色）に７００μｌをピペッティングし、１６０００×ｇ（８０００～２０，０００×ｇ）で１分間遠心する。フロースルーを廃棄する。
（ｘｉ）残りの試料をPAXgene RNAスピンカラムにピペッティングし、１６０００×ｇ（８０００～２０，０００×ｇ）で１分間遠心する。フロースルーを廃棄する。
（ｘｉｉ）カラムを３５０μｌのBuffer BR3で洗浄する。１６，０００×ｇ（８０００～２０，０００×ｇ）で１分間遠心する。
（ｘｉｉｉ）８０μｌ ＤＮアーゼＩミックス（８０μｌ）をPAXgene RNAスピンカラム膜の中央に直接加え、室温（２０～３０℃）で１５分間インキュベートする。
（ｘｉｖ）３５０μｌのBuffer BR3をPAXgene RNAスピンカラムにピペッティングし、１６，０００×ｇ（８０００～２０，０００×ｇ）で１分間遠心する。フロースルーを廃棄する。
（ｘｖ）カラムを５００μｌのBR4で洗浄し、１６，０００×ｇ（８０００～２０，０００×ｇ）で１分間遠心する。フロースルーを廃棄し、１６，０００×ｇ（８０００～２０，０００×ｇ）で更に１分間遠心する。
（ｘｖｉ）カラムに更なる５００μｌのBuffer BR4を加え、１６，０００×ｇ（８０００～２０，０００×ｇ）で３分間遠心する。フロースルーが入った処理用チューブを廃棄し、PAXgene RNAスピンカラムを新しい２ｍｌ処理用チューブに置く。１６，０００×ｇ（８０００～２０，０００×ｇ）で２分間遠心する。カラムを１．５ｍｌチューブに移す。
（ｘｖｉｉ）４０μｌのBuffer BR5をカラム膜に直接加える。１６，０００×ｇ（８０００～２０，０００×ｇ）で２分間遠心することにより、ＲＮＡを溶出させること（注記：最大限の溶出効率を達成するため、膜全体がBuffer BR5で濡れるようにPAXgene RNAスピンカラムを中心に置くことが重要である）
（ｘｖｉｉｉ）例えば、NanaDrop 1000/2000又はQubit機器を使用して、及びQuant-iT（商標）RNAなどのＲＮＡ特異的結合蛍光色素を使用して、ＲＮＡ／純度を定量化する。
（ｘｉｘ）例えば、BioAnalyser 2100又はTapeStation 2200機器（Agilent Technologies）を使用して、ＲＮＡの完全性を決定する。
（ｘｘ）ＲＮＡ試料をすぐに使用しない場合、－２０℃又は－７０℃で保存する。
（ｉ）PAXgene Blood RNAチューブを３０００～５０００×ｇで１０分間、スイングアウトローターを使用して遠心し、上清を除去する。
（ｉｉ）チューブに４ｍｌのＲＮアーゼフリー水を加え、キットに同梱されている新鮮なBD Hemogard Closureを使用してそれを閉じる。
（ｉｉｉ）ペレットの溶解を目視できるようになるまでボルテックスする。３０００～５０００×ｇで１０分間、スイングアウトローターを使用して遠心し、上清を完全に除去する。
（ｉｖ）３５０μｌBuffer BR1を加え、ペレットの溶解を目視できるようになるまでボルテックスする。
（ｖ）試料を１．５ｍｌエッペンドルフ試験管に取り出す。３００μｌbuffer BR2及び４０μｌプロテイナーゼＫを連続して加える。数秒間ボルテックスすることにより混合する。
（ｖｉ）シェーカーインキュベーターを使用して４００～１４００ｒｐｍで５５℃にて１０分間インキュベートする。
（ｖｉｉ）２ｍｌ採取チューブに入れたPAXgene Shredderスピンカラム（lilac）にライセートを直接ピペッティングし、最高速度で（但し、カラムが破損し得るため、２０，０００×ｇは超えないこと）３分間遠心する。
（ｖｉｉｉ）フロースルー画分の上清全体を、処理用チューブ内のペレットを乱さないようにして新鮮な１．５ｍｌチューブに慎重に移す。
（ｉｘ）３５０μｌエタノール（９６～１００％、純度グレードｐ．ａ．）を加える。ボルテックスすることにより混合し、軽く遠心して、チューブの蓋の内側の液滴を取り除く。
（ｘ）２ｍｌ処理用チューブに入れたPAXgene RNAスピンカラム（赤色）に７００μｌをピペッティングし、１６０００×ｇ（８０００～２０，０００×ｇ）で１分間遠心する。フロースルーを廃棄する。
（ｘｉ）残りの試料をPAXgene RNAスピンカラムにピペッティングし、１６０００×ｇ（８０００～２０，０００×ｇ）で１分間遠心する。フロースルーを廃棄する。
（ｘｉｉ）カラムを３５０μｌのBuffer BR3で洗浄する。１６，０００×ｇ（８０００～２０，０００×ｇ）で１分間遠心する。
（ｘｉｉｉ）８０μｌ ＤＮアーゼＩミックス（８０μｌ）をPAXgene RNAスピンカラム膜の中央に直接加え、室温（２０～３０℃）で１５分間インキュベートする。
（ｘｉｖ）３５０μｌのBuffer BR3をPAXgene RNAスピンカラムにピペッティングし、１６，０００×ｇ（８０００～２０，０００×ｇ）で１分間遠心する。フロースルーを廃棄する。
（ｘｖ）カラムを５００μｌのBR4で洗浄し、１６，０００×ｇ（８０００～２０，０００×ｇ）で１分間遠心する。フロースルーを廃棄し、１６，０００×ｇ（８０００～２０，０００×ｇ）で更に１分間遠心する。
（ｘｖｉ）カラムに更なる５００μｌのBuffer BR4を加え、１６，０００×ｇ（８０００～２０，０００×ｇ）で３分間遠心する。フロースルーが入った処理用チューブを廃棄し、PAXgene RNAスピンカラムを新しい２ｍｌ処理用チューブに置く。１６，０００×ｇ（８０００～２０，０００×ｇ）で２分間遠心する。カラムを１．５ｍｌチューブに移す。
（ｘｖｉｉ）４０μｌのBuffer BR5をカラム膜に直接加える。１６，０００×ｇ（８０００～２０，０００×ｇ）で２分間遠心することにより、ＲＮＡを溶出させること（注記：最大限の溶出効率を達成するため、膜全体がBuffer BR5で濡れるようにPAXgene RNAスピンカラムを中心に置くことが重要である）
（ｘｖｉｉｉ）例えば、NanaDrop 1000/2000又はQubit機器を使用して、及びQuant-iT（商標）RNAなどのＲＮＡ特異的結合蛍光色素を使用して、ＲＮＡ／純度を定量化する。
（ｘｉｘ）例えば、BioAnalyser 2100又はTapeStation 2200機器（Agilent Technologies）を使用して、ＲＮＡの完全性を決定する。
（ｘｘ）ＲＮＡ試料をすぐに使用しない場合、－２０℃又は－７０℃で保存する。
【0156】
ｉｉ）ＲＮＡシーケンシング
図２に概要を説明する製造者のプロトコルに従いTruSeq RNA試料調製キット（Illumina）を使用してＲＮＡｓｅｑライブラリを調製した。
図２に概要を説明する製造者のプロトコルに従いTruSeq RNA試料調製キット（Illumina）を使用してＲＮＡｓｅｑライブラリを調製した。
【0157】
全トランスクリプトームシーケンシングライブラリの調製は、Illuminaの「TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero Globin Set」を製造者の指示に従い使用して行った。
【0158】
１２個のインデックス化したアダプターのうちの１つを各々有するライブラリのマルチプレックスをプールした。HiSeq2000シーケンサー（Illumina）の１つのフローセルレーン上にて１０１サイクルのペアエンドランで各プールをシーケンシングした。
