特表2023-515424Ｂ型肝炎及びＤ型肝炎ウイルス感染を阻害するための方法及び組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-13
(54)【発明の名称】Ｂ型肝炎及びＤ型肝炎ウイルス感染を阻害するための方法及び組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20230406BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20230406BHJP
C12N 15/115 20100101ALI20230406BHJP
A61P 31/20 20060101ALI20230406BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230406BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20230406BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20230406BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20230406BHJP
A61K 31/7115 20060101ALI20230406BHJP
A61K 31/712 20060101ALI20230406BHJP
A61K 31/7125 20060101ALI20230406BHJP
A61K 38/43 20060101ALI20230406BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00
C12N15/113 Z ZNA
C12N15/113 130Z
C12N15/115 Z
A61P31/20
A61P31/14
A61K31/7105
A61K31/713
A61K31/7088
A61K31/7115
A61K31/712
A61K31/7125
A61K38/43
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2022549282
(86)(22)【出願日】2021-02-18
(85)【翻訳文提出日】2022-08-16
(86)【国際出願番号】 CA2021050176
(87)【国際公開番号】W WO2021163796
(87)【国際公開日】2021-08-26
(31)【優先権主張番号】62/979,442
(32)【優先日】2020-02-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】505092979
【氏名又は名称】レプリコール インコーポレーティッド
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(74)【代理人】
【識別番号】100162422
【弁理士】
【氏名又は名称】志村 将
(72)【発明者】
【氏名】ヴァイヤン アンドリュー
(72)【発明者】
【氏名】ブーロン リチャード
(72)【発明者】
【氏名】ブランシェ マチウ
(72)【発明者】
【氏名】ラボンテ パトリック
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C084AA01
4C084AA02
4C084AA17
4C084BA44
4C084DC22
4C084NA14
4C084ZB331
4C084ZB332
4C086AA01
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB33
(57)【要約】
本開示は、カゼインキナーゼ１アイソフォームデルタ、ＤＮＡＪＢ１２、及び／又は微小管－アクチン架橋因子１の活性を阻害することによりＨＢＶ ＳＶＰの集合及び又は分泌に関与するタンパク質を阻害するための方法に関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
カゼインキナーゼ１アイソフォームデルタ、ＤＮＡＪＢ１２、及び微小管－アクチン架橋因子１の少なくとも１つの活性を阻害する薬学上許容可能な小分子と、担体とを含む、Ｂ型肝炎又はＤ型肝炎感染症の治療のための組成物。
【請求項2】
前記小分子がオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記オリゴヌクレオチドが、カゼインキナーゼ１アイソフォームデルタ、ＤＮＡＪＢ１２、もしくは微小管－アクチン架橋因子１のｍＲＮＡの一部に相補的な、アンチセンスオリゴヌクレオチド、合成干渉ＲＮＡ、又はＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項4】
ＨＢＶサブウイルス粒子（ＳＶＰ）の集合及び／又は分泌を阻害する、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項5】
前記小分子が、配列番号１２、１３又は１７で示される配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項6】
前記小分子が、配列番号５、６、１０、１２、１３又は１７で示される配列を有する合成干渉ＲＮＡである、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項7】
前記小分子が、配列番号５、６、１０、１２、１３又は１７で示される配列を含むガイドＲＮＡを用いるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９である、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
前記オリゴヌクレオチドが、修飾された核酸塩基を含む、請求項２～７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項9】
前記オリゴヌクレオチドが一本鎖又は二本鎖である、請求項２に記載の組成物。
【請求項10】
前記オリゴヌクレオチドがシュピーゲルマー又はアプタマーである、請求項２に記載の組成物。
【請求項11】
前記オリゴヌクレオチドが、ホスホジエステル結合、糖、及び塩基において少なくとも１つの修飾を含む、請求項２～１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項12】
前記オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、２’－Ｏ－メチル修飾、２’－アミノ修飾、２’－ハロ修飾、非環式ヌクレオチドアナログ、３’－及び／又は５’－キャップ、シトシン塩基の５’メチル化、並びにウラシル塩基の４’チオ化の少なくとも１つを含む、請求項２～１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項13】
配列番号１及び配列番号４からなる少なくとも１種の核酸ポリマーを更に含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項14】
治療を必要とする対象に、カゼインキナーゼ１アイソフォームデルタ、ＤＮＡＪＢ１２、及び微小管－アクチン架橋因子１の活性を阻害する有効量の薬学上許容可能な小分子を投与することを含む、Ｂ型肝炎又はＤ型肝炎感染症の治療のための方法。
【請求項15】
前記小分子がオリゴヌクレオチドである、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記オリゴヌクレオチドが、カゼインキナーゼ１アイソフォームデルタ、ＤｎａＪＢ１２、カゼインキナーゼ１アイソフォームアルファ、コートマーサブユニットイプシロン、トランスデューシンベータ様タンパク質２、又は微小管－アクチン架橋因子１のｍＲＮＡの一部に相補的な、アンチセンスオリゴヌクレオチド、合成干渉ＲＮＡ、又はＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡである、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項17】
