特表 2023-515671 免疫療法に対する腫瘍細胞の感作のための方法及び組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-04-13

(54)【発明の名称】免疫療法に対する腫瘍細胞の感作のための方法及び組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/00 20060101AFI20230406BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230406BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230406BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20230406BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20230406BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20230406BHJP

   A61K 38/19 20060101ALI20230406BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230406BHJP

   A61K 38/43 20060101ALI20230406BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20230406BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20230406BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20230406BHJP

【ＦＩ】

A61K45/00

A61P35/00

A61K48/00

A61K31/7105

A61K31/7088

A61K31/713

A61K38/19

A61K39/395 U

A61K38/43

A61P37/04

C12N15/09 110

C12N15/113 Z ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022552550

(86)(22)【出願日】2021-03-03

(85)【翻訳文提出日】2022-10-28

(86)【国際出願番号】 US2021020697

(87)【国際公開番号】W WO2021178556

(87)【国際公開日】2021-09-10

(31)【優先権主張番号】62/985,004

(32)【優先日】2020-03-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】597160510

【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ヤング， タラ

(72)【発明者】

【氏名】ダリー， クリストファー

(72)【発明者】

【氏名】サーストン， ギャビン

【テーマコード（参考）】

4C084

4C085

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084AA13

4C084AA17

4C084BA44

4C084DA25

4C084DC01

4C084NA14

4C084ZB09

4C084ZB26

4C085AA14

4C085BB11

4C085EE03

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB09

4C086ZB26

(57)【要約】

オートファジーを阻害する薬剤を対象に投与することによるがんの治療または予防（例えば、がんを有する対象の腫瘍を標的とすることによる）に関連する方法及び組成物が、本明細書で提供される。特定の態様において、がん細胞を接触させるかまたはオートファジーを阻害する薬剤を投与することにより、がん細胞を腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）媒介殺傷に対して感作させる方法に関連する組成物の方法が、本明細書で提供される。本明細書では、オートファジー及び／またはＮＦ－κＢ経路を阻害することによって、Ｔ細胞殺傷（例えば、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）媒介殺傷）に対するがん細胞の感受性を増加させるための方法及び組成物が提供される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）媒介殺傷に対してがん細胞を感作させる方法であって、前記方法は、前記がん細胞のオートファジーを阻害する薬剤と前記がん細胞を接触させることを含む、前記方法。

【請求項2】

前記薬剤は、オートファジー遺伝子の発現または活性を阻害する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記オートファジー遺伝子は、ＡＴＧ１２、ＷＩＰＩ２、ＲＢ１ＣＣ１、ＰＩＫ３Ｃ３、ＡＴＧ９Ａ、ＡＴＧ２Ａ、ＡＴＧ５、ＡＴＧ１４、ＥＩ２４、ＮＲＢＦ２、ＡＴＧ１３、ＴＡＸ１ＢＰ１及びＡＴＧ１０から選択される、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記薬剤は、少なくとも１つのオートファジー遺伝子を改変し、前記少なくとも１つのオートファジー遺伝子を改変することにより前記オートファジー遺伝子の発現または活性が低下する、請求項２または請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記オートファジー遺伝子の前記改変は、欠失、挿入、置換またはこれらの組み合わせを含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記薬剤は、前記オートファジー遺伝子の配列を切断または結合するようにＣａｓ酵素を誘導するのに有効なガイドＲＮＡを含む組成物であり、前記ガイドＲＮＡは、前記オートファジー遺伝子内のガイドＲＮＡ標的配列をターゲットとするＤＮＡターゲティングセグメントを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記ガイドＲＮＡは、前記オートファジー遺伝子内の二本鎖切断及び一本鎖切断から選択される切断事象を提供するように構成される、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記ガイドＲＮＡ標的配列は、前記オートファジー遺伝子の開始コドンを含むか、またはそれに近接している、請求項６または７に記載の方法。

【請求項9】

前記ガイドＲＮＡ標的配列は、前記開始コドンの約１０００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０または５ヌクレオチド内である、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記ガイドＲＮＡは、前記ＤＮＡターゲティングセグメント及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む、請求項６～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡが互いにハイブリダイズする別個の分子であるモジュラーガイドＲＮＡである、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記組成物は、Ｃａｓタンパク質または前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列を更に含む、請求項６～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性型Ｃａｓタンパク質である、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記Ｃａｓタンパク質は、転写抑制因子ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓタンパク質である、請求項１２に記載の方法。

【請求項15】

前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項１３または１４に記載の方法。

【請求項16】

前記Ｃａｓ９分子は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質、またはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９タンパク質である、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記薬剤は、前記オートファジー遺伝子の配列を切断または結合するようにＣａｓ酵素を誘導するのに有効なガイドＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列を含む核酸を含む組成物であり、前記ガイドＲＮＡは、前記オートファジー遺伝子内のガイドＲＮＡ標的配列をターゲットとするＤＮＡターゲティングセグメントを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記ガイドＲＮＡ標的配列は、前記オートファジー遺伝子の開始コドンを含むか、またはそれに近接している、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記ガイドＲＮＡ標的配列は、前記開始コドンの約１０００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０または５ヌクレオチド内である、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記ガイドＲＮＡ標的配列は、前記オートファジー遺伝子のエクソン１またはエクソン２にある、請求項１７に記載の方法。

【請求項21】

前記ガイドＲＮＡは、前記ＤＮＡターゲティングセグメント及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む、請求項１７～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記ガイドＲＮＡは、前記ｃｒＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが互いにハイブリダイズする別個の分子であるモジュラーガイドＲＮＡである、請求項１７～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記組成物は、Ｃａｓタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を更に含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性型Ｃａｓタンパク質または転写抑制因子ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓタンパク質である、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項２３または２４に記載の方法。

【請求項26】

前記Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質、またはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９タンパク質である、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記薬剤は、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼまたはジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記薬剤は、ＲＮＡまたはタンパク質の活性を阻害する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記薬剤は、干渉核酸である、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記干渉核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記薬剤は、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３）阻害剤、Ｕｎｃ－５１様キナーゼ１（ＵＬＫ１）阻害剤、液胞タンパク質選別タンパク質１８（Ｖｐｓ１８）阻害剤、液胞タンパク質選別タンパク質３４（Ｖｐｓ３４）阻害剤、ユビキチン特異的ペプチダーゼ（ＵＳＰ１０またはＵＳＰ１３）阻害剤、チオキサントンベースのオートファジー阻害剤、ＡＴＧ４阻害剤、オートフィニブ、３－メチルアデニン、ワートマニン、塩化アンモニウム、バフィロマイシンＡ１、エフロルニチン、ロイペプチン、ベツリン酸、ＣＡ０７４、コルヒチン、タプシガルギン、バキュオリン－１、ビンブラスチン、デスメチルクロミプラミン、ＬＹ２９４００２、ＰＴ２１０、ＧＳＫ－２１２６４５８、スパウチン－１、ＳＡＲ４０５、化合物３１、ＶＰＳ３４－ＩＮ１、ＰＩＫ－ＩＩＩ、化合物６、ＭＲＴ６８９２１、ＳＢＩ－０２０６９６５、ペプスタチンＡ、Ｅ６４ｄ、クロミプラミン、ルカントン、クロロキン、ヒドロキシクロルキン、モネンシン、Ｌｙｓ０５、ＡＲＮ５１８７、化合物３０、ＭＰＴ０Ｌ１４５、ＲＯＣ３２５、ベルテポルフィン、ＮＳＣ１８５０５８及びＮＳＣ３７７０７１から選択される小分子オートファジー阻害剤である、請求項１に記載の方法。

【請求項32】

前記がん細胞は、肺癌細胞、乳癌細胞、結腸癌細胞、子宮頸癌細胞、膵臓癌細胞、腎癌細胞、胃癌細胞、胃腸癌細胞、肝臓癌細胞、骨癌細胞、血液癌細胞、神経組織癌細胞、黒色腫細胞、甲状腺癌細胞、卵巣癌細胞、精巣癌細胞、前立腺癌細胞、子宮頸癌細胞、膣癌細胞、または膀胱癌細胞である、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記がん細胞は、乳癌細胞である、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記がん細胞は、結腸癌細胞である、請求項３２に記載の方法。

【請求項35】

前記がん細胞は、肺癌細胞である、請求項３２に記載の方法。

【請求項36】

前記がん細胞は、卵巣癌細胞である、請求項３２に記載の方法。

【請求項37】

前記がん細胞は、子宮頸癌細胞である、請求項３２に記載の方法。

【請求項38】

前記がん細胞は、膀胱癌細胞である、請求項３２に記載の方法。

【請求項39】

前記がん細胞は、腎臓癌細胞である、請求項３２に記載の方法。

【請求項40】

前記がん細胞は対象内にあり、前記がん細胞のオートファジーを阻害する前記薬剤は、前記対象に投与される、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記対象は、ヒト対象である、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）媒介殺傷に対して対象のがん細胞を感作させる方法であって、前記方法は、前記がん細胞のオートファジーを阻害する薬剤を前記対象に投与することを含む、前記方法。

【請求項43】

対象のがん細胞の腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）媒介殺傷を増加させる方法であって、前記方法は、前記がん細胞のオートファジーを阻害する少なくとも１つの薬剤を前記対象に投与することを含む、前記方法。

【請求項44】

前記薬剤は、オートファジー遺伝子の発現または活性を阻害する、請求項４２または請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記オートファジー遺伝子は、ＡＴＧ１２、ＷＩＰＩ２、ＲＢ１ＣＣ１、ＰＩＫ３Ｃ３、ＡＴＧ９Ａ、ＡＴＧ２Ａ、ＡＴＧ５、ＡＴＧ１４、ＥＩ２４、ＮＲＢＦ２、ＡＴＧ１３、ＴＡＸ１ＢＰ１及びＡＴＧ１０から選択される、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記薬剤は、少なくとも１つのオートファジー遺伝子を改変し、前記少なくとも１つのオートファジー遺伝子を改変することにより前記オートファジー遺伝子の発現または活性が低下する、請求項４４または請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記オートファジー遺伝子の前記改変は、欠失、挿入、置換、これらの組み合わせ、またはＣａｓタンパク質の結合を含む、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記薬剤は、前記オートファジー遺伝子の配列を切断または結合するようにＣａｓ酵素を誘導するのに有効なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む組成物であり、前記ガイドＲＮＡは、前記オートファジー遺伝子内のガイドＲＮＡ標的配列をターゲットとするＤＮＡターゲティングセグメントを含む、請求項４２～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記ガイドＲＮＡは、前記オートファジー遺伝子内の二本鎖切断及び一本鎖切断から選択される切断事象を提供するように構成される、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記ガイドＲＮＡ標的配列は、前記オートファジー遺伝子の開始コドンを含むか、またはそれに近接している、請求項４８または４９に記載の方法。

【請求項51】

前記ガイドＲＮＡ標的配列は、前記開始コドンの約１０００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０または５ヌクレオチド内である、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

前記ガイドＲＮＡ標的配列は、前記オートファジー遺伝子のエクソン１またはエクソン２にある、請求項４８または４９に記載の方法。

【請求項53】

前記ガイドＲＮＡは、前記ＤＮＡターゲティングセグメント及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む、請求項４８～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

前記ガイドＲＮＡは、前記ｃｒＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが互いにハイブリダイズする別個の分子であるモジュラーガイドＲＮＡである、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

前記組成物は、Ｃａｓタンパク質または前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列を更に含む、請求項４８～５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

前記Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性型Ｃａｓタンパク質または転写抑制因子ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓタンパク質である、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項５４～５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

前記Ｃａｓ９分子は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質、またはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９タンパク質である、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

前記薬剤は、前記オートファジー遺伝子の配列を切断または結合するようにＣａｓ酵素を誘導するのに有効なガイドＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列を含む核酸を含む組成物であり、前記ガイドＲＮＡは、前記オートファジー遺伝子内のガイドＲＮＡ標的配列をターゲットとするＤＮＡターゲティングセグメントを含む、請求項４２～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

前記ガイドＲＮＡ標的配列は、前記オートファジー遺伝子の開始コドンを含むか、またはそれに近接している、請求項５９に記載の方法。

【請求項61】

前記ガイドＲＮＡ標的配列は、前記開始コドンの約１０００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０または５ヌクレオチド内である、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

前記ガイドＲＮＡ標的配列は、前記オートファジー遺伝子のエクソン１またはエクソン２にある、請求項５９に記載の方法。

【請求項63】

前記ガイドＲＮＡは、前記ＤＮＡターゲティングセグメント及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む、請求項５９～６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

前記ガイドＲＮＡは、前記ｃｒＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが互いにハイブリダイズする別個の分子であるモジュラーガイドＲＮＡである、請求項３に記載の方法。

【請求項65】

前記組成物は、Ｃａｓタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を更に含む、請求項６３または６４に記載の方法。

【請求項66】

前記Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性型Ｃａｓタンパク質または転写抑制因子ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓタンパク質である、請求項６５に記載の方法。

【請求項67】

前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項６４～６６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項68】

前記Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質、またはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９タンパク質である、請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

前記薬剤は、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼまたはジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項４２～４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項70】

前記薬剤は、ＲＮＡまたはタンパク質の活性を阻害する、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項71】

前記薬剤は、干渉核酸である、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

前記干渉核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項７１に記載の方法。

【請求項73】

前記薬剤は、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３）阻害剤、Ｕｎｃ－５１様キナーゼ１（ＵＬＫ１）阻害剤、液胞タンパク質選別タンパク質１８（Ｖｐｓ１８）阻害剤、液胞タンパク質選別タンパク質３４（Ｖｐｓ３４）阻害剤、ユビキチン特異的ペプチダーゼ（ＵＳＰ１０またはＵＳＰ１３）阻害剤、チオキサントンベースのオートファジー阻害剤、ＡＴＧ４阻害剤、オートフィニブ、３－メチルアデニン、ワートマニン、塩化アンモニウム、バフィロマイシンＡ１、エフロルニチン、ロイペプチン、ベツリン酸、ＣＡ０７４、コルヒチン、タプシガルギン、バキュオリン－１、ビンブラスチン、デスメチルクロミプラミン、ＬＹ２９４００２、ＰＴ２１０、ＧＳＫ－２１２６４５８、スパウチン－１、ＳＡＲ４０５、化合物３１、ＶＰＳ３４－ＩＮ１、ＰＩＫ－ＩＩＩ、化合物６、ＭＲＴ６８９２１、ＳＢＩ－０２０６９６５、ペプスタチンＡ、Ｅ６４ｄ、クロミプラミン、ルカントン、クロロキン、ヒドロキシクロルキン、モネンシン、Ｌｙｓ０５、ＡＲＮ５１８７、化合物３０、ＭＰＴ０Ｌ１４５、ＲＯＣ３２５、ベルテポルフィン、ＮＳＣ１８５０５８及びＮＳＣ３７７０７１から選択される小分子オートファジー阻害剤である、請求項４２または請求項４３に記載の方法。

【請求項74】

前記がん細胞は、肺癌細胞、乳癌細胞、結腸癌細胞、子宮頸癌細胞、膵臓癌細胞、腎癌細胞、胃癌細胞、胃腸癌細胞、肝臓癌細胞、骨癌細胞、血液癌細胞、神経組織癌細胞、黒色腫細胞、甲状腺癌細胞、卵巣癌細胞、精巣癌細胞、前立腺癌細胞、子宮頸癌細胞、膣癌細胞、または膀胱癌細胞である、請求項４２～７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項75】

前記がん細胞は、乳癌細胞である、請求項７４に記載の方法。

【請求項76】

前記がん細胞は、結腸癌細胞である、請求項７４に記載の方法。

【請求項77】

前記がん細胞は、肺癌細胞である、請求項７４に記載の方法。

【請求項78】

前記がん細胞は、卵巣癌細胞である、請求項７４に記載の方法。

【請求項79】

前記がん細胞は、子宮頸癌細胞である、請求項７４に記載の方法。

【請求項80】

前記がん細胞は、膀胱癌細胞である、請求項７４に記載の方法。

【請求項81】

前記がん細胞は、腎臓癌細胞である、請求項７４に記載の方法。

【請求項82】

腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）媒介殺傷に対して対象の腫瘍を感作させる方法であって、前記方法は、前記腫瘍のオートファジーを阻害する薬剤を前記対象に投与することを含む、前記方法。

【請求項83】

対象の腫瘍の腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）媒介殺傷を増加させる方法であって、前記方法は、前記腫瘍のオートファジーを阻害する少なくとも１つの薬剤を前記対象に投与することを含む、前記方法。

【請求項84】

前記薬剤は、オートファジー遺伝子の発現または活性を阻害する、請求項８２または請求項８３に記載の方法。

【請求項85】

前記オートファジー遺伝子は、ＡＴＧ１２、ＷＩＰＩ２、ＲＢ１ＣＣ１、ＰＩＫ３Ｃ３、ＡＴＧ９Ａ、ＡＴＧ２Ａ、ＡＴＧ５、ＡＴＧ１４、ＥＩ２４、ＮＲＢＦ２、ＡＴＧ１３、ＴＡＸ１ＢＰ１及びＡＴＧ１０から選択される、請求項８４に記載の方法。

【請求項86】

前記薬剤は、少なくとも１つのオートファジー遺伝子を改変し、前記少なくとも１つのオートファジー遺伝子を改変することにより前記オートファジー遺伝子の発現または活性が低下する、請求項８４または請求項８５に記載の方法。

【請求項87】

前記オートファジー遺伝子の前記改変は、欠失、挿入、置換、これらの組み合わせ、またはＣａｓタンパク質の結合を含む、請求項８６に記載の方法。

【請求項88】

前記薬剤は、前記オートファジー遺伝子の配列を切断または結合するようにＣａｓ酵素を誘導するのに有効なガイドＲＮＡを含む組成物であり、前記ガイドＲＮＡは、前記オートファジー遺伝子内のガイドＲＮＡ標的配列をターゲットとするＤＮＡターゲティングセグメントを含む、請求項８２～８７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項89】

前記ｇＲＮＡは、前記オートファジー遺伝子内の二本鎖切断及び一本鎖切断から選択される切断事象を提供するように構成される、請求項８８に記載の方法。

【請求項90】

前記ガイドＲＮＡ標的配列は、前記オートファジー遺伝子の開始コドンを含むか、またはそれに近接している、請求項８８または８９に記載の方法。

【請求項91】

前記ガイドＲＮＡ標的配列は、前記開始コドンの約１０００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０または５ヌクレオチド内である、請求項９０に記載の方法。

【請求項92】

前記ガイドＲＮＡ標的配列は、前記オートファジー遺伝子のエクソン１またはエクソン２にある、請求項８８または８９に記載の方法。

【請求項93】

前記ガイドＲＮＡは、前記ＤＮＡターゲティングセグメント及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む、請求項８８～９２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項94】

前記ガイドＲＮＡは、前記ｃｒＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが互いにハイブリダイズする別個の分子であるモジュラーガイドＲＮＡである、請求項９３に記載の方法。

【請求項95】

前記組成物は、Ｃａｓタンパク質または前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列を更に含む、請求項８８～９４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項96】

前記Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性型Ｃａｓタンパク質または転写抑制因子ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓタンパク質である、請求項９５に記載の方法。

【請求項97】

前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項９４～９６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項98】

前記Ｃａｓ９分子は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質、またはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９タンパク質である、請求項９７に記載の方法。

【請求項99】

前記Ｃａｓ９分子は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質である、請求項９８に記載の方法。

【請求項100】

前記薬剤は、前記オートファジー遺伝子の配列を切断または結合するようにＣａｓ酵素を誘導するのに有効なｇＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列を含む核酸を含む組成物であり、前記ガイドＲＮＡは、前記オートファジー遺伝子内のガイドＲＮＡ標的配列をターゲットとするＤＮＡターゲティングセグメントを含む、請求項８２～８７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項101】

前記ガイドＲＮＡ標的配列は、前記オートファジー遺伝子の開始コドンを含むか、またはそれに近接している、請求項１００に記載の方法。

【請求項102】

前記ガイドＲＮＡ標的配列は、前記開始コドンの約１０００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０または５ヌクレオチド内である、請求項１００または１０１に記載の方法。

【請求項103】

前記ガイドＲＮＡ標的配列は、前記オートファジー遺伝子のエクソン１またはエクソン２にある、請求項１００に記載の方法。

【請求項104】

前記ガイドＲＮＡは、前記ＤＮＡターゲティングセグメント及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む、請求項１００～１０３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項105】

前記ガイドＲＮＡは、前記ｃｒＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが互いにハイブリダイズする別個の分子であるモジュラーガイドＲＮＡである、請求項１０４に記載の方法。

【請求項106】

前記組成物は、Ｃａｓタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を更に含む、請求項１００～１０５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項107】

前記Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性型Ｃａｓタンパク質または転写抑制因子ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓタンパク質である、請求項１０６に記載の方法。

【請求項108】

前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項１０５～１０７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項109】

前記Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質、またはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９タンパク質である、請求項１０８に記載の方法。

【請求項110】

前記薬剤は、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼまたはジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項８２～８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項111】

前記薬剤は、ＲＮＡまたはタンパク質の活性を阻害する、請求項８２～８５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項112】

前記薬剤は、干渉核酸である、請求項１１１に記載の方法。

【請求項113】

前記干渉核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１１２に記載の方法。

【請求項114】

前記薬剤は、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３）阻害剤、Ｕｎｃ－５１様キナーゼ１（ＵＬＫ１）阻害剤、液胞タンパク質選別タンパク質１８（Ｖｐｓ１８）阻害剤、液胞タンパク質選別タンパク質３４（Ｖｐｓ３４）阻害剤、ユビキチン特異的ペプチダーゼ（ＵＳＰ１０またはＵＳＰ１３）阻害剤、チオキサントンベースのオートファジー阻害剤、ＡＴＧ４阻害剤、オートフィニブ、３－メチルアデニン、ワートマニン、塩化アンモニウム、バフィロマイシンＡ１、エフロルニチン、ロイペプチン、ベツリン酸、ＣＡ０７４、コルヒチン、タプシガルギン、バキュオリン－１、ビンブラスチン、デスメチルクロミプラミン、ＬＹ２９４００２、ＰＴ２１０、ＧＳＫ－２１２６４５８、スパウチン－１、ＳＡＲ４０５、化合物３１、ＶＰＳ３４－ＩＮ１、ＰＩＫ－ＩＩＩ、化合物６、ＭＲＴ６８９２１、ＳＢＩ－０２０６９６５、ペプスタチンＡ、Ｅ６４ｄ、クロミプラミン、ルカントン、クロロキン、ヒドロキシクロルキン、モネンシン、Ｌｙｓ０５、ＡＲＮ５１８７、化合物３０、ＭＰＴ０Ｌ１４５、ＲＯＣ３２５、ベルテポルフィン、ＮＳＣ１８５０５８及びＮＳＣ３７７０７１から選択される小分子オートファジー阻害剤である、請求項８２または請求項８３に記載の方法。

【請求項115】

前記腫瘍は、腺癌、副腎腫瘍、肛門腫瘍、胆管腫瘍、膀胱腫瘍、骨腫瘍、脳／ＣＮＳ腫瘍、乳房腫瘍、子宮頸部腫瘍、結腸直腸腫瘍、子宮内膜腫瘍、食道腫瘍、ユーイング腫瘍、眼腫瘍、胆嚢腫瘍、胃腸腫瘍、腎臓腫瘍、喉頭または下咽頭腫瘍、肝臓腫瘍、肺腫瘍、中皮腫、多発性骨髄腫、筋肉腫瘍、鼻咽頭腫瘍、神経芽細胞腫、口腔腫瘍、骨肉腫、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、陰茎腫瘍、下垂体腫瘍、原発性腫瘍、前立腺腫瘍、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺腫瘍、軟部肉腫、黒色腫、転移性腫瘍、基底細胞癌、メルケル細胞腫瘍、精巣腫瘍、胸腺腫瘍、甲状腺腫瘍、子宮腫瘍、膣腫瘍、外陰腫瘍、またはウィルムス腫瘍である、請求項８２～１１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項116】

前記腫瘍は、乳房腫瘍である、請求項１１５に記載の方法。

【請求項117】

前記腫瘍は、結腸直腸腫瘍である、請求項１１５に記載の方法。

【請求項118】

前記腫瘍は、肺腫瘍である、請求項１１５に記載の方法。

【請求項119】

前記腫瘍は、卵巣腫瘍である、請求項１１５に記載の方法。

【請求項120】

前記腫瘍は、子宮頸部腫瘍である、請求項１１５に記載の方法。

【請求項121】

前記腫瘍は、膀胱腫瘍である、請求項１１５に記載の方法。

【請求項122】

前記腫瘍は、腎腫瘍である、請求項１１５に記載の方法。

【請求項123】

前記腫瘍は、原発性腫瘍である、請求項１１５～１２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項124】

前記腫瘍は、転移性腫瘍である、請求項１１５～１２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項125】

前記対象は、前記薬剤の投与前に化学療法薬を投与されている、請求項４２～１２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項126】

前記対象は、前記化学療法薬に対して抵抗性である、請求項１２５に記載の方法。

【請求項127】

前記薬剤は、全身的に投与される、請求項４２～１２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項128】

前記薬剤は、静脈内に投与される、請求項１２７に記載の方法。

【請求項129】

前記薬剤は、皮下に投与される、請求項４２～１２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項130】

前記薬剤は、筋肉内に投与される、請求項４２～１２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項131】

前記薬剤は、経口で投与される、請求項４２～１２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項132】

前記薬剤は、局所的に投与される、請求項４２～１２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項133】

前記対象は腫瘍を有し、前記少なくとも１つの薬剤は、前記腫瘍または腫瘍微小環境に局所的に投与される、請求項１３２に記載の方法。

【請求項134】

前記方法は、前記対象に追加の抗がん療法を施すことを更に含む、請求項４２～１３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項135】

前記追加の抗がん療法は、がん免疫療法である、請求項１３４に記載の方法。

【請求項136】

前記がん免疫療法は、自己もしくは同種Ｔ細胞療法、または自己もしくは同種ＣＡＲ Ｔ細胞療法を含む、請求項１３４または請求項１３５に記載の方法。

【請求項137】

前記がん免疫療法は、前記対象にＴＮＦ－αを投与することを含む、請求項１３５に記載の方法。

【請求項138】

前記がん免疫療法は、前記対象に免疫チェックポイント阻害剤を投与することを含む、請求項１３５に記載の方法。

【請求項139】

前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ－Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＭ－４、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰａｌｐｈａ（ＣＤ４７）、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ－２、ＩＬＴ－４、ＴＩＧＩＴ、ＨＨＬＡ２、ブチロフィリン及びＡ２ａＲから選択される免疫チェックポイントタンパク質に特異的な抗体を含む、請求項１３８に記載の方法。

【請求項140】

前記免疫チェックポイント阻害剤は、セミプリマブ（ＲＥＧＮ２８１０）、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ－１１０６、ＯＮＯ－４５３８）、ペムブロリズマブ（ＭＫ－３４７５、ＳＣＨ９００４７５）、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＲＧ７４４６、ＲＯ５５４１２６７）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６、ＭＥＤＩ－４７３６）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、イピリムマブ（ＢＭＳ－７３４０１６、ＩＢＩ３１０、ＭＤＸ－０１０）、ＳＨＲ１２１０、シンチリマブ（ＩＢＩ３０８）、スパルタリズマブ（ＰＤＲ００１）、チスレリズマブ（ＢＧＢ－Ａ３１７）、ピディリズマブ、ＢＣＤ－１００、トリパリマブ（ＪＳ００１）、ＢＡＹ１９０５２５４、ＡＳＰ８３７４、ＰＦ－０６８０１５９１、ＡＭＰ－２２４、ＡＢ１２２、ＡＫ１０５、ＡＭＧ４０４、ＢＣＤ－１００、ＢＩ７５４０９１、Ｆ５２０、ＨＬＸ１０、ＨＸ００８、ＪＴＸ－４０１４、ＬＺＭ００９、ＭＥＤＩ０６８０、ＭＧＡ０１２、Ｓｙｍ０２１、ＴＳＲ－０４２、ＰＳＢ２０５、ＭＧＤ０１９、ＭＧＤ０１３、ＡＫ１０４、ＸｍＡｂ２０７１７、ＲＯ７１２１６６１、ＣＸ－１８８、ＩＮＣＢ０８６５５０、ＦＳ１１８、ＢＣＤ－１３５、ＢＧＢ－Ａ３３３、ＣＢＴ－５０２、ＣＫ－３０１、ＣＳ１００１、ＦＡＺ０５３、ＨＬＸ２０、ＫＮ０３５、ＭＤＸ－１１０５、ＭＳＢ２３１１、ＳＨＲ－１３１６、ＴＧ－１５０１、ＺＫＡＢ００１、ＩＮＢＲＸ－１０５、ＭＣＬＡ－１４５、ＫＮ０４６、Ｍ７８２４、ＬＹ３４１５２４４、ＩＮＣＢ０８６５５０、ＣＡ－１７０、ＣＸ－０７２、ＡＤＵ－１６０４、ＡＧＥＮ１１８１、ＡＧＥＮ１８８４、ＭＫ－１３０８、ＲＥＧＮ４６５９、ＸｍＡｂ２２８４１、ＡＴＯＲ－１０１５、ＰＳＢ２０５、ＭＧＤ０１９、ＡＫ１０４、ＸｍＡｂ２０７１７、ＢＭＳ－９８６２４９、トレメリムマブ、ＢＭＳ－９８６２５８、ＢＧＢ－Ａ４２５、ＩＮＣＡＧＮ０２３９０、Ｓｙｍ０２３、ＪＮＪ６１６１０５８８、ＢＩ７５４１１１、ＬＡＧ５２５、ＭＫ－４２８０、ＲＥＧＮ３７６７、Ｓｙｍ０２２、ＴＳＲ－０３３、レラトリマブ、ＪＴＸ－２０１１、ＭＧＤ００９、ＢＭＳ－９８６２０７、ＯＭＰ－３１３Ｍ３２、ＭＫ－７６８４またはＴＳＲ－０２２である、請求項１３９に記載の方法。

【請求項141】

前記がん免疫療法は、前記対象にがんワクチンを投与することを含む、請求項１３５に記載の方法。

【請求項142】

対象のがんを治療する方法であって、前記方法は、前記対象のがん細胞のオートファジーを阻害する薬剤、及びがん免疫療法を前記対象に投与することを含む、前記方法。

【請求項143】

前記がん免疫療法は、自己もしくは同種Ｔ細胞療法、または自己もしくは同種ＣＡＲ Ｔ細胞療法を含む、請求項１４２に記載の方法。

【請求項144】

前記がん免疫療法は、前記対象にＴＮＦ－αを投与することを含む、請求項１４２に記載の方法。

【請求項145】

前記がん免疫療法は、前記対象に免疫チェックポイント阻害剤を投与することを含む、請求項１４２に記載の方法。

【請求項146】

前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ－Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＭ－４、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰａｌｐｈａ（ＣＤ４７）、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ－２、ＩＬＴ－４、ＴＩＧＩＴ、ＨＨＬＡ２、ブチロフィリン及びＡ２ａＲから選択される免疫チェックポイントタンパク質に特異的な抗体を含む、請求項１４５に記載の方法。

【請求項147】

前記免疫チェックポイント阻害剤は、セミプリマブ（ＲＥＧＮ２８１０）、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ－１１０６、ＯＮＯ－４５３８）、ペムブロリズマブ（ＭＫ－３４７５、ＳＣＨ９００４７５）、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＲＧ７４４６、ＲＯ５５４１２６７）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６、ＭＥＤＩ－４７３６）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、イピリムマブ（ＢＭＳ－７３４０１６、ＩＢＩ３１０、ＭＤＸ－０１０）、ＳＨＲ１２１０、シンチリマブ（ＩＢＩ３０８）、スパルタリズマブ（ＰＤＲ００１）、チスレリズマブ（ＢＧＢ－Ａ３１７）、ピディリズマブ、ＢＣＤ－１００、トリパリマブ（ＪＳ００１）、ＢＡＹ１９０５２５４、ＡＳＰ８３７４、ＰＦ－０６８０１５９１、ＡＭＰ－２２４、ＡＢ１２２、ＡＫ１０５、ＡＭＧ４０４、ＢＣＤ－１００、ＢＩ７５４０９１、Ｆ５２０、ＨＬＸ１０、ＨＸ００８、ＪＴＸ－４０１４、ＬＺＭ００９、ＭＥＤＩ０６８０、ＭＧＡ０１２、Ｓｙｍ０２１、ＴＳＲ－０４２、ＰＳＢ２０５、ＭＧＤ０１９、ＭＧＤ０１３、ＡＫ１０４、ＸｍＡｂ２０７１７、ＲＯ７１２１６６１、ＣＸ－１８８、ＩＮＣＢ０８６５５０、ＦＳ１１８、ＢＣＤ－１３５、ＢＧＢ－Ａ３３３、ＣＢＴ－５０２、ＣＫ－３０１、ＣＳ１００１、ＦＡＺ０５３、ＨＬＸ２０、ＫＮ０３５、ＭＤＸ－１１０５、ＭＳＢ２３１１、ＳＨＲ－１３１６、ＴＧ－１５０１、ＺＫＡＢ００１、ＩＮＢＲＸ－１０５、ＭＣＬＡ－１４５、ＫＮ０４６、Ｍ７８２４、ＬＹ３４１５２４４、ＩＮＣＢ０８６５５０、ＣＡ－１７０、ＣＸ－０７２、ＡＤＵ－１６０４、ＡＧＥＮ１１８１、ＡＧＥＮ１８８４、ＭＫ－１３０８、ＲＥＧＮ４６５９、ＸｍＡｂ２２８４１、ＡＴＯＲ－１０１５、ＰＳＢ２０５、ＭＧＤ０１９、ＡＫ１０４、ＸｍＡｂ２０７１７、ＢＭＳ－９８６２４９、トレメリムマブ、ＢＭＳ－９８６２５８、ＢＧＢ－Ａ４２５、ＩＮＣＡＧＮ０２３９０、Ｓｙｍ０２３、ＪＮＪ６１６１０５８８、ＢＩ７５４１１１、ＬＡＧ５２５、ＭＫ－４２８０、ＲＥＧＮ３７６７、Ｓｙｍ０２２、ＴＳＲ－０３３、レラトリマブ、ＪＴＸ－２０１１、ＭＧＤ００９、ＢＭＳ－９８６２０７、ＯＭＰ－３１３Ｍ３２、ＭＫ－７６８４またはＴＳＲ－０２２である、請求項１４５に記載の方法。

【請求項148】

前記がん免疫療法は、前記対象にがんワクチンを投与することを含む、請求項１４２に記載の方法。

【請求項149】

前記薬剤は、オートファジー遺伝子の発現または活性を阻害する、請求項１４２～１４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項150】

前記オートファジー遺伝子は、ＡＴＧ１２、ＷＩＰＩ２、ＲＢ１ＣＣ１、ＰＩＫ３Ｃ３、ＡＴＧ９Ａ、ＡＴＧ２Ａ、ＡＴＧ５、ＡＴＧ１４、ＥＩ２４、ＮＲＢＦ２、ＡＴＧ１３、ＴＡＸ１ＢＰ１及びＡＴＧ１０から選択される、請求項１４９に記載の方法。

【請求項151】

前記薬剤は、少なくとも１つのオートファジー遺伝子を改変し、前記少なくとも１つのオートファジー遺伝子を改変することにより前記オートファジー遺伝子の発現または活性が低下する、請求項１４９または請求項１５０に記載の方法。

【請求項152】

前記オートファジー遺伝子の前記改変は、欠失、挿入、置換、これらの組み合わせ、またはＣａｓタンパク質の結合を含む、請求項１５１に記載の方法。

【請求項153】

前記薬剤は、前記オートファジー遺伝子の配列を切断または結合するようにＣａｓ酵素を誘導するのに有効なガイドＲＮＡを含む組成物であり、前記ガイドＲＮＡは、前記オートファジー遺伝子内のガイドＲＮＡ標的配列をターゲットとするＤＮＡターゲティングセグメントを含む、請求項１４２～１５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項154】

前記ｇＲＮＡは、前記オートファジー遺伝子内の二本鎖切断及び一本鎖切断から選択される切断事象を提供するように構成される、請求項１５３に記載の方法。

【請求項155】

前記組成物は、Ｃａｓタンパク質または前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列を更に含む、請求項１５３または１５４に記載の方法。

【請求項156】

前記Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性型Ｃａｓタンパク質である、請求項１５５に記載の方法。

【請求項157】

前記Ｃａｓタンパク質は、転写抑制因子ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓタンパク質である、請求項１５５に記載の方法。

【請求項158】

前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項１５５～１５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項159】

前記Ｃａｓ９分子は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質、またはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９タンパク質である、請求項１５８に記載の方法。

【請求項160】

前記薬剤は、前記オートファジー遺伝子の配列を切断または結合するようにＣａｓ酵素を誘導するのに有効なガイドＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列を含む核酸を含む組成物であり、前記ガイドＲＮＡは、前記オートファジー遺伝子内のガイドＲＮＡ標的配列をターゲットとするＤＮＡターゲティングセグメントを含む、請求項１４２～１５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項161】

前記組成物は、Ｃａｓタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を更に含む、請求項１６０に記載の方法。

【請求項162】

前記Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性型Ｃａｓタンパク質である、請求項１６１に記載の方法。

【請求項163】

前記Ｃａｓタンパク質は、転写抑制因子ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓタンパク質である、請求項１６２に記載の方法。

【請求項164】

前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項１６１～１６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項165】

前記Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質、またはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９タンパク質である、請求項１６４に記載の方法。

【請求項166】

前記薬剤は、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼまたはジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項１４２～１５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項167】

前記薬剤は、ＲＮＡまたはタンパク質の活性を阻害する、請求項１４２～１５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項168】

前記薬剤は、干渉核酸である、請求項１６７に記載の方法。

【請求項169】

前記干渉核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１６８に記載の方法。

【請求項170】

前記薬剤は、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３）阻害剤、Ｕｎｃ－５１様キナーゼ１（ＵＬＫ１）阻害剤、液胞タンパク質選別タンパク質１８（Ｖｐｓ１８）阻害剤、液胞タンパク質選別タンパク質３４（Ｖｐｓ３４）阻害剤、ユビキチン特異的ペプチダーゼ（ＵＳＰ１０またはＵＳＰ１３）阻害剤、チオキサントンベースのオートファジー阻害剤、ＡＴＧ４阻害剤、オートフィニブ、３－メチルアデニン、ワートマニン、塩化アンモニウム、バフィロマイシンＡ１、エフロルニチン、ロイペプチン、ベツリン酸、ＣＡ０７４、コルヒチン、タプシガルギン、バキュオリン－１、ビンブラスチン、デスメチルクロミプラミン、ＬＹ２９４００２、ＰＴ２１０、ＧＳＫ－２１２６４５８、スパウチン－１、ＳＡＲ４０５、化合物３１、ＶＰＳ３４－ＩＮ１、ＰＩＫ－ＩＩＩ、化合物６、ＭＲＴ６８９２１、ＳＢＩ－０２０６９６５、ペプスタチンＡ、Ｅ６４ｄ、クロミプラミン、ルカントン、クロロキン、ヒドロキシクロルキン、モネンシン、Ｌｙｓ０５、ＡＲＮ５１８７、化合物３０、ＭＰＴ０Ｌ１４５、ＲＯＣ３２５、ベルテポルフィン、ＮＳＣ１８５０５８及びＮＳＣ３７７０７１から選択される小分子オートファジー阻害剤である、請求項１４２～１４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項171】

前記がん細胞は、肺癌細胞、乳癌細胞、結腸癌細胞、子宮頸癌細胞、膵臓癌細胞、腎癌細胞、胃癌細胞、胃腸癌細胞、肝臓癌細胞、骨癌細胞、血液癌細胞、神経組織癌細胞、黒色腫細胞、甲状腺癌細胞、卵巣癌細胞、精巣癌細胞、前立腺癌細胞、子宮頸癌細胞、膣癌細胞、または膀胱癌細胞である、請求項１４２～１７０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項172】

前記がん細胞は、乳癌細胞である、請求項１７１に記載の方法。

【請求項173】

前記がん細胞は、結腸癌細胞である、請求項１７１に記載の方法。

【請求項174】

前記がん細胞は、肺癌細胞である、請求項１７１に記載の方法。

【請求項175】

前記がん細胞は、卵巣癌細胞である、請求項１７１に記載の方法。

【請求項176】

前記がん細胞は、子宮頸癌細胞である、請求項１７１に記載の方法。

【請求項177】

前記がん細胞は、膀胱癌細胞である、請求項１７１に記載の方法。

【請求項178】

前記がん細胞は、腎臓癌細胞である、請求項１７１に記載の方法。

【請求項179】

前記対象は、ヒトである、請求項４２～１７８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項180】

腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）媒介殺傷に対して対象のがん細胞を感作させる際に使用するための、がん細胞のオートファジーを阻害する薬剤。

