ホーム > 特許ランキング > ザ ジェイ． デビッド グラッドストーン インスティテューツ、 ア テスタメンタリー トラスト エスタブリッシュド アンダー ザ ウィル オブ ジェイ． デビッド グラッドストーン
▶ ザ ジェイ． デビッド グラッドストーン インスティテューツ、 ア テスタメンタリー トラスト エスタブリッシュド アンダー ザ ウィル オブ ジェイ． デビッド グラッドストーンの特許一覧 ▶ ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニアの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-13
(54)【発明の名称】線維症を予防するための線維芽細胞の活性化調節
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6883 20180101AFI20230406BHJP
C12N 5/071 20100101ALN20230406BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20230406BHJP
C12N 9/16 20060101ALN20230406BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20230406BHJP
A61K 35/33 20150101ALN20230406BHJP
A61P 9/00 20060101ALN20230406BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6883 Z ZNA
C12N5/071
C12N15/113 Z
C12N9/16 Z
C12N15/09 110
A61K35/33
A61P9/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022552601
(86)(22)【出願日】2021-03-02
(85)【翻訳文提出日】2022-10-19
(86)【国際出願番号】 US2021020372
(87)【国際公開番号】W WO2021178343
(87)【国際公開日】2021-09-10
(31)【優先権主張番号】62/984,103
(32)【優先日】2020-03-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517352418
【氏名又は名称】ザ ジェイ． デビッド グラッドストーン インスティテューツ、 ア テスタメンタリー トラスト エスタブリッシュド アンダー ザ ウィル オブ ジェイ． デビッド グラッドストーン
(71)【出願人】
【識別番号】506115514
【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100152489
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 美樹
(72)【発明者】
【氏名】アレクサニアン、マイケル
(72)【発明者】
【氏名】パドマナバン、アルン
(72)【発明者】
【氏名】スリヴァスタヴァ、ディーパック
【テーマコード（参考）】
4B050
4B063
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B050CC07
4B050KK07
4B050LL03
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR77
4B063QS25
4B063QS34
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AC14
4B065BA21
4B065CA46
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB63
4C087NA14
4C087ZA36
(57)【要約】
本明細書に記載されるのは、Ｍｅｏｘ１エンハンサー活性、Ｍｅｏｘ１転写、Ｍｅｏｘ１翻訳、ＭＥＯＸ１タンパク質の機能、もしくはそれらの組み合わせを調節することを含む、心臓の状態を治療するための方法である。また、本明細書に記載されるのは、Ｍｅｏｘ１エンハンサー活性を調節し得る薬剤を同定するための方法である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１つの試験薬剤を細胞集団と接触させることで試験アッセイ混合物を提供すること、および、Ｍｅｏｘ１レベルを測定することにより１つ以上のＭｅｏｘ１調節剤を同定することを含む方法。
【請求項2】
前記細胞集団が、線維芽細胞、活性化線維芽細胞、休止線維芽細胞、筋線維芽細胞、活性化筋線維芽細胞、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
Ｍｅｏｘ１レベルを測定することが、Ｍｅｏｘ１エンハンサーのクロマチンアクセシビリティを測定すること、Ｍｅｏｘ１転写物レベルを測定すること、新生Ｍｅｏｘ１転写物レベルを測定すること、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記Ｍｅｏｘ１エンハンサーがヒト１７番染色体の約４３，５８９，３８１位～４３，５９５，２６３位の間に存在する、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
Ｍｅｏｘ１レベルを測定することが、観察されたＭｅｏｘ１転写物またはＭｅｏｘ１新生転写物の細胞あたり遺伝子あたりの絶対数を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記試験薬剤のうち少なくとも１つが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、ガイドＲＮＡおよびｃａｓヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲリボ核タンパク質、またはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記Ｍｅｏｘ１調節剤のうち１つ以上が、Ｍｅｏｘ１レベルを低下させるか、Ｍｅｏｘ１エンハンサー活性を低下させるか、またはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記Ｍｅｏｘ１調節剤のうち１つ以上が、Ｍｅｏｘ１エンハンサーのクロマチンアクセシビリティを低下させるか、Ｍｅｏｘ１転写物レベルを減少させるか、新生Ｍｅｏｘ１転写物レベルを減少させるか、またはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記Ｍｅｏｘ１調節剤のうち１つ以上を心臓の状態または疾患の動物モデルに投与すること、および、前記Ｍｅｏｘ１調節剤のうち１つ以上が心臓の状態または疾患の症状または重症度を軽減するかどうかを決定することで治療剤を同定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記試験薬剤または前記治療剤のうち１つ以上を対象へ投与することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記対象が、心臓線維症、肺線維症、腎臓線維症、肝臓線維症、心不全、うっ血性心不全、心筋梗塞、心虚血、心筋炎、不整脈心筋症、拡張型心筋症、冠動脈疾患、高血圧症、心臓弁膜症、肥大型心筋症（ＨＣＭ）、家族性拡張型心筋症（ＦＤＣＭ）、拘束型心筋症（ＲＣＭ）、不整脈原性心筋症（ＡＶＣ）、未分類の心筋症、またはそれらの組み合わせを有する、または有すると疑われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記細胞集団が、状態または疾患の治療を求める患者に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記細胞集団を有する前記患者が、線維芽細胞において増加したＭｅｏｘ１レベル、線維芽細胞において増加した新生Ｍｅｏｘ１レベル、線維芽細胞内のＭｅｏｘ１エンハンサーにおける増加したクロマチンアクセシビリティ、またはそれらの組み合わせを示す、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記線維芽細胞が、心臓線維芽細胞、肺線維芽細胞、肝臓線維芽細胞、腎臓線維芽細胞、またはそれらの組み合わせである、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
Ｍｅｏｘ１ＲＮＡ転写、Ｍｅｏｘ１クロマチンアクセシビリティ、Ｍｅｏｘ１ ＲＮＡプロセシング、またはＭｅｏｘ１翻訳を阻害する薬剤と細胞を接触させることを含む方法。
【請求項16】
前記細胞が、線維芽細胞、筋線維芽細胞、活性化線維芽細胞、活性化筋線維芽細胞、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記線維芽細胞が、心臓線維芽細胞、肺線維芽細胞、肝臓線維芽細胞、腎臓線維芽細胞、またはそれらの組み合わせである、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記薬剤が、Ｍｅｏｘ１転写のノックダウンまたはノックアウトをする、Ｍｅｏｘ１エンハンサー活性のノックダウンまたはノックアウトをする、またはそれらの組み合わせである、請求項１５に記載の方法。
【請求項19】
前記薬剤が、１つ以上の阻害性核酸、ガイドＲＮＡ、ｃａｓヌクレアーゼ、ｃａｓヌクレアーゼ：ガイドＲＮＡリボ核タンパク質複合体、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項20】
前記細胞を接触させることがｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項21】
改変細胞を単離すること、および、ある心臓の状態または心臓の疾患を有する対象へそれらを投与することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させた前記細胞が、後に改変細胞を投与される対象に由来する、請求項２０に記載の方法。
【請求項23】
前記細胞を接触させることが、対象へ前記薬剤を投与することによりｉｎ ｖｉｖｏで行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項24】
前記対象が、心臓線維症、肺線維症、腎臓線維症、肝臓線維症、心不全、うっ血性心不全、心筋梗塞、心虚血、心筋炎、不整脈心筋症、拡張型心筋症、冠動脈疾患、高血圧症、心臓弁膜症、肥大型心筋症（ＨＣＭ）、家族性拡張型心筋症（ＦＤＣＭ）、拘束型心筋症（ＲＣＭ）、不整脈原性心筋症（ＡＶＣ）、未分類の心筋症、またはそれらの組み合わせを有する、または有すると疑われる、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
政府の支援
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＲ０１ＨＬ１７２４０の下で政府の支援により成された。政府は本発明において一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＲ０１ＨＬ１７２４０の下で政府の支援により成された。政府は本発明において一定の権利を有する。
【0002】
背景
心不全（ＨＦ）は、現在の治療の効果が限られている死亡の主要な原因であり、重要なアンメットニーズである。ストレス活性化シグナルカスケードは、心不全を悪化させるもしくは誘発するクロマチン制御機構に集中することがあり、転写および細胞状態の広範なシフトを誘発し、病的な心臓リモデリングのサイクルを促進させる事象を引き起こす。
心不全（ＨＦ）は、現在の治療の効果が限られている死亡の主要な原因であり、重要なアンメットニーズである。ストレス活性化シグナルカスケードは、心不全を悪化させるもしくは誘発するクロマチン制御機構に集中することがあり、転写および細胞状態の広範なシフトを誘発し、病的な心臓リモデリングのサイクルを促進させる事象を引き起こす。
【発明の概要】
【0003】
本明細書に記載されるのは、例えば、Ｍｅｏｘ１転写、Ｍｅｏｘ１翻訳、もしくはＭＥＯＸ１タンパク質の機能を阻害することを含む、心機能の改善の方法である。本明細書に示されるように、Ｍｅｏｘ１制御因子は、ストレスの多い心臓の事象の間に、線維芽細胞内で活性化され、Ｍｅｏｘ１のレベルの上昇および心臓状態を悪化させる線維化促進事象のカスケードを導く。このようなＭｅｏｘ１制御因子の阻害は心臓の機能を改善し得る。
【0004】
試験評価混合物を提供するために少なくとも１つの試験薬剤と細胞集団を接触させること、およびＭｅｏｘ１レベルを測定することによって１つ以上のＭｅｏｘ１調節剤を同定することを含む方法が本明細書に記載されている。例えば、細胞集団は、線維芽細胞、活性化線維芽細胞、休止線維芽細胞、筋線維芽細胞、活性化筋線維芽細胞、もしくはそれらの組み合わせを含むことができる。細胞集団は、心臓、肺、肝臓、腎臓、またはそれらの組み合わせなど、様々な組織に由来し得る。試験薬剤で評価される細胞集団は、心臓の状態または疾患を治療することを求める患者に由来し得る。試験される細胞集団を提供する患者は、心臓線維芽細胞での増加したＭｅｏｘ１レベル、心臓線維芽細胞での増加した新生Ｍｅｏｘ１レベル、心臓線維芽細胞もしくはその組み合わせにおけるＭｅｏｘ１エンハンサーでの増加したクロマチンアクセシビリティを有し得る。
【0005】
いくつかの場合、Ｍｅｏｘ１レベルの測定は、Ｍｅｏｘ１エンハンサーのクロマチンアクセシビリティの測定、Ｍｅｏｘ１転写物レベルの測定、新生Ｍｅｏｘ１転写物レベルの測定、またはそれらの組み合わせを含む。Ｍｅｏｘ１レベルの測定は、細胞あたり遺伝子あたりの観察されたＭｅｏｘ１転写物もしくはＭｅｏｘ１新生転写物の絶対数の測定を含み得る。Ｍｅｏｘ１エンハンサーはヒト１７番染色体の約４３，５８９，３８１位から４３，５９５，２６３位に存在し得る。様々な試験薬剤が試験され得る。例えば、試験薬剤の少なくとも１つは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、ガイドＲＮＡおよびｃａｓヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲリボ核タンパク質、またはそれらの組み合わせであり得る。Ｍｅｏｘ１レベルを調節し得るＭｅｏｘ１調節剤のうちの１つ以上は、Ｍｅｏｘ１レベルを低下させるか、Ｍｅｏｘ１エンハンサー活性を低下させるか、もしくはそれらの組み合わせであり得る。例えば、Ｍｅｏｘ１調節剤のうちの１つ以上は、Ｍｅｏｘ１エンハンサーのクロマチンアクセシビリティを低下させるか、Ｍｅｏｘ１の転写レベルを低下させるか、新生Ｍｅｏｘ１転写レベルを低下させるか、もしくはそれらの組み合わせであり得る。このような方法はさらに、ある状態もしくは疾患の動物モデルにＭｅｏｘ１調節剤のうちの１つ以上を投与すること、および、その状態もしくは疾患の症状または重症度をＭｅｏｘ１調節剤のうちの１つ以上が低減するかどうかを決定することにより、治療剤を同定することを含み得る。
【0006】
さらに、本方法は、対象に試験薬剤もしくは治療剤のうちの１つ以上を投与することも含み得る。そのような対象は、心臓線維化症、肺線維症、肝線維症、腎線維症、心不全、うっ血性心不全、心筋梗塞、心虚血、心筋炎、不整脈心筋症、拡張型心筋症、冠動脈疾患、高血圧症、心臓弁膜症、肥大型心筋症（ＨＣＭ）、家族性拡張型心筋症（ＦＤＣＭ）、拘束型心筋症（ＲＣＭ）、不整脈原性心筋症（ＡＶＣ）、未分類の心筋症、またはそれらの組み合わせを有するか、または有することが疑われ得る。
【0007】
さらに本明細書に記載されるのは、Ｍｅｏｘ１のＲＮＡ転写、Ｍｅｏｘ１のクロマチンアクセシビリティ、Ｍｅｏｘ１のＲＮＡプロセシング、もしくはＭｅｏｘ１の翻訳を阻害する薬剤と細胞を接触させることを含む方法である。細胞は、線維芽細胞、筋線維芽細胞、活性化線維芽細胞、活性化筋線維芽細胞、もしくはそれらの組み合わせを含み得る。細胞の集団は、心臓、肺、肝臓、腎臓、もしくはそれらの組み合わせなど、様々な組織に由来し得る。
【0008】
薬剤は、Ｍｅｏｘ１の転写のノックダウンもしくはノックアウト、Ｍｅｏｘ１のエンハンサー活性のノックダウンもしくはノックアウト、もしくはそれらの組み合わせをおこなうことができる。例えば、薬剤は、１つ以上の阻害核酸、１つ以上のガイドＲＮＡ、１つ以上のｃａｓヌクレアーゼ：ガイドＲＮＡリボ核タンパク質複合体、もしくはそれらの組み合わせを含み得る。このような細胞の接触は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生じ得る。場合によっては、改変細胞がある状態もしくは心疾患の対象に投与され得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させる細胞は、改変細胞が後に投与される特許（ｐａｔｅｎｔ）または対象に対して同種異系もしくは自家のものであり得る。
【0009】
細胞を試験薬剤もしくは調節剤と接触させることは、対象へ薬剤を投与することによってｉｎ ｖｉｖｏで生じ得る。このような対象は、心臓線維化症、肺線維症、肝線維症、腎線維症、心不全、うっ血性心不全、心筋梗塞、心虚血、心筋炎、不整脈心筋症、拡張型心筋症、冠動脈疾患、高血圧症、心臓弁膜症、肥大型心筋症（ＨＣＭ）、家族性拡張型心筋症（ＦＤＣＭ）、拘束型心筋症（ＲＣＭ）、不整脈原性心筋症（ＡＶＣ）、未分類の心筋症、またはそれらの組み合わせを有するか、または有することが疑われ得る。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図2A】図２Ａ～２Ｊは、ブロモドメインおよびエクストラターミナルドメイン（ＢＥＴ）阻害剤暴露にともなう心不全の動的可逆性が、筋線維芽細胞の状態と相関することを示す。図２Ａは、偽処置マウス（Ｓｈａｍ）、誘発心筋梗塞をともなう溶媒処置マウス（ＭＩ－Ｖｅｈ）および誘発心筋梗塞をともなうＣＰＩ４５６処置マウス（ＭＩ－ＣＰＩ４５６）における心エコー検査により定量化された左心室（ＬＶ）駆出率（ＥＦ）をグラフで示す（Ｓｈａｍ、ＭＩ－Ｖｅｈ、およびＭＩ－ＣＰＩ４５６について、ｎ＝１７、２１、および２１）。心筋梗塞（ＭＩ）モデルは、恒久的な前壁心筋梗塞により誘発した心不全を含んでいた。ＢＥＴ阻害剤ＣＰＩ４５６（１０ｍｇｋ）は、グラフの上のタイムラインに示すように、断続的に投与されたＪＱ１誘導体である。統計的有意性が、ＭＩ－ＶｅｈおよびＭＩ－ＣＰＩ４５６間で示される。
【図2B】図２Ｂは、偽処置マウス（Ｓｈａｍ）、溶媒処置の横狭窄モデル（Ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ Ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｅｌ）（ＴＡＣ）マウス（ＴＡＣ－Ｖｅｈ）および低分子ＢＥＴ阻害剤ＪＱ１で処置した横狭窄モデル（ＴＡＣ）マウス ＴＡＣ ＪＱ１における心エコー検査により定量化された左心室（ＬＶ）駆出率（ＥＦ）を示し（Ｓｈａｍ、ＴＡＣ－Ｖｅｈ、ＴＡＣ ＪＱ１およびＴＡＣ ＪＱ１休薬について、ｎ＝４、６、６および６）、ＢＥＴ阻害剤ＪＱ１（５０ｍｇｋ）の間欠投与（ＪＱ１の休薬なし対ＪＱ１の休薬あり）をともなう。統計的有意差はＴＡＣ ＪＱ１およびＴＡＣ ＪＱ１休薬の間で示される。
【図2C】図２Ｃは、心臓試料由来のシングルセルＲＮＡシーケンシング試料およびトランスポゼースアクセス可能クロマチン（Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ－Ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ）（ＡＴＡＣ）シーケンシング試料の生成のための実験的なワークフローを模式的に示す。図２Ｄは、クラスターの同一性によって色付けされた成体マウス集団内の捕捉された細胞すべての均一多様体近似と投影（ＵＭＡＰ、Ｓｔｒａｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１２５，６６２－６７７（２０１９））プロットを示す。全細胞ｎ＝３５，５５１。示されているように、シングルセルＲＮＡシーケンシングは成体の心臓における主要な非心筋細胞集団を同定する。図２Ｅは、試料の同一性によって色付けされた成体マウス集団内の捕捉された細胞すべての均一多様体近似と投影（ＵＭＡＰ、Ｓｔｒａｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１２５，６６２－６７７（２０１９））プロットを示す。全細胞ｎ＝３５，５５１。ＢＥＴ阻害を受けた心臓における全体的な転写変化が示されている。
【図2I】図２Ｉは、クラスターの関係を示す樹形図とともにクラスターの同一性によって色付けされたＦＢサブクラスターのＵＭＡＰプロットを示す。クラスター０，１，４；２，３；および５の代表的な上位遺伝子オントロジー（ＧＯ）タームが、右側に示される。図２Ａおよび２Ｂでは、示された比較について、＊Ｐ＜０．０５および＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１である。データは、平均±ＳＥＭとして示される。
【図3A】図３Ａ～３Ｊは、線維芽細胞のクロマチン状態の可逆性が、心臓の機能と関連する新規の動的にアクセス可能なＤＮＡエレメントを明らかにすることを説明する。図３Ａは、ｓｃＡＴＡＣｓｅｑ試料に由来する線維芽細胞における遠位エレメントのクロマチンアクセシビリティをグラフで示す。より良い可視化のために、１０％の最も極端な点のトリミングをおこなった。
【図3B】図３Ｂは、試料全体の傾向によってクラスター化された線維芽細胞における遠位エレメントの動的なアクセシビリティ（左）を、それぞれのクラスター内の遠位エレメントに最も近い遺伝子の上位３つのＧＯターム（右）とともに示す。
【図3D】図３Ｄは、非刺激（Ｕｎｓｔｉｍ）およびＴＧＦβ処理した線維芽細胞の間の差次的に転写された遠位領域のＰＲＯＳｅｑカバレッジのヒートマップを示す。上位ＧＯタームが右側に示されるとともに、それぞれの条件の２回の反復実験の平均シグナルが示されている。
【図3E】図３Ｅは、ｉｎ ｖｉｖｏでＳｈａｍとＴＡＣの間で開いた（ｎ＝８９６４）もしくは閉じた（ｎ＝１６２８）ｓｃＡＴＡＣピークについて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＵｎｓｔｉｍおよびＴＧＦβ処理した線維芽細胞で測定されたＰＲＯｓｅｑカバレッジをグラフで示す。
【図3F】図３Ｆは、線維芽細胞がＴＧＦβで刺激を受けるか受けない（Ｕｎｓｔｉｍ）場合のＰｏｓｔｎ発現へのピーク１１領域のＣＲＩＳＰＲｉ標的の効果を示す。Ｐｏｓｔｎ発現を、ＵｎｓｔｉｍおよびＴＧＦβ処理した線維芽細胞で対照株およびピーク１１－ＣＲＩＳＰＲｉ－標的株においてｑＰＣＲで測定した（各パネルは、そのＵｎｓｔｉｍ条件に対して正規化された）。
【図3H】図３Ｈは、線維芽細胞における４７０のスーパーエンハンサーの相関係数（図３Ｇに示された分析を参照）および対応するｐ値を示すボルケーノプロットである。Ｍｅｏｘ１遺伝子に遠位な領域は、最も大きい負の相関係数の１つを有する。図３Ｆでは、示された比較について、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１である。データは平均値±ＳＥＭとして示される。
【図4A】図４Ａ～４Ｋは、Ｍｅｏｘ１の発現を調節するシス調節エレメントのクロマチンアクセシビリティおよび新生転写を示す。図４Ａは、試料同一性（図３Ｇと同じ）によって色付けされサブクラスター化された線維芽細胞のＵＭＡＰプロットを示し、試料中の線維芽細胞でのＭｅｏｘ１発現をＵＭＡＰ特徴プロットおよびバイオリンプロット（ｙ軸はＵＭＩレベルで正規化される）として示す。
【図4B】図４Ｂは、Ｍｅｏｘ１座位（遺伝子およびエンハンサー）を示し、上から下に：線維芽細胞におけるｓｃＡＴＡＣ試料のカバレッジ；成体の心臓におけるＢＲＤ４のＣｈＩＰｓｅｑ（ＧＳＥ４６６６８）、Ｈ３Ｋ２７ａｃおよびＣＴＣＦ（ＥＮＣＳＲ０００ＣＤＦおよびＥＮＣＳＲ０００ＣＢＩ）；ＵｎｓｔｉｍおよびＴＧＦβ処理した線維芽細胞におけるＰＲＯｓｅｑのカバレッジ；およびｓｃＡＴＡＣを用いた線維芽細胞におけるＭｅｏｘ１プロモーターとピーク９／１０領域の間の共アクセシビリティの測定を示す。高転写領域（ピーク９／１０）は、大きなＭｅｏｘ１エンハンサー内で赤色で強調されている。
【図4C1】図４Ｃは、ＵｎｓｔｉｍおよびＴＧＦβ処理した線維芽細胞における染色体コンフォメーションキャプチャ（４Ｃ）のカバレッジを示す、ピーク９領域（アンカーポイント）およびＭｅｏｘ１プロモーターの間の４Ｃを示す。９２２ｋｂ（上）および３２８ｋｂ（下）のゲノム領域が示される。最後のトラックは、ピーク９を有するコールされたＴＧＦβ誘導ループを表す（原文では紫色で色付けされている）。
【図4C2】同上。
【図4D】図４Ｄは、上にＭｅｏｘ１エンハンサー内の３つの領域（ピーク５、９および１３）のＣＲＩＳＰＲｉ標的を模式的に示す。ピーク５、９もしくは１３を標的とする３つのＣＲＩＳＰＲｉ線維芽細胞株におけるＵｎｓｔｉｍおよびＴＧＦβ処理線維芽細胞の間のｑＰＣＲによるＭｅｏｘ１発現（各パネルはそのＵｎｓｔｉｍ条件に対して正規化される）。図４Ｄでは、示された比較について、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１である。データは、平均±ＳＥＭとして示される。
【図4E】図４Ｅは、偽処理された（左端棒）、ＴＡＣを受けた（中央左寄りの棒）、ＴＡＣを受けＪＱ１処理された（中央右寄りの棒）、もしくはＴＡＣを受け一時的にＪＱ１処理されその後ＪＱ１を中止された（右端棒）、線維芽細胞、骨髄細胞および内皮細胞におけるＭｅｏｘ１スーパーエンハンサー（ＳＥ）のクロマチンアクセシビリティを示す。
【図4H】図４Ｈは、心臓線維芽細胞におけるピーク９／１０の欠失によって示されるように、ピーク９／１０がＭｅｏｘ１発現を調節する必須の調節エレメントであることをグラフで示す。Ｍｅｏｘ１発現は、非刺激（Ｕｎｓｔｉｍ）およびＴＧＦβで刺激した、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９処理したＷＴ（アイソジェニック系統）およびピーク９／１０欠失細胞のｑＰＣＲによって測定された。
【図4I】図４Ｉは、Ｃｔｒｌ、Ｂｒｄ２、Ｂｒｄ３もしくはＢｒｄ４のいずれかを標的とするｓｉＲＮＡをともなうＵｎｓｔｉｍもしくはＴＧＦβ処理線維芽細胞における個々のＢＥＴ遺伝子のｑＰＣＲによって測定されたＢｒｄ２、Ｂｒｄ３もしくはＢｒｄ４発現をグラフで示す。
【図4J】図４Ｊは、Ｃｔｒｌ、Ｂｒｄ２、Ｂｒｄ３もしくはＢｒｄ４のいずれかを標的とするｓｉＲＮＡをともなうＵｎｓｔｉｍもしくはＴＧＦβ処理線維芽細胞におけるｑＰＣＲによって測定されたＭｅｏｘ１発現をグラフで示す。４Ｉ～４Ｊでは、示された比較について、＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１および＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１である。データは、平均±ＳＥＭとして示される。データは、平均±ＳＥＭとして示される。
【図5A】図５Ａ～５Ｊは、ＭＥＯＸ１が線維芽細胞の可塑性および線維化促進の機能の新規の調節因子であることを示す。図５Ａは、ＴＧＦβおよびＭｅｏｘ１を標的とするｓｉＲＮＡで７２時間処理した後、圧縮性コラーゲンゲルマトリックス上に播種し、ゲル収縮について評価した線維芽細胞の代表的な画像を示す。比較のために、コラーゲンゲル収縮での対照ｓｉＲＮＡの効果も示す。
【図5C】図５Ｃは、ＴＧＦβおよび、Ｃｔｒｌ ｓｉＲＮＡもしくはＭｅｏｘ１標的ｓｉＲＮＡで７２時間処理後、線維芽細胞内のＥｄｕ取り込みの定量化をグラフで示す。データは、平均±ＳＥＭとして示される。図５Ｂおよび５Ｃでは、示された比較について、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１である。
【図5D】図５Ｄは、ＣｈＩＰｓｅｑシグナル（８３６６領域が示される）の強度によってソートされたタンパク質コード遺伝子（転写開始点から－２ｋｂ、転写終結点から＋２ｋｂ）でのＭＥＯＸ１－ＨＡ ＣｈＩＰｓｅｑの占有率のヒートマップを示す。
【図5E】図５Ｅは、ＣｔｒｌもしくはＭｅｏｘ１ ｓｉＲＮＡとともにＴＧＦβ処理した線維芽細胞間の差次的に転写されたタンパク質コード遺伝子のＰＲＯｓｅｑカバレッジのヒートマップである。各条件において２回の反復実験の平均シグナルを示す。上位の関連ＧＯタームおよび例示的遺伝子を右に示す。
【図5F】図５Ｆは、ＣｔｇｆもしくはＰｏｓｔｎ座位（Ｐｏｓｔｎピーク１１調節エレメントを含む）でのＭＥＯＸ１ ＣｈＩＰおよびＰＲＯｓｅｑ（ＣｔｒｌもしくはＭｅｏｘ１ ｓｉＲＮＡとともにＵｎｓｔｉｍおよびＴＧＦβ処理の線維芽細胞）のカバレッジを示す。
【図5G】図５Ｇは、ヒトの心臓病、例えば、肥大型心筋症（ＨＣＭ）および拡張型心筋症（ＤＣＭ）での、Ｍｅｏｘ１の発現をグラフで示す。バルクＲＮＡｓｅｑデータは、心臓組織において評価された対照およびＨＣＭ／ＤＣＭを有する個体の間のヒトＭＥＯＸ１発現（－ＧＳＥ１４１９１０）を示す。
【図5H】図５Ｈは、突発性肺線維症（ＩＰＦ）におけるＭｅｏｘ１の発現をグラフで示す。バルクＲＮＡｓｅｑデータは、肺組織において評価された対照および突発性肺線維症を有する個体の間のヒトＭＥＯＸ１発現（－ＧＳＥ１３４６９２）を示す。図５Ｇ～５Ｈについて、ｐ値はパネルに示される。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本明細書で示されるように、Ｍｅｏｘ１エンハンサーエレメントは、ストレス誘導性線維芽細胞活性化を可逆的に媒介する線維芽細胞特異的転写スイッチである。本明細書に記載されている実験では、Ｍｅｏｘ１の発現および機能の阻害、および／もしくはＭｅｏｘ１エンハンサーの阻害が、心機能、肺機能、腎機能、肝機能、またはそれらの組み合わせを改善し得ることを示す。したがって、本出願は、Ｍｅｏｘ１転写の阻害、Ｍｅｏｘ１エンハンサーの活性の阻害、もしくはそれらの組み合わせの方法に関する。Ｍｅｏｘ１転写および／またはＭｅｏｘ１エンハンサー活性を調節し得る薬剤を同定するために有用なスクリーニングの方法も記載される。
【0012】
例えば、心不全のマウスモデル、低分子ＢＥＴブロモドメインの阻害剤、およびシングルセルオミクスの組み合わせを使用し、本発明者らは、心臓の筋線維芽細胞が転写の阻害に対して非常によく反応することを示している。例えば、筋線維芽細胞は、それらの細胞の条件の強固な可逆性を示し、基底線維芽細胞と活性化筋線維芽細胞の間を、ＢＥＴ阻害剤暴露に直接的に関連する様式でスイッチングする。加えて、本明細書で提供されるデータは、ヒトの肺、腎臓、および肝臓由来の活性化線維芽細胞におけるＭｅｏｘ１発現の上昇も示す。統合されたエピゲノムアプローチを利用して、本発明者らは、転写因子Ｍｅｏｘ１の発現を調節するスーパーエンハンサーの機能を発見し、詳細に調べた。このスーパーエンハンサーを調節することにより、Ｍｅｏｘ１発現を調節し線維芽細胞活性化の有害作用を低減し得る。
【0013】
Ｍｅｏｘ１は、線維芽細胞に特異的に発現し、線維芽細胞遺伝子のプロモーターに直接結合することにより、それらの増殖や収縮活性を制御する。本明細書に記載されるように、疾患発症過程での転写調節は、シングルセルの調査と組み合わされ、慢性疾患の進行および回復に関与する細胞の条件および分子機構を明らかにし、新規の治療アプローチを提示する。
【0014】
ヒトＭｅｏｘ１遺伝子は１７番染色体に存在し、ＮＣ＿００００１７．１１（４３６４０３８９．．４３６６１９７７、相補）に位置する。Ｍｅｏｘ１染色体座位のマップは、図１に示される。
【0015】
ＭＥＯＸ１アミノ酸配列の例は、ＮＣＢＩデータベースから、アクセッション番号ＮＰ＿００４５１８．１として利用可能であり、以下に配列番号１として示される。
【0016】
【化1】
【0017】
上記ヒトＭＥＯＸ１タンパク質のヌクレオチド配列は、以下に配列番号２として示される。
【0018】
【化2-1】
【0019】
【化2-2】
【0020】
その他のヒトＭｅｏｘ１配列は、アクセッション番号ＮＭ＿０１３９９９．３（ＧＩ：８４１０５３３０）；ＮＭ＿００１０４０００２．２（ＧＩ：１６７５０８７４３７）；およびＸＭ＿０１１５２４８１８．２（ＧＩ：１３７０４７０９９６）として利用可能である。
【0021】
Ｍｅｏｘ１転写因子の発現を制御しているエンハンサーはヒト１７番染色体の約４３，５８９，３８１位から４３，５９５，２６３位に存在する。このエンハンサーのピーク９／１０領域の配列は以下に配列番号３として示される。
【0022】
【化3-1】
【0023】
【化3-2】
【0024】
【化3-3】
【0025】
【化3-4】
【0026】
Ｍｅｏｘ１配列は、ヒト集団の間で変化し得る。多くのそのような変異体は、コドン変異および／もしくは保存的アミノ酸変化を含み得る。しかしながら、Ｍｅｏｘ１配列は、非保存的変異も含み得る。例えば、Ｍｅｏｘ１核酸もしくはＭｅｏｘ１タンパク質は、本明細書に記載されるＭｅｏｘ１核酸配列またはＭｅｏｘ１タンパク質配列のいずれかに対して、少なくとも８５％の配列同一性および／または相補性、もしくは少なくとも９０％の配列同一性および／または相補性、もしくは少なくとも９５％の配列同一性および／または相補性、もしくは少なくとも９６％の配列同一性および／または相補性、もしくは少なくとも９７％の配列同一性および／または相補性、もしくは少なくとも９８％の配列同一性および／または相補性、もしくは少なくとも９９％の配列同一性および／または相補性を有し得る。
【0027】
本明細書に記載のＭｅｏｘ１エンハンサーは、新生Ｍｅｏｘ１転写物において検出することができる。したがって、上記エンハンサーは転写されるということが言える。このため、Ｍｅｏｘ１染色体部位およびＭｅｏｘ１ ＲＮＡ転写物の両方を調節する方法を使用することで、Ｍｅｏｘ１を調節することができる。
【0028】
Ｍｅｏｘ１転写、Ｍｅｏｘ１翻訳、またはＭｅｏｘ１タンパク質機能の阻害は、心臓疾患および状態を治療することに使用され得る。治療され得る疾患および状態の例として、心不全、心臓線維症、肺線維症、腎線維症、肝線維症、うっ血性心不全、心筋梗塞、心虚血、心筋炎、不整脈、またはそれらの組み合わせが含まれる。
【0029】
エピジェネティックなアセチルリジンリーダータンパク質ＢＥＴ（Ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ ａｎｄ Ｅｘｔｒａ Ｔｅｒｍｉｎａｌ）の機能は、心不全発症過程におけるクロマチンコアクチベーターとなり得、これはｉｎ ｖｉｖｏで薬学的に標的になり得る。低分子ＢＥＴ阻害剤ＪＱ１の投与で、複数のげっ歯類モデルにおいてＨＦを予防または治療し得る。しかしながら、これらの有益な効果を仲介する内在性の細胞条件およびエピジェネティック機構、およびそれらの可逆性の程度は不明である。本明細書に記載されている実験では、マウス心不全モデルにおけるエンハンサーからプロモーターへのシグナル伝達を一過的に遮断するために低分子ＢＥＴブロモドメイン阻害を利用し、心臓組織のシングルセルＲＮＡ－ＳｅｑおよびシングルセルＡＴＡＣ－Ｓｅｑと組み合わせることで、治療応答の基礎となる動的な細胞条件および活性化クロマチンエレメントを発見する。
