特表 2023-515709 筋肉特異的プロモーターをコードするＡＡＶベクターを使用するインビボでの衛星細胞の遺伝子編集

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-04-13

(54)【発明の名称】筋肉特異的プロモーターをコードするＡＡＶベクターを使用するインビボでの衛星細胞の遺伝子編集

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/86 20060101AFI20230406BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20230406BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20230406BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230406BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230406BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230406BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20230406BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230406BHJP

   A61K 35/34 20150101ALI20230406BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20230406BHJP

   A61K 38/47 20060101ALN20230406BHJP

【ＦＩ】

C12N15/86 Z ZNA

C12N15/09 110

C12N15/864 100Z

C12N5/10

A61P43/00 105

A61K35/76

A61P21/04

A61K48/00

A61K35/34

A61K45/00

A61K38/47

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022565594

(86)(22)【出願日】2021-04-27

(85)【翻訳文提出日】2022-12-23

(86)【国際出願番号】 US2021029482

(87)【国際公開番号】W WO2021222314

(87)【国際公開日】2021-11-04

(31)【優先権主張番号】63/016,276

(32)【優先日】2020-04-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】507189666

【氏名又は名称】デューク ユニバーシティ

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100123766

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 七重

(74)【代理人】

【識別番号】100137626

【弁理士】

【氏名又は名称】田代 玄

(72)【発明者】

【氏名】ガーズバック チャールズ エイ

(72)【発明者】

【氏名】クォン ジェニファー

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90Y

4B065AA91Y

4B065AA93Y

4B065AA95X

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA23

4B065CA24

4B065CA27

4B065CA44

4B065CA46

4C084AA02

4C084AA13

4C084AA17

4C084BA44

4C084CA53

4C084DC22

4C084MA66

4C084NA05

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZA941

4C084ZB082

4C084ZB211

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB47

4C087BC83

4C087CA04

4C087CA12

4C087MA13

4C087MA56

4C087MA59

4C087MA66

4C087NA05

4C087NA13

4C087NA14

4C087ZA94

4C087ZB21

(57)【要約】

インビボでの筋肉特異的幹細胞又は衛星細胞の遺伝子編集のためのベクター組成物、及びデュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置するための方法が、本明細書において開示されている。
【選択図】図１Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチド配列と、
（ｂ）Ｃａｓ９タンパク質又は前記Ｃａｓ９タンパク質を含む融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド配列と、
（ｃ）１つ又は複数のプロモーターであって、前記プロモーター各々は前記少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする前記ポリヌクレオチド配列及び／又は前記Ｃａｓ９タンパク質若しくは融合タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列と作動可能に連結されている、１つ又は複数のプロモーターと
を含む、ベクター組成物。

【請求項2】

前記１つ又は複数のプロモーターが筋肉特異的プロモーターである、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記１つ又は複数のプロモーターがＣＫ８プロモーター、ＳＰｃ５－１２プロモーター、若しくはＭＨＣＫ７プロモーター、又はそれらの組合せを含む、請求項１又は２に記載の組成物。

【請求項4】

衛星細胞を編集するのに使用するための、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項5】

前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項6】

前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項５に記載の組成物。

【請求項7】

前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ８ベクター、ＡＡＶ１ベクター、ＡＡＶ６．２ベクター、ＡＡＶｒｈ７４ベクター、又はＡＡＶ９ベクターである、請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

（ａ）少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする前記ポリヌクレオチド配列と、（ｂ）Ｃａｓ９タンパク質又は前記Ｃａｓ９タンパク質を含む融合タンパク質をコードする、前記ポリヌクレオチド配列と、（ｃ）前記１つ又は複数のプロモーターとを含む、単一のベクターを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項9】

（ａ）少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする前記ポリヌクレオチド配列と、（ｂ）Ｃａｓ９タンパク質又は前記Ｃａｓ９タンパク質を含む融合タンパク質をコードする、前記ポリヌクレオチド配列と、（ｃ）前記１つ又は複数のプロモーターとを含む、２つ以上のベクターを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項10】

第１のベクターが、前記少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする前記ポリヌクレオチド配列を含み、
第２のベクターが、前記Ｃａｓ９タンパク質又は融合タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列を含む、
請求項９に記載の組成物。

【請求項11】

前記プロモーターが、前記Ｃａｓ９タンパク質又は融合タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列と作動可能に連結されている、請求項１～１０のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項12】

前記プロモーターが、前記少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする前記ポリヌクレオチド配列と作動可能に連結されている、請求項１～１１のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項13】

前記組成物が２つ以上のｇＲＮＡを含み、前記２つ以上のｇＲＮＡが第１のｇＲＮＡと第２のｇＲＮＡとを含み、前記第１のベクターが前記第１のｇＲＮＡをコードし、前記第２のベクターが前記第２のｇＲＮＡをコードする、請求項９～１２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項14】

前記第１のベクターが前記Ｃａｓ９タンパク質又は融合タンパク質をさらにコードする、請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

前記第２のベクターが前記Ｃａｓ９タンパク質又は融合タンパク質をさらにコードする、請求項９～１４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項16】

前記プロモーターが、前記Ｃａｓ９タンパク質又は融合タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列と作動可能に連結されている、請求項９～１５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項17】

前記プロモーターが、前記第１のｇＲＮＡをコードする前記ポリヌクレオチド配列と、及び／又は前記第２のｇＲＮＡをコードする前記ポリヌクレオチド配列と、作動可能に連結されている、請求項１３～１６のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項18】

前記Ｃａｓ９タンパク質が黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質又は化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項19】

前記ＣＫ８プロモーターが配列番号５１のポリヌクレオチド配列を含み、前記Ｓｐｃ５－１２プロモーターが配列番号５２のポリヌクレオチド配列を含み、前記ＭＨＣＫ７プロモーターが配列番号５３のポリヌクレオチド配列を含む、請求項３～１８のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項20】

前記ベクターが配列番号５４～５９からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。

【請求項21】

前記ベクターが幹細胞を標的とする、請求項１～２０のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項22】

前記ベクターが筋衛星細胞への指向性を有する、請求項１～２１のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項23】

請求項１～２２のいずれか１項に記載の組成物を含む細胞。

【請求項24】

請求項１～２２のいずれか１項に記載の組成物を含むキット。

【請求項25】

細胞における変異体遺伝子を修正する方法であって、細胞に請求項１～２２のいずれか１項に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。

【請求項26】

前記細胞が衛星細胞である、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記変異体遺伝子がジストロフィン遺伝子である、請求項２５又は２６に記載の方法。

【請求項28】

対象における変異体ジストロフィン遺伝子をゲノム編集する方法であって、前記対象に請求項１～２２のいずれか１項に記載の組成物を含むゲノム編集組成物を投与するステップを含む、方法。

【請求項29】

前記ゲノム編集組成物が前記対象に筋肉内投与されるか、静脈内投与されるか、又はそれらの組合せで投与される、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

変異体ジストロフィン遺伝子を有する、処置を必要とする対象を処置する方法であって、前記対象に請求項１～２２のいずれか１項に記載の組成物又は請求項２３に記載の細胞を投与するステップを含む、方法。

【請求項31】

デュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する対象を処置する方法であって、細胞を請求項１～２２のいずれか１項に記載の組成物と接触させるステップを含む、方法。

【請求項32】

筋肉細胞、衛星細胞、又は幹細胞である、請求項３１に記載の方法又は請求項２３に記載の細胞。

【請求項33】

衛星細胞である、請求項３１に記載の方法又は請求項２３に記載の細胞。

【請求項34】

前記細胞を前記組成物とインビボ、インビトロ、及び／又はエクスビボで接触させる、請求項３０～３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

前記細胞を前記組成物と接触させた後に、前記細胞を前記対象に移植する、請求項３０～３４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項36】

前記細胞が同種及び自家性である、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記細胞を前記対象の筋肉に投与する、請求項３５又は３６に記載の方法。

【請求項38】

前記対象に前記細胞を移植する前に前記対象を免疫抑制する、請求項３５～３７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項39】

前記細胞が、筋肉内注射、静脈内注射、尾部注射、硝子体内注射、線条体内注射、実質内注射、髄腔内注射、硬膜外注射、眼球後注射、皮下注射、心臓内注射、嚢胞内注射、関節内注射若しくは髄腔内注射、硬膜外カテーテル注入、クモ膜下ブロックカテーテル注入、静脈内注入、ネブライザー経由、スプレー経由、腟内経路経由、又はそれらの組合せから選択される経路を経由して前記対象に移植される、請求項３５～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項40】

衛星細胞指向性を有するＡＡＶベクターをスクリーニングする方法であって、哺乳動物に前記ＡＡＶベクターを投与するステップを含み、前記哺乳動物はＣＡＧ－ｌｏｘＰ－ＳＴＯＰ－ｌｏｘＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ発現カセットをＲｏｓａ２６に保有するアレルを含み、前記哺乳動物のｐａｘ７遺伝子は、蛍光タンパク質を発現する遺伝子でノックインされる、方法。

【請求項41】

目的の遺伝子がＣｒｅをコードする、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記蛍光タンパク質がＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、若しくはＣＦＰ、又はそれらのバリアントを含む、請求項４０に記載の方法。

【請求項43】

衛星細胞における変異体遺伝子を修正する方法であって、細胞に請求項１～２２のいずれか１項に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。

【請求項44】

前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列番号４９若しくは５０又はその相補体を含むポリヌクレオチド配列に結合して前記ポリヌクレオチド配列を標的とするか、或いは前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列番号６０若しくは６１又はその相補体を含むポリヌクレオチド配列を含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の組成物、請求項２３に記載の細胞、請求項２４に記載のキット、又は請求項２５～４３のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願に対する相互参照）
本願は、２０２０年４月２７日に出願された米国仮特許出願第６３／０１６，２７６号に対する優先権を主張し、この米国仮特許出願はその全体が本明細書において参考として援用される。
（連邦政府の資金提供を受けた研究の記載）
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により与えられた助成金Ｒ０１ＡＲ０６９０８５の下で米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明において特定の権利を有する。
（分野）
本開示は、筋肉疾患の処置のための遺伝子編集機構の送達のためのシステム及び方法に関する。

【背景技術】

【0002】

（序論）
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、男性生産数５，０００人中１人に罹患する衰弱性遺伝的疾患であり、機能的なジストロフィンタンパク質の欠如により特徴付けられ、進行性致死性骨格筋変性をもたらす。骨格筋変性は、衛星幹細胞集団を刺激して増殖させ新しい筋線維を生じさせる。ＤＭＤにおいて、衛星細胞は、筋肉再生についての定常的需要により圧倒されている。過剰増殖は複製老化をもたらし、その衛星細胞再生能力は徐々に減少し、線維症及び脂肪沈着を伴う容赦のない筋肉変性に取って代わられる。この疾患の処置について臨床的進歩がなされたが、治癒は開発されるべき状態のままである。その遺伝的性質が原因で、ＤＭＤは、治療的遺伝子編集のための優れた候補であり、ジストロフィン遺伝子の首尾良いＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの修正が、動物モデルにおいて実証された。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を筋肉へ送達するために、遺伝子編集構築物は、最も一般的にはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）にパッケージされ、ＡＡＶは、米国又は欧州における３つの認可された治療で１００を超える臨床試験において使用される有効な遺伝子送達ベクターである。衛星細胞は組織損傷に応答して骨格筋を継続的に補充するので、これらの自己再生する細胞集団の遺伝的修正は、治療的遺伝子生成の持続性供給源を生成し得る。実際、エピソームＡＡＶベクターは、細胞分裂後の希釈化によって失われるので、衛星細胞における変異した遺伝子のゲノムコピーの永続的修正は、遺伝子編集技術の説得力のある進歩であり得る。さらに、インビボにて衛星細胞をＡＡＶベクターで効率的に標的化することは、ネイティブ環境内での衛星細胞生物学の機能及び調節の多くの研究を可能にし得る。

【発明の概要】

【0003】

（概要）
一つの態様において、本開示は、ベクター組成物に関する。ベクター組成物は、（ａ）少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチド配列と；（ｂ）Ｃａｓ９タンパク質又はＣａｓ９タンパク質を含む融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド配列と；（ｃ）１つ又は複数のプロモーターであって、プロモーター各々は少なくとも１つのｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列及び／又はＣａｓ９タンパク質若しくは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列と作動可能に連結されている、１つ又は複数のプロモーターとを含み得る。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のプロモーターは筋肉特異的プロモーターである。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のプロモーターは、ＣＫ８プロモーター、ＳＰｃ５－１２プロモーター、若しくはＭＨＣＫ７プロモーター、又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、衛星細胞を編集するのに使用するためのものである。いくつかの実施形態において、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ８ベクター、ＡＡＶ１ベクター、ＡＡＶ６．２ベクター、ＡＡＶｒｈ７４ベクター、又はＡＡＶ９ベクターである。いくつかの実施形態において、組成物は、（ａ）少なくとも１つのｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列と、（ｂ）Ｃａｓ９タンパク質又はＣａｓ９タンパク質を含む融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド配列と、（ｃ）１つ又は複数のプロモーターとを含む、単一のベクターを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、（ａ）少なくとも１つのｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列と、（ｂ）Ｃａｓ９タンパク質又はＣａｓ９タンパク質を含む融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド配列と、（ｃ）１つ又は複数のプロモーターとを含む、２つ以上のベクターを含む。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、少なくとも１つのｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列を含み、第２のベクターは、Ｃａｓ９タンパク質又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、Ｃａｓ９タンパク質又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列と作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、プロモーターは、少なくとも１つのｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列と作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、組成物は２つ以上のｇＲＮＡを含み、２つ以上のｇＲＮＡは第１のｇＲＮＡと第２のｇＲＮＡとを含み、第１のベクターは第１のｇＲＮＡをコードし、第２のベクターは第２のｇＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態において、第１のベクターはＣａｓ９タンパク質又は融合タンパク質をさらにコードする。いくつかの実施形態において、第２のベクターはＣａｓ９タンパク質又は融合タンパク質をさらにコードする。いくつかの実施形態において、プロモーターは、Ｃａｓ９タンパク質又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列と作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、プロモーターは、第１のｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列と、及び／又は第２のｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列と、作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質又は化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態において、ＣＫ８プロモーターは配列番号５１のポリヌクレオチド配列を含み、Ｓｐｃ５－１２プロモーターは配列番号５２のポリヌクレオチド配列を含み、ＭＨＣＫ７プロモーターは配列番号５３のポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは配列番号５４～５９からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ベクターは幹細胞を標的とする。いくつかの実施形態において、ベクターは筋衛星細胞への指向性を有する。

【0004】

さらなる態様において、本開示は、本明細書において詳述されている組成物を含む細胞に関する。
本開示の別の態様は、本明細書において詳述されている組成物を含むキットを提供する。
本開示の別の態様は、細胞における変異体遺伝子を修正する方法を提供する。方法は、細胞に本明細書において詳述されている組成物を投与するステップを含み得る。いくつかの実施形態において、細胞は衛星細胞である。いくつかの実施形態において、変異体遺伝子はジストロフィン遺伝子である。

【0005】

本開示の別の態様は、対象における変異体ジストロフィン遺伝子をゲノム編集する方法を提供する。方法は、対象に本明細書において詳述されている組成物を含むゲノム編集組成物を投与するステップを含み得る。いくつかの実施形態において、ゲノム編集組成物は、対象に筋肉内投与されるか、静脈内投与されるか、又はそれらの組合せで投与される。

【0006】

本開示の別の態様は、変異体ジストロフィン遺伝子を有する、処置を必要とする対象を処置する方法を提供する。方法は、対象に本明細書において詳述されている組成物又は本明細書において詳述されている細胞を投与するステップを含み得る。
本開示の別の態様は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する対象を処置する方法を提供する。方法は、細胞を本明細書において詳述されている組成物と接触させるステップを含み得る。

【0007】

いくつかの実施形態において、細胞は筋肉細胞、衛星細胞、又は幹細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は衛星細胞である。いくつかの実施形態において、細胞を組成物とインビボ、インビトロ、及び／又はエクスビボで接触させる。いくつかの実施形態において、細胞を組成物と接触させた後に、細胞を対象に移植する。いくつかの実施形態において、細胞は同種及び自家性である。いくつかの実施形態において、細胞を対象の筋肉に投与する。いくつかの実施形態において、対象に細胞を移植する前に対象を免疫抑制する。いくつかの実施形態において、細胞は、筋肉内注射、静脈内注射、尾部注射、硝子体内注射、線条体内注射、実質内注射、髄腔内注射、硬膜外注射、眼球後注射、皮下注射、心臓内注射、嚢胞内注射、関節内注射若しくは髄腔内注射、硬膜外カテーテル注入、クモ膜下ブロックカテーテル注入、静脈内注入、ネブライザー経由、スプレー経由、腟内経路経由、又はそれらの組合せから選択される経路を経由して上記対象に移植される。

【0008】

本開示の別の態様は、衛星細胞指向性を有するＡＡＶベクターをスクリーニングする方法を提供する。方法は、哺乳動物にＡＡＶベクターを投与するステップを含み得、哺乳動物はＣＡＧ－ｌｏｘＰ－ＳＴＯＰ－ｌｏｘＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ発現カセットをＲｏｓａ２６に保有するアレルを含み、哺乳動物のｐａｘ７遺伝子は、蛍光タンパク質を発現する遺伝子でノックインされる。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子はＣｒｅをコードする。いくつかの実施形態において、蛍光タンパク質はＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、若しくはＣＦＰ、又はそれらのバリアントを含む。
本開示の別の態様は、衛星細胞における変異体遺伝子を修正する方法を提供する。方法は、細胞に本明細書において詳述されている組成物を投与するステップを含み得る。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号４９若しくは５０又はその相補体を含むポリヌクレオチド配列に結合してポリヌクレオチド配列を標的とするか、或いは少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号６０若しくは６１又はその相補体を含むポリヌクレオチド配列を含む。
本開示は、以下の詳細な説明及び添付の図面を考慮すれば明らかである他の態様及び実施形態を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1A-F】衛星細胞におけるＡＡＶ形質導入を定量するための二重レポーターマウスを示す図である。図１Ａは、Ｐａｘ７座位にあるノックイン核ＧＦＰ及びＲｏｓａ２６座位にあるＣＡＧ－ＬＳＬ－ｔｄＴｏｍａｔｏを保有する二重レポーターマウスの模式図を示す。Ｃｒｅ媒介性組換えがｔｄＴｏｍａｔｏ発現において生じる。図１Ｂは、ゲーティング戦術を確立するための使用されたＦＡＣＳプロット及びコントロールを示す。緑色のゲートはＰａｘ７－ｎＧＦＰ＋細胞を識別し、一方、黄色ゲートはＰａｘ７－ｎＧＦＰ＋／ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞を識別する。図１Ｃは、一群のＡＡＶ血清型においてパッケージされたＣｒｅの局所注射後のＰａｘ７－ｎＧＦＰ＋細胞の組換え効率を示す（平均±平均値の標準誤差、ｎ＝５匹のマウス）。図１Ｄは、ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身注射後の種々の骨格筋群に由来するＰａｘ７－ｎＧＦＰ＋細胞における組換え効率を示す（平均±平均値の標準誤差、ｎ＝５匹のマウス）。図１Ｅは、Ｐａｘ７－／ｔｄＴｏｍａｔｏ－核（灰色の矢印）と対比した、Ｐａｘ７＋／ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の代表的免疫蛍光染色（黄色の矢印）を示す。図１Ｆは、野生型マウスと比較したｍｄｘマウスにおけるＡＡＶ９－Ｃｒｅの全身注射が、ジストロフィー筋肉の環境において衛星細胞のより高い形質導入を示すことを示す（平均±平均値の標準誤差、ｎ＝５匹のマウス）。

【図2A-F】ＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲが、ｍｄｘマウスにおいてＤｍｄ座位にて衛星細胞の遺伝子編集を誘導することを示す図である。図２Ａは、Ｄｍｄ座位からエクソン２３を切除してそのリーディングフレームを復元するように設計されたＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲを注射された、Ｐａｘ７－ｎＧＦＰ／ｍｄｘマウスを示す。図２Ｂは、エクソン２３の切除に対応する欠失バンドを示す、注射されたＴＡ筋から分離された衛星細胞におけるゲノム欠失領域にわたるＰＣＲを示す。図２Ｃは、５匹中４匹のマウスにおいて、全身注射されたマウスから分離された衛星細胞もまたエクソン２３の切除に対応する欠失バンドを示すことを示す。図２Ｄは、イントロン２２及びイントロン２３におけるｇＲＮＡ標的部位の完全な連結を示すための、欠失バンドのサンガー配列決定である。図２Ｅは、種々の遺伝子編集結果について編集事象のレベルを定量するための、ＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲ局所投与後の衛星細胞ゲノムＤＮＡにおける５’方向又は３’方向のいずれかからのＤｍｄ座位のエクソン２３周辺の標的とされた領域の偏りのない（ｕｎｂｉａｓｅｄ）Ｔｎ５タグメンテーションベースの配列決定を示す。図２Ｆは、エクソン２３欠失のレベルを定量するための、ＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲ局所投与後の衛星細胞ｍＲＮＡの偏りのないＴｎ５タグメンテーションベースの配列決定を示す。

【図3A-E】筋肉特異的プロモーターが衛星細胞において活性であることを示す図である。図３Ａは、Ｃｒｅ発現を駆動する筋肉特異的プロモーターが、ＡＡＶ９中にパッケージされ、筋肉内注射によって等用量でＰａｘ７－ｎＧＦＰ；Ａｉ９；ｍｄｘマウス中へ送達されたことを示す。衛星細胞の組換え効率は、ＣＭＶにより駆動されるＣｒｅにおいて最も高かった（平均±平均値の標準誤差、ｎ＝３～４匹のマウス）。図３Ｂは、ＣＭＶプロモーター、ＣＫ８ｅプロモーター、ＳＰｃ５－１２プロモーター、又はＭＨＣＫ７プロモーターにより駆動されるＳａＣａｓ９をコードするＡＡＶ９と一緒にＡＡＶ９－ｇＲＮＡを注射された、Ｐａｘ７－ｎＧＦＰ／ｍｄｘマウスを示す。筋肉内注射の８週間後、ＴＡ筋を収集し、ジストロフィン陽性線維を免疫蛍光染色により定量した。図３Ｃは、種々の筋肉特異的プロモーター又はＣＭＶを保有するＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲの局所投与後のＴＡ筋ゲノムＤＮＡの偏りのない配列決定を示し、種々の遺伝子編集結果についての編集事象のレベルを定量する。図３Ｄは、種々のプロモーターでの局所ＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲ処理後のバルク筋肉の偏りのない配列決定によって定量した、全編集事象及び欠失事象（平均±平均値の標準誤差、ｎ＝３匹のマウス）を示す。図３Ｅは、選別された衛星細胞由来のゲノムＤＮＡのＰＣＲを示し、ＣＭＶプロモーター又は筋肉特異的プロモーターにより駆動されるＳａＣａｓ９を注射されたマウスにわたるエクソン２３の切除を示す。Ｐ値は、一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定によって決定した（平均±平均値の標準誤差、ｎ＝３匹のマウス）。

【図4A-E】ＡＡＶベクター発現の喪失後のジストロフィンの持続性発現を示すための、ＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲで処理されたＴＡ筋の連続損傷を示す図である。図４Ａは、連続損傷戦略の模式図を示す。Ｍｄｘマウスを、筋肉内注射によりＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲ構築物で処理した。４週間後、マウスを５０μＬの１．２％ ＢａＣｌ２で損傷させて、筋肉の変性及び再生を誘導した。ＢａＣｌ２注射を合計２又は３回投与し、各注射の間に２週間の回復期間を設けた。図４Ｂは、ＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲで処理しＢａＣｌ２で０回、２回、又は３回のいずれかの回損傷させたｍｄｘマウスにおける、ジストロフィン復元の代表的免疫蛍光画像を示す。図４Ｃは、ＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲ処理及びＢａＣｌ２での０回、２回、又は３回の損傷後のジストロフィン＋線維の定量である（平均±平均値の標準誤差、ｎ＝４匹のマウス）。図４Ｄは、ＳａＣａｓ９のＣ末端にあるＨＡエピトープタグのウェスタンブロットであり、３回のＢａＣｌ２損傷後のＳａＣａｓ９の除去を示す。図４Ｅは、ジストロフィンのウェスタンブロットであり、ＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲ発現の非存在下での複数の損傷にわたって持続されるジストロフィン発現の回復を示す。

【図5A-E】ｍｄｘマウス由来のＣＲＩＳＰＲを編集された衛星細胞の連続移植が筋肉再生に寄与することを示す図である。図５Ａは、連続生着（ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）戦略の模式図を示す。Ｐａｘ７ｎＧＦＰ；ｍｄｘドナーマウスに、ＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲ又はＰＢＳを注射した。８週間後、ＧＦＰ＋細胞をフローサイトメトリーにより分離し、２日前に左後肢に照射したｍｄｘ宿主マウス中にすぐに注射した。４週間後、その宿主のＴＡ筋を分析のために分離した。図５Ｂは、ＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲで処理したマウスに由来する衛星細胞を注射したｍｄｘ宿主マウスに由来するＴＡ筋における、ジストロフィンについての免疫蛍光染色の代表的画像を示す。図５Ｃは、ＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲ構築物又はＰＢＳのいずれかで処理したドナーマウス筋肉から分離された衛星細胞を注射された宿主ＴＡ筋における、１ｍｍ２当たりのジストロフィン＋線維の定量である（平均±平均値の標準誤差、ｎ＝３匹のマウス）。図５Ｄは、ＴＡ筋から抽出された宿主ゲノムＤＮＡのＰＣＲを示し、エクソン２３欠失バンドが、ＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲで処理されたドナーに由来する衛星細胞を注射されたマウスにおいてのみ存在することを示す。図５Ｅは、イントロン２２とイントロン２３との完全な連結を示す、欠失バンドのサンガー配列決定を示す。

【図6A】種々の遺伝子編集結果についての編集事象のレベルを定量するための、ＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲ局所投与後の衛星細胞又はバルク筋肉ゲノムＤＮＡの偏りのない配列決定を示す図である。

【図6B】エクソン２３欠失のレベルを定量するための、ＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲ局所投与後の衛星細胞又はバルク筋肉ｍＲＮＡの偏りのない配列決定を示す図である（平均±平均値の標準誤差、ｎ＝４匹のマウス）。

【発明を実施するための形態】

【0010】

（詳細な説明）
本明細書において記載される方法は、ＡＡＶによる衛星細胞の首尾良い形質導入に関し、これらの衛星細胞は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのヒト化マウスモデルにおいてジストロフィンのリーディングフレームを復元してジストロフィンを首尾良く復元するように遺伝子編集を受け得る。

【0011】

筋幹細胞又は衛星細胞におけるジストロフィン遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子編集システムを送達するための、ベクター組成物、遺伝的構築物、及び方法が、本明細書において記載される。本明細書において記載されているベクター組成物は、システム又は組成物に筋幹細胞を標的とさせるために、ＣＫ８、ＳＰｃ５－１２、及び／又はＭＨＣＫ７が挙げられるがこれらに限定はされない、１つ又は複数の筋肉特異的プロモーターの使用を含み得る。本明細書に開示されている主題はまた、遺伝的構築物又は遺伝的構築物を含む組成物を筋幹細胞又は衛星細胞に送達するための方法も提供する。ベクターは、改変型ＡＡＶベクターを含む、ＡＡＶであり得る。本明細書に開示されている主題は、筋幹細胞又は衛星細胞への活性形態のこの種類の治療物質の有効で効率的な送達に関し、それによりゲノム改変を促進する。システム及び方法はまた、ゲノム操作において、及び遺伝子変異の影響を修正又は減少するために、使用され得る。

【0012】

（１．定義）
そうではないと定義されない限り、本明細書において使用されているすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が統制する。好ましい方法及び材料が下記に記載されているが、本明細書において記載される方法及び材料と同様又は同等の方法及び材料が、本発明の実施又は試験において使用され得る。本明細書において記載されるすべての公開物、特許出願、特許及び他の参考文献は、その全体が参考として援用される。本明細書において開示されている材料、方法、及び例は、例示的なものに過ぎず、限定することは意図されない。

【0013】

本明細書において使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「し得る（ｃａｎ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」、及びそれらの異形は、追加的な動作又は構成の可能性を排除しない、非限定的な移行句、用語、又は語であることが意図される。単数形「ある（ａ）」、「及び（ａｎｄ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈がそうではないと明示的に記載しない限り、複数の言及物を含む。本開示はまた、明確に記載されていてもそうではなくても、本明細書において提示されている実施形態又は構成要素を「含む」他の実施形態、本明細書において提示されている実施形態又は構成要素「からなる」他の実施形態、及び本明細書において提示されている実施形態又は構成要素「から本質的になる」他の実施形態も企図する。
本明細書における数の範囲の言及について、同じ精度でその間に存在する数各々が明示的に企図される。例えば、範囲６～９について、６及び９に加えて数７及び８が企図され、範囲６．０～７．０について、数６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０が明示的に企図される。

【0014】

目的の１つ又は複数の値に適用される本明細書において使用される用語「約」又は「およそ（ほぼ）」とは、記載される参照値と同様である値、又はその特定の値について当業者によって決定された場合に許容できる誤差範囲内にある値を指し、その誤差範囲は、その値がどのように測定又は決定されるかに、例えば、測定系の限界に、部分的に依存する。特定の態様において、用語「約」とは、そうではないと記載されるか又はそうではないと文脈から明らかでない限りは、いずれかの方向で、記載される参照値の２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又はそれ以下にある（大きいか又は小さい）値の範囲（そのような数が、あり得る値の１００％を超える場合を除く）を指す。代替的に、「約」は、当該分野における実務に従って３又は３よりも大きい標準偏差以内を意味し得る。代替的に、例えば生物学的システム又はプロセスに関して、用語「約」は、ある値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。

【0015】

本明細書において互換可能に使用される「アデノ随伴ウイルス」又は「ＡＡＶ」とは、ヒト及びいくつかの他の霊長類の種に感染する、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）科のディペンドウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）属に属する小さなウイルスを指す。ＡＡＶは、疾患を引き起こすとは現在知られておらず、結果的にこのウイルスは非常に軽度の免疫応答を引き起こす。
「同種の」とは、同じ種の別の対象に由来する任意の物質を指す。同種細胞は、遺伝的には別個であり免疫学的には不適合性であるが、同じ種に属する。典型的には、「同種」は、ドナーから同じ種のレシピエントへと移植される細胞、例えば幹細胞を定義するために使用される。
本明細書において使用される「アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸及び非天然の人工アミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸アナログ及びアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによりコードされるアミノ酸である。アミノ酸は、一般的に知られているそのアミノ酸の３文字記号又はＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名法委員会により推奨される１文字記号のいずれかによって、本明細書において言及され得る。アミノ酸は、側鎖及びポリペプチド骨格部分を含む。

【0016】

「自家性」とは、対象に由来し同じ対象へと再導入される任意の物質を指す。
本明細書において使用される「結合領域」とは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの遺伝子編集システムにより認識され結合される標的領域内の領域を指す。
本明細書において使用される「コード配列」又は「コード核酸」とは、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ分子）を意味する。コード配列は、その核酸が投与される個体又は哺乳動物の細胞における発現を指示し得るプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントと作動可能に連結された、開始シグナル及び終結シグナルをさらに含み得る。コード配列は、コドンを最適化され得る。

【0017】

本明細書において使用される「相補体」又は「相補的」とは、核酸が、核酸分子のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログの間でワトソン－クリック塩基対合（例えば、Ａ－Ｔ／Ｕ及びＣ－Ｇ）又はフーグスティーン塩基対合を意味し得ることを意味する。「相補性」とは、２つの核酸配列の間において共有される、その２つの核酸配列が互いに対して逆平行に整列された場合に各位置のヌクレオチド塩基が相補的になるような、特性を指す。

【0018】

用語「コントロール」、「参照レベル」、及び「参照」は、本明細書において互換可能に使用される。参照レベルは、測定された結果を評価するためのベンチマークとして使用される、所定の値又は範囲であり得る。本明細書において使用される「コントロール群」とは、一群のコントロール対象を指す。その所定のレベルは、コントロール群からのカットオフ値であり得る。その所定のレベルは、コントロール群からの平均であり得る。カットオフ値（又は所定のカットオフ値）は、適応的指標モデル（ＡＩＭ）方法論により決定され得る。カットオフ値（又は所定のカットオフ値）は、患者群の生物学的サンプルから受信者動作曲線（ＲＯＣ）分析により決定され得る。ＲＯＣ分析は、生物学的分野において概して公知であるように、ある条件を別の条件から区別するための、例えば、ＣＲＣを有する患者を識別する際に各マーカーの成績を決定するための、試験の能力の決定である。ＲＯＣ分析の記載はP.J. Heagerty et al.（Biometrics 2000, 56, 337-44）に提供され、その開示はその全体が本明細書により参考として援用される。代替的に、カットオフ値は、患者群の生物学的サンプルの四分位分析により決定され得る。例えば、カットオフ値は、２５～７５パーセンタイル範囲中の任意の値に対応する値、好ましくは２５パーセンタイル、５０パーセンタイル又は７５パーセンタイル、より好ましくは７５パーセンタイルに対応する値を選択することにより、決定され得る。そのような統計分析は、当該分野において公知である任意の方法を使用して実施され得、（例えば、Ａｎａｌｙｓｅ－ｉｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｌｔｄ．、Ｌｅｅｄｓ、ＵＫ；ＳｔａｔａＣｏｒｐ ＬＰ、Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、ＴＸ；ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ＮＣから）商業的に利用可能な多数のソフトウェアパッケージを通して実施され得る。標的について又はタンパク質活性についての健常又は正常なレベル又は範囲は、標準的な実務に従って定義され得る。コントロールは、本明細書において詳述されている組成物を含まない、対象又は細胞であり得る。コントロールは、その疾患状態が知られている、対象又はそれに由来するサンプルであり得る。対象又はそれに由来するサンプルは、健常なものであっても、疾患状態であっても、処置前の疾患状態であっても、処置中の疾患状態であっても、若しくは処置後の疾患状態であっても、又はそれらの組合せであってもよい。

