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▶ リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-17
(54)【発明の名称】Ｂ４ＧＡＬＴ１媒介性機能の齧歯類モデル
(51)【国際特許分類】
C12N 15/54 20060101AFI20230410BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20230410BHJP
A01K 67/027 20060101ALI20230410BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230410BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20230410BHJP
C12N 9/99 20060101ALI20230410BHJP
C12Q 1/48 20060101ALI20230410BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20230410BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20230410BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20230410BHJP
【ＦＩ】
C12N15/54 ZNA
C12N15/09 110
A01K67/027
C12N5/10
C12N9/10
C12N9/99
C12Q1/48
C12N15/864 100Z
G01N33/15 Z
G01N33/50 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022552466
(86)(22)【出願日】2021-03-03
(85)【翻訳文提出日】2022-08-31
(86)【国際出願番号】 US2021020579
(87)【国際公開番号】W WO2021178474
(87)【国際公開日】2021-09-10
(31)【優先権主張番号】62/985,045
(32)【優先日】2020-03-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】597160510
【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100152489
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 美樹
(72)【発明者】
【氏名】ガッタ、ジューシー デラ
(72)【発明者】
【氏名】ファン、チン
(72)【発明者】
【氏名】シュルディナー、アラン
【テーマコード（参考）】
2G045
4B050
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
2G045AA29
2G045DA60
4B050CC04
4B050DD11
4B050LL03
4B063QA01
4B063QA05
4B063QA18
4B063QQ70
4B063QR06
4B063QR72
4B063QR77
4B065AA91X
4B065AA93Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065CA29
4B065CA46
(57)【要約】
本開示は、遺伝子改変動物に関する。より具体的には、本開示は、内因性Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子が改変されて、例えば、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１タンパク質の位置３５２に対応する位置でコードされたＢ４ｇａｌｔ１タンパク質におけるＡｓｎのＳｅｒへの置換をコードする変異を導入する、または（例えば、肝臓などの選択組織に）機能喪失性変異を導入する、齧歯類動物に関する。本開示はまた、脂質代謝におけるＢ４ｇａｌｔ１の役割を解明することについての、かかる齧歯類動物の使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１座位で内因性齧歯類β４ガラクトトランスフェラーゼ１（Ｂ４ｇａｌｔ１）遺伝子に改変を含む、齧歯類。
【請求項2】
前記改変が、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１タンパク質の３５２位に対応するアミノ酸位置でのＡｓｎのＳｅｒへの置換を含むＢ４ｇａｌｔ１タンパク質をコードする改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子をもたらす、請求項１に記載の齧歯類。
【請求項3】
前記齧歯類がマウスであり、前記置換がマウスＢ４ｇａｌｔ１タンパク質のアミノ酸位置３５３にある、請求項２に記載の齧歯類。
【請求項4】
前記齧歯類が、前記改変を伴わない野生型齧歯類と比較して、ＬＤＬ－Ｃのレベルの減少を呈する、請求項２または３に記載の齧歯類。
【請求項5】
前記改変が、前記齧歯類のゲノムにある、請求項１に記載の齧歯類。
【請求項6】
前記齧歯類が、前記改変についてホモ接合性である、請求項２～５のいずれか一項に記載の齧歯類。
【請求項7】
前記改変が機能喪失性変異である、請求項１に記載の齧歯類。
【請求項8】
前記機能喪失性変異が、前記内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子のコード配列の全部または一部に欠失をもたらす一つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む、請求項７に記載の齧歯類。
【請求項9】
一つ以上のヌクレオチドの前記挿入、欠失、または置換が、前記内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子のエクソン２で発生する、請求項８に記載の齧歯類。
【請求項10】
前記改変が、前記齧歯類のゲノムにある、請求項７～９のいずれか一項に記載の齧歯類。
【請求項11】
前記改変が、前記齧歯類の標的組織または器官の前記内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に導入される、請求項７～９のいずれか一項に記載の齧歯類。
【請求項12】
前記改変が、前記齧歯類の肝臓の前記内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に導入される、請求項１１に記載の齧歯類。
【請求項13】
前記齧歯類が、マウスまたはラットである、請求項１～２および４～１２のいずれか一項に記載の齧歯類。
【請求項14】
内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１座位で内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に改変を含む、単離された齧歯類細胞または組織。
【請求項15】
前記改変が、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１タンパク質の３５２位に対応するアミノ酸位置でのＡｓｎのＳｅｒへの置換を含むＢ４ｇａｌｔ１タンパク質をコードする改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子をもたらす、請求項１４に記載の単離された齧歯類細胞または組織。
【請求項16】
前記齧歯類細胞または組織がマウス細胞または組織であり、前記置換がマウスＢ４ｇａｌｔ１タンパク質のアミノ酸位置３５３にある、請求項１５に記載の単離された齧歯類細胞または組織。
【請求項17】
前記改変が機能喪失性変異である、請求項１４に記載の単離された齧歯類細胞または組織。
【請求項18】
前記機能喪失性変異が、前記内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子のコード配列の全部または一部に欠失をもたらす一つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む、請求項１７に記載の単離された齧歯類細胞または組織。
【請求項19】
一つ以上のヌクレオチドの前記挿入、欠失、または置換が、前記内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１ 遺伝子のエクソン２で発生する、請求項１８に記載の単離された齧歯類細胞または組織。
【請求項20】
前記齧歯類細胞または組織が、マウス細胞または組織である、請求項１４～１５および１７～１９のいずれか一項に記載の単離された齧歯類細胞または組織。
【請求項21】
前記齧歯類細胞または組織が、ラット細胞または組織である、請求項１４～１５および１７～１９のいずれか一項に記載の単離された齧歯類細胞または組織。
【請求項22】
前記齧歯類細胞が、齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞である、請求項１４～２１のいずれか一項に記載の単離された齧歯類細胞または組織。
【請求項23】
請求項２２に記載の単離された齧歯類細胞を含む、齧歯類胚。
【請求項24】
遺伝子改変齧歯類を作製する方法であって、（ｉ）齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞の内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１座位で内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子内に改変を導入し、それによって改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子を含む改変齧歯類ＥＳ細胞を得ること、および
（ｉｉ）前記改変齧歯類ＥＳ細胞を使用して、前記遺伝子改変齧歯類を作製すること、を含む、方法。
【請求項25】
前記改変が、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１タンパク質の３５２位に対応するアミノ酸位置でのＡｓｎのＳｅｒへの置換を含むＢ４ｇａｌｔ１タンパク質をコードする改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子をもたらす、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記齧歯類がマウスであり、前記置換が、マウスＢ４ｇａｌｔ１タンパク質のアミノ酸位置３５３にある、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記改変が機能喪失性変異である、請求項２４に記載の方法。
【請求項28】
前記機能喪失性変異が、前記内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子のコード配列の全部または一部に欠失をもたらす一つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
一つ以上のヌクレオチドの前記挿入、欠失、または置換が、前記内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子のエクソン２で発生する、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記改変が、遺伝子編集システムを介して前記内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子内に導入される、請求項２４～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記遺伝子編集システムがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記遺伝子編集システムが、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓ９酵素、および一本鎖オリゴデオキシ核酸分子（ｓｓＯＤＮ）を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記ガイドＲＮＡおよびｓｓＯＤＮが、齧歯類ＥＳ細胞内に導入され、前記齧歯類ＥＳ細胞が、前記Ｃａｓ９酵素を発現する、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