【請求項181】

対象のがん細胞の腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）媒介殺傷を増加させる際に使用するための、がん細胞のオートファジーを阻害する薬剤。

【請求項182】

がん細胞のオートファジーを阻害する薬剤、及びがんの治療に使用するためのがん免疫療法を含む、併用療法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年３月４日に出願された以下の米国仮特許出願第６２／９８５，００４号の利益を主張するものであり、この内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２１年３月３日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーはＲＰＢ－０２０２５＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、１４，３８３バイトのサイズである。

【背景技術】

【0003】

がんは、米国で２番目に多い死因である。免疫療法はがん治療を一変させたが、これらの治療に対する腫瘍細胞の耐性は大きな課題となっている。例えば、腫瘍細胞におけるβ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）またはＪＡＫ１／ＪＡＫ２の機能喪失変異は、チェックポイント遮断に対する臨床耐性と関連している。重要なことに、Ｔ細胞殺傷に対する腫瘍細胞の感受性を制御する分子メカニズムは、まだ十分に特性評価されていない。したがって、Ｔ細胞殺傷に対するがん細胞の感受性を高める治療を含む、がんの新規かつ効果的な治療の必要性が依然として存在する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

本明細書では、オートファジー及び／またはＮＦ－κＢ経路を阻害することによって、Ｔ細胞殺傷（例えば、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）媒介殺傷）に対するがん細胞の感受性を増加させるための方法及び組成物が提供される。また、本明細書では、がん細胞のオートファジー及び／またはＮＦ－κＢ経路を阻害することで、対象におけるがん細胞のＴ細胞殺傷（例えば、ＴＮＦ－α媒介殺傷）に対する感受性を増大させることによって、対象（例えば、それを必要とする対象）におけるがんを治療する及び／またはがんを防ぐための方法及び組成物も提供される。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、対象にがん治療（例えば、がん免疫療法）を施すことを更に含む。

【0005】

いくつかの態様において、がん細胞のオートファジー及び／またはＮＦ－κＢ経路を阻害する薬剤（例えば、本明細書に開示される少なくとも１つの薬剤）とがん細胞を接触させることによって、がん細胞をＴＮＦ－α媒介殺傷に対して感作させる方法が本明細書に提供される。特定の態様において、がん細胞のオートファジー及び／またはＮＦ－κＢ経路を阻害する少なくとも１つの薬剤（例えば、本明細書に開示される薬剤）を対象に投与することによって、対象におけるがん細胞のＴＮＦ－α媒介殺傷を増加させる方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、がん細胞は、対象内にある。いくつかの実施形態において、がん細胞は、腫瘍（例えば、対象の固形腫瘍）内にある。特定の実施形態において、方法は、対象にがん治療（例えば、がん免疫療法）を施すことを更に含む。

【0006】

いくつかの実施形態において、薬剤は、オートファジー遺伝子（すなわち、阻害されると細胞内のオートファジーレベルの低下をもたらす産物をコードする遺伝子）の発現または活性を阻害することによって、オートファジーを阻害する。いくつかの実施形態において、薬剤は、オートファジー遺伝子を標的とする（例えば、薬剤はオートファジー遺伝子の配列を改変する）。特定の実施形態において、薬剤は、オートファジー遺伝子産物（例えば、オートファジー遺伝子によってコードされるＲＮＡまたはタンパク質）を標的とする。いくつかの実施形態において、オートファジー遺伝子は、ＡＴＧ１２、ＷＩＰＩ２、ＲＢ１ＣＣ１、ＰＩＫ３Ｃ３、ＡＴＧ９Ａ、ＡＴＧ２Ａ、ＡＴＧ５、ＡＴＧ１４、ＥＩ２４、ＮＲＢＦ２、ＡＴＧ１３、ＴＡＸ１ＢＰ１及びＡＴＧ１０から選択され得る。

【0007】

いくつかの実施形態において、薬剤は、ＮＦ－κＢ経路遺伝子の発現または活性を阻害することによってＮＦ－κＢ経路を阻害する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＮＦ－κＢ経路遺伝子自体を標的とする（例えば、薬剤は、ＮＦ－κＢ経路遺伝子の配列を改変する）。特定の実施形態において、薬剤は、ＮＦ－κＢ経路遺伝子産物（例えば、ＮＦ－κＢ経路遺伝子によってコードされるＲＮＡまたはタンパク質）を標的とする。特定の実施形態において、ＮＦ－κＢ遺伝子は、ＣＦＬＡＲ、ＵＢＥ２Ｌ３、ＲＮＦ３１、ＩＫＢＫＢ、ＭＡＰ３Ｋ７、ＴＡＢ１、ＲＥＬＡ、ＩＫＫＢＫＧ、ＣＨＵＫ、ＴＡＢ２、ＴＢＫ１、ＭＡＰＫＡＰＫ２、ＲＢＣＫ１、ＴＲＡＦ２、ＳＨＡＲＰＩＮ及びＴＮＦＡＩＰ３から選択され得る。

【0008】

したがって、特定の実施形態において、薬剤は、少なくとも１つのオートファジー遺伝子またはＮＦ－κＢ遺伝子を改変することができ、少なくとも１つのオートファジー遺伝子及び／またはＮＦ－κＢ遺伝子の改変は、オートファジー遺伝子産物及び／またはＮＦ－κＢ遺伝子産物の発現低下及び／または活性低下をもたらす。特定の実施形態において、オートファジー遺伝子またはＮＦ－κＢ遺伝子の改変は、欠失、挿入、置換またはこれらの組み合わせを含み得る。特定の実施形態において、薬剤は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ剤、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼまたはジンクフィンガーヌクレアーゼであり得る。

【0009】

特定の実施形態において、薬剤は、オートファジー遺伝子もしくはＮＦ－κＢ遺伝子によってコードされるＲＮＡもしくはタンパク質の活性を阻害する、及び／またはそのレベルを低下させる。いくつかの実施形態において、薬剤は、オートファジー遺伝子またはＮＦ－κＢ遺伝子によってコードされるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を標的とする干渉核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド）であり得る。いくつかの実施形態において、薬剤は、オートファジーまたはＮＦ－κＢ経路の小分子阻害剤である。

【0010】

特定の実施形態において、本明細書で提供される方法は、追加の抗がん療法を対象に施すことを更に含む。いくつかの実施形態において、追加の抗がん療法は、がん免疫療法である。いくつかの実施形態において、がん免疫療法は、自己もしくは同種Ｔ細胞療法を対象に施すこと、自己もしくは同種ＣＡＲ Ｔ細胞療法を施すこと、がんワクチンを対象に投与すること、ＴＮＦ－αを対象に投与すること、及び／または免疫チェックポイント阻害剤を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、追加の抗がん療法は、対象へのＳｍａｃ模倣物（例えば、ＬＣＬ－１６１、ＡＰＧ－１３８７、ＴＬ３２７１１、ＧＤＣ－０９１７、ＨＧＳ１０２９、ＡＴ－４０６）の投与を含む。

【0011】

特定の態様において、対象のがん細胞をＴＮＦ－α媒介殺傷に対して感作させるのに使用するための、がん細胞におけるオートファジーを阻害する薬剤が、本明細書で提供される。更に、いくつかの態様において、対象のがん細胞のＴＮＦ－α媒介殺傷を増加させるのに使用するための、がん細胞におけるオートファジーを阻害する薬剤が、本明細書で提供される。いくつかの態様において、がん細胞におけるオートファジーを阻害する薬剤、及びがんの治療に使用するためのがん免疫療法を含む併用療法が、本明細書で提供される。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1-1】Ａ～Ｇの７つの部分を有し、ゲノム全体でのＣＲＩＳＰＲ ＫＯスクリーニングにより、細胞傷害性Ｔ細胞による殺傷を調節する腫瘍細胞遺伝子が同定されることを示している。Ａは、プールされたＣＲＩＳＰＲスクリーニングの概略図を示す。マウスＧｅＣＫＯ ｓｇＲＮＡライブラリーで改変されたＭＣ３８癌細胞に、Ｏｖａまたはスクランブル対照ペプチドを間欠的に投与し、次いで活性化Ｏｖａ特異的細胞傷害性Ｔ細胞と培養した。Ｔ細胞殺傷の後、生き残った腫瘍細胞でのｓｇＲＮＡ表現をイルミナシーケンシングによって評価した。生物学的三重反復を実施した（Ｂ、Ｄ、Ｆ）。腫瘍細胞殺傷を促進する（豊富なｓｇＲＮＡ）または制限する（枯渇したｓｇＲＮＡ）いずれかの遺伝子を示す火山プロット。殺傷を促進する対象遺伝子は、Ｂで強調されている（例えば、抗原提示、ＴＮＦαシグナル伝達、ｍＴＯＲシグナル伝達）。殺傷を制限する対象遺伝子は、Ｄ及びＦで強調されている（例えば、ＮＦ－κＢ経路、オートファジー）。Ｘ軸は、Ｚスコアを示す（スクランブルペプチドを間欠的に投与した細胞と比較して、Ｏｖａを間欠的に投与した細胞の各遺伝子を標的とする６つのｓｇＲＮＡの平均ｌｏｇ_２倍率変化から計算）。Ｙ軸は、ＭＡＧｅＣＫによって計算したＰ値を示す（Ｃ、Ｅ、Ｇ）。ライブラリー内の１２９，２０９個のｓｇＲＮＡすべてのｌｏｇ_２倍率変化の分布（頻度ヒストグラム）。目的の遺伝子を標的とする個々のｓｇＲＮＡは、Ｃでは斜線で、Ｅ及びＧでは斜線で示される。

【図1-2】同上。

【図1-3】同上。

【図1-4】同上。

【図1-5】同上。

【図1-6】同上。

【図1-7】同上。

【0013】

【図2-1】Ａ～Ｇの７つの部分を有し、ＴＮＦα媒介アポトーシスがＴ細胞による腫瘍細胞殺傷の重要な要素であることを示す。Ａは、ＴＮＦα／ＮＦ－κＢシグナル伝達の簡略化されたモデルを示す。Ｂは、対照（ＭＣ３８－ｍＧｅＣＫＯ）またはＢ２ｍ ＫＯ細胞にＯｖａペプチドを間欠的に投与し、１０μｇ／ｍｌのＴＮＦα遮断抗体またはアイソタイプ対照の存在下でＯＴ－１マウスからのＴ細胞と共にインキュベートしたことを示す。２４時間後に細胞生存率を測定した。棒グラフは、Ｔ細胞の非存在下で培養した細胞と比較した相対的な細胞生存率±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ＭＣ３８－ｍＧｅＣＫＯ＋対照Ａｂに対して、テューキーの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。＋Ｐ＜０．０５、ＭＣ３８－Ｂ２ｍＫＯ＋対照Ａｂに対して。Ｃは、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで２４時間処理したＭＣ３８細胞の生存率に対するカスパーゼ阻害（２５μＭのｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ）、Ｔｎｆｒｓｆ１ａ ＫＯ、Ｆａｄｄ ＫＯまたはＲｉｐｋ１ ＫＯの効果を示す。棒グラフは、相対的な細胞生存率±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。標的タンパク質の枯渇を確認するウエスタンブロットは、グラフの下に示されている。＊は、アッセイで使用されるＲｉｐｋ１ ＫＯを示す。Ｄは、指定された濃度のＴＮＦαを腫瘍細胞株に添加し、２４時間後に細胞生存率を測定したことを示す。ｎ＝３。Ｅは、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαを各細胞株へ添加してから２４時間後に指定されたタンパク質のレベルを示すウエスタンブロットを示す。Ｆ及びＧは、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで指定された時間処理した後のＭＣ３８またはＢ１６Ｆ１０細胞における指定されたタンパク質のレベルを示すウエスタンブロットを示す。

【図2-2】同上。

【図2-3】同上。

【図2-4】同上。

【0014】

【図3-1】Ａ～Ｇの７つの部分を有し、ＮＦ－κＢシグナル伝達がＴ細胞による腫瘍細胞殺傷を制限することを示す。Ａは、ＭＣ３８親細胞（モック）、空のベクターで形質導入されたＭＣ３８－Ｃａｓ９細胞またはＭａｐ３ｋ７標的化ｓｇＲＮＡを発現する細胞におけるＭａｐ３ｋ７（別名Ｔａｋ１）及びβ－アクチンタンパク質レベルを示すウエスタンブロットを示す（ｓｇ５及びｓｇ３はスクリーニングで最も顕著に枯渇しており、ｓｇ１は枯渇が最も少なかった）。Ｂは、対照またはＭａｐ３ｋ７ ＫＯ細胞にＯｖａペプチドを間欠的に投与し、指定されたＥ：Ｔ比でＯＴ－１Ｔ細胞と共に２４時間インキュベートしたことを示す。棒グラフは、Ｔ細胞の非存在下で培養した細胞と比較した相対的な細胞生存率±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、親ＭＣ３８細胞に対して、テューキーの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。＋＋Ｐ＜０．００５、＋＋＋＋Ｐ＜０．０００１、Ｍａｐ３ｋ７ ｓｇ５に対して。Ｃは、指定された細胞株のＴ細胞殺傷が２０μｇ／ｍｌのＴＮＦα遮断抗体の存在下で行われたことを示す。Ｄは、細胞が指定された濃度のＴＮＦαで処理され、２４時間後に細胞生存率が測定されたことを示す。ｎ＝３。Ｅは、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで処理してから２時間後の指定されたタンパク質のレベルを示すウエスタンブロットを示す。Ｆ及びＧは、細胞を指定された量のドキソルビシンまたはパクリタキセルで処理し、２４時間後に細胞生存率を測定したことを示す。ｎ＝３。

【図3-2】同上。

【0015】

【図4-1】Ａ～Ｆの６つの部分を有し、オートファジーがＴ細胞による腫瘍細胞殺傷を制限していることを示す。Ａは、ＭＣ３８親細胞（モック）、空のベクターで形質導入されたＭＣ３８－Ｃａｓ９細胞またはＲｂ１ｃｃ１標的化ｓｇＲＮＡを発現する細胞におけるＲｂ１ｃｃ１及びβ－アクチンタンパク質レベルを示すウエスタンブロットを示す（ｓｇ４及びｓｇ５はスクリーニングで最も顕著に枯渇しており、ｓｇ３は枯渇が最も少なかった）。Ｂは、対照またはＲｂ１ｃｃ１ ＫＯ細胞にＯｖａペプチドを間欠的に投与し、指定されたＥ：Ｔ比でＯＴ－１Ｔ細胞と共に２４時間インキュベートしたことを示す。棒グラフは、Ｔ細胞の非存在下で培養した細胞と比較した相対的な細胞生存率±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、親ＭＣ３８細胞に対して、テューキーの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。＋＋＋＋Ｐ＜０．０００１、Ｒｂ１ｃｃ１ ｓｇ４に対して。Ｃは、指定された細胞株のＴ細胞殺傷が２０μｇ／ｍｌのＴＮＦα遮断抗体の存在下で行われたことを示す。＊Ｐ＜０．０５、^＊＊＊Ｐ＜０．０００５、親ＭＣ３８細胞に対して。Ｄは、細胞が指定された濃度のＴＮＦαで処理され、２４時間後に細胞生存率が測定されたことを示す。Ｅ及びＦは、細胞を指定された量のドキソルビシンまたはパクリタキセルで処理し、２４時間後に細胞生存率を測定したことを示す。ｎ＝３。

【図4-2】同上。

【0016】

【図5-1】Ａ～Ｉの９つの部分を有し、オートファジーの阻害が、ＮＦ－βＢシグナル伝達への影響とは無関係に、ＴＮＦαを介したカスパーゼ８の活性化を促進することを示す。Ａは、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで処理してから４時間後の対照またはＲｂ１ｃｃ１ ＫＯ ＭＣ３８細胞における指定されたタンパク質のレベルを示すウエスタンブロットを示す。Ｂは、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで処理してから３０分後（Ｉｋ－Ｂα）または４時間後（Ａ２０）の対照またはＲｂ１ｃｃ１ ＫＯ細胞における指定されたタンパク質のレベルを示すウエスタンブロットを示す。Ｃは、対照またはＭａｐ３ｋ７（Ｔａｋ１）ＫＯ細胞における指定されたタンパク質のレベルを示すウエスタンブロットを示す。Ｄは、２５μＭのｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ（カスパーゼ阻害剤）の存在下または非存在下で、可溶性ＴＮＦαをＲｂ１ｃｃ１ ＫＯ細胞に２４時間添加したことを示す。棒グラフは、対照細胞（ＴＮＦαなし、カスパーゼ阻害剤なし）と比較した相対的な細胞生存率±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。群は、テューキーの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡによって比較した。Ｅは、５μＭのオートフィニブの非存在下または存在下で、ＭＣ３８細胞が未処理または１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで１６時間処理されたことを示す。棒グラフは、対照細胞（ＴＮＦαなし、オートフィニブなし）と比較した相対的な細胞生存率±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。Ｆは、５μＭのオートフィニブの非存在下または存在下で、未処理または１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで３０分間（Ｉｋ－Ｂα）または４時間（カスパーゼ－８、ｐ６２）処理した細胞における指定されたタンパク質のレベルを示すウエスタンブロットを示す。Ｇは、５μＭのオートフィニブまたは１μＭのＬＣＬ－１６１（Ｓｍａｃ模倣物）の非存在下または存在下で、対照、Ｔｎｆｒｓｆ１ａ ＫＯ、Ｆａｄｄ ＫＯまたはＲｉｐｋ１ ＫＯ細胞が未処理または１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで２４時間で処理されたことを示す。棒グラフは、対照細胞（ＴＮＦαまたは阻害剤を含まない空のベクター細胞）と比較した相対的な細胞生存率±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ＴＮＦαで処理した空のベクター細胞に対して。Ｈは、５０μＭのＮｅｃ－１（ネクロトーシス阻害剤）の非存在下または存在下で、ＴＮＦαをＲｂ１ｃｃ１ ＫＯ細胞に２４時間添加したことを示す。棒グラフは、対照細胞（ＴＮＦαなし、カスパーゼ阻害剤なし）と比較した相対的な細胞生存率±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。Ｉは、Ｌ９２９マウス線維芽細胞株及びＭＣ３８親細胞（モック）、空のベクターで形質導入されたＭＣ３８－Ｃａｓ９細胞またはＲｂ１ｃｃ１標的化ｓｇＲＮＡを発現する細胞におけるホスホＭＬＫＬ、総ＭＬＫＬ及びβ－アクチンレベルを示すウエスタンブロットを示す。細胞は、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα、５０μＭのＮｅｃ－１ｓ及び２０μＭのＺ－ＶＡＤ－ＦＭＫの存在下または非存在下で３０分間処理した。

【図5-2】同上。

【図5-3】同上。

【図5-4】同上。

【図5-5】同上。

【0017】

【図6-1】Ａ～Ｇの７つの部分を有し、腫瘍細胞におけるｍＴＯＲシグナル伝達が最大のＴＮＦα及びＴ細胞媒介殺傷に必要であることを示す。Ａは、空のベクターで形質導入されたＭＣ３８細胞またはＭｌｓｔ８標的化ｓｇＲＮＡを発現する細胞における指定されたタンパク質のレベルを示すウエスタンブロットを示す（ｓｇ４及びｓｇ１はスクリーニングで最も顕著に濃縮されており、ｓｇ３は最も少なく濃縮されていた）。Ｂは、対照またはＭｌｓｔ８ ＫＯ細胞が未処理または１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで２４時間処理されたことを示す。棒グラフは、対照細胞（ＴＮＦαなし）と比較した相対的な細胞生存率±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．００５、ＴＮＦαで処理した空のベクター細胞に対して、テューキーの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。Ｃは、対照またはＭｌｓｔ８ＫＯ細胞にＯｖａペプチドを間欠的に投与し、ＯＴ－１Ｔ細胞と共に２４時間インキュベートしたことを示す。棒グラフは、対照細胞（Ｔ細胞なし）と比較した相対的な細胞生存率±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．００５、Ｔ細胞と共にインキュベートした空のベクター細胞に対して。Ｄは、指定された時間、２００ｎＭのラパマイシンで処理されたＭＣ３８細胞における指定されたタンパク質のレベルを示すウエスタンブロットを示す。Ｅは、ビヒクルまたは２００ｎＭのラパマイシンで前処理したウェルを次いで未処理または１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで２４時間処理したことを示す。棒グラフは、対照細胞（ビヒクル、ＴＮＦαなし）と比較した相対的な細胞生存率±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。Ｆは、ビヒクルまたはラパマイシンで前処理した細胞に、スクランブル対照ペプチドまたはＯｖａペプチドのいずれかを間欠的に投与し、ＯＴ－１Ｔ細胞と共に２４時間インキュベートしたことを示す。棒グラフは、対照細胞（Ｔ細胞なし、スクランブルペプチド）と比較した相対的な細胞生存率±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。Ｇは、Ｔ細胞による殺傷を調節する腫瘍細胞経路を示す流れ図を示す。

【図6-2】同上。

【図6-3】同上。

【0018】

【図7-1】Ａ～Ｆの６つの部分を有し、オートファジーがヒト癌細胞のＣＤ３二重特異性抗体誘導殺傷を制限することを示す。Ａは、ヒトＺＲ－７５－１乳癌細胞が、５μＭのオートフィニブまたはＳＡＲ－４０５の非存在下または存在下で、未処理または１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで２４時間処理されたことを示す。棒グラフは、対照細胞（ビヒクル、ＴＮＦαなし）と比較した相対的な細胞生存率±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。群は、テューキーの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡによって比較した。Ｂは、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ^＊＊＊＊の非存在下または存在下で、ＺＲ－７５－１細胞を５μＭのオートフィニブまたはＳＡＲ－４０５で１６時間処理した後の指定されたタンパク質のレベルを示すウエスタンブロットを示す。Ｄは、５μＭのＳＡＲ－４０５の非存在下または存在下で、ＺＲ－７５－１細胞を、１２ｎｇ／ｍｌの対照または乳房腫瘍抗原ｘＣＤ３（ＴＡＡｘＣＤ３（Ｃに示されている））二重特異性抗体の存在下で指定されたＥ：Ｔ比で活性化ヒトＴ細胞と共に２４時間インキュベートしたことを示す。棒グラフは、対照細胞（Ｔ細胞なし、対照二重特異性抗体）と比較した相対的な細胞生存率±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。Ｅは、ＺＲ－７５－１対照またはＲｂ１ｃｃ１ ＫＯ細胞における指定されたタンパク質のレベルを示すウエスタンブロットを示す。Ｆは、ＺＲ－７５－１対照またはＲｂ１ｃｃ１ ＫＯ細胞を、上記のように二重特異性抗体を加えたＴ細胞と共にインキュベートしたことを示す。棒グラフは、対照細胞＋対照ｂｓＡｂと比較した相対的な細胞生存率±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。^＊＊Ｐ＜０．００５、対照細胞に対して。^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、対照細胞＋ＣＤ３ｂｓＡｂに対して。＋＋＋＋Ｐ＜０．０００１、Ｒｂ１ｃｃ１ ＫＯ＋ＣＤ３ｂｓＡｂに対して。

【図7-2】同上。

【図7-3】同上。

【0019】

【図8-1】Ａ～Ｇの７つの部分を有し、オートファジーの不活性化が免疫療法に対して腫瘍を感作させることを示す。Ａは、ＥＭＴ６対照（非標的ｓｇＲＮＡ）またはＲｂ１ｃｃ１ ＫＯ細胞における指定されたタンパク質のレベルを示すウエスタンブロットを示す。Ｂは、ＥＭＴ６対照またはＲｂ１ｃｃ１ ＫＯ細胞を１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで処理し、２４時間後に生存率を測定したことを示す。棒グラフは、対照細胞（対照、ＴＮＦαなし）と比較した相対的な細胞生存率±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。群は、テューキーの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡによって比較した。Ｃは、ＥＭＴ－６細胞（対照またはＲｂ１ｃｃ１ ＫＯ）がＢａｌｂ／ｃマウスに移植されたことを示す。移植の３日後、方法に記載されているように、アイソタイプ対照またはＰＤ－１プラスＣＴＬＡ－４遮断抗体のいずれかでマウスを処理した（群あたりｎ＝１０のマウス）。折れ線グラフは、各群の平均腫瘍体積±ＳＥＭを示す。群は、テューキーの多重比較検定による二元配置ＡＮＯＶＡによって比較した。Ｄは、各マウスの個々の腫瘍増殖曲線を示す。Ｅは、ＭＣ３８対照（非標的ｓｇＲＮＡ）またはＲｂ１ｃｃ１ ＫＯ細胞における指定されたタンパク質のレベルを示すウエスタンブロットを示す。Ｆは、ＭＣ３８細胞（対照またはＲｂ１ｃｃ１ ＫＯ）がＣ５７／ＢＬ６マウスに移植されたことを示す。マウスは、腫瘍が約７０ｍｍ^３のとき無作為化され（１群あたり７～１２匹のマウス）、アイソタイプ対照またはＰＤ－１プラスＣＴＬＡ－４遮断抗体のいずれかで処理した。折れ線グラフは、各群の平均腫瘍体積±ＳＥＭを示す。群は、テューキーの多重比較検定による二元配置ＡＮＯＶＡによって比較した。Ｇは、各マウスの個々の腫瘍増殖曲線を示す。

【図8-2】同上。

【図8-3】同上。

【図8-4】同上。

【0020】

【図9】Ａ～Ｃの３つの部分を有し、ＣＲＩＳＰＲ ＫＯスクリーニング条件を最適化するために使用されるＢ２Ｍノックアウト細胞の使用に関連する。Ａは、Ｂ２Ｍを標的とするｐＬｅｎｔｉ－Ｃａｓ９－Ｂｌａｓｔ及びｐＬｅｎｔｉ－ｇｕｉｄｅ－ｐｕｒｏに感染したＭＣ３８細胞のＢ２Ｍタンパク質レベルを示すウエスタンブロットを示す。Ｂは、ｍＧｅＣＫＯライブラリーを発現するように改変されたＭＣ３８細胞、または未処理もしくは＋／－１０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮｇで２４時間処理したｂ２Ｍ ＫＯ細胞におけるＨ２－Ｋｂ細胞表面発現のＦＡＣＳ分析を示す。Ｃは、Ｏｖａまたはスクランブルペプチドを間欠的に投与したＭＣ３８－Ｃａｓ９－ｍＧｅＣＫＯ細胞、及びＯｖａペプチドを間欠的に投与したＭＣ３８－Ｃａｓ９－Ｂ２Ｍノックアウト細胞のＴ細胞殺傷アッセイを示す。ＯＴ－１マウスから単離されたＣＤ８^＋Ｔ細胞は指定されたＥ：Ｔ比で細胞と共にインキュベートされ、生存率は２４時間後に測定された。

【0021】

【図10】枯渇したｓｇＲＮＡ及び豊富なｓｇＲＮＡの検出を可能にする、ライブラリー表現がＣＲＩＳＰＲ ＫＯスクリーニングの間ずっと十分に維持されていることを示す。Ｔ細胞殺傷後のスクランブル腫瘍細胞対Ｏｖａを間欠的に投与した腫瘍細胞におけるｌｏｇ_２正規化ｓｇＲＮＡ数。Ｒ^２＝０．９５。

【0022】

【図11】Ａ～Ｂの２つの部分を有し、ＭＣ３８細胞の増殖改変因子に関するＣＲＩＳＰＲ ＫＯスクリーニングがコア必須遺伝子の高い割合を同定することを示す。参照対照細胞と比較した、１２回の倍加で継代したＭＣ３８－ｍＧｅＣＫＯ細胞のＬｏｇ２正規化ｓｇＲＮＡ数（ライブラリー感染細胞の選択直後に採取）。Ａは、非標的ｓｇＲＮＡが示されていることを示す。非標的ｓｇＲＮＡの５／１０００だけが、参照対照と比較して２倍を超えて大幅に濃縮または枯渇していた。Ｂは、コア必須遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡを赤で示していることを示す。コア必須遺伝子の９６％（１０２／１０６）はヒットとして同定された（少なくとも２つのｓｇＲＮＡが２倍超で枯渇したと定義）。少なくとも４つのｓｇＲＮＡが、コア必須遺伝子の８５％超で枯渇していた。

【0023】

【図12】オートファジー遺伝子の遺伝子ノックアウトがＭＣ３８細胞の増殖を阻害しないことを示す。ＭＣ３８親細胞、空のベクターを発現する細胞、または指定されたオートファジー遺伝子を標的とする複数のｓｇＲＮＡを発現する細胞における１２回の集団倍加後の生存率アッセイ。

【0024】

【図13】予め活性化されたＴ細胞の細胞毒性機能がＴＮＦα遮断によって制限されないことを示す。ＭＣ３８（ＴＮＦα感受性）またはＢ１６Ｆ１０（ＴＮＦα耐性）細胞にＯｖａペプチドを間欠的に投与し、２０μｇ／ｍｌのＴＮＦα遮断抗体またはアイソタイプ対照抗体の存在下で、指定されたＥ：Ｔ比でＯＴ－１マウス由来のＴ細胞と共に指定された温度でインキュベートした。２４時間後に細胞生存率を測定した。棒グラフは、Ｔ細胞なしでインキュベートした腫瘍細胞と比較した相対的な細胞生存率±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊＊Ｐ＜０．０００５、対照抗体を含むＭＣ３８細胞に対して、テューキーの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。

【0025】

【図14】ＮＦ－κＢシグナル伝達経路が、ＴＮＦα媒介殺傷に耐性のある細胞株で活性であることを示す。１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで指定された時間処理した後のＥＭＴ６または４Ｔ１細胞における指定されたタンパク質のレベルを示すウエスタンブロット。

【0026】

【図15-1】Ａ～Ｇの７つの部分を有し、Ｒｂｃｋ１ ＫＯがＴ細胞による腫瘍細胞殺傷を増加させることを示す。Ａは、ＭＣ３８親細胞（モック）、空のベクターで形質導入されたＭＣ３８－Ｃａｓ９細胞またはＲｂｃｋ１標的化ｓｇＲＮＡを発現する細胞におけるＲｂｃｋ１及びβ－アクチンレベルを示すウエスタンブロットを示す（ｓｇ５及びｓｇ１はスクリーニングで最も顕著に枯渇しており、ｓｇ３は枯渇が最も少なかった）。Ｂは、対照またはＲｂｃｋ１ ＫＯ細胞にＯｖａペプチドを間欠的に投与し、指定されたＥ：Ｔ比でＯＴ－１Ｔ細胞と共に２４時間インキュベートしたことを示す。棒グラフは、Ｔ細胞の非存在下でインキュベートした細胞と比較した相対的な細胞生存率±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、親ＭＣ３８細胞に対して、テューキーの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。＋＋＋＋Ｐ＜０．０００１、Ｒｂｃｋ１ ｓｇ５に対して。Ｃは、指定された細胞株のＴ細胞殺傷が２０μｇ／ｍｌのＴＮＦα遮断抗体の存在下で行われたことを示す。^＊Ｐ＜０．０５、親ＭＣ３８細胞に対して。Ｄは、細胞が指定された濃度のＴＮＦαで処理され、２４時間後に細胞生存率が測定されたことを示す。ｎ＝３。Ｅは、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで処理してから２時間後の指定されたタンパク質のレベルを示すウエスタンブロットを示す。Ｆ及びＧは、細胞を指定された量のドキソルビシンまたはパクリタキセルで処理し、２４時間後に細胞生存率を測定したことを示す。ｎ＝３。

【図15-2】同上。

【0027】

【図16-1】Ａ～Ｇの７つの部分を有し、Ｒｂｌａ ＫＯがＴ細胞による腫瘍細胞殺傷を増加させることを示す。Ａは、ＭＣ３８親細胞（モック）、空のベクターで形質導入されたＭＣ３８－Ｃａｓ９細胞またはＲｅｌａ標的化ｓｇＲＮＡを発現する細胞におけるＲｅｌａ及びβ－アクチンレベルを示すウエスタンブロットを示す（ｓｇ２及びｓｇ３はスクリーニングで最も顕著に枯渇しており、ｓｇ６は枯渇が最も少なかった）。Ｂは、対照またはＲｅｌａ ＫＯ細胞にＯｖａペプチドを間欠的に投与し、指定されたＥ：Ｔ比でＯＴ－１Ｔ細胞と共に２４時間インキュベートしたことを示す。棒グラフは、Ｔ細胞の非存在下で培養した細胞と比較した相対的な細胞生存率±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。^＊＊Ｐ＜０．００５、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、親ＭＣ３８細胞に対して、テューキーの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。＋＋Ｐ＜０．００５、＋＋＋Ｐ＜０．０００５、Ｒｅｌａ ｓｇ２に対して。Ｃは、指定された細胞株のＴ細胞殺傷が２０μｇ／ｍｌのＴＮＦα遮断抗体の存在下で行われたことを示す。Ｄは、細胞が指定された濃度のＴＮＦαで処理され、２４時間後に細胞生存率が測定されたことを示す。ｎ＝３。Ｅは、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで処理してから２時間後の指定されたタンパク質のレベルを示すウエスタンブロットを示す。Ｆ及びＧは、細胞を指定された量のドキソルビシンまたはパクリタキセルで処理し、２４時間後に細胞生存率を測定したことを示す。ｎ＝３。

【図16-2】同上。

【0028】

【図17-1】Ａ～Ｇの７つの部分を有し、Ａｔｇ９ａ ＫＯがＴ細胞による腫瘍細胞殺傷を増加させることを示す。Ａは、ＭＣ３８親細胞（モック）、空のベクターで形質導入されたＭＣ３８－Ｃａｓ９細胞またはＡｔｇ９ａ標的化ｓｇＲＮＡを発現する細胞におけるＡｔｇ９ａ及びβ－アクチンレベルを示すウエスタンブロットを示す（ｓｇ２及びｓｇ１はスクリーニングで最も顕著に枯渇しており、ｓｇ４は枯渇が最も少なかった）。Ｂは、対照またはＡｔｇ９ａ ＫＯ細胞にＯｖａペプチドを間欠的に投与し、指定されたＥ：Ｔ比でＯＴ－１Ｔ細胞と共に２４時間インキュベートしたことを示す。棒グラフは、Ｔ細胞の非存在下で培養した細胞と比較した相対的な細胞生存率±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。^＊＊Ｐ＜０．００５、^＊＊＊Ｐ＜０．０００５、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、親ＭＣ３８細胞に対して、テューキーの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。＋Ｐ＜０．０５、＋＋＋＋Ｐ＜０．０００１、Ａｔｇ９ａ ｓｇ２に対して。Ｃは、指定された細胞株のＴ細胞殺傷が２０μｇ／ｍｌのＴＮＦα遮断抗体の存在下で行われたことを示す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．００５、^＊＊＊Ｐ＜０．０００５、親ＭＣ３８細胞に対して。＋Ｐ＜０．０５、Ａｔｇ９ａ ｓｇ２に対して。Ｄは、細胞が指定された濃度のＴＮＦαで処理され、２４時間後に細胞生存率が測定されたことを示す。ｎ＝３。Ｅは、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで処理してから８時間後の指定されたタンパク質のレベルを示すウエスタンブロットを示す。Ｆは、細胞を指定された量のドキソルビシンまたはパクリタキセルで処理し、２４時間後に細胞生存率を測定したことを示す。ｎ＝３。

【図17-2】同上。

【0029】

【図18-1】Ａ～Ｇの７つの部分を有し、Ａｔｇ１２ ＫＯがＴ細胞による腫瘍細胞殺傷を増加させることを示す。Ａは、ＭＣ３８親細胞（モック）、空のベクターで形質導入されたＭＣ３８－Ｃａｓ９細胞またはＡｔｇ１２標的化ｓｇＲＮＡを発現する細胞におけるＡｔｇ１２及びβ－アクチンレベルを示すウエスタンブロットを示す（ｓｇ３及びｓｇ５はスクリーニングで最も顕著に枯渇しており、ｓｇ６は枯渇が最も少なかった）。Ｂは、対照またはＡｔｇ１２ ＫＯ細胞にＯｖａペプチドを間欠的に投与し、指定されたＥ：Ｔ比でＯＴ－１Ｔ細胞と共に２４時間インキュベートしたことを示す。棒グラフは、Ｔ細胞の非存在下でインキュベートした細胞と比較した相対的な細胞生存率±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、親ＭＣ３８細胞に対して、テューキーの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。Ｃは、指定された細胞株のＴ細胞殺傷が２０μｇ／ｍｌのＴＮＦα遮断抗体の存在下で行われたことを示す。^＊＊Ｐ＜０．００５、^＊＊＊Ｐ＜０．０００５、親ＭＣ３８細胞に対して。Ｄは、細胞が指定された濃度のＴＮＦαで処理され、２４時間後に細胞生存率が測定されたことを示す。ｎ＝３。Ｅは、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで処理してから８時間後の指定されたタンパク質のレベルを示すウエスタンブロットを示す。Ｆ及びＧは、細胞を指定された量のドキソルビシンまたはパクリタキセルで処理し、２４時間後に細胞生存率を測定したことを示す。ｎ＝３。

【図18-2】同上。

【0030】

【図19】Ａ～Ｂの２つの部分を有し、Ｒｂ１ｃｃ１及びＡｔｇ１２ ＫＯ細胞が損なわれたオートファジー活性を示すことを示す。Ａは、ＭＣ３８親細胞（モック）、空のベクターで形質導入されたＭＣ３８－Ｃａｓ９細胞またはＲｂ１ｃｃ１標的化ｓｇＲＮＡを発現するＭＣ３８－Ｃａｓ９細胞におけるＬＣ３Ｂ及びβ－アクチンタンパク質レベルを示すウエスタンブロットを示す（Ｒｂ１ｃｃ１ｓｇ３は、Ｒｂ１ｃｃ１タンパク質を枯渇させる効果がｓｇ４またはｓｇ５よりも低かった－図４を参照）。Ｂは、ＭＣ３８親細胞（モック）、空のベクターで形質導入されたＭＣ３８－Ｃａｓ９細胞またはＡｔｇ１２標的化ｓｇＲＮＡを発現するＭＣ３８－Ｃａｓ９細胞におけるＬＣ３Ｂ及びβ－アクチンレベルを示すウエスタンブロットを示す。細胞は、オートファジーが上流で阻害されない限り、ＬＣ３Ｂ－ＩＩの蓄積をもたらす、リソソームプロテアーゼを阻害するために１０μｇ／ｍｌのペプスタチンＡ及び１０μｇ／ｍｌのＥ－６４－Ｄで４時間処理した。ＬＣ３Ｂ－ＩＩは、タンパク質の脂質付加型（ホスファチジルエタノールアミンに結合）を表す。

【0031】

【図20】オートファジーの不活性化が、ＮＦ－βＢ標的遺伝子のＴＮＦα媒介誘導を損なわないことを示す。対照またはＲｂ１ｃｃ１ ＫＯ ＭＣ３８細胞は、未処理または１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで４時間処理した。次に、細胞溶解物をマウスサイトカインアレイでアッセイし、４０種類のマウスサイトカインのレベルを測定した。ＴＮＦαによって増加したサイトカインを標識する。

【0032】

【図21-1】Ａ～Ｃの３つの部分を有し、オートファジーの薬理学的遮断がヒトがん細胞をＴＮＦα及びＴＲＡＩＬ媒介殺傷に対して感作させることを示す。Ａは、５μＭのオートフィニブの非存在下または存在下で、ＨＣＴ－１１６ヒト結腸癌細胞が、未処理または１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαまたは１０ｎｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬで処理されたことを示す。２４時間後に細胞生存率を測定した。Ｂは、５μＭのオートフィニブの非存在下または存在下で、ＨｅＬａヒト子宮頸癌細胞が、未処理または５０ｎｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬで処理されたことを示す。２４時間後に細胞生存率を測定した。棒グラフは、相対的な細胞生存率±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。処理群は、テューキーの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡによって比較した。Ｃは、５ｍＭのオートフィニブの非存在下または存在下で、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαまたは１０ｎｇ／ｍのＴｒａｉｌで処理してから２４時間後のＨＣＴ－１１６細胞における指定されたタンパク質のレベルを示すウエスタンブロットを示す。Ｄは、５μＭのオートフィニブの非存在下または存在下で、５０ｎｇ／ｍのＴＲＡＩＬで処理してから２４時間後のＨｅＬａ細胞における指定されたタンパク質のレベルを示すウエスタンブロットを示す。Ｅは、５μＭのＳＡＲ４０５もしくはオートフィニブの非存在下または存在下で、未処理または１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαもしくは１０ｎｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬで処理したＭＣ３８細胞について観察した結果をまとめたグラフである。２４時間後に細胞生存率を測定した。Ｆは、５μＭのＳＡＲ４０５もしくはオートフィニブの非存在下または存在下で、未処理または１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαもしくは１０ｎｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬで処理したＥＭＴ６細胞について観察した結果をまとめたグラフである。２４時間後に細胞生存率を測定した。棒グラフは、相対的な細胞生存率±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、未処理細胞に対して、テューキーの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。

