(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-13
(54)【発明の名称】Ｐｉｆ１様ヘリカーゼ及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/55 20060101AFI20230406BHJP
C12N 9/14 20060101ALI20230406BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230406BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230406BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230406BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230406BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230406BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20230406BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20230406BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20230406BHJP
【ＦＩ】
C12N15/55 ZNA
C12N9/14
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12Q1/6869 Z
C12M1/00 A
C12M1/34 B
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022551797
(86)(22)【出願日】2020-06-19
(85)【翻訳文提出日】2022-08-26
(86)【国際出願番号】 CN2020097126
(87)【国際公開番号】W WO2021253410
(87)【国際公開日】2021-12-23
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522332250
【氏名又は名称】チタン テクノロジー リミテッド， ベイジン
【氏名又は名称原語表記】ＱＩＴＡＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＬＴＤ．， ＢＥＩＪＩＮＧ
【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ３０１， Ｆｌｏｏｒ ３， Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ａ５， Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｔｅｒｒｉｔｏｒｙ， Ｚｈｏｎｇｇｕａｎｃｕｎ Ｄｏｎｇｓｈｅｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐａｒｋ， Ｎｏ．６６ Ｘｉ Ｘｉａｏｋｏｕ Ｒｏａｄ， Ｈａｉｄｉａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂｅｉｊｉｎｇ， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002952
【氏名又は名称】弁理士法人鷲田国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ジャン ジョウガン
(72)【発明者】
【氏名】ワン ムーヤン
(72)【発明者】
【氏名】グオ チァンチァン
(72)【発明者】
【氏名】チェン チェンギャオ
【テーマコード（参考）】
4B029
4B050
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029AA23
4B029BB20
4B029FA15
4B050CC04
4B050LL03
4B063QA01
4B063QA13
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QS36
4B063QX05
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA87X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA31
4B065CA46
(57)【要約】
本願は、修飾されたＰｉｆ１様ヘリカーゼ、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼを含む構築体、及び標的ポリヌクレオチドの特徴づけ又はポアを通過する標的ポリヌクレオチドの移動に対する制御における使用を提供する。本願は、さらに、標的ポリヌクレオチドを特徴づける方法、又はポアを通過する標的ポリヌクレオチドの移動を制御する方法を提供する。前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、ポアを通過するポリヌクレオチドの移動を効果的制御し、ストランドシークエンシングプロセスでの精度を向上させることができる。
【選択図】図２
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｐｉｆ１様ヘリカーゼであって、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼのタワードメイン、ピンドメイン及び／又は１Ａドメインへ導入された少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸を含み、
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を保持している、
ことを特徴とするＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項2】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、（ａ）配列番号１のバリアントであって、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメインのＥ２６４－Ｐ２７８及びＮ２９６－Ａ３９４、及び／又はピンドメインのＫ８９－Ｅ１０５、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ８８及びＭ１０６－Ｖ１８１に導入されている、配列番号１のバリアント、
（ｂ）配列番号２のバリアントであって、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメインのＥ２６５－Ｐ２７９及びＮ２９７－Ａ３９２、及び／又はピンドメインのＫ８９－Ｄ１０５、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ８８及びＩ１０６－Ｍ１８０に導入されている、配列番号２のバリアント、
（ｃ）配列番号３のバリアントであって、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメインのＴ２６６－Ｐ２８０及びＮ２９８－Ｓ４０３、及び／又はピンドメインのＫ８９－Ａ１０９、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ８８及びＫ１１０－Ｖ１８２に導入されている、配列番号３のバリアント、
（ｄ）配列番号４のバリアントであって、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメインのＴ２６６－Ｐ２８０及びＮ２９８－Ｓ４０４、及び／又はピンドメインのＫ８９－Ａ１０９、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ８８及びＫ１１０－Ｖ１８２に導入されている、配列番号４のバリアント、
（ｅ）配列番号５のバリアントであって、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメインのＥ２６０－Ｐ２７４及びＮ２９２－Ａ３９１、及び／又はピンドメインのＫ８６－Ｅ１０２、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ８４及びＭ１０３－Ｋ１７７に導入されている、配列番号５のバリアント、
（ｆ）配列番号６のバリアントであって、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメインのＥ２６６－Ｐ２８０及びＮ２９８－Ａ３９６、及び／又はピンドメインのＫ９１－Ｅ１０７、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ９０及びＭ１０８－Ｍ１８３に導入されている、配列番号６のバリアント、
（ｇ）配列番号７のバリアントであって、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメインのＴ２７６－Ｐ２９０及びＮ３０８－Ｐ４０２、及び／又はピンドメインのＫ１００－Ｄ１１６、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ９９及びＤ１１７－Ｍ１９１に導入されている、配列番号７のバリアント、
（ｈ）配列番号８のバリアントであって、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメインのＤ２７４－Ｐ２８８及びＮ３０６－Ａ４０４、及び／又はピンドメインのＫ９５－Ｅ１１２、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ９５及びＩ１１３－Ｋ１８７に導入されている、配列番号８のバリアント、
（ｉ）配列番号９のバリアントであって、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメインのＥ２６０－Ｐ２７４及びＮ２９２－Ａ３９１、及び／又はピンドメインのＫ８６－Ｅ１０２、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ８５及びＭ１０３－Ｋ１７７に導入されている、配列番号９のバリアント、
（ｊ）配列番号１０のバリアントであって、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメインのＥ２６５－Ｐ２７９及びＨ２９７－Ａ３９３、及び／又はピンドメインのＫ８８－Ｅ１０４、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ８７及びＩ１０５－Ｋ１８０に導入されている、配列番号１０のバリアント、又は、
（ｋ）配列番号１１のバリアントであって、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメインのＥ２６４－Ｐ２７８及びＮ２９６－Ｐ３８９、及び／又はピンドメインのＫ９７－Ａ１１３、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ９６及びＰ１１４－Ｋ１８４に導入されている、配列番号１１のバリアント
を含むことを特徴とする請求項１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項3】
前記ヘリカーゼは、（ａ）配列番号１１のバリアントであって、（ｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、（ｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＫ３６０Ｃ、（ｉｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、（ｉｖ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＱ３６３Ｃ、（ｖ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＫ３６６Ｃ、（ｖｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＭ３５６Ｃ、（ｖｉｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＫ３６０Ｃ、（ｖｉｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＭ３５６Ｃ、（ｉｘ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＱ３６３Ｃ、（ｘ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＫ３６６Ｃ、（ｘｉ）Ｆ１０８Ｃ及び／又はＭ３５６Ｃ、（ｘｉｉ）Ｆ１０８Ｃ及び／又はＫ３６０Ｃ、（ｘｉｉｉ）Ｆ１０８Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、（ｘｉｖ）Ｆ１０８Ｃ及び／又はＱ３６３Ｃ、（ｘｖ）Ｆ１０８Ｃ及び／又はＫ３６６Ｃ、（ｘｖｉ）Ｋ１３４Ｃ及び／又はＭ３５６Ｃ、（ｘｖｉｉ）Ｋ１３４Ｃ及び／又はＫ３６０Ｃ、（ｘｖｉｉｉ）Ｋ１３４Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、（ｘｉｘ）Ｋ１３４Ｃ及び／又はＱ３６３Ｃ、（ｘｘ）Ｋ１３４Ｃ及び／又はＫ３６６Ｃ、（ｘｘｉ）（ｉ）～（ｘｘ）のいずれか一つ及びＧ３５９Ｃ、（ｘｘｉｉ）（ｉ）～（ｘｘ）のいずれか一つ及びＱ１１１Ｃ、（ｘｘｉｉｉ）（ｉ）～（ｘｘ）のいずれか一つ及びＩ１３８Ｃ、（ｘｘｉｖ）（ｉ）～（ｘｘ）のいずれか一つ及びＱ１１１Ｃ及びＩ１３８Ｃ、（ｘｘｖ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＦ３７７Ｃ、（ｘｘｖｉ）Ｙ１０３Ｌ、Ｅ１０５Ｙ、Ｎ３５２Ｎ、Ａ３６２Ｃ及びＹ３６５Ｎ、（ｘｘｖｉｉ）Ｅ１０５Ｙ及びＡ３６２Ｃ、（ｘｘｖｉｉｉ）Ａ３６２Ｃ、（ｘｘｉｘ）Ｙ１０３Ｌ、Ｅ１０５Ｃ、Ｎ３５２Ｎ、Ａ３６２Ｙ及びＹ３６５Ｎ、（ｘｘｘ）Ｙ１０３Ｌ、Ｅ１０５Ｃ及びＡ３６２Ｙ、（ｘｘｘｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、及びＩ２８０Ａ、（ｘｘｘｉｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＬ３５８Ｃ、（ｘｘｘｉｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＧ３５９Ｃ、（ｘｘｘｉｖ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、（ｘｘｘｖ）Ｋ１０６Ｃ及び／又はＷ３７８Ｃ、（ｘｘｘｖｉ）Ｔ１０２Ｃ及び／又はＮ３８２Ｃ、（ｘｘｘｖｉｉ）Ｔ１０２Ｃ及び／又はＷ３７８Ｃ、（ｘｘｘｖｉｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＹ３５５Ｃ、（ｘｘｘｉｘ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＮ３８２Ｃ、（ｘｌ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＫ３８１Ｃ、（ｘｌｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＫ３７９Ｃ、（ｘｌｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＤ３７６Ｃ、（ｘｌｉｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＷ３７８Ｃ、（ｘｌｉｖ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＷ３７４Ｃ、（ｘｌｖ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＹ３５５Ｃ、（ｘｌｖｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＮ３８２Ｃ、（ｘｌｖｉｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＫ３８１Ｃ、（ｘｌｖｉｉｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＫ３７９Ｃ、（ｘｌｉｘ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＤ３７６Ｃ、（ｌ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＷ３７８Ｃ、（ｌｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＷ３７４Ｃ、（ｌｉｉ）Ｅ１０５Ｃ及びＡ３６２Ｙ、（ｌｉｉｉ）Ｅ１０５Ｃ、Ｇ３５９及びＡ３６２Ｃ、又は（ｌｉｖ）Ｉ２Ｃ、Ｅ１０５Ｃ及びＡ３６２Ｃを含む、配列番号１１のバリアント、又は、
（ｂ）配列番号１～１０のいずれか一つのバリアントであって、配列番号１１の（ｉ）～（ｌｉｖ）のいずれか一つで定義される位置に対応する位置にシステイン残基を含む、配列番号１～１０のいずれか一つのバリアント
を含むことを特徴とする請求項２に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項4】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼのアミノ酸配列は、配列番号１～１１に示されるアミノ酸配列であるか、又は、配列番号１～１１に示されるアミノ酸配列と少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．９％の相同性を有し、且つ、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有することを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項5】
導入されたシステイン同士が互いに連結される、導入された非天然アミノ酸同士が互いに連結される、導入されたシステインと非天然アミノ酸とが互いに連結される、導入されたシステインと天然アミノ酸とが互いに連結される、又は導入された非天然アミノ酸と天然アミノ酸とが互いに連結されることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項6】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、少なくとも一つ又は複数のシステインの置換をさらに含む、好ましくは、アラニン、セリン又はバリンによるシステインの置換をさらに含む、ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項7】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、（ａ）配列番号５のバリアントであって、一つ又は複数の置換された天然システイン残基がＣ１０９、Ｃ１１４、Ｃ１３６又はＣ４１４のうちの一つ又は複数である、配列番号５のバリアント、又は、
（ｂ）配列番号１、２、３、４、６、７、８、９、１０及び１１のいずれか一つのバリアントであって、一つ又は複数の置換された天然システイン残基が配列番号５のＣ１０９、Ｃ１１４、Ｃ１３６又はＣ４１４のうちの一つ又は複数に対応する、配列番号１、２、３、４、６、７、８、９、１０及び１１のいずれか一つのバリアント
を含むことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項8】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、表面が負に帯電したアミノ酸、極性又は非極性アミノ酸の置換又は修飾をさらに含み、さらに好ましくは、前記置換は、正に帯電したアミノ酸、非荷電アミノ酸による負に帯電したアミノ酸、非荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸、極性又は非極性アミノ酸の置換を含むことを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項9】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、ａ）配列番号１１のバリアントであって、一つ又は複数の負に帯電したアミノ酸がＤ５、Ｅ９、Ｅ２４、Ｅ８７、Ｉ６５、Ｓ５８、Ｄ２０９又はＤ２１６のうちの一つ又は複数である、配列番号１１のバリアント、又は、
ｂ）配列番号１～１０のいずれか一つのバリアントであって、一つ又は複数の負に帯電したアミノ酸が配列番号１１のＤ５、Ｅ９、Ｅ２４、Ｅ８７、Ｉ６５、Ｓ５８、Ｄ２０９又はＤ２１６のうちの一つ又は複数に対応する、配列番号１～１０のいずれか一つのバリアント
を含むことを特徴とする請求項８に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項10】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、ａ）配列番号１のバリアントであって、前記一つ又は複数の負に帯電したアミノ酸がＳ１７１をさらに含む、配列番号１のバリアント、又は、
ｂ）配列番号９のバリアントであって、前記一つ又は複数の負に帯電したアミノ酸がＳ１７３をさらに含む、配列番号９のバリアント
を含むことを特徴とする請求項９に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項11】
前記非天然アミノ酸は、４－アジド－Ｌ－フェニルアラニン（Ｆａｚ）、４－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、３－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、４－アセトアセチル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｏ－アリル－Ｌ－チロシン、３－（フェニルセレニル）－Ｌ－アラニン、Ｏ－２－プロピン－１－イル－Ｌ－チロシン、４－（ジヒドロキシボリル）－Ｌ－フェニルアラニン、４－［（エチルスルファニル）カルボニル］－Ｌ－フェニルアラニン、（２Ｓ）－２－アミノ－３－｛４－［（プロパン－２－イルスルファニル）カルボニル］フェニル｝プロピオン酸、（２Ｓ）－２－アミノ－３－｛４－［（２－アミノ－３－スルファニルプロパノイル）アミノ］フェニル｝プロピオン酸、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、４－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、４－シアノ－Ｌ－フェニルアラニン、３－シアノ－Ｌ－フェニルアラニン、４－フルオロ－Ｌ－フェニルアラニン、４－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、４－ブロモ－Ｌ－フェニルアラニン、Ｏ－（トリフルオロメチル）チロシン、４－ニトロ－Ｌ－フェニルアラニン、３－ヒドロキシ－Ｌ－チロシン、３－アミノ－Ｌ－チロシン、３－ヨード－Ｌ－チロシン、４－イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、３－（２－ナフチル）－Ｌ－アラニン、４－フェニル－Ｌ－フェニルアラニン、（２Ｓ）－２－アミノ－３－（ナフタレン－２－イルアミノ）プロピオン酸、６－（メチルスルファニル）ノルロイシン、６－オキシ－Ｌ－リジン、Ｄ－チロシン、（２Ｒ）－２－ヒドロキシ－３－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、（２Ｒ）－２－アミノオクタン酸エステル－３－（２，２’－ビピリジル－５－イル）－Ｄ－アラニン、２－アミノ－３－（８－ヒドロキシ－３－キノリル）プロピオン酸、４－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｓ－（２－ニトロベンジル）システイン、（２Ｒ）－２－アミノ－３－［（２－ニトロベンジル）スルファニル］プロピオン酸、（２Ｓ）－２－アミノ－３－［（２－ニトロベンジル）オキシ］プロピオン酸、Ｏ－（４，５－ジメトキシ－２－ニトロベンジル）－Ｌ－セリン、（２Ｓ）－２－アミノ－６－（｛［（２－ニトロベンジル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｏ－（２－ニトロベンジル）－Ｌ－チロシン、２－ニトロフェニルアラニン、４－［（Ｅ）－フェニルジアゼニル］－Ｌ－フェニルアラニン、４－［３－（トリフルオロメチル）－３Ｈ－ジアジリジニル－３イル］－Ｄ－フェニルアラニン、２－アミノ－３－［［５－（ジメチルアミノ）－１－ナフチル］スルホニルアミノ］プロピオン酸、（２Ｓ）－２－アミノ－４－（７－ヒドロキシ－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）ブタン酸、（２Ｓ）－３－［（６－アセチルナフタレン－２－イル）アミノ］－２－アミノプロピオン酸、４－（カルボキシメチル）フェニルアラニン、３－ニトロ－Ｌ－チロシン、Ｏ－チオ－Ｌ－チロシン、（２Ｒ）－６－アセチルアミノ－２－アミノカプロン酸エステル、１－メチルヒスチジン、２－アミノノナン酸、２－アミノデカン酸、Ｌ－ホモシステイン、５－スルファニル－ノルバリン、６－スルファニル－Ｌ－ノルロイシン、５－（メチルスルファニル）－Ｌ－ノルバリン、Ｎ６－｛［（２Ｒ，３Ｒ）－３－メチル－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピロール－２－イル］カルボニル｝－Ｌ－リジン、Ｎ６－［（ベンジルオキシ）カルボニル］リジン、（２Ｓ）－２－アミノ－６－［（シクロペンチルカルボニル）アミノ］ヘキサン酸、Ｎ６－［（シクロペンチルオキシ）カルボニル］－Ｌ－リジン、（２Ｓ）－２－アミノ－６－｛［（２Ｒ）－テトラヒドロフラン－２－イルカルボニル］アミノ｝ヘキサン酸、（２Ｓ）－２－アミノ－８－［（２Ｒ，３Ｓ）－３－エチニルテトラヒドロフラン－２－イル］－８－オキシオクタン酸、Ｎ６－（ｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－リジン、（２Ｓ）－２－ヒドロキシ－６－（｛［（２－メチル－２－プロパンイル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｎ６－［（アリルオキシ）カルボニル］リジン、（２Ｓ）－２－アミノ－６－（｛［（２－アジドベンジル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｎ６－Ｌ－プロピル－Ｌ－リジン、（２Ｓ）－２－アミノ－６－｛［（プロプ－２－イン－１－イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸又はＮ６－［（２－アジドエトキシ）カルボニル］－Ｌ－リジンから選択されることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項12】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、（ａ）一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又複数のヌクレオチドと相互作用する少なくとも一つのアミノ酸の置換、及び／又は、
（ｂ）膜貫通ポアと相互作用する少なくとも一つのアミノ酸の置換
をさらに含み、
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する、
ことを特徴とする請求項１乃至１１のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項13】
（ａ）において、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの糖及び／又は塩基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸が、より大きな側鎖を含むアミノ酸で置換される、ことを特徴とする請求項１２に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項14】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、（ａ）配列番号１１のバリアントであって、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの糖及び／又は塩基と相互作用する前記少なくとも一つのアミノ酸が、Ｐ７３、Ｈ９３、Ｎ９９、Ｆ１０９、Ｉ２８０、Ａ１６１、Ｆ１３０、Ｄ１３２、Ｄ１６２、Ｄ１６３、Ｅ２７７、Ｋ４１５、Ｑ２９１、Ｈ３９６、Ｙ２４４又はＰ１００のうちの少なくとも一つである、配列番号１１のバリアント、又は、
（ｂ）配列番号１～１０のいずれか一つのバリアントであって、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの糖及び／又は塩基と相互作用する前記少なくとも一つのアミノ酸が、配列番号１１のＰ７３、Ｈ９３、Ｎ９９、Ｆ１０９、Ｉ２８０、Ａ１６１、Ｆ１３０、Ｄ１３２、Ｄ１６２、Ｄ１６３、Ｅ２７７、Ｋ４１５、Ｑ２９１、Ｈ３９６、Ｙ２４４又はＰ１００のうちの少なくとも一つに対応する、配列番号１～１０のいずれか一つのバリアント
を含むことを特徴とする請求項１３に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項15】
前記より大きな側鎖が、増加した数の炭素原子を含む、増加した長さを有する、増加した分子体積を有する、及び／又は増加したファンデルワールス体積を有することを特徴とする請求項１３又は１４に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項16】
前記より大きな側鎖が、前記少なくとも一つのアミノ酸と前記一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドとの間の（ｉ）静電相互作用、（ｉｉ）水素結合及び／又は（ｉｉｉ）カチオン-π相互作用を増加させることを特徴とする請求項１３乃至１５のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項17】
前記より大きな側鎖のアミノ酸が、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、グリシン（Ｇ）、セレノシステイン（Ｕ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）ではないことを特徴とする請求項１３乃至１６のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項18】
Ａ）ヒスチジン（Ｈ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）又はアスパラギン（Ｎ）、又は、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）で置換され、Ｂ）アスパラギン（Ｎ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）又はヒスチジン（Ｈ）、又は、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）で置換され、
Ｃ）プロリン（Ｐ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）又はトリプトファン（Ｗ）、又は、（ｉｖ）ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）又はイソロイシン（Ｉ）で置換され、
Ｄ）フェニルアラニン（Ｆ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）ヒスチジン（Ｈ）、又は、（ｉｉｉ）チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）で置換され、
Ｅ）アスパラギン酸（Ｄ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）又はヒスチジン（Ｈ）、又は、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）で置換され、