遺伝子改変齧歯類を作製する方法であって、齧歯類組織の内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１座位で、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子内に改変を導入し、それによって前記遺伝子改変齧歯類を得ることを含む、方法。
【請求項35】
前記改変が、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１タンパク質の３５２位に対応するアミノ酸位置でのＡｓｎのＳｅｒへの置換を含むＢ４ｇａｌｔ１タンパク質をコードする改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子をもたらす、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記齧歯類がマウスであり、前記置換が、マウスＢ４ｇａｌｔ１タンパク質のアミノ酸位置３５３にある、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
前記改変が機能喪失性変異である、請求項３４に記載の方法。
【請求項38】
前記機能喪失性変異が、前記内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子のコード配列の全部または一部に欠失をもたらす一つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
一つ以上のヌクレオチドの前記挿入、欠失、または置換が、前記内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子のエクソン２で発生する、請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
前記改変が、遺伝子編集システムを介して前記内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子内に導入される、請求項３４～３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項41】
前記遺伝子編集システムがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが、ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９酵素を含み、前記ガイドＲＮＡが、ＡＡＶシステムによって前記齧歯類内に送達される、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記ＡＡＶシステムが、前記齧歯類の肝臓への前記ガイドＲＮＡの送達を標的とする、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
前記Ｃａｓ９酵素が、前記齧歯類内に前記ガイドＲＮＡを導入する前に、前記齧歯類で発現される、請求項４１～４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
請求項２４～４４のいずれか一項に記載の方法から取得される齧歯類。
【請求項46】
Ｂ４ｇａｌｔ１の活性に対する化合物の効果を試験する方法であって、請求項１～１３のいずれか一項に記載の内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に改変を含む齧歯類を提供することと、
前記改変を伴わない野生型齧歯類を提供することと、
候補Ｂ４ｇａｌｔ１阻害化合物を前記野生型齧歯類に投与することと、
前記改変を有する前記齧歯類および前記野生型齧歯類を調べて、血清ＬＤＬ－Ｃレベルを測定することと、
前記化合物を投与した前記野生型齧歯類からの測定値、前記化合物の前記投与前の前記野生型齧歯類からの測定値、および前記改変を有する前記齧歯類からの測定値を比較して、前記候補化合物が、Ｂ４ｇａｌｔ１の活性を阻害するかどうかを決定することと、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年３月４日に出願された米国仮特許出願第６２／９８５，０４５号の優先権の利益を主張するものであり、当該仮特許出願の全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年３月４日に出願された米国仮特許出願第６２／９８５，０４５号の優先権の利益を主張するものであり、当該仮特許出願の全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、遺伝子改変動物に関する。より具体的には、本開示は、齧歯類動物であって、内因性Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子が改変されて、例えば、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性が低下したＢ４ｇａｌｔ１タンパク質をコードする改変遺伝子を有する、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１タンパク質の３５２位に対応する位置でコードされたＢ４ｇａｌｔ１タンパク質におけるＡｓｎのＳｅｒへの置換をコードする変異を導入する、または（例えば肝臓などの選択組織に）機能喪失性変異を導入する、齧歯類動物に関する。本開示はまた、脂質代謝におけるＢ４ｇａｌｔ１の役割を解明することについての、かかる齧歯類動物の使用に関する。
【0003】
参照による配列表の援用
２０２１年２月２４日に作製され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して米国特許商標庁に提出された３７９９３ＰＣＴ＿１０７００ＷＯ０１＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇという名称の２７ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルの形態をとる配列表が、参照により本明細書に組み込まれる。
２０２１年２月２４日に作製され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して米国特許商標庁に提出された３７９９３ＰＣＴ＿１０７００ＷＯ０１＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇという名称の２７ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルの形態をとる配列表が、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0004】
特許、特許出願、受託番号、技術論文および学術論文を含む様々な参考文献が、本明細書に引用される。各参考文献は、参照によりその全体が、全ての目的について本明細書に組み込まれる。
【0005】
心血管疾患（ＣＶＤ）は、米国において３人の死亡中１人の死因に相当し、世界中の罹患率および死亡率の主要原因である（非特許文献１）。低比重リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）の上昇は、動脈プラーク形成とアテローム性動脈硬化を増加させ、冠動脈疾患（ＣＡＤ）の危険因子である（非特許文献２）。ＬＤＬ－Ｃの遺伝的決定因子のより深い理解は、ＣＡＤを治療または予防するためにより有効かつより安全であり得る治療法のための新規標的を明らかにし得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｂｅｎｊａｍｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２０１８．１３７（１２）：ｐ．ｅ６７－ｅ４９２
【非特許文献2】Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｉｍａｒｙ ｃａｒｅ，２０１３．４０（１）：ｐ．１９５－２１１
【発明の概要】
【0007】
一態様では、本開示は、内因性Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子が改変された遺伝子改変齧歯類動物（例えば、マウスまたはラット）を提供する。
一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１座位で内因性齧歯類β４ガラクトトランスフェラーゼ１（Ｂ４ｇａｌｔ１）遺伝子に改変を含む齧歯類が、本明細書に開示される。
一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１座位で内因性齧歯類β４ガラクトトランスフェラーゼ１（Ｂ４ｇａｌｔ１）遺伝子に改変を含む齧歯類が、本明細書に開示される。
【0008】
一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子における改変は、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性が低下したＢ４ｇａｌｔ１タンパク質をコードする改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子をもたらす。一部のこうした実施形態では、改変は、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子内の一つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、または置換を含む。一部の実施形態では、改変は、置換を含むＢ４ｇａｌｔ１タンパク質がガラクトシルトランスフェラーゼ活性の低減を示すように、Ｂ４ｇａｌｔ１タンパク質中のアミノ酸の置換をもたらすか、またはその置換をコードする。一部のこうした実施形態では、置換は、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１タンパク質の３５２位に対応する齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１タンパク質のアミノ酸位置でのＡｓｎのＳｅｒへの置換である。一部の実施形態では、改変は、齧歯類のゲノム（すなわち、生殖系列ゲノム）にある。一部の実施形態では、改変は、齧歯類の標的組織または器官の内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に導入される。
【0009】
一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子における改変は、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１タンパク質の３５２位に対応するアミノ酸位置でのＡｓｎのＳｅｒへの置換を含むＢ４ｇａｌｔ１タンパク質をコードする改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子をもたらす（また、「Ｎ３５２Ｓノックイン」を含む齧歯類とも称される）。一部の実施形態では、齧歯類がマウスであり、置換がマウスＢ４ｇａｌｔ１タンパク質のアミノ酸位置３５３にある。一部の実施形態では、齧歯類はラットであり、置換はラットＢ４ｇａｌｔ１タンパク質のアミノ酸位置３５３にある。一部の実施形態では、改変は、齧歯類のゲノム（すなわち、生殖系列ゲノム）にある。一部の実施形態では、齧歯類は、改変についてヘテロ接合性である。一部の実施形態では、齧歯類は、改変についてホモ接合性である。Ｎ３５２Ｓノックインを含む齧歯類は、改変を伴わない野生型齧歯類と比較して、ＬＤＬ－Ｃのレベルの減少を示す。一部の実施形態では、改変は、齧歯類の標的組織または器官の内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に導入される。
【0010】
一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子の改変は、機能喪失性変異である。一部の実施形態では、機能喪失性変異は、一つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含み、結果的に、一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子のコード配列の全部または一部に欠失をもたらす。一部の実施形態では、一つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換は、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子のエクソン２で発生する。一部の実施形態では、機能喪失性変異は、齧歯類のゲノム（例えば、生殖系列ゲノム）にある。一部の実施形態では、改変は、齧歯類の標的組織または器官の内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に導入される。一部の実施形態では、標的器官は肝臓である。