【図21-2】同上。

【0033】

【図22-1】Ａ～Ｂの２つの部分を有し、オートファジーの薬理学的遮断が、複数のマウス及びヒトがん細胞株をＴＮＦα媒介殺傷に対して感作させることを示す。Ａは、マウス腫瘍細胞株（ＥＭＴ６、ＬＬ／２、ＣＴ２６、Ｃｏｌｏｎ２６）が、５μＭのオートフィニブの非存在下または存在下にて、未処理または１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで処理され、細胞生存率を２４時間後に測定したことを示す。Ｂは、ヒト腫瘍細胞株（ＢＴ－２０、Ｍｅ－１８０、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１）が、５μＭのオートフィニブもしくは５μＭのＳＡＲ－４０５の非存在下または存在下にて、未処理または１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで処理され、細胞生存率を２４時間後に測定したことを示す。棒グラフは、相対的な細胞生存率±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。処理群は、テューキーの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡによって比較した。

【図22-2】同上。

【0034】

【図23-1】Ａ～Ｂの２つの部分を有し、ＭＣ３８細胞におけるオートファジー遺伝子のＫＯが、細胞表面ＭＨＣ－１レベルまたはＯＶＡペプチドの提示に影響を及ぼさないことを示す。Ａは、ＭＣ３８親細胞（モック）、空のベクターで形質導入されたＭＣ３８－Ｃａｓ９細胞、またはＲｂ１ｃｃ１、Ａｔｇ９ａもしくはＡｔｇ１２標的化ｓｇＲＮＡを発現する細胞におけるＭＨＣ－１（Ｈ２－ｋｂ）細胞表面発現を示す、フローサイトメトリーヒストグラムを示す。Ｂは、ＭＣ３８親細胞（モック）、空のベクターで形質導入されたＭＣ３８－Ｃａｓ９細胞、またはＲｂ１ｃｃ１標的化ｓｇＲＮＡを発現する細胞におけるＭＨＣ－１（Ｈ２－ｋｂ）－Ｏｖａ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）細胞表面発現を示す、フローサイトメトリーヒストグラムを示す。示されるように、染色前に細胞に、Ｏｖａ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）ペプチドまたはスクランブルペプチドを間欠的に投与した。

【図23-2】同上。

【0035】

【図24】オートファジーの活性化が、重要なＴＮＦα経路成分のレベルを増加させないことを示す。１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで処理してから３０分後の、ＭＣ３８親細胞（モック）、空のベクターで形質導入されたＭＣ３８－Ｃａｓ９細胞、またはＲｂ１ｃｃ１標的化ｓｇＲＮＡを発現する細胞における、指定されたタンパク質のレベルを示すウエスタンブロット。

【0036】

【図25】ＭＣ３８腫瘍をＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４抗体で早期に治療することが、完全な腫瘍縮小をもたらすことを示す。ＭＣ３８細胞をＣ５７／ＢＬ６マウスに移植した。移植の３日後、マウスは、アイソタイプ対照またはＰＤ－１プラスＣＴＬＡ－４遮断抗体のいずれかで処理した。各マウスの個々の腫瘍増殖曲線が示される。ｎ＝１５。

【0037】

【図26-1】腫瘍のオートファジーの遺伝的不活性化が、白血球浸潤に影響を及ぼすことを示す。ＭＣ３８及びＥＭＴ６親またはＲｂ１ｃｃ１ ＫＯ腫瘍のＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋ならびにＣＤ８＋細胞のフローサイトメトリー分析が示されている。グラフは、指定された中央値による個々の腫瘍を示す（ｎ＝４）。群は、テューキーの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡによって比較した。

【図26-2】同上。

【発明を実施するための形態】

【0038】

概要
本明細書の開示は、部分的には、オートファジー開始、膜物質の移動またはオートファゴソーム拡大の阻害を含むオートファジー経路の阻害が、がん細胞をＴＮＦα媒介殺傷（例えば、Ｔ細胞による）に対して感作させたという発見に基づいている。更に、出願人は、ＮＦ－κＢ経路の阻害が、ＴＮＦ－α媒介殺傷に対してがん細胞を感作させることを本明細書で示した。特に、本明細書に示されるように、オートファジーの遺伝的阻害は、腫瘍細胞をＴ細胞媒介殺傷に対してｉｎ ｖｉｖｏで感作させる。出願人は、オートファジー経路及びＮＦ－κＢ経路が免疫療法応答性の重要な調節因子であること、ならびにこれらの経路の阻害ががん治療、特にＴ細胞指向治療の有効性を高めることを本明細書で示す。

【0039】

したがって、特定の態様において、がん細胞のオートファジー及び／またはＮＦ－κＢ経路を阻害する薬剤（例えば、本明細書に開示される薬剤）とがん細胞を接触させることによって、がん細胞をＴＮＦ－α媒介殺傷に対して感作させる方法が本明細書に提供される。いくつかの態様において、がん細胞のオートファジー及び／またはＮＦ－κＢ経路を阻害する１つの薬剤（例えば、本明細書に開示される薬剤）を対象に投与することによって、対象におけるがん細胞をＴＮＦ－α媒介殺傷に対して感作させる方法が本明細書で提供される。

【0040】

他の態様において、がん細胞のオートファジー及び／またはＮＦ－κＢ経路を阻害する少なくとも１つの薬剤（例えば、本明細書に開示される薬剤）を対象に投与することによって、対象におけるがん細胞のＴＮＦ－α媒介殺傷を増加させる方法が本明細書で提供される。

【0041】

更なる態様において、本明細書に記載の方法は、腫瘍のオートファジー及び／またはＮＦ－κＢ経路を阻害する薬剤（例えば、本明細書に開示される薬剤）を対象に投与することによって、対象における腫瘍をＴＮＦ－α媒介殺傷に対して感作させる、または対象における腫瘍のＴＮＦ－α媒介殺傷を増加させる方法を含む。対象のがん細胞のオートファジー及び／またはＮＦ－κＢ経路を阻害する薬剤（例えば、本明細書に開示される薬剤）を対象に投与することによって、及び癌免疫療法などのＴＮＦ－α媒介殺傷を誘導する第２の薬剤を対象に投与することによって、対象におけるがんを治療する方法も本明細書に提供される。

【0042】

定義
「ａ」及び「ａｎ」という冠詞は、その冠詞の文法上の対象が１つまたは１つより多いこと（すなわち、少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用される。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または１つより多い要素を意味する。

【0043】

「薬剤」という用語は、本明細書では、化学化合物、小分子、化学化合物の混合物、生物学的巨大分子（核酸（例えば、干渉核酸）、抗体、抗体断片、タンパク質、ペプチドなど）、生体高分子の混合物及び／またはこれらの組み合わせを示すために使用する。特定の実施形態において、本明細書の薬剤は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の構成成分を含む組成物である。そのような薬剤の活性は、それらを、対象において局所的もしくは全身的に作用する生物学的、生理学的または薬理学的に活性な物質である「治療剤」として適切にすることができる。

【0044】

本明細書で使用する場合、「オートファジー遺伝子」は、阻害されると細胞内のオートファジーレベルの低下をもたらす産物をコードする遺伝子である。

【0045】

本明細書で使用する場合、「がん」という用語は、固形腫瘍及び血液由来腫瘍を含むが、これらに限定されない。がんという用語は、皮膚、組織、器官、骨、軟骨、血液、及び脈管の疾病を含む。「がん」という用語は、原発性がん及び転移性がんを更に包含する。

【0046】

「コドン最適化」は、アミノ酸を特定する３塩基対のコドンの組み合わせの多様性によって示されるように、コドンの縮重を利用し、一般に、天然アミノ酸配列を維持しながら、宿主細胞の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンで天然配列の少なくとも１つのコドンを置換することによって、特定の宿主細胞で発現を高めるために核酸配列を改変する工程を含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞または任意の他の目的の宿主細胞を含む所定の原核細胞または真核細胞において天然に存在する核酸配列に比べて高い使用頻度を有するコドンで置換するように改変することができる。コドン使用表は、例えば「Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」で容易に入手可能である。これらの表は、様々な方法で適応させることができる。参照によりその全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる、Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ２８：２９２を参照のこと。特定の宿主における発現のための特定の配列のコドン最適化のためのコンピューターアルゴリズムも利用可能である（例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅを参照）。

【0047】

核酸の「相補性」とは、核酸塩基基の配向により、核酸の一方の鎖のヌクレオチド配列が反対側の核酸鎖の別の配列と水素結合を形成することを意味する。ＤＮＡの相補的な塩基は通常、ＡとＴ及びＣとＧである。ＲＮＡでは、それは通常、ＣとＧ及びＵとＡである。相補性は、完全または実質的／十分であり得る。２つの核酸間の完全な相補性とは、２つの核酸が、二重鎖のすべての塩基がワトソン－クリック対によって相補的な塩基に結合される二重鎖を形成できることを意味する。「実質的」または「十分な」相補性とは、一方の鎖の配列が反対側の鎖の配列に完全及び／または完璧に相補的ではないが、一連のハイブリダイゼーション条件（例えば、塩濃度及び温度）で安定なハイブリッド複合体を形成するのに十分な結合が２つの鎖の塩基間で発生することを意味する。このような条件は、配列及び標準的な数学的計算を使用してハイブリダイズした鎖のＴｍ（融解温度）を予測することによって、または日常的な方法を使用してＴｍを経験的に決定することによって予測できる。Ｔｍは、２本の核酸鎖間で形成されたハイブリダイゼーション複合体の集団が５０％変性する（すなわち、二本鎖核酸分子の集団が半分解離して一本鎖になる）温度を含む。Ｔｍ未満の温度では、ハイブリダイゼーション複合体の形成が促進され、Ｔｍを超える温度では、ハイブリダイゼーション複合体中の鎖の融解または分離が促進される。Ｔｍは、例えば、Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（Ｇ＋Ｃ％）を使用して、１ＭのＮａＣｌ水溶液中の既知のＧ＋Ｃ含量を有する核酸について推定し得るが、他の既知のＴｍ計算では、核酸の構造的特性が考慮される。

【0048】

本明細書で使用する場合、「併用投与」という語句は、以前に投与された治療薬がまだ体内で有効である間に第２の薬剤が投与される（例えば、２つの薬剤が同時に対象に有効であり、２つの薬剤の相乗効果が含まれ得る）ように、２種類以上の異なる治療薬を投与する任意の形態を指す。

【0049】

「遺伝子」という用語は、産物（例えば、ＲＮＡ産物及び／またはポリペプチド産物）をコードする染色体内のＤＮＡ配列を指し、遺伝子が完全長ｍＲＮＡ（５’非翻訳配列及び３’非翻訳配列を含む）に対応するようにコード領域、コード領域を中断する任意の非コードイントロンならびに５’末端及び３’末端の両方でコード領域に隣接して位置決めされている配列を含む。「遺伝子」という用語はまた、調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー及び転写因子結合部位）、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム進入部位、サイレンサー、絶縁配列、及びマトリックス結合領域を含む、他の非コード配列も含む。これらの配列は、遺伝子のコード領域に近い（例えば、１０ｋｂ以内）場合もあるか、または離れた部位にあり得、遺伝子の転写及び翻訳のレベルまたは速度に影響を及ぼす。

【0050】

「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）に結合し、Ｃａｓタンパク質を標的ＤＮＡ内の特定の位置に標的化するＲＮＡ分子である。ガイドＲＮＡは、２つのセグメント、「ＤＮＡターゲティングセグメント」及び「タンパク質結合セグメント」を含み得る。「セグメント」は、ＲＮＡ中のヌクレオチドの連続伸長など分子のセクションまたは領域を含む。Ｃａｓ９のｇＲＮＡなどいくつかのｇＲＮＡは、２つの別々のＲＮＡ分子「アクチベーターＲＮＡ」（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）及び「ターゲッターＲＮＡ」（例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ）を含み得る。他のｇＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子（単一のＲＮＡポリヌクレオチド）であり、「単一分子ｇＲＮＡ」、「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」とも称され得る。例えば、国際特許第ＷＯ２０１３／１７６７７２号、同第ＷＯ２０１４／０６５５９６号、同第ＷＯ２０１４／０８９２９０号、同第ＷＯ２０１４／０９３６２２号、同第ＷＯ２０１４／０９９７５０号、同第ＷＯ２０１３／１４２５７８号及び同第ＷＯ２０１４／１３１８３３号を参照し、これらのそれぞれは参照によりその全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。例えば、Ｃａｓ９の場合、シングルガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡに（例えば、リンカーを介して）融合させたｃｒＲＮＡを含み得る。例えば、Ｃｐｆ１の場合、標的配列への結合を達成するために必要なのは、ｃｒＲＮＡだけである。「ガイドＲＮＡ」及び「ｇＲＮＡ」という用語は、二重分子（すなわち、モジュラー）ｇＲＮＡ及び単一分子ｇＲＮＡの両方を含む。

【0051】

本明細書で使用する場合、「ガイドＲＮＡ標的配列」という用語は、ガイドＲＮＡが相補鎖上でハイブリダイズする配列に対応する（すなわち、配列の逆相補）非相補鎖上の配列を特に指す。すなわち、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＰＡＭに隣接する非相補鎖上の配列を指す（例えば、Ｃａｓ９の場合、ＰＡＭの上流または５’）。ガイドＲＮＡ標的配列は、ガイドＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントに相当するが、ウラシルの代わりにチミンが含まれている。一例として、ＳｐＣａｓ９酵素のガイドＲＮＡ標的配列は、非相補鎖上の５’－ＮＧＧ－３’ＰＡＭの上流の配列を指し得る。

【0052】

「脂質粒子」という用語は、治療用核酸（例えば、ｇＲＮＡ）を目的の標的部位（例えば、細胞、組織、臓器など）に送達するために使用できる脂質製剤を含む。

【0053】

「脂質コンジュゲート」という用語は、脂質粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質を指す。そのような脂質コンジュゲートには、例えば、ジアルキルオキシプロピルに結合したＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲート）、ジアシルグリセロールに結合したＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＧコンジュゲート）、コレステロールに結合したＰＥＧ、ホスファチジルエタノールアミンに結合したＰＥＧ、及びセラミドにコンジュゲートしたＰＥＧ（例えば、米国特許第５，８８５，６１３号を参照）、カチオン性ＰＥＧ脂質、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート（例えば、ＰＯＺ－ＤＡＡコンジュゲート）、ポリアミドオリゴマー（例えば、ＡＴＴＡ脂質コンジュゲート）、ならびにこれらの混合物などのＰＥＧ－脂質コンジュゲートが含まれるが、これらに限定されない。ＰＯＺ－脂質コンジュゲートの更なる例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／００６２８２号に記載されている。ＰＥＧまたはＰＯＺは、脂質に直接コンジュゲートすることができるか、またはリンカー部分を介して脂質に結合し得る。例えば、非エステル含有リンカー部分及びエステル含有リンカー部分を含む、ＰＥＧまたはＰＯＺを脂質に結合するのに適した任意のリンカー部分を使用することができる。特定の実施形態において、アミドまたはカルバマートなどの非エステル含有リンカー部分が使用される。

【0054】

本明細書で使用する場合、「ＮＦ－κＢ遺伝子」は、阻害されると細胞内のＮＦ－κＢシグナル伝達レベルの低下をもたらす産物をコードする遺伝子である。

【0055】

本明細書で使用する場合、「天然に存在しない」系には、天然に存在する状態から変化または変異しているか、天然的に天然に関連する少なくとも１つの他の構成要素を少なくとも実質的に含まないか、または天然的に関連しない少なくとも１つの他の構成要素と関連している系の１つ以上の構成要素など、ヒトの手の関与を示すあらゆるものが含まれる。例えば、いくつかのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、天然では一緒に生じないｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含む天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ複合体を使用するか、天然では生じないＣａｓタンパク質を使用するか、または天然では生じないｇＲＮＡを使用する。

【0056】

本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」という表現は、主題化合物を身体の１つの器官または部分から身体の別の器官または部分に搬送または輸送することに関与する液体充填剤もしくは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、もしくは溶媒カプセル化材料などの薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを意味する。

【0057】

「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、区別なく使用される。これらは、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはその類似体のいずれかである、任意の長さのヌクレオチドの重合形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、既知または不明の任意の機能を果たし得る。ポリヌクレオチドの非限定的な例は、次のとおり、遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義された遺伝子座（複数可）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーである。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの組立て前またはその後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識成分との結合などによって更に修飾され得る。「組換え」ポリヌクレオチドという用語は、天然には存在しないか、もしくは非天然の配置で別のポリヌクレオチドに結合したゲノム、ｃＤＮＡ、半合成、または合成起源のポリヌクレオチドを意味する。

【0058】

核酸は、「５’末端」及び「３’末端」を有すると言われている。これは、１つのモノヌクレオチドペントース環の５’ホスファートがホスホジエステル結合を介して一方向に隣の３’酸素に結合するような方法で、モノヌクレオチドが反応してオリゴヌクレオチドを作成するためである。オリゴヌクレオチドの末端は、その５’ホスファートがモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に結合していない場合、「５’末端」と称される。オリゴヌクレオチドの末端は、その３’酸素が別のモノヌクレオチドペントース環の５’ホスファートに結合していない場合、「３’末端」と称される。核酸配列は、より大きなオリゴヌクレオチドの内部にある場合でも、５’末端及び３’末端を有すると言うことができる。線状または環状ＤＮＡ分子のいずれにおいても、別個の要素は、「下流」もしくは３’要素の「上流」または５’であると称される。

【0059】

「防ぐ」、「防ぐこと」、「防止」などの用語は、疾患、障害もしくは状態を有していないが、発症の危険性がある、もしくは発症する可能性がある対象の疾患、障害または状態を発症する可能性を低下させることを指す。

【0060】

「小分子」という用語は、当技術分野の用語であり、分子量約１０００未満または分子量約５００未満の分子を含む。一実施形態において、小分子はペプチド結合のみを含むわけではない。別の実施形態において、小分子はオリゴマーではない。活性についてスクリーニングし得る例示的な小分子化合物には、ペプチド、ペプチドミメティック、核酸、炭水化物、有機小分子（例えば、ポリケタイド）（Ｃａｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２：６３）、及び天然物抽出ライブラリーが含まれるが、これらに限定されない。

【0061】

「小分子ヘアピン型ＲＮＡ」または「低分子ヘアピン型ＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」には、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現を停止させるために使用できるタイトなヘアピンターンを作成する、低分子ＲＮＡ配列が含まれる。本明細書で提供されるｓｈＲＮＡは、化学的に合成されるか、またはＤＮＡプラスミド中の転写カセットから転写され得る。ｓｈＲＮＡヘアピン構造は、細胞機構によってｓｉＲＮＡに切断され、その後、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合する。

【0062】

本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、処置もしくは治療のために選択されたヒトまたは非ヒト動物を意味する。本明細書で提供される特定の実施形態において、対象はヒト対象である。本明細書で提供されるいくつかの実施形態において、対象は、がんを有する対象など本明細書で提供される方法を必要とする対象である。

【0063】

「ヌクレアーゼ剤の標的配列」という用語は、ヌクレアーゼ剤によりニックまたは二本鎖切断が誘導されるＤＮＡ配列が含まれる。同様に、「ＤＮＡ結合タンパク質の標的配列」という用語は、ＤＮＡ結合タンパク質が結合するＤＮＡ配列が含まれる。標的配列は、細胞にとって内在性（または、ネイティブ）であり得るか、または標的配列は、細胞にとって外来性であり得る。

【0064】

本明細書で使用する場合、「治療上有効な量」及び「有効量」という語句は、あらゆる医学的処置に適用される合理的な利益／リスク比で対象の細胞の少なくとも亜集団において所望の治療効果をもたらすのに有効な薬剤の量を意味する。

【0065】

対象の疾患を「治療する」または疾患を有する対象を「治療する」とは、疾患の少なくとも１つの症状が軽減されるか、または悪化が防止されるように、対象に薬物治療、例えば薬物の投与を施すことを指す。

【0066】

オートファジー及びＮＦ－κＢ経路
上述したように、本明細書の開示は、部分的には、オートファジー開始、膜物質の移動またはオートファゴソーム拡大の阻害を含むオートファジー経路の阻害が、がん細胞をＴＮＦα媒介殺傷（例えば、Ｔ細胞による）に対して感作させたという発見に基づいている。出願人は、オートファジー経路及びＮＦ－κＢ経路が免疫療法応答性の重要な調節因子であること、ならびにこれらの経路の阻害ががん治療、特にＴ細胞指向治療の有効性を高めることを本明細書で示す。

【0067】

したがって、がん細胞のオートファジー及び／またはＮＦ－κＢ経路を阻害する薬剤（例えば、本明細書に開示される少なくとも１つの薬剤）を対象に投与することによって、またはがん細胞を接触させることによって、がん細胞をＴＮＦ－α媒介殺傷に対して感作させる方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、薬剤は、オートファジー遺伝子及び／またはＮＦ－κＢ遺伝子の発現または活性を阻害する。本明細書で使用する場合、「オートファジー遺伝子」は、阻害されると細胞内のオートファジーレベルの低下をもたらす産物をコードする遺伝子を含むが、これに限定されない。オートファジー遺伝子は、例えば、ＡＴＧ１２、ＷＩＰＩ２、ＲＢ１ＣＣ１、ＰＩＫ３Ｃ３、ＡＴＧ９Ａ、ＡＴＧ２Ａ、ＡＴＧ５、ＡＴＧ１４、ＥＩ２４、ＮＲＢＦ２、ＡＴＧ１３、ＴＡＸ１ＢＰ１及びＡＴＧ１０であり得る。これらの例示的なオートファジー遺伝子のｍＲＮＡ、タンパク質及びゲノム（ＧＲＣｈ３８．ｐ１３一次アセンブリ）配列への例示的なＮＣＢＩ配列参照を、表１に提供する。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【0068】

いくつかの実施形態において、薬剤は、ＮＦ－κＢ遺伝子の発現または活性を阻害する。本明細書で使用する場合、「ＮＦ－κＢ遺伝子」は、阻害されると細胞内のＮＦ－κＢシグナル伝達レベルの低下をもたらす産物をコードする遺伝子を含むが、これに限定されない。ＮＦ－κＢ遺伝子は、例えば、ＣＦＬＡＲ、ＵＢＥ２Ｌ３、ＲＮＦ３１、ＩＫＢＫＢ、ＭＡＰ３Ｋ７、ＴＡＢ１、ＲＥＬＡ、ＩＫＫＢＫＧ、ＣＨＵＫ、ＴＡＢ２、ＴＢＫ１、ＭＡＰＫＡＰＫ２、ＲＢＣＫ１、ＴＲＡＦ２、ＳＨＡＲＰＩＮまたはＴＮＦＡＩＰ３であり得る。これらの例示的なＮＦ－κＢ遺伝子のｍＲＮＡ、タンパク質及びゲノム（ＧＲＣｈ３８．ｐ１３一次アセンブリ）配列への例示的なＮＣＢＩ配列参照を、表２に提供する。

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【0069】

他の態様において、がん細胞におけるオートファジー及び／またはＮＦ－κＢ経路を阻害する少なくとも１つの薬剤（例えば、表１もしくは表２の遺伝子などの少なくとも１つのオートファジー遺伝子または少なくとも１つのＮＦ－κＢ遺伝子を改変する薬剤など本明細書に開示される少なくとも１つの薬剤）を対象に投与することによって、対象におけるがん細胞のＴＮＦ－α媒介殺傷を増加させる方法が本明細書に提供される。腫瘍におけるオートファジー及び／またはＮＦ－κＢ経路を阻害する薬剤（例えば、表１もしくは表２の遺伝子などの少なくとも１つのオートファジー遺伝子または少なくとも１つのＮＦ－κＢ遺伝子を改変する薬剤など本明細書に開示される少なくとも１つの薬剤）を対象に投与することによって、対象の腫瘍をＴＮＦ－α媒介殺傷に対して感作させる、または対象における腫瘍のＴＮＦ－α媒介殺傷を増加させる方法も本明細書に開示される。対象のがん細胞及びがん療法（例えば、がん免疫療法）でオートファジー及び／またはＮＦ－κＢ経路を阻害する薬剤（例えば、表１もしくは表２の遺伝子などの少なくとも１つのオートファジー遺伝子または少なくとも１つのＮＦ－κＢ遺伝子を改変する薬剤など本明細書に開示される少なくとも１つの薬剤）を対象に投与することによって、対象のがんを治療する方法も本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのオートファジー遺伝子及び／またはＮＦ－κＢ遺伝子を改変することは、遺伝子の発現または活性の減少をもたらす。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのオートファジー遺伝子及び／またはＮＦ－κＢ遺伝子を改変することは、遺伝子の発現または活性の消失をもたらす。

【0070】

オートファジー及びＮＦ－κＢ経路の調節因子
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系
いくつかの実施形態において、オートファジー遺伝子（例えば、表１のオートファジー遺伝子）もしくはＮＦ－κＢ遺伝子（例えば、表２のＮＦ－κＢ遺伝子）の発現または活性を阻害する薬剤、及びその使用が、本明細書で提供される。特定の実施形態において、薬剤は、少なくとも１つのオートファジー遺伝子またはＮＦ－κＢ遺伝子を改変する薬剤であり得る（例えば、少なくとも１つの遺伝子を改変することは、遺伝子の発現もしくは活性を減少及び／または消失をもたらす）。いくつかの実施形態において、遺伝子の改変は、欠失、挿入、置換またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、改変プロセスは、Ｃａｓタンパク質の遺伝子への結合を含む。

【0071】

特定の実施形態において、オートファジー遺伝子（例えば、表１に列挙されるオートファジー遺伝子）もしくはＮＦ－κＢ遺伝子（例えば、表２に列挙されるＮＦ－κＢ遺伝子）の発現または活性を阻害する薬剤は、ガイドＲＮＡを含む組成物である。いくつかの実施形態において、薬剤は、ガイドＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列を含む核酸を含む組成物である。ガイドＲＮＡは、遺伝子内の配列を切断または結合するようにＣａｓ酵素を誘導するのに効果的であり得、ガイドＲＮＡは、遺伝子内のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするＤＮＡターゲティングセグメントを含む。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、遺伝子内の二本鎖切断及び一本鎖切断から選択される切断事象を提供するように構成される。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ標的配列は、遺伝子の開始コドンを含むか、またはそれに近接している。ガイドＲＮＡ標的配列は、開始コドンの約１０００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０または５ヌクレオチド内であり得る。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ標的配列は、標的化遺伝子のエクソン１に存在する。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ標的配列は、標的化遺伝子のエクソン２に存在する。いくつかの実施形態において、オートファジー遺伝子の発現または活性を阻害する薬剤は、複数のガイドＲＮＡを含む組成物である。例えば、いくつかの実施形態において、組成物は、標的化遺伝子の５’末端を標的とする第１のガイドＲＮＡ及び標的化遺伝子の３’末端を標的とする第２のガイドＲＮＡを含む（例えば、崩壊を誘導するために）。いくつかの実施形態において、組成物は、標的化遺伝子の機能ドメインを改変または欠失するように設計された二重ｇＲＮＡを含む。

【0072】

特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは、オートファジー遺伝子（例えば、表１に列挙されるオートファジー遺伝子）またはＮＦ－κＢ遺伝子（例えば、表２に列挙されるＮＦ－κＢ遺伝子）にハイブリダイズする少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む。一例として、少なくとも１５の連続するヌクレオチドは、表１もしく表２に提供される遺伝子配列とそれぞれ少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である表１に列挙されるオートファジー遺伝子または表２に列挙されるＮＦ－κＢ遺伝子のセグメントにハイブリダイズできる。任意選択で、ガイドＲＮＡは、表１または表２に提供される遺伝子配列の少なくとも１５の連続するヌクレオチドにハイブリダイズできる配列を含む。

【0073】

例えば、特定の実施形態において、細胞のゲノム中のオートファジー遺伝子（例えば、表１に列挙されるオートファジー遺伝子）またはＮＦ－κＢ遺伝子（例えば、表２に列挙されるＮＦ－κＢ遺伝子）に対する標的化遺伝子改変は、細胞または細胞のゲノムを、オートファジー遺伝子（例えば、表１に列挙されるオートファジー遺伝子）またはＮＦ－κＢ遺伝子（例えば、表２に列挙されるＮＦ－κＢ遺伝子）の標的ゲノム遺伝子座内の１つ以上のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズするＣａｓタンパク質及び１つ以上のガイドＲＮＡに接触させることにより作成され得る。すなわち、細胞のゲノム中のオートファジー遺伝子（例えば、表１に列挙されるオートファジー遺伝子）またはＮＦ－κＢ遺伝子（例えば、表２に列挙されるＮＦ－κＢ遺伝子）に対する標的化遺伝子改変は、細胞または細胞のゲノムを、オートファジー遺伝子（例えば、表１に列挙されるオートファジー遺伝子）またはＮＦ－κＢ遺伝子（例えば、表２に列挙されるＮＦ－κＢ遺伝子）の標的ゲノム遺伝子座内の１つ以上のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするＣａｓタンパク質及び１つ以上のガイドＲＮＡに接触させることにより作成され得る。例えば、そのような方法は、オートファジー遺伝子（例えば、表１に列挙されるオートファジー遺伝子）またはＮＦ－κＢ遺伝子（例えば、表２に列挙されるＮＦ－κＢ遺伝子）内のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするＣａｓタンパク質及びガイドＲＮＡに細胞を接触させることを含むことができる。例えば、ガイドＲＮＡ標的配列は、オートファジー遺伝子（例えば、表１に列挙されるオートファジー遺伝子）もしくはＮＦ－κＢ遺伝子（例えば、表２に列挙される）の開始コドン、もしくはオートファジー遺伝子（例えば、表１に列挙されるオートファジー遺伝子）もしくはＮＦ－κＢ遺伝子（例えば、表２に列挙されるＮＦ－κＢ遺伝子）の停止コドンを含むか、またはそれに近接することができる。例えば、ガイドＲＮＡ標的配列は、開始コドンもしくは終止コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド内であり得る。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ標的配列は、標的化遺伝子のエクソン１内にある。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ標的配列は、標的化遺伝子のエクソン２に存在する。いくつかの実施形態において、オートファジー遺伝子の発現または活性を阻害する薬剤は、複数のガイドＲＮＡを含む組成物である。例えば、いくつかの実施形態において、組成物は、標的化遺伝子の５’末端を標的とする第１のガイドＲＮＡ及び標的化遺伝子の３’末端を標的とする第２のガイドＲＮＡを含む（例えば、崩壊を誘導するために）。いくつかの実施形態において、組成物は、標的化遺伝子の機能ドメインを改変または欠失するように設計された二重ｇＲＮＡを含む。

【0074】

いくつかの方法において、２つ以上のヌクレアーゼ剤を使用することができる。例えば、それぞれが開始コドンを含むか、またはこれに近接するヌクレアーゼ標的配列を標的とする、２つ以上のヌクレアーゼ剤を使用することができる。別の例として、１つが開始コドンを含むか、またはこれに近接するヌクレアーゼ標的配列を標的とし、１つが終止コドンを含むか、またはこれに近接するヌクレアーゼ標的配列を標的とする２つのヌクレアーゼ剤を使用することができ、ヌクレアーゼ剤による切断により、２つのヌクレアーゼ標的配列間のコード領域を欠失させることができる。更に別の例として、１つ以上（例えば２つ）が開始コドンを含むかまたはそれに近接するヌクレアーゼ標的配列を標的とし、１つ以上（例えば２つ）が終止コドンを含むかまたはそれに近接するヌクレアーゼ標的配列を標的とする３つ以上のヌクレアーゼ剤を使用することができ、ヌクレアーゼ剤による切断により、開始コドンを含むかまたはそれに近接するヌクレアーゼ標的配列と、終止コドンを含むかまたはそれに近接するヌクレアーゼ標的配列の間のコード領域を欠失させることができる。

【0075】

例示的なオートファジー遺伝子を標的とするのに有用な例示的なｓｇＲＮＡ配列（遺伝子名、ｓｇＲＮＡ ＩＤ、該当する場合ｓｇＲＮＡ番号及び配列）には、Ｒｂ１ｃｃ１、ＭＧＬｉｂＡ＿４４６８８、１、ＡＧＡＧＴＧＴＧＴＡＣＴＴＡＣＡＧＣＧＣ（配列番号３８）；Ｒｂ１ｃｃ１、ＭＧＬｉｂＡ＿４４６８９、２、ＣＴＧＡＡＣＧＴＧＧＣＡＡＡＧＡＡＣＴＴ（配列番号３９）；Ｒｂ１ｃｃ１、ＭＧＬｉｂＡ＿４４６９０、３、ＴＣＡＡＧＡＴＡＧＡＣＣＣＡＡＴＧＡＴＧ（配列番号４０）；Ｒｂ１ｃｃ１、ＭＧＬｉｂＢ＿４４６７５、４、ＣＴＣＣＡＴＴＧＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣ（配列番号４１）；Ｒｂ１ｃｃ１、ＭＧＬｉｂＢ＿４４６７６、５、ＡＴＴＴＧＡＡＣＡＧＴＣＣＴＣＣＡＧＡＴ（配列番号４２）；Ｒｂ１ｃｃ１、ＭＧＬｉｂＢ＿４４６７７、６、ＣＴＴＴＡＧＧＡＡＴＡＧＣＡＧＧＴＧＣＡ（配列番号４３）；Ａｔｇ９ａ、ＭＧＬｉｂＡ＿０５６６１、１、ＣＡＴＡＧＴＣＣＡＣＡＣＡＧＣＴＡＡＣＣ（配列番号４４）；Ａｔｇ９ａ、ＭＧＬｉｂＡ＿０５６６２、２、ＴＴＧＧＧＡＴＣＣＧＡＡＧＡＧＣＡＴＧＴ（配列番号４５）；Ａｔｇ９ａ、ＭＧＬｉｂＡ０５６６３、３、ＣＴＧＣＣＣＡＡＧＴＣＴＧＴＡＧＴＧＣＣ（配列番号４６）；Ａｔｇ９ａ、ＭＧＬｉｂＢ＿０５６６１、４、ＴＣＴＡＴＡＡＣＡＴＴＴＧＣＴＧＣＴＡＴ（配列番号４７）；Ａｔｇ９ａ、ＭＧＬｉｂＢ＿０５６６２、５、ＴＡＣＡＴＧＴＧＡＡＧＣＣＡＴＴＣＴＴＣ（配列番号４８）；Ａｔｇ９ａ、ＭＧＬｉｂＢ＿０５６６３、６、ＡＧＧＡＴＡＴＴＣＧＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧ（配列番号４９）；Ａｔｇ１２、ＭＧＬｉｂＡ＿０５６１９、１、ＴＧＣＡＧＴＴＴＣＧＣＣＣＧＧＡＡＣＧＧ（配列番号５０）；Ａｔｇ１２、ＭＧＬｉｂＡ＿０５６２０、２、ＣＴＣＴＧＧＡＡＧＧＣＴＣＴＣＧＣＣＧＣ（配列番号５１）；Ａｔｇ１２、ＭＧＬｉｂＡ＿０５６２１、３、ＧＡＧＣＧＡＡＣＣＣＧＧＡＣＣＡＴＣＣＡ（配列番号５２）；Ａｔｇ１２、ＭＧＬｉｂＢ＿０５６１９、４、ＴＣＡＴＣＡＴＡＣＣＡＡＣＴＧＴＴＣＣＧ（配列番号５３）；Ａｔｇ１２、ＭＧＬｉｂＢ＿０５６２０、５、ＣＣＴＧＣＡＴＴＡＣＴＧＣＡＡＡＴＣＣＣ（配列番号５４）及びＡｔｇ１２、ＭＧＬｉｂＢ＿０５６２１、６、ＴＴＣＴＧＧＣＴＣＡＴＣＣＣＣＡＴＧＣＣ（配列番号５５）が含まれるが、これらに限定されない。

【0076】

例示的なＮＦ－κＢ遺伝子を標的とするのに有用な例示的なｓｇＲＮＡ配列（遺伝子名、ｓｇＲＮＡ ＩＤ、該当する場合ｓｇＲＮＡ番号及び配列）には、Ｍａｐ３ｋ７、ＭＧＬｉｂＡ＿３０２８６、１、ＧＡＴＧＡＴＣＧＡＡＧＣＧＣＣＧＴＣＧＣ（配列番号１６）；Ｍａｐ３ｋ７、ＭＧＬｉｂＡ＿３０２８７、２、ＣＧＧＣＧＣＴＴＣＧＡＴＣＡＴＣＴＣＡＣ（配列番号１７）；Ｍａｐ３ｋ７、ＭＧＬｉｂＡ＿３０２８８、３、ＧＧＧＡＣＴＴＡＣＴＧＧＡＴＴＣＡＧＧＣ（配列番号１８）；Ｍａｐ３ｋ７、ＭＧＬｉｂＢ＿３０２７７、４、ＧＡＧＴＡＧＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＴＡＡＧ（配列番号１９）；Ｍａｐ３ｋ７、ＭＧＬｉｂＢ＿３０２７８、５、ＴＴＡＡＣＴＣＡＧＧＴＴＧＴＣＧＧＡＡＧ（配列番号２０）；Ｍａｐ３ｋ７、ＭＧＬｉｂＢ＿３０２７９、６、ＧＡＧＧＧＧＧＧＣＴＣＡＴＴＧＴＡＴＡＡ（配列番号２１）；Ｒｂｃｋ１、ＭＧＬｉｂＡ＿４４７１８、１、ＡＧＴＡＣＧＣＣＣＧＧＡＴＡＴＧＡＣＡＧ（配列番号２２）；Ｒｂｃｋ１、ＭＧＬｉｂＡ＿４４７１９、２、ＡＣＧＴＧＴＴＧＣＧＧＧＣＴＧＡＣＡＧＣ（配列番号２３）；Ｒｂｃｋ１、ＭＧＬｉｂＡ＿４４７２０、３、ＣＡＧＣＴＴＡＣＣＧＧＴＧＧＴＧＡＣＴＣ（配列番号２４）；Ｒｂｃｋ１、ＭＧＬｉｂＢ＿４４７０５、４、ＡＡＣＣＴＧＴＣＣＴＴＣＣＧＡＡＧＣＣＣ（配列番号２５）；Ｒｂｃｋ１、ＭＧＬｉｂＢ＿４４７０６、５、ＣＧＧＧＣＧＴＡＣＴＧＴＧＡＧＣＣＡＡＡ（配列番号２６）；Ｒｂｃｋ１、ＭＧＬｉｂＢ＿４４７０７、６、ＣＴＧＣＴＡＴＣＡＡＧＴＡＴＧＣＣＡＣＣ（配列番号２７）；Ｒｅｌａ、ＭＧＬｉｂＡ＿４５０７２、１、ＧＣＧＡＴＴＣＣＧＣＴＡＴＡＡＡＴＧＣＧ（配列番号２８）；Ｒｅｌａ、ＭＧＬｉｂＡ＿４５０７３、２、ＴＣＡＴＣＧＡＡＣＡＧＣＣＧＡＡＧＣＡＡ（配列番号２９）；Ｒｅｌａ、ＭＧＬｉｂＡ＿４５０７４、３、ＧＣＣＣＡＧＡＣＣＧＣＡＧＴＡＴＣＣＡＴ（配列番号３０）；Ｒｅｌａ、ＭＧＬｉｂＢ＿４５０５９、４、ＣＴＧＣＣＧＧＧＡＴＧＧＣＴＡＣＴＡＴＧ（配列番号３１）；Ｒｅｌａ、ＭＧＬｉｂＢ＿４５０６０、５、ＡＣＣＧＴＧＡＡＡＧＧＧＧＴＴＡＴＴＧＴ（配列番号３２）及びＲｅｌａ、ＭＧＬｉｂＢ＿４５０６１、６、ＡＣＴＴＡＣＣＴＧＡＧＧＧＡＡＡＧＡＴＧ（配列番号３３）が含まれるが、これらに限定されない。

【0077】

いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、ＤＮＡターゲティングセグメント及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含み得る。ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡが互いにハイブリダイズする別個の分子であるモジュラーガイドＲＮＡであり得る。

【0078】

いくつかの実施形態において、組成物は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸配列（例えば、転写抑制因子ドメインに融合したヌクレアーゼ活性Ｃａｓタンパク質またはヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質）を更に含む。Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であり得る。Ｃａｓ９分子は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質、またはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９タンパク質であり得る。

【0079】

特定の実施形態において、本明細書に開示する方法及び組成物は、細胞内のゲノムを改変するために、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系またはそのような系の構成要素を利用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｃａｓ遺伝子の発現に関与するか、またはその活性を誘導する転写産物及び他の要素を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型系またはＶ型系（例えば、Ｖ－Ａ亜型またはＶ－Ｂ亜型）であり得る。本明細書に開示する方法及び組成物は、核酸の部位特異的結合または切断のためにＣＲＩＳＰＲ複合体（Ｃａｓタンパク質と複合体化したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む）を利用することによりＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示する組成物及び方法で使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、天然に存在しないものであり得る。