【0159】
ｉｉｉ）遺伝子発現プロファイル生成及び配列解析
HiSeq2000シーケンサー（Illumina）によって生成された１００塩基長ペアエンドリードをCASAVA v1.8でコールし、fastq形式で出力した。trimmomatic (v0.39)を用いて配列のクオリティを評価し、スクリプトを使用してクオリティの低い塩基及びシーケンスリードをトリミングしてフィルタにかけた。リードの３’末端から、クオリティスコアが２０未満の塩基をトリミングした。平均クオリティスコアが２０未満、又はＮが３より大きい、又は最終的な長さが３５塩基未満のリードは破棄した。アラインメント用にペアリードのみを残した。
HiSeq2000シーケンサー（Illumina）によって生成された１００塩基長ペアエンドリードをCASAVA v1.8でコールし、fastq形式で出力した。trimmomatic (v0.39)を用いて配列のクオリティを評価し、スクリプトを使用してクオリティの低い塩基及びシーケンスリードをトリミングしてフィルタにかけた。リードの３’末端から、クオリティスコアが２０未満の塩基をトリミングした。平均クオリティスコアが２０未満、又はＮが３より大きい、又は最終的な長さが３５塩基未満のリードは破棄した。アラインメント用にペアリードのみを残した。
【0160】
ＲＮＡシーケンシングの後、Trimmomaticソフトウェア［７］を使用して、未処理のリード配列を３’末端が最小限のクオリティ（少なくとも３０のphredスコア）となるようにトリミングし、アダプタートレースを除去し、最終的に３２ｂｐの最小長さとなるようにフィルタにかけた。hisat2 (v2.1)を用いてEnsembl GRCh38.84とのアラインメントを実施するか、又はそれに代えて、TopHat2を用いてUCSC hg19参照ゲノム（Illumina iGenomes）配列を実施した［８］。gatk (v4.1.2.0.でレーンのマージ及びデュプリケートのマークを実施し、GTEx collapse遺伝子モデルに従い修正したRNAseQC (v2.3.4) GENCODE v24アノテーションでＱＣ及び数量化を実施した。一意にマッピングされたリードの数を数えることによる遺伝子発現の数量化後、edgeR (v3.26.4.)で遺伝子発現差を実行した［９］。
【0161】
数量化手法は、GTEx又はHTSeqカウントなどのプログラムを使用して、マッピングされたリードの未処理の数を集計して、遺伝子レベルの定量化、及びエクソンレベルの数量化を達成することであった。この、及び同様の代替的な塩基配列決定法については、Conesa et al［７］によって概要が説明されている。２０例の試料のうちの少なくとも１つにおいて百万リード当たりのカウント（ＣＰＭ）が少なくとも２の発現レベルを有するエクソンリードカウントを残した。Bioconductorリソース［８］及びEdgeR Bioconductorパッケージ［９］を使用して、シーケンシングの深さ及び他の変数を調整するＲＮＡプロファイルの正規化を実施した。図３は、ＰＩＤ患者及び対応する正常対照の血中に発現する１９，５２１個の遺伝子を比較する遺伝子発現差解析を示す。
【0162】
ＰＩＤは、概して単一遺伝子疾患であり、ＰＩＤの診断及び治療の推奨には、（臨床症状に加えて）既知の有害なホモ接合突然変異の同定が十分である。既知の有害突然変異を同定するため上記に記載されるＲＮＡシーケンスリードを参照ヒトゲノム又は転写物参照と比較することにより、ＰＩＤ遺伝子における突然変異検出のための配列解析を実施した。TOPHAT2［８］を用いてペアＲＮＡリードをゲノムエクソンとアラインメントしたとともに、UCSC hg19によって指図されるとおりの遺伝子エクソン境界の範囲内に入るリードのみを使用する。各個体からの各一組のアラインメントをソートし、SAMtoolsを使用してインデックスを付けた［１０、１１］。ＰＩＤ発見プロジェクト［１２］からの、UCSC hg19ゲノムアセンブリによって指図されるとおりの遺伝子エクソン境界の範囲内に入る既知の又は疑わしいＰＩＤ遺伝子及び既知の有害突然変異のリストを使用して、SAMtools mpileup機能（バージョン０．１．１４）を使用して、個体における情報量のあるアレル変異体を抽出した。ＲＮＡ配列における変異体検出のための更なる手法が利用可能になりつつある［１３］。
【0163】
ＲＮＡ分析パイプラインは、一組のＰＩＤ遺伝子及びその既知の突然変異及び加えて他の疑わしい遺伝子における突然変異を使用して、ホモ接合突然変異を検出することができる［１２］。パイプラインはまた、優性突然変異であるものを含めた、疾患表現型に寄与するヘテロ接合突然変異、又は同じ遺伝子の２つのアレルにおける異なる有害突然変異の組み合わせも検出することができる［１４］。加えて、ＲＮＡ分析パイプラインは、診断に寄与し得る原因突然変異と密接なつながりのある（及び基礎にある突然変異ハプロタイプを指し示す）変異体ＳＮＰを検出することができる［１５］。場合によっては、ゲノムの他の部分におけるＳＮＰ変異が、ＰＩＤ突然変異によって引き起こされる種々の個体における疾患発現の見込まれる重症度に関する情報を提供し得る。
【0164】
トランスクリプトーム最良線形不偏予測を用いた対象のＰＩＤ診断
正常及びＰＩＤ患者からの参照トランスクリプトームプロファイルセットから、これを使用してトランスクリプトーム関係行列を作成し、そこから予測方程式を導き出して、トランスクリプトームＢＬＵＰを用いたＰＩＤ診断用の予測方程式を開発した。参照トランスクリプトームプロファイルセットは、以前に微生物分子シグネチャについて記載されているとおり［１６］、トランスクリプトーム関係行列の作成に使用した。トランスクリプトームプロファイルは、UCSC hg19ゲノム又は参照ヒトトランスクリプトームデータベースにあるヒト遺伝子（又はエクソン）配列のコレクションとアラインメントするシーケンシングされたリードのカウントのベクトルである。これらのリードは、ＲＮＡに由来するｃＤＮＡの非ターゲットシーケンシングによって生成される。これらのトランスクリプトームプロファイルは、種々のｍＲＮＡ種の相対的存在量と関係する。使用されるモデルは正規分布を仮定し、そのためトランスクリプトームプロファイルは対数変換され、標準化されることになる。試料ｉの遺伝子（又はエクソン）ｊについての対数変換し及び標準化したカウント、成分ｘｉｊを含む、ｎ個の試料及びｍ個の遺伝子のｎ×ｍ行列Ｘから、幾つかのトランスクリプトームプロファイルを組み合わせた。それらとアラインメントするリードが合計１０未満の遺伝子は、標準化前に行列から除去した。これらのプロファイルを比較して、トランスクリプトーム関係行列を作成した（Ｇ＝ＸＸ’／ｍとして計算した）。ＢＬＵＰを用いて疾患状態が予測される。このデータに混合モデルを当てはめた：ｙ＝１ｎμ＋Ｚｇ＋ｅ。式中、ｙは、１試料につき１レコードの、疾患表現型のベクトルであり、１ｎは１のベクトルであり、μは全体平均であり、Ｚは、試料にレコードを割り当てるデザイン行列であり、及びｇは、変量効果推定量～Ｎ（０，Ｇσ２ ｇ）である。表現型ｙは、分析前に、年齢及び性別などの他の固定効果に関して補正した。ASRemlを用いて、データからσ２ ｇを推定し、試料の疾患状態（
