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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-13
(54)【発明の名称】改変免疫細胞とその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20230406BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20230406BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230406BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230406BHJP
C12N 15/861 20060101ALI20230406BHJP
C12N 15/863 20060101ALI20230406BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20230406BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20230406BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20230406BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230406BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20230406BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20230406BHJP
A61K 35/15 20150101ALI20230406BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230406BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20230406BHJP
A61K 35/761 20150101ALI20230406BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20230406BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20230406BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230406BHJP
C12N 15/24 20060101ALN20230406BHJP
C12N 15/26 20060101ALN20230406BHJP
A61K 38/17 20060101ALN20230406BHJP
A61K 38/20 20060101ALN20230406BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z ZNA
C12N15/13
C12N15/12
C12N15/63 Z
C12N15/861 Z
C12N15/863 Z
C12N15/867 Z
C12N15/864 100Z
C12N15/86 Z
C12N5/10
C12N5/0783
A61K35/17
A61K35/15
A61K48/00
A61K35/76
A61K35/761
A61P31/00
A61P37/02
A61P35/00
C12N15/24
C12N15/26
A61K38/17
A61K38/20
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022552469
(86)(22)【出願日】2021-05-24
(85)【翻訳文提出日】2022-08-31
(86)【国際出願番号】 CN2021095556
(87)【国際公開番号】W WO2021238877
(87)【国際公開日】2021-12-02
(31)【優先権主張番号】202010460730.5
(32)【優先日】2020-05-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202010550754.X
(32)【優先日】2020-06-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522329098
【氏名又は名称】南京北恒生物科技有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110000497
【氏名又は名称】弁理士法人グランダム特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】▲シン▼芸
(72)【発明者】
【氏名】閻忠輝
(72)【発明者】
【氏名】熊瑛
(72)【発明者】
【氏名】浦容容
(72)【発明者】
【氏名】任江涛
(72)【発明者】
【氏名】賀小宏
(72)【発明者】
【氏名】王延賓
(72)【発明者】
【氏名】韓露
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA94X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C084AA02
4C084AA07
4C084AA13
4C084BA44
4C084DA12
4C084DA14
4C084NA14
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB37
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZB07
4C087ZB26
4C087ZB32
(57)【要約】
改変免疫細胞は、（ｉ）リガンドを特異的に認識する細胞表面分子、（ｉｉ）外因の性インターロイキン、及び（ｉｉｉ）外因性のＦｌｔ３Ｌ、ＸＣＬ２及び／又はＸＣＬ１遺伝子を、発現する。さらに、治療がん、感染症又は自己免疫疾患の治療における、変免疫細胞の使用を提供する。従来の改変免疫細胞と比較して、腫瘍を殺傷する活性が顕著に向上した。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ｉ）リガンドを特異的に認識する細胞表面分子、（ｉｉ）外因性のインターロイキン、及び（ｉｉｉ）外因性のＦｌｔ３Ｌ、ＸＣＬ２及び／又はＸＣＬ１遺伝子を、発現する改変免疫細胞。
【請求項2】
前記リガンドを特異的に認識する細胞表面分子は、キメラ抗原受容体又はＴ細胞受容体である、請求項１に記載の改変免疫細胞。
【請求項3】
前記リガンドを特異的に認識する細胞表面分子は、リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体である、請求項２に記載の改変免疫細胞。
【請求項4】
前記インターロイキンは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、そのサブユニット、その組み合わせ、又はそのサブユニットの組み合わせである、請求項１～３のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
【請求項5】
前記Ｆｌｔ３Ｌ遺伝子は、配列番号３５又は３７に示される核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し、または、前記Ｆｌｔ３Ｌ遺伝子によってコードされるポリペプチドは、配列番号３６又は３８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
【請求項6】
前記インターロイキンのコード遺伝子は、配列番号２３、２７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９に示される核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し、または、前記インターロイキンは、配列番号２４、２８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項４に記載の改変免疫細胞。
【請求項7】
前記ＸＣＬ１遺伝子は、配列番号２５又は２９に示される核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し、または、前記ＸＣＬ１遺伝子によってコードされるポリペプチドは、配列番号２６又は３０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
【請求項8】
前記ＸＣＬ２遺伝子は、配列番号６７に示される核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し、または、前記ＸＣＬ２遺伝子によってコードされるポリペプチドは、配列番号６８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
【請求項9】
前記免疫細胞は、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単核細胞、ＮＫ細胞、又はＮＫＴ細胞から選択されるものである、請求項１～８のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
【請求項10】
前記Ｔ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、腫瘍浸潤細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、γδ－Ｔ細胞又はαβ－Ｔ細胞である、請求項９に記載の改変免疫細胞。
【請求項11】
前記リガンド結合ドメインは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、単一ドメイン抗体、ナノ抗体、抗原結合リガンド、組換えフィブロネクチンドメイン、ａｎｔｉｃａｌｉｎ、及びＤＡＲＰＩＮから選択するものである、請求項３～１０のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
【請求項12】
前記リガンド結合ドメインは、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ－ｌ ｌＲａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、ＡＦＰ、Ｆｏｌａｔｅ受容体α、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＣＳ１、ＣＤ１３８、ＮＣＡＭ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、Ｐｒｏｓｔａｓｅ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌｏｏ、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、Ｆｕｃｏｓｙｌ ＧＭｌ、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、Ｆｏｌａｔｅ受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ １７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ Ａｌ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、前立腺特異的タンパク質、サバイビン及びテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－ｌ／Ｇａｌｅｃｔｉｎ ８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ １、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ １、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸のカルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＴＧＦβ、ＡＰＲＩＬ、ＮＫＧ２Ｄ、及びそれらの任意の組み合わせから選択される標的に結合する、請求項３に記載の改変免疫細胞。
【請求項13】
前記膜貫通ドメインは、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ζサブユニット、ＣＤ３εサブユニット、ＣＤ３γサブユニット、ＣＤ３δサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４のタンパク質の膜貫通ドメインから選択されるものである、請求項３～１２のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
【請求項14】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄのタンパク質のシグナル伝達ドメインから選択されるものである、請求項３～１３のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
【請求項15】
前記共刺激ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１８（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＬＡＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＰＤ－１、ＬＩＧＨＴ、ＴＲＩＭ、ＺＡＰ７０、及びそれらの組み合わせのタンパク質の共刺激シグナルである伝達ドメインから選択される１つ又は複数である、請求項３～１４のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
【請求項16】
免疫細胞が、ＣＤ５２、ＧＲ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ２４７ζ、ＨＬＡ－Ｉ、ＨＬＡ－ＩＩ、Ｂ２Ｍ、ＰＤ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、及びＴＩＭ３から選択される少なくとも１つの不活性化遺伝子をさらに含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
【請求項17】
前記インターロイキン、Ｆｌｔ３Ｌ、ＸＣＬ２及び／又はＸＣＬ１遺伝子の発現は、条件付き発現である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
【請求項18】
前記インターロイキン、Ｆｌｔ３Ｌ、ＸＣＬ２及び／又はＸＣＬ１遺伝子は、条件付きで発現するように、誘導性、阻害性、又は組織特異的プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１７に記載の改変免疫細胞。
【請求項19】
前記インターロイキン、Ｆｌｔ３Ｌ、ＸＣＬ２及び／又はＸＣＬ１遺伝子は、局在化ドメインに作動可能に連結されている、請求項１～１８のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
【請求項20】
（ｉ）リガンドを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸配列、（ｉｉ）インターロイキンをコードする核酸配列、及び（ｉｉｉ）Ｆｌｔ３Ｌ、ＸＣＬ２及び／又はＸＣＬ１をコードする核酸配列、を含む核酸分子。
【請求項21】
前記リガンドを特異的に認識する細胞表面分子は、キメラ抗原受容体である、請求項２０に記載の核酸分子。
【請求項22】
前記インターロイキンは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、そのサブユニット、その組み合わせ、又はそのサブユニットの組み合わせである、請求項２０に記載の核酸分子。
【請求項23】
請求項２０～２２のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項24】
前記ベクターは、プラスミド、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ポリオーマウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から選択されるものである、請求項２３に記載のベクター。
【請求項25】
請求項１～１９のいずれか一項に記載の改変免疫細胞、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の核酸分子又は請求項２３～２４のいずれか一項に記載のベクターを含む、キット。
【請求項26】
請求項１～１９のいずれか一項に記載の改変免疫細胞、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の核酸分子又は請求項２３～２４のいずれか一項に記載のベクター、及び様々な製薬上許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項27】