【0080】

Ａ．Ｃａｓタンパク質
いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、一般に、ガイドＲＮＡと相互作用することができる少なくとも１つのＲＮＡ認識ドメインまたはＲＮＡ結合ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質はまた、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＤＮａｓｅドメインまたはＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質－タンパク質相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、及び他のドメインを含み得る。いくつかのそのようなドメイン（例えば、ＤＮａｓｅドメイン）は、天然のＣａｓタンパク質に由来し得る。他のそのようなドメインを追加して、改変Ｃａｓタンパク質を作成できる。ヌクレアーゼドメインは、核酸分子の共有結合の切断を含む、核酸切断のための触媒活性を保有している。切断により、平滑末端または付着末端を生成することができ、それは一本鎖または二本鎖であり得る。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は、通常、平滑切断産物を生成する。あるいは、野生型Ｃｐｆ１タンパク質（例えば、ＦｎＣｐｆ１）は、非標的鎖のＰＡＭ配列から１８番目の塩基対の後、及び標的鎖の２３番目の塩基の後に切断が生じた５ヌクレオチドの５’オーバーハングを有する切断産物をもたらし得る。Ｃａｓタンパク質は、標的ゲノム遺伝子座に二本鎖切断（例えば、平滑末端を有する二本鎖切断）を生じる完全な切断活性を有し得るか、または標的ゲノム遺伝子座に一本鎖切断を生じるニッカーゼであり得る。

【0081】

Ｃａｓタンパク質の例として、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓｌ０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、及びＣｕ１９６６、ならびにその相同体または改変体が挙げられる。

【0082】

例示的なＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質由来のタンパク質である。Ｃａｓ９タンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来し、通常、保存されたアーキテクチャを有する４つの重要なモチーフを共有している。モチーフ１、２及び４はＲｕｖＣ様モチーフであり、モチーフ３はＨＮＨモチーフである。例示的なＣａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ種、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ種、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ種、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ種、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ種、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ種、Ｌｙｎｇｂｙａ種、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ種、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓまたはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ由来のものである。Ｃａｓ９ファミリーメンバーの追加の例は、国際特許第ＷＯ２０１４／１３１８３３号に記載されており、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ登録番号Ｑ９９ＺＷ２を付与）は、例示的なＣａｓ９タンパク質である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）（ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｊ７ＲＵＡ５を付与）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ由来のＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９）（ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｑ０Ｐ８９７を付与）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．８：１４５００を参照し、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。ＳａＣａｓ９はＳｐＣａｓ９より小さく、ＣｊＣａｓ９は、ＳａＣａｓ９及びＳｐＣａｓ９の両方より小さい。

【0083】

Ｃａｓタンパク質の別の例は、Ｃｐｆ１（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ１由来のＣＲＩＳＰＲ）タンパク質である。Ｃｐｆ１は大きなタンパク質（約１３００アミノ酸）であり、Ｃａｓ９の対応するドメインに相同なＲｕｖＣ様のヌクレアーゼドメインと、Ｃａｓ９の特徴的なアルギニンリッチクラスターの対応物を有する。しかしながら、Ｃｐｆ１には、Ｃａｓ９タンパク質に存在するＨＮＨヌクレアーゼドメインがなく、ＲｕｖＣ様ドメインは、ＨＮＨドメインを含む長いインサートを含むＣａｓ９とは対照的に、Ｃｐｆ１配列内で連続している。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ１６３（３）：７５９－７７１を参照し、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。例示的なＣｐｆ１タンパク質は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ １、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ亜種ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＣ２０１７ １、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ種ＳＣＡＤＣ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ種ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ ３、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、及びＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ由来のものである。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２由来のＣｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１；割り当てられたＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ａ０Ｑ７Ｑ２）は、例示的なＣｐｆ１タンパク質である。

【0084】

Ｃａｓタンパク質は、野生型タンパク質（すなわち、自然界に存在するもの）、改変型Ｃａｓタンパク質（すなわち、Ｃａｓタンパク質バリアント）、または野生型もしくは改変型Ｃａｓタンパク質の断片であり得る。Ｃａｓタンパク質はまた、野生型または改変型Ｃａｓタンパク質の触媒活性に関する活性型バリアントまたは断片であり得る。触媒活性に関する活性型バリアントまたは断片は、野生型もしくは改変型Ｃａｓタンパク質またはその部分と、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を含むことができ、活性型バリアントは所望の切断部位で切断する能力を保持し、したがってニック誘導活性または二本鎖切断誘導活性を保持している。ニック誘導活性または二本鎖切断誘導活性のアッセイは公知であり、一般的にそれは、切断部位を含むＤＮＡ基質上のＣａｓタンパク質の全体的な活性と特異性を測定する。

【0085】

改変されたＣａｓタンパク質の一例は、非特異的なＤＮＡ接触を減らすように設計された改変（Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ）を保有するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の高忠実度バリアントである、改変されたＳｐＣａｓ９－ＨＦ１タンパク質である。例えば、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ５２９（７５８７）：４９０－４９５を参照し、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。改変されたＣａｓタンパク質の別の例は、非特異的な効果を減らすように設計された改変されたｅＳｐＣａｓ９バリアント（Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）である。例えば、Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ３５１（６２６８）：８４－８８を参照し、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。他のＳｐＣａｓ９バリアントには、Ｋ８５５Ａ及びＫ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａが含まれる。

【0086】

Ｃａｓタンパク質は、核酸結合親和性、核酸結合特異性及び酵素活性のうちの１つ以上を増加または減少させるように改変することができる。Ｃａｓタンパク質はまた、安定性などタンパク質の任意の他の活性または特性を変更するために改変することもできる。例えば、Ｃａｓタンパク質の１つ以上のヌクレアーゼドメインを改変、欠失もしくは不活性化することができるか、またはタンパク質の機能に必須ではないドメインを除去するため、もしくはＣａｓタンパク質の活性または特性を最適化する（例えば、増強または低減する）ためにＣａｓタンパク質を切断することができる。

【0087】

Ｃａｓタンパク質は、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを含み得る。例えば、野生型Ｃｐｆ１タンパク質は一般的に、おそらくは二量体構成で、標的ＤＮＡの両方の鎖を切断するＲｕｖＣ様ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質はまた、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも２つのヌクレアーゼドメインを含み得る。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は一般的に、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインとＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含む。ＲｕｖＣ及びＨＮＨドメインはそれぞれ、二本鎖ＤＮＡの異なる鎖を切断して、ＤＮＡの二本鎖切断を行うことができる。例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ３３７（６０９６）：８１６－８２１を参照し、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。

【0088】

ヌクレアーゼドメインがもはや機能しないか、またはヌクレアーゼ活性を低下させるように、ヌクレアーゼドメインの１つ以上またはすべてを、欠失または変異させることができる。例えば、ヌクレアーゼドメインのうちの１つがＣａｓ９タンパク質で欠失または変異されている場合、結果として生じるＣａｓ９タンパク質はニッカーゼと称され得、二本鎖ターゲットＤＮＡ内に一本鎖切断を生成できるが、二本鎖切断は生成できない（すなわち、相補鎖または非相補鎖を切断できるが、両方は切断できない）。両方のヌクレアーゼドメインが欠失または変異されている場合、結果として得られるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を切断する能力が低下する（例えば、ヌクレアーゼ無もしくはヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質、または触媒活性を伴わないＣａｓタンパク質（ｄＣａｓ））。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する突然変異の例は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣドメインにおけるＤ１０Ａ（Ｃａｓ９の１０位でアスパラギン酸からアラニンへ）突然変異である。同様に、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＨＮＨドメイン内のＨ９３９Ａ（アミノ酸位置８３９でヒスチジンからアラニンへ）、Ｈ８４０Ａ（アミノ酸位置８４０でヒスチジンからアラニンへ）、またはＮ８６３Ａ（アミノ酸位置Ｎ８６３でアスパラギンからアラニンへ）は、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換できる。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する突然変異の他の例には、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９への対応する突然変異が含まれる。例えば、Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９（２１）：９２７５－９２８２及び国際特許第ＷＯ２０１３／１４１６８０号を参照し、そのそれぞれは、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。このような突然変異は、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ媒介変異誘発、または全遺伝子合成などの方法を使用して生成することができる。ニッカーゼを作成する他の突然変異の例は、例えば、国際特許第ＷＯ２０１３／１７６７７２号及び同第ＷＯ２０１３／１４２５７８号で見いだすことができ、そのそれぞれは、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。すべてのヌクレアーゼドメインがＣａｓタンパク質で欠失または変異されている場合（例えば、Ｃａｓ９タンパク質で両方のヌクレアーゼドメインが欠失または変異されている場合）、結果として得られるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を切断する能力が低下する（例えば、ヌクレアーゼ無またはヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質）。１つの具体例は、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９二重変異体、またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９と最適に整列した場合の別の種のＣａｓ９の対応する二重変異体である。別の具体例は、Ｄ１０Ａ／Ｎ８６３Ａ Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９二重変異体、またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９と最適に整列した場合の別の種のＣａｓ９の対応する二重変異体である。

【0089】

Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質の触媒ドメインにおける不活性化する突然変異の例も、知られている。例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９酵素（ＳａＣａｓ９）は、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を生成するために、Ｎ５８０位での置換（例えば、Ｎ５８０Ａ置換）及びＤ１０位での置換（例えば、Ｄ１０Ａ置換）を含み得る。例えば、国際特許第ＷＯ２０１６／１０６２３６号を参照し、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。

【0090】

Ｃｐｆ１タンパク質の触媒ドメインにおける不活性化する突然変異の例も、知られている。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２（ＦｎＣｐｆ１）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６（ＡｓＣｐｆ１）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）、及びＭｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ２３７（ＭｂＣｐｆ１ Ｃｐｆ１）由来のＣｐｆ１タンパク質に関連して、そのような変異には、ＡｓＣｐｆ１の９０８、９９３もしくは１２６３位、もしくはＣｐｆ１オルソログの対応する位置、またはＬｂＣｐｆ１の８３２、９２５、９４７もしくは１１８０位、もしくはＣｐｆ１オルソログの対応する位置の突然変異が含まれ得る。そのような突然変異は、例えば、ＡｓＣｐｆ１の突然変異Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ及びＤ１２６３ＡもしくはＣｐｆ１オルソログの対応する突然変異、またはＬｂＣｐｆ１のＤ８３２Ａ、Ｅ９２５Ａ、Ｄ９４７Ａ及びＤ１１８０ＡもしくはＣｐｆ１オルソログの対応する突然変異のうちの１つ以上を含み得る。例えば、米国特許第２０１６／０２０８２４３号を参照し、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。

【0091】

Ｃａｓタンパク質を、融合タンパク質として異種ポリペプチドに作動可能に連結することもできる。例えば、Ｃａｓタンパク質を、切断ドメイン、エピジェネティック修飾ドメイン、転写活性化ドメイン、または転写抑制因子ドメインに融合させることができる。例えば、国際特許第ＷＯ２０１４／０８９２９０号を参照し、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。転写活性化ドメインの例として、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６活性化ドメイン、ＶＰ６４（ＶＰ１６の四量体誘導体）、ＮＦκＢ ｐ６５活性化ドメイン、ｐ５３活性化ドメイン１及び２、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質）活性化ドメイン、Ｅ２Ａ活性化ドメイン、ならびにＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核因子）活性化ドメインが挙げられる。他の例として、Ｏｃｔ１、Ｏｃｔ－２Ａ、ＳＰ１、ＡＰ－２、ＣＴＦ１、Ｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１、ＰｖＡＬＦ、ＥＲＦ－２、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ－１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ－５、ＡＲＦ－６、ＡＲＦ－７、ＡＲＦ－８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ－ＲＰ／ＧＰ、ＴＲＡＢ１ＰＣ４、及びＨＳＦ１由来の活性化ドメインが挙げられる。例えば、米国特許第２０１６／０２３７４５６号、欧州特許第３０４５５３７号、及び国際特許第ＷＯ２０１１／１４６１２１を参照し、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。場合によっては、ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１と対になったｄＣａｓ９－ＶＰ６４融合タンパク質を含む転写活性化系を使用することができる。そのような系のガイドＲＮＡは、ｓｇＲＮＡテトラループにアプタマー配列を付加し、ステムループ２を二量体化ＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質に結合するように設計することができる。例えば、Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ５１７（７５３６）：５８３－５８８を参照し、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。転写抑制因子ドメインの例として、誘導性ｃＡＭＰ初期抑制因子（ＩＣＥＲ）ドメイン、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックスＡ（ＫＲＡＢ－Ａ）抑制因子ドメイン、ＹＹ１グリシンリッチ抑制因子ドメイン、Ｓｐ１様抑制因子、Ｅ（ｓｐｌ）抑制因子、ΙκΒ抑制因子、及びＭｅＣＰ２が挙げられる。他の例として、Ａ／Ｂ、ＫＯＸ、ＴＧＦ－β誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ－ｅｒｂＡ、ＳＩＤ、ＳＩＤ４Ｘ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＧ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、Ｒｂ、ＲＯＭ２由来の転写抑制ドメインが挙げられる。例えば、欧州特許第３０４５５３７号及び国際特許第ＷＯ２０１１／１４６１２１号を参照し、そのそれぞれは、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。Ｃａｓタンパク質はまた、安定性の増加または減少を提供する異種ポリペプチドに融合させることができる。融合ドメインまたは異種ポリペプチドは、Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または内部に配置することができる。

【0092】

一例として、Ｃａｓタンパク質は、細胞内局在化を提供する１つ以上の異種ポリペプチドに融合できる。そのような異種ポリペプチドは、例えば、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、例えば、核を標的とする単節型ＳＶ４０ ＮＬＳ及び／また双節型αインポーチンＮＬＳ、ミトコンドリアを標的とするミトコンドリア局在化シグナル、ＥＲ保持シグナルなどを含み得る。例えば、Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２（８）：５１０１－５１０５を参照し、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。そのような細胞内局在シグナルは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＣａｓタンパク質内の任意の場所に配置することができる。ＮＬＳには、一連の塩基性アミノ酸を含ませることができ、単節型配列または双節型配列であり得る。任意選択で、Ｃａｓタンパク質は、Ｎ末端のＮＬＳ（例えば、αインポーチンＮＬＳまたは単節型ＮＬＳ）及びＣ末端のＮＬＳ（例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳまたは双節型ＮＬＳ）を含む２つ以上のＮＬＳを含むことができる。Ｃａｓタンパク質はまた、Ｎ末端に２つ以上のＮＬＳ及び／またはＣ末端に２つ以上のＮＬＳを含むことができる。

【0093】

Ｃａｓタンパク質はまた、細胞透過性ドメインまたはタンパク質形質導入ドメインに作動可能に連結することができる。例えば、細胞透過性ドメインは、ＨＩＶ－１ ＴＡＴタンパク質、ヒトＢ型肝炎ウイルス由来ＴＬＭ細胞透過性モチーフ、ＭＰＧ、Ｐｅｐ－１、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルス由来細胞透過性ペプチド、またはポリアルギニンペプチド配列由来のものであり得る。例えば、国際特許第ＷＯ２０１４／０８９２９０号及び国際特許第ＷＯ２０１３／１７６７７２号を参照し、そのそれぞれは、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。細胞透過性ドメインは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＣａｓタンパク質内の任意の場所に配置することができる。

【0094】

Ｃａｓタンパク質はまた、追跡または精製を容易にするために、蛍光タンパク質、精製タグ、またはエピトープタグなどの異種ポリペプチドに作動可能に連結することができる。蛍光タンパク質の例として、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、モノマー型Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄモノマー、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、橙色蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、モノマー型Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、及び任意の他の適切な蛍光タンパク質が挙げられる。タグの例として、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、赤血球凝集素（ＨＡ）、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、及びカルモジュリンが挙げられる。

【0095】

また、Ｃａｓタンパク質を、標識した核酸に係留することもできる。そのような係留（すなわち、物理的連結）は、共有相互作用または非共有相互作用を通じて達成することができ、係留は、直接的であり得るか（例えば、直接的融合によって、あるいはタンパク質のシステインもしくはリジン残基の修飾またはインテイン修飾により達成できる化学的結合によって）、またはストレプトアビジンもしくはアプタマーなどの１つ以上の介在リンカーもしくはアダプター分子を介して達成することができる。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５（１）：４１－５５；Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４６（４６）：８８１９－８８２２；Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ ａｎｄ Ｄｉｘｏｎ（２００９）Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｊ．Ｃｈｅｍ．６２（１０）：１３２８－１３３２；Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．１０（９）：１５５１－１５５７；及びＫｈａｔｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０（１４）：４５３２－４５３９を参照し、そのそれぞれは、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。タンパク質－核酸コンジュゲートを合成するための非共有結合型の戦略として、ビオチン－ストレプトアビジン法及びニッケル－ヒスチジン法が挙げられる。適切に官能化した核酸及びタンパク質を多種多様な化学を使用して結合させることにより、共有結合型のタンパク質－核酸コンジュゲートを合成することができる。これらの化学のいくつかでは、タンパク質表面のアミノ酸残基へのオリゴヌクレオチドの直接的な付加が伴う（例えば、リジンアミンまたはシステインチオール）が、一方で他のより複雑なスキームでは、タンパク質の翻訳後修飾またはタンパク質の触媒ドメインもしくは反応性ドメインの関与が必要である。タンパク質を核酸に共有結合させる方法として、例えば、オリゴヌクレオチドと、タンパク質のリシンまたはシステイン残基との化学的架橋、発現させるタンパク質のライゲーション、化学酵素法、及び光アプタマーの使用が挙げられ得る。標識化核酸を、Ｃ末端、Ｎ末端またはＣａｓタンパク質内の内部領域に係留することができる。一例において、標識化核酸を、Ｃａｓタンパク質のＣ末端またはＮ末端に係留する。同様に、Ｃａｓタンパク質を、５’末端、３’末端、または標識化核酸内の内部領域に係留することができる。すなわち、標識化核酸は、任意の配向及び極性で係留することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質を、標識化核酸の５’末端または３’末端に係留することができる。

【0096】

Ｃａｓタンパク質は、任意の形態で提供することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質を、タンパク質、例えばｇＲＮＡと複合体化したＣａｓタンパク質の形態で提供することができる。あるいは、Ｃａｓタンパク質を、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、例えば、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））またはＤＮＡの形態で提供することができる。任意選択で、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を、特定の細胞または生物においてタンパク質へ効率的に翻訳させるために、コドン最適化することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳類細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、または任意の他の目的の宿主細胞において天然のポリヌクレオチド配列に比べて高い使用頻度を有するコドンで置換するように改変することができる。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を細胞に導入する場合、Ｃａｓタンパク質は、細胞内で、一時的に、条件的に、または構成的に発現する。

【0097】

ｍＲＮＡとして提供されるＣａｓタンパク質は、安定性及び／または免疫原性特性を向上させるために修飾することができる。修飾は、ｍＲＮＡ内の１つ以上のヌクレオシドに対して行うことができる。ｍＲＮＡ核酸塩基に対する化学修飾の例には、プソイドウリジン、１－メチル－プソイドウリジン、及び５－メチル－シチジンが含まれる。例えば、Ｎ１－メチルプソイドウリジンを含有するキャッピングされかつポリアデニル化されたＣａｓ ｍＲＮＡを使用することができる。同様に、同義コドンを使用してウリジンを除去することにより、Ｃａｓ ｍＲＮＡを修飾することができる。

【0098】

Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を、細胞のゲノムに安定的に組み込み、細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。あるいは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を、発現構築物のプロモーターに作動可能に連結することができる。発現構築物には、遺伝子または他の目的の核酸配列（例えば、Ｃａｓ遺伝子）の発現を誘導することができ、そのような目的の核酸配列を標的細胞に移入することができる任意の核酸構築物が含まれる。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクター内にあり得る。あるいは、それは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターとは別個のベクターまたはプラスミド内にあり得る。発現構築物に使用することができるプロモーターとして、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳類細胞、非ヒト哺乳類細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発生的に制限された前駆細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または１細胞ステージ胚のうちの１つ以上の活性なプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは、例えば、条件的プロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであり得る。任意選択で、プロモーターは、一方の向きへのＣａｓタンパク質と、他方の向きへのガイドＲＮＡの両方の発現を駆動する双方向性プロモーターであり得る。そのような双方向性プロモーターは、１）３つの外部制御エレメント：遠位配列エレメント（ＤＳＥ）、近位配列エレメント（ＰＳＥ）、及びＴＡＴＡボックスを含む完全な従来型の単方向性Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、及び２）ＰＳＥ及びＤＳＥの５’末端に逆方向に融合したＴＡＴＡボックスを含む第２の基本的なＰｏｌ ＩＩＩプロモーターからなり得る。例えば、Ｈ１プロモーターでは、ＤＳＥはＰＳＥ及びＴＡＴＡボックスに隣接しており、Ｕ６プロモーター由来のＰＳＥ及びＴＡＴＡボックスを追加することによって逆方向の転写を制御するハイブリッドプロモーターを作成することにより、プロモーターを双方向性にすることができる。例えば、米国特許第２０１６／００７４５３５号を参照し、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。双方向性プロモーターの使用により、Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡをコードする遺伝子を同時に発現させ、コンパクトな発現カセットを生成して送達を促進することができる。

【0099】

Ｂ．ガイドＲＮＡ
ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）に結合し、Ｃａｓタンパク質を標的ＤＮＡ内の特定の位置に標的化するＲＮＡ分子である。例示的な二分子ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「ターゲッターＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡリピート」）分子、及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス作用性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「活性化因子ＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）分子を含む。ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメント（一本鎖）、及びｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の半分を形成する一連のヌクレオチドの両方を含む。ＤＮＡターゲティングセグメントの下流（３’）に位置付けられるｃｒＲＮＡテールの例は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号１）を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。本明細書に開示されるＤＮＡターゲティングセグメントのいずれも、配列番号２の５’末端に結合してｃｒＲＮＡを形成することができる。

【0100】

対応するｔｒａｃｒＲＮＡ（活性化因子ＲＮＡ）は、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の残りの半分を形成する一連のヌクレオチドを含む。一連のｃｒＲＮＡのヌクレオチドは、一連のｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドに相補的であり、一連のｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドとハイブリダイズして、ｇＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する。そのため、各ｃｒＲＮＡは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡを有すると言うことができる。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例は、ＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵ（配列番号３）、ＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号４）、もしくはＧＵＵＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号５）のうちのいずれか１つを含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0101】

ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの両方が必要な系では、ｃｒＲＮＡ及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡがハイブリダイズしてｇＲＮＡを形成する。ｃｒＲＮＡのみが必要な系では、ｃｒＲＮＡはｇＲＮＡであり得る。ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡの相補鎖にハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡターゲティングセグメントを更に提供する。細胞内の修飾に使用される場合、特定のｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列は、ＲＮＡ分子が使用される種に特異的になるように設計され得る。例えば、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ３３９（６１２１）：８２３－８２６；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ３３７（６０９６）：８１６－８２１；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（３）：２２７－２２９；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（３）：２３３－２３９及びＣｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ３３９（６１２１）：８１９－８２３を参照し、そのそれぞれは、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。

【0102】

特定のｇＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメント（ｃｒＲＮＡ）は、以下でより詳細に説明するように、標的ＤＮＡの相補鎖上の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。ｇＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基の対形成）を介して、配列特異的な方法で標的ＤＮＡと相互作用する。そのため、ＤＮＡターゲティングセグメントのヌクレオチド配列は、様々に異なり得、ｇＲＮＡと標的ＤＮＡが相互作用する標的ＤＮＡ内の位置を決定する。対象ｇＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントを、標的ＤＮＡ内の任意の所望の配列にハイブリダイズするように改変することができる。天然のｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系及び生物によって異なるが、多くの場合、２１～４６の間のヌクレオチド長の２つの直列反復配列（ＤＲ）が隣接する２１～７２ヌクレオチド長のターゲティングセグメントを含む（国際特許第ＷＯ２０１４／１３１８３３号を参照し、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの場合、ＤＲは３６ヌクレオチド長であり、ターゲティングセグメントは３０ヌクレオチド長である。３’に位置するＤＲは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡに相補的であり、対応するｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズし、次いでＣａｓタンパク質に結合する。

【0103】

ＤＮＡターゲティングセグメントは、例えば、少なくとも約１２、１５、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５または４０ヌクレオチド長を有することができる。そのようなＤＮＡターゲティングセグメントは、例えば、約１２～約１００、約１２～約８０、約１２～約５０、約１２～約４０、約１２～約３０、約１２～約２５または約１２～約２０ヌクレオチドの長さを有することができる。例えば、ＤＮＡターゲティングセグメントは、約１５～約２５ヌクレオチド（例えば、約１７～約２０ヌクレオチド、または約１７、約１８、約１９もしくは約２０ヌクレオチド）であり得る。例えば、米国特許第２０１６／００２４５２３号を参照し、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９の場合、一般的なＤＮＡターゲティングセグメントは、１６と２０の間のヌクレオチド長または１７と２０の間のヌクレオチド長である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９の場合、一般的なＤＮＡターゲティングセグメントは、２１と２３の間のヌクレオチド長である。Ｃｐｆ１の場合、一般的なＤＮＡターゲティングセグメントは、少なくとも１６ヌクレオチド長または少なくとも１８ヌクレオチド長である。

【0104】

ＴｒａｃｒＲＮＡは、任意の形態（例えば、完全長ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）であり得、長さは様々であり得る。それらには、一次転写産物またはプロセッシング形態を含むことができる。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡの一部として、または二分子ｇＲＮＡの一部として別個の分子として）は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列のすべてもしくは一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５またはそれ以上のヌクレオチド）を含み得る、それから本質的になる、またはそれからなり得る。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例には、１７１ヌクレオチド、８９ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、及び６５ヌクレオチドバージョンが含まれる。例えば、Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ４７１（７３４０）：６０２－６０７、国際特許第ＷＯ２０１４／０９３６６１号を参照し、そのそれぞれは、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）内のｔｒａｃｒＲＮＡの例には、ｓｇＲＮＡの＋４８、＋５４、＋６７及び＋８５バージョン内に見いだされるｔｒａｃｒＲＮＡが含まれ、「＋ｎ」は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡの＋ｎヌクレオチドまでがｓｇＲＮＡに含まれることを示す。例えば、米国特許第８，６９７，３５９号を参照し、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。

【0105】

ガイドＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間の相補性の割合は、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であり得る。標的ＤＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントと相補鎖との間の相補性の割合は、約２０の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも６０％であり得る。例として、標的ＤＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントと相補鎖との間の相補性の割合は、標的ＤＮＡの相補鎖の５’末端の１４の連続ヌクレオチドにわたって約１００％であり得、残部にわたっては０％と低い場合がある。そのような場合、ＤＮＡターゲティングセグメントは、１４ヌクレオチド長とみなすことができる。別の例として、標的ＤＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントと相補鎖との間の相補性の割合は、標的ＤＮＡの相補鎖の５’末端の７の連続ヌクレオチドにわたって約１００％であり得、残部にわたっては０％と低い場合がある。そのような場合、ＤＮＡターゲティングセグメントは、７ヌクレオチド長とみなすことができる。いくつかのガイドＲＮＡでは、ＤＮＡターゲティングセグメント内の少なくとも約１７ヌクレオチドは、標的ＤＮＡの相補鎖に対して相補的である。例えば、ＤＮＡターゲティング配列は、約２０ヌクレオチド長であり得、標的ＤＮＡの相補鎖に対して１つ、２つまたは３つのミスマッチを含み得る。一例において、ミスマッチは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に対応する相補鎖（すなわち、ＰＡＭ配列の逆相補体）の領域に隣接していない（例えば、ミスマッチは、ガイドＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントの５’末端にあるか、またはミスマッチは、ＰＡＭ配列に対応する相補鎖の領域から少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９塩基対離れている）。

【0106】

ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに相補的な２つの一連のヌクレオチドを含むことができる。タンパク質結合セグメントの相補的なヌクレオチドはハイブリダイズして、二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ）を形成する。対象ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、Ｃａｓタンパク質と相互作用し、ｇＲＮＡは、結合したＣａｓタンパク質をＤＮＡターゲティングセグメントを介して標的ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列に誘導する。

【0107】

単一ガイドＲＮＡは、ＤＮＡターゲティングセグメント及び足場配列（すなわち、ガイドＲＮＡのタンパク質結合またはＣａｓ結合配列）を含み得る。例えば、そのようなガイドＲＮＡは、３’足場配列に結合された５’ＤＮＡターゲティングセグメントを有することができる。例示的な足場配列は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵ（バージョン１、配列番号６）；ＧＵＵＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン２、配列番号７）；ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン３、配列番号８）及びＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン４、配列番号９）；ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（バージョン５、配列番号１０）；ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（バージョン６、配列番号１１）もしくはＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵ（バージョン７、配列番号１２）を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。本明細書に開示されるガイドＲＮＡ標的配列のいずれかを標的とするガイドＲＮＡは、例えば、ガイドＲＮＡの３’末端上の例示的なガイドＲＮＡ足場配列のいずれかに融合されたガイドＲＮＡの５’末端上のＤＮＡターゲティングセグメントを含み得る。すなわち、本明細書に開示されるＤＮＡターゲティングセグメントのいずれかを、上記の足場配列のいずれか１つの５’末端に結合して、単一のガイドＲＮＡ（キメラガイドＲＮＡ）を形成することができる。

【0108】

ガイドＲＮＡには、追加の望ましい特徴（例えば、改変または調節された安定性、細胞内ターゲティング、蛍光標識による追跡、タンパク質またはタンパク質複合体に対する結合部位など）を提供する修飾または配列が含まれ得る。そのような修飾の例として、例えば、５’キャップ（例えば、７－メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））、３’ポリアデニル化テール（すなわち、３’ポリ（Ａ）テール）、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質及び／またはタンパク質複合体による調節された安定性及び／または調節されたアクセシビリティを可能にするための）、安定性制御配列、ｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する配列（すなわち、ヘアピン）、ＲＮＡを細胞内の位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する修飾または配列、追跡を提供する修飾または配列（例えば、蛍光分子への直接結合、蛍光検出を促進する部分への結合、蛍光検出を可能にする配列など）、タンパク質に対する結合部位を提供する修飾または配列（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）、及びこれらの組み合わせが挙げられる。修飾の他の例には、操作されたステムループ二重構造、操作されたバルジ領域、ステムループ二重鎖構造の操作されたヘアピン３’、またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。例えば、米国特許第２０１５／０３７６５８６号を参照し、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。バルジは、ｃｒＲＮＡ様領域と最小ｔｒａｃｒＲＮＡ様領域で構成される二重鎖内のヌクレオチドの不対領域であり得る。バルジは、二重鎖の一方の側の不対５’－ＸＸＸＹ－３’（式中、Ｘは任意のプリンであり、Ｙは対向鎖上のヌクレオチドとゆらぎ対を形成することができるヌクレオチドを含む）と、二重鎖の他方の側の不対ヌクレオチド領域とを含むことができる。

【0109】

場合によっては、ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１と対になったｄＣａｓ９－ＶＰ６４融合タンパク質を含む転写活性化系を使用することができる。そのような系のガイドＲＮＡは、ｓｇＲＮＡテトラループに付加したアプタマー配列と、二量体化ＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質を結合するように設計したステムループ２を使用して設計することができる。例えば、Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ５１７（７５３６）：５８３－５８８を参照し、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。

【0110】

無修飾核酸は、分解しやすい可能性がある。外因性核酸はまた、自然免疫応答を誘導することもできる。修飾は、安定性を導入し、免疫原性を低下させるのに役立ち得る。ガイドＲＮＡは、例えば、以下（１）非結合リン酸酸素及び／またはホスホジエステル主鎖結合における結合リン酸酸素の１つ以上の一方もしくは両方の変更または置換、（２）リボース糖の２’ヒドロキシルの変更または置換など、リボース糖の成分の変更または置換、（３）リン酸部分を脱リン酸リンカーで置換、（４）天然の核酸塩基の修飾または置換、（５）リボース－リン酸主鎖の置換または修飾、（６）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾（例えば、末端リン酸基の除去、改変もしくは置換、または部位のコンジュゲーション）、（７）糖の修飾のうちの１つ以上を含む、修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドを含むことができる。他の可能なガイドＲＮＡ修飾には、ウラシルまたはポリウラシルトラクトの修飾または置換が含まれる。例えば、国際特許第２０１５／０４８５７７号及び米国特許第２０１６／０２３７４５５号を参照し、そのそれぞれは、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。同様の修飾は、Ｃａｓ ｍＲＮＡなどのＣａｓをコードする核酸に対して行うことができる。

【0111】

一例として、ガイドＲＮＡの５’末端または３’末端のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を含むことができる（例えば、塩基は、ホスホロチオエート基である修飾リン酸基を有することができる）。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’もしくは３’末端の２、３または４末端ヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を含むことができる。別の例として、ガイドＲＮＡの５’及び／または３’末端のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を有し得る。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’及び／または３’末端（例えば、５’末端）の２、３または４末端ヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル修飾を含むことができる。例えば、国際特許第ＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１号及びＦｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２２（９）：２２２７－２２３５を参照し、そのそれぞれは、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。

【0112】

ガイドＲＮＡは、任意の形態で提供され得る。例えば、ｇＲＮＡは、２つの分子（別個のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）または１つの分子（ｓｇＲＮＡ）のいずれかのＲＮＡの形態で、及び任意選択でＣａｓタンパク質との複合体の形態で提供することができる。ｇＲＮＡはまた、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で提供することができる。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、単一のＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）または別個のＲＮＡ分子（例えば、別個のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードし得る。後者の場合、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、１つのＤＮＡ分子として、またはｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡをそれぞれコードする別々のＤＮＡ分子として提供することができる。

【0113】

ｇＲＮＡをＤＮＡの形で提供する場合、ｇＲＮＡを細胞内で、一時的に、条件的に、または構成的に発現させることができる。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを、細胞のゲノムに安定的に組み込み、細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。あるいは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを、発現構築物のプロモーターに作動可能に連結することができる。例えば、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸などの異種核酸を含むベクター内にあり得る。あるいは、それは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含むベクターとは別個のベクターまたはプラスミド内にあり得る。そのような発現構築物に使用することができるプロモーターとして、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳類細胞、非ヒト哺乳類細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発生的に制限された前駆細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または１細胞ステージ胚のうちの１つ以上の活性なプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは、例えば、条件的プロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであり得る。そのようなプロモーターはまた、例えば、双方向性プロモーターであり得る。適切なプロモーターの具体例として、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、例えば、ヒトＵ６プロモーター、ラットＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーター、またはマウスＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターが挙げられる。

【0114】

あるいは、ｇＲＮＡは、他の様々な方法によって調製することができる。例えば、ｇＲＮＡは、例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって調製することができる（例えば、国際特許第ＷＯ２０１４／０８９２９０号及び同第ＷＯ２０１４／０６５５９６号を参照し、そのそれぞれは、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる）。ガイドＲＮＡはまた、化学合成によって調製される合成的生成分子であり得る。

【0115】

ガイドＲＮＡ（または、ガイドＲＮＡをコードする核酸）は、１つ以上のガイドＲＮＡ（例えば、１、２、３、４またはそれ以上のガイドＲＮＡ）及びガイドＲＮＡの安定性を高める（例えば、所定の保管条件（例えば、－２０℃、４℃、または周囲温度）で分解産物が閾値未満（出発核酸またはタンパク質の０．５重量％未満など）に留まる期間を延長するか、またはｉｎ ｖｉｖｏでの安定性を増加させる）担体を含む組成物内にあり得る。このような担体の非限定例としては、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）マイクロスフィア、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）マイクロスフィア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コクリエート及び脂質微小管が挙げられる。そのような組成物は、Ｃａｓ９タンパク質などのＣａｓタンパク質、またはＣａｓタンパク質をコードする核酸を更に含み得る。

【0116】

Ｃ．ガイドＲＮＡ標的配列
ガイドＲＮＡの標的ＤＮＡには、結合に十分な条件が存在する場合、ｇＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントが結合するＤＮＡに存在する核酸配列が含まれる。適切なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件には、細胞に通常存在する生理学的条件が含まれる。他の適切なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば、無細胞系における条件）は、当技術分野で既知である（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）を参照し、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる）。ｇＲＮＡに相補的でありかつハイブリダイズする標的ＤＮＡの鎖を「相補鎖」と呼ぶことができ、「相補鎖」に相補的な標的ＤＮＡの鎖（したがって、Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡには相補的ではない）は「非相補鎖」または「鋳型鎖」と呼ぶことができる。

【0117】

標的ＤＮＡは、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする相補鎖上の配列及び非相補鎖上の対応する配列（例えば、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する）の両方を含む。ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡの相補鎖に相補性を有するように設計され、ガイドＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントと標的ＤＮＡの相補鎖の間のハイブリダイゼーションは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを引き起こしかつＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があれば、必ずしも完全な相補性は必要ない。ガイドＲＮＡがガイドＲＮＡ標的配列を標的とするものとして本明細書で言及される場合、それが意味することは、ガイドＲＮＡは、非相補鎖上のガイドＲＮＡ標的配列の逆相補鎖である標的ＤＮＡの相補鎖配列にハイブリダイズするということである。

【0118】

標的ＤＮＡまたはガイドＲＮＡ標的配列は、任意のポリヌクレオチドを含み得、例えば、細胞の核もしくは細胞質内、またはミトコンドリアもしくは葉緑体などの細胞のオルガネラ内に配置され得る。標的ＤＮＡまたはガイドＲＮＡ標的配列は、細胞に対して内在性または外来性の任意の核酸配列であり得る。ガイドＲＮＡ標的配列は、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列もしくは非コーディング配列（例えば、調節配列）とすることができ、またはその両方を含ませることができる。

【0119】

ＤＮＡ結合タンパク質の標的配列（例えば、ガイドＲＮＡ標的配列）は、標的遺伝子の発現を変更するのに適しているオートファジー遺伝子（例えば、表１に列挙されたオートファジー遺伝子）またはＮＦ－κＢ遺伝子（例えば、表２に列挙されたＮＦ－κＢ遺伝子）内のどこにでもあり得る。一例において、標的配列は、エンハンサーまたはプロモーターなどの調節エレメント内にあり得るか、または調節エレメントに近接させることができる。例えば、標的配列は、オートファジー遺伝子（例えば、表１に列挙されたオートファジー遺伝子）またはＮＦ－κＢ遺伝子（例えば、表２に列挙されたＮＦ－κＢ遺伝子）の開始コドンを含むか、またはそれに近接することができる。例えば、標的配列は、開始コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド内であり得る。

【0120】

Ｃａｓタンパク質による標的ＤＮＡの部位特異的結合及び切断は、標的ＤＮＡの非相補鎖内のｉ）ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡの対応する相補鎖との間の塩基対相補性及びｉｉ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる短いモチーフの両方によって決定される位置で起こり得る。ＰＡＭは、ガイドＲＮＡ標的配列に隣接させることができる。任意選択で、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＰＡＭによって３’末端に隣接することができる（例えば、Ｃａｓ９の場合）。あるいは、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＰＡＭによって５’末端に隣接することができる（例えば、Ｃｐｆ１の場合）。例えば、Ｃａｓタンパク質の切断部位は、ＰＡＭ配列の上流または下流における（例えば、ガイドＲＮＡ標的配列内の）約１～約１０、または約２～約５塩基対（例えば３塩基対）であり得る。ＳｐＣａｓ９の場合、ＰＡＭ配列（すなわち、非相補鎖上の）は、５’－Ｎ_１ＧＧ－３’であり得、Ｎ_１は任意のＤＮＡヌクレオチドであり、ＰＡＭは標的ＤＮＡの非相補鎖のガイドＲＮＡ標的配列の直近の３’側である。したがって、相補鎖のＰＡＭに対応する配列（すなわち、逆相補鎖）は５’－ＣＣＮ_２－３’であり、Ｎ_２は任意のＤＮＡヌクレオチドであり、ガイドＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントが標的ＤＮＡの相補鎖上でハイブリダイズする配列の直近の５’側である。いくつかのそのような場合では、Ｎ_１とＮ_２は相補的であり得、Ｎ_１－Ｎ_２塩基対は任意の塩基対であり得る（例えば、Ｎ_１＝Ｃ及びＮ_２＝Ｇ、Ｎ_１＝Ｇ及びＮ_２＝Ｃ、Ｎ_１＝Ａ及びＮ_２＝Ｔ、またはＮ_１＝Ｔ及びＮ_２＝Ａ）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９の場合、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲであり得、ＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＴであり得、ＲはＧまたはＡであり得る。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来のＣａｓ９の場合、ＰＡＭは、例えば、ＮＮＮＮＡＣＡＣまたはＮＮＮＮＲＹＡＣであり得、ＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＴであり得、ＲはＧまたはＡであり得る。場合によっては（例えば、ＦｎＣｐｆ１の場合）、ＰＡＭ配列は５’の上流であり得、配列５’－ＴＴＮ－３’を有し得る。