前記組成物が、ＨＢＶサブウイルス粒子（ＳＶＰ）の集合及び／又は分泌を阻害する、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記小分子が、配列番号１２、１３又は１７で示される配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記小分子が、配列番号５、６、１０、１２、１３又は１７で示される配列を有する合成干渉ＲＮＡである、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記小分子が、配列番号５、６、１０、１２、１３又は１７で示される配列を含むガイドＲＮＡを用いるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９である、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記オリゴヌクレオチドが、修飾された核酸塩基を含む、請求項１４～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記オリゴヌクレオチドが一本鎖又は二本鎖である、請求項１５に記載の方法。
【請求項23】
前記オリゴヌクレオチドがシュピーゲルマー、アプタマー、ｍｉＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項24】
前記オリゴヌクレオチドが、ホスホジエステル結合、糖、及び塩基において少なくとも１つの修飾を含む、請求項１４～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、２’－Ｏ－メチル修飾、２’－アミノ修飾、２’－ハロ修飾、非環式ヌクレオチドアナログ、３’－及び／又は５’－キャップ、シトシン塩基の５’メチル化、並びにウラシル塩基の４’チオ化の少なくとも１つを含む、請求項１４～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
配列番号１及び配列番号４からなる少なくとも１種の核酸ポリマーを投与することを更に含む、請求項１４～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
患者におけるＨＢＶサブウイルス粒子（ＳＶＰ）の集合及び／又は分泌を阻害するための、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、２０２０年２月２１日に出願された米国仮出願第６２／９７９，４４２号、及び２０２０年９月１６日に出願された米国仮出願第６３／０７８，９３９号の優先権を主張するものであり、これらはそれぞれ参照によりその全内容が本明細書に援用される。
技術分野
本開示は、ＨＢＶサブウイルス粒子（ＳＶＰ）の集合及び分泌に関与する様々な新規タンパク質を標的とすることにより、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）又はＤ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）感染を阻害するための組成物及び方法に関する。
本願は、２０２０年２月２１日に出願された米国仮出願第６２／９７９，４４２号、及び２０２０年９月１６日に出願された米国仮出願第６３／０７８，９３９号の優先権を主張するものであり、これらはそれぞれ参照によりその全内容が本明細書に援用される。
技術分野
本開示は、ＨＢＶサブウイルス粒子（ＳＶＰ）の集合及び分泌に関与する様々な新規タンパク質を標的とすることにより、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）又はＤ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）感染を阻害するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、ヘパドナウイルス科（ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）のエンベロープウイルスである。このウイルスは、知られている最大のパンデミックウイルス感染の原因であり、世界中で２０億人以上が感染し、これらの個人のうち３億人以上が慢性肝臓感染症を患っている。毎年、ＨＢＶ感染の影響によりおよそ８７万人が死亡している。この疾患の治療の必要性を満たすために、ＨＢＶの治療のために免疫療法薬（ペグ化インターフェロン及びチモシンアルファ１など）、並びにＨＢＶ逆転写酵素の様々なヌクレオシ（チ）ドアナログ阻害剤（エンテカビル及びテノホビルジソプロキシルフマル酸塩など）を含むいくつかの薬物が承認されている。しかしながら、これらの薬物は、肝臓でのウイルスの複製を抑制することができるが、ＨＢＶサブウイルス粒子（ＳＶＰ）の生成にはほとんど又は全く効果がない。これらのＳＶＰは、循環しているＢ型肝炎表面抗原タンパク質（ＨＢｓＡｇ）の大部分をなし、遺伝源として組み込まれたＨＢＶ ＤＮＡを使用して複製とは独立して生成され得る。循環しているＨＢｓＡｇは、最も豊富な循環ウイルス抗原であり、ＨＢＶ感染に対する免疫応答を阻害する上で重要な機能を有する。治療がない場合のＨＢｓＡｇの持続的なクリアランスは、感染の免疫制御の真の回復及び正常な肝機能の回復（機能的治癒）の最良のマーカーとして広く認められており、開発中の新しい治療法の現在の目標である。従って、ＳＶＰの生成を効果的に標的とすることができるＨＢＶのより効果的な治療が依然として必要とされている。
治療中にＨＢｓＡｇの高いクリアランス率を達成し、ＨＢＶ及びＨＤＶ感染症の機能的治癒を達成する能力（治療なしでのＨＤＶ ＲＮＡの持続的クリアランス）を示した開発中の唯一の現在の治療法は、核酸ポリマー（ＮＡＰ）である。ＮＡＰは、ビリオン又はＥ型肝炎抗原などの他のウイルス抗原の産生又は分泌に影響を与えることなく、ＳＶＰの集合及び分泌を選択的に妨害する。しかしながら、今日まで、ＳＶＰの集合及び分泌の基礎となる分子機序又はＨＢＶ及びＨＤＶ感染における抗ウイルス効果を促進するＮＡＰの標的についてはほとんど知られていない。
治療中にＨＢｓＡｇの高いクリアランス率を達成し、ＨＢＶ及びＨＤＶ感染症の機能的治癒を達成する能力（治療なしでのＨＤＶ ＲＮＡの持続的クリアランス）を示した開発中の唯一の現在の治療法は、核酸ポリマー（ＮＡＰ）である。ＮＡＰは、ビリオン又はＥ型肝炎抗原などの他のウイルス抗原の産生又は分泌に影響を与えることなく、ＳＶＰの集合及び分泌を選択的に妨害する。しかしながら、今日まで、ＳＶＰの集合及び分泌の基礎となる分子機序又はＨＢＶ及びＨＤＶ感染における抗ウイルス効果を促進するＮＡＰの標的についてはほとんど知られていない。
【発明の概要】
【0003】
ＨＤＶは、ＨＢＶのサテライト感染と考えられている欠損ウイルスであり、ＨＢＶゲノム由来のＨＢｓＡｇがそのエンベロープを形成することを必要とする。ＨＤＶのＨＢｓＡｇアイソフォーム組成は、ＨＢＶ ＳＶＰの場合と同じであり、ＨＢＶ ＳＶＰ及びＨＤＶの集合及び又は分泌に同様の機構が使用されていることを示している。従って、ＨＢＶ ＳＶＰ及びＨＤＶの集合及び又は分泌に関与する標的を阻害することによりＨＢＶ及び又はＨＤＶ感染症に対してより効果的な治療を提供することが望ましいであろう。
【0004】
概要
本開示によれば、ＨＢＶ感染又はＨＢＶ／ＨＤＶ重複感染を阻害するための方法であって、そのような治療を必要とする患者に次のタンパク質：カゼインキナーゼＩアイソフォームデルタ、ＤＮＡＪＢ１２、又は微小管－アクチン架橋因子１のうち１つ又は複数の機能を阻害する薬理学上許容可能な小分子を投与することを含む方法がここに提供される。