（ａ）リガンドを特異的に認識する細胞表面分子をコードする第１の核酸配列又はそれがコードするリガンドを特異的に認識する細胞表面分子、（ｂ）インターロイキンをコードする第２の核酸配列又はそれがコードするインターロイキン、及び（ｃ）Ｆｌｔ３Ｌ、ＸＣＬ２及び／又はＸＣＬ１をコードする第３の核酸配列又はそれがコードするＦｌｔ３Ｌ、ＸＣＬ２及び／又はＸＣＬ１タンパク質を、免疫細胞に導入することを含む改変免疫細胞を調製する方法。
【請求項28】
前記リガンドを特異的に認識する細胞表面分子は、キメラ抗原受容体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記インターロイキンは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、そのサブユニット、その組み合わせ、又はそのサブユニットの組み合わせである、請求項２７に記載の方法。
【請求項30】
前記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、任意の順で免疫細胞に連続的に導入される、請求項２７に記載の方法。
【請求項31】
前記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、同時に免疫細胞に導入される、請求項２７に記載の方法。
【請求項32】
がん、感染症又は自己免疫疾患を治療するための医薬の調製における、請求項１～１９のいずれか一項に記載の改変免疫細胞、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項２３～２４のいずれか一項に記載のベクター、請求項２５に記載のキット又は請求項２６に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、免疫療法の分野に属し、より具体的には、本発明は、（ｉ）リガンドを特異的に認識する細胞表面分子、（ｉｉ）外因性インターロイキン、及び（ｉｉｉ）外因性Ｆｌｔ３Ｌ、ＸＣＬ２及び／又はＸＣＬ１遺伝子を発現する改変免疫細胞に関する。より好ましくは、前記リガンドを特異的に認識する細胞表面分子は、キメラ抗原受容体である。
【背景技術】
【0002】
腫瘍免疫療法は、主にヒトの免疫系と腫瘍の微小環境の調節によって、最終的に主に自己の免疫を利用して腫瘍細胞を殺傷する方法である。免疫系は、体で全体として形成されたものであり、自然免疫も腫瘍免疫において非常に重要な役割を果たす。
【0003】
樹状細胞及びマクロファージなどの一部の抗原提示細胞は、自然免疫と獲得免疫の間の架け橋である。抗原提示細胞は、腫瘍抗原を認識して獲得免疫系に提示し、腫瘍特異的Ｔ細胞を活性化して、腫瘍を殺傷することができる。したがって、抗原提示を強化することによって免疫系の腫瘍殺傷効果を強化することは、腫瘍免疫の重要な研究の方向である。
【0004】
ＣＡＲ細胞療法は、重要な腫瘍細胞免疫療法である。ＣＡＲ細胞による腫瘍制御は、通常、免疫系の活性化、ＣＡＲ細胞の活性化と拡大、活性化ＣＡＲ細胞による腫瘍組織への浸潤、腫瘍細胞の殺傷のように行われる。しかし、現在のＣＡＲ細胞療法には、腫瘍の微小環境がＣＡＲ細胞を抑制し、ＣＡＲ細胞が腫瘍組織に浸潤することができない問題がある。したがって、ＣＡＲ細胞に対する腫瘍微小環境の阻害を低減し、ＣＡＲ細胞の生存期間を向上させること、又は他の免疫細胞を動員してＣＡＲ細胞との相乗効果を果たすことは、ＣＡＲ細胞の治療効果を改善するために非常に重要である。
【0005】
従来、インターロイキンＩＬ－７とケモカインＣＣＬ－１９は、内因性樹状細胞を腫瘍組織に動員することにより、腫瘍反応性内因性Ｔ細胞を活性化し、メモリーＴ細胞へ分化し、これにより、従来のＴＣＲ－Ｔ細胞（ＣＮ１０９１５３９８９Ａを参照）又はＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性（Ａｄａｃｈｉ，Ｋ． ，Ｋａｎｏ，Ｙ． ，Ｎａｇａｉ，Ｔ． ｅｔ ａｌ． ＩＬ－７ ａｎｄ ＣＣＬ１９ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ＣＡＲ－Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ＣＡＲ－Ｔ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３６，３４６－３５１（２０１８））を促進することが開示された。
【0006】
従来の１型樹状細胞（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＤＣ１、ｃＤＣ１）は、腫瘍抗原を提示する主要な免疫細胞である樹状細胞のサブセットでである。研究により、ｃＤＣ１が腫瘍関連抗原、特に壊死性細胞関連抗原を効果的に提示し、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を効果的に誘導できるので、ｉｎｖｉｖｏでの腫瘍殺傷に対して非常に重要な役割を果たすことを見出した。マウスとヒトの研究により、腫瘍微小環境におけるｃＤＣ１の分布は、抗腫瘍免疫応答と正の相関関係があり、腫瘍関連免疫の重要な評価パラメーターであることを見出した。ｃＤＣ１は、マウスとヒトではあまり分布しておらず、腫瘍免疫応答率が低いマウスとヒトの腫瘍微小環境ではほとんどない。したがって、腫瘍治療におけるｃＤＣ１の役割を最適化することは、腫瘍免疫療法の効果を改善する重要な研究の方向である。
【0007】
ＣＣＬ－１９は、樹状細胞と内因性Ｔ細胞を腫瘍に動員する能力を持つが、ｃＤＣ１樹状細胞を動員する能力は限られているため、ｃＤＣ１樹状細胞を効果的に分化又は動員して、腫瘍抗原提示の効率を高め、体内の養子免疫応答を誘導し、腫瘍の不均一性の問題を解決し、ＣＡＲ細胞治療の効果を向上させる新な免疫療法が必要である。
【発明の概要】
【0008】
第１の局面において、本発明は、（ｉ）リガンドを特異的に認識する細胞表面分子、（ｉｉ）外因性のインターロイキン、及び（ｉｉｉ）外因性のＦｌｔ３Ｌ、ＸＣＬ２及び／又はＸＣＬ１遺伝子を、発現する新規の改変免疫細胞を提供する。
【0009】
一実施形態において、前記リガンドを特異的に認識する細胞表面分子は、キメラ抗原受容体又はＴ細胞受容体であり、好ましくは、キメラ抗原受容体である。
【0010】
一実施形態において、前記インターロイキンは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、そのサブユニット、その組み合わせ、又はそのサブユニットの組み合わせであり、好ましくはＩＬ－７である。
【0011】
一実施形態において、前記インターロイキン、Ｆｌｔ３Ｌ、ＸＣＬ２又はＸＣＬ１タンパク質は、タンパク質分解に耐性のある融合タンパク質或いは変異体である。
【0012】
一実施形態において、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単核細胞、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞から選択されるものである。好ましくは、前記Ｔ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、腫瘍浸潤細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、γδ－Ｔ細胞又はαβ－Ｔ細胞である。
【0013】
一実施形態において、前記リガンドを特異的に認識する細胞表面分子は、リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体である。ここで、リガンド結合ドメインは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、単一ドメイン抗体、ナノ抗体、抗原結合リガンド、組換えフィブロネクチンドメイン、ａｎｔｉｃａｌｉｎ、及びＤＡＲＰＩＮから選択するものである。好ましくは、前記リガンド結合ドメインは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、単一ドメイン抗体、及びナノ抗体から選択されるものである。
【0014】
一実施形態において、前記リガンドを特異的に認識する細胞表面分子は、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ－ｌ ｌＲａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、ＡＦＰ、Ｆｏｌａｔｅ受容体α、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＣＳ１、ＣＤ１３８、ＮＣＡＭ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、Ｐｒｏｓｔａｓｅ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌｏｏ、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、Ｆｕｃｏｓｙｌ ＧＭｌ、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、Ｆｏｌａｔｅ受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ １７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ Ａｌ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、前立腺特異的タンパク質、サバイビン及びテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－ｌ／Ｇａｌｅｃｔｉｎ ８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ １、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ １、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸のカルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＴＧＦβ、ＡＰＲＩＬ、ＮＫＧ２Ｄ、及びそれらの任意の組合せから選択される標的に結合する。好ましくは、前記標的は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＭＵＣ１、ＡＦＰ、Ｆｏｌａｔｅ受容体α、ＣＥＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、ＩＬ１３Ｒａ２、ＧＤ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＳ１、ＢＣＭＡ、メソテリン、及びそれらの任意の組み合わせから選択されるものである。
【0015】
一実施形態において、前記膜貫通ドメインは、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ζサブユニット、ＣＤ３εサブユニット、ＣＤ３γサブユニット、ＣＤ３δサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４のタンパク質の膜貫通ドメインから選択されるものである。好ましくは、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８及びＣＤ２７８の膜貫通ドメインから選択されるものである。
【0016】
一実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄのタンパク質のシグナル伝達ドメインから選択されるものである。好ましくは、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζを含むシグナル伝達ドメインである。
【0017】
一実施形態において、前記共刺激ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１８（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＬＡＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＰＤ－１、ＬＩＧＨＴ、ＴＲＩＭ、ＺＡＰ７０、及びそれらの組み合わせのタンパク質の共刺激シグナルである伝達ドメインから選択される１つ又は複数である。好ましくは、前記共刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、又はＣＤ２７８の共刺激シグナル伝達ドメイン又はそれらの組み合わせである。
【0018】
一実施形態において、外因性のインターロイキン、Ｆｌｔ３Ｌ、ＸＣＬ２及び／又はＸＣＬ１の発現又は活性は、恒常発現である。他の実施形態において、外因性のインターロイキン、Ｆｌｔ３Ｌ、ＸＣＬ２及び／又はＸＣＬ１の発現又は活性は、条件付き発現である。例えば、条件付き発現は、外因性遺伝子を誘導性、阻害性、又は組織特異的プロモーターに作動可能に結合することによって達成される。
【0019】
一実施形態において、インターロイキン、Ｆｌｔ３Ｌ、ＸＣＬ２及び／又はＸＣＬ１は、局在化ドメインに作動可能に連結され得る。前記局在化ドメインは、例えば小胞体、ゴルジ体、核などの細胞膜、細胞質内の特定オルガネラのような特定の細胞位置で、本発明の外因性遺伝子を局在化して発現させることができる。局在化ドメインは、核局在化シグナル、ガイドペプチド、膜貫通ドメインなどを含むが、これらに限定されない。一実施形態において、本発明の外因性遺伝子インターロイキン、Ｆｌｔ３Ｌ、ＸＣＬ２及び／又はＸＣＬ１は、膜貫通ドメインに作動可能に連結され、これによって、改変免疫細胞の表面に固定され、発現することができる。
【0020】
第２の局面において、本発明提は、（ｉ）リガンドを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸配列、（ｉｉ）インターロイキンをコードする核酸配列、及び（ｉｉｉ）Ｆｌｔ３Ｌ、ＸＣＬ２及び／又はＸＣＬ１をコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する。好ましくは、前記リガンドを特異的に認識する細胞表面分子は、キメラ抗原受容体又はＴ細胞受容体であり、より好ましくはキメラ抗原受容体である。好ましくは、前記インターロイキンは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、そのサブユニット、その組み合わせ、又はそのサブユニットの組み合わせであり、より好ましくはＩＬ－７、そのサブユニット又はその組み合わせである。好ましくは、前記核酸は、ＤＮＡ、又はＲＮＡである。
【0021】
本発明は、さらに上記核酸分子を含むベクターを提供する。具体的には、前記ベクターは、プラスミド、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ポリオーマウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から選択されるものである。いくつかの実施形態において、該ベクターは、さらに、免疫細胞における自律複製の起点、選択マーカー、制限酵素切断部位、プロモーター、ポリアデニル化テール（ｐｏｌｙＡ）、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、エンハンサー、ターミネーター、インシュレーター、オペロン、選択マーカー、レポーター遺伝子、ターゲティング配列及び／又はタンパク質精製タグなどのエレメントを含む。特定の実施形態において、前記ベクターは、インビトロで転写されたベクターである。
【0022】
一実施形態において、本発明は、さらに本発明に記載の改変免疫細胞、核酸分子又はベクターを含むキットを提供する。
【0023】
一実施形態において、本発明は、さらに改変免疫細胞、本発明の核酸分子又はベクター、及び様々な薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【0024】
第３の局面において、本発明は、さらに、（ａ）リガンドを特異的に認識する細胞表面分子をコードする第１の核酸配列又はそれがコードするリガンドを特異的に認識する細胞表面分子、（ｂ）インターロイキンをコードする第２の核酸配列又はそれがコードするインターロイキン、（ｃ）ＸＣＬ１、ＸＣＬ２及び／又はＦｌｔ３Ｌをコードする第３の核酸配列又はそれがコードするＸＣＬ１、ＸＣＬ２及び／又はＦｌｔ３Ｌタンパク質を、免疫細胞に導入することを含む改変免疫細胞を調製する方法を提供する。好ましくは、前記リガンドを特異的に認識する細胞表面分子は、キメラ抗原受容体又は嵌合Ｔ細胞受容体であり、より好ましくはキメラ抗原受容体である。好ましくは、前記インターロイキンは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、そのサブユニット、その組み合わせ、又はそのサブユニットの組み合わせであり、より好ましくは、ＩＬ－７、そのサブユニット又はそのサブユニットの組み合わせである。
【0025】
一実施形態において、上記の成分（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、任意の順で免疫細胞に連続的に導入され得る。他の実施形態において、上記の成分（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、例えば、１つ又は複数のベクターに（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）をクローニングすることによって、免疫細胞に同時に導入することができる。
