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特表2023-515469ＡＡＶ結合ポリペプチドを含む精製マトリックス及びその使用方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-13
(54)【発明の名称】ＡＡＶ結合ポリペプチドを含む精製マトリックス及びその使用方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20230406BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230406BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230406BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20230406BHJP
C07K 14/78 20060101ALI20230406BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230406BHJP
C12N 7/00 20060101ALI20230406BHJP
C12N 7/02 20060101ALI20230406BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12 ZNA
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C07K14/705
C07K14/78
C07K19/00
C12N7/00
C12N7/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022549809
(86)(22)【出願日】2021-02-19
(85)【翻訳文提出日】2022-10-17
(86)【国際出願番号】 US2021018812
(87)【国際公開番号】W WO2021168276
(87)【国際公開日】2021-08-26
(31)【優先権主張番号】62/978,616
(32)【優先日】2020-02-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/081,405
(32)【優先日】2020-09-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．プルロニック
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522327887
【氏名又は名称】アイソレア バイオ，インコーポレイテッド
(71)【出願人】
【識別番号】591101777
【氏名又は名称】デューク ユニバーシティ
【氏名又は名称原語表記】ＤＵＫＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】ルジンブール，ケリー エム．
(72)【発明者】
【氏名】ズリッキー，マイケル
(72)【発明者】
【氏名】エルモア，ザッカリー
(72)【発明者】
【氏名】アソカン，アラヴィンド
【テーマコード（参考）】
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA95X
4B065AC20
4B065BA30
4B065CA24
4B065CA44
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA50
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA10
4H045GA15
4H045GA21
(57)【要約】
本明細書には、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合ポリペプチドを含む精製マトリックス及びその使用方法が開示される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
相挙動を有するポリペプチドにカップリングしたＡＡＶ結合ポリペプチドを含む精製マトリックスであって、前記ＡＡＶ結合ポリペプチドが、ＡＡＶ受容体（ＡＡＶＲ）のエクトドメイン、又はそのＡＡＶ結合断片若しくは誘導体を含む、精製マトリックス。
【請求項2】
前記ＡＡＶＲが、ヒト、サル、オランウータン、又はマウスＡＡＶＲ、又はその誘導体である、請求項１に記載の精製マトリックス。
【請求項3】
前記ＡＡＶ結合ポリペプチドが、配列番号２８～３２、３７～４１、４３～４７、及び５２～８６のうちのいずれか１つを含む、請求項１に記載の精製マトリックス。
【請求項4】
前記ＡＡＶ結合ポリペプチドが、配列番号２９、３３、５２、６４のうちのいずれか１つの配列、又は配列番号２９、３３、５２、又は６４のうちのいずれか１つと比べて最大２５個のアミノ酸突然変異を含む配列を含む、請求項１に記載の精製マトリックス。
【請求項5】
前記ＡＡＶ結合ポリペプチドが、多発性嚢胞腎２（ＰＫＤ２）ドメイン、又はその断片を含む、請求項１に記載の精製マトリックス。
【請求項6】
前記ＡＡＶ結合ポリペプチドが、前記相挙動を有するポリペプチドに可逆的にカップリングされる、請求項１～５のいずれか一項に記載の精製マトリックス。
【請求項7】
前記ＡＡＶ結合ポリペプチドが、前記相挙動を有するポリペプチドに共有結合的にカップリングされる、請求項１～５のいずれか一項に記載の精製マトリックス。
【請求項8】
前記相挙動のあるポリペプチドが、エラスチン様ポリペプチドである、請求項１～７のいずれか一項に記載の精製マトリックス。
【請求項9】
前記相挙動のあるポリペプチドが、配列（Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｘａａ－Ｇｌｙ）ｎ（配列番号１０）を有するペンタペプチドリピート、又はそのランダム化されたスクランブル類似体を含み；式中、Ｘａａが、プロリンを除く任意のアミノ酸であってよく、式中、ｎが、１以上３６０以下の間にある整数である、請求項１～７のいずれか一項に記載の精製マトリックス。
【請求項10】
前記相挙動のあるポリペプチドが、ａ．（ＧＲＧＤＳＰＹ）ｎ（配列番号１）
ｂ．（ＧＲＧＤＳＰＨ）ｎ（配列番号２）
ｃ．（ＧＲＧＤＳＰＶ）ｎ（配列番号３）
ｄ．（ＧＲＧＤＳＰＹＧ）ｎ（配列番号４）
ｅ．（ＲＰＬＧＹＤＳ）ｎ（配列番号５）
ｆ．（ＲＰＡＧＹＤＳ）ｎ（配列番号６）
ｇ．（ＺＺＰＸＸＸＸＧＺ）ｍ（配列番号１４８）；
ｈ．（ＧＲＧＤＳＹＰ）ｎ（配列番号７）
ｉ．（ＧＲＧＤＳＰＹＱ）ｎ（配列番号８）
ｊ．（ＧＲＧＮＳＰＹＧ）ｎ（配列番号９）
ｋ．（ＧＶＧＶＰ）ｎ（配列番号１１）；
ｌ．（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１２）；
ｍ．（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１３）；
ｎ．（ＧＶＧＶＰＧＷＧＶＰＧＶＧＶＰＧＷＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１４）；
ｏ．（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＥＧＶＰＧＦＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１５）；
ｐ．（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＫＧＶＰＧＦＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１６）；及び
ｑ．（ＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰ）ｍ（配列番号１７）
から選択されるアミノ酸配列；
又はそのランダム化されたスクランブル類似体
（式中：
ｎは、２０～３６０の範囲の整数であり；及び
ｍは、４～２５の範囲の整数である）を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の精製マトリックス。
【請求項11】
前記相挙動のあるポリペプチドが、（ａ）（ＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１４３）；
（ｂ）（ＺＺＰＸＧＺ）ｍ（配列番号１４９）；
（ｃ）（ＺＺＰＸＸＧＺ）ｍ（配列番号１５０）；又は
（ｄ）（ＺＺＰＸＸＸＧＺ）ｍ（配列番号１５１）
（式中、ｍは、１０以上１６０以下の間にある整数であり、式中、Ｘは、存在する場合に、プロリン又はグリシンを除く任意のアミノ酸であり、及び式中、Ｚは、存在する場合に、任意のアミノ酸である）から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の精製マトリックス。
【請求項12】
前記相挙動のあるポリペプチドが、（ａ）（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１４４）；又は
（ｂ）（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１４６）；
（式中、ｍは、２以上３２以下の間にある整数である）から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の精製マトリックス。
【請求項13】
前記相挙動のあるポリペプチドが、（ａ）（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１４４）（式中、ｍは、８又は１６である）；
（ｂ）（ＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰ）ｍ（配列番号１４５）（式中、ｍは、５以上８０以下の間にある整数である）；又は
（ｃ）（ＧＸＧＶＰ）ｍ（配列番号１４７）（式中、ｍは、１０以上１６０以下の間にある整数であり、及び式中、リピート毎にＸは、独立に、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びセリンからなる群から選択される）から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の精製マトリックス。
【請求項14】
前記精製マトリックスが、配列番号２９、配列番号５２、又は配列番号６４のアミノ酸配列を有するＡＡＶ結合ポリペプチドと、配列番号８８のアミノ酸又は（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（式中、ｍは１６である）の配列（配列番号１２）を含む相挙動のあるポリペプチドとを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の精製マトリックス。
【請求項15】
前記精製マトリックスが、配列番号８７及び１７１～１７４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の精製マトリックス。
【請求項16】
前記精製マトリックスが、配列番号１７１のアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の精製マトリックス。
【請求項17】
前記精製マトリックスが、配列番号１７０のアミノ酸配列を有する相挙動のあるポリペプチドと、配列番号１６９のＡＡＶ結合ポリペプチドとを含む、請求項１５に記載の精製マトリックス。
【請求項18】
ＡＡＶ粒子の精製方法であって、前記ＡＡＶ粒子を請求項１～１７のいずれか一項に記載の精製マトリックスと接触させることを含む方法。
【請求項19】
前記ＡＡＶ粒子が、以下の血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ又はウシＡＡＶのうちのいずれか１つのカプシドタンパク質を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記ＡＡＶ粒子が前記精製マトリックスに可逆的に結合してＡＡＶ－精製マトリックス複合体を形成する、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項21】
第１の環境因子を使用して前記ＡＡＶ－精製マトリックス複合体の前記サイズを増加させることを含む、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法であって、前記第１の環境因子が、
ａ．温度、ｐＨ、塩濃度又は圧力のうちの１つ以上の変化；
ｂ．１つ以上の界面活性剤、補因子、ビタミン、分子クラウディング剤、酵素、変性剤の添加；又は
ｃ．電磁波又は音波の適用
のうちの１つ以上を含む、方法。
【請求項22】
タンジェンシャルフローろ過、分析超遠心、膜クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、ノーマルフローろ過、音波分離、遠心、向流遠心、及び高速タンパク質液体クロマトグラフィーからなる群から選択される技法を用いて前記ＡＡＶ－精製マトリックス複合体をサイズを基準として少なくとも１つの不純物から分離することを含む、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
第２の環境因子を用いて前記ＡＡＶ粒子を前記ＡＡＶ－精製マトリックス複合体から溶出させ、前記第２の環境因子が、ａ．温度、ｐＨ、塩濃度又は圧力のうちの１つ以上の変化；
ｂ．１つ以上の界面活性剤、補因子、ビタミン、分子クラウディング剤、変性剤、酵素の添加；又は
ｃ．電磁波又は音波の適用
のうちの１つ以上を含む、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
配列番号２８～４７、５２、６４、若しくは１６９のうちのいずれか１つの配列又は配列番号２８～４７、５２、６４、若しくは１６９のうちのいずれか１つと比べて少なくとも１つの突然変異を有する配列を含むＡＡＶ結合ポリペプチド。
【請求項25】
請求項２４に記載のＡＡＶ結合ポリペプチドをコードする核酸。
【請求項26】
請求項２５に記載の核酸を含むベクター。
【請求項27】
請求項２４に記載のＡＡＶ結合ポリペプチド、請求項２５に記載の核酸、請求項２６に記載のベクター、又はこれらの組み合わせを含む、組成物。
【請求項28】
ＡＡＶ粒子のその生産時の収率を増加させる方法であって、ＡＡＶ生産細胞を精製マトリックスの存在下に培養することを含む方法。
【請求項29】
ＡＡＶ粒子をその生産時に安定化させる方法であって、ＡＡＶ生産細胞を精製マトリックスの存在下に培養することを含む方法。
【請求項30】
ＡＡＶ粒子をその精製時に安定化させる方法であって、前記ＡＡＶ粒子をその精製時に精製マトリックスと接触させることを含む方法。
【請求項31】
ＡＡＶ粒子をその貯蔵時に安定化させる方法であって、前記ＡＡＶ粒子を精製マトリックスの存在下に貯蔵することを含む方法。
【請求項32】
ＡＡＶ粒子の保管寿命を増加させる方法であって、前記ＡＡＶ粒子を精製マトリックスの存在下に貯蔵することを含む方法。
【請求項33】
前記精製マトリックスが、請求項１～１７のいずれか一項に記載の精製マトリックスである、請求項２８～３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
少なくとも約１０μＭの精製マトリックスが存在する、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記ＡＡＶ粒子が、以下の血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ又はウシＡＡＶのうちのいずれか１つの野生型ＡＡＶ粒子である、請求項２８～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
前記ＡＡＶ粒子が突然変異体ＡＡＶ粒子である、請求項２８～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
前記ＡＡＶ粒子が前記精製マトリックスに可逆的に結合してＡＡＶ－精製マトリックス複合体を形成する、請求項２８～３４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
[0001] 本願は、２０２０年９月２２日に出願された米国仮特許出願第６３／０８１，４０５号及び２０２０年２月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／９７８，６１６号に対する優先権を主張する。前述の出願の各々の内容は、全体として参照により本明細書に援用される。
[0001] 本願は、２０２０年９月２２日に出願された米国仮特許出願第６３／０８１，４０５号及び２０２０年２月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／９７８，６１６号に対する優先権を主張する。前述の出願の各々の内容は、全体として参照により本明細書に援用される。
【0002】
電子的に提出されたテキストファイルに関する記載事項
[0002] 本明細書と共に電子的に提出されたテキストファイルの内容は、全体として参照により本明細書に援用される：配列表のコンピュータ可読形式の写し（ファイル名：ISOL_003_02WO_SeqList_ST25.txt、記録日：２０２１年２月１９日；ファイルサイズ：１５メガバイト）。
[0002] 本明細書と共に電子的に提出されたテキストファイルの内容は、全体として参照により本明細書に援用される：配列表のコンピュータ可読形式の写し（ファイル名：ISOL_003_02WO_SeqList_ST25.txt、記録日：２０２１年２月１９日；ファイルサイズ：１５メガバイト）。
【0003】
[0003] 本開示は、概して、生物製剤の精製のための組成物及び方法に関する。より具体的には、本開示は、アデノ随伴ウイルス結合ポリペプチドを含む精製マトリックス及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【0004】
発明の背景
[0004] アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子療法における１つ以上の治療用遺伝子の送達に有望な輸送手段である。ＡＡＶは、小型の複製欠損性ＤＮＡウイルスであり、感染細胞のゲノムに組み込まれる能力を有する。ＡＡＶは、治療用遺伝子の持続的な発現を促進し、遺伝子療法ベクターを繰り返し投与する必要性を低下させる。
[0004] アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子療法における１つ以上の治療用遺伝子の送達に有望な輸送手段である。ＡＡＶは、小型の複製欠損性ＤＮＡウイルスであり、感染細胞のゲノムに組み込まれる能力を有する。ＡＡＶは、治療用遺伝子の持続的な発現を促進し、遺伝子療法ベクターを繰り返し投与する必要性を低下させる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
[0005] しかしながら、ＡＡＶの作製及び精製方法には制約があり、それらが遺伝子療法へのＡＡＶの広範な使用を困難にしている。ＡＡＶの増殖には、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスを使用する必要がある。ヘルパーウイルスが必要なため、ＡＡＶ粒子の精製は複雑となる。現在のＡＡＶ粒子精製手法は、凍結融解サイクルの繰り返しを用いてＡＡＶ感染細胞を溶解させた後、続いて密度勾配遠心を用いて細胞ライセートを分画することにより、細胞性の汚染物質を含まない、且つ実質的にヘルパーウイルスを含まない感染性ＡＡＶ粒子を入手することを伴うものである。標準的な精製技法では、概して活動性（感染性）ウイルスの収率は極めて低くなる（０．３～５％）。更に、ヘルパーウイルスを全く含まないＡＡＶ組成物を入手することは困難である。従って、当該技術分野では、改良されたＡＡＶ精製方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0006】
発明の概要
[0006] 本開示は、ＡＡＶ結合ポリペプチドを含む精製マトリックス及びその使用方法を提供する。
[0006] 本開示は、ＡＡＶ結合ポリペプチドを含む精製マトリックス及びその使用方法を提供する。
【0007】
[0007] 一部の実施形態において、本開示は、相挙動を有するポリペプチドにカップリングしたＡＡＶ結合ポリペプチドを含む精製マトリックスを提供し、ここでＡＡＶ結合ポリペプチドは、ＡＡＶ受容体（ＡＡＶＲ）のエクトドメイン、又はそのＡＡＶ結合断片若しくは誘導体を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、相挙動を有するポリペプチドに可逆的にカップリングされる。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、相挙動を有するポリペプチドに共有結合的にカップリングされる。
【0008】
[0008] 一部の実施形態において、ＡＡＶＲは、ヒトＡＡＶＲである。一部の実施形態において、ＡＡＶＲは、サルＡＡＶＲである。一部の実施形態において、ＡＡＶＲは、オランウータンＡＡＶＲである。一部の実施形態において、ＡＡＶＲは、マウスＡＡＶＲである。一部の実施形態において、ＡＡＶＲは、ヒト、サル、オランウータン、又はマウスＡＡＶＲのうちのいずれか１つの誘導体である。
【0009】
[0009] 一部の実施形態において、ＡＡＶＲは、野生型ＡＡＶＲである。一部の実施形態において、ＡＡＶＲは、突然変異体ＡＡＶＲである。
【0010】
[0010] 一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、配列番号２９、３３、５２、又は６４のうちのいずれか１つの配列を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、最大２５個のアミノ酸突然変異を有する配列番号２９、３３、５２、又は６４のうちのいずれか１つの配列を含む。
【0011】
[0011] 一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、又は少なくとも５個の突然変異を有する配列番号３５のアミノ酸４１１～４９９を含む。一部の実施形態において、各突然変異は、個別に、Ｖ４４０Ｈ、Ｓ４３１Ｈ、Ｑ４３２Ｈ、Ｔ４３４Ｈ、Ｙ４４２Ｈ、Ｉ４６２Ｈ、Ｄ４３５Ｈ、Ｄ４３６Ｈ、Ｋ４３８Ｈ、及びＩ４３９Ｈからなる群から選択される。
【0012】
[0012] 一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、配列番号２８～３２、３７～４１、４３～４７、及び５２～８６のうちのいずれか１つを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、配列番号２８～３２、３７～４１、４３～４７、及び５２～８６のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つを含む。
【0013】
[0013] 一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、多発性嚢胞腎１（ＰＫＤ１）ドメイン、又はその断片を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、多発性嚢胞腎２（ＰＫＤ２）ドメイン、又はその断片を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、多発性嚢胞腎３（ＰＫＤ３）ドメイン、又はその断片を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、多発性嚢胞腎４（ＰＫＤ４）ドメイン、又はその断片を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、多発性嚢胞腎５（ＰＫＤ５）ドメイン、又はその断片を含む。
【0014】
[0014] 一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、配列番号２９の配列を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸（即ち、非ヒスチジンアミノ酸）がヒスチジンに突然変異している配列番号２９の配列を含む。
【0015】
[0015] 一部の実施形態において、本開示は、支持体にカップリングしたＡＡＶ結合ポリペプチドを含む精製マトリックスを提供し、ここでＡＡＶ結合ポリペプチドは、ＡＡＶ受容体（ＡＡＶＲ）のエクトドメイン、又はそのＡＡＶ結合断片若しくは誘導体を含む。一部の実施形態において、支持体は、ビーズ、樹脂、膜、繊維、ポリマー、プレート、又はチップを含む。一部の実施形態において、支持体は、セファロース、アガロース、セルロース、ポリスチレン、ポリメタクリレート、及び／又はポリアクリルアミドを含むビーズである。一部の実施形態において、支持体は、磁気ビーズである。一部の実施形態において、支持体は、ポリマーである。一部の実施形態において、支持体は、合成ポリマーである。
【0016】
[0016] 一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、支持体に可逆的にカップリングされる。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、相挙動を有するポリペプチドに可逆的にカップリングされる。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、支持体に共有結合的にカップリングされる。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、相挙動のあるポリペプチドに共有結合的にカップリングされる。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、支持体に非共有結合的にカップリングされる。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、相挙動のあるポリペプチドに非共有結合的にカップリングされる。
【0017】
[0017] 一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、支持体にリンカーを介してカップリングされる。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、相挙動のあるポリペプチドにリンカーを介してカップリングされる。一部の実施形態において、リンカーはペプチドリンカーである。一部の実施形態において、ペプチドリンカーは、プロテアーゼ切断部位を含む。一部の実施形態において、リンカーは化学的リンカーである。
【0018】
[0018] 一部の実施形態において、融合タンパク質が、ＡＡＶ結合ポリペプチドと、相挙動を有するポリペプチドとを含む。
【0019】
[0019] 一部の実施形態において、相挙動を有するポリペプチドは、エラスチン様ポリペプチドである。一部の実施形態において、相挙動を有するポリペプチドは、レジリン様ポリペプチドである。
【0020】
[0020] 一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、配列（Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｘａａ－Ｇｌｙ）ｎ（配列番号１０）を有するペンタペプチドリピート、又はそのランダム化されたスクランブル類似体を含み；式中、Ｘａａは、プロリンを除く任意のアミノ酸であってよい。一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、配列（Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｘａａ－Ｇｌｙ）ｎ（配列番号１０）を有するペンタペプチドリピート、又はそのランダム化されたスクランブル類似体を含み；式中、Ｘａａは、プロリンを除く任意のアミノ酸であってよく、式中、ｎは、１以上３６０以下の間にある整数である。一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、（ＧＲＧＤＳＰＹ）ｎ（配列番号１）；（ＧＲＧＤＳＰＨ）ｎ（配列番号２）；（ＧＲＧＤＳＰＶ）ｎ（配列番号３）；（ＧＲＧＤＳＰＹＧ）ｎ（配列番号４）；（ＲＰＬＧＹＤＳ）ｎ（配列番号５）；（ＲＰＡＧＹＤＳ）ｎ（配列番号６）；（ＧＲＧＤＳＹＰ）ｎ（配列番号７）；（ＧＲＧＤＳＰＹＱ）ｎ（配列番号８）；（ＧＲＧＮＳＰＹＧ）ｎ（配列番号９）；（ＧＶＧＶＰ）ｎ（配列番号１１）；（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１２）；（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１３）；（ＧＶＧＶＰＧＷＧＶＰＧＶＧＶＰＧＷＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１４）；（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＥＧＶＰＧＦＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１５）； （ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＫＧＶＰＧＦＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１６）；及び（ＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰ）ｍ（配列番号１７）から選択されるアミノ酸配列；又はそのランダム化されたスクランブル類似体を含み；式中：ｎは、２０～３６０の範囲の整数であり；及びｍは、４～２５の範囲の整数である。一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１４４）又は（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１４６）のアミノ酸配列を含み、式中、ｍは、２以上３２以下の間にある整数である。一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、（ＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰ）ｍ（配列番号１４５）のアミノ酸配列を含み、式中、ｍは、５以上８０以下の間にある整数である。一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、（ＧＸＧＶＰ）ｍ（配列番号１４７）のアミノ酸配列を含み、式中、ｍは、１０以上１６０以下の間にある整数であり、及び式中、リピート毎にＸは、独立に、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びセリンからなる群から選択される。一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、（ＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１４３）、（ＺＺＰＸＸＸＸＧＺ）ｍ（配列番号１４８）、（ＺＺＰＸＧＺ）ｍ（配列番号１４９）、（ＺＺＰＸＸＧＺ）ｍ（配列番号１５０）、又は（ＺＺＰＸＸＸＧＺ）ｍ（配列番号１５１）から選択されるアミノ酸配列を含み、式中、ｍは、１０以上１６０以下の間にある整数であり、式中、Ｘは、存在する場合に、プロリン又はグリシンを除く任意のアミノ酸であり、及び式中、Ｚは、存在する場合に、任意のアミノ酸である。一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、（ＧＲＧＤＸＰＺＸ）ｍ（配列番号１５２）又は（ＸＺＰＸＤＧＲＧ）ｍ（配列番号１５３）のアミノ酸配列を含み、式中、Ｘはグルタミン又はセリンであり、Ｚはチロシン又はバリンであり、及びｍは、１０以上１６０以下の間にある整数である。
【0021】
[0021] 一部の実施形態において、精製マトリックスは、配列番号２９、配列番号５２、又は配列番号６４のアミノ酸配列を有するＡＡＶ結合ポリペプチドと、（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１２）（式中、ｍは１６である）のアミノ酸配列を含む相挙動のあるポリペプチドとを含む。一部の実施形態において、精製マトリックスは、配列番号８７のアミノ酸配列を含む。
【0022】
[0022] 一部の実施形態において、本開示は、ＡＡＶの精製方法であって、ＡＡＶを本明細書に記載される精製マトリックスと接触させることを含む方法を提供する。
【0023】
[0023] 一部の実施形態において、ＡＡＶは、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶは、突然変異体ＡＡＶカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶは、以下の血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ又はウシＡＡＶのうちのいずれか１つのカプシドタンパク質を含む。
【0024】
[0024] 一部の実施形態において、ＡＡＶは、精製マトリックスに可逆的に結合してＡＡＶ－精製マトリックス複合体を形成する。一部の実施形態において、本方法は、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体を１つ以上の不純物から分離することを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体は、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体を洗浄することによって１つ以上の不純物から分離される。
【0025】
[0025] 一部の実施形態において、本方法は、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体からＡＡＶを溶出させることを含む。一部の実施形態において、本方法は、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体を含む組成物のｐＨを変化させることによってＡＡＶを溶出させることを含む。一部の実施形態において、本方法は、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体を含む組成物の温度を変化させることによってＡＡＶを溶出させることを含む。一部の実施形態において、本方法は、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体を含む組成物のイオン強度を変化させることによってＡＡＶを溶出させることを含む。一部の実施形態において、本方法は、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体を含む組成物に還元剤を添加することによってＡＡＶを溶出させることを含む。
【0026】
[0026] 一部の実施形態において、本方法は、第１の環境因子を使用してＡＡＶ－精製マトリックス複合体のサイズを増加させることを含む。一部の実施形態において、第１の環境因子は、ａ．）温度、ｐＨ、塩濃度又は圧力のうちの１つ以上の変化；ｂ．）１つ以上の界面活性剤、補因子、ビタミン、分子クラウディング剤、酵素、変性剤の添加；又はｃ．）電磁波又は音波の適用のうちの１つ以上を含む。
【0027】
[0027] 一部の実施形態において、本方法は、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体をサイズを基準として少なくとも１つの不純物から分離することを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体は、直径を基準として少なくとも１つの不純物から分離される。一部の実施形態において、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体は、質量を基準として少なくとも１つの不純物から分離される。一部の実施形態において、サイズを基準とした分離は、タンジェンシャルフローろ過、分析超遠心、膜クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、ノーマルフローろ過、音波分離、遠心、向流遠心、及び高速タンパク質液体クロマトグラフィーを用いて実施される。
【0028】
[0028] 一部の実施形態では、ＡＡＶをＡＡＶ－精製マトリックス複合体から溶出させるために第２の環境因子が使用される。一部の実施形態において、第２の環境因子は、温度、ｐＨ、塩濃度若しくは圧力のうちの１つ以上の変化；１つ以上の界面活性剤、補因子、ビタミン、分子クラウディング剤、変性剤、酵素の添加；又は電磁波若しくは音波の適用のうちの１つ以上を含む。一部の実施形態において、本開示の方法は、約２時間～約１０時間で完了する。
【0029】
[0029] 一部の実施形態において、本明細書に記載される精製方法は、約４時間～約８時間で完了する。
【0030】