Ｆ）バリン（Ｖ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）、又は、（ｉｖ）イソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）で置換され、
Ｇ）セリン（Ｓ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）、又は、（ｉｖ）イソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）で置換され、及び／又は、
Ｈ）チロシン（Ｙ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、又は、（ｉｉ）トリプトファン（Ｗ）で置換される
ことを特徴とする請求項１２乃至１７のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項19】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号１１のバリアントであり、及び、Ｐ７３Ｌ、Ｐ７３Ｖ、Ｐ７３Ｉ、Ｐ７３Ｅ、Ｐ７３Ｔ、Ｐ７３Ｆ、Ｈ９３Ｎ、Ｈ９３Ｑ、Ｈ９３Ｗ、Ｎ９９Ｒ、Ｎ９９Ｈ、Ｎ９９Ｗ、Ｎ９９Ｙ、Ｐ１００Ｌ、Ｐ１００Ｖ、Ｐ１００Ｉ、Ｐ１００Ｅ、Ｐ１００Ｔ、Ｐ１００Ｆ、Ｆ１３０Ｗ、Ｆ１３０Ｙ、Ｆ１３０Ｈ、Ｄ１３２Ｈ、Ｄ１３２Ｙ、Ｄ１３２Ｋ、Ａ１６１Ｉ、Ａ１６１Ｌ、Ａ１６１Ｎ、Ａ１６１Ｗ、Ａ１６１Ｈ、Ｄ１６２Ｈ、Ｄ１６２Ｙ、Ｄ１６２Ｋ、Ｄ１６３Ｗ、Ｄ１６３Ｆ、Ｄ１６３Ｙ、Ｄ１６３Ｈ、Ｄ１６３Ｉ、Ｄ１６３Ｌ、Ｄ１６３Ｖ、Ｙ２４４Ｗ、Ｙ２４４Ｈ、Ｅ２７７Ｇ、Ｉ２８０Ｈ、Ｉ２８０Ｋ、Ｉ２８０Ｗ、Ｑ２９１Ｋ、Ｑ２９１Ｒ、Ｑ２９１Ｗ、Ｑ２９１Ｆ、Ｈ３９６Ｎ、Ｈ３９６Ｑ、Ｈ３９６Ｗ、Ｋ４１５Ｗ、Ｋ４１５Ｒ、Ｋ４１５Ｈ、Ｋ４１５Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｖ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｉ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｅ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｔ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｆ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ９３Ｎ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ９３Ｑ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ９３Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｒ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｖ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｉ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｅ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｔ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｆ、Ｆ１０９Ｗ／Ｆ１３０Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｆ１３０Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｆ１３０Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｉ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｎ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６２Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６２Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６２Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｆ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｉ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｖ、Ｆ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ２７７Ｇ、Ｆ１０９Ｗ／Ｉ２８０Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｉ２８０Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｉ２８０Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｑ２９１Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｑ２９１Ｒ、Ｆ１０９Ｗ／Ｑ２９１Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｑ２９１Ｆ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｎ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｑ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｋ４１５Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｋ４１５Ｒ、Ｆ１０９Ｗ／Ｋ４１５Ｈ、又はＦ１０９Ｗ／Ｋ４１５Ｙを含む
ことを特徴とする請求項１２乃至１８のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項20】
（ａ）において、一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの一つ又は複数のリン酸基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸が置換されることを特徴とする請求項１２乃至１９のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項21】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、（ａ）配列番号１１のバリアントであって、ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの一つ又は複数のリン酸基と相互作用する前記少なくとも一つのアミノ酸が、Ｈ７５、Ｔ９１、Ｓ９４、Ｋ９７、Ｎ２４６、Ｎ２４７、Ｎ２８４、Ｋ２８８、Ｎ２９７、Ｔ３９４又はＫ３９７のうちの少なくとも一つである、配列番号１１のバリアント、又は、
（ｂ）配列番号１～１０のいずれか一つのバリアントであって、ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの一つ又は複数のリン酸基と相互作用する前記少なくとも一つのアミノ酸が、配列番号１１のＨ７５、Ｔ９１、Ｓ９４、Ｋ９７、Ｎ２４６、Ｎ２４７、Ｎ２８４、Ｋ２８８、Ｎ２９７、Ｔ３９４又はＫ３９７に対応する少なくとも一つのアミノ酸である、配列番号１～１０のいずれか一つのバリアント
を含むことを特徴とする請求項２０に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項22】
ａ）ヒスチジン（Ｈ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）又はスレオニン（Ｔ）、又は、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）又はチロシン（Ｙ）で置換される、ｂ）スレオニン（Ｔ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）又はヒスチジン（Ｈ）、又は、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）又はヒスチジン（Ｈ）で置換される、
ｃ）セリンが、（ｉ）アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）又はヒスチジン（Ｈ）、又は、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）又はヒスチジン（Ｈ）で置換される、
ｄ）アスパラギン（Ｎ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）又はヒスチジン（Ｈ）、又は、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）又はヒスチジン（Ｈ）で置換される、及び／又は、
ｅ）リジン（Ｋ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）又はヒスチジン（Ｈ）、又は、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）又はヒスチジン（Ｈ）で置換される
ことを特徴とする請求項２１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項23】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号１１のバリアントであり、（ａ）Ｈ７５Ｎ、Ｈ７５Ｑ、Ｈ７５Ｋ又はＨ７５Ｆ、
（ｂ）Ｔ９１Ｋ、Ｔ９１Ｑ又はＴ９１Ｎ、
（ｃ）Ｓ９４Ｈ、Ｓ９４Ｎ、Ｓ９４Ｋ、Ｓ９４Ｔ、Ｓ９４Ｒ又はＳ９４Ｑ、
（ｄ）Ｋ９７Ｑ、Ｋ９７Ｈ又はＫ９７Ｙ、
（ｅ）Ｎ２４６Ｈ又はＮ２４６Ｑ、
（ｆ）Ｎ２４７Ｑ又はＮ２４７Ｈ、
（ｇ）Ｎ２８４Ｈ又はＮ２８４Ｑ、
（ｈ）Ｋ２８８Ｑ又はＫ２８８Ｈ、
（ｉ）Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｋ又はＮ２９７Ｈ、
（ｊ）Ｔ３９４Ｋ、Ｔ３９４Ｈ又はＴ３９４Ｎ、若しくは、
（ｋ）Ｋ３９７Ｒ、Ｋ３９７Ｈ又はＫ３９７Ｙ
のうちの一つ又は複数を含むことを特徴とする請求項２０乃至２２のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項24】
前記ヘリカーゼは、膜貫通ポアと相互作用する少なくとも一つのアミノ酸の置換を含み、（ａ）配列番号１１のバリアントにおいて、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼが、（ａ）Ｅ１９６（ｂ）Ｗ２０２（ｃ）Ｎ１９９又は（ｄ）Ｇ２０１上の一つ又は複数の置換を含む、又は、
（ｂ）配列番号１～１０のいずれか一つのバリアントにおいて、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼが、（ａ）Ｅ１９６（ｂ）Ｗ２０２（ｃ）Ｎ１９９又は（ｄ）Ｇ２０１に対応する少なくとも一つの置換を含む
ことを特徴とする請求項１２乃至２３のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項25】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号１１のバリアントであり、及び、－Ｆ１０９／Ｅ１９６／Ｈ７５、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｈ７５Ｎ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｈ７５Ｑ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｈ７５Ｋ、又はＦ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｈ７５Ｆ、
－Ｆ１０９／Ｅ１９６／Ｔ９１、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｔ９１Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｔ９１Ｑ、又はＦ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｔ９１Ｎ、
－Ｆ１０９／Ｓ９４／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｔ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｒ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｑ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｎ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｋ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｎ９９／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｒ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｓ９４／Ｅ１９６／Ｉ２８０、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｈ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｋ、
－Ｆ１０９／Ｐ１００／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｌ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｖ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｉ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｔ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｄ１３２／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｋ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ａ１６１／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｉ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｌ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｎ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｄ１６３／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｆ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｉ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｌ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｖ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｙ２４４／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｎ２４６／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ２４６Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｎ２４６Ｑ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｅ１９６／Ｉ２８０、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｗ、又はＦ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｒ、
－Ｆ１０９／Ｅ１９６／Ｑ２９１、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｑ２９１Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｑ２９１Ｒ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｑ２９１Ｗ、又はＦ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｑ２９１Ｆ、
－Ｆ１０９／Ｎ２９７／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ２９７Ｑ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ２９７Ｋ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｎ２９７Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｔ３９４／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｔ３９４Ｋ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｔ３９４Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｔ３９４Ｎ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｈ３９６／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｆ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｑ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｋ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｋ３９７／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｋ３９７Ｒ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｋ３９７Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｋ３９７Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、又は、
－Ｆ１０９／Ｙ４１６／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｙ４１６Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｙ４１６Ｒ／Ｅ１９６Ｌ
の位置での置換を含むことを特徴とする請求項１乃至２４のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項26】
請求項１乃至２５のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼを少なくとも一つ含むことを特徴とする、構築体。
【請求項27】
前記構築体は、ポリヌクレオチド結合部をさらに含むことを特徴とする請求項２６に記載の構築体。
【請求項28】
請求項１乃至２５のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ、又は請求項２６又は２７に記載の構築体をコードすることを特徴とする、核酸。
【請求項29】
請求項２８に記載の核酸を含むことを特徴とする、発現ベクター。
【請求項30】
請求項２８に記載の核酸、又は請求項２９に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする、宿主細胞。
【請求項31】
ポリヌクレオチドの移動を制御する方法であって、請求項１乃至２５のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ、又は請求項２６又は２７に記載の構築体を、ポリヌクレオチドに接触させること
含むことを特徴とするポリヌクレオチドの移動を制御する方法。
【請求項32】
標的ポリヌクレオチドを特徴づける方法であって、Ｉ）請求項１乃至２５のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ、又は請求項２６又は２７に記載の構築体を、標的ポリヌクレオチド及びポアと接触させて、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼ又は構築体がポアを通過する標的ポリヌクレオチドの移動を制御するようにすること、及び、
ＩＩ）標的ポリヌクレオチドのヌクレオチドと前記ポアが相互作用する時の一つ又は複数の特徴を取得して、前記標的ポリヌクレオチドを特徴づけること
を含むことを特徴とする方法。
【請求項33】
前記方法は、前記ヘリカーゼ又は構築体、及び標的ポリヌクレオチドと接触するポアにまたがって電位差を印加する工程をさらに含み、好ましくは、前記ポアが、生物学的ポア、固体状ポア、又は生物学的ポアと固体状ポアのハイブリッドポアから選択されることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記標的ポリヌクレオチドが、一本鎖、二本鎖、又は少なくとも一部が二本鎖であることを特徴とする請求項３２又は３３に記載の方法。
【請求項35】
前記一つ又は複数の特徴は、標的ポリヌクレオチドの由来、長さ、同一性、配列、二次構造、又は標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否かから選択され、好ましくは、前記一つ又は複数の特徴は、電気的測定及び／又は光学的測定によって行われることを特徴とする請求項３２乃至３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
標的ポリヌクレオチドを特徴づける製品であって、請求項１乃至２５のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ、請求項２６又は２７に記載の構築体、請求項２８に記載の核酸、請求項２９に記載の発現ベクター、又は請求項３０に記載の宿主細胞、及び、
ポア
を含むことを特徴とする製品。
【請求項37】
前記製品は、キット、装置、又はセンサから選択されることを特徴とする請求項３６に記載の製品。
【請求項38】
標的ポリヌクレオチドの特徴づけ又はポアを通過する標的ポリヌクレオチドの移動に対する制御における、請求項１乃至２５のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ、請求項２６又は２７に記載の構築体、請求項２８に記載の核酸、請求項２９に記載の発現ベクター、請求項３０に記載の宿主細胞、又は請求項３６又は３７に記載の製品の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、遺伝子シークエンシング、分子検出及び臨床検出の技術分野に関し、具体的に修飾されたＰｉｆ１様ヘリカーゼ（Ｐｉｆ１－ｌｉｋｅ Ｈｅｌｉｃａｓｅｓ）、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼを含む構築体、及びそれの標的ポリヌクレオチドの特徴づけ又はポアを通過する標的ポリヌクレオチドの移動に対する制御における使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ナノポアシークエンシング技術とは、単一核酸分子を測定ユニットとし、ナノポアを利用してその配列情報をリアルタイムに連続的に読み取る遺伝子シークエンシング技術を指す。
【0003】
ナノポアシークエンシング技術は、イオン電流にチャネルを提供できるナノポアを利用する。電気泳動は、ポリヌクレオチドがナノポアを通過するように駆動し、ポリヌクレオチドがナノポアを通過するため、ナノポアを通過する電流を低減することができる。通過する各ヌクレオチド又は一連のヌクレオチドによって特徴電流が取得され、電流レベルの記録はポリヌクレオチド配列に対応する。「ストランドシークエンシング（ｓｔｒａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」方法（例えば、ヘリカーゼを使用してポアを通過するポリヌクレオチドの移動を制御する）において、単一ポリヌクレオチド鎖が前記ポアを通過して、ヌクレオチドの同定を可能にする。このようなシークエンシング技術の利点とは、ライブラリの構築が簡単で、増幅する必要がないこと、読み取り速度が速く、単一分子で一時間当たり数万塩基の読み取り速度に達することができること、読み取り長さが非常に長く、通常数千塩基であること、ＲＮＡ及びＤＮＡのメチル化を直接測定することが可能であることである。これらは、従来の第２世代シークエンシング技術の範囲を超えている。
【0004】
しかしながら、ナノポアシークエンシング技術にも解決する必要のある難題がある。例えば、ポリヌクレオチドは、ナノポアを介した転座が速すぎ、単一ヌクレオチドの電流レベルが短すぎて区別しにくい。特に、ヌクレオチド配列が非常に長い場合、例えば５００個以上であり、ポリヌクレオチドの移動を制御する分子モーターがポリヌクレオチドから離脱する可能性がある。これにより、ポリヌクレオチドを迅速に、制御されていない方法で、印加されたフィールドの方向に前記ポアを通して引っ張ることができる。
【0005】
従来技術において、この問題を解決するために、例えば、国際公開第２０１３／０５７４９５Ａ３号には、標的ポリヌクレオチドを特徴づける新たな方法が開示されており、前記方法は、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ又は分子モーターによってポアを通過するポリヌクレオチドの移動を制御することを含む。米国特許出願公開第２０１５／００６５３５４号明細書には、ＸＰＤヘリカーゼを用いて標的ポリヌクレオチドを特徴づける方法が開示され、前記方法は、ＸＰＤヘリカーゼによってポアを通過するポリヌクレオチドの移動を制御することを含む。中国特許出願公開第１０７１０９３８０号明細書には、修飾された酵素が開示され、当該酵素は、ポアを通過する標的ポリヌクレオチドの移動を制御できる修飾されたＤｄａヘリカーゼである。上記方法は、いずれもある程度でポアを通過する標的ポリヌクレオチドの移動を制御することができる。しかしながら、依然としてポアを通過する標的ポリヌクレオチドの移動を制御する新たなヘリカーゼを開発し、従来技術には本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼが開示されていない。
【発明の概要】
【0006】
本発明は、ナノポアを通過するポリヌクレオチドの速すぎる転座の問題を解決するために、新たな修飾されたＰｉｆ１様ヘリカーゼを提供し、修飾されたＰｉｆ１様ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドとの結合をより長い時間で保持することができ、ポアを通過するポリヌクレオチドの移動を制御することができる。本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼは、ストランドシークエンシングプロセスにおいてポリヌクレオチドの移動を制御する有用なツールであり、制御可能且つ段階的な方式で、印加電圧によって引き起こされる電界に沿って又はそれに逆らって、ポリヌクレオチドを移動させ、これによりナノポアを通過するポリヌクレオチドの速度を制御し、識別可能な電流レベルを取得することができる。特に、ポリヌクレオチド鎖の長さが増加する場合、例えば、５００個以上のヌクレオチドである場合、プロセシビティを向上させる分子モーターを有する必要があると、本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼは依然としてポリヌクレオチドから離脱しない、即ち、５００、１０００、５０００、１００００、２００００、５００００、１０００００又はより多くのポリヌクレオチドの移動の制御に対して特に効果的である。本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼは、ストランドシークエンシング領域においてポリヌクレオチドのポアからの滑らかな移動を制御し、摺動移動又は不規則な移動を減少させ、これにより、ヌクレオチドのより正確な読み取り及びより長い読み取り長さを促進することができる。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】Ｐｉｆ１様ヘリカーゼ活性を試験する蛍光分析概略図である。ここで、蛍光基質鎖は、５’端のｓｓＤＮＡ突出部分、及び５０塩基をハイブリダイズしたｄｓＤＮＡ部分を有する。ａ）に示すように、主鎖の上部（Ｂ）が３’端にブラックホールクェンチャー（ＢＨＱ－１）塩基（Ｅ）を有し、ハイブリダイズした相補鎖（Ｄ）が５’端にカルボキシフルオレセイン（Ｃ）を有することが含まれる。さらに、蛍光基質の短鎖（Ｄ）と相補的な０．５μＭの捕捉鎖（Ｆ）を含む。ｂ）に示すように、ＡＴＰ（５ｍＭ）及びＭｇＣｌ２（５ｍＭ）の存在下で、前記基質に添加されたヘリカーゼ（２００ｎＭ）が前記蛍光基質の５’端部分に連結され、前記主鎖に沿って移動し、且つ前記相補鎖を巻き戻した後、過剰の捕捉鎖が優先的に相補鎖ＤＮＡにアニーリングして初期基質と損失蛍光との再アニーリングを防止する。ｃ）に示すように、主鎖と完全に相補的な捕捉鎖（Ａ）を過剰に添加した後、巻き戻されない一部のｄｓＤＮＡは過剰のＡの存在により鎖の巻き戻し効果を有し、最終的に全てのｄｓＤＮＡが巻き戻され、蛍光値が最も高くなる。
【図2】蛍光分析によるＰｉｆ１様ヘリカーゼのハイブリダイズしたｄｓＤＮＡ巻き戻し能力の測定を示し、具体的には、４００ｍＭ ＮａＣｌを含有する緩衝液中での時間依存性のｄｓＤＮＡ巻き戻し比の変化図を示す。
【図3】異なるＰｉｆ１様ヘリカーゼのＤＮＡ結合能力のゲル測定結果を示す。レーン１は、予め構築されたｄｓＤＮＡ（配列番号１８と５’ＦＡＭで修飾された配列番号１９のハイブリダイゼーション）である。レーン２～６は、それぞれ、ｄｓＤＮＡに予め連結されたＡｐｈ Ａｃｊ６１、Ａｐｈ ＰＸ２９、Ｓｐｈ ＣＢＨ８、ＰｐｈＰｓｐＹＺＵ０５及びＭｐｈ ＭＰ１を含む。レーン７～１１は、それぞれ、ｄｓＤＮＡに予め連結されたＡｐｈ Ａｃｊ６１－Ｄ９７Ｃ／Ａ３６３Ｃ、Ａｐｈ ＰＸ２９－Ｄ９６Ｃ／Ａ３７１Ｃ、Ｓｐｈ ＣＢＨ８－Ａ９４Ｃ／Ａ３６１Ｃ／Ｃ１３６Ａ、ＰｐｈＰｓｐＹＺＵ０５－Ｄ１０４Ｃ／Ａ３７５Ｃ／Ｃ１４６Ａ及びＭｐｈ ＭＰ１－Ｅ１０５Ｃ／Ａ３６２Ｃを含む。バンドＡは、配列番号１８とハイブリダイズする配列番号１９に対応する。１Ａ、２Ａ、３Ａ、４Ａ、５Ａと標識された領域は、それぞれ、１、２、３、４、５個のヘリカーゼと、配列番号１８とハイブリダイズする配列番号１９との結合に対応する。
【図4】実施例で使用されるＤＮＡ構築体の図であり、ここで、配列番号１３（Ｂと標識される）は、その５’末端が２０個のｉＳｐＣ３スペーサーに連結され（Ａと標識される）、その３’末端が４つのｉＳｐＣ３スペーサーに連結され（Ｃと標識される）、当該スペーサー（Ｃと標識される）は、配列番号１４（Ｄと標識される）の５’末端に連結され、当該配列番号１４（Ｄと標識される）の３’末端が配列番号１７又は配列番号２４（Ｅと標識される）に連結され、当該構築体の配列番号１５（Ｆと標識される）領域が配列番号１６（Ｇと標識され、３’コレステロールテザーを有する）とハイブリダイズする。