【0030】
ＪＱ１は、以下に示す構造を有するチエノトリアゾロジアゼピンである。これはブロモドメインタンパク質のＢＥＴファミリーの強力な阻害剤である。ブロモドメインタンパク質のＢＥＴファミリーは、哺乳類のＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、および精巣特異的タンパク質ＢＲＤＴを含む。
【0031】
【化4】
【0032】
ＪＱ１に構造的に類似したＢＥＴ阻害剤は、ＮＵＴ正中線癌を含む様々な癌に対する臨床試験で、様々な研究者によって試験されている。
スクリーニング
Ｍｅｏｘ１を調節し、それによって心臓の疾患／状態の症状、重症度および／または進行を低減する薬剤は、本明細書に記載の方法を使用することにより同定され得る。
スクリーニング
Ｍｅｏｘ１を調節し、それによって心臓の疾患／状態の症状、重症度および／または進行を低減する薬剤は、本明細書に記載の方法を使用することにより同定され得る。
【0033】
このような方法は、例えば、細胞集団を１つ以上の試験薬剤と接触させることでアッセイ混合物を形成し、その後Ｍｅｏｘ１レベルを測定することを含むことで、１つ以上のＭｅｏｘ１調節剤を同定し得る。細胞の集団は、心臓細胞、線維芽細胞、休止線維芽細胞、筋線維芽細胞、もしくはそれらの組み合わせを含み得る。場合によっては、細胞集団は、活性化線維芽細胞を含む。例えば、線維芽細胞は、ＴＧＦβによって活性化され得る。
【0034】
Ｍｅｏｘ１レベルの測定は、エンハンサーなどのＭｅｏｘ１調節エレメントのクロマチンアクセシビリティの測定を含み得る。例えば、Ｍｅｏｘ１調節エレメントはヒト１７番染色体の約４３，５８９，３８１位と４３，５９５，２６３位との間のエンハンサーなどのピーク９／１０エンハンサーであり得る。
【0035】
場合によっては、スクリーニング方法は、Ｍｅｏｘ１転写物もしくはタンパク質レベルの測定を含み得る。例えば、Ｍｅｏｘ１レベルの測定は、細胞あたり遺伝子あたりの観察されたＭｅｏｘ１転写物（ＵＭＩカウント）の絶対数の測定を含み得る。
【0036】
試験薬剤は、Ｍｅｏｘ１レベルを上昇させるＭｅｏｘ１の調節剤として選択され得る。
しかしながら、試験薬剤は、好ましくはＭｅｏｘ１レベルを低下させるＭｅｏｘ１調節剤として選択され得る。例えば、Ｍｅｏｘ１調節剤のうちの１つ以上は、Ｍｅｏｘ１のエンハンサー活性を低下させることができる。Ｍｅｏｘ１のエンハンサー活性の低下は、例えば、Ｍｅｏｘ１エンハンサーの染色体アクセシビリティを低下させることを含み得る。Ｍｅｏｘ１エンハンサーはヒト１７番染色体上の約４３，５８９，３８１位と４３，５９５，２６３位との間に存在し得る。
しかしながら、試験薬剤は、好ましくはＭｅｏｘ１レベルを低下させるＭｅｏｘ１調節剤として選択され得る。例えば、Ｍｅｏｘ１調節剤のうちの１つ以上は、Ｍｅｏｘ１のエンハンサー活性を低下させることができる。Ｍｅｏｘ１のエンハンサー活性の低下は、例えば、Ｍｅｏｘ１エンハンサーの染色体アクセシビリティを低下させることを含み得る。Ｍｅｏｘ１エンハンサーはヒト１７番染色体上の約４３，５８９，３８１位と４３，５９５，２６３位との間に存在し得る。
【0037】
ある場合には、試験アッセイにおける細胞集団は、心臓の状態または疾患の治療もしくは予防を求める患者由来である。このような患者は、その患者の心臓線維芽細胞におけるＭｅｏｘ１レベルの上昇、心臓線維芽細胞内の１つ以上のＭｅｏｘ１調節エレメントの染色体アクセシビリティの増加、もしくはそれらの組み合わせを示し得る。
【0038】
本明細書に記載されるスクリーニング方法はまた、Ｍｅｏｘ１調節剤のうちの１つ以上を心臓の状態もしくは疾患の動物モデルへ投与し、Ｍｅｏｘ１調節剤のうちの１つ以上が心臓の状態もしくは疾患の症状または重症度を低減するかどうかを決定することにより、治療薬を同定することを含み得る。加えて、前記方法は、試験薬剤または治療薬のうちの１つ以上を患者へ投与することを含み得る。
【0039】
Ｍｅｏｘ１の調節
Ｍｅｏｘ１は様々な薬剤および方法によって調節され得る。例えば、Ｍｅｏｘ１は本明細書に記載されている試験薬剤、治療剤、阻害性核酸、ガイドＲＮＡ、ヌクレアーゼ、リボ核タンパク質複合体であってｃａｓヌクレアーゼ、阻害性核酸、クロマチン安定化剤を含むリボ核タンパク質複合体、もしくはそれらの組み合わせのいずれによっても調節され得る。
Ｍｅｏｘ１は様々な薬剤および方法によって調節され得る。例えば、Ｍｅｏｘ１は本明細書に記載されている試験薬剤、治療剤、阻害性核酸、ガイドＲＮＡ、ヌクレアーゼ、リボ核タンパク質複合体であってｃａｓヌクレアーゼ、阻害性核酸、クロマチン安定化剤を含むリボ核タンパク質複合体、もしくはそれらの組み合わせのいずれによっても調節され得る。
【0040】
例えば、試験薬剤、治療剤、阻害性核酸、ガイドＲＮＡ、ヌクレアーゼ、リボ核タンパク質複合体であってｃａｓヌクレアーゼ、阻害性核酸、クロマチン安定化剤を含むリボ核タンパク質複合体、もしくはそれらの組み合わせは、患者や動物などの対象へ投与され得る。試験薬剤もしくは治療剤を受ける患者および動物は、試験薬剤、治療剤、阻害性核酸、ガイドＲＮＡ、ヌクレアーゼ、リボ核タンパク質複合体であってｃａｓヌクレアーゼ、阻害性核酸、クロマチン安定化剤を含むリボ核タンパク質複合体、もしくはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を必要とするものであり得る。場合によっては、試験薬剤、治療剤、阻害性核酸、ガイドＲＮＡ、ヌクレアーゼ、リボ核タンパク質複合体であってｃａｓヌクレアーゼ、阻害性核酸、クロマチン安定化剤を含むリボ核タンパク質複合体、もしくはそれらの組み合わせを受ける対象は、心臓状態もしくは心臓疾患の動物モデルである。
【0041】
対象は、エンハンサーなどのＭｅｏｘ１調節エレメントにおける増加した染色体アクセシビリティを示す線維芽細胞を有し得る。例えば、Ｍｅｏｘ１調節エレメントは、ヒト染色体１７番上の約４３，５８９，３８１位と４３，５９５，２６３位との間のＭｅｏｘ１エンハンサーなどピーク９／１０エンハンサーであり得る。
【0042】
対象（例えば、患者、動物、および／もしくは動物モデル）は、心臓疾患または心臓状態を有し得る。このような心臓状態または心臓疾患は、心臓線維症、肺線維症、腎臓線維症、肝臓線維症、心不全、うっ血性心不全、心筋梗塞、心虚血、心筋炎、不整脈心筋症、拡張型心筋症、心臓動脈疾患、高血圧症、弁膜性心疾患、肥大型心筋症（ＨＣＭ）、家族性拡張型心筋症（ＦＤＣＭ）、拘束型心筋症（ＲＣＭ）、不整脈原性心筋症（ＡＶＣ）、分類不能の心筋症、またはそれらの組み合わせを含み得る。場合によっては、対象は、心臓疾患もしくは心臓状態のいかなる症状も示さないことがあり、その場合、試験薬剤もしくは治療剤は心臓疾患もしくは心臓状態の発症を抑制するために投与され得る。
【0043】
場合によっては、Ｍｅｏｘ１調節エレメントのノックアウトもしくはノックダウンが、対象の線維芽細胞、筋線維芽細胞、もしくはそれらの組み合わせを調節するために使用され得る。このようなＭｅｏｘ１調節エレメントのノックアウトもしくはノックダウンは細胞もしくは対象内でｉｎ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏで実施され得る。例えば、Ｍｅｏｘ１調節エレメントのノックアウトもしくはノックダウンは、Ｍｅｏｘ１調節エレメントのＣＲＩＳＰＲ修飾もしくはＭｅｏｘ１調節エレメントを標的とするＭｅｏｘ１阻害性核酸の使用を含み得る。
【0044】
対象の細胞の集団内のＭｅｏｘ１調節エレメントのｉｎ ｖｉｔｒｏでのノックアウトもしくはノックダウンは、患者の応答を評価するため、もしくは対象の治療のための治療剤を選択するために使用され得る。しかしながら、場合によっては、対象の細胞の集団内のＭｅｏｘ１調節エレメントのｉｎ ｖｉｔｒｏでのノックアウトもしくはノックダウンを用いることで改変細胞を作製し、続いて患者へ改変した線維芽細胞を再導入し得る。このような改変線維芽細胞は、線維化組織を生じ得る問題のある生理学的反応のカスケードを引き起こすストレス刺激に反応しないことがある。このような理由で、心臓線維症、肺線維症、腎臓線維症、肝臓線維症、および関連臓器不全は、Ｍｅｏｘ１発現の低下によって回避され得る。
【0045】
改変細胞は、例えば、改変線維芽細胞、改変肺線維芽細胞、改変筋線維芽細胞、改変心臓線維芽細胞、改変肺線維芽細胞、改変肝臓線維芽細胞、改変腎臓線維芽細胞、改変心臓細胞、もしくはそれらの組み合わせであり得る。
【0046】
遺伝子調節
本明細書に記載されるのは、Ｍｅｏｘ１ピーク９／１０エンハンサーエレメントを含むＭｅｏｘ１調節エレメントの調節、ノックダウンもしくはノックアウト可能なガイドＲＮＡである。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集システムを使用することで、心臓の状態および疾患の間に活性化されるＭｅｏｘ１調節エレメントを削除修飾し得る。単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、対象のゲノム内の１つ以上の標的配列を認識するために使用され、ヌクレアーゼは１本鎖または２本鎖のゲノムＤＮＡを切断するハサミとして作用し得る。切断部位の近傍のゲノムにおける変異は、内在性の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）もしくは相同配列依存的修復（ＨＤＲ）経路によって導入され得る。したがって、ガイドＲＮＡは、内在性の機構によって欠失および／または改変のための標的Ｍｅｏｘ１ゲノム部位を切断するヌクレアーゼを誘導する。
本明細書に記載されるのは、Ｍｅｏｘ１ピーク９／１０エンハンサーエレメントを含むＭｅｏｘ１調節エレメントの調節、ノックダウンもしくはノックアウト可能なガイドＲＮＡである。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集システムを使用することで、心臓の状態および疾患の間に活性化されるＭｅｏｘ１調節エレメントを削除修飾し得る。単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、対象のゲノム内の１つ以上の標的配列を認識するために使用され、ヌクレアーゼは１本鎖または２本鎖のゲノムＤＮＡを切断するハサミとして作用し得る。切断部位の近傍のゲノムにおける変異は、内在性の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）もしくは相同配列依存的修復（ＨＤＲ）経路によって導入され得る。したがって、ガイドＲＮＡは、内在性の機構によって欠失および／または改変のための標的Ｍｅｏｘ１ゲノム部位を切断するヌクレアーゼを誘導する。
【0047】
Ｍｅｏｘ１特異的ガイドＲＮＡは、ストレス活性化に対する応答性を低下させるためのＭｅｏｘ１調節エレメントの改変が可能であり、これは病状を悪化させる転写および細胞状態での幅広いシフトを引き起こすシグナル伝達カスケードを誘発し得る。
【0048】
Ｃａｓシステムは、２０塩基のｇＲＮＡに一致するゲノム内の任意の配列を認識し得る。しかしながら、「プロトスペーサー隣接モチーフ」（ＰＡＭ）は直接的にＣａｓタンパク質に結合するため、各ｇＲＮＡはまた、Ｃａｓタンパク質の各タイプに不変のＰＡＭに隣接する必要がある。Ｄｏｕｄｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４６（６２１３）：１０７７，１２５８０９６（２０１４）およびＪｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６－２１（２０１２）を参照されたい。したがって、ガイドＲＮＡはＣａｓタンパク質によって結合され得るＰＡＭ部位配列を有し得る。
【0049】
初めてＣａｓシステムが「ＮＧＧ」ＰＡＭ部位を有するＣａｓ９について説明された際、このＰＡＭは、標的となる部位に対して正しい向きのＧＧを必要とするという点でいくらか制限的であった。異なるＣａｓ９の種類は、現在では異なるＰＡＭ部位を有するものとして説明される。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６－２１（２０１２）、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５２０：１８６－９１（２０１５）およびＺｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６３：７５９－７１（２０１５）を参照されたい。加えて、ＰＡＭ認識ドメインにおける変異（表１）は、ＳｐＣａｓ９およびＳａＣａｓ９についてＰＡＭ部位の多様性を増加させた。Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３：１２９３－１２９８（２０１５）およびＫｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５２３：４８１－５（２０１５）を参照されたい。
【0050】
表１ではＰＡＭ部位に関する情報をまとめている。
【0051】
【表1】
【0052】
ＳｐＣａｓ９およびＳａＣａｓ９のガイドＲＮＡは、ＰＡＭ部位の５’方向に２０塩基をカバーする一方、ＦｎＣａｓ２（Ｃｐｆ１）についてはガイドＲＮＡはＰＡＭの３’へ２０塩基をカバーすることに留意されたい。
【0053】
遺伝子編集に使用され得るヌクレアーゼおよびシステムには多くの異なる種類が存在する。採用されるヌクレアーゼは、場合によってはヌクレアーゼ活性を有する任意のＤＮＡ結合タンパク質であり得る。ヌクレアーゼの例は、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ（ＳｐＣａｓ９）ヌクレアーゼ、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）ヌクレアーゼ、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｃａｓ２（ＦｎＣａｓ２，ｄＦｎＣｐｆ１とも呼ばれる）ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｆｏｋ－Ｉヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ活性を有する任意のＤＮＡ結合タンパク質、ヌクレアーゼに結合する任意のＤＮＡ結合タンパク質、もしくはそれらの組み合わせを含む。しかしながら、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが通常もっとも広く用いられている。場合によっては、したがってヌクレアーゼはＣａｓヌクレアーゼである。
【0054】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、通常２つのクラスに分けられる。クラス１システムは、タイプＩ、ＩＩＩ、およびＩＶを含み、クラス２システムはタイプＩＩ、Ｖ、およびＶＩを含む。クラス１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは複数のＣａｓタンパク質の複合体を使用するのに対し、クラス２システムは複数のドメインを有する単一のＣａｓタンパク質のみを使用する。クラス２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは通常、シンプルさと使いやすさから、遺伝子工学的な用途のために好まれている。
【0055】
本明細書に記載の方法では、様々なＣａｓヌクレアーゼが採用され得る。最もよく特徴づけられている３種が例として提供される。最も一般的に使用されるＣａｓヌクレアーゼは、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）である。より最近記載されたＣａｓの形態は、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）およびフランシセラ・ノビシダＣａｓ２（ＦｎＣａｓ２、ＦｎＣｐｆ１とも呼ばれる）である。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６－２１（２０１２）；Ｑｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５２：１１７３－８３（２０１３）；Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５２０：１８６－９１（２０１５）；Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６３：７５９－７１（２０１５）を参照されたい。
【0056】
化膿レンサ球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）ヌクレアーゼのアミノ酸配列の一例を以下に提供する（配列番号４）。
【0057】
【化5】
【0058】
化膿レンサ球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）をコードするｃＤＮＡを以下に提供する（配列番号１５）。
【0059】
【化6-1】
【0060】
【化6-2】
【0061】
【化6-3】
【0062】
フランシセラ・ノビシダＣａｓ２（ＦｎＣａｓ２、ＦｎＣｐｆ１とも呼ばれる）のアミノ酸配列を以下に示す（配列番号１６）。
【0063】
【化7】
【0064】
上述のフランシセラ・ノビシダＣａｓ２（ＦｎＣａｓ２、ｄＦｎＣｐｆ１とも呼ばれる）ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを以下に示す（配列番号１７）。
【0065】
【化8-1】
【0066】
【化8-2】
【0067】
【化8-3】
【0068】
Ｍｅｏｘ１を阻害する核酸
本明細書に記載されるように、Ｍｅｏｘ１の発現の低下は、心機能を改善し得る。さらに、本明細書で提供されるデータは、ピーク９／１０エンハンサーがＭｅｏｘ１新生転写物において転写されていることを示す。
本明細書に記載されるように、Ｍｅｏｘ１の発現の低下は、心機能を改善し得る。さらに、本明細書で提供されるデータは、ピーク９／１０エンハンサーがＭｅｏｘ１新生転写物において転写されていることを示す。
【0069】
阻害性核酸は、Ｍｅｏｘ１の発現および／または翻訳を減少させるために使用され得る。このような阻害性核酸は、Ｍｅｏｘ１および／またはＭｅｏｘ１エンハンサー（例えば、ピーク９／１０Ｍｅｏｘ１エンハンサーエレメント）をコードする新生ＲＮＡを含むＭｅｏｘ１核酸に特異的に結合し得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、心臓線維芽細胞の増殖、遊走、および生存を制御し得るエンハンサーを含む、その他のエンハンサーを抑制するために使用されている（例えば、Ｍｉｃｈｅｌｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．９（３９５）ｅａａｉ９１１８（２０１７）を参照されたい）。したがって、エンハンサーがアミノ酸コード領域から離れている場合であっても、エンハンサーは阻害性核酸によって依然抑制され得る。
【0070】
阻害性核酸は、細胞内もしくはストリンジェントな条件下でＭｅｏｘ１の核酸にハイブリダイズする少なくとも１つのセグメントを有し得る。阻害性核酸は、Ｍｅｏｘ１をコードする核酸のプロセシング、発現、および／または翻訳を低減し得る。阻害性核酸は、ゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、新生ＲＮＡ、もしくはそれらの組み合わせにハイブリダイズし得る。阻害性核酸は、プラスミドベクターもしくはウイルス性ＤＮＡへ組み込まれてもよい。それは、１本鎖もしくは２本鎖、環状、直鎖状であってもよい。
【0071】
阻害性核酸は、１３塩基以上の長さを有するリボースヌクレオチド（ＲＮＡｉ）もしくはデオキシリボースヌクレオチドのポリマーであり得る。阻害性核酸は、天然に存在するヌクレオチド；ホスホロチオレート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏｌａｔｅｓ）などの合成、修飾、もしくは疑似ヌクレオチド；ならびにＰ３２、ビオチン、ジゴキシゲニンなどの検出可能な標識を有するヌクレオチドを含み得る。阻害性核酸は、Ｍｅｏｘ１核酸の発現、プロセシング、および／または翻訳を低減し得る。このような阻害性核酸は、Ｍｅｏｘ１核酸（例えば、Ｍｅｏｘ１ ｍＲＮＡもしくはピーク９／１０エンハンサーなどの少なくとも１つのＭｅｏｘ１エンハンサーエレメントを含むＭｅｏｘ１新生転写物）のセグメントに対して完全に相補的であり得る。
【0072】
阻害性核酸は、細胞内条件もしくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＭｅｏｘ１核酸にハイブリダイズし、Ｍｅｏｘ１核酸の発現を阻害するのに十分なものである。細胞内条件とは、細胞内、例えば、本明細書に記載の標的細胞内で典型的に見られる温度、ｐＨおよび塩濃度などの条件を指す。
【0073】
通常、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで特定の配列に対して熱融点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。しかしながら、ストリンジェントな条件は、本明細書で限定されなければ、所望のストリンジェンシーの程度に応じて、選択された配列の熱融点より約１℃～約２０℃低い範囲の温度を包含する。例えば、２、３、４、もしくは５もしくはそれ以上の、Ｍｅｏｘ１コーディングもしくは隣接配列に対して正確に相補的である連続したヌクレオチドのストレッチを含む阻害性オリゴヌクレオチドは、隣接するコード配列に相補的でない連続したヌクレオチドのストレッチによってそれぞれ分離することができ、このような阻害性核酸は、Ｍｅｏｘ１核酸の機能を依然阻害し得る。通常、連続したヌクレオチドのそれぞれのストレッチは、少なくとも４、５、６、７、または８またはそれ以上のヌクレオチド長である。非相補的介在配列は、１、２、３、または４ヌクレオチド長であり得る。
【0074】
当業者は容易に、センス核酸にハイブリダイズする阻害性核酸の計算された熱融点を用いることで、特定の標的核酸の発現を阻害するために許容されるミスマッチの程度を推定することができる。本発明の阻害性核酸は、例えば、ショートヘアピンＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、リボザイム、またはアンチセンス核酸分子である。
【0075】
阻害性核酸分子は、一本鎖（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）もしくは二本鎖（例えば、ｓｉＲＮＡ）であり得、酵素依存的にもしくは立体的遮断によって機能し得る。酵素依存的に機能する阻害性核酸分子は、ＲＮａｓｅＨ活性に依存する形態を含むことで標的ｍＲＮＡを分解する。これらには、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびホスホロチオエート分子、ならびに、センス－アンチセンス鎖ペアリングを介した標的ｍＲＮＡの認識とそれに続くＲＮＡ誘導サイレンシング複合体による標的ｍＲＮＡの分解に関与する二本鎖ＲＮＡｉ／ｓｉＲＮＡシステムが含まれる。ＲＮａｓｅＨ非依存的な立体的遮断阻害性核酸は、標的ｍＲＮＡに結合しその他の過程の障害となることにより、遺伝子発現もしくはその他のｍＲＮＡ依存性の細胞内プロセスを妨害する。立体的遮断阻害性核酸は、２’－Ｏアルキル（通常、ＲＮａｓｅＨ依存性アンチセンスとのキメラにある）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）およびモルフォリノアンチセンスを含む。
【0076】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、例えば、コードされたポリペプチドの産生が減少するように、Ｍｅｏｘ１のプロセシングまたは翻訳を特異的に低減するために使用され得る。ｓｉＲＮＡは、配列特異的様式において転写後遺伝子サイレンシングを仲介する。例えば、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ－ａｎｄ－Ｓｅｒｖｉｃｅｓ／Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｒｎａｉ．ｈｔｍｌのウェブサイトを参照されたい。いったんＲＮＡ誘導サイレンシング複合体に取り込まれると、ｓｉＲＮＡは、相同な内在性ｍＲＮＡ転写物の切断を、相同ｍＲＮＡ転写物へその複合体を誘導することによって仲介し、相同ｍＲＮＡ転写物はその後その複合体によって切断される。ｓｉＲＮＡは、Ｍｅｏｘ１ ｍＲＮＡ転写物の任意の領域に対して相同であり得る。相同な領域は、５０ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下の長さ、２５ヌクレオチド以下など、もしくは例えば約２１から２３ヌクレオチドの長さであり得る。ｓｉＲＮＡは典型的には二本鎖であり、２ヌクレオチドの３’オーバーハング、例えば３’オーバーハングＵＵジヌクレオチドを有し得る。ｓｉＲＮＡを設計する方法は利用可能であり、例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４－４９８（２００１）；Ｈａｒｂｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．１３：８３－１０６（２００３）を参照されたい。
【0077】
ヘアピンｓｉＲＮＡを発現するｐＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒＮｅｏベクターはＩＭＧＥＮＥＸ社（カリフォルニア州サンディエゴ）から市販されており、Ｍｅｏｘ１発現を阻害するためのｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡの作製に用いることが可能である。ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡの発現プラスミドの構築は、ｍＲＮＡの標的領域の選択を含み、これは試行錯誤を要するプロセスであり得る。しかしながら、Ｅｌｂａｓｈｉｒらは約８０％の確率で成功すると思われるガイドラインを提供する。Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００２．２６（２）：ｐ．１９９－２１３。したがって、合成ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡの合成のために、標的領域として好ましくは開始コドンの５０から１００ヌクレオチド下流が選択され得る。５’および３’非翻訳領域および開始コドンの近傍領域は、これらが調節タンパク質結合部位で豊富である可能性があるため、避けるべきである。ｓｉＲＮＡはＡＡで開始し、センスおよびアンチセンスのｓｉＲＮＡ鎖の両方について３’ＵＵオーバーハングを有し、約５０％のＧ／Ｃ含量を有し得る。合成ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡの配列の一例は５’－ＡＡ（Ｎ１９）ＵＵであり、ここでＮはそのｍＲＮＡ配列における任意のヌクレオチドであり、約５０％のＧ－Ｃ含量であるべきである。選択された配列は、ヒトゲノムデータベースで他と比較することで、他の既知のコード配列に対する相同性を最小化し得る（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトを通じたＢｌａｓｔ検索によって）。
【0078】
阻害性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、および／またはアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、化学的に合成されるか、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって作製されるか、発現ベクターもしくはＰＣＲ発現カセットから発現されてもよい。例えば、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ－ａｎｄ－Ｓｅｒｖｉｃｅｓ／Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｒｎａｉ．ｈｔｍｌのウェブサイトを参照されたい。
【0079】
ｓｉＲＮＡが発現ベクターもしくはＰＣＲ発現カセットから発現する場合、ｓｉＲＮＡをコードするインサートは、ｓｉＲＮＡヘアピンもしくはｓｈＲＮＡに折り畳まれるＲＮＡ転写物として発現し得る。したがって、ＲＮＡ転写物は、ヘアピンループを形成するスペーサー配列によって逆相補的アンチセンスｓｉＲＮＡ配列に連結されるセンスｓｉＲＮＡ配列と、３’末端の連続したＵとを含んでもよい。ヘアピンループは、任意の適切な長さ、例えば、３から３０ヌクレオチドの長さ、もしくは約３から２３ヌクレオチドの長さであってもよく、例えば、ＡＵＧ、ＣＣＣ、ＵＵＣＧ、ＣＣＡＣＣ、ＣＴＣＧＡＧ、ＡＡＧＣＵＵおよびＣＣＡＣＡＣＣを含む様々なヌクレオチド配列を含んでもよい。ｓｉＲＮＡはまた、直接的もしくはトランスジーンもしくはウイルスを介して導入された二本鎖ＲＮＡの切断によって、ｉｎ ｖｉｖｏで作製されてもよい。生物によっては、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによる増幅が生じ得る。
【0080】
短いヘアピンＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、もしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの阻害性核酸は、阻害性核酸の配列を含む発現ベクターもしくは発現カセットに由来する発現によるなどの方法を用いて調製され得る。あるいは、それは天然に存在するヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、またはそれらの任意の組み合わせを使用した化学合成によって調製されてもよい。いくつかの実施形態では、阻害性核酸は、例えば、阻害性核酸の生物学的な安定性を高めるために、もしくは阻害性核酸と標的Ｍｅｏｘ１核酸との間に形成される二本鎖の細胞内での安定性を高めるために設計された、修飾ヌクレオチドまたは非リン酸ジエステル結合から作製される。
【0081】
送達
阻害性核酸、ガイドＲＮＡ、ヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせを送達するための様々な方法がある。場合によっては、阻害性核酸、ガイドＲＮＡ、ヌクレアーゼ、もしくはそれらの組み合わせは対象に直接的に投与される。ほかの場合には、阻害性核酸、ガイドＲＮＡ、ヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせは、１つ以上の発現カセットまたは発現ベクターにコードされ、その発現カセット／ベクターが対象に投与され得る。したがって、阻害性核酸、ガイドＲＮＡ、ヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせは、発現カセット／発現ベクターからｉｎ ｖｉｖｏで発現し得る。
阻害性核酸、ガイドＲＮＡ、ヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせを送達するための様々な方法がある。場合によっては、阻害性核酸、ガイドＲＮＡ、ヌクレアーゼ、もしくはそれらの組み合わせは対象に直接的に投与される。ほかの場合には、阻害性核酸、ガイドＲＮＡ、ヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせは、１つ以上の発現カセットまたは発現ベクターにコードされ、その発現カセット／ベクターが対象に投与され得る。したがって、阻害性核酸、ガイドＲＮＡ、ヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせは、発現カセット／発現ベクターからｉｎ ｖｉｖｏで発現し得る。
【0082】
第１のそしておそらく最も容易なアプローチは、同一のベクターからのヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）をコードするベクターベースのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを用いることであり、これにより異なる構成要素の複数回のトランスフェクションを回避する。第２のアプローチは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡの混合物を送達することであり、第３の戦略は、Ｃａｓ９タンパク質およびｓｇＲＮＡの混合物を送達することである。
【0083】
場合によっては、ガイドＲＮＡは、細胞へ送達されるか、ガイドＲＮＡのうち１つ以上を発現し得る発現カセットまたはベクターの形態で対象へ投与され得る。ヌクレアーゼもまた細胞へ送達されるか、１つ以上のヌクレアーゼを発現し得る発現カセットもしくはベクターの形態で対象へ投与され得る。ヌクレアーゼはまたそれらの個別のｇＲＮＡと結合し、ＲＮＡ－タンパク質複合体（ＲＮＰ）として送達され得る。したがって、ＲＮＰは細胞外で事前に会合し細胞内へ導入され得る。
【0084】
阻害性核酸、ガイドＲＮＡは発現カセットまたはベクターから発現され得る。ヌクレアーゼも、１つ以上のｇＲＮＡとともに同一細胞において発現され得る。阻害性核酸、ガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼは、阻害性核酸、ガイドＲＮＡおよび／またはヌクレアーゼをコードする核酸分子の形態で導入され得る。このような核酸分子は、発現カセットまたは発現ベクターで提供され得る。
【0085】
発現カセットはベクター内に存在してもよい。ベクターは例えば、ウイルス、もしくは細胞によって容易に取り込まれるほかのベクターなどの発現ベクターであってもよい。使用され得るベクターの例としては、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子導入ベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、例えばサイトメガロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、水痘帯状疱疹ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、例えば、ヘルパー依存性アデノウイルスベクター、アデノウイルス－ＡＡＶハイブリッド、狂犬病ウイルスベクター、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）ベクター、コロナウイルスベクター、ポックスウイルスベクターなどが含まれる。非ウイルスベクター、例えば、リポソーム、ナノ粒子、マイクロ粒子、リポプレックス、ポリプレックス、ナノチューブなどが、発現ベクターの送達のために採用されてもよい。一実施形態において、例えば、それぞれ異なる阻害性核酸、ガイドＲＮＡ、異なるヌクレアーゼ、もしくはそれらの組み合わせをコードする２つ以上の発現ベクターが投与される。