また、ＨＢＶ感染又はＨＢＶ／ＨＤＶ重複感染を阻害するための方法であって、そのような治療を必要とする患者に次のタンパク質：カゼインキナーゼＩアイソフォームデルタ、ＤＮＡＪＢ１２、又は微小管－アクチン架橋因子１のうち１つ又は複数のｍＲＮＡの一部に相補的な薬理学上許容可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法も提供される。
また、ＨＢＶ感染又はＨＢＶ／ＨＤＶ重複感染を阻害するための方法であって、そのような治療を必要とする患者に次のタンパク質：カゼインキナーゼＩアイソフォームデルタ、ＤＮＡＪＢ１２、又は微小管－アクチン架橋因子１のうち１つ又は複数のｍＲＮＡの一部に相補的な薬理学上許容可能な合成干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を投与することを含む方法も提供される。
また、ＨＢＶ感染又はＨＢＶ／ＨＤＶ重複感染を阻害するための方法であって、そのような治療を必要とする患者に次のタンパク質：カゼインキナーゼ１アイソフォームデルタ、ＤＮＡＪＢ１２又は微小管－アクチン架橋因子１のうち１つ又は複数のｍＲＮＡの一部に相補的な薬理学上許容可能なＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を投与することを含む方法も提供される。
また、次のタンパク質：カゼインキナーゼＩアイソフォームデルタ、ＤＮＡＪＢ１２又は微小管－アクチン架橋因子１のうち１つ又は複数の機能を阻害する薬理学上許容可能な小分子を含む組成物も提供される。
また、次のタンパク質：カゼインキナーゼＩアイソフォームデルタ、ＤＮＡＪＢ１２又は微小管－アクチン架橋因子１のうち１つ又は複数のｍＲＮＡの一部に相補的な薬理学上許容可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物も提供される。
また、次のタンパク質：カゼインキナーゼＩアイソフォームデルタ、ＤＮＡＪＢ１２又は微小管－アクチン架橋因子１のうち１つ又は複数のｍＲＮＡの一部に相補的な薬理学上許容可能な合成干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む組成物も提供される。
また、ＨＢＶ感染又はＨＢＶ／ＨＤＶ重複感染を阻害するための組成物であって、次のタンパク質：カゼインキナーゼ１アイソフォームデルタ、ＤＮＡＪＢ１２又は微小管－アクチン架橋因子１のうち１つ又は複数のｍＲＮＡの一部に相補的な薬理学上許容可能なＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む組成物も提供される。
本開示によれば、ＨＢＶ感染又はＨＢＶ／ＨＤＶ重複感染を阻害するための方法であって、そのような治療を必要とする患者に次のタンパク質：カゼインキナーゼＩアイソフォームデルタ、ＤＮＡＪＢ１２、又は微小管－アクチン架橋因子１のうち１つ又は複数の機能を阻害する薬理学上許容可能な小分子を投与することを含む方法がここに提供される。
また、ＨＢＶ感染又はＨＢＶ／ＨＤＶ重複感染を阻害するための方法であって、そのような治療を必要とする患者に次のタンパク質：カゼインキナーゼＩアイソフォームデルタ、ＤＮＡＪＢ１２、又は微小管－アクチン架橋因子１のうち１つ又は複数のｍＲＮＡの一部に相補的な薬理学上許容可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法も提供される。
また、ＨＢＶ感染又はＨＢＶ／ＨＤＶ重複感染を阻害するための方法であって、そのような治療を必要とする患者に次のタンパク質：カゼインキナーゼＩアイソフォームデルタ、ＤＮＡＪＢ１２、又は微小管－アクチン架橋因子１のうち１つ又は複数のｍＲＮＡの一部に相補的な薬理学上許容可能な合成干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を投与することを含む方法も提供される。
また、ＨＢＶ感染又はＨＢＶ／ＨＤＶ重複感染を阻害するための方法であって、そのような治療を必要とする患者に次のタンパク質：カゼインキナーゼ１アイソフォームデルタ、ＤＮＡＪＢ１２又は微小管－アクチン架橋因子１のうち１つ又は複数のｍＲＮＡの一部に相補的な薬理学上許容可能なＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を投与することを含む方法も提供される。
また、次のタンパク質：カゼインキナーゼＩアイソフォームデルタ、ＤＮＡＪＢ１２又は微小管－アクチン架橋因子１のうち１つ又は複数の機能を阻害する薬理学上許容可能な小分子を含む組成物も提供される。
また、次のタンパク質：カゼインキナーゼＩアイソフォームデルタ、ＤＮＡＪＢ１２又は微小管－アクチン架橋因子１のうち１つ又は複数のｍＲＮＡの一部に相補的な薬理学上許容可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物も提供される。
また、次のタンパク質：カゼインキナーゼＩアイソフォームデルタ、ＤＮＡＪＢ１２又は微小管－アクチン架橋因子１のうち１つ又は複数のｍＲＮＡの一部に相補的な薬理学上許容可能な合成干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む組成物も提供される。
また、ＨＢＶ感染又はＨＢＶ／ＨＤＶ重複感染を阻害するための組成物であって、次のタンパク質：カゼインキナーゼ１アイソフォームデルタ、ＤＮＡＪＢ１２又は微小管－アクチン架橋因子１のうち１つ又は複数のｍＲＮＡの一部に相補的な薬理学上許容可能なＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む組成物も提供される。
【0005】
一実施形態では、前記小分子はオリゴヌクレオチドである。
更なる実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、カゼインキナーゼ１アイソフォームデルタ、ＤＮＡＪＢ１２又は微小管－アクチン架橋因子１のｍＲＮＡの一部に相補的な、アンチセンスオリゴヌクレオチド、合成干渉ＲＮＡ又はＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。
更なる実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、カゼインキナーゼ１アイソフォームデルタ、ＤＮＡＪＢ１２又は微小管－アクチン架橋因子１のｍＲＮＡの一部に相補的な、アンチセンスオリゴヌクレオチド、合成干渉ＲＮＡ又はＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。
【0006】
一実施形態では、前記小分子は、配列番号１２、１３又は１７で示される配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
代替実施形態では、前記小分子は、配列番号５、６、１０、１２、１３又は１７で示される配列を有する合成干渉ＲＮＡである。
追加の実施形態では、前記小分子は、配列番号５、６、１０、１２、１３又は１７で示される配列を含むガイドＲＮＡを用いるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９である．
追加の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、修飾された核酸塩基を含む。
補足の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは一本鎖又は二本鎖である。
別の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドはシュピーゲルマー（Ｓｐｅｉｇｅｌｍｅｒ）又はアプタマーである。
代替実施形態では、前記小分子は、配列番号５、６、１０、１２、１３又は１７で示される配列を有する合成干渉ＲＮＡである。