【図5】Ｐｉｆ１様ヘリカーゼ（Ｍｐｈ ＭＰ１－Ｅ１０５Ｃ／Ａ３６２Ｃ（変異Ｅ１０５Ｃ／Ａ３６２Ｃを有する配列番号１１））がナノポア８ＭｓｐＡ（配列番号１２）を通過するＤＮＡ構築体Ａの転座を制御する場合の例示的な電流の軌跡（ｙ軸座標＝電流（ｐＡ、０～２５０）、ｘ軸座標＝サンプリング周波数（ｈｚ、０～３．５＊１０５））を示す。
【図6】図５の電流軌跡図に示すＰｉｆ１様ヘリカーゼにより制御されるＤＮＡ移動の領域拡大図（ｙ軸座標＝電流（ｐＡ、３０～１００）、ｘ軸座標＝サンプリング周波数（ｈｚ、２．３４６～２．３６６＊１０５））を示す。
【図7】Ｐｉｆ１様ヘリカーゼ（Ｓｐｈ ＣＢＨ８－Ａ９４Ｃ／Ａ３６１Ｃ／Ｃ１３６Ａ（Ａ９４Ｃ／Ａ３６１Ｃ／Ｃ１３６Ａ変異を有する配列番号５）がＭｓｐＡナノポアを通過するＤＮＡ構築体Ｂの転座を制御する場合の例示的な電流の軌跡（ｙ軸座標＝電流（ｐＡ）、ｘ軸座標＝時間（ｓ））を示す。
【図8】ヘリカーゼ（ＥｐＨ Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１４１Ａ（Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１４１Ａ変異を有する配列番号６））がＭｓｐＡナノポアを通過するＤＮＡ構築体Ｂの転座を制御する場合の例示的な電流軌跡（ｙ軸座標＝電流（ｐＡ）、ｘ軸座標＝時間（ｓ））を示す。
【図9】ヘリカーゼ（Ｐｐｈ ＰｓｐＹＺＵ０５－Ｄ１０４Ｃ／Ａ３７５Ｃ／Ｃ１４６Ａ（Ｄ１０４Ｃ／Ａ３７５Ｃ及びＣ１４６Ａ変異を有する配列番号８））がＭｓｐＡナノポアを通過するＤＮＡ構築体Ｂの転座を制御する場合の例示的な電流の軌跡（ｙ軸座標＝電流（ｐＡ）、ｘ軸座標＝時間（ｓ））を示す。
【図10】精製されたＭｐｈ ＭＰ１（配列番号１１）ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動図を示す。ここで、Ｍは、マーカー（Ｋｄ）であり、レーン１は、Ｍｐｈ ＭＰ１ヘリカーゼの電気泳動結果図である。
【図11A】配列番号１～１１のアミノ酸配列の対応関係を示す。
【図11B】配列番号１～１１のアミノ酸配列の対応関係を示す。
【発明を実施するための形態】
【0008】
本発明の第１態様は、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼを提供し、それは、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼのタワードメイン、ピンドメイン及び／又は１Ａドメイン（ＲｅｃＡ型モータ）へ導入された少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸を含み、前記ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を保持している。
【0009】
好ましくは、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、下記からなる群から選択される任意のものに導入されている。
（ａ）タワードメイン、
（ｂ）ピンドメイン、
（ｃ）１Ａドメイン、
（ｄ）タワードメイン及びピンドメイン、
（ｅ）タワードメイン及び１Ａドメイン。
（ｆ）１Ａドメイン及びピンドメイン、
（ｇ）タワードメイン、ピンドメイン及び１Ａドメイン。
（ａ）タワードメイン、
（ｂ）ピンドメイン、
（ｃ）１Ａドメイン、
（ｄ）タワードメイン及びピンドメイン、
（ｅ）タワードメイン及び１Ａドメイン。
（ｆ）１Ａドメイン及びピンドメイン、
（ｇ）タワードメイン、ピンドメイン及び１Ａドメイン。
【0010】
好ましくは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又はより多くのシステイン残基、若しくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又はより多くの非天然アミノ酸、若しくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又はより多くのシステイン残基及び非天然アミノ酸が、タワードメイン、ピン構造及び／又は１Ａドメインに導入され得る。
【0011】
好ましくは、システイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が導入された後、当該Ｐｉｆ１様ヘリカーゼとポリヌクレオチドの結合がより安定し、その移動を制御する能力が向上される。
【0012】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、Ｐｂａ－ＰＭ２、Ａｐｈ－Ａｃｊ６１、Ａｐｈ－ＰＸ２９、Ａｖｉ－Ａｅｈ１、Ｓｐｈ－ＣＢＨ８、Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６、Ａｐｈ－ＡＭ１０１、ＰｐｈＰｓｐＹＺＵ０５、Ｅｐｈ－ＥｃＳ１、Ｅｐｈ－Ｃｒｏｎｕｓ２、又はＭｐｈ－ＭＰ１から選択される。具体的に、野生型Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、表１に示す通りである。
【0013】
【表1】
【0014】
前記Ｐｉｆ１－ｌｉｋｅヘリカーゼのタワードメイン、ピンドメイン、フックドメイン、１Ａドメイン及び２Ａドメインのアミノ酸残基の位置は、表２に示す通りである。
【0015】
【表2-1】
【0016】
【表2-2】
【0017】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、Ｍｐｈ－ＭＰ１、Ｓｐｈ－ＣＢＨ８、Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６又はＰｐｈＰｓｐＹＺＵ０５から選択される。
【0018】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号１１のバリアントを含み、ここで、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメイン（残基 Ｅ２６４－Ｐ２７８及びＮ２９６－Ｐ３８９）及び／又はピンドメイン（残基 Ｋ９７－Ａ１１３）及び／又は１Ａドメイン（残基 Ｍ１－Ｌ９６及びＰ１１４－Ｋ１８４）に導入されている。
【0019】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号１のバリアントを含み、ここで、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメイン（残基 Ｅ２６４－Ｐ２７８及びＮ２９６－Ａ３９４）及び／又はピンドメイン（残基 Ｋ８９－Ｅ１０５）及び／又は１Ａドメイン（残基 Ｍ１－Ｌ８８及びＭ１０６－Ｖ１８１）に導入されている。
【0020】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号２のバリアントを含み、ここで、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメイン（残基 Ｅ２６５－Ｐ２７９及びＮ２９７－Ａ３９２）及び／又はピンドメイン（残基 Ｋ８９－Ｄ１０５）及び／又は１Ａドメイン（残基 Ｍ１－Ｌ８８及びＩ１０６－Ｍ１８０）に導入されている。
【0021】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号３のバリアントを含み、ここで、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメイン（残基 Ｔ２６６－Ｐ２８０及びＮ２９８－Ｓ４０３）及び／又はピンドメイン（残基 Ｋ８９－Ａ１０９）及び／又は１Ａドメイン（残基 Ｍ１－Ｌ８８及びＫ１１０－Ｖ１８２）に導入されている。
【0022】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号４のバリアントを含み、ここで、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメイン（残基 Ｔ２６６－Ｐ２８０及びＮ２９８－Ｓ４０４）及び／又はピンドメイン（残基 Ｋ８９－Ａ１０９）及び／又は１Ａドメイン（残基 Ｍ１－Ｌ８８及びＫ１１０－Ｖ１８２）に導入されている。
【0023】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号５のバリアントを含み、ここで、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメイン（残基 Ｅ２６０－Ｐ２７４及びＮ２９２－Ａ３９１）及び／又はピンドメイン（残基 Ｋ８６－Ｅ１０２）及び／又は１Ａドメイン（残基 Ｍ１－Ｌ８４及びＭ１０３－Ｋ１７７）に導入されている。
【0024】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号６のバリアントを含み、ここで、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメイン（残基 Ｅ２６６－Ｐ２８０及びＮ２９８－Ａ３９６）及び／又はピンドメイン（残基 Ｋ９１－Ｅ１０７）及び／又は１Ａドメイン（残基 Ｍ１－Ｌ９０及びＭ１０８－Ｍ１８３）に導入されている。
【0025】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号７のバリアントを含み、ここで、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメイン（残基 Ｔ２７６－Ｐ２９０及びＮ３０８－Ｐ４０２）及び／又はピンドメイン（残基 Ｋ１００－Ｄ１１６）及び／又は１Ａドメイン（残基 Ｍ１－Ｌ９９及びＤ１１７－Ｍ１９１）に導入されている。
【0026】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号８のバリアントを含み、ここで、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメイン（残基 Ｄ２７４－Ｐ２８８及びＮ３０６－Ａ４０４）及び／又はピンドメイン（残基 Ｋ９５－Ｅ１１２）及び／又は１Ａドメイン（残基 Ｍ１－Ｌ９５及びＩ１１３－Ｋ１８７）に導入されている。
【0027】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号９のバリアントを含み、ここで、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメイン（残基 Ｅ２６０－Ｐ２７４及びＮ２９２－Ａ３９１）及び／又はピンドメイン（残基 Ｋ８６－Ｅ１０２）及び／又は１Ａドメイン（残基 Ｍ１－Ｌ８５及びＭ１０３－Ｋ１７７）に導入されている。
【0028】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号１０のバリアントを含み、ここで、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメイン（残基 Ｅ２６５－Ｐ２７９及びＨ２９７－Ａ３９３）及び／又はピンドメイン（残基 Ｋ８８－Ｅ１０４）及び／又は１Ａドメイン（残基 Ｍ１－Ｌ８７及びＩ１０５－Ｋ１８０）に導入されている。
【0029】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号１１のバリアントを含み、それは、（ｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、（ｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＫ３６０Ｃ、（ｉｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、（ｉｖ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＱ３６３Ｃ、（ｖ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＫ３６６Ｃ、（ｖｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＭ３５６Ｃ、（ｖｉｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＫ３６０Ｃ、（ｖｉｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＭ３５６Ｃ、（ｉｘ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＱ３６３Ｃ、（ｘ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＫ３６６Ｃ、（ｘｉ）Ｆ１０８Ｃ及び／又はＭ３５６Ｃ、（ｘｉｉ）Ｆ１０８Ｃ及び／又はＫ３６０Ｃ、（ｘｉｉｉ）Ｆ１０８Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、（ｘｉｖ）Ｆ１０８Ｃ及び／又はＱ３６３Ｃ、（ｘｖ）Ｆ１０８Ｃ及び／又はＫ３６６Ｃ、（ｘｖｉ）Ｋ１３４Ｃ及び／又はＭ３５６Ｃ、（ｘｖｉｉ）Ｋ１３４Ｃ及び／又はＫ３６０Ｃ、（ｘｖｉｉｉ）Ｋ１３４Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、（ｘｉｘ）Ｋ１３４Ｃ及び／又はＱ３６３Ｃ、（ｘｘ）Ｋ１３４Ｃ及び／又はＫ３６６Ｃ、（ｘｘｉ）（ｉ）～（ｘｘ）のいずれか一つ及びＧ３５９Ｃ、（ｘｘｉｉ）（ｉ）～（ｘｘ）のいずれか一つ及びＱ１１１Ｃ、（ｘｘｉｉｉ）（ｉ）～（ｘｘ）のいずれか一つ及びＩ１３８Ｃ、（ｘｘｉｖ）（ｉ）～（ｘｘ）のいずれか一つ及びＱ１１１Ｃ及びＩ１３８Ｃ、（ｘｘｖ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＦ３７７Ｃ、（ｘｘｖｉ）Ｙ１０３Ｌ、Ｅ１０５Ｙ、Ｎ３５２Ｎ、Ａ３６２Ｃ及びＹ３６５Ｎ、（ｘｘｖｉｉ）Ｅ１０５Ｙ及びＡ３６２Ｃ、（ｘｘｖｉｉｉ）Ａ３６２Ｃ、（ｘｘｉｘ）Ｙ１０３Ｌ、Ｅ１０５Ｃ、Ｎ３５２Ｎ、Ａ３６２Ｙ及びＹ３６５Ｎ、（ｘｘｘ）Ｙ１０３Ｌ、Ｅ１０５Ｃ及びＡ３６２Ｙ、（ｘｘｘｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、及びＩ２８０Ａ、（ｘｘｘｉｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＬ３５８Ｃ、（ｘｘｘｉｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＧ３５９Ｃ、（ｘｘｘｉｖ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、（ｘｘｘｖ）Ｋ１０６Ｃ及び／又はＷ３７８Ｃ、（ｘｘｘｖｉ）Ｔ１０２Ｃ及び／又はＮ３８２Ｃ、（ｘｘｘｖｉｉ）Ｔ１０２Ｃ及び／又はＷ３７８Ｃ、（ｘｘｘｖｉｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＹ３５５Ｃ、（ｘｘｘｉｘ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＮ３８２Ｃ、（ｘｌ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＫ３８１Ｃ、（ｘｌｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＫ３７９Ｃ、（ｘｌｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＤ３７６Ｃ、（ｘｌｉｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＷ３７８Ｃ、（ｘｌｉｖ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＷ３７４Ｃ、（ｘｌｖ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＹ３５５Ｃ、（ｘｌｖｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＮ３８２Ｃ、（ｘｌｖｉｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＫ３８１Ｃ、（ｘｌｖｉｉｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＫ３７９Ｃ、（ｘｌｉｘ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＤ３７６Ｃ、（ｌ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＷ３７８Ｃ、（ｌｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＷ３７４Ｃ、（ｌｉｉ）Ｅ１０５Ｃ及びＡ３６２Ｙ、（ｌｉｉｉ）Ｅ１０５Ｃ、Ｇ３５９及びＡ３６２Ｃ、又は（ｌｉｖ）Ｉ２Ｃ、Ｅ１０５Ｃ及びＡ３６２Ｃを含む。
【0030】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号１～１０のいずれか一つのバリアントを含み、それは、配列番号１１の（ｉ）～（ｌｉｖ）のいずれか一つで定義される位置に対応する位置にシステイン残基を含む。
【0031】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼのアミノ酸配列は、配列番号１～１１に示されるアミノ酸配列であるか、又は、配列番号１～１１に示されるアミノ酸配列と少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．９％の相同性を有し、且つ、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する。
【0032】
本発明の一つの具体的な実施形態において、システイン残基は、前記配列番号１１の第１０５位及び／又は第３６２位に対応するアミノ酸、例えば、配列番号２の第９７位及び／又は第３６３位、配列番号３の第９６位及び／又は第３７１位、配列番号５の第９４位及び／又は第３６１位、配列番号６の第９９位及び／又は第３６６位、配列番号８の第１０４位及び／又は第３７５位などに導入されている。
【0033】
本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼとポリヌクレオチドの結合の安定性を向上させ、ポリヌクレオチドからの離脱の能力を低下させるために、導入されたシステイン同士を互いに連結させる、導入された非天然アミノ酸同士を互いに連結させる、導入されたシステインと非天然アミノ酸とを互いに連結させる、導入されたシステインとヘリカーゼ上の天然アミノ酸とを互いに連結させる、又は導入された非天然アミノ酸とヘリカーゼ上の天然アミノ酸とを互いに連結させる。
【0034】
任意の数及び組み合わせの二つ以上の導入されたシステイン及び／又は非天然アミノ酸を互いに連結させることができる。例えば、３、４、５、６、７、８又はより多くのシステイン及び／又は非天然アミノ酸を互いに連結させることができる。一つ又は複数のシステインは、一つ又は複数のシステインに連結されてもよい。一つ又は複数のシステインは、一つ又は複数の非天然アミノ酸（例えば、Ｆａｚ）に連結されてもよい。一つ又は複数の非天然アミノ酸（例えば、Ｆａｚ）は、一つ又は複数の非天然アミノ酸（例えば、Ｆａｚ）に連結されてもよい。一つ又は複数のシステインは、一つ又は複数のヘリカーゼ上の天然アミノ酸に連結されてもよい。一つ又は複数の非天然アミノ酸（例えば、Ｆａｚ）は、一つ又は複数のヘリカーゼ上の天然アミノ酸に連結されてもよい。
【0035】
ここで、前記連結はいかなる方式であってもよく、直接連結又は間接連結を含む。好ましくは、前記連結は、一時的な接触であってもよく、永久連結であってもよい。さらに好ましくは、前記連結は、非共有連結又は共有連結であってもよい。
【0036】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記共有連結は、化学的架橋剤、線状分子又は触媒を用いて実現することができる。前記化学的架橋剤は、マレイミド、活性エステル、コハク酸イミド、アジド、アルキン（例えば、ジベンゾシクロオクチンオール（ＤＩＢＯ又はＤＢＣＯ）、ジフルオロシクロアルキン及び線状アルキン）などを含むが、これらに限定されない。化学的架橋剤の長さは一つの炭素（ホスゲンタイプのリンカー）から数オングストロームまで変化できる。前記線状分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧｓ）、ポリペプチド、多糖、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、飽和及び不飽和の炭化水素、ポリアミドを含むが、これらに限定されない。前記触媒は、任意のシステイン残基間、非天然アミノ酸間、システイン残基と非天然アミノ酸の間、非天然アミノ酸と天然アミノ酸の間、又はシステイン残基と天然アミノ酸との間に共有結合を生成させるＴＭＡＤなどのような触媒を含むが、これらに限定されない。
【0037】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、一つ又は複数のシステイン残基の除去によってさらに修飾される。
【0038】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、少なくとも一つ又は複数の天然システインの置換をさらに含む。さらに好ましくは、アラニン、セリン又はバリンによるシステインの置換をさらに含むる。
【0039】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号５のバリアントを含み、前記一つ又は複数の置換された天然システイン残基は、Ｃ１０９、Ｃ１１４、Ｃ１３６又はＣ４１４のうちの一つ又は複数である。
【0040】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号１、２、３、４、６、７、８、９、１０及び１１のいずれか一つのバリアントを含み、前記一つ又は複数の置換された天然システイン残基は、配列番号５のＣ１０９、Ｃ１１４、Ｃ１３６又はＣ４１４のうちの一つ又は複数に対応する。
【0041】
表３は、配列番号５のＣ１０９、Ｃ１１４、Ｃ１３６及びＣ４１４に対応する配列番号１、２、３、４、６、７、８、９、１０及び１１のアミノ酸の位置を示す。
【0042】
【表3】
【0043】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、さらに、その表面の負電荷を低減するように修飾される。
【0044】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、正味の正電荷を増加させる置換をさらに含む。さらに好ましくは、前記正味の正電荷を増加させる置換は、表面に負に帯電したアミノ酸、極性又は非極性のアミノ酸を置換するか又は修飾することを含み、又は正に帯電したアミノ酸を表面に負に帯電したアミノ酸、極性又は非極性のアミノ酸の近くの位置に導入することを含む。さらに好ましくは、前記正味の正電荷を増加させる置換は、正に帯電したアミノ酸による負に帯電したアミノ酸、非荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸、極性又は非極性のアミノ酸の置換を含む。さらに好ましくは、前記正味の正電荷を増加させる置換は、非荷電アミノ酸による負に帯電したアミノ酸、芳香族アミノ酸、極性又は非極性のアミノ酸の置換を含む。適切な正に帯電したアミノ酸は、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）及び／又はアルギニン（Ｒ）を含むが、これらに限定されない。適切な非荷電アミノ酸は、正味電荷を有さない。適切な非荷電アミノ酸は、システイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）又はグルタミン（Ｑ）を含むが、これらに限定されない。非極性アミノ酸は、非極性側鎖を有する。非極性アミノ酸は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、プロリン（Ｐ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）又はバリン（Ｖ）を含むが、これらに限定されない。芳香族アミノ酸は、芳香族側鎖を有する。適切な芳香族アミノ酸は、ヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）又はチロシン（Ｙ）を含むが、これらに限定されない。
【0045】
ここで、前記正に帯電したアミノ酸、非荷電アミノ酸、極性アミノ酸、非極性アミノ酸又は芳香族アミノ酸は、天然又は非天然のアミノ酸であってもよく、人工的に合成又は修飾された天然アミノ酸であってもよい。
【0046】
好ましい置換は、アルギニン（Ｒ）によるグルタミン酸（Ｅ）の置換と、リジン（Ｋ）によるグルタミン酸（Ｅ）の置換、アスパラギン（Ｎ）によるグルタミン酸（Ｅ）の置換、リジン（Ｋ）によるアスパラギン酸（Ｄ）の置換、及びアルギニン（Ｒ）によるアスパラギン酸（Ｄ）の置換を含むが、これらに限定されない。
【0047】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号１１のバリアントを含み、前記一つ又は複数の負に帯電したアミノ酸は、Ｄ５、Ｅ９、Ｅ２４、Ｅ８７、Ｉ６５、Ｓ５８、Ｄ２０９又はＤ２１６のうちの一つ又は複数である。これらのアミノ酸、例えばこれらのアミノ酸のうちの１、２、３、４、５、６、７又は８個を中和することができる。任意の組み合わせを中和することが可能である。
【0048】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号１～１０のいずれか一つのバリアントを含み、前記一つ又は複数の負に帯電したアミノ酸は、配列番号１１のＤ５、Ｅ９、Ｅ２４、Ｅ８７、Ｉ６５、Ｓ５８、Ｄ２０９又はＤ２１６のうちの一つ又は複数に対応する。配列番号１１のＤ５、Ｅ９、Ｅ２４、Ｅ８７、Ｉ６５、Ｓ５８、Ｄ２０９及びＤ２１６に対応する配列番号１～１０のアミノ酸は、図１１の比較を用いて確認することができる。
【0049】
好ましい置換は、配列番号１のバリアントをさらに含み、前記一つ又は複数の負に帯電したアミノ酸は、Ｓ１７１をさらに含む。
【0050】
好ましい置換は、配列番号９のバリアントをさらに含み、前記一つ又は複数の負に帯電したアミノ酸は、Ｓ１７３をさらに含む。
【0051】
好ましくは、前記非天然アミノ酸は、４－アジド－Ｌ－フェニルアラニン（Ｆａｚ）、４－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、３－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、４－アセトアセチル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｏ－アリル－Ｌ－チロシン、３－（フェニルセレニル）－Ｌ－アラニン、Ｏ－２－プロピン－１－イル－Ｌ－チロシン、４－（ジヒドロキシボリル）－Ｌ－フェニルアラニン、４－［（エチルスルファニル）カルボニル］－Ｌ－フェニルアラニン、（２Ｓ）－２－アミノ－３－｛４－［（プロパン－２－イルスルファニル）カルボニル］フェニル｝プロピオン酸、（２Ｓ）－２－アミノ－３－｛４－［（２－アミノ－３－スルファニルプロパノイル）アミノ］フェニル｝プロピオン酸、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、４－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、４－シアノ－Ｌ－フェニルアラニン、３－シアノ－Ｌ－フェニルアラニン、４－フルオロ－Ｌ－フェニルアラニン、４－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、４－ブロモ－Ｌ－フェニルアラニン、Ｏ－（トリフルオロメチル）チロシン、４－ニトロ－Ｌ－フェニルアラニン、３－ヒドロキシ－Ｌ－チロシン、３－アミノ－Ｌ－チロシン、３－ヨード－Ｌ－チロシン、４－イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、３－（２－ナフチル）－Ｌ－アラニン、４－フェニル－Ｌ－フェニルアラニン、（２Ｓ）－２－アミノ－３－（ナフタレン－２－イルアミノ）プロピオン酸、６－（メチルスルファニル）ノルロイシン、６－オキシ－Ｌ－リジン、Ｄ－チロシン、（２Ｒ）－２－ヒドロキシ－３－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、（２Ｒ）－２－アミノオクタン酸エステル－３－（２，２’－ビピリジル－５－イル）－Ｄ－アラニン、２－アミノ－３－（８－ヒドロキシ－３－キノリル）プロピオン酸、４－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｓ－（２－ニトロベンジル）システイン、（２Ｒ）－２－アミノ－３－［（２－ニトロベンジル）スルファニル］プロピオン酸、（２Ｓ）－２－アミノ－３－［（２－ニトロベンジル）オキシ］プロピオン酸、Ｏ－（４，５－ジメトキシ－２－ニトロベンジル）－Ｌ－セリン、（２Ｓ）－２－アミノ－６－（｛［（２－ニトロベンジル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｏ－（２－ニトロベンジル）－Ｌ－チロシン、２－ニトロフェニルアラニン、４－［（Ｅ）－フェニルジアゼニル］－Ｌ－フェニルアラニン、４－［３－（トリフルオロメチル）－３Ｈ－ジアジリジニル－３イル］－Ｄ－フェニルアラニン、２－アミノ－３－［［５－（ジメチルアミノ）－１－ナフチル］スルホニルアミノ］プロピオン酸、（２Ｓ）－２－アミノ４－（７－ヒドロキシ－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）ブタン酸、（２Ｓ）－３－［（６－アセチルナフタレン－２－イル）アミノ］－２－アミノプロピオン酸、４（カルボキシメチル）フェニルアラニン、３－ニトロ－Ｌ－チロシン、Ｏ－チオ－Ｌ－チロシン、（２Ｒ）－６－アセチルアミノ－２－アミノカプロン酸エステル、１－メチルヒスチジン、２－アミノノナン酸、２－アミノデカン酸、Ｌ－ホモシステイン、５－スルファニル－ノルバリン、６－スルファニル－Ｌ－ノルロイシン、５－（メチルスルファニル）－Ｌ－ノルバリン、Ｎ６－｛［（２Ｒ，３Ｒ）－３－メチル－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピロール－２－イル］カルボニル｝－Ｌ－リジン、Ｎ６－［（ベンジルオキシ）カルボニル］リジン、（２Ｓ）－２－アミノ－６－［（シクロペンチルカルボニル）アミノ］ヘキサン酸、Ｎ６－［（シクロペンチルオキシ）カルボニル］－Ｌ－リジン、（２Ｓ）－２－アミノ－６－｛［（２Ｒ）－テトラヒドロフラン－２－イルカルボニル］アミノ｝ヘキサン酸、（２Ｓ）－２－アミノ－８－［（２Ｒ、３Ｓ）－３－エチニルテトラヒドロフラン－２－イル］－８－オキシオクタン酸、Ｎ６－（ｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－リジン、（２Ｓ）－２－ヒドロキシ－６－（｛［（２－メチル－２－プロパンイル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｎ６－［（アリルオキシ）カルボニル］リジン、（２Ｓ）－２－アミノ－６－（｛［（２－アジドベンジル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｎ６－Ｌ－プロピル－Ｌ－リジン、（２Ｓ）－２－アミノ－６－｛［（プロプ－２－イン－１－イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸又はＮ６－［（２－アジドエトキシ）カルボニル］－Ｌ－リジンから選択される。
【0052】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、
（ａ）一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）又は二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）内の一つ又は複数のヌクレオチドと相互作用する少なくとも一つのアミノ酸の置換、及び／又は、
（ｂ）膜貫通ポアと相互作用する少なくとも一つのアミノ酸の置換、をさらに含み、
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する。