【0011】
さらなる態様では、本明細書に記載される改変、すなわち、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１座位での内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子の改変を含む、単離された齧歯類（例えば、マウスまたはラット）細胞または組織が本明細書に提供される。一部の実施形態では、細胞または組織は、改変を含む齧歯類から単離することができる。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞は、齧歯類胚性幹細胞である。
【0012】
一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子における改変は、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性が低下したＢ４ｇａｌｔ１タンパク質をコードする改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子をもたらす。一部のこうした実施形態では、改変は、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子内の一つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、または置換を含む。一部の実施形態では、改変は、置換を含むＢ４ｇａｌｔ１タンパク質がガラクトシルトランスフェラーゼ活性の低減を示すように、Ｂ４ｇａｌｔ１タンパク質中のアミノ酸の置換をもたらすか、またはその置換をコードする。一部のこうした実施形態では、置換は、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１タンパク質の３５２位に対応する齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１タンパク質のアミノ酸位置でのＡｓｎのＳｅｒへの置換である。
【0013】
単離された齧歯類細胞または組織についての一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子における改変は、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１タンパク質の３５２位に対応するアミノ酸位置でのＡｓｎのＳｅｒへの置換を含むＢ４ｇａｌｔ１タンパク質をコードする改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子をもたらす（「Ｎ３５２Ｓノックイン」を含む齧歯類細胞または組織とも呼称される）。一部の実施形態では、齧歯類細胞または組織は、マウス細胞または組織であり、置換は、マウスＢ４ｇａｌｔ１タンパク質のアミノ酸位置３５３にある。一部の実施形態では、齧歯類はラット細胞または組織であり、置換はラットＢ４ｇａｌｔ１タンパク質のアミノ酸位置３５３にある。一部の実施形態では、齧歯類細胞または組織は、改変についてヘテロ接合性である。一部の実施形態では、齧歯類細胞または組織は、改変についてホモ接合性である。一部の実施形態では、齧歯類細胞または組織は、肝臓細胞または組織である。
【0014】
単離された齧歯類細胞または組織についての一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子の改変は、機能喪失性変異である。一部の実施形態では、機能喪失性変異は、一つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含み、結果的に、一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子のコード配列の全部または一部に欠失をもたらす。一部の実施形態では、一つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換は、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子のエクソン２で発生する。
【0015】
また、本明細書に開示される齧歯類胚性細胞を含む齧歯類（例えば、マウスまたはラット）胚も本明細書において提供される。
さらなる態様では、遺伝子改変齧歯類を作製する方法および本方法によって作製された齧歯類が提供される。
さらなる態様では、遺伝子改変齧歯類を作製する方法および本方法によって作製された齧歯類が提供される。
【0016】
一部の実施形態では、（ｉ）齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞の内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１座位で内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子内に改変を導入し、それによって改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子を含む改変齧歯類ＥＳ細胞を取得すること、および（ｉｉ）改変齧歯類ＥＳ細胞を使用して遺伝子改変齧歯類を作製すること、を含む方法。
【0017】
一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子における改変は、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性が低下したＢ４ｇａｌｔ１タンパク質をコードする改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子をもたらす。一部のこうした実施形態では、改変は、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子内の一つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、または置換を含む。一部の実施形態では、改変は、置換を含むＢ４ｇａｌｔ１タンパク質がガラクトシルトランスフェラーゼ活性の低減を示すように、Ｂ４ｇａｌｔ１タンパク質中のアミノ酸の置換をもたらすか、またはその置換をコードする。一部のこうした実施形態では、置換は、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１タンパク質の３５２位に対応する齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１タンパク質のアミノ酸位置でのＡｓｎのＳｅｒへの置換である。
【0018】
一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子における改変は、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１タンパク質の３５２位に対応するアミノ酸位置でのＡｓｎのＳｅｒへの置換を含むＢ４ｇａｌｔ１タンパク質をコードする改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子をもたらす。一部の実施形態では、齧歯類は、マウスであり、置換は、マウスＢ４ｇａｌｔ１タンパク質のアミノ酸位置３５３にある。一部の実施形態では、齧歯類はラットであり、置換はラットＢ４ｇａｌｔ１タンパク質のアミノ酸位置３５３にある。
【0019】
一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子の改変は、機能喪失性変異である。一部の実施形態では、機能喪失性変異は、一つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含み、結果的に、一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｂ４ＧａｌＴ－１遺伝子のコード配列の全部または一部に欠失をもたらす。一部の実施形態では、一つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換は、内因性齧歯類Ｂ４ＧａｌＴ－１遺伝子のエクソン２で発生する。
【0020】
一部の実施形態では、改変は、齧歯類ＥＳ細胞中の内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子内に、遺伝子編集システムを介して導入される。一部の実施形態では、遺伝子編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである。一部の実施形態では、遺伝子編集システムは、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓ９酵素、および一本鎖オリゴデオキシ核酸分子（ｓｓＯＤＮ）を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡおよびｓｓＯＤＮは、齧歯類ＥＳ細胞に導入され（例えば、トランスフェクションまたはエレクトロポレーションを介して）、齧歯類ＥＳ細胞はすでにＣａｓ９酵素を発現するか、または発現するように改変されている。
【0021】
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類を作製する方法は、齧歯類の標的組織中の内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１座位で、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子内に改変を導入し、それによって遺伝子改変齧歯類を得ることを含む。
【0022】
一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子における改変は、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性が低下したＢ４ｇａｌｔ１タンパク質をコードする改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子をもたらす。一部のこうした実施形態では、改変は、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子内の一つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、または置換を含む。一部の実施形態では、改変は、置換を含むＢ４ｇａｌｔ１タンパク質がガラクトシルトランスフェラーゼ活性の低減を示すように、Ｂ４ｇａｌｔ１タンパク質中のアミノ酸の置換をもたらすか、またはその置換をコードする。一部のこうした実施形態では、置換は、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１タンパク質の３５２位に対応する齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１タンパク質のアミノ酸位置でのＡｓｎのＳｅｒへの置換である。
【0023】
一部のこうした実施形態では、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子における改変は、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１タンパク質の３５２位に対応するアミノ酸位置でのＡｓｎのＳｅｒへの置換を含むＢ４ｇａｌｔ１タンパク質をコードする改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子をもたらす。一部の実施形態では、齧歯類は、マウスであり、置換は、マウスＢ４ｇａｌｔ１タンパク質のアミノ酸位置３５３にある。一部の実施形態では、齧歯類はラットであり、置換はラットＢ４ｇａｌｔ１タンパク質のアミノ酸位置３５３にある。
【0024】
一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子の改変は、機能喪失性変異である。一部の実施形態では、機能喪失性変異は、一つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含み、結果的に、一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子のコード配列の全部または一部に欠失をもたらす。一部の実施形態では、一つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換は、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子のエクソン２で発生する。