追加の実施形態では、前記小分子は、配列番号５、６、１０、１２、１３又は１７で示される配列を含むガイドＲＮＡを用いるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９である．
追加の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、修飾された核酸塩基を含む。
補足の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは一本鎖又は二本鎖である。
別の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドはシュピーゲルマー（Ｓｐｅｉｇｅｌｍｅｒ）又はアプタマーである。
【0007】
一実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、そのホスホジエステル結合、その糖、及びその塩基に少なくとも１つの修飾を含む。
別の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、２’－Ｏ－メチル修飾、２’－アミノ修飾、２’－ハロ修飾、非環式ヌクレオチドアナログ、３’－及び／又は５’－キャップ、そのシトシン塩基の５’メチル化、並びにそのウラシル塩基の４’チオ化の少なくとも１つを含む。
追加の実施形態では、本明細書に包含される組成物は、配列番号１及び配列番号４からなる少なくとも１つの核酸ポリマーを更に含む。
別の実施形態では、本明細書に定義される方法及び組成物は、ＨＢＶサブウイルス粒子（ＳＶＰ）の集合及び／又は分泌を阻害する。
別の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、２’－Ｏ－メチル修飾、２’－アミノ修飾、２’－ハロ修飾、非環式ヌクレオチドアナログ、３’－及び／又は５’－キャップ、そのシトシン塩基の５’メチル化、並びにそのウラシル塩基の４’チオ化の少なくとも１つを含む。
追加の実施形態では、本明細書に包含される組成物は、配列番号１及び配列番号４からなる少なくとも１つの核酸ポリマーを更に含む。
別の実施形態では、本明細書に定義される方法及び組成物は、ＨＢＶサブウイルス粒子（ＳＶＰ）の集合及び／又は分泌を阻害する。
【0008】
更に、本明細書に定義される組成物のいずれかを投与することを含む、患者におけるＨＢＶサブウイルス粒子（ＳＶＰ）の集合及び／又は分泌を阻害する方法が提供される。
更に、患者におけるＨＢＶサブウイルス粒子（ＳＶＰ）の集合及び／又は分泌を阻害するための、本明細書に定義されるような組成物の使用が提供される。
更に、治療を必要とする対象に、カゼインキナーゼ１アイソフォームデルタ、ＤＮＡＪＢ１２、及び微小管－アクチン架橋因子１の活性を阻害する薬学上許容可能な小分子の有効量を投与することを含む、Ｂ型肝炎又はＤ型肝炎感染症の治療のための方法が提供される。
また、患者におけるＨＢＶサブウイルス粒子（ＳＶＰ）の集合及び／又は分泌を阻害するための、本明細書に定義されるような組成物の使用も提供される。
ここで、添付の図面を参照する。
更に、患者におけるＨＢＶサブウイルス粒子（ＳＶＰ）の集合及び／又は分泌を阻害するための、本明細書に定義されるような組成物の使用が提供される。
更に、治療を必要とする対象に、カゼインキナーゼ１アイソフォームデルタ、ＤＮＡＪＢ１２、及び微小管－アクチン架橋因子１の活性を阻害する薬学上許容可能な小分子の有効量を投与することを含む、Ｂ型肝炎又はＤ型肝炎感染症の治療のための方法が提供される。
また、患者におけるＨＢＶサブウイルス粒子（ＳＶＰ）の集合及び／又は分泌を阻害するための、本明細書に定義されるような組成物の使用も提供される。
ここで、添付の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】図１は、ＲＥＰ ２１３９とＲＥＰ ２１４７との選択的タンパク質標的相互作用についてのボルケーノプロットを示す。各点は、ＲＥＰ ２１３９又はＲＥＰ ２１４７と相互作用するタンパク質を表す。色の薄い点は、ｐ＜０．０５の場合の選択比率が＞２（ＲＥＰ ２１３９：ＲＥＰ ２１４７）のタンパク質を示す。色の濃い点は、識別された６つの候補を示す。
【発明を実施するための形態】
【0010】
詳細な説明
本開示によれば、以下、次のタンパク質：カゼインキナーゼＩアイソフォームデルタ、ＤＮＡＪＢ１２、又は微小管－アクチン架橋因子１のうち１つ又は複数の機能を阻害する小分子を使用することにより、ＨＢＶ感染又はＨＢＶ／ＨＤＶ重複感染を阻害するための方法が提供される。
本開示によれば、以下、次のタンパク質：カゼインキナーゼＩアイソフォームデルタ、ＤＮＡＪＢ１２、又は微小管－アクチン架橋因子１のうち１つ又は複数の機能を阻害する小分子を使用することにより、ＨＢＶ感染又はＨＢＶ／ＨＤＶ重複感染を阻害するための方法が提供される。
【0011】
ＨＢＶは世界中で３億人を苦しめており、ＨＢＶ感染に起因する合併症により毎年推定８７万人が死亡している。いくつかの抗ウイルス治療の使用が承認されているが、これらには、治療を受けている患者のごく一部を除いて、感染を永続的に制御し得る治療上有効な免疫応答を引き出すことができるものがない。
ＨＢＶ感染は、以下を含む様々な異なる粒子の生成をもたらす：１）ＨＢＶコア抗原タンパク質（ＨＢｃＡｇ）から構築される、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）で覆われたウイルスカプシドを含む感染性ＨＢＶ成熟ビリオン（又はデーン粒子）、２）ビリオン／カプシド相互作用の欠陥の結果である非感染性フィラメント並びに３）脂質、コレステロール、コレステロールエステル及びＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）から構成される高密度リポタンパク質様粒子である非感染性球状サブウイルス粒子（又はＳＶＰ）。生成された１ウイルス粒子ごとに、１０，０００～１００，０００ＳＶＰが血液中に放出される。従って、ＳＶＰ（及びそれらが運ぶＨＢｓＡｇタンパク質）は、血液中で圧倒的多数のウイルスタンパク質を示す。ＨＢＶ感染細胞は、ＨＢＶ ｅ－抗原（ＨＢｅＡｇ）と呼ばれるプレコアタンパク質の可溶性タンパク質分解産物も分泌する。
ＨＢＶ感染は、以下を含む様々な異なる粒子の生成をもたらす：１）ＨＢＶコア抗原タンパク質（ＨＢｃＡｇ）から構築される、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）で覆われたウイルスカプシドを含む感染性ＨＢＶ成熟ビリオン（又はデーン粒子）、２）ビリオン／カプシド相互作用の欠陥の結果である非感染性フィラメント並びに３）脂質、コレステロール、コレステロールエステル及びＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）から構成される高密度リポタンパク質様粒子である非感染性球状サブウイルス粒子（又はＳＶＰ）。生成された１ウイルス粒子ごとに、１０，０００～１００，０００ＳＶＰが血液中に放出される。従って、ＳＶＰ（及びそれらが運ぶＨＢｓＡｇタンパク質）は、血液中で圧倒的多数のウイルスタンパク質を示す。ＨＢＶ感染細胞は、ＨＢＶ ｅ－抗原（ＨＢｅＡｇ）と呼ばれるプレコアタンパク質の可溶性タンパク質分解産物も分泌する。
【0012】
ＨＤＶは、欠損ウイルスであり、共存するＨＢＶの感染に由来するＨＢｓＡｇを使用してそのウイルスエンベロープを形成し（Ｔａｙｌｏｒ、 ２００６、 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、 ３４４： ７１－７６）、従って、ＨＤＶ感染は、ＨＢＶ感染を随伴する対象でのみ発生し得る。無症候性ＨＢＶ保有者及び慢性ＨＢＶ関連肝臓疾患におけるＨＤＶ重複感染の発生率は、ＨＢＶ感染の発生率が低い国では低いが、ＨＢＶ感染の発生率が高い国のＨＢＶ感染者では重大な合併症であり、肝臓疾患から肝硬変への進行速度を加速する可能性がある。ＨＤＶウイルス（ＨＤＶ ｖｉｒｕｓ）を直接標的とする特定の承認された薬剤がなく、承認されたＨＢＶ治療薬との併用療法に対する患者の応答もＨＢＶ単独感染患者よりも劣っているため、ＨＢＶ感染において満たされていない医療の必要性はＨＢＶ／ＨＤＶ重複感染者において更に差し迫っている。