（ａ）一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）又は二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）内の一つ又は複数のヌクレオチドと相互作用する少なくとも一つのアミノ酸の置換、及び／又は、
（ｂ）膜貫通ポアと相互作用する少なくとも一つのアミノ酸の置換、をさらに含み、
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する。
【0053】
さらに好ましくは、（ａ）において、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの糖及び／又は塩基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸は、より大きな側鎖（Ｒ基）を含むアミノ酸で置換される。
【0054】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの糖及び／又は塩基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸の、より大きな側鎖（Ｒ基）を含むアミノ酸による置換を含む。任意の数のアミノ酸、例えば、１個又はその以上、２個又はその以上、３個又はその以上、４個又はその以上、５個又はその以上、又は６個又はその以上のアミノ酸を置換することができる。各アミノ酸は、塩基、糖、又は塩基及び糖と相互作用することができる。タンパク質モデリングを使用して、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの糖及び／又は塩基と相互作用するアミノ酸を同定することができる。
【0055】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号１１のバリアントを含み、ここで、前記一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの糖及び／又は塩基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸は、Ｐ７３、Ｈ９３、Ｎ９９、Ｆ１０９、Ｉ２８０、Ａ１６１、Ｆ１３０、Ｄ１３２、Ｄ１６２、Ｄ１６３、Ｅ２７７、Ｋ４１５、Ｑ２９１、Ｈ３９６、Ｙ２４４又はＰ１００のうちの少なくとも一つである。これらの番号は、配列番号１１の関連位置に対応し、配列番号１１に比べて、一つ又は複数のアミノ酸がバリアントに挿入又は欠失された場合に変更する必要がある場合がある。上記のように、当業者は、バリアントの相応位置を確認することができる。さらに好ましくは、配列番号１１のバリアントを含み、ここで、前記一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの糖及び／又は塩基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸は、Ｆ１０９及び一つ又は複数のＰ７３、Ｈ９３、Ｎ９９、Ｆ１０９、Ｉ２８０、Ａ１６１、Ｆ１３０、Ｄ１３２、Ｄ１６２、Ｄ１６３、Ｅ２７７、Ｋ４１５、Ｑ２９１、Ｈ３９６、Ｙ２４４又はＰ１００である。
【0056】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号１～１０のいずれか一つのバリアントであり、ここで、前記一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの糖及び／又は塩基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸は、配列番号１１のＰ７３、Ｈ９３、Ｎ９９、Ｆ１０９、Ｉ２８０、Ａ１６１、Ｆ１３０、Ｄ１３２、Ｄ１６２、Ｄ１６３、Ｅ２７７、Ｋ４１５、Ｑ２９１、Ｈ３９６、Ｙ２４４又はＰ１００に対応する少なくとも一つのアミノ酸である。さらに好ましくは、配列番号１～１０のいずれか一つのバリアントを含み、ここで、前記一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの糖及び／又は塩基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸は、配列番号１１のＦ１０９に対応するアミノ酸、及び配列番号１１のＰ７３、Ｈ９３、Ｎ９９、Ｆ１０９、Ｉ２８０、Ａ１６１、Ｆ１３０、Ｄ１３２、Ｄ１６２、Ｄ１６３、Ｅ２７７、Ｋ４１５、Ｑ２９１、Ｈ３９６、Ｙ２４４又はＰ１００に対応する一つ又は複数のアミノ酸である。
【0057】
表４には、配列番号１１のＰ７３、Ｈ９３、Ｎ９９、Ｆ１０９、Ｉ２８０、Ａ１６１、Ｆ１３０、Ｄ１３２、Ｄ１６２、Ｄ１６３、Ｅ２７７、Ｋ４１５、Ｑ２９１、Ｈ３９６、Ｙ２４４、及びＰ１００に対応する配列番号１～１０のアミノ酸が示されている。
【0058】
【表4】
【0059】
より大きな側鎖（Ｒ基）は、好ましくは、（ａ）増加した数の炭素原子数を含む、（ｂ）増加した長さを有する、（ｃ）増加した分子体積を有する、及び／又は、（ｄ）増加したファンデルワールス体積を有する。より大きな側鎖（Ｒ基）は、好ましくは、「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」、「（ａ）及び（ｂ）」、「（ａ）及び（ｃ）」、「（ａ）及び（ｄ）」、「（ｂ）及び（ｃ）」、「（ｂ）及び（ｄ）」、「（ｃ）及び（ｄ）」、「（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）」、「（ａ）、（ｂ）及び（ｄ）」、「（ａ）、（ｃ）及び（ｄ）」、「（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）」、又は、「（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）」である。（ａ）から（ｄ）のそれぞれは、本技術分野の標準的な方法によって測定することができる。
【0060】
さらに好ましくは、前記より大きな側鎖（Ｒ基）は、前記少なくとも一つのアミノ酸と前記一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドとの間の（ｉ）静電相互作用、（ｉｉ）水素結合及び／又は（ｉｉｉ）カチオン-π（カチオン－ｐｉ）相互作用を増加させる。例えば、（ｉ）において、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）及びリジン（Ｋ）などの正に帯電したアミノ酸は、静電相互作用を増加させるＲ基を有する。例えば、（ｉｉ）において、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）及びヒスチジン（Ｈ）などのアミノ酸は、水素結合を増加させるＲ基を有する。例えば、（ｉｉｉ）において、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）又はヒスチジン（Ｈ）などの芳香族アミノ酸は、カチオン-π（カチオン－ｐｉ）相互作用を増加させるＲ基を有する。
【0061】
より大きな側鎖（Ｒ）を含むアミノ酸は、非天然アミノ酸であってもよい。前記非天然アミノ酸は、以下に検討されたもののいずれか一種であってもよい。
【0062】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記より大きな側鎖（Ｒ基）のアミノ酸は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、グリシン（Ｇ）、セレノシステイン（Ｕ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）ではない。
【0063】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、以下の置換の一つ又は複数を含む。
【0064】
Ａ）ヒスチジン（Ｈ）は、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）又はアスパラギン（Ｎ）、若しくは、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）で置換されることが好ましい。ヒスチジン（Ｈ）は、（ａ）Ｎ、Ｑ又はＷ、若しくは、（ｂ）Ｙ、Ｆ、Ｑ又はＫで置換されることがより好ましい。
【0065】
Ｂ）アスパラギン（Ｎ）は、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）又はヒスチジン（Ｈ）、若しくは、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）で置換されることが好ましい。アスパラギン（Ｎ）は、Ｒ、Ｈ、Ｗ又はＹで置換されることがより好ましい。
【0066】
Ｃ）プロリン（Ｐ）は、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）又はトリプトファン（Ｗ）、若しくは、（ｉｖ）ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）又はイソロイシン（Ｉ）で置換されることが好ましい。プロリン（Ｐ）は、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）又はトリプトファン（Ｗ）、若しくは、（ｉｖ）ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）又はイソロイシン（Ｉ）で置換されることがより好ましい。プロリン（Ｐ）は、（ａ）Ｆ、（ｂ）Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｔ又はＦ、若しくは、（ｃ）Ｗ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｉ、Ｌ又はＶで置換されることがより好ましい。
【0067】
Ｄ）バリン（Ｖ）は、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）、若しくは、（ｉｖ）イソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）で置換されることが好ましい。バリン（Ｖ）は、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）、若しくは、（ｉｖ）イソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）で置換されることがより好ましい。バリン（Ｖ）は、Ｉ若しくはＨ若しくはＩ、Ｌ、Ｎ、Ｗ又はＨで置換されることがより好ましい。
【0068】
Ｅ）フェニルアラニン（Ｆ）は、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）ヒスチジン（Ｈ）、又は（ｉｉｉ）チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）で置換されることが好ましい。フェニルアラニン（Ｆ）は、（ａ）Ｗ、（ｂ）Ｗ、Ｙ又はＨ、（ｃ）Ｗ、Ｒ又はＫ、若しくは、（ｄ）Ｋ、Ｈ、Ｗ又はＲで置換されることがより好ましい。
【0069】
Ｆ）グルタミン（Ｑ）は、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、若しくは、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）で置換されることが好ましい。
【0070】
Ｇ）アラニン（Ａ）は、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）、若しくは、（ｉｖ）イソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）で置換されることが好ましい。
【0071】
Ｈ）セリン（Ｓ）は、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）、若しくは、（ｉｖ）イソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）で置換されることが好ましい。セリン（Ｓ）は、Ｋ、Ｒ、Ｗ又はＦで置換されることが好ましい。
【0072】
Ｉ）リジン（Ｋ）は、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又は（ｉｉｉ）チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）で置換されることが好ましい。
【0073】
Ｊ）アルギニン（Ｒ）は、（ｉｉｉ）チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）で置換されることが好ましい。
【0074】
Ｋ）メチオニン（Ｍ）は、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）又はヒスチジン（Ｈ）、若しくは、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）で置換されることが好ましい。
【0075】
Ｌ）ロイシン（Ｌ）は、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）又はアスパラギン（Ｎ）、若しくは、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）で置換されることが好ましい。
【0076】
Ｍ）アスパラギン酸（Ｄ）は、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）又はヒスチジン（Ｈ）、若しくは、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）で置換されることが好ましい。アスパラギン酸（Ｄ）は、Ｈ、Ｙ、又はＫで置換されることがより好ましい。
【0077】
Ｎ）グルタミン酸（Ｅ）は、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）又はヒスチジン（Ｈ）、若しくは、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）で置換されることが好ましい。
【0078】
Ｏ）イソロイシン（Ｉ）は、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）、若しくは、（ｉｖ）ロイシン（Ｌ）で置換されることが好ましい。
【0079】
Ｐ）チロシン（Ｙ）は、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、若しくは、（ｉｉ）トリプトファン（Ｗ）で置換されることが好ましい。チロシン（Ｙ）は、Ｗ又はＲで置換されることがより好ましい。
【0080】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、より好ましくは、配列番号１１のバリアントを含み、それは、以下を含む。
Ｐ７３Ｌ、Ｐ７３Ｖ、Ｐ７３Ｉ、Ｐ７３Ｅ、Ｐ７３Ｔ、Ｐ７３Ｆ、Ｈ９３Ｎ、Ｈ９３Ｑ、Ｈ９３Ｗ、Ｎ９９Ｒ、Ｎ９９Ｈ、Ｎ９９Ｗ、Ｎ９９Ｙ、Ｐ１００Ｌ、Ｐ１００Ｖ、Ｐ１００Ｉ、Ｐ１００Ｅ、Ｐ１００Ｔ、Ｐ１００Ｆ、Ｆ１３０Ｗ、Ｆ１３０Ｙ、Ｆ１３０Ｈ、Ｄ１３２Ｈ、Ｄ１３２Ｙ、Ｄ１３２Ｋ、Ａ１６１Ｉ、Ａ１６１Ｌ、Ａ１６１Ｎ、Ａ１６１Ｗ、Ａ１６１Ｈ、Ｄ１６２Ｈ、Ｄ１６２Ｙ、Ｄ１６２Ｋ、Ｄ１６３Ｗ、Ｄ１６３Ｆ、Ｄ１６３Ｙ、Ｄ１６３Ｈ、Ｄ１６３Ｉ、Ｄ１６３Ｌ、Ｄ１６３Ｖ、Ｙ２４４Ｗ、Ｙ２４４Ｈ、Ｅ２７７Ｇ、Ｉ２８０Ｈ、Ｉ２８０Ｋ、Ｉ２８０Ｗ、Ｑ２９１Ｋ、Ｑ２９１Ｒ、Ｑ２９１Ｗ、Ｑ２９１Ｆ、Ｈ３９６Ｎ、Ｈ３９６Ｑ、Ｈ３９６Ｗ、Ｋ４１５Ｗ、Ｋ４１５Ｒ、Ｋ４１５Ｈ、Ｋ４１５Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｖ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｉ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｅ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｔ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｆ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ９３Ｎ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ９３Ｑ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ９３Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｒ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｖ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｉ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｅ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｔ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｆ、Ｆ１０９Ｗ／Ｆ１３０Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｆ１３０Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｆ１３０Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｉ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｎ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６２Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６２Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６２Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｆ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｉ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｖ、Ｆ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ２７７Ｇ、Ｆ１０９Ｗ／Ｉ２８０Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｉ２８０Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｉ２８０Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｑ２９１Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｑ２９１Ｒ、Ｆ１０９Ｗ／Ｑ２９１Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｑ２９１Ｆ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｎ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｑ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｋ４１５Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｋ４１５Ｒ、Ｆ１０９Ｗ／Ｋ４１５Ｈ、又はＦ１０９Ｗ／Ｋ４１５Ｙ。
Ｐ７３Ｌ、Ｐ７３Ｖ、Ｐ７３Ｉ、Ｐ７３Ｅ、Ｐ７３Ｔ、Ｐ７３Ｆ、Ｈ９３Ｎ、Ｈ９３Ｑ、Ｈ９３Ｗ、Ｎ９９Ｒ、Ｎ９９Ｈ、Ｎ９９Ｗ、Ｎ９９Ｙ、Ｐ１００Ｌ、Ｐ１００Ｖ、Ｐ１００Ｉ、Ｐ１００Ｅ、Ｐ１００Ｔ、Ｐ１００Ｆ、Ｆ１３０Ｗ、Ｆ１３０Ｙ、Ｆ１３０Ｈ、Ｄ１３２Ｈ、Ｄ１３２Ｙ、Ｄ１３２Ｋ、Ａ１６１Ｉ、Ａ１６１Ｌ、Ａ１６１Ｎ、Ａ１６１Ｗ、Ａ１６１Ｈ、Ｄ１６２Ｈ、Ｄ１６２Ｙ、Ｄ１６２Ｋ、Ｄ１６３Ｗ、Ｄ１６３Ｆ、Ｄ１６３Ｙ、Ｄ１６３Ｈ、Ｄ１６３Ｉ、Ｄ１６３Ｌ、Ｄ１６３Ｖ、Ｙ２４４Ｗ、Ｙ２４４Ｈ、Ｅ２７７Ｇ、Ｉ２８０Ｈ、Ｉ２８０Ｋ、Ｉ２８０Ｗ、Ｑ２９１Ｋ、Ｑ２９１Ｒ、Ｑ２９１Ｗ、Ｑ２９１Ｆ、Ｈ３９６Ｎ、Ｈ３９６Ｑ、Ｈ３９６Ｗ、Ｋ４１５Ｗ、Ｋ４１５Ｒ、Ｋ４１５Ｈ、Ｋ４１５Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｖ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｉ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｅ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｔ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｆ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ９３Ｎ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ９３Ｑ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ９３Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｒ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｖ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｉ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｅ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｔ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｆ、Ｆ１０９Ｗ／Ｆ１３０Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｆ１３０Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｆ１３０Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｉ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｎ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６２Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６２Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６２Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｆ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｉ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｖ、Ｆ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ２７７Ｇ、Ｆ１０９Ｗ／Ｉ２８０Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｉ２８０Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｉ２８０Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｑ２９１Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｑ２９１Ｒ、Ｆ１０９Ｗ／Ｑ２９１Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｑ２９１Ｆ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｎ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｑ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｋ４１５Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｋ４１５Ｒ、Ｆ１０９Ｗ／Ｋ４１５Ｈ、又はＦ１０９Ｗ／Ｋ４１５Ｙ。
【0081】
本発明のヘリカーゼは、好ましくは、ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの一つ又は複数のリン酸基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸が置換されたヘリカーゼである。任意の数のアミノ酸、例えば、１個又はその以上、２個又はその以上、３個又はその以上、４個又はその以上、５個又はその以上又は６個又はその以上のアミノ酸を置換することができる。ｓｓＤＮＡ内のヌクレオチドは、それぞれ三つのリン酸基を含む。置換された各アミノ酸は、毎回任意の数のリン酸基、例えば、毎回一つ、二つ又は三つのリン酸基と相互作用することができる。一つ又は複数のリン酸基と相互作用するアミノ酸は、タンパク質モデリングを使用して同定することができる。
【0082】
置換は、好ましくは、前記少なくとも一つのアミノ酸と前記ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡ内の一つ又は複数のリン酸基との間の（ｉ）静電相互作用、（ｉｉ）水素結合及び／又は（ｉｉｉ）カチオン-π（カチオン－ｐｉ）相互作用を増加させる。以下、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の好ましい置換について、タグ（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を用いて説明する。
【0083】
置換は、好ましくは、サイト（位置）での正味の正電荷を増加させる。本技術分野で既知の方法を使用して、任意の位置の正味電荷を測定することができる。例えば、等電点を用いてアミノ酸の正味電荷を定義することができる。正味電荷は、通常約７．５で測定される。置換は、好ましくは、正に帯電したアミノ酸、非荷電アミノ酸、非極性アミノ酸又は芳香族アミノ酸による負に帯電したアミノ酸の置換である。負に帯電したアミノ酸は、正味の負に帯電したアミノ酸である。負に帯電したアミノ酸は、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）を含むが、これらに限定されない。正に帯電したアミノ酸は、正味の正に帯電したアミノ酸である。正に帯電したアミノ酸は、天然又は非天然に存在する。正に帯電したアミノ酸は、合成又は修飾され得る。例えば、正味の正に帯電した修飾アミノ酸は、本発明で用いられるために専門的に設計られることができる。アミノ酸に対する多くの異なるタイプの修飾は、本技術分野で公知である。好ましい天然に存在する正に帯電したアミノ酸は、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）を含むが、これらに限定されない。
【0084】
非荷電アミノ酸、非極性アミノ酸又は芳香族アミノ酸は、天然又は非天然に存在するものであってもよい。それは、合成又は修飾されたものであってもよい。非荷電アミノ酸は、正味電荷を有しない。適切な非荷電アミノ酸は、システイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）及びグルタミン（Ｑ）を含むが、これらに限定されない。非極性アミノ酸は、非極性側鎖を有する。適切な非極性アミノ酸は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、プロリン（Ｐ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）及びバリン（Ｖ）を含むが、これらに限定されない。芳香族アミノ酸は、芳香族側鎖を有する。好適な芳香族アミノ酸は、ヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）及びチロシン（Ｙ）を含むが、これらに限定されない。
【0085】
Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、好ましくは、配列番号１１のバリアントを含み、ここで、ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの一つ又は複数のリン酸基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸は、Ｈ７５、Ｔ９１、Ｓ９４、Ｋ９７、Ｎ２４６、Ｎ２４７、Ｎ２８４、Ｋ２８８、Ｎ２９７、Ｔ３９４又はＫ３９７のうちの少なくとも一つである。これらの番号は、配列番号１１の関連位置に対応し、配列番号１１に比べて、一つ又は複数のアミノ酸がバリアントに挿入又は欠失された状態で変更する必要がある場合がある。当業者であれば、上記のようなバリアントの相応位置を確認することができる。
【0086】
Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、好ましくは、配列番号１～１０のいずれか一つのバリアントを含み、ここで、前記ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの一つ又は複数のリン酸基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸は、配列番号１１のＨ７５、Ｔ９１、Ｓ９４、Ｋ９７、Ｎ２４６、Ｎ２４７、Ｎ２８４、Ｋ２８８、Ｎ２９７、Ｔ３９４又はＫ３９７に対応する少なくとも一つのアミノ酸である。
【0087】
表５は、配列番号１１のＨ７５、Ｔ９１、Ｓ９４、Ｋ９７、Ｎ２４６、Ｎ２４７、Ｎ２８４、Ｋ２８８、Ｎ２９７、Ｔ３９４及びＫ３９７に対応する配列番号１～１０のアミノ酸を示す。
【0088】
【表5】
【0089】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、以下のいずれ一つ又は複数を含む。
ａ）ヒスチジン（Ｈ）の、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）又はスレオニン（Ｔ）、若しくは、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）又はチロシン（Ｙ）による置換、
ｂ）スレオニン（Ｔ）の、（ｉ）アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）又はヒスチジン（Ｈ）、若しくは、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）又はヒスチジン（Ｈ）による置換、
ｃ）セリンの、（ｉ）アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）又はヒスチジン（Ｈ）、若しくは、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）又はヒスチジン（Ｈ）による置換、
ｄ）アスパラギン（Ｎ）の、（ｉ）アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）又はヒスチジン（Ｈ）、若しくは、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）又はヒスチジン（Ｈ）による置換、及び／又は、
ｅ）リジン（Ｋ）の、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）又はヒスチジン（Ｈ）、若しくは、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）又はヒスチジン（Ｈ）による置換。