[0030] 一部の実施形態では、組成物が、本開示の方法により精製されたＡＡＶ粒子を含む。一部の実施形態において、この組成物は、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％が不純物を含まない。
【0031】
[0031] 一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、配列番号２８～４７、５２、又は６４のうちのいずれか１つの配列、又は少なくとも１つのアミノ酸突然変異を有する配列番号２８～４７、５２又は６４のうちのいずれか１つの配列を含む。
【0032】
[0032] また、本明細書には、本明細書に記載される１つ以上のＡＡＶ結合ポリペプチドをコードする核酸も提供される。
【0033】
[0033] また、本明細書には、本明細書に記載される１つ以上のＡＡＶ結合ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターも提供される。
【0034】
[0034] また、本明細書には、本明細書に開示されるＡＡＶ結合ポリペプチド、ＡＡＶ結合ポリペプチドをコードする核酸、及び／又はＡＡＶ結合ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを含む組成物も提供される。
【0035】
[0035] また、本明細書には、本明細書に開示されるＡＡＶ結合ポリペプチド、ＡＡＶ結合ポリペプチドをコードする核酸、及び／又はＡＡＶ結合ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを含むキットも提供される。
【0036】
[0036] また、本明細書には、ＡＡＶ粒子のその生産時の収率を増加させる方法であって、ＡＡＶ生産細胞を精製マトリックスの存在下に培養することを含む方法も提供される。一部の実施形態において、少なくとも約１０μＭの精製マトリックスが存在する。一部の実施形態において、少なくとも約１０μＭの精製マトリックスが存在する。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、以下の血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ又はウシＡＡＶのうちのいずれか１つの野生型ＡＡＶ粒子である。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、突然変異体ＡＡＶ粒子である。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は精製マトリックスに可逆的に結合してＡＡＶ－精製マトリックス複合体を形成する。
【0037】
[0037] また、本明細書には、ＡＡＶ粒子をその生産時に安定化させる方法であって、ＡＡＶ生産細胞を精製マトリックスの存在下に培養することを含む方法も提供される。一部の実施形態において、少なくとも約１０μＭの精製マトリックスが存在する。一部の実施形態において、少なくとも約１０μＭの精製マトリックスが存在する。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、以下の血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ又はウシＡＡＶのうちのいずれか１つの野生型ＡＡＶ粒子である。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、突然変異体ＡＡＶ粒子である。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は精製マトリックスに可逆的に結合してＡＡＶ－精製マトリックス複合体を形成する。
【0038】
[0038] また、本明細書には、ＡＡＶ粒子をその精製時に安定化させる方法であって、ＡＡＶ粒子をその精製時に精製マトリックスと接触させることを含む方法も提供される。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子の精製時に少なくとも約１０μＭの精製マトリックスが存在する。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子の精製時に少なくとも約５０μＭの精製マトリックスが存在する。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、以下の血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ又はウシＡＡＶのうちのいずれか１つの野生型ＡＡＶ粒子である。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、突然変異体ＡＡＶ粒子である。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は精製マトリックスに可逆的に結合してＡＡＶ－精製マトリックス複合体を形成する。
【0039】
[0039] また、本明細書には、ＡＡＶ粒子をその貯蔵時に安定化させる方法であって、ＡＡＶ粒子を精製マトリックスの存在下に貯蔵することを含む方法も提供される。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子の精製時に少なくとも約１０μＭの精製マトリックスが存在する。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子の精製時に少なくとも約５０μＭの精製マトリックスが存在する。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、以下の血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ又はウシＡＡＶのうちのいずれか１つの野生型ＡＡＶ粒子である。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、突然変異体ＡＡＶ粒子である。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は精製マトリックスに可逆的に結合してＡＡＶ－精製マトリックス複合体を形成する。
【0040】
[0040] また、本明細書には、ＡＡＶ粒子の保管寿命を増加させる方法であって、ＡＡＶ粒子を精製マトリックスの存在下に貯蔵することを含む方法も提供される。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子の精製時に少なくとも約１０μＭの精製マトリックスが存在する。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子の精製時に少なくとも約５０μＭの精製マトリックスが存在する。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、以下の血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ又はウシＡＡＶのうちのいずれか１つの野生型ＡＡＶ粒子である。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、突然変異体ＡＡＶ粒子である。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は精製マトリックスに可逆的に結合してＡＡＶ－精製マトリックス複合体を形成する。
【0041】
[0041] これら及び他の実施形態について、以下の詳細な説明、実施例、及び特許請求の範囲に詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【0042】
【図1】[0042]定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって決定したときの、精製マトリックスを使用して細胞上清から捕捉したＡＡＶ粒子の割合を示す。
【図2】[0043]ｑＰＣＲによって決定したときの、様々な溶出条件（例えば、第２の環境因子）を用いて精製マトリックスから溶出したＡＡＶ粒子の割合を示す。
【図3】[0044]（１）精製していない細胞上清の試料、及び（２）本開示の方法により精製したＡＡＶ粒子を含む試料を含有する銀染色したゲルの画像を提供する。ＡＡＶ粒子を含有する試料では、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３タンパク質のバンドが予想どおりのサイズ（即ち、それぞれ８７ｋＤａ、７２ｋＤａ、及び６２ｋＤａ）で観察された。
【図4】[0045]ウエスタンブロットの画像を提供し、これは、本明細書に記載される精製マトリックスを使用して、細胞上清中に存在するＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質を捕捉し、細胞上清から除去することに成功したことを示している。
【図5A】[0046]対照ＡＡＶ粒子（Pos Ctrl）、又は（ｉ）本開示の方法によって精製していないか（Pos Ctrl）、若しくは（ｉｉ）本開示の精製マトリックス（例えばViraTag（商標））で精製したか、いずれかの、tdTomatoトランス遺伝子を担持するＡＡＶ８粒子に感染させた細胞の写真を示す。対照ＡＡＶ及びViraTag（商標）で精製したＡＡＶの両方とも、感染性である。「Neg Ctrl」と表示される画像は、いかなるＡＡＶ粒子にも感染させなかった細胞を示す。
【図5B】[0047]対照ＡＡＶ粒子（Pos Ctrl）又は本明細書に記載されるとおりの精製マトリックス（例えばViraTag（商標））で精製したＡＡＶ粒子に感染させた細胞の蛍光強度を示す。試験した両方のタイプのＡＡＶ粒子が、tdTomatoトランス遺伝子を担持した。
【図6】[0048]ＡＡＶ９精製マトリックス複合体を不純物から分離する間のタンジェンシャルフローろ過流束及び膜間差圧を示すグラフである。精製マトリックスはＡＡＶ９粒子をタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）によって濃縮－ダイアフィルトレーション－濃縮－ダイアフィルトレーション（ＣＤＣＤ）モードで効率的に精製することができる。この工程は、高い流束で且つ低く安定した膜間差圧（ＴＭＰ）によって透過制御モードで実施される。
【図7】[0049]ウエスタンブロットであり、これは、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）工程の種々のステップにおけるＡＡＶのＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３タンパク質の有無を示す。ＳＭ（出発材料）と表示される第１のレーンは、出発材料中にＡＡＶ粒子が存在することを示す。ＳＭは、tdTomatoトランス遺伝子をパッケージングする組換えＡＡＶ９ベクターを産生する培養ＨＥＫ２９３細胞からの上清であって、１０Ｕ／ｍＬベンゾナーゼ及び０．０１％プルロニック酸で処理される。Ｃ（Ｐ）と表示される第２のレーンは、透過液中にＡＡＶ粒子が存在しないことを示す。Ｃ（Ｒ）と表示される第３のレーンは、保持液中にＡＡＶ粒子が存在することを示す。Ｗ（Ｐ）と表示される第４のレーンは、除去した汚染物質を含有する洗浄液中にＡＡＶ粒子が存在しないことを示す。Ｅ（Ｐ）と表示される第５のレーンは、溶出したＡＡＶ粒子を示す。
【図8】[0050]ＴＦＦ濃縮及びダイアフィルトレーションの間のＡＡＶ－精製マトリックス複合体を含有する組成物内にある汚染宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の定量化を示すグラフである。ＡＡＶ－精製マトリックス複合体を含有する組成物は、ＳＭ又は「出発材料」と称され、血清型ＡＡＶ９のＡＡＶ粒子を含有する。ＴＦＦの濃縮及びダイアフィルトレーション段階全体を通じて、１ｍＬ画分が収集される。ＤＶ１、ＤＶ２、ＤＶ３－４、ＤＶ５－６、ＤＶ７－８、及びＤＶ９－１０は、ＴＦＦの濃縮段階の間に収集された画分を指す。Ｗ１－２、Ｗ３－４、及びＷ５－６は、ダイアフィルトレーションの洗浄段階の間に収集された画分を指す。ＥＣ、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、及びＥ４は、ダイアフィルトレーションの溶出段階の間に収集された画分を指す。
【図9】[0051]精製マトリックスによる精製前（出発材料（ＳＭ）と称される）及び精製マトリックスによる精製後（「溶出」と称される）のＡＡＶ９粒子を含む組成物中における二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）不純物の濃度を示すグラフである。
【図10】[0052]ＡＡＶ８粒子の組成物が精製マトリックスの「ＡＡＶ捕捉効率」に及ぼす効果を示すグラフである。ＡＡＶ８粒子を含む組成物には、「ライセート」と称される、ＡＡＶ８粒子を産生するＨＥＫ２９３細胞の細胞ライセートからの組成物、及び「上清」と称される、ＡＡＶ８粒子を産生するＨＥＫ２９３細胞から回収した培地を含む組成物が含まれた。組成物は、１×１０７ウイルス粒子毎マイクロリットル（ｖｐ／ｕＬ）（「Ｅ７」と称される）、１×１０８ｖｐ／ｕＬ、又は１×１０１０ｖｐ／ｕＬのウイルス力価を含有した。組成物は、清澄化したもの（＋）、又は清澄化していないもの（－）であった。組成物は、ヌクレアーゼに曝露したもの（＋）又はヌクレアーゼに曝露していないもの（－）であった。精製マトリックスを使用して、各組成物からＡＡＶ８粒子を捕捉した。各試料のＡＡＶ捕捉効率は、以下の式を用いて計算した：１００×（精製マトリックスによって捕捉されたＡＡＶ８粒子数／精製前の組成物中にあるＡＡＶ８粒子数）。
【図11】[0053]銀染色したＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの画像を提供し、これは、ＡＡＶ８粒子を精製マトリックスで精製すると、ベンゾナーゼヌクレアーゼによる前処理とは無関係に、高純度のＡＡＶ８粒子が生じることを示している。（－）は、ベンゾナーゼヌクレアーゼによる前処理が実施されなかったことを示し、（＋）は、前処理が実施されたことを示している。
【図12】[0054]ベンゾナーゼヌクレアーゼ前処理がある（＋）又はない（－）ときのＡＡＶ８試料中のｄｓＤＮＡ濃度を示すグラフである。前処理があるとき、又はないときで、精製マトリックスから溶出した精製後のＡＡＶ８を含む組成物は、Quant-iT picogreenアッセイによって評価したとき、同程度のｄｓＤＮＡを有した。溶解したＳＭ：清澄化した細胞ライセートを含む出発材料；捕捉：精製マトリックス捕捉ステップ上清；溶出：精製マトリックス溶出ステップ上清。
【図13】[0055]様々な速度で遠心した後のＡＡＶ捕捉効率を示す。この図は、３５００及び１６０００ＲＣＦを含め、５００相対遠心力（ＲＣＦ）以上の遠心速度を用いると、９５％を超えるＡＡＶ８粒子の捕捉が達成されることを示している。
【図14】[0056]逆方向末端反復（ＩＴＲ）定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって定量化したときの、標準条件下（対照）又は精製マトリックス添加時のＨＥＫ２９３細胞培養物によって生み出されるＡＡＶ２力価の比較を示す。このデータは、精製マトリックスが存在すると、力価が８％以上増加し得ることを示している。スチューデントｔ検定、ｐ＝０．０７７。
【図15】[0057]ＡＡＶ８粒子と精製マトリックスとを含む組成物及びＡＡＶ８粒子とＰＢＳとを含む組成物（陰性対照）における凍結融解サイクルを繰り返した後の全ＡＡＶ８カプシドの変化率を示す。
【図16】[0058]精製マトリックス濃度がＡＡＶ８粒子の捕捉効率に及ぼす効果を示すグラフである。捕捉効率は、以下の式を用いて計算した：１００×（精製マトリックスによって捕捉されたＡＡＶ８粒子数／精製前の組成物中にあるＡＡＶ８粒子数）。
【発明を実施するための形態】
【0043】
定義
[0059] 本明細書で使用されるとき、及び添付の特許請求の範囲において、単数形「ある（a）」、「ある（an）」、及び「その（the）」は、文脈上特に明確に指示されない限り、複数形の指示対象を含む。従って、例えば、「あるタンパク質」と言うとき、それは１つのタンパク質を指すか、又はかかるタンパク質の混合物を指すことができ、「その方法」と言うとき、それは当業者に公知の等価なステップ及び／又は方法への言及を含むなどである。
[0059] 本明細書で使用されるとき、及び添付の特許請求の範囲において、単数形「ある（a）」、「ある（an）」、及び「その（the）」は、文脈上特に明確に指示されない限り、複数形の指示対象を含む。従って、例えば、「あるタンパク質」と言うとき、それは１つのタンパク質を指すか、又はかかるタンパク質の混合物を指すことができ、「その方法」と言うとき、それは当業者に公知の等価なステップ及び／又は方法への言及を含むなどである。
【0044】
[0060] 本明細書で使用されるとき、用語「約」又は「近似的に」は、数値の前に付くとき、値±１０％の範囲を示す。例えば、「約１００」は、９０及び１１０を包含する。
【0045】
[0061] また、本明細書で使用されるとき、「及び／又は」は、関連のある列挙される項目のうちの１つ以上の可能なあらゆる組み合わせ、並びに別様に解釈されるときの組み合わせの欠如（「又は」）を指し、及びそれを包含する。
【0046】
[0062] 文脈上特に指示がない限り、本明細書に記載される様々な特徴を任意の組み合わせで用い得ることが具体的に意図される。
【0047】
[0063] 更に、本開示はまた、一部の実施形態において、本明細書に示される任意の特徴又は特徴の組み合わせが除外され又は省かれ得ることも企図する。更に説明すれば、例えば、特定のアミノ酸がＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ及び／又はＶから選択されてもよいと本明細書に指示がある場合、その文言はまた、アミノ酸が、それらのアミノ酸の任意の一部、例えばＡ、Ｇ、Ｉ又はＬ；Ａ、Ｇ、Ｉ又はＶ；Ａ又はＧ；Ｌのみ等から選択されてもよいことも指示しており、ここではかかる部分的組み合わせの各々が本明細書に明示的に示されたものとする。更に、かかる文言はまた、指定されるアミノ酸の１つ以上がディスクレームされてもよいことも指示している。例えば、詳細な実施形態において、アミノ酸は、Ａ、Ｇ又はＩでない；Ａでない；Ｇ又はＶでない等であり、ここでは、かかる可能なディスクレーマーの各々が本明細書に明示的に示されたものとする。
【0048】
[0064] 「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）は、小型の複製欠損性パルボウイルスである。本明細書で使用されるとき、ＡＡＶは、以下の血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（３Ａ型及び３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｈｕ．６８、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、フトアゴヒゲトカゲＡＡＶ、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２ｇ９、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ７ｍ８、ＡＡＶ Ａｎｃ８０、ＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂ、及び現在公知の、又は後に発見される任意の他のＡＡＶのうちのいずれか１つの野生型又は突然変異体ＡＡＶを指し得る。一部の実施形態において、ＡＡＶは一本鎖ゲノムを有し得るか、又は二本鎖のゲノムを有し得る（例えば、自己相補性ＡＡＶ）。
【0049】
[0065] 「ＡＡＶ粒子」は、典型的には、カプシドと、タンパク質カプシドによってカプシドに封入された核酸（例えば、トランス遺伝子を含む核酸）とを含む。「カプシド」は、ほぼ球形のタンパク質外殻であり、Ｔ＝１の正二十面体対称で会合及び配列した個々の「カプシドタンパク質サブユニット」又は「カプシドタンパク質」（例えば、約６０個のカプシドタンパク質サブユニット）を含んでいる。従って、本明細書に記載されるＡＡＶベクターのカプシドは、複数のカプシドタンパク質を含む。ＡＡＶ粒子がカプシドタンパク質を含むと記載されるとき、そのＡＡＶ粒子はカプシドを含み、ここでカプシドは１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質を含むことは理解されるであろう。ＡＡＶ粒子が結合ドメインに結合していると記載されるとき、その結合ドメインは、カプシドの範囲内にある１つ以上のカプシドタンパク質に結合していてもよいことは理解されるであろう。用語「空のＡＡＶ粒子」又は「空のカプシド」は、発現カセット又はトランス遺伝子を含むベクターゲノム又は核酸を一切含まないＡＡＶ粒子又はカプシドを指す。
【0050】
[0066] 本明細書で使用されるとき、用語「ＡＡＶ試料」は、本明細書では「ＡＡＶ組成物」と同義的に使用され、ＡＡＶ粒子を含有する組成物を指す。一部の実施形態において、「ＡＡＶ試料」は、特定の血清型のＡＡＶを含有する組成物を指す。例えば、「ＡＡＶ８試料」は、ＡＡＶ８粒子を含む組成物を指す。
【0051】
[0067] 本明細書で使用されるとき、用語「汚染物質」及び「不純物」は、同義的に使用される。汚染物質とは、精製された組成物に望ましくない任意の物質を指し得る。一部の実施形態において、汚染物質は、精製することが望まれる生物製剤以外の任意の物質である。汚染物質の非限定的な例としては、限定はされないが、溶媒、タンパク質、ペプチド、炭水化物、核酸、ウイルス、細胞（例えば、細菌、酵母、又は哺乳類細胞）、炭水化物、脂質、又はリポ多糖が挙げられる。一部の実施形態において、汚染物質は、エンドトキシン又はマイコトキシンである。
【0052】
[0068] 本明細書で使用されるとき、用語「断片」には、それがタンパク質又はポリペプチドを指すとき、トランケートされた形態のタンパク質又はポリペプチドが含まれる。例えば、ＡＡＶＲの断片は、完全長ＡＡＶＲのアミノ酸の約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、又は約９９％を含み得る。
【0053】
[0069] 本明細書で使用されるとき、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は同義的に使用され、ペプチド結合によって共有結合的に連結されたアミノ酸残基を含む化合物を指す。タンパク質は、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質の配列を含むことのできるアミノ酸の最大数に制限は設けられない。用語「ペプチド」は、例えば、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、又はこれらの組み合わせを含めた、アミノ酸の短鎖を指し得る。タンパク質及びペプチドには、例えば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾されたポリペプチド、誘導体、類似体、及び融合タンパク質が含まれ得る。
【0054】
[0070] 「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド塩基の配列であり、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド配列（天然に存在するヌクレオチド及び天然に存在しないヌクレオチドの両方を含む）であってもよい。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖のいずれかのＤＮＡ配列である。
【0055】
[0071] 本明細書で使用されるとき、ウイルス粒子を「単離する」又は「精製する」（又は文法上の等価語）とは、そのウイルス粒子が、ウイルス粒子を含む出発材料（例えば、細胞ライセート）中にある他の成分の少なくとも一部から少なくとも部分的に分離されることを意味する。代表的な実施形態において、「単離された」又は「精製された」ウイルス粒子は、出発材料と比較したとき少なくとも約１０倍、約１００倍、約１０００倍、約１０，０００倍又はそれ以上濃縮される。
【0056】
[0072] 本明細書で使用されるとき、用語「アミノ酸」は、任意の天然に存在するアミノ酸、その修飾された形態、及び合成アミノ酸を包含する。天然に存在する、左旋性の（Ｌ－）アミノ酸を表１に示す。
【0057】
【表1】
【0058】
[0073] 或いは、アミノ酸は、修飾アミノ酸残基であってもよく（非限定的な例を表２に示す）、及び／又は翻訳後修飾（例えば、アセチル化、アミド化、ホルミル化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化又は硫酸化）によって修飾されているアミノ酸であってもよい。
【0059】
【表2】
【0060】
【表3】
【0061】
[0074] 更に、天然に存在しないアミノ酸は、「非天然」アミノ酸であり得る。
【0062】
[0075] 本明細書で使用されるとき、用語「環境因子」は、タンパク質ベースの精製マトリックスを含む組成物への適用時に組成物の１つ以上の特性を変化させる任意の因子である。環境因子の非限定的な例としては、温度、ｐＨ、塩濃度、精製マトリックスの濃度、生物製剤の濃度、若しくは圧力のうちの１つ以上の変化；１つ以上の界面活性剤、補因子、ビタミン、分子クラウディング剤、変性剤、還元剤、若しくは酸化剤の添加；又は電磁波若しくは音波の適用が挙げられる。
【0063】
[0076] 本明細書で使用されるとき、用語「相挙動のあるポリペプチド」は、相転移を起こす能力のある任意のポリペプチドを指す。一部の実施形態において、こうしたポリペプチドは、環境因子の適用に起因して相転移を起こす。例示的な相挙動のあるポリペプチドとしては、エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）及びレジリン様ポリペプチド（ＲＬＰ）が挙げられる。
【0064】
本明細書で使用されるとき、用語「融合タンパク質」は、自然の中では一体に融合して見られない２つの（又は更に多くの）異なるポリペプチドをコードする２つの異種ヌクレオチド配列又はそれらの断片が、正しい翻訳リーディングフレームに一体に融合しているときに作り出されるポリペプチドを指す。
【0065】
ＡＡＶ結合ポリペプチドを含む精製マトリックス
[0077] 本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合ポリペプチドを含む精製マトリックスを提供する。一部の実施形態において、本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の精製方法であって、ＡＡＶ粒子を本明細書に記載される精製マトリックスと接触させることを含む方法を提供する。一部の実施形態において、本明細書に記載される方法は、高力価のＡＡＶ粒子を生み出し、ＡＡＶ粒子を含む組成物から１つ以上の汚染物質を除去する。
[0077] 本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合ポリペプチドを含む精製マトリックスを提供する。一部の実施形態において、本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の精製方法であって、ＡＡＶ粒子を本明細書に記載される精製マトリックスと接触させることを含む方法を提供する。一部の実施形態において、本明細書に記載される方法は、高力価のＡＡＶ粒子を生み出し、ＡＡＶ粒子を含む組成物から１つ以上の汚染物質を除去する。
【0066】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
[0078] 一部の実施形態において、本明細書に記載される精製マトリックスは、ＡＡＶ粒子の精製に利用される。ＡＡＶは、パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）に含まれるデペンドパルボウイルス属（Ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）に属する。ＡＡＶは、末端に２つの１４５ヌクレオチド長逆方向末端反復（ＩＴＲ）がある約４．７キロベースの線状一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ゲノムを有する。ＡＡＶはポリメラーゼをコードせず、ゲノム複製を細胞のポリメラーゼに頼る。
[0078] 一部の実施形態において、本明細書に記載される精製マトリックスは、ＡＡＶ粒子の精製に利用される。ＡＡＶは、パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）に含まれるデペンドパルボウイルス属（Ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）に属する。ＡＡＶは、末端に２つの１４５ヌクレオチド長逆方向末端反復（ＩＴＲ）がある約４．７キロベースの線状一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ゲノムを有する。ＡＡＶはポリメラーゼをコードせず、ゲノム複製を細胞のポリメラーゼに頼る。
【0067】
[0079] ＡＡＶは、溶菌ウイルスとして増殖し得るか、又は宿主細胞ＤＮＡに組み込まれて、プロウイルスとして維持され得る。一定の条件下では、ＡＡＶはヘルパーウイルスが存在しなくても複製することができるものの、効率的な複製には、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、又はワクシニアウイルスなどのヘルパーウイルスとの共感染が必要である。
【0068】
[0080] 本明細書に開示される組成物及び方法は、以下の血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（３Ａ型及び３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｈｕ．６８、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、フトアゴヒゲトカゲＡＡＶ、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２ｇ９、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ７ｍ８、ＡＡＶ Ａｎｃ８０、ＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂ、又は現在公知の、若しくは後に発見される任意の他のＡＡＶのうちのいずれか１つの野生型又は突然変異体ＡＡＶ粒子の精製に使用し得る。
【0069】
ＡＡＶ結合ポリペプチド
[0081] 一部の実施形態において、本開示は、ＡＡＶ結合ポリペプチドを含む精製マトリックスを提供する。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、ＡＡＶ受容体（ＡＡＶＲ）のエクトドメイン、又はそのＡＡＶ結合断片若しくは誘導体を含む。
[0081] 一部の実施形態において、本開示は、ＡＡＶ結合ポリペプチドを含む精製マトリックスを提供する。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、ＡＡＶ受容体（ＡＡＶＲ）のエクトドメイン、又はそのＡＡＶ結合断片若しくは誘導体を含む。
【0070】
[0082] ＡＡＶＲ、別名ＫＩＡＡ０３１９Ｌ（例えば、Uniprotアクセッション番号Ｑ８ＩＺＡ０を参照のこと）は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９を含めた複数のＡＡＶ血清型のカプシドに結合する１５０ｋＤａの糖タンパク質である。ＡＡＶＲのエクトドメインは、Ｎ末端にある８個のシステインのモチーフ（ＭＡＮＥＣ）と、多発性嚢胞腎（ＰＫＤ）ドメインとして知られる５個の免疫グロブリンドメインとを含む。ＡＡＶ粒子はＰＫＤドメインに結合して、形質導入を容易にする。従って、一部の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ結合ポリペプチドは、１、２、３、４、又は５個のＰＫＤドメイン、又はその断片若しくは誘導体を含む。
【0071】
[0083] 一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、ヒトＡＡＶＲ（配列番号３５）、マウスＡＡＶＲ（配列番号３６）、又はオランウータンＡＡＶＲ（配列番号４２）、又はその断片若しくは誘導体を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、配列番号３５、３６、又は４２のうちのいずれか１つと少なくとも９０％又は少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、ＡＡＶＲのエクトドメイン又はその断片若しくは誘導体を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、Ｎ末端メチオニンを含むＡＡＶＲの断片を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、配列番号３３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。
【0072】
[0084] 一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５個又はそれ以上のアミノ酸突然変異を有する配列番号３３又は配列番号３４の配列を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、配列番号３３又は配列番号３４の配列、又はそれと少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％の同一性を有する配列を含む。特に指示されない限り、配列同一性は、blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiで利用可能な国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information：ＮＣＢＩ）のBasic Local Alignment Search Tool（BLAST（登録商標））を用いて決定される。一部の実施形態において、配列同一性は、比較される配列の全長にわたって計算される。一部の実施形態において、配列同一性は、比較される各配列の２０アミノ酸、５０アミノ酸、７５アミノ酸、１００アミノ酸、２５０アミノ酸、５００アミノ酸、７５０アミノ酸、又は１０００アミノ酸断片にわたって計算される。
【0073】
[0085] 一部の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ結合ポリペプチドは、２個、３個、４個、５個、又はそれ以上のＰＫＤなど、１つ以上のＰＫＤを含む。一部の実施形態において、ＰＫＤは、各々個別に、表３に掲載されるＰＫＤから選択される。例えば、一部の実施形態において、ＰＫＤは、各々個別に、配列番号２８～３２、３７～４１、及び４３～４７から選択される。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは複数のＰＫＤを含み、それらのＰＫＤは、リンカーによって互いに接続されている。リンカーの非限定的な例は、本開示全体を通じて記載される。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは複数のＰＫＤドメインを含み、ここで各ＰＫＤドメインは、同じ又は実質的に同じ配列を有する。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは複数のＰＫＤドメインを含み、ここで各ＰＫＤは、異なる配列を有する。
【0074】
【表4】
【0075】
[0086] 一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、多発性嚢胞腎１（ＰＤＫ１）ドメインを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、多発性嚢胞腎２（ＰＤＫ２）ドメインを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、多発性嚢胞腎３（ＰＤＫ３）ドメインを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、多発性嚢胞腎４（ＰＤＫ４）ドメインを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、多発性嚢胞腎５（ＰＤＫ５）ドメインを含む。
【0076】