【0026】
第４の局面において、本発明は、さらに、本発明による有効量の免疫細胞、核酸分子、ベクター又は医薬組成物を被験者に投与することで、がん、感染症又は自己免疫疾患に罹患している被験者を治療する方法を提供する。
【0027】
一実施形態において、前記がんは、固形腫瘍又は血液腫瘍である。より具体的には、前記がんは、脳神経膠腫、芽細胞腫、肉腫、白血病、基底細胞がん、胆道がん、膀胱がん、骨肉腫、脳がん及びＣＮＳがん、乳がん、腹膜がん、子宮頸がん、絨毛がん、結腸癌及び直腸がん、結合組織がん、消化器系のがん、子宮内膜がん、食道がん、眼がん、頭頸部がん、胃がん、神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ）、肝臓がん、肝細胞腫瘍、上皮内腫瘍、腎臓がん、喉頭がん、肝臓腫瘍、肺がん、リンパ腫、メラノーマ、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸がん、呼吸器系のがん、唾液腺がん、皮膚がん、扁平細胞がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮又は子宮内膜がん、泌尿器系の悪性腫瘍、外陰がん及びその他のがんと肉腫、ならびにＢ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、エイズ関連リンパ腫、及びＷａｌｄｅｎｓｔｒｏｍマクログロブリン血症、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ性白血病、形質細胞様樹状細胞腫、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、悪性リンパ増殖性疾患、ＭＡＬＴリンパ腫、有毛細胞白血病、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、脊髄異形成症、形質芽球性リンパ腫、前白血病、形質細胞様樹状細胞腫瘍、及び移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）から選択されるものである。
【0028】
一実施形態において、前記感染症は、ウイルス、細菌、真菌、及び寄生虫によって引き起こされる感染症を含むが、これらに限定されない。
【0029】
一実施形態において、前記自己免疫疾患は、Ｉ型糖尿病、腹腔疾患、グレーブス病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、アジソン病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、重力筋無力症、血管炎症、悪性貧血、及び全身性エリテマトーデスなどを含むが、これらに限定されない。
【0030】
本発明の改変免疫細胞の利点は、共発現されたインターロイキン及びＦｌｔ３Ｌ、ＸＣＬ２及び／又はＸＣＬ１が、腫瘍部位でのＤＣ細胞の分化又は動員を効果的に促進し、ＤＣ細胞の数を増加させ、改変免疫細胞の増殖及び生存時間を増加することができる。これによって、改変免疫細胞に対する腫瘍微小環境の阻害効果を低減し、改変免疫細胞の腫瘍殺傷能力を改善するできるとともに、増加したＤＣ細胞のにより、体内Ｔ細胞の養子免疫応答を活性化し、人工免疫細胞との相乗効果をもたらし、最終的に腫瘍抑制を強化することができる。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【発明を実施するための形態】
【0032】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての科学的及び技術的用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【0033】
リガンドを特異的に認識する細胞表面分子
本明細書において、「リガンドを特異的に認識する細胞表面分子」という用語は、標的分子（例えば、リガンド）に特異的に結合することができる細胞の表面上に発現される分子を指す。このような表面分子は、通常、リガンドを特異的に結合可能なリガンド結合ドメイン、表面分子を細胞表面に固定する膜貫通ドメイン、及びシグナル伝達に関与する細胞内ドメインを含む。このような表面分子の例には、例えば、Ｔ細胞受容体又はキメラ抗原受容体が含まれる。
本明細書において、「リガンドを特異的に認識する細胞表面分子」という用語は、標的分子（例えば、リガンド）に特異的に結合することができる細胞の表面上に発現される分子を指す。このような表面分子は、通常、リガンドを特異的に結合可能なリガンド結合ドメイン、表面分子を細胞表面に固定する膜貫通ドメイン、及びシグナル伝達に関与する細胞内ドメインを含む。このような表面分子の例には、例えば、Ｔ細胞受容体又はキメラ抗原受容体が含まれる。
【0034】
本明細書において、「Ｔ細胞受容体」又は「ＴＣＲ」という用語は、抗原提示に応答し、Ｔ細胞活性化に関与する膜タンパク質複合体を指す。ＴＣＲの刺激は、抗原提示細胞上の主要組織適合遺伝子複合体分子（ＭＨＣ）によって引き起こされる。前記抗原提示細胞は、抗原ペプチドをＴ細胞に提示し、ＴＣＲ複合体に結合して、一連の細胞内シグナル伝達を誘導する。ＴＣＲは、それぞれヘテロダイマーを形成する６つのペプチド鎖で構成されており、通常、αβ型とγδ型に分ける。各ペプチド鎖は、定常領域及び可変領域を含み、可変領域は、特定の抗原及びＭＨＣ分子への特異性の結合に関与している。ＴＣＲの可変領域は、リガンド結合ドメインを含むか、又はリガンド結合ドメインと改変可能に連結され得る。そのうち、リガンド結合ドメインは、以下のように定義される。
【0035】
本明細書において、「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」は、通常、リガンド結合ドメイン（例えば、抗体の抗原結合部分）、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインをそれぞれ含む人工的に構築されたハイブリッドポリペプチドを指し、各ドメインがリンカーによって接続されている。ＣＡＲは、モノクローナル抗体の抗原結合特性を利用して、Ｔ細胞及びその他の免疫細胞の特異性と反応性を、ＭＨＣ非拘束的な方法で選択された標的に再方向付けする能力を有する。ＭＨＣ非拘束性の抗原認識は、ＣＡＲ細胞に、抗原プロセッシングとは無関係に抗原を認識することで、腫瘍回避の主要なメカニズムをバイパスする能力を与える。また、ＣＡＲは、Ｔ細胞内で発現すると、有利には内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のα鎖及びβ鎖と二量体化しない。
【0036】
本明細書において、「リガンド結合ドメイン」は、リガンド（例えば、抗原）に結合することができる任意の構造又はその機能的変異体を指す。リガンド結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ抗体、及びそれらの機能的フラグメントを含む抗体構造であり得るが、これらに限定されない。例えば、リガンド結合ドメインは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖抗体（Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｒａｇｍｅｎｔ、ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（Ｓｉｎｇｌｅ Ｄｏｍａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｓｄＡｂ）、ナノ抗体（Ｎａｎｏｂｏｄｙ、Ｎｂ）、抗原結合リガンド、組換えフィブロネクチンドメイン、ａｎｔｉｃａｌｉｎ、及びＤＡＲＰＩＮなどを含むが、これらに限定されない。好ましくは、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、及びナノ抗体から選択される。本発明において、リガンド結合ドメインは、一価又は二価であり得、そして単一特異性、二重特異性又は多重特異性抗体であり得る。他の実施形態において、リガンド結合ドメインは、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＴＧＦβ、ＡＰＲＩＬ、及びＮＫＧ２Ｄなどの特定のタンパク質の特異的結合ポリペプチド又は受容体構造であり得る。
【0037】
「Ｆａｂ」は、免疫グロブリン分子がパパインで切断されてなる２つの同一のフラグメントのいずれかを指し、ジスルフィド結合しているインタクトな軽鎖及び重鎖のＮ末端部分からなり、重鎖のＮ末端部分は、重鎖可変領域とＣＨ１を含む。インタクトなＩｇＧと比較して、Ｆａｂは、Ｆｃフラグメントを含まず、移動度と組織浸透性が高く、抗体のエフェクター機能を媒介することなく抗原に一価で結合できる。
【0038】
「単鎖抗体」又は「ｓｃＦｖ」は、リンカーで繋がれた抗体重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）から構成される抗体である。リンカーの最適な長さ及び／又はアミノ酸組成を選択することが可能である。リンカーの長さは、ｓｃＦｖの可変領域の折りたたみ方と相互作用のし方に大きく影響し得る。実際、短いリンカーが用いられる場合（例えば、５－１０アミノ酸の間）、鎖内の折り畳みが防ぐことができる。リンカーのサイズと構成の選択については、例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒｅｔ ａｌ．，１９９３Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４－６４４８；米国特許出願公開第２００５／０１００５４３、２００５／０１７５６０６、２００７／００１４７９４、並びにＰＣＴ出願公開ＷＯ２００６／０２０２５８及びＷＯ２００７／０２４７１５を参照されたい。それらは、参照することによって本明細書に組み込まれる。ｓｃＦｖは、任意の順序で繋がれたＶＨ、及びＶＬ、例えば、ＶＨ－リンカー－ＶＬ、又はＶＬ－リンカー－ＶＨを含む。
【0039】
「シグナルドメイン抗体」又は「ｓｄＡｂ」は、１つの重鎖可変領域（ＶＨＨ）と２つの従来のＣＨ２及びＣＨ３領域のみを含む、天然で軽鎖を欠く抗体を指し、「重鎖抗体」とも呼ばれる。
【0040】
「ナノボディ」又は「Ｎｂ」は、元の重鎖抗体と同じの構造安定性及び抗原結合活性を有し、個別にクローン化され及び発現されたＶＨＨ構造を指し、標的抗原に結合可能なものとして知られている最小の単位である。
【0041】
「機能的バリアント」又は「機能的フラグメント」は、親のアミノ酸配列を実質的に含み、また親のアミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾（即ち、置換、欠失又は挿入）を含む変異体を指し、変異体が親のアミノ酸配列の生物学的活性を保持していることを条件とする。一実施形態において、前記アミノ酸修飾は、好ましくは保存的修飾である。
【0042】
本明細書で使用される「保存的修飾」は、アミノ酸配列を含む抗体又は抗体フラグメントの結合特徴に顕著な影響を与えないか、または変更しないアミノ酸修飾を指す。これらの保存的修飾は、アミノ酸置換、追加、及び欠失を含む。修飾は、部位特異的変異誘発及びＰＣＲ媒介変異誘発などの当分野で公知の標準的な技術によって、本発明のキメラ抗原受容体に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野で定義されている。アミノ酸残基のファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β－分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有する。保存的修飾は、例えば、極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び／又は関与する残基の両親媒性の性質の類似性に基づいて選択することができる。
【0043】
したがって、「機能的バリアント」又は「機能的フラグメント」は、親のアミノ酸配列と少なくとも７５％同一であり、好ましくは、少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有し、親のアミノ酸の生物学的活性、例えば、結合活性を保持する。
【0044】
本明細書で使用される「配列同一性」は、２つの（ヌクレオチド又はアミノ酸）配列がアラインメントの同じ位置に同一の残基を有する程度を指し、通常、パーセンテージとして表される。好ましくは、同一性は、比較される配列の全長にわたって決定される。したがって、まったく同じである配列の２つのコピーは、１００％同一性を有する。当業者は、配列の同一性の決定のため、例えばＢｌａｓｔ（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）、Ｂｌａｓｔ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０）、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７）、及びＣｌｕｓｔａｌＷなどのいくつかのアルゴリズムを、標準的なパラメータを使用して利用可能であることを認識しているであろう。
【0045】
リガンド結合ドメインは、特定の病患状態に関する標的細胞上の細胞表面マーカー、例えば、腫瘍特異的抗原又は腫瘍関連抗原を識別して選択され得る。したがって、一実施形態において、本発明のリガンド結合ドメインは、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ－ｌ ｌＲａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、Ｆｏｌａｔｅ受容体α、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、Ｐｒｏｓｔａｓｅ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌＯＯ、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、Ｆｕｃｏｓｙｌ ＧＭｌ、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、Ｆｏｌａｔｅ受容体 β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ １７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ Ａｌ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、前立腺特異的タンパク質、サバイビン及びテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－ｌ／Ｇａｌｅｃｔｉｎ ８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ １、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ １、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸のカルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＴＧＦβ、ＡＰＲＩＬ、ＮＫＧ２Ｄ、及びそれらの任意の組み合わせから選択される１つまたは複数の標的に結合する。好ましくは、前記標的は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＡＰ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＣＡＩＸ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＧＰＣ３、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、ＮＫＧ２Ｄ、及びそれらの任意の組み合わせから選択される。本発明のＣＡＲは、標的とされる抗原に応じて、その抗原に対する特異的なリガンド結合ドメインを含むように設計することができる。例えば、ＣＤ１９が標的となる抗原である場合、ＣＤ１９抗体を本発明のリガンド結合ドメインとして使用することができる。好ましい実施形態において、本発明ＣＡＲは、ＣＤ１９ ｓｃＦｖを含み、ＣＤ１９ ｓｃＦｖが、配列番号２の１－１０７位又は配列番号１４の１－１０７位に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域配列及び配列番号２の１２３－２４２位又は配列番号１４の１２３－２３８位に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域配列を含む。
【0046】