【0013】
現在承認されているＨＢＶ治療としては、インターフェロン－α又はチモシンα１に基づく免疫療法、及びヌクレオシド／ヌクレオチドアナログによるＨＢＶポリメラーゼの阻害によるウイルス産生の抑制が挙げられる。ＨＢＶポリメラーゼ阻害薬は、感染性ビリオン産生の減少に有効であるが、ＨＢｓＡｇの減少に対する効果はほとんど若しくは全くなく、又は限られた数の患者における長期治療でＨＢｓＡｇを極めて緩徐に減少させるだけである（Ｆｕｎｇら、 ２０１１、 Ａｍ． Ｊ． Ｇａｓｔｅｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、 １０６： １７６６－１７７３； Ｒｅｉｊｎｄｅｒｓら、 ２０１１、 Ｊ． Ｈｅｐａｔｏｌ．、 ５４： ４４９－４５４；）。ＨＢＶポリメラーゼ阻害薬の主な効果は、感染性ビリオンに存在する部分的二本鎖ＤＮＡへのプレゲノムウイルスｍＲＮＡの変換をブロックすることである。インターフェロンに基づく免疫療法は、感染性ウイルスの減少と血液からのＨＢｓＡｇの除去を達成することができるが、治療を受けた対象のごく一部で可能であるにすぎない。
ＨＢｓＡｇは、ＨＢＶ感染及びＨＢＶ／ＨＤＶ重複感染において重要な役割を果たす。ビリオン形成に不可欠な構造成分としての役割とは別に、ＨＢｓＡｇはまた、ウイルスカプシド及びゲノムを欠いた、主にＨＢｓＡｇを血液中に送達する働きをするように見えるサブウイルス粒子（ＳＶＰ）の形で感染者の血液中に大量に放出される。ＳＶＰは感染細胞からデーン粒子の１０，０００～１００，０００倍過剰に分泌され、これにより、ＳＶＰはＨＢｓＡｇ抗体（抗ＨＢｓ）を効果的に隔離することができるため、血液中のＨＢＶ又はＨＤＶウイルスは適応免疫による認識を逃れることができる。いくつかの研究はまた、ＨＢｓＡｇがＨＢＶ感染に対する適応免疫応答及び自然免疫応答の活性化を直接ブロックすることを示唆している（Ｖａｉｌｌａｎｔ、 ＡＣＳ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２０２０、１２月１０日に印刷前にオンラインで公開）。ヒトＨＢＶ感染におけるこの機能性及び免疫療法薬の活性に対するその影響の存在並びにＨＢＶ／ＨＤＶ重複感染におけるこれらの抗ウイルス効果の追加の適用性は、米国公開特許第２０１４／００６５１０２号明細書で従前に記載されており、これは参照により全体として本明細書に援用される。
ＨＢｓＡｇは、ＨＢＶ感染及びＨＢＶ／ＨＤＶ重複感染において重要な役割を果たす。ビリオン形成に不可欠な構造成分としての役割とは別に、ＨＢｓＡｇはまた、ウイルスカプシド及びゲノムを欠いた、主にＨＢｓＡｇを血液中に送達する働きをするように見えるサブウイルス粒子（ＳＶＰ）の形で感染者の血液中に大量に放出される。ＳＶＰは感染細胞からデーン粒子の１０，０００～１００，０００倍過剰に分泌され、これにより、ＳＶＰはＨＢｓＡｇ抗体（抗ＨＢｓ）を効果的に隔離することができるため、血液中のＨＢＶ又はＨＤＶウイルスは適応免疫による認識を逃れることができる。いくつかの研究はまた、ＨＢｓＡｇがＨＢＶ感染に対する適応免疫応答及び自然免疫応答の活性化を直接ブロックすることを示唆している（Ｖａｉｌｌａｎｔ、 ＡＣＳ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２０２０、１２月１０日に印刷前にオンラインで公開）。ヒトＨＢＶ感染におけるこの機能性及び免疫療法薬の活性に対するその影響の存在並びにＨＢＶ／ＨＤＶ重複感染におけるこれらの抗ウイルス効果の追加の適用性は、米国公開特許第２０１４／００６５１０２号明細書で従前に記載されており、これは参照により全体として本明細書に援用される。
【0014】
慢性ＨＢＶ感染症のもう１つの重要な特徴は、ＨＢＶミニ染色体とも呼ばれる共有結合性閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）と、染色体に組み込まれたＨＢＶ ＤＮＡとからなる感染細胞の核にＨＢＶ遺伝情報の安定した貯蔵庫を確立することである。ｃｃｃＤＮＡは、核内に複数のコピーで存在し、全てのウイルスタンパク質をコードするｍＲＮＡを生成するための転写鋳型として働き、新しいビリオンを生成するための未成熟ゲノム（プレゲノムＲＮＡ）として働く。組み込まれたＨＢＶ ＤＮＡは、プレゲノムＲＮＡを生成することができないため、ビリオンを生成することができない。しかしながら、ウイルス複製を直接標的とする抗ウイルスアプローチの影響を受けない独立したＨＢｓＡｇ（及びＳＶＰ）供給源として存在し得る。
【0015】
用語「オリゴヌクレオチド（ＯＮ）」とは、リボ核酸（ＲＮＡ）及び／又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマー又はポリマーを指す。この用語には、修飾された核酸塩基（５’メチルシトシン及び４’チオウラシルを含む）、糖及び共有結合性ヌクレオシド間（主鎖）結合からなるＯＮ、並びに同様に働く非天然部分を有するＯＮが含まれる。そのような修飾された又は置換されたＯＮは、例えば、免疫反応性の低下、細胞取り込みの増強、核酸標的に対する親和性の増強（アンチセンスＯＮ、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡに関して）及び／又はヌクレアーゼ媒介分解に対する安定性の増加などの望ましい特性のため、天然形態よりも好ましい場合がある。ＯＮは、二本鎖である場合もある。また、ＯＮには、アンチセンスオリゴヌクレオチド、シュピーゲルマー、アプタマー及びｍｉＲＮＡなどの一本鎖分子だけでなく、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）などの二本鎖分子も含まれる。
ＯＮは、様々な修飾、例えば、安定化修飾を含むことができ、従って、そのホスホジエステル結合及び／又はその糖、及び／又はその塩基に少なくとも１つの修飾を含むことができる。例えば、ＯＮは、限定されるものではないが、１若しくは複数の修飾を含み得るか、又は列挙される修飾を含む全ての結合若しくは糖若しくは塩基を含むように完全に修飾され得る。修飾された結合には、ホスホロチオエート結合及びホスホロジチオエート結合が含まれ得る。修飾された結合は有用であるが、ＯＮには、ホスホジエステル結合が含まれ得る。追加の有用な修飾には、限定されるものではないが、２’－Ｏ－アルキル修飾（２’－Ｏ－メチル修飾など）、２’ Ｏ－メトキシエチル（２’ＭＯＥ）、２’－アミノ修飾、２’－ハロ修飾（２’－フルオロなど）を含む糖の２’位での修飾；非環式ヌクレオチドアナログが含まれる。ロックド核酸などの他の２’修飾も当技術分野では知られており、使用することができる。具体的には、ＯＮは、全体に修飾された結合を有するか、又は各結合が修飾されており（例えば、ホスホロチオエート）；３’－及び／又は５’－キャップを有し；末端３’－５’結合を含み；そのＯＮは、リンカー（単数又は複数）によって結合された２つ以上のＯＮ配列からなるコンカテマーであるか、又はそれを含む。塩基修飾には、シトシン塩基の５’メチル化（５’メチルシトシン又はヌクレオチドに関しては、５’メチルシチジン）及び／又はウラシル塩基の４’チオ化（４’チオウラシル又はヌクレオチドに関しては、４’チオウリジン）が含まれ得る。オリゴヌクレオチドがホスホロチオエート結合、２’リボース修飾（２’Ｏ－メチル化など）及び修飾塩基（５’メチルシトシンなど）を有するなど、合成条件に化学的適合性がある場合には、化学的適合性がある異なる修飾結合を組み合わせることができる。更に、ＯＮは、これらの異なる修飾の全てで完全に修飾されていてよい（例えば、各結合がホスホロチオエート化され、各リボースが２’修飾され、各塩基が修飾されている）。