【0019】

本明細書において使用される「修正する」、「遺伝子編集する」及び「復元する」とは、機能障害性のタンパク質若しくは短縮されたタンパク質をコードするか又はタンパク質を全くコードしない変異体遺伝子を変化させて、全長の機能的なタンパク質発現又は部分的に全長の機能的なタンパク質発現が得られるようにすることを指す。変異体遺伝子を修正又は復元することは、相同組換え修復（ＨＤＲ）などの修復機構により、その変異を有さないその遺伝子のコピーで、その遺伝子の変異を有する領域を置換すること又は変異体遺伝子全体を置換することを含み得る。変異体遺伝子を修正又は復元することはまた、未成熟終止コドン、異常なスプライスアクセプター部位、又は異常なスプライスドナー部位を引き起こすフレームシフト変異を、その遺伝子中に、後に非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を使用して修復される二本鎖切断を生成することにより修復することを含み得る。ＮＨＥＪは、適切なリーディングフレームを復元して未成熟終止コドンを除去し得る、少なくとも１塩基対を修復中に付加又は欠失し得る。変異体遺伝子を修正又は復元することはまた、異常なスプライスアクセプター部位又は異常なスプライスドナー配列を破壊することを含み得る。変異体遺伝子を修正又は復元することはまた、２つのヌクレアーゼ標的部位間のＤＮＡを除去しそのＤＮＡ切断をＮＨＥＪにより修復することによって、適切なリーディングフレームを復元するために同じＤＮＡ鎖にある２つのヌクレアーゼの同時作用により非必須遺伝子セグメントを欠失させることを含み得る。

【0020】

本明細書において互換可能に使用される「クラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復」及び「ＣＲＩＳＰＲ」とは、配列決定された細菌のおよそ４０％及び配列決定された古細菌の９０％のゲノムにおいて見出される、複数の短い直接反復を含む座位を指す。ＣＲＩＳＰＲシステムは、侵入するファージ及びプラスミドに対する防御に関与する、ある形態の獲得免疫を提供する微生物ヌクレアーゼシステムである。微生物宿主中にあるＣＲＩＳＰＲ座位は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子と、ＣＲＩＳＰＲ媒介性核酸切断の特異性をプログラム可能な非コードＲＮＡエレメントとの組合せを含む。スペーサーと呼ばれる外来ＤＮＡの短いセグメントが、ＣＲＩＳＰＲ反復の間でゲノム中に組み込まれ、過去の曝露の「記憶」として作用する。Ｃａｓタンパク質としては、例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ９、及びカスケードタンパク質が挙げられる。Ｃａｓ１２ａはまた、「Ｃｐｆ１」とも呼ばれ得る。Ｃａｓ１２ａは、二本鎖ＤＮＡにおいて互い違い切断を引き起こす一方、Ｃａｓ９は平滑切断を生じる。Ｃａｓ９は、ｓｇＲＮＡ（これは本明細書において「ｇＲＮＡ」とも互換可能に呼ばれ得る）の３’末端と複合体を形成し、そのタンパク質－ＲＮＡ対は、ｇＲＮＡ配列の５’末端と、プロトスペーサーとして公知であるあらかじめ決められた２０ｂｐのＤＮＡ配列との間での相補的塩基対合によって、そのゲノム標的を認識する。この複合体は、病原体ＤＮＡの相同性座位に対して、ｃｒＲＮＡ内にコードされる領域すなわちプロトスペーサー、及びその病原体ゲノム内のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を介して指向される。非コードＣＲＩＳＰＲアレイが転写され、直接反復内で切断されて個々のスペーサー配列を含む短いｃｒＲＮＡへとなり、これらが、Ｃａｓヌクレアーゼを標的部位（プロトスペーサー）へと指向させる。発現されるｇＲＮＡの２０ｂｐ認識配列を単に交換することによって、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、新しいゲノム標的へと指向され得る。ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、真核生物中のＲＮＡｉと同様の様式で外因性遺伝的エレメントを認識して発現停止させるために使用される。

【0021】

３つの種類のＣＲＩＳＰＲシステム（タイプＩ、ＩＩ、及びＩＩＩのエフェクターシステム）が公知である。タイプＩＩエフェクターシステムは、ｄｓＤＮＡを切断するために単一のエフェクター酵素Ｃａｓ９を使用して、４つの連続的ステップで、標的とされたＤＮＡ二本鎖切断を実行する。複合体として作用する複数の別個のエフェクターを必要とするタイプＩ及びタイプＩＩＩのエフェクターシステムと比較して、タイプＩＩエフェクターシステムは、真核生物細胞などの別の環境において機能し得る。タイプＩＩエフェクターシステムは、スペーサー含有ＣＲＩＳＰＲ座位から転写される長いプレｃｒＲＮＡと、Ｃａｓ９タンパク質と、プレｃｒＲＮＡプロセシングに関与するｔｒａｃｒＲＮＡとからなる。ｔｒａｃｒＲＮＡは、プレｃｒＲＮＡのスペーサーを分離する反復領域にハイブリダイズし、その結果、内因性ＲＮアーゼＩＩＩによるｄｓＲＮＡ切断を開始する。この切断の後には、Ｃａｓ９による各スペーサー内での第２の切断事象が続き、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びＣａｓ９が付随したままである成熟ｃｒＲＮＡを生じ、Ｃａｓ９：ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を形成する。Ｃａｓ１２ａシステムが、首尾良い標的化のためにｃｒＲＮＡを含む一方、Ｃａｓ９システムは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの両方を含む。

【0022】

Ｃａｓ９：ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、そのＤＮＡ二重鎖を巻き戻し、切断するｃｒＲＮＡと一致する配列を探索する。標的認識は、標的ＤＮＡ中の「プロトスペーサー」配列と、ｃｒＲＮＡ中の残りのスペーサー配列との間の相補性の検出の際に生じる。Ｃａｓ９は、正確なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）もまたプロトスペーサーの３’末端に存在する場合に、標的ＤＮＡの切断を媒介する。プロトスペーサーの標的化のために、その配列は、ＤＮＡ切断のために必要なＣａｓ９ヌクレアーゼにより認識される短い配列であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が、直後に続かなければならない。種々のタイプＩＩシステムが、種々のＰＡＭ要件を有する。

【0023】

化膿性連鎖球菌の操作された形態のタイプＩＩエフェクターシステムは、ゲノム操作のためにヒト細胞において機能することが示された。このシステムにおいて、Ｃａｓ９タンパク質は、合成的に再構成された「ガイドＲＮＡ」（「ｇＲＮＡ」、本明細書においてキメラ単一ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）とも互換可能に使用される）によってゲノム標的部位へと指向された。このガイドＲＮＡは、一般にＲＮアーゼＩＩＩ及びｃｒＲＮＡプロセシングの必要性を排除するｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ融合物である。遺伝子編集及び遺伝的疾患を処置する際に使用するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの操作されたシステムが、本明細書において提供される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの操作されたシステムは、例えば、遺伝的疾患、加齢、組織再生、又は創傷治癒に関与する遺伝子を含む、任意の遺伝子を標的とするように設計され得る。

【0024】

用語「方向性プロモーター」とは、２つの別個の配列の転写を両方の方向で駆動可能である２つ以上のプロモーターを指す。１つの実施形態において、１つのプロモーターは５’から３’への転写を駆動し、もう１つのプロモーターは、３’から５’への転写を駆動する。１つの実施形態において、双方向プロモーターは、少なくとも２つの別個の配列、例えば、コード配列又は非コード配列の発現を、対向する方向で駆動し得る、二本鎖転写制御エレメントである。そのようなプロモーター配列は、対向する方向で作用する２つの個別のプロモーター配列、例えば、その２つの個別のプロモーター配列若しくはその少なくともコア配列を含む、ハイブリッド配列、キメラ配列又は融合配列によってか、或いはそうでなければ両方の方向で転写を開始し得る１つだけの転写調節配列によって、対向する方向でその２つのプロモーターを含むパッケージ構築物を含む、１つのヌクレオチド配列がもう１つの（相補的）ヌクレオチド配列に連結されたものなどから構成され得る。その２つの個別のプロモーター配列は、いくつかの実施形態において、並置されてもよく、又はリンカー配列が第１の配列と第２の配列との間に配置されてもよい。プロモーター配列は逆向きにされて、反対の方向にある別のプロモーター配列と組み合わされ得る。双方向プロモーターの両方の側に位置する遺伝子は、両方の方向でその転写を駆動する、単一の転写制御配列又は領域と作動可能に連結され得る。他の実施形態において、双方向プロモーターは並置されない。例えば、１つのプロモーターがヌクレオチドフラグメントの５’末端における転写を駆動し得、別のプロモーターが、同じフラグメントの３’末端からの転写を駆動し得る。別の実施形態において、第１の遺伝子が、さらなる調節エレメント、例えば、レポーターエレメント又はターミネーターエレメントを伴ってか又は伴わずに、双方向プロモーターと作動可能に連結され得、第２の遺伝子が、これもまたさらなる調節エレメントを伴ってか又は伴わずに、反対の方向の双方向性プロモーター及び相補的プロモーター配列と作動可能に連結され得る。

【0025】

本明細書において互換可能に使用される「ドナーＤＮＡ」、「ドナーテンプレート」、及び「修復テンプレート」とは、目的の遺伝子の少なくとも一部を含む、二本鎖ＤＮＡのフラグメント又は分子を指す。ドナーＤＮＡは、完全な機能的なタンパク質又は部分的に機能的なタンパク質をコードし得る。

【0026】

本明細書において互換可能に使用される「デュシェンヌ型筋ジストロフィー」又は「ＤＭＤ」とは、筋肉変性及び最終的な死をもたらす、致死性の潜性Ｘ連鎖障害を指す。ＤＭＤは、一般的な遺伝性一遺伝子性疾患であり、３５００人の男性のうち１人で発症する。ＤＭＤは、ジストロフィン遺伝子においてナンセンス変異又はフレームシフト変異を引き起こす、遺伝性変異又は自然発生変異の結果である。ＤＭＤを引き起こすジストロフィン変異の大多数は、そのリーディングフレームを破壊しジストロフィン遺伝子における未成熟翻訳終結を引き起こす、エクソンの欠失である。ＤＭＤ患者は、典型的には、小児の間に自身を物理的に支持する能力を失い、ティーンエイジ年代の間に次第に弱くなり、その２０代に死亡する。

【0027】

本明細書において使用される「ジストロフィン」とは、筋線維の細胞骨格を、細胞膜を通して周囲の細胞外マトリックスに結合させるタンパク質複合体の一部である、棒の形状をした細胞質タンパク質を指す。ジストロフィンは、筋肉細胞の完全性及び機能を調節するのを担う細胞膜のジストログリカン複合体に対して、構造的安定性を提供する。本明細書において互換可能に使用されるジストロフィン遺伝子又は「ＤＭＤ遺伝子」は、座位Ｘｐ２１にある２．２メガベースである。一次転写は、約２，４００ｋｂの寸法であり、成熟ｍＲＮＡは約１４ｋｂである。７９個のエクソンが、３５００アミノ酸超であるタンパク質をコードする。
本明細書において使用される「カプセル化された」とは、完全なカプセル化、部分的カプセル化、又はその両方の状態でｍＲＮＡ又はｇＲＮＡを提供する脂質ナノ粒子を指す。一つの実施形態において、その核酸（例えば、ｍＲＮＡ又はｇＲＮＡ）は、脂質ナノ粒子又は脂質マイクロ粒子中に完全にカプセル化される。

【0028】

本明細書において使用される「エンハンサー」とは、複数のアクチベーター結合部位及びリプレッサー結合部位を含む非コードＤＮＡ配列を指す。エンハンサーは、長さが２００ｂｐ～１ｋｂの範囲にあり、エンハンサーは、プロモーターの５’上流側若しくは調節される遺伝子の第１のイントロン内にて近位にあるか、又は隣接する遺伝子のイントロン中若しくはその座位から遠く離れた遺伝子間領域にて遠位にあるかのいずれであってもよい。ＤＮＡループ形成を介して、活性なエンハンサーは、コアＤＮＡ結合モチーフプロモーター特異性に依存して、プロモーターと接触する。４～５個のエンハンサーが、プロモーターと相互作用し得る。同様に、エンハンサーは、連結制限なく１つよりも多くの遺伝子を調節し得、隣接する遺伝子を「スキップ」してより遠位にある遺伝子を調節し得る。転写調節は、プロモーターが存在する染色体とは異なる染色体に位置するエレメントを含み得る。近位エンハンサー又は隣接する遺伝子のプロモーターが、より遠位にあるエレメントを動員するためのプラットフォームとして作用し得る。

【0029】

本明細書において使用されるジストロフィンの「エクソン４５～５５」とは、すべてのジストロフィン変異のおよそ４５％が位置する領域を指す。エクソン４５～５５欠失は、非常に軽度のベッカー表現型と関連しており、無症候性個体においてさえも見出されている。エクソン４５～５５マルチエクソンスキッピングが、すべてのＤＭＤ患者のおよそ５０％にとって有益である。
本明細書において使用される「エクソン５１」とは、ジストロフィン遺伝子のエクソン５１を指す。エクソン５１は、ＤＭＤ患者におけるフレーム破壊欠失と頻繁に隣接し、オリゴヌクレオチドベースのエクソンスキッピングのために臨床試験において標的とされている。エクソン５１スキッピング化合物であるエテプリルセンについての臨床試験は、４８週間にわたる有意な機能的有益性が報告され、ベースラインと比較して平均４７％のジストロフィン陽性線維があった。エクソン５１における変異は、ＮＨＥＪベースのゲノム編集による永続的修正に適し得る。

【0030】

本明細書において互換可能に使用される「フレームシフト」又は「フレームシフト変異」とは、１つ又は複数のヌクレオチドの付加又は欠失が、ｍＲＮＡ中のコドンのリーディングフレームのシフトを引き起こす型の遺伝子変異を指す。リーディングフレームのシフトは、タンパク質翻訳でのアミノ酸配列の変化、例えば、ミスセンス変異又は未成熟終止コドンをもたらし得る。
本明細書において使用される「機能的な」及び「完全な機能的な」は、生物学的活性を有するタンパク質を記述する。「機能的な遺伝子」とは、機能的なタンパク質へと翻訳されるｍＲＮＡへと転写される遺伝子を指す。
本明細書において使用される「融合タンパク質」は、別個のタンパク質を元々コードする２つ以上の遺伝子の結合を介して作製されたキメラタンパク質を指す。その融合遺伝子の翻訳は、元のタンパク質の各々に由来する機能的特性を有する単一のポリペプチドを生じる。

【0031】

本明細書において使用される「遺伝的構築物」とは、タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列及びその発現を指示する遺伝的配列を指す。そのコード配列は、調節エレメントと作動可能に連結された開始シグナル及び終結シグナルを含み得、その調節エレメントは、そのポリヌクレオチドが投与される対象の細胞における発現を指示し得る、プロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む。本明細書において使用される場合、用語「発現可能な形態」とは、タンパク質をコードするコード配列と作動可能に連結された必要な調節エレメントを含み、対象の細胞中に存在する場合にそのコード配列が発現されるようになっている、遺伝子構築物を指す。

【0032】

本明細書において使用される「遺伝的疾患」とは、ゲノムにおける１つ又は複数の異常によって部分的又は完全に、直接的又は間接的に引き起こされる疾患、特に出生から存在する状態を指す。異常は、変異、例えば、置換、挿入、又は欠失であり得る。異常は、遺伝子のコード配列又はその調節配列に影響し得る。遺伝的疾患は、ＤＭＤ、血友病、嚢胞性線維症、ハンチントン舞踏病、家族性高コレステロール血症（ＬＤＬレセプター欠損）、肝芽腫、ウィルソン病、先天性肝性ポルフィリン症、肝代謝の遺伝性障害、レッシュ・ナイハン症候群、鎌状赤血球貧血、サラセミア、色素性乾皮症、ファンコニ貧血、色素性網膜炎、毛細血管拡張性運動失調症、ブルーム症候群、網膜芽細胞腫、及びテイ・サックス病であり得るが、これらに限定はされない。
本明細書において使用される「ゲノム編集」又は「遺伝子編集」とは、遺伝子を変化させることを指す。ゲノム編集は、変異体遺伝子を修正若しくは復元すること、又は追加的な変異を付加することを含み得る。ゲノム編集は、遺伝子、例えば変異体遺伝子又は正常な遺伝子をノックアウトすることを含み得る。ゲノム編集は、目的の遺伝子を変化させることによって疾患を処置するため、例えば、筋肉修復を増強するために、使用され得る。いくつかの実施形態において、本明細書において詳述されている組成物及び方法は、体細胞における使用のためのものであり、生殖系列細胞における使用のためのものではない。

【0033】

本明細書において使用される用語「異種」とは、天然では互いに対して同じ関係では見出されない２つ以上の部分配列を含む核酸を指す。例えば、組換え生成される核酸は、典型的には、新しい機能的な核酸を生成するように合成的に配置された無関係の遺伝子に由来する２つ以上の配列、例えば、ある供給源に由来するプロモーター及び別の供給源に由来するコード領域を有する。従って、その２つの核酸は、この状況においては、互いに対して異種である。細胞に添加される場合、組換え核酸はまた、その細胞の内因性遺伝子に対して異種である。従って、染色体において、異種核酸は、染色体中に組み込まれている非ネイティブ（天然に存在しない）核酸、又は非ネイティブ（天然に存在しない）染色体外核酸を含む。同様に、異種タンパク質とは、そのタンパク質が、天然では互いに対して同じ関係で見出されない２つ以上の部分配列を含むこと（例えば、その２つの部分配列が単一の核酸配列によりコードされる「融合タンパク質」）を示す。

【0034】

本明細書において互換可能に使用される「相同組換え修復」又は「ＨＤＲ」とは、ＤＮＡの相同性部分が核中に存在する場合に、大部分が細胞周期のＧ２期及びＳ期において、二本鎖ＤＮＡ損傷を修復する細胞中の機構を指す。ＨＤＲは、ドナーＤＮＡテンプレートを使用して修復をガイドし、遺伝子全体の標的化した付加を含む、ゲノムに対する特定の配列変化を引き起こすために使用され得る。ドナーテンプレートがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子編集システムと一緒に提供される場合、その細胞機構は、相同組換えによりその切断を修復し、これはＤＮＡ切断の存在下では数桁増強される。相同性ＤＮＡ部分が存在しない場合、非相同末端結合が代わりに生じ得る。

【0035】

２つ以上のポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列の文脈において本明細書において使用される「同一の」又は「同一性」は、それらの配列が、特定の領域にわたって同じである、特定のパーセンテージの残基を有することを意味する。パーセンテージは、その２つの配列を最適に整列すること、特定の領域にわたって２つの配列を比較すること、両方の配列において同一の残基が存在する位置の数を決定して一致した位置の数を得ること、一致した位置の数を特定の領域の全位置数で除算すること、及びその結果に１００を乗算して配列同一性のパーセンテージを得ることによって、計算され得る。２つの配列が異なる長さであるか又は整列が１つ又は複数の互い違いの末端を生じ、特定の比較領域が単一の配列のみを含む場合、単一の配列の残基が、計算の分母に含められるが分子には含められない。ＤＮＡとＲＮＡとを比較する場合、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）は等価であると考えられ得る。同一性は、手作業によってか、又はＢＬＡＳＴ若しくはＢＬＡＳＴ ２．０などのコンピュータ配列アルゴリズムを使用することによって、実施され得る。

【0036】

本明細書において互換可能に使用される「変異体遺伝子」又は「変異した遺伝子」とは、検出可能な変異を受けている遺伝子を指す。変異体遺伝子は、その遺伝子の正常な伝達及び発現に影響する変化、例えば、遺伝物質の喪失、獲得、又は交換を受けている。本明細書において使用される「破壊された遺伝子」とは未成熟終止コドンを引き起こす変異を有する変異体遺伝子を指す。その破壊された遺伝子生成物は、全長の破壊されていない遺伝子生成物と比較して短縮されている。

【0037】

本明細書において使用される「非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路」とは、ＤＮＡ中の二本鎖切断を、相同性テンプレートを必要とすることなくその切断末端を直接連結することによって修復する経路を指す。ＮＨＥＪによるＤＮＡ末端のテンプレート非依存性再連結は、そのＤＮＡ切断点でランダムな微小挿入及び微小欠失（インデル）を導入する、確率論的な誤りがちな修復プロセスである。この方法は、標的とされた遺伝子配列のリーディングフレームを意図的に破壊、欠失、又は変化させるために使用され得る。ＮＨＥＪは、典型的には、マイクロホモロジーと呼ばれる短い相同性ＤＮＡ配列を使用して修復をガイドする。これらのマイクロホモロジーは、二本鎖切断の末端にある一本鎖突出にしばしば存在する。その突出が完全に適合性である場合、ＮＨＥＪは通常はその切断を正確に修復し、それでもなお、ヌクレオチドの喪失をもたらす不正確な修復もまた、生じ得るが、その不正確な修復は、その突出が適合性ではない場合の方がかなり多く起こる。

【0038】

本明細書において使用される「正常な遺伝子」とは、変化、例えば遺伝物質の欠如、獲得、又は交換を受けていない遺伝子を指す。正常な遺伝子は、正常な遺伝子伝達及び遺伝子発現を経験する。例えば、正常な遺伝子は、野生型遺伝子であり得る。
本明細書において使用される「ヌクレアーゼ媒介性ＮＨＥＪ」とは、ヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９が、二本鎖ＤＮＡを切断した後に開始されるＮＨＥＪを指す。
本明細書において使用される「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」は、一緒に共有結合された少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。一本鎖の記載はまた、その相補鎖の配列も定義する。従って、ポリヌクレオチドはまた、記載された一本鎖の相補鎖も包含する。ポリヌクレオチドの多くのバリアントが、所定のポリヌクレオチドと同じ目的のために使用され得る。従って、ポリヌクレオチドはまた、実質的に同一のポリヌクレオチド及びその相補体を包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズし得るプローブを提供する。従って、ポリヌクレオチドはまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。ポリヌクレオチドは、一本鎖であってもよく、若しくは二本鎖であってもよく、又は二本鎖配列及び一本鎖配列の両方の部分を含み得る。ポリヌクレオチドは、天然若しくは合成の核酸、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、又はハイブリッドであり得、ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの組合せ、及び例えば、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチンヒポキサンチン、イソシトシン、及びイソグアニンを含む、塩基の組合せを含み得る。ポリヌクレオチドは、化学合成法又は組換え方法によって取得され得る。

【0039】

「オープンリーディングフレーム」とは、開始コドンで始まり終止コドンで終わる一続きのコドンを指す。複数のエクソンを含む真核生物遺伝子において、イントロンが除去され、その後、エクソンが転写後に一緒に結合されてタンパク質翻訳用の最終ｍＲＮＡを生じる。オープンリーディングフレームは、連続的なコドン連続体であり得る。いくつかの実施形態において、オープンリーディングフレームは、タンパク質の発現のために、スプライシングされたｍＲＮＡにのみ当てはまるが、ゲノムＤＮＡには当てはまらない。

【0040】

本明細書において使用される「作動可能に連結されている」とは、遺伝子の発現が、その遺伝子が空間的に結合されたプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’側（上流）に位置してもよく、又は３’側（下流）に位置してもよい。プロモーターと遺伝子との間の距離は、そのプロモーターと、そのプロモーターが由来する遺伝子中でそのプロモーターが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであり得る。当該分野において公知であるように、この距離の変動は、プロモーター機能が喪失することなく調整され得る。核酸配列又はアミノ酸配列は、互いと機能的な関係になるように配置された場合に、「作動可能に連結されている」（又は「作動的に連結されている」）。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、それがコード配列の転写を調節するか又はその転写の調節に寄与する場合に、コード配列と作動可能に連結されている。作動可能に連結されたＤＮＡ配列は、典型的には連続的であり、作動可能に連結されたアミノ酸配列は、典型的には、連続的であり同じリーディングフレーム中にある。しかし、エンハンサーはプロモーターから数キロベース又はそれ以上まで分離されている場合に概して機能し、イントロン配列は可変の長さであり得るので、いくつかのポリヌクレオチドエレメントは、作動可能に連結されているが連続的ではないものであり得る。同様に、主にポリペプチド配列において連続的ではない特定のアミノ酸配列が、それにも関わらず、例えば、ポリペプチド鎖のフォールディングが原因で、作動可能に連結されたものであり得る。融合ポリペプチドに関して、用語「作動的に連結されている」及び「作動可能に連結されている」は、その成分の各々が、もう一方の成分と連結して、それがそのようには連結されていなかった場合と同じ機能を実施することを指し得る。

【0041】

本明細書において使用される「部分的に機能的な」とは、変異体遺伝子によりコードされ、機能的なタンパク質よりも少ないが機能的ではないタンパク質よりは多い生物学的活性を有する、タンパク質を記述する。

【0042】

「ペプチド」又は「ポリペプチド」は、ペプチド結合により連結された２つ以上のアミノ酸の連結された配列である。ポリペプチドは、天然であってもよく、合成であってもよく、又は天然及び合成の改変形若しくは組合せであってもよい。ペプチド及びポリペプチドは、タンパク質、例えば、結合タンパク質、レセプター、及び抗体を含む。用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、及び「ペプチド」は、本明細書において互換可能に使用される。「一次構造」とは、特定のペプチドのアミノ酸配列を指す。「二次構造」とは、ポリペプチド内の局所的に規則的な三次元構造を指す。これらの構造は、ドメイン、例えば、酵素ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、ポアドメイン、及び細胞質尾部ドメインとして一般的に公知である。「ドメイン」は、ポリペプチドの小型の単位を形成するポリペプチド部分であり、典型的には１５～３５０アミノ酸長である。例示的なドメインとしては、酵素的活性又はリガンド結合活性を有するドメインが挙げられる。典型的なドメインは、より小さな構成の部分、例えば、βシートの連続体及びαヘリックスの連続体から構成される。「三次構造」とは、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造を指す。「四次構造」とは、独立した三次単位の非共有結合的会合によって形成される三次元構造を指す。「モチーフ」とは、ポリペプチド配列の部分であり、少なくとも２つのアミノ酸を含む。モチーフは、２～２０、２～１５、又は２～１０アミノ酸長であり得る。いくつかの実施形態において、モチーフは、３、４、５、６、又は７個連続するアミノ酸を含む。ドメインは、一連の同じ型のモチーフから構成され得る。

【0043】

本明細書において互換可能に使用される「未成熟終止コドン」又は「アウトオブフレーム終止コドン」とは、その野生型遺伝子では通常は見出されない位置で終止コドンを生じる、ＤＮＡの配列中のナンセンス変異を指す。未成熟終止コドンは、タンパク質を、そのタンパク質の全長バージョンと比較して短縮させ得るか又は短くし得る。

【0044】

本明細書において使用される「プロモーター」とは、細胞における核酸の発現を付与、活性化又は増強可能である、合成又は天然由来の分子を意味する。プロモーターは、核酸の発現をさらに増強するため、並びに／又は核酸の空間的発現及び／若しくは時間的発現を変更するために、１つ又は複数の特定の転写調節配列を含み得る。プロモーターはまた、転写開始部位から数千塩基対程度に位置し得る、遠位エンハンサー又はリプレッサーエレメントを含み得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、及び動物を含む供給源に由来し得る。プロモーターは、遺伝子成分の発現を構成的に調節し得、或いは発現が生じる細胞、組織若しくは器官に関して、又は発現が生じる発達段階に関して、又は外因性刺激、例えば、心理的ストレス、病原体、金属イオン、若しくは誘発剤に応答して、遺伝子成分の発現を差次的に調節し得る。プロモーターの代表的例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター－プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター又はＳＶ４０後期プロモーター、ヒトＵ６（ｈＵ６）プロモーター、及びＣＭＶ ＩＥプロモーターが挙げられる。筋肉特異的幹細胞を標的とするプロモーターとしては、ＣＫ８プロモーター、Ｓｐｃ５－１２プロモーター、及びＭＨＣＫ７プロモーターが挙げられ得る。

【0045】

用語「組換え」とは、例えば、細胞、核酸、タンパク質、又はベクターに関して使用される場合、その細胞、核酸、タンパク質、又はベクターが、異種核酸若しくは異種タンパク質の導入又はネイティブ核酸若しくはタンパク質の変更によって改変されていること、或いはその細胞がそのように改変された細胞に由来することを示す。従って、例えば、組換え細胞は、ネイティブ（天然に存在する）形態のその細胞内では見出されない遺伝子を発現するか、又は別の状況では正常若しくは異常に発現されるか、過小発現されるか、又は全く発現されない、ネイティブ遺伝子の第２のコピーを発現する。

【0046】

本明細書において使用される「サンプル」又は「試験サンプル」とは、標的の存在及び／又はレベルが検出又は決定されるべき任意のサンプルを意味し得、或いは本明細書において詳述されているＤＮＡ標的化システム若しくは遺伝子編集システム又はそれらの成分を含む任意のサンプルを意味し得る。サンプルは、液体、溶液、乳濁液、又は懸濁物を含み得る。サンプルは、医学的サンプルを含み得る。サンプルは、任意の生物学的液体又は組織、例えば、血液、全血、血漿及び血清などの血液画分、筋肉、間質液、汗、唾液、尿、涙、滑液、骨髄、脳脊髄液、鼻分泌物、痰、羊水、気管支肺胞洗浄液、胃洗浄物、嘔吐、糞便物質、肺組織、末梢血単核球、総白血球、リンパ節細胞、脾細胞、扁桃細胞、がん細胞、腫瘍細胞、胆汁、消化液、皮膚、又はそれらの組合せを含み得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、アリコートを含む。他の実施形態において、サンプルは、生物学的液体を含む。サンプルは、当該分野において公知である任意の手段によって取得され得る。サンプルは、患者から取得された状態で直接使用されてもよく、又は本明細書において議論されているある種の様式若しくは当該分野で公知であるような別の方法で、サンプルの特徴を改変するために、例えば、濾過、蒸留、抽出、濃縮、遠心分離、干渉する成分の不活化、試薬の添加などによって事前処理されてもよい。

【0047】

「筋衛星（ｍｙｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ）細胞」又は「筋幹細胞」としても公知である「衛星細胞」は、成熟筋肉において見出される細胞質をほとんど含まない小さな多能性細胞である。衛星細胞は、骨格筋細胞の前駆体であり、衛星細胞又は分化した骨格筋細胞を生じることができる。
本明細書において使用される「部位特異的ヌクレアーゼ」とは、ＤＮＡ配列を特異的に認識して切断可能である酵素を指す。部位特異的ヌクレアーゼは、操作され得る。操作された部位特異的ヌクレアーゼの例としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースのシステムが挙げられ得る。
「幹細胞」とは概して、分裂時に２つの発達上の選択肢に直面する細胞を指し、その娘細胞は、元の細胞と同一（自己再生）であってもよく、又はその娘細胞はより特化した細胞型の前駆体（分化）であってもよい。従って、幹細胞は、１つ又は他の経路（各細胞型のうちの１つが形成され得るさらなる経路が存在する）を採用可能である。従って、幹細胞は、最終分化せず他の型の細胞を生成することが可能である、細胞である。

【0048】

本明細書において互換可能に使用される「対象」及び「患者」とは、本明細書において記載される組成物又は方法を欲するか又は必要とする、哺乳動物を含むがそれに限定はされない任意の脊椎動物を指す。対象は、ヒトであってもよく、又は非ヒトであってもよい。対象は脊椎動物であり得る。対象は哺乳動物であり得る。哺乳動物は霊長類であってもよく、又は非霊長類であってもよい。哺乳動物は、例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ハリネズミ、アリクイ、カモノハシ、ゾウ、アルパカ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、及びマウスなどの、非霊長類であり得る。哺乳動物は、霊長類、例えば、ヒトであり得る。哺乳動物は、例えば、サル、カニクイザル、アカゲザル、チンパンジー、ゴリラ、オラウータン、及びテナガザルなどの、非ヒト霊長類であり得る。対象は、任意の年齢又は発達段階、例えば、成体、青年、又は小児などであり得る。対象は雄であり得る。対象は雌であり得る。いくつかの実施形態において、対象は、特定の遺伝的マーカーを有する。対象は、他の形態の処置を経験中であり得る。

【0049】

「実質的に同一の」とは、第１及び第２のアミノ酸配列又は第１及び第２のポリヌクレオチド配列が、それぞれ、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００アミノ酸又はヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であることを意味し得る。
本明細書において使用される「標的遺伝子」とは、既知の遺伝子生成物又は推定遺伝子生成物をコードする、任意のヌクレオチド配列を指す。標的遺伝子は、遺伝的疾患に関与する変異した遺伝子であり得る。

【0050】

本明細書において使用される「標的領域」とは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子編集システム又は標的化システムが結合するように設計されている、標的遺伝子の領域を指す。
「転写調節エレメント」又は「調節エレメント」とは、核酸配列の発現を制御し得る、例えば、核酸配列の発現を活性化、増強、若しくは減少し得るか、又は核酸配列の空間的及び／若しくは時間的発現を変化させ得る、遺伝的エレメントを指す。調節エレメントの例としては、例えば、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、及び終結シグナルが挙げられる。調節エレメントは、その調節エレメントが作動可能に連結された遺伝子に関して、「内因性」、「外因性」又は「異種」であり得る。「内因性」調節エレメントは、ゲノム中の所定の遺伝子と天然で連結されている調節エレメントである。「外因性」又は「異種」調節エレメントは、所定の遺伝子と通常は連結されていないが遺伝的操作によって遺伝子と作動可能に連結して配置されている、調節エレメントである。

【0051】

本明細書において使用される「導入遺伝子」とは、ある生物から分離されていて別の生物中へと導入される遺伝子配列を含む、遺伝子又は遺伝物質を指す。この非ネイティブＤＮＡセグメントは、トランスジェニック生物においてＲＮＡ又はタンパク質を生成する能力を保持し得、又はこの非ネイティブＤＮＡセグメントは、トランスジェニック生物の遺伝コードの正常な機能を変化させ得る。導入遺伝子の導入は、生物の表現型を変化させる可能性を有する。

【0052】

対象を疾患から保護することに言及する場合の「処置」又は「処置する」又は「処理」とは、疾患の進行を抑止、抑制、逆転、軽減、寛解、若しくは阻害すること、又は疾患を完全に除去することを意味する。処置は、急性様式又は長期様式のいずれでも実施され得る。この用語はまた、疾患の重症度又はその疾患による苦痛の前のそのような疾患に関連する症状を減少させることも指す。疾患を予防することは、疾患の発症前に本発明の組成物を対象に投与するステップを含む。疾患を抑止することは、その疾患の誘導後であるがその疾患の臨床的出現の前に、本発明の組成物を対象に投与するステップを含む。疾患を抑制又は寛解することは、その疾患の臨床的出現の後に、本発明の組成物を対象に投与するステップを含む。

【0053】

ポリヌクレオチドに関して本明細書において使用される「バリアント」とは、（ｉ）言及されたヌクレオチド配列の部分若しくはフラグメント；（ｉｉ）言及されたヌクレオチド配列の相補体若しくはその部分；（ｉｉｉ）言及された核酸若しくはその相補体と実質的に同一の核酸；又は（ｉｖ）言及された核酸、その相補体、若しくはそれらと実質的に同一の配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を意味する。