【0086】
発現カセットまたは発現ベクターは、阻害性核酸、ガイドＲＮＡ、ヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせをコードする核酸セグメントに作動可能に連結されたプロモーター配列を含む。機能的な阻害性核酸、ガイドＲＮＡ、ヌクレアーゼまたはそれらの組み合わせの発現を確実にする方法として、トランスジーン、発現カセット、または発現ベクターからの発現が含まれ得る。例えば、選択された阻害性核酸、ガイドＲＮＡ、ヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせをコードする核酸セグメントは、ベクター、例えばプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、もしくは遺伝子工学に利用可能なその他のベクターなどに存在し得る。ベクターに挿入されたコード配列は、標準的な方法によって合成されてもよいし、天然の供給源から単離されてもよい。コード配列はさらに、転写調節エレメント、終結配列、および／またはその他のアミノ酸をコードする配列に連結されてもよい。このような調節配列は、転写の開始、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）（Ｏｗｅｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：１４７１－１４７６（２００１））、および任意で、転写終結および転写物安定化を確実にする調節エレメントを提供し得る。
【0087】
転写の開始を確実にする調節エレメントの非限定的な例として、翻訳開始コドン、例えばＳＶ４０エンハンサーなどの転写エンハンサー、インシュレーターおよび／またはプロモーターが含まれる。プロモーターは、構成的プロモーター、誘導的プロモーター、もしくは組織特異的プロモーターであり得る。使用され得るプロモーターの例として、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ｌａｃＺプロモーター、ニワトリベータアクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター（ニワトリベータアクチンプロモーターおよびサイトメガロウイルス即時型エンハンサーの組み合わせ）、ｇａｉ１０プロモーター、ヒト伸長因子１αプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーターＣａＭキナーゼプロモーター、ｌａｃ、ｔｒｐもしくはｔａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、オートグラファカリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）多面体プロモーター、または哺乳類およびその他の動物細胞内のグロビンイントロンが含まれ得る。転写終結を確実にする調節エレメントの非限定的な例として、Ｖ４０－ポリＡ部位、ｔｋ－ポリＡ部位、もしくはＳＶ４０、ｌａｃＺもしくはＡｃＭＮＰＶ多面体ポリアデニル化シグナルが含まれ、本発明の核酸配列の下流に含まれることになる。追加の調節エレメントは、翻訳エンハンサー、Ｋｏｚａｋ配列およびＲＮＡスプライシングのためのドナーおよびアクセプター部位に隣接した介在配列を含み得る。さらに、複製起点、薬剤耐性遺伝子もしくは調節因子（誘導性プロモーターの一部として）もまた、含まれてよい。
【0088】
発現カセットおよび／または発現ベクターは、細胞内に導入され得る。細胞は、任意の哺乳類もしくは鳥類の細胞であり得る。例えば、細胞は、ヒト細胞、もしくは家畜化された動物、動物園の動物、もしくは実験動物由来の細胞であり得る。
【0089】
細胞は、治療の必要性のある対象から得てもよい。細胞は対象に対して自家もしくは同種異系であり得る。場合によっては、細胞は線維芽細胞、筋線維芽細胞、心臓線維芽細胞、誘導多能性幹細胞、心臓前駆細胞、心筋細胞および／または心臓細胞であり得る。同種異系細胞は対象のそれと一致するように分類することができる。
【0090】
ガイドＲＮＡはまた、細胞へ導入されるか、ＲＮＡ－タンパク質複合体（ＲＮＰ）の形態で対象へ投与され得る。ヌクレアーゼは細胞への導入前に１つ以上のｇＲＮＡに前もって結合することができる。Ｃａｓ－ｇＲＮＡ複合体のＲＮＰ送達の利点は、ｅｘ ｖｉｖｏで容易に制御できる複合体形成であり、選択したＣａｓポリペプチドが選択したガイドＲＮＡと独立して複合化できるため、所望の複合体の構造および組成を確実に知ることができる。ＲＮＰは非常に安定で、ｇＲＮＡの明らかな交換はない。したがって、ヌクレアーゼ－ｇＲＮＡ ＲＮＰは、ゲノム編集の部位へ選択したｇＲＮＡを運ぶことができる。
【0091】
例えば、ＣａｓＲＮＰは、タンパク質に対してモル過剰のｇＲＮＡ（例えば、約１：１．１から１：１．４のタンパク質対ｇＲＮＡのモル比を用いて）を使用して、Ｃａｓタンパク質を選択したｇＲＮＡとともにインキュベートすることにより調製され得る。このようなインキュベーションの間に使用される緩衝液は、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール、および１ｍＭ ＴＣＥＰを含み得る。インキュベーションは、３７℃で約５分から約３０分（通常１０分で十分）でおこなわれてもよい。参照ＤＮＡもしくはＨＤＲテンプレートを使用する際に、それをＣａｓＲＮＰへ追加してもよい。
【0092】
細胞へＣａｓＲＮＰを導入するためにヌクレオフェクションが採用され得る。以下を参照されたい。Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｉｍｉｎｇ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｅｌｉｆｅ ３：ｅ０４７６６。例えば、ヌクレオフェクション反応は、約１０μｌから４０μｌのヌクレオフェクション試薬中約１×１０４個から１×１０７個の細胞を約５μから３０μｌのＲＮＰ：ＤＮＡと混合することを含み得る。いくつかの例において、２×１０５個の細胞を、約２０μｌのヌクレオフェクション試薬および約１０μｌのＲＮＰ：ＤＮＡと混合した。エレクトロポレーションの後、増殖培地を添加し、細胞を増殖および評価のために組織培養プレートへ移す。ヌクレオフェクション試薬および機器はＬｏｎｚａ社（ニュージャージー州アレンデール）より入手可能である。
【0093】
したがって、本発明は、心臓の状態および疾患を治療、抑制、もしくは予防する遺伝子治療ベクターなどの薬物療法に使用するための薬剤を提供する。
投与
ガイドＲＮＡ、もしくはガイドＲＮＡを発現し得る発現カセット／発現ベクターは対象へ投与され得る。改変された細胞（例えば、線維芽細胞）は、Ｍｅｏｘ１転写および／またはＭｅｏｘ１エンハンサー活性を低減し、対象へ投与もされ得る。本明細書に記載されるように作製される、ヒト患者もしくはその他の対象における心臓の状態および／または疾患の治療もしくは予防のために、このようなガイドＲＮＡ、発現カセット、発現ベクターおよび細胞が採用され得る。患者もしくは対象は、そのような治療を必要とすることがある。場合によっては、患者もしくは対象は、心臓の状態／疾患もしくはその他の医学的状態のいかなる症状もまだ示さないことがある。
投与
ガイドＲＮＡ、もしくはガイドＲＮＡを発現し得る発現カセット／発現ベクターは対象へ投与され得る。改変された細胞（例えば、線維芽細胞）は、Ｍｅｏｘ１転写および／またはＭｅｏｘ１エンハンサー活性を低減し、対象へ投与もされ得る。本明細書に記載されるように作製される、ヒト患者もしくはその他の対象における心臓の状態および／または疾患の治療もしくは予防のために、このようなガイドＲＮＡ、発現カセット、発現ベクターおよび細胞が採用され得る。患者もしくは対象は、そのような治療を必要とすることがある。場合によっては、患者もしくは対象は、心臓の状態／疾患もしくはその他の医学的状態のいかなる症状もまだ示さないことがある。
【0094】
ガイドＲＮＡ、発現カセット、発現ベクター、および細胞は、心臓組織などの特定の組織部位に取り込まれ、移植され、もしくはそこへ遊走することをそれらに可能とさせる方法で投与される。このようなガイドＲＮＡ、発現カセット、発現ベクター、および細胞は、心臓組織を含む組織の機能的に欠損した領域を再構成もしくは再生し得る。例えば、心臓組織へ細胞を投与するために適合され得る装置が利用可能である。
【0095】
治療のために、ガイドＲＮＡ、発現カセット、発現ベクター、および／または細胞（例えば、線維芽細胞、筋線維芽細胞、心臓細胞など）は局所的もしくは全身的に投与され得る。投与は、注射、カテーテル、植込み型デバイスなどによってなされてもよい。ガイドＲＮＡ、発現カセット、発現ベクター、および細胞は任意の生理学的に許容される賦形剤もしくは対象に悪影響を及ぼさない担体中で投与されてもよい。例えば、ガイドＲＮＡ、発現カセット、発現ベクター、および細胞は静脈内にもしくは心臓内経路を介して（例えば、心外膜もしくは心筋内に）投与され得る。ガイドＲＮＡ、発現カセット、発現ベクターおよび／または細胞を対象、特にヒト対象へ投与する方法は、ガイドＲＮＡ、発現カセット、発現ベクターおよび細胞の標的部位への注射または移植を含むか、もしくはそれらは発現カセット、発現ベクター、および細胞の導入、取り込み（ｕｐｔａｋｅ）、取り込み（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、または移植を容易にする送達デバイスに挿入され得る。このような送達デバイスは、カテーテルなど、レシピエント対象の体内に細胞、発現ベクター、および流体を導入するためのチューブを含む。チューブは、さらに、シリンジなどの針を含んでもよく、それを通して本発明の細胞が所望の位置で対象へ導入され得る。この方法を用いて複数回の注射をおこなってもよい。
【0096】
本明細書で使用される用語「溶液」は、その中で本発明のガイドＲＮＡ、発現カセット、発現ベクター、および細胞が生存能力および／または機能性を維持する担体もしくは希釈剤を含む。使用できる担体および希釈剤には、生理食塩水、水性緩衝液、溶媒および／または分散媒体が含まれ得る。そのような担体および希釈剤の使用は、当該技術分野において利用可能である。溶液は好ましくは、注射容易性が存在する程度に無菌であり流体である。
【0097】
ガイドＲＮＡ、発現カセット、発現ベクター、および細胞はまた、支持マトリックスに埋め込まれ得る。適切な成分には、ガイドＲＮＡ、発現カセット、発現ベクター、および改変細胞の接着の取り込みを支持または促進するマトリックスタンパク質が含まれる。別の実施形態において、組成物は生理学的に許容されるマトリックス足場を含んでもよい。このような生理学的に許容されるマトリックス足場は、再吸収可能および／または生分解性であり得る。
【0098】
場合によっては、心臓細胞はガイドＲＮＡおよび任意でヌクレアーゼを発現するように改変され得る。加えて、心臓細胞は、ガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼによって改変されることで、低下したＭｅｏｘ１発現および／または低下した少なくとも１つのＭｅｏｘ１調節エレメントの活性を有する改変細胞の集団を生成することができる。
【0099】
本明細書に記載された方法によって生成された改変細胞の集団は、低い割合の非線維芽細胞（例えば、その他の心臓細胞および／または内皮細胞）を含み得る。例えば、組成物中での使用および対象への投与のための改変細胞の集団は、約９０％未満の非線維芽細胞、約８５％未満の非線維芽細胞、約８０％未満の非線維芽細胞、約７５％未満の非線維芽細胞、約７０％未満の非線維芽細胞、約６５％未満の非線維芽細胞、約６０％未満の非線維芽細胞、約５５％未満の非線維芽細胞、約５０％未満の非線維芽細胞、約４５％未満の非線維芽細胞、約４０％未満の非線維芽細胞、約３５％未満の非線維芽細胞、約３０％未満の非線維芽細胞、約２５％未満の非線維芽細胞、約２０％未満の非線維芽細胞、約１５％未満の非線維芽細胞、約１２％未満の非線維芽細胞、約１０％未満の非線維芽細胞、約８％未満の非線維芽細胞、約６％未満の非線維芽細胞、約５％未満の非線維芽細胞、約４％未満の非線維芽細胞、約３％未満の非線維芽細胞、約２％未満の非線維芽細胞、約１％未満の非線維芽細胞を、細胞集団内の全細胞に対し有し得る。
【0100】
多くの細胞タイプは、対象内で再生および分化のために適切な部位へ遊走することが可能である。様々な治療投与レジメンの適合性および細胞組成物の用量を決定するために、線維芽細胞もしくはその他のタイプの細胞はまず、適切な動物モデルにおいて試験され得る。ある段階では、細胞はｉｎ ｖｉｖｏで生存しそれらの表現型を維持する能力について評価される。細胞はまた、それらがｉｎ ｖｉｖｏで患部もしくは損傷部位へ遊走するかどうかを確認するために、または、投与されるべき細胞の適切な数もしくは用量を決定するために、評価され得る。細胞組成物は、免疫不全動物（例えば、ヌードマウス、または化学的にもしくは放射線照射によって免疫不全状態にさせられた動物）へ投与され得る。組織は、再増殖の期間の後に採取され、投与された細胞またはその子孫がまだ存在しているか、生存しているか、および／または所望の、もしくは望ましくない位置に遊走したかどうかについて評価され得る。
【0101】
注入された線維芽細胞もしくはその他の細胞タイプは、様々な方法によって追跡することが可能である。例えば、検出可能な標識（例えば、緑色蛍光タンパク質、もしくはベータガラクトシダーゼ）を含むまたは発現する細胞は、容易に検出可能である。細胞は、ＢｒｄＵまたは［３Ｈ］－チミジン、もしくは緑色蛍光タンパク質、またはベータガラクトシダーゼを発現し得る発現カセットの導入により、予め標識することができる。あるいは、改変細胞は、試験に使用された動物によって発現されない細胞マーカー（例えば、実験動物へ細胞を注入する場合、ヒト特異的抗原）の発現によって検出することが可能である。投与された改変細胞の集団の存在および表現型は、蛍光顕微鏡によって（例えば、緑色蛍光タンパク質、もしくはベータガラクトシダーゼについて）、免疫組織化学（例えば、ヒト抗原に対する抗体の使用）によって、ＥＬＩＳＡ（ヒト抗原に対する抗体の使用）によって、もしくは心臓の表現型を示すＲＮＡに特異的な増幅を引き起こすプライマーおよびハイブリダイゼーション条件を使用するＲＴ－ＰＣＲ解析によって、評価され得る。
【0102】
改変細胞は、対象の疾患もしくは状態の程度に応じて様々な量で組成物に含まれ得る。例えば、組成物は、約１０３～約１０１２個の改変細胞、または約１０４～約１０１０個の改変細胞、または約１０５～１０８個の改変細胞を含む、局所的もしくは全身的投与のための液体形態で調製され得る。
【0103】
１つ以上のガイドＲＮＡを含むＲＮＰもしくは１つ以上のガイドＲＮＡ、ヌクレアーゼ、もしくはそれらの組み合わせを発現し得る発現ベクターはまた、細胞と共にまたは細胞なしで投与され得る。
【0104】
追加の細胞を伴うまたは伴わないガイドＲＮＡ、ヌクレアーゼ、および／またはＲＮＰは、単回投与として、複数回投与で、連続的または断続的な方法で、例えば、レシピエントの生理学的状態に依存して、投与の目的がストレス性の事象に応答するか、より持続した治療目的のためであるかに応じて、および当業者に知られているその他の要因に応じて、組成物中で投与されてもよい。本発明の組成物の投与は、単回投与として、もしくは予め選択された期間にわたって原則的に連続的であってもよいし、間隔を置いた一連の投与であってもよい。局所および全身投与の両方が考えられる。
【0105】
治療において使用されるガイドＲＮＡ、ヌクレアーゼ、ＲＮＰ、および／または細胞の量は、選択された特定の担体によって変化し得るだけでなく、投与経路、治療される状態の性質および患者の年齢および状態によっても変化し得ることが理解されるであろう。最終的には、付き添いの医療ケア提供者が適切な用量を決定してもよい。
【0106】
以下の実施例では、本発明の開発に関連する研究の一部を示す。本発明者らによる以下の刊行物ではさらなる詳細を提供する：Ａｌｅｘａｎｉａｎら（Ａ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｓｗｉｔｃｈ Ｇｏｖｅｒｎｉｎｇ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ Ｕｎｄｅｒｌｉｅｓ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｈｅａｒｔ Ｄｉｓｅａｓｅ，ｂｉｏＲｘｉｖ（Ｊｕｌｙ ２０２０）ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０７．２１．２１４８７４，全体を参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【0107】
実施例１：材料および方法
この実施例では、本発明の開発において使用された材料および方法のいくつかを記載する。
この実施例では、本発明の開発において使用された材料および方法のいくつかを記載する。
【0108】
動物モデル
動物使用に関するすべてのプロトコルは、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ）によって承認され、実験動物の管理と使用に関する国立衛生研究所ガイド（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）に厳密に従って実施された。年齢を合わせたオスのＣ５７Ｂ１／６Ｊを使用して研究は実施された。マウスは、温度および湿度が管理された病原体のない施設で、１２時間の明暗サイクルで飼育された。
動物使用に関するすべてのプロトコルは、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ）によって承認され、実験動物の管理と使用に関する国立衛生研究所ガイド（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）に厳密に従って実施された。年齢を合わせたオスのＣ５７Ｂ１／６Ｊを使用して研究は実施された。マウスは、温度および湿度が管理された病原体のない施設で、１２時間の明暗サイクルで飼育された。
【0109】
ＪＱ１の調製
ＪＱ１は、Ｆｉｌｉｐｐａｋｏｐｏｕｌｏｓら（Ｎａｔｕｒｅ４６８，１０６７－１０７３（２０１０））によって記載されているように、Ｊｕｎ Ｑｉの研究室（Ｄａｎａ－Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）において合成および精製された。ｉｎ ｖｉｖｏ実験では、保存溶液［ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に５０ｍｇ／ｍｌのＪＱ１］を激しいボルテックス処理を用いて水性担体（１０％ヒドロキシプロピルｂ－シクロデキストリン；Ｓｉｇｍａ Ｃ０９２６）中で作業濃度の５ｍｇ／ｍｌに希釈した。マウスに５０ｍｇ／ｋｇの用量で、１日１回腹腔内に注入した。ビヒクル対照は、１０％ヒドロキシプロピルｂ－シクロデキストリン担体溶液に溶解した等量のＤＭＳＯであった。すべての溶液を、滅菌技術を使用し調製および投与した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では、ＪＱ１をＤＭＳＯに溶解し終濃度５００ｎＭで細胞へ投与し、等量のＤＭＳＯを対照として使用した。
ＪＱ１は、Ｆｉｌｉｐｐａｋｏｐｏｕｌｏｓら（Ｎａｔｕｒｅ４６８，１０６７－１０７３（２０１０））によって記載されているように、Ｊｕｎ Ｑｉの研究室（Ｄａｎａ－Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）において合成および精製された。ｉｎ ｖｉｖｏ実験では、保存溶液［ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に５０ｍｇ／ｍｌのＪＱ１］を激しいボルテックス処理を用いて水性担体（１０％ヒドロキシプロピルｂ－シクロデキストリン；Ｓｉｇｍａ Ｃ０９２６）中で作業濃度の５ｍｇ／ｍｌに希釈した。マウスに５０ｍｇ／ｋｇの用量で、１日１回腹腔内に注入した。ビヒクル対照は、１０％ヒドロキシプロピルｂ－シクロデキストリン担体溶液に溶解した等量のＤＭＳＯであった。すべての溶液を、滅菌技術を使用し調製および投与した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では、ＪＱ１をＤＭＳＯに溶解し終濃度５００ｎＭで細胞へ投与し、等量のＤＭＳＯを対照として使用した。
【0110】
横大動脈狭窄のマウスモデル、人工エコーおよび線維化の定量化
すべてのマウスは、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙからの８～１０週齢のオスのＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスであった（ストックナンバー：０００６６４）。手術中の体温（３７℃）の維持を助けるため、マウスを温度調節された小動物手術台に置いた。マウスをイソフルランで麻酔し、人工呼吸器を装着し（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）、そして開胸術をおこなった。横大動脈狭窄（ＴＡＣ）の手術では、Ａｎａｎｄ（Ｃｅｌｌ １５４：５６９－５８２（２０１３））に記載されているように、７－０絹縫合糸および２５ゲージ針を用いて、大動脈弓を左総頸動脈と腕頭動脈の間で狭窄した。ＪＱ１（５０ｍｇ／ｋｇ／日）もしくはビヒクルの腹腔内注入を、ＴＡＣ手術の１８日後に施し図２Ｂで記載するように継続した。偽（Ｓｈａｍ）手術のため、開胸術を上記のようにおこない、大動脈をさらなる介入なしに外科的に露出した。心エコー検査のため、マウスを１％吸入イソフルランで麻酔し、Ｖｅｖｏ ３１００ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＦｕｊｉＦｉｌｍ ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ社）およびＭＸ５５０Ｓプローブを用いて画像化した。Ａｎａｎｄ（２０１３）に記載されているように、Ｍモードサンプリングおよび中乳頭レベルでの心室（ＬＶ）短軸で取得した統合心電図ゲートキロヘルツ可視化（ＥＫＶ）画像から、測定値を得た。Ａｎａｎｄ（２０１３）に記載されているように、拡張末期および収縮末期における高解像度二次元測定より、左心室面積および駆出率を得た。ＴＡＣ ＪＱ１およびＴＡＣ ＪＱ１休薬動物における線維化の定量化のために、マウスをＴＡＣ後６２日で安楽死させた。左心室尖部への２２．５Ｇ針の導入を介した１０ｍｌのＰＢＳでの潅流および右心房の切り取り後、心臓を外植した。心臓をＰＢＳで洗浄し２％ＰＦＡで一晩固定した後、段階的に１００％エタノールまで脱水した。パラフィン包埋のために、心臓を自動化されたシステムで、一連の、ＰＢＳ洗浄、濃度上昇系列のアルコール（Ａｇａ）、Ｃｌｅａｒ Ｒｉｔｅ ３（商標）（Ｒｉｃｈａｒｄ－Ａｌｌａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および５６℃でのＳｈａｎｄｏｎ Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により処理した。心臓をパラフィンに包埋し横方向に切断した（３μｍ切片）。心房の基部から尖部までの心室の異なるＺ位置を代表する切片を脱脂し、再水和し、製造業者のプロトコルにしたがってピクロシリウスレッド染色（ａｂ１５０６８１）をおこなった。切片はキシレン中で透明化され（ｄｉａｐｈａｎｉｚｅｄ）、組織学的検査のためＤＰＸ Ｍｏｕｎｔａｎｔ中にマウントした（０６５２２、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。画像を４倍の対物レンズが付属しているＬｅｉｃａ ＤＭｉ８ Ｗｉｄｅｆｉｅｌｄで取得しＦＩＪＩソフトウェアを使用して解析した。Ｆｉｊｉでは、画像を、赤、緑、および青のチャンネルに分離し、線維化および全組織切片面積をそれぞれ、緑と青のチャンネルへ閾値ツールを使用して測定した。線維化の割合を全組織切片面積に対して正規化し、動物ごとに全部で２４切片の解析をおこなった。Ｐｒｉｓｍ８を用いてデータの統計的解析をおこない、ｐ＜０．０５で統計的有意性を決定した。テューキーの多重比較検定を適用した。正規性はダゴスティーノ－ピアソンオムニバス正規性検定では証明されなかったため、Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓａｍｐｌｅｓ Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を利用した。盲検法（英数字コードによる試料の標識）を線維化解析のために実施した。
すべてのマウスは、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙからの８～１０週齢のオスのＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスであった（ストックナンバー：０００６６４）。手術中の体温（３７℃）の維持を助けるため、マウスを温度調節された小動物手術台に置いた。マウスをイソフルランで麻酔し、人工呼吸器を装着し（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）、そして開胸術をおこなった。横大動脈狭窄（ＴＡＣ）の手術では、Ａｎａｎｄ（Ｃｅｌｌ １５４：５６９－５８２（２０１３））に記載されているように、７－０絹縫合糸および２５ゲージ針を用いて、大動脈弓を左総頸動脈と腕頭動脈の間で狭窄した。ＪＱ１（５０ｍｇ／ｋｇ／日）もしくはビヒクルの腹腔内注入を、ＴＡＣ手術の１８日後に施し図２Ｂで記載するように継続した。偽（Ｓｈａｍ）手術のため、開胸術を上記のようにおこない、大動脈をさらなる介入なしに外科的に露出した。心エコー検査のため、マウスを１％吸入イソフルランで麻酔し、Ｖｅｖｏ ３１００ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＦｕｊｉＦｉｌｍ ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ社）およびＭＸ５５０Ｓプローブを用いて画像化した。Ａｎａｎｄ（２０１３）に記載されているように、Ｍモードサンプリングおよび中乳頭レベルでの心室（ＬＶ）短軸で取得した統合心電図ゲートキロヘルツ可視化（ＥＫＶ）画像から、測定値を得た。Ａｎａｎｄ（２０１３）に記載されているように、拡張末期および収縮末期における高解像度二次元測定より、左心室面積および駆出率を得た。ＴＡＣ ＪＱ１およびＴＡＣ ＪＱ１休薬動物における線維化の定量化のために、マウスをＴＡＣ後６２日で安楽死させた。左心室尖部への２２．５Ｇ針の導入を介した１０ｍｌのＰＢＳでの潅流および右心房の切り取り後、心臓を外植した。心臓をＰＢＳで洗浄し２％ＰＦＡで一晩固定した後、段階的に１００％エタノールまで脱水した。パラフィン包埋のために、心臓を自動化されたシステムで、一連の、ＰＢＳ洗浄、濃度上昇系列のアルコール（Ａｇａ）、Ｃｌｅａｒ Ｒｉｔｅ ３（商標）（Ｒｉｃｈａｒｄ－Ａｌｌａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および５６℃でのＳｈａｎｄｏｎ Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により処理した。心臓をパラフィンに包埋し横方向に切断した（３μｍ切片）。心房の基部から尖部までの心室の異なるＺ位置を代表する切片を脱脂し、再水和し、製造業者のプロトコルにしたがってピクロシリウスレッド染色（ａｂ１５０６８１）をおこなった。切片はキシレン中で透明化され（ｄｉａｐｈａｎｉｚｅｄ）、組織学的検査のためＤＰＸ Ｍｏｕｎｔａｎｔ中にマウントした（０６５２２、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。画像を４倍の対物レンズが付属しているＬｅｉｃａ ＤＭｉ８ Ｗｉｄｅｆｉｅｌｄで取得しＦＩＪＩソフトウェアを使用して解析した。Ｆｉｊｉでは、画像を、赤、緑、および青のチャンネルに分離し、線維化および全組織切片面積をそれぞれ、緑と青のチャンネルへ閾値ツールを使用して測定した。線維化の割合を全組織切片面積に対して正規化し、動物ごとに全部で２４切片の解析をおこなった。Ｐｒｉｓｍ８を用いてデータの統計的解析をおこない、ｐ＜０．０５で統計的有意性を決定した。テューキーの多重比較検定を適用した。正規性はダゴスティーノ－ピアソンオムニバス正規性検定では証明されなかったため、Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓａｍｐｌｅｓ Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を利用した。盲検法（英数字コードによる試料の標識）を線維化解析のために実施した。
【0111】
ランゲンドルフ潅流およびその後のシングルセルＲＮＡおよびＡＴＡＣｓｅｑのための細胞と核の単離
Ｌｉら（Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．（２０１４））に記載されたものに変更を加えて、マウスの心臓からの細胞単離をおこなった。簡潔に述べると、適切な麻酔レベルに達した後、開胸術をおこない、マウスの心臓を単離した。単離した心臓にカニューレを挿入し、ランゲンドルフ潅流システム（Ｒａｄｎｏｔｉ １２０１０８ＥＺ）で３７℃で５～１０分の間、潅流緩衝液（１２０．４ｍＭ ＮａＣｌ、１４．７ｍＭ ＫＣｌ、０．６ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．６ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ Ｎａ－ＨＥＰＥＳ、４．６ｍＭ ＮａＨＣＯ３、３０ｍＭタウリン、１０ｍＭ２，３－ブタンジオンモノオキシム、および５．５ｍＭグルコース、ｐＨ７．０）で潅流した。カニューレ挿入した心臓を、その後、３７℃で約１０分間、消化緩衝液（３００ユニット／ｍＬのコラゲナーゼＩＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）および５０μＭ ＣａＣｌ２を含む潅流緩衝液）によって消化した。消化の終わりに、心房と大血管を除去し、心室組織を３７℃で停止緩衝液（１０％胎仔ウシ血清を含む潅流緩衝液）中に移し、穏やかに小片に裂いた。穏やかなピペッティングの後、細胞懸濁液をファルコンチューブ内で、その後室温（ＲＴ）で３０×ｇで３分間、２５０μＭの濾過器に通した。次いで、上清（ほとんどの非（ｎｏｎ－）心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ、ＣＭ）を含む）をペレット（ＣＭ画分を含む）から分離した。非ＣＭ画分を再び、３０×ｇで３分間室温で遠心分離し、上清を保存した。その後、上清を細胞濾過器（７０μｍ）を用いて濾過し、最終的に４００×ｇで３分間室温で遠心分離しデブリを除去した。非ＣＭペレットを最終的に１ｍＬの冷ＰＢＳ ０．５％ＢＳＡに再懸濁した。血球計数器を使用しトリパンブルーで３万個の細胞を数え、次いでその後の１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ（登録商標）シングルセルＲＮＡｓｅｑ調製に使用した。シングルセルＡＴＡＣについては、単離され精製された５０万個の非ＣＭを１００μＬの溶解緩衝液（ヌクレアーゼフリー水中にＴｒｉｓ－ＨＣｌ １０ｍＭ ｐＨ７．４、ＮａＣｌ １０ｍＭ、ＭｇＣｌ２ ３ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０ ０．１％、Ｐ４０ ０．１％、ジギトニン ０．０１％、ＢＳＡ １％）に再懸濁し、１０回のピペッティングをし５分間氷上に静置した。その後、核を１％ＢＳＡを含む１ｍＬの１×ＰＢＳで洗浄し、その後４℃で５分間遠心分離した。核ペレットを、１％ＢＳＡを含む１ｍＬの１×ＰＢＳに再懸濁し、１０μＭの濾過器（ｐｌｕｒｉＳｅｌｅｃｔ ＃４３－５００１０－００）を用いて濾過した。その後、核を血球計数器を使用しＤＡＰＩで数え、最終的に３万個の非ＣＭ核をその後の１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ（登録商標）シングルセルＡＴＡＣｓｅｑ調製に使用した。最初の遠心分離後、ＣＭ画分を再び停止緩衝液中で３０×ｇで３分間室温で遠心分離し、上清を廃棄した。最終的にＣＭペレットを停止緩衝液中で４００×ｇで３分間室温で遠心分離し、その後上清を廃棄し、細胞ペレットをその後のＲＮＡ抽出のためにＱｉａｚｏｌ（登録商標）（ｍｉＲＮｅａｓｙキット－Ｑｉａｇｅｎ）中に溶解した。
Ｌｉら（Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．（２０１４））に記載されたものに変更を加えて、マウスの心臓からの細胞単離をおこなった。簡潔に述べると、適切な麻酔レベルに達した後、開胸術をおこない、マウスの心臓を単離した。単離した心臓にカニューレを挿入し、ランゲンドルフ潅流システム（Ｒａｄｎｏｔｉ １２０１０８ＥＺ）で３７℃で５～１０分の間、潅流緩衝液（１２０．４ｍＭ ＮａＣｌ、１４．７ｍＭ ＫＣｌ、０．６ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．６ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ Ｎａ－ＨＥＰＥＳ、４．６ｍＭ ＮａＨＣＯ３、３０ｍＭタウリン、１０ｍＭ２，３－ブタンジオンモノオキシム、および５．５ｍＭグルコース、ｐＨ７．０）で潅流した。カニューレ挿入した心臓を、その後、３７℃で約１０分間、消化緩衝液（３００ユニット／ｍＬのコラゲナーゼＩＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）および５０μＭ ＣａＣｌ２を含む潅流緩衝液）によって消化した。消化の終わりに、心房と大血管を除去し、心室組織を３７℃で停止緩衝液（１０％胎仔ウシ血清を含む潅流緩衝液）中に移し、穏やかに小片に裂いた。穏やかなピペッティングの後、細胞懸濁液をファルコンチューブ内で、その後室温（ＲＴ）で３０×ｇで３分間、２５０μＭの濾過器に通した。次いで、上清（ほとんどの非（ｎｏｎ－）心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ、ＣＭ）を含む）をペレット（ＣＭ画分を含む）から分離した。非ＣＭ画分を再び、３０×ｇで３分間室温で遠心分離し、上清を保存した。その後、上清を細胞濾過器（７０μｍ）を用いて濾過し、最終的に４００×ｇで３分間室温で遠心分離しデブリを除去した。非ＣＭペレットを最終的に１ｍＬの冷ＰＢＳ ０．５％ＢＳＡに再懸濁した。血球計数器を使用しトリパンブルーで３万個の細胞を数え、次いでその後の１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ（登録商標）シングルセルＲＮＡｓｅｑ調製に使用した。シングルセルＡＴＡＣについては、単離され精製された５０万個の非ＣＭを１００μＬの溶解緩衝液（ヌクレアーゼフリー水中にＴｒｉｓ－ＨＣｌ １０ｍＭ ｐＨ７．４、ＮａＣｌ １０ｍＭ、ＭｇＣｌ２ ３ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０ ０．１％、Ｐ４０ ０．１％、ジギトニン ０．０１％、ＢＳＡ １％）に再懸濁し、１０回のピペッティングをし５分間氷上に静置した。その後、核を１％ＢＳＡを含む１ｍＬの１×ＰＢＳで洗浄し、その後４℃で５分間遠心分離した。核ペレットを、１％ＢＳＡを含む１ｍＬの１×ＰＢＳに再懸濁し、１０μＭの濾過器（ｐｌｕｒｉＳｅｌｅｃｔ ＃４３－５００１０－００）を用いて濾過した。その後、核を血球計数器を使用しＤＡＰＩで数え、最終的に３万個の非ＣＭ核をその後の１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ（登録商標）シングルセルＡＴＡＣｓｅｑ調製に使用した。最初の遠心分離後、ＣＭ画分を再び停止緩衝液中で３０×ｇで３分間室温で遠心分離し、上清を廃棄した。最終的にＣＭペレットを停止緩衝液中で４００×ｇで３分間室温で遠心分離し、その後上清を廃棄し、細胞ペレットをその後のＲＮＡ抽出のためにＱｉａｚｏｌ（登録商標）（ｍｉＲＮｅａｓｙキット－Ｑｉａｇｅｎ）中に溶解した。