[0087] 一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、ＰＫＤ１及びＰＫＤ２ドメインを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、配列番号９２のアミノ酸配列を有するＰＫＤ１及びＰＫＤ２ドメインを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、ＰＫＤ１及びＰＫＤ３ドメインを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、ＰＫＤ１及びＰＫＤ４ドメインを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、ＰＫＤ１及びＰＫＤ５ドメインを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、ＰＫＤ２及びＰＫＤ３ドメインを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、ＰＫＤ２及びＰＫＤ４ドメインを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、ＰＫＤ２及びＰＫＤ５ドメインを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、ＰＫＤ３及びＰＫＤ４ドメインを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、ＰＫＤ３及びＰＫＤ５ドメインを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、ＰＫＤ４及びＰＫＤ５ドメインを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは３個のＰＫＤドメインを含み、ここで各ＰＫＤドメインは、ＰＫＤ１～５のいずれか１つから独立に選択される。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは４個のＰＫＤドメインを含み、ここで各ＰＫＤドメインは、ＰＫＤ１～５のいずれか１つから独立に選択される。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは５個のＰＫＤドメインを含み、ここで各ＰＫＤドメインは、ＰＫＤ１～５のいずれか１つから独立に選択される。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは５個より多いＰＫＤドメインを含み、ここで各ＰＫＤドメインは、ＰＫＤ１～５のいずれか１つから独立に選択される。
【0077】
[0088] 前段落の任意の実施形態において、ＰＫＤドメインの各々は、野生型又は突然変異体ＰＫＤドメインから独立に選択されてもよい。一部の実施形態において、各ＰＫＤは、野生型ＰＫＤと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を有し得る。一部の実施形態において、本明細書に開示されるＡＡＶ結合ポリペプチドは、野生型ＰＫＤと少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、１つ以上のＰＫＤを用いてＡＡＶに結合する。
【0078】
[0089] 一部の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ結合ポリペプチドは、その野生型ＡＡＶＲ又はＰＫＤと比べて少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、少なくとも約２５個のアミノ酸突然変異を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、その野生型ＡＡＶＲ又はＰＫＤと比べて最大約２５個のアミノ酸突然変異、又はそれ以上を含む。例えば、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、野生型ＡＡＶＲと比べて約２５～３５、約３５～４５、約４５～５５、約５５～６５、又は約６５～７５個のアミノ酸突然変異を含み得る。
【0079】
[0090] 一部の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ結合ポリペプチドは、その野生型ＡＡＶＲ又はＰＫＤと比べて少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、少なくとも約２５個のアミノ酸突然変異を含み、ここで各突然変異は、天然アミノ酸残基からヒスチジンへの変化を含む。
【0080】
[0091] 一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、配列番号２９の配列を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸（即ち、非ヒスチジンアミノ酸）がヒスチジンに突然変異している配列番号２９の配列を含む。
【0081】
[0092] 一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、又は少なくとも５個の突然変異を有する配列番号３５を含む。一部の実施形態において、各突然変異は、個別に、Ｖ４４０Ｈ、Ｓ４３１Ｈ、Ｑ４３２Ｈ、Ｔ４３４Ｈ、Ｙ４４２Ｈ、Ｉ４６２Ｈ、Ｄ４３５Ｈ、Ｄ４３６Ｈ、Ｋ４３８Ｈ、及びＩ４３９Ｈからなる群から選択される。
【0082】
[0093] 一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、又は少なくとも５個の突然変異を有する配列番号３５のアミノ酸４１１～４９９を含み、ここで各突然変異は、個別に、Ｖ４４０Ｈ、Ｓ４３１Ｈ、Ｑ４３２Ｈ、Ｔ４３４Ｈ、Ｙ４４２Ｈ、Ｉ４６２Ｈ、Ｄ４３５Ｈ、Ｄ４３６Ｈ、Ｋ４３８Ｈ、及びＩ４３９Ｈからなる群から選択される。
【0083】
[0094] 一部の実施形態において、配列番号３５のＡＡＶ結合ポリペプチド又はその断片は、表４にある突然変異の組み合わせのうちの１つ以上を有する。表４の各行が、突然変異の組み合わせを意味する。
【0084】
【表5】
【0085】
【表6】
【0086】
【表7】
【0087】
【表8】
【0088】
【表9】
【0089】
【表10】
【0090】
【表11】
【0091】
【表12】
【0092】
【表13】
【0093】
【表14】
【0094】
【表15】
【0095】
【表16】
【0096】
【表17】
【0097】
【表18】
【0098】
【表19】
【0099】
【表20】
【0100】
【表21】
【0101】
【表22】
【0102】
【表23】
【0103】
【表24】
【0104】
【表25】
【0105】
【表26】
【0106】
【表27】
【0107】
【表28】
【0108】
【表29】
【0109】
【表30】
【0110】
【表31】
【0111】
【表32】
【0112】
[0095] 一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、又は少なくとも５個の突然変異を有する配列番号２９を含み、ここで各突然変異は、個別に、Ｓ２３Ｈ、Ｑ２４Ｈ、Ｔ２６Ｈ、Ｄ２９Ｈ、Ｋ３０Ｈ、Ｉ３１Ｈ、Ｖ３２Ｈ、Ｙ３４Ｈ、及びＩ５４Ｈからなる群から選択される。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、Ｖ３２Ｈ及びＶ３４Ｈ突然変異を有する配列番号２９を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、Ｓ２３Ｈ及びＱ２４Ｈ突然変異を有する配列番号２９を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、又は少なくとも５個の突然変異を有する配列番号２９を含み、ここで各突然変異は、個別に、Ｓ２３Ｈ、Ｑ２４Ｈ、Ｔ２６Ｈ、Ｄ２９Ｈ、Ｋ３０Ｈ、Ｉ３１Ｈ、Ｖ３２Ｈ、Ｙ３４Ｈ、及びＩ５４Ｈからなる群から選択される。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、配列番号７６～８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【0113】
[0096] 一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、Ｎ末端におけるＧＮＲＰＰ（配列番号８９）のアミノ酸配列を有する追加の５アミノ酸と、Ｃ末端におけるＶＤＹＰＧ（配列番号９０）のアミノ酸配列を有する追加の５アミノ酸とを有する配列番号２９を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、配列番号５２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、又は少なくとも５個の突然変異であって、各々が個別に、Ｓ２３Ｈ、Ｑ２４Ｈ、Ｔ２６Ｈ、Ｄ２９Ｈ、Ｋ３０Ｈ、Ｉ３１Ｈ、Ｖ３２Ｈ、Ｙ３４Ｈ、及びＩ５４Ｈからなる群から選択される突然変異を有する配列番号２９とＮ末端におけるＧＮＲＰＰ（配列番号８９）のアミノ酸配列を有する追加の５アミノ酸と、Ｃ末端におけるＶＤＹＰＧ（配列番号９０）のアミノ酸配列を有する追加の５アミノ酸とを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、又は少なくとも５個の突然変異を有する配列番号５２を含み、ここで各突然変異は、個別に、Ｓ２３Ｈ、Ｑ２４Ｈ、Ｔ２６Ｈ、Ｄ２９Ｈ、Ｋ３０Ｈ、Ｉ３１Ｈ、Ｖ３２Ｈ、Ｙ３４Ｈ、及びＩ５４Ｈからなる群から選択される。
【0114】
[0097] 一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、配列番号９３～１１６のうちのいずれか１つの核酸配列によってコードされる。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、Ｖ３２Ｈ及びＶ３４Ｈ突然変異を有する配列番号２９とＮ末端におけるＧＮＲＰＰ（配列番号８９）のアミノ酸配列を有する追加の５アミノ酸と、Ｃ末端におけるＶＤＹＰＧ（配列番号９０）のアミノ酸配列を有する追加の５アミノ酸とを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、Ｓ２３Ｈ及びＱ２４Ｈ突然変異を有する配列番号２９とＮ末端におけるＧＮＲＰＰ（配列番号８９）のアミノ酸配列を有する追加の５アミノ酸と、Ｃ末端におけるＶＤＹＰＧ（配列番号９０）のアミノ酸配列を有する追加の５アミノ酸とを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、又は少なくとも５個の突然変異であって、各々が個別に、Ｓ２３Ｈ、Ｑ２４Ｈ、Ｔ２６Ｈ、Ｄ２９Ｈ、Ｋ３０Ｈ、Ｉ３１Ｈ、Ｖ３２Ｈ、Ｙ３４Ｈ、及びＩ５４Ｈからなる群から選択される突然変異を有する配列番号２９とＮ末端におけるＧＮＲＰＰ（配列番号８９）のアミノ酸配列を有する追加の５アミノ酸と、Ｃ末端におけるＶＤＹＰＧ（配列番号９０）のアミノ酸配列を有する追加の５アミノ酸とを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、配列番号５３～６３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【0115】
[0098] 一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、配列番号２９のアミノ酸配列と、加えてＮ末端におけるＧＮＲＰＰ（配列番号８９）のアミノ酸配列を有する追加の５アミノ酸と、Ｃ末端におけるＶＤＹＰ（配列番号９１）のアミノ酸配列を有する追加の４アミノ酸とを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、配列番号６４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、又は少なくとも５個の突然変異であって、各々が個別に、Ｓ２３Ｈ、Ｑ２４Ｈ、Ｔ２６Ｈ、Ｄ２９Ｈ、Ｋ３０Ｈ、Ｉ３１Ｈ、Ｖ３２Ｈ、Ｙ３４Ｈ、及びＩ５４Ｈからなる群から選択される突然変異を有する配列番号２９のアミノ酸配列と、Ｎ末端におけるＧＮＲＰＰ（配列番号８９）のアミノ酸配列を有する追加の５アミノ酸と、Ｃ末端におけるＶＤＹＰ（配列番号９１）のアミノ酸配列を有する追加の４アミノ酸とを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、配列番号２９＋Ｖ３２Ｈ及びＶ３４Ｈ突然変異とＮ末端におけるＧＮＲＰＰ（配列番号８９）のアミノ酸配列を有する追加の５アミノ酸と、Ｃ末端におけるＶＤＹＰ（配列番号９１）のアミノ酸配列を有する追加の４アミノ酸とを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、Ｓ２３Ｈ及びＱ２４Ｈ突然変異を有する配列番号２９とＮ末端におけるＧＮＲＰＰ（配列番号８９）のアミノ酸配列を有する追加の５アミノ酸と、Ｃ末端におけるＶＤＹＰ（配列番号９１）のアミノ酸配列を有する追加の４アミノ酸とを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、又は少なくとも５個の突然変異であって、各々が個別に、Ｓ２３Ｈ、Ｑ２４Ｈ、Ｔ２６Ｈ、Ｄ２９Ｈ、Ｋ３０Ｈ、Ｉ３１Ｈ、Ｖ３２Ｈ、Ｙ３４Ｈ、及びＩ５４Ｈからなる群から選択される突然変異を有する配列番号２９のアミノ酸配列とＮ末端におけるＧＮＲＰＰ（配列番号８９）のアミノ酸配列を有する追加の５アミノ酸と、Ｃ末端におけるＶＤＹＰ（配列番号９１）のアミノ酸配列を有する追加の４アミノ酸とを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、配列番号６５～７５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【0116】
[0099] 一部の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ結合ポリペプチドは、１つ以上のＭＡＮＥＣモチーフを含む（例えば、配列番号４９～５１を参照のこと）。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ結合ポリペプチドは、１つ以上の組換えＭＡＮＥＣモチーフを含む。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ結合ポリペプチドは、野生型ＭＡＮＥＣモチーフと少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５、又は少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、配列番号４９～５１のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％の同一性を有するＭＡＮＥＣモチーフを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、１つ以上のＭＡＮＥＣモチーフを介してＡＡＶ粒子に結合する。
【0117】
[0100] 一部の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ結合ポリペプチドは、Ｎ末端メチオニンを含む。一部の実施形態において、Ｎ末端メチオニンは、本明細書に記載されるＡＡＶ結合ポリペプチドの翻訳を開始させる。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ結合ポリペプチドは、Ｎ末端メチオニンを欠いている。
【0118】
[0101] 一部の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ結合ポリペプチドは、以下の血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、及び／又はＡＡＶｒｈ７４のＡＡＶ粒子に結合する。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、以下の血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９のうちの１つ以上のＡＡＶ粒子に結合する。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、ＡＡＶ１粒子に結合する。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、ＡＡＶ２粒子に結合する。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、ＡＡＶ３Ｂ粒子に結合する。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、ＡＡＶ５粒子に結合する。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、ＡＡＶ６粒子に結合する。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、ＡＡＶ８粒子に結合する。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、ＡＡＶ９粒子に結合する。
【0119】
[0102] 一部の実施形態において、ＡＡＶＲは、ヒトＡＡＶＲである。一部の実施形態において、ＡＡＶＲは、霊長類ＡＡＶＲである。一部の実施形態において、ＡＡＶＲは、野生型ＡＡＶＲである。一部の実施形態において、ＡＡＶＲは、突然変異体ＡＡＶＲである。
【0120】
[0103] 一部の実施形態において、ＡＡＶＲは、糖タンパク質である。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ結合ポリペプチドは、１つ以上のグリコシル化部位を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、Ｏ結合型グリコシル化部位を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、Ｎ結合型グリコシル化部位を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶＲは、Ｎ結合型グリコシル化を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶＲは、１つ以上のアスパラギン及び／又はグルタミン残基がグリコシル化されている。
【0121】
[0104] 一部の実施形態において、精製マトリックスは、約１～約１００個のＡＡＶ結合ポリペプチドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドの数は、約１、約５、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、又は約１００である。一部の実施形態において、相挙動のある単一のポリペプチドが、約１～約１００個のＡＡＶ結合ポリペプチドなど、複数のＡＡＶ結合ポリペプチドにカップリングされてもよい。
【0122】
[0105] 一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、配列番号２８～３４、３７～４１、４３～４７、及び５２～８６のうちのいずれか１つの配列を含む。相挙動のある単一のポリペプチドが複数のＡＡＶ結合ポリペプチドにカップリングされる一部の実施形態において、各ＡＡＶ結合ポリペプチドは、配列番号２８～３４、３７～４１、４３～４７、及び５２～８６から独立に選択されてもよい。
【0123】
[0106] 一部の実施形態では、核酸が、本明細書に記載される１つ以上のＡＡＶ結合ポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ベクターが、本明細書に記載される１つ以上のＡＡＶ結合ポリペプチドをコードする核酸を含む。
【0124】
[0107] 一部の実施形態では、キットが、ＡＡＶ結合ポリペプチド、ＡＡＶ結合ポリペプチドをコードする核酸、及び／又はＡＡＶ結合ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを含む。
【0125】
[0108] 一部の実施形態では、精製マトリックスが、ＡＡＶ結合ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、キットが、精製マトリックスを含む。
【0126】
[0109] 一部の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ結合ポリペプチドは、１つ以上のＡＡＶ粒子に結合する。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドを含む精製マトリックスは、１つ以上のＡＡＶ粒子に結合する。
【0127】
[0110] 一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、約１ｎＭ～約５００ｎＭのＫｄを有する。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、約１ｎＭ、約２ｎＭ、約３ｎＭ、約４ｎＭ、約５ｎＭ、約６ｎＭ、約７ｎＭ、約８ｎＭ、約９ｎＭ、約１０ｎＭ、約２０ｎＭ、約３０ｎＭ、約４０ｎＭ、約５０ｎＭ、約６０ｎＭ、約７０ｎＭ、約８０ｎＭ、約９０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１１０ｎＭ、約１２０ｎＭ、約１３０ｎＭ、約１４０ｎＭ、約１５０ｎＭ、約１６０ｎＭ、約１７０ｎＭ、約１８０ｎＭ、約１９０ｎＭ、約２００ｎＭ、約２１０ｎＭ、約２２０ｎＭ、約２３０ｎＭ、約２４０ｎＭ、約２５０ｎＭ、約２６０ｎＭ、約２７０ｎＭ、約２８０ｎＭ、約２９０ｎＭ、約３００ｎＭ、約３１０ｎＭ、約３２０ｎＭ、約３３０ｎＭ、約３４０ｎＭ、約３５０ｎＭ、約３６０ｎＭ、約３７０ｎＭ、約３８０ｎＭ、約３９０ｎＭ、約４００ｎＭ、約４１０ｎＭ、約４２０ｎＭ、約４３０ｎＭ、約４４０ｎＭ、約４５０ｎＭ、約４６０ｎＭ、約４７０ｎＭ、約４８０ｎＭ、約４９０ｎＭ、又は約５００ｎＭ（間にある全ての値及び範囲を含む）のＫｄを有する。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、５０ｎＭ以上の親和性を有する。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、約５０ｎＭ、約４０ｎＭ、約３０ｎＭ、約２０ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約０．１ｎＭ、約０．０１ｎＭ、約０．００１ｎＭの親和性を有する。
【0128】
[0111] 一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子へのＡＡＶ結合ポリペプチドの結合は、２．５以上のｐＨで破綻する。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子へのＡＡＶ結合ポリペプチドの結合は、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、約９．０、約９．５、約１０．０、約１０．５、約１１．０、約１１．５、約１２．０、約１２．５、約１３．０、又は約１３．５のｐＨで破綻する。
【0129】
支持体
[0112] 一部の実施形態において、本開示は、支持体（例えば、固体支持体）にカップリングされるＡＡＶ結合ポリペプチドを含む精製マトリックスを提供する。一部の実施形態において、本開示は、ＡＡＶ結合ポリペプチドと、支持体にカップリングされる相挙動を有するペプチドとを含む精製マトリックスを提供する。一部の実施形態において、支持体は、ビーズ、樹脂、プレート、チップ、膜、繊維、又はポリマーである。一部の実施形態において、支持体は、シリカ、アガロース、ソフトアガロース、セルロース、酢酸セルロース、ポリスチレン、セファロース、ヘパリンセファロース、セルファインサルフェイト（celluline sulfate）、ヒドロキシアパタイト、セラミックハイドロキシアパタイト、アガロース、デキストラン、ラテックス、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリ（スチレンジビニル）ベンゼン、セラミック粒子、ポリアクリルアミド、ポリオレフィン、及び／又はポリフッ化ビニリデン、アガロースに固定化されたスルホプロピル、及び／又はこれらの組み合わせを含む。
[0112] 一部の実施形態において、本開示は、支持体（例えば、固体支持体）にカップリングされるＡＡＶ結合ポリペプチドを含む精製マトリックスを提供する。一部の実施形態において、本開示は、ＡＡＶ結合ポリペプチドと、支持体にカップリングされる相挙動を有するペプチドとを含む精製マトリックスを提供する。一部の実施形態において、支持体は、ビーズ、樹脂、プレート、チップ、膜、繊維、又はポリマーである。一部の実施形態において、支持体は、シリカ、アガロース、ソフトアガロース、セルロース、酢酸セルロース、ポリスチレン、セファロース、ヘパリンセファロース、セルファインサルフェイト（celluline sulfate）、ヒドロキシアパタイト、セラミックハイドロキシアパタイト、アガロース、デキストラン、ラテックス、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリ（スチレンジビニル）ベンゼン、セラミック粒子、ポリアクリルアミド、ポリオレフィン、及び／又はポリフッ化ビニリデン、アガロースに固定化されたスルホプロピル、及び／又はこれらの組み合わせを含む。
【0130】
[0113] 一部の実施形態において、支持体は、ポリマーである。ポリマーの非限定的な例としては、ポリアクリル酸（polyamylic acid）、ポリアクリロニトリル（polyacrlonitrile）、ポリアリルアミン（polyallyamine）、ポリアクリレート類、ポリアクリル酸ブチル、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸アルキル類、ポリメタクリル酸アルキル、ポリブタジエン、ポリカルボメチルシラン、ポリスチレン、ポリペプチド、ポリ核酸、及びポリ（カーボネート）ウレタンが挙げられる。一部の実施形態において、支持体は、合成ポリマーである。一部の実施形態において、支持体は、組換えポリマーである。
【0131】
[0114] 一部の実施形態において、支持体は、樹脂である。一部の実施形態において、樹脂は正電荷である。一部の実施形態において、樹脂にカチオンが取り付けられる。一部の実施形態において、カチオンは、第４級アミノ基である。一部の実施形態において、正電荷樹脂は、ジエチルアミノエチルセルロース、磁性アミン、磁性プロピルアミン、磁性第４級アンモニウム、磁性ポリ－Ｄ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン官能化ポリウレタン、スペルミンラテックス、トリス（２－アミノエチル）アミンラテックス、トリス（２－アミノエチル）アミンビーズ化アガロース、トリス（２－アミノエチル）－アクリルアミド、及びトリス（２－アミノエチル）ポリウレタンアミンを含む。一部の実施形態において、樹脂は負電荷である。一部の実施形態において、樹脂にアニオンが取り付けられる。一部の実施形態において、樹脂にアニオンが共有結合的に取り付けられる。アニオンの非限定的な例としては、スルホン酸塩又はカルボン酸塩が挙げられる。
【0132】
[0115] 一部の実施形態において、支持体は、多孔質である。一部の実施形態において、多孔質支持体は、樹脂又はビーズである。一部の実施形態において、多孔質支持体は、磁気ビーズである。一部の実施形態において、多孔質支持体は、約５０ｎｍ～約５０００ｎｍの細孔径を有する。一部の実施形態において、細孔径は、約５０ｎｍ、約１００ｎｍ、約１５０ｎｍ、約２００ｎｍ、約３００ｎｍ、約４００ｎｍ、約５００ｎｍ、約６００ｎｍ、約７００ｎｍ、約８００ｎｍ、約９００ｎｍ、約１０００ｎｍ、約１１００ｎｍ、約１２００ｎｍ、約１３００ｎｍ、約１４００ｎｍ、約１５００ｎｍ、約１６００ｎｍ、約１７００ｎｍ、約１８００ｎｍ、約１９００ｎｍ、約２０００ｎｍ、約２１００ｎｍ、約２２００ｎｍ、約２３００ｎｍ、約２４００ｎｍ、約２５００ｎｍ、約２６００ｎｍ、約２７００ｎｍ、約２８００ｎｍ、約２９００ｎｍ、約３０００ｎｍ、約３１００ｎｍ、約３２００ｎｍ、約３３００ｎｍ、約３４００ｎｍ、約３５００ｎｍ、約３６００ｎｍ、約３７００ｎｍ、約３８００ｎｍ、約３９００ｎｍ、約４０００ｎｍ、約４１００ｎｍ、約４２００ｎｍ、約４３００ｎｍ、約４４００ｎｍ、約４５００ｎｍ、約４６００ｎｍ、約４７００ｎｍ、約４８００ｎｍ、約４９００ｎｍ、又は約５０００ｎｍである。一部の実施形態において、細孔径とは、細孔の半径である。一部の実施形態において、細孔径とは、細孔の直径である。
【0133】
[0116] 一部の実施形態において、支持体は、１つ以上の架橋材料を含む。一部の実施形態において、多孔質支持体は、１つ以上の架橋材料を含む。一部の実施形態において、架橋は、ＡＡＶによる支持体の細孔との相互作用を防止する。一部の実施形態において、支持体は、静的繊維網目である。一部の実施形態において、支持体は、固体網目である。
【0134】
[0117] 一部の実施形態において、支持体は、ＡＡＶ結合ポリペプチドへのカップリング前に前処理される。一部の実施形態において、支持体は、ＲＮアーゼ溶液で前処理される。
【0135】
[0118] 一部の実施形態において、支持体は、リンカーを介してＡＡＶ結合ポリペプチドにカップリングされる。一部の実施形態において、リンカーは、支持体にカップリングされる。一部の実施形態において、リンカーは、ＡＡＶ結合ポリペプチドにカップリングされる。リンカーの例は、本開示全体を通じて提供される。
【0136】
[0119] 一部の実施形態において、支持体は、デカンテーション、遠心又はろ過によって溶液から分離される。粒子が磁性である場合、磁界分離を用いることができる。
【0137】
[0120] 一部の実施形態において、支持体はベッセルに収容される。ベッセルの非限定的な例としては、遠心管、スピンチューブ、シリンジ、カートリッジ、チャンバ、チップ、多重ウェルプレート、ビーカー、クロマトグラフィーカラム、又は試験管が挙げられる。
【0138】
相挙動を有するポリペプチド
[0121] 一部の実施形態において、本開示は、相挙動を有するポリペプチドを含む精製マトリックスを提供する。一部の実施形態において、本開示は、ＡＡＶ結合タンパク質にカップリングしている相挙動を有するポリペプチドを含む精製マトリックスを提供する。一部の実施形態において、本開示は、（ｉ）ＡＡＶ結合タンパク質と（ｉｉ）相挙動を有するポリペプチドとを含む融合タンパク質にカップリングされる支持体を含む精製マトリックスを提供する。
[0121] 一部の実施形態において、本開示は、相挙動を有するポリペプチドを含む精製マトリックスを提供する。一部の実施形態において、本開示は、ＡＡＶ結合タンパク質にカップリングしている相挙動を有するポリペプチドを含む精製マトリックスを提供する。一部の実施形態において、本開示は、（ｉ）ＡＡＶ結合タンパク質と（ｉｉ）相挙動を有するポリペプチドとを含む融合タンパク質にカップリングされる支持体を含む精製マトリックスを提供する。
【0139】
[0122] 一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、レジリン様ポリペプチド（ＲＬＰ）である。レジリン様ポリペプチドは、望ましい弾性回復力、圧縮弾性率、引張弾性率、剛性率、破断点伸び、最大引張り強さ、硬さ、反発弾性、及び圧縮永久ひずみを含めた機械的特性を備える弾性ポリペプチドである。一部の実施形態において、本明細書に記載されるレジリン様ポリペプチドは、１つ以上のリピートを含むポリマーである。一部の実施形態において、ポリマーリピートは、配列番号１～９のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を有し得る。
【0140】
[0123] 一部の実施形態において、レジリン様ポリペプチドは、２種類以上のリピート、例えば配列番号１のリピートと配列番号３のリピートとを含む。
【0141】
[0124] 一部の実施形態において、本明細書に記載されるレジリン様ポリペプチドは、所与のＲＬＰ内に最大５００回現れるリピートを含む。一部の実施形態において、リピートは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約２６０、約２７０、約２８０、約２９０、約３００、約３１０、約３２０、約３３０、約３４０、約３５０、約３６０、約３７０、約３８０、約３９０、約４００、約４５０、又は約５００回現れる。
【0142】
[0125] 一部の実施形態において、ＲＬＰは、１つ以上の部分的リピートを含む。一部の実施形態において、部分的リピートの長さは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０アミノ酸である。一部の実施形態において、ＲＬＰは、リピートの一部でないＲＬＰのＮ末端又はＣ末端に１つ以上の追加のアミノ酸を含む。
【0143】
[0126] 一部の実施形態において、１つ以上のＲＬＰリピートはスクランブルされ、即ち、それらは異なるアミノ酸配列を含有するが、同じアミノ酸組成を保持している。例えば、リピートは、配列番号８と異なるアミノ酸配列を有するが、同じアミノ酸組成を保持していてもよい。
【0144】
[0127] 一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、エラスチン様ポリペプチドである。エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）は、トロポエラスチンから誘導されるバイオポリマーである。一部の実施形態において、本明細書に記載されるエラスチン様ポリペプチドは、配列（Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｘａａ－Ｇｌｙ）ｎ（配列番号１０）を有するペンタペプチドリピートを含むポリマーである。
【0145】
[0128] 一部の実施形態において、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、又は５００（間にある全ての値及び範囲を含む）である。
【0146】
[0129] 一部の実施形態において、ペンタペプチドリピートはスクランブルされ、例えばそれは異なるアミノ酸配列を含むが、同じアミノ酸組成を維持している。例えば、ＥＬＰは、配列番号１０と異なるアミノ酸配列を含み得るが、同じアミノ酸組成を維持していており、例えば配列の４０％がグリシンであり、配列の２０％がＸａａ（例えば、プロリンを除くいずれかのアミノ酸）であり、配列の２０％がプロリンであり、及び配列の２０％がバリンである。
【0147】
[0130] 一部の実施形態において、ＥＬＰは、１つ以上の部分的リピートを含む。一部の実施形態において、部分的リピートの長さは、１、２、３、又は４アミノ酸である。一部の実施形態において、ＥＬＰは、リピートの一部でないＥＬＰのＮ末端又はＣ末端に１つ以上の追加のアミノ酸を含む。
【0148】
[0131] ＥＬＰ及びＲＬＰは、環境因子に応答して相転移を起こす。ＥＬＰ及びＲＬＰは、１つ以上のポリペプチド（１つ以上のＡＡＶ結合ポリペプチドなど）にカップリングしたとき、又は１つ以上の他のポリペプチド（１つ以上のＡＡＶ結合ポリペプチドなど）との融合タンパク質として発現したときに相転移を起こすその能力を保持している。ＥＬＰ及びＲＬＰのようなポリマーは、曇点温度（Ｔｃ）とも称される転移温度（Ｔｔ）を呈する。一部の実施形態において、ＥＬＰ及びＲＬＰは、Ｔｔで可溶性相から不溶性相への可逆的相転移を起こす。加熱又は塩濃度の上昇に伴い可溶性相から不溶性相へと転移するＥＬＰは、下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）と称されるＴｔを有する。冷却又は塩濃度の低下に伴い可溶性相から不溶性相へと転移するＲＬＰは、下限臨界共溶温度（ＵＣＳＴ）と称されるＴｔを有する。一部の実施形態において、相転移は、ＥＬＰ及び／又はＲＬＰの二次構造が変化する結果として生じる。例えば、ＥＬＰの相転移は、ランダムコイル（Ｔｔ未満）からＩＩ型βターンへと二次構造が変化する結果として生じる。一部の実施形態において、二次構造の変化は、円偏光二色性分光偏光測定法、小角Ｘ線散乱、紫外・可視分光光度法、静的光散乱、動的光散乱、核磁気共鳴分光法、固体核磁気共鳴分光法、赤外分光法、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）、小角中性子散乱、顕微鏡法、及び低温電子顕微鏡法から選択される方法によって特徴付けられる。一部の実施形態において、ＥＬＰの相転移は、二次構造の変化によって生じるのではない。
【0149】
[0132] 一部の実施形態において、本明細書に記載されるＲＬＰ及びＥＬＰは、約０℃～約１００℃の間の転移温度を有する。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＲＬＰ及びＥＬＰは、約１０℃～約５０℃の間の転移温度を有する。一部の実施形態において、転移温度は、約０℃、約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、約７５℃、約７６℃、約７７℃、約７８℃、約７９℃、約８０℃、約８１℃、約８２℃、約８３℃、約８４℃、約８５℃、約８６℃、約８７℃、約８８℃、約８９℃、約９０℃、約９１℃、約９２℃、約９３℃、約９４℃、約９５℃、約９６℃、約９７℃、約９８℃、約９９℃、又は約１００℃である。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＲＬＰは、約１０℃～約１００℃の転移温度を有する。