【0054】

アミノ酸の挿入、欠失、又は保存的置換によりアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持する、ペプチド又はポリペプチドに関する「バリアント」。バリアントはまた、あるアミノ酸配列を有する言及されたタンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、少なくとも１つの生物学的活性を保持する、タンパク質も意味し得る。「生物学的活性」の代表的例としては、特異的抗体若しくはポリペプチドによって結合される能力、又は免疫応答を促進する能力が挙げられる。バリアントは、その機能的なフラグメントを意味し得る。バリアントはまた、ポリペプチドの複数コピーも意味し得る。複数コピーは、タンデム型であってもよく、又はリンカーによって分離されていてもよい。アミノ酸の保存的置換、例えば、あるアミノ酸を類似する特性（例えば、親水性、荷電領域の程度及び分布）を有する別のアミノ酸で置換することは、微小な変化を典型的には含むものとして当該分野において認識されている。これらの微小な変化は、当該分野において理解されるように（Kyte et al., J. Mol. Biol. 1982, 157, 105-132）、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することによって、部分的には識別され得る。あるアミノ酸の疎水性親水性指標は、そのアミノ酸の疎水性及び電荷を考慮することに基づく。類似する疎水性親水性指標のアミノ酸が置換されてもなおタンパク質機能を保持し得ることは、当該分野において公知である。一つの態様において、±２の疎水性親水性指標を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性もまた、生物学的機能を保持するタンパク質を生じる置換を明らかにするために使用され得る。ペプチドの状況におけるアミノ酸の親水性を考慮することにより、そのペプチドの最大の局所的平均親水性の計算が可能になる。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸を用いて実施され得る。アミノ酸の疎水性指標及び親水性値の両方は、そのアミノ酸の特定の側鎖により影響を受ける。その知見と一致して、生物学的機能と適合性があるアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、大きさ、及び他の特性によって明らかにされるような、そのアミノ酸の相対的類似性、及び特にアミノ酸の側鎖に依存することが理解される。

【0055】

本明細書において使用される「ベクター」とは、複製起点を含む核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体、又は酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡベクター又はＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製する染色体外ベクターであり得、好ましくはＤＮＡプラスミドである。例えば、ベクターは、Ｃａｓ９タンパク質及び少なくとも１つのｇＲＮＡ分子をコードし得る。

【0056】

本明細書においてそうではないと定義されない限り、本開示に関して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。例えば、本明細書において記載される細胞培養、組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質化学、核酸化学及びハイブリダイゼーションに関して使用されるすべての命名法、並びにそれらの技術は、当該分野において周知であり一般的に使用されるものである。それらの用語の意味及び範囲は明らかであるが、しかし万一、なんらかの隠れた曖昧さがある場合には、本明細書において提供されている定義が、いかなる辞書にも外部の定義にも優先する。さらに、そうではないように文脈によって要求されない限りは、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数を含む。

【0057】

（２．ジストロフィン遺伝子）
ジストロフィンは、筋線維の細胞骨格を、細胞膜を通して周囲の細胞外マトリックスに結合させるタンパク質複合体の一部である、棒の形状をした細胞質タンパク質である。ジストロフィンは、細胞膜のジストログリカン複合体に対して、構造的安定性を提供する。ジストロフィン遺伝子は、座位Ｘｐ２１にある２．２メガベースである。一次転写は、約２，４００ｋｂの寸法であり、成熟ｍＲＮＡは約１４ｋｂである。７９個のエクソンが、およそ２２０万ヌクレオチドを含み、３５００アミノ酸超であるタンパク質をコードする。正常な骨格筋組織は、少量のジストロフィンしか含まないが、その異常な発現が存在しないと、重篤で治癒不可能な症状の発症がもたらされる。ジストロフィン遺伝子におけるいくつかの変異は、欠損性ジストロフィンの生成及び重篤なジストロフィー表現型を罹患した患者においてもたらす。ジストロフィン遺伝子におけるいくつかの変異は、部分的に機能的なジストロフィンタンパク質及びかなりより軽度のジストロフィー表現型を罹患した患者においてもたらす。

【0058】

ＤＭＤは、ジストロフィン遺伝子においてナンセンス変異又はフレームシフト変異を引き起こす遺伝性変異又は自然発生変異の結果である。ＤＭＤは、最も有病率の高い致死性遺伝性小児疾患であり、およそ５，０００人の新生児男性のうちの１人に罹患する。ＤＭＤは、機能的なジストロフィン遺伝子の欠如が原因で、進行性の筋肉の弱さによって特徴付けられ、２０代中盤の年齢の対象における死亡をしばしばもたらす。ほとんどの変異は、リーディングフレームを破壊するジストロフィン遺伝子における欠失である。天然に存在する変異及びその結果は、ＤＭＤについては比較的よく理解されている。そのロッドドメイン内に含まれるエクソン４５～５５領域において生じるインフレーム欠失は、非常に機能的なジストロフィンタンパク質を生成し得、多くの保因者が無症状であるかは又は軽度の症状を示す。ジストロフィンのエクソン４５～５５は、変異ホットスポットである。さらに、患者のうちの６０％よりも多くが、ジストロフィン遺伝子のこの領域におけるエクソンを標的とすることによって、処置され得る。内部が欠失しているが機能的なジストロフィンタンパク質を生成するためにｍＲＮＡスプライシングの間に非必須エクソンをスキッピング（例えば、エクソン４５スキッピング）することによって、ＤＭＤ患者における破壊されたジストロフィンリーディングフレームを復元する努力が、行われてきた。内部ジストロフィンエクソンの欠失（例えば、エクソン４５の欠失）は、適切なリーディングフレームを保持し得、内部が短縮されているが部分的に機能的なジストロフィンタンパク質を生成し得る。ジストロフィンのエクソン４５～５５の間の欠失は、ＤＭＤと比較してかなり軽度である表現型を生じ得る。

【0059】

ジストロフィン遺伝子は、変異体ジストロフィン遺伝子であり得る。ジストロフィン遺伝子は、野生型ジストロフィン遺伝子であり得る。ジストロフィン遺伝子は、野生型ジストロフィン遺伝子と機能的に同一の配列を有し得、例えば、その配列は、コドンを最適化され得るが、依然として、野生型ジストロフィンと同じタンパク質をコードする。変異体ジストロフィン遺伝子は、野生型ジストロフィン遺伝子と比較して１つ又は複数の変異を含み得る。変異は、例えば、ヌクレオチドの欠失、置換、付加、トランスバージョン、又はそれらの組合せを含み得る。変異は、少なくとも１つのイントロン及び／又はエクソンのすべて若しくは部分の欠失を含み得る。変異体ジストロフィン遺伝子のエクソンは、ジストロフィン遺伝子から変異又は少なくとも部分的に欠失され得る。変異体ジストロフィン遺伝子のエクソンは、完全に欠失され得る。変異体ジストロフィン遺伝子は、野生型ジストロフィン遺伝子における対応する配列に対応する、部分又はそのフラグメントを有し得る。いくつかの実施形態において、欠失又は変異したエクソンによって引き起こされた破壊されたジストロフィン遺伝子は、対応する野生型エクソンを戻して付加することによって、ＤＭＤ患者において復元され得る。いくつかの実施形態において、欠失又は変異したエクソン５２によって引き起こされた破壊されたジストロフィンは、野生型エクソン５２を戻して付加することによって、ＤＭＤ患者において復元され得る。特定の実施形態において、エクソン５２を付加してリーディングフレームを復元すると、欠失変異を有するＤＭＤ対象を含む、ＤＭＤ対象における表現型を寛解する。特定の実施形態において、１つ又は複数のエクソンが、破壊されたジストロフィン遺伝子に付加及び挿入され得る。その１つ又は複数のエクソンは、ジストロフィンにおける対応する変異又は欠失したエクソンを修正するように付加及び挿入され得る。その１つ又は複数のエクソンは、エクソン５２を戻して付加及び挿入することに加えて、破壊されたジストロフィン遺伝子に付加及び挿入され得る。特定の実施形態において、ジストロフィン遺伝子のエクソン５２とは、ジストロフィン遺伝子の５２番目のエクソンを指す。エクソン５２は、ＤＭＤ患者におけるフレームを破壊する欠失に頻繁に隣接する。

【0060】

（３．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子編集システム）
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子編集システムが、本明細書において提供される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子編集システムは、変異したゲノム配列における変異及び／又は欠失したエクソンを修正し、それにより標的とされた配列から発現されるタンパク質に適切な機能を復元するために、使用され得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子編集システムは、Ｃａｓ９タンパク質又は融合タンパク質と、少なくとも１つのｇＲＮＡとを含み得、「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム」とも呼ばれ得る。

【0061】

（ａ．Ｃａｓ９タンパク質）
Ｃａｓ９タンパク質は、核酸を切断しＣＲＩＳＰＲ座位によりコードされるエンドヌクレアーゼであり、タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲシステムに関与する。Ｃａｓ９タンパク質は、任意の細菌又は古細菌の種に由来し得、それらの種としては、化膿性連鎖球菌、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、アシドボラックス・アベナエ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ）、アクチノバチルス・プルロニューモニアエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アクチノバチルス・スクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、アクチノバチルス・スイス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｉｓ）、アクチノマイセス属の種（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、シクリフィルス・デニトリフィカンス（ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アミノモナス・パウシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・スミシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ）、バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス属の種（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐ．）、ブラストピレルラ・マリナ（Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｍａｒｉｎａ）、ブラディリゾビウム属の種（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．）、ブレビバチルス・ラテロスポルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ）、カンジダツス・プニセイスピリルム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、クロストリジウム・セルロリチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・パーフリンゲン（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、コリネバクテリウム・アクコレンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｃｏｌｅｎｓ）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、コリネバクテリウム・マトルコチイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ）、ディノロセオバクター・シバエ（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ）、ユーバクテリウム・ドリクム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ）、ガンマプロテオバクテリア（ｇａｍｍａ ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、パラインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・スプトルム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｕｔｏｒｕｍ）、ヘリコバクター・カナデンシス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヘリコバクター・シナエディ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｎａｅｄｉ）、ヘリコバクター・ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ）、イリオバクター・ポリトロプス（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、リステリア・イバノビイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリアセアエ・バクテリウム（Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メチロシスチス属の種（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）、メチロシナス・トリコスポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、モビルンカス・ムリエリス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｍｕｌｉｅｒｉｓ）、ナイセリア・バシリフォルミス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ）、ナイセリア・フラベッセンス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ）、ナイセリア属の種（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐ．）、ナイセリア・ワズワーシイ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ）、ニトロソモナス属の種（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、パルビバクラム・ラバメンティボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ファスコラークトバクテリウム・スクシナテュテンス（Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ）、ラルストニア・シジジイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドブラム属の種（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｐ．）、シモンシエラ・ムエレリ（Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉ）、スフィンゴモナス属の種（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、スポロラクトバチルス・ビネアエ（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｎｅａｅ）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、ストレプトコッカス属の種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、サブドリグラヌルム属の種（Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ ｓｐ．）、チストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ）、トレポネーマ属の種（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐ．）、又はベルミネフロバクター・エイセニアエ（Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ）が挙げられるが、これらに限定はされない。特定の実施形態において、Ｃａｓ９分子は、化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９分子（本明細書において「ＳｐＣａｓ９」ともまた呼ばれる）である。ＳｐＣａｓ９は、配列番号１８のアミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態において、Ｃａｓ９分子は、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子（本明細書において「ＳａＣａｓ９」ともまた呼ばれる）である。ＳａＣａｓ９は、配列番号１９のアミノ酸配列を含み得る。

【0062】

Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９融合タンパク質は、１つ又は複数のｇＲＮＡ分子と相互作用し得、ｇＲＮＡ分子と共同して、標的領域を含む部位、特定の実施形態においてはＰＡＭ配列を含む部位に、局在化し得る。Ｃａｓ９タンパク質は、ｇＲＮＡの３’末端と複合体を形成する。Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９融合タンパク質がＰＡＭ配列を認識する能力は、例えば、当該分野において公知であるような形質転換アッセイを使用することによって、決定され得る。

【0063】

ＣＲＩＳＰＲベースのシステムの特異性は、標的配列及びプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）という、２つの要因に依存し得る。標的配列は、ｇＲＮＡの５’末端に位置し、プロトスペーサーとして公知である正確なＤＮＡ配列で宿主ＤＮＡの塩基対と結合するように設計される。ｇＲＮＡの認識配列を単に交換することによって、Ｃａｓ９タンパク質は、新しいゲノム標的に指向され得る。そのＰＡＭ配列は、変更されるべきＤＮＡに位置し、Ｃａｓ９タンパク質によって認識される。Ｃａｓ９タンパク質のＰＡＭ認識配列は、種特異的であり得る。

【0064】

特定の実施形態において、標的核酸と相互作用して標的核酸を切断するＣａｓ９分子又はＣａｓ９融合タンパク質の能力は、ＰＡＭ配列依存性である。ＰＡＭ配列は、標的核酸中の配列である。特定の実施形態において、標的核酸の切断は、ＰＡＭ配列の上流で生じる。異なる細菌種に由来するＣａｓ９分子は、異なる配列モチーフ（例えば、ＰＡＭ配列）を認識し得る。化膿性連鎖球菌のＣａｓ９分子は、ＮＲＧというＰＡＭ配列（５’－ＮＲＧ－３’、Ｒは任意のヌクレオチド残基であり、いくつかの実施形態において、ＲはＡ又はＧのうちのいずれかである、配列番号１）を認識し得る。特定の実施形態において、化膿性連鎖球菌のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＧＧ（配列番号２）を自然に好み認識し得、その配列から１～１０ｂｐ、例えば３～５ｂｐ上流の標的核酸配列の切断を指示する。いくつかの実施形態において、化膿性連鎖球菌のＣａｓ９分子は、他のＰＡＭ配列、例えばＮＡＧ（配列番号３）を、操作されたシステムにおいて受容する（Hsu et al., Nature Biotechnology 2013 doi:10.1038/nbt.2647）。特定の実施形態において、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＧＧＮＧ（配列番号４）及び／又はＮＮＡＧＡＡＷ（Ｗ＝Ａ若しくはＴ）（配列番号５）を認識し、これらの配列から１～１０ｂｐ、例えば３～５ｂｐ上流の標的核酸配列の切断を指示する。特定の実施形態において、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＧＧ（配列番号２）及び／又はＮＡＡＲ（Ｒ＝Ａ又はＧ）（配列番号６）を認識し、この配列から１～１０ｂｐ、例えば３～５ｂｐ上流の標的核酸配列の切断を指示する。特定の実施形態において、黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲ（Ｒ＝Ａ又はＧ）（配列番号７）を認識し、その配列から１～１０ｂｐ、例えば３～５ｂｐ上流の標的核酸配列の切断を指示する。特定の実施形態において、黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲＮ（Ｒ＝Ａ又はＧ）（配列番号８）を認識し、その配列から１～１０ｂｐ、例えば３～５ｂｐ上流の標的核酸配列の切断を指示する。特定の実施形態において、黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲＴ（Ｒ＝Ａ又はＧ）（配列番号９）を認識し、その配列から１～１０ｂｐ、例えば３～５ｂｐ上流の標的核酸配列の切断を指示する。特定の実施形態において、黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲＶ（Ｒ＝Ａ又はＧ；Ｖ＝Ａ又はＣ又はＧ）（配列番号１０）を認識し、その配列から１～１０ｂｐ、例えば３～５ｂｐ上流の標的核酸配列の切断を指示する。髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来するＣａｓ９分子（ＮｍＣａｓ９）は、ＮＮＮＮＧＡＴＴ（配列番号１１）のネイティブＰＡＭを通常は有するが、高度に縮重したＮＮＮＮＧＮＮＮというＰＡＭ（配列番号１２）を含む種々のＰＡＭにわたる活性を有し得る（Esvelt et al. Nature Methods 2013 doi:10.1038/nmeth.2681）。上記の実施形態において、Ｎは、任意のヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＴのうちのいずれでもあり得る。Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９分子のＰＡＭ特異性を変更するために操作され得る。

【0065】

いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、ＰＡＭ配列ＮＧＧ（配列番号２）又はＮＧＡ（配列番号１３）又はＮＮＮＲＲＴ（Ｒ＝Ａ若しくはＧ）（配列番号１４）又はＡＴＴＣＣＴ（配列番号１５）又はＮＧＡＮ（配列番号１６）又はＮＧＮＧ（配列番号１７）を認識する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、黄色ブドウ球菌のＣａｓ９タンパク質であり、配列モチーフＮＮＧＲＲ（Ｒ＝Ａ若しくはＧ）（配列番号７）、ＮＮＧＲＲＮ（Ｒ＝Ａ若しくはＧ）（配列番号８）、ＮＮＧＲＲＴ（Ｒ＝Ａ若しくはＧ）（配列番号９）、又はＮＮＧＲＲＶ（Ｒ＝Ａ若しくはＧ）（Ｖ＝Ａ若しくはＧ若しくはＣ）（配列番号１０）を認識する。上記の実施形態において、Ｎは、任意のヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＴのうちのいずれでもあり得る。

【0066】

追加的に又は代替的に、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸は、核局在化配列（ＮＬＳ）を含み得る。核局在化配列は、当該分野において公知であり、例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳ（Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ－Ｖａｌ；配列番号７０）である。

【0067】

いくつかの実施形態において、上記の少なくとも１つのＣａｓ９分子は変異体Ｃａｓ９分子である。上記Ｃａｓ９タンパク質は、そのヌクレアーゼ活性が不活化されるように、変異され得る。エンドヌクレアーゼ活性を有しない不活化したＣａｓ９タンパク質（「ｉＣａｓ９」、また「ｄＣａｓ９」とも呼ばれる）が、ｇＲＮＡによって細菌、酵母、及びヒトの細胞中の遺伝子に対して標的化されており、立体障害を介して遺伝子発現を発現停止する。ヌクレアーゼ活性を不活化する化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９配列に関する例示的な変異としては、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ及び／又はＤ９８６Ａが挙げられる。Ｄ１０Ａ変異を有する化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号２０のアミノ酸配列を含み得る。Ｄ１０Ａ変異及びＨ８４９Ａ変異を有する化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号２１のアミノ酸配列を含み得る。ヌクレアーゼ活性を不活化する黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９配列に関する例示的な変異としては、Ｄ１０Ａ及びＮ５８０Ａが挙げられる。特定の実施形態において、変異体黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子は、Ｄ１０Ａ変異を含む。この変異体黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２２において記載されている。特定の実施形態において、変異体黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子は、Ｎ５８０Ａ変異を含む。この変異体黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２３において記載されている。

【0068】

いくつかの実施形態において、上記Ｃａｓ９タンパク質は、ＶＱＲバリアントである。Ｃａｓ９のＶＱＲバリアントは、Kleinstiver, et al.（Nature 2015,523,481-485、本明細書において参考として援用される）において詳述されるように、異なるＰＡＭ認識を有する変異体である。

【0069】

Ｃａｓ９分子をコードするポリヌクレオチドは、合成ポリヌクレオチドであり得る。例えば、合成ポリヌクレオチドは、化学的に改変され得る。合成ポリヌクレオチドは、コドンを最適化され得、例えば、少なくとも１つの一般的ではないコドン又はそれほど一般的ではないコドンが、一般的なコドンによって置換されている。例えば、合成ポリヌクレオチドは、本明細書において記載されるように、最適化された、例えば、哺乳動物発現系における発現のために最適化された、メッセンジャーｍＲＮＡの合成を指示し得る。化膿性連鎖球菌のＣａｓ９分子をコードする例示的なコドンを最適化された核酸配列は、配列番号２４において記載されている。黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子をコードし核局在化配列（ＮＬＳ）を任意に含む、例示的なコドンを最適化された核酸配列は、配列番号２５～３１において記載されている。黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子をコードする別の例示的なコドンを最適化された核酸配列は、配列番号３２のヌクレオチド１２９３～４４５１を含む。

【0070】

（ｂ．Ｃａｓ９融合タンパク質）
代替的に又は追加的に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子編集システムは、融合タンパク質を含み得る。融合タンパク質は、２種の異種ポリペプチドドメインを含み得る。第１のポリペプチドドメインは、Ｃａｓ９タンパク質又は変異したＣａｓ９タンパク質を含む。第１のポリペプチドドメインは、少なくとも１つの第２のポリペプチドドメインに融合される。第２のポリペプチドドメインは、Ｃａｓ９タンパク質に対して内因性である別の活性を有する。例えば、第２のポリペプチドドメインは、活性、例えば、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ヌクレアーゼ活性、核酸結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）活性、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチル化活性、及び／又は脱アセチル化活性を有し得る。第２のポリペプチドドメインの活性は、直接的であってもよく、又は間接的であってもよい。第２のポリペプチドドメインは、この活性をそれ自体が有し得（直接的）、又は第２のポリペプチドドメインは、この活性を有するポリペプチドドメインを動員及び／又はそれと相互作用し得る（間接的）。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドドメインは、転写活性化活性を有する。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドドメインは、転写抑制活性を有する。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドドメインは、合成転写因子を含む。第２のポリペプチドドメインは、第１のポリペプチドドメインのＣ末端にあり得、若しくは第１のポリペプチドドメインのＮ末端にあり得、又はそれらの組合せであり得る。融合タンパク質は、１つの第２のポリペプチドドメインを含み得る。融合タンパク質は、第２のポリペプチドドメインを２つ含み得る。例えば、融合タンパク質は、第１のポリペプチドドメインのＮ末端にある第２のポリペプチドドメインと、第１のポリペプチドドメインのＣ末端にある第２のポリペプチドドメインとを含み得る。他の実施形態において、融合タンパク質は、単一の第１のポリペプチドドメインと、１つよりも多い（例えば、２つ又は３つの）第２のポリペプチドドメインをタンデムに含み得る。

【0071】

上記第１のポリペプチドドメインから第２のポリペプチドドメインへの連結は、リンカーが第２のポリペプチドドメインの機能に干渉しない限りは、可逆的若しくは不可逆的な共有結合も介し得、又は非共有結合も介し得る。例えば、Ｃａｓポリペプチドは、融合タンパク質の部分として第２のポリペプチドドメインに連結され得る。別の例として、それらは、可逆的な非共有結合相互作用、例えばアビジン（若しくはストレプトアビジン）－ビオチン相互作用、ヒスチジン－二価金属イオン相互作用（例えば、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｆｅ）、多量体化（例えば、二量体化）ドメインの間の相互作用、又はグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）－グルタチオン相互作用を介して、連結され得る。なお別の例として、それらは、リンカーを用いて、ジブロモマレイミド（ＤＢＭ）又はアミノ－チオール結合などの共有結合的であるが可逆的に、連結され得る。いくつかの実施形態において、そのＣａｓ９融合タンパク質は、少なくとも１つのリンカーを含む。リンカーは、Ｃａｓ９融合タンパク質のポリペプチド配列中のどこか、例えば、第１のポリペプチドドメインと第２のポリペプチドドメインとの間に、含まれ得る。リンカーは、Ｃａｓ９融合タンパク質中の成分の可動性を促進又は制限するために、任意の長さ及び設計であり得る。リンカーは、約２～約１００、約５～約８０、約１０～約６０、又は約２０～約５０アミノ酸の任意のアミノ酸配列を含み得る。リンカーは、少なくとも約２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、又は３０アミノ酸のアミノ酸配列を含み得る。リンカーは、約１００、９０、８０、７０、６０、５０、又は４０アミノ酸未満のアミノ酸配列を含み得る。リンカーは、２～２０アミノ酸長であるアミノ酸配列の連続反復又はタンデム反復を含み得る。

【0072】

（ｉ）転写活性化活性）
上記第２のポリペプチドドメインは、転写活性化活性、例えば、トランス活性化ドメインを有し得る。例えば、内因性哺乳動物遺伝子、例えばヒト遺伝子の遺伝子発現は、第１のポリペプチドドメイン、例えばｄＣａｓ９と、トランス活性化ドメインとの融合タンパク質を、哺乳動物プロモーターに対して、ｇＲＮＡの組合せを介して標的化することによって、達成され得る。トランス活性化ドメインは、ＶＰ１６タンパク質、ＶＰ４８ドメイン若しくはＶＰ６４ドメインなどの複数のＶＰ１６タンパク質、ＮＦκＢ転写アクチベーター活性のｐ６５ドメイン、ＴＥＴ１、ＶＰＲ、ＶＰＨ、Ｒｔａ、及び／又はｐ３００を含み得る。例えば、融合タンパク質は、ｄＣａｓ９－ｐ３００を含み得る。いくつかの実施形態において、ｐ３００は、配列番号３３又は配列番号３４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。他の実施形態において、融合タンパク質は、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４を含む。他の実施形態において、融合タンパク質は、ＶＰ６４－ｄＣａｓ９－ＶＰ６４を含む。ＶＰ６４－ｄＣａｓ９－ＶＰ６４は、配列番号３６のポリヌクレオチドによってコードされる配列番号３５のアミノ酸配列を有する、ポリペプチドを含み得る。

【0073】

（ｉｉ）転写抑制活性）
上記第２のポリペプチドドメインは、転写抑制活性を有し得る。リプレッサーの非限定的な例としては、ＫＲＡＢドメイン若しくはＫＲＡＢなどのクルッペル関連ボックス活性、ＭＥＣＰ２、ＥＥＤ、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）若しくはＭａｄ－ＳＩＤリプレッサードメイン、ＳＩＤ４Ｘリプレッサードメイン、Ｍｘｉｌリプレッサードメイン、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、Ｇ９Ａ、ＥＳＥＴ／ＳＥＴＢＤ１、Ｃｉｒ４、Ｓｕ（ｖａｒ）３－９、Ｐｒ－ＳＥＴ７／８、ＳＵＶ４－２０Ｈ１、ＰＲ－ｓｅｔ７、Ｓｕｖ４－２０、Ｓｅｔ９、ＥＺＨ２、ＲＩＺ１、ＪＭＪＤ２Ａ／ＪＨＤＭ３Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪ２Ｄ２Ｃ／ＧＡＳＣ１、ＪＭＪＤ２Ｄ、Ｒｐｈ１、ＪＡＲＩＤ１Ａ／ＲＢＰ２、ＪＡＲＩＤ１Ｂ／ＰＬＵ－１、ＪＡＲＩＤ１Ｃ／ＳＭＣＸ、ＪＡＲＩＤ１Ｄ／ＳＭＣＹ、Ｌｉｄ、Ｊｈｎ２、Ｊｍｊ２、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、Ｒｐｄ３、Ｈｏｓ１、Ｃｉｒ６、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、Ｈｄａ１、Ｃｉｒ３、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、Ｓｉｒ２、Ｈｓｔ１、Ｈｓｔ２、Ｈｓｔ３、Ｈｓｔ４、ＨＤＡＣ１１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３ａ／３ｂ、ＤＮＭＴ３Ａ－３Ｌ、ＭＥＴ１、ＤＲＭ３、ＺＭＥＴ２、ＣＭＴ１、ＣＭＴ２、ラミニンＡ、ラミニンＢ、ＣＴＣＦ、及び／又はＴＡＴＡボックス結合タンパク質活性を有するドメイン、或いはそれらの組合せが挙げられる。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドドメインは、ＫＲＡＢドメイン活性、ＥＲＦリプレッサードメイン活性、Ｍｘｉｌリプレッサードメイン活性、ＳＩＤ４Ｘリプレッサードメイン活性、Ｍａｄ－ＳＩＤリプレッサードメイン活性、ＤＮＭＴ３Ａ若しくはＤＮＭＴ３Ｌ又はそれらの融合活性、ＬＳＤ１ヒストンデメチラーゼ活性、或いはＴＡＴＡボックス結合タンパク質活性を有する。いくつかの実施形態において、そのポリペプチドドメインは、ＫＲＡＢを含む。例えば、その融合タンパク質は、化膿性連鎖球菌ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ（ポリヌクレオチド配列は配列番号６２；タンパク質配列は配列番号６３）であり得る。その融合タンパク質は、黄色ブドウ球菌ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ（ポリヌクレオチド配列は配列番号６４；タンパク質配列は配列番号６５）であり得る。

【0074】

（ｉｉｉ）転写終結因子活性）
上記第２のポリペプチドドメインは、転写終結因子活性を有し得る。第２のポリペプチドドメインは、真核生物終結因子１（ＥＲＦ１）活性又は真核生物終結因子３（ＥＲＦ３）活性を有し得る。

【0075】

（ｉｖ）ヒストン修飾活性）
上記第２のポリペプチドドメインは、ヒストン修飾活性を有し得る。第２のポリペプチドドメインは、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、又はヒストンメチルトランスフェラーゼの活性を有し得る。ヒストンアセチルトランスフェラーゼは、ｐ３００若しくはＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）タンパク質、又はそれらのフラグメントであり得る。例えば、その融合タンパク質は、ｄＣａｓ９－ｐ３００であり得る。いくつかの実施形態において、ｐ３００は、配列番号３３又は配列番号３４のポリペプチドを含む。

【0076】

（ｖ）ヌクレアーゼ活性）
上記第２のポリペプチドドメインは、Ｃａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ活性とは異なるヌクレアーゼ活性を有し得る。ヌクレアーゼ、又はヌクレアーゼ活性を有するタンパク質は、核酸のヌクレオチドサブユニットの間のホスホジエステル結合を切断可能である酵素である。ヌクレアーゼは、それらの酵素のうちのいくつかは、両方の分類中に入り得るが、通常はエンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼとにさらに分割される。周知のヌクレアーゼとしては、デオキシリボヌクレアーゼ及びリボヌクレアーゼが挙げられる。

【0077】

（ｖｉ）核酸結合活性）
上記第２のポリペプチドドメインは、核酸結合活性又は核酸結合タンパク質－ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を有し得る。ＤＢＤは、二本鎖又は一本鎖ＤＮＡを認識する少なくとも１つのモチーフを含む、独立的にフォールディングされたタンパク質ドメインである。ＤＢＤは、特定のＤＮＡ配列（認識配列）を認識し得るか、又はＤＮＡに対する一般的親和性を有し得る。核酸結合領域は、ヘリックス－ターン－ヘリックス領域、ロイシンジッパー領域、ウィングドヘリックス領域、ウィングドヘリックス－ターン－ヘリックス領域、ヘリックス－ループ－ヘリックス領域、免疫グロブリンフォールド、Ｂ３ドメイン、ジンクフィンガー、ＨＭＧボックス、Ｗｏｒ３ドメイン、及びＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインから選択され得る。

【0078】

（ｖｉｉ）メチラーゼ活性）
上記第２のポリペプチドドメインは、メチラーゼ活性を有し得、このメチラーゼ活性は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、低分子、シトシン、又はアデニンへメチル基を転移することを含む。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドドメインは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼを含む。
（ｖｉｉｉ）デメチラーゼ活性）
上記第２のポリペプチドドメインは、デメチラーゼ活性を有し得る。第２のポリペプチドドメインは、メチル（ＣＨ３－）基を核酸、タンパク質（特にヒストン）、及び他の分子から除去する酵素を含み得る。代替的に、その第２のポリペプチドは、ＤＮＡを脱メチル化するための機構において、メチル基をヒドロキシメチルシトシンへと変換し得る。第２のポリペプチドは、この反応を触媒し得る。例えば、この反応を触媒する第２のポリペプチドは、Ｔｅｔ１であり得、このＴｅｔ１はまた、Ｔｅｔ１ＣＤ（テン－イレブン（ｔｅｎ－ｅｌｅｖｅｎ）トランスロケーションメチルシトシンジオキシゲナーゼ１；ポリヌクレオチド配列は配列番号６６；アミノ酸配列は配列番号６７）としても公知である。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドドメインは、ヒストンデメチラーゼ活性を有する。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドドメインは、ＤＮＡデメチラーゼ活性を有する。

【0079】

（ｃ．ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ））
上記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの遺伝子編集システムは、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子を含む。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの遺伝子編集システムは、２つのｇＲＮＡ分子を含み得る。少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、標的領域に結合してそれを認識し得る。ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子編集システムの標的化を提供する。ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡという、２つの非コードＲＮＡの融合物である。ｇＲＮＡは、タイプＩＩエフェクターシステムに関与する天然に存在するｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖を模倣する。この二重鎖は、例えば４２ヌクレオチドのｃｒＲＮＡ及び７５ヌクレオチドのｔｒａｃｒＲＮＡを含み得、この二重鎖は、Ｃａｓ９が標的核酸に結合し、いくつかの場合にその標的核酸を切断するための、ガイドとして作用する。そのｇＲＮＡは、任意の望ましいＤＮＡ配列を、その望ましいＤＮＡ標的との相補的塩基対合を介して標的化特異性を付与する２０ｂｐプロトスペーサーをコードする配列を交換することによって、標的とし得る。「標的領域」又は「標的配列」又は「プロトスペーサー」とは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子編集システムが標的として結合する、標的遺伝子の領域を指す。ゲノム中の標的配列を標的とするｇＲＮＡの部分は、「標的化配列」又は「標的化部分」又は「標的化ドメイン」と呼ばれ得る。「プロトスペーサー」又は「ｇＲＮＡスペーサー」は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子編集システムが標的として結合する、標的遺伝子の領域を指し得、「プロトスペーサー」又は「ｇＲＮＡスペーサー」はまた、ゲノム中の標的とされた配列と相補的であるｇＲＮＡの部分も指し得る。ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ足場を含み得る。ｇＲＮＡ足場は、ｇＲＮＡへのＣａｓ９の結合を促進し、ｇＲＮＡ足場は、エンドヌクレアーゼ活性を促進し得る。ｇＲＮＡ足場は、ｇＲＮＡが標的とする配列に対応するｇＲＮＡの部分に続く、ポリヌクレオチド配列である。合わせると、ｇＲＮＡ標的化部分及びｇＲＮＡ足場は、１つのポリヌクレオチドを形成する。ｇＲＮＡの定常領域は、配列番号６９（ＲＮＡ）の配列を含み得、この配列番号６９（ＲＮＡ）の配列は、配列番号６８（ＤＮＡ）を含む配列によってコードされる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子編集システムは、少なくとも１つのｇＲＮＡを含み得、ｇＲＮＡは、別個のＤＮＡ配列を標的とする。標的ＤＮＡ配列は、重複し得る。ｇＲＮＡは、その５’末端に標的化ドメインを含み得、標的化ドメインは、その後に適切なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が続いた場合には、標的遺伝子の標的領域の、例えば約１０～約２０ヌクレオチドにハイブリダイズ可能であるためには十分にその標的領域に対して相補的である。標的領域又はプロトスペーサーの後には、ゲノム中のそのプロトスペーサーの３’末端にあるＰＡＭ配列が続く。種々のタイプＩＩシステムが、上記に詳述したように、種々のＰＡＭ要件を有する。