【0112】
精製心筋細胞におけるバルクＲＮＡシーケンシング
ＣＭ由来のトータルＲＮＡを、製造者の指示に従い、ｍｉＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量化した。バイオアナライザーＡｇｉｌｅｎｔ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたＲＮＡ品質管理後、Ｇｌａｄｓｔｏｎｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ ｃｏｒｅのｏｖａｔｉｏｎ ＲＮＡ－ｓｅｑユニバーサルキット（ＮｕＧＥＮ；鎖特異的）を用いて、Ｓｈａｍ（×３）、ＴＡＣ－Ｖｅｈ（×３）およびＴＡＣ－ＪＱ１（×３）の９試料について、ペアードエンドポリ（Ａ）濃縮ＲＮＡライブラリを調製した。ハイスループットシーケンシングをＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）５００装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でＰＥ７５ランを使用しておこなった。リード結果をＳＴＡＲ（ｖ２．７．３ａ）を用いてｍｍ１０参照マウスゲノムに対してマッピングし、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子に割り当てた。本発明者らは、ロー（ｒａｗ）カウントを用いて遺伝子発現を定量化し、試料全体で平均ＦＰＫＭ値が＞０．５ ＦＰＫＭを示したタンパク質コード遺伝子を保持した。ここでＦＰＫＭは、マッピングされた１００万のリードあたりの１キロベースの転写物あたりのフラグメント（ｔｈｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｐｅｄ ｒｅａｄｓ）である。次に本発明者らは、ＤＥＳｅｑ２（ｖ．１．２４．０ Ｒ ｐａｃｋａｇｅ、Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１５、５５０（２０１４）を参照のこと）のデフォルト設定を用いて、差次的遺伝子発現検定を実施した。統計的有意性を５％偽陽性率（ＦＤＲ；Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ）に設定した。
ＣＭ由来のトータルＲＮＡを、製造者の指示に従い、ｍｉＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量化した。バイオアナライザーＡｇｉｌｅｎｔ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたＲＮＡ品質管理後、Ｇｌａｄｓｔｏｎｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ ｃｏｒｅのｏｖａｔｉｏｎ ＲＮＡ－ｓｅｑユニバーサルキット（ＮｕＧＥＮ；鎖特異的）を用いて、Ｓｈａｍ（×３）、ＴＡＣ－Ｖｅｈ（×３）およびＴＡＣ－ＪＱ１（×３）の９試料について、ペアードエンドポリ（Ａ）濃縮ＲＮＡライブラリを調製した。ハイスループットシーケンシングをＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）５００装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でＰＥ７５ランを使用しておこなった。リード結果をＳＴＡＲ（ｖ２．７．３ａ）を用いてｍｍ１０参照マウスゲノムに対してマッピングし、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子に割り当てた。本発明者らは、ロー（ｒａｗ）カウントを用いて遺伝子発現を定量化し、試料全体で平均ＦＰＫＭ値が＞０．５ ＦＰＫＭを示したタンパク質コード遺伝子を保持した。ここでＦＰＫＭは、マッピングされた１００万のリードあたりの１キロベースの転写物あたりのフラグメント（ｔｈｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｐｅｄ ｒｅａｄｓ）である。次に本発明者らは、ＤＥＳｅｑ２（ｖ．１．２４．０ Ｒ ｐａｃｋａｇｅ、Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１５、５５０（２０１４）を参照のこと）のデフォルト設定を用いて、差次的遺伝子発現検定を実施した。統計的有意性を５％偽陽性率（ＦＤＲ；Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ）に設定した。
【0113】
シングルセルトランスクリプトームライブラリの調製、シーケンシング、および処理
非ＣＭ細胞懸濁液（２×Ｓｈａｍ、２×ＴＡＣ－Ｖｅｈ、２×ＴＡＣ－ＪＱ１および２×ＴＡＣ－ＪＱ１休薬）由来のシングルセル液滴ライブラリ（図２Ｃ）をＣｈｒｏｍｉｕｍ（登録商標）シングルセル３’Ｒｅａｇｅｎｔキットｖ．２ユーザーガイド内の製造者の指示に従って、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ（登録商標）コントローラで作製した。ライブラリ調製に使用された追加の要素として、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ（登録商標）シングルセル３’ライブラリとゲルビーズキットｖ．２（ＰＮ－１２０２３７）およびＣｈｒｏｍｉｕｍ（登録商標）シングルセル３’Ｃｈｉｐキットｖ．２（ＰＮ－１２０２３６）が含まれる。Ｃｈｒｏｍｉｕｍ（登録商標）シングルセル３’ライブラリとゲルビーズキットｖ．２（ＰＮ－１２０２３７）およびＣｈｒｏｍｉｕｍ（登録商標）ｉ７マルチプレックスキット（ＰＮ－１２０２６２）を用いて製造者の指示に従ってライブラリを調製した。品質管理のランのためにＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で、その後より深度のあるシーケンシングのためにＮｏｖａＳｅｑ（登録商標）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で、最終的なライブラリをシーケンシングした。８試料をすべてプールし、単一のレーンでシーケンシングした。Ｃｈｒｏｍｉｕｍ（登録商標）シングルセルｖ．２の仕様に従って、シーケンシングパラメーターを選択した。細胞あたりの整列されたリードの総数が少なくとも５０，０００の平均リード深度となるように、すべてのライブラリをシーケンシングした。ロー（ｒａｗ）シーケンシングリードを１０Ｘ ＧｅｎｏｍｉｃｓのＣｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒ ｖ．２．２．０パイプラインを用いて処理した。簡潔に述べると、リードをデマルチプレックスし、マウスｍｍ１０ゲノムに対してアライメントし、観察された転写物の絶対数（ＵＭＩカウント）を細胞あたり遺伝子あたりで定量化することで、遺伝子－バーコードマトリックスを作成した。８試料由来のデータを集約し同じシーケンシング深度へ正規化した結果、すべての試料の統合された遺伝子－バーコードマトリックスを得た。
非ＣＭ細胞懸濁液（２×Ｓｈａｍ、２×ＴＡＣ－Ｖｅｈ、２×ＴＡＣ－ＪＱ１および２×ＴＡＣ－ＪＱ１休薬）由来のシングルセル液滴ライブラリ（図２Ｃ）をＣｈｒｏｍｉｕｍ（登録商標）シングルセル３’Ｒｅａｇｅｎｔキットｖ．２ユーザーガイド内の製造者の指示に従って、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ（登録商標）コントローラで作製した。ライブラリ調製に使用された追加の要素として、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ（登録商標）シングルセル３’ライブラリとゲルビーズキットｖ．２（ＰＮ－１２０２３７）およびＣｈｒｏｍｉｕｍ（登録商標）シングルセル３’Ｃｈｉｐキットｖ．２（ＰＮ－１２０２３６）が含まれる。Ｃｈｒｏｍｉｕｍ（登録商標）シングルセル３’ライブラリとゲルビーズキットｖ．２（ＰＮ－１２０２３７）およびＣｈｒｏｍｉｕｍ（登録商標）ｉ７マルチプレックスキット（ＰＮ－１２０２６２）を用いて製造者の指示に従ってライブラリを調製した。品質管理のランのためにＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で、その後より深度のあるシーケンシングのためにＮｏｖａＳｅｑ（登録商標）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で、最終的なライブラリをシーケンシングした。８試料をすべてプールし、単一のレーンでシーケンシングした。Ｃｈｒｏｍｉｕｍ（登録商標）シングルセルｖ．２の仕様に従って、シーケンシングパラメーターを選択した。細胞あたりの整列されたリードの総数が少なくとも５０，０００の平均リード深度となるように、すべてのライブラリをシーケンシングした。ロー（ｒａｗ）シーケンシングリードを１０Ｘ ＧｅｎｏｍｉｃｓのＣｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒ ｖ．２．２．０パイプラインを用いて処理した。簡潔に述べると、リードをデマルチプレックスし、マウスｍｍ１０ゲノムに対してアライメントし、観察された転写物の絶対数（ＵＭＩカウント）を細胞あたり遺伝子あたりで定量化することで、遺伝子－バーコードマトリックスを作成した。８試料由来のデータを集約し同じシーケンシング深度へ正規化した結果、すべての試料の統合された遺伝子－バーコードマトリックスを得た。
【0114】
トランスクリプトーム解析のための細胞フィルタリングおよび細胞タイプクラスタリング
我々の８試料から採取した３５，５５１個の細胞からトランスクリプトームをシーケンシングした（図２Ｃ）。これらの細胞のフィルタリングおよびクラスタリング解析をＳｅｕｒａｔ ｖ．２．２Ｒパッケージを用いて実施した。細胞を細胞あたりおよび総発現量あたりの発現遺伝子について正規化し、その後１０，０００のスケールファクターで乗じ、対数変換をおこなった。低品質の細胞は我々の解析から除外した。これは、遺伝子が４，０００超かつ１，０００未満の細胞、およびミトコンドリア遺伝子の高い割合（０．２％超）を有する細胞を除外することにより達成した。フィルタリングステップに続いて、我々はデータを正規化し（ＮｏｒｍａｌｉｚｅＤａｔａ関数、１０，０００のデフォルトスケール係数）、すべての遺伝子に対し線形回帰をおこなった（ＳｃａｌｅＤａｔａ関数）。その後、本発明者らは、線形次元削減（ＲｕｎＰＣＡ関数）を実施した。有意な主成分を下流のグラフに基づく別個の集団への半教師なしクラスタリングに使用し（ＦｉｎｄＣｌｕｓｔｅｒｓ関数）、均一多様体近似と投影（ＵＭＡＰ）（Ｂｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３７：３８－４４（２０１８））次元削減を、二次元中に細胞集団を投影するために使用した。クラスタリングについては、解像度パラメーターをＳｅｕｒａｔのガイドラインに従って、細胞数に基づいて近似した；解像度パラメーターのベクターをＦｉｎｄＣｌｕｓｔｅｒｓ関数に通し、別個のマーカー遺伝子発現を有する識別可能なクラスターを確立する最適な解像度を選択した。本発明者らは、主要な成体心臓の非ＣＭ細胞集団を表す合計９つのクラスターを得た。各クラスターを駆動するマーカー遺伝子を同定するために、基となる負の二項分布（ｎｅｇｂｉｎｏｍ）を仮定した尤度比検定を用い、差次的遺伝子発現について、クラスターをペアワイズで比較した（ＦｉｎｄＡｌｌＭａｒｋｅｒｓ関数）。その後、本発明者らは、線維芽細胞（クラスター０）、骨髄（クラスター１）および内皮（クラスター２および３）集団についての次の解析のために、特定のクラスターを単離した（ＷｈｉｃｈＣｅｌｌｓ関数）。関数ｄｉｆｆＥｘｐ＝ＦｉｎｄＭａｒｋｅｒｓを用いて３つの主要な細胞集団における試料間の差次的遺伝子解析をおこなった。異なる試料間の遺伝子発現データの可視化のため、いくつかのＳｅｕｒａｔ機能を使用した：ＦｅａｔｕｒｅＰｌｏｔ、ＶｌｎＰｌｏｔおよびＤｏｔＰｌｏｔである。正規化された発現スコアを計算するため、特定の遺伝子セットをＳｅｕｒａｔオブジェクトへ渡しスコアを生成した。すべての線維芽細胞において遺伝子特徴スコアを解析するため、本発明者らは、各細胞における所与の遺伝子について平均スケール化およびＺスコア正規化した遺伝子発現を集約した（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １７：８３３－８４３（２０２０））。その後、得られたスコアをバイオリンプロットにプロットした。
我々の８試料から採取した３５，５５１個の細胞からトランスクリプトームをシーケンシングした（図２Ｃ）。これらの細胞のフィルタリングおよびクラスタリング解析をＳｅｕｒａｔ ｖ．２．２Ｒパッケージを用いて実施した。細胞を細胞あたりおよび総発現量あたりの発現遺伝子について正規化し、その後１０，０００のスケールファクターで乗じ、対数変換をおこなった。低品質の細胞は我々の解析から除外した。これは、遺伝子が４，０００超かつ１，０００未満の細胞、およびミトコンドリア遺伝子の高い割合（０．２％超）を有する細胞を除外することにより達成した。フィルタリングステップに続いて、我々はデータを正規化し（ＮｏｒｍａｌｉｚｅＤａｔａ関数、１０，０００のデフォルトスケール係数）、すべての遺伝子に対し線形回帰をおこなった（ＳｃａｌｅＤａｔａ関数）。その後、本発明者らは、線形次元削減（ＲｕｎＰＣＡ関数）を実施した。有意な主成分を下流のグラフに基づく別個の集団への半教師なしクラスタリングに使用し（ＦｉｎｄＣｌｕｓｔｅｒｓ関数）、均一多様体近似と投影（ＵＭＡＰ）（Ｂｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３７：３８－４４（２０１８））次元削減を、二次元中に細胞集団を投影するために使用した。クラスタリングについては、解像度パラメーターをＳｅｕｒａｔのガイドラインに従って、細胞数に基づいて近似した；解像度パラメーターのベクターをＦｉｎｄＣｌｕｓｔｅｒｓ関数に通し、別個のマーカー遺伝子発現を有する識別可能なクラスターを確立する最適な解像度を選択した。本発明者らは、主要な成体心臓の非ＣＭ細胞集団を表す合計９つのクラスターを得た。各クラスターを駆動するマーカー遺伝子を同定するために、基となる負の二項分布（ｎｅｇｂｉｎｏｍ）を仮定した尤度比検定を用い、差次的遺伝子発現について、クラスターをペアワイズで比較した（ＦｉｎｄＡｌｌＭａｒｋｅｒｓ関数）。その後、本発明者らは、線維芽細胞（クラスター０）、骨髄（クラスター１）および内皮（クラスター２および３）集団についての次の解析のために、特定のクラスターを単離した（ＷｈｉｃｈＣｅｌｌｓ関数）。関数ｄｉｆｆＥｘｐ＝ＦｉｎｄＭａｒｋｅｒｓを用いて３つの主要な細胞集団における試料間の差次的遺伝子解析をおこなった。異なる試料間の遺伝子発現データの可視化のため、いくつかのＳｅｕｒａｔ機能を使用した：ＦｅａｔｕｒｅＰｌｏｔ、ＶｌｎＰｌｏｔおよびＤｏｔＰｌｏｔである。正規化された発現スコアを計算するため、特定の遺伝子セットをＳｅｕｒａｔオブジェクトへ渡しスコアを生成した。すべての線維芽細胞において遺伝子特徴スコアを解析するため、本発明者らは、各細胞における所与の遺伝子について平均スケール化およびＺスコア正規化した遺伝子発現を集約した（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １７：８３３－８４３（２０２０））。その後、得られたスコアをバイオリンプロットにプロットした。
【0115】
シングルセルＡＴＡＣライブラリ調製、シーケンシング、および処理
核単離に成功した後、次いで核を１０Ｘ ＧｅｎｏｍｉｃｓシングルセルＡＴＡＣキットｖ１．０（ＰＮ－１０００１１０）に従って、まずＴｎ５トランスポゼースとともに１時間インキュベートし、続いて製造者の指示に従って１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ（登録商標）コントローラを用いてＧＥＭ生成およびバーコード増幅をおこなうことにより処理した。ライブラリ調製に使用された追加の構成要素として、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ（登録商標）Ｃｈｉｐ ＥシングルセルＡＴＡＣキット（ＰＮ－１００００８２）およびＣｈｒｏｍｉｕｍ（登録商標）ｉ７マルチプレックスキットＮ、Ｓｅｔ Ａ ｐｒｉｍｅｒｓ（ＰＮ－１００００８４）が含まれる。品質管理のランのためにＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で、その後より深度のあるシーケンシングのためにＮｏｖａＳｅｑ（登録商標）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で、最終的なライブラリをシーケンシングした。前述の８試料すべて（２×Ｓｈａｍ、２×ＴＡＣ－Ｖｅｈ、２×ＴＡＣ－ＪＱ１および２×ＴＡＣ－ＪＱ１休薬）（図２Ｃ）をプールし、ＮｏｖａＳｅｑ（登録商標）の単一のレーンでシーケンシングした。Ｃｈｒｏｍｉｕｍ（登録商標）シングルセルＡＴＡＣ ｖ１．０の仕様に従って、シーケンシングパラメーターを選択した。少なくとも２，５００断片／核の中央値リード深度となるように、すべてのライブラリをシーケンシングした。ロー（Ｒａｗ）シーケンシングリードを１０Ｘ ＧｅｎｏｍｉｃｓのＣｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒ ＡＴＡＣ ｖ１．０パイプラインを用いて処理した。簡潔に述べると、リードをデマルチプレックスし、マウスｍｍ１０ゲノムに対してアライメントした。試料品質の試験として、ＣｅｌｌＲａｎｇｅｒによって測定して、最低でも７０％の断片が標的領域と重複した。その後、集約された断片上でピークをコールし、次いでこれらのピーク内で自動的に決定された閾値（通常約２００）より少ない断片を有するバーコードを破棄した。残りの断片の数を数えることでピーク・バイ・バーコードマトリックスを生成した。
核単離に成功した後、次いで核を１０Ｘ ＧｅｎｏｍｉｃｓシングルセルＡＴＡＣキットｖ１．０（ＰＮ－１０００１１０）に従って、まずＴｎ５トランスポゼースとともに１時間インキュベートし、続いて製造者の指示に従って１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ（登録商標）コントローラを用いてＧＥＭ生成およびバーコード増幅をおこなうことにより処理した。ライブラリ調製に使用された追加の構成要素として、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ（登録商標）Ｃｈｉｐ ＥシングルセルＡＴＡＣキット（ＰＮ－１００００８２）およびＣｈｒｏｍｉｕｍ（登録商標）ｉ７マルチプレックスキットＮ、Ｓｅｔ Ａ ｐｒｉｍｅｒｓ（ＰＮ－１００００８４）が含まれる。品質管理のランのためにＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で、その後より深度のあるシーケンシングのためにＮｏｖａＳｅｑ（登録商標）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で、最終的なライブラリをシーケンシングした。前述の８試料すべて（２×Ｓｈａｍ、２×ＴＡＣ－Ｖｅｈ、２×ＴＡＣ－ＪＱ１および２×ＴＡＣ－ＪＱ１休薬）（図２Ｃ）をプールし、ＮｏｖａＳｅｑ（登録商標）の単一のレーンでシーケンシングした。Ｃｈｒｏｍｉｕｍ（登録商標）シングルセルＡＴＡＣ ｖ１．０の仕様に従って、シーケンシングパラメーターを選択した。少なくとも２，５００断片／核の中央値リード深度となるように、すべてのライブラリをシーケンシングした。ロー（Ｒａｗ）シーケンシングリードを１０Ｘ ＧｅｎｏｍｉｃｓのＣｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒ ＡＴＡＣ ｖ１．０パイプラインを用いて処理した。簡潔に述べると、リードをデマルチプレックスし、マウスｍｍ１０ゲノムに対してアライメントした。試料品質の試験として、ＣｅｌｌＲａｎｇｅｒによって測定して、最低でも７０％の断片が標的領域と重複した。その後、集約された断片上でピークをコールし、次いでこれらのピーク内で自動的に決定された閾値（通常約２００）より少ない断片を有するバーコードを破棄した。残りの断片の数を数えることでピーク・バイ・バーコードマトリックスを生成した。
【0116】
ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑに基づくシングルセルＡＴＡＣ試料内の細胞タイプの同定
本発明者らは、ｓｃＲＮＡｓｅｑデータにおける各クラスターについてマーカー遺伝子のリストを同定した。次に、各ｓｃＡＴＡＣｓｅｑ試料内の各細胞について、本発明者らは、各クラスターのマーカー遺伝子のプロモーター内に存在する細胞のアクセス可能なピークの割合を計算した。本発明者らは、ＣｅｌｌＲａｎｇｅｒによって生成された２値化のピーク・バイ・セルマトリックスのＪａｃｃａｒｄ類似性を用いて各試料の完全な細胞－細胞類似性マトリックスを計算した。図２Ｊは、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータからｓｃＡＴＡＣ－ｓｅｑ試料までのクラスター１のマッピングの例を示す。例えば、図２Ｊの右端のパネルにおいてより暗いドットで印付けられた細胞は、骨髄マーカー遺伝子のアクセス可能なプロモーターを有する。図２Ｊにおける各細胞の陰影付けは、選択された単一の細胞に対してそれらがどの程度類似するかを反映する。その後、本発明者らは、Ｐｒｚｙｔｙｃｋｉ＆Ｐｏｌｌａｎｄに記載されている方法を使用することで各標識の全体的な影響スコアを計算した（ＢｉｏＲｘｉｖ（２０１９）．ｄｏｉ：１０．１１０１／８４７６５７）。各試料について本発明者らは、３つの選択されたマーカー遺伝子（それぞれ、Ｄｃｎ、Ｌｙｚ２、Ｆａｂｐ４）についてアクセス可能なプロモーターを有する細胞において、３つの関心のある細胞タイプ（線維芽細胞、骨髄、内皮）に対応する標識の中央値の影響を最大化するパラメーターｓを選択した。本発明者らは、その細胞に最も大きな影響を有する標識に基づいて各細胞にタイプを割り当てた。図２Ｊは、細胞が影響スコアを使用してｔＳＮＥ空間に再投影されると、同じ標識を有する細胞が一緒にクラスター化することを示す（この投影は例示目的のためのみに使用される）。この方法を用いて、本発明者らは、８つの試料にわたって、５，２１５個を線維芽細胞、４，２７８個を内皮、および３，４４４個を骨髄細胞として同定した。
本発明者らは、ｓｃＲＮＡｓｅｑデータにおける各クラスターについてマーカー遺伝子のリストを同定した。次に、各ｓｃＡＴＡＣｓｅｑ試料内の各細胞について、本発明者らは、各クラスターのマーカー遺伝子のプロモーター内に存在する細胞のアクセス可能なピークの割合を計算した。本発明者らは、ＣｅｌｌＲａｎｇｅｒによって生成された２値化のピーク・バイ・セルマトリックスのＪａｃｃａｒｄ類似性を用いて各試料の完全な細胞－細胞類似性マトリックスを計算した。図２Ｊは、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータからｓｃＡＴＡＣ－ｓｅｑ試料までのクラスター１のマッピングの例を示す。例えば、図２Ｊの右端のパネルにおいてより暗いドットで印付けられた細胞は、骨髄マーカー遺伝子のアクセス可能なプロモーターを有する。図２Ｊにおける各細胞の陰影付けは、選択された単一の細胞に対してそれらがどの程度類似するかを反映する。その後、本発明者らは、Ｐｒｚｙｔｙｃｋｉ＆Ｐｏｌｌａｎｄに記載されている方法を使用することで各標識の全体的な影響スコアを計算した（ＢｉｏＲｘｉｖ（２０１９）．ｄｏｉ：１０．１１０１／８４７６５７）。各試料について本発明者らは、３つの選択されたマーカー遺伝子（それぞれ、Ｄｃｎ、Ｌｙｚ２、Ｆａｂｐ４）についてアクセス可能なプロモーターを有する細胞において、３つの関心のある細胞タイプ（線維芽細胞、骨髄、内皮）に対応する標識の中央値の影響を最大化するパラメーターｓを選択した。本発明者らは、その細胞に最も大きな影響を有する標識に基づいて各細胞にタイプを割り当てた。図２Ｊは、細胞が影響スコアを使用してｔＳＮＥ空間に再投影されると、同じ標識を有する細胞が一緒にクラスター化することを示す（この投影は例示目的のためのみに使用される）。この方法を用いて、本発明者らは、８つの試料にわたって、５，２１５個を線維芽細胞、４，２７８個を内皮、および３，４４４個を骨髄細胞として同定した。
【0117】
シングルセルＡＴＡＣにおける細胞タイプ濃縮（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）ピークの決定
バイアスを避けるため、本発明者らは、各タイプの細胞のアクセシビリティをほかのタイプの細胞のアクセシビリティと比較することによって各試料について別々に細胞タイプ濃縮ピークを計算した。各細胞タイプについて、どのピークが細胞タイプで濃縮されているかを決定するために、我々は、そのタイプではない類似した数のアクセス可能なピークを有する同数の細胞のセットを繰り返し（各１０回）サンプリングし、片側Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を計算することで、各ピークが調べられた細胞タイプにおいてよりアクセス可能かどうかを決定した。次に本発明者らは、Ｆｉｓｈｅｒの方法を用いて収集したｐ値を組み合わせ、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇの手順を用いて多重仮説補正の調整をおこなった。本発明者らは、ＦＤＲ＜０．１で有意であった場合、ピークを細胞タイプで濃縮されているとみなした。各細胞タイプについて、本発明者らは、少なくとも１つのほかの試料において再現しなかったいずれのピークも破棄した。これにより、２２，４６７個の線維芽細胞濃縮ピーク、１２，６０２個の内皮濃縮ピーク、および１１，１５６個の骨髄濃縮ピークが同定された。なお、ピークは２以上の細胞タイプにおいて濃縮され得ることに留意されたい。
バイアスを避けるため、本発明者らは、各タイプの細胞のアクセシビリティをほかのタイプの細胞のアクセシビリティと比較することによって各試料について別々に細胞タイプ濃縮ピークを計算した。各細胞タイプについて、どのピークが細胞タイプで濃縮されているかを決定するために、我々は、そのタイプではない類似した数のアクセス可能なピークを有する同数の細胞のセットを繰り返し（各１０回）サンプリングし、片側Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を計算することで、各ピークが調べられた細胞タイプにおいてよりアクセス可能かどうかを決定した。次に本発明者らは、Ｆｉｓｈｅｒの方法を用いて収集したｐ値を組み合わせ、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇの手順を用いて多重仮説補正の調整をおこなった。本発明者らは、ＦＤＲ＜０．１で有意であった場合、ピークを細胞タイプで濃縮されているとみなした。各細胞タイプについて、本発明者らは、少なくとも１つのほかの試料において再現しなかったいずれのピークも破棄した。これにより、２２，４６７個の線維芽細胞濃縮ピーク、１２，６０２個の内皮濃縮ピーク、および１１，１５６個の骨髄濃縮ピークが同定された。なお、ピークは２以上の細胞タイプにおいて濃縮され得ることに留意されたい。
【0118】
シングルセルＡＴＡＣで正規化したアクセシビリティスコアの計算
各ピークについて、本発明者らは、各細胞について正規化したアクセシビリティスコアをその細胞内のアクセス可能なピークの総数に対する１として計算した。細胞タイプおよび条件における全体的なアクセシビリティの傾向を計算するために、本発明者らは、その条件においてアクセス可能である細胞内のすべての細胞タイプ濃縮ピークの割合を計算した。ゲノムワイドに正規化したアクセシビリティ（例えば、ブラウザトラック用）については、我々は代わりに断片の数によって正規化した。これをおこなうため、本発明者らはまず、ゲノムワイドなアクセシビリティを計算したい細胞のバーコードに対応するすべての断片を見出した。本発明者らは、ｂｅｄｔｏｏｌｓ２内のｕｎｉｏｎＢｅｄＧｒａｐｈｓ関数を用いてそれらの細胞のｂｅｄファイルをマージすることでｂｅｄｇｒａｐｈを作成した。本発明者らは、結合ｂｅｄｇｒａｐｈの各領域に、その結合に使用した細胞数分の、その細胞の断片の総数分の、その領域内の各細胞内の断片数の合計として、アクセシビリティスコアを割り当てた。ピークとプロモーターの間のコアクセシビリティを計算するために、本発明者らはプロモーターおよびピークのどちらもアクセス可能な細胞の数を数え、プロモーターのアクセシビリティによって正規化した。
各ピークについて、本発明者らは、各細胞について正規化したアクセシビリティスコアをその細胞内のアクセス可能なピークの総数に対する１として計算した。細胞タイプおよび条件における全体的なアクセシビリティの傾向を計算するために、本発明者らは、その条件においてアクセス可能である細胞内のすべての細胞タイプ濃縮ピークの割合を計算した。ゲノムワイドに正規化したアクセシビリティ（例えば、ブラウザトラック用）については、我々は代わりに断片の数によって正規化した。これをおこなうため、本発明者らはまず、ゲノムワイドなアクセシビリティを計算したい細胞のバーコードに対応するすべての断片を見出した。本発明者らは、ｂｅｄｔｏｏｌｓ２内のｕｎｉｏｎＢｅｄＧｒａｐｈｓ関数を用いてそれらの細胞のｂｅｄファイルをマージすることでｂｅｄｇｒａｐｈを作成した。本発明者らは、結合ｂｅｄｇｒａｐｈの各領域に、その結合に使用した細胞数分の、その細胞の断片の総数分の、その領域内の各細胞内の断片数の合計として、アクセシビリティスコアを割り当てた。ピークとプロモーターの間のコアクセシビリティを計算するために、本発明者らはプロモーターおよびピークのどちらもアクセス可能な細胞の数を数え、プロモーターのアクセシビリティによって正規化した。
【0119】
シングルセルＡＴＡＣデータからのＴＦ濃縮スコアの算出
各細胞タイプの条件の間の転写因子結合における変化の重要性を評価するため、本発明者らは、教師あり学習モデルを訓練することで転写因子結合位置と遺伝子発現変化を関連付けた。本発明者らは、ＨＯＭＥＲに含まれる既知の脊椎動物のモチーフを有する転写因子（ＴＦ）を使用し、線維芽細胞、骨髄および内皮細胞におけるＴＡＣでの最も発現していたＴＦを有する上位１０個を選択した。まず、各転写因子についてすべてのアクセス可能な結合部位を、その条件での遠位細胞タイプ濃縮ピークのセットを使用しＨＯＭＥＲでの“ｆｉｎｄＭｏｔｉｆｓＧｅｎｏｍｅ．ｐｌ”コマンドとともに“－ｆｉｎｄ”オプションを用いて各条件において決定した。次いで、本発明者らは、各結合部位から各遺伝子の転写開始部位までの距離を計算することにより、各条件ｃに対するｇ－バイ－ｍマトリックスＭｃを生成した。ここで、ｇは遺伝子の数であり、ｍは転写因子の数である。各遺伝子ｉおよびモチーフｊの各結合位置ｋについて、マトリックスにおける対応するエントリーを以下のように定義した：
各細胞タイプの条件の間の転写因子結合における変化の重要性を評価するため、本発明者らは、教師あり学習モデルを訓練することで転写因子結合位置と遺伝子発現変化を関連付けた。本発明者らは、ＨＯＭＥＲに含まれる既知の脊椎動物のモチーフを有する転写因子（ＴＦ）を使用し、線維芽細胞、骨髄および内皮細胞におけるＴＡＣでの最も発現していたＴＦを有する上位１０個を選択した。まず、各転写因子についてすべてのアクセス可能な結合部位を、その条件での遠位細胞タイプ濃縮ピークのセットを使用しＨＯＭＥＲでの“ｆｉｎｄＭｏｔｉｆｓＧｅｎｏｍｅ．ｐｌ”コマンドとともに“－ｆｉｎｄ”オプションを用いて各条件において決定した。次いで、本発明者らは、各結合部位から各遺伝子の転写開始部位までの距離を計算することにより、各条件ｃに対するｇ－バイ－ｍマトリックスＭｃを生成した。ここで、ｇは遺伝子の数であり、ｍは転写因子の数である。各遺伝子ｉおよびモチーフｊの各結合位置ｋについて、マトリックスにおける対応するエントリーを以下のように定義した：
【0120】
【数1】
【0121】
次に、２つの条件ｃ１およびｃ２の間のモチーフ結合強度の差を
【0122】
【数2】
【0123】
として計算した。その後、２つの条件の間の遺伝子発現における対数倍率変化の長さｇのベクトルＹが与えられると、本発明者らは、Ｓｔｏｎｅら（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２５：８７－１０２．ｅ９（２０１９））に記載されている標的最尤推定（ｔＭＬＥ）アプローチを用いてほかの転写因子の影響を考慮しながら、その転写因子に関連する遺伝子からその転写因子に関連しない遺伝子を差し引いた発現変化の差として各転写因子の重要度を算出した。
【0124】
スーパーエンハンサーのアトラスの作成およびクロマチンアクセシビリティと駆出率の相関
スーパーエンハンサーを見出すため、本発明者らはまず、ＴＡＣ Ｖｅｈ試料由来のシングルセルＡＴＡＣデータを用いて、遺伝子によって分離されなかった互いに１２．５ｋｂ以内のすべての細胞タイプ濃縮ピークをつなぎ合わせた。その後、本発明者らは、各潜在的スーパーエンハンサーについて正規化したアクセシビリティを計算し、ＲＯＳＥアルゴリズム（Ｗｈｙｔｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １５３：３０７－３１９（２０１３））を使用することで領域がスーパーエンハンサーとコールされ得る閾値を決定した。本発明者らは、この方法を使用することで、罹患心臓（ＴＡＣ Ｖｅｈ）における線維芽細胞、骨髄および内皮細胞についてのスーパーエンハンサーカタログを構築した。その次に、本発明者らは、各スーパーエンハンサーのアクセシビリティがどの程度左心室駆出率（ＥＦ）と相関しているかを計算した。各スーパーエンハンサーについて、我々は応答変数としての４つの条件にわたるＥＦ観察のベクトル、および所与の細胞タイプにわたる、およびタイプとしてのほかの細胞にわたる、平均アクセシビリティを２項ベクトルとして用い、線形モデルを適合させた。ほかの細胞タイプにおけるアクセシビリティの変化を制御する場合、所与の細胞タイプに対するモデルの適合係数は、その細胞タイプにおけるアクセシビリティの変化によって説明されるＥＦの変化量である。本発明者らは、この値を、各細胞タイプの各スーパーエンハンサーについての相関係数と呼び、各係数の有意性は線形モデルにおけるその項のｐ値によって決定する。比較のために、スーパーエンハンサーをｉｎ ｖｉｔｒｏ非刺激およびＴＧＦ－β細胞株（下記参照）由来のＨ３Ｋ２７Ａｃピークを用いた同じ方法を使用し生成した。