本明細書で使用される「膜貫通ドメイン」は、免疫細胞（例えば、リンパ球、ＮＫ細胞、又はＮＫＴ細胞）の表面でキメラ抗原受容体を発現可能にし、標的細胞に対する免疫細胞の細胞応答を導くポリペプチド構造を指す。膜貫通ドメインは、天然又は合成で得られ、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来し得る。膜貫通ドメインは、キメラ抗原受容体が標的抗原に結合するときにシグナル伝達することができる。とても適する本発明の膜貫通ドメインは、例えば、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ζサブユニット、ＣＤ３εサブユニット、ＣＤ３γサブユニット、ＣＤ３δサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４とその機能的フラグメントに由来し得る。または、膜貫通ドメインは、合成で得られるものであり、ロイシン及びバリンなどの疎水性残基を主に含み得る。好ましくは、前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８α鎖に由来し、配列番号４又は１６に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。または、前記ＣＤ８α膜貫通ドメインのコード配列は、配列番号３又は１５に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。
【0047】
一実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体は、さらに、リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとの間のヒンジ領域を含み得る。本明細書で使用される「ヒンジ領域」、膜貫通ドメインをリガンド結合ドメインに連結するように機能する任意のオリゴペプチド又はポリペプチドを指す。具体的には、ヒンジ領域は、リガンド結合ドメインへより大きな柔軟性とアクセス性を提供するためのものである。ヒンジ領域は、最大３００アミノ酸を含み得る。好ましくは、１０～１００アミノ酸を含み、最も好ましくは、２５～５０アミノ酸を含む。ヒンジ領域は、全体又は一部が天然分子に由来し得、例えば、全体又は一部がＣＤ８、ＣＤ４又はＣＤ２８の細胞外領域に由来し、又は全体又は一部が抗体定常領域に由来し得る。または、ヒンジ領域は、天然に存在するヒンジ配列に対応する合成配列であるか、又は完全に合成されたヒンジ配列であってもよい。好ましい実施形態において、ヒンジ領域は、ＣＤ８α鎖、ＦｃγＲＩＩＩα受容体、ＩｇＧ４又はＩｇＧ１のヒンジ領域部分を含む。より好ましくは、ＣＤ８αヒンジであり、それは、配列番号１２又は２２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、または、ＣＤ８αヒンジのコード配列は、配列番号１１又は２１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。
【0048】
本明細書で使用される「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特定な機能を実行するように指示する、タンパク質の部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、リガンド結合ドメインでの抗原結合後の細胞内の一次シグナル伝達に関与することで、免疫細胞の活性化と免疫応答をもたらす。言い換えれば、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを発現している免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つを活性化する役割を果たす。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性又はヘルパー活性であり得る。
【0049】
一実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体に含まれる細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞受容体及び補助受容体の細胞質配列であり得る。それらは、抗原受容体結合に一緒に作用して、一次シグナル伝達、ならびにこれらの配列の任意の誘導体又は変異体、及び同じ又は類似の機能的を有する任意の合成配列を開始する。細胞内シグナル伝達ドメインは、多数の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｍｏｔｉｆｓ，ＩＴＡＭ）を含み得る。本発明の細胞内シグナル伝達ドメインの非限定的な例は、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するものが含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、本発明のＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。このシグナル伝達ドメインは、配列番号８又は２０に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。或いはそのコード配列は、配列番号７又は１９に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。
【0050】
一実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体は、１つ又は複数の共刺激ドメインを含む。共刺激ドメインは、共刺激分子の細胞内部分全体を含む共刺激分子からの細胞内機能的シグナル伝達ドメイン、又はその機能的フラグメントであり得る。「共刺激分子」は、Ｔ細胞上の共刺激リガンドに特異的に結合し、それによってＴ細胞の共刺激応答（例えば、増殖）を媒介する同族の結合パートナーを指す。共刺激分子には、ＭＨＣクラス１分子、ＢＴＬＡ、及びＴｏｌｌリガンド受容体が含まれるが、これらに限定されない。本発明の共刺激ドメインの非限定的な例には、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１８（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＬＡＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＰＤ－１、ＬＩＧＨＴ、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０のタンパク質に由来する共刺激シグナル伝達ドメインが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明のＣＡＲの共刺激ドメインは、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０又はそれらの組み合わせに由来する。一実施形態において、本発明のＣＡＲに含まれる共刺激ドメインは、配列番号６又は１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。または、該共刺激ドメインのコード配列は、配列番号５又は１７に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。
【0051】
一実施形態において、本発明のＣＡＲは、Ｔ細胞などの細胞で発現する場合、新生タンパク質を小胞体へ輸送し、さらに細胞表面に輸送できるように、シグナルペプチドをさらに含む。シグナルペプチドのコアは、単一のα－ヘリックスを形成する傾向がある疎水性アミノ酸の長いセグメントを含みえる。シグナルペプチドの末端には、通常、シグナルペプチダーゼによって認識及び切断されるアミノ酸のセグメントがある。シグナルペプチダーゼは、転座中又は転座後に切断され、遊離シグナルペプチド及び成熟タンパク質が生成される。そして、遊離シグナルペプチドは、特定のプロテアーゼによって消化される。本発明に用いられるシグナルペプチドは、例えば、ＣＤ８α、ＩｇＧ１、ＧＭ－ＣＳＦＲαなどに由来する、当業者であれば周知のものである。一実施形態において、本発明に用いられるシグナルペプチドは、配列番号１０又は３４に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。または、該シグナルペプチド的コード配列は、配列番号９又は３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。
【0052】
一実施形態において、本発明のＣＡＲは、ＣＡＲの発現時間を調節するためのスイッチ構造をさらに含む。例えば、スイッチ構造は、ダイマー化ドメインの形をとることができ、それと対応するリガンドに結合することによってコンフォメーション変化を誘発し、細胞外結合ドメインを露出させて標的抗原に結合させ、それによってシグナル伝達経路を活性化する。または、スイッチドメインを使用して、それぞれ結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインと接続してもよく、スイッチドメインが互いに結合する場合だけ（例えば、誘導化合物の存在下で）、結合ドメインとシグナル伝達ドメインとがダイマーによって連結され、シグナル伝達経路を活性化することができる。スイッチ構造は、マスキングペプチドの形態であり得る。マスキングペプチドは、細胞外結合ドメインをマスクして、標的抗原への結合を阻止することができ、マスキングペプチドが、例えばプロテアーゼによって切断されると、細胞外結合ドメインが露出され、「通常」のＣＡＲ構造となることができる。当業者に知られている各種のスイッチ構造も本発明に使用することができる。
【0053】
一実施形態において、本発明のＣＡＲは、自殺遺伝子を含み得、即ち、外因性物質によって誘導され得る細胞死シグナルを発現させ、必要な場合（例えば、重度の毒性副作用が発生した場合）に、ＣＡＲ細胞を除去する。例えば、自殺遺伝子は、ＣＤ２０エピトープ、ＲＱＲ８などの挿入されたエピトープの形をとることができ、必要に応じて、これらのエピトープを標的とする抗体または試薬を加えることによりＣＡＲ細胞を排除することができる。自殺遺伝子は単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）であってもよく、この遺伝子により、ガンシクロビル治療によって誘発されて細胞死を引き起こすことが可能である。自殺遺伝子はｉＣａｓｐａｓｅ－９であってもよく、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７などの化学誘導薬によってダイマー化するように誘導して、下流のＣａｓｐａｓｅ３分子を活性化してアポトーシスを引き起こすことが可能である。当業者に知られている各種の自殺遺伝子を本発明に使用することができる。
【0054】
一実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、（ａ）４－１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン、（ｂ）ＣＤ２７共刺激ドメイン及びＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン、（ｃ）ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン、（ｄ）ＯＸ４０共刺激ドメイン及びＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン、（ｅ）ＣＤ２８共刺激ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン、（ｆ）ＯＸ４０共刺激ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン、または（ｇ）ＣＤ２８共刺激ドメイン、ＯＸ４０共刺激ドメイン及びＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【0055】
インターロイキン
インターロイキンは、白血球によって産生され、白血球間で機能するサイトカインの一種であり、情報の伝達と、免疫細胞の活性化および調節と、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化、増殖、分化の媒介と、炎症反応において重要な役割を果たす。インターロイキンの生物学的効果は、通常、対応する受容体への結合によって達成され、例えば、ＩＬ－７の生物学的特性は、ＩＬ－７の受容体ＩＬ－７Ｒへの結合によって達成される。
インターロイキンは、白血球によって産生され、白血球間で機能するサイトカインの一種であり、情報の伝達と、免疫細胞の活性化および調節と、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化、増殖、分化の媒介と、炎症反応において重要な役割を果たす。インターロイキンの生物学的効果は、通常、対応する受容体への結合によって達成され、例えば、ＩＬ－７の生物学的特性は、ＩＬ－７の受容体ＩＬ－７Ｒへの結合によって達成される。
【0056】
一実施形態において、本発明に用いられるインターロイキンは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、それらのサブユニット、それらの組み合わせ、又はサブユニットの組み合わせを含むが、これらに限定されない。ＩＬ－２は、主にＴ細胞によって産生され、オートクリン及びパラクリンにより役割を果たす。ＩＬ－２は、Ｔ細胞の増殖を維持し、サイトカインの産生を促進するだけでなく、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞傷害性を発揮させることができる。また、ＩＬ－２は、ＮＫ細胞の増殖を刺激し、ＮＫ殺傷活性を増強し、ＮＫ細胞からのＩＦＮγ、ＴＮＦβ、ＴＧＦβなどの因子の産生を促進し、マクロファージを活性化し、マクロファージの抗原提示能力と標的細胞殺傷能力を高めることができる。ＩＬ－７は、主に骨髄と胸腺間質細胞によって産生され、その主な機能として、前駆Ｂ細胞の成長を促進することと、末梢Ｔ細胞のアポトーシスを抑え、細胞増殖と持続的生存を誘導することと、樹状細胞とマクロファージの発達と機能に影響を与え、マクロファージに様々なサイトカインを分泌させることとを含む。ＩＬ－１２は、主にＴ細胞とＮＫ細胞に作用する。具体的には、ＩＬ－１２は、活性化Ｔ細胞の増殖を刺激し、Ｔｈ０細胞からＴｈ１細胞への分化を促進すると、ＣＴＬ及びＮＫ細胞の細胞傷害性活性を誘導してＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＧＭＣＳＦなどのサイトカインの分泌を促進すると、ＮＫ細胞とＩＬ－２Ｒα、ＴＮＦ受容体、ＣＤ５６の発現を促進し、腫瘍細胞に対するＡＤＣＣ効果を高めるという役割を果たすことができる。ＩＬ－１５は、活性化マクロファージ、表皮細胞、線維芽細胞などの様々な細胞で産生される。ＩＬ－１５の分子構造は、ＩＬ－２と類似しているため、ＩＬ－２Ｒのβ鎖とγ鎖を使用して標的細胞に結合し、ＩＬ－２と同様の生物学的活性を発揮することができる。例えば、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増殖を刺激し、Ｂ細胞のの増殖と分化を誘導することができる。ＩＬ－２１は、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔｆｈ細胞、Ｔｈ１７細胞によって産生され、ＩＬ－２及びＩＬ－１５と高い相同性を示す。ＩＬ－２１は、幅広い免疫調節機能を持っており、ＩＬ－２１を活性化すると、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を促進し、ＮＫ細胞の細胞傷害性活性を高め、Ｂ細胞の増殖と分化を促進することができる。Ｔｈ１７細胞から分泌されるＩＬ－１７は、制御性Ｔ細胞を抑制し、好中球とマクロファージを動員して活性化する炎症誘発性分子である。ＩＬ－１８も、炎症誘発性分子であり、Ｔ細胞とＮＫ細胞から分泌されるものである。活性化したマクロファージも大量のＩＬ－１８を分泌することができる。ＩＬ－１８は、自然免疫及び養子免疫に対して重要な役割を果たすことが報告された。ＩＬ－２３は、同様にＴ細胞及びＮＫ細胞から分泌されるものであり、Ｔｈ１７細胞の分化を促進することができる。樹状細胞、単球、マクロファージも、低レベルのＩＬ－２３受容体を発現し、ＩＬ－２３によって活性化させることができる。研究により、これらのインターロイキンが単独又は組み合わせて効果的な抗腫瘍効果を発揮できることが分かる。
【0057】
一実施形態において、本発明で使用されるインターロイキンは、配列番号２３、２７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７又は５９に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。または、そのコード配列は、配列番号２４、２８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、又は６０に示される核酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。
【0058】
Ｆｌｔ３Ｌ遺伝子