ａ）ヒスチジン（Ｈ）の、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）又はスレオニン（Ｔ）、若しくは、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）又はチロシン（Ｙ）による置換、
ｂ）スレオニン（Ｔ）の、（ｉ）アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）又はヒスチジン（Ｈ）、若しくは、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）又はヒスチジン（Ｈ）による置換、
ｃ）セリンの、（ｉ）アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）又はヒスチジン（Ｈ）、若しくは、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）又はヒスチジン（Ｈ）による置換、
ｄ）アスパラギン（Ｎ）の、（ｉ）アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）又はヒスチジン（Ｈ）、若しくは、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）又はヒスチジン（Ｈ）による置換、及び／又は、
ｅ）リジン（Ｋ）の、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）又はヒスチジン（Ｈ）、若しくは、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）又はヒスチジン（Ｈ）による置換。
【0090】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号１１のバリアントであり、それは、（ａ）～（ｋ）のうちの一つ又は複数を含み、ここで、
（ａ）Ｈ７５Ｎ、Ｈ７５Ｑ、Ｈ７５Ｋ又はＨ７５Ｆ、（ｂ）Ｔ９１Ｋ、Ｔ９１Ｑ又はＴ９１Ｎ、（ｃ）Ｓ９４Ｈ、Ｓ９４Ｎ、Ｓ９４Ｋ、Ｓ９４Ｔ、Ｓ９４Ｒ又はＳ９４Ｑ、（ｄ）Ｋ９７Ｑ、Ｋ９７Ｈ又はＫ９７Ｙ、（ｅ）Ｎ２４６Ｈ又はＮ２４６Ｑ、（ｆ）Ｎ２４７Ｑ又はＮ２４７Ｈ、（ｇ）Ｎ２８４Ｈ又はＮ２８４Ｑ、（ｈ）Ｋ２８８Ｑ又はＫ２８８Ｈ、（ｉ）Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｋ又はＮ２９７Ｈ、（ｊ）Ｔ３９４Ｋ、Ｔ３９４Ｈ又はＴ３９４Ｎ、若しくは、（ｋ）Ｋ３９３Ｒ、Ｋ３９７Ｈ又はＫ３９７Ｙである。
（ａ）Ｈ７５Ｎ、Ｈ７５Ｑ、Ｈ７５Ｋ又はＨ７５Ｆ、（ｂ）Ｔ９１Ｋ、Ｔ９１Ｑ又はＴ９１Ｎ、（ｃ）Ｓ９４Ｈ、Ｓ９４Ｎ、Ｓ９４Ｋ、Ｓ９４Ｔ、Ｓ９４Ｒ又はＳ９４Ｑ、（ｄ）Ｋ９７Ｑ、Ｋ９７Ｈ又はＫ９７Ｙ、（ｅ）Ｎ２４６Ｈ又はＮ２４６Ｑ、（ｆ）Ｎ２４７Ｑ又はＮ２４７Ｈ、（ｇ）Ｎ２８４Ｈ又はＮ２８４Ｑ、（ｈ）Ｋ２８８Ｑ又はＫ２８８Ｈ、（ｉ）Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｋ又はＮ２９７Ｈ、（ｊ）Ｔ３９４Ｋ、Ｔ３９４Ｈ又はＴ３９４Ｎ、若しくは、（ｋ）Ｋ３９３Ｒ、Ｋ３９７Ｈ又はＫ３９７Ｙである。
【0091】
本発明のヘリカーゼは、膜貫通ポアと相互作用するヘリカーゼの一部が一つ又は複数の修飾を含み、好ましくは一つ又は複数の置換を含み、さらに好ましくは、前記ヘリカーゼは、膜貫通ポアと相互作用する少なくとも一つのアミノ酸の置換を含む。前記膜貫通ポアと相互作用するヘリカーゼの一部は、通常、ヘリカーゼがポアを通過するポリヌクレオチドの移動を制御するために用いられる場合、膜貫通ポアと相互作用するヘリカーゼの一部であり、例えば、以下でより詳細に説明する。ヘリカーゼがポアを通過するポリヌクレオチドの移動を制御するために用いられる場合、前記一部は通常ポアと相互作用又は接触するアミノ酸を含む。電位が印加され、ヘリカーゼとポアを通って移動するポリヌクレオチドとが結合又は連結される場合、前記一部は通常ポアと相互作用又は接触するアミノ酸を含む。
【0092】
膜貫通ポアと相互作用する一部は、好ましくは、配列番号１１のバリアントを含み、ここでの位置は、Ｅ１９６、Ｗ２０２、Ｎ１９９又はＧ２０１上の一つ又は複数（例えば、２個、３個、４個又は５個）のアミノ酸の置換を含む。
【0093】
膜貫通ポアと相互作用する一部は、好ましくは、配列番号１～１０のいずれか一つのバリアントを含み、それは、（ａ）Ｅ１９６、（ｂ）Ｗ２０２、（ｃ）、Ｎ１９９、又は（ｄ）Ｇ２０１位置での配列番号１１に対応する少なくとも一つのアミノ酸又は複数の置換を含む。
【0094】
表６は、配列番号１１のＥ１９６、Ｗ２０２、Ｎ１９９、Ｇ２０１に対応する配列番号１～１０のアミノ酸を示す。
【0095】
【表6】
【0096】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号１１のバリアントである。それは、以下の位置の置換を含む。
－Ｆ１０９／Ｅ１９６／Ｈ７５、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｈ７５Ｎ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｈ７５Ｑ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｈ７５Ｋ、又はＦ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｈ７５Ｆ、
－Ｆ１０９／Ｅ１９６／Ｔ９１、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｔ９１Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｔ９１Ｑ、又はＦ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｔ９１Ｎ、
－Ｆ１０９／Ｓ９４／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｔ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｒ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｑ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｎ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｋ／Ｅ１９６Ｌ、
Ｆ１０９／Ｎ９９／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｒ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｓ９４／Ｅ１９６／Ｉ２８０、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｈ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｋ、
－Ｆ１０９／Ｐ１００／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｌ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｖ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｉ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｔ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｄ１３２／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｋ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ａ１６１／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｉ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｌ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｎ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｄ１６３／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｆ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｉ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｌ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｖ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｙ２４４／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｎ２４６／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ２４６Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｎ２４６Ｑ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｅ１９６／Ｉ２８０、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｗ、又はＦ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｒ、
－Ｆ１０９／Ｅ１９６／Ｑ２９１、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｑ２９１Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｑ２９１Ｒ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｑ２９１Ｗ、又はＦ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｑ２９１Ｆ、
－Ｆ１０９／Ｎ２９７／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ２９７Ｑ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ２９７Ｋ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｎ２９７Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｔ３９４／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｔ３９４Ｋ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｔ３９４Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｔ３９４Ｎ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｈ３９６／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｆ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｑ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｋ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｋ３９７／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｋ３９７Ｒ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｋ３９７Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｋ３９７Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、若しくは、
－Ｆ１０９／Ｙ４１６／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｙ４１６Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｙ４１６Ｒ／Ｅ１９６Ｌ。
－Ｆ１０９／Ｅ１９６／Ｈ７５、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｈ７５Ｎ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｈ７５Ｑ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｈ７５Ｋ、又はＦ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｈ７５Ｆ、
－Ｆ１０９／Ｅ１９６／Ｔ９１、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｔ９１Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｔ９１Ｑ、又はＦ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｔ９１Ｎ、
－Ｆ１０９／Ｓ９４／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｔ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｒ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｑ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｎ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｋ／Ｅ１９６Ｌ、
Ｆ１０９／Ｎ９９／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｒ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｓ９４／Ｅ１９６／Ｉ２８０、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｈ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｋ、
－Ｆ１０９／Ｐ１００／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｌ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｖ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｉ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｔ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｄ１３２／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｋ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ａ１６１／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｉ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｌ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｎ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｄ１６３／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｆ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｉ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｌ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｖ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｙ２４４／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｎ２４６／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ２４６Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｎ２４６Ｑ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｅ１９６／Ｉ２８０、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｗ、又はＦ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｒ、
－Ｆ１０９／Ｅ１９６／Ｑ２９１、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｑ２９１Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｑ２９１Ｒ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｑ２９１Ｗ、又はＦ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｑ２９１Ｆ、
－Ｆ１０９／Ｎ２９７／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ２９７Ｑ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ２９７Ｋ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｎ２９７Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｔ３９４／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｔ３９４Ｋ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｔ３９４Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｔ３９４Ｎ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｈ３９６／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｆ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｑ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｋ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｋ３９７／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｋ３９７Ｒ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｋ３９７Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｋ３９７Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、若しくは、
－Ｆ１０９／Ｙ４１６／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｙ４１６Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｙ４１６Ｒ／Ｅ１９６Ｌ。
【0097】
Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、野生型ヘリカーゼのアミノ酸配列から変化され且つポリヌクレオチド結合活性を保持するアミノ酸配列を有する酵素である。特に、配列番号１～１１のいずれか一つのバリアントは、配列番号１～１１のいずれか一つのアミノ酸配列から変化され且つポリヌクレオチド結合活性を保持するアミノ酸配列を有する酵素である。ポリヌクレオチド結合活性は、本技術分野の既知の方法を用いて確認することができる。適切な方法は、蛍光異方性法、トリプトファン蛍光法及び電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を含むが、これらに限定されない。例えば、一本鎖ポリヌクレオチドと結合するバリアントの能力は、実施例に説明されたように確認することができる。
【0098】
アミノ酸の同一性に基づいて、配列番号１～１１のいずれか一つのアミノ酸配列の長さ全体に対して、バリアントは、当該配列と少なくとも２０％の同一性を有することが好ましい。より好ましくは、アミノ酸の同一性に基づいて、前記バリアントのポリペプチドは、配列番号１～１１のいずれか一つのアミノ酸配列の配列全体に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％及びより好ましく少なくとも９５％、９７％又は９９％の同一性を有することができる。１００以上、例えば１５０、２００、３００、４００又は５００又はより多くの連続アミノ酸の長さに、少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％のアミノ酸同一性（厳密な相同性）を有することができる。
【0099】
本発明の第２態様は、本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼを少なくとも一つ又は複数含む構築体を提供する。
【0100】
好ましくは、前記構築体は、ポリヌクレオチド結合部をさらに含む。
【0101】
好ましくは、前記構築体は、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する。
【0102】
好ましくは、前記ポリヌクレオチド結合部は、ポリヌクレオチドの塩基に結合する部分、及び／又はポリヌクレオチドの糖に結合する部分、及び／又はポリヌクレオチドのリン酸に結合する部分であってもよい。
【0103】
好ましくは、前記構築体を構成するＰｉｆ１様ヘリカーゼとポリヌクレオチド結合部は、単独で調製された後に直接連結することができる。遺伝子融合の方式により構築体を直接調製することがでる。例えば、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼをコードするヌクレオチドとポリヌクレオチド結合部とを連結させ、発現のために宿主細胞に移し、精製する。
【0104】
さらに好ましくは、前記ポリヌクレオチド結合部は、ポリヌクレオチドに結合できるポリペプチドであり、真核生物の一本鎖結合タンパク質、細菌の一本鎖結合タンパク質、古細菌の一本鎖結合タンパク質、ウイルスの一本鎖結合タンパク質又は二本鎖結合タンパク質のうちの一種又は二種以上の組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【0105】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記ポリヌクレオチド結合部は、表７に示すいずれか一種を含むが、これらに限定されない。
【0106】
【表7】
【0107】
本発明の第３態様は、本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼ又は前記構築体をコードする核酸を提供する。
【0108】
本発明の第４態様は、本発明に係る核酸を含む発現ベクターを提供する。
【0109】
好ましくは、前記核酸は、発現ベクターの調節エレメントに作動可能に連結され、ここで、前記調節エレメントは、好ましくは、プロモーターである。
【0110】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記プロモーターは、Ｔ７、ｔｒｃ、ｌａｃ、ａｒａ又はλＬから選択される。
【0111】
好ましくは、前記発現ベクターは、プラスミド、ウイルス又はファージを含むが、これらに限定されない。
【0112】
本発明の第５態様は、本発明に係る核酸又は発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【0113】
好ましくは、前記宿主細胞は大腸菌を含むが、これらに限定されない。
【0114】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記宿主細胞は、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＪＭ１０９（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、ＴＵＮＥＲ、Ｃ４１（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）、Ｏｒｉｇａｍｉ、Ｏｒｉｇａｍｉ Ｂなどから選択される。
【0115】
本発明の第６態様は、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼの調製方法を提供し、前記方法は、野生型Ｐｉｆ１様ヘリカーゼを提供し、次に前記野生型Ｐｉｆ１様ヘリカーゼを修飾して本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼを取得することを含む。
【0116】
本発明の第７態様は、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼの調製方法を提供し、前記方法は、本発明に係る宿主細胞を培養し、誘導性の発現と精製を行って、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼを取得することを含む。
【0117】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記方法は、本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼのアミノ酸配列に従って、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼをコードする核酸配列を取得し、酵素切断して発現ベクターにライゲーションし、次に大腸菌に形質転換し、誘導性の発現と精製を行って、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼを得る。
【0118】
本発明の第８態様は、ポリヌクレオチドの移動を制御する方法を提供する。前記方法は、本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼ又は構築体をポリヌクレオチドに接触させることを含む。
【0119】
好ましくは、前記ポリヌクレオチドの移動を制御することは、ポアを通過するポリヌクレオチドの移動を制御することである。前記ポアはナノポアであり、前記ナノポアは膜貫通ポアである。当該ポアは、天然又は人工のポアであってもよく、タンパクポア、ポリヌクレオチドポア又は固体状ポアを含むが、これらに限定されない。
【0120】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記膜貫通ポアは、生物学的ポア、固体状ポア、又は生物学的ポアと固体状ポアのハイブリッドポアから選択される。
【0121】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記ポアは、マイコバクテリウム・スメグマティス・ポリンＡ、マイコバクテリウム・スメグマティス・ポリンＢ、マイコバクテリウム・スメグマティス・ポリンＣ、マイコバクテリウム・スメグマティス・ポリンＤ、ヘモリシン、リシン、インターロイキン、外膜ポリンＦ、外膜ポリンＧ、外膜ホスホリパーゼＡ、ＷＺＡ又はナイセリアオートトランスポーターリポタンパク質などから由来するものを含むが、これらに限定されない。
【0122】
好ましくは、前記方法は、一つ又は複数のＰｉｆ１様ヘリカーゼと共にポリヌクレオチドの移動を制御することができる。
【0123】
本発明の第９態様は、標的ポリヌクレオチドを特徴づける方法を提供し、前記方法は、以下を含む。
Ｉ）本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼ又は構築体を、標的ポリヌクレオチド及びポアと接触させて、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼ又は構築体がポアを通過する標的ポリヌクレオチドの移動を制御するようにすること、及び、
ＩＩ）標的ポリヌクレオチドのヌクレオチドと前記ポアが相互作用する時の一つ又は複数の特徴を取得して、前記標的ポリヌクレオチドを特徴づけること。
Ｉ）本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼ又は構築体を、標的ポリヌクレオチド及びポアと接触させて、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼ又は構築体がポアを通過する標的ポリヌクレオチドの移動を制御するようにすること、及び、
ＩＩ）標的ポリヌクレオチドのヌクレオチドと前記ポアが相互作用する時の一つ又は複数の特徴を取得して、前記標的ポリヌクレオチドを特徴づけること。
【0124】
好ましくは、前記方法において任意の数の本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼを使用することができる。好ましくは、一つ又は複数であり、より好ましくは、１、２、３、４、５、６、７、８、９個又はより多くてもよい。ここで、前記二つ以上の本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼは、同じでも異なってもよい。野生型Ｐｉｆ１様ヘリカーゼ又は他のタイプのヘリカーゼを含み得る。さらに、二つ以上のヘリカーゼが互いに連結されるか又はポリヌクレオチドにそれぞれ結合されて、ポリヌクレオチドの移動を制御する機能を奏することができる。
【0125】
好ましくは、ポアに一つの力（例えば、電圧）を印加すると、ポアを通過する標的ポリヌクレオチドの速度がＰｉｆ１様ヘリカーゼ又は構築体により制御され、これにより識別可能な安定した電流レベルを取得し、標的ポリヌクレオチドの特徴を確認するために用いられる。
【0126】
好ましくは、工程Ｉ）及びＩＩ）を一回又は複数回繰り返す。
【0127】
好ましくは、前記方法は、前記ヘリカーゼ又は構築体、及び標的ポリヌクレオチドと接触するポアにまたがって電位差を印加する工程をさらに含む。
【0128】
好ましくは、前記ポアは、印加された電位の駆動で水和イオンが膜の一側から膜の他側に流れることを許容する構造である。さらに好ましくは、前記ポアはナノポアであり、前記ナノポアは膜貫通ポアである。前記膜貫通ポアは、標的ポリヌクレオチドの移動にチャネルを提供する。
【0129】
前記膜は、従来技術において存在するいかなる膜であってもよく、好ましくは両親媒性分子層、即ち、少なくとも一つの親水性部分と少なくとも一つの親油性又は疎水性部分を有する両親媒性分子（例えば、リン脂質）で形成された層である。両親媒性分子は、合成又は天然に存在することができる。さらに好ましくは、前記膜は脂質二重層膜である。
【0130】
前記標的ポリヌクレオチドは、任意の既知の方法を用いて膜に連結されることができる。膜が両親媒性分子層、例えば脂質二重分子層であれば、前記ポリヌクレオチドは、好ましくは、前記膜に存在するポリペプチド又は前記膜に存在する疎水性アンカーによって当該膜に連結される。ここで、疎水性アンカーは、脂質、脂肪酸、ステロール、カーボンナノチューブ又はアミノ酸であることが好ましい。