スーパーエンハンサーを見出すため、本発明者らはまず、ＴＡＣ Ｖｅｈ試料由来のシングルセルＡＴＡＣデータを用いて、遺伝子によって分離されなかった互いに１２．５ｋｂ以内のすべての細胞タイプ濃縮ピークをつなぎ合わせた。その後、本発明者らは、各潜在的スーパーエンハンサーについて正規化したアクセシビリティを計算し、ＲＯＳＥアルゴリズム（Ｗｈｙｔｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １５３：３０７－３１９（２０１３））を使用することで領域がスーパーエンハンサーとコールされ得る閾値を決定した。本発明者らは、この方法を使用することで、罹患心臓（ＴＡＣ Ｖｅｈ）における線維芽細胞、骨髄および内皮細胞についてのスーパーエンハンサーカタログを構築した。その次に、本発明者らは、各スーパーエンハンサーのアクセシビリティがどの程度左心室駆出率（ＥＦ）と相関しているかを計算した。各スーパーエンハンサーについて、我々は応答変数としての４つの条件にわたるＥＦ観察のベクトル、および所与の細胞タイプにわたる、およびタイプとしてのほかの細胞にわたる、平均アクセシビリティを２項ベクトルとして用い、線形モデルを適合させた。ほかの細胞タイプにおけるアクセシビリティの変化を制御する場合、所与の細胞タイプに対するモデルの適合係数は、その細胞タイプにおけるアクセシビリティの変化によって説明されるＥＦの変化量である。本発明者らは、この値を、各細胞タイプの各スーパーエンハンサーについての相関係数と呼び、各係数の有意性は線形モデルにおけるその項のｐ値によって決定する。比較のために、スーパーエンハンサーをｉｎ ｖｉｔｒｏ非刺激およびＴＧＦ－β細胞株（下記参照）由来のＨ３Ｋ２７Ａｃピークを用いた同じ方法を使用し生成した。
【0125】
心臓線維芽細胞不死化細胞株の作製、培養条件およびＴＧＦβ刺激
Ｔｃｆ２１ＭＣＭマウス（Ａｃｈａｒｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓｉｓ ４９，８７０－８７７（２０１１））をＲｏｓａ２６－Ａｉ６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ストック＃００７９０６）と交配してＴｃｆ２１ＭＣＭ／＋；Ｒｏｓａ２６Ａｉ６／＋マウスを作製した。１０週齢で、タモキシフェン（７５ｍｇタモキシフェン／ｋｇ）の腹腔内注射を５日間（１日１回）おこなった。タモキシフェンをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙのガイドライン（ウェブサイトｊａｘ．ｏｒｇ／ｒｅｓｅａｒｃｈ－ａｎｄ－ｆａｃｕｌｔｙ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｃｒｅ－ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ／ｔａｍｏｘｉｆｅｎ＃を参照）に従って調製した。注射の５日後、マウスを犠牲にし、ランゲンドルフ潅流を介して非心筋細胞を単離した（詳細は方法の節「ランゲンドルフ潅流およびその後のシングルセルＲＮＡおよびＡＴＡＣｓｅｑのための細胞と核の単離」を参照）。１０万個のＺｓＧｒｅｅｎ陽性細胞をＢＤ ＡｒｉａＩＩソーターを用いて選別し、５％ＣＯ２で加湿したインキュベータ内で３７℃で３日間培養し、線維芽細胞培地：１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、１×非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１０Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンおよび１ｍＭピルビン酸ナトリウム（すべてＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を補充した高グルコースＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で維持した。初代細胞は培養中に予め決められた有限数の細胞分裂しかおこなわず、その後複製老化の状態に入るため、本発明者らはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）Ｔ抗原の発現に基づく培養中の哺乳類細胞を不死化する広く用いられている方法を採用した。線維芽細胞の不死化のために、選抜の３日後、線維芽細胞をトリプシン処理し、午後に１００ｍｍプレートあたり５×１０５個を再播種した。翌朝、新鮮な培地をプレートに加え、２時間後に、製造者の指示に従って、ポリブレンの存在下（終濃度が５μｇ／ｍｌとなるように添加）で１００ｍｍプレートあたり５μｌのＳＶ４０Ｔ抗原発現ＶＳＶ－Ｇ偽型レンチウイルス粒子（Ａｌｓｔｅｍ、＃ＣＩＬＶ０１）を線維芽細胞に感染させた。翌日、ウイルス上清を含む培地を除去し、線維芽細胞を１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、１×非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１０Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンおよび１ｍＭピルビン酸ナトリウム（すべてＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を補充した高グルコースＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に戻した。７２時間後、細胞をトリプシン処理し、２枚の１００ｍｍプレートに１：２に分割した。その後、培地中にピューロマイシン（終濃度１μｇ／ｍｌ）を添加することで安定な細胞株生成のための感染細胞をポジティブセレクションした。ピューロマイシン選択の１０日後、複数のクローンを増殖のために採取した。日常的な細胞株メンテナンスとして、線維芽細胞を２～３日ごとに分割し、培地を１日おきに交換した。同じ培地をレンチウイルス生産のためのＨＥＫ－２９３Ｔ細胞培養に使用した（次の節を参照）。ＴＧＦ－β刺激のため、１日目に６ウェルプレートに１×１０５個／ウェルで線維芽細胞を播種した。２日目に、培地を０．５％ＦＢＳを有する同じ基礎培地に変えた。３日目に、ＴＧＦ－β１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃１００－２１Ｃ）を１０ｎｇ／ｍｌの濃度で培地に添加した。細胞を５日目に下流の分析のために回収した。
Ｔｃｆ２１ＭＣＭマウス（Ａｃｈａｒｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓｉｓ ４９，８７０－８７７（２０１１））をＲｏｓａ２６－Ａｉ６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ストック＃００７９０６）と交配してＴｃｆ２１ＭＣＭ／＋；Ｒｏｓａ２６Ａｉ６／＋マウスを作製した。１０週齢で、タモキシフェン（７５ｍｇタモキシフェン／ｋｇ）の腹腔内注射を５日間（１日１回）おこなった。タモキシフェンをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙのガイドライン（ウェブサイトｊａｘ．ｏｒｇ／ｒｅｓｅａｒｃｈ－ａｎｄ－ｆａｃｕｌｔｙ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｃｒｅ－ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ／ｔａｍｏｘｉｆｅｎ＃を参照）に従って調製した。注射の５日後、マウスを犠牲にし、ランゲンドルフ潅流を介して非心筋細胞を単離した（詳細は方法の節「ランゲンドルフ潅流およびその後のシングルセルＲＮＡおよびＡＴＡＣｓｅｑのための細胞と核の単離」を参照）。１０万個のＺｓＧｒｅｅｎ陽性細胞をＢＤ ＡｒｉａＩＩソーターを用いて選別し、５％ＣＯ２で加湿したインキュベータ内で３７℃で３日間培養し、線維芽細胞培地：１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、１×非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１０Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンおよび１ｍＭピルビン酸ナトリウム（すべてＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を補充した高グルコースＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で維持した。初代細胞は培養中に予め決められた有限数の細胞分裂しかおこなわず、その後複製老化の状態に入るため、本発明者らはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）Ｔ抗原の発現に基づく培養中の哺乳類細胞を不死化する広く用いられている方法を採用した。線維芽細胞の不死化のために、選抜の３日後、線維芽細胞をトリプシン処理し、午後に１００ｍｍプレートあたり５×１０５個を再播種した。翌朝、新鮮な培地をプレートに加え、２時間後に、製造者の指示に従って、ポリブレンの存在下（終濃度が５μｇ／ｍｌとなるように添加）で１００ｍｍプレートあたり５μｌのＳＶ４０Ｔ抗原発現ＶＳＶ－Ｇ偽型レンチウイルス粒子（Ａｌｓｔｅｍ、＃ＣＩＬＶ０１）を線維芽細胞に感染させた。翌日、ウイルス上清を含む培地を除去し、線維芽細胞を１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、１×非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１０Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンおよび１ｍＭピルビン酸ナトリウム（すべてＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を補充した高グルコースＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に戻した。７２時間後、細胞をトリプシン処理し、２枚の１００ｍｍプレートに１：２に分割した。その後、培地中にピューロマイシン（終濃度１μｇ／ｍｌ）を添加することで安定な細胞株生成のための感染細胞をポジティブセレクションした。ピューロマイシン選択の１０日後、複数のクローンを増殖のために採取した。日常的な細胞株メンテナンスとして、線維芽細胞を２～３日ごとに分割し、培地を１日おきに交換した。同じ培地をレンチウイルス生産のためのＨＥＫ－２９３Ｔ細胞培養に使用した（次の節を参照）。ＴＧＦ－β刺激のため、１日目に６ウェルプレートに１×１０５個／ウェルで線維芽細胞を播種した。２日目に、培地を０．５％ＦＢＳを有する同じ基礎培地に変えた。３日目に、ＴＧＦ－β１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃１００－２１Ｃ）を１０ｎｇ／ｍｌの濃度で培地に添加した。細胞を５日目に下流の分析のために回収した。
【0126】
ＲＮＡ抽出、ＲＴ－ＰＣＲ、およびリアルタイムＰＣＲ解析
定量的ＲＴ－ＰＣＲ。ＴＲＩｚｏｌ（商標）ＬＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に細胞を採取し、製造者の指示に従って、Ｄｉｒｅｃｔ－Ｚｏｌ ＲＮＡキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使ってトータルＲＮＡを抽出した。ｑＲＴ－ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のためのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘを用いて５００ｎｇのＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲのために、１／５０のｃＤＮＡをＴａｑｍａｎ（登録商標）ユニバーサルＰＣＲマスターミックス（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた定量的ＰＣＲ反応に適用した。ＰＣＲを７９００ＨＴ高速リアルタイムシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）でおこなった。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブは「Ｔａｑｍａｎプローブ表」にリストされている。ｅＲＮＡ発現解析のため、１／３０のｃＤＮＡをＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いた定量的ＰＣＲ反応に適用した。プライマー配列は「エンハンサーＲＮＡ（ｅＲＮＡ）のためのＳｙｂｅｒプライマーの表」にリストされている。すべての遺伝子発現をＡｃｔｂ遺伝子で正規化した。
定量的ＲＴ－ＰＣＲ。ＴＲＩｚｏｌ（商標）ＬＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に細胞を採取し、製造者の指示に従って、Ｄｉｒｅｃｔ－Ｚｏｌ ＲＮＡキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使ってトータルＲＮＡを抽出した。ｑＲＴ－ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のためのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘを用いて５００ｎｇのＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲのために、１／５０のｃＤＮＡをＴａｑｍａｎ（登録商標）ユニバーサルＰＣＲマスターミックス（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた定量的ＰＣＲ反応に適用した。ＰＣＲを７９００ＨＴ高速リアルタイムシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）でおこなった。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブは「Ｔａｑｍａｎプローブ表」にリストされている。ｅＲＮＡ発現解析のため、１／３０のｃＤＮＡをＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いた定量的ＰＣＲ反応に適用した。プライマー配列は「エンハンサーＲＮＡ（ｅＲＮＡ）のためのＳｙｂｅｒプライマーの表」にリストされている。すべての遺伝子発現をＡｃｔｂ遺伝子で正規化した。
【0127】
精密核ランオンシーケンシング（ＰＲＯｓｅｑ）
Ｋｗａｋらによって報告されたものに（Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：９５０－９５３（２０１３））いくつかの変更を加えながらＰＲＯ－ｓｅｑ実験を実施した。簡潔に述べると、３００万個の心臓線維芽細胞を本方法において以前に記載したように培養した。ＴＧＦβ処理の４８時間後、細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄し、その後膨潤緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、３ｍＭ ＣａＣｌ２）中で１０分間氷上で順次膨潤させ、回収し、溶解緩衝液（膨潤緩衝液に０．５％ＮＰ－４０、２０ユニットのＳＵＰＥＲａｓｅ－Ｉｎ、および１０％グリセロールを加えた）中で溶解した。得られた核を５ｍｌの溶解緩衝液でさらに２回洗浄し、２００μｌの凍結緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．３、４０％グリセロール、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁し、２つの等しいアリコート（アリコートＡ：キャップ除去なし；アリコートＢ：キャップ除去）に分割した。ランオンアッセイのため、再懸濁した核を等量の反応緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、３００ｍＭ ＫＣｌ、２０ユニットのＳＵＰＥＲａｓｅ－Ｉｎ、１％サルコシル、１００Ｍ Ａ／ＧＴＰ、１００μＭ ビオチン－１１－Ｃ／ＵＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ））と混合し、５分間３０℃でインキュベートした。その後、製造者の指示に従って、得られた核－ランオンＲＮＡ（ＮＲＯ－ＲＮＡ）をＴＲＩｚｏｌ（商標）ＬＳ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１０２９６－０２８）を用いて抽出した。ＮＲＯ－ＲＮＡを氷上で３０分間のアルカリ塩基の加水分解によって２００～５００ｎｔに断片化し、１×体積の１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．８を加えることにより中和し、過剰な塩および残留ＮＴＰをＰ－３０カラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｃａｔ＃７３２－６２５０）を用いて除去した。製造者の指示に従って、断片化した新生ＲＮＡを、１０μｌのＭｙＯｎｅストレプトアビジンＣ１ダイナビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ＃６５００１）を用いて２度沈殿させることでビオチン標識ＲＮＡを濃縮した。ビーズを高塩（２Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）で２回、中塩（１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）で１回、そして低塩（５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００）で１回洗浄した。結合したＲＮＡを２回の連続した抽出においてＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃１５５９６－０１８）を用いてビーズから抽出し、ＲＮＡ画分をプールし、続いてエタノール沈殿した。
Ｋｗａｋらによって報告されたものに（Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：９５０－９５３（２０１３））いくつかの変更を加えながらＰＲＯ－ｓｅｑ実験を実施した。簡潔に述べると、３００万個の心臓線維芽細胞を本方法において以前に記載したように培養した。ＴＧＦβ処理の４８時間後、細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄し、その後膨潤緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、３ｍＭ ＣａＣｌ２）中で１０分間氷上で順次膨潤させ、回収し、溶解緩衝液（膨潤緩衝液に０．５％ＮＰ－４０、２０ユニットのＳＵＰＥＲａｓｅ－Ｉｎ、および１０％グリセロールを加えた）中で溶解した。得られた核を５ｍｌの溶解緩衝液でさらに２回洗浄し、２００μｌの凍結緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．３、４０％グリセロール、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁し、２つの等しいアリコート（アリコートＡ：キャップ除去なし；アリコートＢ：キャップ除去）に分割した。ランオンアッセイのため、再懸濁した核を等量の反応緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、３００ｍＭ ＫＣｌ、２０ユニットのＳＵＰＥＲａｓｅ－Ｉｎ、１％サルコシル、１００Ｍ Ａ／ＧＴＰ、１００μＭ ビオチン－１１－Ｃ／ＵＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ））と混合し、５分間３０℃でインキュベートした。その後、製造者の指示に従って、得られた核－ランオンＲＮＡ（ＮＲＯ－ＲＮＡ）をＴＲＩｚｏｌ（商標）ＬＳ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１０２９６－０２８）を用いて抽出した。ＮＲＯ－ＲＮＡを氷上で３０分間のアルカリ塩基の加水分解によって２００～５００ｎｔに断片化し、１×体積の１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．８を加えることにより中和し、過剰な塩および残留ＮＴＰをＰ－３０カラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｃａｔ＃７３２－６２５０）を用いて除去した。製造者の指示に従って、断片化した新生ＲＮＡを、１０μｌのＭｙＯｎｅストレプトアビジンＣ１ダイナビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ＃６５００１）を用いて２度沈殿させることでビオチン標識ＲＮＡを濃縮した。ビーズを高塩（２Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）で２回、中塩（１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）で１回、そして低塩（５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００）で１回洗浄した。結合したＲＮＡを２回の連続した抽出においてＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃１５５９６－０１８）を用いてビーズから抽出し、ＲＮＡ画分をプールし、続いてエタノール沈殿した。
【0128】
このステップにおいて、アリコートＢのみをキャップ除去混合物（１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液ＮＥＢ（Ｂ９００４Ｓ）、２０ユニットのＳＵＰＥＲａｓｅ－Ｉｎ）中でＲＮＡ ５’ピロホスホヒドロラーゼとともに３７℃で１時間インキュベートすることで、新生ＲＮＡから５’キャップを除去した。キャップ除去反応を試料を５分間６５℃で加熱することにより停止し、ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃１５５９６－０１８）を用いて抽出し、続いてエタノール沈殿した。その後、Ｔ４反応混合物（Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ ＃Ｍ０２０１Ｌ）、１×ＰＮＫ緩衝液（ＮＥＢ ＃Ｂ２０１Ｓ）、１０ｍＭ ＡＴＰ（ＮＥＢ ＃Ｂ０７０６Ａ））中で３７℃で１時間インキュベートすることによって、両方のアリコートで５’リン酸化をおこなった。ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃１５５９６－０１８）を用いて抽出し、続いてエタノール沈殿した。製造者の指示に従って、ライブラリをＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）マルチプレックスＳｍａｌｌ ＲＮＡライブラリＰｒｅｐセット（ＮＥＢ、Ｃａｔ＃Ｅ７３００Ｓ）を用いて作製した。ｃＤＮＡ産物を１０％ポリアクリルアミドＴＢＥ－尿素ゲルで分離し、２００～５００ｂｐの間を移動している断片のみを切り出し、ゲル抽出により回収した。最後に、ライブラリをＱｕｂｉｔ（登録商標）を用いて定量し、ＨｉＳｅｑ（登録商標）４０００プラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上の配列ＳＲ７５ｂｐへ送った。
【0129】
ＰＲＯｓｅｑ解析
ディープシーケンシングから得られたＦａｓｔＱファイルについて、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ（Ｂｏｌｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３０：２１１４－２１２０（２０１４））を用いて低品質リードを除去した。アリコートＡ（キャップ除去なし）およびアリコートＢ（キャップ除去）からのトリミングされたＦａｓｔＱファイルをＢｏｗｔｉｅ２（ウェブサイトｂｏｗｔｉｅ－ｂｉｏ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｂｏｗｔｉｅ２／を参照）を用いて参照ゲノム（ｍｍ１０）に対して一緒にアライメントした。結果として得られたアライメントファイルを使用することでｈｏｍｅｒ（ウェブサイトｈｏｍｅｒ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／ｈｏｍｅｒ／を参照）を用いた下流の解析のためのＴａｇ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙを作成した。コード遺伝子および遠位エレメントの差次的発現はｈｏｍｅｒコマンドａｎａｌｙｚｅＲｅｐｅａｔｓ．ｐｌおよびｇｅｔＤｉｆｆＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ｐｌ（ｈｏｍｅｒ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／ｈｏｍｅｒ／ｎｇｓ／ｄｉｆｆＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ｈｔｍｌを参照）を用いて実施した。最小転写の閾値を用いることで、差次的転写遺伝子（遠位エレメントについてすべての試料でｘ＞２０の平均行数、タンパク質コード遺伝子についてすべての試料でｘ＞４０の平均行数）を選択した。ヒストグラムプロットをコマンドａｎｎｏｔａｔｅＰｅａｋｓ（ｈｏｍｅｒ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／ｈｏｍｅｒ／ｎｇｓ／ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ．ｈｔｍｌを参照）のヒストグラムモードを用いて生成した。本発明者らは、ｍａｋｅＭｅｔａＧｅｎｅＰｒｏｆｉｌｅ．ｐｌと呼ばれるツールを使用しメタジーンヒストグラムを生成した（ｈｏｍｅｒ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／ｈｏｍｅｒ／ｎｇｓ／ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ｈｔｍｌを参照）。最後に、ｈｏｍｅｒコマンドｆｉｎｄＰｅａｋｓおよびｇｅｔＤｉｓｔａｌＰｅａｋｓ．ｐｌを用いて（ｈｏｍｅｒ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／ｈｏｍｅｒ／ｎｇｓ／ｇｒｏｓｅｑ／ｇｒｏｓｅｑ．ｈｔｍｌを参照）、ＰＲＯｓｅｑタグの密度に基づいてエンハンサーをコールした。
ディープシーケンシングから得られたＦａｓｔＱファイルについて、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ（Ｂｏｌｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３０：２１１４－２１２０（２０１４））を用いて低品質リードを除去した。アリコートＡ（キャップ除去なし）およびアリコートＢ（キャップ除去）からのトリミングされたＦａｓｔＱファイルをＢｏｗｔｉｅ２（ウェブサイトｂｏｗｔｉｅ－ｂｉｏ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｂｏｗｔｉｅ２／を参照）を用いて参照ゲノム（ｍｍ１０）に対して一緒にアライメントした。結果として得られたアライメントファイルを使用することでｈｏｍｅｒ（ウェブサイトｈｏｍｅｒ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／ｈｏｍｅｒ／を参照）を用いた下流の解析のためのＴａｇ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙを作成した。コード遺伝子および遠位エレメントの差次的発現はｈｏｍｅｒコマンドａｎａｌｙｚｅＲｅｐｅａｔｓ．ｐｌおよびｇｅｔＤｉｆｆＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ｐｌ（ｈｏｍｅｒ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／ｈｏｍｅｒ／ｎｇｓ／ｄｉｆｆＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ｈｔｍｌを参照）を用いて実施した。最小転写の閾値を用いることで、差次的転写遺伝子（遠位エレメントについてすべての試料でｘ＞２０の平均行数、タンパク質コード遺伝子についてすべての試料でｘ＞４０の平均行数）を選択した。ヒストグラムプロットをコマンドａｎｎｏｔａｔｅＰｅａｋｓ（ｈｏｍｅｒ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／ｈｏｍｅｒ／ｎｇｓ／ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ．ｈｔｍｌを参照）のヒストグラムモードを用いて生成した。本発明者らは、ｍａｋｅＭｅｔａＧｅｎｅＰｒｏｆｉｌｅ．ｐｌと呼ばれるツールを使用しメタジーンヒストグラムを生成した（ｈｏｍｅｒ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／ｈｏｍｅｒ／ｎｇｓ／ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ｈｔｍｌを参照）。最後に、ｈｏｍｅｒコマンドｆｉｎｄＰｅａｋｓおよびｇｅｔＤｉｓｔａｌＰｅａｋｓ．ｐｌを用いて（ｈｏｍｅｒ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／ｈｏｍｅｒ／ｎｇｓ／ｇｒｏｓｅｑ／ｇｒｏｓｅｑ．ｈｔｍｌを参照）、ＰＲＯｓｅｑタグの密度に基づいてエンハンサーをコールした。
【0130】
配列特異的抑制のためのＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）
エンハンサー活性を抑制するために、ＣＲＩＳＰＲｉを使用した。レンチウイルスプラスミドｐＨＲ－ＳＦＦＶ－ＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９－ｍｃｈｅｒｒｙ（Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｗｅｉｓｓｍｅｎ博士より贈与、Ａｄｄｇｅｎｅ：６０９５４）を使用した。ｇＲＮＡレンチウイルスベクターを構築するため、ピューロマイシン遺伝子をハイグロマイシン遺伝子に置き換えることによりｐＵ６－ｓｇＲＮＡＥＦ１Ａｌｐｈａ－ｐｕｒｏＴ２Ａ－ＢＦＰ（Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｗｅｉｓｓｍｅｎ博士より贈与、Ａｄｄｇｅｎｅ：６０９５５）を改変し、ｐＵ６－ｓｇＲＮＡＥＦ１Ａｌｐｈａ－ＨｙｇＴ２Ａ－ＢＦＰを作製した。５’および３’のオーバーハングを有する合成ｇＲＮＡオリゴのペア（「エンハンサーを標的とするＣＲＩＳＰＲｉガイドＲＮＡの表」）をアニールし、Ｔ４リガーゼによるライゲーションによってＢｓｔＸＩおよびＢｌｐＩで二重消化したｐＵ６－ｓｇＲＮＡＥＦ１Ａｌｐｈａ－ＨｙｇＴ２Ａ－ＢＦＰへサブクローニングした。コンストラクトを配列決定により確認した（Ｑｕｉｎｔａｒａ Ｂｉｏ、カリフォルニア州バークレー）。エンハンサーピークを抑制するためのｇＲＮＡをプログラムＣｈｏｐｃｈｏｐ（ｃｈｏｐｃｈｏｐ．ｃｂｕ．ｕｉｂ．ｎｏを参照）によって選択した。レンチウイルス粒子を作製するために、２×１０６個のＨＥＫ－２９３Ｔ細胞をトランスフェクションの１日前に１００ｍｍプレートに播種し、１０ｍｌの線維芽細胞培地中で培養した。トランスフェクションの当日、古い培地に８ｍｌの新鮮な培地を補充し、次いで５μｇの所望のレンチウイルスベクターを２．５μｇのエンベロープタンパク質ベクターｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ：１２２５８）、および２．５μｇのパッケージングベクターｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅ：１２２６０）とともに、製造者の指示に従って、５９μｌのＦＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、カリフォルニア州サンルイスオビスポ）を使用しＨＥＫ ２９３Ｔ細胞へコトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、上清を回収し１２ｍｌの新鮮な培地をプレートに添加し、さらに２４時間培養し２度目の上清の回収をおこなった。すべての上清を４５μｍのＰＶＤＦシリンジフィルター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を通して濾過することで細胞デブリ混入物を除去した。その後、得られた上清を心臓の線維芽細胞における形質導入の実施に使用した。まず、本発明者らは、線維芽細胞ＣＲＩＳＰＲｉ対照株を作製した。我々は、ＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９－ｍｃｈｅｒｒｙを発現するレンチウイルスベクターを用いて線維芽細胞を形質導入した。その後、本発明者らは線維芽細胞を回収し、フローサイトメトリー（ＢＤ Ａｒｉａｌ ＩＩ）によって単一細胞を９６ウェルプレートに選抜し、ＣＲＩＳＰＲｉ機構を発現するクローン線維芽細胞株を作製した。ｄＣａｓ９の発現をウェスタンブロットによって確認し（データ非開示）、最も高いｄＣａｓ９の発現を有する線維芽細胞株（クローンＣ１と呼ばれる）を続く実験に使用した。本研究におけるエンハンサー領域の標的抑制を伴う線維芽細胞株の作製のために、前述のＣ１クローンを、所望の領域を標的とする３つのｇＲＮＡウイルスベクター（エンハンサーピークの中央を標的とする１つのｇＲＮＡ、そのピークの両端を標的とするその他のｇＲＮＡ）を用いて形質導入した。標的ｇＲＮＡの純粋なポリクローナル集団を７日間の２００μｇ／ｍｌでのハイグロマイシン選択によって選抜した。次いで、これらｇＲＮＡ－Ｃ１細胞株をＣ１対照株とともに、ＴＧＦ－β刺激のために使用した（本明細書のほかの節を参照）。