チロシンキナーゼ受容体３リガンド（Ｆｍｓ－ｌｉｋｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ３ ｌｉｇａｎｄ，Ｆｌｔ３Ｌ）は、サイトカインであり、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ受容体３（Ｆｍｓ－ｌｉｋｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｆｌｔ３Ｒ）に特異的に結合でき、それにより、ＤＣ細胞、ナチュラルキラー細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球などの増殖、分化、成熟を促進することができる。Ｆｌｔ３Ｌは、あらゆるマウスの組織や臓器に広く存在する。Ｆｌｔ３Ｌは、ヒト末梢血単球で最も高く発現し、次に心臓、胎盤、肺、脾臓、胸腺、卵巣、小腸、肝臓、腎臓、膵臓で発現し、脳組織で最も低く発現した。
チロシンキナーゼ受容体３リガンド（Ｆｍｓ－ｌｉｋｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ３ ｌｉｇａｎｄ，Ｆｌｔ３Ｌ）は、サイトカインであり、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ受容体３（Ｆｍｓ－ｌｉｋｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｆｌｔ３Ｒ）に特異的に結合でき、それにより、ＤＣ細胞、ナチュラルキラー細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球などの増殖、分化、成熟を促進することができる。Ｆｌｔ３Ｌは、あらゆるマウスの組織や臓器に広く存在する。Ｆｌｔ３Ｌは、ヒト末梢血単球で最も高く発現し、次に心臓、胎盤、肺、脾臓、胸腺、卵巣、小腸、肝臓、腎臓、膵臓で発現し、脳組織で最も低く発現した。
【0059】
研究により、Ｆｌｔ３Ｌは、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１３などのサイトカインとの組み合わせによってＴ細胞の増殖を促進できることがわかった。また、Ｆｌｔ３Ｌは、Ｂ細胞の初期分化と、ＮＫ細胞やＤＣなどの血液由来の前駆細胞の分化とに重要な役割を果たす。特に、未成熟なＤＣのみが受容体Ｆｌｔ３Ｒを発現できるため、Ｆｌｔ３Ｌは、ＤＣ前駆細胞を選択的に増殖させ、ＤＣ分化を促進することができる。研究により、Ｆｌｔ３Ｌをマウスに皮下注射すると、リンパ組織及び非リンパ組織のＤＣ数を大幅に増加可能のことがわかった。Ｆｌｔ３Ｌを運ぶ組換えアデノウイルスベクターと化学療法薬５－フルオロウラシルの組み合わせが、肝臓又は直腸癌のマウスモデルにおいて有意な抗腫瘍効果を達成したことが報告された。具体的には、Ｆｌｔ３Ｌは、骨髄免疫細胞の増殖と分化を刺激することにより、化学療法薬によって引き起こされる骨髄損傷を効果的に防止したが、局所的に増殖する腫瘍のＤＣは、５－フルオロウラシル及びＮＫ細胞によって殺された腫瘍細胞のフラグメントを提示し、それによって特定の抗腫瘍免疫応答を誘発した。
【0060】
一実施形態において、本発明で使用されるＦｌｔ３Ｌは、配列番号３６又は３８に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。または、Ｆｌｔ３Ｌのコード配列は、配列番号３５又は３７に示される核酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。
【0061】
ＸＣＬ１及びＸＣＬ２遺伝子
リンパ系ケモカインとしても知られるＣ型ケモカインファミリーは、主にＣＤ８＋Ｔ細胞とナチュラルキラー細胞によって産生されるＸＣＬ１とＸＣＬ２の２つのメンバーを含む。ＸＣＬ１は、独自の配列機能と２つの交換可能なタンパク質空間コンフォメーションを有し、これによって、他のケモカインと異ならせ、独自の機能を果たすことができる。ＸＣＬ１特異的受容体ＸＣＲ１は、Ｇタンパク質共役型受容体ファミリーのメンバーであり、２つの間の相互作用が、胸腺のネガティブセレクションと自己免疫寛容の確立に重要な役割を果たすだけでなく、交差抗原提示を開始し、細胞傷害性免疫応答を仲介することもできる。ＸＣＬ１は、免疫系のバランスを調節し、腸の免疫恒常性を維持するだけでなく、自己免疫疾患、腎炎、結核、ヒト免疫不全ウイルス感染症などの様々な疾患にも関連している。ＸＣＬ２とＸＣＬ１の核酸配列は９７％同一であり、７位と８位で２つのアミノ酸残基が異なる。ＸＣＬ１ではＡｓｐとＬｙｓであり、ＸＣＬ２ではＨｉｓとＡｒｇである。研究により、ＸＣＬ２は、ＸＣＬ１と比べて、発現プロファイル、構造、及び機能が非常に似っていることが分かった。例えば、ＸＣＬ１と同様に、ＸＣＬ２も、単量体と二量体の２つの相互変換可能なタンパク質空間コンフォメーションを有する。そのうち、単量体のコンフォメーションは、ＸＣＲ１に結合して活性化させ、二量体のコンフォメーションは、グリコサミノグリカン（Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ、ＧＡＧ）のヘアピン構造に対してより高い親和性を示す。ＸＣＬ１及びＸＣＬ２の受容体であるＸＣＲ１は、抗原提示能力を持つＤＣ（ｃＤＣ１）細胞で選択的に発現しており、いくつかの研究により、ＸＣＬ１の導入により、抗腫瘍免疫療法及び標的ワクチンの有効性を効果的に改善できることがわかった。
リンパ系ケモカインとしても知られるＣ型ケモカインファミリーは、主にＣＤ８＋Ｔ細胞とナチュラルキラー細胞によって産生されるＸＣＬ１とＸＣＬ２の２つのメンバーを含む。ＸＣＬ１は、独自の配列機能と２つの交換可能なタンパク質空間コンフォメーションを有し、これによって、他のケモカインと異ならせ、独自の機能を果たすことができる。ＸＣＬ１特異的受容体ＸＣＲ１は、Ｇタンパク質共役型受容体ファミリーのメンバーであり、２つの間の相互作用が、胸腺のネガティブセレクションと自己免疫寛容の確立に重要な役割を果たすだけでなく、交差抗原提示を開始し、細胞傷害性免疫応答を仲介することもできる。ＸＣＬ１は、免疫系のバランスを調節し、腸の免疫恒常性を維持するだけでなく、自己免疫疾患、腎炎、結核、ヒト免疫不全ウイルス感染症などの様々な疾患にも関連している。ＸＣＬ２とＸＣＬ１の核酸配列は９７％同一であり、７位と８位で２つのアミノ酸残基が異なる。ＸＣＬ１ではＡｓｐとＬｙｓであり、ＸＣＬ２ではＨｉｓとＡｒｇである。研究により、ＸＣＬ２は、ＸＣＬ１と比べて、発現プロファイル、構造、及び機能が非常に似っていることが分かった。例えば、ＸＣＬ１と同様に、ＸＣＬ２も、単量体と二量体の２つの相互変換可能なタンパク質空間コンフォメーションを有する。そのうち、単量体のコンフォメーションは、ＸＣＲ１に結合して活性化させ、二量体のコンフォメーションは、グリコサミノグリカン（Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ、ＧＡＧ）のヘアピン構造に対してより高い親和性を示す。ＸＣＬ１及びＸＣＬ２の受容体であるＸＣＲ１は、抗原提示能力を持つＤＣ（ｃＤＣ１）細胞で選択的に発現しており、いくつかの研究により、ＸＣＬ１の導入により、抗腫瘍免疫療法及び標的ワクチンの有効性を効果的に改善できることがわかった。
【0062】
一実施形態において、本発明で使用されるＸＣＬ１は、配列番号２６又は３０に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。または、ＸＣＬ１のコード配列は、配列番号２５又は２９に示される核酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。
【0063】
一実施形態において、本発明で使用されるＸＣＬ２は、配列番号６８に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。または、ＸＣＬ２のコード配列は、配列番号６７に示される核酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。
【0064】
外因性遺伝子の発現
本発明の外因性遺伝子、例えば、インターロイキン、Ｆｌｔ３Ｌ、ＸＣＬ２及び／又はＸＣＬ１の発現は、構成的発現又は条件付き発現であり得る。
本発明の外因性遺伝子、例えば、インターロイキン、Ｆｌｔ３Ｌ、ＸＣＬ２及び／又はＸＣＬ１の発現は、構成的発現又は条件付き発現であり得る。
【0065】
一実施形態において、外因性インターロイキン、Ｆｌｔ３Ｌ、ＸＣＬ２及び／又はＸＣＬ１の発現は、条件付き発現である。例えば、必要に応じて、本発明の外因性遺伝子を、誘導性、阻害性、又は組織特異的プロモーターに作動可能に連結して、特定の時間又は特定の組織又は細胞型において、導入された外因性遺伝子の発現レベルを調節することができる。一実施形態において、プロモーターは、誘導性プロモーター、即ち、特定の環境条件、発生条件、又は誘導物質の存在下のみで転写を開始するプロモーターである。そのような環境条件は、例えば、腫瘍酸性微小環境、腫瘍低酸素微小環境などを含む。そのような誘導剤は、例えば、シクサイクリン、テトラサイクリン、又はそれらの類似体を含む。テトラサイクリンの類似体は、例えば、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、デスメチルクロロテトラサイクリン、メチサイクリン、ドキシサイクリン、及びミノサイクリンホワイトを含む。誘導性プロモーターは、例えば、Ｌａｃオペロン配列、テトラサイクリンオペロン配列、ガラクトースオペロン配列、又はドキシサイクリンオペロン配列などを含む。他の実施形態において、プロモーターは、抑制可能なプロモーターである。即ち、抑制可能なプロモーターに特異的なリプレッサーの存在下で、細胞内の外来遺伝子の発現が抑制されるか、又は発現されない。抑制可能なプロモーターは、例えば、Ｌａｃ阻害性エレメント又はテトラサイクリン阻害性エレメントを含む。本発明では、Ｔｅｔ－ｏｎシステム、Ｔｅｔ－ｏｆｆシステム、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムなどを含む当分野で周知の誘導性／阻害性発現システムを使用することができるが、これらに限定されない。
【0066】
一実施形態において、インターロイキン、Ｆｌｔ３Ｌ、ＸＣＬ２及び／又はＸＣＬ１は、局在化ドメインに作動可能に連結され得る。前記局在化ドメインは、例えば小胞体、ゴルジ体、核などの細胞膜、細胞質内の特定のオルガネラのような特定の細胞位置で、本発明の外因性遺伝子を局在化して発現させることができる。局在化ドメインは、核局在化シグナル、ガイドペプチド、膜貫通ドメインなどを含むが、これらに限定されない。一実施形態において、本発明の外因性遺伝子インターロイキン、Ｆｌｔ３Ｌ、ＸＣＬ２及び／又はＸＣＬ１は、膜貫通ドメインに作動可能に連結され、これによって、改変免疫細胞の表面に固定され、発現することができる。
【0067】
一実施形態において、本発明における外因性遺伝子、例えば、インターロイキン、Ｆｌｔ３Ｌ、ＸＣＬ２又はＸＣＬ１タンパク質は、野生型、又は特定の特性（例えば、タンパク質分解に対する耐性）を有する、融合タンパク質又は変異体である。
【0068】
核酸
本発明は、さらに、（ｉ）リガンドを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸配列、（ｉｉ）インターロイキンをコードする核酸配列、及び（ｉｉｉ）Ｆｌｔ３Ｌ、ＸＣＬ２及び／又はＸＣＬ１をコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する。
本発明は、さらに、（ｉ）リガンドを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸配列、（ｉｉ）インターロイキンをコードする核酸配列、及び（ｉｉｉ）Ｆｌｔ３Ｌ、ＸＣＬ２及び／又はＸＣＬ１をコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する。
【0069】
一実施形態において、前記リガンドを特異的に認識する細胞表面分子は、Ｔ細胞受容体又はキメラ抗原受容体であり、好ましくはキメラ抗原受容体である。キメラ抗原受容体は、上記のように定義される。
【0070】
本明細書で使用される「核酸分子」は、それぞれ一本鎖及び／又は二本鎖形態、線状又は環状、又はそれらの混合物（ハイブリッド分子を含む）である、修飾又は非修飾のＲＮＡ、又はＤＮＡなどのリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドの配列を含む。したがって、本発明の核酸は、ＤＮＡ（例えば、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｉｖｔＲＮＡ）、それらの組み合わせ又は誘導体（例えば、ＰＮＡ）を含む。好ましくは、前記核酸は、ＤＮＡ、又はＲＮＡであり、より好ましくはｍＲＮＡである。
【0071】
核酸は、通常のホスホジエステル結合又は非通常の結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に発見するアミド結合）を含み得る。本発明の核酸は、例えば、トリチル化塩基及び滅多に見られない塩基（例えば、イノシン）などの１つ又は複数の修飾された塩基をさらに含む。本発明の多鎖ＣＡＲがポリヌクレオチドから発現され得ば、化学的、酵素的、又は代謝的修飾を含む他の修飾も考えられる。核酸は、単離された形で提供することができる。一実施形態において、核酸は、転写制御エレメント（プロモーター、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルを含む）、リボソーム結合部位、イントロンなどの調節配列を、さらに含む。
【0072】
本発明の核酸配列は、所望の宿主細胞（例えば、免疫細胞）において最適な発現を行い、又は細菌、酵母、又は昆虫細胞での発現に使用するように、コドン最適化される。コドン最適化は、ターゲティング配列に存在する、特定の種の高発現遺伝子でまれなコドンを、その種の高発現遺伝子で一般的なコドンで置き換え、置換前後のコドンが同じアミノ酸をコードすることを指す。したがって、最適なコドンの選択は、宿主ゲノムのコドン使用嗜好によって決められる。
【0073】
ベクター
本発明は、さらに、本発明に記載の核酸を含むベクターを提供する。ここで、リガンドを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸配列、ＩＬ－７をコードする核酸配列、ＸＣＬ１をコードする核酸、ＸＣＬ２をコードする核酸及び／又はＦｌｔ３Ｌをコードする核酸配列は、１つ以上のベクターにすることができる。
本発明は、さらに、本発明に記載の核酸を含むベクターを提供する。ここで、リガンドを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸配列、ＩＬ－７をコードする核酸配列、ＸＣＬ１をコードする核酸、ＸＣＬ２をコードする核酸及び／又はＦｌｔ３Ｌをコードする核酸配列は、１つ以上のベクターにすることができる。
【0074】
本明細書で使用される「ベクター」は、（外因性）遺伝物質を宿主細胞に移すためのビヒクルとして使用される核酸分子であり、核酸分子が、該宿主細胞において、例えば、複製及び／又は発現することができる。
【0075】
ベクターは、通常、ターゲティングベクターと発現ベクターを含む。「ターゲティングベクター」は、例えば、相同組換え又は特定の標的部位での配列を使用するハイブリッドリコンビナーゼによって、単離された核酸を細胞の内部に送達する培地である。「発現ベクター」は、適切な宿主細胞における異種核酸配列（例えば、本発明のキメラ抗原受容体ポリペプチドをコードする配列）の転写及びそれらのｍＲＮＡの翻訳に使用されるベクターである。本発明に適するベクターは、当分野の既知のものであり、多くの市販のものを利用可能である。一実施形態において、本発明のベクターは、プラスミド、ウイルス（例えばレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ、ポリオーマウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）など）、ファージ、ファージミド、コスミド、及び人工染色体（ＢＡＣ、及びＹＡＣを含む）を含むが、これらに限定されない。ベクター自体は、通常、ヌクレオチド配列であり、インサート（導入遺伝子）を含むＤＮＡ配列と、ベクターの「バッバックボーン」として機能するより大きな配列とを含むことが一般的である。操作されたベクターは、通常、宿主細胞における自律複製のための起点（ポリヌクレオチドの安定発現が望まれる場合）、選択マーカー、及び制限酵素切断部位（例えば、マルチクローニング部位、ＭＣＳ）をさらに含む。ベクターは、プロモーター、ポリアデニル化テール（ｐｏｌｙＡ）、３’ＵＴＲ、エンハンサー、ターミネーター、インシュレーター、オペロン、選択マーカー、レポーター遺伝子、ターゲティング配列及び／又はタンパク質精製タグなどのエレメントもさらに含む。具体的な実施形態において、前記ベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたベクターである。
【0076】
改変免疫細胞とその調製方法
本発明は、さらに、本発明の核酸又はベクターを含む改変免疫細胞を提供する。つまり、本発明の改変免疫細胞は、リガンドを特異的に認識する細胞表面分子、外因性ＩＬ－７遺伝子、並びにＸＣＬ１、ＸＣＬ２及び／又はＦｌｔ３Ｌ遺伝子を発現する。
本発明は、さらに、本発明の核酸又はベクターを含む改変免疫細胞を提供する。つまり、本発明の改変免疫細胞は、リガンドを特異的に認識する細胞表面分子、外因性ＩＬ－７遺伝子、並びにＸＣＬ１、ＸＣＬ２及び／又はＦｌｔ３Ｌ遺伝子を発現する。
【0077】