ＯＮは、様々な修飾、例えば、安定化修飾を含むことができ、従って、そのホスホジエステル結合及び／又はその糖、及び／又はその塩基に少なくとも１つの修飾を含むことができる。例えば、ＯＮは、限定されるものではないが、１若しくは複数の修飾を含み得るか、又は列挙される修飾を含む全ての結合若しくは糖若しくは塩基を含むように完全に修飾され得る。修飾された結合には、ホスホロチオエート結合及びホスホロジチオエート結合が含まれ得る。修飾された結合は有用であるが、ＯＮには、ホスホジエステル結合が含まれ得る。追加の有用な修飾には、限定されるものではないが、２’－Ｏ－アルキル修飾（２’－Ｏ－メチル修飾など）、２’ Ｏ－メトキシエチル（２’ＭＯＥ）、２’－アミノ修飾、２’－ハロ修飾（２’－フルオロなど）を含む糖の２’位での修飾；非環式ヌクレオチドアナログが含まれる。ロックド核酸などの他の２’修飾も当技術分野では知られており、使用することができる。具体的には、ＯＮは、全体に修飾された結合を有するか、又は各結合が修飾されており（例えば、ホスホロチオエート）；３’－及び／又は５’－キャップを有し；末端３’－５’結合を含み；そのＯＮは、リンカー（単数又は複数）によって結合された２つ以上のＯＮ配列からなるコンカテマーであるか、又はそれを含む。塩基修飾には、シトシン塩基の５’メチル化（５’メチルシトシン又はヌクレオチドに関しては、５’メチルシチジン）及び／又はウラシル塩基の４’チオ化（４’チオウラシル又はヌクレオチドに関しては、４’チオウリジン）が含まれ得る。オリゴヌクレオチドがホスホロチオエート結合、２’リボース修飾（２’Ｏ－メチル化など）及び修飾塩基（５’メチルシトシンなど）を有するなど、合成条件に化学的適合性がある場合には、化学的適合性がある異なる修飾結合を組み合わせることができる。更に、ＯＮは、これらの異なる修飾の全てで完全に修飾されていてよい（例えば、各結合がホスホロチオエート化され、各リボースが２’修飾され、各塩基が修飾されている）。
【0016】
本明細書に包含されるように、用語「核酸ポリマー」又はＮＡＰは、核酸標的とハイブリダイズするか、又は特定のタンパク質への結合をもたらす配列特異的二次構造を採用するための、配列特異的機能がない一本鎖ＯＮである。ＮＡＰの生化学的活性は、存在するヌクレオチドの特定の順序に由来する特定の二次／三次ＯＮ構造を必要とする、ＯＮのＴｏｌｌ様受容体認識、標的核酸とのハイブリダイゼーション又はアプタマー相互作用に依存しない。ＮＡＰは、米国特許第８，０６７，３８５号、米国特許第８，００８，２７０号、米国特許第８，５１３，２１１号、及び米国特許第８，００８，２６９号に記載されているように、塩基及び又は結合及び又は糖修飾を含むことができる。ＮＡＰは、抗ウイルス活性を有するためにホスホロチオ化を必要とし、抗ウイルス効果を発揮するために長さ（一般には、２０ヌクレオチドを超える）を必要とする。
一本鎖又は二本鎖のアンチセンスＯＮ（例えば、合成干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））は、アンチセンスＯＮと目的のｍＲＮＡの標的部分の配列との特異的ハイブリダイゼーションによって目的のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の特定の領域を標的とするように設計される。アンチセンスＯＮが細胞に導入されると、ｍＲＮＡ上に又はｍｉＲＮＡとの二本鎖領域が形成され、この特定のｍＲＮＡ又はｍｉＲＮＡはＲＮＡｓｅ Ｈにより分解に向かう。ｓｉＲＮＡが細胞に導入される（又はｓｈＲＮＡが細胞内で発現される）と、アンチセンス鎖（又はガイド鎖）はＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）に組み込まれる。これは、標的ｍＲＮＡ上の相補領域とのガイド鎖標的化ハイブリダイゼーションを使用して、アルゴノートと呼ばれるＲＩＳＣの触媒成分による切断を行う。アンチセンス及びｓｉＲＮＡの同定、設計及び最適化は当技術分野で非常に明確に定義されており、標的ｍＲＮＡの配列のみを必要とする。
一本鎖又は二本鎖のアンチセンスＯＮ（例えば、合成干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））は、アンチセンスＯＮと目的のｍＲＮＡの標的部分の配列との特異的ハイブリダイゼーションによって目的のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の特定の領域を標的とするように設計される。アンチセンスＯＮが細胞に導入されると、ｍＲＮＡ上に又はｍｉＲＮＡとの二本鎖領域が形成され、この特定のｍＲＮＡ又はｍｉＲＮＡはＲＮＡｓｅ Ｈにより分解に向かう。ｓｉＲＮＡが細胞に導入される（又はｓｈＲＮＡが細胞内で発現される）と、アンチセンス鎖（又はガイド鎖）はＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）に組み込まれる。これは、標的ｍＲＮＡ上の相補領域とのガイド鎖標的化ハイブリダイゼーションを使用して、アルゴノートと呼ばれるＲＩＳＣの触媒成分による切断を行う。アンチセンス及びｓｉＲＮＡの同定、設計及び最適化は当技術分野で非常に明確に定義されており、標的ｍＲＮＡの配列のみを必要とする。
【0017】
ＣＲＳＰＲ－Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９タンパク質）の働きと、目的の遺伝子を標的とするように操作されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を使用する。ｇＲＮＡは、協力して、Ｃａｓ９活性を目的の遺伝子に向け、欠陥配列にスプライシングし、従って、機能的ｍＲＮＡの転写を永久に妨げる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の同定、設計及び最適化は当技術分野で非常に明確に定義されており、標的遺伝子の配列のみを必要とする。
【0018】
オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｏｇｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）アプタマーは、これらのオリゴヌクレオチド（ｏｌｏｇｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）によって形成される三次元構造（ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）のために、配列特異的且つ選択的なタンパク質相互作用を採用するオリゴヌクレオチドである。アプタマーは、合理的に設計するか、又は試験管内進化法（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）（ＳＥＬＥＸ法）及び目的のタンパク質標的を使用して縮重ライブラリから選択することができる。アプタマーはまた、シュピーゲルマーとしても知られるヌクレアーゼ分解（ｄｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）に対して高い耐性を有するＬ－リボースヌクレオチドから構築することもできる。アプタマーはまた、オリゴヌクレオチドについて上記のように（ｄｅｓｃｒｉｖｅｄ ａｂｏｖｅ）修飾して、タンパク質相互作用の特異性及び／又は強度を最適化し、それらの医薬適合性を最適化する（ｏｐｒｔｍｉｚｅ）ことができる。
本開示は、以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されるであろう。
本開示は、以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されるであろう。
【実施例】
【0019】
実施例Ｉ
ＮＡＰの標的インタラクターの同定