【0080】

上記ｇＲＮＡの標的化ドメインは、その標的ＤＮＡの標的領域に対して完全に相補的である必要はない。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡの標的化ドメインは、ある長さのヌクレオチド、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチドにわたって、標的領域に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは少なくとも９９％相補的である（か又は、標的領域と比較して１個、２個若しくは３個のミスマッチを有する）。例えば、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化ドメインは、標的領域の少なくとも１８ヌクレオチドにわたって少なくとも８０％相補的であり得る。標的領域は、標的ＤＮＡのいずれかの鎖に存在し得る。

【0081】

上記に記載されるように、上記ｇＲＮＡ分子は、標的化ドメイン（また、標的とされた配列又は標的化配列とも呼ばれる）を含み、標的化ドメインは、その標的ＤＮＡ配列と相補的なポリヌクレオチド配列である。ｇＲＮＡは、標的化ドメイン又は相補的ポリヌクレオチド配列の５’末端に「Ｇ」を含み得る。上記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子編集システムは、種々の配列及び長さのｇＲＮＡを使用し得る。ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、標的ＤＮＡ配列の少なくとも１０塩基対、少なくとも１１塩基対、少なくとも１２塩基対、少なくとも１３塩基対、少なくとも１４塩基対、少なくとも１５塩基対、少なくとも１６塩基対、少なくとも１７塩基対、少なくとも１８塩基対、少なくとも１９塩基対、少なくとも２０塩基対、少なくとも２１塩基対、少なくとも２２塩基対、少なくとも２３塩基対、少なくとも２４塩基対、少なくとも２５塩基対、少なくとも３０塩基対、又は少なくとも３５塩基対の相補的ポリヌクレオチド配列と、その後に続くＰＡＭ配列とを含み得る。特定の実施形態において、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、１９～２５ヌクレオチド長を有する。特定の実施形態において、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、２０ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、２１ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、２２ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、２３ヌクレオチド長である。

【0082】

上記ｇＲＮＡは、ジストロフィン遺伝子のイントロン又はエクソンの内部又は付近にある領域を標的とし得る。例えば、ｇＲＮＡは、配列番号４９～５０のうちの少なくとも１つ、又はその相補体若しくはそのバリアント若しくはその短縮物（表２）を含む、ポリヌクレオチド配列に結合してそれを標的とし得、及び／又はそれにハイブリダイズし得る。ｇＲＮＡは、配列番号６０～６１から選択されるポリヌクレオチド配列、又はその相補体若しくはそのバリアント若しくはその短縮物を含み得る。短縮物は、言及される配列よりも１、２、３、４、５、６、７、８、又は９ヌクレオチド短いものであり得る。配列番号４９及び６０は、マウスｍｄｘエクソン２３の欠失のための、イントロン２２を標的とするｇＲＮＡに関する。配列番号５０及び６１は、マウスｍｄｘエクソン２３の欠失のための、イントロン２３を標的とするｇＲＮＡに関する。

【0083】

【表1】

【0084】

上記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子編集システムに含まれ得るｇＲＮＡ分子の数は、少なくとも１個のｇＲＮＡ、少なくとも２個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも３個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも４個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも５個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも６個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも７個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも８個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも９個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも１０個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも１１個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも１２個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも１３個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも１４個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも１５個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも１６個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも１７個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも１８個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも１８個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも２０個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも２５個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも３０個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも３５個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも４０個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも４５個の別個のｇＲＮＡ、又は少なくとも５０個の別個のｇＲＮＡであり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子編集システムに含まれ得るｇＲＮＡ分子の数は、５０個未満の別個のｇＲＮＡ、４５個未満の別個のｇＲＮＡ、４０個未満の別個のｇＲＮＡ、３５個未満の別個のｇＲＮＡ、３０個未満の別個のｇＲＮＡ、２５個未満の別個のｇＲＮＡ、２０個未満の別個のｇＲＮＡ、１９個未満の別個のｇＲＮＡ、１８個未満の別個のｇＲＮＡ、１７個未満の別個のｇＲＮＡ、１６個未満の別個のｇＲＮＡ、１５個未満の別個のｇＲＮＡ、１４個未満の別個のｇＲＮＡ、１３個未満の別個のｇＲＮＡ、１２個未満の別個のｇＲＮＡ、１１個未満の別個のｇＲＮＡ、１０個未満の別個のｇＲＮＡ、９個未満の別個のｇＲＮＡ、８個未満の別個のｇＲＮＡ、７個未満の別個のｇＲＮＡ、６個未満の別個のｇＲＮＡ、５個未満の別個のｇＲＮＡ、４個未満の別個のｇＲＮＡ、３個未満の別個のｇＲＮＡ、又は２個未満の別個のｇＲＮＡであり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子編集システムに含まれ得るｇＲＮＡの数は、少なくとも１個のｇＲＮＡ～少なくとも５０個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡ～少なくとも４５個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡ～少なくとも４０個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡ～少なくとも３５個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡ～少なくとも３０個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡ～少なくとも２５個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡ～少なくとも２０個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡ～少なくとも１６個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡ～少なくとも１２個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡ～少なくとも８個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡ～少なくとも４個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも４個のｇＲＮＡ～少なくとも５０個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも４個の別個のｇＲＮＡ～少なくとも４５個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも４個の別個のｇＲＮＡ～少なくとも４０個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも４個の別個のｇＲＮＡ～少なくとも３５個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも４個の別個のｇＲＮＡ～少なくとも３０個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも４個の別個のｇＲＮＡ～少なくとも２５個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも４個の別個のｇＲＮＡ～少なくとも２０個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも４個の別個のｇＲＮＡ～少なくとも１６個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも４個の別個のｇＲＮＡ～少なくとも１２個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも４個の別個のｇＲＮＡ～少なくとも８個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも８個の別個のｇＲＮＡ～少なくとも５０個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも８個の別個のｇＲＮＡ～少なくとも４５個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも８個の別個のｇＲＮＡ～少なくとも４０個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも８個の別個のｇＲＮＡ～少なくとも３５個の別個のｇＲＮＡ、８個の別個のｇＲＮＡ～少なくとも３０個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも８個の別個のｇＲＮＡ～少なくとも２５個の別個のｇＲＮＡ、８個の別個のｇＲＮＡ～少なくとも２０個の別個のｇＲＮＡ、少なくとも８個の別個のｇＲＮＡ～少なくとも１６個の別個のｇＲＮＡ、又は８個の別個のｇＲＮＡ～少なくとも１２個の別個のｇＲＮＡの間であり得る。

【0085】

（ｄ．ドナー配列）
いくつかの実施形態において、上記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子編集システムは、少なくとも１つのドナー配列を含み得る。ドナー配列は、ゲノム中に挿入されるべきポリヌクレオチド配列を含む。ドナー配列は、ある遺伝子の野生型配列を含み得る。例えば、ドナー配列は、ジストロフィン遺伝子の１つの野生型エクソン又は１つよりも多い野生型エクソンを含み得る。

【0086】

上記ｇＲＮＡ及びドナー配列は、種々のモル比で存在し得る。ｇＲＮＡとドナー配列との間のモル比は、１：１、又は１：１５、又は５：１～１：１０、又は１：１～１：５であり得る。ｇＲＮＡとドナー配列との間のモル比は、少なくとも１：１、少なくとも１：２、少なくとも１：３、少なくとも１：４、少なくとも１：５、少なくとも１：６、少なくとも１：７、少なくとも１：８、少なくとも１：９、少なくとも１：１０、少なくとも１：１５、又は少なくとも１：２０であり得る。ｇＲＮＡとドナー配列との間のモル比は、２０：１未満、１５：１未満、１０：１未満、９：１未満、８：１未満、７：１未満、６：１未満、５：１未満、４：１未満、３：１未満、２：１未満、又は１：１未満であり得る。

【0087】

（ｅ．修復経路）
上記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子編集システムは、部位特異的二本鎖切断を標的とされたゲノム座位、例えば、ジストロフィン遺伝子の内部又は付近の部位にて導入するために、使用され得る。部位特異的二本鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子編集システムが標的ＤＮＡ配列に結合する場合に引き起こされ、それによりその標的ＤＮＡの切断を可能にする。このＤＮＡ切断は、天然のＤＮＡ修復機構を刺激して、２つの可能な修復経路である相同組換え修復（ＨＤＲ）又は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路のうちの１つに導き得る。

【0088】

（ｉ）相同組換え修復（ＨＤＲ））
ある遺伝子からのタンパク質発現の復元は、相同組換え修復（ＨＤＲ）を含み得る。ドナーテンプレートが、細胞に投与され得る。ドナーテンプレートは、完全な機能的なタンパク質又は部分的に機能的なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み得る。そのような実施形態において、ドナーテンプレートは、変異体遺伝子を復元するための完全に機能的な遺伝子構築物、又は相同組換え修復後に変異体遺伝子の復元をもたらす遺伝子のフラグメントを含み得る。他の実施形態において、ドナーテンプレートは、ある遺伝子の阻害的調節エレメントの変異したバージョンをコードするヌクレオチド配列を含み得る。変異は、例えば、ヌクレオチドの置換、挿入、欠失、又はそれらの組合せを含み得る。そのような実施形態において、その遺伝子の阻害的調節エレメント中に導入された変異は、阻害的調節エレメントの転写又は阻害性調節エレメントへの結合を減少し得る。

【0089】

（ｉｉ）ＮＨＥＪ）
遺伝子からのタンパク質発現の復元は、テンプレートのないＮＨＥＪ媒介性ＤＮＡ修復を介し得る。特定の実施形態において、ＮＨＥＪは、ヌクレアーゼ媒介性ＮＨＥＪであり、これは、特定の実施形態においては、二本鎖ＤＮＡを切断するＣａｓ９分子により開始されるＮＨＥＪを指す。この方法は、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子編集システム又はそれを含む組成物を、遺伝子編集のために対象に投与するステップを含む。
ヌクレアーゼ媒介性ＮＨＥＪは、変異した標的遺伝子を修正し得、ＨＤＲ経路を上回るいくつかの潜在的利点を提供し得る。例えば、ＮＨＥＪは、非特異的挿入変異を引き起こし得る、ドナーテンプレートを必要としない。ＨＤＲとは対照的に、ＮＨＥＪは、細胞周期のすべての段階において効率的に作動し、従って、周期中及び有糸分裂後の両方の細胞、例えば筋線維において、効果的に使用され得る。これは、オリゴヌクレオチドベースのエクソンスキッピング又は薬理的に強制した終止コドンのリードスルーに対する、強力で永続的な遺伝子復元の代替法を提供し、これは、理論的にはわずか１回の薬物処理しか必要としないものであり得る。

【0090】

（４．遺伝的構築物）
上記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子編集システムは、遺伝的構築物によりコードされ得、又は遺伝的構築物内に含まれ得る。遺伝的構築物、例えば、プラスミド又は発現ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子編集システム及び／又は少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする、核酸を含み得る。特定の実施形態において、遺伝的構築物は、１つのｇＲＮＡ分子、すなわち第１のｇＲＮＡ分子をコードし、任意にＣａｓ９分子又は融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、遺伝的構築物は、２つのｇＲＮＡ分子、すなわち第１のｇＲＮＡ分子及び第２のｇＲＮＡ分子をコードし、Ｃａｓ９分子又は融合タンパク質を任意にコードする。いくつかの実施形態において、第１の遺伝的構築物は、１つのｇＲＮＡ分子、すなわち第１のｇＲＮＡ分子をコードし、Ｃａｓ９分子又は融合タンパク質を任意にコードし、第２の遺伝的構築物は、１つのｇＲＮＡ分子、すなわち第２のｇＲＮＡ分子をコードし、Ｃａｓ９分子又は融合タンパク質を任意にコードする。

【0091】

遺伝的構築物は、ポリヌクレオチド、例えばベクター及びプラスミドを含み得る。遺伝的構築物は、セントロメア、テロメア、又はプラスミド若しくはコスミドなどの、直線状ミニ染色体であり得る。そのベクターは、参考として全体が援用される、Sambrook et al., Molecular Cloning and Laboratory Manual, Second Ed., Cold Spring Harbor(1989)を含む、慣用的技術及び容易に利用可能な開始材料によってタンパク質を生成するための、発現ベクター又はシステムであり得る。その構築物は、組換え体であり得る。遺伝的構築物は、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、及び組換えアデノウイルス随伴ウイルスなどの、組換えウイルスベクターのゲノムの部分であり得る。遺伝的構築物は、核酸のコード配列の遺伝子発現のための調節エレメントを含み得る。調節エレメントは、プロモーター、エンハンサー、開始コドン、終止コドン、又はポリアデニル化シグナルであり得る。

【0092】

上記遺伝的構築物は、上記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの遺伝子編集システムをコードする異種核酸を含み得、開始コドンをさらに含み得、その開始コドンは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの遺伝子編集システムのコード配列の上流にあり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの遺伝子編集システムは、終止コドンを含み得、終止コドンは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの遺伝子編集システムのコード配列の下流にあり得る。開始コドン及び終止コドンは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの遺伝子編集システムのコード配列とインフレームにあり得る。

【0093】

上記ベクターはまた、上記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの遺伝子編集システムのコード配列と作動可能に連結されたプロモーターを含み得る。プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制的プロモーター、又は調節可能なプロモーターであり得る。プロモーターは、ユビキタスプロモーターであり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの遺伝子編集システムは、空間及び時間における遺伝子／ゲノム編集の動的制御を可能にするために、光誘導性制御下又は化学誘導性制御下にあり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの遺伝子編集システムのコード配列と作動可能に連結されたプロモーターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、ＣＭＶ最初期プロモーターなどのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、又はラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターに由来する作動可能に連結されたプロモーターであり得る。いくつかの実施形態において、そのプロモーターはＣＭＶプロモーターである。プロモーターはまた、ヒト遺伝子、例えば、ヒトユビキチンＣ（ｈＵｂＣ）、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、又はヒトメタロチオネインに由来する、プロモーターであり得る。プロモーターは、組織特異的プロモーターであり得る。組織特異的プロモーターは、特定の細胞型のみにおいて活性を有するプロモーターである。組織特異的プロモーターの例、例えば、天然又は合成の、筋肉又は皮膚特異的プロモーターは、米国特許出願公開第ＵＳ２００４０１７５７２７号において記載されており、その内容は、その全体が本明細書において援用される。組織特異的プロモーターは、筋肉特異的プロモーターであり得る。そのプロモーターは、例えば、ＣＫ８プロモーター、Ｓｐｃ５１２プロモーター、ＭＨＣＫ７プロモーターであり得る。筋肉特異的幹細胞を標的とするプロモーターとしては、ＣＫ８プロモーター、Ｓｐｃ５－１２プロモーター、及びＭＨＣＫ７プロモーターが、挙げられ得る。ＣＫ８プロモーターは、配列番号５１のポリヌクレオチド配列を含み得る。Ｓｐｃ５－１２プロモーターは、配列番号５２のポリヌクレオチド配列を含み得る。ＭＨＣＫ７プロモーターは、配列番号５３のポリヌクレオチド配列を含み得る。

【0094】

上記遺伝的構築物はまた、ポリアデニル化シグナルも含み得、このポリアデニル化シグナルは、上記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの遺伝子編集システムの下流にあり得る。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、又はヒトβ－グロビンポリアデニル化シグナルであり得る。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に由来するポリアデニル化シグナルであり得る。

【0095】

上記遺伝的構築物中のコード配列は、安定性及び高レベルの発現のために最適化され得る。いくつかの場合において、コドンは、そのＲＮＡの二次構造形成、例えば、分子内結合が原因で形成される二次構造形成を、減少するように選択される。
上記遺伝的構築物はまた、上記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの遺伝子編集システム又はｇＲＮＡの上流に、エンハンサーを含み得る。エンハンサーは、ＤＮＡ発現のために必要であり得る。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン又はウイルスのエンハンサー、例えば、ＣＭＶ、ＨＡ、ＲＳＶ、若しくはＥＢＶに由来するエンハンサーであり得る。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号及びＷＯ９４／０１６７３７に記載されており、それらの各々の内容は、参考として完全に援用される。遺伝的構築物はまた、ベクターを染色体外で維持するため、及び細胞においてそのベクターの複数のコピーを生成するために、哺乳動物複製起点を含み得る。遺伝的構築物はまた、調節配列を含み得、その調節配列は、そのベクターが投与される哺乳動物細胞又はヒト細胞における遺伝子発現のために十分に適しているものであり得る。遺伝的構築物はまた、レポーター遺伝子、例えば緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）、及び／又は選択マーカー、例えばハイグロマイシン（「Ｈｙｇｒｏ」）を含み得る。

【0096】

上記遺伝的構築物は、上記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの遺伝子編集システムをコードする核酸で細胞をトランスフェクトするために有用であり得、その形質転換された宿主細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの遺伝子編集システムの発現が生じる条件下で培養され維持される。遺伝的構築物は、細胞中に形質転換又は形質導入され得る。遺伝的構築物は、任意の適切な型の送達媒介物中に処方され得、その送達媒介物としては、例えば、細胞中への送達のための、ウイルスベクター、レンチウイルス発現、ｍＲＮＡ電気穿孔、及び脂質媒介性トランスフェクションが挙げられる。遺伝的構築物は、細胞中で生存する、生きている減弱した微生物又は組換え微生物ベクター中にある、遺伝物質の一部であり得る。遺伝的構築物は、機能する染色体外分子として、その細胞中に存在し得る。

【0097】

本明細書において詳述されているシステム又はその成分を用いて形質転換又は形質導入された細胞が、本明細書においてさらに提供される。適切な細胞型は、本明細書において詳述されている。いくつかの実施形態において、細胞は幹細胞である。幹細胞は、ヒト幹細胞であり得る。いくつかの実施形態において、細胞は胚性幹細胞である。幹細胞は、ヒト多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であり得る。細胞は、筋肉細胞であり得る。細胞は、衛星細胞であり得る。本明細書において詳述されているＤＮＡ標的化システム又はその成分を用いて形質転換又は形質導入された幹細胞に由来するニューロン、例えばｉＰＳＣに由来するニューロンが、さらに提供される。

【0098】

（ａ．ウイルスベクター）
遺伝的構築物は、ウイルスベクターであり得る。ウイルス送達システムが、本明細書においてさらに提供される。ウイルス送達システムは、例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ｍＲＮＡ電気穿孔、又はナノ粒子を含み得る。いくつかの実施形態において、そのベクターは、改変型レンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。ＡＡＶベクターは、ヒト及び他のいくつかの霊長類種に感染する、パルボウイルス科のディペンドウイルス属に属する小さいウイルスである。ＡＡＶベクターは、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ７４、Ｒｈ７４、若しくはＲｈ１０、又はそれらのハイブリッド若しくはキメラであり得る。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、又はＡＡＶ５ベクターである。

【0099】

ＡＡＶベクターは、種々の構築物の構成を使用して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子編集システムを送達するために使用され得る。例えば、ＡＡＶベクターは、Ｃａｓ９又は融合タンパク質と、ｇＲＮＡ発現カセットとを、別個のベクター又は同じベクターにて送達し得る。代替的に、黄色ブドウ球菌又は髄膜炎菌などの種に由来する小さなＣａｓ９タンパク質又は融合タンパク質が使用される場合には、そのＣａｓ９と、２個までのｇＲＮＡ発現カセットとの両方が、単一のＡＡＶベクター中で合わせられ得る。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、４．７ｋｂのパッケージング限界を有する。

【0100】

いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶベクターは改変型ＡＡＶベクターである。改変型ＡＡＶベクターは、増強した心臓及び／又は骨格筋組織指向性を有し得る。組織指向性とは、特定のウイルス又は細菌の増殖を支持する、宿主の細胞及び／又は組織を記述する。例えば、いくつかのウイルスは、広い組織指向性を有し、それらは多くの型の細胞及び組織に感染し得る。他のウイルスは、主に単一の組織に感染し得る。いくつかの実施形態において、そのベクターは、筋衛星細胞への指向性を有する。改変型ＡＡＶベクターは、哺乳動物の細胞において上記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子編集システムを送達及び発現することが可能であり得る。例えば、改変型ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ－ＳＡＳＴＧベクター（Piacentino et al. Human Gene Therapy 2012, 23, 635-646）であり得る。改変型ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９などの、いくつかのキャプシド型のうちの１つ又は複数に基づき得る。改変型ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２シュードタイプと合わせた代替的筋肉指向性ＡＡＶキャプシドに基づき得、例えば、全身送達及び局所送達により骨格筋又は心筋に効率的に形質導入する、ＡＡＶ２／１ベクター、ＡＡＶ２／６ベクター、ＡＡＶ２／７ベクター、ＡＡＶ２／８ベクター、ＡＡＶ２／９ベクター、ＡＡＶ２．５ベクター、及びＡＡＶ／ＳＡＳＴＧベクター（Seto et al. Current Gene Therapy 2012, 12, 139-151）である。改変型ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２ｉ８Ｇ９（Shen et al. J. Biol. Chem. 2013, 288, 28814-28823）であり得る。
上記遺伝的構築物は、配列番号５４～５９から選択されるポリヌクレオチド配列を含み得る。遺伝的構築物は、配列番号５４～５９のうちの少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含み得る。

【0101】

（５．医薬組成物）
上記の遺伝的構築物又は遺伝子編集システムを含む医薬組成物が、本明細書においてさらに提供される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの遺伝子編集システムをコードするＤＮＡを約１ｎｇ～約１０ｍｇ含み得る。本明細書において詳述されているシステム若しくは遺伝的構築物、又はその少なくとも１つの成分は、医薬分野の当業者にとって周知である標準的技術に従って、医薬組成物へと処方され得る。医薬組成物は、使用されるべき投与様式に従って処方され得る。医薬組成物が注射可能な医薬組成物である場合には、それらの医薬組成物は、滅菌されており、発熱物質を含まず、粒子を含まない。等張性処方物が、好ましくは使用される。概して、等張性のための添加剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール及びラクトースが挙げられ得る。いくつかの場合において、等張液、例えばリン酸緩衝化生理食塩水が、好ましい。安定剤としては、ゼラチン及びアルブミンが挙げられる。いくつかの実施形態において、血管収縮剤が、その処方物に添加される。

【0102】

上記組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。薬学的に許容される賦形剤は、媒介物、アジュバント、キャリア、又は希釈剤として機能的な分子であり得る。用語「薬学的に許容されるキャリア」は、毒性がなく不活性な、固体、半固体又は液体の、任意の型の、充填剤、希釈剤、カプセル剤又は処方助剤であり得る。薬学的に許容されるキャリアとしては、例えば、希釈剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤、着色剤、矯味鏡臭剤、甘味料、抗酸化剤、保存剤、滑剤、溶剤、懸濁剤、湿潤剤、界面活性剤、軟化剤、噴霧剤、保湿剤、散剤、ｐＨ調整剤、及びそれらの組合せが挙げられる。薬学的に許容される賦形剤は、表面活性剤を含み得るトランスフェクション促進剤、例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡなどのＬＰＳアナログ、ムラミルペプチド、キノンアナログ、スクアレン及びスクアレンなどのベシクル、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、若しくはナノ粒子、又は他の公知のトランスフェクション促進剤であり得る。トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリ－Ｌ－グルタメート（ＬＧＳ）などのポリカチオン、又は脂質であり得る。トランスフェクション促進剤は、ポリ－Ｌ－グルタメートであり得、より好ましくは、ポリ－Ｌ－グルタメートは、骨格筋又は心筋において遺伝子編集するための組成物中に６ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で存在し得る。

【0103】

（６．投与）
本明細書において詳述されているシステム若しくは遺伝的構築物、又はそれらの少なくとも１つの成分は、細胞に投与又は送達され得る。核酸を宿主細胞中に導入する方法は、当該分野において公知であり、任意の公知の方法が、核酸（例えば、発現構築物）を細胞中に導入するために使用され得る。適切な方法としては、例えば、ウイルス感染又はバクテリオファージ感染、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、ポリカチオン又は脂質：核酸結合体、リポフェクション、電気穿孔、ヌクレオフェクション、イムノリポソーム、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介性トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、リポソーム媒介性トランスフェクション、パーティクルガン技術、リン酸カルシム沈殿、直接微量注入、ナノ粒子媒介性核酸送達などが挙げられる。いくつかの実施形態において、その組成物は、ｍＲＮＡ送達及びリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体送達により送達され得る。そのシステム、遺伝的構築物、又はそれらを含む組成物は、ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ若しくはＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩｂデバイス、又は他の電気穿孔デバイスを使用して、電気穿孔され得る。ＢｉｏＲａｄ電気穿孔溶液、Ｓｉｇｍａリン酸緩衝化生理食塩水 製品番号Ｄ８５３７（ＰＢＳ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＯｐｔｉＭＥＭ Ｉ（ＯＭ）、又はＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液Ｖ（Ｎ．Ｖ．）などの、いくつかの異なる緩衝液が使用され得る。トランスフェクションは、トランスフェクション試薬、例えばＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を含み得る。

【0104】

本明細書において詳述されているシステム若しくは遺伝的構築物、又はそれらの少なくともそれらの１つの成分、或いはそれらを含む医薬組成物は、対象に投与され得る。そのような組成物は、特定の対象の年齢、性別、体重及び状態、並びに投与経路などの要因を考慮して、医学分野の当業者にとって周知である投与量及び技術で、投与され得る。本開示のシステム若しくはその少なくとも１つの成分、遺伝的構築物、又はそれらを含む組成物は、経口的に、非経口的に、舌下に、経皮的に、直腸内に、経粘膜的に、局所に、鼻腔内、腟内、吸入経由、頬側投与経由、胸膜内に、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、皮内に、表皮に、筋肉内、鼻腔内、髄腔内、頭蓋内、及び関節内、又はそれらの組合せなどの、種々の経路によって、対象に投与され得る。特定の実施形態において、上記システム、遺伝的構築物、又はそれらを含む組成物は、対象に、筋肉内投与されるか、静脈内投与されるか、又はそれらの組合せで投与される。そのシステム、遺伝的構築物、又はそれらを含む組成物は、対象に、インビボ電気穿孔を伴うか又は伴わないＤＮＡ注射（ＤＮＡワクチン接種とも呼ばれる）、リポソーム媒介性、ナノ粒子促進性、組換えベクター、例えば、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、及び組換えアデノウイルス随伴ウイルスなどの、いくつかの技術によって送達され得る。その組成物は、脳又は中枢神経系の他の成分へ注射され得る。その組成物は、骨格筋又は心筋に注射され得る。例えば、その組成物は、前脛骨筋又は尾に注射され得る。獣医学用途のために、そのシステム、遺伝的構築物、又はそれらを含む組成物は、通常の獣医学の実務に従って、適切に受容可能な処方物として投与され得る。獣医は、特定の動物にとって最も適切な投与レジメン及び投与経路を容易に決定し得る。そのシステム、遺伝的構築物、又はそれらを含む組成物は、従来のシリンジ、針なし注射デバイス、「微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｇｏｎｅ ｇｕｎ）」又は他の物理的方法、例えば、電気穿孔（「ＥＰ」）、「水力学的方法」、若しくは超音波によって、投与され得る。代替的に、非ウイルス遺伝子導入若しくは非組込みウイルス遺伝子導入によるか、又は精製タンパク質及び細胞膜透過モチーフを含むｇＲＮＡの直接送達による、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースのシステムの一過性インビボ送達は、外因性ＤＮＡ組込みのリスクが最小限又は皆無である、インサイツでの非常に特異的な修正及び／又は復元を可能にし得る。

【0105】

本開示のシステム若しくは本明細書において詳述されている遺伝的構築物、又はそれらの少なくとも１つの成分、或いはそれらを含む医薬組成物、及び上記ベクターを対象の細胞へ送達した際には、トランスフェクトされた細胞は、ｇＲＮＡ分子と、Ｃａｓ９分子又は融合タンパク質とを発現し得る。

【0106】

（ａ．細胞型）
本明細書において詳述される送達方法及び／又は投与経路のいずれもが、無数の細胞型、例えば、野生型及びＤＭＤ患者由来株などの不死化筋芽細胞、初代（ｐｒｉｍａｌ）ＤＭＤ皮膚線維芽細胞、誘導された多能性幹細胞などの幹細胞、骨髄由来前駆細胞、骨格筋前駆細胞、ＤＭＤ患者由来のヒト骨格筋芽細胞、ＣＤ １３３＋細胞、中胚葉性血管芽細胞（ｍｅｓｏａｎｇｉｏｂｌａｓｔ）、心筋細胞、肝細胞、軟骨細胞、間葉系前駆細胞、造血幹細胞、筋肉細胞、平滑筋細胞、及びＭｙｏＤ形質導入細胞若しくはＰａｘ７形質導入細胞、又は他の筋原性前駆細胞が挙げられるがこれらに限定はされない、細胞ベースの治療のために現在調査中である細胞型を用いて、利用され得る。ヒト筋原性細胞の不死化は、遺伝的に修正された筋原性細胞のクローン誘導のために使用され得る。細胞は、遺伝的に修正又は復元されたジストロフィン遺伝子を含み、そのゲノム中のタンパク質コード領域中にヌクレアーゼにより誘導される他の変異を含まない、不死化ＤＭＤ筋芽細胞のクローン集団を分離及び増殖させるために、エクスビボで改変され得る。本明細書において詳述されているシステム又はその成分を用いて形質転換又は形質導入された細胞が、本明細書においてさらに提供される。例えば、本明細書において詳述されているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムをコードする単離されたポリヌクレオチドを含む細胞が、本明細書において提供される。

【0107】

（７．キット）
ジストロフィン遺伝子の機能を復元するため、及び／又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子編集システム若しくはその成分の発現を筋肉細胞又は衛星細胞に指向させるために使用され得る、キットが、本明細書において提供される。キットは、上記の、ジストロフィン遺伝子の機能を復元するため、又は発現を筋肉細胞又は衛星細胞に指向させるための、遺伝的構築物又はそれを含む組成物を含み得る。いくつかの実施形態において、キットは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの遺伝子編集システムを使用するための指示書をさらに含む。

【0108】

キットに含まれる指示書は、包装材料に貼り付けられ得、又はパケージ挿入物として含まれ得る。指示書は、典型的には印刷物に記載されるが、そのようなものに限定はされない。そのような指示書を保存すること及び指示書をエンドユーザーに伝達することが可能なあらゆる媒体が、本開示によって企図される。そのような媒体としては、電子記録媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ ＲＯＭ）などが挙げられるが、これらに限定はされない。本明細書において使用される場合、用語「指示書」とは、その指示書を提供するインターネットサイトのアドレスを含み得る。
筋肉特異的幹細胞又は衛星細胞を標的とするための上記遺伝的構築物又はそれを含む組成物は、ジストロフィン遺伝子の領域に特異的に結合してそれを切断する、上記のｇＲＮＡ分子とＣａｓ９タンパク質又は融合タンパク質とを含む、改変型ＡＡＶベクターを含み得る。上記のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの遺伝子編集システムは、上記のように、変異体ジストロフィン遺伝子中の特定の領域に特異的に結合してそれを標的とするために、上記キット中に含まれ得る。

【0109】

（８．方法）
（ａ．処置の方法）
細胞における変異体遺伝子を修正する方法が、本明細書において提供され、その方法は、細胞に本明細書において記載される組成物を投与するステップを含む。その方法は、対象に本明細書において記載されているベクター組成物を含むゲノム編集組成物を投与することを含む、変異体ジストロフィン遺伝子を修正するステップを含み得る。ゲノム編集組成物は、対象に、筋肉内投与され得るか、静脈内投与され得るか、又はそれらの組合せで投与され得る。ＤＭＤ筋ジストロフィーに罹患している対象を処置する方法もまた、本明細書において提供される。その方法は、対象に、本明細書において開示されている組成物を投与するステップを含み得る。

【実施例】

【0110】

（９．実施例）
上記は、以下の実施例を参照することによって、より良く理解され得、以下の実施例は、本発明の例示目的のために提示されており、本発明の範囲を限定することは意図されない。本開示は、複数の態様及び実施形態を有し、付随する非限定的な実施例によって説明される。

【0111】

（実施例１）
（材料及び方法）
（プラスミド設計及びＡＡＶ生成）。ＣＭＶにより駆動されるＣｒｅリコンビナーゼを含むＡＡＶ構築物を、Ｐｅｎｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅから購入した。ＣＭＶ－Ｃｒｅプラスミドもまた、Ｐｅｎｎ Ｖｅｃｏｒ Ｃｏｒｅから購入し、それを使用してＣＫ８ｅ－Ｃｒｅ ＡＡＶ導入プラスミド、ＳＰｃ５－１２－Ｃｒｅ ＡＡＶ導入プラスミド、及びＭＨＣＫ７－Ｃｒｅ ＡＡＶ導入プラスミドを作製した。ＣＲＩＳＰＲ実験のために、ＣＭＶ－ＳａＣａｓ９－３ｘＨＡ－ｂＧＨｐＡを含むＡＡＶ導入プラスミドを、Ａｄｄｇｅｎｅ（プラスミド番号６１５９２）から獲得した。ＣＭＶを除去し、筋肉特異的プロモーターをこのプラスミド中にクローニングして、ＣＫ８ｅにより駆動されるＳａＣａｓ９導入プラスミド、ＳＰｃ５－１２により駆動されるＳａＣａｓ９導入プラスミド、及びＭＨＣＫ７により駆動されるＳａＣａｓ９導入プラスミドを作製した。ヒトＵ６プロモーターにより駆動される、マウスエクソン２３切除のための２つのｇＲＮＡ発現カセットを含むＡＡＶ導入プラスミドを使用して、組換えＡＡＶを調製した。完全なＩＴＲを、すべてのベクターにおけるＡＡＶ生成の前にＳｍａＩ消化によって確認した。複数のバッチのＡＡＶを生成し、プラスミド標準曲線を用いたｑＲＴ－ＰＣＲにより力価を測定して、研究における等しい投与量を確実にした。

【0112】

（動物）。マウスＣ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ－Ｄｍｄｍｄｘ／Ｊ（ｍｄｘ）系統及びＢ６．Ｃｇ－Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ９（ＣＡＧ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）Ｈｚｅ／Ｊ（Ａｉ９）系統を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから取得した。Ｐａｘ７－ｎＧＦＰマウスを、核－ＧＦＰシグナルを内因性Ｐａｘ７の１番目のエクソン中にノックインすることにより作製し、それは、Ｓ．Ｔａｊｂａｋｈｓｈ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ）により親切にも提供された。ＮＯＤ．ＳＣＩＤ．γマウスを、Ｄｕｋｅ ＣＣＩＦ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｃｏｒｅから取得した。Ｐａｘ７ｎＧＦＰ（＋／－）；Ａｉ９（＋／－）；ｍｄｘ（＋／０）雄を、Ｃｒｅ研究のために使用した。動物を含むすべての実験は、アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）の実験動物の管理と使用に関する指針を厳格に固守して実行した。すべての実験は、デュークユニバーシティーの動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって認可された。