【0121】

ガイドＲＮＡ標的配列の例は、ＳｐＣａｓ９タンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。例えば、ガイドＲＮＡ標的配列＋ＰＡＭの２つの例は、ＧＮ_１９ＮＧＧ（配列番号１３）またはＮ_２０ＮＧＧ（配列番号１４）である。例えば、国際特許第ＷＯ２０１４／１６５８２５号を参照し、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。５’末端のグアニンは、細胞内のＲＮＡポリメラーゼによる転写を促進することができる。ガイドＲＮＡ標的配列＋ＰＡＭの他の例は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ７ポリメラーゼによる効率的な転写を促進するために、５’末端に２つのグアニンヌクレオチド（例えば、ＧＧＮ_２０ＮＧＧ、配列番号１５）を含み得る。例えば、国際特許第ＷＯ２０１４／０６５５９６号を参照し、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。他のガイドＲＮＡ標的配列＋ＰＡＭは、５’ＧまたはＧＧ及び３’ＧＧまたはＮＧＧを含む、４～２２の間のヌクレオチド長を有し得る。更に他のガイドＲＮＡ標的配列＋ＰＡＭは、１４と２０の間のヌクレオチド長を有し得る。例示的なｓｇＲＮＡ配列には、配列番号１７～３８、４０～４１、４３、４８及び５０～５５が含まれるが、これらに限定されない。

【0122】

標的ＤＮＡにハイブリダイズしたＣＲＩＳＰＲ複合体の形成は、ガイドＲＮＡ標的配列に対応する領域内またはその近くの標的ＤＮＡの一方または両方の鎖の切断をもたらし得る（すなわち、標的ＤＮＡの非相補鎖上のガイドＲＮＡ標的配列、及びガイドＲＮＡがハイブリダイズする相補鎖上の逆相補鎖）。例えば、切断部位は、ガイドＲＮＡ標的配列内（例えば、ＰＡＭ配列に対して定義された位置）であり得る。「切断部位」には、Ｃａｓタンパク質が一本鎖切断または二本鎖切断を生じる標的ＤＮＡの位置が含まれる。切断部位は、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖のみ（例えば、ニッカーゼを使用する場合）または両方の鎖上であり得る。切断部位は、両方の鎖の同じ位置であり得るか（平滑末端を生じる、例えば、Ｃａｓ９）、または各鎖の異なる部位であり得る（ねじれ型末端（すなわち、オーバーハング）を生じる、例えば、Ｃｐｆ１）。ねじれ型末端は、例えば、それぞれが異なる鎖の異なる切断部位で一本鎖切断を生じ、それによって二本鎖切断を生じる、２つのＣａｓタンパク質を使用することによって生成され得る。例えば、第１のニッカーゼは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の第１の鎖上に一本鎖切断を作成することができ、第２のニッカーゼは、オーバーハング配列が作成されるようにｄｓＤＮＡの第２の鎖上に一本鎖切断を作成することができる。場合によっては、第１の鎖上のニッカーゼのガイドＲＮＡ標的配列または切断部位は、第２の鎖上のニッカーゼのガイドＲＮＡ標的配列または切断部位から少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００または１，０００塩基対だけ離れている。

【0123】

追加の遺伝子修飾剤
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される薬剤は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系以外のゲノム編集のための薬剤である。ＤＮＡの欠失は、標的遺伝子をノックアウトまたは破壊する遺伝子治療を使用して行うことができる。ノックアウトは、遺伝子ノックダウンであり得るか、または遺伝子は、これに限定されないがレトロウイルス遺伝子導入を含む、点変異、挿入、欠失、フレームシフトまたはミスセンス変異などの当技術分野で既知の技術による変異によってノックアウトされ得る。いくつかの実施形態において、薬剤は、本明細書に開示される遺伝子の少なくとも１つ（例えば、本明細書に開示されるオートファジー遺伝子などのオートファジー遺伝子、または本明細書に開示されるＮＦ－κＢ遺伝子などのＮＦ－κＢ遺伝子）を結合及び修飾するのに効果的なヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮ）である。

【0124】

所望の標的配列にニックまたは二本鎖切断を誘導する任意のヌクレアーゼ剤または所望の標的配列に結合する任意のＤＮＡ結合タンパク質を、本明細書に開示する方法及び組成物において使用することができる。天然またはネイティブのヌクレアーゼ剤を、ヌクレアーゼ剤が所望の標的配列にニックまたは二本鎖切断を誘導する限り、使用することができる。同様に、天然またはネイティブのＤＮＡ結合タンパク質を、ＤＮＡ結合タンパク質が所望の標的配列に結合する限り、使用することができる。あるいは、修飾型または改変型ヌクレアーゼ剤またはＤＮＡ結合タンパク質を使用することができる。「改変型ヌクレアーゼ剤またはＤＮＡ結合タンパク質」には、所望の標的配列を特異的に認識するようにその天然型から改変された（修飾または誘導された）ヌクレアーゼ剤またはＤＮＡ結合タンパク質が含まれる。したがって、改変型ヌクレアーゼ剤またはＤＮＡ結合タンパク質は、ネイティブの天然ヌクレアーゼ剤もしくはＤＮＡ結合タンパク質に由来するものであるか、または人工的に作成もしくは合成することができる。改変型ヌクレアーゼ剤またはＤＮＡ結合タンパク質は、標的配列を認識することができ、例えば、その場合、標的配列は、ネイティブの（未改変または未修飾の）ヌクレアーゼ剤またはＤＮＡ結合タンパク質によって認識されるであろう配列ではない。ヌクレアーゼ剤またはＤＮＡ結合タンパク質の修飾は、タンパク質切断剤中のわずか１個のアミノ酸または核酸切断剤中のわずか１個のヌクレオチドとすることができる。標的配列または他のＤＮＡにニックまたは二本鎖切断を生じさせることは、本明細書では、標的配列または他のＤＮＡを「切る」または「切断する」と呼ぶことができる。

【0125】

ヌクレアーゼ剤またはＤＮＡ結合タンパク質（すなわち、改変型ヌクレアーゼ剤またはＤＮＡ結合タンパク質）の活性バリアント及び断片も提供される。そのような活性バリアントは、天然のヌクレアーゼ剤もしくはＤＮＡ結合タンパク質と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性があり、活性バリアントは、所望の標的配列で切断する能力を保持し、そのため、ニックもしくは二重鎖切断誘導活性を保持するか、または所望の標的配列を結合する能力を保持する。例えば、本明細書に記載のヌクレアーゼ剤のいずれかを天然のエンドヌクレアーゼ配列から改変し、天然のヌクレアーゼ剤によって認識されなかった標的配列でニックまたは二本鎖切断を認識して誘導するように設計することができる。したがって、いくつかの改変型ヌクレアーゼは、対応する天然のヌクレアーゼ剤標的配列とは異なる標的配列でニックまたは二本鎖切断を誘導する特異性を有する。ニックまたは二本鎖切断誘導活性のアッセイは既知であり、一般的にそれは、標的配列を含むＤＮＡ基質上のエンドヌクレアーゼの全体的な活性及び特異性を測定する。標的配列は、細胞にとって内在性（または、ネイティブ）であり得るか、または標的配列は、細胞にとって外来性であり得る。細胞にとって外因性である標的配列は、細胞のゲノムに自然に存在するわけではない。標的配列はまた、標的遺伝子座に配置することを望む目的のポリヌクレオチドに対して外来性であり得る。場合によっては、標的配列は、宿主細胞のゲノム中に一箇所だけ存在する。

【0126】

例示する標的配列の活性バリアント及び断片も提供される。そのような活性バリアントは、所与の標的配列に対して、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％、またはそれ以上の配列同一性を有し、活性バリアントは生物活性を保持し、したがってヌクレアーゼ剤によって配列特異的な様式で認識かつ切断され得る。ヌクレアーゼ剤による標的配列の二本鎖切断を測定するアッセイは、公知である（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ｑＰＣＲアッセイ、Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ４７６：２９５－３０７、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0127】

標的配列の長さは様々に異なり得るが、例えば、ジンクフィンガータンパク質またはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）対に対して約３０～３６ｂｐ（すなわち、各ＺＦＮに対して約１５～１８ｂｐ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）に対して約３６ｂｐ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡに対して約２０ｂｐの標的配列が挙げられる。

【0128】

ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ剤の標的配列は、標的ゲノム遺伝子座の内部または近傍の任意の場所に配置することができる。標的配列は、遺伝子のコード領域内、または遺伝子の発現に影響を及ぼす制御領域内に配置することができる。ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ剤の標的配列は、イントロン、エクソン、プロモーター、エンハンサー、制御領域、または任意の非タンパク質コード領域に配置することができる。

【0129】

本明細書に開示する様々な方法及び組成物において使用することができるＤＮＡ結合タンパク質の１つの種類は、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）である。ＴＡＬＥは、例えば、エピジェネティック修飾ドメイン、転写活性化ドメイン、または転写抑制因子ドメインに融合させるか、または連結することができる。そのようなドメインの例は、Ｃａｓタンパク質に関して以下に記載されており、例えば、国際特許第ＷＯ２０１１／１４５１２１号にも見いだすことができ、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。それに対応して、本明細書に開示する様々な方法及び組成物において使用することができるヌクレアーゼ剤の１つのタイプは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、原核生物または真核生物のゲノムの特定の標的配列において二本鎖切断を行うために使用することができる配列特異的ヌクレアーゼのクラスである。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、ＦｏｋＩなどのエンドヌクレアーゼの触媒ドメインに、ネイティブ型もしくは改変型転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター、またはその機能部分を融合することにより作成する。ユニークなモジュラー型ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインにより、潜在的に任意のＤＮＡ認識特異性を有するタンパク質の設計が可能になる。したがって、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインを、特定のＤＮＡ標的部位を認識するように設計し、したがって、所望の標的配列において二本鎖切断を行うために使用することができる。国際特許第ＷＯ２０１０／０７９４３０号；Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０７（５０：２１６１７－２１６２２；Ｓｃｈｏｌｚｅ＆Ｂｏｃｈ（２０１０）Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ１：４２８－４３２；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１８６：７５７－７６１；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９（１）：３５９－３７２；及びＭｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２９：１４３－１４８を参照し、そのそれぞれは、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。

【0130】

ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの末端からの非特異的ＤＮＡ切断ドメインを使用して、酵母アッセイで活性なハイブリッドヌクレアーゼを構築できる。これらの試薬は、植物細胞及び動物細胞でも活性がある。ＦｏｋＩドメインは二量体として機能し、適切な配向及び間隔で標的ゲノム内の部位に固有のＤＮＡ結合ドメインを備える２つの構築物を必要とする。ＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ切断ドメインの間のアミノ酸残基数と、２つの個々のＴＡＬＥＮ結合部位の間の塩基数の両方が、高レベルの活性を達成するためのパラメーターである。ＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ切断ドメインとの間のアミノ酸残基の数は、複数のＴＡＬエフェクター反復配列とＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインとの間のスペーサー（スペーサー配列とは異なる）の導入によって改変され得る。スペーサー配列は、１２～３０ヌクレオチドであり得る。

【0131】

アミノ酸配列とＴＡＬＥＮ結合ドメインのＤＮＡ認識との間の関係により、設計可能なタンパク質が可能になる。この場合、人工遺伝子合成は、ＴＡＬＥ結合ドメインに見られる反復配列の不適切なアニーリングのために問題がある。これに対する１つの解決策は、公開されているソフトウェアプログラム（ＤＮＡＷｏｒｋｓ）を使用して、２段階ＰＣＲでのアセンブリ、オリゴヌクレオチドアセンブリとそれに続く全遺伝子増幅に適したオリゴヌクレオチドを計算することである。操作されたＴＡＬＥ構築物を生成するための多数のモジュラーアセンブリスキームも報告されている。どちらの方法も、ジンクフィンガーＤＮＡ認識ドメインを生成するためのモジュラーアセンブリ法と概念的に類似した、ＤＮＡ結合ドメインを操作するための体系的なアプローチを提供する。

【0132】

ＴＡＬＥＮ遺伝子が組み立てられると、それらはプラスミドに挿入される。次いで、プラスミドを使用して、遺伝子産物が発現する標的細胞にトランスフェクトし、核に入ってゲノムにアクセスする。ＴＡＬＥＮは、細胞が修復メカニズムで応答する二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導することにより、ゲノムを編集するために使用できる。

【0133】

適切なＴＡＬヌクレアーゼの例、及び適切なＴＡＬヌクレアーゼを調製するための方法は、例えば、米国特許第２０１１／０２３９３１５Ａ１号、同第２０１１／０２６９２３４Ａ１号、同第２０１１／０１４５９４０Ａ１号、同第２００３／０２３２４１０Ａ１号、同第２００５／０２０８４８９Ａ１号、同第２００５／００２６１５７Ａ１号、同第２００５／００６４４７４Ａ１号、同第２００６／０１８８９８７Ａ１号及び同第２００６／００６３２３１Ａ１号を参照し、そのそれぞれは、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。様々な実施形態において、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、例えば、目的のゲノム遺伝子座の標的核酸配列またはその近傍を切断するように設計され、標的核酸配列は、改変されるべき配列またはその近傍にある。

【0134】

いくつかのＴＡＬＥＮでは、ＴＡＬＥＮの各モノマーは、２つの超可変残基を介して単一の塩基対を認識する３３～３５のＴＡＬリピートを含む。いくつかのＴＡＬＥＮでは、ヌクレアーゼ剤は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼなどの独立したヌクレアーゼに作動可能に連結したＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。例えば、ヌクレアーゼ剤は、第１のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメイン及び第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含むことができ、第１及び第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインのそれぞれは、ＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結し、第１及び第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインは、様々な長さ（１２～２０ｂｐ）のスペーサー配列によって分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖中の２つの隣接する標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットは二量体化して、標的配列において二本鎖切断を行う活性型ヌクレアーゼを生成する。

【0135】

転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることによって生成される人工制限酵素である。これらの試薬は、効率的でプログラム可能な特異的なＤＮＡ切断を可能にし、ｉｎ ｓｉｔｕゲノム編集の強力なツールである。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、実質的にあらゆるＤＮＡ配列に結合するようにすばやく操作され得る。本明細書で使用する場合、ＴＡＬＥＮという用語は広義であり、別のＴＡＬＥＮの支援なしに二本鎖ＤＮＡを切断できる単量体ＴＡＬＥＮを含む。ＴＡＬＥＮという用語はまた、同じ部位でＤＮＡを切断するために協働するように操作されたＴＡＬＥＮの対の一方または両方のメンバーを指すためにも使用される。一緒に機能するＴＡＬＥＮは、左ＴＡＬＥＮ及び右ＴＡＬＥＮと呼ばれることがあり、これはＤＮＡの利き手を参照している。米国特許第１２／９６５，５９０号、同第１３／４２６，９９１号（米国特許第８，４５０，４７１号）、同第１３／４２７，０４０号（米国特許第８，４４０，４３１号）、同第１３／４２７，１３７号（米国特許第８，４４０，４３２号）及び同第１３／７３８，３８１号を参照し、そのすべては、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。

【0136】

ＤＮＡ結合タンパク質の別の例は、ジンクフィンガータンパク質である。そのようなジンクフィンガータンパク質は、例えば、エピジェネティック修飾ドメイン、転写活性化ドメイン、または転写抑制因子ドメインに連結するか、または融合させることができる。そのようなドメインの例は、Ｃａｓタンパク質に関して以下に記載されており、例えば、国際特許第ＷＯ２０１１／１４５１２１号にも見いだすことができ、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。それに対応して、本明細書に開示する様々な方法及び組成物において使用することができるヌクレアーゼ剤の別の例はジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。いくつかのＺＦＮでは、ＺＦＮの各モノマーは３つ以上のジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含み、各ジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインは３ｂｐの部分部位に結合する。他のＺＦＮでは、ＺＦＮは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼなどの独立したヌクレアーゼに作動可能に連結したジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。例えば、ヌクレアーゼ剤は第１のＺＦＮ及び第２のＺＦＮを含むことができ、第１のＺＦＮ及び第２のＺＦＮのそれぞれはＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットに作動可能に連結し、第１及び第２のＺＦＮは、約５～７ｂｐのスペーサーにより分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖において２つの隣接する標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットは二量体化して、二本鎖切断を行う活性型ヌクレアーゼを生成する。例えば、米国特許第２００６／０２４６５６７号、同第２００８／０１８２３３２号、同第２００２／００８１６１４号、同第２００３／００２１７７６号、国際特許第ＷＯ２００２／０５７３０８Ａ２号、米国特許第２０１３／０１２３４８４号、同第２０１０／０２９１０４８号、国際特許第ＷＯ２０１１／０１７２９３Ａ２号、及び Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３１（７）：３９７－４０５を参照し、そのそれぞれは、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。

【0137】

干渉核酸剤
特定の実施形態において、オートファジーもしくはＮＦ－κＢ遺伝子（例えば、表１または表２に列挙される遺伝子）の産物（例えば、ｍＲＮＡ産物）の活性または発現を選択的に標的としかつ阻害する干渉核酸分子は、本明細書で提供される、及び／または本明細書に記載の方法で使用される。いくつかの実施形態において、干渉核酸は、少なくとも１つのオートファジー遺伝子または少なくとも１つのＮＦ－κＢ遺伝子（例えば、表１または表２に列挙される遺伝子）の産物を発現する細胞で細胞毒性を誘導する。薬剤は、少なくとも１つのオートファジー遺伝子または少なくとも１つのＮＦ－κＢ遺伝子の産物（例えば、ｍＲＮＡ産物）の発現または活性を少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％阻害し得る。本明細書に開示する薬剤は、少なくとも１つのオートファジー遺伝子または少なくとも１つのＮＦ－κＢ遺伝子の産物（例えば、ｍＲＮＡ産物）に対する少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の相補性を含み得る。

【0138】

いくつかの実施形態において、干渉核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＰＮＡ、またはｍｉＲＮＡ分子である。干渉核酸は一般に、それぞれが塩基対部分を有し、塩基対形成部分がワトソン－クリック塩基対形成によって核酸（通常ＲＮＡ）中の標的配列にハイブリダイズするのを可能にするサブユニット間結合によって連結され、標的配列内に核酸、オリゴマーヘテロ二重鎖を形成する環状サブユニットの配列を含む。干渉ＲＮＡ分子には、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子、一本鎖ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子及びｓｈＲＮＡ分子が含まれるが、これらに限定されない。

【0139】

通常、標的ｍＲＮＡ配列の補体の少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３ヌクレオチドは、標的転写物の阻害を媒介するのに十分である。完全な相補性は必要ない。いくつかの実施形態において、干渉核酸分子は二本鎖ＲＮＡである。二本鎖ＲＮＡ分子は、２ヌクレオチド３’オーバーハングを有し得る。いくつかの実施形態において、２本のＲＮＡ鎖はヘアピン構造を介して結合され、ｓｈＲＮＡ分子を形成する。ｓｈＲＮＡ分子は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ分子に由来するヘアピンを含有できる。例えば、ｍｉＲ３０ ｍｉＲＮＡ由来のヘアピンを含有するｐＣＡＧ－ｍｉＲ３０構築物内に干渉ＲＮＡ配列をクローニングすることにより、ＲＮＡｉベクターを構築することができる。ＲＮＡ干渉分子には、ＲＮＡ残基と同様にＤＮＡ残基も含まれ得る。

【0140】

本明細書で提供される干渉核酸分子は、ＲＮＡ塩基、非ＲＮＡ塩基、またはＲＮＡ塩基と非ＲＮＡ塩基の混合物を含み得る。例えば、本明細書で提供される干渉核酸分子は、主にＲＮＡ塩基からなり得るが、ＤＮＡ塩基または天然には存在しないヌクレオチドも含み得る。

【0141】

干渉核酸は、様々なオリゴヌクレオチド化学物質を利用することができる。オリゴヌクレオチド化学物質の例としては、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、連結核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオエート、２’Ｏ－Ｍｅ修飾オリゴヌクレオチド、及びモルホリノ化学物質（前述の任意のものの組み合わせを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、ＰＮＡ及びＬＮＡ化学物質は、２’Ｏ－Ｍｅオリゴヌクレオチドに比べて標的結合強度が比較的高いため、より短いターゲティング配列を利用することができる。ホスホロチオエート及び２’Ｏ－Ｍｅ修飾化学物質を組み合わせて、ホスホロチオエート骨格を有する２’Ｏ－Ｍｅ修飾オリゴヌクレオチドを生成することがよくある。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ／２０１３／１１２０５３号及び同第ＷＯ／２００９／００８７２５号を参照し、参照によりその全体が組み込まれる。

【0142】

ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ピリミジンまたはプリン塩基が結合したＮ－（２－アミノエチル）グリシン単位からなる、デオキシリボース骨格と構造的に相同な骨格のＤＮＡの類似体である。天然のピリミジン及びプリン塩基を含有するＰＮＡは、ワトソン－クリック塩基対形成規則に従い、相補的なオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、塩基対認識に関してＤＮＡを模倣する（Ｅｇｈｏｌｍ，Ｂｕｃｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．１９９３）。ＰＮＡの骨格は、ホスホジエステル結合ではなく、ペプチド結合によって形成されるため、アンチセンス用途に適している（下の構造を参照）。骨格は帯電しておらず、通常よりも優れた熱安定性を示すＰＮＡ／ＤＮＡまたＰＮＡ／ＲＮＡ二重鎖をもたらす。ＰＮＡは、ヌクレアーゼまたはプロテアーゼによって認識されない。

【0143】

自然の構造に対する根本的な構造変化にもかかわらず、ＰＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡへのらせん形状の配列特異的結合が可能である。ＰＮＡの特徴には、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡに対する高い結合親和性、一塩基ミスマッチによって生じる不安定化効果、ヌクレアーゼ及びプロテアーゼに対する耐性、塩濃度に依存しないＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイゼーション、ならびにホモプリンＤＮＡとの三重鎖形成が挙げられる。ＰＡＮＡＧＥＮＥ（商標）は、独自のＢｔｓＰＮＡモノマー（Ｂｔｓ、ベンゾチアゾール－２－スルホニル基）及び独自のオリゴマー化プロセスを開発した。ＢｔｓＰＮＡモノマーを使用したＰＮＡオリゴマー化は、脱保護、カップリング及びキャッピングの反復サイクルからなる。ＰＮＡは、当技術分野で既知の任意の技術を使用して合成的に生成することができる。例えば、米国特許第６，９６９，７６６号、同第７，２１１，６６８号、同第７，０２２，８５１号、同第７，１２５，９９４号、同第７，１４５，００６号及び同第７，１７９，８９６号を参照のこと。またＰＮＡの調製については、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号及び同第５，７１９，２６２号も参照のこと。ＰＮＡ化合物の更なる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１４９７－１５００，１９９１で見いだすことができる。前述のそれぞれは、参照によりその全体が組み込まれる。

【0144】

干渉核酸はまた、「ロックド核酸」サブユニット（ＬＮＡ）も含み得る。「ＬＮＡ」は、架橋核酸（ＢＮＡ）と呼ばれる修飾の一種である。ＢＮＡは、リボース環の構造をＣ３０－エンド（ノーザン）シュガーパッカーにロックする共有結合によって特性評価される。ＬＮＡの場合、架橋は、２’－Ｏと４’－Ｃ位の間のメチレンからなる。ＬＮＡは、骨格の事前組織化及び塩基スタッキングを強化して、ハイブリダイゼーション及び熱安定性を高める。

【0145】

ＬＮＡの構造は、例えば、Ｗｅｎｇｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９８）４５５；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９９８）５４：３６０７，ａｎｄ Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９９）３２：３０１）；Ｏｂｉｋａ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９７）３８：８７３５；（１９９８）３９：５４０１及びＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００８）１６：９２３０で見いだし得る。本明細書で提供される化合物は、１つ以上のＬＮＡを組み込むことができ、場合によっては、化合物は完全にＬＮＡからなり得る。個々のＬＮＡヌクレオシドサブユニットの合成及びオリゴヌクレオチドへのそれらの組み込みのための方法は、例えば、米国特許第７，５７２，５８２号、同第７，５６９，５７５号、同第７，０８４，１２５号、同第７，０６０，８０９号、同第７，０５３，２０７号、同第７，０３４，１３３号、同第６，７９４，４９９号及び同第６，６７０，４６１号に記載されており、そのそれぞれは、参照によりその全体が組み込まれる。典型的なサブユニット間リンカーには、ホスホジエステル及びホスホロチオエート部分が含まれる。あるいは、リンを含有しないリンカーを使用することができる。一実施形態は、各ＬＮＡサブユニットがＤＮＡサブユニットによって分離されているＬＮＡ含有化合物である。特定の化合物は、サブユニット間リンカーがホスホロチオエートである交互のＬＮＡサブユニット及びＤＮＡサブユニットからなる。

【0146】

「ホスホロチオエート」（またはＳ－オリゴ）は、架橋していない酸素の１つが硫黄に置き換えられた正常なＤＮＡのバリアントである。ヌクレオチド間結合の硫化は、５’から３’及び３’から５’へのＤＮＡ ＰＯＬ１エキソヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＳ１及びＰ１、ＲＮａｓｅ、血清ヌクレアーゼ、及びヘビ毒ホスホジエステラーゼを含むエンドヌクレアーゼならびにエキソヌクレアーゼの作用を低下させる。ホスホロチオエートは、次の２つの主要な経路によって、二硫化炭素中の元素状硫黄の溶液をホスホン酸水素に作用させることにより、または亜リン酸トリエステルをテトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）もしくは３Ｈ－１，２－ベンソジチオール－３－オン１，１－ジオキシド（ＢＤＴＤ）で硫化する方法により（例えば、Ｉｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５，４６９３－４６９９，１９９０を参照）作成される。後者の方法は、元素状硫黄がほとんどの有機溶媒に不溶であるという問題、及び二硫化炭素の毒性を回避する。ＴＥＴＤ及びＢＤＴＤ方法ではまた、より高純度のホスホロチオエートも得られる。

【0147】

「２’Ｏ－Ｍｅオリゴヌクレオチド」分子は、リボース分子の２’－ＯＨ残基にメチル基を有する。２’－Ｏ－Ｍｅ－ＲＮＡは、ＤＮＡと同じ（または類似した）挙動を示すが、ヌクレアーゼ分解から保護されている。２’－Ｏ－Ｍｅ－ＲＮＡは、更なる安定化のためにホスホチオエートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）と組み合わせることもできる。２’Ｏ－Ｍｅオリゴヌクレオチド（ホスホジエステルまたはホスホチオエート）は、当技術分野における通常の技術に従って合成することができる（例えば、Ｙｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２：２００８－１６，２００４を参照）。

【0148】

本明細書に記載の干渉核酸は、細胞と接触させ得るか、または生物（例えば、ヒト）に投与し得る。あるいは、干渉ＲＮＡ分子をコードする構築物及び／またはベクターは、細胞または生物に接触させ得るか、または導入することができる。特定の実施形態において、ウイルス、レトロウイルス、またはレンチウイルスベクターが使用される。いくつかの実施形態において、ベクターは、心臓組織に対する向性を有する。いくつかの実施形態において、ベクターは、アデノ随伴ウイルスである。

【0149】

一実施形態において、干渉核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子である。そのようなｓｉＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ分子が標的ＲＮＡを下方制御するように、標的領域に対して十分な相同性を有する領域を含み、ヌクレオチドに関して十分な長さであるべきである。「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語は、修飾されたＲＮＡまたはヌクレオチド代替物の場合、１つ以上の位置における修飾されたヌクレオチドまたは代替置換部位も指すことができる。ｓｉＲＮＡ分子と標的の間に完全な相補性がある必要はないが、標的ＲＮＡのＲＮＡｉ切断などによって、ｓｉＲＮＡ分子が配列特異的なサイレンシングを誘導できるようにするのに十分な対応関係が必要である。いくつかの実施形態において、センス鎖は、分子の全体的な二本鎖特性を維持するためにアンチセンス鎖と十分に相補的であるだけでよい。

【0150】

更に、ｓｉＲＮＡ分子は修飾され得るか、またはヌクレオシド代替物を含み得る。ｓｉＲＮＡ分子の一本鎖領域は修飾され得るか、またはヌクレオシド代替物を含み得、例えば不対領域もしくはヘアピン構造の領域、例えば２つの相補的領域を連結する領域は、修飾またはヌクレオシド代替物を有し得る。例えばエキソヌクレアーゼに対して、ｓｉＲＮＡ分子の１つ以上の３’末端もしくは５’末端を安定化するための修飾、またはアンチセンスｓｉＲＮＡ剤がＲＩＳＣに入るのを促進するための修飾も有用である。修飾には、Ｃ３（またはＣ６、Ｃ７、Ｃ１２）アミノリンカー、チオールリンカー、カルボキシルリンカー、非ヌクレオチドスペーサー（Ｃ３、Ｃ６、Ｃ９、Ｃ１２、脱塩基、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール）、ＲＮＡ合成中に複数のカップリングを可能にする、ホスホルアミダイトとしてかつ別のＤＭＴ保護ヒドロキシル基を有する特別なビオチンまたはフルオレセイン試薬が含まれ得る。

【0151】

ｓｈＲＮＡの非限定的な例には、センス及びアンチセンス領域が核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカーによって連結されている、一本鎖分子から組み立てられた二本鎖ポリヌクレオチド分子、ならびに自己相補的なセンス及びアンチセンス領域を有するヘアピン二次構造を備える二本鎖ポリヌクレオチド分子が含まれる。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡのセンス及びアンチセンス鎖は、約１～約２５ヌクレオチド、約２～約２０ヌクレオチド、約４～約１５ヌクレオチド、約５～約１２ヌクレオチド、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５もしくはそれ以上のヌクレオチドを含むループ構造によって連結される。

【0152】

ｓｈＲＮＡ、ならびにそのようなｓｈＲＮＡを設計及び合成する方法に関する更なる実施形態は、米国特許出願公開第２０１１／００７１２０８号に記載されており、その開示は、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。

【0153】

いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が本明細書に提供される。ｍｉＲＮＡは、生物で自然に生成される小さなＲＮＡの大きな群を表し、そのうちのいくつかは標的遺伝子の発現を調節する。ｍｉＲＮＡは、ダイサーによって約７０ヌクレオチドの一本鎖ヘアピン前駆体転写物から形成される。ｍｉＲＮＡはタンパク質に翻訳されるのではなく、代わりに特定のメッセンジャーＲＮＡに結合し、それにより翻訳をブロックする。場合によっては、ｍｉＲＮＡは、標的と不正確に塩基対を形成し、翻訳を阻害する。

【0154】

特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的配列に対して１００％相補的であり得るか、またはオリゴヌクレオチドと標的配列との間に形成されるヘテロ二本鎖が、細胞ヌクレアーゼの作用及びｉｎ ｖｉｖｏで発生し得る他の分解モードに耐えられるほど十分に安定している限り、例えば、疾患関連変異を含む対立遺伝子の選択的ターゲティングを改善するために、ミスマッチを含み得る。したがって、特定のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと標的配列の間に約または少なくとも約７０％の配列相補性、例えば７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相補性を有し得る。ヌクレアーゼによる切断の影響を受けにくいオリゴヌクレオチド骨格について本明細書で説明する。存在する場合、ミスマッチは通常、ハイブリッド二本鎖の中間領域よりも末端領域に向かって不安定になりにくい。許容されるミスマッチの数は、よく理解されている二本鎖安定性の原則に従って、オリゴヌクレオチドの長さ、二重鎖中のＧ：Ｃ塩基対の割合、及び二重鎖中のミスマッチ（複数可）の位置に依存する。

【0155】

干渉核酸分子は、例えば、化学合成、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、またはＲｎａｓｅ ＩＩＩもしくはダイサーによる長いｄｓＲＮＡの消化によって調製することができる。これらは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、または当技術分野で既知の他の方法によって細胞に導入することができる。Ｈａｎｎｏｎ，ＧＪ，２００２，ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，Ｎａｔｕｒｅ４１８：２４４－２５１；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ Ｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｔｈｅ ｒｅｓｔ ｉｓ ｓｉｌｅｎｃｅ．ＲＮＡ７：１５０９－１５２１；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ Ｇ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡｉ：Ｎａｔｕｒｅ ａｂｈｏｒｓ ａ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ． Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２：２２５－２３２；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，２００２，Ａ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ２９６：５５０－５５３；Ｌｅｅ ＮＳ，Ｄｏｈｊｉｍａ Ｔ，Ｂａｕｅｒ Ｇ，Ｌｉ Ｈ，Ｌｉ Ｍ－Ｊ，Ｅｈｓａｎｉ Ａ，Ｓａｌｖａｔｅｒｒａ Ｐ， ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ Ｊ．（２００２）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ＨＩＶ－１ ｒｅｖ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５００－５０５；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ Ｍ，ａｎｄ Ｔａｉｒａ Ｋ．（２００２）．Ｕ６－ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ｄｒｉｖｅｎ ｓｉＲＮＡｓ ｗｉｔｈ ｆｏｕｒ ｕｒｉｄｉｎｅ ３’ｏｖｅｒｈａｎｇｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４９７－５００；Ｐａｄｄｉｓｏｎ ＰＪ，Ｃａｕｄｙ ＡＡ，Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ Ｅ，Ｈａｎｎｏｎ ＧＪ，ａｎｄ Ｃｏｎｋｌｉｎ ＤＳ．（２００２）．Ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡｓ （ｓｈＲＮＡｓ） ｉｎｄｕｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．１６：９４８－９５８；Ｐａｕｌ ＣＰ，Ｇｏｏｄ ＰＤ，Ｗｉｎｅｒ Ｉ，ａｎｄ Ｅｎｇｅｌｋｅ ＤＲ．（２００２）．Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５０５－５０８；Ｓｕｉ Ｇ，Ｓｏｏｈｏｏ Ｃ，Ａｆｆａｒ Ｅ－Ｂ，Ｇａｙ Ｆ，Ｓｈｉ Ｙ，Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ ＷＣ，ａｎｄ Ｓｈｉ Ｙ．（２００２）．Ａ ＤＮＡ ｖｅｃｔｏｒ－ｂａｓｅｄ ＲＮＡｉ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｔｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９（６）：５５１５－５５２０；Ｙｕ Ｊ－Ｙ，ＤｅＲｕｉｔｅｒ ＳＬ，ａｎｄ Ｔｕｒｎｅｒ ＤＬ．（２００２）．ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｈｏｒｔ－ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ ａｎｄ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９（９）：６０４７－６０５２を参照。

【0156】

本方法では、干渉核酸分子またはポリヌクレオチドをコードする干渉核酸を、例えば裸の核酸として、送達試薬と組み合わせて及び／または干渉核酸分子を発現する配列を含む核酸として、対象に投与することができる。いくつかの実施形態において、干渉核酸は、対象の腫瘍に直接投与される。いくつかの実施形態において、干渉核酸分子を発現する配列を含む核酸は、ベクター、例えば、プラスミド、ウイルス及び細菌ベクター内に送達される。当技術分野で既知の任意の核酸送達方法を、本明細書に記載の方法で使用することができる。適切な送達試薬には、例えば、Ｍｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓｉｔ ＴＫＯ親油性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオン（例えば、ポリリジン）、アテロコラーゲン、ナノプレックス及びリポソームが含まれるが、これらに限定されない。核酸分子の送達ビヒクルとしてのアテロコラーゲンの使用は、Ｍｉｎａｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３２（１３）：ｅ１０９（２００４）；Ｈａｎａｉ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．，１０８２：９－１７（２００６）；及びＫａｗａｔａ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．，７（９）：２９０４－１２（２００８）に記載され、それらのそれぞれは、その全体が本明細書に組み込まれる。例示的な干渉核酸送達システムは、米国特許第８，２８３，４６１号、同第８，３１３，７７２号、同第８，５０１，９３０号、同第８，４２６，５５４号、同第８，２６８，７９８号及び同第８，３２４，３６６号に提供されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0157】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、リポソームを使用して、阻害性オリゴヌクレオチドを対象に送達する。本明細書に記載の方法での使用に適したリポソームは、一般的に中性または負荷電のリン脂質及びコレステロールなどのステロールを含む、標準的な小胞形成脂質から形成され得る。脂質の選択は一般に、リポソームの望ましいサイズや血流中のリポソームの半減期などの要因を考慮することによって行われる。リポソームの調製する様々な方法は、例えば、Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．（１９８０），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７ならびに米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号及び同第５，０１９，３６９号に記載されているように既知であり、これらの開示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0158】

本方法で使用するリポソームはまた、単核マクロファージ系（「ＭＭＳ」）及び網内皮系（「ＲＥＳ」）によるクリアランスを回避するように修飾され得る。このような改変リポソームは、表面にオプソニン化阻害部位を有するか、またはリポソーム構造に組み込まれている。

【0159】

小分子剤
本明細書に開示される方法及び組成物の特定の実施形態は、小分子薬剤、例えば、がん細胞におけるオートファジー遺伝子（例えば、本明細書に開示されるオートファジー遺伝子）またはＮＦ－κＢ遺伝子（例えば、本明細書に開示されるＮＦ－κＢ遺伝子）の産物の発現または活性を阻害する小分子薬剤の使用に関する。いくつかの実施形態において、小分子は、オートファジー遺伝子（例えば、本明細書に開示されるオートファジー遺伝子）またはＮＦ－κＢ遺伝子（例えば、本明細書に開示されるＮＦ－κＢ遺伝子）の産物を発現する細胞の細胞毒性を誘導する。そのような薬剤には、当技術分野で既知のもの、及び本明細書に記載のスクリーニングアッセイを使用して同定されたものが含まれる。本明細書で提供される小分子は、オートファジー遺伝子（例えば、本明細書に開示されるオートファジー遺伝子）もしくはＮＦ－κＢ遺伝子（例えば、本明細書に開示されるＮＦ－κＢ遺伝子）の産物に対する少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％の特異性を有し得る。

【0160】

特定の実施形態において、薬剤は、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３）阻害剤、Ｕｎｃ－５１様キナーゼ１（ＵＬＫ１）阻害剤、液胞タンパク質選別タンパク質１８（Ｖｐｓ１８）阻害剤、液胞タンパク質選別タンパク質３４（Ｖｐｓ３４）阻害剤、ユビキチン特異的ペプチダーゼ（ＵＳＰ１０またはＵＳＰ１３）阻害剤、チオキサントンベースのオートファジー阻害剤、ＡＴＧ４阻害剤、オートフィニブ、３－メチルアデニン、ワートマニン、塩化アンモニウム、バフィロマイシンＡ１、エフロルニチン、ロイペプチン、ベツリン酸、ＣＡ０７４、コルヒチン、タプシガルギン、バキュオリン－１、ビンブラスチン、デスメチルクロミプラミン、ＬＹ２９４００２、ＰＴ２１０、ＧＳＫ－２１２６４５８、スパウチン－１、ＳＡＲ４０５、化合物３１、ＶＰＳ３４－ＩＮ１、ＰＩＫ－ＩＩＩ、化合物６、ＭＲＴ６８９２１、ＳＢＩ－０２０６９６５、ペプスタチンＡ、Ｅ６４ｄ、クロミプラミン、ルカントン、クロロキン、ヒドロキシクロルキン、モネンシン、Ｌｙｓ０５、ＡＲＮ５１８７、化合物３０、ＭＰＴ０Ｌ１４５、ＲＯＣ３２５、ベルテポルフィン、ＮＳＣ１８５０５８及びＮＳＣ３７７０７１などの小分子オートファジー阻害剤であり得る。追加のオートファジー阻害剤及びオートファジー阻害剤に関する詳細は、Ｗａｌｅｓｋａ Ｋ．Ｍａｒｔｉｎｓ ａｎｄ Ｍａｕｒｉｃｉｏ Ｓ．Ｂａｐｔｉｓｔａ（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ１０ｔｈ２０１６）． Ａｕｔｏｐｈａｇｙ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｅｌｌｅ－Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｎｉｋｏｌａｉ Ｖ．Ｇｏｒｂｕｎｏｖ ａｎｄ Ｍａｒｉｏｎ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，ＩｎｔｅｃｈＯｐｅｎ，ＤＯＩ：１０．５７７２／６３９７６（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｎｔｅｃｈｏｐｅｎ．ｃｏｍ／ｂｏｏｋｓ／ａｕｔｏｐｈａｇｙ－ｉｎ－ｃｕｒｒｅｎｔ－ｔｒｅｎｄｓ－ｉｎ－ｃｅｌｌｕｌａｒ－ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ－ａｎｄ－ｐａｔｈｏｌｏｇｙ／ａｕｔｏｐｈａｇｙ－ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ－ｆｏｒ－ｏｒｇａｎｅｌｌｅ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ－ｔｈｅｒａｐｙから入手可能）；Ｐａｓｑｕｉｅｒ，Ｂｅｎｏｉｔ．“Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．”Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ７３（２０１５）：９８５－１００１；米国特許第８５２４７６２号及び同第９９２６３２６号；ＷＩＰＯ公開第ＷＯ２０１１０１１５２２号に見いだされ得、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0161】