これは長さｎのベクトルである）を以下のとおり予測する：
正常及びＰＩＤ患者からの参照トランスクリプトームプロファイルセットから、これを使用してトランスクリプトーム関係行列を作成し、そこから予測方程式を導き出して、トランスクリプトームＢＬＵＰを用いたＰＩＤ診断用の予測方程式を開発した。参照トランスクリプトームプロファイルセットは、以前に微生物分子シグネチャについて記載されているとおり［１６］、トランスクリプトーム関係行列の作成に使用した。トランスクリプトームプロファイルは、UCSC hg19ゲノム又は参照ヒトトランスクリプトームデータベースにあるヒト遺伝子（又はエクソン）配列のコレクションとアラインメントするシーケンシングされたリードのカウントのベクトルである。これらのリードは、ＲＮＡに由来するｃＤＮＡの非ターゲットシーケンシングによって生成される。これらのトランスクリプトームプロファイルは、種々のｍＲＮＡ種の相対的存在量と関係する。使用されるモデルは正規分布を仮定し、そのためトランスクリプトームプロファイルは対数変換され、標準化されることになる。試料ｉの遺伝子（又はエクソン）ｊについての対数変換し及び標準化したカウント、成分ｘｉｊを含む、ｎ個の試料及びｍ個の遺伝子のｎ×ｍ行列Ｘから、幾つかのトランスクリプトームプロファイルを組み合わせた。それらとアラインメントするリードが合計１０未満の遺伝子は、標準化前に行列から除去した。これらのプロファイルを比較して、トランスクリプトーム関係行列を作成した（Ｇ＝ＸＸ’／ｍとして計算した）。ＢＬＵＰを用いて疾患状態が予測される。このデータに混合モデルを当てはめた：ｙ＝１ｎμ＋Ｚｇ＋ｅ。式中、ｙは、１試料につき１レコードの、疾患表現型のベクトルであり、１ｎは１のベクトルであり、μは全体平均であり、Ｚは、試料にレコードを割り当てるデザイン行列であり、及びｇは、変量効果推定量～Ｎ（０，Ｇσ２ ｇ）である。表現型ｙは、分析前に、年齢及び性別などの他の固定効果に関して補正した。ASRemlを用いて、データからσ２ ｇを推定し、試料の疾患状態（
【数1】
これは長さｎのベクトルである）を以下のとおり予測する：
【数2】
【0165】
この方程式を解くと、各トランスクリプトームプロファイルについて平均値の推定量及び残差の推定量が得られ、ここで
は次元ｎ×１を有することになる。各トランスクリプトームプロファイルについて、予測される疾患表現型は、
であった。
【数3】
は次元ｎ×１を有することになる。各トランスクリプトームプロファイルについて、予測される疾患表現型は、
【数4】
であった。
【0166】
ＰＩＤのトランスクリプトームプロファイル予測はフリー統計ソフトウェアR（バージョン３．１．２；The R Foundation for Statistical Computing；http://www.r-project.org/）で実施し、パッケージrrBLUP［１７］を使用した。トランスクリプトーム関係行列をＢＬＵＰに当てはめ、ＰＩＤ及び非ＰＩＤを訓練セット又は検証セットのいずれかとする２分割交差検証、及びデータセットから順次１つの個体を取り除き、残りのデータを用いて疾患予測値を推定するリーブワンアウト法と呼ばれる代替的な手順を用いて検証した。予測されている個体は、訓練セットから常に省かれる。図４は、リーブワンアウト予測手法を用いて予測モデルを適用した結果を示す。図５は、このモデルの有用性を実証するＲＯＣ曲線である。表１は、予測モデルに使用した５００個の予測変異体遺伝子の一覧を示す。図６は、ＰＩＤで上方又は下方調節される個別の遺伝子の４つの例を示す。
【0167】
【表1】
【0168】
【表2】
【0169】
【表3】
【0170】
罹患者及び非罹患者からのトランスクリプトーム試料参照数を増やすと、トランスクリプトームＢＬＵＰについて更なる訓練が容易になり、繰り返す毎に予測及び診断の正確さが増す。
【0171】
【表4】
【0172】
【表5】
【0173】
メタゲノムプロファイルの決定
リボソーム又は微生物ＤＮＡの非ターゲット超並列シーケンシングを実施して、参照ＰＩＤメタゲノムプロファイルを生成した。
リボソーム又は微生物ＤＮＡの非ターゲット超並列シーケンシングを実施して、参照ＰＩＤメタゲノムプロファイルを生成した。
【0174】
ｉ）試料採取及びＤＮＡ抽出
マイクロバイオームプロファイル取得のため、以下に記載するとおりＤＮＡ抽出キットを使用して口腔スワブ及び毛包からＤＮＡを抽出した。
マイクロバイオームプロファイル取得のため、以下に記載するとおりＤＮＡ抽出キットを使用して口腔スワブ及び毛包からＤＮＡを抽出した。
【0175】
口腔スワブ（buccal swap）試料採取：
１．試料採取前４時間以内のどこかの時点で歯を磨き、試料採取前の（歯磨き後の）食事は控える。
２．綿スワブ又はナイロンブラシを使用して頬粘膜を押し付けて拭った。
３．滅菌ピンセットでスワブから綿を剥ぎ取り、溶解緩衝液が入ったチューブに入れるか、又は溶解緩衝液が入ったチューブにナイロンブラシの頭部を直接入れた。
１．試料採取前４時間以内のどこかの時点で歯を磨き、試料採取前の（歯磨き後の）食事は控える。
２．綿スワブ又はナイロンブラシを使用して頬粘膜を押し付けて拭った。
３．滅菌ピンセットでスワブから綿を剥ぎ取り、溶解緩衝液が入ったチューブに入れるか、又は溶解緩衝液が入ったチューブにナイロンブラシの頭部を直接入れた。
【0176】
口腔スワブからＤＮＡを抽出する
材料：
１．QIAamp DNA Miniキット（Qiagen、カタログ番号／ＩＤ：５１３０４、カタログ番号／ＩＤ：５１３０６）
２．ＲＮアーゼＡ溶液（R6148-25ml、Sigma）
３．溶解緩衝液の調製：２５ｍＭトリス．ＨＣｌ、ｐＨ８．０の溶液中の２０ｍｇリゾチーム；２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０及び１％Triton X-100
材料：
１．QIAamp DNA Miniキット（Qiagen、カタログ番号／ＩＤ：５１３０４、カタログ番号／ＩＤ：５１３０６）
２．ＲＮアーゼＡ溶液（R6148-25ml、Sigma）
３．溶解緩衝液の調製：２５ｍＭトリス．ＨＣｌ、ｐＨ８．０の溶液中の２０ｍｇリゾチーム；２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０及び１％Triton X-100
【0177】
プロトコル：
・口腔スワブ（綿）を１．５ｍＬ又は２ｍＬチューブに入れる。
・４００μｌ溶解緩衝液（２５ｍＭトリス．ＨＣｌ、ｐＨ８．０の溶液中２０ｍｇ／ｍｌリゾチーム；２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０及び１％Triton X-100）を加える。綿を数回押し、ピペッティングすることによって混合した。
・３７℃で６０分間インキュベートする。
・４０μｌプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）及び４００μｌのBuffer ALを加える。１０秒間ボルテックスすることにより徹底的に混合する（注記：プロテイナーゼＫをBuffer ALに直接混合しないこと）。チューブを軽く遠心して、蓋の内側の液滴を取り除く。