【0113】

（インビボＡＡＶ投与）。これらの研究に使用したすべてのマウスは、６～８週齢で注射された雄であった。衛星細胞のＣｒｅ媒介性組換えにおけるＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９の比較のために、Ｐａｘ７ｎＧＦＰ；Ａｉ９；ｍｄｘマウスに、ＴＡ筋中に４０μＬの４．７２Ｅ＋１１ｖｇを局所投与したか、又は尾静脈注射を介して２００μＬの２Ｅ＋１２ｖｇを全身投与した。注射の８週間後、マウスを安楽死させ、筋肉を、フローサイトメトリー及び免疫蛍光染色による分析のために収集した。
構成的プロモーターと筋肉特異的プロモーターとの間で衛星細胞のＣｒｅ媒介性組換えを比較するために、Ｐａｘ７ｎＧＦＰ；Ａｉ９；ｍｄｘに、４０μＬの４．００Ｅ＋１０ｖｇのＡＡＶ９ ＣＭＶにより駆動されるＣｒｅ、ＡＡＶ９ ＣＫ８ｅにより駆動されるＣｒｅ、ＡＡＶ９ ＳＰｃ５－１２により駆動されるＣｒｅ、又はＡＡＶ９ ＭＨＣＫ７により駆動されるＣｒｅを、そのＴＡ筋に局所投与した。
ＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲ実験のために、マウスに、ベクター１つ当たり７Ｅ＋１１～１Ｅ＋１２ｖｇを局所注射した。
連続損傷実験のために、ｍｄｘマウスに、ベクター１つ当たり１Ｅ＋１２ｖｇのＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲ構築物を、そのＴＡ筋に注射した。注射の４週間後、そのＴＡ筋を、５０μＬのＢａＣｌ２での損傷に供した。その筋肉を、連続的追加ＢａＣｌ２損傷の前に２週間、回復させた。筋肉を、最後のＢａＣｌ２損傷の２週間後に収集した。

【0114】

（ＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲ細胞移植実験）。生着実験のために、Ｐａｘ７ｎＧＦＰ；ｍｄｘマウスに、ＣＲＩＳＰＲベクター１つ当たり合計２Ｅ＋１２ｖｇを、後肢に注射した（ＴＡ、腓腹筋、及び四頭筋に注射した）。コントロールＰａｘ７ｎＧＦＰ；ｍｄｘマウスに、ＰＢＳを注射した。８週間後、注射した後肢を収集し、衛星細胞を、酵素消化及び選別を介して分離した。マウス１匹当たり２０～４０ｋの衛星細胞を分離し、細胞を、遠心沈殿し、１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを補充した１５μＬのハンクス平衡塩溶液中に再懸濁した。
筋肉内細胞移植の２日前に、レシピエントｍｄｘマウスをイソフルランで麻酔し、１本の後肢に、Ｘ－ＲＡＤ ３２０生物学的照射器を使用して１８Ｇｙ線量の照射を行った。移植の１日前に、マウスは、タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ、５ｍｇ／ｋｇ）を毎日腹腔内注射する免疫抑制レジメンを開始した。８週間前にＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲ又はＰＢＳで処理したＰａｘ７－ｎＧＦＰマウスから選別した衛星細胞を、レシピエントｍｄｘマウスのＴＡ筋に注射した。移植の４週間後、マウスを安楽死させ、そのＴＡ筋をゲノムＤＮＡ抽出のために収集し、組織の一部を、切片化のため、及びジストロフィン発現についての染色のために、包埋した。

【0115】

（衛星細胞分離）。局所筋肉内研究のために、筋肉を収集し、切断して小片にした。筋肉を、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にて０．２％のコラゲナーゼＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１７１０１－０１５）で１時間、酵素消化し、その後、０．２％のディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１７１０５－０４１）で３０分間消化した。細胞を、３０μｍフィルターに通して濾過し、ＳＯＮＹ ＳＨ８００フローサイトメーターにてＧＦＰ発現によって選別した。細胞を、遠心分離によって収集し、ゲノムＤＮＡを、フェノール－クロロホルム抽出によってすぐに分離した。

【0116】

（ゲノムＤＮＡ分析）。マウス筋肉に由来するゲノムＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。エクソン２３欠失を評価した。Ｔｎ５媒介性標的濃縮及び配列決定を、Ｎｅｘｔｅｒａ ＤＮＡ ｆｌｅｘ ｌｉｂｒａｒｙ ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して実施した。表１は、この研究において使用したオリゴヌクレオチド配列を列挙している。

【0117】

【表2】

【0118】

（組織学及び免疫蛍光）。収集した筋肉を、液体窒素中で冷却したＯｐｔｉｍａｌ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（ＯＣＴ）コンパウンド中でマウント及び凍結した。連続する１０μｍの凍結切片を収集した。凍結切片を、２％のＰＦＡで５分間固定し、ＰＢＳ＋０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘで１０分間、透過処理した。ブロッキング緩衝液（５％ヤギ血清、２％ ＢＳＡ、Ｍ．Ｏ．Ｍ．ブロッキング試薬、及び０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を補充した、ＰＢＳ）を、室温にて１時間塗布した。サンプルを、４℃にて一晩、以下の抗体の組合せとともにインキュベートした：Ｐａｘ７（１：５、ＤＳＨＢ）、ＭＡＮＤＹＳ８（１：２００、Ｓｉｇｍａ Ｄ８１６８）、ラミニン（１：２００、Ｓｉｇｍａ Ｌ９３９３）、ＲＦＰ（１：１０００、Ｒｏｃｋｌａｎｄ ６００－４０１－３７９）。サンプルを、ＰＢＳで１５分間洗浄し、１：５００で希釈したＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た適合する二次抗体、及びＤＡＰＩとともに、室温にて１時間インキュベートした。サンプルをＰＢＳで１５分間洗浄し、スライドを、ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともにマウントし、従来の蛍光顕微鏡を使用して画像化した。６０×画像を、共焦点顕微鏡を用いて撮影した。

【0119】

（ウェスタンブロット）。筋肉生検を、ＢｉｏＭａｓｈｅｒ（Ｔａｋａｒａ）を用いて、プロテイナーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含むＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）中で破壊し、氷上で３０分間、断続的にボルテックス処理しながらインキュベートした。サンプルを、４℃にて１６０００×ｇで３０分間遠心分離し、その上清を分離し、ビシンコニン（ｂｉｃｉｎｃｈｒｏｎｉｃ）酸アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて定量した。タンパク質分離物を、ＮｕＰＡＧＥローディング緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１０％ β－メルカプトエタノールと混合し、１００℃にて１０分間沸騰させた。サンプルを、将来の分析のために、液体窒素中で瞬間凍結した。レーン１つ当たり全タンパク質２５μｇを、ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む４～１２％ ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にローディングし、２００Ｖにて４５分間電気泳動した。タンパク質を、１０％ メタノール及び０．０１％ ＳＤＳを含む１× ｔｒｉｓ－グリシン転写緩衝液中で、４℃で４００ｍＡにて１時間、ニトロセルロース膜に転写した。そのブロットを、５％の乳汁－ＴＢＳＴ中でブロックし、抗ＨＡ（１：１０００、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ９０１５０２）、ＭＡＮＤＹＳ８（１：２００、Ｓｉｇｍａ Ｄ８１６８）、及びＧＡＰＤＨ（１：５０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ２１１８Ｓ）を用いて、５％の乳汁－ＴＢＳＴ中で４℃にて一晩プローブ処理した。その後、ブロットを、マウス又はウサギの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合型二次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）とともに、５％の乳汁－ＴＢＳＴ中で１時間インキュベートした。ブロットを、Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｃ ＥＣＬ基質（Ｂｉｏｒａｄ）を使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ化学発光システム（Ｂｉｏｒａｄ）で可視化した。

【0120】

（実施例２）
（衛星細胞の標的化効率についてのＡＡＶ血清型のプロファイリング）
Ａｉ９マウスのアレルは、ＣＡＧ－ｌｏｘＰ－ＳＴＯＰ－ｌｏｘＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ発現カセットをＲｏｓａ２６座位に保有する（Madisen, L. et al. Nat. Neurosci. 2010, 13, 133-140）。Ｃｒｅリコンビナーゼによるその終止カセットの切除は、そのｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光タンパク質の発現による、標的細胞の永続的標識化をもたらす。本発明者らは、そのＡｉ９マウスをＰａｘ７－ｎＧＦＰマウスと交雑させた。このＰａｘ７－ｎＧＦＰマウス中では、衛星細胞を特異的に標識するように、核局在化ＧＦＰがＰａｘ７の１番目のエクソン中にノックインされている（Sambasivan, R. et al. Developmental Biology 2012, 381, 241-255）。ＡＡＶベクターを介してＣｒｅリコンビナーゼを送達することによって、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現は、そのＡＡＶによって形質導入された細胞を標識する（図１Ａ）。従って、ｔｄＴｏｍａｔｏを共発現するあらゆるＧＦＰ＋細胞は、そのＡＡＶベクターで形質導入された衛星細胞を示す（図１Ｂ）。本発明者らは、ＣＭＶ－ＣｒｅをコードするＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６．２（形質導入効率を増加する点変異を有するＡＡＶ６（Limberis, M. P., et al. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 2009, 17, 294-301）、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９血清型を、Ｐａｘ７ｎＧＦＰ；Ａｉ９；ｍｄｘマウスの前脛骨（ＴＡ）筋に、４．７２Ｅ＋１１ｖｇの等用量で注射した。筋肉を注射の８週間後に収集し、その組織を、フローサイトメトリーによる即時の分析のために、シングルセルになるように解離させた。本発明者らは、ＡＡＶ９、ＡＡＶ６．２、及びＡＡＶ８がＰａｘ７－ｎＧＦＰ＋細胞を最も効率よく標識して、約６０％のｎＧＦＰ＋細胞においてｔｄＴｏｍａｔｏ発現をもたらしたことを、見出した（図１Ｃ）。その後、本発明者らは、その上位４つの成績のＡＡＶ血清型を、２Ｅ＋１２ｖｇの等用量の尾静脈注射を介する全身投与によって評価した。本発明者らは種々の骨格筋型を収集し、本発明者らは、全身注射後に、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９がＡＡＶ６．２及びＡＡＶ１よりも明らかに性能が優れていたことを、見出した。ＡＡＶ９は、Ｐａｘ７－ＧＦＰ＋細胞の有意な標的化を示し、それは種々の筋肉型について２０～３０％の範囲であった（図１Ｄ）。ｔｄＴｏｍａｔｏとＰａｘ７とのインビボでの正確な共局在化を、組織切片の免疫蛍光染色によって確認した（図１Ｅ）。本発明者らは、感度の高いＣｒｅ／ｌｏｘベースの二重レポーターマウスを使用して、ＡＡＶがインビボで衛星細胞を効率的に形質導入できることを示す。本発明者らは、独特な組織指向性を示す一般的に使用される一連のＡＡＶ血清型を試験して、ＡＡＶ９及びＡＡＶ８が局所注射及び全身尾静脈注射の両方における衛星細胞形質導入のために最も適切であることを結論付ける。

【0121】

衛星細胞は正常な組織と比較してジストロフィーの筋肉において活性化され増殖性であるので、本発明者らはまた、ＡＡＶ９－ＣｒｅをＰａｘ７ｎＧＦＰ；Ａｉ９；ＷＴマウスに全身注射して、衛星細胞のＡＡＶ形質導入に対するジストロフィー環境の役割を調査した。興味深いことに、本発明者らは、横隔膜を除く試験したすべての筋肉組織について、野生型マウスと対比したｍｄｘマウスにおいて、衛星細胞の有意に異なる形質導入効率を見出し（図１Ｆ）、おそらくこれは、再生するジストロフィーの筋肉における衛星細胞の活性化状態と関連した。本発明者らは、ｍｄｘマウスにおいて野生型マウスと比較して高いＡＡＶ９形質導入を見出した。

【0122】

（実施例３）
（ＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲ構築物はインビボでの遺伝子編集のために衛星細胞を標的とする）
次に、本発明者らは、Ｐａｘ７ｎＧＦＰ；ｍｄｘマウスを使用して、衛星細胞における遺伝子編集のレベルを、二重ＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲ戦略を用いて評価し、この二重ＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲ戦略は、黄色ブドウ球菌由来のＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）をコードする１つのＡＡＶ９ベクターと、ｍｄｘマウス中のＤｍｄ遺伝子からエクソン２３を切除するように設計された２個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするもう１つのＡＡＶ９ベクターとからなった（図２Ａ）。そのＳａＣａｓ９ ＡＡＶベクター及びｇＲＮＡ ＡＡＶベクターを、１Ｅ＋１２ｖｇ／ベクターという等価なウイルス力価であらかじめ混合し、ＴＡ筋に注射した。コントロールマウスには、等容積のＰＢＳの注射をＴＡに与えた。注射の８週間後に、筋肉を、酵素解離及び衛星細胞選別のために収集した。ゲノムＤＮＡを、選別した細胞から分離した。エクソン２３にわたるＰＣＲは、ＣＲＩＳＰＲで処理された筋肉から分離した衛星細胞において、より小さな欠失バンドを示した（図２Ｂ）。５Ｅ＋１２ｖｇ／ベクターでのＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲの全身送達もまた実施し、衛星細胞を、処理の８週間後に後肢筋肉及び横隔膜から分離した。欠失バンドがまた、サンプルの大部分において、全身静脈内送達後の衛星細胞から検出できた（図２Ｃ）。ゲル抽出した欠失バンドのサンガー配列決定によって、エクソン２３欠失を確認する（図２Ｄ）。

【0123】

衛星細胞における遺伝子編集のレベルを定量するために、本発明者らは、Ｔｎ５トランスポゾンベースのＤＮＡタグメンテーションプロトコルを、偏りのない配列決定のために適合させた。この方法を使用して、本発明者らは、ＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲの筋肉内注射の８週間後に衛星細胞において、エクソン欠失、いずれかのｇＲＮＡ標的部位におけるインデル、逆位、及びＡＡＶ組込みを含む、遺伝子編集結果を定量した（図２Ｅ）。その種々の編集結果は、衛星細胞において約０．０１～１％の範囲にあり、単一のｇＲＮＡ部位におけるインデルが最もよくある結果であった。本発明者らはまた、この方法をこれらの細胞由来のｃＤＮＡに適用して、ジストロフィン転写物におけるエクソン２３欠失のレベルを定量し、それは約０．４％～１％の範囲にあった（図２Ｆ）。衛星細胞におけるこれらの編集頻度は、処理したバルク筋肉組織において本発明者らが以前に報告し（Nelson, C. E. et al. Nat. Med. 2019, 25, 427-432）そして本明細書において同様に観察したもの（図６Ａ及び図６Ｂ）の約１０分の１である。
本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ゲノム編集が衛星細胞集団においてインビボで生じることを示す。本発明者らは、遺伝子編集結果のレベルを定量し、それにより、衛星細胞集団における、バルク筋肉と比較して有意に少ない遺伝子編集が明らかになった。

【0124】

（実施例４）
（筋肉特異的プロモーターは衛星細胞において活性である）
次に、本発明者らは、構成的ＣＭＶプロモーターではなく筋肉特異的プロモーターによってＣｒｅが駆動される場合の、衛星細胞における組換え効率を規定しようと努めた。多くの一般的に使用されるＡＡＶベクターは広範な組織指向性を示すので、臨床試験は、導入遺伝子のオフターゲット発現を回避するために利用可能である場合に、組織特異的プロモーターを用いて進める。ＣＭＶにより駆動されるＣａｓ９発現は、成体マウスにおいて免疫応答を惹起することが示されており、ＣＭＶにより駆動されるＣａｓ９発現は、非筋肉組織において遺伝子編集を引き起こし得る。Ｃａｓ９発現を筋肉に限定することは、オフターゲットゲノム編集効果のリスクを減少することができる。Ｃａｓ９発現を筋肉に限定することは、免疫応答の惹起を最小にできた。筋肉特異的プロモーターは骨格筋及び心筋を効率的に標的とするように設計されるが、衛星細胞における発現の程度は非効率的であると推定される。本発明者らの二重レポーターシステムを用いた衛星細胞における遺伝子発現の効率を決定するために、本発明者らは、ユビキタスＣＭＶプロモーターをコードするか、又はＣｒｅリコンビナーゼ発現を駆動する筋肉特異的な、ＣＫ８ｅ２３プロモーター、ＳＰｃ５－１２２４プロモーター、若しくはＭＨＣＫ７２５プロモーターをコードする、４Ｅ＋１０ｖｇのＡＡＶ９を、Ｐａｘ７ｎＧＦＰ；Ａｉ９；ｍｄｘマウスのＴＡ筋に送達した。ＣＭＶ（３３％）と比較して、組換えの効率は、ＣＫ８ｅ（１５．６％）及びＭＨＣＫ７（１５．６％）については約半分であり、ＳｐＣ５－１２（１１．５％）については３分の１であった。このことは、これらの筋肉特異的プロモーターは、ＣＭＶよりも小さい程度ではあるが、衛星細胞において活性であることを示唆した（図３Ａ）。

【0125】

筋肉特異的プロモーターに対してユビキタスプロモーターにおける遺伝子編集効率を比較するために、本発明者らは、ＣＭＶプロモーター、ＣＫ８ｅプロモーター、ＳＰｃ５－１２プロモーター、又はＭＨＣＫ７プロモーターのいずれかを用いてＳａＣａｓ９発現を駆動し、ＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲ構築物を等価なウイルス用量で筋肉内送達した。本発明者らは、これらの種々のプロモーターの間でバルク筋肉レベルでのジストロフィン復元を比較し、ＴＡ筋切片の免疫蛍光染色により、ＣＭＶ（３５％）と比較して多い数のジストロフィン＋線維が、ＭＨＣＫ７プロモーター（７３％）、ＳＰｃ５－１２プロモーター（５３％）、及びＣＫ８ｅ（４８．３％）プロモーターを保有するＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲで処理した筋肉において明らかになった（図３Ｂ）。上記の偏りのないＴｎ５タグメンテーションベースの方法を使用して、本発明者らはまた、バルク筋肉におけるこれらの種々のプロモーターにわたる遺伝子編集結果のレベルを定量した（図３Ｃ及び図３Ｄ）。本発明者らは、ＭＨＣＫ７－Ｃａｓ９処理マウスにおいて欠失発生が最も多く、ＳＰｃ５－１２がそれに次ぐことを見出した。筋肉特異的プロモーターを用いて衛星細胞において遺伝子編集を達成し得るかどうかを決定するため、本発明者らは、ＧＦＰ＋衛星細胞を処理マウスから分離し、Ｄｍｄ座位にわたるＰＣＲを実施した。エクソン２３欠失バンドを、すべての条件で検出した（図３Ｅ）。ＣＭＶプロモーターを種々の筋肉特異的プロモーターで置換してＣｒｅリコンビナーゼを駆動すること、及び等用量のＡＡＶ９を送達することによって、本発明者らは、筋肉特異的プロモーターであるＣＫ８ｅ、ＳｐＣ５－１２、及びＭＨＣＫ７は衛星細胞において実際に活性であったことを観察した。そのＭＨＣＫ７プロモーターは、最大レベルのジストロフィン復元（図３Ｂ）及び遺伝子編集（図３Ｃ）をもたらした。

【0126】

（実施例５）
（連続損傷後のＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲで処理された筋肉における持続性ジストロフィン発現）
ジストロフィン遺伝子修正のための衛星細胞の標的化は、エピソームＡＡＶベクターの喪失後でさえ継続的治療効果を提供し得た、ジストロフィンを発現する細胞の自己再生供給源を提供することができた。ジストロフィンを修正した衛星細胞の長期寄与を調査するため、本発明者らは、ｍｄｘマウスのＴＡ筋に、Ｃａｓ９を駆動するＣＭＶプロモーターを含むＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲ構築物を注射し、ジストロフィン発現をモニターした。そのｍｄｘマウスモデルはヒトＤＭＤの変性表現型の重症度を再現しないので、本発明者らは、筋肉の変性及び再生を、連続損傷戦略を実施することによって加速した。ＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲ構築物の最初の注射の４週間後、マウスに、５０μＬの１．２％塩化バリウム（ＢａＣｌ２）を注射して、２週間毎に最大６週間、筋肉損傷を誘導した（図４Ａ）。ＴＡに対するこの用量のＢａＣｌ２損傷は、野生型マウスにおいて損傷の１８時間後に、筋線維の８０％超で壊死を誘導した。従って、本発明者らは、２回又は３回の損傷が、ＣＲＩＳＰＲで処理された筋線維の変性と、それに続く衛星細胞からの新しい筋線維の再生を誘導するために十分であるという仮説を立てた。２回又は３回の損傷の後、本発明者らは、ウェスタンブロットによってＴＡ筋においてＳａＣａｓ９タンパク質をもはや検出できず、このことは、ＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲ構築物の喪失を示した（図４Ｂ）。ベクターの喪失にも関わらず、本発明者らは、免疫蛍光染色によって、３回の再生にわたるジストロフィン発現の維持を観察した（図４Ｃ）。すべての線維（ラミニン＋）の分数としてのジストロフィン＋線維の定量は、２回又は３回のいずれかの損傷後には約１０％に減少した、２８．３％の線維におけるジストロフィンの初期復元を示す図４Ｄ）。タンパク質溶解物のウェスタンブロットもまた、ＳａＣａｓ９の喪失後のジストロフィンタンパク質の維持を示した（図４Ｅ）。

【0127】

（実施例６）
（ＣＲＩＳＰＲで修正された衛星細胞の連続移植は、ジストロフィン＋筋線維の再生に寄与する）
遺伝子編集された衛星細胞がジストロフィン＋筋線維を生じることができることを示すために、本発明者らは、連続移植研究を実施した（図５Ａ）。Ｐａｘ７ｎＧＦＰ；ｍｄｘマウスに、後肢においてＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲ構築物又はＰＢＳのいずれかを注射した。８週間後、注射した筋肉を収集し、約３０，０００個のＧＦＰ＋衛星細胞をＦＡＣＳによって選別した。選別した細胞を、２日前に１８Ｇｙの照射を与えて宿主衛星細胞を無能力にしていた（Boldrin, L., et al. Stem Cells 2012, 30, 1971-1984）以外の点では未処理のｍｄｘ宿主マウスのＴＡ筋へとすぐに移植した。その宿主マウスを、タクロリムスの毎日の腹腔内注射で免疫抑制した。生着の４週間後、そのＴＡ筋を収集し、ジストロフィン発現について分析した。ジストロフィン＋線維の斑点を、ＣＲＩＳＰＲで修正された衛星細胞を注射した宿主ＴＡ筋において観察した（図５Ｂ）。ＰＢＳを注射したＰａｘ７ｎＧＦＰ；ｍｄｘドナーマウスから収集した衛星細胞を注射したＭｄｘ宿主マウスは、１．４６±０．４１ジストロフィン＋線維／ｍｍ２を示した。これは、同じ齢の群のｍｄｘマウスにおいて見出された復帰変異体線維の数（Pigozzo, S. R. et al. PLoS One 2013, 8）と同様である。対照的に、ＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲを注射したｍｄｘマウスから収集した衛星細胞を注射したｍｄｘマウスは、５．９５±０．４０ジストロフィン＋線維／ｍｍ２を示し（図５Ｃ）、これは、ＣＲＩＳＰＲで修正された衛星細胞の移植がジストロフィン＋線維の増加をもたらしたことを示唆した。本発明者らがＤｍｄ座位にわたる欠失ＰＣＲを実施した場合に、本発明者らは、ＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲで処理された衛星細胞を注射した宿主ＴＡに由来するゲノムＤＮＡだけにおいて欠失バンドを観察した。このことは、その群で観察されたジストロフィン＋線維が、遺伝子編集された細胞から生成されることを示した（図４Ｄ及び図４Ｅ）。

【0128】

以下の２つの独立した方法を使用して、衛星細胞がＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲによってインビボで編集されることを示した：変性後のジストロフィン発現の維持を評価すること（図４Ａ～図４Ｅ）及び衛星細胞移植後のジストロフィン発現（図５Ａ～図５Ｅ）。３回の変性及び再生後のジストロフィン発現の寿命が実証された。これは、ジストロフィンを修正された衛星細胞からの長期間の寄与を示す。重要なことに、衛星細胞は自己再生し、各線維には多くの衛星細胞が存在するので、編集された衛星細胞がたとえ低レベルであっても、有意なレベルのジストロフィン陽性線維を経時的にもたらし得る。
偏りのないＴｎ５タグメンテーションベースの配列決定方法を使用して、本発明者らは、衛星細胞における遺伝子編集の量の定量を提供する。これらの方法による衛星細胞への送達は、遺伝性筋ジストロフィーの環境における衛星細胞の最終的成功のための重要で予想外の考慮事項である。本明細書において実証された遺伝子編集技術及び送達方法のこの新規な最適化は、新規な増強された衛星細胞遺伝子編集を提供して、ＤＭＤ患者に長期間の治療効果を提供する。

【0129】

特定の態様についての上記の記述は、他の者が、当業者内の知識を適用することにより、過度の実験をすることなく、本開示の概括的概念から逸脱することなく、そのような特定の態様を種々の応用のために容易に改変及び／又は適合できる、本発明の概括的性質を、非常に十分に明らかにする。従って、そのような適合及び改変は、本明細書において提示される教示及び指針に基づいて、開示された態様の等価物の意味及び範囲の内部にあることが、意図される。本明細書の用語又は術語が上記の教示及び指針を考慮して当業者によって解釈されるべきであるように、本明細書における用語又は術語は記述を目的とするのであって限定を目的とはしないことが、理解されるべきである。

【0130】

本開示の広がり及び範囲は、上記の例示的な態様のいずれによっても限定されるべきではないが、以下の特許請求の範囲及びその等価物に従ってのみ定義されるべきである。
本出願において引用されているすべての公開物、特許、特許出願、及び／又は他の文書は、あたかも個別の公開物、特許、特許出願、及び／又は他の文書の各々がすべての目的のために参考として援用されると個別に示されたかのような場合と同じ程度に、すべての目的のためにその全体が参考として援用される。
完全であることを期すために、本発明の種々の態様が、以下の番号付けされた条項に示される。

【0131】

条項１。（ａ）少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチド配列と、
（ｂ）Ｃａｓ９タンパク質又は前記Ｃａｓ９タンパク質を含む融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド配列と、
（ｃ）１つ又は複数のプロモーターであり、前記プロモーター各々は前記少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする前記ポリヌクレオチド配列及び／又は前記Ｃａｓ９タンパク質若しくは融合タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列と作動可能に連結されている、１つ又は複数のプロモーターと
を含む、ベクター組成物。
条項２。前記１つ又は複数のプロモーターが筋肉特異的プロモーターである、条項１に記載の組成物。
条項３。前記１つ又は複数のプロモーターがＣＫ８プロモーター、ＳＰｃ５－１２プロモーター、若しくはＭＨＣＫ７プロモーター、又はそれらの組合せを含む、条項１又は２に記載の組成物。
条項４。衛星細胞を編集するのに使用するための、条項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
条項５。前記ベクターがウイルスベクターである、条項１～４のいずれか１項に記載の組成物。

【0132】

条項６。前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、条項５に記載の組成物。
条項７。前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ８ベクター、ＡＡＶ１ベクター、ＡＡＶ６．２ベクター、ＡＡＶｒｈ７４ベクター、又はＡＡＶ９ベクターである、条項６に記載の組成物。
条項８。（ａ）少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする前記ポリヌクレオチド配列と、（ｂ）Ｃａｓ９タンパク質又は前記Ｃａｓ９タンパク質を含む融合タンパク質をコードする、前記ポリヌクレオチド配列と、（ｃ）前記１つ又は複数のプロモーターとを含む、単一のベクターを含む、条項１～７のいずれか１項に記載の組成物。
条項９。（ａ）少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする前記ポリヌクレオチド配列と、（ｂ）Ｃａｓ９タンパク質又は前記Ｃａｓ９タンパク質を含む融合タンパク質をコードする、前記ポリヌクレオチド配列と、（ｃ）前記１つ又は複数のプロモーターとを含む、２つ以上のベクターを含む、条項１～７のいずれか１項に記載の組成物。

【0133】

条項１０。第１のベクターが、前記少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする前記ポリヌクレオチド配列を含み、
第２のベクターが、前記Ｃａｓ９タンパク質又は融合タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列を含む、
条項９に記載の組成物。
条項１１。前記プロモーターが、前記Ｃａｓ９タンパク質又は融合タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列と作動可能に連結されている、条項１～１０のいずれか１項に記載の組成物。
条項１２。前記プロモーターが、前記少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする前記ポリヌクレオチド配列と作動可能に連結されている、条項１～１１のいずれか１項に記載の組成物。
条項１３。前記組成物が２つ以上のｇＲＮＡを含み、前記２つ以上のｇＲＮＡが第１のｇＲＮＡと第２のｇＲＮＡとを含み、前記第１のベクターが前記第１のｇＲＮＡをコードし、前記第２のベクターが前記第２のｇＲＮＡをコードする、条項９～１２のいずれか１項に記載の組成物。
条項１４。前記第１のベクターが前記Ｃａｓ９タンパク質又は融合タンパク質をさらにコードする、条項１３に記載の組成物。

【0134】

条項１５。前記第２のベクターが前記Ｃａｓ９タンパク質又は融合タンパク質をさらにコードする、条項９～１４のいずれか１項に記載の組成物。
条項１６。前記プロモーターが、前記Ｃａｓ９タンパク質又は融合タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列と作動可能に連結されている、条項９～１５のいずれか１項に記載の組成物。
条項１７。前記プロモーターが、前記第１のｇＲＮＡをコードする前記ポリヌクレオチド配列と、及び／又は前記第２のｇＲＮＡをコードする前記ポリヌクレオチド配列と、作動可能に連結されている、条項１３～１６のいずれか１項に記載の組成物。
条項１８。前記Ｃａｓ９タンパク質が黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９タンパク質又は化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９タンパク質である、条項１～１７のいずれか１項に記載の組成物。
条項１９。前記ＣＫ８プロモーターが配列番号５１のポリヌクレオチド配列を含み、前記Ｓｐｃ５－１２プロモーターが配列番号５２のポリヌクレオチド配列を含み、前記ＭＨＣＫ７プロモーターが配列番号５３のポリヌクレオチド配列を含む、条項３～１８のいずれか１項に記載の組成物。

【0135】

条項２０。前記ベクターが配列番号５４～５９からなる群から選択される、条項１に記載の組成物。
条項２１。前記ベクターが幹細胞を標的とする、条項１～２０のいずれか１項に記載の組成物。
条項２２。前記ベクターが筋衛星細胞への指向性を有する、条項１～２１のいずれか１項に記載の組成物。
条項２３。条項１～２２のいずれか１項に記載の組成物を含む細胞。
条項２４。条項１～２２のいずれか１項に記載の組成物を含むキット。

【0136】

条項２５。細胞における変異体遺伝子を修正する方法であって、細胞に条項１～２２のいずれか１項に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
条項２６。前記細胞が衛星細胞である、条項２５に記載の方法。
条項２７。前記変異体遺伝子がジストロフィン遺伝子である、条項２５又は２６に記載の方法。
条項２８。対象における変異体ジストロフィン遺伝子をゲノム編集する方法であって、前記対象に条項１～２２のいずれか１項に記載の組成物を含むゲノム編集組成物を投与するステップを含む、方法。
条項２９。前記ゲノム編集組成物が前記対象に筋肉内投与されるか、静脈内投与されるか、又はそれらの組合せで投与される、条項２８に記載の方法。

【0137】

条項３０。変異体ジストロフィン遺伝子を有する、処置を必要とする対象を処置する方法であって、前記対象に条項１～２２のいずれか１項に記載の組成物又は条項２３に記載の細胞を投与するステップを含む、方法。
条項３１。デュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する対象を処置する方法であって、細胞を条項１～２２のいずれか１項に記載の組成物と接触させるステップを含む、方法。
条項３２。筋肉細胞、衛星細胞、又は幹細胞である、条項３１に記載の方法又は条項２３に記載の細胞。
条項３３。衛星細胞である、条項３１に記載の方法又は条項２３に記載の細胞。
条項３４。前記細胞を前記組成物とインビボ、インビトロ、及び／又はエクスビボで接触させる、条項３０～３３のいずれか１項に記載の方法。

【0138】

条項３５。前記細胞を前記組成物と接触させた後に、前記細胞を前記対象に移植する、条項３０～３４のいずれか１項に記載の方法。
条項３６。前記細胞が同種及び自家性である、条項３５に記載の方法。
条項３７。前記細胞を前記対象の筋肉に投与する、条項３５又は３６に記載の方法。
条項３８。前記対象に前記細胞を移植する前に前記対象を免疫抑制する、条項３５～３７のいずれか１項に記載の方法。
条項３９。前記細胞が、筋肉内注射、静脈内注射、尾部注射、硝子体内注射、線条体内注射、実質内注射、髄腔内注射、硬膜外注射、眼球後注射、皮下注射、心臓内注射、嚢胞内注射、関節内注射若しくは髄腔内注射、硬膜外カテーテル注入、クモ膜下ブロックカテーテル注入、静脈内注入、ネブライザー経由、スプレー経由、腟内経路経由、又はそれらの組合せから選択される経路を経由して前記対象に移植される、条項３５～３８のいずれか１項に記載の方法。

【0139】

条項４０。衛星細胞指向性を有するＡＡＶベクターをスクリーニングする方法であって、哺乳動物に前記ＡＡＶベクターを投与するステップを含み、前記哺乳動物はＣＡＧ－ｌｏｘＰ－ＳＴＯＰ－ｌｏｘＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ発現カセットをＲｏｓａ２６に保有するアレルを含み、前記哺乳動物のｐａｘ７遺伝子は、蛍光タンパク質を発現する遺伝子でノックインされる、方法。
条項４１。目的の遺伝子がＣｒｅをコードする、条項４０に記載の方法。
条項４２。前記蛍光タンパク質がＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、若しくはＣＦＰ、又はそれらのバリアントを含む、条項４０に記載の方法。
条項４３。衛星細胞における変異体遺伝子を修正する方法であって、細胞に条項１～２２のいずれか１項に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
条項４４。前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列番号４９若しくは５０又はその相補体を含むポリヌクレオチド配列に結合して前記ポリヌクレオチド配列を標的とするか、或いは前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列番号６０若しくは６１又はその相補体を含むポリヌクレオチド配列を含む、条項１～２２のいずれか１項に記載の組成物、条項２３に記載の細胞、条項２４に記載のキット、又は条項２５～４３のいずれか１項に記載の方法。