【0131】
好ましくは、前記ポアは生物学的ポア、固体状ポア、又は生物学的ポアと固体状ポアのハイブリッドポアから選択される。
【0132】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記ポアは、マイコバクテリウム・スメグマティス・ポリンＡ、マイコバクテリウム・スメグマティス・ポリンＢ、マイコバクテリウム・スメグマティス・ポリンＣ、マイコバクテリウム・スメグマティス・ポリンＤ、ヘモリシン、リシン、インターロイキン、外膜ポリンＦ、外膜ポリンＧ、外膜ホスホリパーゼＡ、ＷＺＡ又はナイセリアオートトランスポーターリポタンパク質等から由来するものを含むが、これらに限定されない。
【0133】
移動を促進する全ての必要な成分を提供する場合、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼはＤＮＡに沿って５’－３’の方向で移動するが、ＤＮＡのポア内での配向（ＤＮＡのどの末端が捕捉されるかに依存する）とは、酵素を使用して、印加されたフィールドの方向の逆方向でＤＮＡをポアから取り出すために用いられるか、又は印加された電界の方向に沿ってＤＮＡをポアに移動するために用いられることを意味する。
【0134】
好ましくは、前記標的ポリヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖又は少なくとも一部が二本鎖である。
【0135】
さらに好ましくは、前記標的ポリヌクレオチドは、タグ、スペーサー、メチル化、酸化又は損傷の方式により修飾されることができる。
【0136】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記標的ポリヌクレオチドは、少なくとも一部が二本鎖である。ここで、前記二本鎖部分は、前記ポアに優先的にねじ込まれるリーダー配列を含むＹアダプター構造を構成する。
【0137】
さらに好ましくは、前記標的ポリヌクレオチドの長さは１０～１０００００個又はより多くてもよい。
【0138】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記標的ポリヌクレオチドの長さは、少なくとも１０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、少なくとも１０００個、少なくとも２０００個、少なくとも５０００個、少なくとも１００００個、少なくとも５００００個又は少なくとも１０００００個などであってもよい。
【0139】
好ましくは、前記ヘリカーゼは、一本鎖ポリヌクレオチドの内部ヌクレオチドに結合される。
【0140】
好ましくは、前記一つ又は複数の特徴は、標的ポリヌクレオチドの由来、長さ、同一性、配列、二次構造、又は標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否かから選択される。
【0141】
好ましくは、前記一つ又は複数の特徴は、電気的測定及び／又は光学的測定によって行われる。
【0142】
さらに好ましくは、電気的測定及び／又は光学的測定によって電気信号及び／又は光信号を生成し、各ヌクレオチドは一つの信号レベルに対応し、続いて電気信号及び／又は光信号をヌクレオチドの特徴に変換する。
【0143】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記電気的測定は、電流測定、インピーダンス測定、トンネリング測定、ウィンドトンネル測定又は電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）測定などを含むが、これらに限定されない。
【0144】
本発明に係る電気信号は電流、電圧、トンネリング、抵抗、電位、導電率又は横方向の電気的測定の測定値から選択される。
【0145】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記電気信号は、前記ポアを通過する電流である。
【0146】
好ましくは、前記特徴付けは、改良されたビタビアルゴリズムを使用することをさらに含む。
【0147】
本発明の第１０態様は、標的ポリヌクレオチドを特徴づける製品を提供する。前記製品は、本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼ、構築体、核酸、発現ベクター又は宿主細胞、及びポアを含む。
【0148】
好ましくは、前記製品は、複数のＰｉｆ１様ヘリカーゼ及び／又は複数の構築体を含む。
【0149】
好ましくは、前記製品は、複数のポアを含む。さらに好ましくは、前記ポアはナノポアであり、前記ナノポアは膜貫通ポアである。
【0150】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記膜貫通ポアは、生物学的ポア、固体状ポア、又は生物学的ポアと固体状ポアのハイブリッドポアから選択される。
【0151】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記ポアは、マイコバクテリウム・スメグマティス・ポリンＡ、マイコバクテリウム・スメグマティス・ポリンＢ、マイコバクテリウム・スメグマティス・ポリンＣ、マイコバクテリウム・スメグマティス・ポリンＤ、ヘモリシン、リシン、インターロイキン、外膜ポリンＦ、外膜ポリンＧ、外膜ホスホリパーゼＡ、ＷＺＡ又はナイセリアオートトランスポーターリポタンパク質等から由来するものを含むが、これらに限定されない。
【0152】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記製品は、複数のＰｉｆ１様ヘリカーゼ又は複数の構築体、及び複数のポアを含む。
【0153】
好ましくは、前記製品は、キット、装置又はセンサから選択される。
【0154】
さらに好ましくは、前記キットは、脂質二重層を含むチップをさらに含む。前記ポアは、脂質二重層に跨る。
【0155】
本発明に係るキットは、一つ又は複数の脂質二重層を含み、各脂質二重層は、一つ又は複数の前記ポアを含む。
【0156】
本発明に係るキットは、標的ポリヌクレオチドを特徴づける試薬又は装置をさらに含む。好ましくは、前記試薬は、緩衝剤、ＰＣＲ増幅に必要なツールを含む。
【0157】
本発明の第１１態様は、標的ポリヌクレオチドの特徴づけ又はポアを通過する標的ポリヌクレオチドの移動に対する制御における、本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼ、構築体、核酸、発現ベクター、宿主細胞又は製品の使用を提供する。
【0158】
本発明の第１２態様は、標的ポリヌクレオチドを特徴づけるキットを提供する。前記キットは、本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼ、構築体又は核酸、発現ベクター又は宿主細胞、及びポアを含む。
【0159】
本発明の第１３態様は、標的ポリヌクレオチドを特徴づける装置を提供する。前記装置は、本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼ、構築体又は核酸、発現ベクター又は宿主細胞、及びポアを含む。
【0160】
好ましくは、前記装置は、前記複数のポアを支持し且つポアとポリヌクレオチドとの相互作用信号を伝達できるセンサ、及び少なくとも一つの標的ポリヌクレオチドを貯蔵するための貯蔵器、及び特徴付けを実施する過程に必要な溶液を含む。
【0161】
好ましくは、前記装置は、複数のＰｉｆ１様ヘリカーゼ及び／又は複数の構築体、及び複数のポアを含む。
【0162】
本発明の第１４態様は、標的ポリヌクレオチドを特徴づけるセンサを提供し、前記センサは、前記ポアと本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼ又は構築体との間に複合体を形成することを含む。
【0163】
好ましくは、前記標的ポリヌクレオチドの存在下で、前記ポアとヘリカーゼ又は構築体とを接触させ、前記ポアに跨って電位を印加する。前記電位は、電圧電位又は化学電位から選択される。
【0164】
本発明の第１５態様は、標的ポリヌクレオチドを特徴づけるセンサを形成する方法を提供し、前記ポアと本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼ又は構築体との間に複合体を形成して標的ポリヌクレオチドを特徴づけるセンサを形成することを含む。
【0165】
本発明の第１６態様は、ポリヌクレオチドに連結される二つ又は複数のヘリカーゼを提供し、ここで、前記二つ又は複数のヘリカーゼの少なくとも一つが本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼである。
【0166】
本発明の第１７態様は、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼオリゴマーを提供し、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼオリゴマーは、一つ又は複数の本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼを含む。
【0167】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼオリゴマーは、野生型Ｐｉｆ１様ヘリカーゼ又は他のタイプのヘリカーゼをさらに含み得る。ここで、前記他のタイプのヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ、ＸＰＤヘリカーゼ、Ｄｄａヘリカーゼ、ＴｒａＩヘリカーゼ又はＴｒｗＣヘリカーゼなどであってもよい。
【0168】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼと野生型Ｐｉｆ１様ヘリカーゼとの間、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼとＰｉｆ１様ヘリカーゼとの間、野生型Ｐｉｆ１様ヘリカーゼと野生型Ｐｉｆ１様ヘリカーゼとの間、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼと他のタイプのヘリカーゼとの間又は野生型Ｐｉｆ１様ヘリカーゼと他のタイプのヘリカーゼとの間は、頭対頭、尾対尾、又は頭対尾の方式で連結又は配列されてもよい。
【0169】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼオリゴマーは、二つ以上の本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼを含み、ここで、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、異なっても同じであってもよい。
【0170】
本発明に係る「Ｐｉｆ１様ヘリカーゼ」は修飾されたものである。前記修飾は、野生型又は天然ヘリカーゼに対して修飾されたものである。
【0171】
本発明に係る「Ｐｉｆ１様ヘリカーゼ」、「構築体」又は「ポア」は、いずれも修飾されて、同定又は精製に役立つ。例えば、ヒスチジン残基（Ｈｉｓタグ）、アスパラギン酸残基（ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグ、Ｆｌａｇタグ、ＳＵＭＯタグ、ＧＳＴタグ又はＭＢＰタグを添加して、又は信号配列を添加して、ポリペプチドに信号配列が自然に含まれていない細胞からの分泌を促進する。遺伝子タグを導入する代わりに、化学反応によりタグをＰｉｆ１様ヘリカーゼ、ポア又は構築体上の天然又は人工位置に連結することもできる。
【0172】
本発明に係る「ヌクレオチド」は、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）及びデオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）を含むが、これらに限定されない。好ましくは、前記ヌクレオチドは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ又はｄＣＭＰから選択される。
【0173】
本発明に係る「保存的アミノ酸置換」は、アラニンとセリン、グリシン、スレオニン、バリン、プロリン又はグルタミン酸との間の置換、及び／又は、アスパラギン酸とグリシン、アスパラギン又はグルタミン酸との間の置換、及び／又は、セリンとグリシン、アスパラギン又はスレオニンとの置換、及び／又は、ロイシンとイソロイシン又はバリンとの間の置換、及び／又は、バリンとロイシン、イソロイシンとの間の置換、及び／又は、チロシンとフェニルアラニンとの間の置換、及び／又は、リジンとアルギニンとの間の置換を含むが、これらに限定されない。上記の前記置換基は、本発明に記載のアミノ酸配列の活性を変化させない。
【0174】
本発明に係る「二つ以上」は、二つ、三つ、四つ、五つ、六つ、七つ、八つ、又はより多くの個数などを含む。
【0175】
本発明に係る「複数」は、二つ以上、三つ以上、四つ以上、五つ以上、六つ以上、七つ以上、八つ以上、又はより多くの個数などを含むが、これらに限定されない。
【0176】
本発明に係る「少なくとも一つ」は、一つ以上、二つ以上、三つ以上、四つ以上、五つ以上、六つ以上、七つ以上、八つ以上又はより多くの個数などを含むが、これらに限定されない。
【0177】
本発明に係る「及び／又は」は、択一の項目及び任意の個数の項目の組み合わせを含む。
【0178】
本発明に係る「含む」は、制限のない用語であり、記載された特定の成分又は工程、及び実質的な効果を有さない他の成分又は工程を含むことを意味する。
【0179】
本発明に係る「非天然アミノ酸」は、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼに天然に存在するアミノ酸ではない。好ましくは、４－アジド－Ｌ－フェニルアラニン（Ｆａｚ）、４－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、３－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、４－アセトアセチル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｏ－アリル－Ｌ－チロシン、３－（フェニルセレニル）－Ｌ－アラニン、Ｏ－２－プロピン－１－イル－Ｌ－チロシン、４－（ジヒドロキシボリル）－Ｌ－フェニルアラニン、４－［（エチルスルファニル）カルボニル］－Ｌ－フェニルアラニン、（２Ｓ）－２－アミノ－３－｛４－［（プロパン－２－イルスルファニル）カルボニル］フェニル｝プロピオン酸、（２Ｓ）－２－アミノ－３－｛４－［（２－アミノ－３－スルファニルプロパノイル）アミノ］フェニル｝プロピオン酸、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、４－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、４－シアノ－Ｌ－フェニルアラニン、３－シアノ－Ｌ－フェニルアラニン、４－フルオロ－Ｌ－フェニルアラニン、４－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、４－ブロモ－Ｌ－フェニルアラニン、Ｏ－（トリフルオロメチル）チロシン、４－ニトロＬ－フェニルアラニン、３－ヒドロキシ－Ｌ－チロシン、３－アミノ－Ｌ－チロシン、３－ヨード－Ｌ－チロシン、４－イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、３－（２－ナフチル）－Ｌ－アラニン、４－フェニル－Ｌ－フェニルアラニン、（２Ｓ）－２－アミノ－３－（ナフタレン－２－イルアミノ）プロピオン酸、６－（メチルスルファニル）ノルロイシン、６－オキシ－Ｌ－リジン、Ｄ－チロシン、（２Ｒ）－２－ヒドロキシ－３－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、（２Ｒ）－２－アミノオクタン酸エステル－３－（２，２’－ビピリジル－５－イル）－Ｄ－アラニン、２－アミノ－３－（８－ヒドロキシ－３－キノリル）プロピオン酸、４－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｓ－（２－ニトロベンジル）システイン、（２Ｒ）－２－アミノ－３－［（２－ニトロベンジル）スルファニル］プロピオン酸、（２Ｓ）－２－アミノ－３－［（２－ニトロベンジル）オキシ］プロピオン酸、Ｏ－（４，５－ジメトキシ－２－ニトロベンジル）－Ｌ－セリン、（２Ｓ）－２－アミノ－６－（｛［（２－ニトロベンジル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｏ－（２－ニトロベンジル）－Ｌ－チロシン、２－ニトロフェニルアラニン、４－［（Ｅ）－フェニルジアゼニル］－Ｌ－フェニルアラニン、４－［３－（トリフルオロメチル）－３Ｈ－ジアジリジニル－３イル］－Ｄ－フェニルアラニン、２－アミノ－３－［［５－（ジメチルアミノ）－１－ナフチル］スルホニルアミノ］プロピオン酸、（２Ｓ）－２－アミノ４－（７－ヒドロキシ－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）ブタン酸、（２Ｓ）－３－［（６－アセチルナフタレン－２－イル）アミノ］－２－アミノプロピオン酸、４－（カルボキシメチル）フェニルアラニン、３－ニトロ－Ｌ－チロシン、Ｏ－チオ－Ｌ－チロシン、（２Ｒ）－６－アセチルアミノ－２－アミノカプロン酸エステル、１－メチルヒスチジン、２－アミノノナン酸、２－アミノデカン酸、Ｌ－ホモシステイン、５－スルファニル－ノルバリン、６－スルファニル－Ｌ－ノルロイシン、５－（メチルスルファニル）－Ｌ－ノルバリン、Ｎ６－｛［（２Ｒ，３Ｒ）－３－メチル－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピロール－２－イル］カルボニル｝－Ｌ－リジン、Ｎ６－［（ベンジルオキシ）カルボニル］リジン、（２Ｓ）－２－アミノ－６－［（シクロペンチルカルボニル）アミノ］ヘキサン酸、Ｎ６－［（シクロペンチルオキシ）カルボニル］－Ｌ－リジン、（２Ｓ）－２－アミノ－６－｛［（２Ｒ）－テトラヒドロフラン－２－イルカルボニル］アミノ｝ヘキサン酸、（２Ｓ）－２－アミノ－８－［（２Ｒ，３Ｓ）－３－エチニルテトラヒドロフラン－２－イル］－８－オキシオクタン酸、Ｎ６－（ｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－リジン、（２Ｓ）－２－ヒドロキシ－６－（｛［（２－メチル－２－プロパンイル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｎ６－［（アリルオキシ）カルボニル］リジン、（２Ｓ）－２－アミノ－６－（｛［（２－アジドベンジル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｎ６－Ｌ－プロピル－Ｌ－リジン、（２Ｓ）－２－アミノ－６－｛［（プロプ－２－イン－１－イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸又はＮ６－［（２－アジドエトキシ）カルボニル］－Ｌ－リジンを含むが、これらに限定されない。
【0180】
以下、図面を参照して本発明の実施例を詳細に説明する。
【実施例】
【0181】
下記の実施例は、本発明の内容をさらに説明するものであるが、本発明を限定するものと理解すべきではない。本発明の主旨及び実質から逸脱することなく、本発明の方法、工程又は条件に対して行われた修正又は差替えは、いずれも本発明の範囲内に属する。
【0182】
特に明記しない限り、実施例で用いられる技術的手段は、当業者に周知の従来の手段である。各実施例で使用される装置及び試薬はいずれも常用の市販品であり得る。
【0183】
実施例１ Ｐｉｆ１様ヘリカーゼの調製
１ 材料及び方法
Ｐｉｆ１様ヘリカーゼ配列を含有する組換えプラスミド（アミノ酸配列の配列番号１～１１のバリアントであり、それはヌクレオチド配列の配列番号２５～３５に対応する）を、熱ショックによりＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換し、蘇生した細菌溶液をアンピシリン耐性の固体ＬＢプレートに塗布した後、３７℃で一晩培養し、単一コロニーを選び、１００ｍｌのアンピシリン耐性液体ＬＢ培地に接種し、３７℃で培養する。接種量の１％をアンピシリン耐性ＬＢ液体培地に接種して拡大培養し、３７℃、２００ｒｐｍの条件下で培養し、そのＯＤ６００値を連続的に測定する。ＯＤ６００＝０．６～０．８である場合、ＬＢ培地の培養液を１８℃に冷却し、イソプロピルチオガラクトシド（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－Ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ、ＩＰＴＧ）を添加して発現を誘導し、最終濃度を１ｍＭにする。１２～１６時間後、１８℃で細菌を収集する。細菌を高圧下で粉砕し、ＦＰＬＣ方法で精製し、サンプルを収集する。
１ 材料及び方法
Ｐｉｆ１様ヘリカーゼ配列を含有する組換えプラスミド（アミノ酸配列の配列番号１～１１のバリアントであり、それはヌクレオチド配列の配列番号２５～３５に対応する）を、熱ショックによりＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換し、蘇生した細菌溶液をアンピシリン耐性の固体ＬＢプレートに塗布した後、３７℃で一晩培養し、単一コロニーを選び、１００ｍｌのアンピシリン耐性液体ＬＢ培地に接種し、３７℃で培養する。接種量の１％をアンピシリン耐性ＬＢ液体培地に接種して拡大培養し、３７℃、２００ｒｐｍの条件下で培養し、そのＯＤ６００値を連続的に測定する。ＯＤ６００＝０．６～０．８である場合、ＬＢ培地の培養液を１８℃に冷却し、イソプロピルチオガラクトシド（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－Ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ、ＩＰＴＧ）を添加して発現を誘導し、最終濃度を１ｍＭにする。１２～１６時間後、１８℃で細菌を収集する。細菌を高圧下で粉砕し、ＦＰＬＣ方法で精製し、サンプルを収集する。
【0184】
２ 結果
図１０は、精製されたＭｐｈ ＭＰ１（配列番号１１のバリアント）ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動図を示す。
図１０は、精製されたＭｐｈ ＭＰ１（配列番号１１のバリアント）ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動図を示す。
【0185】
実施例２
蛍光分析を用いて酵素の活性を検出することによって、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼのハイブリダイズしたｄｓＤＮＡ巻き戻し能力を説明する。
蛍光分析を用いて酵素の活性を検出することによって、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼのハイブリダイズしたｄｓＤＮＡ巻き戻し能力を説明する。
【0186】
１ 材料及び方法
図１のａ）に示すように、蛍光基質鎖（最終濃度 １００ｎＭ）は、５’端のｓｓＤＮＡ突出部分、及び５０塩基のハイブリダイズしたｄｓＤＮＡ部分を有する。主鎖の上部（Ｂ）が３’端にブラックホールクェンチャー（ＢＨＱ－１）塩基（配列番号２０－ＢＨＱ－３’）を有し、前記ハイブリダイズした相補鎖が５’端にカルボキシフルオレセイン（５’ＦＡＭ－配列番号２１）を有することを含む。ハイブリダイズしたフルオレセイン由来蛍光が局所的なＢＨＱ－１によって消光され、基質は本質的に非蛍光性である。さらに、蛍光基質の短鎖に相補的な０．５μＭの捕捉鎖（配列番号２２）を含む。ｂ）に示すように、ＡＴＰ（５ｍＭ）及びＭｇＣｌ２（５ｍＭ）の存在下で、基質に添加されたＰｉｆ１様ヘリカーゼ（２００ｎＭ）は、前記蛍光基質の５’端部分に連結され、前記主鎖に沿って移動し、前記相補鎖を巻き戻した後、過剰の捕捉鎖が優先的に相補鎖ＤＮＡにアニーリングして、最初の基質の再アニーリングと蛍光の損失を防止する。同時に、システム内に依然としてＰｉｆ１様ヘリカーゼによって巻き戻されない一定量のハイブリッドしたｄｓＤＮＡが存在する。ｃ）に示すように、主鎖に完全に相補的な捕捉鎖Ａ（配列番号２３）を過剰に添加した後、巻き戻されないｄｓＤＮＡの一部は、過剰なＡの存在により鎖巻き戻し効果を奏し、最終的に全てのｄｓＤＮＡが巻き戻され、蛍光値が最も高くなる。
図１のａ）に示すように、蛍光基質鎖（最終濃度 １００ｎＭ）は、５’端のｓｓＤＮＡ突出部分、及び５０塩基のハイブリダイズしたｄｓＤＮＡ部分を有する。主鎖の上部（Ｂ）が３’端にブラックホールクェンチャー（ＢＨＱ－１）塩基（配列番号２０－ＢＨＱ－３’）を有し、前記ハイブリダイズした相補鎖が５’端にカルボキシフルオレセイン（５’ＦＡＭ－配列番号２１）を有することを含む。ハイブリダイズしたフルオレセイン由来蛍光が局所的なＢＨＱ－１によって消光され、基質は本質的に非蛍光性である。さらに、蛍光基質の短鎖に相補的な０．５μＭの捕捉鎖（配列番号２２）を含む。ｂ）に示すように、ＡＴＰ（５ｍＭ）及びＭｇＣｌ２（５ｍＭ）の存在下で、基質に添加されたＰｉｆ１様ヘリカーゼ（２００ｎＭ）は、前記蛍光基質の５’端部分に連結され、前記主鎖に沿って移動し、前記相補鎖を巻き戻した後、過剰の捕捉鎖が優先的に相補鎖ＤＮＡにアニーリングして、最初の基質の再アニーリングと蛍光の損失を防止する。同時に、システム内に依然としてＰｉｆ１様ヘリカーゼによって巻き戻されない一定量のハイブリッドしたｄｓＤＮＡが存在する。ｃ）に示すように、主鎖に完全に相補的な捕捉鎖Ａ（配列番号２３）を過剰に添加した後、巻き戻されないｄｓＤＮＡの一部は、過剰なＡの存在により鎖巻き戻し効果を奏し、最終的に全てのｄｓＤＮＡが巻き戻され、蛍光値が最も高くなる。
【0187】
２ 結果
図２は、４００ｍＭ ＮａＣｌを含有する緩衝液中での時間依存性のｄｓＤＮＡ巻き戻し比の変化図を示す（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、５ｍＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｎＭ蛍光基質ＤＮＡ、０．５μＭ捕捉ＤＮＡ）。
図２は、４００ｍＭ ＮａＣｌを含有する緩衝液中での時間依存性のｄｓＤＮＡ巻き戻し比の変化図を示す（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、５ｍＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｎＭ蛍光基質ＤＮＡ、０．５μＭ捕捉ＤＮＡ）。
【0188】
実施例３
例示的にゲル測定を使用して本発明の修飾されたＰｉｆ１様ヘリカーゼのＤＮＡ結合能力を測定する。
例示的にゲル測定を使用して本発明の修飾されたＰｉｆ１様ヘリカーゼのＤＮＡ結合能力を測定する。
【0189】
具体的に、Ａｐｈ Ａｃｊ６１－Ｄ９７Ｃ／Ａ３６３Ｃ（Ｄ９７Ｃ／Ａ３６３Ｃ変異を有する配列番号２）、Ａｐｈ ＰＸ２９－Ｄ９６Ｃ／Ａ３７１Ｃ（Ｄ９６Ｃ／Ａ３７１Ｃ変異を有する配列番号３）、Ｓｐｈ ＣＢＨ８－Ａ９４Ｃ／Ａ３６１Ｃ／Ｃ１３６Ａ（Ａ９４Ｃ／Ａ３６１Ｃ及びＣ１３６Ａ変異を有する配列番号５）、Ｐｐｈ ＰｓｐＹＺＵ０５－Ｄ１０４Ｃ／Ａ３７５Ｃ／Ｃ１４６Ａ（Ｄ１０４Ｃ／Ａ３７５Ｃ及びＣ１４６Ａ変異を有する配列番号８）及びＭｐｈ ＭＰ１－Ｅ１０５Ｃ／Ａ３６２Ｃ（Ｅ１０５Ｃ／Ａ３６２Ｃ変異を有する配列番号１１）とＤＮＡとの結合能力を測定する。
【0190】
１ 材料及び方法
１０ｍＭ ＨＥＰＥ、ｐＨ値 ８．０、４００ｍＭ 塩化カリウム中で、アニーリングしたＤＮＡ複合体（配列番号１８と５’ＦＡＭで修飾された配列番号１９とのハイブリダイゼーション）を、（１：１、体積／体積）の割合で、それぞれ、Ａｐｈ Ａｃｊ６１、Ａｐｈ ＰＸ２９、Ｓｐｈ ＣＢＨ８、Ｐｐｈ ＰｓｐＹＺＵ０５、Ｍｐｈ ＭＰ１、Ａｐｈ Ａｃｊ６１－Ｄ９７Ｃ／Ａ３６３Ｃ、Ａｐｈ ＰＸ２９－Ｄ９６Ｃ／Ａ３７１Ｃ、Ｓｐｈ ＣＢＨ８－Ａ９４Ｃ／Ａ３６１Ｃ／Ｃ１３６Ａ、Ｐｐｈ ＰｓｐＹＺＵ０５－Ｄ１０４Ｃ／Ａ３７５Ｃ／Ｃ１４６Ａ、Ｍｐｈ ＭＰ１－Ｅ１０５Ｃ／Ａ３６２Ｃと混合して、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼの最終濃度（６００ｎＭ）及びＤＮＡ（３０ｎＭ）を得る。Ｐｉｆ１様ヘリカーゼを室温下で１時間ＤＮＡと結合させる。最終濃度が５μＭになるまで、ＴＭＡＤを各サンプルに添加し、室温で１時間培養する。サンプルを４～２０％ＴＢＥゲルにロードし、１６０Ｖで１．５時間泳動する。そして、当該ゲルを青色蛍光下でＤＮＡバンドを観察する。
１０ｍＭ ＨＥＰＥ、ｐＨ値 ８．０、４００ｍＭ 塩化カリウム中で、アニーリングしたＤＮＡ複合体（配列番号１８と５’ＦＡＭで修飾された配列番号１９とのハイブリダイゼーション）を、（１：１、体積／体積）の割合で、それぞれ、Ａｐｈ Ａｃｊ６１、Ａｐｈ ＰＸ２９、Ｓｐｈ ＣＢＨ８、Ｐｐｈ ＰｓｐＹＺＵ０５、Ｍｐｈ ＭＰ１、Ａｐｈ Ａｃｊ６１－Ｄ９７Ｃ／Ａ３６３Ｃ、Ａｐｈ ＰＸ２９－Ｄ９６Ｃ／Ａ３７１Ｃ、Ｓｐｈ ＣＢＨ８－Ａ９４Ｃ／Ａ３６１Ｃ／Ｃ１３６Ａ、Ｐｐｈ ＰｓｐＹＺＵ０５－Ｄ１０４Ｃ／Ａ３７５Ｃ／Ｃ１４６Ａ、Ｍｐｈ ＭＰ１－Ｅ１０５Ｃ／Ａ３６２Ｃと混合して、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼの最終濃度（６００ｎＭ）及びＤＮＡ（３０ｎＭ）を得る。Ｐｉｆ１様ヘリカーゼを室温下で１時間ＤＮＡと結合させる。最終濃度が５μＭになるまで、ＴＭＡＤを各サンプルに添加し、室温で１時間培養する。サンプルを４～２０％ＴＢＥゲルにロードし、１６０Ｖで１．５時間泳動する。そして、当該ゲルを青色蛍光下でＤＮＡバンドを観察する。
【0191】
２ 結果
図３は、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼの修飾前後のＤＮＡ結合能力への影響を示す。レーン２～６は、大量のＤＮＡが電気泳動過程においてＰｉｆ１様ヘリカーゼと結合せず、明らかな結合バンドが観察されないことを示す。レーン７～１１は、異なる個数の酵素がＤＮＡと結合した結合バンドを示し、ここで、レーン９及び１０は、最大５個のＰｉｆ１様ヘリカーゼが配列番号１８の一本鎖部分と結合できることを示す。これは、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼが修飾された後にＤＮＡと結合する結合強度を大幅に向上させることを示す。
図３は、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼの修飾前後のＤＮＡ結合能力への影響を示す。レーン２～６は、大量のＤＮＡが電気泳動過程においてＰｉｆ１様ヘリカーゼと結合せず、明らかな結合バンドが観察されないことを示す。レーン７～１１は、異なる個数の酵素がＤＮＡと結合した結合バンドを示し、ここで、レーン９及び１０は、最大５個のＰｉｆ１様ヘリカーゼが配列番号１８の一本鎖部分と結合できることを示す。これは、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼが修飾された後にＤＮＡと結合する結合強度を大幅に向上させることを示す。
【0192】
実施例４
本実施例は、Ｍｐｈ ＭＰ１－Ｅ１０５Ｃ／Ａ３６２Ｃ（変異Ｅ１０５Ｃ／Ａ３６２Ｃを有する配列番号１１）を例として、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼが単一ＭｓｐＡナノポア（配列番号１２）を通過するＤＮＡ鎖全体をどのように制御するかを検証する。
本実施例は、Ｍｐｈ ＭＰ１－Ｅ１０５Ｃ／Ａ３６２Ｃ（変異Ｅ１０５Ｃ／Ａ３６２Ｃを有する配列番号１１）を例として、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼが単一ＭｓｐＡナノポア（配列番号１２）を通過するＤＮＡ鎖全体をどのように制御するかを検証する。
【0193】
１ 材料及び方法
図４に示すようなＤＮＡ構築体Ａを調製する。配列番号１３は、その５’末端が２０個のｉＳｐＣ３スペーサーに連結され、その３’末端が４つのｉＳｐＣ３スペーサーに連結され、当該スペーサーは、配列番号１４の５’末端に連結され、当該配列番号１４の３’末端は、配列番号１７に連結され、当該ＤＮＡ構築体の配列番号１５領域は、配列番号１６（３’コレステロールテザーを有する）とハイブリダイズする。