本明細書で使用される「免疫細胞」は、１つ又は複数のエフェクター機能（例えば、細胞傷害性細胞死滅活性、サイトカインの分泌、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣの誘導）を有する免疫系の任意の細胞を指す。例えば、免疫細胞は、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、ＮＫ細胞及び／又はＮＫＴ細胞、または臍帯血などの幹細胞源から得られる免疫細胞であり得る。好ましくは、免疫細胞はＴ細胞である。Ｔ細胞は、例えば初代Ｔのようなｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されたＴ細胞、又はＪｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１などのようなｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されたＴ細胞系からのＴ細胞、又は被験者から得られたＴ細胞などの任意のＴ細胞であり得る。被験者は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、及びそれらのトランスジェニック種を含む。Ｔ細胞は、様々な供給源から入手可能であり、末梢血単球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位の組織、腹水、胸膜滲出液、脾臓組織、腫瘍などを含む。Ｔ細胞は、濃縮又は精製されることも可能である。Ｔ細胞は、任意の発達段階のものであってもよく、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（例えばＴｈ１及びＴｈ２細胞）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、γδ－Ｔ細胞、αβ－Ｔ細胞などを含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、免疫細胞はヒトＴ細胞である。Ｔ細胞は、フィコール分離などの当業者で知られる様々な技術を使用して、被験者の血液から得ることができる。本発明において、免疫細胞は、キメラ抗原受容体、外因性ＩＬ－７遺伝子、並びにＸＣＬ１、ＸＣＬ２、及び／又はＦｌｔ３Ｌ遺伝子を発現するように操作されたものである。
【0078】
当分野で公知の方法（例えば、形質導入、トランスフェクション、形質転換などによる）で、キメラ抗原受容体ポリペプチド、ならびにＩＬ－７遺伝子及びＸＣＬ１、ＸＣＬ２及び／又はＦｌｔ３Ｌ遺伝子をコードする核酸配列を、免疫細胞に導入することができる。「トランスフェクション」は、核酸分子又はポリヌクレオチド（ベクターを含む）を標的細胞に導入するプロセスである。例えば、ＲＮＡトランスフェクションの場合、ＲＮＡ（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡ、ｉｖｔＲＮＡ）を宿主細胞に導入するプロセスである。この用語は、主に真核細胞での非ウイルス法に使用される。「形質導入」という用語は、通常、ウイルスを介した核酸分子又はポリヌクレオチドの転移を説明するために使用される。動物細胞のトランスフェクションは、通常、細胞膜に一過性の細孔又は「穴」を開いて、物質の取り込みを可能にすることに関するものである。トランスフェクションは、リン酸カルシウムを使用して、エレクトロポレーションで、細胞を圧搾することにより、または、カチオン性脂質を材料と混合してリポソーム（細胞膜と融合し、その運搬物を内部に沈着させる）を製造することにより、実施することができる。真核生物宿主細胞をトランスフェクトするための例示的な技術には、脂質小胞媒介取り込み、熱ショック媒介取り込み、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション（リン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈殿）、マイクロインジェクション、及びエレクトロポレーション穿孔が含まれる。「形質転換」という用語は、核酸分子又はポリヌクレオチド（ベクターを含む）の、細菌への又は非動物の真核細胞（植物細胞を含む）への、非ウイルス性転写を説明するために使用される。したがって、形質転換とは、細菌又は非動物の真核細胞の、その周囲からの細胞膜を介した直接取り込み、それに続く外因性遺伝物質（核酸分子）の取り込みから生じる遺伝学的変化である。形質転換は、人工的手段で実現される。形質転換が起こるためには、細胞又は細菌がコンピテンスの状態になければならない。原核生物の形質転換の技術は、熱ショック媒介取り込み、無傷細胞の細菌プロトプラストとの融合、マイクロインジェクション、及びエレクトロポレーションを含み得る。
【0079】
したがって、本発明は、さらに改変免疫細胞を調製する方法を提供する。改変免疫細胞を調製する方法は、免疫細胞に、（ａ）リガンドを特異的に認識する細胞表面分子をコードする第１の核酸配列又はそれがコードするリガンドを特異的に認識する細胞表面分子、（ｂ）ＩＬ－７をコードする第２の核酸配列又はそれがコードするＩＬ－７タンパク質、及び（ｃ）ＸＣＬ１、ＸＣＬ２及び／又はＦｌｔ３Ｌをコードする第３の核酸配列又はそれがコードするＸＣＬ１、ＸＣＬ２及び／又はＦｌｔ３Ｌタンパク質を導入することを含む。
【0080】
一実施形態において、上記の成分（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、任意の順で免疫細胞に連続的に導入され得る。他の実施形態において、上記の成分（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、例えば、１つ又は複数のベクターに（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）をクローニングすることによって、免疫細胞に同時に導入することができる。
【0081】
核酸又はベクターが免疫細胞に導入された後、当業者は、従来の技術によって、得られた免疫細胞を増幅及び活性化することができる。
【0082】
さらに他の実施形態において、本発明の免疫細胞は、ＣＤ５２、ＧＲ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ２４７ζ、ＨＬＡ－Ｉ、ＨＬＡ－ＩＩ、Ｂ２Ｍ、並びにＰＤ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３及びＴＩＭ３などの免疫チェックポイント遺伝子から選択される少なくとも１つの不活化遺伝子をさらに含む。より具体的には、免疫細胞の少なくともＴＣＲ成分（ＴＣＲα、ＴＣＲβ遺伝子を含む）又はＣＤ３成分（ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ２４７ζを含む）が不活性化される。この不活性化により、ＴＣＲ－ＣＤ３複合体は、細胞内で機能的しなくなる。この方法は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に対してとても有効である。遺伝子を不活性化する方法は、当分野で公知のものであり、例えば、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、又はＣＲＩＳＰＲシステムにおけるＣａｓ酵素媒介によるＤＮＡフラグメント化によって、行われる。
【0083】
キット及び医薬組成物
本発明は、本発明の改変免疫細胞、核酸分子又はベクターを含むキットを提供する。
本発明は、本発明の改変免疫細胞、核酸分子又はベクターを含むキットを提供する。
【0084】
好ましい実施形態において、本発明のキットは、説明書をさらに含む。
【0085】
本発明は、さらに、活性剤としての本発明の改変免疫細胞、核酸分子又はベクター、及び様々な薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。したがって、本発明は、さらに、医薬組成物又は医薬品の調製における核酸分子、ベクター又は改変免疫細胞の使用を含む。
【0086】
本明細書で使用される「薬学的に許容される賦形剤」は、被験者及び有効成分と薬理学的及び／又は生理学的に適合性する（即ち、望ましくない局所的又は全身的作用を引き起こすことなく所望の治療効果を引き出すことができる）ベクター及び／又は賦形剤を意味し、当分野で公知のものである（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ，１９ｔｈ ｅｄ．Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５を参照）。薬学的に許容される賦形剤の例として、充填剤、結合剤、崩壊剤、コーティング剤、吸着剤、付着防止剤、流動促進剤、抗酸化剤、香味剤、着色剤、甘味料、溶媒、共溶媒、緩衝剤、キレート剤、界面活性剤、希釈剤、湿潤剤、防腐剤、乳化剤、コーティング剤、等張剤、吸収遅延剤、安定剤及び張性調整剤を含むが、これに限定されない。当業者であれば、本発明の所望の医薬組成物を調製するために、適切な賦形剤を選択することができる。本発明の医薬組成物に使用される例示的な賦形剤は、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース及び水を含む。通常、適切な賦形剤の選択は、使用される活性剤、治療される疾患、及び医薬組成物の所望の剤形により決められる。
【0087】
本発明による医薬組成物は、様々な経路による投与に適する。通常、投入は、非経口的に達成される。非経口送達方法は、局所、動脈内、筋肉内、皮下、髄内、くも膜下腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、子宮内、膣内、舌下又は鼻腔内の投与を含む。
【0088】
本発明による医薬組成物は、さらに、固形剤、液剤、気体剤形、若しくは凍結乾燥剤形などの様々な剤形で調製することができる。特に、軟膏、クリーム、経皮パッチ、ゲル、散剤、錠剤、液剤、エアロゾル、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳化剤、カプセル剤、シロップ剤、エリキシル剤、エキス剤、チンキ剤または液体エキス剤抽出物の剤形で、又は所望の投入方法に特に適切な剤形で製剤化され得る。医薬品を生産するの本発明の公知のプロセスは、例えば、慣用的な混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、封鎖、又は凍結乾燥プロセスを含み得る。本明細書に記載の免疫細胞を含む医薬組成物は、通常、液剤で提供され、好ましくは薬学的に許容される緩衝液を含む。
【0089】
本発明による医薬組成物は、さらに、治療される疾患の治療及び／又は予防に適した１つ又は複数の他の薬剤と組み合わせて投与され得る。組み合わせに適した薬剤の好ましい例として、次のものが挙げられる。
【0090】
・公知の抗がん剤、例えば、シスプラチン、メイタンシン誘導体、ラケルマイシン（ｒａｃｈｅｌｍｙｃｉｎ）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ドセタキセル、エトポシド、ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン、メルファラン、ミトキサントロン、ソルフィマーソディウムホトフィリンII（ｓｏｒｆｉｍｅｒ ｓｏｄｉｕｍｐｈｏｔｏｆｒｉｎ ＩＩ）、テモゾロマイド、トポテカン、トリメトレキサートグルクロネート（ｔｒｉｍｅｔｒｅａｔｅ ｇｌｕｃｕｒｏｎａｔｅ）、オーリスタチンＥ（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ）、ビンクリスチン及びドキソルビシン；
・ペプチド細胞毒素、例えば、リシン、ジフテリア毒素、シュードモナス細菌外毒素Ａ、ＤＮａｓｅ、及びＲＮａｓｅなど；
・放射性核種、例えば、ヨウ素１３１、レニウム１８６、インジウム１１１、イリジウム９０、ビスマス２１０及び２１３、アクチニウム２２５、及びアスタチン２１３；
・プロドラッグ、例えば、抗体指向酵素プロドラッグなど；
・免疫刺激剤血、例えば、血小板第４因子、黒色腫成長刺激タンパク質など；
・抗体又はそのフラグメント、例えば、抗ＣＤ３抗体又はそのフラグメント；
・補体活性化物質；
・異種タンパク質ドメイン、同種タンパク質ドメイン、ウイルス性／細菌性タンパク質ドメイン、ウイルス性／細菌性ペプチド。
・ペプチド細胞毒素、例えば、リシン、ジフテリア毒素、シュードモナス細菌外毒素Ａ、ＤＮａｓｅ、及びＲＮａｓｅなど；
・放射性核種、例えば、ヨウ素１３１、レニウム１８６、インジウム１１１、イリジウム９０、ビスマス２１０及び２１３、アクチニウム２２５、及びアスタチン２１３；
・プロドラッグ、例えば、抗体指向酵素プロドラッグなど；
・免疫刺激剤血、例えば、血小板第４因子、黒色腫成長刺激タンパク質など；
・抗体又はそのフラグメント、例えば、抗ＣＤ３抗体又はそのフラグメント；
・補体活性化物質；
・異種タンパク質ドメイン、同種タンパク質ドメイン、ウイルス性／細菌性タンパク質ドメイン、ウイルス性／細菌性ペプチド。
【0091】
また、本発明の医薬組成物は、化学療法及び放射線療法などの１つ又は複数の他の治療方法と組み合わせて使用することができる。
【0092】
治療への応用
本発明は、癌、感染症又は自己免疫疾患に罹患している被験者を治療する方法をさらに提供し、本発明による有効量の免疫細胞又は医薬組成物を被験者に投与することを含む。したがって、本発明は、癌、感染症又は自己免疫疾患の治療のための薬剤の製造における改変免疫細胞の使用をさらに含む。
本発明は、癌、感染症又は自己免疫疾患に罹患している被験者を治療する方法をさらに提供し、本発明による有効量の免疫細胞又は医薬組成物を被験者に投与することを含む。したがって、本発明は、癌、感染症又は自己免疫疾患の治療のための薬剤の製造における改変免疫細胞の使用をさらに含む。
【0093】
一実施形態において、有効量の本発明の免疫細胞及び／又は医薬組成物が被験者に直接投与される。
【0094】
他の実施形態において、本発明の治療方法は、エクスビボ治療である。具体的には、この方法は、免疫細胞を含むサンプルを提供するステップ（ａ）と、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、本発明のキメラ抗原受容体及び発現しようとする外因性遺伝子を、免疫細胞に導入し、改変された免疫細胞を得るステップ（ｂ）と、改変された免疫細胞を被験者に投与するステップ（ｃ）とを含む。好ましくは、ステップ（ａ）における免疫細胞は、マクロファージ、樹状細胞、単球、Ｔ細胞、ＮＫ細胞及び／又はＮＫＴ細胞から選択され、また、当分野で公知の方法によって被験者のサンプル（特に血液サンプル）から得るものである。なお、本発明のキメラ抗原受容体及び外因性遺伝子を発現し、本明細書に記載の所望の生物学的エフェクター機能を発揮できる他の免疫細胞も使用することができる。また、免疫細胞として、通常、被験者の免疫系と適合するものが選択され、即ち、好ましくは、免疫原性応答を誘発しないものを選ぶ。例えば、「遍在的なレシピエント細胞」、即ち、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成長及び増殖することができる所望の生物学的エフェクター機能を発揮する遍在的な適合性を有するリンパ球を使用することができる。そのような細胞の使用は、被験者自身のリンパ球を入手及び／又は提供する必要性がない。ステップ（ｃ）のエクスビボ導入は、エレクトロポレーションを介して、本明細書に記載の核酸又はベクターを免疫細胞に導入することにより、又は上記のレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター又はレトロウイルスベクターのようなウイルスベクターで免疫細胞を感染させることにより実施することができる。他の考えられる方法としては、リポソームなどのトランスフェクション試薬の使用、又は一過性ＲＮＡトランスフェクションの使用が挙げられる。
【0095】
一実施形態において、前記免疫細胞は、自己細胞又は同種異系細胞、好ましくはＴ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、ＮＫ細胞及び／又はＮＫＴ細胞であり、より好ましくはＴ細胞、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞である。
【0096】
本明細書において、「自己」という用語は、任意の材料であって、後にそれが再導入される個体と同じ個体由来のものを指す。
【0097】
本明細書において、「同種異系」という用語は、任意の材料であって、同じ種の異なる動物、または該材料が導入される個体と異なる患者由来のものを指す。遺伝子が１つ以上の遺伝子座で同一ではない場合、２つ以上の個体は互いに同種異系であると言われる。いくつかの態様において、同じ種の個体由来の同種異系材料は、抗原的に相互作用するのに十分に遺伝学的に異なり得る。
【0098】
本明細書において、「被験者」という用語は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、又はウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、癌の動物モデルを表す被験者として有利に使用することができる。好ましくは、被験者は、ヒトである。
【0099】