【0140】

（配列）
配列番号１
ＮＲＧ（Ｎは、任意のヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＴのうちのいずれでも、あり得る）
配列番号２
ＮＧＧ（Ｎは、任意のヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＴのうちのいずれでも、あり得る）
配列番号３
ＮＡＧ（Ｎは、任意のヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＴのうちのいずれでも、あり得る）
配列番号４
ＮＧＧＮＧ（Ｎは、任意のヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＴのうちのいずれでも、あり得る）
配列番号５
ＮＮＡＧＡＡＷ（Ｗ＝Ａ又はＴ；Ｎは、任意のヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＴのうちのいずれでも、あり得る）

【0141】

配列番号６
ＮＡＡＲ（Ｒ＝Ａ又はＧ；Ｎは、任意のヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＴのうちのいずれでも、あり得る）
配列番号７
ＮＮＧＲＲ（Ｒ＝Ａ又はＧ；Ｎは、任意のヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＴのうちのいずれでも、あり得る）
配列番号８
ＮＮＧＲＲＮ（Ｒ＝Ａ又はＧ；Ｎは、任意のヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＴのうちのいずれでも、あり得る）
配列番号９
ＮＮＧＲＲＴ（Ｒ＝Ａ又はＧ；Ｎは、任意のヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＴのうちのいずれでも、あり得る）

【0142】

配列番号１０
ＮＮＧＲＲＶ（Ｒ＝Ａ又はＧ；Ｎは、任意のヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＴのうちのいずれでも、あり得る）
配列番号１１
ＮＮＮＮＧＡＴＴ（Ｎは、任意のヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＴのうちのいずれでも、あり得る）
配列番号１２
ＮＮＮＮＧＮＮＮ（Ｎは、任意のヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＴのうちのいずれでも、あり得る）
配列番号１３
ＮＧＡ（Ｎは、任意のヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＴのうちのいずれでも、あり得る）
配列番号１４
ＮＮＮＲＲＴ（Ｒ＝Ａ又はＧ；Ｎは、任意のヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＴのうちのいずれでも、あり得る）
配列番号１５
ＡＴＴＣＣＴ

【0143】

配列番号１６
ＮＧＡＮ（Ｎは、任意のヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＴのうちのいずれでも、あり得る）
配列番号１７
ＮＧＮＧ（Ｎは、任意のヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＴのうちのいずれでも、あり得る）

【0144】

配列番号１８
化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD

【0145】

配列番号１９
黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子
MKRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG

【0146】

配列番号２０
化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９（Ｄ１０Ａを有する）
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD

【0147】

配列番号２１
化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９（Ｄ１０Ａ、Ｈ８４９Ａを有する）
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD

【0148】

配列番号２２
黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９のＤ１０Ａ変異体のポリヌクレオチド配列
atgaaaagga actacattct ggggctggcc atcgggatta caagcgtggg gtatgggatt
attgactatg aaacaaggga cgtgatcgac gcaggcgtca gactgttcaa ggaggccaac
gtggaaaaca atgagggacg gagaagcaag aggggagcca ggcgcctgaa acgacggaga
aggcacagaa tccagagggt gaagaaactg ctgttcgatt acaacctgct gaccgaccat
tctgagctga gtggaattaa tccttatgaa gccagggtga aaggcctgag tcagaagctg
tcagaggaag agttttccgc agctctgctg cacctggcta agcgccgagg agtgcataac
gtcaatgagg tggaagagga caccggcaac gagctgtcta caaaggaaca gatctcacgc
aatagcaaag ctctggaaga gaagtatgtc gcagagctgc agctggaacg gctgaagaaa
gatggcgagg tgagagggtc aattaatagg ttcaagacaa gcgactacgt caaagaagcc
aagcagctgc tgaaagtgca gaaggcttac caccagctgg atcagagctt catcgatact
tatatcgacc tgctggagac tcggagaacc tactatgagg gaccaggaga agggagcccc
ttcggatgga aagacatcaa ggaatggtac gagatgctga tgggacattg cacctatttt
ccagaagagc tgagaagcgt caagtacgct tataacgcag atctgtacaa cgccctgaat
gacctgaaca acctggtcat caccagggat gaaaacgaga aactggaata ctatgagaag
ttccagatca tcgaaaacgt gtttaagcag aagaaaaagc ctacactgaa acagattgct
aaggagatcc tggtcaacga agaggacatc aagggctacc gggtgacaag cactggaaaa
ccagagttca ccaatctgaa agtgtatcac gatattaagg acatcacagc acggaaagaa
atcattgaga acgccgaact gctggatcag attgctaaga tcctgactat ctaccagagc
tccgaggaca tccaggaaga gctgactaac ctgaacagcg agctgaccca ggaagagatc
gaacagatta gtaatctgaa ggggtacacc ggaacacaca acctgtccct gaaagctatc
aatctgattc tggatgagct gtggcataca aacgacaatc agattgcaat ctttaaccgg
ctgaagctgg tcccaaaaaa ggtggacctg agtcagcaga aagagatccc aaccacactg
gtggacgatt tcattctgtc acccgtggtc aagcggagct tcatccagag catcaaagtg
atcaacgcca tcatcaagaa gtacggcctg cccaatgata tcattatcga gctggctagg
gagaagaaca gcaaggacgc acagaagatg atcaatgaga tgcagaaacg aaaccggcag
accaatgaac gcattgaaga gattatccga actaccggga aagagaacgc aaagtacctg
attgaaaaaa tcaagctgca cgatatgcag gagggaaagt gtctgtattc tctggaggcc
atccccctgg aggacctgct gaacaatcca ttcaactacg aggtcgatca tattatcccc
agaagcgtgt ccttcgacaa ttcctttaac aacaaggtgc tggtcaagca ggaagagaac
tctaaaaagg gcaataggac tcctttccag tacctgtcta gttcagattc caagatctct
tacgaaacct ttaaaaagca cattctgaat ctggccaaag gaaagggccg catcagcaag
accaaaaagg agtacctgct ggaagagcgg gacatcaaca gattctccgt ccagaaggat
tttattaacc ggaatctggt ggacacaaga tacgctactc gcggcctgat gaatctgctg
cgatcctatt tccgggtgaa caatctggat gtgaaagtca agtccatcaa cggcgggttc
acatcttttc tgaggcgcaa atggaagttt aaaaaggagc gcaacaaagg gtacaagcac
catgccgaag atgctctgat tatcgcaaat gccgacttca tctttaagga gtggaaaaag
ctggacaaag ccaagaaagt gatggagaac cagatgttcg aagagaagca ggccgaatct
atgcccgaaa tcgagacaga acaggagtac aaggagattt tcatcactcc tcaccagatc
aagcatatca aggatttcaa ggactacaag tactctcacc gggtggataa aaagcccaac
agagagctga tcaatgacac cctgtatagt acaagaaaag acgataaggg gaataccctg
attgtgaaca atctgaacgg actgtacgac aaagataatg acaagctgaa aaagctgatc
aacaaaagtc ccgagaagct gctgatgtac caccatgatc ctcagacata tcagaaactg
aagctgatta tggagcagta cggcgacgag aagaacccac tgtataagta ctatgaagag
actgggaact acctgaccaa gtatagcaaa aaggataatg gccccgtgat caagaagatc
aagtactatg ggaacaagct gaatgcccat ctggacatca cagacgatta ccctaacagt
cgcaacaagg tggtcaagct gtcactgaag ccatacagat tcgatgtcta tctggacaac
ggcgtgtata aatttgtgac tgtcaagaat ctggatgtca tcaaaaagga gaactactat
gaagtgaata gcaagtgcta cgaagaggct aaaaagctga aaaagattag caaccaggca
gagttcatcg cctcctttta caacaacgac ctgattaaga tcaatggcga actgtatagg
gtcatcgggg tgaacaatga tctgctgaac cgcattgaag tgaatatgat tgacatcact
taccgagagt atctggaaaa catgaatgat aagcgccccc ctcgaattat caaaacaatt
gcctctaaga ctcagagtat caaaaagtac tcaaccgaca ttctgggaaa cctgtatgag
gtgaagagca aaaagcaccc tcagattatc aaaaagggc

【0149】

配列番号２３
黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９のＮ５８０Ａ変異体のポリヌクレオチド配列
atgaaaagga actacattct ggggctggac atcgggatta caagcgtggg gtatgggatt
attgactatg aaacaaggga cgtgatcgac gcaggcgtca gactgttcaa ggaggccaac
gtggaaaaca atgagggacg gagaagcaag aggggagcca ggcgcctgaa acgacggaga
aggcacagaa tccagagggt gaagaaactg ctgttcgatt acaacctgct gaccgaccat
tctgagctga gtggaattaa tccttatgaa gccagggtga aaggcctgag tcagaagctg
tcagaggaag agttttccgc agctctgctg cacctggcta agcgccgagg agtgcataac
gtcaatgagg tggaagagga caccggcaac gagctgtcta caaaggaaca gatctcacgc
aatagcaaag ctctggaaga gaagtatgtc gcagagctgc agctggaacg gctgaagaaa
gatggcgagg tgagagggtc aattaatagg ttcaagacaa gcgactacgt caaagaagcc
aagcagctgc tgaaagtgca gaaggcttac caccagctgg atcagagctt catcgatact
tatatcgacc tgctggagac tcggagaacc tactatgagg gaccaggaga agggagcccc
ttcggatgga aagacatcaa ggaatggtac gagatgctga tgggacattg cacctatttt
ccagaagagc tgagaagcgt caagtacgct tataacgcag atctgtacaa cgccctgaat
gacctgaaca acctggtcat caccagggat gaaaacgaga aactggaata ctatgagaag
ttccagatca tcgaaaacgt gtttaagcag aagaaaaagc ctacactgaa acagattgct
aaggagatcc tggtcaacga agaggacatc aagggctacc gggtgacaag cactggaaaa
ccagagttca ccaatctgaa agtgtatcac gatattaagg acatcacagc acggaaagaa
atcattgaga acgccgaact gctggatcag attgctaaga tcctgactat ctaccagagc
tccgaggaca tccaggaaga gctgactaac ctgaacagcg agctgaccca ggaagagatc
gaacagatta gtaatctgaa ggggtacacc ggaacacaca acctgtccct gaaagctatc
aatctgattc tggatgagct gtggcataca aacgacaatc agattgcaat ctttaaccgg
ctgaagctgg tcccaaaaaa ggtggacctg agtcagcaga aagagatccc aaccacactg
gtggacgatt tcattctgtc acccgtggtc aagcggagct tcatccagag catcaaagtg
atcaacgcca tcatcaagaa gtacggcctg cccaatgata tcattatcga gctggctagg
gagaagaaca gcaaggacgc acagaagatg atcaatgaga tgcagaaacg aaaccggcag
accaatgaac gcattgaaga gattatccga actaccggga aagagaacgc aaagtacctg
attgaaaaaa tcaagctgca cgatatgcag gagggaaagt gtctgtattc tctggaggcc
atccccctgg aggacctgct gaacaatcca ttcaactacg aggtcgatca tattatcccc
agaagcgtgt ccttcgacaa ttcctttaac aacaaggtgc tggtcaagca ggaagaggcc
tctaaaaagg gcaataggac tcctttccag tacctgtcta gttcagattc caagatctct
tacgaaacct ttaaaaagca cattctgaat ctggccaaag gaaagggccg catcagcaag
accaaaaagg agtacctgct ggaagagcgg gacatcaaca gattctccgt ccagaaggat
tttattaacc ggaatctggt ggacacaaga tacgctactc gcggcctgat gaatctgctg
cgatcctatt tccgggtgaa caatctggat gtgaaagtca agtccatcaa cggcgggttc
acatcttttc tgaggcgcaa atggaagttt aaaaaggagc gcaacaaagg gtacaagcac
catgccgaag atgctctgat tatcgcaaat gccgacttca tctttaagga gtggaaaaag
ctggacaaag ccaagaaagt gatggagaac cagatgttcg aagagaagca ggccgaatct
atgcccgaaa tcgagacaga acaggagtac aaggagattt tcatcactcc tcaccagatc
aagcatatca aggatttcaa ggactacaag tactctcacc gggtggataa aaagcccaac
agagagctga tcaatgacac cctgtatagt acaagaaaag acgataaggg gaataccctg
attgtgaaca atctgaacgg actgtacgac aaagataatg acaagctgaa aaagctgatc
aacaaaagtc ccgagaagct gctgatgtac caccatgatc ctcagacata tcagaaactg
aagctgatta tggagcagta cggcgacgag aagaacccac tgtataagta ctatgaagag
actgggaact acctgaccaa gtatagcaaa aaggataatg gccccgtgat caagaagatc
aagtactatg ggaacaagct gaatgcccat ctggacatca cagacgatta ccctaacagt
cgcaacaagg tggtcaagct gtcactgaag ccatacagat tcgatgtcta tctggacaac
ggcgtgtata aatttgtgac tgtcaagaat ctggatgtca tcaaaaagga gaactactat
gaagtgaata gcaagtgcta cgaagaggct aaaaagctga aaaagattag caaccaggca
gagttcatcg cctcctttta caacaacgac ctgattaaga tcaatggcga actgtatagg
gtcatcgggg tgaacaatga tctgctgaac cgcattgaag tgaatatgat tgacatcact
taccgagagt atctggaaaa catgaatgat aagcgccccc ctcgaattat caaaacaatt
gcctctaaga ctcagagtat caaaaagtac tcaaccgaca ttctgggaaa cctgtatgag
gtgaagagca aaaagcaccc tcagattatc aaaaagggc

【0150】

配列番号２４
化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９をコードする、コドンを最適化されたポリヌクレオチド
atggataaaa agtacagcat cgggctggac atcggtacaa actcagtggg gtgggccgtg
attacggacg agtacaaggt accctccaaa aaatttaaag tgctgggtaa cacggacaga
cactctataa agaaaaatct tattggagcc ttgctgttcg actcaggcga gacagccgaa
gccacaaggt tgaagcggac cgccaggagg cggtatacca ggagaaagaa ccgcatatgc
tacctgcaag aaatcttcag taacgagatg gcaaaggttg acgatagctt tttccatcgc
ctggaagaat cctttcttgt tgaggaagac aagaagcacg aacggcaccc catctttggc
aatattgtcg acgaagtggc atatcacgaa aagtacccga ctatctacca cctcaggaag
aagctggtgg actctaccga taaggcggac ctcagactta tttatttggc actcgcccac
atgattaaat ttagaggaca tttcttgatc gagggcgacc tgaacccgga caacagtgac
gtcgataagc tgttcatcca acttgtgcag acctacaatc aactgttcga agaaaaccct
ataaatgctt caggagtcga cgctaaagca atcctgtccg cgcgcctctc aaaatctaga
agacttgaga atctgattgc tcagttgccc ggggaaaaga aaaatggatt gtttggcaac
ctgatcgccc tcagtctcgg actgacccca aatttcaaaa gtaacttcga cctggccgaa
gacgctaagc tccagctgtc caaggacaca tacgatgacg acctcgacaa tctgctggcc
cagattgggg atcagtacgc cgatctcttt ttggcagcaa agaacctgtc cgacgccatc
ctgttgagcg atatcttgag agtgaacacc gaaattacta aagcacccct tagcgcatct
atgatcaagc ggtacgacga gcatcatcag gatctgaccc tgctgaaggc tcttgtgagg
caacagctcc ccgaaaaata caaggaaatc ttctttgacc agagcaaaaa cggctacgct
ggctatatag atggtggggc cagtcaggag gaattctata aattcatcaa gcccattctc
gagaaaatgg acggcacaga ggagttgctg gtcaaactta acagggagga cctgctgcgg
aagcagcgga cctttgacaa cgggtctatc ccccaccaga ttcatctggg cgaactgcac
gcaatcctga ggaggcagga ggatttttat ccttttctta aagataaccg cgagaaaata
gaaaagattc ttacattcag gatcccgtac tacgtgggac ctctcgcccg gggcaattca
cggtttgcct ggatgacaag gaagtcagag gagactatta caccttggaa cttcgaagaa
gtggtggaca agggtgcatc tgcccagtct ttcatcgagc ggatgacaaa ttttgacaag
aacctcccta atgagaaggt gctgcccaaa cattctctgc tctacgagta ctttaccgtc
tacaatgaac tgactaaagt caagtacgtc accgagggaa tgaggaagcc ggcattcctt
agtggagaac agaagaaggc gattgtagac ctgttgttca agaccaacag gaaggtgact
gtgaagcaac ttaaagaaga ctactttaag aagatcgaat gttttgacag tgtggaaatt
tcaggggttg aagaccgctt caatgcgtca ttggggactt accatgatct tctcaagatc
ataaaggaca aagacttcct ggacaacgaa gaaaatgagg atattctcga agacatcgtc
ctcaccctga ccctgttcga agacagggaa atgatagaag agcgcttgaa aacctatgcc
cacctcttcg acgataaagt tatgaagcag ctgaagcgca ggagatacac aggatgggga
agattgtcaa ggaagctgat caatggaatt agggataaac agagtggcaa gaccatactg
gatttcctca aatctgatgg cttcgccaat aggaacttca tgcaactgat tcacgatgac
tctcttacct tcaaggagga cattcaaaag gctcaggtga gcgggcaggg agactccctt
catgaacaca tcgcgaattt ggcaggttcc cccgctatta aaaagggcat ccttcaaact
gtcaaggtgg tggatgaatt ggtcaaggta atgggcagac ataagccaga aaatattgtg
atcgagatgg cccgcgaaaa ccagaccaca cagaagggcc agaaaaatag tagagagcgg
atgaagagga tcgaggaggg catcaaagag ctgggatctc agattctcaa agaacacccc
gtagaaaaca cacagctgca gaacgaaaaa ttgtacttgt actatctgca gaacggcaga
gacatgtacg tcgaccaaga acttgatatt aatagactgt ccgactatga cgtagaccat
atcgtgcccc agtccttcct gaaggacgac tccattgata acaaagtctt gacaagaagc
gacaagaaca ggggtaaaag tgataatgtg cctagcgagg aggtggtgaa aaaaatgaag
aactactggc gacagctgct taatgcaaag ctcattacac aacggaagtt cgataatctg
acgaaagcag agagaggtgg cttgtctgag ttggacaagg cagggtttat taagcggcag
ctggtggaaa ctaggcagat cacaaagcac gtggcgcaga ttttggacag ccggatgaac
acaaaatacg acgaaaatga taaactgata cgagaggtca aagttatcac gctgaaaagc
aagctggtgt ccgattttcg gaaagacttc cagttctaca aagttcgcga gattaataac
taccatcatg ctcacgatgc gtacctgaac gctgttgtcg ggaccgcctt gataaagaag
tacccaaagc tggaatccga gttcgtatac ggggattaca aagtgtacga tgtgaggaaa
atgatagcca agtccgagca ggagattgga aaggccacag ctaagtactt cttttattct
aacatcatga atttttttaa gacggaaatt accctggcca acggagagat cagaaagcgg
ccccttatag agacaaatgg tgaaacaggt gaaatcgtct gggataaggg cagggatttc
gctactgtga ggaaggtgct gagtatgcca caggtaaata tcgtgaaaaa aaccgaagta
cagaccggag gattttccaa ggaaagcatt ttgcctaaaa gaaactcaga caagctcatc
gcccgcaaga aagattggga ccctaagaaa tacgggggat ttgactcacc caccgtagcc
tattctgtgc tggtggtagc taaggtggaa aaaggaaagt ctaagaagct gaagtccgtg
aaggaactct tgggaatcac tatcatggaa agatcatcct ttgaaaagaa ccctatcgat
ttcctggagg ctaagggtta caaggaggtc aagaaagacc tcatcattaa actgccaaaa
tactctctct tcgagctgga aaatggcagg aagagaatgt tggccagcgc cggagagctg
caaaagggaa acgagcttgc tctgccctcc aaatatgtta attttctcta tctcgcttcc
cactatgaaa agctgaaagg gtctcccgaa gataacgagc agaagcagct gttcgtcgaa
cagcacaagc actatctgga tgaaataatc gaacaaataa gcgagttcag caaaagggtt
atcctggcgg atgctaattt ggacaaagta ctgtctgctt ataacaagca ccgggataag
cctattaggg aacaagccga gaatataatt cacctcttta cactcacgaa tctcggagcc
cccgccgcct tcaaatactt tgatacgact atcgaccgga aacggtatac cagtaccaaa
gaggtcctcg atgccaccct catccaccag tcaattactg gcctgtacga aacacggatc
gacctctctc aactgggcgg cgactag

【0151】

配列番号２５
黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９をコードする、コドンを最適化された核酸配列
atgaaaagga actacattct ggggctggac atcgggatta caagcgtggg gtatgggatt
attgactatg aaacaaggga cgtgatcgac gcaggcgtca gactgttcaa ggaggccaac
gtggaaaaca atgagggacg gagaagcaag aggggagcca ggcgcctgaa acgacggaga
aggcacagaa tccagagggt gaagaaactg ctgttcgatt acaacctgct gaccgaccat
tctgagctga gtggaattaa tccttatgaa gccagggtga aaggcctgag tcagaagctg
tcagaggaag agttttccgc agctctgctg cacctggcta agcgccgagg agtgcataac
gtcaatgagg tggaagagga caccggcaac gagctgtcta caaaggaaca gatctcacgc
aatagcaaag ctctggaaga gaagtatgtc gcagagctgc agctggaacg gctgaagaaa
gatggcgagg tgagagggtc aattaatagg ttcaagacaa gcgactacgt caaagaagcc
aagcagctgc tgaaagtgca gaaggcttac caccagctgg atcagagctt catcgatact
tatatcgacc tgctggagac tcggagaacc tactatgagg gaccaggaga agggagcccc
ttcggatgga aagacatcaa ggaatggtac gagatgctga tgggacattg cacctatttt
ccagaagagc tgagaagcgt caagtacgct tataacgcag atctgtacaa cgccctgaat
gacctgaaca acctggtcat caccagggat gaaaacgaga aactggaata ctatgagaag
ttccagatca tcgaaaacgt gtttaagcag aagaaaaagc ctacactgaa acagattgct
aaggagatcc tggtcaacga agaggacatc aagggctacc gggtgacaag cactggaaaa
ccagagttca ccaatctgaa agtgtatcac gatattaagg acatcacagc acggaaagaa
atcattgaga acgccgaact gctggatcag attgctaaga tcctgactat ctaccagagc
tccgaggaca tccaggaaga gctgactaac ctgaacagcg agctgaccca ggaagagatc
gaacagatta gtaatctgaa ggggtacacc ggaacacaca acctgtccct gaaagctatc
aatctgattc tggatgagct gtggcataca aacgacaatc agattgcaat ctttaaccgg
ctgaagctgg tcccaaaaaa ggtggacctg agtcagcaga aagagatccc aaccacactg
gtggacgatt tcattctgtc acccgtggtc aagcggagct tcatccagag catcaaagtg
atcaacgcca tcatcaagaa gtacggcctg cccaatgata tcattatcga gctggctagg
gagaagaaca gcaaggacgc acagaagatg atcaatgaga tgcagaaacg aaaccggcag
accaatgaac gcattgaaga gattatccga actaccggga aagagaacgc aaagtacctg
attgaaaaaa tcaagctgca cgatatgcag gagggaaagt gtctgtattc tctggaggcc
tccccctgg aggacctgct gaacaatcca ttcaactacg aggtcgatca tattatcccc
agaagcgtgt ccttcgacaa ttcctttaac aacaaggtgc tggtcaagca ggaagagaac
tctaaaaagg gcaataggac tcctttccag tacctgtcta gttcagattc caagatctct
tacgaaacct ttaaaaagca cattctgaat ctggccaaag gaaagggccg catcagcaag
accaaaaagg agtacctgct ggaagagcgg gacatcaaca gattctccgt ccagaaggat
tttattaacc ggaatctggt ggacacaaga tacgctactc gcggcctgat gaatctgctg
cgatcctatt tccgggtgaa caatctggat gtgaaagtca agtccatcaa cggcgggttc
acatcttttc tgaggcgcaa atggaagttt aaaaaggagc gcaacaaagg gtacaagcac
catgccgaag atgctctgat tatcgcaaat gccgacttca tctttaagga gtggaaaaag
ctggacaaag ccaagaaagt gatggagaac cagatgttcg aagagaagca ggccgaatct
atgcccgaaa tcgagacaga acaggagtac aaggagattt tcatcactcc tcaccagatc
aagcatatca aggatttcaa ggactacaag tactctcacc gggtggataa aaagcccaac
agagagctga tcaatgacac cctgtatagt acaagaaaag acgataaggg gaataccctg
attgtgaaca atctgaacgg actgtacgac aaagataatg acaagctgaa aaagctgatc
aacaaaagtc ccgagaagct gctgatgtac caccatgatc ctcagacata tcagaaactg
aagctgatta tggagcagta cggcgacgag aagaacccac tgtataagta ctatgaagag
actgggaact acctgaccaa gtatagcaaa aaggataatg gccccgtgat caagaagatc
aagtactatg ggaacaagct gaatgcccat ctggacatca cagacgatta ccctaacagt
cgcaacaagg tggtcaagct gtcactgaag ccatacagat tcgatgtcta tctggacaac
ggcgtgtata aatttgtgac tgtcaagaat ctggatgtca tcaaaaagga gaactactat
gaagtgaata gcaagtgcta cgaagaggct aaaaagctga aaaagattag caaccaggca
gagttcatcg cctcctttta caacaacgac ctgattaaga tcaatggcga actgtatagg
gtcatcgggg tgaacaatga tctgctgaac cgcattgaag tgaatatgat tgacatcact
taccgagagt atctggaaaa catgaatgat aagcgccccc ctcgaattat caaaacaatt
gcctctaaga ctcagagtat caaaaagtac tcaaccgaca ttctgggaaa cctgtatgag
gtgaagagca aaaagcaccc tcagattatc aaaaagggc

【0152】

配列番号２６
黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９をコードする、コドンを最適化された核酸配列
atgaagcgga actacatcct gggcctggac atcggcatca ccagcgtggg ctacggcatc
atcgactacg agacacggga cgtgatcgat gccggcgtgc ggctgttcaa agaggccaac
gtggaaaaca acgagggcag gcggagcaag agaggcgcca gaaggctgaa gcggcggagg
cggcatagaa tccagagagt gaagaagctg ctgttcgact acaacctgct gaccgaccac
agcgagctga gcggcatcaa cccctacgag gccagagtga agggcctgag ccagaagctg
agcgaggaag agttctctgc cgccctgctg cacctggcca agagaagagg cgtgcacaac
gtgaacgagg tggaagagga caccggcaac gagctgtcca ccaaagagca gatcagccgg
aacagcaagg ccctggaaga gaaatacgtg gccgaactgc agctggaacg gctgaagaaa
gacggcgaag tgcggggcag catcaacaga ttcaagacca gcgactacgt gaaagaagcc
aaacagctgc tgaaggtgca gaaggcctac caccagctgg accagagctt catcgacacc
tacatcgacc tgctggaaac ccggcggacc tactatgagg gacctggcga gggcagcccc
ttcggctgga aggacatcaa agaatggtac gagatgctga tgggccactg cacctacttc
cccgaggaac tgcggagcgt gaagtacgcc tacaacgccg acctgtacaa cgccctgaac
gacctgaaca atctcgtgat caccagggac gagaacgaga agctggaata ttacgagaag
ttccagatca tcgagaacgt gttcaagcag aagaagaagc ccaccctgaa gcagatcgcc
aaagaaatcc tcgtgaacga agaggatatt aagggctaca gagtgaccag caccggcaag
cccgagttca ccaacctgaa ggtgtaccac gacatcaagg acattaccgc ccggaaagag
attattgaga acgccgagct gctggatcag attgccaaga tcctgaccat ctaccagagc
agcgaggaca tccaggaaga actgaccaat ctgaactccg agctgaccca ggaagagatc
gagcagatct ctaatctgaa gggctatacc ggcacccaca acctgagcct gaaggccatc
aacctgatcc tggacgagct gtggcacacc aacgacaacc agatcgctat cttcaaccgg
ctgaagctgg tgcccaagaa ggtggacctg tcccagcaga aagagatccc caccaccctg
gtggacgact tcatcctgag ccccgtcgtg aagagaagct tcatccagag catcaaagtg
atcaacgcca tcatcaagaa gtacggcctg cccaacgaca tcattatcga gctggcccgc
gagaagaact ccaaggacgc ccagaaaatg atcaacgaga tgcagaagcg gaaccggcag
accaacgagc ggatcgagga aatcatccgg accaccggca aagagaacgc caagtacctg
atcgagaaga tcaagctgca cgacatgcag gaaggcaagt gcctgtacag cctggaagcc
atccctctgg aagatctgct gaacaacccc ttcaactatg aggtggacca catcatcccc
agaagcgtgt ccttcgacaa cagcttcaac aacaaggtgc tcgtgaagca ggaagaaaac
agcaagaagg gcaaccggac cccattccag tacctgagca gcagcgacag caagatcagc
tacgaaacct tcaagaagca catcctgaat ctggccaagg gcaagggcag aatcagcaag
accaagaaag agtatctgct ggaagaacgg gacatcaaca ggttctccgt gcagaaagac
ttcatcaacc ggaacctggt ggataccaga tacgccacca gaggcctgat gaacctgctg
cggagctact tcagagtgaa caacctggac gtgaaagtga agtccatcaa tggcggcttc
accagctttc tgcggcggaa gtggaagttt aagaaagagc ggaacaaggg gtacaagcac
cacgccgagg acgccctgat cattgccaac gccgatttca tcttcaaaga gtggaagaaa
ctggacaagg ccaaaaaagt gatggaaaac cagatgttcg aggaaaagca ggccgagagc
atgcccgaga tcgaaaccga gcaggagtac aaagagatct tcatcacccc ccaccagatc
aagcacatta aggacttcaa ggactacaag tacagccacc gggtggacaa gaagcctaat
agagagctga ttaacgacac cctgtactcc acccggaagg acgacaaggg caacaccctg
atcgtgaaca atctgaacgg cctgtacgac aaggacaatg acaagctgaa aaagctgatc
aacaagagcc ccgaaaagct gctgatgtac caccacgacc cccagaccta ccagaaactg
aagctgatta tggaacagta cggcgacgag aagaatcccc tgtacaagta ctacgaggaa
accgggaact acctgaccaa gtactccaaa aaggacaacg gccccgtgat caagaagatt
aagtattacg gcaacaaact gaacgcccat ctggacatca ccgacgacta ccccaacagc
agaaacaagg tcgtgaagct gtccctgaag ccctacagat tcgacgtgta cctggacaat
ggcgtgtaca agttcgtgac cgtgaagaat ctggatgtga tcaaaaaaga aaactactac
gaagtgaata gcaagtgcta tgaggaagct aagaagctga agaagatcag caaccaggcc
gagtttatcg cctccttcta caacaacgat ctgatcaaga tcaacggcga gctgtataga
gtgatcggcg tgaacaacga cctgctgaac cggatcgaag tgaacatgat cgacatcacc
taccgcgagt acctggaaaa catgaacgac aagaggcccc ccaggatcat taagacaatc
gcctccaaga cccagagcat taagaagtac agcacagaca ttctgggcaa cctgtatgaa
gtgaaatcta agaagcaccc tcagatcatc aaaaagggc

【0153】

配列番号２７
黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９をコードする、コドンを最適化された核酸配列
atgaagcgca actacatcct cggactggac atcggcatta cctccgtggg atacggcatc
atcgattacg aaactaggga tgtgatcgac gctggagtca ggctgttcaa agaggcgaac
gtggagaaca acgaggggcg gcgctcaaag aggggggccc gccggctgaa gcgccgccgc
agacatagaa tccagcgcgt gaagaagctg ctgttcgact acaaccttct gaccgaccac
tccgaacttt ccggcatcaa cccatatgag gctagagtga agggattgtc ccaaaagctg
tccgaggaag agttctccgc cgcgttgctc cacctcgcca agcgcagggg agtgcacaat
gtgaacgaag tggaagaaga taccggaaac gagctgtcca ccaaggagca gatcagccgg
aactccaagg ccctggaaga gaaatacgtg gcggaactgc aactggagcg gctgaagaaa
gacggagaag tgcgcggctc gatcaaccgc ttcaagacct cggactacgt gaaggaggcc
aagcagctcc tgaaagtgca aaaggcctat caccaacttg accagtcctt tatcgatacc
tacatcgatc tgctcgagac tcggcggact tactacgagg gtccagggga gggctcccca
tttggttgga aggatattaa ggagtggtac gaaatgctga tgggacactg cacatacttc
cctgaggagc tgcggagcgt gaaatacgca tacaacgcag acctgtacaa cgcgctgaac
gacctgaaca atctcgtgat cacccgggac gagaacgaaa agctcgagta ttacgaaaag
ttccagatta ttgagaacgt gttcaaacag aagaagaagc cgacactgaa gcagattgcc
aaggaaatcc tcgtgaacga agaggacatc aagggctatc gagtgacctc aacgggaaag
ccggagttca ccaatctgaa ggtctaccac gacatcaaag acattaccgc ccggaaggag
atcattgaga acgcggagct gttggaccag attgcgaaga ttctgaccat ctaccaatcc
tccgaggata ttcaggaaga actcaccaac ctcaacagcg aactgaccca ggaggagata
gagcaaatct ccaacctgaa gggctacacc ggaactcata acctgagcct gaaggccatc
aacttgatcc tggacgagct gtggcacacc aacgataacc agatcgctat tttcaatcgg
ctgaagctgg tccccaagaa agtggacctc tcacaacaaa aggagatccc tactaccctt
gtggacgatt tcattctgtc ccccgtggtc aagagaagct tcatacagtc aatcaaagtg
atcaatgcca ttatcaagaa atacggtctg cccaacgaca ttatcattga gctcgcccgc
gagaagaact cgaaggacgc ccagaagatg attaacgaaa tgcagaagag gaaccgacag
actaacgaac ggatcgaaga aatcatccgg accaccggga aggaaaacgc gaagtacctg
atcgaaaaga tcaagctcca tgacatgcag gaaggaaagt gtctgtactc gctggaggcc
attccgctgg aggacttgct gaacaaccct tttaactacg aagtggatca tatcattccg
aggagcgtgt cattcgacaa ttccttcaac aacaaggtcc tcgtgaagca ggaggaaaac
tcgaagaagg gaaaccgcac gccgttccag tacctgagca gcagcgactc caagatttcc
tacgaaacct tcaagaagca catcctcaac ctggcaaagg ggaagggtcg catctccaag
accaagaagg aatatctgct ggaagaaaga gacatcaaca gattctccgt gcaaaaggac
ttcatcaacc gcaacctcgt ggatactaga tacgctactc ggggtctgat gaacctcctg
agaagctact ttagagtgaa caatctggac gtgaaggtca agtcgattaa cggaggtttc
acctccttcc tgcggcgcaa gtggaagttc aagaaggaac ggaacaaggg ctacaagcac
cacgccgagg acgccctgat cattgccaac gccgacttca tcttcaaaga atggaagaaa
cttgacaagg ctaagaaggt catggaaaac cagatgttcg aagaaaagca ggccgagtct
atgcctgaaa tcgagactga acaggagtac aaggaaatct ttattacgcc acaccagatc
aaacacatca aggatttcaa ggattacaag tactcacatc gcgtggacaa aaagccgaac
agggaactga tcaacgacac cctctactcc acccggaagg atgacaaagg gaataccctc
atcgtcaaca accttaacgg cctgtacgac aaggacaacg ataagctgaa gaagctcatt
aacaagtcgc ccgaaaagtt gctgatgtac caccacgacc ctcagactta ccagaagctc
aagctgatca tggagcagta tggggacgag aaaaacccgt tgtacaagta ctacgaagaa
actgggaatt atctgactaa gtactccaag aaagataacg gccccgtgat taagaagatt
aagtactacg gcaacaagct gaacgcccat ctggacatca ccgatgacta ccctaattcc
cgcaacaagg tcgtcaagct gagcctcaag ccctaccggt ttgatgtgta ccttgacaat
ggagtgtaca agttcgtgac tgtgaagaac cttgacgtga tcaagaagga gaactactac
gaagtcaact ccaagtgcta cgaggaagca aagaagttga agaagatctc gaaccaggcc
gagttcattg cctccttcta taacaacgac ctgattaaga tcaacggcga actgtaccgc
gtcattggcg tgaacaacga tctcctgaac cgcatcgaag tgaacatgat cgacatcact
taccgggaat acctggagaa tatgaacgac aagcgcccgc cccggatcat taagactatc
gcctcaaaga cccagtcgat caagaagtac agcaccgaca tcctgggcaa cctgtacgag
gtcaaatcga agaagcaccc ccagatcatc aagaaggga