【0025】
一部の実施形態では、改変は、遺伝子編集システムを介して内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子内に導入される。一部の実施形態では、遺伝子編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのガイドＲＮＡは、ＡＡＶシステムによって齧歯類内に送達される。一部の実施形態では、ＡＡＶシステムは、齧歯類の肝臓へのガイドＲＮＡの送達を標的とする。一部の実施形態では、Ｃａｓ９酵素は、ガイドＲＮＡを齧歯類内に導入する前に、齧歯類で発現される。
【0026】
別の態様では、取得された齧歯類および齧歯類子孫を育種する方法が本明細書に提供される。
一部の実施形態では、そのゲノムが内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に改変を含む（すなわち、改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子を含む）第一の齧歯類を第二の齧歯類と育種させ、そのゲノムが齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に改変を含む子孫齧歯類をもたらす方法が本明細書に開示される。
一部の実施形態では、そのゲノムが内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に改変を含む（すなわち、改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子を含む）第一の齧歯類を第二の齧歯類と育種させ、そのゲノムが齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に改変を含む子孫齧歯類をもたらす方法が本明細書に開示される。
【0027】
一部の実施形態では、そのゲノムが内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に改変を含む第一の齧歯類を、第二の齧歯類と交配させることから取得される子孫であって、その子孫のゲノムが齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に改変を含む、子孫が、本明細書に開示される。
【0028】
さらなる態様では、Ｂ４ｇａｌｔ１および脂質代謝に対する化合物の効果を試験する方法であって、（ｉ）本明細書に記載される内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に改変を含む齧歯類を提供することと、改変を伴わない野生型齧歯類を提供すること、（ｉｉ）候補Ｂ４ｇａｌｔ１阻害化合物を野生型齧歯類に投与すること、（ｉｉｉ）血清ＬＤＬ－Ｃレベルを測定するために、改変を有する齧歯類および野生型齧歯類を調べること、および（ｉｖ）化合物を投与された野生型齧歯類からの測定値、化合物の投与前の野生型齧歯類からの測定値、および改変を有する齧歯類からの測定値を比較して、候補化合物がＢ４ｇａｌｔ１の活性を阻害するかどうかを決定すること、を含む方法が、本明細書において提供される。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図1A】図１Ａは、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１（配列番号２）およびマウスＢ４ｇａｌｔ１（配列番号４）タンパク質配列のアラインメントを示す。両方の配列に共通するアミノ酸は囲まれている。ヒトタンパク質の３５２位のＡｓｎ残基と、対応するマウスタンパク質の３５３位のＡｓｎ残基とは、囲まれて示されている。
【図1B】図１Ｂは、マウスＢ４ｇａｌｔ１遺伝子（上）およびタンパク質（下）を示す。上：水平の線／バーはマウスＢ４ｇａｌｔ１遺伝子座を表し、エクソンは線の上の垂直のバーによって示される。エクソン１およびエクソン６の開放、未充填の部分は、それぞれ５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）および３’ＵＴＲを表す。下：水平のバーはマウスＢ４ｇａｌｔ１タンパク質を表す。エクソン間の接合部は、バー内の垂直線によって示され、接合部に対応するアミノ酸位置は、垂直線の下に示されている。Ｎ３５３Ｓ置換は、アスタリスクで示されている。
【図1C】図１Ｃは、マウスＢ４ｇａｌｔ１タンパク質のＮ３５３Ｓ置換をもたらすマウスＢ４ｇａｌｔ１遺伝子のエクソン５に変異を導入するための例示的な戦略を示す。野生型エクソン５配列（配列番号１２）の一部に対して相補的であるガイドＲＮＡ配列（配列番号１１）は、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）に二本鎖切断を導入するように指示する。鋳型として、一本鎖ドナーオリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）配列（配列番号１３）を使用して修復すると、変異（ＡからＧへのヌクレオチド置換）が導入され、コードされたＢ４ｇａｌｔ１タンパク質においてＮ３５３Ｓ置換が生じる。
【図2B】同上。
【図3】図３Ａ～３Ｅは、血漿中の脂質および酵素レベルに対する肝臓特異的Ｂ４ｇａｌｔ１アブレーションの効果を示す。３Ａ、３Ｂ：ＡＡＶ８によるウイルス形質導入から１４週目での肝臓および脾臓におけるｂ４ｇａｌｔ１の編集の割合。各実験群において、Ｂ４ｇａｌｔ１のＩＮＤＥＬを含有するリードの数を、Ｂ４ｇａｌｔ１野生型配列を有するリードの数と比較した（実施例２の方法セクションに記載されるように）。３Ｃ：ＡＡＶ８によるウイルス形質導入から１４週目のＴａｑｍａｎによる肝臓におけるＢ４ｇａｌｔ１ ｍＲＮＡレベルの分析。Ｂ４ｇａｌｔ１の発現は、Ｇａｐｄｈハウスキーピング遺伝子に対して計算された。値は、１条件当たり４回の技術的反復の平均を表す。３Ｄ、３Ｅ：Ｂ４ｇａｌｔ１肝臓ノックアウトおよびＣｆｂノックアウト対照からのＬＤＬ－ＣおよびＡＳＴの血漿レベルを示す。２週間の時点の後、ウイルスベクターの注入から１２週間の合計試験期間の間、４週間ごとに定期的に出血させた。値は、３～５個の生物学的複製の平均を表す。エラーバーは標準エラーを示す。
【図4】図４Ａ～４Ｊは、血漿中の脂質および酵素レベルに対する肝臓特異的Ｂ４ｇａｌｔ１アブレーションの効果を示す。４Ａ、４Ｂ：Ｂ４ｇａｌｔ１のエクソン２に対して設計された二つの異なるｇＲＮＡを担持する、ＡＡＶ８によるウイルス形質導入から１４週目での肝臓および脾臓におけるｂ４ｇａｌｔ１の編集の割合。各実験群において、ｂ４ｇａｌｔ１のＩＮＤＥＬを含有するリードの数を、ｂ４ｇａｌｔ１野生型配列を有するリードの数と比較した（方法を参照のこと）。４Ｃ：ＡＡＶ８によるウイルス形質導入から１４週目のＴａｑｍａｎによる肝臓におけるｂ４ｇａｌｔ１ ｍＲＮＡレベルの分析。ｂ４ｇａｌｔ１の発現は、ｇａｐｄｈハウスキーピング遺伝子に対して計算された。値は、１条件当たり４回の技術的反復の平均を表す。４Ｄ～４Ｊ：ｂ４ｇａｌｔ１肝臓特異的ノックアウトおよびｃｆｂノックアウト対照で測定されたＬＤＬ－Ｃ；ＡＳＴ；Ｔ－コレステロール；ＨＤＬ－Ｃ；ＮＥＦＡ；トリグリセリドおよびＡＬＴについての血漿レベルを示す。２週間の時点の後、ウイルスベクターの注入から１２週間の合計試験期間の間、４週間ごとに定期的に出血させた。値は、３～５個の生物学的複製の平均を表す。エラーバーは標準エラーを示す。
【発明を実施するための形態】
【0030】
ヒト代謝（例えば、脂質代謝）および疾患の動物モデルとしての使用に適した遺伝子改変齧歯類が本明細書に開示される。特に、内因性Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子が改変されて、例えば、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性が低下したＢ４ｇａｌｔ１タンパク質をコードする、アミノ酸置換をもたらす変異を導入する、または機能喪失性変異を導入する齧歯類動物が本明細書に開示される。脂質代謝におけるＢ４ｇａｌｔ１の役割を解明することについての、かかる齧歯類動物の使用もまた、本明細書に開示される。
【0031】
Ｂ４ＧＡＬＴ１
Ｂ４ＧＡＬＴ１（または非ヒト由来のＢ４ｇａｌｔ１）は、糖タンパク質中のＮ結合型オリゴ糖部分の処理において重要な役割を果たすＩＩ型膜結合糖タンパク質をコードするベータ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子ファミリーのメンバーである。Ｂ４ＧＡＬＴ１（またはＢ４ｇａｌｔ１）活性の障害は、Ｎ結合型オリゴ糖の構造を変化させ、糖タンパク質機能を変化させる可能性のあるグリカン構造に異常を導入する可能性がある。
Ｂ４ＧＡＬＴ１（または非ヒト由来のＢ４ｇａｌｔ１）は、糖タンパク質中のＮ結合型オリゴ糖部分の処理において重要な役割を果たすＩＩ型膜結合糖タンパク質をコードするベータ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子ファミリーのメンバーである。Ｂ４ＧＡＬＴ１（またはＢ４ｇａｌｔ１）活性の障害は、Ｎ結合型オリゴ糖の構造を変化させ、糖タンパク質機能を変化させる可能性のあるグリカン構造に異常を導入する可能性がある。
【0032】
ヒトＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子は、９番染色体上の９ｐ２１．１に位置し、６つのエクソンを有する約５６ｋｂの長さであり、３９８アミノ酸のポリペプチドをコードする。マウスＢ４ｇａｌｔ１遺伝子は、４番染色体上に位置し、６つのエクソンを有する約４９ｋｂの長さであり、３９９アミノ酸のタンパク質をコードする。Ｂ４ＧＡＬＴ１は、種間で高度に保存される。ヒト、マウス、およびラット由来の例示的なｍＲＮＡおよびタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいて、表１に列挙するアクセッション番号で利用可能であり、また配列表にも配列番号１～６として記載される。
【0033】
【表1】
【0034】
改変Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子を含む齧歯類
本開示は、内因性Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子が改変されて、例えば、アミノ酸置換（例えば、Ｂ４ｇａｌｔ１タンパク質の活性を低下させる置換）をもたらす変異を導入するか、または機能喪失性変異を導入する齧歯類（例えば、マウスおよびラット）を提供する。
本開示は、内因性Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子が改変されて、例えば、アミノ酸置換（例えば、Ｂ４ｇａｌｔ１タンパク質の活性を低下させる置換）をもたらす変異を導入するか、または機能喪失性変異を導入する齧歯類（例えば、マウスおよびラット）を提供する。
【0035】
「変異」という用語は、遺伝子内の一つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、または置換を含む。本明細書で使用される場合、用語「変異」、「変更」、および「改変」は、互換的に使用される。変異遺伝子（または遺伝子の変異対立遺伝子）は、野生型遺伝子または参照遺伝子と比べて、変異、変更または改変を含むことが、本明細書において理解される。一部の実施形態では、変異は、単一ヌクレオチドの置換である。一部の実施形態では、変異は、一つ以上のヌクレオチド、例えば、遺伝子のコード配列における一つ以上のヌクレオチドの欠失である。一部の実施形態では、遺伝子における変異は、例えば遺伝子の一つ以上のエクソンなどの連続核酸配列の欠失を含む。一部の実施形態では、遺伝子における変異は、コードされたタンパク質における一つ以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換をもたらす。一部の実施形態では、遺伝子における変異は、コードされたアミノ酸を変化させない。
【0036】