いくつかの実施形態において、薬剤は、ＮＦ－κＢ経路の阻害剤であり得る。小分子オートファジー阻害剤には、ＩＫＫ及びＩκＢリン酸化阻害剤、ＩκＢ分解阻害剤、プロテアソーム及びプロテアーゼ阻害剤、ＩκＢα上方制御、ＮＦ－κＢ核移行、ならびにＮＦ－κＢ発現阻害剤、ＮＦ－κＢ ＤＮＡ結合阻害剤、ＮＦ－κＢ転写活性化阻害剤、抗酸化剤、または上流標的阻害剤が含まれる。ＮＦ－κＢ阻害剤のリストは、Ｇｉｌｍｏｒｅ，Ｔ．，Ｈｅｒｓｃｏｖｉｔｃｈ，Ｍ．“Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ＮＦ－κＢ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：７８５ ａｎｄ ｃｏｕｎｔｉｎｇ．”Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２５，６８８７－６８９９（２００６）に見いだされ得、参照により全体が本明細書に組み込まれる。

【0162】

本明細書に開示される方法で有用な薬剤は、天然及び／または合成化合物の系統的ライブラリーを含む任意の入手可能な供給源から得ることができる。薬剤はまた、生物学的ライブラリー；ペプトイドライブラリー（ペプチドの機能性を有しながら、酵素分解に対して抵抗性であり、それにもかかわらず生物活性を維持する新規な非ペプチド主鎖を備える分子のライブラリー、例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８－８５を参照）；空間的にアドレス指定可能な並行固相または溶液相ライブラリー；逆重畳を必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；及びアフィニティークロマトグラフィー選択を使用した合成ライブラリー法を含む、当技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチのいずれかによって取得することもできる。生物学的ライブラリー及びペプトイドライブラリーのアプローチは、ペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の小分子ライブラリーに適用できる（Ｌａｍ，１９９７，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４５）。

【0163】

分子ライブラリーの合成方法の例は、当技術分野で、例えば、ＤｅＷｉｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１及びＧａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３で見いだされ得る。

【0164】

薬剤のライブラリーは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１３：４１２－４２１）、またはビーズ上（Ｌａｍ，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ３５４：８２－８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ３６４：５５５－５５６）、細菌及び／または胞子（Ｌａｄｎｅｒ，ＵＳＰ５，２２３，４０９）、プラスミド（Ｃｕｌｌ ｅｔ ａｌ，１９９２，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ８９：１８６５－１８６９）またはファージ上（Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３８６－３９０；Ｄｅｖｌｉｎ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：４０４－４０６；Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８－６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１－３１０；Ｌａｄｎｅｒ，ｓｕｐｒａ．）に存在し得る。

【0165】

本明細書に開示される方法に有用な薬剤は、例えば、候補薬剤または試験薬剤、例えば、オートファジー遺伝子（例えば、本明細書に開示されるオートファジー遺伝子）またはＮＦ－κＢ遺伝子（例えば、本明細書に開示されるＮＦ－κＢ遺伝子）の産物の活性または発現を減少させる薬剤をスクリーニングするためのアッセイを使用して同定され得る。

【0166】

薬剤送達
本明細書に開示される核酸及びタンパク質剤（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ剤、ＴＡＬＥＮ剤、ＺＦＮ剤、干渉核酸剤）は、任意の利用可能な手段によって細胞（例えば、がん細胞）に導入することができる。「導入する」とは、配列が細胞の内部にアクセスできるような方法で核酸またはタンパク質を細胞に提示することが含まれる。導入は任意の手段によって達成することができ、１つ以上の成分（例えば、２つの成分、またはすべての成分）を任意の組み合わせで同時にまたは連続して細胞に導入することができる。細胞のゲノムをヌクレアーゼ剤と接触させることは、１つ以上のヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸（例えば、１つ以上のＣａｓタンパク質または１つ以上のＣａｓタンパク質をコードする核酸、及び１つ以上のガイドＲＮＡまたは１つ以上のガイドＲＮＡをコードする核酸（すなわち、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び１つ以上のｔｒａｃｒＲＮＡ））を細胞内へ導入することを含み得る。細胞のゲノムとの接触（すなわち、細胞との接触）は、上記の成分のうちの１つのみ、１つ以上の成分、またはすべての成分を細胞に導入することを含み得る。

【0167】

いくつかの実施形態において、本明細書で提供される核酸及びタンパク質薬剤の適切な送達方法には、エレクトロポレーション、ｉＴＯＰ、脂質ナノ粒子、ポリマーナノ粒子、ＣＰＰ送達、ＤＮＡナノ構造、または金ナノ粒子が含まれるが、これらに限定されない。

【0168】

本明細書に開示される核酸薬剤（例えば、プラスミドベースのｇＲＮＡ－Ｃａｓ、Ｃａ９ ｍＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、干渉核酸薬剤）の適切な送達方法には、エレクトロポレーション、流体力学的注入、マイクロインジェクション、機械的細胞変形、脂質ナノ粒子、ＡＡＶまたはレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。

【0169】

ヌクレアーゼ剤は、タンパク質の形態で、またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸、例えば、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））もしくはＤＮＡの形態で細胞に導入することができる。ＤＮＡの形態で導入する場合、ＤＮＡを、細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。そのようなＤＮＡを、１つ以上の発現構築物の中に存在させることができる。

【0170】

例えば、Ｃａｓタンパク質は、タンパク質、例えば、ｇＲＮＡと複合体化したＣａｓタンパク質の形態で、またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、例えば、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））もしくはＤＮＡの形態で細胞に導入することができる。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡの形態で、またはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で細胞に導入することができる。ＤＮＡの形態で導入する場合、Ｃａｓタンパク質及び／またはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを、細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。そのようなＤＮＡを、１つ以上の発現構築物の中に存在させることができる。例えば、そのような発現構築物は、単一の核酸分子の成分であり得る。あるいは、それらは、２つ以上の核酸分子の間で任意の組み合わせで分離することができる（すなわち、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードするＤＮＡ、１つ以上のｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ、及びＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡを、別々の核酸分子の成分とすることができる）。

【0171】

本明細書における開示はまた、オートファジーもしくはＮＦ－ｋＢ遺伝子発現を標的とするｇＲＮＡ分子の１つまたはカクテル及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物も提供する。例えば、本発明は、それぞれがオートファジーまたはＮＦ－ｋＢ遺伝子を標的とする１、２、３、またはそれ以上のｇＲＮＡ分子を含む、医薬組成物を提供する。

【0172】

本明細書で提供される薬剤は、脂質粒子内に包まれたｇＲＮＡを含み得る。脂質粒子内に封入されたｇＲＮＡのカクテルを含む製剤に関して、異なるｇＲＮＡ分子は、同じ脂質粒子内に共封入される得るか、またはカクテル内に存在する各種類のｇＲＮＡ種が別々の粒子に封入され得るか、またはいくつかのｇＲＮＡ種は同じ粒子に共封入され得、他のｇＲＮＡ種は製剤内の異なる粒子に封入される。特定の実施形態において、脂質粒子は、ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡの両方を含む。特定の実施形態において、脂質粒子の１つの集団はｇＲＮＡを含み、脂質粒子の別の集団はＣａｓタンパク質（複数可）またはＣａｓタンパク質（複数可）をコードするｍＲＮＡを含み、これらの脂質粒子は同じ組成物または異なる組成物であり得、同時にまたは連続して投与され得る。

【0173】

いくつかの実施形態において、脂質粒子は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質及び任意選択で粒子の凝集を防ぐ複合脂質から形成される。核酸分子（例えば、ｇＲＮＡ分子）を含む脂質粒子は、核酸－脂質粒子と称される。核酸は、脂質粒子内に完全に封入され得、それによって核酸を酵素分解から保護することができる。いくつかの実施形態において、核酸－脂質粒子は、約５：１～約１５：１の総脂質：ｇＲＮＡ質量比を有する。特定の実施形態において、核酸－脂質粒子は、約５：１～約１５：１、または約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１もしくは１５：１、もしくはその一部もしくはその範囲の総脂質：ｇＲＮＡ質量比を有する。特定の実施形態において、核酸－脂質粒子は、約９：１の総脂質：ｇＲＮＡ質量比（例えば、９．１：１、９．２：１、９．３：１、９．４：１、９．５：１、９．６：１、９．７：１及び９．８：１を含む、８．５：１～１０：１または８．９：１～１０：１または９：１～９．９：１の脂質：薬物比）を有する。核酸－脂質粒子の投与は、例えば、経口、鼻腔内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、病巣内、気管内、皮下または皮内など当技術分野で既知の任意の経路によることができる。特定の実施形態において、核酸－脂質粒子は、例えば、経腸または非経口投与経路を介して全身的に投与される。核酸は、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／０３６８３号に記載されているように縮合剤と複合体を形成し、脂質粒子内に封入され得、その開示は、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。

【0174】

本明細書で提供される脂質粒子は、約３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍまで、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約９０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０ｎｍ～約９０ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、または約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍもしくは１５０ｎｍの平均直径を有し得る。核酸－脂質粒子及びそれらの調製方法は、例えば、米国特許公開第２００４０１４２０２５号及び同第２００７００４２０３１号に開示されており、その開示は、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。

【0175】

核酸－脂質粒子は、脂質コンジュゲートを含み得る。そのような脂質コンジュゲートには、例えば、ジアルキルオキシプロピルにカップリングされたＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲート）、ジアシルグリセロールにカップリングされたＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＧコンジュゲート）、コレステロールにカップリングされたＰＥＧ、ホスファチジルエタノールアミンにカップリングされたＰＥＧ、及びセラミドにコンジュゲートしたＰＥＧ（例えば、米国特許第５，８８５，６１３号を参照）、カチオン性ＰＥＧ脂質、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート（例えば、ＰＯＺ－ＤＡＡコンジュゲート）、ポリアミドオリゴマー（例えば、ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート）、及びこれらの混合物などのＰＥＧ－脂質コンジュゲートが含まれるが、これらに限定されない。ＰＯＺ－脂質コンジュゲートの更なる例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／００６２８２号に記載されている。ＰＥＧまたはＰＯＺは、脂質に直接コンジュゲートし得るか、またはリンカー部分を介して脂質に結合し得る。例えば、非エステル含有リンカー部位及びエステル含有リンカー部位を含む、ＰＥＧまたはＰＯＺを脂質にカップリングするのに適した任意のリンカー部位を使用することができる。特定の実施形態において、アミドまたはカルバマートなどの非エステル含有リンカー部位が使用される。

【0176】

いくつかの実施形態において、核酸－脂質粒子中の脂質コンジュゲートは、粒子の凝集を阻害し、例えば、本明細書に記載の脂質コンジュゲートの１つ以上を含み得る。１つの特定の実施形態において、脂質コンジュゲートは、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む。ＰＥＧ－脂質コンジュゲートの例には、ＰＥＧ－ＤＡＧコンジュゲート、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲート及びこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＡＧ）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＰＥＧ－ＤＡＡ）コンジュゲート、ＰＥＧ－リン脂質コンジュゲート、ＰＥＧ－セラミド（ＰＥＧ－Ｃｅｒ）コンジュゲート及びこれらの混合物から選択される。特定の実施形態において、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートである。特定の実施形態において、脂質粒子中のＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、ＰＥＧ－ジデシルオキシプロピル（Ｃ１０）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）コンジュゲート、またはこれらの混合物を含み得る。特定の実施形態において、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）コンジュゲートである。別の実施形態において、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、化合物（６６）（ＰＥＧ－Ｃ－ＤＭＡ）コンジュゲートである。別の実施形態において、脂質コンジュゲートは、ＰＯＺ－ＤＡＡコンジュゲートなどのＰＯＺ－脂質コンジュゲートを含む。

【0177】

特定の実施形態において、粒子の凝集を阻害する複合化脂質は、粒子中に存在する総脂質の約０．５モル％～約３モル％を含む。

【0178】

有用な製剤の追加の実施形態は、公開された米国特許出願公開第２０１１／００７６３３５Ａ１号及び同第２０１８／０２４５０７４Ａ１号に記載されており、その開示は、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。

【0179】

特定の実施形態において、本明細書で提供される核酸剤（例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする及び／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡ）は、ベクター（例えば、ウイルスベクター／ウイルスまたはプラスミド）によって送達される。

【0180】

ベクターは、Ｃａｓタンパク質及び／またはｇＲＮＡ分子、及び／または標的とされる領域（例えば、標的配列）に対して高い相同性を備えるドナー鋳型をコードする配列を含むことができる。特定の実施形態において、ドナー鋳型は、標的配列の全部または一部を含む。例示的なドナー鋳型は、修復鋳型、例えば遺伝子修正鋳型、または遺伝子突然変異鋳型、例えば点突然変異（例えば、単一ヌクレオチド（ｎｔ）置換）鋳型である。ベクターはまた、例えばＣａｓ分子配列に融合されたシグナルペプチド（例えば、核局在化、核小体局在化、またはミトコンドリア局在化のための）をコードする配列を含み得る。例えば、ベクターは、Ｃａｓ分子をコードする配列に融合された核局在化配列（例えば、ＳＶ４０由来）を含むことができる。

【0181】

１つ以上の調節／制御エレメント、例えばプロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、２Ａ配列、及びスプライスアクセプターまたはドナーを、ベクターに含めることができる。特定の実施形態において、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識される。他の実施形態において、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識される（例えば、Ｕ６プロモーター）。特定の実施形態において、プロモーターは、調節性プロモーター（例えば、誘導性プロモーター）である。特定の実施形態において、プロモーターは、構成的プロモーターである。特定の実施形態において、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。特定の実施形態において、プロモーターは、ウイルスプロモーターである。特定の実施形態において、プロモーターは、非ウイルスプロモーターである。

【0182】

特定の実施形態において、ベクターまたは送達ビヒクルは、ウイルスベクターである（例えば、組換えウイルスの生成用）。特定の実施形態において、ウイルスは、ＤＮＡウイルス（例えば、ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡウイルス）である。特定の実施形態において、ウイルスは、ＲＮＡウイルス（例えば、ｓｓＲＮＡウイルス）である。特定の実施形態において、ウイルスは、分裂細胞に感染する。他の実施形態において、ウイルスは、非分裂細胞に感染する。例示的なウイルスベクター／ウイルスには、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、及び単純ヘルペスウイルスが含まれる。

【0183】

特定の実施形態において、ウイルスは、分裂細胞に感染する。他の実施形態において、ウイルスは、非分裂細胞に感染する。特定の実施形態において、ウイルスは、分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染する。特定の実施形態において、ウイルスは、宿主ゲノムに組み込むことができる。特定の実施形態において、ウイルスは、例えばヒトにおいて免疫が低下するように操作される。特定の実施形態において、ウイルスは、複製可能である。他の実施形態において、ウイルスは複製欠損性であり、例えば、ビリオン複製の更なるラウンドに必要な遺伝子の１つ以上のコード領域を有する及び／または他の遺伝子で置換または削除されたものをパッケージングする。特定の実施形態において、ウイルスは、Ｃａｓ分子（複数可）及び／またはｇＲＮＡ分子（複数可）の一過性発現を生じさせる。他の実施形態において、ウイルスは、Ｃａｓ分子（複数可）及び／またはｇＲＮＡ分子（複数可）の持続的、例えば、少なくとも１週間、２週間、１か月、２か月、３か月、６か月、９か月、１年、２年または永続的な発現を生じさせる。ウイルスのパッケージング能力は、例えば、少なくとも約４ｋｂ～少なくとも約３０ｋｂ、例えば、少なくとも約５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂまたは５０ｋｂで変化し得る。

【0184】

特定の実施形態において、ウイルスベクターは、特定の細胞型または組織を認識する。例えば、ウイルスベクターは、異なる／代替のウイルス外被糖タンパク質で偽型化され得る；細胞型特異的受容体で操作され得る（例えば、ペプチドリガンド、単鎖抗体または成長因子などの標的リガンドを組み込むための１つ以上のウイルス外被糖タンパク質の遺伝子修飾（複数可））；及び／または一方の末端がウイルス糖タンパク質を認識し、もう一方の末端が標的細胞表面の部位を認識する二重特異性を持つ分子架橋を有するように操作され得る（例えば、リガンド受容体、モノクローナル抗体、アビジン－ビオチン及び化学結合）。

【0185】

例示的なウイルスベクター／ウイルスには、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、及び単純ヘルペスウイルスが含まれる。

【0186】

特定の実施形態において、Ｃａｓ及び／またはｇＲＮＡをコードする配列は、組換えレトロウイルスによって送達される。特定の実施形態において、レトロウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス）は、例えば、宿主ゲノムへの組み込みを可能にする逆転写酵素を含む。特定の実施形態において、レトロウイルスは、複製可能である。

【0187】

特定の実施形態において、レトロウイルスは複製欠損性であり、例えば、ビリオン複製の更なるラウンドに必要な遺伝子のより多くのコード領域のうちの１つを有する及び他の遺伝子で置換または削除されたものをパッケージングする。

【0188】

特定の実施形態において、Ｃａｓ及び／またはｇＲＮＡをコードする核酸配列（任意選択でドナー鋳型核酸）は、組換えレンチウイルスによって送達される。例えば、レンチウイルスは複製欠損性であり、例えば、ウイルス複製に必要な１つ以上の遺伝子を含まない。

【0189】

特定の実施形態において、Ｃａｓ及び／またはｇＲＮＡをコードする核酸配列（任意選択でドナー鋳型核酸）は、組換えアデノウイルスによって送達される。

【0190】

特定の実施形態において、アデノウイルスは、ヒトにおいて免疫が低下するように操作される。特定の実施形態において、Ｃａｓ及び／またはｇＲＮＡをコードする核酸配列（任意選択でドナー鋳型核酸）は、組換えＡＡＶによって送達される。特定の実施形態において、ＡＡＶは、そのゲノムを宿主細胞、例えば本明細書に記載の標的細胞のゲノムに組み込まない。特定の実施形態において、ＡＡＶは、そのゲノムの少なくとも一部を宿主細胞、例えば本明細書に記載の標的細胞のゲノムに組み込むことができる。特定の実施形態において、ＡＡＶは、自己相補性アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）、例えば、一緒にアニーリングして二本鎖ＤＮＡを形成する両方の鎖をパッケージングするｓｃＡＡＶである。開示された方法で使用され得るＡＡＶ血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、改変ＡＡＶ２（例えば、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆ及び／またはＳ６６２Ｖでの改変）、ＡＡＶ３、改変ＡＡＶ３（例えば、Ｙ７０５Ｆ、Ｙ７３ＩＦ及び／またはＴ４９２Ｖでの改変）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、改変ＡＡＶ６（例えば、Ｓ６６３Ｖ及び／またはＴ４９２Ｖでの改変）、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０が含まれ、偽型化ＡＡＶ、例えばＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５及びＡＡＶ２／６もまた開示された方法で使用できる。特定の実施形態において、本明細書に記載の方法で使用できるＡＡＶカプシドは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ３２／３３、ＡＡＶ．ｒｈ４３、ＡＡＶ．ｒｈ６４Ｒ１またはＡＡＶ７ｍ８由来のカプシド配列である。

【0191】

特定の実施形態において、Ｃａｓ及び／またはｇＲＮＡをコードする核酸配列（任意選択でドナー鋳型核酸）は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ３２／３３、ＡＡＶ．ｒｈ４３またはＡＡＶ．ｒｈ６４Ｒ１由来のカプシド配列と例えば約５０％以上、例えば約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上または約９５％以上の配列相同性を備える再操作されたＡＡＶカプシドで送達される。

【0192】

特定の実施形態において、Ｃａｓ及び／またはｇＲＮＡをコードする核酸配列（任意選択でドナー鋳型核酸）は、キメラＡＡＶカプシドによって送達される。例示的なキメラＡＡＶカプシドには、ＡＡＶ９ｉ１、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ２ｉ８Ｇ９またはＡＡＶ８Ｇ９が含まれるが、これらに限定されない。

【0193】

特定の実施形態において、ＡＡＶは、自己相補性アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）、例えば、一緒にアニーリングして二本鎖ＤＮＡを形成する両方の鎖をパッケージングするｓｃＡＡＶである。

【0194】

特定の実施形態において、Ｃａｓ９及び／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡ（任意選択でドナー鋳型核酸）は、ハイブリッドウイルス、例えば、本明細書に記載のウイルスの１つ以上のハイブリッドによって送達される。特定の実施形態において、ハイブリッドウイルスは、ボカウイルス、Ｂ１９ウイルス、ブタＡＡＶ、ガチョウＡＡＶ、ネコＡＡＶ、イヌＡＡＶ、またはＭＶＭとのＡＡＶ（例えば、任意のＡＡＶ血清型）のハイブリッドである。薬剤のウイルスベクター送達に関する追加情報は、ＷＩＰＯ公開第ＷＯ２０１８０８１５０４Ａ１号に記載されており、その全体が参照により組み込まれる。

【0195】

特定の実施形態において、送達ビヒクルは非ウイルスベクターである。特定の実施形態において、非ウイルスベクターは無機ナノ粒子である。例示的な無機ナノ粒子には、例えば、磁性ナノ粒子（例えば、Ｆｅ３Ｍｎ０２）及びシリカが含まれる。ナノ粒子の外表面は、ペイロードの付着（例えば、結合または捕捉）を可能にする正荷電ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリセリン）とコンジュゲートすることができる。

【0196】

いくつかの方法において、ヌクレアーゼ剤をコードするＤＮＡ（例えば、Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡ）を、ＤＮＡミニサークルを介して細胞に導入することができる。例えば、国際特許第ＷＯ２０１４／１８２７００号を参照し、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。ＤＮＡミニサークルは、複製起点も抗生物質選択マーカーも有していない、非ウイルス性遺伝子導入に使用できるスーパーコイルＤＮＡ分子である。したがって、ＤＮＡミニサークルは通常、プラスミドベクターよりもサイズが小さい。これらのＤＮＡには細菌ＤＮＡが欠いており、したがって細菌ＤＮＡに見いだされる非メチル化ＣｐＧモチーフがない。

【0197】

本明細書に提供される方法は、核酸またはタンパク質を細胞に導入するための特定の方法に依存せず、核酸またはタンパク質が少なくとも１つの細胞の内部にアクセスすることのみである。核酸及びタンパク質を様々な細胞型に導入する方法は公知であり、例えば、安定的遺伝子導入法、一過性遺伝子導入法、及びウイルスを介した方法が挙げられる。

【0198】

遺伝子導入プロトコル及び核酸またはタンパク質を細胞に導入するためのプロトコルは、様々であり得る。非限定的な遺伝子導入方法には、リポソーム、ナノ粒子、リン酸カルシウム（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２（２）：４５６－６７，Ｂａｃｃｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４（４）：１５９０－４及びＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ（１９９１）．Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ．ｐｐ．９６－９７）、デンドリマー、またはＤＥＡＥ－デキストランまたはポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーを使用する化学ベースの遺伝子導入方法が含まれる。非化学的方法としては、エレクトロポレーション、ソノポレーション、及び光遺伝子導入が挙げられる。粒子ベースの遺伝子導入方法としては、遺伝子銃、または磁石補助型トランスフェクションの使用が挙げられる（Ｂｅｒｔｒａｍ（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ７，２７７－２８）。ウイルスによる方法も、遺伝子導入に使用することができる。

【0199】

細胞への核酸またはタンパク質の導入は、エレクトロポレーション、細胞質内注射、ウイルス感染、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、形質移入、脂質を介した形質移入、またはヌクレオフェクションによっても媒介され得る。ヌクレオフェクションは、核酸基質を細胞質だけでなく核膜を介して核内に送達できるようにする改良されたエレクトロポレーション法である。更に、本明細書に開示する方法におけるヌクレオフェクションの使用は典型的に、通常のエレクトロポレーションよりもはるかに少ない細胞しか必要としない（例えば、通常のエレクトロポレーションが７００万であるのに対して約２００万で済む）。一例において、ヌクレオフェクションは、ＬＯＮＺＡ（登録商標）ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）システムを使用して行われる。

【0200】

細胞への核酸またはタンパク質の導入はまた、マイクロインジェクションによって達成することもできる。ｍＲＮＡのマイクロインジェクションは好ましくは、細胞質内で実施し（例えば、ｍＲＮＡを翻訳機構に直接送達するために）、一方、タンパク質、またはＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡのマイクロインジェクションは好ましくは、核内で実施する。あるいは、マイクロインジェクションは、核と細胞質の両方への注射により行うこともできる：針を最初に核に導入し、第１の量を注射し、細胞から針を取り出しながら第２の量を細胞質に注射することができる。ヌクレアーゼ剤タンパク質を細胞質に注射する場合、確実に核／前核へ送達するために、核局在化シグナルをタンパク質に好ましくは含ませる。マイクロインジェクションを行う方法は既知である。例えば、Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｇｙ Ａ，Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ Ｍ，Ｖｉｎｔｅｒｓｔｅｎ Ｋ，Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｒ．，２００３，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０７：１５０２２－１５０２６及びＭｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０９：９３５４－９３５９を参照のこと。

【0201】

核酸またはタンパク質を細胞に導入する他の方法として、例えば、ベクター送達、粒子を介した送達、エキソソームを介した送達、脂質ナノ粒子を介した送達、細胞透過ペプチドを介した送達、または埋め込み型装置を介した送達が挙げられる。核酸またはタンパク質を対象に投与してｉｎ ｖｉｖｏで細胞を改変する方法を、本明細書の他の場所に開示する。

【0202】

細胞への核酸及びタンパク質の導入は、流体力学的送達（ＨＤＤ）によっても達成することができる。流体力学的送達は、ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞内ＤＮＡ送達の方法として登場した。実質細胞への遺伝子送達では、選択した血管を介して必須のＤＮＡ配列のみを注入する必要があり、現在のウイルス及び合成ベクターに関連する安全性の懸念が排除される。血流に注入されると、ＤＮＡは、血液にアクセスできる様々な組織の細胞に到達することができる。流体力学的送達は、大量の溶液を循環中の非圧縮性血液に急速に注入することによって生成される力を利用して、大きくかつ膜不透過性の化合物が実質細胞に入るのを防ぐ内皮及び細胞膜の物理的障壁を克服する。ＤＮＡの送達に加えて、この方法は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＲＮＡ、タンパク質及び他の小分子化合物の効率的な細胞内送達に有用である。例えば、Ｂｏｎａｍａｓｓａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２８（４）：６９４－７０１を参照し、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。

【0203】

核酸またはタンパク質を細胞に導入するための他の方法としては、例えば、ベクター送達、粒子を介した送達、エキソソームを介した送達、脂質ナノ粒子を介した送達、細胞透過性ペプチドを介した送達、または埋め込み型デバイスを介した送達が挙げられる。特定の例として、核酸またはタンパク質を、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）マイクロスフィア、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）マイクロスフィア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コクリエート、または脂質微小管などの担体中で、細胞に導入することができる。

【0204】

場合によっては、方法及び組成物で使用する細胞は、それらのゲノムに安定的に組み込まれたＤＮＡ構築物を有する。そのような場合、接触は、ゲノムに既に安定的に組み込まれた構築物を有する細胞を提供することを含み得る。例えば、本明細書に開示する方法において使用する細胞は、そのゲノムに安定的に組み込まれた既存のＣａｓコード遺伝子を有していてもよい（すなわち、Ｃａｓ作動可能細胞）。「安定に組み入れられる」または「安定に導入される」または「安定に組み込まれる」は、ヌクレオチド配列が細胞のゲノムに組み込まれ、その子孫によって継承されることができるように、ポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む。ＤＮＡ構築物または標的化ゲノム組み込み系の様々な成分の安定した組み込みに、任意のプロトコルを使用してもよい。

【0205】

ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ剤は、任意の公知の手段によって細胞に導入してもよい。ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ剤をコードするポリペプチドを、細胞に直接導入してもよい。あるいは、ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドを、細胞に導入することができる。ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する場合、細胞内でＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ剤を、一時的に、条件的に、または構成的に発現させることができる。例えば、ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドを発現カセットに含め、条件的プロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターに作動可能に連結することができる。そのようなプロモーターを、本明細書の他の場所で更に詳細に論じる。あるいは、ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ剤を、ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ剤をコードするｍＲＮＡとして細胞に導入することができる。

【0206】

ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドを、細胞のゲノムに安定的に組み込み、細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。あるいは、ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドを、ターゲティングベクター内、またはインサートのポリヌクレオチドを含むターゲティングベクターとは別のベクターもしくはプラスミド内に存在させることができる。

【0207】

ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドの導入を介してＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ剤を細胞に提供する場合、ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ剤をコードするそのようなポリヌクレオチドを、ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ剤をコードする天然のポリヌクレオチド配列に比べて目的細胞内での使用頻度が高いコドンで置換するように改変することができる。例えば、ＤＮＡ結合タンパク質またはヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドを、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳類細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞または任意の他の目的の宿主細胞を含む、所定の目的の原核細胞または真核細胞において天然のポリヌクレオチド配列に比べて使用頻度の高いコドンで置換するように改変することができる。

【0208】

治療方法
いくつかの態様において、がん細胞のオートファジー及び／またはＮＦ－κＢ経路を阻害する１つの薬剤（例えば、本明細書に開示される薬剤）を対象に投与することによって、対象におけるがん細胞をＴＮＦ－α媒介殺傷に対して感作させる方法が本明細書で提供される。他の態様において、がん細胞のオートファジー及び／またはＮＦ－κＢ経路を阻害する少なくとも１つの薬剤（例えば、本明細書に開示される薬剤）を対象に投与することによって、対象におけるがん細胞のＴＮＦ－α媒介殺傷を増加させる方法が本明細書で提供される。更なる態様において、本明細書に記載の方法は、腫瘍のオートファジー及び／またはＮＦ－κＢ経路を阻害する薬剤（例えば、本明細書に開示される薬剤）を対象に投与することによって、対象における腫瘍をＴＮＦ－α媒介殺傷に対して感作させる、または対象における腫瘍のＴＮＦ－α媒介殺傷を増加させる方法を含む。

【0209】

対象のがん細胞のオートファジー及び／またはＮＦ－κＢ経路を阻害する薬剤（例えば、本明細書に開示される薬剤）を対象に投与することによって、及び追加のがん療法によって、対象におけるがんを治療する方法もまた本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、追加のがん療法は、がん免疫療法である。特定の実施形態において、追加の療法は、がん細胞のＴＮＦ－α媒介殺傷を誘導する治療である。いくつかの実施形態において、追加の療法は、がん細胞のＴ細胞殺傷（例えば、がん細胞の細胞傷害性Ｔ細胞殺傷）を誘導する治療である。いくつかの実施形態において、追加のがん療法は、免疫チェックポイント阻害、ＴＮＦ－α投与、Ｔ細胞免疫療法（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞免疫療法）及び／またはがんワクチンを含む。

【0210】

したがって、特定の実施形態において、本発明の薬剤を単独で使用するか、または別の種類の治療薬と組み合わせて投与することができる。例えば、異なる治療剤は、同時にもしくは連続して同じ製剤または別々の製剤中で投与することができる。特定の実施形態において、異なる治療剤は、互いに約１時間、約１２時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、または約１週間以内に投与することができる。したがって、そのような治療を受ける対象は、異なる治療薬の複合効果から利益を得ることができる。

【0211】

特定の実施形態において、組成物、例えば、薬学的に許容される担体と共に本明細書に記載される少なくとも１つの薬剤を含有する医薬組成物が提供される。一実施形態において、組成物は、本明細書に記載の複数（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上または５つ以上）の薬剤の組み合わせを含む。

【0212】

いくつかの実施形態において、医薬組成物は、局所的にまたは全身的に投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、対象に存在する腫瘍または腫瘍微小環境に局所的に投与され得る。いくつかの実施形態において、薬剤または医薬組成物は、第２のがん治療剤と共に投与される。

【0213】

本明細書に記載の薬剤は、免疫療法を含む任意の他のがん療法と併用して投与することができる。追加のがん療法には、免疫チェックポイント阻害が含まれる。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントタンパク質を阻害する。免疫チェックポイント阻害とは、がん細胞が免疫応答を防止または下方制御するために生成できるチェックポイントを阻害することを広く指す。免疫チェックポイントタンパク質の例は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ－Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＭ－４、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰａｌｐｈａ（ＣＤ４７）、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ－２、ＩＬＴ－４、ＴＩＧＩＴ、ＨＨＬＡ２、ブチロフィリン、Ａ２ａＲ及びこれらの組み合わせである。免疫チェックポイント阻害剤は、セミプリマブ（ＲＥＧＮ２８１０）、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ－１１０６、ＯＮＯ－４５３８）、ペムブロリズマブ（ＭＫ－３４７５、ＳＣＨ９００４７５）、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＲＧ７４４６、ＲＯ５５４１２６７）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６、ＭＥＤＩ－４７３６）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、イピリムマブ（ＢＭＳ－７３４０１６、ＩＢＩ３１０、ＭＤＸ－０１０）、ＳＨＲ１２１０、シンチリマブ（ＩＢＩ３０８）、スパルタリズマブ（ＰＤＲ００１）、チスレリズマブ（ＢＧＢ－Ａ３１７）、ピディリズマブ、ＢＣＤ－１００、トリパリマブ（ＪＳ００１）、ＢＡＹ１９０５２５４、ＡＳＰ８３７４、ＰＦ－０６８０１５９１、ＡＭＰ－２２４、ＡＢ１２２、ＡＫ１０５、ＡＭＧ４０４、ＢＣＤ－１００、ＢＩ７５４０９１、Ｆ５２０、ＨＬＸ１０、ＨＸ００８、ＪＴＸ－４０１４、ＬＺＭ００９、ＭＥＤＩ０６８０、ＭＧＡ０１２、Ｓｙｍ０２１、ＴＳＲ－０４２、ＰＳＢ２０５、ＭＧＤ０１９、ＭＧＤ０１３、ＡＫ１０４、ＸｍＡｂ２０７１７、ＲＯ７１２１６６１、ＣＸ－１８８、ＩＮＣＢ０８６５５０、ＦＳ１１８、ＢＣＤ－１３５、ＢＧＢ－Ａ３３３、ＣＢＴ－５０２、ＣＫ－３０１、ＣＳ１００１、ＦＡＺ０５３、ＨＬＸ２０、ＫＮ０３５、ＭＤＸ－１１０５、ＭＳＢ２３１１、ＳＨＲ－１３１６、ＴＧ－１５０１、ＺＫＡＢ００１、ＩＮＢＲＸ－１０５、ＭＣＬＡ－１４５、ＫＮ０４６、Ｍ７８２４、ＬＹ３４１５２４４、ＩＮＣＢ０８６５５０、ＣＡ－１７０、ＣＸ－０７２、ＡＤＵ－１６０４、ＡＧＥＮ１１８１、ＡＧＥＮ１８８４、ＭＫ－１３０８、ＲＥＧＮ４６５９、ＸｍＡｂ２２８４１、ＡＴＯＲ－１０１５、ＰＳＢ２０５、ＭＧＤ０１９、ＡＫ１０４、ＸｍＡｂ２０７１７、ＢＭＳ－９８６２４９、トレメリムマブ、ＢＭＳ－９８６２５８、ＢＧＢ－Ａ４２５、ＩＮＣＡＧＮ０２３９０、Ｓｙｍ０２３、ＪＮＪ６１６１０５８８、ＢＩ７５４１１１、ＬＡＧ５２５、ＭＫ－４２８０、ＲＥＧＮ３７６７、Ｓｙｍ０２２、ＴＳＲ－０３３、レラトリマブ、ＪＴＸ－２０１１、ＭＧＤ００９、ＢＭＳ－９８６２０７、ＯＭＰ－３１３Ｍ３２、ＭＫ－７６８４またはＴＳＲ－０２２であり得る。

【0214】

追加のがん免疫療法には、自己もしくは同種Ｔ細胞療法、または自己もしくは同種ＣＡＲ Ｔ細胞療法などの養子免疫療法が含まれる。養子免疫療法は、腫瘍またはがん細胞に対する患者の免疫応答を高めるように設計された治療法である。この方法は、個体からの免疫細胞の除去、ｅｘ ｖｉｖｏでのエフェクター細胞の形成、臨床的に適切な数への細胞の増殖、及び細胞の患者への再注入を含む。本明細書で開示される薬剤と、クラスＩ ＭＨＣ上に提示されるペプチド（例えば、がんペプチドもしくは対象特異的ペプチド）に特異的に結合するＴ細胞受容体を発現する同種または自己ＣＴＬとの同時投与を含む方法が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、ＣＴＬは、細胞バンクに由来するか、またはＣＴＬが投与されている対象に由来する。いくつかの実施形態において、ＭＨＣはクラスＩ ＭＨＣである。いくつかの実施形態において、クラスＩＩ ＭＨＣは、ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＰＡ、ＨＬＡ－ＤＱＡまたはＨＬＡ－ＤＲＡであるα鎖ポリペプチドを有する。いくつかの実施形態において、クラスＩＩ ＭＨＣは、ＨＬＡ－ＤＭＢ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＰＢ、ＨＬＡ－ＤＱＢまたはＨＬＡ－ＤＲＢであるβ鎖ポリペプチドを有する。いくつかの実施形態において、ＣＴＬは、対象に投与される前に細胞ライブラリーまたはバンクに保存される。

【0215】

いくつかの実施形態において、Ｔ細胞を、対象のがんまたは腫瘍に特異的なペプチドを提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）と接触させる。いくつかの実施形態において、ＡＰＣは、Ｂ細胞、抗原提示Ｔ細胞、樹状細胞、または人工抗原提示細胞（例えば、ａＫ５６２細胞）である。当該プロセスで使用する樹状細胞は、患者の試料からＰＢＭＣを採取し、それらをプラスチックに付着させることによって調製することができる。一般に、単球集団は固着し、他のすべての細胞は洗い流すことができる。次いで、付着集団をＩＬ－４及びＧＭ－ＣＳＦで分化させ、単球由来の樹状細胞を産生する。これらの細胞は、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＰＧＥ－１及びＴＮＦ－α（樹状細胞の表面で重要な共刺激分子を上方制御）の添加によって成熟し得、その後、本明細書で提供される１つ以上のペプチドで形質導入される。いくつかの実施形態において、ＡＰＣは、ａＫ５６２細胞などの人工抗原提示細胞である。いくつかの実施形態において、人工抗原提示細胞は、ＣＤ８０、ＣＤ８３、４１ＢＢ－Ｌ及び／またはＣＤ８６を発現するように操作される。ａＫ５６２細胞を含む例示的な人工抗原提示細胞は、米国特許第２００３／０１４７８６９号に記載され、これは参照により本明細書に組み込まれる。抗原提示細胞を作製する例示的な方法は、国際特許第ＷＯ２０１３０８８１１４号に見いだすことができ、その全体が本明細書に組み込まれる。

【0216】

別の例示的な養子免疫療法プロトコルは、自己腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の投与を含む。ＴＩＬ細胞は、殺傷力が高い。ＴＩＬ細胞は、固形腫瘍においてｉｎ ｖｉｖｏで分化したエフェクター細胞である（がんの養子免疫療法のためのＴＩＬ細胞を生成する方法を記載する米国特許第５，１２６，１３２号を参照）。ＴＩＬ細胞は、例えば、患者から腫瘍試料を採取し、腫瘍試料に浸潤していたリンパ球を単離し、これらのＴＩＬ細胞をＩＬ－２の存在下で ｅｘ ｖｉｖｏで増殖させ、細胞をＩＬ－２と共に患者に再注入することによって産生することができる。

【0217】

追加のがん治療は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法であり得る。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、腫瘍関連表面抗原に対する抗体ベースの特異性と、特異的な抗腫瘍細胞免疫活性を有するＴ細胞受容体活性化細胞内ドメインを組み合わせた分子である（Ｅｓｈｈａｒ，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ４５（３－４）１３１－１３６；Ｅｓｈｈａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ９０（２）：７２０－７２４；Ｂｒｏｃｋｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｊａｌａｉｎｅｎ，１９９８，Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ６８：２５７－２６９）。これらのＣＡＲは、Ｔ細胞の活性化及び共刺激シグナルを提供する細胞内ドメインに融合した単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗原特異的細胞外領域を介して、Ｔ細胞がＭＨＣに依存しない一次活性化を達成できるようにする。第２世代及び第３世代のＣＡＲはまた、様々な固形腫瘍及び白血病モデルにおけるサイトカイン分泌ならびに抗腫瘍活性を増強する、ＣＤ２８及び／またはＣＤ１３７（４－１ＢＢ）細胞内活性化モチーフを介して適切な共刺激シグナルも提供する（Ｐｉｎｔｈｕｓ，ｅｔ ａｌ，２００４，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ１１４（１２）：１７７４－１７８１；Ｍｉｌｏｎｅ，ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ１７（８）：１４５３－１４６４；Ｓａｄｅｌａｉｎ，ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ２１（２）：２１５－２２３）。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法には、患者の自己Ｔ細胞を遺伝子改変して腫瘍抗原に特異的なＣＡＲ を発現させた後、ｅｘ ｖｉｖｏで細胞を増殖させ、患者に再注入することを含む。ＣＡＲは、特定のモノクローナル抗体から可変である選択された一本鎖断片と、１つ以上のＴ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインとの融合タンパク質である。このＴ細胞の遺伝子改変は、ウイルスベースの遺伝子導入方法、またはＤＮＡベースのトランスポゾン、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術もしくはエレクトロポレーションによるｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたｍＲＮＡの直接導入などの非ウイルス方法のいずれかを介して生じ得る。