【0154】

配列番号２８
黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９をコードする、コドンを最適化された核酸配列
atggccccaaagaagaagcggaaggtcggtatccacggagtcccagcagccaagcggaactacatcctgggcctggacatcggcatcaccagcgtgggctacggcatcatcgactacgagacacgggacgtgatcgatgccggcgtgcggctgttcaaagaggccaacgtggaaaacaacgagggcaggcggagcaagagaggcgccagaaggctgaagcggcggaggcggcatagaatccagagagtgaagaagctgctgttcgactacaacctgctgaccgaccacagcgagctgagcggcatcaacccctacgaggccagagtgaagggcctgagccagaagctgagcgaggaagagttctctgccgccctgctgcacctggccaagagaagaggcgtgcacaacgtgaacgaggtggaagaggacaccggcaacgagctgtccaccagagagcagatcagccggaacagcaaggccctggaagagaaatacgtggccgaactgcagctggaacggctgaagaaagacggcgaagtgcggggcagcatcaacagattcaagaccagcgactacgtgaaagaagccaaacagctgctgaaggtgcagaaggcctaccaccagctggaccagagcttcatcgacacctacatcgacctgctggaaacccggcggacctactatgagggacctggcgagggcagccccttcggctggaaggacatcaaagaatggtacgagatgctgatgggccactgcacctacttccccgaggaactgcggagcgtgaagtacgcctacaacgccgacctgtacaacgccctgaacgacctgaacaatctcgtgatcaccagggacgagaacgagaagctggaatattacgagaagttccagatcatcgagaacgtgttcaagcagaagaagaagcccaccctgaagcagatcgccaaagaaatcctcgtgaacgaagaggatattaagggctacagagtgaccagcaccggcaagcccgagttcaccaacctgaaggtgtaccacgacatcaaggacattaccgcccggaaagagattattgagaacgccgagctgctggatcagattgccaagatcctgaccatctaccagagcagcgaggacatccaggaagaactgaccaatctgaactccgagctgacccaggaagagatcgagcagatctctaatctgaagggctataccggcacccacaacctgagcctgaaggccatcaacctgatcctggacgagctgtggcacaccaacgacaaccagatcgctatcttcaaccggctgaagctggtgcccaagaaggtggacctgtcccagcagaaagagatccccaccaccctggtggacgacttcatcctgagccccgtcgtgaagagaagcttcatccagagcatcaaagtgatcaacgccatcatcaagaagtacggcctgcccaacgacatcattatcgagctggcccgcgagaagaactccaaggacgcccagaaaatgatcaacgagatgcagaagcggaaccggcagaccaacgagcggatcgaggaaatcatccggaccaccggcaaagagaacgccaagtacctgatcgagaagatcaagctgcacgacatgcaggaaggcaagtgcctgtacagcctggaagccatccctctggaagatctgctgaacaaccccttcaactatgaggtggaccacatcatccccagaagcgtgtccttcgacaacagcttcaacaacaaggtgctcgtgaagcaggaagaaaacagcaagaagggcaaccggaccccattccagtacctgagcagcagcgacagcaagatcagctacgaaaccttcaagaagcacatcctgaatctggccaagggcaagggcagaatcagcaagaccaagaaagagtatctgctggaagaacgggacatcaacaggttctccgtgcagaaagacttcatcaaccggaacctggtggataccagatacgccaccagaggcctgatgaacctgctgcggagctacttcagagtgaacaacctggacgtgaaagtgaagtccatcaatggcggcttcaccagctttctgcggcggaagtggaagtttaagaaagagcggaacaaggggtacaagcaccacgccgaggacgccctgatcattgccaacgccgatttcatcttcaaagagtggaagaaactggacaaggccaaaaaagtgatggaaaaccagatgttcgaggaaaggcaggccgagagcatgcccgagatcgaaaccgagcaggagtacaaagagatcttcatcaccccccaccagatcaagcacattaaggacttcaaggactacaagtacagccaccgggtggacaagaagcctaatagagagctgattaacgacaccctgtactccacccggaaggacgacaagggcaacaccctgatcgtgaacaatctgaacggcctgtacgacaaggacaatgacaagctgaaaaagctgatcaacaagagccccgaaaagctgctgatgtaccaccacgacccccagacctaccagaaactgaagctgattatggaacagtacggcgacgagaagaatcccctgtacaagtactacgaggaaaccgggaactacctgaccaagtactccaaaaaggacaacggccccgtgatcaagaagattaagtattacggcaacaaactgaacgcccatctggacatcaccgacgactaccccaacagcagaaacaaggtcgtgaagctgtccctgaagccctacagattcgacgtgtacctggacaatggcgtgtacaagttcgtgaccgtgaagaatctggatgtgatcaaaaaagaaaactactacgaagtgaatagcaagtgctatgaggaagctaagaagctgaagaagatcagcaaccaggccgagtttatcgcctccttctacaacaacgatctgatcaagatcaacggcgagctgtatagagtgatcggcgtgaacaacgacctgctgaaccggatcgaagtgaacatgatcgacatcacctaccgcgagtacctggaaaacatgaacgacaagaggccccccaggatcattaagacaatcgcctccaagacccagagcattaagaagtacagcacagacattctgggcaacctgtatgaagtgaaatctaagaagcaccctcagatcatcaaaaagggcaaaaggccggcggccacgaaaaaggccggccaggcaaaaaagaaaaag

【0155】

配列番号２９
黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９をコードする、コドンを最適化された核酸配列
accggtgcca ccatgtaccc atacgatgtt ccagattacg cttcgccgaa gaaaaagcgc
aaggtcgaag cgtccatgaa aaggaactac attctggggc tggacatcgg gattacaagc
gtggggtatg ggattattga ctatgaaaca agggacgtga tcgacgcagg cgtcagactg
ttcaaggagg ccaacgtgga aaacaatgag ggacggagaa gcaagagggg agccaggcgc
ctgaaacgac ggagaaggca cagaatccag agggtgaaga aactgctgtt cgattacaac
ctgctgaccg accattctga gctgagtgga attaatcctt atgaagccag ggtgaaaggc
ctgagtcaga agctgtcaga ggaagagttt tccgcagctc tgctgcacct ggctaagcgc
cgaggagtgc ataacgtcaa tgaggtggaa gaggacaccg gcaacgagct gtctacaaag
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【0156】

配列番号３０
黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９をコードする、コドンを最適化された核酸配列
atggccccaaagaagaagcggaaggtcggtatccacggagtcccagcagccaagcggaactacatcctgggcctggacatcggcatcaccagcgtgggctacggcatcatcgactacgagacacgggacgtgatcgatgccggcgtgcggctgttcaaagaggccaacgtggaaaacaacgagggcaggcggagcaagagaggcgccagaaggctgaagcggcggaggcggcatagaatccagagagtgaagaagctgctgttcgactacaacctgctgaccgaccacagcgagctgagcggcatcaacccctacgaggccagagtgaagggcctgagccagaagctgagcgaggaagagttctctgccgccctgctgcacctggccaagagaagaggcgtgcacaacgtgaacgaggtggaagaggacaccggcaacgagctgtccaccaaagagcagatcagccggaacagcaaggccctggaagagaaatacgtggccgaactgcagctggaacggctgaagaaagacggcgaagtgcggggcagcatcaacagattcaagaccagcgactacgtgaaagaagccaaacagctgctgaaggtgcagaaggcctaccaccagctggaccagagcttcatcgacacctacatcgacctgctggaaacccggcggacctactatgagggacctggcgagggcagccccttcggctggaaggacatcaaagaatggtacgagatgctgatgggccactgcacctacttccccgaggaactgcggagcgtgaagtacgcctacaacgccgacctgtacaacgccctgaacgacctgaacaatctcgtgatcaccagggacgagaacgagaagctggaatattacgagaagttccagatcatcgagaacgtgttcaagcagaagaagaagcccaccctgaagcagatcgccaaagaaatcctcgtgaacgaagaggatattaagggctacagagtgaccagcaccggcaagcccgagttcaccaacctgaaggtgtaccacgacatcaaggacattaccgcccggaaagagattattgagaacgccgagctgctggatcagattgccaagatcctgaccatctaccagagcagcgaggacatccaggaagaactgaccaatctgaactccgagctgacccaggaagagatcgagcagatctctaatctgaagggctataccggcacccacaacctgagcctgaaggccatcaacctgatcctggacgagctgtggcacaccaacgacaaccagatcgctatcttcaaccggctgaagctggtgcccaagaaggtggacctgtcccagcagaaagagatccccaccaccctggtggacgacttcatcctgagccccgtcgtgaagagaagcttcatccagagcatcaaagtgatcaacgccatcatcaagaagtacggcctgcccaacgacatcattatcgagctggcccgcgagaagaactccaaggacgcccagaaaatgatcaacgagatgcagaagcggaaccggcagaccaacgagcggatcgaggaaatcatccggaccaccggcaaagagaacgccaagtacctgatcgagaagatcaagctgcacgacatgcaggaaggcaagtgcctgtacagcctggaagccatccctctggaagatctgctgaacaaccccttcaactatgaggtggaccacatcatccccagaagcgtgtccttcgacaacagcttcaacaacaaggtgctcgtgaagcaggaagaaaacagcaagaagggcaaccggaccccattccagtacctgagcagcagcgacagcaagatcagctacgaaaccttcaagaagcacatcctgaatctggccaagggcaagggcagaatcagcaagaccaagaaagagtatctgctggaagaacgggacatcaacaggttctccgtgcagaaagacttcatcaaccggaacctggtggataccagatacgccaccagaggcctgatgaacctgctgcggagctacttcagagtgaacaacctggacgtgaaagtgaagtccatcaatggcggcttcaccagctttctgcggcggaagtggaagtttaagaaagagcggaacaaggggtacaagcaccacgccgaggacgccctgatcattgccaacgccgatttcatcttcaaagagtggaagaaactggacaaggccaaaaaagtgatggaaaaccagatgttcgaggaaaagcaggccgagagcatgcccgagatcgaaaccgagcaggagtacaaagagatcttcatcaccccccaccagatcaagcacattaaggacttcaaggactacaagtacagccaccgggtggacaagaagcctaatagagagctgattaacgacaccctgtactccacccggaaggacgacaagggcaacaccctgatcgtgaacaatctgaacggcctgtacgacaaggacaatgacaagctgaaaaagctgatcaacaagagccccgaaaagctgctgatgtaccaccacgacccccagacctaccagaaactgaagctgattatggaacagtacggcgacgagaagaatcccctgtacaagtactacgaggaaaccgggaactacctgaccaagtactccaaaaaggacaacggccccgtgatcaagaagattaagtattacggcaacaaactgaacgcccatctggacatcaccgacgactaccccaacagcagaaacaaggtcgtgaagctgtccctgaagccctacagattcgacgtgtacctggacaatggcgtgtacaagttcgtgaccgtgaagaatctggatgtgatcaaaaaagaaaactactacgaagtgaatagcaagtgctatgaggaagctaagaagctgaagaagatcagcaaccaggccgagtttatcgcctccttctacaacaacgatctgatcaagatcaacggcgagctgtatagagtgatcggcgtgaacaacgacctgctgaaccggatcgaagtgaacatgatcgacatcacctaccgcgagtacctggaaaacatgaacgacaagaggccccccaggatcattaagacaatcgcctccaagacccagagcattaagaagtacagcacagacattctgggcaacctgtatgaagtgaaatctaagaagcaccctcagatcatcaaaaagggcaaaaggccggcggccacgaaaaaggccggccaggcaaaaaagaaaaag

【0157】

配列番号３１
黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９をコードする、コドンを最適化された核酸配列
aagcggaactacatcctgggcctggacatcggcatcaccagcgtgggctacggcatcatcgactacgagacacgggacgtgatcgatgccggcgtgcggctgttcaaagaggccaacgtggaaaacaacgagggcaggcggagcaagagaggcgccagaaggctgaagcggcggaggcggcatagaatccagagagtgaagaagctgctgttcgactacaacctgctgaccgaccacagcgagctgagcggcatcaacccctacgaggccagagtgaagggcctgagccagaagctgagcgaggaagagttctctgccgccctgctgcacctggccaagagaagaggcgtgcacaacgtgaacgaggtggaagaggacaccggcaacgagctgtccaccaaagagcagatcagccggaacagcaaggccctggaagagaaatacgtggccgaactgcagctggaacggctgaagaaagacggcgaagtgcggggcagcatcaacagattcaagaccagcgactacgtgaaagaagccaaacagctgctgaaggtgcagaaggcctaccaccagctggaccagagcttcatcgacacctacatcgacctgctggaaacccggcggacctactatgagggacctggcgagggcagccccttcggctggaaggacatcaaagaatggtacgagatgctgatgggccactgcacctacttccccgaggaactgcggagcgtgaagtacgcctacaacgccgacctgtacaacgccctgaacgacctgaacaatctcgtgatcaccagggacgagaacgagaagctggaatattacgagaagttccagatcatcgagaacgtgttcaagcagaagaagaagcccaccctgaagcagatcgccaaagaaatcctcgtgaacgaagaggatattaagggctacagagtgaccagcaccggcaagcccgagttcaccaacctgaaggtgtaccacgacatcaaggacattaccgcccggaaagagattattgagaacgccgagctgctggatcagattgccaagatcctgaccatctaccagagcagcgaggacatccaggaagaactgaccaatctgaactccgagctgacccaggaagagatcgagcagatctctaatctgaagggctataccggcacccacaacctgagcctgaaggccatcaacctgatcctggacgagctgtggcacaccaacgacaaccagatcgctatcttcaaccggctgaagctggtgcccaagaaggtggacctgtcccagcagaaagagatccccaccaccctggtggacgacttcatcctgagccccgtcgtgaagagaagcttcatccagagcatcaaagtgatcaacgccatcatcaagaagtacggcctgcccaacgacatcattatcgagctggcccgcgagaagaactccaaggacgcccagaaaatgatcaacgagatgcagaagcggaaccggcagaccaacgagcggatcgaggaaatcatccggaccaccggcaaagagaacgccaagtacctgatcgagaagatcaagctgcacgacatgcaggaaggcaagtgcctgtacagcctggaagccatccctctggaagatctgctgaacaaccccttcaactatgaggtggaccacatcatccccagaagcgtgtccttcgacaacagcttcaacaacaaggtgctcgtgaagcaggaagaaaacagcaagaagggcaaccggaccccattccagtacctgagcagcagcgacagcaagatcagctacgaaaccttcaagaagcacatcctgaatctggccaagggcaagggcagaatcagcaagaccaagaaagagtatctgctggaagaacgggacatcaacaggttctccgtgcagaaagacttcatcaaccggaacctggtggataccagatacgccaccagaggcctgatgaacctgctgcggagctacttcagagtgaacaacctggacgtgaaagtgaagtccatcaatggcggcttcaccagctttctgcggcggaagtggaagtttaagaaagagcggaacaaggggtacaagcaccacgccgaggacgccctgatcattgccaacgccgatttcatcttcaaagagtggaagaaactggacaaggccaaaaaagtgatggaaaaccagatgttcgaggaaaagcaggccgagagcatgcccgagatcgaaaccgagcaggagtacaaagagatcttcatcaccccccaccagatcaagcacattaaggacttcaaggactacaagtacagccaccgggtggacaagaagcctaatagagagctgattaacgacaccctgtactccacccggaaggacgacaagggcaacaccctgatcgtgaacaatctgaacggcctgtacgacaaggacaatgacaagctgaaaaagctgatcaacaagagccccgaaaagctgctgatgtaccaccacgacccccagacctaccagaaactgaagctgattatggaacagtacggcgacgagaagaatcccctgtacaagtactacgaggaaaccgggaactacctgaccaagtactccaaaaaggacaacggccccgtgatcaagaagattaagtattacggcaacaaactgaacgcccatctggacatcaccgacgactaccccaacagcagaaacaaggtcgtgaagctgtccctgaagccctacagattcgacgtgtacctggacaatggcgtgtacaagttcgtgaccgtgaagaatctggatgtgatcaaaaaagaaaactactacgaagtgaatagcaagtgctatgaggaagctaagaagctgaagaagatcagcaaccaggccgagtttatcgcctccttctacaacaacgatctgatcaagatcaacggcgagctgtatagagtgatcggcgtgaacaacgacctgctgaaccggatcgaagtgaacatgatcgacatcacctaccgcgagtacctggaaaacatgaacgacaagaggccccccaggatcattaagacaatcgcctccaagacccagagcattaagaagtacagcacagacattctgggcaacctgtatgaagtgaaatctaagaagcaccctcagatcatcaaaaagggc

【0158】

配列番号３２
黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９をコードする、コドンを最適化された核酸配列をコードする、ベクター（ｐＤＯ２４２）
ctaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgagcgcgcgtaatacgactcactatagggcgaattgggtacCtttaattctagtactatgcaTgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactaccggtgccaccATGAAAAGGAACTACATTCTGGGGCTGGACATCGGGATTACAAGCGTGGGGTATGGGATTATTGACTATGAAACAAGGGACGTGATCGACGCAGGCGTCAGACTGTTCAAGGAGGCCAACGTGGAAAACAATGAGGGACGGAGAAGCAAGAGGGGAGCCAGGCGCCTGAAACGACGGAGAAGGCACAGAATCCAGAGGGTGAAGAAACTGCTGTTCGATTACAACCTGCTGACCGACCATTCTGAGCTGAGTGGAATTAATCCTTATGAAGCCAGGGTGAAAGGCCTGAGTCAGAAGCTGTCAGAGGAAGAGTTTTCCGCAGCTCTGCTGCACCTGGCTAAGCGCCGAGGAGTGCATAACGTCAATGAGGTGGAAGAGGACACCGGCAACGAGCTGTCTACAAAGGAACAGATCTCACGCAATAGCAAAGCTCTGGAAGAGAAGTATGTCGCAGAGCTGCAGCTGGAACGGCTGAAGAAAGATGGCGAGGTGAGAGGGTCAATTAATAGGTTCAAGACAAGCGACTACGTCAAAGAAGCCAAGCAGCTGCTGAAAGTGCAGAAGGCTTACCACCAGCTGGATCAGAGCTTCATCGATACTTATATCGACCTGCTGGAGACTCGGAGAACCTACTATGAGGGACCAGGAGAAGGGAGCCCCTTCGGATGGAAAGACATCAAGGAATGGTACGAGATGCTGATGGGACATTGCACCTATTTTCCAGAAGAGCTGAGAAGCGTCAAGTACGCTTATAACGCAGATCTGTACAACGCCCTGAATGACCTGAACAACCTGGTCATCACCAGGGATGAAAACGAGAAACTGGAATACTATGAGAAGTTCCAGATCATCGAAAACGTGTTTAAGCAGAAGAAAAAGCCTACACTGAAACAGATTGCTAAGGAGATCCTGGTCAACGAAGAGGACATCAAGGGCTACCGGGTGACAAGCACTGGAAAACCAGAGTTCACCAATCTGAAAGTGTATCACGATATTAAGGACATCACAGCACGGAAAGAAATCATTGAGAACGCCGAACTGCTGGATCAGATTGCTAAGATCCTGACTATCTACCAGAGCTCCGAGGACATCCAGGAAGAGCTGACTAACCTGAACAGCGAGCTGACCCAGGAAGAGATCGAACAGATTAGTAATCTGAAGGGGTACACCGGAACACACAACCTGTCCCTGAAAGCTATCAATCTGATTCTGGATGAGCTGTGGCATACAAACGACAATCAGATTGCAATCTTTAACCGGCTGAAGCTGGTCCCAAAAAAGGTGGACCTGAGTCAGCAGAAAGAGATCCCAACCACACTGGTGGACGATTTCATTCTGTCACCCGTGGTCAAGCGGAGCTTCATCCAGAGCATCAAAGTGATCAACGCCATCATCAAGAAGTACGGCCTGCCCAATGATATCATTATCGAGCTGGCTAGGGAGAAGAACAGCAAGGACGCACAGAAGATGATCAATGAGATGCAGAAACGAAACCGGCAGACCAATGAACGCATTGAAGAGATTATCCGAACTACCGGGAAAGAGAACGCAAAGTACCTGATTGAAAAAATCAAGCTGCACGATATGCAGGAGGGAAAGTGTCTGTATTCTCTGGAGGCCATCCCCCTGGAGGACCTGCTGAACAATCCATTCAACTACGAGGTCGATCATATTATCCCCAGAAGCGTGTCCTTCGACAATTCCTTTAACAACAAGGTGCTGGTCAAGCAGGAAGAGAACTCTAAAAAGGGCAATAGGACTCCTTTCCAGTACCTGTCTAGTTCAGATTCCAAGATCTCTTACGAAACCTTTAAAAAGCACATTCTGAATCTGGCCAAAGGAAAGGGCCGCATCAGCAAGACCAAAAAGGAGTACCTGCTGGAAGAGCGGGACATCAACAGATTCTCCGTCCAGAAGGATTTTATTAACCGGAATCTGGTGGACACAAGATACGCTACTCGCGGCCTGATGAATCTGCTGCGATCCTATTTCCGGGTGAACAATCTGGATGTGAAAGTCAAGTCCATCAACGGCGGGTTCACATCTTTTCTGAGGCGCAAATGGAAGTTTAAAAAGGAGCGCAACAAAGGGTACAAGCACCATGCCGAAGATGCTCTGATTATCGCAAATGCCGACTTCATCTTTAAGGAGTGGAAAAAGCTGGACAAAGCCAAGAAAGTGATGGAGAACCAGATGTTCGAAGAGAAGCAGGCCGAATCTATGCCCGAAATCGAGACAGAACAGGAGTACAAGGAGATTTTCATCACTCCTCACCAGATCAAGCATATCAAGGATTTCAAGGACTACAAGTACTCTCACCGGGTGGATAAAAAGCCCAACAGAGAGCTGATCAATGACACCCTGTATAGTACAAGAAAAGACGATAAGGGGAATACCCTGATTGTGAACAATCTGAACGGACTGTACGACAAAGATAATGACAAGCTGAAAAAGCTGATCAACAAAAGTCCCGAGAAGCTGCTGATGTACCACCATGATCCTCAGACATATCAGAAACTGAAGCTGATTATGGAGCAGTACGGCGACGAGAAGAACCCACTGTATAAGTACTATGAAGAGACTGGGAACTACCTGACCAAGTATAGCAAAAAGGATAATGGCCCCGTGATCAAGAAGATCAAGTACTATGGGAACAAGCTGAATGCCCATCTGGACATCACAGACGATTACCCTAACAGTCGCAACAAGGTGGTCAAGCTGTCACTGAAGCCATACAGATTCGATGTCTATCTGGACAACGGCGTGTATAAATTTGTGACTGTCAAGAATCTGGATGTCATCAAAAAGGAGAACTACTATGAAGTGAATAGCAAGTGCTACGAAGAGGCTAAAAAGCTGAAAAAGATTAGCAACCAGGCAGAGTTCATCGCCTCCTTTTACAACAACGACCTGATTAAGATCAATGGCGAACTGTATAGGGTCATCGGGGTGAACAATGATCTGCTGAACCGCATTGAAGTGAATATGATTGACATCACTTACCGAGAGTATCTGGAAAACATGAATGATAAGCGCCCCCCTCGAATTATCAAAACAATTGCCTCTAAGACTCAGAGTATCAAAAAGTACTCAACCGACATTCTGGGAAACCTGTATGAGGTGAAGAGCAAAAAGCACCCTCAGATTATCAAAAAGGGCagcggaggcaagcgtcctgctgctactaagaaagctggtcaagctaagaaaaagaaaggatcctacccatacgatgttccagattacgcttaagaattcctagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagagaatagcaggcatgctggggaggtagcggccgcCCgcggtggagctccagcttttgttccctttagtgagggttaattgcgcgcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccac

【0159】

配列番号３３
ヒトｐ３００（Ｌ５５３Ｍ変異を有する）タンパク質
MAENVVEPGPPSAKRPKLSSPALSASASDGTDFGSLFDLEHDLPDELINSTELGLTNGGDINQLQTSLGMVQDAASKHKQLSELLRSGSSPNLNMGVGGPGQVMASQAQQSSPGLGLINSMVKSPMTQAGLTSPNMGMGTSGPNQGPTQSTGMMNSPVNQPAMGMNTGMNAGMNPGMLAAGNGQGIMPNQVMNGSIGAGRGRQNMQYPNPGMGSAGNLLTEPLQQGSPQMGGQTGLRGPQPLKMGMMNNPNPYGSPYTQNPGQQIGASGLGLQIQTKTVLSNNLSPFAMDKKAVPGGGMPNMGQQPAPQVQQPGLVTPVAQGMGSGAHTADPEKRKLIQQQLVLLLHAHKCQRREQANGEVRQCNLPHCRTMKNVLNHMTHCQSGKSCQVAHCASSRQIISHWKNCTRHDCPVCLPLKNAGDKRNQQPILTGAPVGLGNPSSLGVGQQSAPNLSTVSQIDPSSIERAYAALGLPYQVNQMPTQPQVQAKNQQNQQPGQSPQGMRPMSNMSASPMGVNGGVGVQTPSLLSDSMLHSAINSQNPMMSENASVPSMGPMPTAAQPSTTGIRKQWHEDITQDLRNHLVHKLVQAIFPTPDPAALKDRRMENLVAYARKVEGDMYESANNRAEYYHLLAEKIYKIQKELEEKRRTRLQKQNMLPNAAGMVPVSMNPGPNMGQPQPGMTSNGPLPDPSMIRGSVPNQMMPRITPQSGLNQFGQMSMAQPPIVPRQTPPLQHHGQLAQPGALNPPMGYGPRMQQPSNQGQFLPQTQFPSQGMNVTNIPLAPSSGQAPVSQAQMSSSSCPVNSPIMPPGSQGSHIHCPQLPQPALHQNSPSPVPSRTPTPHHTPPSIGAQQPPATTIPAPVPTPPAMPPGPQSQALHPPPRQTPTPPTTQLPQQVQPSLPAAPSADQPQQQPRSQQSTAASVPTPTAPLLPPQPATPLSQPAVSIEGQVSNPPSTSSTEVNSQAIAEKQPSQEVKMEAKMEVDQPEPADTQPEDISESKVEDCKMESTETEERSTELKTEIKEEEDQPSTSATQSSPAPGQSKKKIFKPEELRQALMPTLEALYRQDPESLPFRQPVDPQLLGIPDYFDIVKSPMDLSTIKRKLDTGQYQEPWQYVDDIWLMFNNAWLYNRKTSRVYKYCSKLSEVFEQEIDPVMQSLGYCCGRKLEFSPQTLCCYGKQLCTIPRDATYYSYQNRYHFCEKCFNEIQGESVSLGDDPSQPQTTINKEQFSKRKNDTLDPELFVECTECGRKMHQICVLHHEIIWPAGFVCDGCLKKSARTRKENKFSAKRLPSTRLGTFLENRVNDFLRRQNHPESGEVTVRVVHASDKTVEVKPGMKARFVDSGEMAESFPYRTKALFAFEEIDGVDLCFFGMHVQEYGSDCPPPNQRRVYISYLDSVHFFRPKCLRTAVYHEILIGYLEYVKKLGYTTGHIWACPPSEGDDYIFHCHPPDQKIPKPKRLQEWYKKMLDKAVSERIVHDYKDIFKQATEDRLTSAKELPYFEGDFWPNVLEESIKELEQEEEERKREENTSNESTDVTKGDSKNAKKKNNKKTSKNKSSLSRGNKKKPGMPNVSNDLSQKLYATMEKHKEVFFVIRLIAGPAANSLPPIVDPDPLIPCDLMDGRDAFLTLARDKHLEFSSLRRAQWSTMCMLVELHTQSQDRFVYTCNECKHHVETRWHCTVCEDYDLCITCYNTKNHDHKMEKLGLGLDDESNNQQAAATQSPGDSRRLSIQRCIQSLVHACQCRNANCSLPSCQKMKRVVQHTKGCKRKTNGGCPICKQLIALCCYHAKHCQENKCPVPFCLNIKQKLRQQQLQHRLQQAQMLRRRMASMQRTGVVGQQQGLPSPTPATPTTPTGQQPTTPQTPQPTSQPQPTPPNSMPPYLPRTQAAGPVSQGKAAGQVTPPTPPQTAQPPLPGPPPAAVEMAMQIQRAAETQRQMAHVQIFQRPIQHQMPPMTPMAPMGMNPPPMTRGPSGHLEPGMGPTGMQQQPPWSQGGLPQPQQLQSGMPRPAMMSVAQHGQPLNMAPQPGLGQVGISPLKPGTVSQQALQNLLRTLRSPSSPLQQQQVLSILHANPQLLAAFIKQRAAKYANSNPQPIPGQPGMPQGQPGLQPPTMPGQQGVHSNPAMQNMNPMQAGVQRAGLPQQQPQQQLQPPMGGMSPQAQQMNMNHNTMPSQFRDILRRQQMMQQQQQQGAGPGIGPGMANHNQFQQPQGVGYPPQQQQRMQHHMQQMQQGNMGQIGQLPQALGAEAGASLQAYQQRLLQQQMGSPVQPNPMSPQQHMLPNQAQSPHLQGQQIPNSLSNQVRSPQPVPSPRPQSQPPHSSPSPRMQPQPSPHHVSPQTSSPHPGLVAAQANPMEQGHFASPDQNSMLSQLASNPGMANLHGASATDLGLSTDNSDLNSNLSQSTLDIH

【0160】

配列番号３４
ヒトｐ３００コアエフェクタータンパク質（配列番号３３のアミノ酸１０４８～１６６４）
IFKPEELRQALMPTLEALYRQDPESLPFRQPVDPQLLGIPDYFDIVKSPMDLSTIKRKLDTGQYQEPWQYVDDIWLMFNNAWLYNRKTSRVYKYCSKLSEVFEQEIDPVMQSLGYCCGRKLEFSPQTLCCYGKQLCTIPRDATYYSYQNRYHFCEKCFNEIQGESVSLGDDPSQPQTTINKEQFSKRKNDTLDPELFVECTECGRKMHQICVLHHEIIWPAGFVCDGCLKKSARTRKENKFSAKRLPSTRLGTFLENRVNDFLRRQNHPESGEVTVRVVHASDKTVEVKPGMKARFVDSGEMAESFPYRTKALFAFEEIDGVDLCFFGMHVQEYGSDCPPPNQRRVYISYLDSVHFFRPKCLRTAVYHEILIGYLEYVKKLGYTTGHIWACPPSEGDDYIFHCHPPDQKIPKPKRLQEWYKKMLDKAVSERIVHDYKDIFKQATEDRLTSAKELPYFEGDFWPNVLEESIKELEQEEEERKREENTSNESTDVTKGDSKNAKKKNNKKTSKNKSSLSRGNKKKPGMPNVSNDLSQKLYATMEKHKEVFFVIRLIAGPAANSLPPIVDPDPLIPCDLMDGRDAFLTLARDKHLEFSSLRRAQWSTMCMLVELHTQSQD

【0161】

配列番号３５
ＶＰ６４－ｄＣａｓ９－ＶＰ６４タンパク質
RADALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMVNPKKKRKVGRGMDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSRADPKKKRKVASRADALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLI

【0162】

配列番号３６
ＶＰ６４－ｄＣａｓ９－ＶＰ６４ ＤＮＡ
cgggctgacgcattggacgattttgatctggatatgctgggaagtgacgccctcgatgattttgaccttgacatgcttggttcggatgcccttgatgactttgacctcgacatgctcggcagtgacgcccttgatgatttcgacctggacatggttaaccccaagaagaagaggaaggtgggccgcggaatggacaagaagtactccattgggctcgccatcggcacaaacagcgtcggctgggccgtcattacggacgagtacaaggtgccgagcaaaaaattcaaagttctgggcaataccgatcgccacagcataaagaagaacctcattggcgccctcctgttcgactccggggaaaccgccgaagccacgcggctcaaaagaacagcacggcgcagatatacccgcagaaagaatcggatctgctacctgcaggagatctttagtaatgagatggctaaggtggatgactctttcttccataggctggaggagtcctttttggtggaggaggataaaaagcacgagcgccacccaatctttggcaatatcgtggacgaggtggcgtaccatgaaaagtacccaaccatatatcatctgaggaagaagcttgtagacagtactgataaggctgacttgcggttgatctatctcgcgctggcgcatatgatcaaatttcggggacacttcctcatcgagggggacctgaacccagacaacagcgatgtcgacaaactctttatccaactggttcagacttacaatcagcttttcgaagagaacccgatcaacgcatccggagttgacgccaaagcaatcctgagcgctaggctgtccaaatcccggcggctcgaaaacctcatcgcacagctccctggggagaagaagaacggcctgtttggtaatcttatcgccctgtcactcgggctgacccccaactttaaatctaacttcgacctggccgaagatgccaagcttcaactgagcaaagacacctacgatgatgatctcgacaatctgctggcccagatcggcgaccagtacgcagacctttttttggcggcaaagaacctgtcagacgccattctgctgagtgatattctgcgagtgaacacggagatcaccaaagctccgctgagcgctagtatgatcaagcgctatgatgagcaccaccaagacttgactttgctgaaggcccttgtcagacagcaactgcctgagaagtacaaggaaattttcttcgatcagtctaaaaatggctacgccggatacattgacggcggagcaagccaggaggaattttacaaatttattaagcccatcttggaaaaaatggacggcaccgaggagctgctggtaaagcttaacagagaagatctgttgcgcaaacagcgcactttcgacaatggaagcatcccccaccagattcacctgggcgaactgcacgctatcctcaggcggcaagaggatttctacccctttttgaaagataacagggaaaagattgagaaaatcctcacatttcggataccctactatgtaggccccctcgcccggggaaattccagattcgcgtggatgactcgcaaatcagaagagaccatcactccctggaacttcgaggaagtcgtggataagggggcctctgcccagtccttcatcgaaaggatgactaactttgataaaaatctgcctaacgaaaaggtgcttcctaaacactctctgctgtacgagtacttcacagtttataacgagctcaccaaggtcaaatacgtcacagaagggatgagaaagccagcattcctgtctggagagcagaagaaagctatcgtggacctcctcttcaagacgaaccggaaagttaccgtgaaacagctcaaagaagactatttcaaaaagattgaatgtttcgactctgttgaaatcagcggagtggaggatcgcttcaacgcatccctgggaacgtatcacgatctcctgaaaatcattaaagacaaggacttcctggacaatgaggagaacgaggacattcttgaggacattgtcctcacccttacgttgtttgaagatagggagatgattgaagaacgcttgaaaacttacgctcatctcttcgacgacaaagtcatgaaacagctcaagaggcgccgatatacaggatgggggcggctgtcaagaaaactgatcaatgggatccgagacaagcagagtggaaagacaatcctggattttcttaagtccgatggatttgccaaccggaacttcatgcagttgatccatgatgactctctcacctttaaggaggacatccagaaagcacaagtttctggccagggggacagtcttcacgagcacatcgctaatcttgcaggtagcccagctatcaaaaagggaatactgcagaccgttaaggtcgtggatgaactcgtcaaagtaatgggaaggcataagcccgagaatatcgttatcgagatggcccgagagaaccaaactacccagaagggacagaagaacagtagggaaaggatgaagaggattgaagagggtataaaagaactggggtcccaaatccttaaggaacacccagttgaaaacacccagcttcagaatgagaagctctacctgtactacctgcagaacggcagggacatgtacgtggatcaggaactggacatcaatcggctctccgactacgacgtggatgccatcgtgccccagtcttttctcaaagatgattctattgataataaagtgttgacaagatccgataaaaatagagggaagagtgataacgtcccctcagaagaagttgtcaagaaaatgaaaaattattggcggcagctgctgaacgccaaactgatcacacaacggaagttcgataatctgactaaggctgaacgaggtggcctgtctgagttggataaagccggcttcatcaaaaggcagcttgttgagacacgccagatcaccaagcacgtggcccaaattctcgattcacgcatgaacaccaagtacgatgaaaatgacaaactgattcgagaggtgaaagttattactctgaagtctaagctggtctcagatttcagaaaggactttcagttttataaggtgagagagatcaacaattaccaccatgcgcatgatgcctacctgaatgcagtggtaggcactgcacttatcaaaaaatatcccaagcttgaatctgaatttgtttacggagactataaagtgtacgatgttaggaaaatgatcgcaaagtctgagcaggaaataggcaaggccaccgctaagtacttcttttacagcaatattatgaattttttcaagaccgagattacactggccaatggagagattcggaagcgaccacttatcgaaacaaacggagaaacaggagaaatcgtgtgggacaagggtagggatttcgcgacagtccggaaggtcctgtccatgccgcaggtgaacatcgttaaaaagaccgaagtacagaccggaggcttctccaaggaaagtatcctcccgaaaaggaacagcgacaagctgatcgcacgcaaaaaagattgggaccccaagaaatacggcggattcgattctcctacagtcgcttacagtgtactggttgtggccaaagtggagaaagggaagtctaaaaaactcaaaagcgtcaaggaactgctgggcatcacaatcatggagcgatcaagcttcgaaaaaaaccccatcgactttctcgaggcgaaaggatataaagaggtcaaaaaagacctcatcattaagcttcccaagtactctctctttgagcttgaaaacggccggaaacgaatgctcgctagtgcgggcgagctgcagaaaggtaacgagctggcactgccctctaaatacgttaatttcttgtatctggccagccactatgaaaagctcaaagggtctcccgaagataatgagcagaagcagctgttcgtggaacaacacaaacactaccttgatgagatcatcgagcaaataagcgaattctccaaaagagtgatcctcgccgacgctaacctcgataaggtgctttctgcttacaataagcacagggataagcccatcagggagcaggcagaaaacattatccacttgtttactctgaccaacttgggcgcgcctgcagccttcaagtacttcgacaccaccatagacagaaagcggtacacctctacaaaggaggtcctggacgccacactgattcatcagtcaattacggggctctatgaaacaagaatcgacctctctcagctcggtggagacagcagggctgaccccaagaagaagaggaaggtggctagccgcgccgacgcgctggacgatttcgatctcgacatgctgggttctgatgccctcgatgactttgacctggatatgttgggaagcgacgcattggatgactttgatctggacatgctcggctccgatgctctggacgatttcgatctcgatatgttaatc

【0163】

【表3】

【0164】

配列番号４９
マウスｍｄｘエクソン２３の欠失のための、イントロン２２用ｇＲＮＡ標的配列
5’TACACTAACACGCATATTTG
配列番号５０
マウスｍｄｘエクソン２３の欠失のための、イントロン２３用ｇＲＮＡ標的配列
5’CATTGCATCCATGTCTGACT

【0165】

配列番号５１
ＣＫ８プロモーターポリヌクレオチド
ctagactagcatgctgcccatgtaaggaggcaaggcctggggacacccgagatgcctggttataattaacccagacatgtggctgcccccccccccccaacacctgctgcctctaaaaataaccctgcatgccatgttcccggcgaagggccagctgtcccccgccagctagactcagcacttagtttaggaaccagtgagcaagtcagcccttggggcagcccatacaaggccatggggctgggcaagctgcacgcctgggtccggggtgggcacggtgcccgggcaacgagctgaaagctcatctgctctcaggggcccctccctggggacagcccctcctggctagtcacaccctgtaggctcctctatataacccaggggcacaggggctgccctcattctaccaccacctccacagcacagacagacactcaggagccagccagc

【0166】

配列番号５２
Ｓｐｃ５－１２プロモーターポリヌクレオチド
cggccgtccgccttcggcaccatcctcacgacacccaaatatggcgacgggtgaggaatggtggggagttatttttagagcggtgaggaaggtgggcaggcagcaggtgttggcgctctaaaaataactcccgggagttatttttagagcggaggaatggtggacacccaaatatggcgacggttcctcacccgtcgccatatttgggtgtccgccctcggccggggccgcattcctgggggccgggcggtgctcccgcccgcctcgataaaaggctccggggccggcggcggcccacgagctacccggaggagcgggaggcgccaagctctaga

【0167】

配列番号５３
ＭＨＣＫ７プロモーターポリヌクレオチド
agcttgcatgtctaagctagacccttcagattaaaaataactgaggtaagggcctgggtaggggaggtggtgtgagacgctcctgtctctcctctatctgcccatcggccctttggggaggaggaatgtgcccaaggactaaaaaaaggccatggagccagaggggcgagggcaacagacctttcatgggcaaaccttggggccctgctgtctagcatgccccactacgggtctaggctgcccatgtaaggaggcaaggcctggggacacccgagatgcctggttataattaacccagacatgtggctgcccccccccccccaacacctgctgcctctaaaaataaccctgtccctggtggatcccctgcatgcgaagatcttcgaacaaggctgtgggggactgagggcaggctgtaacaggcttgggggccagggcttatacgtgcctgggactcccaaagtattactgttccatgttcccggcgaagggccagctgtcccccgccagctagactcagcacttagtttaggaaccagtgagcaagtcagcccttggggcagcccatacaaggccatggggctgggcaagctgcacgcctgggtccggggtgggcacggtgcccgggcaacgagctgaaagctcatctgctctcaggggcccctccctggggacagcccctcctggctagtcacaccctgtaggctcctctatataacccaggggcacaggggctgccctcattctaccaccacctccacagcacagacagacactcaggagccagccagc

【0168】

配列番号５４
ｐＡＡＶ２２、Ｒｅｐ２及びＣａｐ１
acctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcgcgccgatatcgttaacgccccgcgccggccgctctagaactagtggatcccccggaagatcagaagttcctattccgaagttcctattctctagaaagtataggaacttctgatctattcgagctcggtacccctagagtcctgtattagaggtcacgtgagtgttttgcgacattttgcgacaccatgtggtcacgctgggtatttaagcccgagtgagcacgcagggtctccattttgaagcgggaggtttgaacgcgcagccgccatgccggggttttacgagattgtgattaaggtccccagcgaccttgacgagcatctgcccggcatttctgacagctttgtgaactgggtggccgagaaggaatgggagttgccgccagattctgacatggatctgaatctgattgagcaggcacccctgaccgtggccgagaagctgcagcgcgactttctgacggaatggcgccgtgtgagtaaggccccggaggcccttttctttgtgcaatttgagaagggagagagctacttccacatgcacgtgctcgtggaaaccaccggggtgaaatccatggttttgggacgtttcctgagtcagattcgcgaaaaactgattcagagaatttaccgcgggatcgagccgactttgccaaactggttcgcggtcacaaagaccagaaatggcgccggaggcgggaacaaggtggtggatgagtgctacatccccaattacttgctccccaaaacccagcctgagctccagtgggcgtggactaatatggaacagtatttaagcgcctgtttgaatctcacggagcgtaaacggttggtggcgcagcatctgacgcacgtgtcgcagacgcaggagcagaacaaagagaatcagaatcccaattctgatgcgccggtgatcagatcaaaaacttcagccaggtacatggagctggtcgggtggctcgtggacaaggggattacctcggagaagcagtggatccaggaggaccaggcctcatacatctccttcaatgcggcctccaactcgcggtcccaaatcaaggctgccttggacaatgcgggaaagattatgagcctgactaaaaccgcccccgactacctggtgggccagcagcccgtggaggacatttccagcaatcggatttataaaattttggaactaaacgggtacgatccccaatatgcggcttccgtctttctgggatgggccacgaaaaagttcggcaagaggaacaccatctggctgtttgggcctgcaactaccgggaagaccaacatcgcggaggccatagcccacactgtgcccttctacgggtgcgtaaactggaccaatgagaactttcccttcaacgactgtgtcgacaagatggtgatctggtgggaggaggggaagatgaccgccaaggtcgtggagtcggccaaagccattctcggaggaagcaaggtgcgcgtggaccagaaatgcaagtcctcggcccagatagacccgactcccgtgatcgtcacctccaacaccaacatgtgcgccgtgattgacgggaactcaacgaccttcgaacaccagcagccgttgcaagaccggatgttcaaatttgaactcacccgccgtctggatcatgactttgggaaggtcaccaagcaggaagtcaaagactttttccggtgggcaaaggatcacgtggttgaggtggagcatgaattctacgtcaaaaagggtggagccaagaaaagacccgcccccagtgacgcagatataagtgagcccaaacgggtgcgcgagtcagttgcgcagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacaggtaccaaaacaaatgttctcgtcacgtgggcatgaatctgatgctgtttccctgcagacaatgcgagagaatgaatcagaattcaaatatctgcttcactcacggacagaaagactgtttagagtgctttcccgtgtcagaatctcaacccgtttctgtcgtcaaaaaggcgtatcagaaactgtgctacattcatcatatcatgggaaaggtgccagacgcttgcactgcctgcgatctggtcaatgtggatttggatgactgcatctttgaacaataaatgatttaaatcaggtatggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacactctctctgaaggaataagacagtggtggaagctcaaacctggcccaccaccaccaaagcccgcagagcggcataaggacgacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctcggacccttcaacggactcgacaagggagagccggtcaacgaggcagacgccgcggccctcgagcacgacaaagcctacgaccggcagctcgacagcggagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgcggagtttcaggagcgccttaaagaagatacgtcttttgggggcaacctcggacgagcagtcttccaggcgaaaaagagggttcttgaacctctgggcctggttgaggaacctgttaagacggctccgggaaaaaagaggccggtagagcactctcctgtggagccagactcctcctcgggaaccggaaaggcgggccagcagcctgcaagaaaaagattgaattttggtcagactggagacgcagactcagtacctgacccccagcctctcggacagccaccagcagccccctctggtctgggaactaatacgatggctacaggcagtggcgcaccaatggcagacaataacgagggcgccgacggagtgggtaattcctcgggaaattggcattgcgattccacatggatgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgaacctgggccctgcccacctacaacaaccacctctacaaacaaatttccagccaatcaggagcctcgaacgacaatcactactttggctacagcaccccttgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcaaagactcatcaacaacaactggggattccgacccaagagactcaacttcaagctctttaacattcaagtcaaagaggtcacgcagaatgacggtacgacgacgattgccaataaccttaccagcacggttcaggtgtttactgactcggagtaccagctcccgtacgtcctcggctcggcgcatcaaggatgcctcccgccgttcccagcagacgtcttcatggtgccacagtatggatacctcaccctgaacaacgggagtcaggcagtaggacgctcttcattttactgcctggagtactttccttctcagatgctgcgtaccggaaacaactttaccttcagctacacttttgaggacgttcctttccacagcagctacgctcacagccagagtctggaccgtctcatgaatcctctcatcgaccagtacctgtattacttgagcagaacaaacactccaagtggaaccaccacgcagtcaaggcttcagttttctcaggccggagcgagtgacattcgggaccagtctaggaactggcttcctggaccctgttaccgccagcagcgagtatcaaagacatctgcggataacaacaacagtgaatactcgtggactggagctaccaagtaccacctcaatggcagagactctctggtgaatccgggcccggccatggcaagccacaaggacgatgaagaaaagttttttcctcagagcggggttctcatctttgggaagcaaggctcagagaaaacaaatgtggacattgaaaaggtcatgattacagacgaagaggaaatcaggacaaccaatcccgtggctacggagcagtatggttctgtatctaccaacctccagagaggcaacagacaagcagctaccgcagatgtcaacacacaaggcgttcttccaggcatggtctggcaggacagagatgtgtaccttcaggggcccatctgggcaaagattccacacacggacggacattttcacccctctcccctcatgggtggattcggacttaaacaccctcctccacagattctcatcaagaacaccccggtacctgcgaatccttcgaccaccttcagtgcggcaaagtttgcttccttcatcacacagtactccacgggacaggtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaaacgctggaatcccgaaattcagtacacttccaactacaacaagtctgttaatgtggactttactgtggacactaatggcgtgtattcagagcctcgccccattggcaccagatacctgactcgta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【0169】

配列番号５５
ｐＡＡＶ２５、Ｒｅｐ２及びＣａｐ２
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【0170】

配列番号５６
ｐＡＡＶ２８、Ｒｅｐ２及びＣａｐ５
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【0171】

配列番号５７
ｐＡＡＶ２１、Ｒｅｐ２及びＣａｐ６
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【0172】

配列番号５８
ｐＡＡＶ２６、Ｒｅｐ２及びＣａｐ８
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【0173】

配列番号５９
ｐＡＡＶ２９、Ｒｅｐ２及びＣａｐ９
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【0174】

配列番号６０
uacacuaacacgcauauuug
配列番号６１
cauugcauccaugucugacu
配列番号６２
化膿性連鎖球菌ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢをコードするポリヌクレオチド配列
atggactacaaagaccatgacggtgattataaagatcatgacatcgattacaaggatgacgatgacaagatggcccccaagaagaagaggaaggtgggccgcggaatggacaagaagtactccattgggctcgccatcggcacaaacagcgtcggctgggccgtcattacggacgagtacaaggtgccgagcaaaaaattcaaagttctgggcaataccgatcgccacagcataaagaagaacctcattggcgccctcctgttcgactccggggaaaccgccgaagccacgcggctcaaaagaacagcacggcgcagatatacccgcagaaagaatcggatctgctacctgcaggagatctttagtaatgagatggctaaggtggatgactctttcttccataggctggaggagtcctttttggtggaggaggataaaaagcacgagcgccacccaatctttggcaatatcgtggacgaggtggcgtaccatgaaaagtacccaaccatatatcatctgaggaagaagcttgtagacagtactgataaggctgacttgcggttgatctatctcgcgctggcgcatatgatcaaatttcggggacacttcctcatcgagggggacctgaacccagacaacagcgatgtcgacaaactctttatccaactggttcagacttacaatcagcttttcgaagagaacccgatcaacgcatccggagttgacgccaaagcaatcctgagcgctaggctgtccaaatcccggcggctcgaaaacctcatcgcacagctccctggggagaagaagaacggcctgtttggtaatcttatcgccctgtcactcgggctgacccccaactttaaatctaacttcgacctggccgaagatgccaagcttcaactgagcaaagacacctacgatgatgatctcgacaatctgctggcccagatcggcgaccagtacgcagacctttttttggcggcaaagaacctgtcagacgccattctgctgagtgatattctgcgagtgaacacggagatcaccaaagctccgctgagcgctagtatgatcaagcgctatgatgagcaccaccaagacttgactttgctgaaggcccttgtcagacagcaactgcctgagaagtacaaggaaattttcttcgatcagtctaaaaatggctacgccggatacattgacggcggagcaagccaggaggaattttacaaatttattaagcccatcttggaaaaaatggacggcaccgaggagctgctggtaaagcttaacagagaagatctgttgcgcaaacagcgcactttcgacaatggaagcatcccccaccagattcacctgggcgaactgcacgctatcctcaggcggcaagaggatttctacccctttttgaaagataacagggaaaagattgagaaaatcctcacatttcggataccctactatgtaggccccctcgcccggggaaattccagattcgcgtggatgactcgcaaatcagaagagaccatcactccctggaacttcgaggaagtcgtggataagggggcctctgcccagtccttcatcgaaaggatgactaactttgataaaaatctgcctaacgaaaaggtgcttcctaaacactctctgctgtacgagtacttcacagtttataacgagctcaccaaggtcaaatacgtcacagaagggatgagaaagccagcattcctgtctggagagcagaagaaagctatcgtggacctcctcttcaagacgaaccggaaagttaccgtgaaacagctcaaagaagactatttcaaaaagattgaatgtttcgactctgttgaaatcagcggagtggaggatcgcttcaacgcatccctgggaacgtatcacgatctcctgaaaatcattaaagacaaggacttcctggacaatgaggagaacgaggacattcttgaggacattgtcctcacccttacgttgtttgaagatagggagatgattgaagaacgcttgaaaacttacgctcatctcttcgacgacaaagtcatgaaacagctcaagaggcgccgatatacaggatgggggcggctgtcaagaaaactgatcaatgggatccgagacaagcagagtggaaagacaatcctggattttcttaagtccgatggatttgccaaccggaacttcatgcagttgatccatgatgactctctcacctttaaggaggacatccagaaagcacaagtttctggccagggggacagtcttcacgagcacatcgctaatcttgcaggtagcccagctatcaaaaagggaatactgcagaccgttaaggtcgtggatgaactcgtcaaagtaatgggaaggcataagcccgagaatatcgttatcgagatggcccgagagaaccaaactacccagaagggacagaagaacagtagggaaaggatgaagaggattgaagagggtataaaagaactggggtcccaaatccttaaggaacacccagttgaaaacacccagcttcagaatgagaagctctacctgtactacctgcagaacggcagggacatgtacgtggatcaggaactggacatcaatcggctctccgactacgacgtggatgccatcgtgccccagtcttttctcaaagatgattctattgataataaagtgttgacaagatccgataaaaatagagggaagagtgataacgtcccctcagaagaagttgtcaagaaaatgaaaaattattggcggcagctgctgaacgccaaactgatcacacaacggaagttcgataatctgactaaggctgaacgaggtggcctgtctgagttggataaagccggcttcatcaaaaggcagcttgttgagacacgccagatcaccaagcacgtggcccaaattctcgattcacgcatgaacaccaagtacgatgaaaatgacaaactgattcgagaggtgaaagttattactctgaagtctaagctggtctcagatttcagaaaggactttcagttttataaggtgagagagatcaacaattaccaccatgcgcatgatgcctacctgaatgcagtggtaggcactgcacttatcaaaaaatatcccaagcttgaatctgaatttgtttacggagactataaagtgtacgatgttaggaaaatgatcgcaaagtctgagcaggaaataggcaaggccaccgctaagtacttcttttacagcaatattatgaattttttcaagaccgagattacactggccaatggagagattcggaagcgaccacttatcgaaacaaacggagaaacaggagaaatcgtgtgggacaagggtagggatttcgcgacagtccggaaggtcctgtccatgccgcaggtgaacatcgttaaaaagaccgaagtacagaccggaggcttctccaaggaaagtatcctcccgaaaaggaacagcgacaagctgatcgcacgcaaaaaagattgggaccccaagaaatacggcggattcgattctcctacagtcgcttacagtgtactggttgtggccaaagtggagaaagggaagtctaaaaaactcaaaagcgtcaaggaactgctgggcatcacaatcatggagcgatcaagcttcgaaaaaaaccccatcgactttctcgaggcgaaaggatataaagaggtcaaaaaagacctcatcattaagcttcccaagtactctctctttgagcttgaaaacggccggaaacgaatgctcgctagtgcgggcgagctgcagaaaggtaacgagctggcactgccctctaaatacgttaatttcttgtatctggccagccactatgaaaagctcaaagggtctcccgaagataatgagcagaagcagctgttcgtggaacaacacaaacactaccttgatgagatcatcgagcaaataagcgaattctccaaaagagtgatcctcgccgacgctaacctcgataaggtgctttctgcttacaataagcacagggataagcccatcagggagcaggcagaaaacattatccacttgtttactctgaccaacttgggcgcgcctgcagccttcaagtacttcgacaccaccatagacagaaagcggtacacctctacaaaggaggtcctggacgccacactgattcatcagtcaattacggggctctatgaaacaagaatcgacctctctcagctcggtggagacagcagggctgaccccaagaagaagaggaaggtggctagcgatgctaagtcactgactgcctggtcccggacactggtgaccttcaaggatgtgtttgtggacttcaccagggaggagtggaagctgctggacactgctcagcagatcctgtacagaaatgtgatgctggagaactataagaacctggtttccttgggttatcagcttactaagccagatgtgatcctccggttggagaagggagaagagccctggctggtggagagagaaattcaccaagagacccatcctgattcagagactgcatttgaaatcaaatcatcagttccgaaaaagaaacgcaaagtttga

【0175】

配列番号６３
化膿性連鎖球菌ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢタンパク質のポリペプチド配列
MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKMAPKKKRKVGRGMDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSRADPKKKRKVASDAKSLTAWSRTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQILYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEPWLVEREIHQETHPDSETAFEIKSSVPKKKRKV

【0176】

配列番号６４
黄色ブドウ球菌ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢタンパク質のポリヌクレオチド配列
atggccccaaagaagaagcggaaggtcggtatccacggagtcccagcagccaagcggaactacatcctgggcctggccatcggcatcaccagcgtgggctacggcatcatcgactacgagacacgggacgtgatcgatgccggcgtgcggctgttcaaagaggccaacgtggaaaacaacgagggcaggcggagcaagagaggcgccagaaggctgaagcggcggaggcggcatagaatccagagagtgaagaagctgctgttcgactacaacctgctgaccgaccacagcgagctgagcggcatcaacccctacgaggccagagtgaagggcctgagccagaagctgagcgaggaagagttctctgccgccctgctgcacctggccaagagaagaggcgtgcacaacgtgaacgaggtggaagaggacaccggcaacgagctgtccaccaaagagcagatcagccggaacagcaaggccctggaagagaaatacgtggccgaactgcagctggaacggctgaagaaagacggcgaagtgcggggcagcatcaacagattcaagaccagcgactacgtgaaagaagccaaacagctgctgaaggtgcagaaggcctaccaccagctggaccagagcttcatcgacacctacatcgacctgctggaaacccggcggacctactatgagggacctggcgagggcagccccttcggctggaaggacatcaaagaatggtacgagatgctgatgggccactgcacctacttccccgaggaactgcggagcgtgaagtacgcctacaacgccgacctgtacaacgccctgaacgacctgaacaatctcgtgatcaccagggacgagaacgagaagctggaatattacgagaagttccagatcatcgagaacgtgttcaagcagaagaagaagcccaccctgaagcagatcgccaaagaaatcctcgtgaacgaagaggatattaagggctacagagtgaccagcaccggcaagcccgagttcaccaacctgaaggtgtaccacgacatcaaggacattaccgcccggaaagagattattgagaacgccgagctgctggatcagattgccaagatcctgaccatctaccagagcagcgaggacatccaggaagaactgaccaatctgaactccgagctgacccaggaagagatcgagcagatctctaatctgaagggctataccggcacccacaacctgagcctgaaggccatcaacctgatcctggacgagctgtggcacaccaacgacaaccagatcgctatcttcaaccggctgaagctggtgcccaagaaggtggacctgtcccagcagaaagagatccccaccaccctggtggacgacttcatcctgagccccgtcgtgaagagaagcttcatccagagcatcaaagtgatcaacgccatcatcaagaagtacggcctgcccaacgacatcattatcgagctggcccgcgagaagaactccaaggacgcccagaaaatgatcaacgagatgcagaagcggaaccggcagaccaacgagcggatcgaggaaatcatccggaccaccggcaaagagaacgccaagtacctgatcgagaagatcaagctgcacgacatgcaggaaggcaagtgcctgtacagcctggaagccatccctctggaagatctgctgaacaaccccttcaactatgaggtggaccacatcatccccagaagcgtgtccttcgacaacagcttcaacaacaaggtgctcgtgaagcaggaagaagccagcaagaagggcaaccggaccccattccagtacctgagcagcagcgacagcaagatcagctacgaaaccttcaagaagcacatcctgaatctggccaagggcaagggcagaatcagcaagaccaagaaagagtatctgctggaagaacgggacatcaacaggttctccgtgcagaaagacttcatcaaccggaacctggtggataccagatacgccaccagaggcctgatgaacctgctgcggagctacttcagagtgaacaacctggacgtgaaagtgaagtccatcaatggcggcttcaccagctttctgcggcggaagtggaagtttaagaaagagcggaacaaggggtacaagcaccacgccgaggacgccctgatcattgccaacgccgatttcatcttcaaagagtggaagaaactggacaaggccaaaaaagtgatggaaaaccagatgttcgaggaaaagcaggccgagagcatgcccgagatcgaaaccgagcaggagtacaaagagatcttcatcaccccccaccagatcaagcacattaaggacttcaaggactacaagtacagccaccgggtggacaagaagcctaatagagagctgattaacgacaccctgtactccacccggaaggacgacaagggcaacaccctgatcgtgaacaatctgaacggcctgtacgacaaggacaatgacaagctgaaaaagctgatcaacaagagccccgaaaagctgctgatgtaccaccacgacccccagacctaccagaaactgaagctgattatggaacagtacggcgacgagaagaatcccctgtacaagtactacgaggaaaccgggaactacctgaccaagtactccaaaaaggacaacggccccgtgatcaagaagattaagtattacggcaacaaactgaacgcccatctggacatcaccgacgactaccccaacagcagaaacaaggtcgtgaagctgtccctgaagccctacagattcgacgtgtacctggacaatggcgtgtacaagttcgtgaccgtgaagaatctggatgtgatcaaaaaagaaaactactacgaagtgaatagcaagtgctatgaggaagctaagaagctgaagaagatcagcaaccaggccgagtttatcgcctccttctacaacaacgatctgatcaagatcaacggcgagctgtatagagtgatcggcgtgaacaacgacctgctgaaccggatcgaagtgaacatgatcgacatcacctaccgcgagtacctggaaaacatgaacgacaagaggccccccaggatcattaagacaatcgcctccaagacccagagcattaagaagtacagcacagacattctgggcaacctgtatgaagtgaaatctaagaagcaccctcagatcatcaaaaagggcaaaaggccggcggccacgaaaaaggccggccaggcaaaaaagaaaaagggatccgatgctaagtcactgactgcctggtcccggacactggtgaccttcaaggatgtgtttgtggacttcaccagggaggagtggaagctgctggacactgctcagcagatcctgtacagaaatgtgatgctggagaactataagaacctggtttccttgggttatcagcttactaagccagatgtgatcctccggttggagaagggagaagagccctggctggtggagagagaaattcaccaagagacccatcctgattcagagactgcatttgaaatcaaatcatcagttccgaaaaagaaacgcaaagtt

【0177】

配列番号６５
黄色ブドウ球菌ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢタンパク質のポリペプチド配列
MAPKKKRKVGIHGVPAAKRNYILGLAIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEEASKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKGKRPAATKKAGQAKKKKGSDAKSLTAWSRTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQILYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEPWLVEREIHQETHPDSETAFEIKSSVPKKKRKV

【0178】

配列番号６６
Ｔｅｔ１ＣＤのポリヌクレオチド配列
ctgcccacctgcagctgtcttgatcgagttatacaaaaagacaaaggcccatattatacacaccttggggcaggaccaagtgttgctgctgtcagggaaatcatggagaataggtatggtcaaaaaggaaacgcaataaggatagaaatagtagtgtacaccggtaaagaagggaaaagctctcatgggtgtccaattgctaagtgggttttaagaagaagcagtgatgaagaaaaagttctttgtttggtccggcagcgtacaggccaccactgtccaactgctgtgatggtggtgctcatcatggtgtgggatggcatccctcttccaatggccgaccggctatacacagagctcacagagaatctaaagtcatacaatgggcaccctaccgacagaagatgcaccctcaatgaaaatcgtacctgtacatgtcaaggaattgatccagagacttgtggagcttcattctcttttggctgttcatggagtatgtactttaatggctgtaagtttggtagaagcccaagccccagaagatttagaattgatccaagctctcccttacatgaaaaaaaccttgaagataacttacagagtttggctacacgattagctccaatttataagcagtatgctccagtagcttaccaaaatcaggtggaatatgaaaatgttgcccgagaatgtcggcttggcagcaaggaaggtcgacccttctctggggtcactgcttgcctggacttctgtgctcatccccacagggacattcacaacatgaataatggaagcactgtggtttgtaccttaactcgagaagataaccgctctttgggtgttattcctcaagatgagcagctccatgtgctacctctttataagctttcagacacagatgagtttggctccaaggaaggaatggaagccaagatcaaatctggggccatcgaggtcctggcaccccgccgcaaaaaaagaacgtgtttcactcagcctgttccccgttctggaaagaagagggctgcgatgatgacagaggttcttgcacataagataagggcagtggaaaagaaacctattccccgaatcaagcggaagaataactcaacaacaacaaacaacagtaagccttcgtcactgccaaccttagggagtaacactgagaccgtgcaacctgaagtaaaaagtgaaaccgaaccccattttatcttaaaaagttcagacaacactaaaacttattcgctgatgccatccgctcctcacccagtgaaagaggcatctccaggcttctcctggtccccgaagactgcttcagccacaccagctccactgaagaatgacgcaacagcctcatgcgggttttcagaaagaagcagcactccccactgtacgatgccttcgggaagactcagtggtgccaatgctgcagctgctgatggccctggcatttcacagcttggcgaagtggctcctctccccaccctgtctgctcctgtgatggagcccctcattaattctgagccttccactggtgtgactgagccgctaacgcctcatcagccaaaccaccagccctccttcctcacctctcctcaagaccttgcctcttctccaatggaagaagatgagcagcattctgaagcagatgagcctccatcagacgaacccctatctgatgaccccctgtcacctgctgaggagaaattgccccacattgatgagtattggtcagacagtgagcacatctttttggatgcaaatattggtggggtggccatcgcacctgctcacggctcggttttgattgagtgtgcccggcgagagctgcacgctaccactcctgttgagcaccccaaccgtaatcatccaacccgcctctcccttgtcttttaccagcacaaaaacctaaataagccccaacatggttttgaactaaacaagattaagtttgaggctaaagaagctaagaataagaaaatgaaggcctcagagcaaaaagaccaggcagctaatgaaggtccagaacagtcctctgaagtaaatgaattgaaccaaattccttctcataaagcattaacattaacccatgacaatgttgtcaccgtgtccccttatgctctcacacacgttgcggggccctataaccattgggtc

【0179】

配列番号６７
Ｔｅｔ１ＣＤのポリペプチド配列
LPTCSCLDRVIQKDKGPYYTHLGAGPSVAAVREIMENRYGQKGNAIRIEIVVYTGKEGKSSHGCPIAKWVLRRSSDEEKVLCLVRQRTGHHCPTAVMVVLIMVWDGIPLPMADRLYTELTENLKSYNGHPTDRRCTLNENRTCTCQGIDPETCGASFSFGCSWSMYFNGCKFGRSPSPRRFRIDPSSPLHEKNLEDNLQSLATRLAPIYKQYAPVAYQNQVEYENVARECRLGSKEGRPFSGVTACLDFCAHPHRDIHNMNNGSTVVCTLTREDNRSLGVIPQDEQLHVLPLYKLSDTDEFGSKEGMEAKIKSGAIEVLAPRRKKRTCFTQPVPRSGKKRAAMMTEVLAHKIRAVEKKPIPRIKRKNNSTTTNNSKPSSLPTLGSNTETVQPEVKSETEPHFILKSSDNTKTYSLMPSAPHPVKEASPGFSWSPKTASATPAPLKNDATASCGFSERSSTPHCTMPSGRLSGANAAAADGPGISQLGEVAPLPTLSAPVMEPLINSEPSTGVTEPLTPHQPNHQPSFLTSPQDLASSPMEEDEQHSEADEPPSDEPLSDDPLSPAEEKLPHIDEYWSDSEHIFLDANIGGVAIAPAHGSVLIECARRELHATTPVEHPNRNHPTRLSLVFYQHKNLNKPQHGFELNKIKFEAKEAKNKKMKASEQKDQAANEGPEQSSEVNELNQIPSHKALTLTHDNVVTVSPYALTHVAGPYNHWV

【0180】

配列番号６８
ｇＲＮＡ定常領域のＤＮＡ配列
gtttaagagctatgctggaaacagcatagcaagtttaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc

【0181】

配列番号６９
ｇＲＮＡ定常領域のＲＮＡ配列
guuuaagagcuaugcuggaaacagcauagcaaguuuaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc

【0182】

配列番号７０
ＳＶ４０ ＮＬＳ
Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ－Ｖａｌ

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図6A】

【図6B】

【配列表】

2023515709000001.app

【国際調査報告】