ＮＡＰの抗ウイルス活性の生物学的基礎は、これらのポリマーと両親媒性アルファヘリックスの露出した疎水性表面との相互作用である（Ｖａｉｌｌａｎｔ、 ２０１９、 ＡＣＳ Ｉｎｆ Ｄｉｓ、 １０： ６７５－６８７）。現在のリードＮＡＰは、ＲＥＰ ２１３９であり（表１参照；配列番号１）、配列（２’ＯＭｅ アデノシン、２’ＯＭｅ－５－Ｍｅ シチジン）20を有する完全にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチドである。このＮＡＰは、ＨＢｅＡｇ陽性及び陰性の慢性感染症及びＨＢＶ／ＨＤＶ重複感染症において、安全で、忍容性が高く且つ複数のＨＢＶ遺伝子型の感染に対して活性が強いことが示されている（Ｖａｉｌｌａｎｔ、 ２０１９、 ＡＣＳ Ｉｎｆ Ｄｉｓ、 １０： ６７５－６８７）。ポリマーの長さに沿った２’ＯＭｅ修飾の存在は、抗ウイルス活性に影響を与えない（Ａｌ－Ｍａｈｔａｂら、 ２０１６、 ＰＬｏＳ ＯＮＥ、 １１： ｅ０１５６６６７、 Ｒｏｅｈｌら、 ２０１７、 Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ、 ８： １－１２）が、ポリマーの長軸に沿って水和を増加させ、水溶性を改善し、標的外相互作用を減少させる。ＮＡＰ ＲＥＰ ２１４７（配列番号２）は、不活性なＲＥＰ ２１３９の非ホスホロチオエート化対応物である（表１参照）。ＮＡＰ ＲＥＰ ２１７９（配列番号３）は、ＲＥＰ ２１３９の２０量体対応物であり、これもまた不活性である（Ｂｌａｎｃｈｅｔら、 ２０１９、 Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．、 １６４： ９７－１０５）。これら３つのＮＡＰは、ＳＶＰの集合及び又は分泌に関与する宿主タンパク質標的を同定するための生物学的に検証された選択ツールを提供する。
ＮＡＰの標的インタラクターの同定
ＮＡＰの抗ウイルス活性の生物学的基礎は、これらのポリマーと両親媒性アルファヘリックスの露出した疎水性表面との相互作用である（Ｖａｉｌｌａｎｔ、 ２０１９、 ＡＣＳ Ｉｎｆ Ｄｉｓ、 １０： ６７５－６８７）。現在のリードＮＡＰは、ＲＥＰ ２１３９であり（表１参照；配列番号１）、配列（２’ＯＭｅ アデノシン、２’ＯＭｅ－５－Ｍｅ シチジン）20を有する完全にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチドである。このＮＡＰは、ＨＢｅＡｇ陽性及び陰性の慢性感染症及びＨＢＶ／ＨＤＶ重複感染症において、安全で、忍容性が高く且つ複数のＨＢＶ遺伝子型の感染に対して活性が強いことが示されている（Ｖａｉｌｌａｎｔ、 ２０１９、 ＡＣＳ Ｉｎｆ Ｄｉｓ、 １０： ６７５－６８７）。ポリマーの長さに沿った２’ＯＭｅ修飾の存在は、抗ウイルス活性に影響を与えない（Ａｌ－Ｍａｈｔａｂら、 ２０１６、 ＰＬｏＳ ＯＮＥ、 １１： ｅ０１５６６６７、 Ｒｏｅｈｌら、 ２０１７、 Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ、 ８： １－１２）が、ポリマーの長軸に沿って水和を増加させ、水溶性を改善し、標的外相互作用を減少させる。ＮＡＰ ＲＥＰ ２１４７（配列番号２）は、不活性なＲＥＰ ２１３９の非ホスホロチオエート化対応物である（表１参照）。ＮＡＰ ＲＥＰ ２１７９（配列番号３）は、ＲＥＰ ２１３９の２０量体対応物であり、これもまた不活性である（Ｂｌａｎｃｈｅｔら、 ２０１９、 Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．、 １６４： ９７－１０５）。これら３つのＮＡＰは、ＳＶＰの集合及び又は分泌に関与する宿主タンパク質標的を同定するための生物学的に検証された選択ツールを提供する。
【0020】
【表1】
【0021】
ＨｅｐＧ２．２．１５細胞は、ビリオン及びＳＶＰの産生を再現するＨＢＶ感染症のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルであり、ＮＡＰの生物学的応答はｉｎ ｖｉｖｏ研究及びヒト研究の両方で観察されたものに匹敵する（Ａｌ－Ｍａｈｔａｂら、 ２０１６、 ＰＬｏＳ ＯＮＥ、 １１： ｅ０１５６６６７、 Ｂａｚｉｎｅｔら、 ２０１７、 Ｌａｎｃｅｔ Ｇａｓｔｒｏ Ｈｅｐａｔｏｌ、 １２： ８７７－８８９； Ｑｕｉｎｅｔら、 ２０１８、 Ｈｅｐａｔｏｌ、 ６７： ２１２７－２１４０； Ｂｌａｎｃｈｅｔ ａｔ ａｌ．、 ２０１９、 Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ、 １６４： ９７－１０５）。これらの細胞から細胞溶解物を調製し、ビオチン化したＲＥＰ ２１３９、ＲＥＰ ２１４７及びＲＥＰ ２１７９で三反復でプローブした。各ＮＡＰについて、結合したタンパク質を質量分析により同定した。次に、これら３つのタンパク質サブセットに選択法を適用して、ＲＥＰ ２１４７よりもＲＥＰ ２１３９に選択的に結合するタンパク質及びＲＥＰ ２１７９よりもＲＥＰ ２１３９に選択的に結合するタンパク質を同定した。これらの分析についてのボルケーノプロットを図１及び２に示している。これらの図は、相対濃縮比（ｘ軸）とこの濃縮の統計的有意性をプロットしたものである。この選択法によりＲＥＰ ２１４７よりもＲＥＰ ２１３９に選択的に結合する２９９のタンパク質候補とＲＥＰ ２１７９よりもＲＥＰ ２１３９に選択的に結合する８２の候補を同定した。
【0022】
これらの同定されたタンパク質から、ＲＥＰ ２１４７よりもＲＥＰ ２１３９且つＲＥＰ ２１７９よりもＲＥＰ ２１３９によって結合されることについて最大の選択性を示し、これまでに特徴付けられたＤＮＡ／ＲＮＡ結合活性がない最終候補を同定した。これらのタンパク質を以下のように同定した：
１．微小管に基づく小胞輸送の調節に関与するカゼインキナーゼＩアイソフォームデルタ（ＣＳＮＫ１Ｄ）
２．ＤＮＡＪＢ１２（これまで特徴付けられていなかった機能を備えたＥＲ常在性シャペロン）
３．小胞形成及びＥＲからゴルジ体への逆行性輸送に関与するコートマーサブユニットイプシロン（ＣＯＰＥ）、
４．微小管に基づく小胞輸送の調節に関与するカゼインキナーゼＩアイソフォームアルファ（ＣＳＮＫ１Ａ）
５．トランスデューシンベータ様タンパク質２（ＴＢＬ－２）＿（ＥＲストレス応答のシグナル伝達に関与するＥＲ常在性内在性膜タンパク質）
６．微小管－アクチン架橋因子１（ＭＣＡＦ－１）（細胞周辺での細胞骨格相互作用に関与するタンパク質）
上記タンパク質とＮＡＰとの相互作用は全て、ＮＡＰとの抗ウイルス活性で観察されたものと同じ構造結合関係を示している。ＨＢＶに対してｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでＮＡＰについて確立された構造機能関係に従う新規ＮＡＰインタラクターを同定したのはこのスクリーニングアプローチが初めてであった。これらの標的は全て、細胞内タンパク質の形態形成又は輸送及び分泌のいずれかに関与しており、ＨＢＶ ＳＶＰの形態形成及び分泌を阻害するＮＡＰの標的となるタンパク質の候補である。従って、これらの新規タンパク質は全て、ＳＶＰの集合及び分泌を阻害するための適当に特徴付けられた潜在的な治療標的を表している。前記タンパク質の機能の阻害（小分子に基づくアプローチを使用）又は前記タンパク質の産生の減少（アンチセンスオリゴヌクレオチド又は合成干渉ＲＮＡを使用）を含むＨＢＶ感染症の治療のための方法及び組成物は、ＨＤＶ感染症に対して等しく効果的である。
１．微小管に基づく小胞輸送の調節に関与するカゼインキナーゼＩアイソフォームデルタ（ＣＳＮＫ１Ｄ）
２．ＤＮＡＪＢ１２（これまで特徴付けられていなかった機能を備えたＥＲ常在性シャペロン）
３．小胞形成及びＥＲからゴルジ体への逆行性輸送に関与するコートマーサブユニットイプシロン（ＣＯＰＥ）、
４．微小管に基づく小胞輸送の調節に関与するカゼインキナーゼＩアイソフォームアルファ（ＣＳＮＫ１Ａ）
５．トランスデューシンベータ様タンパク質２（ＴＢＬ－２）＿（ＥＲストレス応答のシグナル伝達に関与するＥＲ常在性内在性膜タンパク質）