【0150】
[0133] 一部の実施形態において、本明細書に記載されるＲＬＰ及びＥＬＰのＴｔは、ＲＬＰ及びＥＬＰの一次構造（例えばアミノ酸配列）を操作することによって調節される。一部の実施形態において、ＥＬＰ又はＲＬＰの疎水性が調節される。一部の実施形態において、ＥＬＰの疎水性は、ゲスト残基Ｘａａのアイデンティティを変えることによって修飾される。一部の実施形態では、ＥＬＰ又はＲＬＰの疎水性を増加させる結果、Ｔｔが低下する。一部の実施形態では、ＥＬＰ又はＲＬＰの疎水性を低下させる結果、Ｔｔが上昇する。一部の実施形態において、ＥＬＰ又はＲＬＰの極性が調節される。一部の実施形態において、ＥＬＰの極性は、ゲスト残基Ｘａａのアイデンティティを変えることによって調節される。一部の実施形態では、ＥＬＰ又はＲＬＰの極性を増加させる結果、Ｔｔが上昇する。一部の実施形態では、ＥＬＰ又はＲＬＰの極性を低下させる結果、Ｔｔが低下する。
【0151】
[0134] 一部の実施形態において、ＥＬＰペンタペプチドリピートの数（ｎ）を調節すると、Ｔｔが変わる。一部の実施形態において、ペンタペプチドリピート（Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｘａａ－Ｇｌｙ）ｎ（配列番号１０）のｎは、１以上５００以下の整数である。一部の実施形態において、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、又は５００（間にある全ての値及び範囲を含む）である。
【0152】
[0135] 一部の実施形態において、Ｘａａは「ゲスト残基」、すなわちＥＬＰの相挙動を消失させることのない任意のアミノ酸である。一部の実施形態において、Ｘａａは、プロリンを除く任意のアミノ酸である。一部の実施形態において、Ｘａａは、各リピートについて独立に選択される。例えば、所与のＥＬＰは、ゲスト残基アラニン、グリシン、及びバリンを８：７：１の比で含み得る。一部の実施形態において、Ｘａａは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン（praline）、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンからなる群から選択される。一部の実施形態において、Ｘａａは、表２及び／又は２，４－ジアミノ酪酸、α－アミノイソ酪酸、アロイソロイシン、４－アミノ酪酸、２－アミノ酪酸（Ａｂｕ）、ε－Ａｈｘ、６－アミノヘキサン酸、２－アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、３－アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β－アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えば、β－メチルアミノ酸、Ｃα－メチルアミノ酸、Ｎａ－メチルアミノ酸など、及び一般にアミノ酸類似体からなる群から選択される非古典的アミノ酸である。一部の実施形態において、Ｘａａは、天然又は非古典的アミノ酸のＤ－異性体である。
【0153】
[0136] 一部の実施形態において、本明細書に記載されるＲＬＰ及びＥＬＰのＴｔは、ＲＬＰ及び／又はＥＬＰを含む組成物に１つ以上の環境因子を導入することによって調節される。一部の実施形態において、ＥＬＰ及び／又はＲＬＰのＴｔは、溶媒のイオン強度を調整することによって調節される。一部の実施形態において、溶媒のイオン強度は、塩を加えることによって調整される。一部の実施形態において、ＥＬＰ及び／又はＲＬＰは、コスモトロープとして分類されるアニオンを含む溶媒中では、より低いＴｔを含む。コスモトロープであるアニオンは高度に水和され、ＥＬＰ及び／又はＲＬＰ上の水の遮蔽に影響を与える。一部の実施形態において、ＥＬＰ及び／又はＲＬＰのＴｔは、カオトロープであるアニオンを加えることを通じて調整されてもよい。低濃度では、カオトロープを加えると、ＥＬＰ及び／又はＲＬＰのＴｔが上昇する。高濃度では、カオトロープを加えると、ＥＬＰ及び／又はＲＬＰのＴｔが低下する。一部の実施形態において、ＥＬＰ及び／又はＲＬＰのＴｔは、水素結合を破綻させる１つ以上の試薬を導入することによって調整されてもよい。水素結合を破綻させる試薬の非限定的な例としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び尿素が挙げられる。一部の実施形態において、水素結合形成を亢進させる試薬を利用してＴｔが調節される。一部の実施形態において、疎水性相互作用を亢進させる試薬を利用してＴｔが調節される。トリフルオロエタノールは、疎水性相互作用及び水素結合形成の両方を亢進させることによってＴｔの低下を生じさせる試薬である。
【0154】
[0137] 一部の実施形態において、ＥＬＰ及び／又はＲＬＰ濃度を調整してＴｔを調節することができる。一部の実施形態において、ＥＬＰ及び／又はＲＬＰ濃度が高くなると、Ｔｔは減少する。一部の実施形態において、ＥＬＰ及び／又はＲＬＰ濃度が低くなると、Ｔｔは上昇する。
【0155】
[0138] 加えて、ｐＨ、光、及びイオン濃度の調節もまた利用して、Ｔｔを調節することができる。
【0156】
[0139] 一部の実施形態において、荷電アミノ酸（例えば、ヒスチジン、リジン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、オルニチン、又は他の非天然荷電アミノ酸）の数（例えば、加える、又は取り除く）及びアイデンティティ（例えば、正電荷又は負電荷を持つ）を調節することにより、ｐＨ調節によるＴｔの調整が可能となる。
【0157】
[0140] 一部の実施形態において、本明細書に記載されるＥＬＰ及び／又はＲＬＰはブロック共重合体である。ブロック共重合体は２つ以上の配列ドメイン又はブロックを含み、ここで２つ以上のブロックが異なる特性を備える。調整することのできる特性の非限定的な例としては、親水性、疎水性、極性、及び二次構造が挙げられる。一部の実施形態において、ブロック共重合体は両親媒性であり、例えばそれは、少なくとも１つの疎水性ブロックと少なくとも１つの親水性ブロックとを含む。
【0158】
[0141] 一部の実施形態において、本明細書に記載されるＥＬＰ及び／又はＲＬＰは、様々な形態に集合する。形態の非限定的な例としては、球状凝集体、ミセル、小胞、フィブリル、ナノフィブリル、ナノチューブ、及びヒドロゲルが挙げられる。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＲＬＰ及び／又はＥＬＰは、環境因子を加えた後、様々な形態に集合する。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＲＬＰ及び／又はＥＬＰは、環境因子を加えた後、ある形態から別の形態へと変化する。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＲＬＰ及び／又はＥＬＰは、ＡＡＶ粒子を加えた後、ある形態から別の形態へと変化する。
【0159】
[0142] 一部の実施形態において、環境因子を加えることにより、ＲＬＰ及び／又はＥＬＰが相転移を起こす。一部の実施形態において、ＲＬＰ及び／又はＥＬＰ相転移時、ＲＬＰ及び／又はＥＬＰは、ある形態から別の形態へと変換される。
【0160】
[0143] 一部の実施形態において、ＲＬＰ及び／又はＥＬＰの相転移により、稠密体、液体、液滴の形成が生じる。
【0161】
[0144] 一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、
（ａ）（ＧＲＧＤＳＰＹ）ｎ（配列番号１）
（ｂ）（ＧＲＧＤＳＰＨ）ｎ（配列番号２）
（ｃ）（ＧＲＧＤＳＰＶ）ｎ（配列番号３）
（ｄ）（ＧＲＧＤＳＰＹＧ）ｎ（配列番号４）
（ｅ）（ＲＰＬＧＹＤＳ）ｎ（配列番号５）
（ｆ）（ＲＰＡＧＹＤＳ）ｎ（配列番号６）
（ｇ）（ＧＲＧＤＳＹＰ）ｎ（配列番号７）
（ｈ）（ＧＲＧＤＳＰＹＱ）ｎ（配列番号８）
（ｉ）（ＧＲＧＮＳＰＹＧ）ｎ（配列番号９）
（ｊ）（ＧＶＧＶＰ）ｎ（配列番号１１）；
（ｋ）（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１２）；
（ｌ）（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１３）；
（ｍ）（ＧＶＧＶＰＧＷＧＶＰＧＶＧＶＰＧＷＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１４）；
（ｎ）（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＥＧＶＰＧＦＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１５）；
（ｏ）（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＫＧＶＰＧＦＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１６）；及び
（ｐ）（ＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰ）ｍ（配列番号１７）
からなる群から選択されるアミノ酸配列；
又はこれらのランダム化されたスクランブル類似体
（式中：
ｎは、１以上～５００以下の範囲の整数であり；及び
ｍは、４以上～２５以下の範囲の整数である）を含む。
（ａ）（ＧＲＧＤＳＰＹ）ｎ（配列番号１）
（ｂ）（ＧＲＧＤＳＰＨ）ｎ（配列番号２）
（ｃ）（ＧＲＧＤＳＰＶ）ｎ（配列番号３）
（ｄ）（ＧＲＧＤＳＰＹＧ）ｎ（配列番号４）
（ｅ）（ＲＰＬＧＹＤＳ）ｎ（配列番号５）
（ｆ）（ＲＰＡＧＹＤＳ）ｎ（配列番号６）
（ｇ）（ＧＲＧＤＳＹＰ）ｎ（配列番号７）
（ｈ）（ＧＲＧＤＳＰＹＱ）ｎ（配列番号８）
（ｉ）（ＧＲＧＮＳＰＹＧ）ｎ（配列番号９）
（ｊ）（ＧＶＧＶＰ）ｎ（配列番号１１）；
（ｋ）（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１２）；
（ｌ）（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１３）；
（ｍ）（ＧＶＧＶＰＧＷＧＶＰＧＶＧＶＰＧＷＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１４）；
（ｎ）（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＥＧＶＰＧＦＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１５）；
（ｏ）（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＫＧＶＰＧＦＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１６）；及び
（ｐ）（ＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰ）ｍ（配列番号１７）
からなる群から選択されるアミノ酸配列；
又はこれらのランダム化されたスクランブル類似体
（式中：
ｎは、１以上～５００以下の範囲の整数であり；及び
ｍは、４以上～２５以下の範囲の整数である）を含む。
【0162】
[0145] 一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１２）（式中、ｍは１６である）である。一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１２）（式中、ｍは１６である）のアミノ酸配列と、Ｎ末端又はＣ末端における最大１０個の追加のアミノ酸とを含む。一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１２）（式中、ｍは１６である）のアミノ酸配列と、追加のＣ末端グリシンとを含む。一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１２）（式中、ｍは１６である）のアミノ酸配列と、追加のＮ末端メチオニンとを含む。一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１２）（式中、ｍは１６である）のアミノ酸配列と、追加のＣ末端グリシン及び追加のＮ末端メチオニンとを含む。
【0163】
[0146] 一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、配列番号８８のアミノ酸配列を有する。
【0164】
[0147] 一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１４４）又は（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１４６）（式中、ｍは、２以上３２以下の間にある整数である）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１４４）（式中、ｍは、８又は１６である）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、（ＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰ）ｍ（配列番号１４５）（式中、ｍは、５以上８０以下の間にある整数である）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、（ＧＸＧＶＰ）ｍ（配列番号１４７）（式中、ｍは、１０以上１６０以下の間にある整数であり、及び式中、リピート毎にＸは、独立に、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びセリンからなる群から選択される）のアミノ酸配列を含む。
【0165】
[0148] 一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、
（ａ）（ＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１４３）；
（ｂ）（ＺＺＰＸＸＸＸＧＺ）ｍ（配列番号１４８）；
（ｃ）（ＺＺＰＸＧＺ）ｍ（配列番号１４９）；
（ｄ）（ＺＺＰＸＸＧＺ）ｍ（配列番号１５０）；又は
（ｅ）（ＺＺＰＸＸＸＧＺ）ｍ（配列番号１５１）
（式中、ｍは、１０以上１６０以下の間にある整数であり、式中、Ｘは、存在する場合に、プロリン又はグリシンを除く任意のアミノ酸であり、及び式中、Ｚは、存在する場合に、任意のアミノ酸である）から選択されるアミノ酸配列を含む。
（ａ）（ＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１４３）；
（ｂ）（ＺＺＰＸＸＸＸＧＺ）ｍ（配列番号１４８）；
（ｃ）（ＺＺＰＸＧＺ）ｍ（配列番号１４９）；
（ｄ）（ＺＺＰＸＸＧＺ）ｍ（配列番号１５０）；又は
（ｅ）（ＺＺＰＸＸＸＧＺ）ｍ（配列番号１５１）
（式中、ｍは、１０以上１６０以下の間にある整数であり、式中、Ｘは、存在する場合に、プロリン又はグリシンを除く任意のアミノ酸であり、及び式中、Ｚは、存在する場合に、任意のアミノ酸である）から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0166】
[0149] 一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、（ＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１４３）（式中、ｍは、２０、４０、又は８０である）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、（ＧＲＧＤＸＰＺＸ）ｍ（配列番号１５２）又は（ＸＺＰＸＤＧＲＧ）ｍ（配列番号１５３）（式中、Ｘは、グルタミン又はセリンであり、Ｚは、チロシン又はバリンであり、及びｍは、１０以上１６０以下の間にある整数である）のアミノ酸配列を含む。
【0167】
[0150] 一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、第１の一組のリピート配列と、第２の一組のリピート配列とを含む。第１の一組のリピート配列及び第２の一組のリピート配列は、各々個別に、１回以上繰り返される配列を含み得る。一部の実施形態において、第１の一組のリピート配列及び／又は第２の一組のリピート配列は、配列番号１～１７及び１４３～１５３のいずれか１つを含む繰り返し配列を含む。一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、第１の一組のリピート配列及び第２の一組のリピート配列を含み、ここで第１の一組のリピート配列は、（ＧＲＧＤＸＰＺＸ）４０（配列番号１５４）のアミノ酸配列を含み、第２の一組のリピート配列は、アミノ酸配列（ＧＶＧＶＰ）８０（配列番号１５５）を含む（式中、Ｘはグルタミンであり、及びＺはチロシンである）。一部の実施形態において、第１の一組のリピート配列と第２の一組のリピート配列とを含む相挙動のあるポリペプチドは、配列番号１５６の配列を含む。一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、又は少なくとも１０組の異なる一組のリピート配列を含む。一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチド内にある各一組のリピート配列は、約５～約４００回、例えば、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１０５、約１１０、約１１５、約１２０、約１２５、約１３０、約１３５、約１４０、約１４５、約１５０、約１５５、約１６０、約１６５、約１７０、約１７５、約１８０、約１８５、約１９０、約１９５、約２００、約２０５、約２１０、約２１５、約２２０、約２２５、約２３０、約２３５、約２４０、約２４５、約２５０、約２５５、約２６０、約２６５、約２７０、約２７５、約２８０、約２８５、約２９０、約２９５、約３００、約３０５、約３１０、約３１５、約３２０、約３２５、約３３０、約３３５、約３４０、約３４５、約３５０、約３５５、約３６０、約３６５、約３７０、約３７５、約３８０、約３８５、約３９０、約３９５、又は約４００回繰り返す配列を含む。
【0168】
[0151] 一部の実施形態において、配列番号１～１７、８８及び１４３～１５３のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む相挙動のあるポリペプチドはまた、最大１０個の追加のＮ末端及び／又はＣ末端アミノ酸も含む。一部の実施形態において、配列番号１～１７、８８及び１４３～１５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む相挙動のあるポリペプチドはまた、追加のＮ末端メチオニンも含む。一部の実施形態において、配列番号１～１７、８８及び１４３～１５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む相挙動のあるポリペプチドはまた、追加のＣ末端グリシンも含む。
【0169】
[0152] 一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、ＥＬＰ及び／又はＲＬＰの同じアミノ酸組成を有するが、リピートは含まない。一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、ＥＬＰ及び／又はＲＬＰと約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、ＥＬＰ及び／又はＲＬＰと約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一のアミノ酸組成を含む。一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、ＥＬＰ及び／又はＲＬＰと約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一の疎水性アミノ酸の組成を含む。
【0170】
[0153] 一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、繰り返しのない非構造化ポリペプチドを含む。一部の実施形態において、繰り返しのない非構造化ポリペプチドは、少なくとも５０アミノ酸を含むアミノ酸配列を有する。一部の実施形態において、繰り返しのない非構造化ポリペプチドは、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、又は少なくとも１００アミノ酸を含むアミノ酸配列を有する。一部の実施形態において、繰り返しのない非構造化ポリペプチドの配列は、少なくとも約１０％のプロリン（例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、又は少なくとも８０％）及び少なくとも２０％のグリシン（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％）である。一部の実施形態において、繰り返しのない非構造化ポリペプチドは、バリン、アラニン、ロイシン、リジン、トレオニン、イソロイシン、チロシン、セリン、及びフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸を少なくとも約４０％含む配列を有する。
【0171】
[0154] 一部の実施形態において、繰り返しのない非構造化ポリペプチドは、３個の連続した同一のアミノ酸を含まない配列を含み、ここで繰り返しのない非構造化ポリペプチドに任意の５～１０アミノ酸部分配列が１回より多く現れることはなく、及び繰り返しのない非構造化ポリペプチドが、プロリンで始まってプロリンで終わる部分配列を含むとき、及びここでその部分配列は、少なくとも１つのグリシンを更に含む。
【0172】
[0155] 一部の実施形態において、本明細書に記載されるＥＬＰ及び／又はＲＬＰは、融合タンパク質の成分として発現する。一部の実施形態において、融合タンパク質は、ＥＬＰ及び／又はＲＬＰと、ＡＡＶＲエクトドメイン（ecodomain）などのＡＡＶ結合ポリペプチド又はその断片若しくは誘導体とを含む。一部の実施形態において、融合タンパク質は、細菌又は哺乳類細胞で発現する。一部の実施形態において、融合タンパク質は、大腸菌（Escherichia coli）で発現する。一部の実施形態において、融合タンパク質は、昆虫細胞で発現する。一部の実施形態において、繰り返しのない非構造化ポリペプチドの配列は、少なくとも約１０％のプロリン（例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％）及び少なくとも２０％のグリシン（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％）であり、及び少なくとも４０％（例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％）が、バリン、アラニン、ロイシン、リジン、トレオニン、イソロイシン、チロシン、セリン、及びフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸である。
【0173】
[0156] 一部の実施形態において、繰り返しのない非構造化ポリペプチドは、３個の連続した同一のアミノ酸を含まない。一部の実施形態において、繰り返しのない非構造化ポリペプチドは、繰り返しのない非構造化ポリペプチド配列に１回のみ現れる部分配列（例えば、繰り返しのない非構造化ポリペプチドの断片）を含む。一部の実施形態において、繰り返しのない非構造化ポリペプチドは、プロリンで始まってプロリンで終わる部分配列を含む。一部の実施形態において、繰り返しのない非構造化ポリペプチドは、少なくとも１つのグリシンを含む部分配列を含む。
【0174】
[0157] 一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１２）（式中、ｍは１６である）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、配列番号１６４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、配列番号１７０のアミノ酸配列を含む。
【0175】
[0158] 一部の実施形態において、相挙動のあるポリペプチドは、シグナルペプチドを含む。
【0176】
精製マトリックスへのＡＡＶの結合
[0159] 一部の実施形態において、本開示は、ＡＡＶ結合ポリペプチドを含む精製マトリックスを提供し、ここでＡＡＶ結合ポリペプチドは、相挙動のあるポリペプチド及び／又は支持体にカップリングされている。
[0159] 一部の実施形態において、本開示は、ＡＡＶ結合ポリペプチドを含む精製マトリックスを提供し、ここでＡＡＶ結合ポリペプチドは、相挙動のあるポリペプチド及び／又は支持体にカップリングされている。
【0177】
[0160] 一部の実施形態において、本開示は、（ｉ）ＡＡＶ結合ポリペプチドと（ｉｉ）相挙動のあるポリペプチドとを含む融合タンパク質を含む精製マトリックスを提供し、ここで融合タンパク質は、支持体（例えば、固体支持体）にカップリングされている。一部の実施形態において、融合タンパク質は、ＡＡＶ結合ポリペプチド中の残基を介して支持体にカップリングされている。一部の実施形態において、融合タンパク質は、相挙動のあるポリペプチド中の残基を介して支持体にカップリングされている。一部の実施形態において、融合タンパク質は、ＡＡＶ結合ポリペプチドと支持体との間のリンカー中の残基を介して支持体にカップリングされている。一部の実施形態において、支持体への結合及び／又はカップリングは可逆的である。
【0178】
[0161] 一部の実施形態において、精製マトリックスは、ＡＡＶ粒子と接触させる。一部の実施形態において、精製マトリックスは、ＡＡＶ粒子に結合して複合体を形成する。一部の実施形態において、（ｉ）ＡＡＶ結合ポリペプチドと（ｉｉ）相挙動のあるポリペプチドとを含む融合タンパク質を含む精製マトリックスは、ＡＡＶ粒子に結合して複合体を形成する。一部の実施形態において、（ｉ）ＡＡＶ結合ポリペプチドと（ｉｉ）相挙動のあるポリペプチドとを含む融合タンパク質を含む精製マトリックスは、ＡＡＶ粒子に結合して複合体を形成する。
【0179】
[0162] 一部の実施形態において、精製マトリックスは、ＡＡＶに可逆的に結合する。可逆的結合及び／又は可逆的カップリングとは、複合体が個々の成分へと解離し得る、例えば分離し得ることを意味する。例えば、精製マトリックスとＡＡＶ粒子との間で複合体が可逆的に形成される場合、その精製マトリックスとＡＡＶ粒子とは、続いて解離することができる。一部の実施形態において、可逆的結合により、ＡＡＶ粒子を精製マトリックスから分離することが可能になる。一部の実施形態において、解離は環境因子によって引き起こされる。一部の実施形態において、可逆的結合により、汚染物質及び／又は不純物を精製マトリックスから分離することが可能になる。一部の実施形態において、可逆的結合により、他の分子を精製マトリックスから分離することが可能になる。
【0180】
[0163] 一部の実施形態において、可逆的結合は非共有結合性であり、即ち、複合体の相互作用する成分の間（精製マトリックスと汚染物質、生物製剤、及び／又は他の分子との間など）に共有結合は形成されない。一部の実施形態において、非共有結合性相互作用により、精製マトリックスと汚染物質、生物製剤、及び／又は他の分子との互いの結合が生じる。非共有結合性相互作用の非限定的な例としては、双極子間力、ファンデルワールス力、ロンドン分散力、水素結合、疎水性相互作用、及び静電相互作用が挙げられる。一部の実施形態において、非共有結合性の結合は、環境因子を加えることにより破綻する。
【0181】
[0164] 一部の実施形態において、精製マトリックスとＡＡＶ粒子との間の結合は、共有結合性である。一部の実施形態において、精製マトリックスとＡＡＶ粒子との間の共有結合は、例えばプロテアーゼを用いて切断されてもよい。
【0182】
[0165] 一部の実施形態において、精製マトリックスはリサイクル可能であり、つまり、これは１回以上の使用後に再使用できるということである。一部の実施形態において、精製マトリックスは、初回使用後、それが再び使用される前に再生される。一部の実施形態において、精製マトリックスは、精製マトリックスを塩酸グアニジンと共にインキュベートすることによって再生される。一部の実施形態において、精製マトリックスは、精製マトリックスを塩酸グアニジン中で約６Ｍなど、約１Ｍ～約１０Ｍの範囲の濃度にてインキュベートすることによって再生される。一部の実施形態において、精製マトリックスは、精製マトリックスを水酸化ナトリウム中でインキュベートすることによって再生される。一部の実施形態において、精製マトリックスは、精製マトリックスを水酸化ナトリウム中で約１Ｍなど、約０．１Ｍ～約１０Ｍの範囲の濃度にてインキュベートすることによって再生される。インキュベーションは、例えば、約１～約３０分、約５～約１０分、又は約１０～約１０分の長さであってもよい。一部の実施形態において、インキュベーションは、約５分の長さである。
【0183】
[0166] 一部の実施形態において、精製マトリックスは、精製マトリックスを、８０℃より高い、８５℃より高い、９０℃より高い、９５℃より高い、又は１００℃より高い温度など、高温でインキュベートすることによって再生される。インキュベーションは、例えば、約１～約３０分、約５～約１０分、又は約１０～約１０分の長さであってもよい。一部の実施形態において、インキュベーションは、約５分の長さである。一部の実施形態において、精製マトリックスは、精製マトリックスを９５℃で約５分間インキュベートすることによって再生される。
【0184】
[0167] 一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子を含む第１の組成物からＡＡＶ粒子を精製した後、精製マトリックスは再生され、ＡＡＶ粒子を含む更なる組成物からのＡＡＶ粒子の捕捉に使用される。一部の実施形態において、精製マトリックスは、少なくとも５サイクルの精製、例えば、少なくとも約５サイクル、少なくとも約６サイクル、少なくとも約７サイクル、少なくとも約８サイクル、少なくとも約９サイクル、少なくとも約１０サイクルに再使用することができる。各精製サイクルが、ＡＡＶ粒子を含む組成物からＡＡＶ粒子を精製するための精製マトリックスの使用を指す。後続のサイクルは、ＡＡＶ粒子を含む更なる組成物からＡＡＶ粒子を精製するための同じ精製マトリックスの更なる使用を指す。例えば、３サイクル目の精製では、精製マトリックスは、ＡＡＶ粒子を含む第３の組成物からＡＡＶ粒子を精製するため３回目に使用される；同じ精製マトリックスが既に、ＡＡＶ粒子を含む第１の組成物からＡＡＶ粒子を精製するため１サイクル目に使用され、ＡＡＶ粒子を含む第２の組成物からＡＡＶ粒子を精製するため２サイクル目に使用された。
【0185】
[0168] 一部の実施形態において、精製マトリックスは、少なくとも５回の精製サイクル後にも、組成物から少なくとも９５％のＡＡＶ粒子を捕捉する能力を保持している。
【0186】
リンカー
[0169] 一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、相挙動のあるポリペプチド又は支持体にリンカーを介してカップリングされる。一部の実施形態において、精製マトリックスの機能に干渉しない任意のリンカーを利用し得る。
[0169] 一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、相挙動のあるポリペプチド又は支持体にリンカーを介してカップリングされる。一部の実施形態において、精製マトリックスの機能に干渉しない任意のリンカーを利用し得る。
【0187】
[0170] 一部の実施形態において、リンカーは、ＡＡＶ結合ポリペプチドを相挙動のあるポリペプチドに接続する。一部の実施形態において、リンカーは、相挙動のあるポリペプチドとＡＡＶ結合ポリペプチドとの間の協働的相互作用を可能にする。一部の実施形態において、リンカーはペプチドである。一部の実施形態において、リンカーは、相挙動のあるポリペプチドの相挙動を保つ。一部の実施形態において、リンカーは、相挙動のあるポリペプチドのＴｔを保つ。一部の実施形態において、リンカーは、捕捉ドメインの構造を保つ。一部の実施形態において、リンカーは、１～５０アミノ酸を含む。一部の実施形態において、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０アミノ酸を含む。
【0188】
[0171] 一部の実施形態において、リンカーアミノ酸配列にプロリンを含めることにより、リンカーの剛直性を増加させる。
【0189】
[0172] 一部の実施形態において、トレオニン、セリン、及びグリシンを含めた小型の極性アミノ酸を含めることにより、リンカーの柔軟性を増加させる。
【0190】
[0173] 一部の実施形態において、リンカーは、限定はされないが、αヘリックス、βストランド、及びランダムコイルを含め、様々な二次構造をとり得る。一部の実施形態において、リンカーはαヘリックスをとり、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号１８）（式中、ｎは１～２０の範囲のリピート数である）のアミノ酸リピートを含む。
【0191】
[0174] 一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｎ（配列番号１９）［式中、ｎは、１～３０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０）の整数であることができる］を含む。実施形態において、ポリペプチドリンカーは、（ＳＧＧＧ）ｎ（配列番号２０）［式中、ｎは、１～５０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０）の整数である］のリピートを有する。実施形態において、ポリペプチドリンカーは、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２１）［式中、ｎは、１～２０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０の整数である）］のリピートを有する。
【0192】
[0175] 一部の実施形態において、リンカーは、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号２２）のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態において、リンカーは、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号２３）のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態において、リンカーはグリシンのみを含む。
【0193】
[0176] 一部の実施形態において、ペプチドリンカーはプロテアーゼ切断部位を含む。一部の実施形態において、プロテアーゼ切断部位はフューリン切断部位である。
【0194】
[0177] 一部の態様において、ポリペプチドリンカーは、ポリ－（Ｇｌｙ）ｎリンカー［式中、ｎは、１～３０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０である］（配列番号４８）である。他の実施形態において、リンカーは、ジペプチド、トリペプチド、及びクアドリペプチドからなる群から選択される。実施形態において、リンカーは、アラニン－セリン（ＡＳ）、ロイシン－グルタミン酸（ＬＥ）、及びセリン－アルギニン（ＳＲ）からなる群から選択されるジペプチドである。
【0195】
[0178] 一部の実施形態において、リンカーは、ＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳ（配列番号１５７）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ（配列番号１５８）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＳＧＳＴＫＧ（配列番号１５９）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１６０）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＥＦ（配列番号１６１）、ＳＲＳＳＧ（配列番号１６２）、及びＳＧＳＳＣ（配列番号１６３）から選択される。
【0196】