用語「機能喪失」は、完全な機能喪失および部分的な機能喪失を含む。一部の実施形態では、遺伝子における改変または変更は、少なくとも機能性が低減されたポリペプチドの発現をもたらし、ある場合では、改変も変更も有さない参照遺伝子によってコードされるポリペプチドと比ベて、機能性が実質的に低減された、または機能性が完全に欠如したポリペプチドの発現をもたらす。したがって、遺伝子改変は、完全な機能喪失または部分的な機能喪失を引き起こす可能性がある。一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子における改変を含む齧歯類動物であって、ここで改変を含む齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子が、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性が低下したＢ４ｇａｌｔ１タンパク質をコードする、齧歯類動物を本明細書に開示する。一部の実施形態では、改変は、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子の一つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、または置換を含む。一部の実施形態では、改変は、Ｂ４ｇａｌｔ１タンパク質中のアミノ酸の置換をもたらすか、またはその置換をコードする。一部の実施形態では、置換は、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１タンパク質の３５２位に対応する齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１タンパク質のアミノ酸位置でのＡｓｎのＳｅｒへの置換である。一部の実施形態では、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性の減少は、例えば、野生型齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子（改変を伴わない齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子）によってコードされる天然型または野生型齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１タンパク質に対する活性の阻害または減少であってもよい。
【0037】
一部の実施形態では、改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子が、ヒトＢ４ｇａｌｔ１タンパク質中の３５２位に対応するアミノ酸位置でのＡｓｎのＳｅｒへの置換を含む改変Ｂ４ｇａｌｔ１タンパク質をコードするように、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に改変を含む齧歯類動物が本明細書に開示される。こうした齧歯類は、本明細書ではＮ３５２Ｓノックインを有する齧歯類とも呼称される。改変は、例えば、ヒトＢ４ｇａｌｔ１タンパク質中の３５２位に対応する位置でのＡｓｎに対するコドン中のヌクレオチドの置換であってもよく、コードされた齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１タンパク質中のＡｓｎのＳｅｒへの置換をもたらす。こうした改変はまた、「ＮのＳへの置換をコードする」とも言われる。ヒトＢ４ＧＡＬＴ１のＮ３５２Ｓ変化は、ＬＤＬ－Ｃの低下と関連していると考えられる。
【0038】
本明細書で使用される場合、所与のポリペプチドまたは核酸分子内の位置のナンバリングの文脈で使用される場合の、語句「対応する」またはその文法的変形は、所与のアミノ酸または核酸分子が参照分子（例えば、野生型ヒトＢ４ＧＡＬＴ１ポリペプチドまたは野生型ヒトＢ４ＧＡＬＴ１核酸分子である本明細書の参照分子）と比較された場合に、指定された参照ポリペプチドまたは核酸分子のナンバリングを指す。言い換えれば、所与のポリマー中のアミノ酸残基またはヌクレオチドの位置は、所与のポリマー内のアミノ酸残基またはヌクレオチドの実際の数値の位置によってではなく、参照分子に対して指定される。例えば、所与のアミノ酸配列は、二つの配列間の残基一致を最適化するためにギャップを導入することによって、参照配列に整列され得る。これらの場合、ギャップが存在するが、所与のアミノ酸配列または核酸配列中の残基のナンバリングは、それが整列された参照配列に対して行われる。
【0039】
例えば、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１タンパク質の３５２位に対応する齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１タンパク質内の位置は、齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１タンパク質とヒトＢ４ＧＡＬＴ１タンパク質のアミノ酸配列（例えば配列番号２）との間の配列アライメントを実行することによって容易に特定することができる。配列番号２の３５２位に対応するアミノ酸位置を特定するために配列アライメントを行うために使用できる様々な計算アルゴリズムが存在する。例えば、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．１９９７ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）またはＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェア（Ｓｉｅｖｅｒｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ ２０１４ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０７９：１０５－１１６．）を使用することにより、配列アライメントが行われてもよい。しかしながら、配列は、手動で整列することもできる。
【0040】
一部の実施形態では、齧歯類は、改変マウスＢ４ｇａｌｔ１遺伝子が、ヒトＢ４ｇａｌｔ１タンパク質の３５２位に対応するアミノ酸位置でのＡｓｎのＳｅｒへの置換を含む改変マウスＢ４ｇａｌｔ１タンパク質をコードするように、内因性マウスＢ４ｇａｌｔ１遺伝子に改変を含むマウスである。マウスＢ４ｇａｌｔ１タンパク質（例えば、配列番号４）の３５３位は、例えば配列番号２の、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１タンパク質の３５２位に対応する。例えば、図１Ａを参照のこと。
【0041】
一部の実施形態では、齧歯類は、改変ラットＢ４ｇａｌｔ１遺伝子が、ヒトＢ４ｇａｌｔ１タンパク質の３５２位に対応するアミノ酸位置でのＡｓｎのＳｅｒへの置換を含む改変ラットＢ４ｇａｌｔ１タンパク質をコードするように、内因性ラットＢ４ｇａｌｔ１遺伝子に改変を含むラットである。ラットＢ４ｇａｌｔ１タンパク質（例えば、配列番号６）の３５３位は、例えば配列番号２の、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１タンパク質の３５２位に対応する。
【0042】
一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に改変を含み、この改変が機能喪失性変異である齧歯類動物が本明細書に開示される。
一部の実施形態では、齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子の機能喪失性変異は、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子の少なくとも一部の欠失を含む。
一部の実施形態では、齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子の機能喪失性変異は、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子の少なくとも一部の欠失を含む。
【0043】
遺伝子の「一部」は、本明細書において、遺伝子の「断片」と互換的に使用され、それは、例えば、５’調節領域（例えば、プロモーター）、５’非コードエクソン配列、３’非コードエクソン配列、５’もしくは３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、完全もしくは部分的なエクソン、完全もしくは部分的なイントロン、最終のエクソンの下流の３’領域、またはその組み合わせを含む、遺伝子の連続ヌクレオチド配列の一部への言及を含む。一部の実施形態では、遺伝子の一部は、遺伝子のコード領域、例えば、遺伝子のＡＴＧ開始コドンから停止コドンまでを含む核酸（ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）を指す。
【0044】
一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子の改変は、一つ以上のヌクレオチド（例えば、エクソン内）の挿入、欠失、または置換から生じる機能喪失性変異を含み、それによりコード配列の少なくとも一部分の欠失がもたらされる。
【0045】
一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子における改変（例えば、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１の３５２に対応する位置でのＮのＳへの置換をもたらす点変異、または機能喪失性変異）は、齧歯類動物のゲノム（すなわち、生殖系列ゲノム）にある。一部の実施形態では、齧歯類は、改変についてヘテロ接合性である。一部の実施形態では、齧歯類は、改変についてホモ接合性である。
【0046】
一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子の改変は、齧歯類の選択されたまたは標的化された組織または器官、すなわち、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子の組織または器官特異的改変に存在する。一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子の改変は、齧歯類の肝臓に存在する。一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子における機能喪失性変異は、齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子の肝臓特異的アブレーションを達成するために、齧歯類の肝臓に存在する。
【0047】
一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類動物は、野生型齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１タンパク質を発現することができない。例えば、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子の一方のコピーが改変（例えば、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１のＮ３５２Ｓに対応する置換をもたらす改変）を含有し、他方のコピーが破壊または欠失している齧歯類が提供される。あるいは、齧歯類動物は、改変に対してホモ接合性であり、その結果、野生型齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１タンパク質を発現することができない。
【0048】
本明細書に提供される齧歯類動物は、内因性Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子における改変（Ｎ３５２Ｓノックインに対してホモ接合性またはヘテロ接合性のいずれか、または肝臓特異的アブレーション）の結果として、例えば、野生型マウスと比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれ以上のＬＤＬ－Ｃレベルの減少を示す（すなわち、改変を伴わないマウス）。
【0049】
本明細書に記載される実施形態のいずれについても、齧歯類は、例えば、マウス、ラット、およびハムスターを含み得る。
一部の実施形態では、齧歯類は、マウスである。一部の実施形態では、齧歯類は、Ｃ５７ＢＬ系統、例えば、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウスである。他の実施形態では、齧歯類は、１２９系統、例えば、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９／ＳｖＪａｅ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２からなる群から選択される１２９系統のマウスである（例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ １０：８３６；Ａｕｅｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２９（５）：１０２４－１０２８，１０３０，１０３２を参照されたい）。一部の実施形態では、齧歯類は、前述の１２９系統および前述のＣ５７ＢＬ／６系統を混合したマウスである。特定の実施形態では、マウスは、前述の１２９系統の混合（すなわち、交雑）、または前述のＣ５７ＢＬ系統の混合、またはＣ５７ＢＬ系統および１２９系統の混合である。特定の実施形態では、当該マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６系統と１２９系統の混合である。特定の実施形態では、マウスは、ＶＧＦ１系統であり、これは、Ｃ５７ＢＬ／６および１２９の交雑であるＦ１Ｈ４系統としても知られる。他の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統、例えばＢＡＬＢ／ｃ系統である。一部の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統および別の前述の系統の混合である。