・５５℃で６０分間インキュベートする。インキュベーション中、時折ボルテックスして試料を分散させる。
・８０℃で更に１５分間インキュベートしてプロテイナーゼＫを不活性化させる。
・溶液を新しいチューブに取り出す。ピペットの先端を用いて綿をきつく押し付け、可能な限り溶液を取り除く。
・ＲＮアーゼＡ溶液（R6148-25ml、Sigma）８μｌを３７℃で６０分間加える。
・試料に４５０μｌエタノール（９６～１００％）を加え、１５秒間パルスボルテックスすることにより混合する。チューブを軽く遠心して、蓋の内側の液滴を取り除く。
・混合物（全ての沈殿物を含むもの、混合物を２分量に分ける必要がある）をMiniスピンカラムに適用する。キャップを閉め、最高速度で１分間遠心する。
・カラムに５００μｌのBuffer AW1を加える。キャップを閉め、最高速度で１分間遠心し、ろ液を廃棄する。
・カラムに５００μｌのBuffer AW2を加える。キャップを閉め、最高速度で１分間遠心し、ろ液を廃棄する。
・カラムを新しい２ｍｌ採取チューブに移し、最高速度で２分間遠心する。
・カラムを１．５ｍｌチューブに入れ、所要のｇＤＮＡ濃度に応じて５０～１００μｌのBuffer EB（Qiagen）又は１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ８．５を加える。室温で１～３分間インキュベートし、次に最高速度で２分間遠心する。
・口腔スワブ（綿）を１．５ｍＬ又は２ｍＬチューブに入れる。
・４００μｌ溶解緩衝液（２５ｍＭトリス．ＨＣｌ、ｐＨ８．０の溶液中２０ｍｇ／ｍｌリゾチーム；２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０及び１％Triton X-100）を加える。綿を数回押し、ピペッティングすることによって混合した。
・３７℃で６０分間インキュベートする。
・４０μｌプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）及び４００μｌのBuffer ALを加える。１０秒間ボルテックスすることにより徹底的に混合する（注記：プロテイナーゼＫをBuffer ALに直接混合しないこと）。チューブを軽く遠心して、蓋の内側の液滴を取り除く。
・５５℃で６０分間インキュベートする。インキュベーション中、時折ボルテックスして試料を分散させる。
・８０℃で更に１５分間インキュベートしてプロテイナーゼＫを不活性化させる。
・溶液を新しいチューブに取り出す。ピペットの先端を用いて綿をきつく押し付け、可能な限り溶液を取り除く。
・ＲＮアーゼＡ溶液（R6148-25ml、Sigma）８μｌを３７℃で６０分間加える。
・試料に４５０μｌエタノール（９６～１００％）を加え、１５秒間パルスボルテックスすることにより混合する。チューブを軽く遠心して、蓋の内側の液滴を取り除く。
・混合物（全ての沈殿物を含むもの、混合物を２分量に分ける必要がある）をMiniスピンカラムに適用する。キャップを閉め、最高速度で１分間遠心する。
・カラムに５００μｌのBuffer AW1を加える。キャップを閉め、最高速度で１分間遠心し、ろ液を廃棄する。
・カラムに５００μｌのBuffer AW2を加える。キャップを閉め、最高速度で１分間遠心し、ろ液を廃棄する。
・カラムを新しい２ｍｌ採取チューブに移し、最高速度で２分間遠心する。
・カラムを１．５ｍｌチューブに入れ、所要のｇＤＮＡ濃度に応じて５０～１００μｌのBuffer EB（Qiagen）又は１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ８．５を加える。室温で１～３分間インキュベートし、次に最高速度で２分間遠心する。
【0178】
皮膚の試料採取について、皮膚調製指示には、全ての試料採取前１２時間は入浴を控えること、及び皮膚軟化薬又は抗菌性石鹸若しくはシャンプーを控えることが含まれる。試料採取部位には、耳介後方襞、肘窩又は掌側前腕が含まれる。４ｃｍ２の範囲から細菌スワブ（Epicentreスワブによる）及び擦過検体（滅菌使い捨て手術用メスによる）を入手し、上記に口腔スワブ試料について記載したとおり酵素溶解緩衝液及びリゾチーム中でインキュベートする。
【0179】
口腔スワブからの微生物ＤＮＡの増幅
ＰＣＲ １６Ｓ ＰＣＲ
使用したプライマー：１６Ｓ Ｖ４領域をカバーする３４１Ｆ／８０６Ｒプライマー。プライマー部位は、「フォワード」プライマー３４１Ｆ及び「リバース」プライマー８０６Ｒによって標的化される。加えて、Illumina MySeqシーケンシング用のバーコーディングプライマーを含める（以下の網掛け部分）。
ＰＣＲ １６Ｓ ＰＣＲ
使用したプライマー：１６Ｓ Ｖ４領域をカバーする３４１Ｆ／８０６Ｒプライマー。プライマー部位は、「フォワード」プライマー３４１Ｆ及び「リバース」プライマー８０６Ｒによって標的化される。加えて、Illumina MySeqシーケンシング用のバーコーディングプライマーを含める（以下の網掛け部分）。
【0180】
Illumina Multiplexing Read1シーケンシングプライマーを加えた（８０６Ｒ Ａｄ）
【化1】
【0181】
Illumina Multiplexing Read2シーケンシングプライマーを加えた（３４１Ｆ Ａｄ）
【化2】
【0182】
【表6】
【0183】
【表7】
【0184】
口腔スワブからの微生物ＤＮＡのシーケンシング
シーケンシングMiSeqに標準Illuminaプロトコルを使用した。
シーケンシングMiSeqに標準Illuminaプロトコルを使用した。
【0185】
ｉｉ）ターゲット及び非ターゲット超並列シーケンシング
Illuminaバーコーディングプライマーを使用したインデックス化プロトコルを製造者が記載するとおり用いてシーケンシング用のライブラリ調製を実施した。インデックスは、シーケンシングランの短い第３のリードである。簡潔に言えば、ＤＮＡが３００ｂｐに剪断され、ライゲーションによってアダプターが付加され、次にＰＣＲを用いてインデックスが付加される。次にライブラリが数量化され、プールされる。HiSeq2000（商標）シーケンサーでゲノムＤＮＡのペアエンドシーケンシングを実施した。各リードの平均Phredクオリティスコアが２０を上回ることになるようにシーケンスリードをトリミングした。トリミング後にリード長さが５０を下回る場合、そのリードは廃棄した。
Illuminaバーコーディングプライマーを使用したインデックス化プロトコルを製造者が記載するとおり用いてシーケンシング用のライブラリ調製を実施した。インデックスは、シーケンシングランの短い第３のリードである。簡潔に言えば、ＤＮＡが３００ｂｐに剪断され、ライゲーションによってアダプターが付加され、次にＰＣＲを用いてインデックスが付加される。次にライブラリが数量化され、プールされる。HiSeq2000（商標）シーケンサーでゲノムＤＮＡのペアエンドシーケンシングを実施した。各リードの平均Phredクオリティスコアが２０を上回ることになるようにシーケンスリードをトリミングした。トリミング後にリード長さが５０を下回る場合、そのリードは廃棄した。
【0186】
ｉｉｉ）メタゲノムプロファイル分析