[0179] 一部の実施形態において、リンカーは、自己切断型ペプチドである。一部の実施形態において、自己切断型ペプチドは、２Ａペプチドである。２Ａペプチドは、細胞におけるタンパク質の翻訳時にリボソームスキッピングを誘導する１８～２２アミノ酸長ペプチドのクラスである。一部の実施形態において、２Ａペプチドは、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１６４）のアミノ酸配列を有するＴ２Ａペプチド、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１６５）のアミノ酸配列を有するＰ２Ａペプチド、ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１６６）のアミノ酸配列を有するＥ２Ａペプチド、又はＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１６７）のアミノ酸配列を有するＦ２Ａペプチドである。一部の実施形態において、２Ａペプチドは、配列番号１６４～１６７のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の同一性を有する。一部の実施形態において、２Ａペプチドは、そのＮ末端にＧＳＧ（配列番号１６８）を更に含む。
【0197】
[0180] 一部の実施形態において、リンカーは化学的リンカーである。一部の実施形態において、化学的リンカーは、炭水化物リンカー、脂質リンカー、脂肪酸リンカー、及びポリエーテルリンカーからなる群から選択される。
【0198】
[0181] 一部の実施形態において、リンカーは、支持体とＡＡＶ結合ポリペプチドとの間の直接的な共有結合性の連結である。一部の実施形態において、リンカーは、ＡＡＶ結合ポリペプチドのアミノ酸残基と相挙動のあるポリペプチドのアミノ酸残基との間の直接的な共有結合性の連結である。一部の実施形態において、融合タンパク質は、相挙動のあるポリペプチドとＡＡＶ結合ポリペプチドとを含む。一部の実施形態において、融合タンパク質は、本明細書に記載されるとおりの１つ以上のリンカーを更に含む。一部の実施形態において、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、相挙動のあるポリペプチドと、リンカーと、ＡＡＶ結合ポリペプチドとを含む。一部の実施形態において、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、ＡＡＶ結合ポリペプチドと、リンカーと、相挙動のあるポリペプチドとを含む。
【0199】
[0182] 一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは１つ以上の多発性嚢胞腎ドメイン（ＰＫＤ）を含み、ここでＰＫＤは、個別に、ＰＫＤ１、ＰＫＤ２、ＰＫＤ３、ＰＫＤ４、及びＰＫＤ５から選択される。一部の実施形態では、２つ以上のＰＫＤをリンカーが隔てている。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、第１のＰＫＤドメインと、リンカーと、第２のＰＫＤドメインとを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、第１のＰＫＤドメインと、リンカーと、第２のＰＫＤドメインと、リンカーと、少なくとも１つの追加のＰＫＤドメインとを含む。
【0200】
[0183] 一部の実施形態において、リンカーは、ＡＡＶＲの断片を含む。一部の実施形態において、リンカーは、１～１２００アミノ酸長の間である。一部の実施形態において、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１０２５、１０５０、１０７５、１１００、１１２５、１１５０、１１７５、１２００、１２２５、又は１２５０アミノ酸を含む。一部の実施形態において、リンカーは、配列番号２４～２７のうちのいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を有する。
【0201】
ＡＡＶの精製方法
[0184] 一部の実施形態において、本開示は、開示される精製マトリックスを使用したＡＡＶ粒子の精製方法を提供する。
[0184] 一部の実施形態において、本開示は、開示される精製マトリックスを使用したＡＡＶ粒子の精製方法を提供する。
【0202】
[0185] 一部の実施形態において、精製マトリックスは、（ｉ）（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１２）（式中、ｍは１６である）のアミノ酸配列を含む相挙動のあるポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＡＡＶ結合ポリペプチドとを含む。一部の実施形態において、精製マトリックスは、（ｉ）（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１２）（式中、ｍは１６である）のアミノ酸配列を含む相挙動のあるポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＡＡＶ結合ポリペプチドとを含む。一部の実施形態において、精製マトリックスは、（ｉ）（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１２）（式中、ｍは１６である）のアミノ酸配列を含む相挙動のあるポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＡＡＶ結合ポリペプチドとを含む。
【0203】
[0186] 一部の実施形態において、精製マトリックスは、（ｉ）（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１２）（式中、ｍは１６である）のアミノ酸配列を含む相挙動のあるポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＡＡＶ結合ポリペプチドとを含む。一部の実施形態において、精製マトリックスは、（ｉ）配列番号１７０のアミノ酸配列を含む相挙動のあるポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＡＡＶ結合ポリペプチドとを含む。一部の実施形態において、精製マトリックスは、配列番号１７１のアミノ酸配列を含み、ここで相挙動のあるポリペプチドは、配列番号１７０のアミノ酸配列を含み、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、配列番号１６９のアミノ酸配列を含む。
【0204】
[0187] 一部の実施形態において、精製マトリックスは、（ｉ）配列番号８８のアミノ酸配列を含む相挙動のあるポリペプチドと（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＡＡＶ結合ポリペプチドとを含む。一部の実施形態において、精製マトリックスは、（ｉ）配列番号８８のアミノ酸配列を含む相挙動のあるポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＡＡＶ結合ポリペプチドとを含む。一部の実施形態において、精製マトリックスは、（ｉ）配列番号８８のアミノ酸配列を含む相挙動のあるポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＡＡＶ結合ポリペプチドとを含む。
【0205】
[0188] 一部の実施形態において、精製マトリックスは、（ｉ）（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１２）（式中、ｍは１６である）のアミノ酸配列を含む相挙動のあるポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＡＡＶ結合ポリペプチドとを含む。一部の実施形態において、精製マトリックスは、（ｉ）（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１２）（式中、ｍは１６である）のアミノ酸配列を含む相挙動のあるポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＡＡＶ結合ポリペプチドと、（ｉｉｉ）任意選択で、相挙動のあるポリペプチド及び／又はＡＡＶ結合ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端における最大約１０個の追加のアミノ酸、（ｉｖ）任意選択で、Ｃ末端グリシン、及び（ｖ）任意選択で、Ｎ末端メチオニンを含む。
【0206】
[0189] 一部の実施形態において、精製マトリックスは、（ｉ）（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１２）（式中、ｍは１６である）のアミノ酸配列を含む相挙動のあるポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＡＡＶ結合ポリペプチドとを含む。一部の実施形態において、精製マトリックスは、（ｉ）（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１２）（式中、ｍは１６である）のアミノ酸配列を含む相挙動のあるポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＡＡＶ結合ポリペプチドと、（ｉｉｉ）任意選択のＮ末端メチオニン、（ｉｖ）任意選択のＣ末端グリシン、及び（ｖ）任意選択で、相挙動のあるポリペプチド及び／又はＡＡＶ結合ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端における最大約１０個の追加のアミノ酸を含む。
【0207】
[0190] 一部の実施形態において、精製マトリックスは、（ｉ）（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１２）（式中、ｍは１６である）のアミノ酸配列を含む相挙動のあるポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＡＡＶ結合ポリペプチドとを含む。一部の実施形態において、精製マトリックスは、（ｉ）（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１２）（式中、ｍは１６である）のアミノ酸配列を含む相挙動のあるポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＡＡＶ結合ポリペプチドと、（ｉｉｉ）任意選択のＮ末端メチオニンと、（ｉｖ）任意選択のＣ末端グリシンと、（ｖ）任意選択で、Ｎ末端及び／又はＣ末端における最大約１０個の追加のアミノ酸とを含む。
【0208】
[0191] 一部の実施形態において、精製マトリックスは、配列番号８８のアミノ酸配列を含む相挙動のあるポリペプチドを含む。
【0209】
[0192] 一部の実施形態において、精製マトリックスは、配列番号２９、５２、又は６４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＡＡＶ結合ポリペプチドを含む。
【0210】
[0193] 一部の実施形態において、精製マトリックスは、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＡＡＶ結合ポリペプチドを含む。
【0211】
[0194] 一部の実施形態において、精製マトリックスは、配列番号８７のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態において、精製マトリックスは、配列番号１７１のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態において、精製マトリックスは、配列番号１７１～１７４又は８７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有する。
【0212】
[0195] 一部の実施形態において、本方法は、１つ以上の不純物（本明細書では汚染物質とも称される）からのＡＡＶ粒子の分離を可能にする。一部の実施形態において、不純物は、ＡＡＶ組成物中に望ましくない任意の化学薬品又は生物製剤である。一部の実施形態において、不純物は、ウイルス、タンパク質、核酸、リポ多糖類、脂質、マイコトキシン、炭水化物、及び／又は細胞である。一部の実施形態において、細胞には、細菌細胞、動物細胞、及びヒト細胞が含まれる。一部の実施形態において、細胞は、細菌細胞、酵母細胞、又は哺乳類細胞などの動物細胞からなる群から選択される。一部の実施形態において、細胞は、ニワトリ細胞、マウス細胞、モルモット細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、ヤギ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、又はウシ細胞である。一部の実施形態において、細胞はヒト細胞である。
【0213】
[0196] 一部の実施形態において、本開示は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（３Ａ型及び３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｈｕ．６８、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、フトアゴヒゲトカゲＡＡＶ、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２ｇ９、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ７ｍ８、ＡＡＶ Ａｎｃ８０、ＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂ、及び現在公知の、又は後に発見される任意の他のＡＡＶから選択される野生型又は突然変異体ＡＡＶの精製方法を提供する。
【0214】
[0197] 一部の実施形態において、本開示は、ＡＡＶ粒子の精製方法であって、ＡＡＶ結合ポリペプチドと支持体とを含む精製マトリックスをＡＡＶ粒子に接触させることを含み、ＡＡＶ結合ポリペプチドが、支持体にカップリングされている、方法を提供する。
【0215】
[0198] 一部の実施形態において、本開示は、ＡＡＶ粒子の精製方法であって、ＡＡＶ結合ポリペプチドと相挙動のあるポリペプチドとを含む精製マトリックスをＡＡＶ粒子に接触させることを含み、ＡＡＶ結合ポリペプチドが、相挙動のあるポリペプチドにカップリングされている、方法を提供する。
【0216】
[0199] 一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子を精製する方法は、ＡＡＶ粒子を精製マトリックスと接触させることを含み、ここで精製マトリックスは、（ｉ）ＡＡＶ結合ポリペプチドと（ｉｉ）相挙動のあるポリペプチドとを含み；ＡＡＶ粒子は精製マトリックスに結合して複合体を形成し；複合体のサイズが第１の環境因子によって増加し；複合体はサイズを基準として少なくとも１つの汚染物質から分離され；及びＡＡＶ粒子は第２の環境因子によって精製マトリックスから分離される。
【0217】
[0200] 一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子を精製する方法は、ＡＡＶ粒子を精製マトリックスと接触させることを含み、ここで精製マトリックスは、（ｉ）ＡＡＶ結合ポリペプチドと（ｉｉ）相挙動のあるポリペプチドとを含み；ＡＡＶ粒子はマトリックスに結合して複合体を形成し；複合体のサイズが増加し；複合体はサイズを基準として少なくとも１つの汚染物質から分離され；及びＡＡＶ粒子は環境因子によってマトリックスから分離される。
【0218】
[0201] 一部の実施形態において、本明細書に記載される方法は、ＡＡＶ粒子と精製マトリックスとの間での複合体の形成を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は精製マトリックスに可逆的に結合する。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、非共有結合性相互作用を通じて本明細書に記載される精製マトリックスに結合する。
【0219】
[0202] 一部の実施形態において、本明細書に記載される精製マトリックスと、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（３Ａ型及び３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｈｕ．６８、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、フトアゴヒゲトカゲＡＡＶ、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２ｇ９、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ７ｍ８、ＡＡＶ Ａｎｃ８０、ＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂ、及び現在公知の、又は後に発見される任意の他のＡＡＶ血清型から選択される血清型の野生型又は突然変異体ＡＡＶ粒子との間に複合体が形成される。
【0220】
[0203] 一部の実施形態において、精製マトリックスと野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を有するＡＡＶ粒子との間に複合体が形成される。一部の実施形態において、複合体は、精製マトリックスと突然変異体ＡＡＶカプシドタンパク質を有するＡＡＶ粒子との間に形成される。一部の実施形態において、複合体は、精製マトリックスとヒトＡＡＶ粒子との間に形成される。一部の実施形態において、複合体は、精製マトリックスと霊長類ＡＡＶ粒子との間に形成される。一部の実施形態において、複合体は、精製マトリックスとウシＡＡＶ粒子との間に形成される。一部の実施形態において、複合体は、精製マトリックスとトリＡＡＶ粒子との間に形成される。一部の実施形態において、複合体は、精製マトリックスとオランウータンＡＡＶ粒子との間に形成される。一部の実施形態において、複合体は、精製マトリックスとサルＡＡＶ粒子との間に形成される。一部の実施形態において、複合体は、精製マトリックスとマウスＡＡＶ粒子との間に形成される。
【0221】
[0204] 一部の実施形態では、環境因子を使用してＡＡＶ－精製マトリックス複合体のサイズを増加させる。本明細書で使用されるとき、語句「サイズの増加」は、複合体の直径の増加又は複合体の質量の増加を指し得る。一部の実施形態において、サイズの増加は、複合体のモル質量の増加である。一部の実施形態において、サイズの増加は、複合体の流体力学半径の増加である。
【0222】
[0205] 一部の実施形態において、本明細書に記載される複合体のサイズは、環境因子の適用後に増加する。一部の実施形態において、精製マトリックスと生物製剤、汚染物質、及び／又は他の分子との間に形成される複合体のサイズが増加する。一部の実施形態において、初期複合体のサイズは、複数の複合体が凝集する結果として増加する。一部の実施形態において、複数の複合体は、精製マトリックスの自己集合に起因して凝集する。一部の実施形態において、複数の複合体は、環境因子の適用に起因して凝集する。一部の実施形態において、サイズ増加は、複数のタンパク質ベースの精製マトリックス分子の間の非共有結合性相互作用によって安定化する。一部の実施形態において、サイズ増加は、相挙動のあるポリペプチド間の非共有結合性相互作用によって安定化する。一部の実施形態において、非共有結合性相互作用は、双極子間力、ファンデルワールス力、ロンドン分散力、水素結合、疎水性相互作用、及び／又は静電相互作用である。
【0223】
[0206] 一部の実施形態において、本開示の方法は、混合物中にある複数の複合体の形成を提供する。一部の実施形態では、全ての複合体のサイズが増加する。一部の実施形態では、一部の複合体のサイズが増加し、他の複合体のサイズは一定のままである。一部の実施形態において、１つの複合体のサイズが増加し、他の複合体のサイズは一定のままである。
【0224】
[0207] 一部の実施形態において、複合体のサイズは、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約５５倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約６５倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約８５倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約９５倍、少なくとも約１００倍、又はそれ以上に増加する。一部の実施形態において、初期複合体のサイズは、少なくとも約２倍に増加する。一部の実施形態において、初期複合体のサイズは、少なくとも約５倍に増加する。一部の実施形態において、初期複合体のサイズは、少なくとも約１０倍に増加する。一部の実施形態において、初期複合体のサイズは、少なくとも約２５倍に増加する。
【0225】
[0208] 一部の実施形態において、複合体のサイズの増加は、肉眼で目視観察することができる。例えば、複合体のサイズの増加は、複合体を含む組成物の色、明澄度、粘度の変化を生じさせてもよく、及び／又は複合体の溶解度の変化（例えば、溶液からの沈殿）を生じさせてもよく、ここでかかる変化は、ヒトがいかなる特殊な機器も使用することなく観察可能である。
【0226】
[0209] 一部の実施形態において、当業者は、複合体のサイズの増加を、当該技術分野において公知の方法により測定し得る。一部の実施形態において、複合体のサイズの増加は、Ｘ線散乱、小角Ｘ線散乱、広角Ｘ線散乱、動的光散乱、分析超遠心、サイズ排除クロマトグラフィー、及び光子相関分光法からなる群から選択される技法を利用して測定することができる。
【0227】
[0210] 一部の実施形態において、環境因子は、ＡＡＶ粒子と精製マトリックスとを含む組成物に加えられる第１の環境因子である。環境因子の例は、本開示全体を通じて提供される。
【0228】
[0211] 一部の実施形態において、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体は、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体を洗浄することによって１つ以上の不純物から分離される。一部の実施形態において、ＡＡＶ－精製マトリックスの洗浄は、ＡＡＶ粒子による精製マトリックスとの結合を妨げない。一部の実施形態において、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体は緩衝液で洗浄される。緩衝液の非限定的な例としては、酢酸ナトリウム、生理食塩水、グリシンＨＣＬ、カコジル酸塩緩衝液、トリス－ＨＣｌ、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、クエン酸塩、リン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）が挙げられる。一部の実施形態において、緩衝液は、アルギニン、ヒスチジン、尿素、プルロニック酸、及びtriton-x-100のうちの１つ以上を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体は溶媒で洗浄される。溶媒の非限定的な例としては、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、水、エタノール、トルエン、酢酸メチル、及び酢酸エチルが挙げられる。
【0229】
[0212] 一部の実施形態において、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体は、サイズを基準として少なくとも１つの不純物から分離される。一部の実施形態において、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体は、直径を基準として少なくとも１つの不純物から分離される。一部の実施形態において、ＡＡＶ－精製マトリックスは、半径を基準として少なくとも１つの不純物から分離される。一部の実施形態において、ＡＡＶ－精製マトリックスは、質量を基準として少なくとも１つの不純物から分離される。一部の実施形態において、ＡＡＶ－精製マトリックスは、モル質量を基準として少なくとも１つの不純物から分離される。一部の実施形態において、ＡＡＶ－精製マトリックスは、遠心、タンジェンシャルフローろ過、分析超遠心、膜クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ノーマルフローろ過、音波分離、遠心、向流遠心、及び高速タンパク質液体クロマトグラフィーからなる群から選択される技法を用いることによってサイズを基準として少なくとも１つの不純物から分離される。
【0230】
[0213] 一部の実施形態において、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体は、遠心を用いてサイズを基準として少なくとも１つの不純物から分離される。一部の実施形態において、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体を少なくとも１つの不純物から分離するのに約１００相対遠心力（ＲＣＦ）～約１６，０００ＲＣＦの間、例えば、約５００～約１６，０００ＲＣＦ、約１，０００ＲＣＦ～１６，０００ＲＣＦが適用される。一部の実施形態において、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体を少なくとも１つの不純物から分離するのに少なくとも５００相対遠心力（ＲＣＦ）、例えば、少なくとも約５００ＲＣＦ、少なくとも約６００ＲＣＦ、少なくとも約７００ＲＣＦ、少なくとも約８００ＲＣＦ、少なくとも約９００ＲＣＦ、少なくとも約１０００ＲＣＦ、少なくとも約２０００ＲＣＦ、少なくとも約３０００ＲＣＦ、少なくとも約３５００ＲＣＦ、少なくとも約４０００ＲＣＦ、少なくとも約５０００ＲＣＦ、少なくとも約６０００ＲＣＦ、少なくとも約７０００ＲＣＦ、少なくとも約８０００ＲＣＦ、少なくとも約９０００ＲＣＦ、少なくとも約１０，０００ＲＣＦ、少なくとも約１１，０００ＲＣＦ、少なくとも約１２，０００ＲＣＦ、少なくとも約１３，０００ＲＣＦ、少なくとも約１４，０００ＲＣＦ、少なくとも約１５，０００ＲＣＦ、少なくとも約１６，０００ＲＣＦ、少なくとも約１７，０００ＲＣＦ、少なくとも約１８，０００ＲＣＦ、少なくとも約１９，０００ＲＣＦ、又は少なくとも約２０，０００ＲＣＦが適用される。
【0231】
[0214] 一部の実施形態において、ＡＡＶ－精製マトリックスは、ＴＦＦを用いてサイズを基準として少なくとも１つの不純物から分離される。一部の実施形態では、ＴＦＦを用いてＡＡＶ－精製マトリックスを少なくとも１つの不純物からサイズを基準として分離してもよく、本明細書では「ダイアフィルトレーション」とも称される工程である。ダイアフィルトレーションは、洗浄及び溶出の両方のステップを含む。洗浄は、ＡＡＶ－精製マトリックスを含む組成物中に含まれる不純物を取り除く。溶出は、精製されたＡＡＶ粒子を精製マトリックスから分離する。一部の実施形態において、ＡＡＶ－精製マトリックスはＴＦＦを用いて濃縮される。一部の実施形態では、ＴＦＦを用いて組成物内でのＡＡＶ－精製マトリックスの濃度を増加させてもよく、本明細書では「濃縮」とも称される工程である。
【0232】
[0215] タンジェンシャルフローろ過は、分子の分離及び／又は濃縮に精密ろ過膜及び限外ろ過膜の両方を採用する。精密ろ過膜は、典型的には０．１μｍ～１０μｍの間の細孔径を有する。限外ろ過膜は、典型的には、細孔径０．００１μｍ～０．１μｍの間の、精密ろ過膜よりも小さい細孔径を有する。一部の実施形態において、本開示の方法では、細孔径約０．００１μｍ～約１０μｍの間の膜が利用される。一部の実施形態において、膜は、約０．００１μｍ、約０．０１μｍ、約０．０５μｍ、約０．１μｍ、約０．２μｍ、約０．３μｍ、約０．４μｍ、約０．５μｍ、約０．６μｍ、約０．７μｍ、約０．８μｍ、約０．９μｍ、約１．０μｍ、約２μｍ、約３μｍ、約４μｍ、約５μｍ、約６μｍ、約７μｍ、約８μｍ、約９μｍ、又は約１０μｍ（これらの間にある全ての値及び範囲を含む）の細孔径を有する。一部の実施形態において、膜は、約０．１μｍの細孔径を有する。一部の実施形態において、膜は、約０．２μｍの細孔径を有する。
【0233】
[0216] 一部の実施形態において、膜は、親水性化ポリフッ化ビニリデン（poly(vinylildene difluoride)）（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルスルホン（polyetheresulfone）（ＰＥＳ）、リン酸セルロース、ジエチルアミノエチルセルロース、ポリスルホン（polysufone）、再生セルロース、ナイロン、硝酸セルロース、酢酸セルロース、ペグ化ＰＥＳ、及びスルホン化ＰＥＳで作られている。
【0234】
[0217] ＴＦＦでは、膜が混合流体の流れに対して接線方向に置かれ、混合流体が膜の第１の面の上を接線方向に流される。同時に、流体媒質が膜の第２の表面と接触して置かれる。膜間差圧が、流体を膜に押し通し、透過性分子を共に運んでいく力である。
【0235】
[0218] 一部の実施形態において、１つ以上の汚染物質又は不純物からのサイズを基準としたＡＡＶと精製マトリックスとの複合体の分離は、約０．１バール～約３バールの間の膜間差圧のＴＦＦを用いて実施される。一部の実施形態において、膜間差圧は、約０．１バール、約０．２バール、約０．３バール、約０．４バール、約０．５バール、約０．６バール、約０．７バール、約０．８バール、約０．９バール、約１．０バール、約１．１バール、約１．２バール、約１．３バール、約１．４バール、約１．５バール、約１．６バール、約１．７バール、約１．８バール、約１．９バール、約２．０バール、約２．１バール、約２．２バール、約２．３バール、約２．４バール、約２．５バール、約２．６バール、約２．７バール、約２．８バール、約２．９バール、又は約３．０バール（これらの間にある全ての値及び範囲を含む）である。一部の実施形態において、膜間差圧は約１．５バールである。
【0236】
[0219] 一部の実施形態において、１つ以上の汚染物質からの本明細書に記載されるＡＡＶ粒子と精製マトリックスとの複合体の分離を向上させるため、クロスフロー流速が調整される。クロスフロー流速は、溶液の流れが供給チャネルを通って膜を越える速度である。これは、ろ液の流れを制限し得る分子を押し流す力を提供する。一部の実施形態において、クロスフロー流速は、約５００Ｌ／ｍ２／ｈ～約２０００Ｌ／ｍ２／ｈの間である。一部の実施形態において、クロスフロー流速は、約５００Ｌ／ｍ２／ｈ、約６００Ｌ／ｍ２／ｈ、約７００Ｌ／ｍ２／ｈ、約８００Ｌ／ｍ２／ｈ、約９００Ｌ／ｍ２／ｈ、約１０００Ｌ／ｍ２／ｈ、約１１００Ｌ／ｍ２／ｈ、約１２００Ｌ／ｍ２／ｈ、約１３００Ｌ／ｍ２／ｈ、約１４００Ｌ／ｍ２／ｈ、約１５００Ｌ／ｍ２／ｈ、約１６００Ｌ／ｍ２／ｈ、約１７００Ｌ／ｍ２／ｈ、約１８００Ｌ／ｍ２／ｈ、約１９００Ｌ／ｍ２／ｈ、又は約２０００Ｌ／ｍ２／ｈの間（これらの間にある全ての値及び範囲を含む）である。一部の実施形態において、クロスフロー流速は、約９６０Ｌ／ｍ２／ｈである。一部の実施形態において、ＴＦＦ分離は、精製マトリックスとＡＡＶ粒子とを含む複合体を保持するが、汚染物質は通過させる膜を使用することによって行われる。
【0237】
[0220] 一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体を含む組成物のｐＨを変化させることによってＡＡＶ－精製マトリックス複合体から溶出される。一部の実施形態では、ｐＨを約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、又は約６．０単位増加させる。一部の実施形態では、ｐＨを約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、又は約６．０単位低下させる。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体から約２のｐＨで溶出される。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体から約３のｐＨで溶出される。
【0238】
[0221] 一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体を含む組成物の温度を変化させることによってＡＡＶ－精製マトリックス複合体から溶出される。一部の実施形態では、温度を０．５℃、約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、又は約４０℃上昇させる。一部の実施形態では、温度を約０．５℃、約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、又は約４０℃低下させる。
【0239】
[0222] 一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体を含む組成物のイオン強度を変化させることによってＡＡＶ－精製マトリックス複合体から溶出される。一部の実施形態において、イオン強度の変化は、塩濃度を増加させることによってもたらされる。一部の実施形態において、イオン強度の変化は、塩濃度を低下させることによってもたらされる。塩の非限定的な例としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、グリシン、アルギニン、硫酸銅、ヨウ化ナトリウム、硫酸アンモニウム、及び硫酸ナトリウムが挙げられる。一部の実施形態では、タンパク質ベースの精製マトリックスと生物製剤、汚染物質、及び／又は分子とを含む組成物中の塩濃度を変化させるために透析が用いられる。
【0240】
[0223] 一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体を含む組成物に還元剤を添加することによってＡＡＶ－精製マトリックス複合体から溶出される。一部の実施形態において、１つ以上の還元剤は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２－メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ヒドラジン、水素化ホウ素、アミンボラン類、低級アルキル置換アミンボラン類、トリエタノールアミン、及びＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）からなる群から選択される。
【0241】
[0224] 一部の実施形態では、環境因子を用いてＡＡＶ粒子がＡＡＶ－精製マトリックス複合体から溶出される。一部の実施形態において、環境因子は、ＡＡＶ粒子とＡＡＶ－精製マトリックス複合体とを含む組成物に加えられる第１の環境因子である。一部の実施形態において、環境因子は、ＡＡＶ粒子とＡＡＶ－精製マトリックス複合体とを含む組成物に加えられる第２の環境因子である。環境因子の非限定的な例は、本開示全体を通じて提供される。
【0242】
[0225] 一部の実施形態において、本明細書に記載される精製マトリックスを使用してＡＡＶ粒子を精製する方法は、約３０分～約２４時間で完了する。一部の実施形態において、本明細書に記載される方法は、約３０分～約２４時間で完了する。一部の実施形態において、本方法は、約３０分、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、又は約２４時間で完了する。一部の実施形態において、本明細書に記載される精製マトリックスを使用してＡＡＶ粒子を精製する方法は、約２時間～約１０時間で完了する。
【0243】
[0226] 一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子の精製収率は、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％である。
【0244】
[0227] 一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の純度に精製される。
【0245】
[0228] 一部の実施形態において、本明細書に記載される方法は、１日に少なくとも０．１ｋｇ、少なくとも約０．２ｋｇ、少なくとも約０．３ｋｇ、少なくとも約０．４ｋｇ、少なくとも約０．５ｋｇ、少なくとも約０．６ｋｇ、少なくとも約０．７ｋｇ、少なくとも約０．８ｋｇ、少なくとも約０．９ｋｇ、少なくとも約１ｋｇ、少なくとも約２ｋｇ、少なくとも約３ｋｇ、少なくとも約４ｋｇ、少なくとも約５ｋｇ、少なくとも約６ｋｇ、少なくとも約７ｋｇ、少なくとも約８ｋｇ、少なくとも約９ｋｇ、少なくとも約１０ｋｇ、又はそれ以上のＡＡＶ（これらの間にある全ての値及び範囲を含む）の精製が可能である。
【0246】
[0229] 一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、その生物学的活性及び／又は構造を保持している。一部の実施形態において、精製されたＡＡＶ粒子は、生物学的活性の亢進を呈する。
【0247】