一部の実施形態では、齧歯類は、マウスである。一部の実施形態では、齧歯類は、Ｃ５７ＢＬ系統、例えば、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウスである。他の実施形態では、齧歯類は、１２９系統、例えば、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９／ＳｖＪａｅ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２からなる群から選択される１２９系統のマウスである（例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ １０：８３６；Ａｕｅｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２９（５）：１０２４－１０２８，１０３０，１０３２を参照されたい）。一部の実施形態では、齧歯類は、前述の１２９系統および前述のＣ５７ＢＬ／６系統を混合したマウスである。特定の実施形態では、マウスは、前述の１２９系統の混合（すなわち、交雑）、または前述のＣ５７ＢＬ系統の混合、またはＣ５７ＢＬ系統および１２９系統の混合である。特定の実施形態では、当該マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６系統と１２９系統の混合である。特定の実施形態では、マウスは、ＶＧＦ１系統であり、これは、Ｃ５７ＢＬ／６および１２９の交雑であるＦ１Ｈ４系統としても知られる。他の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統、例えばＢＡＬＢ／ｃ系統である。一部の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統および別の前述の系統の混合である。
【0050】
一部の実施形態では、齧歯類は、ラットである。特定の実施形態では、ラットは、Ｗｉｓｔａｒラット、ＬＥＡ系統、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ系統、Ｆｉｓｃｈｅｒ系統、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉから選択される。他の実施形態では、ラットは、Ｗｉｓｔａｒ、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉからなる群から選択される二つ以上の系統の混合である。
【0051】
Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に改変を含む齧歯類を作製する方法
内因性Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に改変を含む本明細書に提供される齧歯類は、様々な方法を使用して作製することができる。
内因性Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に改変を含む本明細書に提供される齧歯類は、様々な方法を使用して作製することができる。
【0052】
一部の実施形態では、改変は、遺伝子編集システム（「標的ゲノム編集」システムとしても知られる）を使用して、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子内に導入され得る。
一部の実施形態では、遺伝子編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、およびＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）から選択される。ＺＦＮはＣａｒｒｏｌｌ，Ｄ．（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１８８．４（２０１１）：７７３－７８２）で概説されており、ＴＡＬＥＮはＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１６１．１（２０１３）：２０－２７）で概説されており、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、遺伝子編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、およびＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）から選択される。ＺＦＮはＣａｒｒｏｌｌ，Ｄ．（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１８８．４（２０１１）：７７３－７８２）で概説されており、ＴＡＬＥＮはＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１６１．１（２０１３）：２０－２７）で概説されており、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0053】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子内に改変を導入するために使用される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、細菌ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）免疫システムに基づく方法である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、カスタマイズ可能な小さな非コードＲＮＡ（ガイドＲＮＡまたはｇＲＮＡ）により誘導されたゲノムＤＮＡの標的切断を可能にし、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）機構および相同性誘導型修復（ＨＤＲ）機構の両方による遺伝子改変をもたらす。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓおよび類似の遺伝子編集システムは、試薬およびプロトコルが容易に利用可能であり当技術分野で既知である。例示的なゲノム編集プロトコルは、Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ｄｏｕｄｎａ，ａｎｄ Ｐｒａｓｈａｎｔ Ｍａｌｉ，“ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（２０１６）（ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ：９７８－１－６２１８２１－３０－４）．およびＲａｎ，Ｆ．Ａｎｎ，ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２０１３），８（１１）：２２８１－２３０８）に記載されており、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0054】
一部の実施形態では、改変は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムおよび外因性ドナー核酸を使用して、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子内に導入される。一部の実施形態では、齧歯類ＥＳ細胞を使用してＣａｓヌクレアーゼを発現する、または齧歯類ＥＳ細胞を改変してＣａｓヌクレアーゼを発現する。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（別称ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（別称Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（別称ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（別称ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（別称ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（別称ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｕ１９６６、ならびにそれらのホモログまたは改変型からなる群から選択される。特定の実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼはＣａｓ９である。
【0055】
一部の実施形態では、外因性ドナー核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む。一部の実施形態では、外因性ドナー核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、外因性ドナー核酸は一本鎖である。一部の実施形態では、外因性ドナー核酸は、二本鎖である。一部の実施形態では、外因性ドナー核酸は、直線型である。一部の実施形態では、外因性ドナー核酸は、環状型である。一部の実施形態では、外因性ドナー核酸は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）である。例えば、Ｙｏｓｈｉｍｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．７：１０４３１、米国特許出願公開第２０１９／００３２１５５号および第２０１９／００３２１５６号を参照されたい（それらはすべて参照によりその全体が組み込まれている）。
【0056】
一部の実施形態では、外因性ドナー核酸は、約５０ヌクレオチド～約５ｋｂの長さ、約５０ヌクレオチド～約３ｋｂの長さ、または約５０～約１，０００ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、外因性ドナー核酸の長さは約４０～約２００ヌクレオチドである。例えば、外因性ドナー核酸は、約５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１１０、１１０～１２０、１２０～１３０、１３０～１４０、１４０～１５０、１５０～１６０、１６０～１７０、１７０～１８０、１８０～１９０または１９０～２００ヌクレオチドの長さとすることができる。一部の実施形態では、外因性ドナー核酸は、約５０～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、または９００～１０００ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、外因性ドナー核酸は約１～１．５、１．５～２、２～２．５、２．５～３、３～３．５、３．５～４、４～４．５、または４．５～５ｋｂの長さである。一部の実施形態では、外因性ドナー核酸は、５ｋｂ以下、４．５ｋｂ以下、４ｋｂ以下、３．５ｋｂ以下、３ｋｂ以下、２．５ｋｂ以下、２ｋｂ以下、１．５ｋｂ以下、１ｋｂ以下、９００ヌクレオチド以下、８００ヌクレオチド以下、７００ヌクレオチド以下、６００ヌクレオチド以下、５００ヌクレオチド以下、４００ヌクレオチド以下、３００ヌクレオチド以下、２００ヌクレオチド以下、１００ヌクレオチド以下、または５０ヌクレオチド以下の長さである。
【0057】
一部の実施形態では、外因性ドナー核酸は、約８０ヌクレオチド～約２００ヌクレオチドの長さであるｓｓＯＤＮである。一部の実施形態では、外因性ドナー核酸は、約８０ヌクレオチド～約３ｋｂの長さのｓｓＯＤＮである。一部の実施形態では、ｓｓＯＤＮは、それぞれ約４０ヌクレオチド～約６０ヌクレオチドの長さの相同アームを有する。一部の実施形態では、ｓｓＯＤＮは、それぞれ約３０ヌクレオチド～１００ヌクレオチドの長さの相同アームを有する。一部の実施形態では、相同アームは、各相同アームに同じ数のヌクレオチドを有する対称である。一部の実施形態では、相同アームは、各相同アームに異なる数のヌクレオチドを有する非対称である。