図４に示すようなＤＮＡ構築体Ａを調製する。配列番号１３は、その５’末端が２０個のｉＳｐＣ３スペーサーに連結され、その３’末端が４つのｉＳｐＣ３スペーサーに連結され、当該スペーサーは、配列番号１４の５’末端に連結され、当該配列番号１４の３’末端は、配列番号１７に連結され、当該ＤＮＡ構築体の配列番号１５領域は、配列番号１６（３’コレステロールテザーを有する）とハイブリダイズする。
【0194】
調製されたＤＮＡ構築体とＭｐｈ ＭＰ１－Ｅ１０５Ｃ／Ａ３６２Ｃを、２５℃の緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、４００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセリン、２ｍＭ ＤＴＴ）中で一緒に３０分間プレインキュベートする。
【0195】
電気的測定値は、１，２－ジエタノールアシル－グリセリン－３－コリンリン酸脂質二重分子層に埋め込まれたＭｓｐＡナノポアから取得される。Ｍｏｎｔａｌ－Ｍｕｅｌｌｅｒ技術により、ＰＴＦＥ膜上の直径約２５μｍの孔に二重分子層を形成し、二つの約１００μＬの緩衝溶液を分離する。全ての実験は、前記緩衝液中で行われる。デジタル変換器を備えた増幅器を用いて、単一チャネルの電流を測定する。Ａｇ／ＡｇＣｌ電極が前記緩衝液に連結され、シスコンパートメントは増幅器の接地端子に連結され、トランスコンパートメントは活性電極に連結される。
【0196】
前記二重分子層が単一ポアを実現した後、ＤＮＡポリヌクレオチド及びＰｉｆ１様ヘリカーゼを、電気生理学的チャンバーのシスコンパートメントの７０μＬ緩衝液に添加し、前記ナノポアでの酵素－ＤＮＡ複合体の捕捉を開始する。必要に応じて、前記シスコンパートメントに二価金属（５ｍＭ ＭｇＣｌ２）及びＮＴＰ（２．８６μＭ ＡＴＰ）を添加することにより、ヘリカーゼのＡＴＰ酵素活性を活性化する。実験は、＋１８０ｍＶの定電位で実施される。
【0197】
２ 結果及び検討
結果から、ＤＮＡ構築体におけるＰｉｆ１様ヘリカーゼにより制御されるＤＮＡ移動が観察され、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼにより制御されるＤＮＡ移動の結果は、図５に示す通りである。Ｐｉｆ１様ヘリカーゼにより制御されるＤＮＡ移動は５０秒であり、前記ナノポアを通過する１０ｋＢに近いＤＮＡ構築体の転座に対応する。ここで、図６は、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼにより制御されるＤＮＡ移動の部分領域の拡大図を示す。
結果から、ＤＮＡ構築体におけるＰｉｆ１様ヘリカーゼにより制御されるＤＮＡ移動が観察され、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼにより制御されるＤＮＡ移動の結果は、図５に示す通りである。Ｐｉｆ１様ヘリカーゼにより制御されるＤＮＡ移動は５０秒であり、前記ナノポアを通過する１０ｋＢに近いＤＮＡ構築体の転座に対応する。ここで、図６は、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼにより制御されるＤＮＡ移動の部分領域の拡大図を示す。
【0198】
実施例５
本実施例は、Ｓｐｈ ＣＢＨ８－Ａ９４Ｃ／Ａ３６１Ｃ／Ｃ１３６Ａ（Ａ９４Ｃ／Ａ３６１Ｃ／Ｃ１３６Ａ変異を有する配列番号５）及びＥｐｈ Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１４１Ａ（Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１４１Ａ変異を有する配列番号６）及びＰｐｈ ＰｓｐＹＺＵ０５－Ｄ１０４Ｃ／Ａ３７５Ｃ／Ｃ１４６Ａ（Ｄ１０４Ｃ／Ａ３７５Ｃ及びＣ１４６Ａ変異を有する配列番号８）を例として、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼが単一ＭｓｐＡナノポアを通過するＤＮＡ鎖全体をどのように制御するかを検証する。
本実施例は、Ｓｐｈ ＣＢＨ８－Ａ９４Ｃ／Ａ３６１Ｃ／Ｃ１３６Ａ（Ａ９４Ｃ／Ａ３６１Ｃ／Ｃ１３６Ａ変異を有する配列番号５）及びＥｐｈ Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１４１Ａ（Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１４１Ａ変異を有する配列番号６）及びＰｐｈ ＰｓｐＹＺＵ０５－Ｄ１０４Ｃ／Ａ３７５Ｃ／Ｃ１４６Ａ（Ｄ１０４Ｃ／Ａ３７５Ｃ及びＣ１４６Ａ変異を有する配列番号８）を例として、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼが単一ＭｓｐＡナノポアを通過するＤＮＡ鎖全体をどのように制御するかを検証する。
【0199】
１ 材料及び方法
図４に示すようなＤＮＡ構築体Ｂを調製する。配列番号１３は、その５’末端が２０個のｉＳｐＣ３スペーサーに連結され、その３’末端が４つのｉＳｐＣ３スペーサーに連結され、当該スペーサーは、配列番号１４の５’末端に連結され、当配列番号１４の３’末端は、配列番号２４に連結され、当該ＤＮＡ構築体の配列番号１５領域は、配列番号１６（３’コレステロールテザーを有する）とハイブリダイズする。当該ＤＮＡ構築体Ｂは、実施例４で用いられる構築体と類似し、相違とは、Ｅと標識される領域が配列番号２４に対応することである。
図４に示すようなＤＮＡ構築体Ｂを調製する。配列番号１３は、その５’末端が２０個のｉＳｐＣ３スペーサーに連結され、その３’末端が４つのｉＳｐＣ３スペーサーに連結され、当該スペーサーは、配列番号１４の５’末端に連結され、当配列番号１４の３’末端は、配列番号２４に連結され、当該ＤＮＡ構築体の配列番号１５領域は、配列番号１６（３’コレステロールテザーを有する）とハイブリダイズする。当該ＤＮＡ構築体Ｂは、実施例４で用いられる構築体と類似し、相違とは、Ｅと標識される領域が配列番号２４に対応することである。
【0200】
緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｌにおいて、１０ｍＭ ＴｒｉＳ ｐＨ７．５）中でのＤＮＡ構築体Ｂと緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０）中でのＳｐｈ ＣＢＨ８－Ａ９４Ｃ／Ａ３６１Ｃ／Ｃ１３６Ａ、Ｅｐｈ Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１４１Ａ又はＰｐｈ ＰｓｐＹＺＵ０５－Ｄ１０４Ｃ／Ａ３７５Ｃ／Ｃ１４６Ａとを、室温下で３０分間プレインキュベートする。次に、ＤＮＡ／酵素のプレ混合物にＴＭＡＤを添加し、さらに３０分間インキュベートする。最後に、前記プレ混合物に緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、６００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８．０、３ｍＭ ＭｇＣｌ２）及びＡＴＰを添加する。
【0201】
電気的測定値は、室温で、緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８．０）中でのブロック共重合体に挿入された単一ＭｓｐＡナノポアから取得される。単一ポアをブロック共重合体に挿入した後、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼ（Ｓｐｈ ＣＢＨ８－Ａ９４Ｃ／Ａ３６１Ｃ／Ｃ１３６Ａ、Ｅｐｈ Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１４１Ａ又はＰｐｈ ＰｓｐＹＺＵ０５－Ｄ１０４Ｃ／Ａ３７５Ｃ／Ｃ１４６Ａ（１ｎＭ 最終濃度））、ＤＮＡ（０．３ｎＭ 最終濃度）、燃料（ＡＴＰ、３ｍＭ 最終濃度）のプレ混合物を、単一ナノポア実験システムに添加する。各実験は、保持電位１８０ｍＶで２時間実施され、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼの制御によるＤＮＡの移動が監視される。
【0202】
２ 結果
ＤＮＡ構築体Ｂに対して、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼの制御によるＤＮＡの移動を観察し、そのＳｐｈ ＣＢＨ８－Ａ９４Ｃ／Ａ３６１Ｃ／Ｃ１３６Ａ、Ｅｐｈ Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１４１Ａ又はＰｐｈ ＰｓｐＹＺＵ０５－Ｄ１０４Ｃ／Ａ３７５Ｃ／Ｃ１４６Ａの制御によるＤＮＡの移動の結果は、それぞれ図７～９に示す通りである。
ＤＮＡ構築体Ｂに対して、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼの制御によるＤＮＡの移動を観察し、そのＳｐｈ ＣＢＨ８－Ａ９４Ｃ／Ａ３６１Ｃ／Ｃ１３６Ａ、Ｅｐｈ Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１４１Ａ又はＰｐｈ ＰｓｐＹＺＵ０５－Ｄ１０４Ｃ／Ａ３７５Ｃ／Ｃ１４６Ａの制御によるＤＮＡの移動の結果は、それぞれ図７～９に示す通りである。
【0203】
上記で本発明の好ましい実施態様を詳細に説明したが、本発明は上記実施態様における特定の詳細に限定されるものではない。本発明の技術的主旨の範囲内で、本発明の技術的解決手段に対して様々な簡単な変形を行うことができ、これらの簡単な変形はいずれも本発明の保護範囲内に属する。
【0204】
また、上記の具体的な実施態様に記述された各具体的な技術的特徴は、矛盾がない状況で任意の適切な方式で組み合わせることができることに留意されたい。不必要な説明を避けるために、本発明は、様々な可能な組み合わせ方式を説明しない。
【配列表フリーテキスト】
【0205】
配列番号１： Ｐｉｆ１様ヘリカーゼＰｂａ－ＰＭ２
配列番号２： Ｐｉｆ１様ヘリカーゼＡｐｈ－Ａｃｊ６１
配列番号３： Ｐｉｆ１様ヘリカーゼＡｐｈ－ＰＸ２９
配列番号４： Ｐｉｆ１様ヘリカーゼＡｖｉ－Ａｅｈ１
配列番号５： Ｐｉｆ１様ヘリカーゼＳｐｈ－ＣＢＨ８
配列番号６： Ｐｉｆ１様ヘリカーゼＥｐｈ－Ｐｅｉ２６
配列番号７： Ｐｉｆ１様ヘリカーゼＡｐｈ－ＡＭ１０１
配列番号８： Ｐｉｆ１様ヘリカーゼＰｐｈＰｓｐＹＺＵ０５
配列番号９： Ｐｉｆ１様ヘリカーゼＥｐｈ－ＥｃＳ１
配列番号１０： Ｐｉｆ１様ヘリカーゼＥｐｈ－Ｃｒｏｎｕｓ２
配列番号１１： Ｐｉｆ１様ヘリカーゼＭｐｈ－ＭＰ１
配列番号１２： 単一ＭｓｐＡナノポア
配列番号１３： 図４におけるＤＮＡ構築体Ａを調製するための配列（Ｂ）
配列番号１４： 図４におけるＤＮＡ構築体Ａを調製するための配列（Ｄ）
配列番号１５： 図４におけるＤＮＡ構築体Ａを調製するための配列（Ｆ）
配列番号１６： 図４におけるＤＮＡ構築体Ａを調製するための配列（Ｇ）
配列番号１７： 図４におけるＤＮＡ構築体Ａを調製するための配列（Ｅ）
配列番号１８： ＤＮＡ結合標的
配列番号２０： 蛍光基質鎖／主鎖上部ＢＨＱ－３’
配列番号２１： 蛍光基質鎖／ハイブリダイズした相補鎖５’ＦＡＭ
配列番号２２： 蛍光基質鎖／捕捉鎖
配列番号２３： 蛍光基質鎖／捕捉鎖Ａ
配列番号２４： 図４におけるＤＮＡ構築体Ｂを調製するための配列（Ｅ）
配列番号２５： 配列番号１に対応する塩基配列
配列番号２６： 配列番号２に対応する塩基配列
配列番号２７： 配列番号３に対応する塩基配列
配列番号２８： 配列番号４に対応する塩基配列
配列番号２９： 配列番号５に対応する塩基配列
配列番号３０： 配列番号６に対応する塩基配列
配列番号３１： 配列番号７に対応する塩基配列
配列番号３２： 配列番号８に対応する塩基配列
配列番号３３： 配列番号９に対応する塩基配列
配列番号３４： 配列番号１０に対応する塩基配列
配列番号３５： 配列番号１１に対応する塩基配列
配列番号２： Ｐｉｆ１様ヘリカーゼＡｐｈ－Ａｃｊ６１
配列番号３： Ｐｉｆ１様ヘリカーゼＡｐｈ－ＰＸ２９
配列番号４： Ｐｉｆ１様ヘリカーゼＡｖｉ－Ａｅｈ１
配列番号５： Ｐｉｆ１様ヘリカーゼＳｐｈ－ＣＢＨ８
配列番号６： Ｐｉｆ１様ヘリカーゼＥｐｈ－Ｐｅｉ２６
配列番号７： Ｐｉｆ１様ヘリカーゼＡｐｈ－ＡＭ１０１
配列番号８： Ｐｉｆ１様ヘリカーゼＰｐｈＰｓｐＹＺＵ０５
配列番号９： Ｐｉｆ１様ヘリカーゼＥｐｈ－ＥｃＳ１
配列番号１０： Ｐｉｆ１様ヘリカーゼＥｐｈ－Ｃｒｏｎｕｓ２
配列番号１１： Ｐｉｆ１様ヘリカーゼＭｐｈ－ＭＰ１
配列番号１２： 単一ＭｓｐＡナノポア
配列番号１３： 図４におけるＤＮＡ構築体Ａを調製するための配列（Ｂ）
配列番号１４： 図４におけるＤＮＡ構築体Ａを調製するための配列（Ｄ）
配列番号１５： 図４におけるＤＮＡ構築体Ａを調製するための配列（Ｆ）
配列番号１６： 図４におけるＤＮＡ構築体Ａを調製するための配列（Ｇ）
配列番号１７： 図４におけるＤＮＡ構築体Ａを調製するための配列（Ｅ）
配列番号１８： ＤＮＡ結合標的
配列番号２０： 蛍光基質鎖／主鎖上部ＢＨＱ－３’
配列番号２１： 蛍光基質鎖／ハイブリダイズした相補鎖５’ＦＡＭ
配列番号２２： 蛍光基質鎖／捕捉鎖
配列番号２３： 蛍光基質鎖／捕捉鎖Ａ
配列番号２４： 図４におけるＤＮＡ構築体Ｂを調製するための配列（Ｅ）
配列番号２５： 配列番号１に対応する塩基配列
配列番号２６： 配列番号２に対応する塩基配列
配列番号２７： 配列番号３に対応する塩基配列
配列番号２８： 配列番号４に対応する塩基配列
配列番号２９： 配列番号５に対応する塩基配列
配列番号３０： 配列番号６に対応する塩基配列
配列番号３１： 配列番号７に対応する塩基配列
配列番号３２： 配列番号８に対応する塩基配列
配列番号３３： 配列番号９に対応する塩基配列
配列番号３４： 配列番号１０に対応する塩基配列
配列番号３５： 配列番号１１に対応する塩基配列
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-08-26
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｐｉｆ１様ヘリカーゼであって、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼのタワードメイン、ピンドメイン及び／又は１Ａドメインへ導入された少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸を含み、
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を保持している、
ことを特徴とするＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項2】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、（ａ）配列番号１のバリアントであって、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメインのＥ２６４－Ｐ２７８及びＮ２９６－Ａ３９４、及び／又はピンドメインのＫ８９－Ｅ１０５、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ８８及びＭ１０６－Ｖ１８１に導入されている、配列番号１のバリアント、
（ｂ）配列番号２のバリアントであって、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメインのＥ２６５－Ｐ２７９及びＮ２９７－Ａ３９２、及び／又はピンドメインのＫ８９－Ｄ１０５、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ８８及びＩ１０６－Ｍ１８０に導入されている、配列番号２のバリアント、
（ｃ）配列番号３のバリアントであって、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメインのＴ２６６－Ｐ２８０及びＮ２９８－Ｓ４０３、及び／又はピンドメインのＫ８９－Ａ１０９、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ８８及びＫ１１０－Ｖ１８２に導入されている、配列番号３のバリアント、
（ｄ）配列番号４のバリアントであって、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメインのＴ２６６－Ｐ２８０及びＮ２９８－Ｓ４０４、及び／又はピンドメインのＫ８９－Ａ１０９、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ８８及びＫ１１０－Ｖ１８２に導入されている、配列番号４のバリアント、
（ｅ）配列番号５のバリアントであって、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメインのＥ２６０－Ｐ２７４及びＮ２９２－Ａ３９１、及び／又はピンドメインのＫ８６－Ｅ１０２、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ８４及びＭ１０３－Ｋ１７７に導入されている、配列番号５のバリアント、
（ｆ）配列番号６のバリアントであって、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメインのＥ２６６－Ｐ２８０及びＮ２９８－Ａ３９６、及び／又はピンドメインのＫ９１－Ｅ１０７、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ９０及びＭ１０８－Ｍ１８３に導入されている、配列番号６のバリアント、
（ｇ）配列番号７のバリアントであって、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメインのＴ２７６－Ｐ２９０及びＮ３０８－Ｐ４０２、及び／又はピンドメインのＫ１００－Ｄ１１６、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ９９及びＤ１１７－Ｍ１９１に導入されている、配列番号７のバリアント、
（ｈ）配列番号８のバリアントであって、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメインのＤ２７４－Ｐ２８８及びＮ３０６－Ａ４０４、及び／又はピンドメインのＫ９５－Ｅ１１２、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ９５及びＩ１１３－Ｋ１８７に導入されている、配列番号８のバリアント、
（ｉ）配列番号９のバリアントであって、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメインのＥ２６０－Ｐ２７４及びＮ２９２－Ａ３９１、及び／又はピンドメインのＫ８６－Ｅ１０２、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ８５及びＭ１０３－Ｋ１７７に導入されている、配列番号９のバリアント、
（ｊ）配列番号１０のバリアントであって、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメインのＥ２６５－Ｐ２７９及びＨ２９７－Ａ３９３、及び／又はピンドメインのＫ８８－Ｅ１０４、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ８７及びＩ１０５－Ｋ１８０に導入されている、配列番号１０のバリアント、又は、
（ｋ）配列番号１１のバリアントであって、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメインのＥ２６４－Ｐ２７８及びＮ２９６－Ｐ３８９、及び／又はピンドメインのＫ９７－Ａ１１３、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ９６及びＰ１１４－Ｋ１８４に導入されている、配列番号１１のバリアント
を含むことを特徴とする請求項１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項3】
前記ヘリカーゼは、（ａ）配列番号１１のバリアントであって、（ｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、（ｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＫ３６０Ｃ、（ｉｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、（ｉｖ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＱ３６３Ｃ、（ｖ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＫ３６６Ｃ、（ｖｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＭ３５６Ｃ、（ｖｉｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＫ３６０Ｃ、（ｖｉｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＭ３５６Ｃ、（ｉｘ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＱ３６３Ｃ、（ｘ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＫ３６６Ｃ、（ｘｉ）Ｆ１０８Ｃ及び／又はＭ３５６Ｃ、（ｘｉｉ）Ｆ１０８Ｃ及び／又はＫ３６０Ｃ、（ｘｉｉｉ）Ｆ１０８Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、（ｘｉｖ）Ｆ１０８Ｃ及び／又はＱ３６３Ｃ、（ｘｖ）Ｆ１０８Ｃ及び／又はＫ３６６Ｃ、（ｘｖｉ）Ｋ１３４Ｃ及び／又はＭ３５６Ｃ、（ｘｖｉｉ）Ｋ１３４Ｃ及び／又はＫ３６０Ｃ、（ｘｖｉｉｉ）Ｋ１３４Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、（ｘｉｘ）Ｋ１３４Ｃ及び／又はＱ３６３Ｃ、（ｘｘ）Ｋ１３４Ｃ及び／又はＫ３６６Ｃ、（ｘｘｉ）（ｉ）～（ｘｘ）のいずれか一つ及びＧ３５９Ｃ、（ｘｘｉｉ）（ｉ）～（ｘｘ）のいずれか一つ及びＱ１１１Ｃ、（ｘｘｉｉｉ）（ｉ）～（ｘｘ）のいずれか一つ及びＩ１３８Ｃ、（ｘｘｉｖ）（ｉ）～（ｘｘ）のいずれか一つ及びＱ１１１Ｃ及びＩ１３８Ｃ、（ｘｘｖ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＦ３７７Ｃ、（ｘｘｖｉ）Ｙ１０３Ｌ、Ｅ１０５Ｙ、Ｎ３５２Ｎ、Ａ３６２Ｃ及びＹ３６５Ｎ、（ｘｘｖｉｉ）Ｅ１０５Ｙ及びＡ３６２Ｃ、（ｘｘｖｉｉｉ）Ａ３６２Ｃ、（ｘｘｉｘ）Ｙ１０３Ｌ、Ｅ１０５Ｃ、Ｎ３５２Ｎ、Ａ３６２Ｙ及びＹ３６５Ｎ、（ｘｘｘ）Ｙ１０３Ｌ、Ｅ１０５Ｃ及びＡ３６２Ｙ、（ｘｘｘｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、及びＩ２８０Ａ、（ｘｘｘｉｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＬ３５８Ｃ、（ｘｘｘｉｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＧ３５９Ｃ、（ｘｘｘｉｖ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、（ｘｘｘｖ）Ｋ１０６Ｃ及び／又はＷ３７８Ｃ、（ｘｘｘｖｉ）Ｔ１０２Ｃ及び／又はＮ３８２Ｃ、（ｘｘｘｖｉｉ）Ｔ１０２Ｃ及び／又はＷ３７８Ｃ、（ｘｘｘｖｉｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＹ３５５Ｃ、（ｘｘｘｉｘ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＮ３８２Ｃ、（ｘｌ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＫ３８１Ｃ、（ｘｌｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＫ３７９Ｃ、（ｘｌｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＤ３７６Ｃ、（ｘｌｉｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＷ３７８Ｃ、（ｘｌｉｖ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＷ３７４Ｃ、（ｘｌｖ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＹ３５５Ｃ、（ｘｌｖｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＮ３８２Ｃ、（ｘｌｖｉｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＫ３８１Ｃ、（ｘｌｖｉｉｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＫ３７９Ｃ、（ｘｌｉｘ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＤ３７６Ｃ、（ｌ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＷ３７８Ｃ、（ｌｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＷ３７４Ｃ、（ｌｉｉ）Ｅ１０５Ｃ及びＡ３６２Ｙ、（ｌｉｉｉ）Ｅ１０５Ｃ、Ｇ３５９及びＡ３６２Ｃ、又は（ｌｉｖ）Ｉ２Ｃ、Ｅ１０５Ｃ及びＡ３６２Ｃを含む、配列番号１１のバリアント、又は、
（ｂ）配列番号１～１０のいずれか一つのバリアントであって、配列番号１１の（ｉ）～（ｌｉｖ）のいずれか一つで定義される位置に対応する位置にシステイン残基を含む、配列番号１～１０のいずれか一つのバリアント
を含むことを特徴とする請求項２に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項4】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼのアミノ酸配列は、配列番号１～１１に示されるアミノ酸配列であるか、又は、配列番号１～１１に示されるアミノ酸配列と少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．９％の相同性を有し、且つ、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有することを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項5】
導入されたシステイン同士が互いに連結される、導入された非天然アミノ酸同士が互いに連結される、導入されたシステインと非天然アミノ酸とが互いに連結される、導入されたシステインと天然アミノ酸とが互いに連結される、又は導入された非天然アミノ酸と天然アミノ酸とが互いに連結されることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項6】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、少なくとも一つ又は複数のシステインの置換をさらに含む、及び／又は、アラニン、セリン又はバリンによるシステインの置換をさらに含む、ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項7】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、（ａ）配列番号５のバリアントであって、一つ又は複数の置換された天然システイン残基がＣ１０９、Ｃ１１４、Ｃ１３６又はＣ４１４のうちの一つ又は複数である、配列番号５のバリアント、又は、
（ｂ）配列番号１、２、３、４、６、７、８、９、１０及び１１のいずれか一つのバリアントであって、一つ又は複数の置換された天然システイン残基が配列番号５のＣ１０９、Ｃ１１４、Ｃ１３６又はＣ４１４のうちの一つ又は複数に対応する、配列番号１、２、３、４、６、７、８、９、１０及び１１のいずれか一つのバリアント
を含むことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項8】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、表面が負に帯電したアミノ酸、極性又は非極性アミノ酸の置換又は修飾をさらに含み、前記置換は、正に帯電したアミノ酸、非荷電アミノ酸による負に帯電したアミノ酸、非荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸、極性又は非極性アミノ酸の置換を含むことを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項9】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、ａ）配列番号１１のバリアントであって、一つ又は複数の負に帯電したアミノ酸がＤ５、Ｅ９、Ｅ２４、Ｅ８７、Ｉ６５、Ｓ５８、Ｄ２０９又はＤ２１６のうちの一つ又は複数である、配列番号１１のバリアント、又は、
ｂ）配列番号１～１０のいずれか一つのバリアントであって、一つ又は複数の負に帯電したアミノ酸が配列番号１１のＤ５、Ｅ９、Ｅ２４、Ｅ８７、Ｉ６５、Ｓ５８、Ｄ２０９又はＤ２１６のうちの一つ又は複数に対応する、配列番号１～１０のいずれか一つのバリアント
を含むことを特徴とする請求項８に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項10】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、ａ）配列番号１のバリアントであって、前記一つ又は複数の負に帯電したアミノ酸がＳ１７１をさらに含む、配列番号１のバリアント、又は、
ｂ）配列番号９のバリアントであって、前記一つ又は複数の負に帯電したアミノ酸がＳ１７３をさらに含む、配列番号９のバリアント
を含むことを特徴とする請求項９に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項11】