[0230] 一部の実施形態において、精製されたＡＡＶ粒子は、精製後にその感染力の約９５％を保持している。一部の実施形態において、精製されたＡＡＶ粒子は、精製後にその感染力の約９６％を保持している。一部の実施形態において、精製されたＡＡＶ粒子は、精製後にその感染力の約９７％を保持している。一部の実施形態において、精製されたＡＡＶ粒子は、精製後にその感染力の約９８％を保持している。一部の実施形態において、精製されたＡＡＶ粒子は、精製後にその感染力の約９９％を保持している。一部の実施形態において、精製されたＡＡＶ粒子は、精製後にその感染力の約１００％を保持している。
【0248】
[0231] 一部の実施形態において、本明細書に開示されるマトリックスを使用して精製されたＡＡＶ粒子を含む組成物は、「内包型」のＡＡＶ粒子が濃縮されている。内包型ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶカプシド内に封入された所望のゲノム材料（例えば、ＡＡＶゲノム又は移入用カセット）を含む。空のＡＡＶ粒子は、所望のゲノム材料を欠いている。
【0249】
[0232] 試料中の内包型粒子及び空の粒子の相対量を決定する技法は幾つかある。例えば、本開示の精製マトリックスから溶出される試料中に存在するＡＡＶ粒子の総数は、ＥＬＩＳＡを用いて決定されてもよい。一部の実施形態において、本開示の精製マトリックスから溶出される試料中に存在するウイルスゲノムの数は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を用いて決定されてもよい。一部の実施形態において、ｑＰＣＲプライマーは逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を標的とする。ＩＴＲ配列を標的とするプライマーを利用したｑＰＣＲは、本明細書では、「ＩＴＲ ｑＰＣＲ」と称される。ＡＡＶ粒子の総数に対するウイルスゲノムの数の比が、全粒子に対する内包型粒子の比の近似を与える。一部の実施形態では、ｑＰＣＲ：ＥＬＩＳＡ値（例えば、試料中に存在するウイルスゲノムの数：試料中に存在するＡＡＶ粒子の総数）を用いて、全粒子に対する相対的な内包型粒子の比が近似される。
【0250】
[0233] 一部の実施形態において、ｑＰＣＲ：ＥＬＩＳＡ値は、本開示の精製マトリックスによる精製後に増加する。一部の実施形態において、本開示の精製マトリックスによる精製後、試料のｑＰＣＲ：ＥＬＩＳＡ値は、精製前の試料のｑＰＣＲ：ＥＬＩＳＡ値と比較して少なくとも約２５％、例えば少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約１００％増加する。一部の実施形態において、本開示の精製マトリックスによる精製後、試料のｑＰＣＲ：ＥＬＩＳＡ値は、精製前の試料のｑＰＣＲ：ＥＬＩＳＡ値と比較して少なくとも約５０％増加する。
【0251】
ＡＡＶ粒子を安定化させる方法
[0234] 本発明者らは、本明細書に記載される精製マトリックスが、予想外にも、ＡＡＶ粒子のその生産、精製、及び／又は貯蔵時の安定化を助け得ることを発見した。本明細書においてＡＡＶ粒子との関連で使用されるとき、用語「安定化させる」又は「安定化」とは、精製マトリックスが、複数のＡＡＶ粒子を含むＡＡＶ試料の分解又は凝集を低減し、ＡＡＶ粒子が他のタンパク質（例えば、細胞のＡＡＶ受容体）に結合するのを防止し、又は生産株細胞による合成を亢進させる能力を指す。
[0234] 本発明者らは、本明細書に記載される精製マトリックスが、予想外にも、ＡＡＶ粒子のその生産、精製、及び／又は貯蔵時の安定化を助け得ることを発見した。本明細書においてＡＡＶ粒子との関連で使用されるとき、用語「安定化させる」又は「安定化」とは、精製マトリックスが、複数のＡＡＶ粒子を含むＡＡＶ試料の分解又は凝集を低減し、ＡＡＶ粒子が他のタンパク質（例えば、細胞のＡＡＶ受容体）に結合するのを防止し、又は生産株細胞による合成を亢進させる能力を指す。
【0252】
[0235] 従って、一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子をその生産、精製、又は貯蔵時に精製マトリックスと接触させる。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子のその生産時の収率を増加させる方法は、ＡＡＶ生産細胞を精製マトリックスの存在下に培養することを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子をその生産時に安定化させる方法は、ＡＡＶ生産細胞を精製マトリックスの存在下に培養することを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子をその精製時に安定化させる方法は、ＡＡＶ粒子をその精製時に精製マトリックスと接触させることを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子をその貯蔵時に安定化させる方法は、ＡＡＶ粒子を精製マトリックスの存在下に貯蔵することを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子の保管寿命を増加させる方法は、ＡＡＶ粒子を精製マトリックスの存在下に貯蔵することを含む。
【0253】
[0236] 例えば、精製マトリックスは、培養下での生産時にＡＡＶ粒子と接触させてもよい。ＡＡＶ粒子は、典型的には、ＨＥＫ２９３細胞又はＳｆ９細胞などの生産細胞株で生産される。一部の実施形態において、生産細胞株には、ＡＡＶの生産に必要な様々な遺伝子を含有する１つ以上のプラスミドがトランスフェクトされる（例えば、三重トランスフェクションプロトコル）。一部の実施形態において、生産細胞株には、ＡＡＶの生産に必要な様々な遺伝子を含有するバキュロウイルス構築物を感染させる。培養下のＡＡＶ生産細胞に精製マトリックスを（例えば、それを組織培養培地に添加することにより）添加すると、この工程で入手されるＡＡＶ粒子の収率及び／又は品質が増加し得る。一部の実施形態において、精製マトリックスは、約１μＭ～約１ｍＭ、例えば、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約８μＭ、約９μＭ、約１０μＭ、約２０μＭ、約３０μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、約６０μＭ、約７０μＭ、約８０μＭ、約９０μＭ、約１００μＭ、約１５０μＭ、約２００μＭ、約２５０μＭ、約３００μＭ、約３５０μＭ、約４００μＭ、約４５０μＭ、約５００μＭ、約５５０μＭ、約６００μＭ、約６５０μＭ、約７００μＭ、約７５０μＭ、約８００μＭ、約８５０μＭ、約９００μＭ、約９５０μＭ、又は約１ｍＭ（間にある全ての値及び範囲を含む）の濃度で培養物に添加されてもよい。一部の実施形態において、精製マトリックスは、約１０μＭの濃度で培養物に添加される。一部の実施形態において、精製マトリックスは、約１００μＭの濃度で培養物に添加される。いかなる理論によっても拘束されることなく、精製マトリックスは、ＡＡＶ粒子が生産されているときにそれに結合する、及び／又はそれを物理的に取り囲むことができ、それによって、ＡＡＶ粒子に対する細胞受容体を含め、他のタンパク質にＡＡＶ粒子が結合するのを防止すると考えられる。従って、培養細胞によって生産され、培養培地中に分泌されるＡＡＶは、精製マトリックスの存在下にあれば、生産株細胞を再感染させることができないであろう。一部の実施形態において、培養下のＡＡＶ生産細胞株に精製マトリックスを添加すると、ＡＡＶ粒子の収率が増加し得る。例えば、培養下のＡＡＶ生産細胞株に精製マトリックスを添加すると、精製マトリックスなしに培養される細胞と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、又はそれ以上のウイルス力価の増加が達成されることになり得る。
【0254】
[0237] 別の例として、精製されたＡＡＶ試料が（本明細書に記載される方法、又は当該技術分野において公知の他の方法を用いて）調製された後、貯蔵前（例えば、凍結前）に精製マトリックスが試料に添加されてもよい。いかなる理論によっても拘束されることなく、精製マトリックスはＡＡＶ粒子に結合し、及び／又はそれを物理的に取り囲み、ひいてはそれが他のＡＡＶ粒子と凝集するのを防止し、また、特に複数回の凍結融解サイクル中に、ＡＡＶ粒子を分解から保護する助けにもなると考えられる。ＡＡＶ粒子の凝集は、顕微鏡法によって目視で、及び／又はＸ線散乱、レーザー回折、分析超遠心、動的光散乱、ナノ粒子トラッキング解析、共鳴質量測定、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー、光遮蔽法、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される技法によって観察されてもよい。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、精製マトリックスの存在下に、約－８０℃～約４０℃の間、例えば、約－８０℃、約－７５℃、約－７０℃、約－６５℃、約－６０℃、約－５５℃、約－５０℃、約－４５℃、約－４０℃、約－３５℃、約－３０℃、約－２５℃、約－２０℃、約－１５℃、約－１０℃、約－５℃、約０℃、約４℃、約５℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、又は約４０℃の温度で凍結及び貯蔵されてもよい。
【0255】
[0238] 一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子が精製マトリックスの存在下に貯蔵されるとき、ＡＡＶ粒子の保管寿命は、精製マトリックスが存在しない中で貯蔵した試料と比較すると、少なくとも約１０％長くなる。例えば、一部の実施形態において、保管寿命は、精製マトリックスが存在しない中、ほぼ同じ温度で貯蔵したＡＡＶ粒子の保管寿命と比べて少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、又は少なくとも約５００％長くなる。
【0256】
[0239] 一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、精製マトリックスの存在下に約－８０℃で貯蔵される。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、精製マトリックスの存在下に約－２０℃で貯蔵される。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、精製マトリックスの存在下に約４℃で貯蔵される。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子が精製マトリックスの存在下に約－８０℃、約－２０℃、又は約４℃で貯蔵されたとき、ＡＡＶの保管寿命は、それが精製マトリックスが存在しない中で貯蔵された場合と比べて少なくとも約１０％長くなる。例えば、ＡＡＶ粒子の保管寿命は、精製マトリックスが存在しない中、同じ温度で貯蔵したＡＡＶの保管寿命と比べて少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、又は少なくとも約５００％長くなり得る。本明細書で使用されるとき、増加した保管寿命とは、ＡＡＶ粒子が貯蔵されて、実質的に同じレベルの感染力をなおも保持している時間の長さの増加を指し得る。
【0257】
[0240] 一部の実施形態において、精製マトリックスを使用してＡＡＶ粒子をその生産、精製、及び／又は貯蔵時に安定化させると、「内包型」ＡＡＶ粒子の収率が増加し得る。従って、一部の実施形態において、精製マトリックスと接触させたときのＡＡＶ粒子の安定化の向上は、内包型ＡＡＶ粒子の数を空の粒子と比較して定量することにより測定し得る。一部の実施形態において、ＡＡＶ試料の生産、精製、及び／又は貯蔵時に精製マトリックスを使用すると、精製マトリックスの存在下に生産、精製、及び／又は貯蔵されないＡＡＶ試料と比較したとき、ｑＰＣＲ：ＥＬＩＳＡ値が増加することになり得る。
【0258】
環境因子
[0241] 一部の実施形態において、本開示の方法は、精製マトリックスとＡＡＶ粒子とを含む組成物に対して１つ以上の環境因子を提供する。一部の実施形態において、精製マトリックスとＡＡＶ粒子とを含む組成物に１つ以上の環境因子が適用される。環境因子を適用すると、精製マトリックスとＡＡＶ粒子とを含む組成物に変化が生じる。一部の実施形態では、環境因子を使用して、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体のサイズを増加させる。一部の実施形態では、環境因子を使用して、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体を含む組成物から１つ以上の不純物を除去する。一部の実施形態では、環境因子を使用して、精製マトリックス複合体から１つ以上のＡＡＶ粒子を溶出させる。一部の実施形態において、１つ以上の環境因子は、タンパク質ベースの精製マトリックスと生物製剤、汚染物質、及び／又は分子との間の複合体のサイズの増加を生じさせる。一部の実施形態において、１つ以上の環境因子は、相挙動のあるポリペプチドの凝集を生じさせる。一部の実施形態において、１つ以上の環境因子は、ＡＡＶ粒子がその天然の構造、機能、及び活性を保持することを可能にする。一部の実施形態において、１つ以上の環境因子は、ＡＡＶ粒子がその天然の構造、機能、及び活性を亢進させることを可能にする。
[0241] 一部の実施形態において、本開示の方法は、精製マトリックスとＡＡＶ粒子とを含む組成物に対して１つ以上の環境因子を提供する。一部の実施形態において、精製マトリックスとＡＡＶ粒子とを含む組成物に１つ以上の環境因子が適用される。環境因子を適用すると、精製マトリックスとＡＡＶ粒子とを含む組成物に変化が生じる。一部の実施形態では、環境因子を使用して、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体のサイズを増加させる。一部の実施形態では、環境因子を使用して、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体を含む組成物から１つ以上の不純物を除去する。一部の実施形態では、環境因子を使用して、精製マトリックス複合体から１つ以上のＡＡＶ粒子を溶出させる。一部の実施形態において、１つ以上の環境因子は、タンパク質ベースの精製マトリックスと生物製剤、汚染物質、及び／又は分子との間の複合体のサイズの増加を生じさせる。一部の実施形態において、１つ以上の環境因子は、相挙動のあるポリペプチドの凝集を生じさせる。一部の実施形態において、１つ以上の環境因子は、ＡＡＶ粒子がその天然の構造、機能、及び活性を保持することを可能にする。一部の実施形態において、１つ以上の環境因子は、ＡＡＶ粒子がその天然の構造、機能、及び活性を亢進させることを可能にする。
【0259】
[0242] 一部の実施形態において、環境因子は、温度の変化である。一部の実施形態では、温度を約０．５℃、約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、又は約４０℃増加させる。一部の実施形態では、温度を約０．５℃、約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、又は約４０℃低下させる。
【0260】
[0243] 一部の実施形態において、環境因子は、ｐＨの変化である。一部の実施形態では、ｐＨを約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、又は約６．０単位増加させる。
【0261】
[0244] 一部の実施形態では、ｐＨを約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、又は約６．０単位低下させる。
【0262】
[0245] 一部の実施形態において、環境因子は、イオン強度の変化である。一部の実施形態において、イオン強度の変化は、塩の濃度を増加させることによってもたらされる。一部の実施形態において、イオン強度の変化は、塩の濃度を低下させることによってもたらされる。塩の非限定的な例としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸銅、ヨウ化ナトリウム、及び硫酸ナトリウムが挙げられる。一部の実施形態において、塩は、約０．１Ｍ～約５Ｍの間、例えば、約０．１Ｍ、約０．２Ｍ、約０．３Ｍ、約０．４Ｍ、約０．５Ｍ、約０．６Ｍ、約０．７Ｍ、約０．８Ｍ、約０．９Ｍ、約１Ｍ、約１．１Ｍ、約１．２Ｍ、約１．３Ｍ、約１．４Ｍ、約１．５Ｍ、約１．６Ｍ、約１．７Ｍ、約１．８Ｍ、約１．９Ｍ、約２Ｍ、約２．１Ｍ、約２．２Ｍ、約２．３Ｍ、約２．４Ｍ、約２．５Ｍ、約２．６Ｍ、約２．７Ｍ、約２．８Ｍ、約２．９Ｍ、約３Ｍ、約３．１Ｍ、約３．２Ｍ、約３．３Ｍ、約３．４Ｍ、約３．５Ｍ、約３．６Ｍ、約３．７Ｍ、約３．８Ｍ、約３．９Ｍ、約４Ｍ、約４．１Ｍ、約４．２Ｍ、約４．３Ｍ、約４．４Ｍ、約４．５Ｍ、約４．６Ｍ、約４．７Ｍ、約４．８Ｍ、約４．９Ｍ、又は約５Ｍの濃度を有する。一部の実施形態において、塩は、０．６Ｍの濃度を有する。一部の実施形態では、タンパク質ベースの精製マトリックスと生物製剤、汚染物質、及び／又は分子とを含む組成物の塩の濃度を変化させるために透析が用いられる。
【0263】
[0246] 一部の実施形態において、環境因子は、補因子の添加である。補因子の非限定的な例としては、カルシウム、マグネシウム、コバルト、銅、亜鉛、鉄、マンガン、セレン、モリブデン、カリウム、補酵素Ａ（ＣｏＡ）、ヌクレオシド三リン酸、及びビタミン（例えば、ビタミンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、又はＦ）が挙げられる。一部の実施形態において、補因子は、カルシウムである。一部の実施形態において、ヌクレオシド三リン酸は、アデノシン三リン酸、ウリジン三リン酸、グアノシン三リン酸、シチジン三リン酸、又はチミジン三リン酸である。一部の実施形態において、ビタミンは脂溶性物質である。一部の実施形態において、ビタミンは水溶性である。ビタミンの非限定的な例としては、ビタミンＡ、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン又はナイアシンアミド）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン、ピリドキサール、又はピリドキサミン、又は塩酸ピリドキシン）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ９（葉酸）、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、Ｋ１、及びＫ２、葉酸、及びビオチンが挙げられる。
【0264】
[0247] 一部の実施形態において、環境因子は、タンパク質ベースの精製マトリックスの濃度の変化である。一部の実施形態において、環境因子は、生物製剤、汚染物質、及び／又は他の分子の濃度の変化である。
【0265】
[0248] 一部の実施形態において、環境因子は、タンパク質ベースの精製マトリックスと生物製剤、汚染物質、及び／又は分子とを含む組成物の圧力の変化である。一部の実施形態において、圧力の変化は、組成物の容積を増加又は低下させることによって達成されてもよい。
【0266】
[0249] 一部の実施形態において、環境因子は、１つ以上の界面活性剤の添加である。一部の実施形態において、１つ以上の界面活性剤は、遊離脂肪酸塩、石鹸、ラウリル硫酸ナトリウムなどの脂肪酸スルホン酸塩、エトキシ化プロピレングリコールなどのエトキシ化化合物、レシチン、ポリグルコン酸塩、第４級アンモニウム塩、リグニンスルホン酸塩、３－（（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ）－１－プロパンスルホン酸塩（ＣＨＡＰＳ）、スクロース及びグルコースを含めた糖類、Triton X-100、及びNP-40である。一部の実施形態において、界面活性剤は、アニオン性、非イオン性、又は両性である。
【0267】
[0250] 一部の実施形態において、環境因子は、１つ以上の分子クラウディング剤の添加である。分子クラウディング剤の非限定的な例としては、ポリエチレングリコール、デキストラン、及びフィコールが挙げられる。ＰＥＧには、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ８０００、及びＰＥＧ１００００が含まれ得る。
【0268】
[0251] 一部の実施形態において、環境因子は、１つ以上の酸化剤の添加である。酸化剤の非限定的な例としては、過酸化水素、親水的又は疎水的に活性化させた過酸化水素、予め形成された過酸、モノ過硫酸塩又は次亜塩素酸塩が挙げられる。
【0269】
[0252] 一部の実施形態において、環境因子は、１つ以上の還元剤の添加である。一部の実施形態において、１つ以上の還元剤は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２－メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ヒドラジン、水素化ホウ素、アミンボラン類、低級アルキル置換アミンボラン類、トリエタノールアミン、及びＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）からなる群から選択される。一部の実施形態において、環境因子は、１つ以上の変性剤の添加である。変性剤の非限定的な例としては、尿素、塩酸グアニジン、グアニジン、サリチル酸ナトリウム、ジメチルスルホキシド、及びプロピレングリコールが挙げられる。
【0270】
[0253] 一部の実施形態において、環境因子は、１つ以上の酵素の添加である。酵素の非限定的な例としては、プロテアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、シンテターゼ、トランスフェラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどのヌクレアーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、デヒドロゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、及びリパーゼが挙げられる。
【0271】
[0254] 一部の実施形態において、環境因子は、電磁波の適用である。一部の実施形態において、環境因子は、光の適用である。一部の実施形態において、電磁波は、約０．０００１ｎｍ～約１００ｍの間の波長を有する。一部の実施形態において、電磁波は、ガンマ線、Ｘ線、紫外線、可視光、赤外線、及び電波からなる群から選択される。一部の実施形態において、電磁波はガンマ線である。一部の実施形態において、ガンマ線は、約０．０００１ｎｍ～約０．０１ｎｍの間、例えば、０．０００１ｎｍ、０．０００５ｎｍ、０．００１ｎｍ、０．００２ｎｍ、０．００３ｎｍ、０．００４ｎｍ、０．００５ｎｍ、０．００６ｎｍ、０．００７ｎｍ、０．００８ｎｍ、０．００９ｎｍ、及び０．０１ｎｍの波長を有する。一部の実施形態において、Ｘ線は、約０．０１ｎｍ～約１０ｎｍの間、例えば、約０．０１ｎｍ、０．０２ｎｍ、０．０３ｎｍ、０．０４ｎｍ、０．０５ｎｍ、０．０６ｎｍ、０．０７ｎｍ、０．０８ｎｍ、０．０９ｎｍ、０．１０ｎｍ、０．２ｎｍ、０．３ｎｍ、０．４ｎｍ、０．５ｎｍ、０．６ｎｍ、０．７ｎｍ、０．８ｎｍ、０．９ｎｍ、１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、又は約１０ｎｍの波長を有する。一部の実施形態において、紫外線放射は、約１０ｎｍ～約４００ｎｍの間、例えば、約１０ｎｍ、約２０ｎｍ、約３０ｎｍ、約４０ｎｍ、約５０ｎｍ、約６０ｎｍ、約７０ｎｍ、約８０ｎｍ、約９０ｎｍ、約１００ｎｍ、約１５０ｎｍ、約２００ｎｍ、約２５０ｎｍ、約２８０ｎｍ、約３００ｎｍ、約３５０ｎｍ、又は約４００ｎｍの波長を有する。一部の実施形態において、可視光波は、約４００ｎｍ～約８００ｎｍの間、例えば、約４００ｎｍ、約４５０ｎｍ、約５００ｎｍ、約５５０ｎｍ、約６００ｎｍ、約６５０ｎｍ、約７００ｎｍ、約７５０ｎｍ、又は約８００ｎｍの波長を有する。一部の実施形態において、赤外線放射は、約８００ｎｍ～約０．１ｃｍの間、例えば、約８００ｎｍ、約１μｍ、約２μｍ、約３μｍ、約４μｍ、約５μｍ、約６μｍ、約７μｍ、約８μｍ、約９μｍ、約１０μｍ、約２０μｍ、約３０μｍ、約４０μｍ、約５０μｍ、約６０μｍ、約７０μｍ、約８０μｍ、約９０μｍ、約１００μｍ、約２００μｍ、約３００μｍ、約４００μｍ、約５００μｍ、約６００μｍ、約７００μｍ、約８００μｍ、約９００μｍ、又は約０．１ｃｍの波長を有する。一部の実施形態において、電波は、約０．１ｃｍ～１００ｍの間、例えば、約０．１ｃｍ、約１ｃｍ、約１０ｃｍ、約１００ｃｍ、約１０００ｃｍ、約２０００ｃｍ、約３０００ｃｍ、約４０００ｃｍ、約５０００ｃｍ、約６０００ｃｍ、約７０００ｃｍ、約８０００ｃｍ、約９０００ｃｍ、又は約１００ｍの波長を有する。
【0272】
[0255] 一部の実施形態において、環境因子は、音波の適用である。一部の実施形態において、音波は、約１Ｈｚ～２０００ｋＨｚの間の周波数を有する。一部の実施形態において、音波は、約１Ｈｚ、約５Ｈｚ、約１０Ｈｚ、約２０Ｈｚ、約３０Ｈｚ、約４０Ｈｚ、約５０Ｈｚ、約６０Ｈｚ、約７０Ｈｚ、約８０Ｈｚ、約９０Ｈｚ、約１００Ｈｚ、約２００Ｈｚ、約３００Ｈｚ、約４００Ｈｚ、約５００Ｈｚ、約６００Ｈｚ、約７００Ｈｚ、約８００Ｈｚ、約９００Ｈｚ、約１ｋＨｚ、約１００ｋＨｚ、約２００ｋＨｚ、約３００ｋＨｚ、約４００ｋＨｚ、約５００ｋＨｚ、約６００ｋＨｚ、約７００ｋＨｚ、約８００ｋＨｚ、約９００ｋＨｚ、約１０００ｋＨｚ、約１１００ｋＨｚ、約１２００ｋＨｚ、約１３００ｋＨｚ、約１４００ｋＨｚ、約１５００ｋＨｚ、約１６００ｋＨｚ、約１７００ｋＨｚ、約１８００ｋＨｚ、約１９００ｋＨｚ、又は約２０００ｋＨｚの周波数を有する。
【実施例】
【0273】
実施例１．ＡＡＶ結合ポリペプチドの開発
[0256] 野生型ＡＡＶＲエクトドメインの部位特異的突然変異誘発を実施する。より具体的には、配列番号３３～４７のうちのいずれか１つから、あるアミノ酸配列を含むＡＡＶ結合ポリペプチドを選択し、それを標準的なクローン技術を用いた１つ以上のアミノ酸残基の部位特異的突然変異誘発に供する。ＡＡＶ結合ポリペプチドの親和性を特徴付ける。ＡＡＶに対して少なくとも５０ｎＭ又はそれ以上の結合親和性を有するＡＡＶ結合ポリペプチドを選択する。ｐＨの変化及び塩の添加を含めた様々な環境因子がＡＡＶへのＡＡＶ結合ポリペプチドの結合を破綻させる能力を特徴付ける。
[0256] 野生型ＡＡＶＲエクトドメインの部位特異的突然変異誘発を実施する。より具体的には、配列番号３３～４７のうちのいずれか１つから、あるアミノ酸配列を含むＡＡＶ結合ポリペプチドを選択し、それを標準的なクローン技術を用いた１つ以上のアミノ酸残基の部位特異的突然変異誘発に供する。ＡＡＶ結合ポリペプチドの親和性を特徴付ける。ＡＡＶに対して少なくとも５０ｎＭ又はそれ以上の結合親和性を有するＡＡＶ結合ポリペプチドを選択する。ｐＨの変化及び塩の添加を含めた様々な環境因子がＡＡＶへのＡＡＶ結合ポリペプチドの結合を破綻させる能力を特徴付ける。
【0274】
実施例２．ＡＡＶ結合ポリペプチドと相挙動のあるポリペプチドとを含む精製マトリックスを使用したＡＡＶの精製
[0257] 実施例１のＡＡＶ結合ポリペプチドを含む精製マトリックスを作成し、特徴付ける。より具体的には、（ｉ）実施例１のＡＡＶ結合ポリペプチドと（ｉｉ）相挙動のあるポリペプチド（例えば、ＥＬＰ）とを含む融合タンパク質を、標準プロトコルに従い大腸菌（Escherichia coli）で発現させる。等温滴定型熱量測定法を利用してＡＡＶ粒子に対する融合タンパク質の親和性を特徴付ける。融合タンパク質の転移温度を紫外可視分光光度法を用いて決定する。次に、標準的な技法を用いて、融合タンパク質をリンカー中に支持体へと共有結合的にカップリングして、精製マトリックスを作製する。支持体は、磁性ビーズ又は多孔質ビーズなど、ビーズである。
[0257] 実施例１のＡＡＶ結合ポリペプチドを含む精製マトリックスを作成し、特徴付ける。より具体的には、（ｉ）実施例１のＡＡＶ結合ポリペプチドと（ｉｉ）相挙動のあるポリペプチド（例えば、ＥＬＰ）とを含む融合タンパク質を、標準プロトコルに従い大腸菌（Escherichia coli）で発現させる。等温滴定型熱量測定法を利用してＡＡＶ粒子に対する融合タンパク質の親和性を特徴付ける。融合タンパク質の転移温度を紫外可視分光光度法を用いて決定する。次に、標準的な技法を用いて、融合タンパク質をリンカー中に支持体へと共有結合的にカップリングして、精製マトリックスを作製する。支持体は、磁性ビーズ又は多孔質ビーズなど、ビーズである。
【0275】
[0258] 次に精製マトリックスを、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９を含む種々の精製ＡＡＶ試料と共に別々にインキュベートする。精製マトリックスは、様々なＡＡＶ粒子との複合体を形成する。
【0276】
[0259] 精製マトリックスとＡＡＶ粒子との様々なモル比を試験して、精製（即ち、ＡＡＶ粒子の完全な捕捉）に最適な比を決定する。精製マトリックスと生物製剤とを含有する組成物に環境因子（例えば、塩化ナトリウム又は硫酸アンモニウムなどの塩の添加）を適用して、タンパク質ベースの精製マトリックスのサイズの増加を生じさせる。
【0277】
[0260] タンジェンシャルフローろ過及び遠心の両方を利用して、タンパク質ベースの精製マトリックスからＡＡＶ粒子を分離する。遠心及びタンジェンシャルフローろ過は、いずれもタンパク質ベースの精製マトリックスからの生物製剤の分離が可能であるものの、特殊な遠心機の必要なしに数千リットルの試料容積の迅速な精製が可能であるという理由でタンジェンシャルフローろ過が好ましい。
【0278】
[0261] ＴＦＦは、標準条件－例えば、１．５バール膜間差圧及び９６０Ｌ／ｍ２／ｈクロスフロー流速を用いて実施する。０．１μｍ親水性化ポリ（ビニリデンジフルオライド）（ＰＶＤＦ）膜など、標準ＴＦＦ膜を使用する。
【0279】
[0262] ｐＨを（例えば４．５などの酸性ｐＨ）調整して、ＡＡＶから精製マトリックスを分離（即ち溶出）させる。ＡＡＶの純度をサイズ排除クロマトグラフィーによって特徴付ける。タンパク質ベースの精製マトリックスは、次に更なる精製ラウンドに再使用する。
【0280】
実施例３．ＡＡＶ結合ポリペプチドと支持体とを含む精製マトリックスを利用した細胞ライセートからのＡＡＶの精製
[0263] 生産株細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３）において標準プロトコルに従いＡＡＶを生産する。細胞を溶解させて、遠心により細胞残屑を除去する。細胞上清を実施例２の精製マトリックスのうちのいずれか１つとある期間にわたって接触させて、複合体を形成させる。環境因子を適用して複合体のサイズを増加させる。ＡＡＶが結合した精製マトリックスをサイズを基準として不純物から分離する。第２の環境因子を適用することにより、精製マトリックスからＡＡＶを溶出させる。次にＡＡＶの力価を決定し、後に使用するため－８０℃で凍結する。
[0263] 生産株細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３）において標準プロトコルに従いＡＡＶを生産する。細胞を溶解させて、遠心により細胞残屑を除去する。細胞上清を実施例２の精製マトリックスのうちのいずれか１つとある期間にわたって接触させて、複合体を形成させる。環境因子を適用して複合体のサイズを増加させる。ＡＡＶが結合した精製マトリックスをサイズを基準として不純物から分離する。第２の環境因子を適用することにより、精製マトリックスからＡＡＶを溶出させる。次にＡＡＶの力価を決定し、後に使用するため－８０℃で凍結する。
【0281】
実施例４．精製マトリックスを使用した複数のＡＡＶ血清型の精製
[0264] tdTomatoトランス遺伝子をパッケージングする、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９粒子を含めた組換えＡＡＶ粒子を、標準プロトコルに従い生産株細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３）において産生させた。細胞を溶解させて、遠心することにより細胞残屑を除去した。細胞上清を、ある期間にわたって配列番号１７１のアミノ酸配列を有する精製マトリックスと接触させることにより、複合体を形成させた。精製マトリックスは、配列番号１６９のアミノ酸配列を有するＡＡＶ結合ポリペプチドと、配列番号１７０のアミノ酸配列を有する相挙動のあるポリペプチドとを含んだ。次に環境因子（例えば、０．５Ｍ～２ＭのＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、又はＣａＣｌ２）を適用して複合体のサイズを増加させた。精製マトリックス、環境因子、及び細胞上清を室温で１５分間インキュベートした。続いて、１３ｃｍ２中空フィルタ（０．２μｍ細孔径）を使用して精製マトリックス、環境因子、及び細胞上清を濃縮した（５～１０倍）。リン酸緩衝溶液及び塩化ナトリウムを使用して６回の洗浄ダイアボリュームを実施した。このプロトコルによれば、ＡＡＶが結合した精製マトリックスを不純物からサイズを基準として分離することが可能であった。緩衝液（例えば、第２の環境因子）を適用することにより、ＡＡＶを精製マトリックスから溶出させた。保持液から精製マトリックスを収集した。表５に示されるとおり、様々な緩衝液を評価した。次にＡＡＶを力価測定し、後に使用するため－８０℃で凍結した。
[0264] tdTomatoトランス遺伝子をパッケージングする、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９粒子を含めた組換えＡＡＶ粒子を、標準プロトコルに従い生産株細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３）において産生させた。細胞を溶解させて、遠心することにより細胞残屑を除去した。細胞上清を、ある期間にわたって配列番号１７１のアミノ酸配列を有する精製マトリックスと接触させることにより、複合体を形成させた。精製マトリックスは、配列番号１６９のアミノ酸配列を有するＡＡＶ結合ポリペプチドと、配列番号１７０のアミノ酸配列を有する相挙動のあるポリペプチドとを含んだ。次に環境因子（例えば、０．５Ｍ～２ＭのＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、又はＣａＣｌ２）を適用して複合体のサイズを増加させた。精製マトリックス、環境因子、及び細胞上清を室温で１５分間インキュベートした。続いて、１３ｃｍ２中空フィルタ（０．２μｍ細孔径）を使用して精製マトリックス、環境因子、及び細胞上清を濃縮した（５～１０倍）。リン酸緩衝溶液及び塩化ナトリウムを使用して６回の洗浄ダイアボリュームを実施した。このプロトコルによれば、ＡＡＶが結合した精製マトリックスを不純物からサイズを基準として分離することが可能であった。緩衝液（例えば、第２の環境因子）を適用することにより、ＡＡＶを精製マトリックスから溶出させた。保持液から精製マトリックスを収集した。表５に示されるとおり、様々な緩衝液を評価した。次にＡＡＶを力価測定し、後に使用するため－８０℃で凍結した。
【0282】
【表33】
【0283】
[0265] 定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を利用して、溶液から捕捉されたＡＡＶの量及び溶出後に入手されたＡＡＶの量を評価した。精製マトリックスは、９９％を超える複数の血清型（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９）のＡＡＶ粒子を捕捉した（図１）。評価した各緩衝液が、単回ダイアボリュームで６５％を上回る結合ＡＡＶ粒子を溶出した（図２）。
【0284】
[0266] ＡＡＶ粒子の溶出後に精製マトリックスをリサイクルして、それを将来の精製に利用できるか否かを決定した。リサイクルは、精製マトリックスを９５℃で５分間インキュベートするか、又は精製マトリックスを１Ｍ ＮａＯＨ又は６Ｍ塩酸グアニジンに５分間浸漬することによって実施した。
【0285】
[0267] 表６が示すとおり、精製マトリックスは、再生させて、繰り返し捕捉に利用することができる。５サイクルの精製／再生後、精製マトリックスは９８％のＡＡＶを捕捉する。
【0286】
【表34】
【0287】
[0268] ドデシル硫酸ナトリウム（sodium dodecycl sulfate）－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を利用して、溶出したＡＡＶ試料の純度を評価した。次にゲルを銀染色することにより、試料中にある任意の汚染物質を可視化した。図３に示されるとおり、ゲル上には、主要なＡＡＶ構造タンパク質Ｖｐ１、Ｖｐ２、及びＶｐ３が見えるが、他の主要なバンドは認められなかった。ウエスタンブロットにより、精製マトリックスから溶出したカプシドタンパク質が試料中に存在することが確認された（図４）。更に、ＡＡＶ粒子が精製マトリックスによって捕捉された後、捕捉上清中にＡＡＶ粒子は残っていなかった（図４のCapture Sup）。まとめると、このデータは、精製マトリックスからの溶出後、試料から実質的に全ての汚染物質が除去されており、単離されたＡＡＶは高い純度を有することを示している。