【0058】
一部の実施形態では、外因性ドナー核酸は、標的ゲノム座位で対象核酸配列を欠失させ、それを核酸挿入で置換するように設計される。一部の実施形態では、外因性ドナー核酸は、一つ以上のヌクレオチドの置換を導入するよう設計される。外因性ドナー核酸の例は、配列番号１３のヌクレオチド配列を有するｓｓＯＤＮである。
【0059】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムおよび外因性ドナー核酸は、齧歯類ＥＳ細胞において内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に改変を導入するために、齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞内に導入される。一部の実施形態では、齧歯類ＥＳ細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのいくつかの構成要素を既に発現している。特定の実施形態では、齧歯類ＥＳ細胞は、その全体が本明細書に組み込まれるＵＳ２０１９／００３２１５５Ａ１（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）に記載されるＣａｓ準備完了マウス胚性細胞である。
【0060】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、および／または外因性ドナー核酸は、任意の送達方法（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、または水力学的遺伝子送達（ＨＤＤ））および任意の投与経路を介して、細胞または非ヒト動物（例えば、齧歯類）内に導入される。
【0061】
一部の実施形態では、遺伝子編集構成要素（例えば、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、および／または外因性ドナー核酸）は、ＡＡＶ介在送達を介して送達される。例えば、米国特許出願公開第２０１６／０１５９４３６号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。複数のＡＡＶ血清型が特定されている。これらの血清型は、感染する細胞型が異なっており（すなわち指向性が異なる）、それにより特定細胞型への優先的形質導入が可能となる。ＣＮＳ組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が含まれる。心臓組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が含まれる。腎臓組織に対する血清型にはＡＡＶ２が含まれる。肺組織に対する血清型には、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、およびＡＡＶ９が含まれる。膵臓組織に対する血清型にはＡＡＶ８が含まれる。光受容体細胞に対する血清型には、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ８が含まれる。網膜色素上皮組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ８が含まれる。骨格筋組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が含まれる。肝臓組織に対する血清型としては、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９が挙げられるが、特にＡＡＶ８が挙げられる。
【0062】
一部の実施形態では、ＡＡＶの指向性は、シュードタイピングを介してさらに改良させてもよい。シュードタイピングは、カプシドと、異なるウイルス血清型由来のゲノムとを混合する方法である。例えば、ＡＡＶ２／８は、血清型８由来のカプシドにパッケージングされた血清型２のゲノムを含有するウイルスを示す。一部の実施形態では、シュードタイピングが為されたウイルスは、改善された形質導入効率、ならびに変化された指向性を呈する。一部の実施形態では、異なる血清型から誘導されたハイブリッドカプシドを使用してウイルスの指向性を変化させる。
【0063】
一部の実施形態では、肝臓の内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムおよびＡＡＶシステムを使用することによる改変のための標的とされる。
一部の実施形態では、肝臓特異的標的化は、肝臓に対する指向性を有するＡＡＶシステムによって達成される。特定の実施形態では、ＡＡＶシステムは、肝臓指向性を有する異なる血清型に由来するハイブリッドカプシド（例えば、肝臓指向性ＡＡＶ：ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９からのカプシドの任意の組み合わせ）を含むＡＡＶ８、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、およびハイブリッドＡＡＶ系統から選択される。
一部の実施形態では、肝臓特異的標的化は、肝臓に対する指向性を有するＡＡＶシステムによって達成される。特定の実施形態では、ＡＡＶシステムは、肝臓指向性を有する異なる血清型に由来するハイブリッドカプシド（例えば、肝臓指向性ＡＡＶ：ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９からのカプシドの任意の組み合わせ）を含むＡＡＶ８、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、およびハイブリッドＡＡＶ系統から選択される。
【0064】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ、および／または外因性ドナー核酸（例えば、ｓｓＯＤＮ）は、ＡＡＶ８を介して送達される。一部の実施形態では、Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ、および／または外因性ドナー核酸（例えば、ｓｓＯＤＮ）は、ＡＡＶ２／８を介して送達される。一部の実施形態では、Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ、および／または外因性ドナー核酸（例えば、ｓｓＯＤＮ）は、肝臓指向性を有するハイブリッドカプシドを含むＡＡＶ系統を介して送達される。
【0065】
一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子の改変は、遺伝子編集システムの少なくとも一つの構成要素の肝臓特異的発現を介して、肝臓に特異的に作製することができる。一部の実施形態では、肝臓特異的発現は、遺伝子編集システム構成要素の少なくとも一つの構成要素（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの場合：ｇＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、外因性ドナー核酸など）を肝臓特異的プロモーターに動作可能に連結することによって達成される。特定の実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、アルブミンプロモーターである。
【0066】
一部の実施形態では、特定の肝臓標的化は、遺伝子編集システムの構成要素の水力学的尾静脈注射によって促進される。水力学的尾静脈注射の方法は、Ｋｉｍ，Ｍｅｅ Ｊ．，ａｎｄ Ｎａｄａｖ Ａｈｉｔｕｖ．（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２０１３．２７９－２８９）に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0067】
一部の実施形態では、上述の実施形態のうちの一つ以上の組み合わせが、肝臓特異的改変を達成するために利用され、すなわち、（ｉ）肝臓指向性ＡＡＶシステム（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの一つ以上の構成要素または外因性ドナー核酸を送達するために、（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの一つ以上の構成要素または外因性ドナー核酸の肝臓特異的発現をもたらす肝臓特異的プロモーター、および（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの一つ以上の構成要素、および外因性ドナー核酸、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの一つ以上の構成要素と、外因性ドナー核酸とを担持する、核酸もしくはウイルスベクター、の水力学的尾静脈注射、の組み合わせである。
【0068】
一部の実施形態では、齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子の改変は、齧歯類のゲノム（すなわち、生殖系列ゲノム）内に導入される。これは、齧歯類ＥＳ細胞において齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子内に改変を導入することによって達成され、次いで、改変ＥＳ細胞（すなわち、改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子を有する齧歯類ＥＳ細胞）をドナー細胞として使用して、生殖系列ゲノムに改変を有する齧歯類を作製することができる。
【0069】
一部の実施形態では、改変は、上述のように、遺伝子編集システムを利用することによって、齧歯類ＥＳ細胞の齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子内に導入される。
一部の実施形態では、改変は、改変を含有する齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１核酸配列を担持する標的化ベクターの使用を介して、齧歯類ＥＳ細胞中の内因性Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子内に導入される。標的化ベクターは、改変含有齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１核酸配列に加えて、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１座位において、齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子配列に対して好適な長さで、かつ相同な隣接する核酸配列も含むことができ、これにより、変異含有齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１核酸配列の、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子内への相同な組換えおよび組み込みを媒介することができる。
一部の実施形態では、改変は、改変を含有する齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１核酸配列を担持する標的化ベクターの使用を介して、齧歯類ＥＳ細胞中の内因性Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子内に導入される。標的化ベクターは、改変含有齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１核酸配列に加えて、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１座位において、齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子配列に対して好適な長さで、かつ相同な隣接する核酸配列も含むことができ、これにより、変異含有齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１核酸配列の、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子内への相同な組換えおよび組み込みを媒介することができる。
【0070】