６．微小管－アクチン架橋因子１（ＭＣＡＦ－１）（細胞周辺での細胞骨格相互作用に関与するタンパク質）
上記タンパク質とＮＡＰとの相互作用は全て、ＮＡＰとの抗ウイルス活性で観察されたものと同じ構造結合関係を示している。ＨＢＶに対してｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでＮＡＰについて確立された構造機能関係に従う新規ＮＡＰインタラクターを同定したのはこのスクリーニングアプローチが初めてであった。これらの標的は全て、細胞内タンパク質の形態形成又は輸送及び分泌のいずれかに関与しており、ＨＢＶ ＳＶＰの形態形成及び分泌を阻害するＮＡＰの標的となるタンパク質の候補である。従って、これらの新規タンパク質は全て、ＳＶＰの集合及び分泌を阻害するための適当に特徴付けられた潜在的な治療標的を表している。前記タンパク質の機能の阻害（小分子に基づくアプローチを使用）又は前記タンパク質の産生の減少（アンチセンスオリゴヌクレオチド又は合成干渉ＲＮＡを使用）を含むＨＢＶ感染症の治療のための方法及び組成物は、ＨＤＶ感染症に対して等しく効果的である。
【0023】
実施例ＩＩ
ＮＡＰの標的インタラクターの検証
ＳＶＰの集合及び又は分泌における上記で同定されたＮＡＰインタラクターの各々の潜在的な役割を調べるために、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞でのそれらの発現を、ｓｈＲＮＡアプローチを使用してノックダウンした。ＮＡＰ相互作用がサイズ選択的ではない外れ値のタンパク質（ＣＯＰＡ）を陰性対照として選択した。
レンチウイルスの構築物を、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の発現用ベクターとして使用した。ｐｓＰＡＸ２、ｐＭＤ２．Ｇ、及びｐＲＳＶ－ＲＥＶプラスミドはＡｄｄｇｅｎｅから購入した。特定のノックダウンについての標的配列（表２）は、ＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）オンラインツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）を使用して確認し、レンチウイルスプラスミドＭＩＳＳＩＯＮ ｐＬＫＯ．１－ｐｕｒｏにクローニングした。レンチウイルスベクターは、パッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２、ｐＭＤ２．Ｇ、及びｐＲＳＶ－ＲＥＶとともに、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のｐＬＫＯ．１－ｐｕｒｏ誘導体でのトランスフェクションによって作出した。これらのトランスフェクト細胞からの上清を、トランスフェクション後２日目に回収し、清澄化し、濾過した（０．４５μｍ）。
ＮＡＰの標的インタラクターの検証
ＳＶＰの集合及び又は分泌における上記で同定されたＮＡＰインタラクターの各々の潜在的な役割を調べるために、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞でのそれらの発現を、ｓｈＲＮＡアプローチを使用してノックダウンした。ＮＡＰ相互作用がサイズ選択的ではない外れ値のタンパク質（ＣＯＰＡ）を陰性対照として選択した。
レンチウイルスの構築物を、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の発現用ベクターとして使用した。ｐｓＰＡＸ２、ｐＭＤ２．Ｇ、及びｐＲＳＶ－ＲＥＶプラスミドはＡｄｄｇｅｎｅから購入した。特定のノックダウンについての標的配列（表２）は、ＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）オンラインツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）を使用して確認し、レンチウイルスプラスミドＭＩＳＳＩＯＮ ｐＬＫＯ．１－ｐｕｒｏにクローニングした。レンチウイルスベクターは、パッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２、ｐＭＤ２．Ｇ、及びｐＲＳＶ－ＲＥＶとともに、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のｐＬＫＯ．１－ｐｕｒｏ誘導体でのトランスフェクションによって作出した。これらのトランスフェクト細胞からの上清を、トランスフェクション後２日目に回収し、清澄化し、濾過した（０．４５μｍ）。
【0024】
【表2】
【0025】
ＨｅｐＧ２．２．１５細胞は、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で３７℃にて、１０％ウシ胎仔血清、１％グルタミン及び０．１％ゲンタマイシンを添加したウィリアム培地Ｅ（ＷＭＥ）で維持した。トランスフェクションの２４時間前に、細胞をトリプシン処理し、ウェルあたり１×１０5細胞の密度で２４ウェルプレートに播種した。ＨｅｐＧ２．２．１５標的細胞に８μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ）の存在下でレンチウイルス構築物を１６時間接種し、更に３日間培養した。対照として、モック細胞にｓｈＲＮＡ配列を含まないレンチウイルスベクター（ｐＬＫＯ．１ ＳＨＣ００１又はＳＨＣ００２）を形質導入した。次に、細胞を回収し、溶解し、ＲＴ－ｑＰＣＲ、ＢＣＡ法によるプロテオーム定量及びＨＢｓＡｇ ＥＬＩＳＡにより分析した。細胞溶解物中及び／又は上清中のＨＢｓＡｇレベルは、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標）ＨＢｓＡｇ ＥＩＡ ３．０（Ｂｉｏｒａｄ）を使用した酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。定量は、ＨｅｐＧ２．２．１５上清の希釈からの標準曲線を使用して行った。全ての結果を、ＢＣＡタンパク質アッセイによって決定された総細胞タンパク質に従って正規化した。
【0026】
これらの実験の結果により、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞からのＨＢｓＡｇの放出を阻害する３つのＮＡＰインタラクターを同定した（図３）。これらのインタラクターは、カゼインキナーゼ１デルタ（ＣＳＮＫ１Ｄ）、ＤＮＡＪＢ１２及び微小管－アクチン架橋因子１（ＭＣＡＦ１）である。従って、小分子を使用してこれらのタンパク質の機能を直接妨害するか、又はアンチセンス若しくはｓｉＲＮＡを使用してこれらのタンパク質のｍＲＮＡを分解するか、又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用してこれらのタンパク質の遺伝子を破壊するための方法は、当業者ならば簡単に導き出すことができる。アンチセンス、ＲＮＡｉ又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によるＨＢＶ及びＨＢＶ／ＨＤＶ感染症の治療のための組成物及び方法は、上記で表２に記載されているような、ＣＳＮＫ１、ＤＮＡＪＢ１２若しくはＭＣＡＦ－１の標的配列、又は当技術分野で周知の確立された方法を使用したこれらの標的の任意の他の適当なｍＲＮＡ若しくは遺伝子配列の使用を含むことができる。
【0027】
本開示をその特定の実施形態に関連して説明してきたが、それは更なる修飾が可能であり、本願は、当技術分野における既知の又は慣習的な実施の範囲内であり、且つ、前述の本質的な特徴に適用される可能性があり、且つ、添付の特許請求の範囲に従うような本開示からのそのような逸脱を含む任意の変形、使用、又は適合を包含することを意図することが理解される。
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】
【国際調査報告】