【0288】
[0269] 続く実験において、精製マトリックスが内包型カプシド、空のカプシド、又は両方を捕捉可能かどうかを評価した。精製マトリックスから溶出した試料中に存在するＡＡＶカプシドの総数は、ＥＬＩＳＡベースのアッセイを用いて推定した。溶出させた試料はまた、ｑＰＣＲも用いて評価し、ウイルスゲノムの数を決定した。ｑＰＣＲ：ＥＬＩＳＡ値を用いて、総カプシドに対する内包型カプシドの比率を近似した。表７に示されるとおり、精製マトリックスは内包型カプシドを濃縮した。
【0289】
【表35】
【0290】
[0270] 溶出させたＡＡＶ試料はまた、それが精製後にも感染力を維持したかどうかを決定するためにもアッセイした。培養下にあるＨＥＫ２９３細胞（１０，０００細胞／ウェル）に、tdTomatoトランス遺伝子を担持するＡＡＶ８を感染多重度（ＭＯＩ）１×１０６又は１×１０７で投与した。４８のインキュベーション後、細胞をtdTomato蛍光に関して蛍光顕微鏡法を用いて可視化した。図５Ａに示されるとおり、精製マトリックス（ViraTag（商標））によって精製したＡＡＶは、標準プロトコル（Pos Ctrl）に従い精製したＡＡＶと同程度に細胞を感染させた。図５Ｂに示されるとおり、このデータを定量化した。標準プロトコル（Pos Ctrl）によって精製したＡＡＶ８と、精製マトリックス（ViraTag（商標））によって精製したＡＡＶ８との感染力レベルの間に統計的に有意な差はなかった。従って、このデータは、試験した精製マトリックス（ViraTag（商標））を用いて精製したＡＡＶ粒子が高度な感染力を保持していることを示している。
【0291】
実施例５．精製マトリックス及びタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）を用いたＡＡＶ９の精製
[0271] tdTomatoトランス遺伝子をパッケージングする組換えＡＡＶ９ベクターを生産するＨＥＫ２９３細胞を浮遊状態で成長させて、遠心により回収した。２００ｍＬの上清を１０Ｕ／ｍＬベンゾナーゼ及び０．０１％プルロニック酸で処理し、０．２ミクロンボトルトップフィルタに通して滅菌ろ過した。次に、この出発材料（ＳＭ）を実施例４の１μＭの精製マトリックス及び０．６Ｍ ＮａＣｌ塩（即ち、第１の環境因子）と混合してＡＡＶ－精製マトリックス複合体を形成した。
[0271] tdTomatoトランス遺伝子をパッケージングする組換えＡＡＶ９ベクターを生産するＨＥＫ２９３細胞を浮遊状態で成長させて、遠心により回収した。２００ｍＬの上清を１０Ｕ／ｍＬベンゾナーゼ及び０．０１％プルロニック酸で処理し、０．２ミクロンボトルトップフィルタに通して滅菌ろ過した。次に、この出発材料（ＳＭ）を実施例４の１μＭの精製マトリックス及び０．６Ｍ ＮａＣｌ塩（即ち、第１の環境因子）と混合してＡＡＶ－精製マトリックス複合体を形成した。
【0292】
[0272] このＳＭをRepligen KR2iタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）ユニットを使用して連続流加培養モードで処理した。ＴＦＦは、５０μＭ精製マトリックス及び０．６Ｍ ＮａＣｌで調製した２０ｍＬ保持液ベッセル、並びに０．２ミクロン細孔の１３ｃｍ２中空糸フィルタでセットアップした。濃縮－ダイアフィルトレーション（ＣＤ）モード（１０倍濃縮係数（ＣＦ）、６倍ダイアボリューム（ＤＶ）のランを、等しい流量に設定したＳＭを含む透過液対照及び透過液ポンプで行った。２００ｍＬ ＳＭ供給液が全て処理されたところで、保持された材料を６ＤＶの洗浄緩衝液（２０ｍＭトリス、０．５Ｍ ＮａＣｌ）でリンスした。ここで汚染物質を含まないものとなったＡＡＶ９材料を、次に氷上で再溶解させて、透過液側の弁を閉めたまま等容積の２×溶出緩衝液（即ち、第２の環境因子）と混合した。溶出緩衝液は、ｐＨ３の１００ｍＭグリシン及び０．６Ｍ ＮａＣｌを含有した。２０分後、この再循環試料を加温して室温に戻し、ＮａＣｌで相分離させた。透過液側の弁を開き、純粋なＡＡＶ９を溶出緩衝液ダイアボリューム（１００ｍＭグリシン、ｐＨ３、０．６Ｍ ＮａＣｌ）による第２のＣＤモード（２×ＣＦ、４×ＤＶ）で収集した。このラン全体を通じて流束及び膜間差圧（ＴＭＰ）を追跡し（図６）、安定した効率的な、且つ規模調整可能な工程が実証された。このラン全体を通じて透過液及び保持液試料を収集することにより、抗ＡＡＶウエスタンブロットによるＡＡＶ損失の分析（図７）、並びにHEK HCP ELISA（Cygnus（登録商標））を用いた宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）定量化及びQuant-iT（商標）picogreen assay（登録商標）（Thermo Fisher（登録商標））を用いたｄｓＤＮＡ定量化による純度の分析にかけた。この工程は、２～３対数のＨＣＰ（図８）及び３対数を超える二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）（図９）の除去が可能であった。
【0293】
実施例６．力価、清澄化、及びヌクレアーゼ処理がＡＡＶ精製に及ぼす効果
[0273] 実施例４の精製マトリックスが、ＡＡＶ８粒子を生産するＨＥＫ２９３細胞の細胞ライセート又は浮遊培養培地（図１０では「上清」と称される）からＡＡＶ８粒子を捕捉する能力を試験した。細胞ライセートは、ＡＡＶ８粒子を生産するＨＥＫ２９３細胞のペレットを０．５％Triton-X-100に再懸濁することによって作製した。
[0273] 実施例４の精製マトリックスが、ＡＡＶ８粒子を生産するＨＥＫ２９３細胞の細胞ライセート又は浮遊培養培地（図１０では「上清」と称される）からＡＡＶ８粒子を捕捉する能力を試験した。細胞ライセートは、ＡＡＶ８粒子を生産するＨＥＫ２９３細胞のペレットを０．５％Triton-X-100に再懸濁することによって作製した。
【0294】
[0274] 評価した細胞ライセート及び培地は、１×１０８～１×１０７ウイルス粒子毎マイクロリットル（ｖｐ／μＬ）の範囲の力価のＡＡＶ粒子を含有した。ヌクレアーゼ処理した細胞ライセートから精製マトリックスがＡＡＶ８粒子を捕捉する能力もまた評価した。ヌクレアーゼ処理した細胞ライセートは、５０Ｕ／ｍＬベンゾナーゼ（Millipore（登録商標））と共に３４℃で１時間インキュベートした。
【0295】
[0275] 清澄化した細胞ライセート又は培地から精製マトリックスがＡＡＶ８粒子を捕捉する能力もまた評価した。細胞ライセート及び／又は培地は、１３，２００ｒｐｍで１０分の遠心によって清澄化した。この上清を、続く１３，２００ｒｐｍで１０分のＡＡＶ８粒子の単離に使用した。
【0296】
[0276] 各試料から、試料を１０μＭ精製マトリックス及び０．６Ｍ ＮａＣｌ（即ち、第１の環境因子）と混合し、試料を１３，２００ｒｐｍで１０分間遠心することにより、ＡＡＶ８粒子を単離した。
【0297】
[0277] ＡＡＶ－精製マトリックス複合体を含有するペレットを、ｐＨ３の１００ｍＭグリシンを含む溶出緩衝液（即ち、第２の環境因子）に氷上で再懸濁し、室温に加温し、０．６Ｍ塩で転移させて、次に２度目の遠心を行った。逆方向末端反復（ＩＴＲ）定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を用いて、溶出したＡＡＶ８の量を出発材料（即ち、ＡＡＶ８粒子を含む培地又は細胞ライセート）と比較した。この技法は、ＰＣＲを用いてＩＴＲの数を測定することによってＡＡＶ粒子の数を定量化する。各試料のＡＡＶ捕捉効率は、以下の式を用いて計算した：１００×（精製マトリックスによって捕捉されたＡＡＶ８粒子数／精製前の組成物中にあるＡＡＶ８粒子数）。
【0298】
[0278] 精製マトリックスは、力価（１×１０７～４×１０１０）、清澄化、ヌクレアーゼ処理、又は出発材料としてライセートか培地かにかかわらず、９８％を超えるＡＡＶ粒子をロバストに捕捉した（図１０）。ヌクレアーゼ処理有り及び無しのライセート試料の評価から、ヌクレアーゼ処理は、銀染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図１１）及びｄｓＤＮＡに関するQuant-iT（商標）picogreenアッセイ（図１２）によって比較したとき、最終的に溶出するＡＡＶ８粒子の純度に影響を与えなかったことが示された。
【0299】
実施例７．遠心速度がＡＡＶ８捕捉に及ぼす効果
[0279] ＡＡＶ８ ＨＥＫ２９３浮遊細胞培養液から回収した培地を１０μＭ精製マトリックス及び０．６Ｍ ＮａＣｌと混合してＡＡＶ－精製マトリックス複合体を形成した。この試料を１００～１６，０００の範囲の相対遠心力（ＲＣＦ）で１０分間遠心した。各ＲＣＦについて、上清中に残る捕捉されなかったＡＡＶ８をＩＴＲ ｑＰＣＲを用いて定量化し、出発回収材料中に測定される量に対する割合として計算した。ＡＡＶ捕捉効率は、上清中に捕捉されないまま残る割合を１００％から差し引いたものとして測定し、結果から、５００ＲＣＦ以上の速度で極めて効率的なＡＡＶ８捕捉が生じたことが示された（図１３）。
[0279] ＡＡＶ８ ＨＥＫ２９３浮遊細胞培養液から回収した培地を１０μＭ精製マトリックス及び０．６Ｍ ＮａＣｌと混合してＡＡＶ－精製マトリックス複合体を形成した。この試料を１００～１６，０００の範囲の相対遠心力（ＲＣＦ）で１０分間遠心した。各ＲＣＦについて、上清中に残る捕捉されなかったＡＡＶ８をＩＴＲ ｑＰＣＲを用いて定量化し、出発回収材料中に測定される量に対する割合として計算した。ＡＡＶ捕捉効率は、上清中に捕捉されないまま残る割合を１００％から差し引いたものとして測定し、結果から、５００ＲＣＦ以上の速度で極めて効率的なＡＡＶ８捕捉が生じたことが示された（図１３）。
【0300】
実施例８．精製マトリックスによるＡＡＶ２の安定化
[0280] 接着ＨＥＫ２９３細胞を標準的な三重トランスフェクション方法によりトランスフェクトし、それを使用して、ルシフェラーゼトランス遺伝子を担持する組換えＡＡＶ２粒子を作製した。この細胞を精製マトリックスの存在下又は非存在下で６日間培養した。１０μＭの実施例４の精製マトリックスの存在下で培養した細胞を対照細胞と、治療又は対照の各群についてトリプリケートで比較した。４日目に培養培地を収集し、精製マトリックス添加剤有り又は無しの等容積の培地を補充した。６日目、再び培地を収集し、細胞をＰＢＳでリンスし、剥ぎ取ることによって回収した。ＩＴＲ２に対するプライマーを使用したｑＰＣＲを用いて比較するため、全ての画分で収集されたベクターゲノム総量を定量化した。培養培地に精製マトリックスを含めると、ベクターゲノム（ｖｇ）力価が少なくとも８％増加した（図１４）。
[0280] 接着ＨＥＫ２９３細胞を標準的な三重トランスフェクション方法によりトランスフェクトし、それを使用して、ルシフェラーゼトランス遺伝子を担持する組換えＡＡＶ２粒子を作製した。この細胞を精製マトリックスの存在下又は非存在下で６日間培養した。１０μＭの実施例４の精製マトリックスの存在下で培養した細胞を対照細胞と、治療又は対照の各群についてトリプリケートで比較した。４日目に培養培地を収集し、精製マトリックス添加剤有り又は無しの等容積の培地を補充した。６日目、再び培地を収集し、細胞をＰＢＳでリンスし、剥ぎ取ることによって回収した。ＩＴＲ２に対するプライマーを使用したｑＰＣＲを用いて比較するため、全ての画分で収集されたベクターゲノム総量を定量化した。培養培地に精製マトリックスを含めると、ベクターゲノム（ｖｇ）力価が少なくとも８％増加した（図１４）。
【0301】
実施例９．精製マトリックスによるＡＡＶ８の安定化
[0281] 浮遊状態で成長させたＨＥＫ２９３細胞から培地を回収し、ここで細胞はＧＦＰ－ＡＡＶ８を生産した。培地をアリコートに分け、１００μＭの実施例４の精製マトリックスの添加有り又は無しのいずれかで－２０℃で貯蔵した。加速安定性研究として、試料を凍結融解サイクル（－２０℃～室温）に供し、次に、インタクトなＡＡＶ粒子の総量を定量化するＡＡＶ８ ＥＬＩＳＡ（Progen）を用いてアッセイした。対照及び精製マトリックス処理試料の定量化した粒子を凍結融解のない出発材料で正規化した。このデータは、凍結融解を介した分解及び凝集に対するＡＡＶ粒子の抵抗性が精製マトリックスによって亢進し得ることを示している（図１５）。
[0281] 浮遊状態で成長させたＨＥＫ２９３細胞から培地を回収し、ここで細胞はＧＦＰ－ＡＡＶ８を生産した。培地をアリコートに分け、１００μＭの実施例４の精製マトリックスの添加有り又は無しのいずれかで－２０℃で貯蔵した。加速安定性研究として、試料を凍結融解サイクル（－２０℃～室温）に供し、次に、インタクトなＡＡＶ粒子の総量を定量化するＡＡＶ８ ＥＬＩＳＡ（Progen）を用いてアッセイした。対照及び精製マトリックス処理試料の定量化した粒子を凍結融解のない出発材料で正規化した。このデータは、凍結融解を介した分解及び凝集に対するＡＡＶ粒子の抵抗性が精製マトリックスによって亢進し得ることを示している（図１５）。
【0302】
実施例１０．精製マトリックスによるＡＡＶ８粒子の捕捉
[0282] ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）トランス遺伝子を担持するＡＡＶ８粒子を生産するＨＥＫ２９３浮遊細胞から培地を回収した。この培地を、０μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１０μＭ、及び５０μＭの実施例４の精製マトリックスと接触させると、ＡＡＶ８粒子と精製マトリックスとの間で複合体が形成された。第１の環境因子（即ち０．６Ｍ ＮａＣｌ）を適用して、複合体のサイズを増加させた。続いて、複合体が入った培地を１３，２００毎分回転数（ｒｐｍ）で１０分間（ｍｉｎ）遠心した。このプロトコルによれば、サイズを基準として複合体を不純物から分離することが可能であった。逆方向末端反復（ＩＴＲ）定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を利用して、出発材料中のＡＡＶ粒子の量と比較した、精製マトリックスを使用して培地から捕捉されたＡＡＶ粒子の量を評価した。この技法は、ＰＣＲを用いてＩＴＲの数を測定することによってＡＡＶ粒子の数を定量化する。各濃度における精製マトリックスの捕捉効率は、以下の式を用いて計算した：１００×（精製マトリックスによって捕捉されたＡＡＶ８粒子数／精製前の組成物中にあるＡＡＶ８粒子数）。図１６は、１０μＭ以上の精製マトリックス濃度が、ロバストな９８％を超えるウイルス捕捉に十分であることを示している。
[0282] ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）トランス遺伝子を担持するＡＡＶ８粒子を生産するＨＥＫ２９３浮遊細胞から培地を回収した。この培地を、０μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１０μＭ、及び５０μＭの実施例４の精製マトリックスと接触させると、ＡＡＶ８粒子と精製マトリックスとの間で複合体が形成された。第１の環境因子（即ち０．６Ｍ ＮａＣｌ）を適用して、複合体のサイズを増加させた。続いて、複合体が入った培地を１３，２００毎分回転数（ｒｐｍ）で１０分間（ｍｉｎ）遠心した。このプロトコルによれば、サイズを基準として複合体を不純物から分離することが可能であった。逆方向末端反復（ＩＴＲ）定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を利用して、出発材料中のＡＡＶ粒子の量と比較した、精製マトリックスを使用して培地から捕捉されたＡＡＶ粒子の量を評価した。この技法は、ＰＣＲを用いてＩＴＲの数を測定することによってＡＡＶ粒子の数を定量化する。各濃度における精製マトリックスの捕捉効率は、以下の式を用いて計算した：１００×（精製マトリックスによって捕捉されたＡＡＶ８粒子数／精製前の組成物中にあるＡＡＶ８粒子数）。図１６は、１０μＭ以上の精製マトリックス濃度が、ロバストな９８％を超えるウイルス捕捉に十分であることを示している。
【0303】
本開示の番号付き実施形態
[0283] 添付の特許請求の範囲にもかかわらず、本開示は、以下の番号付き実施形態を示す：
１．支持体にカップリングしたＡＡＶ結合ポリペプチドを含む精製マトリックスであって、ＡＡＶ結合ポリペプチドが、ＡＡＶ受容体（ＡＡＶＲ）のエクトドメイン、又はそのＡＡＶ結合断片若しくは誘導体を含む、精製マトリックス。
２．ＡＡＶＲがヒトＡＡＶＲである、実施形態１に記載の精製マトリックス。
３．ＡＡＶＲがサルＡＡＶＲである、実施形態１に記載の精製マトリックス。
４．ＡＡＶＲがオランウータンＡＡＶＲである、実施形態１に記載の精製マトリックス。
５．ＡＡＶＲがマウスＡＡＶＲである、実施形態１に記載の精製マトリックス。
６．ＡＡＶＲが野生型ＡＡＶＲである、実施形態１～５のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
７．ＡＡＶＲが突然変異体ＡＡＶＲである、実施形態１～５のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
８．ＡＡＶ結合ポリペプチドが配列番号３３の配列を含む、実施形態１に記載の精製マトリックス。
９．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、最大２５個のアミノ酸突然変異を有する配列番号３３の配列を含む、実施形態１に記載の精製マトリックス。
１０．ＡＡＶ結合ドメインが、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、又は少なくとも５個の突然変異を有する配列番号３５のアミノ酸４１１～４９９を含み、各突然変異が、個別に、Ｖ４４０Ｈ、Ｓ４３１Ｈ、Ｑ４３２Ｈ、Ｔ４３４Ｈ、Ｙ４４２Ｈ、Ｉ４６２Ｈ、Ｄ４３５Ｈ、Ｄ４３６Ｈ、Ｋ４３８Ｈ、及びＩ４３９Ｈからなる群から選択される、実施形態１に記載の精製マトリックス。
１１．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、配列番号２８～３２、３７～４１、４３～４７、及び５２～８６のうちのいずれか１つを含む、実施形態１に記載の精製マトリックス。
１２．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、配列番号２８～３２、３７～４１、４３～４７、及び５２～８６のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つを含む、実施形態１に記載の精製マトリックス。
１３．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、多発性嚢胞腎１（ＰＫＤ１）ドメイン、又はその断片を含む、実施形態１に記載の精製マトリックス。
１４．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、多発性嚢胞腎２（ＰＫＤ２）ドメイン、又はその断片を含む、実施形態１に記載の精製マトリックス。
１５．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、多発性嚢胞腎３（ＰＫＤ３）ドメイン、又はその断片を含む、実施形態１に記載の精製マトリックス。
１６．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、多発性嚢胞腎４（ＰＫＤ４）ドメイン、又はその断片を含む、実施形態１に記載の精製マトリックス。
１７．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、多発性嚢胞腎５（ＰＫＤ５）ドメイン、又はその断片を含む、実施形態１に記載の精製マトリックス。
１８．ＡＡＶ結合ポリペプチドが配列番号２９の配列を含む、実施形態１に記載の精製マトリックス。
１９．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、少なくとも１つのアミノ酸がヒスチジンに突然変異している配列番号２９の配列を含む、実施形態１８に記載の精製マトリックス。
２０．支持体が、ビーズ、樹脂、膜、繊維、ポリマー、プレート、又はチップである、実施形態１～１９のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
２１．支持体が、セファロース、アガロース、セルロース、ポリスチレン、ポリメタクリレート、及び／又はポリアクリルアミドを含むビーズである、実施形態２０に記載の精製マトリックス。
２２．支持体が、磁気ビーズである、実施形態２０に記載の精製マトリックス。
２３．支持体が、ポリマーである、実施形態２０に記載の精製マトリックス。
２４．支持体が、合成ポリマーである、実施形態２３に記載の精製マトリックス。
２５．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、支持体に可逆的にカップリングされる、実施形態１～２４のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
２６．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、支持体に共有結合的にカップリングされる、実施形態１～２４のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
２７．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、支持体に非共有結合的にカップリングされる、実施形態１～２４のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
２８．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、支持体にリンカーを介してカップリングされる、実施形態１～２７のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
２９．リンカーがペプチドリンカーである、実施形態２８に記載の精製マトリックス。
３０．ペプチドリンカーがプロテアーゼ切断部位を含む、実施形態２９に記載の精製マトリックス。
３１．リンカーが化学的リンカーである、実施形態２８に記載の精製マトリックス。
３２．再使用可能である、実施形態１～３１のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
３３．配列番号９のアミノ酸配列を有するＡＡＶ結合ポリペプチドを含む、実施形態１～３１のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
３４．配列番号５２のアミノ酸配列を有するＡＡＶ結合ポリペプチドを含む、実施形態１～３１のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
３５．配列番号６４のアミノ酸配列を有するＡＡＶ結合ポリペプチドを含む、実施形態１～３１のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
３６．相挙動を有するポリペプチドにカップリングしたＡＡＶ結合ポリペプチドを含む精製マトリックスであって、ＡＡＶ結合ポリペプチドが、ＡＡＶ受容体（ＡＡＶＲ）のエクトドメイン、又はそのＡＡＶ結合断片若しくは誘導体を含む、精製マトリックス。
３７．ＡＡＶＲがヒトＡＡＶＲである、実施形態３６に記載の精製マトリックス。
３８．ＡＡＶＲがサルＡＡＶＲである、実施形態３６に記載の精製マトリックス。
３９．ＡＡＶＲがオランウータンＡＡＶＲである、実施形態３６に記載の精製マトリックス。
４０．ＡＡＶＲがマウスＡＡＶＲである、実施形態３６に記載の精製マトリックス。
４１．ＡＡＶＲが野生型ＡＡＶＲである、実施形態３６～４０のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
４２．ＡＡＶＲが突然変異体ＡＡＶＲである、実施形態３６～４０のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
４３．ＡＡＶ結合ポリペプチドが配列番号３３の配列を含む、実施形態３６に記載の精製マトリックス。
４４．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、最大２５個のアミノ酸突然変異を有する配列番号３３の配列を含む、実施形態３６に記載の精製マトリックス。
４５．ＡＡＶ結合ドメインが、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、又は少なくとも５個の突然変異を有する配列番号３５のアミノ酸４１１～４９９を含み、各突然変異が、個別に、Ｖ４４０Ｈ、Ｓ４３１Ｈ、Ｑ４３２Ｈ、Ｔ４３４Ｈ、Ｙ４４２Ｈ、Ｉ４６２Ｈ、Ｄ４３５Ｈ、Ｄ４３６Ｈ、Ｋ４３８Ｈ、及びＩ４３９Ｈからなる群から選択される、実施形態３６に記載の精製マトリックス。
４６．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、配列番号２８～３２、３７～４１、４３～４７、及び５２～８６のうちのいずれか１つを含む、実施形態３６に記載の精製マトリックス。
４７．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、配列番号２８～３２、３７～４１、４３～４７、及び５２～８６のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つを含む、実施形態３６に記載の精製マトリックス。
４８．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、多発性嚢胞腎１（ＰＫＤ１）ドメイン、又はその断片を含む、実施形態３６に記載の精製マトリックス。
４９．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、多発性嚢胞腎２（ＰＫＤ２）ドメイン、又はその断片を含む、実施形態３６に記載の精製マトリックス。
５０．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、多発性嚢胞腎３（ＰＫＤ３）ドメイン、又はその断片を含む、実施形態３６に記載の精製マトリックス。
５１．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、多発性嚢胞腎４（ＰＫＤ４）ドメイン、又はその断片を含む、実施形態３６に記載の精製マトリックス。
５２．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、多発性嚢胞腎５（ＰＫＤ５）ドメイン、又はその断片を含む、実施形態３６に記載の精製マトリックス。
５３．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、配列番号２９の配列を含む、実施形態３６に記載の精製マトリックス。
５４．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、少なくとも１つのアミノ酸がヒスチジンに突然変異している配列番号２９の配列を含む、実施形態５３に記載の精製マトリックス。
５５．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、相挙動を有するポリペプチドに可逆的にカップリングされる、実施形態３６～５４のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
５６．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、相挙動を有するポリペプチドに共有結合的にカップリングされる、実施形態３６～５４のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
５７．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、相挙動を有するポリペプチドに非共有結合的にカップリングされる、実施形態３６～５４のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
５８．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、相挙動を有するポリペプチドにリンカーを介してカップリングされる、実施形態３６～５７のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
５９．リンカーがペプチドリンカーである、実施形態５８に記載の精製マトリックス。
６０．ペプチドリンカーがプロテアーゼ切断部位を含む、実施形態５８に記載の精製マトリックス。
６１．リンカーが化学的リンカーである、実施形態５８に記載の精製マトリックス。
６２．融合タンパク質が、ＡＡＶ結合ポリペプチドと、相挙動を有するポリペプチドとを含む、実施形態３６～６１のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
６３．相挙動のあるポリペプチドが、エラスチン様ポリペプチドである、実施形態３６～６２のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
６４．相挙動のあるポリペプチドが、レジリン様ポリペプチドである、実施形態３６～６２のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
６５．相挙動のあるポリペプチドが、配列（Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｘａａ－Ｇｌｙ）ｎ（配列番号１０）を有するペンタペプチドリピート、又はそのランダム化されたスクランブル類似体を含むポリマーであり；式中、Ｘａａが、プロリンを除く任意のアミノ酸であってよい、実施形態６３に記載の精製マトリックス。
６６．ｎが、１以上３６０以下の整数である、実施形態６５に記載の精製マトリックス。
６７．相挙動のあるポリペプチドが、
ａ．（ＧＲＧＤＳＰＹ）ｎ（配列番号１）
ｂ．（ＧＲＧＤＳＰＨ）ｎ（配列番号２）
ｃ．（ＧＲＧＤＳＰＶ）ｎ（配列番号３）
ｄ．（ＧＲＧＤＳＰＹＧ）ｎ（配列番号４）
ｅ．（ＲＰＬＧＹＤＳ）ｎ（配列番号５）
ｆ．（ＲＰＡＧＹＤＳ）ｎ（配列番号６）
ｇ．（ＧＲＧＤＳＹＰ）ｎ（配列番号７）
ｈ．（ＧＲＧＤＳＰＹＱ）ｎ（配列番号８）
ｉ．（ＧＲＧＮＳＰＹＧ）ｎ（配列番号９）
ｊ．（ＧＶＧＶＰ）ｎ（配列番号１１）；
ｋ．（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１２）；
ｌ．（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１３）；
ｍ．（ＧＶＧＶＰＧＷＧＶＰＧＶＧＶＰＧＷＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１４）；
ｎ．（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＥＧＶＰＧＦＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１５）；
ｏ．（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＫＧＶＰＧＦＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１６）；及び
ｐ．（ＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰ）ｍ（配列番号１７）
から選択されるアミノ酸配列；
又はそのランダム化されたスクランブル類似体
（式中：
ｎは、２０～３６０の範囲の整数であり；及び
ｍは、４～２５の範囲の整数である）を含む、実施形態１～６３のいずれか１つに記載の精製マトリックス。
６８．相挙動のあるポリペプチドが、
（ａ）（ＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１４３）；
（ｂ）（ＺＺＰＸＸＸＸＧＺ）ｍ（配列番号１４８）；
（ｃ）（ＺＺＰＸＧＺ）ｍ（配列番号１４９）；
（ｄ）（ＺＺＰＸＸＧＺ）ｍ（配列番号１５０）；又は
（ｅ）（ＺＺＰＸＸＸＧＺ）ｍ（配列番号１５１）
（式中、ｍは、１０以上１６０以下の間にある整数であり、式中、Ｘは、存在する場合に、プロリン又はグリシンを除く任意のアミノ酸であり、及び式中、Ｚは、存在する場合に、任意のアミノ酸である）から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１～６３のいずれか１つに記載の精製マトリックス。
６９．相挙動のあるポリペプチドが、
（ａ）（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１４４）；又は
（ｂ）（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１４６）；
（式中、ｍは、２以上３２以下の間にある整数である）から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１～６３のいずれか１つに記載の精製マトリックス。
７０．相挙動のあるポリペプチドが、
（ａ）（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１４４）（式中、ｍは、８又は１６である）；
（ｂ）（ＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰ）ｍ（配列番号１４５）（式中、ｍは、５以上８０以下の間にある整数である）；又は
（ｃ）（ＧＸＧＶＰ）ｍ（配列番号１４７）（式中、ｍは、１０以上１６０以下の間にある整数であり、及び式中、リピート毎にＸは、独立に、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びセリンからなる群から選択される）から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１～６３のいずれか１つに記載の精製マトリックス。
７１．再使用可能である、実施形態３６～７０のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
７２．配列番号２９のアミノ酸配列を有するＡＡＶ結合ポリペプチドを含む、実施形態３６～７０のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
７３．配列番号５２のアミノ酸配列を有するＡＡＶ結合ポリペプチドを含む、実施形態３６～７０のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
７４．配列番号６４のアミノ酸配列を有するＡＡＶ結合ポリペプチドを含む、実施形態３６～７０のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
７５．配列番号２９のアミノ酸配列を有するＡＡＶ結合ポリペプチドと、配列番号８８のアミノ酸配列又は（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１２）（式中、ｍは１６である）を含む相挙動のあるポリペプチドとを含む、実施形態３６～７０のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
７６．精製マトリックスが、配列番号５２のアミノ酸配列を有するＡＡＶ結合ポリペプチドと、配列番号８８のアミノ酸配列又は（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１２）（式中、ｍは１６である）を含む相挙動のあるポリペプチドとを含む、実施形態３６～７０のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
７７．精製マトリックスが、配列番号６４のアミノ酸配列を有するＡＡＶ結合ポリペプチドと、配列番号８８のアミノ酸配列又は（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１２）（式中、ｍは１６である）を含む相挙動のあるポリペプチドとを含む、実施形態３６～７０のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
７８．配列番号８７及び１７１～１７４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態３６～７０のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
７９．ＡＡＶの精製方法であって、ＡＡＶを実施形態１～３５のいずれか一つに記載の精製マトリックスと接触させることを含む方法。
８０．ＡＡＶが、野生型ＡＡＶカプシドを含む、実施形態７９に記載の方法。
８１．ＡＡＶが、突然変異体ＡＡＶカプシドを含む、実施形態７９に記載の方法。
８２．ＡＡＶが、以下の血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、又はＡＡＶｒｈ７４のうちのいずれか１つのカプシドを含む、実施形態７９に記載の方法。
８３．ＡＡＶが精製マトリックスに可逆的に結合してＡＡＶ－精製マトリックス複合体を形成する、実施形態７９～８２のいずれか一つに記載の方法。