【0218】

対象からＴ細胞を含む試料を取得し、試料から細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を単離し、ｅｘ ｖｉｖｏでＣＴＬを増殖させ、増殖したＣＴＬを少なくとも１つの薬剤（例えば、本明細書に開示される任意の薬剤）と併用して対象に投与することによって対象のがんを治療する方法もまた、本明細書で提供する。細胞傷害性Ｔ細胞は、腫瘍浸潤性リンパ球であり得る。ＣＴＬを増殖させることは、ＣＴＬをがん特異的または腫瘍特異的抗原を発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）と接触させて、抗原特異的ＣＴＬを作製することを含み得る。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞または単離されたＣＴＬを含む試料は、対象への投与前に刺激される。当該方法は、対象に投与する前に、ＣＴＬを抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ＯＫＴ３）と接触させることを更に含み得る。他の実施形態において、方法は、対象への投与前に、ＣＴＬをヒトインターロイキン（ＩＬ）－２と接触させることを更に含む。

【0219】

いくつかの実施形態において、対象は、薬剤の投与前に化学療法薬を投与されている。対象は、化学療法薬に抵抗性であり得る。対象は、本明細書に開示される追加のがん治療剤の投与に続いてまたは同時に化学療法剤を投与され得る。化学療法薬には、アルキル化剤（例えば、チオテパ及びシクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（商標）））、アルキルスルホン酸塩（例えば、ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン）、アジリジン（例えば、ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、及びウレドパ）、エミレルミン及びメミラメラミン（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスファオルアミド、及びトリメミローロメラミンを含む）、アセトゲニン（特にブラタシン及び ブラタシノン）、カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）、ブリオスタチン、カリスタチン、ＣＣ－１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビセレシン合成類似体を含む）、クリプトフィシン（人工クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）、ドラスタチン、デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ－２１８９及びＣＢＩ－ＴＭＩを含む）、エリュテロビン、パンクラチスタチン、サルコジクチイン、スポンギスタチン、ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン）、エンジイン抗生物質などの抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンγ１及び親和性カリケアマイシン）、ジネマイシン（ジネマイシンＡを含む）、ビスホスホネート（例えば、クロドロネート）、エスペラミシン、ならびにネオカルジノスタチンクロモフォア及び関連する色素タンパク質エンジイン抗菌性クロモフォア、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルチノフィリン、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン（Ａｄｒａｍｙｃｉｎ（商標））（モルホリノドキソルビシン、シアノモルホリノドキソルビシン、２－ピロリノドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート及び５－フルオロウラシル（５－ＦＵ））、葉酸類似体（例えば、デモプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート）、プリン類似体（例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン）、ピリミジン類似体（例えば、アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン）、アンドロゲン（例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン）、抗副腎剤（例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン）、葉酸補充薬（例えば、フォリン酸）、アセグラトン、アルドホスファミド配糖体、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン、ヘストラブシル、ビサントレン、エダトラキサート、デフォファミン、デメコルシン、ジアジクオン、エルホルミチン、エリプチニウムアセテート、エポチロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシ尿素、レンチナン、ロニダミン、マイタンシノイド（例えば、マイタンシン及びアンサマイトシン）、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダモール、ニトラクリン、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、２－エチルヒドラジド、プロカルバジン、ＰＳＫ（商標）、ラゾキサン、リゾキシン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム、テヌアゾン酸、トリアジコン、２，２’，２”－トリクオロトリエミルアミン、トリコテセン（特に、Ｔ－２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）、ウレタン、ビンデシン、ダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ピポブロマン、ガシトシン、アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）、シクロホスファミド、チオペタ、タキソイド（例えば、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｅｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）及びドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅｔ（商標）、Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ））、クロラムブシル、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（商標））、６－チオグアニン、メルカプトプリン、メトトレキサート、白金類似体（例えば、シスプラチン及びカルボプラチン）、ビンブラスチン、白金、エトポシド（ＶＰ－１６）、イホスファミド、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（商標））、ノバントロン、テニポシド、エダトレキサート、ダウノマイシン、アミノプテリン、キセオロダ、イバンドロネート、ＣＰＴ－１１、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００、ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）、レチノイン（例えば、レチノイン酸）、カペシタビン、ならびに上記いずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体を含む。腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤（例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（商標）を含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４－ドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ（商標））を含む抗エストロゲンならびに選択的エストロゲン受容体修飾薬（ＳＥＲＭ））；副腎内のエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼ阻害剤（例えば、４（５）－イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール（Ｍｅｇａｃｅ（商標））、エキセメスタン、ホルメスタイン、ファドロゾール、ボロゾール（Ｒｉｖｉｓｏｒ（商標））、レトロゾール（Ｆｅｍａｒａ（商標））及びアナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（商標）））；抗アンドロゲン（例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロハイド及びゴセレリン）；ならびに上述のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体もまた「化学療法剤」の定義に含まれる。

【0220】

以下で詳細に記述されるように、本明細書で開示される医薬組成物及び／または薬剤は、固体または液体の形態での投与用に特別に製剤化され得、（１）経口投与、例えば、ドレンチ（水性または非水性の溶液または懸濁液）、錠剤、例えば、口腔粘膜、舌下、及び全身吸収を目的にしたもの、ボーラス、散剤、顆粒剤、舌への塗布のためのペースト剤、または（２）非経口投与、例えば、皮下、筋肉内、静脈内、くも膜下腔内、脳内もしくは硬膜外注射による、例えば、無菌の溶液もしくは懸濁液、もしくは徐放性製剤に適応されたものを含む。医薬製剤または組成物を調製する方法は、本明細書に記載の薬剤を担体及び任意選択で１つ以上の補助成分と会合させる工程を含む。一般に、製剤は、本明細書に記載の薬剤を液体担体または微粉化固体担体またはその両方と均一かつ密接に会合させ、次いで、必要に応じて、産物を成形することによって調製される。

【0221】

効能
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法を使用して、任意のがん性または前がん性腫瘍を含む任意のがんを治療することができる。本明細書で提供される方法及び組成物によって治療され得るがんには、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、首、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌または子宮のがんが含まれるが、これらに限定されない。更に、がんは具体的には以下の組織学的種類のものであり得るが、これらに限定されない：悪性新生物；細胞癌；未分化細胞癌；巨大及び紡錘細胞癌；小細胞癌；乳頭癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；毛母細胞癌；移行細胞癌；乳頭状移行上皮癌；腺癌；悪性ガストリノーマ；胆管癌；肝細胞癌；肝細胞癌と胆管癌の複合；線維腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープの腺癌；家族性大腸ポリポーシス腺癌；固形がん；悪性カルチノイド腫瘍；気管支肺胞腺癌；乳頭状腺癌；嫌色素性癌；好酸性癌；好酸性腺癌；好塩基性癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞腺癌；乳頭状及び濾胞腺癌；非被包性硬化性癌；副腎皮質癌；類内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳道腺癌；粘表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢胞腺癌；乳頭漿液性嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌；粘液腺癌；印環細胞癌；浸潤性乳管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；乳房パジェット病；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生腺癌；悪性胸腺腫；悪性卵巣間質腫；悪性テコーマ；悪性顆粒膜細胞腫瘍；及び悪性神経芽細胞腫；セルトリ細胞癌；悪性ライディッヒ細胞腫；悪性脂質細胞腫；悪性傍神経節腫；悪性乳房外傍神経節腫；褐色細胞腫；血管球血管肉腫；悪性黒色腫；無色素性黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大な色素性母斑の悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；悪性青色母斑；肉腫；線維肉腫；悪性線維性組織球腫；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質肉腫；悪性混合腫瘍；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；癌肉腫；悪性間葉腫；悪性ブレンナー腫瘍；悪性葉状腫瘍；滑膜肉腫；悪性中皮腫；未分化胚細胞腫；胚性癌腫；悪性奇形腫；悪性卵巣甲状腺腫；絨毛癌；悪性中腎腫；血管肉腫；悪性血管内皮腫；カポジ肉腫；悪性血管外皮腫；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；悪性軟骨芽細胞腫；間葉性軟骨肉腫；骨巨細胞腫；ユーイング肉腫；悪性歯原性腫瘍；エナメル上皮歯牙肉腫；悪性エナメル上皮腫；エナメル芽細胞性線維肉腫；悪性松果体腫；脊索腫；悪性神経膠腫；上衣腫；星状細胞腫；原形質星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；神経膠芽腫；乏突起神経膠腫；乏突起神経膠芽細胞腫；原始神経外胚葉性腫瘍；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅覚神経原性腫瘍；悪性髄膜腫；神経線維肉腫；悪性神経鞘腫；悪性顆粒細胞腫；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキンリンパ腫；側肉芽腫；小リンパ球性悪性リンパ腫；びまん性大細胞型悪性リンパ腫；濾胞性悪性リンパ腫；菌状息肉症；他の指定された非ホジキンリンパ腫；悪性組織球症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄肉腫；及び毛様細胞白血病。

【0222】

いくつかの実施形態において、がんは、固形腫瘍を含む。いくつかの実施形態において、腫瘍は、腺癌、副腎腫瘍、肛門腫瘍、胆管腫瘍、膀胱腫瘍、骨腫瘍、血液由来腫瘍、脳／ＣＮＳ腫瘍、乳房腫瘍、子宮頸部腫瘍、結腸直腸腫瘍、子宮内膜腫瘍、食道腫瘍、ユーイング腫瘍、眼腫瘍、胆嚢腫瘍、胃腸腫瘍、腎臓腫瘍、喉頭または下咽頭腫瘍、肝臓腫瘍、肺腫瘍、中皮腫、多発性骨髄腫、筋肉腫瘍、鼻咽頭腫瘍、神経芽細胞腫、口腔腫瘍、骨肉腫、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、陰茎腫瘍、下垂体腫瘍、原発性腫瘍、前立腺腫瘍、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺腫瘍、軟部肉腫、黒色腫、転移性腫瘍、基底細胞癌、メルケル細胞腫瘍、精巣腫瘍、胸腺腫瘍、甲状腺腫瘍、子宮腫瘍、膣腫瘍、外陰腫瘍、またはウィルムス腫瘍である。

【0223】

特定の実施形態において、癌は、結腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、腎臓癌または子宮頸癌から選択される。

【0224】

追加の方法
特定の態様において、試験薬剤が少なくとも１つのオートファジー遺伝子もしくはＮＦ－κＢ遺伝子（例えば、表１または表２に列挙された遺伝子）の産物の発現または活性を阻害するかどうかを決定することを含む、薬剤（例えば、試験薬剤）が抗癌治療剤であるかどうかを判定する方法が本明細書で提供され、試験薬剤は、少なくとも１つのオートファジー遺伝子またはＮＦ－κＢ遺伝子（例えば、表１または表２に列挙された遺伝子）の産物の発現または活性を阻害する場合、試験薬剤は抗癌治療剤であると決定される。また、ガイドＲＮＡ試験薬剤がＣａｓ酵素にオートファジー遺伝子またはＮＦ－κＢ遺伝子（例えば、表１または表２に列記された遺伝子）中の配列の切断または結合を誘導させるのに有効であるかどうかを判定することを含む、ガイドＲＮＡ薬剤が抗癌治療薬であるかどうかを判定する方法を本明細書で提供し、ガイドＲＮＡは、オートファジー遺伝子またはＮＦ－κＢ遺伝子内のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするＤＮＡターゲティングセグメントを含み、試験薬剤がＣａｓ酵素に遺伝子内の配列の切断または結合を誘導するのに有効である場合、試験薬剤は抗癌治療薬である。本明細書に開示される試験薬剤は、細胞集団の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％によって本明細書に開示される少なくとも１つの遺伝子の産物の発現を低減させ得る。

【0225】

いくつかの実施形態において、試験薬剤は、試験薬剤のライブラリーのメンバーである。試験薬剤は、ｇＲＮＡ、ＴＡＬＥＮまたはジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ、干渉核酸または小分子を含む、本明細書に開示される任意の薬剤であり得る。本明細書に開示される試験薬剤は、少なくとも１つのオートファジー遺伝子またはＮＦ－κＢ遺伝子の産物の発現または活性を少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％阻害し得る。本明細書に開示される試験薬剤は、表１または表２の少なくとも１つの遺伝子の産物の発現または活性を少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％阻害し得る。

【0226】

また、患者が本明細書で提供されるがん治療の候補であるかどうかを決定する方法も本明細書で提供される。いくつかの態様において、対象の腫瘍内の細胞による表１または表２に列挙された遺伝子の産物の発現は、対象が治療の候補であることを示す。いくつかの実施形態において、遺伝子産物はｍＲＮＡ産物である。いくつかの実施形態において、遺伝子産物はタンパク質産物である。タンパク質産物は、タンパク質産物に特異的な抗体を使用して、ＩＨＣによって、またはフローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ）によって検出することができる。遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ産物）は、核酸増幅、核酸プローブ、または配列決定によって検出することができる。

【0227】

いくつかの実施形態において、少なくとも１つのオートファジー遺伝子またはＮＦ－κＢ遺伝子（例えば、表１または表２に列記された少なくとも１つの遺伝子）の発現レベルを最初に測定することによってがん細胞または腫瘍細胞を標的にして殺傷する方法が本明細書に提供され、発現レベルが決定された閾値を超える場合、本明細書に開示される薬剤（複数可）を投与することによってがんまたは腫瘍細胞を標的にして殺傷する。遺伝子（例えば、表１または表２の遺伝子）の閾値は、これに限定されないが、疾患組織（例えば、腫瘍またはがん性組織）対健康な組織（例えば、腫瘍またはがんに関連しない組織）における遺伝子または遺伝子産物の発現を決定することを含む、多くの技術によって決定され得る。遺伝子（例えば、表１または表２の遺伝子）の閾値は、ある時点でのがん細胞または腫瘍における遺伝子産物の発現を後の時点と比較することによって決定することができる。健康な組織及び疾患組織は、対象から、または異なる個体から採取することができる。他の実施形態において、遺伝子または遺伝子産物の発現閾値は、組織バンクまたは第三者供給源からの組織の遺伝子または遺伝子産物の発現を試験することによって決定される。例えば、対象または第三者からの疾患組織からの腫瘍またはがん細胞が遺伝子産物のより高い発現を示す場合、対象は治療の候補である。後の時点からの腫瘍またはがん細胞が遺伝子産物のより高い発現を示す場合、対象は治療の候補である。

【実施例】

【0228】

免疫チェックポイント阻害剤はがん治療を一変させたが、Ｔ細胞を介した殺傷に対する腫瘍細胞の感受性の分子的な決定要因は完全には解明されていないままである。Ｔ細胞による殺傷を調節する腫瘍細胞遺伝子／経路を同定するゲノム規模のＣＲＩＳＰＲノックアウトスクリーニングを、本明細書に記載する。当該スクリーニングは、腫瘍細胞の抗原提示及びＴＮＦαシグナル伝達を殺傷の要件として同定し、逆に、ＮＦ－κＢシグナル伝達及びオートファジーを主要な保護メカニズムとして同定した。個々のオートファジー遺伝子のノックアウトまたはオートファジーの薬理学的阻害により、様々な系統の腫瘍細胞がＴ細胞及び／またはＴＮＦαによる殺傷に対して感作される。逆に、オートファジー活性の増加をもたらすｍＴＯＲシグナル伝達の阻害は、腫瘍細胞をＴ細胞の殺傷から保護した。メカニズム的に、オートファジーが損なわれた状況下での強化されたＴ細胞／ＴＮＦα媒介殺傷は、欠陥のあるＮＦ－κＢシグナル伝達に起因するものではなく、カスパーゼ８活性化の増加と関連しており、ＴＮＦαシグナル伝達経路の比較的初期の段階でのオートファジーの役割を示唆する。最後に、腫瘍細胞オートファジーの遺伝的不活性化は、腫瘍モデルにおけるＴ細胞チェックポイント阻害剤の有効性を高め、オートファジーが抗腫瘍免疫の重要な調節因子であることを示唆する。これらの知見は、保護的なＮＦ－κＢまたはオートファジー経路を標的にすることで、腫瘍をＴ細胞指向免疫療法に対して感作させる可能性があることを示唆する。

【0229】

Ｔ細胞殺傷に対する腫瘍細胞の感受性を調節する遺伝子／経路を体系的に明らかにするため、複数の群は、プールされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９スクリーニングを利用した。これらのスクリーニングにより、腫瘍細胞の殺傷における抗原提示及びＩＦＮγシグナル伝達の重要な役割が確認された。更に、これらのスクリーニングにより、チロシンホスファターゼＰｔｐｎ２、アペリン受容体ＡＰＬＮＲ、Ｐｂｒｍ１及びＳＷＩ／ＳＮＦクロマチンリモデリング複合体などの殺傷の新規の調節因子が同定された。興味深いことに、これらのスクリーニングのいくつかは、Ｔ細胞殺傷プロセスにおける腫瘍細胞のＴＮＦαまたはＴＲＡＩＬシグナル伝達の重要な役割も示唆した。成功したものの、ほとんどの場合、これらのスクリーニングは、Ｔ細胞による殺傷に必要な腫瘍細胞遺伝子（すなわち、生き残った腫瘍細胞に富むシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ））を同定した。

【0230】

慎重に最適化された条件下で実施されたプールされたゲノム規模のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウト（ＫＯ）スクリーニングにより、Ｔ細胞殺傷を制限する腫瘍細胞遺伝子の効率的な同定が可能になった。Ｔ細胞媒介腫瘍細胞殺傷の調節におけるＴＮＦα／ＮＦ－κＢシグナル伝達の重要な役割を実証することに加えて、結果は、Ｔ細胞誘導性アポトーシスから腫瘍細胞を保護するオートファジーのこれまで認識されていなかった役割を明らかにする。本明細書では、オートファジーがＮＦ－κＢ経路の活性を調節することなく、ＴＮＦα依存性のカスパーゼ８の活性化を制限すること、及びオートファジーの遺伝的阻害が腫瘍をＴ細胞チェックポイント阻害剤に対して感作させることが示されている。したがって、オートファジー経路は免疫療法応答の重要な調節因子であると思われ、この経路の阻害がＴ細胞指向療法の有効性を高める可能性を示唆している。

【0231】

Ｔ細胞殺傷に対する感受性を調節する腫瘍細胞遺伝子の同定
細胞傷害性Ｔ細胞による殺傷に対する腫瘍細胞の感受性を調節する遺伝子を同定するために、ＭＣ３８結腸腺癌細胞のゲノム全体でのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９スクリーニングを実施した。マウスシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）ＫＯライブラリーで形質導入された腫瘍細胞は、ＭＨＣクラス Ｉ制限Ｏｖａペプチドまたはスクランブル対照ペプチドを間欠的に投与され、ＯＴ－１トランスジェニックマウス（Ｏｖａペプチドを認識するＴ細胞受容体を発現する）から単離された活性化ＣＤ８^＋Ｔ細胞とインキュベートした（図１のＡ）。陽性対照としてＢ２ｍ ＫＯ細胞（Ｔ細胞殺傷から保護されている）を使用して、スクリーニング条件を最適化かつ検証した。目標は、スクリーニングで約９０％腫瘍細胞の殺傷を達成することだった（図９）。Ｔ細胞への２４時間の曝露後、生存腫瘍細胞を採取し、Ｏｖａを間欠的に投与した腫瘍細胞対対照腫瘍細胞におけるｓｇＲＮＡ表現をＮＧＳによって評価した。ライブラリーの初期提示が高いため（約２０００ｘ適用範囲）、殺傷した後でも腫瘍細胞でｓｇＲＮＡ提示が維持され、枯渇したｓｇＲＮＡと濃縮されたｓｇＲＮＡを効率的に検出できた（Ｒ^２＝０．９５、Ｏｖａ対対照ペプチド間欠的投与細胞）（表３、図１０）。Ｔ細胞殺傷とは無関係に腫瘍細胞増殖／生存を調節する遺伝子を同定するために、Ｔ細胞を添加せずに、１２回の集団倍加のために継代したライブラリー改変腫瘍細胞を用いて、並行スクリーニングを行った。既知のコア必須遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡのかなりの割合が、この並行増殖スクリーニングで枯渇したが、非標的ｓｇＲＮＡの表現はほとんど変化せず（図１１）、ＭＣ３８細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介遺伝子改変の有効性及び特異性を確認した。

【0232】

濃縮されたｓｇＲＮＡの分析により、Ｔ細胞による腫瘍細胞の殺傷に必要な重要な経路として、抗原提示及びＴＮＦα誘導アポトーシスシグナル伝達が同定された（図１のＢ）。予想どおり、Ｂ２ｍ及びＭＨＣクラスＩ分子Ｈ２－Ｋ１を標的とする複数のｓｇＲＮＡが大幅に濃縮され、Ｔ細胞殺傷がＯｖａペプチドの細胞表面提示に依存していることが確認された。Ｈ２－Ｋ１及びＢ２ｍを標的とする６つのｓｇＲＮＡすべての回復は、細胞のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介遺伝子改変の有効性を更に強調する。興味深いことに、Ｔｎｆｒｓｆ１ａ（ＴＮＦ受容体１、ＴＮＦＲ１）、カスパーゼ－８（ＴＮＦα誘導性アポトーシスに必要）及びＴｒａｄｄ（ＴＮＦαシグナル伝達経路の重要なアダプター分子）を標的とする複数のｓｇＲＮＡも濃縮されており（図１、Ｂ及びＣ）、Ｔ細胞由来のＴＮＦαが腫瘍細胞死滅に重要な役割を果たしていることを示唆した。最後に、ｍＴＯＲシグナル伝達経路のいくつかの遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡが濃縮された（例えば、Ｍｔｏｒ、Ｍｌｓｔ８、Ｒｉｃｔｏｒ、Ｍａｐｋａｐ１、Ｔｔｉ２、Ｔｅｌｏ２、Ｔｔｉ１）。以下に示すように、ｍＴＯＲシグナル伝達の不活性化は、オートファジー活性の増加を生じさせることによりＴ細胞殺傷から腫瘍細胞を保護する。

【0233】

枯渇したｓｇＲＮＡの分析により、ＮＦ－κＢシグナル伝達及びオートファジーが、Ｔ細胞による腫瘍細胞殺傷を制限する２つの重要な経路であることが同定された。ＬＵＢＡＣ（Ｓｈａｒｐｉｎ、Ｒｂｃｋ１及びＲｎｆ３１）、ＴＡＫ１（Ｍａｐ３ｋ７／Ｔａｋ１、Ｔａｂ１、Ｔａｂ２）及びＮｅｍｏ複合体（Ｃｈｕｋ、Ｉｋｂｋｂ及びＩｋｂｋｇ）の各メンバーを含むＮＦ－κＢシグナル伝達に関与する遺伝子を標的とする複数のｓｇＲＮＡは、著しく枯渇した。更に、追加のＮＦ－κＢ経路またはＮＦ－κＢ標的遺伝子（Ｔｒａｆ２、Ｔｂｋ１、Ｍａｐｋａｐｋ２、Ｒｅｌａ、Ｃｆｌａｒ及びＴｎｆａｉｐ３）を標的とするｓｇＲＮＡも枯渇した（図１のＤ及びＥ）。ＮＦ－κＢ経路が、Ｃｆｌａｒ（ｃ－Ｆｌｉｐ）などの生存遺伝子の転写誘導を介してＴＮＦα依存性アポトーシスを制限する役割を十分に確立しているため、これらの知見は、Ｔ細胞媒介殺傷におけるＴＮＦαの重要な役割と一致している。

【0234】

興味深いことに、オートファジー経路（Ｒｂ１ｃｃ１、Ｐｉｋ３ｃ３、Ｎｒｂｆ２、Ａｔｇ１３、Ａｔｇ１４）、膜物質の移動（Ａｔｇ９ａ、Ａｔｇ２ａ、Ｔａｘ１ｂｐ１）またはオートファゴソーム増殖（Ａｔｇ５、Ａｔｇ１２、Ａｔｇ１０）の遺伝子を標的とする複数のｓｇＲＮＡが大幅に枯渇していた（図１のＦ及びＧ）。これらのデータは、腫瘍細胞のオートファジー活性がＴ細胞殺傷に関連して保護的な役割を果たしていることを示している。オートファジーは、他の環境（例えば、栄養不足）で細胞死を制限することが知られているが、これは、Ｔ細胞誘発腫瘍細胞アポトーシスにおいてオートファジーが重要な役割を果たしていることを初めて示している。重要なことに、ＮＦ－κＢ経路遺伝子またはオートファジー遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡは、並行細胞増殖スクリーニングで枯渇せず、フォローアップ実験により、ＭＣ３８細胞におけるオートファジー遺伝子のＫＯが細胞増殖を損なわないことが確認され（図１２）、これらの遺伝子のＫＯは、特にＴ細胞媒介殺傷において細胞の適応度を低下させることを示している。ｍＴＯＲシグナル伝達はオートファジーの阻害において確立された役割を持っているため、オートファジーの保護的役割は、ｍＴＯＲ経路の複数の遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡがスクリーニングで濃縮されたという観察と一致している（図１のＢ）。

【0235】

ＴＮＦα誘導性アポトーシスシグナル伝達は、Ｔ細胞による腫瘍細胞殺傷に重要な役割を果たしている。
ＣＲＩＳＰＲスクリーニングは、腫瘍細胞の殺傷におけるＴ細胞由来のＴＮＦαの重要な役割を示した。細胞傷害性Ｔ細胞による殺傷は、主にＴ細胞顆粒からのパーフォリン及びグランザイムの放出に起因すると考えられているが、このプロセスにおけるＴＮＦα（及び他の細胞死受容体リガンド）の役割は以前に提唱されている。ＴＮＦαは、アポトーシス（カスパーゼ－８依存性）またはネクロトーシスのいずれかによって細胞死を促進することができるが、いくつかの分子チェックポイント（ＮＦ－κＢ活性化を含む）が機能して、ＴＮＦα誘導性細胞死を阻害する。したがって、ＴＮＦαに対するほとんどの細胞の既定の反応は、生存及び炎症促進性遺伝子の誘導であると考えられている。ＴＮＦα／ＮＦ－κＢシグナル伝達の簡略化されたモデルについては図２のＡを参照のこと。

【0236】

図２のＢに示すように、Ｔ細胞殺傷アッセイにＴＮＦα遮断抗体を添加すると、ＭＣ３８細胞死が有意に減少し（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介によるＢ２ｍの不活性化）、ＴＮＦαシグナル伝達の役割を確認した。アッセイ（活性化前のＴ細胞を使用する）における腫瘍細胞殺傷に対するＴＮＦα遮断の効果は、ＴＮＦα遮断がＴＮＦα非感受性腫瘍細胞の殺傷を制限しないため、Ｔ細胞機能の阻害に起因するものではないことに注意することが重要である（図１３）。ＭＣ３８細胞のＴ細胞殺傷に対するＴＮＦαの有意な寄与と一致して、可溶性ＴＮＦαは、アポトーシス機構を介してＭＣ３８細胞死を促進した（すなわち、殺傷は、カスパーゼ阻害剤ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫによってブロックされた）（図２のＣ）。更に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用するＫＯ細胞株の生成は、ＭＣ３８細胞のＴＮＦα媒介殺傷がＴＮＦＲ１に完全に依存し、ＦＡＤＤ（カスパーゼ８活性化複合体の構築に重要なアダプタータンパク質）及びＲＩＰＫ１（カスパーゼ８と相互作用してアポトーシスを促進するキナーゼ）に部分的に依存することを確認した（図２のＣ）。

【0237】

腫瘍細胞株のパネルでカスパーゼ－８活性化及びアポトーシスを誘導するＴＮＦαの能力が評価され、これらの細胞株の大部分（ＣＴ２６、Ｂ１６Ｆ１０、４Ｔ１）はＴＮＦαによって殺傷されなかったが、ＥＭＴ６細胞（ＭＣ３８と共に）はＴＮＦα誘導性カスパーゼ８活性化及びアポトーシスを示した（図２のＤ及びＥ）。（ＴＮＦαによる殺傷に感受性のあるヒトがん細胞株の例については、図２２を参照）。上述のように、ＮＦ－κＢシグナル伝達は、ＴＮＦα依存性アポトーシスの制限において重要な役割を果たしていると考えられる。しかし、ＴＮＦα感受性細胞株対耐性細胞株では、ＮＦ－κＢ活性化に明らかな違いは見られなかった。ＴＮＦα感受性ＭＣ３８及びＥＭＴ６細胞は、ＴＮＦα耐性Ｂ１６Ｆ１０及び４Ｔ１細胞で観察されたものと同様の、Ｉκ－Ｂα（ＮＦ－κＢを細胞質に隔離することにより阻害する）の効率的な分解及びＮＦ－κＢサブユニットｐ６５／Ｒｅｌａのリン酸化を示した（図２のＦ、図１４）。更に、ＭＣ３８細胞は、２つのＮＦ－κＢ標的遺伝子Ａ２０及びＩＣＡＭ－１の強力なＴＮＦα誘導性発現を示した（図２のＧ）。したがって、ＮＦ－κＢ経路は明らかにＴＮＦα依存性を制限するが、ＴＮＦα誘導殺傷に対する感受性は、欠陥のあるＮＦ－κＢ活性化以外の要因に明らかに起因し得る。

【0238】

ＮＦ－κＢシグナル伝達は、Ｔ細胞及びＴＮＦαによる腫瘍細胞殺傷を制限する。
Ｔ細胞によるＭＣ３８細胞の殺傷を制限する際のＮＦ－κＢ経路の役割を示すスクリーニングデータを確認するために、３つの重要なＮＦ－κＢ経路遺伝子（Ｍａｐ３ｋ７／Ｔａｋ１、Ｒｂｃｋ１及びＲｅｌａ）は、スクリーニングで枯渇したｓｇＲＮＡを使用して不活性化された。複数のｓｇＲＮＡによるＭａｐ３ｋ７の不活性化は、ＭＣ３８細胞をＴ細胞殺傷に対して感作させ、異なるｓｇＲＮＡによるＭａｐ３ｋ７タンパク質の枯渇の程度は感作の程度と相関し、これらの効果が予想通りであることを示した（図３のＡ及びＢ）。Ｍａｐ３ｋ７ ＫＯはＴＮＦαによるＮＦ－κＢ標的遺伝子Ａ２０及びＩＣＡＭ－１の誘導を有意に阻害し、Ｍａｐ３ｋ７ ＫＯがＮＦ－κＢ経路を無効にすることが確認された（図３のＥ）。Ｒｂｃｋ１（図１５）及びＮＦ－κＢサブユニットｐ６５（Ｒｅｌａ）（図１６）のノックアウト時に、Ｔ細胞殺傷に対する同様の効果が観察され、ＮＦ－κＢシグナル伝達の保護効果が更に検証された。

【0239】

重要なことに、飽和量のＴＮＦα遮断抗体の存在下で、Ｍａｐ３ｋ７ ＫＯ（Ｒｂｃｋ１及びＲｅｌａ ＫＯと同様に）はもはやＴ細胞によるＭＣ３８細胞の殺傷を増強しなかった （図３のＣ、ならびに図１５及び図１６）。これは、ＮＦ－κＢ経路の保護効果が、ＴＮＦα媒介アポトーシス阻害を反映していることを示す（パーフォリン／グランザイム媒介殺傷よりも）。この仮説と一致して、Ｍａｐ３ｋ７、Ｒｂｃｋ１及びＲｅｌａのＫＯは、ＴＮＦα誘導性カスパーゼ８の活性化及び細胞死を有意に増加させた（図３のＤ及びＥ、図１５及び図１６）。ＴＮＦα依存性アポトーシスに対する効果とは対照的に、Ｍａｐ３ｋ７ ＫＯ（Ｒｂｃｋ１及びＲｅｌａ ＫＯと同様に）は、化学療法薬ドキソルビシン及びパクリタキセルによるＭＣ３８細胞の殺傷に影響を及ぼさず、ＮＦ－κＢがこれらの細胞をいかなるアポトーシス誘導性刺激からも広く保護しなかったことを示した（図３のＦ、図１５及び図１６）。

【0240】

オートファジーは、Ｔ細胞及びＴＮＦαによる腫瘍細胞殺傷を制限する。
Ｔ細胞による腫瘍細胞殺傷を制限するオートファジーの役割を検証するために、３つの必須オートファジー遺伝子（Ｒｂ１ｃｃ１、Ａｔｇ９ａ及びＡｔｇ１２）を、スクリーニングで枯渇したｓｇＲＮＡを使用して不活性化した。複数のｓｇＲＮＡによるＲｂ１ｃｃ１（ＦＩＰ２００としても既知）の不活性化は、ＭＣ３８細胞をＴ細胞殺傷に対して感作させ、Ｒｂ１ｃｃ１タンパク質の枯渇の程度は感作の程度と相関し、これらの効果が予想通りであることを確認した（図４のＡ及びＢ）。同様の結果がＡｔｇ９ａ（図１７）及びＡｔｇ１２（図１８）のＫＯで見られ、オートファジーの保護的役割が更に検証された。重要なことに、オートファジーカーゴ受容体ｐ６２（セクエストソーム１、ｓｑｓｔｍ１としても既知）のレベルの大幅な増加（図５のＡ、図１７及び図１８）及びオートファゴソームタンパク質ＬＣ３の脂質化型であるＬＣ３－ＩＩのレベルの低下（図１８）によって示されるように、これらの３つの主要なオートファジー成分のノックアウトは、実際にＭＣ３８細胞のオートファジー活性を損う。ｐ６２は、ユビキチン化タンパク質をオートファゴソームに結合させ、それ自体がオートファジーによって分解されるため、オートファジーが阻害されるとそのレベルが上昇する。ＬＣ３－Ｉは、ホスファチジルエタノールアミンへ結合を介してＬＣ３－ＩＩに変換され、オートファゴソームの形成と伸長が開始される。したがって、この変換の上流でオートファジーを阻害すると、ＬＣ３－ＩＩの形成が阻害される（Ｄｅｒｅｔｉｃ，２００８）。

【0241】

オートファジーは、複数のメカニズムによって、例えばマイトファジー－特に外膜の透過及びアポトーシスカスケードを引き起こす可能性のある損傷したミトコンドリアの除去－を介して、アポトーシスを阻害することが提唱されている。オートファジーがＴ細胞による腫瘍細胞殺傷を制限するメカニズムへの洞察を得ることを目的とした一連の実験が行われた。オートファジーの遺伝的不活性化は、ＭＣ３８細胞における細胞表面ＭＨＣ－Ｉ発現もしくはＯｖａペプチドの提示にほとんどまたはまったく影響を及ぼさなかった（図２３）。

【0242】

図４のＣに示すように、Ｒｂ１ｃｃ１ ＫＯは、ＴＮＦα遮断抗体の存在下で、ＭＣ３８細胞の殺傷にわずかな影響しか及ぼさず、Ｔ細胞殺傷に関連するオートファジーの保護効果は、主にＴＮＦα依存性アポトーシスの阻害によって媒介されることを示した。Ａｔｇ９ａ及びＡｔｇ１２ ＫＯ細胞でも同様の結果が見られた（図１７及び図１８）。これらの観察結果と一致して、Ｒｂ１ｃｃ１、Ａｔｇ９ａまたはＡｔｇ１２のＫＯは、ＴＮＦα依存性カスパーゼ８の活性化及びアポトーシスを有意に増加させた（図４のＤ、図５のＡならびに図１７及び図１８）。したがって、オートファジーは、カスパーゼ８活性化のレベル（任意のミトコンドリア関与の上流）で、ＴＮＦαシグナル伝達カスケードの初期段階を調節するようにみえる。この設定におけるオートファジーの特定のシグナル伝達機能と一致して、オートファジー遺伝子のＫＯは、化学療法薬ドキソルビシンまたはパクリタキセルによる殺傷に対してＭＣ３８細胞を感作しなかった（図４のＥ、図１７及び図１８）。

【0243】

ＮＦ－κＢ経路及びオートファジー経路の両方がＴ細胞による腫瘍細胞殺傷を制限することを考慮して、これらの経路間の機構的接続の可能性を調査した。１つの可能性は、オートファジーの不活性化がどういうわけかＮＦ－κＢシグナル伝達の異常をもたらし、それによってＴＮＦα媒介アポトーシスに感作させることである。しかし、オートファジー遺伝子Ｒｂ１ｃｃ１のＫＯは、ＴＮＦαを介したＩκ－Ｂαの分解、ＮＦ－κＢ標的遺伝子Ａ２０の誘導、または発現にＮＦ－κＢを必要とするいくつかのケモカインの誘導（例えば、ＣＸＣＬ１０及びＣＣＬ２）には影響を及ぼさなかった（図５のＢ、図２０）。したがって、オートファジーは、ＮＦ－κＢの活性化に必要な役割の結果として、ＭＣ３８細胞におけるＴＮＦα媒介アポトーシスを制限しない。逆に、オートファジー受容体ｐ６２のレベルは、Ｍａｐ３ｋ７ ＫＯの影響を受けず（図５のＣ）、無傷のＮＦ－κＢ経路がオートファジー活性に必要ないことを示唆した。

【0244】

次に、オートファジーが阻害されたときにＴＮＦαが細胞を殺傷するメカニズムを調べた。Ｒｂ１ｃｃ１の不活性化がＴＮＦα誘導性カスパーゼ８の活性化を増加させるという観察結果は、オートファジー経路が損なわれている状況では、ＴＮＦαがネクロトーシスではなくアポトーシスを介して細胞を殺傷することを示唆している。この主張を支持して、汎カスパーゼ阻害剤は、Ｒｂ１ｃｃ１ ＫＯ細胞におけるＴＮＦα媒介殺傷をブロックしたが（図５のＤ）、ネクロプシス阻害剤は効果がなかった（図５のＨ）。これらの観察結果と一致して、ＴＮＦαは、Ｒｂ１ｃｃ１ ＫＯ細胞においてネクロプトーシスのメディエーターである混合型キナーゼドメイン様タンパク質（ＭＬＫＬ）のリン酸化を誘導しなかった（図５の１）。

【0245】

ＴＮＦα誘導性アポトーシスは、キナーゼＲＩＰＫ１の関与によって区別される複数の分子メカニズムを介して発生し得る。オートファジー阻害に関連してＴＮＦαシグナル伝達の遺伝子解析を可能にするために、脂質キナーゼＶｐｓ３４の選択的小分子阻害剤であるオートフィニブが採用された。それは、オートファゴソームの形成に不可欠である。オートフィニブによるＭＣ３８細胞の処理は、ＴＮＦα媒介カスパーゼ８活性化及び殺傷を増加させた（及びｐ６２のレベルを大幅に増加させ、オートファジーの遮断を確認した）（図５のＥ及びＦ）。重要なことに、オートフィニブは、ＴＮＦαを介したＩκ－Ｂαの分解に影響を及ぼさず（図５のＦ）、オートファジーの障害がＮＦ－κＢ経路の欠陥にはつながらないことを示している（上述のＲｂ１ｃｃ１ ＫＯのデータと一致）。

【0246】

細胞がＴＮＦα誘導性殺傷を制限する重要なメカニズムの１つが、ＲＩＰＫ１のアポトーシス活性の阻害であることは十分に確立されている。ＴＮＦＲ１シグナル伝達経路におけるこの「早期チェックポイント」に寄与する分子イベントの中に、ｃＩＡＰによるＲＩＰＫ１のユビキチン化がある。したがって、Ｓｍａｃ模倣体によるｃＩＡＰ機能の阻害は、ＦＡＤＤ／ＲＩＰＫ１／ｃａｓｐａｓｅ－８依存性アポトーシスを促進する（図２のＡのモデルを参照）。このモデルと一致して、ＣＲＩＳＰＲを介したＲｉｐｋ１、ＦａｄｄまたはＴｎｆｒｓｆ１ａの不活化は、Ｓｍａｃ模倣体の存在下でＴＮＦαによる殺傷を有意に減少させた（図５のＧ）。しかし、Ｒｉｐｋ１、Ｔｎｆｒｓｆ１ａまたはＦａｄｄの不活性化も、オートフィニブの存在下でＴＮＦαによる殺傷を有意に減少させたが、Ｒｉｐｋ１の不活性化は効果がなかった（図５のＧ）。したがって、オートファジーが損なわれた細胞では、ＴＮＦα誘導性アポトーシスはＦＡＤＤ／ｃａｓｐａｓｅ－８依存性だが、ＲＩＰＫ１依存性ではなく、ＴＮＦＲ１シグナル伝達経路の初期チェックポイントが機能し続けていることを示唆している。したがって、オートファジーは、ＦＡＤＤ／カスパーゼ－８複合体の形成及び／または活性を制限することにより及びＲＩＰＫ１活性を制限しないことにより、ＴＮＦα誘導性アポトーシスを阻害するようにみえる。オートファジーの不活性化は、ＴＮＦＲ１、ＴＲＡＤＤ（ＴＮＦＲ１関連死ドメインタンパク質）またはＦＡＤＤの総タンパク質レベルに影響を及ぼさず、ＴＮＦα誘導性アポトーシスの増強が、これらの重要な経路成分のレベル上昇によって単純に引き起こされるのではないことが示された（図２４）。