メタゲノム最良線形不偏予測を用いた対象のＰＩＤ診断
基本的に以前記載されているとおり［１６］、生成された参照メタゲノムプロファイルセットを使用してメタゲノム関係行列を作成した。メタゲノムプロファイルは、１６Ｓ ｒＲＮＡ配列又はデータベースにある他の利用可能な若しくは生成された参照配列セット（ここではコンティグと称される）のコレクションとアラインメントするシーケンシングしたリードのカウントのベクトルである。これらのリードは、微生物ＤＮＡの非ターゲットシーケンシングによるか、又は微生物ＤＮＡからＰＣＲによって増幅した１６Ｓリボソーム配列のシーケンシングによって生成された。これらのメタゲノムプロファイルは、種々の微生物種の相対的存在量と関係する。使用されるモデルは正規分布を仮定し、そのためメタゲノムプロファイルは対数変換され、標準化されることになる。
メタゲノム最良線形不偏予測を用いた対象のＰＩＤ診断
基本的に以前記載されているとおり［１６］、生成された参照メタゲノムプロファイルセットを使用してメタゲノム関係行列を作成した。メタゲノムプロファイルは、１６Ｓ ｒＲＮＡ配列又はデータベースにある他の利用可能な若しくは生成された参照配列セット（ここではコンティグと称される）のコレクションとアラインメントするシーケンシングしたリードのカウントのベクトルである。これらのリードは、微生物ＤＮＡの非ターゲットシーケンシングによるか、又は微生物ＤＮＡからＰＣＲによって増幅した１６Ｓリボソーム配列のシーケンシングによって生成された。これらのメタゲノムプロファイルは、種々の微生物種の相対的存在量と関係する。使用されるモデルは正規分布を仮定し、そのためメタゲノムプロファイルは対数変換され、標準化されることになる。
【0187】
試料ｉのコンティグｊについての対数変換し及び標準化したカウント、成分ｘｉｊを含む、ｎ個の試料及びｍ個のコンティグのｎ×ｍ行列Ｘから、幾つかのメタゲノムプロファイルを組み合わせた。それらとアラインメントするリードが合計１０未満のコンティグは、標準化前に行列から除去することになる。これらのプロファイルを比較して、マイクロバイオーム関係行列を作る（Ｇ＝ＸＸ’／ｍとして計算される）。最良線形不偏予測を用いて表現型を予測した。データに混合モデルを当てはめた：ｙ＝１ｎμ＋Ｚｇ＋ｅ。式中、ｙは、１試料につき１レコードの、臨床表現型のベクトルであり、１ｎは１のベクトルであり、μは全体平均であり、Ｚは、試料にレコードを割り当てるデザイン行列であり、及びｇは、変動効果推定量～Ｎ（０，Ｇσ２
ｇ）である。ASRemlを用いて、データからσ２
ｇを推定し、試料の表現型（
これは長さｎのベクトルである）を以下のとおり予測した：
【数5】
これは長さｎのベクトルである）を以下のとおり予測した：
【数6】
【0188】
この方程式を解くと、各メタゲノムプロファイルについて平均値の推定量及び残差の推定量が得られ、ここで
は次元ｎ×１を有することになる。各メタゲノムプロファイルについて、予測される表現型は、
である。
【数7】
は次元ｎ×１を有することになる。各メタゲノムプロファイルについて、予測される表現型は、
【数8】
である。
【0189】
ＰＩＤのマイクロバイオームプロファイル予測はフリー統計ソフトウェアR（バージョン３．１．２；The R Foundation for Statistical Computing；http://www.r-project.org/）で実施し、パッケージrrBLUP［１７］を使用した。メタゲノミクス関係行列を最良線形回帰モデル（ＢＬＵＰ）に当てはめ、ＰＩＤ及び非ＰＩＤを訓練セット又は検証セットのいずれかとする２分割交差検証、及びデータセットから順次１つの個体を取り除き、残りのデータを用いて疾患予測値を推定するリーブワンアウト法と呼ばれる代替的な手順を用いて検証する。予測されている個体は、訓練セットから常に省かれた。
【0190】
上記に記載したとおりメタゲノミクスＢＬＵＰ（又はＢａｙｅｓＲ）を訓練するための罹患者及び非罹患者からのマイクロバイオーム試料参照数を更新すると、繰り返す毎に予測精度が増加する。図７は、ＰＩＤ患者と年齢及び性別対応対照との間の特定の微生物における有意差の例を実証する分析を示す。
【0191】
ＲＮＡ及びメタゲノム最良線形不偏予測の組み合わせによる対象のＰＩＤ診断
統合的（トランスクリプトミクス及びメタゲノミクス）予測をR統計ソフトウェアで実施した。ＰＩＤについての２０例の陽性診断及び２０例の陰性診断並びに血中トランスクリプトームプロファイル及びメタゲノムプロファイルを線形回帰モデルに当てはめた。
統合的（トランスクリプトミクス及びメタゲノミクス）予測をR統計ソフトウェアで実施した。ＰＩＤについての２０例の陽性診断及び２０例の陰性診断並びに血中トランスクリプトームプロファイル及びメタゲノムプロファイルを線形回帰モデルに当てはめた。
【0192】
上記にＲＮＡ転写物存在量について記載したＺ行列を以下のとおりメタゲノムＺ１関係行列と組み合わせる拡張関係行列を開発した：
ｙ＝１ｎμ＋Ｚｇ＋Ｚ１ｇ１＋ｅ
ｙ＝１ｎμ＋Ｚｇ＋Ｚ１ｇ１＋ｅ
【0193】
この結果の係数に、それぞれ血中トランスクリプトームプロファイル及びメタゲノムプロファイルを乗じることにより、統合的予測ＰＩＤ疾患表現型を計算した。予測精度は、ピアソン相関「ｒ」、即ち、測定値と予測値との間の相関によって評価した。
【0194】
これらの結果から、以下のことが実証された：第一に、トランスクリプトームプロファイルはこれらの状況でＰＩＤを予測することができた；第二に、トランスクリプトームをメタゲノミクス情報と統合すると、予測精度を高めることができる。罹患者及び非罹患者を含む訓練用のトランスクリプトーム及びマイクロバイオーム試料参照を更新すると、予測精度が高まることになる。
【0195】
遺伝子配列に基づく予測による対象のＰＩＤ診断
ＰＩＤは、概して単一遺伝子疾患であり、ＰＩＤの診断及び治療の推奨には、（臨床症状に加えて）既知のホモ接合突然変異の同定が十分であり、この情報は、上記に記載したとおりＲＮＡ配列から導き出すことができる。加えて、通常血中に発現するＰＩＤ遺伝子の発現が血中に検出されない場合、それもまた、重大な調節欠陥又は不安定化突然変異を指示しており、ＲＮＡｓｅｑは、こうした重大な発現の欠陥を直接明らかにすることができ、原因突然変異の確認がなくても診断が可能となる。
ＰＩＤは、概して単一遺伝子疾患であり、ＰＩＤの診断及び治療の推奨には、（臨床症状に加えて）既知のホモ接合突然変異の同定が十分であり、この情報は、上記に記載したとおりＲＮＡ配列から導き出すことができる。加えて、通常血中に発現するＰＩＤ遺伝子の発現が血中に検出されない場合、それもまた、重大な調節欠陥又は不安定化突然変異を指示しており、ＲＮＡｓｅｑは、こうした重大な発現の欠陥を直接明らかにすることができ、原因突然変異の確認がなくても診断が可能となる。
【0196】
集団中の欠陥免疫遺伝子との連関を持つ、ＳＮＰ変異体など、ｍＲＮＡの他のゲノム変異体が、予測に有用であり得る。ｍＲＮＡの既知の突然変異は、同じ遺伝子、又は染色体上で近傍にある遺伝子から発現するｍＲＮＡに共起するハプロタイプマーカーとの連関から推測又はインピュートされてもよい。このゲノム情報は、ゲノム配列又はＲＮＡ配列から入手することができ、これを単独で、又はトランスクリプトームＢＬＵＰ若しくはトランスクリプトームＢａｙｅｓＲと組み合わせて使用することにより、診断情報が与えられる。