エンハンサー活性を抑制するために、ＣＲＩＳＰＲｉを使用した。レンチウイルスプラスミドｐＨＲ－ＳＦＦＶ－ＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９－ｍｃｈｅｒｒｙ（Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｗｅｉｓｓｍｅｎ博士より贈与、Ａｄｄｇｅｎｅ：６０９５４）を使用した。ｇＲＮＡレンチウイルスベクターを構築するため、ピューロマイシン遺伝子をハイグロマイシン遺伝子に置き換えることによりｐＵ６－ｓｇＲＮＡＥＦ１Ａｌｐｈａ－ｐｕｒｏＴ２Ａ－ＢＦＰ（Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｗｅｉｓｓｍｅｎ博士より贈与、Ａｄｄｇｅｎｅ：６０９５５）を改変し、ｐＵ６－ｓｇＲＮＡＥＦ１Ａｌｐｈａ－ＨｙｇＴ２Ａ－ＢＦＰを作製した。５’および３’のオーバーハングを有する合成ｇＲＮＡオリゴのペア（「エンハンサーを標的とするＣＲＩＳＰＲｉガイドＲＮＡの表」）をアニールし、Ｔ４リガーゼによるライゲーションによってＢｓｔＸＩおよびＢｌｐＩで二重消化したｐＵ６－ｓｇＲＮＡＥＦ１Ａｌｐｈａ－ＨｙｇＴ２Ａ－ＢＦＰへサブクローニングした。コンストラクトを配列決定により確認した（Ｑｕｉｎｔａｒａ Ｂｉｏ、カリフォルニア州バークレー）。エンハンサーピークを抑制するためのｇＲＮＡをプログラムＣｈｏｐｃｈｏｐ（ｃｈｏｐｃｈｏｐ．ｃｂｕ．ｕｉｂ．ｎｏを参照）によって選択した。レンチウイルス粒子を作製するために、２×１０６個のＨＥＫ－２９３Ｔ細胞をトランスフェクションの１日前に１００ｍｍプレートに播種し、１０ｍｌの線維芽細胞培地中で培養した。トランスフェクションの当日、古い培地に８ｍｌの新鮮な培地を補充し、次いで５μｇの所望のレンチウイルスベクターを２．５μｇのエンベロープタンパク質ベクターｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ：１２２５８）、および２．５μｇのパッケージングベクターｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅ：１２２６０）とともに、製造者の指示に従って、５９μｌのＦＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、カリフォルニア州サンルイスオビスポ）を使用しＨＥＫ ２９３Ｔ細胞へコトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、上清を回収し１２ｍｌの新鮮な培地をプレートに添加し、さらに２４時間培養し２度目の上清の回収をおこなった。すべての上清を４５μｍのＰＶＤＦシリンジフィルター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を通して濾過することで細胞デブリ混入物を除去した。その後、得られた上清を心臓の線維芽細胞における形質導入の実施に使用した。まず、本発明者らは、線維芽細胞ＣＲＩＳＰＲｉ対照株を作製した。我々は、ＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９－ｍｃｈｅｒｒｙを発現するレンチウイルスベクターを用いて線維芽細胞を形質導入した。その後、本発明者らは線維芽細胞を回収し、フローサイトメトリー（ＢＤ Ａｒｉａｌ ＩＩ）によって単一細胞を９６ウェルプレートに選抜し、ＣＲＩＳＰＲｉ機構を発現するクローン線維芽細胞株を作製した。ｄＣａｓ９の発現をウェスタンブロットによって確認し（データ非開示）、最も高いｄＣａｓ９の発現を有する線維芽細胞株（クローンＣ１と呼ばれる）を続く実験に使用した。本研究におけるエンハンサー領域の標的抑制を伴う線維芽細胞株の作製のために、前述のＣ１クローンを、所望の領域を標的とする３つのｇＲＮＡウイルスベクター（エンハンサーピークの中央を標的とする１つのｇＲＮＡ、そのピークの両端を標的とするその他のｇＲＮＡ）を用いて形質導入した。標的ｇＲＮＡの純粋なポリクローナル集団を７日間の２００μｇ／ｍｌでのハイグロマイシン選択によって選抜した。次いで、これらｇＲＮＡ－Ｃ１細胞株をＣ１対照株とともに、ＴＧＦ－β刺激のために使用した（本明細書のほかの節を参照）。
【0131】
心臓線維芽細胞におけるＭｅｏｘ１エンハンサーピーク９／１０欠失の作製
不死化した心臓線維芽細胞において欠失を作製するため、本発明者らはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）介在ゲノム編集を使用した。所望の欠失領域（Ｍｍ Ｃｈｒ１７：ｃｈｒ１７：４３，５９１，４４６－４３，５９２，４９１）に隣接する２つのｃｒＲＮＡオリゴ（ｕｐｐｅｒ－ｃｒＲＮＡ：ＡＧＧＣＴＴＣＡＣＴＴＡＣＣＣＴＡＧＡＣ（配列番号１８）；Ｄｏｗｎ－ｃｒＲＮＡ：ＣＡＡＴＡＡＴＧＧＧＣＴＣＴＧＴＡＡＧＧ（配列番号１９））をＴｒａｃＲＮＡオリゴとともに合成し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）より入手した。トランスフェクションの前に、２４０ｐｍｏｌの各ｃｒＲＮＡオリゴを同量のＴｒａｃＲＮＡとアニーリングさせてガイドＲＮＡ複合体を形成した。これは、混合物を９５℃で５分間加熱し室温で３０分間冷却することによって行った。その後、ガイドＲＮＡ混合物を４０ｐｍｏｌのｓｐＣａｓ９タンパク質（Ｍａｃｒｏ Ｌａｂ、ＵＣＢ）と混合し、Ｐ２初代細胞４Ｄヌクレオフェクターｘキット（Ｌｏｎｚａ）の２０μｌのトランスフェクション溶液を用いて室温で１５分間インキュベートした。
不死化した心臓線維芽細胞において欠失を作製するため、本発明者らはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）介在ゲノム編集を使用した。所望の欠失領域（Ｍｍ Ｃｈｒ１７：ｃｈｒ１７：４３，５９１，４４６－４３，５９２，４９１）に隣接する２つのｃｒＲＮＡオリゴ（ｕｐｐｅｒ－ｃｒＲＮＡ：ＡＧＧＣＴＴＣＡＣＴＴＡＣＣＣＴＡＧＡＣ（配列番号１８）；Ｄｏｗｎ－ｃｒＲＮＡ：ＣＡＡＴＡＡＴＧＧＧＣＴＣＴＧＴＡＡＧＧ（配列番号１９））をＴｒａｃＲＮＡオリゴとともに合成し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）より入手した。トランスフェクションの前に、２４０ｐｍｏｌの各ｃｒＲＮＡオリゴを同量のＴｒａｃＲＮＡとアニーリングさせてガイドＲＮＡ複合体を形成した。これは、混合物を９５℃で５分間加熱し室温で３０分間冷却することによって行った。その後、ガイドＲＮＡ混合物を４０ｐｍｏｌのｓｐＣａｓ９タンパク質（Ｍａｃｒｏ Ｌａｂ、ＵＣＢ）と混合し、Ｐ２初代細胞４Ｄヌクレオフェクターｘキット（Ｌｏｎｚａ）の２０μｌのトランスフェクション溶液を用いて室温で１５分間インキュベートした。
【0132】
最終的なＣａｓ９：ｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体を、Ｌｏｎｚａ４Ｄヌクレオフェクター（Ｌｏｎｚａ）内のＰｒｏｇ ＥＮ－１５０を用いて１×１０５個の心臓線維芽細胞へヌクレオフェクションした。トランスフェクションの後、細胞を９６ウェルプレートの１ウェルへ播種し２日間培養した。３日目、細胞をトリプシンによって分離し、１ｍｌの線維芽細胞培養培地に再懸濁した。細胞の数を数え、ウェルあたり１細胞を得るために３００細胞を３枚の９６ウェルプレートに播種した。播種後に、単一の細胞を有するウェルのみに印を付けた。２週間後、クローンがコンフルエントになったら、４分の１の細胞を続く培養へ回し、残りの４分の３をゲノムＤＮＡを抽出するために回収した。欠失領域の上流および下流から選択したプライマーのペア（表：Ｍｅｏｘ１エンハンサーピーク９／１０欠失の検出のためのプライマー）を用いてＰｒｉｍＳＴＡＲ（登録商標）ポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ Ｂｉｏ）を使用したＰＣＲ解析により、欠失の検出を実施した。ＰＣＲ産物をサンガーシーケンシングによりシーケンシングすることで欠失の有無を確認した。さらにクローンをデジタルＰＣＲを用いて解析することで両アレル性のピーク９／１０欠失クローンを同定した。デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）アッセイ混合物は、５０～１００ｎｇのゲノムＤＮＡ、１×ｄｄＰＣＲスーパーミックス（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、終濃度９００ｎＭおよび２２０ｎＭのＷＴプライマーおよびＤｅｌプライマーをＦＡＭまたはＨＥＸ標識したプローブとともに含み、２２μｌの最終体積で調製した。２０μｌのアッセイ混合物および７０μｌのｄｄＰＣＲ液滴オイル（ＢｉｏＲＡｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をＱＸ１００／２００ ＤＧカートリッジ（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）上へ移し、その後、ＱＸ１００液滴ジェネレーター（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）へ添加した。個々の試料およびオイルをフロー収束結合部を通して引き抜きオイル液滴中に水を生成するジェネレーターである。その後、４０μｌのオイルおよび試料の液滴エマルジョンを９６ウェルプレートへ移し、９５℃１０分、９４℃１分および６０℃１分（４０サイクルの繰り返し）、その後９８℃１０分で、Ｔ１００ Ｔｈｅｒｍｏ Ｃｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲＡｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でのＰＣＲ反応をおこなった。ＰＣＲの完了後、次いでプレートをＱＸ２００液滴リーダー（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）へ移し、ＱＸソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて分析した。欠失を有するクローンおよび有しないクローンをＴＧＦ－β１刺激の研究のために使用した。
【0133】
ＭＥＯＸ１－ＨＡ心臓線維芽細胞株の作製
ベクターＨＡ－ｔａｇ－ＭＥＯＸ１マウス（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）由来のＨＡｔａｇ－ｍＭｅｏｘ１断片をＰＣＲ増幅することによってｐＨＲ－ＨＡｔａｇ－ｍＭｅｏｘ１ベクターを構築した。ｐＨＲ－ＨＡｔａｇ－ｍＭＥＯＸ１コンストラクトを作製するため、ｐＨＲ－ＳＦＦＶ－ＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９－ｍＣｈｅｒｒｙベクター由来のＫＲＡＢおよびｄＣａｓ９のカセットを、ＳＢＩ Ｓｙｓｔｅｍ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ（カリフォルニア州パロアルト）が提供しているＣｏｌｄ－ｆｕｓｉｏｎクローニングキットを用いて製造者によって提供された指示に従い、ＨＡ－ｔａｇ－ＭＥＯＸ１カセットに置き換えた。コンストラクトをシーケンシングにより確認した。レンチウイルス粒子を作製するため、「配列特異的抑制のためのＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）」の節に記載されるものと同じ手順を使用した。その後、得られた上清を使用し、ＨＡ－ｔａｇ－ＭＥＯＸ１およびｍＣｈｅｒｒｙを発現するレンチウイルスベクターを用いて、不死化した心臓線維芽細胞の形質転換を実施した。安定なｍＣｈｅｒｒｙの発現に対してフローサイトメトリー（ＢＤ Ａｒｉａｌ ＩＩ）を用いて、ＨＡ－ｔａｇ－ＭＥＯＸ１線維芽細胞の純粋なポリクローナル集団を選別した。このＨＡ－ｔａｇ－ＭＥＯＸ１線維芽細胞株を、その後のクロマチン免疫沈降に続くシーケンシング（ＣｈＩＰｓｅｑ）に使用した。
ベクターＨＡ－ｔａｇ－ＭＥＯＸ１マウス（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）由来のＨＡｔａｇ－ｍＭｅｏｘ１断片をＰＣＲ増幅することによってｐＨＲ－ＨＡｔａｇ－ｍＭｅｏｘ１ベクターを構築した。ｐＨＲ－ＨＡｔａｇ－ｍＭＥＯＸ１コンストラクトを作製するため、ｐＨＲ－ＳＦＦＶ－ＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９－ｍＣｈｅｒｒｙベクター由来のＫＲＡＢおよびｄＣａｓ９のカセットを、ＳＢＩ Ｓｙｓｔｅｍ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ（カリフォルニア州パロアルト）が提供しているＣｏｌｄ－ｆｕｓｉｏｎクローニングキットを用いて製造者によって提供された指示に従い、ＨＡ－ｔａｇ－ＭＥＯＸ１カセットに置き換えた。コンストラクトをシーケンシングにより確認した。レンチウイルス粒子を作製するため、「配列特異的抑制のためのＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）」の節に記載されるものと同じ手順を使用した。その後、得られた上清を使用し、ＨＡ－ｔａｇ－ＭＥＯＸ１およびｍＣｈｅｒｒｙを発現するレンチウイルスベクターを用いて、不死化した心臓線維芽細胞の形質転換を実施した。安定なｍＣｈｅｒｒｙの発現に対してフローサイトメトリー（ＢＤ Ａｒｉａｌ ＩＩ）を用いて、ＨＡ－ｔａｇ－ＭＥＯＸ１線維芽細胞の純粋なポリクローナル集団を選別した。このＨＡ－ｔａｇ－ＭＥＯＸ１線維芽細胞株を、その後のクロマチン免疫沈降に続くシーケンシング（ＣｈＩＰｓｅｑ）に使用した。
【0134】
ＣｈＩＰアッセイ、シーケンシングのためのライブラリ調製および解析
ＣｈＩＰ実験のため、非刺激およびＴＧＦβ処理の条件の、１０×１０６個の心臓の不死化した線維芽細胞（ＭＥＯＸ１ ＣｈＩＰｓｅｑのためのＨＡ－ｔａｇ－ＭＥＯＸ１線維芽細胞）をペレットにし、１０ｍｌのＤＭＥＭに懸濁し、１％ホルマリン溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で室温で１０分間揺動させることにより架橋した。その後、グリシン（終濃度０．１２５Ｍ）を添加することで５分間架橋を抑えた。試料を４℃で５分間１０００ｒｃｆで遠心分離した。プロテアーゼ阻害剤およびフォスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ ＃４６９３１３２００１）を添加した１０ｍｌの冷１×ＰＢＳで細胞を洗浄し、そのペレットを液体窒素中で瞬間凍結した。すべての試料を使用するまで－８０℃で保存した。準備ができた際に、細胞ペレットを、細胞溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８、８５ｍＭ ＫＣｌ、０．５％ＮＰ－４０、プロテアーゼ阻害剤）中で１０分間ローテーター上で４゜℃でインキュベートした。核を、遠心分離（２，５００×ｇ、５分、４℃）によって単離し、核溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８、１％ＳＤＳ、プロテアーゼ阻害剤）中で再懸濁し、３０分間ローテーター上で４℃でインキュベートした。Ｃｏｖａｒｉｓ（登録商標）Ｓ２ソニケーター（Ｃｏｖａｒｉｓ Ｉｎｃ）を用いて２０分間（６０ｓサイクル、２０％ｄｕｔｙサイクル、２００サイクル／ｂｕｒｓｔ、強度＝５）、ＤＮＡが２００～７００塩基対の範囲になるまで、クロマチンを剪断した。クロマチンを、ＣｈＩＰ希釈緩衝液（０．０１％ＳＤＳ、１．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、１．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１６．７ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８、１６７ｍＭ ＮａＣｌ、プロテアーゼ阻害剤）中で３倍に希釈し、３μｌの抗ＨＡ抗体（Ａｂｃａｍ ＃９１１０）もしくは２μｌの抗Ｈ３Ｋ２７ａｃ（Ａｂｃａｍ ＃４７２９）もしくは２μｌの抗Ｈ３Ｋ９ｍ３（Ａｂｃａｍ ＃８８９８）とともに４℃で一晩回転させながらインキュベートした。抗体－タンパク質複合体を、Ｐｉｅｒｃｅタンパク質Ａ／Ｇ磁気ビーズを用いて４℃で２時間回転させながら免疫沈降した。ビーズを５回（回転しながら２分／洗浄）、冷ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ、ｐＨ７．５、５００ｍＭ ＬｉＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＮＰ－４０、０．７％デオキシコール酸ナトリウム）で洗浄し、次いで冷たい最終洗浄緩衝液（１×ＴＥ、５０ｍＭ ＮａＣｌ）で１回洗浄した。免疫沈降したクロマチンを、溶出緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ）中で６５℃で攪拌しながら３０分間、溶出した。高塩緩衝液（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８、１．２５Ｍ ＮａＣｌ）およびプロテアーゼＫ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ（ＮＥＢ））を添加し、６５℃で一晩で架橋を元に戻した。試料をＲＮａｓｅＡで処理し、ＤＮＡをＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ｃａｔ＃Ａ６３８８１）で精製した。続くＣｈＩＰｓｅｑのため、断片化したＣｈＩＰおよびインプットＤＮＡを、ＩｌｌｕｍｉｎａのためのＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＤＮＡライブラリＰｒｅｐキット（ＮＥＢ、Ｅ７６４５）を用いて、末端修復し、５’－リン酸化し、ｄＡ－テール化をした。試料をマルチプレックスシーケンシングのためアダプターオリゴに連結させ（ＮＥＢ、Ｅ７３３５）、ＰＣＲ増幅し、Ｇｌａｄｓｔｏｎｅ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓでＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）５００上でシーケンシングした。ＣｈＩＰ ｑＰＣＲのために、ＰｏｓｔｎおよびＭｅｏｘ１座位における定義された領域にまたがるプライマー（プライマー配列のための表を参照）を用いて、ＣｈＩＰ化したＤＮＡおよびインプットＤＮＡを増幅し、ＲＴ－ｑＰＣＲを実行した。
ＣｈＩＰ実験のため、非刺激およびＴＧＦβ処理の条件の、１０×１０６個の心臓の不死化した線維芽細胞（ＭＥＯＸ１ ＣｈＩＰｓｅｑのためのＨＡ－ｔａｇ－ＭＥＯＸ１線維芽細胞）をペレットにし、１０ｍｌのＤＭＥＭに懸濁し、１％ホルマリン溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で室温で１０分間揺動させることにより架橋した。その後、グリシン（終濃度０．１２５Ｍ）を添加することで５分間架橋を抑えた。試料を４℃で５分間１０００ｒｃｆで遠心分離した。プロテアーゼ阻害剤およびフォスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ ＃４６９３１３２００１）を添加した１０ｍｌの冷１×ＰＢＳで細胞を洗浄し、そのペレットを液体窒素中で瞬間凍結した。すべての試料を使用するまで－８０℃で保存した。準備ができた際に、細胞ペレットを、細胞溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８、８５ｍＭ ＫＣｌ、０．５％ＮＰ－４０、プロテアーゼ阻害剤）中で１０分間ローテーター上で４゜℃でインキュベートした。核を、遠心分離（２，５００×ｇ、５分、４℃）によって単離し、核溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８、１％ＳＤＳ、プロテアーゼ阻害剤）中で再懸濁し、３０分間ローテーター上で４℃でインキュベートした。Ｃｏｖａｒｉｓ（登録商標）Ｓ２ソニケーター（Ｃｏｖａｒｉｓ Ｉｎｃ）を用いて２０分間（６０ｓサイクル、２０％ｄｕｔｙサイクル、２００サイクル／ｂｕｒｓｔ、強度＝５）、ＤＮＡが２００～７００塩基対の範囲になるまで、クロマチンを剪断した。クロマチンを、ＣｈＩＰ希釈緩衝液（０．０１％ＳＤＳ、１．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、１．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１６．７ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８、１６７ｍＭ ＮａＣｌ、プロテアーゼ阻害剤）中で３倍に希釈し、３μｌの抗ＨＡ抗体（Ａｂｃａｍ ＃９１１０）もしくは２μｌの抗Ｈ３Ｋ２７ａｃ（Ａｂｃａｍ ＃４７２９）もしくは２μｌの抗Ｈ３Ｋ９ｍ３（Ａｂｃａｍ ＃８８９８）とともに４℃で一晩回転させながらインキュベートした。抗体－タンパク質複合体を、Ｐｉｅｒｃｅタンパク質Ａ／Ｇ磁気ビーズを用いて４℃で２時間回転させながら免疫沈降した。ビーズを５回（回転しながら２分／洗浄）、冷ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ、ｐＨ７．５、５００ｍＭ ＬｉＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＮＰ－４０、０．７％デオキシコール酸ナトリウム）で洗浄し、次いで冷たい最終洗浄緩衝液（１×ＴＥ、５０ｍＭ ＮａＣｌ）で１回洗浄した。免疫沈降したクロマチンを、溶出緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ）中で６５℃で攪拌しながら３０分間、溶出した。高塩緩衝液（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８、１．２５Ｍ ＮａＣｌ）およびプロテアーゼＫ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ（ＮＥＢ））を添加し、６５℃で一晩で架橋を元に戻した。試料をＲＮａｓｅＡで処理し、ＤＮＡをＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ｃａｔ＃Ａ６３８８１）で精製した。続くＣｈＩＰｓｅｑのため、断片化したＣｈＩＰおよびインプットＤＮＡを、ＩｌｌｕｍｉｎａのためのＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＤＮＡライブラリＰｒｅｐキット（ＮＥＢ、Ｅ７６４５）を用いて、末端修復し、５’－リン酸化し、ｄＡ－テール化をした。試料をマルチプレックスシーケンシングのためアダプターオリゴに連結させ（ＮＥＢ、Ｅ７３３５）、ＰＣＲ増幅し、Ｇｌａｄｓｔｏｎｅ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓでＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）５００上でシーケンシングした。ＣｈＩＰ ｑＰＣＲのために、ＰｏｓｔｎおよびＭｅｏｘ１座位における定義された領域にまたがるプライマー（プライマー配列のための表を参照）を用いて、ＣｈＩＰ化したＤＮＡおよびインプットＤＮＡを増幅し、ＲＴ－ｑＰＣＲを実行した。
【0135】
ＣｈＩＰ解析のため、既知のアダプターおよびリードの低品質領域のトリミングを、Ｆａｓｔｑ－ｍｃｆを用いて実施した。配列品質管理をＦａｓｔＱＣを用いて評価した（ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃ／を参照）。ｍｍ１０参照ゲノムへのアライメントをＢｏｗｔｉｅ２．２．４（Ｌａｎｇｍｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ９，３５７－３５９（２０１２））を用いて実施した。ｄｅｅｐｔｏｏｌｓ ３．５．０のｍｕｌｔｉＢａｍＳｕｍｍａｒｙを用いて、反復実験の相関を検定した（Ｒａｍｉｒｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４４，Ｗ１６０－５（２０１６））。ＧＥＭを用いてピークをコールした（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．８、ｅ１００２６３８（２０１２））。ピークごとのリードカウントをｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓを用いて作成し（Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３０，９２３－９３０（２０１４））、ＣｈＩＰおよびインプットの試料について別々に上位四分位点正規化を用いて、試料間のシーケンシング深度の差を考慮して正規化した。ＭＥＯＸ１抗ＨＡおよびＨ３Ｋ２７ａｃ ＣｈＩＰｓｅｑについて、ＭＥＯＸ１またはＨ３Ｋ２７ａｃで濃縮される領域を、ｅｄｇｅＲに実装されているように、カウントデータの疑似尤度負の二項一般化ｌｏｇ線形モデルについて、経験的ベイズのＦ検定を用いて決定した。具体的には、本発明者らは、対応するインプット試料に対するＣｈＩＰの正規化されたピークシグナルでの有意な（つまり、ＦＤＲ＜５％で０でない）ｌｏｇ２倍増について検定した。ＢＥＤＴｏｏｌｓを用いて領域の共通部分を見出した（Ｑｕｉｎｌａｎ ＆ Ｈａｌｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２６，８４１－８４２（２０１０））。最初にＭＥＯＸ１カバレッジ分布を、ｄｅｅｐｔｏｏｌｓ ３．５．０（これはまたプロットトラックに使用されるｂｉｇｗｉｇファイルも出力する）のｂａｍＣｏｍｐａｒｅを用いて条件（非刺激およびＴＧＦβ）あたり全部で３回の反復実験にわたるリード正規化平均をまず計算し、次にｓｃａｌｅ－ｒｅｇｉｏｎｓオプションを用いてｄｅｅｐｔｏｏｌｓ ３．５．０のｃｏｍｐｕｔｅＭａｔｒｉｘを使用しスコア化した。Ｈ３Ｋ２７Ａｃ領域のカバレッジについては、Ｈ３Ｋ２７Ａｃデータの各ピークを中央にして上流および下流に１ｋｂ伸長した範囲でまずｂｅｄファイルを作成したことを除いて、同様に計算した；ｃｏｍｐｕｔｅＭａｔｒｉｘをｓｃａｌｅ－ｒｅｇｉｏｎｓオプションなしでこれらのｂｅｄファイル上で実行した。いくつのタンパク質コード遺伝子座位がＭＥＯＸ１ピークと重複しているかを計算するため、本発明者らは、ＴＧＦβ処理でのＭＥＯＸ１ ＣｈＩＰでの３回の反復実験の結果の少なくとも２つに存在するピークを保持した。
【0136】
環状化染色体コンフォメーションキャプチャ（４Ｃ）
４Ｃ－ｓｅｑ実験を、Ｓｔａｄｈｏｕｄｅｒｓら（Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌ．８：５０９－５２４（２０１３））によって報告されているように、いくつかの変更を加えて大規模に実施した。簡潔に述べると、１，０００万個の心臓線維芽細胞を本方法に上記したように培養した。ＴＧＦ－β処理の４８時間後に、細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄し、その後１％ホルムアルデヒドで１０分間順次架橋した。終濃度が０．１２５Ｍとなるようにグリシンを添加し、反応を抑えた。細胞を冷ＰＢＳでもう一回洗浄し、５ｍｌの氷冷溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ＮＰ－４０＋プロテアーゼ阻害剤）内で氷上で１０分間インキュベートすることにより核を抽出した。核を制限酵素緩衝液（ＮＥＢ Ｃａｔ＃Ｂ７００６Ｓ）中で再懸濁し、０．３％ＳＤＳとともに３７℃で１時間インキュベートし、さらに２％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００で１時間インキュベートした。４００ＵのＤｐｎＩＩ制限酵素（ＮＥＢ Ｃａｔ＃Ｒ０５４３Ｓ）を加え一晩インキュベートした。制限酵素を６５℃で２０分間熱失活させた。物理的に近接したＤＮＡ領域のライゲーションを１０００ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ Ｍ０２０２Ｍ）を用いて一晩実施した。翌日、３００μｇのプロテアーゼＫを添加し、脱架橋を６５℃で一晩実施した。脱架橋の後、ＤＮＡをフェノール／クロロホルム沈殿を用いて精製し、４００ＵのＮｌａＩＩＩ制限酵素（ＮＥＢ Ｃａｔ＃Ｒ０１２５Ｓ）を添加しその後６５℃で４時間のインキュベートすることにより２回目の消化を実施した。２回目の消化後、ＤＮＡのライゲーションを上記したようにＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて再び実施した。部分的Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列アダプターを含むプライマー（第１プライマー：ｇｔｔｃａｇａｇｔｔｃｔａｃａｇｔｃｃｇａｃｇａｔｃ（配列番号２０）；第２プライマー：ａｇａｃｇｔｇｔｇｃｔｃｔｔｃｃｇａｔｃｔ（配列番号２１）をＰＣＲで使用することにより、４Ｃ－ｓｅｑライブラリを増幅した。第１プライマーを各ビューポイント上に設計し、第２プライマーをビューポイントに最も近いＮｌａＩＩＩ切断部位の傍に設計した。使用したプライマー配列を「４Ｃプライマー表」に記載した。
４Ｃ－ｓｅｑ実験を、Ｓｔａｄｈｏｕｄｅｒｓら（Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌ．８：５０９－５２４（２０１３））によって報告されているように、いくつかの変更を加えて大規模に実施した。簡潔に述べると、１，０００万個の心臓線維芽細胞を本方法に上記したように培養した。ＴＧＦ－β処理の４８時間後に、細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄し、その後１％ホルムアルデヒドで１０分間順次架橋した。終濃度が０．１２５Ｍとなるようにグリシンを添加し、反応を抑えた。細胞を冷ＰＢＳでもう一回洗浄し、５ｍｌの氷冷溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ＮＰ－４０＋プロテアーゼ阻害剤）内で氷上で１０分間インキュベートすることにより核を抽出した。核を制限酵素緩衝液（ＮＥＢ Ｃａｔ＃Ｂ７００６Ｓ）中で再懸濁し、０．３％ＳＤＳとともに３７℃で１時間インキュベートし、さらに２％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００で１時間インキュベートした。４００ＵのＤｐｎＩＩ制限酵素（ＮＥＢ Ｃａｔ＃Ｒ０５４３Ｓ）を加え一晩インキュベートした。制限酵素を６５℃で２０分間熱失活させた。物理的に近接したＤＮＡ領域のライゲーションを１０００ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ Ｍ０２０２Ｍ）を用いて一晩実施した。翌日、３００μｇのプロテアーゼＫを添加し、脱架橋を６５℃で一晩実施した。脱架橋の後、ＤＮＡをフェノール／クロロホルム沈殿を用いて精製し、４００ＵのＮｌａＩＩＩ制限酵素（ＮＥＢ Ｃａｔ＃Ｒ０１２５Ｓ）を添加しその後６５℃で４時間のインキュベートすることにより２回目の消化を実施した。２回目の消化後、ＤＮＡのライゲーションを上記したようにＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて再び実施した。部分的Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列アダプターを含むプライマー（第１プライマー：ｇｔｔｃａｇａｇｔｔｃｔａｃａｇｔｃｃｇａｃｇａｔｃ（配列番号２０）；第２プライマー：ａｇａｃｇｔｇｔｇｃｔｃｔｔｃｃｇａｔｃｔ（配列番号２１）をＰＣＲで使用することにより、４Ｃ－ｓｅｑライブラリを増幅した。第１プライマーを各ビューポイント上に設計し、第２プライマーをビューポイントに最も近いＮｌａＩＩＩ切断部位の傍に設計した。使用したプライマー配列を「４Ｃプライマー表」に記載した。
【0137】
全長Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列アダプターおよびバーコードは、２回目のＰＣＲで追加した。最後に、ライブラリをキュービット（登録商標）で定量化し、ライブラリの品質は、バイオアナライザーＡｇｉｌｅｎｔ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で確認した。ハイスループットシーケンシングは、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）５００装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上のＳＥ７５ランを使用しておこなった。シーケンシングの結果を、Ｋｒｉｊｇｅｒら（Ｍｅｔｈｏｄｓ １７０，１７－３２（２０２０））によって記載されているように解析した。Ｋｒｉｊｇｅｒ（２０２０）によって記載されているように、ｄｅ関数「ｄｏＰｅａｋＣ」をパイプラインによって生成されたｒｄｓファイル上で直接用いて、バックグラウンド上のピークコールを実施した。
【0138】
心臓線維芽細胞へのｓｉＲＮＡトランスフェクション
１×１０５個の不死化した線維芽細胞もしくは初代成体心臓線維芽細胞を６ウェルプレートにトランスフェクションの前日に播種した。トランスフェクションの当日、続くＴＧＦβ処理用のウェルを０．５％ＦＢＳを含む線維芽細胞培地に切り替え、非刺激のウェルを１０％ＦＢＳを含む通常の線維芽細胞培地に切り替えた。製造者の指示に従い、各ウェルに７μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（リポフェクタマイン）（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、細胞に１５ｎＭのマウスＭｅｏｘ１、ｓｉＢｒｄ２、ｓｉＢｒｄ３、ｓｉＢｒｄ４、ｓｉＳｍａｄ２もしくはｓｉＳｍａｄ３のｓｉＲＮＡもしくは１５ｎＭのｓｉＲＮＡ対照（すべてのｓｉＲＮＡはＳｉｇｍａから入手、参照番号を下記の表に示す）でトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、０．５％ＦＢＳ培地を有するウェルをＴＧＦ－β１で処理した（詳細な手順はほかの節に記載されている）。