【0247】

ＮＦ－κＢ経路及びオートファジー経路の両方がＴ細胞による腫瘍細胞殺傷を制限することを考慮して、これらの経路間の機構的接続の可能性を調査した。１つの可能性は、オートファジーの不活性化がＮＦ－κＢシグナル伝達の異常をもたらし、それによってＴＮＦα媒介アポトーシスに感作させることである。しかし、Ｒｂ１ｃｃ１のＫＯは、ＴＮＦαを介したＩκ－Ｂαの分解、ＮＦ－κＢ標的遺伝子Ａ２０の誘導、または発現にＮＦ－κＢを必要とするいくつかのケモカインの誘導（例えば、ＣＸＣＬ１０及びＣＣＬ２）には影響を及ぼさなかった（図４のＧ及び図２０）。したがって、オートファジーが損なわれても、ＮＦ－κＢの活性化が損なわれることはない。逆に、オートファジー受容体ｐ６２のレベルは、Ｍａｐ３ｋ７ ＫＯの影響を受けず（図４のＨ）、無傷のＮＦ－κＢ経路がオートファジー活性に必要ないことを示唆した。

【0248】

ＴＲＡＩＬは、２つのＴＮＦＲＳＦファミリー受容体であるＴＲＡＩＬ－Ｒ１及びＴＲＡＩＬ－Ｒ２の活性化を通じてアポトーシスを促進する。オートファジーがＴＲＡＩＬ－Ｒの下流のアポトーシスシグナル伝達も制限できるかどうかを判断するために、オートフィニブの非存在下または存在下でがん細胞をＴＲＡＩＬで攻撃した。図２１のＡ～Ｃに示すように、オートファジーがブロックされると、ヒトがん細胞におけるカスパーゼ－８の活性化及びＴＲＡＩＬによるアポトーシスの誘導が増加し、オートファジーが複数の細胞死受容体によるアポトーシスシグナル伝達を制限できることを示唆した（おそらく、ＴＮＦα及びＴＲＡＩＬの両方によるアポトーシスの誘導に不可欠であるＦＡＤＤ／ｃａｓｐａｓｅ－８複合体の活性の効果を介して）。オートファジー阻害によりＭＣ３８細胞はＴＲＡＩＬに対して感作されたが、これらの細胞は、ＴＮＦαによってより効果的に殺傷される（図２１のＡ～Ｆ）。

【0249】

腫瘍細胞ｍＴＯＲシグナル伝達は、Ｔ細胞／ＴＮＦα媒介殺傷に対する感受性を高める。
ｍＴＯＲ経路の遺伝子（例えば、Ｍｌｓｔ８、Ｍｔｏｒ、Ｒｉｃｔｏｒ、Ｍａｐｋａｐ１）を標的とする複数のｓｇＲＮＡがスクリーニングで濃縮され、ｍＴＯＲシグナル伝達が効率的な腫瘍細胞殺傷に必要であることが示唆された。ｍＴＯＲ経路は、細胞代謝の重要な調整因子であり、栄養レベル及び成長因子を細胞の成長及び増殖に結び付ける。細胞増殖の促進におけるその役割と一致して、ｍＴＯＲシグナル伝達は、複数のメカニズムを介してオートファジー活性を阻害する。オートファジーの保護的役割に関する知見を考慮すると、ｍＴＯＲは、オートファジーの阻害を通じて、Ｔ細胞媒介殺傷に対する腫瘍細胞の感受性を高める可能性があるようにみえる。

【0250】

スクリーニング結果を確認するために、Ｍｌｓｔ８（ｍＴＯＲシグナル伝達複合体であるｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２の両方の必須成分）は、スクリーニングで濃縮されたｓｇＲＮＡを使用して不活性化された。Ｍｌｓｔ８の不活性化は、ホスホＳ６の減少（ｍＴＯＲＣ１依存性）及びホスホＡｋｔレベルの減少（ｍＴＯＲＣ２依存性）によって証明されるように、ｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２の両方の活性を阻害した（図６のＡ）。ｍＴＯＲシグナル伝達によるオートファジーの阻害と一致して、Ｍｌｓｔ８ ＫＯ細胞はｐ６２レベルの低下を示し、オートファジー活性の増加が確認された（図６のＡ）。Ｍｌｓｔ８ ＫＯ細胞におけるオートファジーの上昇は、ＴＮＦα及びＴ細胞媒介殺傷の両方に対する感受性の低下と関連していた（図６のＢ及びＣ）。重要なことに、腫瘍細胞殺傷に対する各Ｍｌｓｔ８ ｓｇＲＮＡの効果の大きさは、Ｍｌｓｔ８タンパク質の枯渇の程度と相関し（図６のＡ）、これらの効果が予想通りであることが確認された。腫瘍細胞殺傷に対するｍＴＯＲ経路の影響を更に説明するために、ｍＴＯＲＣ１シグナル伝達をラパマイシンでブロックすると、ホスホＳ６及びｐ６２レベルが低下した（オートファジー活性の上昇が確認された）（図６のＤ）。Ｍｌｓｔ８ ＫＯと同様に、ラパマイシンによるｍＴＯＲＣ１の阻害は、ＴＮＦα及びＴ細胞媒介殺傷の両方を有意に減少させた（図６のＥ及びＦ）。

【0251】

ｍＴＯＲ調節の効果に関するこれらの知見は、腫瘍細胞の保護メカニズムとしてのオートファジーの重要性を更に裏付けている。スクリーニングで同定された様々なシグナル伝達経路によるＴ細胞媒介腫瘍細胞殺傷の調節を示す図を、図６のＧに示した。

【0252】

オートファジーは、様々な系統のがん細胞をＴ細胞及びＴＮＦα媒介殺傷から保護する。
オートファジーの保護的役割に関する知見を拡張するために、オートフィニブ及び別のＶｐｓ３４遮断剤であるＳＡＲ４０５を使用して、がん細胞株パネルにおけるオートファジー阻害の効果を評価した。オートフィニブ及びＳＡＲ４０５はどちらもＶｐｓ３４を標的とするが、これらの阻害剤は構造的に異なり、そのため、異なるオフターゲット効果を有する可能性がある。どちらのオートファジー阻害剤も、ベースラインでＴＮＦαに対して感受性を示さない細胞株を含む、異なる系統（例えば、結腸、乳房、肺）の複数のマウス及びヒトがん細胞株においてＴＮＦαによる殺傷を有意に増加させた（図７のＡ、図２２）。オートファジー阻害剤は、ｐ６２レベルを有意に上昇させ（オートファジー遮断を確認）、ヒト乳癌細胞におけるＴＮＦα誘導性カスパーゼ－８活性化を増強した（図７のＢ）。したがって、ＴＮＦα治療という観点からオートファジーの保護的役割は、広く関連しているようにみえる。

【0253】

これまでのところ、標的細胞のＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体によるＴ細胞受容体の関与を通じてＴ細胞が活性化されると、ＴＮＦαが腫瘍細胞殺傷に寄与することが示されている。これらの条件下では、腫瘍細胞のオートファジーが実質的な保護的役割を果たすことが示されている。当該知見の潜在的な臨床的関連性を更に裏付けるために、オートファジーが、ＣＤ３二重特異性抗体による刺激後のＴ細胞による腫瘍細胞殺傷も調節するかどうかを求めた。新しく有望な治療クラスであるこれらの抗体は、一方のアームで腫瘍抗原に結合し、もう一方のアームでＴ細胞上のＣＤ３に結合し、それによって腫瘍細胞と細胞傷害性Ｔ細胞を架橋して、腫瘍細胞殺傷死滅を可能にする（図７のＣ）。乳房腫瘍抗原ｘＣＤ３二重特異性抗体（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎで生成）を使用して、ヒトＴ細胞によるＺＲ－７５－１ヒト乳癌細胞の殺傷を促進した。図７のＣに示すように、ＳＡＲ－４０５によるオートファジーの阻害により、腫瘍細胞殺傷が大幅に増加した。オートファジーの薬理学的遮断の効果と一致して、Ｒｂ１ｃｃ１ ＫＯによるオートファジーの遺伝的不活性化は、ＣＤ３二重特異性抗体誘導性殺傷を増強した（図７のＤ及びＥ）。まとめると、これらの知見は、ＣＤ３二重特異性抗体によって誘導されるＴ細胞殺傷に関連するオートファジーの保護的役割と、ヒト乳癌細胞におけるオートファジーの保護的役割を確認する。

【0254】

オートファジーの遺伝的不活性化は、免疫療法に対して腫瘍を感作させる。
知見の臨床的関連性を更に評価するために、オートファジーの遺伝的不活性化がＴ細胞チェックポイント阻害剤に対する腫瘍の応答性を高めるかどうかを求めた。ＥＭＴ６マウス乳癌細胞におけるＲｂ１ｃｃ１のＫＯは、ｐ６２タンパク質レベルの大幅な増加をもたらし、オートファジー活性の減少を確認し（図８のＡ）、ＴＮＦα誘導性アポトーシスに対するＥＭＴ６細胞の感受性を増加させた（図８のＢ）。対照またはＲｂ１ｃｃ１ ＫＯ細胞をマウスに移植し、移植の３日後にマウスを対照抗体またはＰＤ－１及びＣＴＬＡ４遮断抗体の組み合わせで処理した。図８のＣに示すように、ＰＤ－１とＣＴＬＡ４の併用遮断は、Ｒｂ１ｃｃ１ ＫＯ腫瘍の完全な退縮を促進しつつも、対照のＥＭＴ６腫瘍に対してわずかな増殖阻害効果しかなかった。個々の腫瘍増殖曲線は、対照腫瘍の０／１０と比較して、Ｒｂ１ｃｃ１ ＫＯ腫瘍の１０／１０が退縮したことを示す（図８のＤ）。

【0255】

次に、ＭＣ３８腫瘍を用いて同様の実験を行った。図８のＥに示すように、ＭＣ３８細胞におけるＲｂ１ｃｃ１のＫＯは、ｐ６２タンパク質レベルの大幅な増加によって証明されるように、オートファジーの障害をもたらした。ＰＤ－１＋ＣＴＬＡ４の併用遮断により、対照ＭＣ３８腫瘍の増殖が減少したが、Ｒｂ１ｃｃ１ ＫＯ腫瘍に対するチェックポイント遮断の効果は有意に大きかった（図８のＦ）。免疫療法に応答したＲｂ１ｃｃ１ ＫＯ腫瘍対対照腫瘍の増殖の遅延は、図８のＧに示されている個々の腫瘍増殖曲線から容易に明らかである。まとめると、これらの知見は、オートファジーが損なわれた腫瘍が、臨床的に関連するＴ細胞チェックポイント阻害剤に対する応答性の増加を示すことを示している。

【0256】

Ｒｂ１ｃｃ１ ＫＯ腫瘍との関連でＴｎｆｒｓｆ１ａ（ＴＮＦＲ１をコードする）ＫＯの効果を試験した。本明細書に開示されるように、Ｒｂ１ｃｃ１ ＫＯ細胞で観察されるＴＮＦα媒介アポトーシス増加は、Ｒｂ１ｃｃ１／Ｔｎｆｒｓｆ１ａダブルＫＯ ＥＭＴ６細胞では逆転した（図８のＡ及びＢ）。Ｔｎｆｒｓｆ１ａのｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子不活性化は、Ｒｂ１ｃｃ１ ＫＯ腫瘍で観察される免疫療法に対する感作を制限した（図８のＣ及びＤ）。したがって、オートファジーが損なわれた腫瘍に関連して、Ｔｎｆｒｓｆ１ａ ＫＯは保護的である。オートファジーが損なわれていない対照腫瘍では、Ｔｎｆｒｓｆ１ａ ＫＯは、腫瘍を免疫チェックポイント遮断から保護しないが、実際には治療に対して感作させている（図８のＣ）。Ｔｎｆｒｓｆ１ａ ＫＯが状況依存的に腫瘍に影響を与えることは明らかである。それにもかかわらず、データは、腫瘍細胞オートファジーが損なわれている状況では、ＴＮＦα誘導性アポトーシスが抗腫瘍免疫の重要な要素であることを示している。

【0257】

Ｒｂ１ｃｃ１ ＫＯ腫瘍への白血球浸潤を評価した。ＥＭＴ６及びＭＣ３８モデルの両方で、Ｒｂ１ｃｃ１ ＫＯ腫瘍は、対照腫瘍と比較して、ＣＤ４５＋白血球の数が増加していた（図２６）。しかし、全体的な白血球の浸潤は増加したが、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の優先的な浸潤は観察されなかった。それにもかかわらず、白血球浸潤の増加及びＴ細胞媒介殺傷に対する感受性の増加の両方が、オートファジー障害腫瘍モデルで観察された免疫療法に対する応答の増強に寄与している可能性がある。

【0258】

ゲノム規模のＣＲＩＳＰＲスクリーニングを使用して、腫瘍細胞のＴＮＦαシグナル伝達がＴ細胞媒介殺傷の重要な構成要素であることを同定し、逆にＮＦ－κＢ経路及びオートファジー経路の両方に対する保護的役割を同定した。本明細書に提示されたデータは、オートファジーが、ミトコンドリア関与の上流でカスパーゼ－８活性化の阻害を介して、ＴＮＦαによる腫瘍細胞殺傷を制限することを示している。より具体的には、オートファジーはＦＡＤＤ／カスパーゼ－８複合体の形成及び／または活性を阻害するようにみえ、これは、オートファジーがＴＲＡＩＬによる腫瘍細胞殺傷を制限できるという観察と一致し、これはまた、ＦＡＤＤ／カスパーゼ－８を介した細胞毒性も誘発する。

【0259】

これらのｉｎ ｖｉｖｏ実験は、腫瘍細胞におけるオートファジーの遺伝的不活性化がＴ細胞チェックポイント阻害剤の有効性を高めることを示しており、オートファジーの薬理学的阻害もそのような治療の有効性を高める可能性があることを示唆している。がんにおけるオートファジーの役割は広く研究されているが、このプロセスが腫瘍細胞の増殖／生存にとってどれほど重要であるかは不明のままである。それにもかかわらず、本明細書に提示されたデータは、オートファジー阻害剤が、腫瘍細胞増殖の潜在的な調節とは別に、がん細胞をＴＮＦα誘導性アポトーシスに対して感作させる可能性があることを示している。

【0260】

要約すると、本明細書に提示された分析は、Ｔ細胞媒介殺傷に対する腫瘍細胞の感受性を制限するオートファジーの役割を明らかにした。オートファジーが腫瘍の免疫逃避の潜在的なメカニズムであることが同定されたことは、オートファジー阻害剤がＴ細胞関与免疫療法の有効性を高める可能性を示唆している。更に、本明細書に提供されたデータは、オートファジーが、ミトコンドリア関与の上流でカスパーゼ－８活性化の阻害を介して、Ｔ細胞及びＴＮＦαによる腫瘍細胞殺傷を制限することを示している。更に、オートファジーの阻害は、腫瘍細胞を化学療法誘発性アポトーシスに感作させず、より一般的な抗アポトーシス機能（例えば、マイトファジー）ではなく、ＴＮＦαシグナル伝達の調節におけるオートファジーの比較的特異的な役割を示唆している。したがって、本明細書で提供されるデータは、オートファジー阻害剤の新しい治療的使用、すなわち、がん細胞が増殖／生存についてオートファジーに依存していない場合でも、がん細胞をＴ細胞殺傷の影響を受けやすくすることを示唆している。

【0261】

材料及び方法
がん細胞株
ＭＣ３８マウス結腸癌細胞は、米国の国立衛生研究所（ＮＩＨ）リポジトリから入手した。４Ｔ１、Ｂ１６Ｆ１０、ＣＴ２６、ＥＭＴ６、Ｌ９２９マウスがん細胞、及びＺＲ７５－１、ＨＣＴ－１１６、ＨｅＬａ、ＢＴ－２０、Ｍｅ－１８０、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１ヒトがん細胞、ならびにヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔヒト細胞は、米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）からのものであった。Ｃｏｌｏｎ２６マウスがん細胞は、米国の国立がん研究所（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓが運営）のがん治療及び診断部門からのものであった。すべての細胞は、製造元の推奨培地で培養された。すべての細胞株は、２０１６年にショートタンデムリピートプロファイリング（ＩＤＥＸＸ ＢｉｏＲｅｓｅａｒｃｈ）によって認証された。

【0262】

マウス
ＯＴ－１ Ｃ５７ＢＬ／６－Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）１１００Ｍｊｂ／Ｊマウス（００３８３１）、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（０００６６４）及びＢａｌｂ／ｃマウス（０００６５１）は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙからのものであった。

【0263】

ＣＲＩＳＰＲノックアウトｓｇＲＮＡライブラリー及びゲノム規模のスクリーニング
マウスｓｇＲＮＡライブラリー（ＧｅＣＫＯ Ａ及びＢ；約１３０，０００ｓｇＲＮＡ総量）及びｐＬｅｎｔｉＣａｓ９－Ｂｌａｓｔプラスミドは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔから購入した。ゲノム全体のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９スクリーニングは、レンチウイルス感染（ｐＬｅｎｔｉＣａｓ９－Ｂｌａｓｔ）及びブラストサイジン（１２μｇ／ｍｌ）による選択によりＣａｓ９ヌクレアーゼを発現するように操作されたＭＣ３８細胞を使用して実施した。各ｓｇＲＮＡが約２００個の細胞に導入されるように、ＭＣ３８－Ｃａｓ９細胞に、感染倍率０．３倍でマウスＧｅＣＫＯライブラリー（ＡとＢを合わせて）を感染させた。細胞は１２μｇ／ｍｌのピューロマイシンで３日間選択し、約１億３０００万個の細胞を参照対照試料として取りわけた。感染した７日後に、Ｔ細胞殺傷アッセイを３回同じ方法で設定した。約２０００ｘライブラリー表現でのライブラリー操作細胞は、Ｏｖａペプチドを間欠的に投与し、約２００ｘライブラリー表現での細胞は、対照ペプチドを間欠的に投与した。ペプチドを間欠的に投与した後、細胞を活性化ＣＤ８^＋Ｔ細胞（ＯＴ－１マウスから単離）と１：３のＥ：Ｔ比で共培養した。２４時間の共培養後、腫瘍細胞の約９０％が殺傷されたとき、非接着細胞がＰＢＳで洗い流され、生腫瘍細胞が採取された。その後、ＤＮｅａｓｙ血液＆組織キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡ抽出を実施し、ＮＧＳライブラリーを前述のように調製した。その後、ＮＧＳライブラリーをマルチプレックスし、８０塩基対（ｂｐ）シングルエンドリードを生成するＮｅｘｔＳｅｑ５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で実行した。ｂｃｌ２ｆａｓｔｑソフトウェア（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でデマルチプレックスした後、ｓｇＲＮＡに隣接する１６ｂｐベクター配列についてリードをスクリーニングし、ｓｇＲＮＡカウントのために下流の２０ｂｐのｓｇＲＮＡリードを抽出した。その後、ＭＡＧｅＣＫを使用してリードをカウントし、遺伝子／ｓｇＲＮＡ濃縮及び統計解析を実行した。Ｔ細胞を添加せずに増殖させたＭＣ３８細胞を、感染後１週間で回収し、ｓｇＲＮＡ表現と参照対照細胞のそれを比較した。

【0264】

検証実験に使用したｓｇＲＮＡ配列（遺伝子名、ｓｇＲＮＡ ＩＤ、該当する場合ｓｇＲＮＡ番号及び配列）は以下のとおりである（個々のｓｇＲＮＡはｐＬｅｎｔｉ－Ｇｕｉｄｅ－ＰｕｒｏまたはｐＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ ｖ２プラスミドのいずれかにクローニングされた）：Ｍａｐ３ｋ７、ＭＧＬｉｂＡ＿３０２８６、１、ＧＡＴＧＡＴＣＧＡＡＧＣＧＣＣＧＴＣＧＣ（配列番号１６）；Ｍａｐ３ｋ７、ＭＧＬｉｂＡ＿３０２８８、３、ＧＧＧＡＣＴＴＡＣＴＧＧＡＴＴＣＡＧＧＣ（配列番号１８）；Ｍａｐ３ｋ７、ＭＧＬｉｂＢ＿３０２７８、５、ＴＴＡＡＣＴＣＡＧＧＴＴＧＴＣＧＧＡＡＧ（配列番号２０）；Ｒｂｃｋ１、ＭＧＬｉｂＡ＿４４７１８、１、ＡＧＴＡＣＧＣＣＣＧＧＡＴＡＴＧＡＣＡＧ（配列番号２２）；Ｒｂｃｋ１、ＭＧＬｉｂＡ＿４４７２０、３、ＣＡＧＣＴＴＡＣＣＧＧＴＧＧＴＧＡＣＴＣ（配列番号２４）；Ｒｂｃｋ１、ＭＧＬｉｂＢ＿４４７０６、５、ＣＧＧＧＣＧＴＡＣＴＧＴＧＡＧＣＣＡＡＡ（配列番号２６）；Ｒｅｌａ、ＭＧＬｉｂＡ＿４５０７３、２、ＴＣＡＴＣＧＡＡＣＡＧＣＣＧＡＡＧＣＡＡ（配列番号２９）；Ｒｅｌａ、ＭＧＬｉｂＡ＿４５０７４、３、ＧＣＣＣＡＧＡＣＣＧＣＡＧＴＡＴＣＣＡＴ（配列番号３０）；Ｒｅｌａ、ＭＧＬｉｂＢ＿４５０６１、６、ＡＣＴＴＡＣＣＴＧＡＧＧＧＡＡＡＧＡＴＧ（配列番号３３）；Ｒｂ１ｃｃ１、ＭＧＬｉｂＡ＿４４６９０、３、ＴＣＡＡＧＡＴＡＧＡＣＣＣＡＡＴＧＡＴＧ（配列番号３６）；Ｒｂ１ｃｃ１、ＭＧＬｉｂＢ＿４４６７５、４、ＣＴＣＣＡＴＴＧＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣ（配列番号３７）；Ｒｂ１ｃｃ１、ＭＧＬｉｂＢ＿４４６７６、５、ＡＴＴＴＧＡＡＣＡＧＴＣＣＴＣＣＡＧＡＴ（配列番号３８）；Ａｔｇ９ａ、ＭＧＬｉｂＡ＿０５６６１、１、ＣＡＴＡＧＴＣＣＡＣＡＣＡＧＣＴＡＡＣＣ（配列番号４０）；Ａｔｇ９ａ、ＭＧＬｉｂＡ＿０５６６２、２、ＴＴＧＧＧＡＴＣＣＧＡＡＧＡＧＣＡＴＧＴ（配列番号４１）；Ａｔｇ９ａ、ＭＧＬｉｂＢ＿０５６６１、４、ＴＣＴＡＴＡＡＣＡＴＴＴＧＣＴＧＣＴＡＴ（配列番号４３）；Ａｔｇ１２、ＭＧＬｉｂＡ＿０５６２１、３、ＧＡＧＣＧＡＡＣＣＣＧＧＡＣＣＡＴＣＣＡ（配列番号４８）；Ａｔｇ１２、ＭＧＬｉｂＢ＿０５６２０、５、ＣＣＴＧＣＡＴＴＡＣＴＧＣＡＡＡＴＣＣＣ（配列番号５０）；Ａｔｇ１２、ＭＧＬｉｂＢ＿０５６２１、６、ＴＴＣＴＧＧＣＴＣＡＴＣＣＣＣＡＴＧＣＣ（配列番号５１）；Ｔｎｆｒｓｆ１ａ、ＭＧＬｉｂＡ＿５５１１６、ＧＴＧＴＣＴＣＡＣＴＣＡＧＧＴＡＧＣＧＴ（配列番号５２）；Ｒｉｐｋ１、ＭＧＬｉｂＡ＿４５６３５、３、ＧＴＡＣＡＣＧＴＣＣＧＡＣＴＴＣＴＣＣＧ（配列番号５３）；Ｆａｄｄ、ＭＧＬｉｂＡ＿１６９８８、２、ＴＡＧＡＴＣＧＴＧＴＣＧＧＣＧＣＡＧＣＧ（配列番号５４）；Ｂ２Ｍ、ＭＧＬｉｂＡ＿０６１１１、１、ＡＧＴＡＴＡＣＴＣＡＣＧＣＣＡＣＣＣＡＣ（配列番号５５）；Ｒｂ１ｃｃ１、ＨＧＬｉｂＢ＿４０３６６、６、ＧＧＣＴＧＣＡＡＴＣＡＴＧＧＣＣＡＡＣＣ（配列番号５６）；Ｍｌｓｔ８、ＭＧＬｉｂＡ＿３１４８０、１、ＧＡＣＴＣＣＧＴＣＡＴＡＡＣＴＧＡＴＧＡ（配列番号５７）；Ｍｌｓｔ８、ＭＧＬｉｂＡ＿３１４８２、３、ＣＧＡＡＧＣＡＴＧＡＴＴＧＣＴＧＣＴＧＣ（配列番号５８）；Ｍｌｓｔ８、ＭＧＬｉｂＢ＿３１４７１、４、ＡＧＣＡＣＴＣＡＣＧＧＣＡＣＴＡＴＴＧＡ（配列番号５９）。

【0265】

レンチウイルスパッケージング／形質導入及びＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子ノックアウト
検証実験では、目的の遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡを、ｐＬｅｎｔｉ－Ｇｕｉｄｅ－ＰｕｒｏまたはｐＬｅｎｔｉＣｒｉｓｐｒ ｖ２（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）にクローニングした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して、ｐＬｅｎｔｉ－Ｃａｓ９－ＢｌａｓｔまたはｐＬｅｎｔｉ－Ｇｕｉｄｅ－ＰｕｒｏまたはｐＬｅｎｔｉＣｒｉｓｐｒ ｖ２、ならびにパッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ及びｐＭＤ２．Ｇで遺伝子導入された。６時間後、培地を完全増殖培地に交換した。７２時間後、レンチウイルスを含有する上清を回収し、濾過し、超遠心分離によって濃縮し、－８０℃で保存した。レンチウイルス形質導入のために、腫瘍細胞を、０．３のＭＯＩにて５ｕｇ／ｍｌのポリブレン及びレンチウイルスを含む完全培地に播種した。ライブラリー表現を維持するのに十分な数のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用して、マウスＧｅＣＫＯ Ａ及びＢプラスミドライブラリーをプールし、同じ方法でレンチウイルスにパッケージングした。２４時間後、培地をＤＮａｓｅを含有する完全増殖培地に交換し、レンチウイルスを上述のように濃縮した。

【0266】

ＣＤ８＋Ｔ細胞の単離及び活性化
ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、６～８週齢の雄ＯＴ－１マウスの脾臓及びリンパ節から単離された。これらのマウスには、マウスＴｃｒａ－Ｖ２及びＴｃｒｂ－Ｖ５遺伝子の遺伝子導入インサートが含まれている。遺伝子導入Ｔ細胞受容体は、Ｈ－２Ｋｂ ＭＨＣクラスＩタンパク質との関連でオボアルブミンペプチド残基２５７～２６４を認識するように設計された。いくつかの実験において、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞がＰＢＭＣから単離された。Ｔ細胞は、２～３日間、１：２のビーズ：細胞比でＣＤ３／ＣＤ２８ビーズでｉｎ ｖｉｔｒｏにて活性化された。Ｔ細胞は、２０ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ－２、１０％の熱不活性化ウシ胎児血清、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．０５ｍＭの２－メルカプトエタノール及び５０Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地で活性化された。ＣＤ３二重特異性抗体を使用したヒト腫瘍細胞殺傷実験では、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＵｎｔｏｕｃｈｅｄヒトＴ細胞キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（ＲｅａｃｈＢｉｏ）からヒトＴ細胞を単離した。

【0267】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイ
ＭＣ３８細胞を２４ウェルあたり３４，０００細胞で播種し、播種から２４時間後に１ｎｇ／ｍｌのＯｖａまたはスクランブルペプチドを間欠的に投与した。間欠的投与された細胞を、指定されたＥ：Ｔ比にて活性化ＣＤ８^＋Ｔ細胞（ＯＴ－１マウスから単離）で培養した。２４時間後、接着していない腫瘍細胞をＰＢＳで洗い流し、細胞の生存率を評価した。指定されている場合、中和ＴＮＦα抗体またはアイソタイプ対照抗体を、１０または２０μｇ／ｍｌの濃度で添加した。

【0268】

ヒトＺＲ－７５－１細胞を、２４ウェルあたり１００，０００細胞で播種した。２４時間後、５μＭのオートファジー阻害剤ＳＡＲ－４０５の非存在下または存在下で、細胞を、１２ｎｇ／ｍｌの乳房腫瘍抗原ｘＣＤ３または対照（ＺＲ－７５－１細胞に結合していない）二重特異性抗体の存在下で、活性化ＣＤ８^＋Ｔ細胞（ヒトＰＢＭＣから単離）と指定されたＥ：Ｔ比にて２４時間インキュベートした。

【0269】

ＴＮＦα、ＴＲＡＩＬ、ドキソルビシンまたはパクリタキセルの細胞生存率に対する効果を、指定された濃度での２４時間のインキュベーション後に評価した。ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）またはＴＲＡＩＬ（１０ｎｇ／ｍｌまたは５０ｎｇ／ｍｌ）誘導性殺傷に対する５μＭのオートフィニブまたはＳＡＲ－４０５の効果は、特に断りのない限り、２４時間のインキュベーション後に評価した。すべての場合において、細胞生存率は、細胞のデヒドロゲナーゼ活性によって減少し、黄色のホルマザン色素（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を生成する、ＣＣＫ８細胞計数キット－８（ＣＣＫ－８）試薬を使用して測定した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ３マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して吸光度を測定した。

【0270】

異種移植片実験
ＥＭＴ６異種移植実験では、５×１０^６個の細胞を、６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの右側腹部に皮下注射した。移植の３日後、マウスは、ＣＴＬＡ－４プラスＰＤ－１遮断抗体またはアイソタイプ対照のいずれかで処理した（ｎ＝１０マウス／群）。処理の初日に、ＣＴＬＡ－４プラスＰＤ－１遮断抗体（５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射によって投与した。処理の３日目と６日目に、ＣＴＬＡ－４抗体（２．５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。４、８、１１及び１５日目に、５ｍｇ／ｋｇのＰＤ－１抗体を投与した。腫瘍の成長は週３回ノギスで監視され、腫瘍の体積（ｍｍ３）は次の式：１／２×縦×横^２を使用して推定した。

【0271】

ＭＣ３８異種移植実験では、３×１０^５個の細胞を、６～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部に皮下注射した。移植から１０日後、腫瘍体積が約７０ｍｍ３のとき、マウスを無作為化し、上述のようにＣＴＬＡ－４プラスＰＤ－１遮断抗体またはアイソタイプ対照のいずれかで処理した（ｎ＝７～１２マウス／群）。ＣＲＩＳＰＲ操作細胞を使用した腫瘍実験では、Ｃａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡは、レンチウイルス修飾に関連する免疫原性の増加を克服するために、リボ核タンパク質の一過性遺伝子導入を介して細胞に送達された。ｓｇＲＮＡ配列は、Ｒｂ１ｃｃ１ ＫＯの場合、ＣＵＣＣＡＵＵＧＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣ、Ｔｎｆｒｓｆ１ａ ＫＯの場合、ＵＵＣＵＣＣＣＧＧＵＣＡＣＣＡＡＧ、及び非ターゲティングは、ＡＡＡＵＧＵＧＡＧＡＧＡＵＣＡＧＡＧＵＡＡＵのとおりである。遺伝子導入の後、クローンを単離し、遺伝子ＫＯについて試験した。ＭＣ３８細胞については、８つのＫＯクローンのプールを腫瘍実験に使用し、ＥＭＴ６細胞については、４つのＫＯクローンのプールを使用した。

【0272】

抗体及び試薬
ＰＤ－１遮断抗体（クローンＲＭＰ１－１４）及びラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対照抗体は、ＢｉｏＸＣｅｌｌ製であった。アイソタイプＩｇＧ２ａによるＣＴＬＡ４遮断抗体（クローン９Ｄ９）の社内バージョンは、公開された一次配列を使用して生成された。ＣＤ３二重特異性抗体は、以前に記載された方法を使用してＲｅｇｅｎｅｒｏｎで生成された（Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。マウス反応性ＴＮＦα中和抗体（クローンＭＰ６－ＸＴ２２）及びラットＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ製であった。ヒト反応性ＴＮＦα中和抗体（クローンＭＡＢ１）及びマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体はＢｉｏｌｅｇｅｎｄ製であった。組換えマウス及びヒトＴＮＦα及びＩＦＮγは、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ製であった。組換えヒトＴＲＡＩＬは、Ｅｎｚｏ製であった。Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ汎カスパーゼ阻害剤は、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ製であった。Ｏｖａ ＳＩＩＮＦＥＫＬ（２５７～２６４）ペプチド及びスクランブル対照ペプチドＦＩＬＫＳＩＮＥ（２５７～２６４）は、ＡｎａＳｐｅｃ製であった。ＥａｓｙＳｅｐマウスＣＤ８^＋Ｔ細胞分離キットは、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ製であった。ＤｙｎａｂｅａｄｓマウスＴ－活性化因子ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅ製であった。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｕｎｔｏｕｃｈｅｄヒトＣＤ８ Ｔ細胞キットは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製であった。ヒトＰＢＭＣは、ＲｅａｃｈＢｉｏから購入した。マウスサイトカインアレイパネルＡは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製であった。プロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤及びＢＣＡ試薬は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製であった。オートフィニブはＢｉｏｖｉｓｉｏｎ製、ＳＡＲ－４０５はＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ製、ＬＣＬ－１６１（Ｓｍａｃ模倣体）はＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ製であった。Ｎｅｃ－１ｓは、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ製であった。Ｃａｓ９タンパク質及びｔｒｕｅｇｕｉｄｅ合成ｇＲＮＡは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製であった。ドキソルビシン及びパクリタキセルは、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ製であった。

【0273】

免疫ブロット
全細胞ライセートは、５％の２－メルカプトエタノールを含有するトリス－グリシンＳＤＳ試料バッファー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で調製した。ウエスタンブロッティングは、トリス－グリシンポリアクリルアミドＳＤＳゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及びＰＶＤＦメンブレン（ＢｉｏＲａｄ）を使用して従来の手法で実施した。ブロットは、ＴＢＳ中の５％の粉乳及び０．５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）－２０でブロックされ、一次抗体と共に一晩インキュベートした。二次抗体を添加した後、メンブレンをＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＰｌｕｓまたはＦｅｍｔｏ基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）とインキュベートし、発光をＣ３００撮像装置（Ａｚｕｒｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で保存した。ＴＡＫ１、Ｒｂｃｋ１、ＲｅｌＡ ｐ６５、Ｒｂ１ｃｃ１、Ａｔｇ１２、切断型カスパーゼ－８、プロカスパーゼ－８、ＲＩＰＫ１、ＲＩＰＫ１ホスホ－Ｓｅｒ３２１、ＲＩＰＫ１ホスホ－Ｓｅｒ１６６、Ｉκ－Ｂα、Ａ２０、ｐ６２、ホスホ－ｐ６５、ＬＣ３Ｂ、ＴＮＦＲ１（ＣＳＴ）、Ａｔｇ９ａ（Ｎｏｖｕｓ）、ｃＩＡＰ１（Ｅｎｚｏ）、β２Ｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＦＡＤＤ及びＩＣＡＭ（Ａｂｃａｍ）に対する一次抗体を使用した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合型β－アクチン抗体、ならびにマウスＩｇＧ、ウサギＩｇＧ及びヤギＩｇＧに対する二次抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製であった。

【0274】

異種移植片実験。レンチウイルスベクターによる細胞の改変に関連する免疫原性の増加を克服するために、リボ核タンパク質の一過性遺伝子導入を介してＣａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡを細胞に送達した。Ｒｂ１ｃｃ１ ＫＯに使用されたｓｇＲＮＡ配列は、ＣＵＣＣＡＵＵＧＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣであり、非ターゲティングｓｇＲＮＡ配列は、ＡＡＡＵＧＵＧＡＧＡＵＣＡＧＡＧＵＡＡＵであった。遺伝子導入の後、クローンを単離し、遺伝子ノックアウトについて試験した。ＭＣ３８細胞については、８つのＫＯクローンのプールを腫瘍実験に使用し、ＥＭＴ６細胞については、４つのＫＯクローンのプールを使用した。

【0275】

マウスサイトカインアレイ
対照またはＲｂ１ｃｃ１ターゲッティングｓｇＲＮＡを発現するＲｂ１ｃｃ１ＫＯ ＭＣ３８細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのマウスＴＮＦαで４時間処理した。処理後、細胞を氷冷したＰＢＳで２回洗浄し、１ｍＬの１％ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０、ｐＨ８．０の２０ｍＭのトリス－ＨＣＬ、１３７ｍＭのＮａＣＬ、１０％のグリセロール、２ｍＭのＥＤＴＡプラス１ＸＨａｌｔプロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤カクテルに溶解させた。４℃にて３０分間回転させた後、溶解物を、１４，０００ｇで４℃にて５分間遠心分離することにより清澄化し、タンパク質濃度を標準的なＢＣＡアッセイで測定した。サイトカイン産生を評価するには、プロテオームプロファイラーマウスサイトカインアレイパネルＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。３００μｇの細胞溶解物を使用して、標準キットのプロトコルに従った。

【0276】

腫瘍免疫表現型及びフローサイトメトリー分析
腫瘍を採取し、機械的に断片に分解した（４ｍｍ超）、その後、マウス腫瘍解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して３７℃にて４５分間酵素消化した。単細胞懸濁液を調製し、赤血球をＡＣＫバッファー（Ｌｏｎｚａ）で溶解した。細胞を計数し、Ｆｃブロック（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で氷上にて３０分間ブロックし、示されているように生存率色素ならびにＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色した。ＭＣ３８親及びオートファジーＫＯ細胞を、ＭＨＣ－Ｉ（Ｈ２－ｋｂ）もしくはアイソタイプ対照（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）抗体、またはＭＨＣ－Ｉ（Ｈ２－ｋｂ）－Ｏｖａ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）またはアイソタイプ対照（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）抗体で染色した。

【0277】

定量化と統計解析
プールされたＣＲＩＳＰＲスクリーニングの分析のために、すべての試料が同じ総リードカウントを有するように、各試料にスケーリング係数を掛けることによってデータを最初に正規化した。群を比較するために、正規化されたリードカウントテーブルをＭＡＧｅＣＫ（バージョン０．５．８）への入力として使用し、１つの群を処理として、もう１つの群を対照として割り当てた（５８）。細胞ベースのアッセイからのデータを複数の処理群と比較するために、テューキーの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡを使用した。異なる処理を受けた腫瘍の成長を比較するために、テューキーの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡを使用した。０．０５未満のＰ値は有意であるとみなした。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、統計的比較を実施した。

【0278】

参照による組み込み
本明細書で言及されるすべての公開物、特許、及び特許出願は、それぞれ個々の公開物、特許または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示される場合と同様に、これをもって、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾が生じる場合には、本明細書中のいかなる定義も含め、本出願が優先される。

【0279】

ワールドワイドウェブ上でＴｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＴＩＧＲ）及び／またはワールドワイドウェブ上でＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）によって維持されているものなどの公開データベースにおけるエントリーと相関する受託番号を参照する任意のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列も参照によってそれらの全体が組み込まれる。

【0280】

均等物
当業者であれば、通常の実験を使用するだけで、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態の均等物を数多く認識または確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図1-4】

【図1-5】

【図1-6】

【図1-7】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図2-4】

【図3-1】

【図3-2】

【図4-1】

【図4-2】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図5-4】

【図5-5】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図8-1】

【図8-2】

【図8-3】

【図8-4】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15-1】

【図15-2】

【図16-1】

【図16-2】

【図17-1】

【図17-2】

【図18-1】

【図18-2】

【図19】

【図20】

【図21-1】

【図21-2】

【図22-1】

【図22-2】

【図23-1】

【図23-2】

【図24】

【図25】

【図26-1】

【図26-2】

【配列表】

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【国際調査報告】