【0197】
同じＰＩＤ疾患突然変異の現れ方は個体間で異なり［１８］、様々なゲノム変異体が疾患の重症度に影響を与えることもあり、この寄与する又は予測性のある（protective）変異を測定することは、疾患の発現が弱まる低重症度又は遅発性のＰＩＤ症例の予測を助ける上で有用であり得る。十分な患者試料が入手されれば、ＲＮＡ配列（及び／又は全ゲノム又はエクソーム配列）を通じて検出されるゲノムのこの種の変異は、疾患重症度の予測を助けるのに一層有用となるであろう。これらはまた、ＰＩＤの自己免疫性所見［１９］又は自己免疫症状を含むＰＩＤ症例の診断を改善する助けにもなり得る。
【0198】
本研究に組み入れた患者は、ＤＮＡシーケンシングによって同定された、その疾患の原因となる既知の遺伝子突然変異を有していた。遺伝子突然変異をＲＮＡｓｅｑデータ中にｍＲＮＡレベルでも同定可能であるような十分なレベルでＰＩＤ遺伝子が血中において転写されるかどうかを判定するため、幾例もの個体でＰＩＤ遺伝子転写物の発現レベルを決定した。ＰＩＤ遺伝子をカバーするシーケンスリード数を調べることにより、ＲＮＡに突然変異を検出する可能性を決定することが可能である。図７は、ＰＩＤ患者における幾つかのＰＩＤ遺伝子の十分な遺伝子発現の検出を実証している。ＣＸＣＲ４遺伝子を突然変異検出の成功例として用いると、ＲＮＡｓｅｑを用いて、疾患の原因となる優性ミスセンス遺伝子突然変異が同定された（図９）。ＰＩＤ患者４１から入手された全血ＲＮＡｓｅｑデータでは、合計１８３個のｍＲＮＡシーケンスリードが、ＣＸＣＲ４ ｍＲＮＡ配列中で突然変異型のアレル（矢印で示す位置にある）が観察される領域をカバーし（８３コピー）、及び正常なアレル変異体配列（１００コピー）が観察され、決定された。２番染色体のこの位置におけるＡ塩基変異体は、ＰＩＤを引き起こすことが公知の、ＣＸＣＲ４のコード配列中に終止コドンを作り出す（ａｒｇからＳＴＯＰへの）ミスセンス突然変異である（図９）。
【0199】
種々の線形混合モデル手法による対象のＰＩＤ診断
Kemper et al［２０］により記載されるとおりの、全ゲノム間配列変異に基づくゲノム予測に適用されるＢａｙｅｓＲなど、ＢＬＵＰに代わる別の線形混合モデル手法もまた、Ｘ行列が正規化後のコンティグ当たりのリードカウントによって個体を記述するＢＬＵＰを用いて上記に説明した方法と同じように、トランスクリプトーム及び／又はメタゲノミクスデータに適用することができる。ＢａｙｅｓＲ方法は、遺伝子発現の真の効果が、最初はゼロ分散から、中程度乃至大きい分散のものに至るまでの、一連の正規分布から導き出されると仮定する。ＢａｙｅｓＲがＢＬＵＰに優る利点は、個別の遺伝子の効果が、ＢＬＵＰほど平均値に向かってきつく圧縮されないことである。ＢａｙｅｓＲ手法はまた、MacLeod et al［２１］により記載されるとおり、免疫系調節機能などの既知の生物学的情報を含むように拡張することもできる（ＢａｙｅｓＲＣ）。
Kemper et al［２０］により記載されるとおりの、全ゲノム間配列変異に基づくゲノム予測に適用されるＢａｙｅｓＲなど、ＢＬＵＰに代わる別の線形混合モデル手法もまた、Ｘ行列が正規化後のコンティグ当たりのリードカウントによって個体を記述するＢＬＵＰを用いて上記に説明した方法と同じように、トランスクリプトーム及び／又はメタゲノミクスデータに適用することができる。ＢａｙｅｓＲ方法は、遺伝子発現の真の効果が、最初はゼロ分散から、中程度乃至大きい分散のものに至るまでの、一連の正規分布から導き出されると仮定する。ＢａｙｅｓＲがＢＬＵＰに優る利点は、個別の遺伝子の効果が、ＢＬＵＰほど平均値に向かってきつく圧縮されないことである。ＢａｙｅｓＲ手法はまた、MacLeod et al［２１］により記載されるとおり、免疫系調節機能などの既知の生物学的情報を含むように拡張することもできる（ＢａｙｅｓＲＣ）。
【0200】
機械学習手法による対象のＰＩＤ診断
線形混合モデルに代わる別の手法もまた、ＢＬＵＰを用いて上記に説明したものと似た予測的な方法でトランスクリプトーム及び／又はメタゲノムデータに適用することができ、ＰＩＤの分類及び予測を可能にし得る。機械学習、サポートベクターマシン、及びニューラルネットワークは、患者及び正常対照からのトランスクリプトーム及び／又はメタゲノムデータを患者分類、続く予測モデル訓練の入力として使用する線形混合モデルに代わる別の手法を提供することができる。同様の手法が、癌患者を高リスク群又は低リスク群に分類するために、及び予後判定を支援する予測モデルの開発に用いられており［２２］、この目的で腫瘍ＲＮＡｓｅｑデータを入力として使用することについて、調査中である［２３］。
線形混合モデルに代わる別の手法もまた、ＢＬＵＰを用いて上記に説明したものと似た予測的な方法でトランスクリプトーム及び／又はメタゲノムデータに適用することができ、ＰＩＤの分類及び予測を可能にし得る。機械学習、サポートベクターマシン、及びニューラルネットワークは、患者及び正常対照からのトランスクリプトーム及び／又はメタゲノムデータを患者分類、続く予測モデル訓練の入力として使用する線形混合モデルに代わる別の手法を提供することができる。同様の手法が、癌患者を高リスク群又は低リスク群に分類するために、及び予後判定を支援する予測モデルの開発に用いられており［２２］、この目的で腫瘍ＲＮＡｓｅｑデータを入力として使用することについて、調査中である［２３］。
【0201】
線形混合モデルは、対象からの記述的レポートと組み合わせてもよく、こうしたレポートは、情報を得た臨床医が免疫系調節異常、影響を受ける細胞及び経路、疾患状態及び恐らくは好ましい治療を評価する助けとなるため有用となり得る。
【0202】
これを行うため、所与のＰＩＤ患者で発現に有意な差がある遺伝子（例えば、２０又は５０又は更には１００個のＤＥ遺伝子）を同定し、このＤＥ遺伝子セットを、DAVID又はReactomeプログラムなど、又はそれと同様のパスウェイ過剰出現解析（即ち、遺伝子セットエンリッチメント解析）に供してもよく、そこから、対象において影響を受ける経路及び細胞機能に関するレポートが生成される。
【0203】
診断を補足する更なる定性的レポートは、どのように対象のトランスクリプトームをデータベース中の他の患者と比較するかについてのクラスタリングレポートを提供することとなる可能性がある。これは、当該の患者からのトランスクリプトーム関係行列又は遺伝子発現差の他の分析に基づき得る。同じ遺伝子に突然変異を有する患者は、そのトランスクリプトームに基づき互いに近いクラスターを形成することが理解されるであろう。より大規模な患者データベースが利用可能になれば、このクラスタリングは、新しく診断された患者をトランスクリプトームに基づきＰＩＤ疾患サブタイプに分類する助けとなり得る（見付け出される突然変異検出類似性及び補完する）。
【0204】
参考文献