一実施形態において、前記がんは、リガンド結合ドメインによって結合された標的の発現に関連するがんである。例えば、前記がんは、脳神経膠腫、芽細胞腫、肉腫、白血病、基底細胞がん、胆道がん、膀胱がん、骨肉腫、脳がん及びＣＮＳがん、乳がん、腹膜がん、子宮頸がん、絨毛がん、結腸癌及び直腸がん、結合組織がん、消化器系のがん、子宮内膜がん、食道がん、眼がん、頭頸部がん、胃がん（胃腸がんを含む）、神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ）、肝臓がん、肝細胞腫瘍、上皮内腫瘍、腎臓がん、喉頭がん、肝臓腫瘍、肺がん（例えば、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、腺がん、扁平上皮がん）、リンパ腫（ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫を含む）、メラノーマ、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔がん（例えば、唇、舌、口、咽頭）、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸がん、呼吸器系のがん、唾液腺がん、皮膚がん、扁平細胞がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮又は子宮内膜がん、泌尿器系の悪性腫瘍、外陰がん及びその他のがんと肉腫、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中等度／濾胞性ＮＨＬ、中等度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度の小さな非切断細胞ＮＨＬ、大きなしこりＮＨＬを含む）、マントル細胞リンパ腫、エイズ関連リンパ腫、及びＷａｌｄｅｎｓｔｒｏｍマクログロブリン血症、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ性白血病、形質細胞様樹状細胞腫、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、悪性リンパ増殖性疾患、ＭＡＬＴリンパ腫、有毛細胞白血病、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症、形質芽球性リンパ腫、前白血病、形質細胞様樹状細胞腫瘍、及び移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、及び標的発現に関連する他の疾患が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明の改変免疫細胞又は医薬組成物で治療することができる疾患は、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、脳神経膠腫、膵臓がん、胃がんなどから選択される。
【0100】
一実施形態において、前記感染症は、ウイルス、細菌、真菌、及び寄生虫によって引き起こされる感染症を含むが、これらに限定されない。
【0101】
一実施形態において、前記自己免疫疾患は、Ｉ型糖尿病、腹腔疾患、グレーブス病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、アジソン病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、重力筋無力症、血管炎症、悪性貧血、及び全身性エリテマトーデスなどを含むが、これらに限定されない。
【0102】
一実施形態において、前記方法は、さらに、１つ又は複数の追加の化学療法剤、生物学的薬剤、薬物又は治療を前記被験者に投与することを含む。この実施形態において、化学療法剤、生物学的、薬物又は治療は、放射線療法、外科手術、抗体剤及び／又は小分子、ならびにそれらの任意の組み合わせから選択される。
【0103】
以下、添付の図面を参照しながら例を挙げて本発明をで詳細に説明する。なお、当業者であれば、添付の図面および実施例は、例示的なものにすぎず、本発明を限定するものではないと理解される。本出願の実施例および実施例の特徴は、矛盾がない限り、互いに組み合わせることができる。
【0104】
実施例１ マウス膵臓がん細胞株Ｐａｎｃ０２－ｍＣＤ１９の構築
１．ｐＬＶ－ｍＣＤ１９プラスミドの調製
マウス脾臓の全ｍＲＮＡをテンプレートとして、逆転写ＰＣＲによりマウス脾臓の全ｃＤＮＡ配列を取得し、さらに、ＰＣＲにより、ＸｂａＩ、及びＳａｌＩ制限部位を含むマウスｍＣＤ１９配列を取得した。そして、ｍＣＤ１９遺伝子をｐＬＶ－ＢＨＡｍプラスミドに組換えて、ｐＬＶ－ＢＨＡｍ－ｍＣＤ１９プラスミドを得た。
１．ｐＬＶ－ｍＣＤ１９プラスミドの調製
マウス脾臓の全ｍＲＮＡをテンプレートとして、逆転写ＰＣＲによりマウス脾臓の全ｃＤＮＡ配列を取得し、さらに、ＰＣＲにより、ＸｂａＩ、及びＳａｌＩ制限部位を含むマウスｍＣＤ１９配列を取得した。そして、ｍＣＤ１９遺伝子をｐＬＶ－ＢＨＡｍプラスミドに組換えて、ｐＬＶ－ＢＨＡｍ－ｍＣＤ１９プラスミドを得た。
【0105】
２．レンチウイルスのパッケージ
Ｔ１７５フラスコでは、２９３Ｔ細胞を、３０×１０６細胞／フラスコの密度で１０％ウシ胎児血清を含む３０ ｍｌのＤＭＥＭ培地に播種し、３７°Ｃ、５％ＣＯ２のインキュベーターで一晩培養した。
Ｔ１７５フラスコでは、２９３Ｔ細胞を、３０×１０６細胞／フラスコの密度で１０％ウシ胎児血清を含む３０ ｍｌのＤＭＥＭ培地に播種し、３７°Ｃ、５％ＣＯ２のインキュベーターで一晩培養した。
【0106】
３ｍｌ Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、ロット番号３１９８５－０７０）、３４μｇ ｐＬＶ－ＢＨＡｍ－ｍＣＤ１９プラスミド、８．５μｇ ｐＭＤ２．Ｇベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ、ロット番号１２２５９）、及び１７μｇ ｐｓＰＡＸ２ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ、ロット番号１２２６０）を滅菌チューブに加えた。その後、１２０μｌ Ｘ－ｔｒｅｍｅ ＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ、ロット番号０６３６６２３６００１）を加え、均一に混合し、室温で１５分間インキュベートした。その後、プラスミド／ベクター／トランスフェクション試薬の混合物を、事前に調製した２９３Ｔ細胞の培養フラスコに滴下し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩インキュベートした。トランスフェクションの２４時間後と４８時間後に培養物を収集し、組み合わせた後、超遠心分離（２５０００ｇ、４℃、２．５ｈ）して、濃縮されたｐＬＶ－ＢＨＡｍ－ｍＣＤ１９レンチウイルスを得、－８０℃で保存した。
【0107】
３．Ｐａｎｃ０２－ｍＣＤ１９細胞株のスクリーニング
６ウェル細胞培養プレートの各ウェルに、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、ロット番号Ｃ１２４３０５００ＢＴ）、１×１０６個のマウス膵臓がん細胞Ｐａｎｃ０２（中国薬科大学の研究室から贈与）、及び２００μｌ ｐＬＶ－ＢＨＡｍ－ｍＣＤ１９レンチウイルスを加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下で４８時間インキュベートした。その後、細胞を０．２５％のトリプシンで消化して単細胞懸濁液を形成し、細胞を希釈して９６ウェルプレートに移し、モノクローナル細胞が現れるまで培養を続けた。また、モノクローナル細胞を採取し、０．２５％のトリプシンで単一細胞に再度消化し、２００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地で再懸濁した。ＡＰＣ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ１９抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ロット番号１１５５１２）を使用して、フローサイトメトリーによって感染効率を検出し、ＣＤ１９陽性クローンをスクリーニングした。陽性クローンを３～４回継代した後、フローサイトメトリーでＣＤ１９の発現レベルを検出した。ウイルスに感染していないＰａｎｃ０２細胞を対照として使用した。
６ウェル細胞培養プレートの各ウェルに、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、ロット番号Ｃ１２４３０５００ＢＴ）、１×１０６個のマウス膵臓がん細胞Ｐａｎｃ０２（中国薬科大学の研究室から贈与）、及び２００μｌ ｐＬＶ－ＢＨＡｍ－ｍＣＤ１９レンチウイルスを加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下で４８時間インキュベートした。その後、細胞を０．２５％のトリプシンで消化して単細胞懸濁液を形成し、細胞を希釈して９６ウェルプレートに移し、モノクローナル細胞が現れるまで培養を続けた。また、モノクローナル細胞を採取し、０．２５％のトリプシンで単一細胞に再度消化し、２００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地で再懸濁した。ＡＰＣ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ１９抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ロット番号１１５５１２）を使用して、フローサイトメトリーによって感染効率を検出し、ＣＤ１９陽性クローンをスクリーニングした。陽性クローンを３～４回継代した後、フローサイトメトリーでＣＤ１９の発現レベルを検出した。ウイルスに感染していないＰａｎｃ０２細胞を対照として使用した。
【0108】
図３は結果を示す。最終的にスクリーニングされたＰａｎｃ０２－ｍＣＤ１９細胞株では、ＣＤ１９の発現率は１００％であった。
【0109】
実施例２ ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製
１．レトロウイルスプラスミドの構築
ｍＣＤ１９－ｓｃＦｖ、ｍＣＤ８ａヒンジ領域、膜貫通領域、マウス４１ｂｂ細胞内ドメイン及びマウスＣＤ３ζ細胞内ドメインのコード配列フラグメントを人工的に合成し、ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ制限部位を両端に付加した。フラグメントをＭＳＣＶベクターにクローン化して、ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲプラスミドを得た。
１．レトロウイルスプラスミドの構築
ｍＣＤ１９－ｓｃＦｖ、ｍＣＤ８ａヒンジ領域、膜貫通領域、マウス４１ｂｂ細胞内ドメイン及びマウスＣＤ３ζ細胞内ドメインのコード配列フラグメントを人工的に合成し、ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ制限部位を両端に付加した。フラグメントをＭＳＣＶベクターにクローン化して、ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲプラスミドを得た。
【0110】
Ｔ２ＡとマウスＩＬ－７を順に接続するコード配列フラグメントを人工的に合成し、ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ制限部位を両端に付加した。フラグメントをＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲベクターにクローン化して、ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＩＬ－７プラスミドを得た。
【0111】
Ｔ２ＡとマウスＸＣＬ１を順に接続するコード配列フラグメントを人工的に合成し、ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ制限部位を両端に付加した。フラグメントをＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲベクターにクローン化して、ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＸＣＬ１プラスミドを得た。
【0112】
Ｔ２ＡとマウスＣＣＬ１９を順に接続するコード配列フラグメントを人工的に合成し、ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ制限部位を両端に付加した。フラグメントをＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲベクターにクローン化して、ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＣＣＬ１９プラスミドを得た。
【0113】
Ｔ２ＡとマウスＦｌｔ３Ｌを順に接続するコード配列フラグメントを人工的に合成し、ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ制限部位を両端に付加した。フラグメントをＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲベクターにクローン化して、ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｆｌｔ３Ｌプラスミドを得た。
【0114】
２．レトロウイルスの調製
Ｔ１７５フラスコで、２９３Ｔ細胞を、３０×１０６個の細胞／フラスコの密度で１０％ウシ胎児血清を含む３０ ｍｌのＤＭＥＭ培地に播種し、３７°Ｃ、５％ＣＯ２のインキュベーターで一晩培養し、ウイルスをパッケージングした。
Ｔ１７５フラスコで、２９３Ｔ細胞を、３０×１０６個の細胞／フラスコの密度で１０％ウシ胎児血清を含む３０ ｍｌのＤＭＥＭ培地に播種し、３７°Ｃ、５％ＣＯ２のインキュベーターで一晩培養し、ウイルスをパッケージングした。
【0115】
３ｍｌ Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、ロット番号３１９８５－０７０）、４５μｇレトロウイルスプラスミド（ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲプラスミド、ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＩＬ－７プラスミド、ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＸＣＬ１プラスミド、ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＣＣＬ１９、又はＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｆｌｔ３Ｌプラスミド）、及び１５μｇパッケージングベクターｐＣＬ－Ｅｃｏ（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｈｅｗｕ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， ＬＴＤ．、ロット番号Ｐ３０２９）を滅菌チューブに加えた。その後、１２０μｌ Ｘ－ｔｒｅｍｅ ＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ、ロット番号０６３６６２３６００１）を加え、均一に混合し、室温で１５分間インキュベートした。その後、プラスミド／ベクター／トランスフェクション試薬の混合物を、事前に調製した２９３Ｔ細胞の培養フラスコに滴下し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩インキュベートした。トランスフェクションの７２時間後に培養物を収集し、遠心分離（２０００ｇ、４℃、１０分間）して、レトロウイルスの上清を取得した。
【0116】
３．ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製
Ｔリンパ球をマウス脾臓から分離し、ＤｙｎａＢｅａｄｓ ＣＤ３／ＣＤ２８ ＣＴＳＴＭ（Ｇｉｂｃｏ，ロット番号４０２０３Ｄ）でＴ細胞を活性化させた後、３７℃、５％ＣＯ２で１日間培養した。
Ｔリンパ球をマウス脾臓から分離し、ＤｙｎａＢｅａｄｓ ＣＤ３／ＣＤ２８ ＣＴＳＴＭ（Ｇｉｂｃｏ，ロット番号４０２０３Ｄ）でＴ細胞を活性化させた後、３７℃、５％ＣＯ２で１日間培養した。
【0117】
１ウェルあたり３×１０６個の細胞／ｍＬの密度で、活性化されたＴ細胞を、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎで一晩プレコートした２４ウェルプレートに接種し、そして、５００μＬの完全培地（ＮＴ、コントロール）、ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲウイルス、ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＸＣＬ１ウイルス、ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｆｌｔ３Ｌウイルス、ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＩＬ－７ウイルス＋ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＣＣＬ１９ウイルス、ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＩＬ－７ウイルス＋ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｆｌｔ３Ｌウイルス、又はＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＩＬ－７ウイルス＋ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＸＣＬ１ウイルスをそれぞれに加え、完全培地を２ｍＬに補充した。