前記非天然アミノ酸は、４－アジド－Ｌ－フェニルアラニン（Ｆａｚ）、４－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、３－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、４－アセトアセチル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｏ－アリル－Ｌ－チロシン、３－（フェニルセレニル）－Ｌ－アラニン、Ｏ－２－プロピン－１－イル－Ｌ－チロシン、４－（ジヒドロキシボリル）－Ｌ－フェニルアラニン、４－［（エチルスルファニル）カルボニル］－Ｌ－フェニルアラニン、（２Ｓ）－２－アミノ－３－｛４－［（プロパン－２－イルスルファニル）カルボニル］フェニル｝プロピオン酸、（２Ｓ）－２－アミノ－３－｛４－［（２－アミノ－３－スルファニルプロパノイル）アミノ］フェニル｝プロピオン酸、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、４－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、４－シアノ－Ｌ－フェニルアラニン、３－シアノ－Ｌ－フェニルアラニン、４－フルオロ－Ｌ－フェニルアラニン、４－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、４－ブロモ－Ｌ－フェニルアラニン、Ｏ－（トリフルオロメチル）チロシン、４－ニトロ－Ｌ－フェニルアラニン、３－ヒドロキシ－Ｌ－チロシン、３－アミノ－Ｌ－チロシン、３－ヨード－Ｌ－チロシン、４－イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、３－（２－ナフチル）－Ｌ－アラニン、４－フェニル－Ｌ－フェニルアラニン、（２Ｓ）－２－アミノ－３－（ナフタレン－２－イルアミノ）プロピオン酸、６－（メチルスルファニル）ノルロイシン、６－オキシ－Ｌ－リジン、Ｄ－チロシン、（２Ｒ）－２－ヒドロキシ－３－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、（２Ｒ）－２－アミノオクタン酸エステル－３－（２，２’－ビピリジル－５－イル）－Ｄ－アラニン、２－アミノ－３－（８－ヒドロキシ－３－キノリル）プロピオン酸、４－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｓ－（２－ニトロベンジル）システイン、（２Ｒ）－２－アミノ－３－［（２－ニトロベンジル）スルファニル］プロピオン酸、（２Ｓ）－２－アミノ－３－［（２－ニトロベンジル）オキシ］プロピオン酸、Ｏ－（４，５－ジメトキシ－２－ニトロベンジル）－Ｌ－セリン、（２Ｓ）－２－アミノ－６－（｛［（２－ニトロベンジル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｏ－（２－ニトロベンジル）－Ｌ－チロシン、２－ニトロフェニルアラニン、４－［（Ｅ）－フェニルジアゼニル］－Ｌ－フェニルアラニン、４－［３－（トリフルオロメチル）－３Ｈ－ジアジリジニル－３イル］－Ｄ－フェニルアラニン、２－アミノ－３－［［５－（ジメチルアミノ）－１－ナフチル］スルホニルアミノ］プロピオン酸、（２Ｓ）－２－アミノ－４－（７－ヒドロキシ－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）ブタン酸、（２Ｓ）－３－［（６－アセチルナフタレン－２－イル）アミノ］－２－アミノプロピオン酸、４－（カルボキシメチル）フェニルアラニン、３－ニトロ－Ｌ－チロシン、Ｏ－チオ－Ｌ－チロシン、（２Ｒ）－６－アセチルアミノ－２－アミノカプロン酸エステル、１－メチルヒスチジン、２－アミノノナン酸、２－アミノデカン酸、Ｌ－ホモシステイン、５－スルファニル－ノルバリン、６－スルファニル－Ｌ－ノルロイシン、５－（メチルスルファニル）－Ｌ－ノルバリン、Ｎ６－｛［（２Ｒ，３Ｒ）－３－メチル－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピロール－２－イル］カルボニル｝－Ｌ－リジン、Ｎ６－［（ベンジルオキシ）カルボニル］リジン、（２Ｓ）－２－アミノ－６－［（シクロペンチルカルボニル）アミノ］ヘキサン酸、Ｎ６－［（シクロペンチルオキシ）カルボニル］－Ｌ－リジン、（２Ｓ）－２－アミノ－６－｛［（２Ｒ）－テトラヒドロフラン－２－イルカルボニル］アミノ｝ヘキサン酸、（２Ｓ）－２－アミノ－８－［（２Ｒ，３Ｓ）－３－エチニルテトラヒドロフラン－２－イル］－８－オキシオクタン酸、Ｎ６－（ｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－リジン、（２Ｓ）－２－ヒドロキシ－６－（｛［（２－メチル－２－プロパンイル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｎ６－［（アリルオキシ）カルボニル］リジン、（２Ｓ）－２－アミノ－６－（｛［（２－アジドベンジル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｎ６－Ｌ－プロピル－Ｌ－リジン、（２Ｓ）－２－アミノ－６－｛［（プロプ－２－イン－１－イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸又はＮ６－［（２－アジドエトキシ）カルボニル］－Ｌ－リジンから選択されることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項12】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、（ａ）一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又複数のヌクレオチドと相互作用する少なくとも一つのアミノ酸の置換、及び／又は、
（ｂ）膜貫通ポアと相互作用する少なくとも一つのアミノ酸の置換
をさらに含み、
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する、
ことを特徴とする請求項１乃至１１のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項13】
（ａ）において、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの糖及び／又は塩基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸が、より大きな側鎖を含むアミノ酸で置換される、ことを特徴とする請求項１２に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項14】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、（ａ）配列番号１１のバリアントであって、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの糖及び／又は塩基と相互作用する前記少なくとも一つのアミノ酸が、Ｐ７３、Ｈ９３、Ｎ９９、Ｆ１０９、Ｉ２８０、Ａ１６１、Ｆ１３０、Ｄ１３２、Ｄ１６２、Ｄ１６３、Ｅ２７７、Ｋ４１５、Ｑ２９１、Ｈ３９６、Ｙ２４４又はＰ１００のうちの少なくとも一つである、配列番号１１のバリアント、又は、
（ｂ）配列番号１～１０のいずれか一つのバリアントであって、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの糖及び／又は塩基と相互作用する前記少なくとも一つのアミノ酸が、配列番号１１のＰ７３、Ｈ９３、Ｎ９９、Ｆ１０９、Ｉ２８０、Ａ１６１、Ｆ１３０、Ｄ１３２、Ｄ１６２、Ｄ１６３、Ｅ２７７、Ｋ４１５、Ｑ２９１、Ｈ３９６、Ｙ２４４又はＰ１００のうちの少なくとも一つに対応する、配列番号１～１０のいずれか一つのバリアント
を含むことを特徴とする請求項１３に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項15】
前記より大きな側鎖が、増加した数の炭素原子を含む、増加した長さを有する、増加した分子体積を有する、及び／又は増加したファンデルワールス体積を有することを特徴とする請求項１３又は１４に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項16】
前記より大きな側鎖が、前記少なくとも一つのアミノ酸と前記一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドとの間の（ｉ）静電相互作用、（ｉｉ）水素結合及び／又は（ｉｉｉ）カチオン-π相互作用を増加させることを特徴とする請求項１３乃至１５のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項17】
前記より大きな側鎖のアミノ酸が、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、グリシン（Ｇ）、セレノシステイン（Ｕ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）ではないことを特徴とする請求項１３乃至１６のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項18】
Ａ）ヒスチジン（Ｈ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）又はアスパラギン（Ｎ）、又は、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）で置換され、Ｂ）アスパラギン（Ｎ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）又はヒスチジン（Ｈ）、又は、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）で置換され、
Ｃ）プロリン（Ｐ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）又はトリプトファン（Ｗ）、又は、（ｉｖ）ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）又はイソロイシン（Ｉ）で置換され、
Ｄ）フェニルアラニン（Ｆ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）ヒスチジン（Ｈ）、又は、（ｉｉｉ）チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）で置換され、
Ｅ）アスパラギン酸（Ｄ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）又はヒスチジン（Ｈ）、又は、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）で置換され、
Ｆ）バリン（Ｖ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）、又は、（ｉｖ）イソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）で置換され、
Ｇ）セリン（Ｓ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）、又は、（ｉｖ）イソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）で置換され、及び／又は、
Ｈ）チロシン（Ｙ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、又は、（ｉｉ）トリプトファン（Ｗ）で置換される
ことを特徴とする請求項１２乃至１７のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項19】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号１１のバリアントであり、及び、Ｐ７３Ｌ、Ｐ７３Ｖ、Ｐ７３Ｉ、Ｐ７３Ｅ、Ｐ７３Ｔ、Ｐ７３Ｆ、Ｈ９３Ｎ、Ｈ９３Ｑ、Ｈ９３Ｗ、Ｎ９９Ｒ、Ｎ９９Ｈ、Ｎ９９Ｗ、Ｎ９９Ｙ、Ｐ１００Ｌ、Ｐ１００Ｖ、Ｐ１００Ｉ、Ｐ１００Ｅ、Ｐ１００Ｔ、Ｐ１００Ｆ、Ｆ１３０Ｗ、Ｆ１３０Ｙ、Ｆ１３０Ｈ、Ｄ１３２Ｈ、Ｄ１３２Ｙ、Ｄ１３２Ｋ、Ａ１６１Ｉ、Ａ１６１Ｌ、Ａ１６１Ｎ、Ａ１６１Ｗ、Ａ１６１Ｈ、Ｄ１６２Ｈ、Ｄ１６２Ｙ、Ｄ１６２Ｋ、Ｄ１６３Ｗ、Ｄ１６３Ｆ、Ｄ１６３Ｙ、Ｄ１６３Ｈ、Ｄ１６３Ｉ、Ｄ１６３Ｌ、Ｄ１６３Ｖ、Ｙ２４４Ｗ、Ｙ２４４Ｈ、Ｅ２７７Ｇ、Ｉ２８０Ｈ、Ｉ２８０Ｋ、Ｉ２８０Ｗ、Ｑ２９１Ｋ、Ｑ２９１Ｒ、Ｑ２９１Ｗ、Ｑ２９１Ｆ、Ｈ３９６Ｎ、Ｈ３９６Ｑ、Ｈ３９６Ｗ、Ｋ４１５Ｗ、Ｋ４１５Ｒ、Ｋ４１５Ｈ、Ｋ４１５Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｖ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｉ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｅ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｔ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｆ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ９３Ｎ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ９３Ｑ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ９３Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｒ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｖ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｉ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｅ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｔ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｆ、Ｆ１０９Ｗ／Ｆ１３０Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｆ１３０Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｆ１３０Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｉ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｎ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６２Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６２Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６２Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｆ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｉ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｖ、Ｆ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ２７７Ｇ、Ｆ１０９Ｗ／Ｉ２８０Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｉ２８０Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｉ２８０Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｑ２９１Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｑ２９１Ｒ、Ｆ１０９Ｗ／Ｑ２９１Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｑ２９１Ｆ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｎ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｑ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｋ４１５Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｋ４１５Ｒ、Ｆ１０９Ｗ／Ｋ４１５Ｈ、又はＦ１０９Ｗ／Ｋ４１５Ｙを含む
ことを特徴とする請求項１２乃至１８のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項20】
（ａ）において、一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの一つ又は複数のリン酸基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸が置換されることを特徴とする請求項１２乃至１９のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項21】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、（ａ）配列番号１１のバリアントであって、ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの一つ又は複数のリン酸基と相互作用する前記少なくとも一つのアミノ酸が、Ｈ７５、Ｔ９１、Ｓ９４、Ｋ９７、Ｎ２４６、Ｎ２４７、Ｎ２８４、Ｋ２８８、Ｎ２９７、Ｔ３９４又はＫ３９７のうちの少なくとも一つである、配列番号１１のバリアント、又は、
（ｂ）配列番号１～１０のいずれか一つのバリアントであって、ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの一つ又は複数のリン酸基と相互作用する前記少なくとも一つのアミノ酸が、配列番号１１のＨ７５、Ｔ９１、Ｓ９４、Ｋ９７、Ｎ２４６、Ｎ２４７、Ｎ２８４、Ｋ２８８、Ｎ２９７、Ｔ３９４又はＫ３９７に対応する少なくとも一つのアミノ酸である、配列番号１～１０のいずれか一つのバリアント
を含むことを特徴とする請求項２０に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項22】
ａ）ヒスチジン（Ｈ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）又はスレオニン（Ｔ）、又は、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）又はチロシン（Ｙ）で置換される、ｂ）スレオニン（Ｔ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）又はヒスチジン（Ｈ）、又は、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）又はヒスチジン（Ｈ）で置換される、
ｃ）セリンが、（ｉ）アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）又はヒスチジン（Ｈ）、又は、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）又はヒスチジン（Ｈ）で置換される、
ｄ）アスパラギン（Ｎ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）又はヒスチジン（Ｈ）、又は、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）又はヒスチジン（Ｈ）で置換される、及び／又は、
ｅ）リジン（Ｋ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）又はヒスチジン（Ｈ）、又は、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）又はヒスチジン（Ｈ）で置換される
ことを特徴とする請求項２１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項23】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号１１のバリアントであり、（ａ）Ｈ７５Ｎ、Ｈ７５Ｑ、Ｈ７５Ｋ又はＨ７５Ｆ、
（ｂ）Ｔ９１Ｋ、Ｔ９１Ｑ又はＴ９１Ｎ、
（ｃ）Ｓ９４Ｈ、Ｓ９４Ｎ、Ｓ９４Ｋ、Ｓ９４Ｔ、Ｓ９４Ｒ又はＳ９４Ｑ、
（ｄ）Ｋ９７Ｑ、Ｋ９７Ｈ又はＫ９７Ｙ、
（ｅ）Ｎ２４６Ｈ又はＮ２４６Ｑ、
（ｆ）Ｎ２４７Ｑ又はＮ２４７Ｈ、
（ｇ）Ｎ２８４Ｈ又はＮ２８４Ｑ、
（ｈ）Ｋ２８８Ｑ又はＫ２８８Ｈ、
（ｉ）Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｋ又はＮ２９７Ｈ、
（ｊ）Ｔ３９４Ｋ、Ｔ３９４Ｈ又はＴ３９４Ｎ、若しくは、
（ｋ）Ｋ３９７Ｒ、Ｋ３９７Ｈ又はＫ３９７Ｙ
のうちの一つ又は複数を含むことを特徴とする請求項２０乃至２２のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項24】
前記ヘリカーゼは、膜貫通ポアと相互作用する少なくとも一つのアミノ酸の置換を含み、（ａ）配列番号１１のバリアントにおいて、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼが、（ａ）Ｅ１９６（ｂ）Ｗ２０２（ｃ）Ｎ１９９又は（ｄ）Ｇ２０１上の一つ又は複数の置換を含む、又は、
（ｂ）配列番号１～１０のいずれか一つのバリアントにおいて、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼが、（ａ）Ｅ１９６（ｂ）Ｗ２０２（ｃ）Ｎ１９９又は（ｄ）Ｇ２０１に対応する少なくとも一つの置換を含む
ことを特徴とする請求項１２乃至２３のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項25】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号１１のバリアントであり、及び、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｈ７５Ｎ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｈ７５Ｑ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｈ７５Ｋ、又はＦ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｈ７５Ｆを含む、Ｆ１０９／Ｅ１９６／Ｈ７５、
Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｔ９１Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｔ９１Ｑ、又はＦ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｔ９１Ｎを含む、Ｆ１０９／Ｅ１９６／Ｔ９１、
Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｔ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｒ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｑ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｎ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｋ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｓ９４／Ｅ１９６、
Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｒ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｙ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｎ９９／Ｅ１９６、
Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｈ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｋを含む、Ｆ１０９／Ｓ９４／Ｅ１９６／Ｉ２８０、
Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｌ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｖ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｉ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｔ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｐ１００／Ｅ１９６、
Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｋ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｄ１３２／Ｅ１９６、
Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｉ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｌ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｎ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｈ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ａ１６１／Ｅ１９６、
Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｆ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｉ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｌ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｖ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｄ１６３／Ｅ１９６、
Ｆ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｈ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｙ２４４／Ｅ１９６、
Ｆ１０９Ｗ／Ｎ２４６Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｎ２４６Ｑ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｎ２４６／Ｅ１９６、
Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｗ、又はＦ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｒを含む、Ｆ１０９／Ｅ１９６／Ｉ２８０、
Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｑ２９１Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｑ２９１Ｒ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｑ２９１Ｗ、又はＦ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｑ２９１Ｆを含む、Ｆ１０９／Ｅ１９６／Ｑ２９１、
Ｆ１０９Ｗ／Ｎ２９７Ｑ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ２９７Ｋ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｎ２９７Ｈ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｎ２９７／Ｅ１９６、
Ｆ１０９Ｗ／Ｔ３９４Ｋ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｔ３９４Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｔ３９４Ｎ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｔ３９４／Ｅ１９６、
Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｆ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｑ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｋ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｈ３９６／Ｅ１９６、
Ｆ１０９Ｗ／Ｋ３９７Ｒ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｋ３９７Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｋ３９７Ｙ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｋ３９７／Ｅ１９６、又は、
Ｆ１０９Ｗ／Ｙ４１６Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｙ４１６Ｒ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｙ４１６／Ｅ１９６ の位置での置換を含むことを特徴とする請求項１乃至２４のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項26】
請求項１乃至２５のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼを少なくとも一つ含むことを特徴とする、構築体。
【請求項27】
前記構築体は、ポリヌクレオチド結合部をさらに含むことを特徴とする請求項２６に記載の構築体。
【請求項28】
請求項１乃至２５のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ、又は請求項２６又は２７に記載の構築体をコードすることを特徴とする、核酸。
【請求項29】
請求項２８に記載の核酸を含むことを特徴とする、発現ベクター。
【請求項30】
請求項２８に記載の核酸、又は請求項２９に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする、宿主細胞。
【請求項31】
ポリヌクレオチドの移動を制御する方法であって、請求項１乃至２５のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ、又は請求項２６又は２７に記載の構築体を、ポリヌクレオチドに接触させること
含むことを特徴とするポリヌクレオチドの移動を制御する方法。
【請求項32】
標的ポリヌクレオチドを特徴づける方法であって、Ｉ）請求項１乃至２５のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ、又は請求項２６又は２７に記載の構築体を、標的ポリヌクレオチド及びポアと接触させて、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼ又は構築体がポアを通過する標的ポリヌクレオチドの移動を制御するようにすること、及び、
ＩＩ）標的ポリヌクレオチドのヌクレオチドと前記ポアが相互作用する時の一つ又は複数の特徴を取得して、前記標的ポリヌクレオチドを特徴づけること
を含むことを特徴とする方法。
【請求項33】
前記方法は、前記ヘリカーゼ又は構築体、及び標的ポリヌクレオチドと接触するポアにまたがって電位差を印加する工程をさらに含み、前記ポアが、生物学的ポア、固体状ポア、又は生物学的ポアと固体状ポアのハイブリッドポアから選択されることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記標的ポリヌクレオチドが、一本鎖、二本鎖、又は少なくとも一部が二本鎖であることを特徴とする請求項３２又は３３に記載の方法。
【請求項35】
前記一つ又は複数の特徴は、標的ポリヌクレオチドの由来、長さ、同一性、配列、二次構造、又は標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否かから選択され、及び／又は、前記一つ又は複数の特徴は、電気的測定及び／又は光学的測定によって行われることを特徴とする請求項３２乃至３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
標的ポリヌクレオチドを特徴づける製品であって、請求項１乃至２５のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ、請求項２６又は２７に記載の構築体、請求項２８に記載の核酸、請求項２９に記載の発現ベクター、又は請求項３０に記載の宿主細胞、及び、
ポア
を含むことを特徴とする製品。
【請求項37】
前記製品は、キット、装置、又はセンサから選択されることを特徴とする請求項３６に記載の製品。
【請求項38】
標的ポリヌクレオチドの特徴づけ又はポアを通過する標的ポリヌクレオチドの移動に対する制御における、請求項１乃至２５のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ、請求項２６又は２７に記載の構築体、請求項２８に記載の核酸、請求項２９に記載の発現ベクター、請求項３０に記載の宿主細胞、又は請求項３６又は３７に記載の製品の使用。
【国際調査報告】