1. Salem S, Langlais D, Lefebvre F, Bourque G, Bigley V, Haniffa M, Casanova JL, Burk D, Berghuis A, Butler KM et al: Functional characterization of the human dendritic cell immunodeficiency associated with the IRF8(K108E) mutation. Blood 2014, 124(12):1894-1904.
2. Naik S, Bouladoux N, Wilhelm C, Molloy MJ, Salcedo R, Kastenmuller W, Deming C, Quinones M, Koo L, Conlan S et al: Compartmentalized control of skin immunity by resident commensals. Science 2012, 337(6098):1115-1119.
3. Oh J, Freeman AF, Park M, Sokolic R, Candotti F, Holland SM, Segre JA, Kong HH: The altered landscape of the human skin microbiome in patients with primary immunodeficiencies. Genome research 2013, 23(12):2103-2114.
4. Gallo V, Dotta L, Giardino G, Cirillo E, Lougaris V, D’Assante R, Prandini A, Consolini R, Farrow EG, Thiffault I et al: Diagnostics of Primary Immunodeficiencies through Next-Generation Sequencing. Frontiers in immunology 2016, 7:466.
5. Erbe M, Hayes BJ, Matukumalli LK, Goswami S, Bowman PJ, Reich CM, Mason BA, Goddard ME: Improving accuracy of genomic predictions within and between dairy cattle breeds with imputed high-density single nucleotide polymorphism panels. Journal of dairy science 2012, 95(7):4114-4129.
6. Zhang W, Yu Y, Hertwig F, Thierry-Mieg J, Thierry-Mieg D, Wang J, Furlanello C, Devanarayan V, Cheng J, Deng Y et al: Comparison of RNA-seq and microarray-based models for clinical endpoint prediction. Genome biology 2015, 16:133.
7. Conesa A, Madrigal P, Tarazona S, Gomez-Cabrero D, Cervera A, McPherson A, Szczesniak MW, Gaffney DJ, Elo LL, Zhang X et al: A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome biology 2016, 17:13.
8. Huber W, Carey VJ, Gentleman R, Anders S, Carlson M, Carvalho BS, Bravo HC, Davis S, Gatto L, Girke T et al: Orchestrating high-throughput genomic analysis with Bioconductor. Nature methods 2015, 12(2):115-121.
9. Robinson MD, McCarthy DJ, Smyth GK: edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics 2010, 26(1):139-140.
10.Etherington GJ, Ramirez-Gonzalez RH, MacLean D: bio-samtools 2: a package for analysis and visualization of sequence and alignment data with SAMtools in Ruby. Bioinformatics 2015, 31(15):2565-2567.
11. Li H, Handsaker B, Wysoker A, Fennell T, Ruan J, Homer N, Marth G, Abecasis G, Durbin R: The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics 2009, 25(16):2078-2079.
12. Itan Y, Casanova JL: Novel primary immunodeficiency candidate genes predicted by the human gene connectome. Frontiers in immunology 2015, 6:142.
13. Sheng Q, Zhao S, Li CI, Shyr Y, Guo Y: Practicability of detecting somatic point mutation from RNA high throughput sequencing data. Genomics 2016, 107(5):163-169.
14. Lionakis MS: Genetic Susceptibility to Fungal Infections in Humans. Current fungal infection reports 2012, 6(1):11-22.
15. Hsu AP, Sampaio EP, Khan J, Calvo KR, Lemieux JE, Patel SY, Frucht DM, Vinh DC, Auth RD, Freeman AF et al: Mutations in GATA2 are associated with the autosomal dominant and sporadic monocytopenia and mycobacterial infection (MonoMAC) syndrome. Blood 2011, 118(10):2653-2655.
16. Ross EM, Moate PJ, Marett LC, Cocks BG, Hayes BJ: Metagenomic predictions: from microbiome to complex health and environmental phenotypes in humans and cattle. PloS one 2013, 8(9):e73056.