【0118】
２４ウェルプレートを遠心分離機に入れて遠心分離し、３２℃、２０００ｇで２時間遠心分離した。そして、２４ウェルプレートを３７℃、ＣＯ２インキュベーターに入れて静置培養した。翌日、新鮮な培地を交換し、細胞密度を１×１０６個の細胞／ｍＬに調整した。感染の３日後、その後の分析のために細胞を収集した。収集された細胞はＮＴ細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＸＣＬ１細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｆｌｔ３Ｌ細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＩＬ－７－ＣＣＬ１９細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＩＬ－７－Ｆｌｔ３Ｌ細胞、及びｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＩＬ－７－ＸＣＬ１細胞である。
【0119】
実施例３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の発現の検出
１．細胞表面ＣＡＲの発現レベル
実施例２によって調製された２×１０５個のＣＡＲ－Ｔ細胞を取り出し、Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｒａｔ ＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）Ｂｉｏｔｉｎ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，ロット番号６９１０－２５０）を一次抗体として用い、ＡＰＣ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ロット番号５５４０６７）をニ次抗体として用い、フローサイトメトリーで、ＣＡＲ Ｔ細胞でのＣＡＲの発現レベルを検出した。図４はその結果示す。
１．細胞表面ＣＡＲの発現レベル
実施例２によって調製された２×１０５個のＣＡＲ－Ｔ細胞を取り出し、Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｒａｔ ＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）Ｂｉｏｔｉｎ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，ロット番号６９１０－２５０）を一次抗体として用い、ＡＰＣ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ロット番号５５４０６７）をニ次抗体として用い、フローサイトメトリーで、ＣＡＲ Ｔ細胞でのＣＡＲの発現レベルを検出した。図４はその結果示す。
【0120】
以上の結果から分かるように、コントロールと比較して、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＸＣＬ１、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｆｌｔ３Ｌ、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＩＬ－７－ＸＣＬ１、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＩＬ－７－ＣＣＬ１９細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＩＬ－７－Ｆｌｔ３Ｌ細胞でのＣＡＲ陽性効率は、全て５０％を超え、これらの細胞がいずれもＣＡＲを効果的に発現できる。
【0121】
２．ＸＣＬ１の発現レベル
実施例２によって調製されたＣＡＲ－Ｔ細胞の上清を収集し、メーカーのおすすめに従って、Ｍｏｕｓｅ ＸＣＬ１ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ロット番号ＤＹ４８６）を使用して、細胞におけるのＸＣＬ１の分泌レベルを検出した。図５は結果を示す。
実施例２によって調製されたＣＡＲ－Ｔ細胞の上清を収集し、メーカーのおすすめに従って、Ｍｏｕｓｅ ＸＣＬ１ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ロット番号ＤＹ４８６）を使用して、細胞におけるのＸＣＬ１の分泌レベルを検出した。図５は結果を示す。
【0122】
以上の結果から分かるように、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＸＣＬ１を含む２つのＣＡＲ Ｔ細胞は、いずれもＸＣＬ１を効率的に分泌した。
【0123】
３．ＩＬ－７の発現レベル
実施例２によって調製されたＣＡＲ－Ｔ細胞の上清を収集し、メーカーのおすすめに従って、Ｍｏｕｓｅ ＩＬ－７ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ロット番号ＤＹ４０７）を使用して、細胞におけるＩＬ－７の分泌レベルを検出した。図６は結果を示す。
実施例２によって調製されたＣＡＲ－Ｔ細胞の上清を収集し、メーカーのおすすめに従って、Ｍｏｕｓｅ ＩＬ－７ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ロット番号ＤＹ４０７）を使用して、細胞におけるＩＬ－７の分泌レベルを検出した。図６は結果を示す。
【0124】
以上の結果から分かるように、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＩＬ－７を含む３つの Ｔ細胞は、いずれもＩＬ－７を効率的に分泌した。
【0125】
４．ＣＣＬ１９の発現レベル
実施例２によって調製されたＣＡＲ－Ｔ細胞の上清を収集し、メーカーのおすすめに従って、Ｍｏｕｓｅ ＣＣＬ１９ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ロット番号ＤＹ４４０）を使用して、細胞におけるＣＣＬ１９の分泌レベルを検出した。図７は結果を示す。
実施例２によって調製されたＣＡＲ－Ｔ細胞の上清を収集し、メーカーのおすすめに従って、Ｍｏｕｓｅ ＣＣＬ１９ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ロット番号ＤＹ４４０）を使用して、細胞におけるＣＣＬ１９の分泌レベルを検出した。図７は結果を示す。
【0126】
以上の結果から分かるように、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＣＣＬ１９を含むＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＣＬ１９を効果的に発現できる。
【0127】
５．Ｆｌｔ３Ｌの発現レベル
実施例２によって調製されたＣＡＲ－Ｔ細胞の上清を収集し、メーカーのおすすめに従って、Ｍｏｕｓｅ Ｆｌｔ－３ Ｌｉｇａｎｄ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ロット番号ＤＹ４２７）を使用して、細胞におけるＦｌｔ３Ｌの分泌レベルを検出した。図８は結果を示す。
実施例２によって調製されたＣＡＲ－Ｔ細胞の上清を収集し、メーカーのおすすめに従って、Ｍｏｕｓｅ Ｆｌｔ－３ Ｌｉｇａｎｄ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ロット番号ＤＹ４２７）を使用して、細胞におけるＦｌｔ３Ｌの分泌レベルを検出した。図８は結果を示す。
【0128】
以上の結果から分かるように、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｆｌｔ３Ｌを含む２つのＣＡＲ Ｔ細胞は、いずれもＦｌｔ３Ｌを効果的に発現できる。
【0129】
実施例４ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＩＦＮ－γの分泌レベルの検出
２×１０５個の細胞／１００μｌの濃度で、ＮＴ細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＸＣＬ１細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｆｌｔ３Ｌ細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＩＬ－７－ＣＣＬ１９細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＩＬ－７－Ｆｌｔ３Ｌ細胞及びｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＩＬ－７－ＸＣＬ１細胞を、９６ウェルの丸底プレートに加えた。その後、各ウェルに１×１０４個の細胞／１００μｌの濃度で標的Ｐａｎｃ０２－ｍＣＤ１９細胞又は非標的Ｐａｎｃ０２細胞に加えた。３７℃で２４時間のインキュベーション後、培養上清を回収した。メーカーのおすすめに従って、Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ－ｇａｍｍａ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ、ロット番号ＤＹ４８５）を使用して、培養上清におけるＩＦＮ－γの発現レベルを検出した。
２×１０５個の細胞／１００μｌの濃度で、ＮＴ細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＸＣＬ１細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｆｌｔ３Ｌ細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＩＬ－７－ＣＣＬ１９細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＩＬ－７－Ｆｌｔ３Ｌ細胞及びｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＩＬ－７－ＸＣＬ１細胞を、９６ウェルの丸底プレートに加えた。その後、各ウェルに１×１０４個の細胞／１００μｌの濃度で標的Ｐａｎｃ０２－ｍＣＤ１９細胞又は非標的Ｐａｎｃ０２細胞に加えた。３７℃で２４時間のインキュベーション後、培養上清を回収した。メーカーのおすすめに従って、Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ－ｇａｍｍａ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ、ロット番号ＤＹ４８５）を使用して、培養上清におけるＩＦＮ－γの発現レベルを検出した。
【0130】
図９は検出結果を示す。以上の結果から分かるように、非標的細胞Ｐａｎｃ０２ではＩＦＮ－γの放出は検出されず、ＮＴ細胞はＩＦＮ－γを発現しなかった。これは、本実施例のＣＡＲＴ細胞の殺傷が特異的であることを示している。標的細胞を殺すことから見れば、ＣＡＲのみを発現するＴ細胞と比べて、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ－７＋Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ－７＋ＣＣＬ１９、又はＩＬ－７＋ＸＣＬ１の追加発現は、いずれも抗原特異的ＩＦＮ－γレベルを有意に増加させた。
【0131】
実施例５ ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍抑制効果の検証
実施例１で調製された５×１０５個のＰａｎｃ０２－ｍＣＤ１９膵臓がん細胞を、健康なＣ５７ＢＬ／６マウスの左前肢の腋窩に皮下接種した。
実施例１で調製された５×１０５個のＰａｎｃ０２－ｍＣＤ１９膵臓がん細胞を、健康なＣ５７ＢＬ／６マウスの左前肢の腋窩に皮下接種した。
【0132】
膵臓がん細胞を接種したマウスを、それぞれ６匹のマウスからなる７つのグループにランダムに分けた。腫瘍体積が１００ｍｍ３に成長したとき、５×１０６個の実施例２によって調製されたＮＴ細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＸＣＬ１細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｆｌｔ３Ｌ細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＩＬ－７－ＣＣＬ１９細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＩＬ－７－Ｆｌｔ３Ｌ細胞、又はｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＩＬ－７－ＸＣＬ１細胞を尾静脈を介して各マウスに注射した。
【0133】
実験が終了するまで、マウスの体重及び腫瘍体積の変化をモニターした。
【0134】
図１０はマウスの体重の変化を示す。以上の結果から分かるように、ＣＡＲ－Ｔ細胞投与後、各群のマウスの体重は、対照群と比較して有意差はなく、観察期間中、腫瘍が１５００ｍｍを超えなかったとき、マウスは活動的であり、正常な毛色を有していた。これは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の投与がマウスに対して明らかな毒性や副作用をもたらさないことを示している。
【0135】
図１１はマウスの腫瘍体積の変化を示す。以上の結果から分かるように、ＮＴ細胞や従来のＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、ＸＣＬ１又はＦｌｔ３Ｌのみを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞は、抗腫瘍効果を有意に増強できなかった。これは、ＸＣＬ１又はＦｌｔ３ＬだけではＣＡＲ－Ｔ細胞との相乗効果をもたらすことができないことを示している。また、ＩＬ－７とＣＣＬ１９を共発現するＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果は、従来のＣＡＲ－Ｔ細胞よりも有意に優れており、これは以前の報告と一致している。なお、本発明者らは、ＩＬ－７＋ＸＣＬ１及びＩＬ－７＋Ｆｌｔ３Ｌの組み合わせが、ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍抑制効果を有意に改善するだけでなく、ＣＡＲ－Ｔに対するＩＬ－７＋ＣＣＬ１９の組み合わせの強化効果よりもはるかに優れていることを見出した。これは、予想以上のことであった。そのうち、ＩＬ－７とＸＣＬ１を共発現するＣＡＲ－Ｔ細胞は、腫瘍抑制効果が最も高く、有意な再発せず、腫瘍をほぼ完全に消失させた。
【0136】
図１２はマウスの生存曲線を示す。以上の結果から分かるように、従来のＣＡＲ－Ｔ細胞療法と比較して、追加発現したＸＣＬ１又はＦｌｔ３Ｌのみでは、マウスの生存期間を有意に延長しなかったが、ＩＬ－７＋ＣＣＬ１９、ＩＬ－７＋Ｆｌｔ３Ｌ、又はＩＬ－７＋ＸＣＬ１を共発現するＣＡＲ－Ｔ細胞は、マウスの生存を効果的に延長することができた。そのうち、ＩＬ－７＋ＸＣＬ１グループでは、５匹のマウスが完全寛解を達成し、実験が終了するまで腫瘍のない生存を維持し、１匹のマウスが非常に良好な部分寛解を達成し、腫瘍抑制状態を維持し続けた。ＩＬ－７＋Ｆｌｔ３Ｌグループでは、実験終了時に３匹のマウスが完全寛解を維持していました。ＩＬ－７＋ＣＣＬ１９群では、２匹のマウスが実験終了時に完全寛解を維持し、腫瘍のない生存を維持した。残りのマウスは、実験の初期段階では従来のＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して一定の腫瘍抑制効果があったが、実験の後半では腫瘍抑制効果が消失し、マウスが死亡した。
【0137】
上記の結果から分かるように、ＩＬ－７＋ＸＣＬ１、又はＩＬ－７＋Ｆｌｔ３Ｌの共発現は、標的膵臓がん細胞に対する改変免疫細胞の阻害効果を効果的に増強し、生存率を大幅に改善し、強化効果は、従来のＩＬ－７＋ＣＣＬ１９の組み合わせよりも優れている。
【0138】
なお、上記は、本発明の好ましい実施形態にすぎず、本発明を限定するものではない。当業者にとって、本発明に様々な修正及び変更を有してもよい。本発明の精神及び原理から逸脱しない限り、行った如何なる変更、均等置換、改良等も、本出願の保護範囲内に属する。
【配列表フリーテキスト】
【0139】
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】
【国際調査報告】