１×１０５個の不死化した線維芽細胞もしくは初代成体心臓線維芽細胞を６ウェルプレートにトランスフェクションの前日に播種した。トランスフェクションの当日、続くＴＧＦβ処理用のウェルを０．５％ＦＢＳを含む線維芽細胞培地に切り替え、非刺激のウェルを１０％ＦＢＳを含む通常の線維芽細胞培地に切り替えた。製造者の指示に従い、各ウェルに７μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（リポフェクタマイン）（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、細胞に１５ｎＭのマウスＭｅｏｘ１、ｓｉＢｒｄ２、ｓｉＢｒｄ３、ｓｉＢｒｄ４、ｓｉＳｍａｄ２もしくはｓｉＳｍａｄ３のｓｉＲＮＡもしくは１５ｎＭのｓｉＲＮＡ対照（すべてのｓｉＲＮＡはＳｉｇｍａから入手、参照番号を下記の表に示す）でトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、０．５％ＦＢＳ培地を有するウェルをＴＧＦ－β１で処理した（詳細な手順はほかの節に記載されている）。
【0139】
平滑筋アクチンタンパク質免疫染色
非刺激およびＴＧＢβ処理した線維芽細胞（ｓｉＲＮＡ対照またはＭｅｏｘ１をともなう）を上記したように刺激した（詳細は「心臓線維芽細胞不死化細胞株の作製、培養条件およびＴＧＦβ刺激」の節を参照されたい）。アルファ平滑筋アクチン染色のため、細胞を４％ＰＦＡで１５分間固定し、洗浄し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ）中で５分間透過させた。ＭＯＭ遮断溶液（ＶＥＣＴＯＲ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でブロッキングした後、次いで細胞をアルファ平滑筋アクチンに対する一次抗体（ａＳＭＡ；ＤＡＫＯ、Ｍ０８５１；１：１００）とともに３０分間インキュベートし、続いて、ＭＯＭ希釈用液（ＶＥＣＴＯＲ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で希釈したロバ抗マウスＩｇＧ５５５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１：４００）およびＨｏｅｃｈｓｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，６２２４６；１：１００００）染料とともにインキュベートした。試料間で同じ取得設定を用いて画像化をＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｚ１上で実施し、ＦＩＪＩを用いてａＳＭＡ発現の倍率変化を定量化した。ａＳＭＡの平均蛍光強度をＭｅａｓｕｒｅツール（Ｓｅｔ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓは「ｍｅａｎ ｇｒｅｙ ｖａｌｕｅ」）を用いて定量化し、総細胞数に対して正規化した。閾値、分水界および分析粒子ツールを用いてフィールドあたりのすべての核を分析することにより、総細胞数を定量化した。ウェルあたり、関心のある合計１０領域を分析した。Ｐｒｉｓｍ８を用い、統計的有意性の決定をｐ＜０．０５として、データの統計解析を実施した。テューキーの多重比較検定を適用した。正規性はダゴスティーノ－ピアソンオムニバス正規性検定では証明されなかったため、Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓａｍｐｌｅｓ Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を利用した。盲検法（英数字コードによる試料の標識）を線維芽細胞ａＳＭＡ発現を解析するために実装した。
非刺激およびＴＧＢβ処理した線維芽細胞（ｓｉＲＮＡ対照またはＭｅｏｘ１をともなう）を上記したように刺激した（詳細は「心臓線維芽細胞不死化細胞株の作製、培養条件およびＴＧＦβ刺激」の節を参照されたい）。アルファ平滑筋アクチン染色のため、細胞を４％ＰＦＡで１５分間固定し、洗浄し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ）中で５分間透過させた。ＭＯＭ遮断溶液（ＶＥＣＴＯＲ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でブロッキングした後、次いで細胞をアルファ平滑筋アクチンに対する一次抗体（ａＳＭＡ；ＤＡＫＯ、Ｍ０８５１；１：１００）とともに３０分間インキュベートし、続いて、ＭＯＭ希釈用液（ＶＥＣＴＯＲ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で希釈したロバ抗マウスＩｇＧ５５５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１：４００）およびＨｏｅｃｈｓｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，６２２４６；１：１００００）染料とともにインキュベートした。試料間で同じ取得設定を用いて画像化をＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｚ１上で実施し、ＦＩＪＩを用いてａＳＭＡ発現の倍率変化を定量化した。ａＳＭＡの平均蛍光強度をＭｅａｓｕｒｅツール（Ｓｅｔ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓは「ｍｅａｎ ｇｒｅｙ ｖａｌｕｅ」）を用いて定量化し、総細胞数に対して正規化した。閾値、分水界および分析粒子ツールを用いてフィールドあたりのすべての核を分析することにより、総細胞数を定量化した。ウェルあたり、関心のある合計１０領域を分析した。Ｐｒｉｓｍ８を用い、統計的有意性の決定をｐ＜０．０５として、データの統計解析を実施した。テューキーの多重比較検定を適用した。正規性はダゴスティーノ－ピアソンオムニバス正規性検定では証明されなかったため、Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓａｍｐｌｅｓ Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を利用した。盲検法（英数字コードによる試料の標識）を線維芽細胞ａＳＭＡ発現を解析するために実装した。
【0140】
初代成体心臓線維芽細胞の単離および培養
初代成体マウス心室線維芽細胞（ＡＭＶＦ）を、以前に記載されたプロトコル（Ｔｒａｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．７０、９５８－９７１（２０１７））に多少の変更を加えて調製した。簡潔に述べると、マウスをイソフルランで麻酔し、腹腔内注射を介して１００μＬのヘパリン（１００Ｕ／ｍＬ）を投与した。心臓を摘出し、大動脈根のカニューレ挿入によりただちにランゲンドルフ装置に吊るし、潅流を、最初の４分間の潅流緩衝液（１１３ｍＭ ＮａＣｌ、４．７ｍＭ ＫＣｌ、０．６ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．６ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１２ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ ＫＨＣＯ３、３０ｍＭ タウリン、１０ｍＭ ２，３－ブタンジオンモノキシム、５．５ｍＭ Ｄ－（＋）－グルコース、ｐＨ７．４）をともなって開始し３７℃で４ｍＬ／分の一定速度で潅流をおこなった。その後、カルシウムを含まない消化緩衝液（潅流緩衝液中に４００ユニット／ｍＬのコラゲナーゼＩＩ；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ ＬＳ００４１７７）での３分間の潅流と続く５０μＭ ＣａＣｌ２を含む消化緩衝液での１２分間の潅流によって、酵素消化を達成した。心臓を潅流装置から除去し、心房を除去し、停止緩衝液（潅流緩衝液中に１０％ＦＢＳおよび１２．５μＭのＣａＣｌ２）中に心室を置いた。組織が十分に消化されるまで、トランスファーピペットを用いて心室を穏やかに機械的に破砕した。細胞懸濁液を２５０μｍのメッシュに通して濾過し、ＣＭを１０分間重力によって沈降させた；最初の非ＣＭ画分を含む上清を回収した。ＣＭを追加の１０ｍＬの停止緩衝液中で再懸濁し、次いで１０分間沈降させた。上清を回収し、両方の非ＣＭ画分を５００×ｇで５分間遠心分離した。ＣＭを破棄した。非ＣＭを再懸濁し、混合し、１０％ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）ＦＢＳ（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ－Ｐｒｏｄｕｃｔｓ １００－１０６）、１％ペニシリンストレプトマイシン Ｌ－グルタミン（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３０－００９－Ｃｌ）および１μｍｏｌ／Ｌアスコルビン酸を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ １０－０９２－ＣＶ）から成る増殖培地に播いた。８０％コンフルエントに達した時点で、自発的な活性化を抑制する試みとして、ＡＭＶＦをＰ１に１回継代し、下流のアッセイのために適切に播種した。
初代成体マウス心室線維芽細胞（ＡＭＶＦ）を、以前に記載されたプロトコル（Ｔｒａｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．７０、９５８－９７１（２０１７））に多少の変更を加えて調製した。簡潔に述べると、マウスをイソフルランで麻酔し、腹腔内注射を介して１００μＬのヘパリン（１００Ｕ／ｍＬ）を投与した。心臓を摘出し、大動脈根のカニューレ挿入によりただちにランゲンドルフ装置に吊るし、潅流を、最初の４分間の潅流緩衝液（１１３ｍＭ ＮａＣｌ、４．７ｍＭ ＫＣｌ、０．６ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．６ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１２ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ ＫＨＣＯ３、３０ｍＭ タウリン、１０ｍＭ ２，３－ブタンジオンモノキシム、５．５ｍＭ Ｄ－（＋）－グルコース、ｐＨ７．４）をともなって開始し３７℃で４ｍＬ／分の一定速度で潅流をおこなった。その後、カルシウムを含まない消化緩衝液（潅流緩衝液中に４００ユニット／ｍＬのコラゲナーゼＩＩ；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ ＬＳ００４１７７）での３分間の潅流と続く５０μＭ ＣａＣｌ２を含む消化緩衝液での１２分間の潅流によって、酵素消化を達成した。心臓を潅流装置から除去し、心房を除去し、停止緩衝液（潅流緩衝液中に１０％ＦＢＳおよび１２．５μＭのＣａＣｌ２）中に心室を置いた。組織が十分に消化されるまで、トランスファーピペットを用いて心室を穏やかに機械的に破砕した。細胞懸濁液を２５０μｍのメッシュに通して濾過し、ＣＭを１０分間重力によって沈降させた；最初の非ＣＭ画分を含む上清を回収した。ＣＭを追加の１０ｍＬの停止緩衝液中で再懸濁し、次いで１０分間沈降させた。上清を回収し、両方の非ＣＭ画分を５００×ｇで５分間遠心分離した。ＣＭを破棄した。非ＣＭを再懸濁し、混合し、１０％ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）ＦＢＳ（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ－Ｐｒｏｄｕｃｔｓ １００－１０６）、１％ペニシリンストレプトマイシン Ｌ－グルタミン（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３０－００９－Ｃｌ）および１μｍｏｌ／Ｌアスコルビン酸を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ １０－０９２－ＣＶ）から成る増殖培地に播いた。８０％コンフルエントに達した時点で、自発的な活性化を抑制する試みとして、ＡＭＶＦをＰ１に１回継代し、下流のアッセイのために適切に播種した。
【0141】
コラーゲンゲル収縮アッセイ
圧縮性コラーゲンを、３７Ｃで１．５時間インキュベートすることにより、ＰｕｒｅＣｏｌ ＥＺゲル溶液（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＢｉｏＭａｔｒｉｘ ５０７４）を用いて２４－ウェルプレートに調製した。一晩の血清欠乏（０．１％ ＦＢＳ）による平衡化の２４時間前に、コラーゲンゲル上に血清添加増殖培地に懸濁した継代１ＡＭＶＦを播種し（１５０，０００細胞／ゲル）、２４時間後、一晩の血清欠乏（０．１％ＦＢＳ）により平衡化した。血清飢餓の間、製造者の指示に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ １３７７８０３０）を用いてマウスＭｅｏｘ１に対するｓｉＲＮＡ（もしくはネガティブ対照ｓｉＲＮＡ）を細胞にトランスフェクションした。収縮の開始時、ゲルをウェルの壁から離し、トランスフェクション試薬を除去し、細胞を１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－β１（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ５０７２５１４３）で７２時間処理した。ウェルの画像を２４時間ごとにキャプチャした；各ウェルのゲル領域をＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて決定し、データを収縮率として記録する。
圧縮性コラーゲンを、３７Ｃで１．５時間インキュベートすることにより、ＰｕｒｅＣｏｌ ＥＺゲル溶液（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＢｉｏＭａｔｒｉｘ ５０７４）を用いて２４－ウェルプレートに調製した。一晩の血清欠乏（０．１％ ＦＢＳ）による平衡化の２４時間前に、コラーゲンゲル上に血清添加増殖培地に懸濁した継代１ＡＭＶＦを播種し（１５０，０００細胞／ゲル）、２４時間後、一晩の血清欠乏（０．１％ＦＢＳ）により平衡化した。血清飢餓の間、製造者の指示に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ １３７７８０３０）を用いてマウスＭｅｏｘ１に対するｓｉＲＮＡ（もしくはネガティブ対照ｓｉＲＮＡ）を細胞にトランスフェクションした。収縮の開始時、ゲルをウェルの壁から離し、トランスフェクション試薬を除去し、細胞を１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－β１（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ５０７２５１４３）で７２時間処理した。ウェルの画像を２４時間ごとにキャプチャした；各ウェルのゲル領域をＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて決定し、データを収縮率として記録する。
【0142】
ＥｄＵ（５－エチル－２’－デオキシウリジン）取り込みアッセイ
継代１のＡＭＶＦを、２０，０００細胞／ウェルの密度で、ガラスのカバースリップを含む１２ウェルプレートに２４時間播種し、続いて血清飢餓培地（０．１％ＦＢＳ）中で一晩平衡化した。また、血清飢餓の間、製造者の指示に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ １３７７８０３０）を用いてマウスＭｅｏｘ１に対するｓｉＲＮＡ（もしくはネガティブ対照ｓｉＲＮＡ）を細胞にトランスフェクションした。培地を交換し、細胞を１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－β１（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ５０７２５１４３）で４８時間刺激した；ＡＭＶＦを１０μＭの５－エチル－２’－デオキシウリジン（ＥｄＵ）とともに同時にインキュベートすることで刺激の４８時間にわたって増殖性細胞を標識した。ＡＭＶＦを３．７％ホルムアルデヒドで固定し、製造者のプロトコルに従い、イメージングのためのＣｌｉｃｋ－ｉＴ（商標）ＥｄＵイメージングキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃ１０３３７）を用いてＥｄＵ－陽性細胞を検出した。ＰｒｏＬｏｎｇ（商標）Ｄｉａｍｏｎｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｐ３６９６１）を用いて、カバースリップをマウントし、一晩硬化させてからキーエンスＢＺ－Ｘ７１０蛍光顕微鏡上で画像化した。フィールドあたり検出された核の数に対するＥｄＵ陽性細胞の割合を定量化することにより、ＥｄＵ取り込みの割合を決定した。
継代１のＡＭＶＦを、２０，０００細胞／ウェルの密度で、ガラスのカバースリップを含む１２ウェルプレートに２４時間播種し、続いて血清飢餓培地（０．１％ＦＢＳ）中で一晩平衡化した。また、血清飢餓の間、製造者の指示に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ １３７７８０３０）を用いてマウスＭｅｏｘ１に対するｓｉＲＮＡ（もしくはネガティブ対照ｓｉＲＮＡ）を細胞にトランスフェクションした。培地を交換し、細胞を１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－β１（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ５０７２５１４３）で４８時間刺激した；ＡＭＶＦを１０μＭの５－エチル－２’－デオキシウリジン（ＥｄＵ）とともに同時にインキュベートすることで刺激の４８時間にわたって増殖性細胞を標識した。ＡＭＶＦを３．７％ホルムアルデヒドで固定し、製造者のプロトコルに従い、イメージングのためのＣｌｉｃｋ－ｉＴ（商標）ＥｄＵイメージングキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃ１０３３７）を用いてＥｄＵ－陽性細胞を検出した。ＰｒｏＬｏｎｇ（商標）Ｄｉａｍｏｎｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｐ３６９６１）を用いて、カバースリップをマウントし、一晩硬化させてからキーエンスＢＺ－Ｘ７１０蛍光顕微鏡上で画像化した。フィールドあたり検出された核の数に対するＥｄＵ陽性細胞の割合を定量化することにより、ＥｄＵ取り込みの割合を決定した。
【0143】
肺、肝臓、および腎臓由来のヒト線維芽細胞
肺（ＡＴＣＣ、＃ＣＲＬ－４０５８）、肝臓（ＣＥＬＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＩＮＣ、＃７１２－０５ｆ）および腎臓（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、＃Ｈ－６０１６）由来のヒト線維芽細胞を継代しマウス心臓線維芽細胞のように増殖させた（詳細は「心臓線維芽細胞不死化細胞株の作製、培養条件およびＴＧＦβ刺激」の節を参照されたい）。簡潔に述べると、１日目に６ウェルプレートに１×１０５個／ウェルでヒト線維芽細胞を播種した。２日目に、培地を０．５％ＦＢＳを含む同じ基礎培地に交換した。３日目に、ＴＧＦ－β１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃１００－２１Ｃ）を１０ｎｇ／ｍｌの濃度で培地へ添加した。ＪＱ１を０．５μＭの終濃度で添加した。５日目に、ＲＴ－ｑＰＣＲおよび遺伝子発現解析のために細胞を回収した。
肺（ＡＴＣＣ、＃ＣＲＬ－４０５８）、肝臓（ＣＥＬＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＩＮＣ、＃７１２－０５ｆ）および腎臓（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、＃Ｈ－６０１６）由来のヒト線維芽細胞を継代しマウス心臓線維芽細胞のように増殖させた（詳細は「心臓線維芽細胞不死化細胞株の作製、培養条件およびＴＧＦβ刺激」の節を参照されたい）。簡潔に述べると、１日目に６ウェルプレートに１×１０５個／ウェルでヒト線維芽細胞を播種した。２日目に、培地を０．５％ＦＢＳを含む同じ基礎培地に交換した。３日目に、ＴＧＦ－β１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃１００－２１Ｃ）を１０ｎｇ／ｍｌの濃度で培地へ添加した。ＪＱ１を０．５μＭの終濃度で添加した。５日目に、ＲＴ－ｑＰＣＲおよび遺伝子発現解析のために細胞を回収した。
【0144】
遺伝子オントロジー（ＧＯ）解析
遠位エレメントのＧＯ解析を、ＧＲＥＡＴを用いて実施した（ｇｒｅａｔ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｐｕｂｌｉｃ／ｈｔｍｌ／を参照）。タンパク質コード遺伝子のＧＯ解析をＥｎｒｉｃｈｒ（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １４、１２８（２０１３））を用いて実施した。
遠位エレメントのＧＯ解析を、ＧＲＥＡＴを用いて実施した（ｇｒｅａｔ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｐｕｂｌｉｃ／ｈｔｍｌ／を参照）。タンパク質コード遺伝子のＧＯ解析をＥｎｒｉｃｈｒ（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １４、１２８（２０１３））を用いて実施した。
【0145】
統計と再現性
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を用いて標準的な統計解析を実施した。複数の条件を比較する場合、一元配置分散分析に続くテューキーの範囲検定を実施することで、条件のペア間での有意性を評価した。２つの条件のみを検定する場合、我々はスチューデントのｔ検定を実施した。クロマチンアクセシビリティを示す図に関連するすべてのｐ値は両側ウィルコクソン検定を用いて取得した。心機能に関するすべての定量化については、ＲＴ－ｑＰＣＲによる遺伝子発現、コラーゲン収縮およびＥｄＵ取り込み平均値±ＳＥＭを図中に報告した。ＲＴ－ｑＰＣＲ解析もしくはＲＮＡｓｅｑ ＦＰＫＭによる遺伝子発現データについては、反復実験の数をグラフ中のデータポイントとして示す。すべてのグラフにおける有意性のレベルを以下のように表す：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を用いて標準的な統計解析を実施した。複数の条件を比較する場合、一元配置分散分析に続くテューキーの範囲検定を実施することで、条件のペア間での有意性を評価した。２つの条件のみを検定する場合、我々はスチューデントのｔ検定を実施した。クロマチンアクセシビリティを示す図に関連するすべてのｐ値は両側ウィルコクソン検定を用いて取得した。心機能に関するすべての定量化については、ＲＴ－ｑＰＣＲによる遺伝子発現、コラーゲン収縮およびＥｄＵ取り込み平均値±ＳＥＭを図中に報告した。ＲＴ－ｑＰＣＲ解析もしくはＲＮＡｓｅｑ ＦＰＫＭによる遺伝子発現データについては、反復実験の数をグラフ中のデータポイントとして示す。すべてのグラフにおける有意性のレベルを以下のように表す：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【0146】
【表2】
【0147】
【表3】
【0148】
【表4】
【0149】
【表5】
【0150】
【表6】
【0151】
【表7】
【0152】
【表8】
【0153】
実施例２：ＢＥＴ阻害を伴う心不全の動的可逆性の追跡および筋線維芽細胞状態
本実施例では、心不全のマウスモデルにおける低分子ＢＥＴブロモドメイン阻害の治療効果の調査、およびそのような心不全がＣＰＩ－４５６の投与の開始、休薬、および再開により可逆的であるかどうかについて記述する。
本実施例では、心不全のマウスモデルにおける低分子ＢＥＴブロモドメイン阻害の治療効果の調査、およびそのような心不全がＣＰＩ－４５６の投与の開始、休薬、および再開により可逆的であるかどうかについて記述する。
【0154】
最初の研究では、恒久的な前壁心筋梗塞（ＭＩ）により誘導された心不全のマウスモデルにおいて、化合物ＣＰＩ－４５６を評価した。ＣＰＩ－４５６は、ナノモル以下の効力と薬物に類似した薬物動態特性を有する経口投与可能な生物学的に利用できるＢＥＴブロモドメイン阻害剤であり、当初は癌治療のための臨床候補として開発された。
【0155】
ＭＩの５日後に開始した１カ月のＣＰＩ－４５６の治療では、左心室（ＬＶ）の収縮機能が有意に改善された（図２Ａ）。その後の３週間、ＣＰＩ－４５６を中断したところ、ＬＶの収縮機能が低下した（図２Ａ）。その後の２週間の再投与では、最初の治療段階と同程度にＬＶの収縮機能が改善され、再び、その後の本試験の最終週でのＣＰＩ－４５６の中止によりＬＶ機能の低下は未治療対照のものへと戻った。
【0156】
同様の可逆性は、横大動脈狭窄（ＴＡＣ）を介して達成されたＬＶ圧負荷誘導心不全のよく確立されたマウスモデルにおいて、低分子ＢＥＴ阻害剤ＪＱ１を用いたときに観察された（図２Ｂ）。ＪＱ１の構造を以下に示す。
【0157】
【化9】
【0158】
総合して、異なるマウスの心不全モデルにおいて化学的に多様なＢＥＴブロモドメイン阻害剤を使用することにより、これらの研究はＬＶ機能における有意な治療上の可逆性を示している。
【0159】
ＢＥＴブロモドメイン阻害はエンハンサーからプロモーターのシグナル伝達を可逆的に阻害することから、本発明者らはＢＥＴ阻害剤への暴露により、それらの観察された治療効果に相関する様式で、ｉｎ ｖｉｖｏで心臓細胞の状態における可逆的な変化を引き起こすことが可能であると仮定した。
【0160】
ＬＶ収縮機能におけるＢＥＴ阻害の顕著な保護効果を考慮し、最初の実験は心筋細胞（ＣＭ）のプロファイリングに焦点を当てた。すべての続くｉｎ ｖｉｖｏのトランスクリプトームおよびエピゲノム解析は、ＬＶすべての領域で画一的かつ高い再現性でストレスを与えるマウスＴＡＣモデルにおいて実施された。成体ＣＭの大部分は大きすぎて典型的なシングルセルマイクロ流体ワークフローに適切に格納することができないため、本発明者らは成体のＣＭを単離し、バルクＲＮＡ－Ｓｅｑによりそれらを解析した。
【0161】
驚くべきことに、単離された成体のＣＭのトランスクリプトームにおけるＪＱ１の効果は、以前に発表された全ＬＶ組織のトランスクリプトームの特徴と比較すると控え目であり（＜３％重複）、このことは遺伝子発現変化におけるもっとも強固な効果は非ＣＭ集団において生じていることを強く示すものであった。そこで、本発明者らは、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓプラットフォームを用いてマウスの心臓の非ＣＭ区分におけるシングルセルＲＮＡシーケンシング（ｓｃＲＮＡｓｅｑ）を実施した。
【0162】
本発明者らは、４つの実験群から収集した３５，０００個以上の個々の細胞をシーケンシングした：Ｓｈａｍ、ＴＡＣビヒクル処理（ＴＡＣ）、ＴＡＣ ＪＱ１処理（ＴＡＣ－ＪＱ１）およびＴＡＣ ＪＱ１処理に続くＪＱ１の休薬（ＴＡＣ ＪＱ１休薬）（図２Ｃ）である。ｓｃＲＮＡｓｅｑの教師なしクラスタリングにより、線維芽細胞（ＦＢ）、内皮細胞、骨髄細胞および心外膜細胞を含む多様な心臓細胞亜集団を適切に同定した（図２Ｄ）。このクラスタリングでの最も顕著な発見は線維芽細胞集団において明らかであり、ＴＡＣが細胞状態の大きな遷移を引き起こし、ＪＱ１処理がこの細胞状態をＳｈａｍ状態に近いものへと近づける、細胞状態の劇的な回復を導いた（図２Ｅ）。ＪＱ１の休薬は、ＴＡＣ様のストレス状態へと戻るＦＢ集団の遷移と関連し、このことはＪＱ１暴露に対するこの細胞区分の可逆的な感受性を強調していた（図２Ｅ）。興味深いことに、ＪＱ１の暴露はまた、内皮および骨髄の区分において動的なトランスクリプトームの遷移を引き起こした（図２Ｅ）。しかしながら、Ｓｈａｍ－とＴＡＣ－様状態の間のＦＢの可逆的な遷移とは対照的に、細胞状態のＪＱ１を介した遷移の鮮明な可逆性は、内皮および骨髄細胞においてはあまり明らかではなかった。
【0163】
ＪＱ１暴露／休薬に応答した線維芽細胞状態のほぼ完全な双方向可逆性を考慮して、本発明者らは、線維芽細胞区分の転写の可逆性を分析することに着目した。１３，９３７個の個々の線維芽細胞のトランスクリプトームの差次的発現解析により、Ｓｈａｍ群とＴＡＣ ＪＱ１群の間の強い類似性が指摘され、ＢＥＴ阻害によってかなり減弱した線維化促進遺伝子の核となる特性が強調された（図２Ｆ）。線維芽細胞の部分集合化および再クラスタリングにより、さらに、ＪＱ１暴露への応答におけるＳｈａｍとＴＡＣの状態の間の線維芽細胞の強固な可逆性が示された（図２Ｇ）。
【0164】
心臓ストレスは、常在線維芽細胞を筋線維芽細胞（ｍｙｏＦＢ）と呼ばれる収縮性および合成性のある状態へ遷移する引き金となり得る。ｍｙｏＦＢマーカー遺伝子Ｐｏｓｔｎの重ね合わせにより、ＴＡＣがｍｙｏＦＢの活性化を導くことが示された。しかしながら、ＪＱ１の投与はｍｙｏＦＢ細胞の状態をＳｈａｍ様の状態へ戻し、ＪＱ１の休薬はこれらの細胞をｍｙｏＦＢに戻す（図２Ｈ）。線維芽細胞のサブクラスタリングにより、基底ＦＢ状態（ＳｈａｍおよびＴＡＣ ＪＱ１細胞を含む；クラスター０、１、および４）対ｍｙｏＦＢ状態（ＴＡＣおよびＴＡＣ ＪＱ１休薬細胞を含む；クラスター２、３、および５）の区分を示す１０個のクラスターが存在することが示された（図２Ｉ）。
【0165】
遺伝子オントロジー（ＧＯ）解析により、基底線維芽細胞ホメオスタシスと関連した遺伝子プログラムがＳｈａｍおよびＴＡＣ ＪＱ１細胞においてどのように濃縮されているかということ、さらにＴＡＣおよびＴＡＣ ＪＱ１休薬集団は線維化促進性、分泌性、増殖性、および遊走性の遺伝子プログラムにおいて濃縮されているということが強調された（図２Ｉ）。総合すると、これらのデータは、基底線維芽細胞状態と活性化されたｍｙｏＦＢ状態との間の可逆的な遷移を転写阻害を用いて強固に切り替え得ることを示し、このことはｍｙｏＦＢにおけるＢＥＴタンパク質機能が心不全発症の軌跡に影響を与えることを示している。線維芽細胞における線維化誘導および分泌性タンパク質の動的な制御を考慮すると、ＢＥＴ阻害の効果は細胞自律的および非細胞自律的であり得る。
【0166】
実施例３：心不全におけるクロマチンアクセシビリティおよびエンハンサー活性化
本発明者らは、ＪＱ１暴露の結果観察される転写可逆性は、心不全発症時の心臓線維芽細胞およびその他の内在性の心臓細胞タイプ内のクロマチンアクセシビリティおよびエンハンサー活性化において対応する変化によって裏付けられるだろうという仮説を立てた。これを検証するために、本発明者らは、シングルセルトランスクリプトーム解析を、ｓｃＲＮＡｓｅｑに使用したものと同じ心臓からのトランスポラーゼ－アクセシブルクロマチンシーケンシングのためのシングルセルアッセイ（ｓｃＡＴＡＣｓｅｑ）と統合した（図２Ｃ）。
本発明者らは、ＪＱ１暴露の結果観察される転写可逆性は、心不全発症時の心臓線維芽細胞およびその他の内在性の心臓細胞タイプ内のクロマチンアクセシビリティおよびエンハンサー活性化において対応する変化によって裏付けられるだろうという仮説を立てた。これを検証するために、本発明者らは、シングルセルトランスクリプトーム解析を、ｓｃＲＮＡｓｅｑに使用したものと同じ心臓からのトランスポラーゼ－アクセシブルクロマチンシーケンシングのためのシングルセルアッセイ（ｓｃＡＴＡＣｓｅｑ）と統合した（図２Ｃ）。
【0167】
本発明者らは、３１，７６６個の個々の細胞に分布する４９０，０２０のアクセス可能な部位を同定し、クロマチンの特徴に基づいて細胞の同一性を割り当てた。本研究の焦点は遠位の調節エレメントを分析することであった。したがって、本発明者らは、プロモーターおよび遺伝子本体におけるアクセス可能な部位を除外し、その後のすべての解析に使用される、線維芽細胞、骨髄、および内皮で濃縮された遠位エレメントのカタログを定義した。
【0168】
興味深いことに、線維芽細胞はＴＡＣの後にクロマチンアクセシビリティの有意に大きな増加を示し、これはＪＱ１処理を用いて可逆的に減弱され（図３Ａ）、この特徴は骨髄および内皮細胞ではあまり明白ではなかった（図３Ｉ～３Ｊ）。このことは、線維芽細胞集団が、部分的にＢＥＴタンパク質に依存した慢性心不全時のクロマチン活性化を優先的に受けることを強調している。クロマチン活性化における動的および可逆的な変化を分析するために、本発明者らは、４つの試料にわたって開いているおよび閉じている遠位エレメントを定義し、すべての条件にわたって構成的に開いていた領域を除外した。図３Ｂに示されるように、クロマチン状態の強固な可逆性は、特に線維芽細胞において、ストレスおよびＢＥＴ阻害に応答して生じた。
【0169】
非常に感度が高く非常に動的な線維芽細胞遠位エレメントのクラスターが本発明者らによって同定され、それらはＳｈａｍでは閉じ、ＴＡＣでは開き、ＪＱ１では閉じ、そしてＪＱ１休薬後に確実に再アクセス可能であった（クラスター２、図３Ｂ）。ＧＯ解析では、これらの領域が、有害な心臓リモデリングおよび線維化の２つの特徴である心臓の肥大および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の組織化を調節する遺伝子の近傍に存在することが示された。興味深いことに、本発明者らはまた、ＳｈａｍからＴＡＣの際に開きＪＱ１には非感受性である線維芽細胞領域の大きなクラスターを同定し、このことはＢＥＴ非依存性であるストレス応答性クロマチン活性化の特徴を強調していた（クラスター９、図３Ｂ）。
【0170】
次に、本発明者らは、心臓の機能において有意な変化が生じる上述の３つの表現型遷移で動的に調整される領域において、どのように転写因子（ＴＦ）結合モチーフのアクセシビリティが変化したかを探索した：ＳｈａｍからＴＡＣ、ＴＡＣからＴＡＣ－ＪＱ１、およびＴＡＣ－ＪＱ１からＴＡＣ－ＪＱ１休薬である。線維芽細胞において、ＣＥＢＰＢ、ＪＵＮおよびＭＥＯＸ１のＴＦ結合モチーフでは、ＳｈａｍからＴＡＣへの変遷時のアクセス可能な領域においては濃縮が示された。その後のＢＥＴ阻害では濃縮の消失が、次いでＪＱ１休薬では濃縮の再獲得が示された。これらのデータは、ストレス活性化ＴＦについて機能的に関連するモチーフで濃縮された領域においてクロマチンダイナミクスが生じていることを示す（図３Ｃ）。
【0171】