17. Endelman JB: Ridge Regression and Other Kernels for Genomic Selection with R Package rrBLUP. The Plant Genome 2011, 4(3):250-255.
18. Alcais A, Quintana-Murci L, Thaler DS, Schurr E, Abel L, Casanova JL: Life-threatening infectious diseases of childhood: single-gene inborn errors of immunity? Annals of the New York Academy of Sciences 2010, 1214:18-33.
19. Carneiro-Sampaio M, Coutinho A: Early-onset autoimmune disease as a manifestation of primary immunodeficiency. Frontiers in immunology 2015, 6:185.
20. Kemper KE, Reich CM, Bowman PJ, Vander Jagt CJ, Chamberlain AJ, Mason BA, Hayes BJ, Goddard ME: Improved precision of QTL mapping using a nonlinear Bayesian method in a multi-breed population leads to greater accuracy of across-breed genomic predictions. Genetics, selection, evolution : GSE 2015, 47:29.
21. MacLeod IM, Bowman PJ, Vander Jagt CJ, Haile-Mariam M, Kemper KE, Chamberlain AJ, Schrooten C, Hayes BJ, Goddard ME: Exploiting biological priors and sequence variants enhances QTL discovery and genomic prediction of complex traits. BMC genomics 2016, 17:144.
22. Kourou K, Exarchos TP, Exarchos KP, Karamouzis MV, Fotiadis DI Machine learning applications in cancer prognosis and prediction. Comput Struct Biotechnol J. 2014 Nov 15;13:8-17.
23. Han H, Liu Y. Transcriptome marker diagnostics using big data. IET Syst Biol. 2016 Feb;10(1):41-8.
1. Salem S, Langlais D, Lefebvre F, Bourque G, Bigley V, Haniffa M, Casanova JL, Burk D, Berghuis A, Butler KM et al: Functional characterization of the human dendritic cell immunodeficiency associated with the IRF8(K108E) mutation. Blood 2014, 124(12):1894-1904.
2. Naik S, Bouladoux N, Wilhelm C, Molloy MJ, Salcedo R, Kastenmuller W, Deming C, Quinones M, Koo L, Conlan S et al: Compartmentalized control of skin immunity by resident commensals. Science 2012, 337(6098):1115-1119.
3. Oh J, Freeman AF, Park M, Sokolic R, Candotti F, Holland SM, Segre JA, Kong HH: The altered landscape of the human skin microbiome in patients with primary immunodeficiencies. Genome research 2013, 23(12):2103-2114.
4. Gallo V, Dotta L, Giardino G, Cirillo E, Lougaris V, D’Assante R, Prandini A, Consolini R, Farrow EG, Thiffault I et al: Diagnostics of Primary Immunodeficiencies through Next-Generation Sequencing. Frontiers in immunology 2016, 7:466.
5. Erbe M, Hayes BJ, Matukumalli LK, Goswami S, Bowman PJ, Reich CM, Mason BA, Goddard ME: Improving accuracy of genomic predictions within and between dairy cattle breeds with imputed high-density single nucleotide polymorphism panels. Journal of dairy science 2012, 95(7):4114-4129.
6. Zhang W, Yu Y, Hertwig F, Thierry-Mieg J, Thierry-Mieg D, Wang J, Furlanello C, Devanarayan V, Cheng J, Deng Y et al: Comparison of RNA-seq and microarray-based models for clinical endpoint prediction. Genome biology 2015, 16:133.
7. Conesa A, Madrigal P, Tarazona S, Gomez-Cabrero D, Cervera A, McPherson A, Szczesniak MW, Gaffney DJ, Elo LL, Zhang X et al: A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome biology 2016, 17:13.
8. Huber W, Carey VJ, Gentleman R, Anders S, Carlson M, Carvalho BS, Bravo HC, Davis S, Gatto L, Girke T et al: Orchestrating high-throughput genomic analysis with Bioconductor. Nature methods 2015, 12(2):115-121.
9. Robinson MD, McCarthy DJ, Smyth GK: edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics 2010, 26(1):139-140.
10.Etherington GJ, Ramirez-Gonzalez RH, MacLean D: bio-samtools 2: a package for analysis and visualization of sequence and alignment data with SAMtools in Ruby. Bioinformatics 2015, 31(15):2565-2567.
11. Li H, Handsaker B, Wysoker A, Fennell T, Ruan J, Homer N, Marth G, Abecasis G, Durbin R: The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics 2009, 25(16):2078-2079.
12. Itan Y, Casanova JL: Novel primary immunodeficiency candidate genes predicted by the human gene connectome. Frontiers in immunology 2015, 6:142.
13. Sheng Q, Zhao S, Li CI, Shyr Y, Guo Y: Practicability of detecting somatic point mutation from RNA high throughput sequencing data. Genomics 2016, 107(5):163-169.
14. Lionakis MS: Genetic Susceptibility to Fungal Infections in Humans. Current fungal infection reports 2012, 6(1):11-22.
15. Hsu AP, Sampaio EP, Khan J, Calvo KR, Lemieux JE, Patel SY, Frucht DM, Vinh DC, Auth RD, Freeman AF et al: Mutations in GATA2 are associated with the autosomal dominant and sporadic monocytopenia and mycobacterial infection (MonoMAC) syndrome. Blood 2011, 118(10):2653-2655.
16. Ross EM, Moate PJ, Marett LC, Cocks BG, Hayes BJ: Metagenomic predictions: from microbiome to complex health and environmental phenotypes in humans and cattle. PloS one 2013, 8(9):e73056.
17. Endelman JB: Ridge Regression and Other Kernels for Genomic Selection with R Package rrBLUP. The Plant Genome 2011, 4(3):250-255.
18. Alcais A, Quintana-Murci L, Thaler DS, Schurr E, Abel L, Casanova JL: Life-threatening infectious diseases of childhood: single-gene inborn errors of immunity? Annals of the New York Academy of Sciences 2010, 1214:18-33.
19. Carneiro-Sampaio M, Coutinho A: Early-onset autoimmune disease as a manifestation of primary immunodeficiency. Frontiers in immunology 2015, 6:185.
20. Kemper KE, Reich CM, Bowman PJ, Vander Jagt CJ, Chamberlain AJ, Mason BA, Hayes BJ, Goddard ME: Improved precision of QTL mapping using a nonlinear Bayesian method in a multi-breed population leads to greater accuracy of across-breed genomic predictions. Genetics, selection, evolution : GSE 2015, 47:29.
21. MacLeod IM, Bowman PJ, Vander Jagt CJ, Haile-Mariam M, Kemper KE, Chamberlain AJ, Schrooten C, Hayes BJ, Goddard ME: Exploiting biological priors and sequence variants enhances QTL discovery and genomic prediction of complex traits. BMC genomics 2016, 17:144.
22. Kourou K, Exarchos TP, Exarchos KP, Karamouzis MV, Fotiadis DI Machine learning applications in cancer prognosis and prediction. Comput Struct Biotechnol J. 2014 Nov 15;13:8-17.
23. Han H, Liu Y. Transcriptome marker diagnostics using big data. IET Syst Biol. 2016 Feb;10(1):41-8.
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【国際調査報告】