８４．ＡＡＶ－精製マトリックス複合体を１つ以上の不純物から分離することを含む、実施形態８３に記載の方法。
８５．ＡＡＶ－精製マトリックス複合体が、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体を洗浄することによって１つ以上の不純物から分離される、実施形態８４に記載の方法。
８６．ＡＡＶ－精製マトリックス複合体からＡＡＶを溶出させることを含む、実施形態８３～８５のいずれか一つに記載の方法。
８７．ＡＡＶが、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体を含む組成物のｐＨを変化させることによってＡＡＶ－精製マトリックス複合体から溶出される、実施形態８６に記載の方法。
８８．ＡＡＶが、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体を含む組成物の温度を変化させることによってＡＡＶ－精製マトリックス複合体から溶出される、実施形態８６に記載の方法。
８９．ＡＡＶが、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体を含む組成物のイオン強度を変化させることによってＡＡＶ－精製マトリックス複合体から溶出される、実施形態８６に記載の方法。
９０．ＡＡＶが、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体を含む組成物に還元剤を添加することによってＡＡＶ－精製マトリックス複合体から溶出される、実施形態８６に記載の方法。
９１．ＡＡＶの精製方法であって、ＡＡＶを実施形態３６～７８のいずれか一つに記載の精製マトリックスと接触させることを含む方法。
９２．ＡＡＶが、野生型ＡＡＶカプシドを含む、実施形態９１に記載の方法。
９３．ＡＡＶが、突然変異体ＡＡＶカプシドを含む、実施形態９１に記載の方法。
９４．ＡＡＶが、以下の血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ又はウシＡＡＶのうちのいずれか１つのカプシドを含む、実施形態９１に記載の方法。
９５．ＡＡＶが精製マトリックスに可逆的に結合してＡＡＶ－精製マトリックス複合体を形成する、実施形態９１～９４のいずれか一つに記載の方法。
９６．第１の環境因子を使用してＡＡＶ－精製マトリックス複合体のサイズを増加させることを含む、実施形態９５に記載の方法。
９７．第１の環境因子が、
ａ．温度、ｐＨ、塩濃度又は圧力のうちの１つ以上の変化；
ｂ．１つ以上の界面活性剤、補因子、ビタミン、分子クラウディング剤、酵素、変性剤の添加；又は
ｃ．電磁波又は音波の適用
のうちの１つ以上を含む、実施形態９６に記載の方法。
９８．ＡＡＶ－精製マトリックス複合体をサイズを基準として少なくとも１つの不純物から分離することを含む、実施形態９６又は９７に記載の方法。
９９．ＡＡＶ－精製マトリックス複合体が、直径を基準として少なくとも１つの不純物から分離される、実施形態９８に記載の方法。
１００．ＡＡＶ－精製マトリックス複合体が、質量を基準として少なくとも１つの不純物から分離される、実施形態９８に記載の方法。
１０１．サイズを基準とした分離が、タンジェンシャルフローろ過、分析超遠心、膜クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、ノーマルフローろ過、音波分離、遠心、向流遠心、及び高速タンパク質液体クロマトグラフィーを用いて実施される、実施形態９８～１００のいずれか一つに記載の方法。
１０２．第２の環境因子を使用してＡＡＶをＡＡＶ－精製マトリックス複合体から溶出させる、実施形態９１～１０１のいずれか一つに記載の方法。
１０３．第２の環境因子が、
ａ．温度、ｐＨ、塩濃度又は圧力のうちの１つ以上の変化；
ｂ．１つ以上の界面活性剤、補因子、ビタミン、分子クラウディング剤、変性剤、酵素の添加；又は
ｃ．電磁波又は音波の適用
のうちの１つ以上を含む、実施形態１０２に記載の方法。
１０４．精製マトリックスを再生すること、及び精製マトリックスを第２のＡＡＶの精製に再使用することを含む、実施形態７９～１０３のいずれか一つに記載の方法。
１０５．精製されたＡＡＶが、精製前の感染力レベルの９５％より高い感染力レベルを有する、実施形態７９～１０３のいずれか一つに記載の方法。
１０６．ＡＡＶが精製後にその感染力の少なくとも９６％を保持している、実施形態７９～１０３のいずれか一つに記載の方法。
１０７．ＡＡＶが精製後にその感染力の少なくとも９７％を保持している、実施形態７９～１０３のいずれか一つに記載の方法。
１０８．ＡＡＶが精製後にその感染力の少なくとも９８％を保持している、実施形態７９～１０３のいずれか一つに記載の方法。
１０９．ＡＡＶが精製後にその感染力の少なくとも９９％を保持している、実施形態７９～１０３のいずれか一つに記載の方法。
１１０．ＡＡＶが精製後にその感染力の少なくとも１００％を保持している、実施形態７９～１０３のいずれか一つに記載の方法。
１１１．精製されたＡＡＶで内包型カプシドが濃縮されている、実施形態７９～１０３のいずれか一つに記載の方法。
１１２．精製されたＡＡＶが、精製前のｑＰＣＲ：ＥＬＩＳＡ比と比較してｑＰＣＲ：ＥＬＩＳＡ比の増加を呈する、実施形態１１１に記載の方法。
１１３．約２～約１０時間で完了する、実施形態７９～１１２のいずれか一つに記載の方法。
１１４．約４～約８時間で完了する、実施形態１１３に記載の方法。
１１５．実施形態７９～１１４のいずれか一つに記載の方法により精製されたＡＡＶを含む組成物。
１１６．少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％が不純物を含まない、実施形態１１５に記載の組成物。
１１７．少なくとも１つの突然変異を有する配列番号２８～４７のうちのいずれか１つの配列を含むＡＡＶ結合ポリペプチド。
１１８．実施形態１１７に記載のＡＡＶ結合ポリペプチドをコードする核酸。
１１９．実施形態１１８に記載の核酸を含むベクター。
１２０．実施形態１１７に記載のＡＡＶ結合ポリペプチド、実施形態１１８に記載の核酸、又は実施形態１１９に記載のベクターを含む組成物。
１２１．実施形態１１７に記載のＡＡＶ結合ポリペプチド、実施形態１１８に記載の核酸、又は実施形態１１９に記載のベクターを含むキット。
１２２．ＡＡＶ粒子のその生産時の収率を増加させる方法であって、ＡＡＶ生産細胞を精製マトリックスの存在下に培養することを含む方法。
１２３．ＡＡＶ粒子をその生産時に安定化させる方法であって、ＡＡＶ生産細胞を精製マトリックスの存在下に培養することを含む方法。
１２４．ＡＡＶ粒子をその精製時に安定化させる方法であって、ＡＡＶ粒子をその精製時に精製マトリックスと接触させることを含む方法。
１２５．ＡＡＶ粒子をその貯蔵時に安定化させる方法であって、ＡＡＶ粒子を精製マトリックスの存在下に貯蔵することを含む方法。
１２６．ＡＡＶ粒子の保管寿命を増加させる方法であって、ＡＡＶ粒子を精製マトリックスの存在下に貯蔵することを含む方法。
１２７．精製マトリックスが、実施形態１～７８のいずれか一つに記載の精製マトリックスである、実施形態１２２～１２６のいずれか一つに記載の方法。
１２８．ＡＡＶ粒子が、以下の血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ又はウシＡＡＶのうちのいずれか１つの野生型ＡＡＶ粒子である、実施形態１２２～１２７のいずれか一つに記載の方法。
１２９．ＡＡＶ粒子が、突然変異体ＡＡＶ粒子である、実施形態１２２～１２７のいずれか一つに記載の方法。
１３０．ＡＡＶ粒子が精製マトリックスに可逆的に結合してＡＡＶ－精製マトリックス複合体を形成する、実施形態１２２～１２７のいずれか一つに記載の方法。
１３１．精製マトリックスが少なくとも約１０μＭの濃度で存在する、実施形態１２２～１２７のいずれか一つに記載の方法。
[0283] 添付の特許請求の範囲にもかかわらず、本開示は、以下の番号付き実施形態を示す：
１．支持体にカップリングしたＡＡＶ結合ポリペプチドを含む精製マトリックスであって、ＡＡＶ結合ポリペプチドが、ＡＡＶ受容体（ＡＡＶＲ）のエクトドメイン、又はそのＡＡＶ結合断片若しくは誘導体を含む、精製マトリックス。
２．ＡＡＶＲがヒトＡＡＶＲである、実施形態１に記載の精製マトリックス。
３．ＡＡＶＲがサルＡＡＶＲである、実施形態１に記載の精製マトリックス。
４．ＡＡＶＲがオランウータンＡＡＶＲである、実施形態１に記載の精製マトリックス。
５．ＡＡＶＲがマウスＡＡＶＲである、実施形態１に記載の精製マトリックス。
６．ＡＡＶＲが野生型ＡＡＶＲである、実施形態１～５のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
７．ＡＡＶＲが突然変異体ＡＡＶＲである、実施形態１～５のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
８．ＡＡＶ結合ポリペプチドが配列番号３３の配列を含む、実施形態１に記載の精製マトリックス。
９．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、最大２５個のアミノ酸突然変異を有する配列番号３３の配列を含む、実施形態１に記載の精製マトリックス。
１０．ＡＡＶ結合ドメインが、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、又は少なくとも５個の突然変異を有する配列番号３５のアミノ酸４１１～４９９を含み、各突然変異が、個別に、Ｖ４４０Ｈ、Ｓ４３１Ｈ、Ｑ４３２Ｈ、Ｔ４３４Ｈ、Ｙ４４２Ｈ、Ｉ４６２Ｈ、Ｄ４３５Ｈ、Ｄ４３６Ｈ、Ｋ４３８Ｈ、及びＩ４３９Ｈからなる群から選択される、実施形態１に記載の精製マトリックス。
１１．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、配列番号２８～３２、３７～４１、４３～４７、及び５２～８６のうちのいずれか１つを含む、実施形態１に記載の精製マトリックス。
１２．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、配列番号２８～３２、３７～４１、４３～４７、及び５２～８６のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つを含む、実施形態１に記載の精製マトリックス。
１３．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、多発性嚢胞腎１（ＰＫＤ１）ドメイン、又はその断片を含む、実施形態１に記載の精製マトリックス。
１４．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、多発性嚢胞腎２（ＰＫＤ２）ドメイン、又はその断片を含む、実施形態１に記載の精製マトリックス。
１５．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、多発性嚢胞腎３（ＰＫＤ３）ドメイン、又はその断片を含む、実施形態１に記載の精製マトリックス。
１６．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、多発性嚢胞腎４（ＰＫＤ４）ドメイン、又はその断片を含む、実施形態１に記載の精製マトリックス。
１７．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、多発性嚢胞腎５（ＰＫＤ５）ドメイン、又はその断片を含む、実施形態１に記載の精製マトリックス。
１８．ＡＡＶ結合ポリペプチドが配列番号２９の配列を含む、実施形態１に記載の精製マトリックス。
１９．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、少なくとも１つのアミノ酸がヒスチジンに突然変異している配列番号２９の配列を含む、実施形態１８に記載の精製マトリックス。
２０．支持体が、ビーズ、樹脂、膜、繊維、ポリマー、プレート、又はチップである、実施形態１～１９のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
２１．支持体が、セファロース、アガロース、セルロース、ポリスチレン、ポリメタクリレート、及び／又はポリアクリルアミドを含むビーズである、実施形態２０に記載の精製マトリックス。
２２．支持体が、磁気ビーズである、実施形態２０に記載の精製マトリックス。
２３．支持体が、ポリマーである、実施形態２０に記載の精製マトリックス。
２４．支持体が、合成ポリマーである、実施形態２３に記載の精製マトリックス。
２５．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、支持体に可逆的にカップリングされる、実施形態１～２４のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
２６．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、支持体に共有結合的にカップリングされる、実施形態１～２４のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
２７．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、支持体に非共有結合的にカップリングされる、実施形態１～２４のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
２８．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、支持体にリンカーを介してカップリングされる、実施形態１～２７のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
２９．リンカーがペプチドリンカーである、実施形態２８に記載の精製マトリックス。
３０．ペプチドリンカーがプロテアーゼ切断部位を含む、実施形態２９に記載の精製マトリックス。
３１．リンカーが化学的リンカーである、実施形態２８に記載の精製マトリックス。
３２．再使用可能である、実施形態１～３１のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
３３．配列番号９のアミノ酸配列を有するＡＡＶ結合ポリペプチドを含む、実施形態１～３１のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
３４．配列番号５２のアミノ酸配列を有するＡＡＶ結合ポリペプチドを含む、実施形態１～３１のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
３５．配列番号６４のアミノ酸配列を有するＡＡＶ結合ポリペプチドを含む、実施形態１～３１のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
３６．相挙動を有するポリペプチドにカップリングしたＡＡＶ結合ポリペプチドを含む精製マトリックスであって、ＡＡＶ結合ポリペプチドが、ＡＡＶ受容体（ＡＡＶＲ）のエクトドメイン、又はそのＡＡＶ結合断片若しくは誘導体を含む、精製マトリックス。
３７．ＡＡＶＲがヒトＡＡＶＲである、実施形態３６に記載の精製マトリックス。
３８．ＡＡＶＲがサルＡＡＶＲである、実施形態３６に記載の精製マトリックス。
３９．ＡＡＶＲがオランウータンＡＡＶＲである、実施形態３６に記載の精製マトリックス。
４０．ＡＡＶＲがマウスＡＡＶＲである、実施形態３６に記載の精製マトリックス。
４１．ＡＡＶＲが野生型ＡＡＶＲである、実施形態３６～４０のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
４２．ＡＡＶＲが突然変異体ＡＡＶＲである、実施形態３６～４０のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
４３．ＡＡＶ結合ポリペプチドが配列番号３３の配列を含む、実施形態３６に記載の精製マトリックス。
４４．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、最大２５個のアミノ酸突然変異を有する配列番号３３の配列を含む、実施形態３６に記載の精製マトリックス。
４５．ＡＡＶ結合ドメインが、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、又は少なくとも５個の突然変異を有する配列番号３５のアミノ酸４１１～４９９を含み、各突然変異が、個別に、Ｖ４４０Ｈ、Ｓ４３１Ｈ、Ｑ４３２Ｈ、Ｔ４３４Ｈ、Ｙ４４２Ｈ、Ｉ４６２Ｈ、Ｄ４３５Ｈ、Ｄ４３６Ｈ、Ｋ４３８Ｈ、及びＩ４３９Ｈからなる群から選択される、実施形態３６に記載の精製マトリックス。
４６．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、配列番号２８～３２、３７～４１、４３～４７、及び５２～８６のうちのいずれか１つを含む、実施形態３６に記載の精製マトリックス。
４７．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、配列番号２８～３２、３７～４１、４３～４７、及び５２～８６のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つを含む、実施形態３６に記載の精製マトリックス。
４８．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、多発性嚢胞腎１（ＰＫＤ１）ドメイン、又はその断片を含む、実施形態３６に記載の精製マトリックス。
４９．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、多発性嚢胞腎２（ＰＫＤ２）ドメイン、又はその断片を含む、実施形態３６に記載の精製マトリックス。
５０．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、多発性嚢胞腎３（ＰＫＤ３）ドメイン、又はその断片を含む、実施形態３６に記載の精製マトリックス。
５１．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、多発性嚢胞腎４（ＰＫＤ４）ドメイン、又はその断片を含む、実施形態３６に記載の精製マトリックス。
５２．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、多発性嚢胞腎５（ＰＫＤ５）ドメイン、又はその断片を含む、実施形態３６に記載の精製マトリックス。
５３．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、配列番号２９の配列を含む、実施形態３６に記載の精製マトリックス。
５４．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、少なくとも１つのアミノ酸がヒスチジンに突然変異している配列番号２９の配列を含む、実施形態５３に記載の精製マトリックス。
５５．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、相挙動を有するポリペプチドに可逆的にカップリングされる、実施形態３６～５４のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
５６．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、相挙動を有するポリペプチドに共有結合的にカップリングされる、実施形態３６～５４のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
５７．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、相挙動を有するポリペプチドに非共有結合的にカップリングされる、実施形態３６～５４のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
５８．ＡＡＶ結合ポリペプチドが、相挙動を有するポリペプチドにリンカーを介してカップリングされる、実施形態３６～５７のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
５９．リンカーがペプチドリンカーである、実施形態５８に記載の精製マトリックス。
６０．ペプチドリンカーがプロテアーゼ切断部位を含む、実施形態５８に記載の精製マトリックス。
６１．リンカーが化学的リンカーである、実施形態５８に記載の精製マトリックス。
６２．融合タンパク質が、ＡＡＶ結合ポリペプチドと、相挙動を有するポリペプチドとを含む、実施形態３６～６１のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
６３．相挙動のあるポリペプチドが、エラスチン様ポリペプチドである、実施形態３６～６２のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
６４．相挙動のあるポリペプチドが、レジリン様ポリペプチドである、実施形態３６～６２のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
６５．相挙動のあるポリペプチドが、配列（Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｘａａ－Ｇｌｙ）ｎ（配列番号１０）を有するペンタペプチドリピート、又はそのランダム化されたスクランブル類似体を含むポリマーであり；式中、Ｘａａが、プロリンを除く任意のアミノ酸であってよい、実施形態６３に記載の精製マトリックス。
６６．ｎが、１以上３６０以下の整数である、実施形態６５に記載の精製マトリックス。
６７．相挙動のあるポリペプチドが、
ａ．（ＧＲＧＤＳＰＹ）ｎ（配列番号１）
ｂ．（ＧＲＧＤＳＰＨ）ｎ（配列番号２）
ｃ．（ＧＲＧＤＳＰＶ）ｎ（配列番号３）
ｄ．（ＧＲＧＤＳＰＹＧ）ｎ（配列番号４）
ｅ．（ＲＰＬＧＹＤＳ）ｎ（配列番号５）
ｆ．（ＲＰＡＧＹＤＳ）ｎ（配列番号６）
ｇ．（ＧＲＧＤＳＹＰ）ｎ（配列番号７）
ｈ．（ＧＲＧＤＳＰＹＱ）ｎ（配列番号８）
ｉ．（ＧＲＧＮＳＰＹＧ）ｎ（配列番号９）
ｊ．（ＧＶＧＶＰ）ｎ（配列番号１１）；
ｋ．（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１２）；
ｌ．（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１３）；
ｍ．（ＧＶＧＶＰＧＷＧＶＰＧＶＧＶＰＧＷＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１４）；
ｎ．（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＥＧＶＰＧＦＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１５）；
ｏ．（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＫＧＶＰＧＦＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１６）；及び
ｐ．（ＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰ）ｍ（配列番号１７）
から選択されるアミノ酸配列；
又はそのランダム化されたスクランブル類似体
（式中：
ｎは、２０～３６０の範囲の整数であり；及び
ｍは、４～２５の範囲の整数である）を含む、実施形態１～６３のいずれか１つに記載の精製マトリックス。
６８．相挙動のあるポリペプチドが、
（ａ）（ＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１４３）；
（ｂ）（ＺＺＰＸＸＸＸＧＺ）ｍ（配列番号１４８）；
（ｃ）（ＺＺＰＸＧＺ）ｍ（配列番号１４９）；
（ｄ）（ＺＺＰＸＸＧＺ）ｍ（配列番号１５０）；又は
（ｅ）（ＺＺＰＸＸＸＧＺ）ｍ（配列番号１５１）
（式中、ｍは、１０以上１６０以下の間にある整数であり、式中、Ｘは、存在する場合に、プロリン又はグリシンを除く任意のアミノ酸であり、及び式中、Ｚは、存在する場合に、任意のアミノ酸である）から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１～６３のいずれか１つに記載の精製マトリックス。
６９．相挙動のあるポリペプチドが、
（ａ）（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１４４）；又は
（ｂ）（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１４６）；
（式中、ｍは、２以上３２以下の間にある整数である）から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１～６３のいずれか１つに記載の精製マトリックス。
７０．相挙動のあるポリペプチドが、
（ａ）（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１４４）（式中、ｍは、８又は１６である）；
（ｂ）（ＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰ）ｍ（配列番号１４５）（式中、ｍは、５以上８０以下の間にある整数である）；又は
（ｃ）（ＧＸＧＶＰ）ｍ（配列番号１４７）（式中、ｍは、１０以上１６０以下の間にある整数であり、及び式中、リピート毎にＸは、独立に、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びセリンからなる群から選択される）から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１～６３のいずれか１つに記載の精製マトリックス。
７１．再使用可能である、実施形態３６～７０のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
７２．配列番号２９のアミノ酸配列を有するＡＡＶ結合ポリペプチドを含む、実施形態３６～７０のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
７３．配列番号５２のアミノ酸配列を有するＡＡＶ結合ポリペプチドを含む、実施形態３６～７０のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
７４．配列番号６４のアミノ酸配列を有するＡＡＶ結合ポリペプチドを含む、実施形態３６～７０のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
７５．配列番号２９のアミノ酸配列を有するＡＡＶ結合ポリペプチドと、配列番号８８のアミノ酸配列又は（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１２）（式中、ｍは１６である）を含む相挙動のあるポリペプチドとを含む、実施形態３６～７０のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
７６．精製マトリックスが、配列番号５２のアミノ酸配列を有するＡＡＶ結合ポリペプチドと、配列番号８８のアミノ酸配列又は（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１２）（式中、ｍは１６である）を含む相挙動のあるポリペプチドとを含む、実施形態３６～７０のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
７７．精製マトリックスが、配列番号６４のアミノ酸配列を有するＡＡＶ結合ポリペプチドと、配列番号８８のアミノ酸配列又は（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）ｍ（配列番号１２）（式中、ｍは１６である）を含む相挙動のあるポリペプチドとを含む、実施形態３６～７０のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
７８．配列番号８７及び１７１～１７４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態３６～７０のいずれか一つに記載の精製マトリックス。
７９．ＡＡＶの精製方法であって、ＡＡＶを実施形態１～３５のいずれか一つに記載の精製マトリックスと接触させることを含む方法。
８０．ＡＡＶが、野生型ＡＡＶカプシドを含む、実施形態７９に記載の方法。
８１．ＡＡＶが、突然変異体ＡＡＶカプシドを含む、実施形態７９に記載の方法。
８２．ＡＡＶが、以下の血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、又はＡＡＶｒｈ７４のうちのいずれか１つのカプシドを含む、実施形態７９に記載の方法。
８３．ＡＡＶが精製マトリックスに可逆的に結合してＡＡＶ－精製マトリックス複合体を形成する、実施形態７９～８２のいずれか一つに記載の方法。
８４．ＡＡＶ－精製マトリックス複合体を１つ以上の不純物から分離することを含む、実施形態８３に記載の方法。
８５．ＡＡＶ－精製マトリックス複合体が、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体を洗浄することによって１つ以上の不純物から分離される、実施形態８４に記載の方法。
８６．ＡＡＶ－精製マトリックス複合体からＡＡＶを溶出させることを含む、実施形態８３～８５のいずれか一つに記載の方法。
８７．ＡＡＶが、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体を含む組成物のｐＨを変化させることによってＡＡＶ－精製マトリックス複合体から溶出される、実施形態８６に記載の方法。
８８．ＡＡＶが、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体を含む組成物の温度を変化させることによってＡＡＶ－精製マトリックス複合体から溶出される、実施形態８６に記載の方法。
８９．ＡＡＶが、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体を含む組成物のイオン強度を変化させることによってＡＡＶ－精製マトリックス複合体から溶出される、実施形態８６に記載の方法。
９０．ＡＡＶが、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体を含む組成物に還元剤を添加することによってＡＡＶ－精製マトリックス複合体から溶出される、実施形態８６に記載の方法。
９１．ＡＡＶの精製方法であって、ＡＡＶを実施形態３６～７８のいずれか一つに記載の精製マトリックスと接触させることを含む方法。
９２．ＡＡＶが、野生型ＡＡＶカプシドを含む、実施形態９１に記載の方法。
９３．ＡＡＶが、突然変異体ＡＡＶカプシドを含む、実施形態９１に記載の方法。
９４．ＡＡＶが、以下の血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ又はウシＡＡＶのうちのいずれか１つのカプシドを含む、実施形態９１に記載の方法。
９５．ＡＡＶが精製マトリックスに可逆的に結合してＡＡＶ－精製マトリックス複合体を形成する、実施形態９１～９４のいずれか一つに記載の方法。
９６．第１の環境因子を使用してＡＡＶ－精製マトリックス複合体のサイズを増加させることを含む、実施形態９５に記載の方法。
９７．第１の環境因子が、
ａ．温度、ｐＨ、塩濃度又は圧力のうちの１つ以上の変化；
ｂ．１つ以上の界面活性剤、補因子、ビタミン、分子クラウディング剤、酵素、変性剤の添加；又は
ｃ．電磁波又は音波の適用
のうちの１つ以上を含む、実施形態９６に記載の方法。
９８．ＡＡＶ－精製マトリックス複合体をサイズを基準として少なくとも１つの不純物から分離することを含む、実施形態９６又は９７に記載の方法。
９９．ＡＡＶ－精製マトリックス複合体が、直径を基準として少なくとも１つの不純物から分離される、実施形態９８に記載の方法。
１００．ＡＡＶ－精製マトリックス複合体が、質量を基準として少なくとも１つの不純物から分離される、実施形態９８に記載の方法。
１０１．サイズを基準とした分離が、タンジェンシャルフローろ過、分析超遠心、膜クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、ノーマルフローろ過、音波分離、遠心、向流遠心、及び高速タンパク質液体クロマトグラフィーを用いて実施される、実施形態９８～１００のいずれか一つに記載の方法。
１０２．第２の環境因子を使用してＡＡＶをＡＡＶ－精製マトリックス複合体から溶出させる、実施形態９１～１０１のいずれか一つに記載の方法。
１０３．第２の環境因子が、
ａ．温度、ｐＨ、塩濃度又は圧力のうちの１つ以上の変化；
ｂ．１つ以上の界面活性剤、補因子、ビタミン、分子クラウディング剤、変性剤、酵素の添加；又は
ｃ．電磁波又は音波の適用
のうちの１つ以上を含む、実施形態１０２に記載の方法。
１０４．精製マトリックスを再生すること、及び精製マトリックスを第２のＡＡＶの精製に再使用することを含む、実施形態７９～１０３のいずれか一つに記載の方法。
１０５．精製されたＡＡＶが、精製前の感染力レベルの９５％より高い感染力レベルを有する、実施形態７９～１０３のいずれか一つに記載の方法。
１０６．ＡＡＶが精製後にその感染力の少なくとも９６％を保持している、実施形態７９～１０３のいずれか一つに記載の方法。
１０７．ＡＡＶが精製後にその感染力の少なくとも９７％を保持している、実施形態７９～１０３のいずれか一つに記載の方法。
１０８．ＡＡＶが精製後にその感染力の少なくとも９８％を保持している、実施形態７９～１０３のいずれか一つに記載の方法。
１０９．ＡＡＶが精製後にその感染力の少なくとも９９％を保持している、実施形態７９～１０３のいずれか一つに記載の方法。
１１０．ＡＡＶが精製後にその感染力の少なくとも１００％を保持している、実施形態７９～１０３のいずれか一つに記載の方法。
１１１．精製されたＡＡＶで内包型カプシドが濃縮されている、実施形態７９～１０３のいずれか一つに記載の方法。
１１２．精製されたＡＡＶが、精製前のｑＰＣＲ：ＥＬＩＳＡ比と比較してｑＰＣＲ：ＥＬＩＳＡ比の増加を呈する、実施形態１１１に記載の方法。
１１３．約２～約１０時間で完了する、実施形態７９～１１２のいずれか一つに記載の方法。
１１４．約４～約８時間で完了する、実施形態１１３に記載の方法。
１１５．実施形態７９～１１４のいずれか一つに記載の方法により精製されたＡＡＶを含む組成物。
１１６．少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％が不純物を含まない、実施形態１１５に記載の組成物。
１１７．少なくとも１つの突然変異を有する配列番号２８～４７のうちのいずれか１つの配列を含むＡＡＶ結合ポリペプチド。
１１８．実施形態１１７に記載のＡＡＶ結合ポリペプチドをコードする核酸。
１１９．実施形態１１８に記載の核酸を含むベクター。
１２０．実施形態１１７に記載のＡＡＶ結合ポリペプチド、実施形態１１８に記載の核酸、又は実施形態１１９に記載のベクターを含む組成物。
１２１．実施形態１１７に記載のＡＡＶ結合ポリペプチド、実施形態１１８に記載の核酸、又は実施形態１１９に記載のベクターを含むキット。
１２２．ＡＡＶ粒子のその生産時の収率を増加させる方法であって、ＡＡＶ生産細胞を精製マトリックスの存在下に培養することを含む方法。
１２３．ＡＡＶ粒子をその生産時に安定化させる方法であって、ＡＡＶ生産細胞を精製マトリックスの存在下に培養することを含む方法。
１２４．ＡＡＶ粒子をその精製時に安定化させる方法であって、ＡＡＶ粒子をその精製時に精製マトリックスと接触させることを含む方法。
１２５．ＡＡＶ粒子をその貯蔵時に安定化させる方法であって、ＡＡＶ粒子を精製マトリックスの存在下に貯蔵することを含む方法。
１２６．ＡＡＶ粒子の保管寿命を増加させる方法であって、ＡＡＶ粒子を精製マトリックスの存在下に貯蔵することを含む方法。
１２７．精製マトリックスが、実施形態１～７８のいずれか一つに記載の精製マトリックスである、実施形態１２２～１２６のいずれか一つに記載の方法。
１２８．ＡＡＶ粒子が、以下の血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ又はウシＡＡＶのうちのいずれか１つの野生型ＡＡＶ粒子である、実施形態１２２～１２７のいずれか一つに記載の方法。
１２９．ＡＡＶ粒子が、突然変異体ＡＡＶ粒子である、実施形態１２２～１２７のいずれか一つに記載の方法。
１３０．ＡＡＶ粒子が精製マトリックスに可逆的に結合してＡＡＶ－精製マトリックス複合体を形成する、実施形態１２２～１２７のいずれか一つに記載の方法。
１３１．精製マトリックスが少なくとも約１０μＭの濃度で存在する、実施形態１２２～１２７のいずれか一つに記載の方法。
【0304】
参照による援用
[0284] 本明細書に引用される全ての参考文献、論文、刊行物、特許、特許公報、及び特許出願は、あらゆる目的から全体として参照により援用される。しかしながら、本明細書に引用される任意の参考文献、論文、刊行物、特許、特許公報、及び特許出願についての言及は、それが世界のどこの国でも有効な先行技術を構成する又は技術常識の一部を成すことの承認又は何らかの形の示唆ではなく、及びそのように解釈されてはならない。
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】
【国際調査報告】