次に、本発明者らは、ｓｃＡＴＡＣｓｅｑ中に発見された機能的に関連する線維芽細胞および活性化ｍｙｏＦＢのエンハンサーを同定しようと努めた。研究により、エンハンサーは広範に転写され得ること、そしてこの新生転写活性は強固でありエンハンサー活性の独立した指標であることが示される。そこで、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養された線維芽細胞に対し精密核ランオン転写シーケンシング（ＰＲＯｓｅｑ；Ｍａｈａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１１：１４５５－１４７６（２０１６））を実施することでゲノムワイドなＲＮＡポリメラーゼＩＩ新生転写をマッピングし推定的な活性化エンハンサーを同定した。ＰＲＯｓｅｑは大量の細胞を必要とするため、本発明者らは、初代成体マウス心臓線維芽細胞から不死化株を作製し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｍｙｏＦＢ細胞状態遷移を誘発するための古典的な刺激物質であるＴＧＦ－βで不死化細胞株を処理した（Ｄｏｂａｃｚｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．５１，６００－６０６（２０１１））。本発明者らは、ＴＧＦ－β刺激後に有意に多く転写され、線維化促進および合成促進遺伝子の近傍に位置する１セットの遠位エレメントを同定した（図３Ｄ）。ｓｃＡＴＡＣｓｅｑデータを用いて、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏでＳｈａｍとＴＡＣの間で開いているかまたは閉じているかのいずれかである遠位エレメントを同定し、次いでこれらと同一の領域で、培養されたＦＢにおけるＰＲＯｓｅｑシグナルを評価した。図３Ｅに示されるように、培養された線維芽細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏのＴＧＦ－β刺激は、心不全発症時のｉｎ ｖｉｖｏの内在性線維芽細胞において生じるものと類似した全体的な転写の変化を誘発する。Ｐｏｓｔｎ座位の可視化は、ＴＡＣ後にｉｎ ｖｉｖｏで生じたクロマチン開口が存在するところを示し、それはＪＱ１暴露に対する動的な感受性と相関した。この大きなエンハンサーのうち、ＰＲＯｓｅｑはピーク１１を、ＴＧＦ－β処理後に大量に転写される特定の領域（ピーク１１）として明らかにした。Ｐｏｓｔｎプロモーターとピーク１１領域との間のｓｃＡＴＡＣｓｅｑコアクセシビリティ解析は、Ｓｈａｍ状態では低いコアクセシビリティ、ＴＡＣに対してはコアクセシビリティの強固な増加、そしてＪＱ１暴露に対してはコアクセシビリティの調節を示した。
【0172】
ＫＲＡＢリプレッサータンパク質に融合した触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質（ｄＣａｓ９）を展開するＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）（Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １５４，４４２－４５１（２０１３））を、ピーク１１領域に特異的なガイドＲＮＡとともに使用することで、線維芽細胞におけるこの特定の調節エレメントの配列特異的抑制を駆動した。本発明者らは、このピーク１１領域がＴＧＦ－β刺激に続くＰｏｓｔｎ誘導に必須であることを見出した（図３Ｆ）。
【0173】
ｍｙｏＦＢのマーカーであるＰｏｓｔｎの動的な転写制御が実証されたことから、本発明者らは、本明細書に記載されるようにシングルセルトランスクリプトームとエピゲノムを統合したアプローチは疾患発症時の細胞内ストレス応答を制御する新規のメカニズムの発見に活用し得ると仮定した。したがって、本発明者らは、バイアスのないエンハンサー発見パイプラインを構築することで、心不全の進行および回復における役割を果たし得る遠位エレメントを明らかにした。疾患心臓（ＴＡＣ）における我々のｓｃＡＴＡＣｓｅｑのデータを使用して、線維芽細胞、骨髄細胞および内皮細胞について、細胞集団で濃縮された大きなエンハンサー（ストレッチまたはスーパーエンハンサーとしても知られている）のカタログを構築した。ＢＥＴ阻害は、ＴＡＣモデルにおいて心機能を確実に改善したため、本発明者らは、線維芽細胞、骨髄細胞、および内皮細胞におけるこれらのエンハンサーのアクセシビリティの程度をＬＶ駆出率と関連付けた。エンハンサークロマチンアクセシビリティと生理学的特性（この場合、ＬＶ駆出率）の間の相関分析は、図３Ｇに要約される。エンハンサーエレメントのアクセシビリティが心機能と反相関する場合、エンハンサーエレメントは負の相関を有するものとして定義された（すなわち、これらエンハンサーは心機能が低下する設定であるＳｈａｍからＴＡＣでは開いていた）。対照的に、正の相関を有するエンハンサーは、ＳｈａｍからＴＡＣでは閉じていた。相関係数のボルケーノプロットを各細胞タイプごとに作成した（図３Ｈ）。線維芽細胞において同定された４７０個の大きなエンハンサーのうち、４８個は強い負の相関を示し、一方２２個は強い正の相関を示した（図３Ｈ）。
【0174】
実施例４：Ｍｅｏｘ１は筋線維芽細胞特異的転写因子である
本実施例は、Ｍｅｏｘ１が筋線維芽細胞特異的転写因子であることを示している。
線維芽細胞内で最も負の相関を示すエレメントの１つは、沿軸中胚葉内で発現し硬節の発生に必要なホメオドメインを含む転写因子である、Ｍｅｏｘ１の下流の大きなエンハンサーであった（図３Ｈ）。Ｍｅｏｘ１は健常なマウスの心臓では最小限に発現したがＴＡＣに続くＭｙｏＦＢでは高度に発現上昇したため、特に興味深い（図４Ａ）。ＢＥＴ阻害はＭｅｏｘ１の発現を消失させるが、ＪＱ１休薬はＭｅｏｘ１発現の強固な再誘導と関連した（図４Ａ）。内在性心臓線維芽細胞におけるクロマチンの動的にアクセス可能な領域に付随するＭＥＯＸ１のＤＮＡ結合モチーフの濃縮と組み合わせると（図３Ｃ）、このことは、ストレス条件下で、重要な線維芽細胞調節エレメントとＭＥＯＸ１の動的な発現上昇および機能的関与を示した。
本実施例は、Ｍｅｏｘ１が筋線維芽細胞特異的転写因子であることを示している。
線維芽細胞内で最も負の相関を示すエレメントの１つは、沿軸中胚葉内で発現し硬節の発生に必要なホメオドメインを含む転写因子である、Ｍｅｏｘ１の下流の大きなエンハンサーであった（図３Ｈ）。Ｍｅｏｘ１は健常なマウスの心臓では最小限に発現したがＴＡＣに続くＭｙｏＦＢでは高度に発現上昇したため、特に興味深い（図４Ａ）。ＢＥＴ阻害はＭｅｏｘ１の発現を消失させるが、ＪＱ１休薬はＭｅｏｘ１発現の強固な再誘導と関連した（図４Ａ）。内在性心臓線維芽細胞におけるクロマチンの動的にアクセス可能な領域に付随するＭＥＯＸ１のＤＮＡ結合モチーフの濃縮と組み合わせると（図３Ｃ）、このことは、ストレス条件下で、重要な線維芽細胞調節エレメントとＭＥＯＸ１の動的な発現上昇および機能的関与を示した。
【0175】
Ｍｅｏｘ１下流のエンハンサーは、線維芽細胞においてストレスおよびＪＱ１暴露に極度に感受性が高かったが、骨髄および内皮細胞ではそうではなかった（図４Ｂおよび４Ｅ）。このエンハンサーは、線維芽細胞でのＳｈａｍからＴＡＣ状態への遷移において有意に開く１０個のピークを有し、これらのピークは、この遷移においてアクセス可能であり、ＪＱ１処理によりＳｈａｍレベルに戻って閉じ、ＪＱ１が休薬された際に再度開いた（図４Ｂ、４Ｅ～４Ｆ）。Ｍｅｏｘ１エンハンサーのすべての個々のピークにおけるクロマチンアクセシビリティの解析により、特定のエレメントが動的に調節されていることが示された。
【0176】
マウス１１番染色体１０１，８２８，４０１位から１０１，８３３，０６８位におけるマウスＭｅｏｘ１ピーク９／１０領域の配列を以下に示す（配列番号７４）。
【0177】
【化10-1】
【0178】
【化10-2】
【0179】
【化10-3】
【0180】
成体マウスＬＶ組織由来の公的に入手可能であるＢＲＤ４およびＨ３Ｋ２７ａｃのＣｈＩＰ－Ｓｅｑデータにより、Ｍｅｏｘ１座位における活性化エンハンサーマークが裏付けされ、ＣＴＣＦ ＣｈＩＰｓｅｑでは、Ｍｅｏｘ１遺伝子とエンハンサーとの間の接触絶縁の非存在が一貫していたことから、このエンハンサーがＭｅｏｘ１を調節する可能性を提起した（図４Ｂ）。重要なことに、Ｍｅｏｘ１ ｍＲＮＡの発現はＴＧＦ－βで処理した培養線維芽細胞において誘導された（図４Ｇ）。
【0181】
ＴＧＦ－βで誘導されたＭｅｏｘ１の発現上昇はＪＱ１によって抑制され、３つのＢＥＴ（Ｂｒｄ２、Ｂｒｄ３またはＢｒｄ４）のそれぞれを個別にｓｉＲＮＡでノックダウンするとＭｅｏｘ１誘導はＢＲＤ２またはＢＲＤ３ではなく、ＢＲＤ４依存的であることが示された（図４Ｉ～４Ｊ）。ｉｎ ｖｉｖｏでのＴＡＣによるアクセシビリティの増加を示すこの座位において、個々のｓｃＡＴＡＣ－ｓｅｑピークの中で、培養線維芽細胞のＰＲＯｓｅｑにより、ＴＧＦ－β刺激に続く新生転写の顕著な増加を特徴とするＭｅｏｘ１プロモーターの６２キロベース（ｋｂ）下流に位置する特定の領域（ピーク９／１０）を同定することができた（図４Ｂ）。注目すべきは、この７８０塩基対（ｂｐ）のエレメントがＭｅｏｘ１遺伝子本体そのものよりも強いＴＧＦ－β刺激による転写を示し、またＴＧＦ－β刺激に応答して全ゲノムにわたって最も異なって転写される領域の一つであったことである（図４Ｂ）。Ｍｅｏｘ１プロモーターおよびピーク９／１０領域は、Ｓｈａｍ状態においては低いコアクセシビリティを示し、ＴＡＣに応答してコアクセシビリティは強く増加し、ＢＥＴ阻害に応答してコアクセシビリティが調節された（図４Ｂ）。培養線維芽細胞におけるこの座位の染色体コンフォメーションキャプチャ解析により、ＴＧＦ－β刺激に応答してピーク９／１０エンハンサー領域とＭｅｏｘ１プロモーターとの間の接触において強固な増加が明らかとなり、これらのエレメント間の動的な接触と一致していた。大きなＭｅｏｘ１調節エレメントの中でほかの領域と比較すると、ピーク９／１０は、機能的に関連するエンハンサーの強力な予測因子である２つの特徴、強いクロマチンアクセシビリティおよび新生転写を特徴とした。ピーク９／１０の内在性の機能を決定的に調べるために、本発明者らは、個々の部位を特異的に標的としたガイド鎖を用いてＭｅｏｘ１座位において一連のＣＲＩＳＰＲｉ実験を実施し、ピーク９／１０エレメントがＴＧＦ－β刺激時のＭｅｏｘ１のトランスアクチベーションに必要であるが（図４Ｈ）、ｉｎ ｖｉｖｏで同定されたほかのアクセス可能領域はそうではない（データ非公表）ことを見出した。
【0182】
次に、本発明者らは、ＭＥＯＸ１の機能を調べ、この十分に特徴づけられていないホメオボックス転写因子は、線維性疾患に関与する遺伝子プログラムを直接調節している可能性を仮定した。ｓｉＲＮＡによるＭｅｏｘ１のノックダウンにより、ＴＧＦ－β刺激コラーゲンゲル収縮およびＥｄＵ取り込みの有意な減少が生じ、疾患病因におけるＭｙｏＦＢの２つの機能的特徴である収縮と増殖の表現型遷移にＭＥＯＸ１が必要であることを確認した（図５Ａ～５Ｃ）。ＣｈＩＰｓｅｑでは、ＭＥＯＸ１が線維芽細胞のホメオスタシスおよびストレス応答に関与する遺伝子に結合することが示された（図５Ｄ）。高度にＭＥＯＸ１が結合する遺伝子のＧＯ解析では、アポトーシス、ＥＣＭ／コラーゲン組織化および細胞接着に関連するタームの濃縮が示された。
【0183】
ＭＥＯＸ１がストレス応答性線維化促進遺伝子の転写を制御するかどうかを理解するために、本発明者らは、対照もしくはＭｅｏｘ１標的ｓｉＲＮＡのいずれかの存在下でＴＧＦ－β処理した線維芽細胞においてＰＲＯｓｅｑを実施した。Ｍｅｏｘ１が枯渇した場合、５０９遺伝子が有意に少なく転写され、一方で８１９遺伝子はより多く転写された（図５Ｅ）。特に、Ｍｅｏｘ１依存性遺伝子のＧＯ解析では、細胞運動性、増殖および遊走の調節などの線維化促過程のための濃縮が明らかとなった。これらの遺伝子の中には、ＣｔｇｆおよびＰｏｓｔｎを含む心臓のＭｙｏＦＢ活性化の古典的なマーカーが存在した。それらのプロモーターおよび近位調節エレメント（図３Ｆに記載されるＰｏｓｔｎピーク１１エンハンサーを含む）ではＭＥＯＸ１濃縮を示し、これらはＭｅｏｘ１欠乏に続いて転写の大きい減少を特徴とする領域である（図５Ｆ）。これらの知見は、ＭＥＯＸ１が、線維化疾患に関与する線維芽細胞からｍｙｏＦＢへのスイッチの際に必須転写メディエーターとして機能することを示す。ヒト成体心臓由来の最近の公的に入手可能であるシングルセルデータ（ｈｅａｒｔｃｅｌｌａｔｌａｓ．ｏｒｇを参照）を用いて、本発明者らは、ＭＥＯＸ１がＰＯＳＴＮと同じ活性化線維芽細胞のサブセットで特異的に発現していることを見出した。
【0184】
次に、本発明者らは、線維性疾患におけるＭＥＯＸ１の活性化がげっ歯類からヒトまで保存されているかどうかを探索した。ヒト成体心臓からのシングルセルデータは、ＭＥＯＸ１が活性化線維芽細胞で発現しＰＯＳＴＮとともに活性化線維芽細胞のクラスターを決定する上位遺伝子の一つであることを示した。ヒト胎児心臓由来のクロマチンアクセシビリティの最近のアトラスでは、ピーク９／１０のシンテニック領域が線維芽細胞におけるＭＥＯＸ１遠位エレメントの中で、アクセス可能なクロマチンの最も強いシグナルによって特徴付けられることを示した。心不全と同様に、多くの重大なヒトの疾患は、不適応な線維芽細胞の活性化を特徴とする。
【0185】
線維芽細胞は組織特異的な挙動を有し得るため、本発明者らは、ヒトの肺、肝臓および腎臓という、慢性的な臓器不全の状況において実質的な線維化をしばしば発症する３つの臓器に由来する線維芽細胞においてもまたＭＥＯＸ１が誘導されるかどうかを調べた。心臓における我々の知見と同様に、ＭＥＯＸ１の発現は、ＴＧＦβによって誘導され、ヒトの肺、肝臓および腎臓由来の線維芽細胞においてＪＱ１によって抑制された（図５Ｉ）。さらに、ＭＥＯＸ１の発現は、心筋症患者（ｎ＝１９３）由来の心臓組織および突発性肺線維症患者（ｎ＝３６）由来の肺組織において、つまり病的線維化を顕著な特徴とする２つのヒトの疾患において有意に発現上昇した（図５Ｇ～５Ｈ）。
【0186】
特に、ＭＥＯＸ１の発現は、心筋症患者由来の心臓組織および突発性肺線維症患者由来の肺組織などの線維症を顕著に特徴付けるヒトの疾患において、有意に発現上昇した（図５Ｇ～５Ｊ）。
【0187】
参考文献
【0188】
【表9-1】
【0189】
【表9-2】
【0190】
【表9-3】
【0191】
【表9-4】
【0192】
【表9-5】
【0193】
【表9-6】
【0194】
本明細書で参照もしくは言及したすべての特許および刊行物は、本発明が属する技術分野の当業者の技術レベルを示すものであり、そのように参照されている各特許もしくは各刊行物は、その全体が参照により個別に組み込まれていた場合、またはその全体が本明細書で説明されていた場合と、同じ程度に、これによって参照により明確に組み込まれている。出願人は、そのように引用された特許または刊行物からのあらゆるそしてすべての試料および情報を物理的に本明細書に組み込む権利を保有する。
【0195】
以下の付記は、本明細書の前述の記述に従った本発明の様々な実施形態を説明し要約することを意図するものである。
付記
１．少なくとも１つの試験薬剤を細胞集団と接触させることで試験アッセイ混合物を提供すること、および、Ｍｅｏｘ１レベルを測定することにより１つ以上のＭｅｏｘ１調節剤を同定することを含む方法。
付記
１．少なくとも１つの試験薬剤を細胞集団と接触させることで試験アッセイ混合物を提供すること、および、Ｍｅｏｘ１レベルを測定することにより１つ以上のＭｅｏｘ１調節剤を同定することを含む方法。
【0196】
２．前記細胞集団は、線維芽細胞、休止線維芽細胞、筋線維芽細胞またはそれらの組み合わせを含む、付記１に記載の方法。
３．前記細胞集団は活性化線維芽細胞を含む、付記１または２に記載の方法。
３．前記細胞集団は活性化線維芽細胞を含む、付記１または２に記載の方法。
【0197】
４．前記線維芽細胞がＴＧＦβによって活性化される、付記１～３のいずれか一項に記載の方法。
５．Ｍｅｏｘ１レベルを測定することはＭｅｏｘ１調節エレメントのクロマチンアクセシビリティを測定することを含む、付記１～４のいずれか一項に記載の方法。
５．Ｍｅｏｘ１レベルを測定することはＭｅｏｘ１調節エレメントのクロマチンアクセシビリティを測定することを含む、付記１～４のいずれか一項に記載の方法。
【0198】
６．前記Ｍｅｏｘ１調節エレメントがエンハンサーである、付記５に記載の方法。
７．前記Ｍｅｏｘ１調節エレメントがピーク９／１０エンハンサーである、付記５または６に記載の方法。
７．前記Ｍｅｏｘ１調節エレメントがピーク９／１０エンハンサーである、付記５または６に記載の方法。
【0199】
８．前記Ｍｅｏｘ１調節エレメントがヒト１７番染色体の約４３，５８９，３８１位～４３，５９５，２６３位の間にある、付記５、６または７に記載の方法。
９．前記細胞集団が、心臓組織、肺組織、肝臓組織、腎臓組織、またはそれらの組み合わせに由来する線維芽細胞を含む、付記１～８のいずれか一項に記載の方法。
９．前記細胞集団が、心臓組織、肺組織、肝臓組織、腎臓組織、またはそれらの組み合わせに由来する線維芽細胞を含む、付記１～８のいずれか一項に記載の方法。
【0200】
１０．Ｍｅｏｘ１レベルを測定することがＭｅｏｘ１転写物またはタンパク質レベルを測定することを含むか、またはＭｅｏｘ１レベルを測定することが細胞あたり遺伝子あたりで観察されるＭｅｏｘ１転写物の絶対数（ＵＭＩカウント）を測定することを含む、付記１～９のいずれか一項に記載の方法。
【0201】
１１．前記Ｍｅｏｘ１調節剤のうちの１つ以上がＭｅｏｘ１レベルを増加させる、付記１～１０のいずれか一項に記載の方法。
１２．前記Ｍｅｏｘ１調節剤のうちの１つ以上がＭｅｏｘ１レベルを減少させる、付記１～１０のいずれか一項に記載の方法。
１２．前記Ｍｅｏｘ１調節剤のうちの１つ以上がＭｅｏｘ１レベルを減少させる、付記１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【0202】
１３．前記Ｍｅｏｘ１調節剤のうちの１つ以上がＭｅｏｘ１エンハンサー活性を低下させる、付記１～１２のいずれか一項に記載の方法。
１４．前記Ｍｅｏｘ１調節剤のうちの１つ以上がＭｅｏｘ１エンハンサーの染色体アクセシビリティを低下させる、付記１～１３のいずれか一項に記載の方法。
１４．前記Ｍｅｏｘ１調節剤のうちの１つ以上がＭｅｏｘ１エンハンサーの染色体アクセシビリティを低下させる、付記１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【0203】
１５．前記Ｍｅｏｘ１エンハンサーがヒト１７番染色体の約４３，５８９，３８１位～４３，５９５，２６３位の間に存在する、付記１４に記載の方法。
１６．前記Ｍｅｏｘ１調節剤のうちの１つ以上を心臓の状態または疾患の動物モデルへ投与すること、および、前記Ｍｅｏｘ１調節剤のうちの１つ以上が心臓の状態または疾患の症状または重症度を低減するかどうかを決定することによって治療剤を同定することをさらに含む、付記１～１５のいずれか一項に記載の方法。
１６．前記Ｍｅｏｘ１調節剤のうちの１つ以上を心臓の状態または疾患の動物モデルへ投与すること、および、前記Ｍｅｏｘ１調節剤のうちの１つ以上が心臓の状態または疾患の症状または重症度を低減するかどうかを決定することによって治療剤を同定することをさらに含む、付記１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【0204】
１７．前記治療剤のうちの１つ以上を患者へ投与することをさらに含む、付記１６に記載の方法。
１８．前記患者が前記治療剤のうちの１つ以上を必要としている、付記１７に記載の方法。
１８．前記患者が前記治療剤のうちの１つ以上を必要としている、付記１７に記載の方法。
【0205】
１９．前記動物モデルまたは前記患者が、心臓線維症、肺線維症、腎臓線維症、肝臓線維症、心不全、うっ血性心不全、心筋梗塞、心虚血、心筋炎、不整脈心筋症、拡張型心筋症、冠動脈疾患、高血圧症、心臓弁膜症、肥大型心筋症（ＨＣＭ）、家族性拡張型心筋症（ＦＤＣＭ）、拘束型心筋症（ＲＣＭ）、不整脈原性心筋症（ＡＶＣ）、未分類の心筋症、またはそれらの組み合わせを有する、付記１６、１７、または１８に記載の方法。
【0206】
２０．前記細胞集団が、心臓の状態または疾患の治療を求める患者または対象由来である、付記１～１９のいずれか一項に記載の方法。
２１．前記患者または対象が、心臓線維芽細胞における増加したＭｅｏｘ１レベル、増加したＭｅｏｘ１新生転写、心臓線維芽細胞内のＭｅｏｘ１調節エレメントにおける増加したクロマチンアクセシビリティ、またはそれらの組み合わせを示す、付記２０に記載の方法。
２１．前記患者または対象が、心臓線維芽細胞における増加したＭｅｏｘ１レベル、増加したＭｅｏｘ１新生転写、心臓線維芽細胞内のＭｅｏｘ１調節エレメントにおける増加したクロマチンアクセシビリティ、またはそれらの組み合わせを示す、付記２０に記載の方法。
【0207】
２２．前記患者または対象の線維芽細胞内、筋線維芽細胞内、またはそれらの組み合わせにおける前記Ｍｅｏｘ１調節エレメントのノックアウトまたはノックダウンを含む、付記２０または２１に記載の方法。
【0208】
２３．前記患者または対象の線維芽細胞内での前記Ｍｅｏｘ１調節エレメントのｉｎ ｖｉｖｏでのノックアウトまたはノックダウンを含む、付記２０、２１、または２２に記載の方法。
【0209】
２４．前記Ｍｅｏｘ１調節エレメントのノックアウトまたはノックダウンが、前記Ｍｅｏｘ１調節エレメントのＣＲＩＳＰＲ修飾、Ｍｅｏｘ１阻害性核酸とＭｅｏｘ１調節エレメントの接触、もしくはそれらの組み合わせを含む、付記２３に記載の方法。
【0210】
２５．前記Ｍｅｏｘ１阻害性核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、ガイドＲＮＡおよびｃａｓヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲリボ核タンパク質、もしくはそれらの組み合わせである、付記２４に記載の方法。
【0211】
２６．前記患者の線維芽細胞集団内で前記Ｍｅｏｘ１調節エレメントのｉｎ ｖｉｔｒｏでのノックアウトまたはノックダウンすることで改変線維芽細胞を生成すること、および、前記改変線維芽細胞を前記患者へ再導入することを含む、付記２２～２４または２５に記載の方法。
【0212】
２７．前記線維芽細胞が、心臓線維芽細胞、筋線維芽細胞、もしくはそれらの組み合わせである、付記２０～２５のいずれか一項に記載の方法。
２８．Ｍｅｏｘ１調節エレメントにおける増加したクロマチンアクセシビリティ、増加したＭｅｏｘ１発現、増加したＭｅｏｘ１新生転写物レベル、またはそれらの組み合わせを示す線維芽細胞を含む対象へ治療剤を投与することを含む方法。
２８．Ｍｅｏｘ１調節エレメントにおける増加したクロマチンアクセシビリティ、増加したＭｅｏｘ１発現、増加したＭｅｏｘ１新生転写物レベル、またはそれらの組み合わせを示す線維芽細胞を含む対象へ治療剤を投与することを含む方法。
【0213】
２９．前記Ｍｅｏｘ１調節エレメントがエンハンサーである、付記２８に記載の方法。
３０．前記Ｍｅｏｘ１調節エレメントがピーク９／１０エンハンサーである、付記２８または２９に記載の方法。
３０．前記Ｍｅｏｘ１調節エレメントがピーク９／１０エンハンサーである、付記２８または２９に記載の方法。
【0214】
３１．前記Ｍｅｏｘ１調節エレメントがヒト１７番染色体の約４３，５８９，３８１位～４３，５９５，２６３位の間に存在する、付記２８～３０のいずれか一項に記載の方法。
【0215】
３２．前記治療剤が、ガイドＲＮＡ、ｃａｓヌクレアーゼを含むリボ核タンパク質複合体、阻害性核酸、クロマチン安定化剤、またはそれらの組み合わせである、付記２８～３１のいずれか一項に記載の方法。
【0216】
３３．心臓の疾患または状態を治療するために、Ｍｅｏｘ１転写、Ｍｅｏｘ１翻訳、またはＭＥＯＸ１タンパク質の機能を調節する薬剤を対象へ投与することを含む方法。
３４．前記薬剤が、Ｍｅｏｘ１転写、Ｍｅｏｘ１翻訳、またはＭＥＯＸ１タンパク質の機能のうちの１つ以上の組み合わせを阻害する、付記３３に記載の方法。
３４．前記薬剤が、Ｍｅｏｘ１転写、Ｍｅｏｘ１翻訳、またはＭＥＯＸ１タンパク質の機能のうちの１つ以上の組み合わせを阻害する、付記３３に記載の方法。
【0217】
３５．前記薬剤が、Ｍｅｏｘ１転写、Ｍｅｏｘ１翻訳、またはＭＥＯＸ１タンパク質の機能を阻害する、付記３３または３４に記載の方法。
３６．前記薬剤が、Ｍｅｏｘ１遺伝子に作動可能に連結したエンハンサーを直接的または間接的に調節する、付記３３、３４、または３５に記載の方法。
３６．前記薬剤が、Ｍｅｏｘ１遺伝子に作動可能に連結したエンハンサーを直接的または間接的に調節する、付記３３、３４、または３５に記載の方法。
【0218】
３７．前記薬剤が、Ｍｅｏｘ１遺伝子またはＭＥＯＸ１コード領域に作動可能に連結したエンハンサーに結合する、付記３３～３５または３６に記載の方法。
３８．前記薬剤がＭｅｏｘ１翻訳を減少させるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）核酸である、付記３３～３６または３７に記載の方法。
３８．前記薬剤がＭｅｏｘ１翻訳を減少させるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）核酸である、付記３３～３６または３７に記載の方法。
【0219】
３９．前記Ｍｅｏｘ１阻害核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、またはそれらの組み合わせである、付記３３～３７または３８に記載の方法。
【0220】
本明細書に記載の特定の方法および組成物は、好ましい実施形態の代表であり例示であって、本発明の範囲の限定として意図されるものではない。ほかの目的、態様、および実施形態は本明細書を検討すれば当業者が思い付くものであり、本請求の範囲によって定義される本発明の主旨の中に包含される。本発明の範囲および主旨から逸脱することなく、本明細書に開示された本発明に対して様々な置き換えおよび修正がなされ得ることは当業者には容易に明らかであろう。
【0221】
本明細書に例示的に記載された本発明は、必須として本明細書に具体的に開示されていない、任意の要素または任意制限が存在しなくても適切に実施され得る。本明細書に例示的に記載された方法および過程は、異なるステップの順序でも適切に実施され得、方法および過程は本明細書もしくは本特許請求の範囲に示されるステップの順序に必ずしも限定されない。
【0222】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「１つ」（ａ，ａｎ）および「その」、「前記」（ｔｈｅ）は、文脈が明確にそうでないことを指示しない限り、複数形の言及を含む。したがって、例えば、「核酸（ａ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」または「タンパク質（ａ ｐｒｏｔｅｉｎ）」または「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、複数のこのような核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）、タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、細胞（ｃｅｌｌｓ）など（例えば、核酸もしくは発現カセットの溶液または乾燥調製物、タンパク質の溶液、または細胞の集団）を含む。本明細書において、用語「または」、「もしくは」（ｏｒ）は、非排他的なまたは／もしくはを指すために使用され、特に断りのない限り、「ＡまたはＢ」は「ＡだがＢではない」、「ＢだがＡではない」、および「ＡおよびＢ」を含む。
【0223】
いかなる状況においても、特許は、明細書に具体的に開示された特定の実施例または実施形態または方法に限定されると解釈されてはならない。いかなる状況においても、特許は、審査官または特許商標庁のその他の職員もしくは従業員によってなされた声明によって限定されると解釈してはならないが、ただしその声明が出願人による応答文書において明示的に採用されており、かつ資格または留保がない場合はこの限りではない。
【0224】
採用された用語および表現は、説明の用語として使用され、限定するものではなく、そのような用語および表現を使用して図示および記述またはそれらの一部のいかなる等価物も除外する意図はないが、請求された本発明の範囲内で様々な修正が可能であることが認識される。それゆえに、本発明は、好ましい実施形態および任意の特徴によって具体的に開示されてはいるが、本明細書に開示された概念の修正および変形は当業者によって用いられてもよく、そのような修正および変形は本発明の添付の特許請求の範囲および付記によって定義される本発明の範囲内にあると考えられることが理解されるであろう。
【0225】
本発明は、本明細書に広く一般的に記載されている。属開示に含まれるより狭い種および亜属分類の各々もまた、本発明の一部を形成する。これは、切除された材料が本明細書に具体的に記載されているか否かに関わらず、属からの任意の主題を除去する但し書き、もしくは否定的な限定を伴う本発明の全体的な記述を含む。加えて、本発明の特徴または態様はマーカッシュグループの観点から説明され、当業者は、本発明がまたそれによってマーカッシュグループの任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの観点からも説明されることを認識するであろう。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2F】
【図2G】
【図2H】
【図2I】
【図2J】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図3G】
【図3H】
【図3I】
【図3J】
【図4A】
【図4B】
【図4C1】
【図4C2】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図4G】
【図4H】
【図4I】
【図4J】
【図4K】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図5G】
【図5H】
【図5I】
【図5J】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-10-19
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１つの試験薬剤を細胞集団と接触させることで試験アッセイ混合物を提供すること、および、Ｍｅｏｘ１レベルを測定することにより１つ以上のＭｅｏｘ１調節剤を同定することを含む方法。
【請求項2】
前記細胞集団が、線維芽細胞、活性化線維芽細胞、休止線維芽細胞、筋線維芽細胞、活性化筋線維芽細胞、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
Ｍｅｏｘ１レベルを測定することが、Ｍｅｏｘ１エンハンサーのクロマチンアクセシビリティを測定すること、Ｍｅｏｘ１転写物レベルを測定すること、新生Ｍｅｏｘ１転写物レベルを測定すること、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記Ｍｅｏｘ１エンハンサーがヒト１７番染色体の約４３，５８９，３８１位～４３，５９５，２６３位の間に存在する、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
Ｍｅｏｘ１レベルを測定することが、観察されたＭｅｏｘ１転写物またはＭｅｏｘ１新生転写物の細胞あたり遺伝子あたりの絶対数を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記試験薬剤のうち少なくとも１つが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、ガイドＲＮＡおよびｃａｓヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲリボ核タンパク質、またはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記Ｍｅｏｘ１調節剤のうち１つ以上が、Ｍｅｏｘ１レベルを低下させるか、Ｍｅｏｘ１エンハンサー活性を低下させるか、またはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記Ｍｅｏｘ１調節剤のうち１つ以上が、Ｍｅｏｘ１エンハンサーのクロマチンアクセシビリティを低下させるか、Ｍｅｏｘ１転写物レベルを減少させるか、新生Ｍｅｏｘ１転写物レベルを減少させるか、またはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記Ｍｅｏｘ１調節剤のうち１つ以上を心臓の状態または疾患の動物モデルに投与すること、および、前記Ｍｅｏｘ１調節剤のうち１つ以上が心臓の状態または疾患の症状または重症度を軽減するかどうかを決定することで治療剤を同定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記細胞集団が、状態または疾患の治療を求める患者に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記細胞集団を有する前記患者が、線維芽細胞において増加したＭｅｏｘ１レベル、線維芽細胞において増加した新生Ｍｅｏｘ１レベル、線維芽細胞内のＭｅｏｘ１エンハンサーにおける増加したクロマチンアクセシビリティ、またはそれらの組み合わせを示す、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記線維芽細胞が、心臓線維芽細胞、肺線維芽細胞、肝臓線維芽細胞、腎臓線維芽細胞、またはそれらの組み合わせである、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
Ｍｅｏｘ１ ＲＮＡ転写、Ｍｅｏｘ１クロマチンアクセシビリティ、Ｍｅｏｘ１ ＲＮＡプロセシング、またはＭｅｏｘ１翻訳を阻害する薬剤と細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させることを含む方法。
【請求項14】
前記細胞が、線維芽細胞、筋線維芽細胞、活性化線維芽細胞、活性化筋線維芽細胞、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記線維芽細胞が、心臓線維芽細胞、肺線維芽細胞、肝臓線維芽細胞、腎臓線維芽細胞、またはそれらの組み合わせである、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記薬剤が、Ｍｅｏｘ１転写のノックダウンまたはノックアウトをする、Ｍｅｏｘ１エンハンサー活性のノックダウンまたはノックアウトをする、またはそれらの組み合わせである、請求項１３に記載の方法。
【請求項17】
前記薬剤が、１つ以上の阻害性核酸、ガイドＲＮＡ、ｃａｓヌクレアーゼ、ｃａｓヌクレアーゼ：ガイドＲＮＡリボ核タンパク質複合体、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項18】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させた前記細胞が、後に改変細胞を投与される対象に由来する、請求項１３に記載の方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0001】
政府の支援
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＲ０１ＨＬ１２７２４０の下で政府の支援により成された。政府は本発明において一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＲ０１ＨＬ１２７２４０の下で政府の支援により成された。政府は本発明において一定の権利を有する。
【国際調査報告】