一部の実施形態では、齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子改変を含む核酸分子（例えば、挿入核酸）がベクター、好ましくはＤＮＡベクターへと挿入される。サイズに応じて、改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子配列を、ｃＤＮＡ源から直接クローニングすることができ、またはＧｅｎＢａｎｋから入手可能な公開されている配列に基づいてコンピュータにより設計することができる。別の方法として、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリは、齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子配列を提供することができる。齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子配列はまた、酵母人工染色体（ＹＡＣ）から単離、クローニング、および／または移転されてもよい。
【0071】
一部の実施形態では、挿入核酸は、選択可能なマーカー遺伝子（例えば、米国特許第８，６９７，８５１号、同第８，５１８，３９２号、および同第８，３５４，３８９号（これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる）に記載の選択可能なマーカー遺伝子を含有する自己欠失型カセット）も含有し、これらは、部位特異的組換え部位（例えば、ｌｏｘＰ、Ｆｒｔなど）に隣接する、またはこれらを含むことができる。選択可能なマーカー遺伝子を変異に隣接するベクター上に置いて、トランスフェクタントの容易な選択を可能にすることができる。
【0072】
一部の実施形態では、改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子配列を担持するＢＡＣベクターを、例えば、エレクトロポレーションによって齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞内に導入することができる。マウスＥＳ細胞とラットＥＳ細胞の両方が、共に当技術分野で説明されている。例えば、米国特許第７，５７６，２５９号、米国特許第７，６５９，４４２号、米国特許第７，２９４，７５４号、および米国特許出願公開第２００８－００７８０００Ａ１号（これらの全てが、参照により本明細書に組み込まれる）は、マウスＥＳ細胞および遺伝子改変されたマウスを作製するＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（商標）法を記載し、米国特許出願公開第２０１４／０２３５９３３Ａ１号および米国特許出願公開第２０１４／０３１０８２８Ａ１（これらの全てが、参照により本明細書に組み込まれる）は、ラットＥＳ細胞および遺伝子改変されたラットを作製する方法を記載する。
【0073】
レシピエント細胞における相同な組換えは、染色体ＤＮＡ内に破断を組み込み部位に導入することによって容易にすることができ、これは特定の組み込みの部位にある特定のヌクレアーゼを標的化することによって達成され得る。標的の座位においてＤＮＡ配列を識別するＤＮＡ結合タンパク質は、当技術分野で既知である。一部の実施形態では、標的配列中の特定の３－ヌクレオチド配列を認識する亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）が利用される。一部の実施形態では、転写活性化様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を、部位特異的なゲノム編集に採用してもよい。他の実施形態では、構成要素（Ｃａｓ９およびｔｒａｃｒＲＮＡ）と標的特異的ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とからなるＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）が利用される。
【0074】
一部の実施形態では、５’および３’相同アームに隣接する対象の核酸（例えば、導入される改変を含有する核酸）を担持する標的ベクターは、一つ以上の追加のベクターまたはｍＲＮＡを有する細胞内に導入される。一実施形態では、一つ以上の追化的なベクターまたはｍＲＮＡは、部位特異的ヌクレアーゼ（亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質、およびＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない）をコードするヌクレオチド配列を含有する。
【0075】
記載される標的化ベクターまたは遺伝子編集システムの使用のいずれかを介して、そのゲノム内に組み込まれた改変遺伝子配列を有するＥＳ細胞を選択することができる。選択後、陽性のＥＳクローンは、例えば、必要に応じて、自己欠失型カセットを除去するように改変することができる。次に、ゲノム内に組み込まれた改変を有するＥＳ細胞を、ドナーＥＳ細胞として、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（商標）法（例えば、米国特許第７，５７６，２５９号、同第７，６５９，４４２号、同第７，２９４，７５４号、および米国特許出願公開第２００８／００７８０００Ａ１号を参照）、または米国特許出願公開第２０１４／０２３５９３３Ａ１号および同第２０１４／０３１０８２８Ａ１号に記載の方法を用いることによって、前桑実期の胚（例えば、８細胞期胚）への注入に使用する。ドナーＥＳ細胞を含む胚を胚盤胞段階までインキュベートし、次に代理母へと移植して、完全にドナーＥＳ細胞に由来するＦ０齧歯類を産生する。変異対立遺伝子を有する齧歯類の仔は、変異配列または選択可能なマーカー遺伝子の存在を検出する対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．、上記）を使用して、尾切片から単離されたＤＮＡを遺伝子型解析により識別することができる。
【0076】
一部の実施形態では、改変は、齧歯類の生殖系列ゲノム内の代わりに、齧歯類の標的組織または器官の齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子内に導入される。
一部の実施形態では、改変は、齧歯類の肝臓の齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子内に導入される、すなわち、齧歯類の肝臓に特異的に導入される。用語「肝臓特異的」は、所望の結果（送達、発現、および／または標的改変）が、他の組織または器官と比較して、有意に多く（例えば、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、またはそれ以上）発生することを意味する。上述のように、下記のアプローチの一つ以上が、肝臓特異的改変を達成するために利用され得る：（ｉ）肝臓指向性ＡＡＶシステム（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの一つ以上の構成要素または外因性ドナー核酸を送達するために、（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの一つ以上の構成要素または外因性ドナー核酸の肝臓特異的発現をもたらす肝臓特異的プロモーター、および（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの一つ以上の構成要素、および外因性ドナー核酸、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの一つ以上の構成要素と、外因性ドナー核酸とを担持する、核酸もしくはウイルスベクター、の水力学的尾静脈注射。
一部の実施形態では、改変は、齧歯類の肝臓の齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子内に導入される、すなわち、齧歯類の肝臓に特異的に導入される。用語「肝臓特異的」は、所望の結果（送達、発現、および／または標的改変）が、他の組織または器官と比較して、有意に多く（例えば、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、またはそれ以上）発生することを意味する。上述のように、下記のアプローチの一つ以上が、肝臓特異的改変を達成するために利用され得る：（ｉ）肝臓指向性ＡＡＶシステム（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの一つ以上の構成要素または外因性ドナー核酸を送達するために、（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの一つ以上の構成要素または外因性ドナー核酸の肝臓特異的発現をもたらす肝臓特異的プロモーター、および（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの一つ以上の構成要素、および外因性ドナー核酸、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの一つ以上の構成要素と、外因性ドナー核酸とを担持する、核酸もしくはウイルスベクター、の水力学的尾静脈注射。
【0077】
繁殖の方法および作製された子孫
一部の実施形態では、本明細書に開示される、そのゲノムが内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に改変を含む（すなわち、改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子）第一の齧歯類を、第二の齧歯類と交配させ、そのゲノムが齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に改変を含む子孫齧歯類をもたらすことを含む方法が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子における改変は、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性が低下したＢ４ｇａｌｔ１タンパク質をコードする改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子をもたらす。一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子における改変は、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１タンパク質の３５２位に対応するアミノ酸位置でのＡｓｎのＳｅｒへの置換を含むＢ４ｇａｌｔ１タンパク質をコードする改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子をもたらす（すなわち、「Ｎ３５２Ｓノックイン」）；そのような実施形態では、方法は、そのゲノムがＮ３５２Ｓノックインを含む第一の齧歯類を、第二の齧歯類と交配させて、そのゲノムがＮ３５２Ｓノックインを含む子孫齧歯類を結果としてもたらすことを含む。繁殖（または「交配」または「交雑」）は、当技術分野で容易に入手可能なプロトコルに従って行うことができる。例えば、ＪｏＶＥ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ．Ｌａｂ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ Ｗｅａｎｉｎｇ，ＪｏＶＥ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，（２０１８）（ｖｉｄｅｏ ａｒｔｉｃｌｅ）；Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ Ｃｏｌｏｎｉｅｓ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｉｃｅ，Ａ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｍａｎｕａｌ，φ２００７ Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（すべては参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
一部の実施形態では、本明細書に開示される、そのゲノムが内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に改変を含む（すなわち、改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子）第一の齧歯類を、第二の齧歯類と交配させ、そのゲノムが齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に改変を含む子孫齧歯類をもたらすことを含む方法が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子における改変は、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性が低下したＢ４ｇａｌｔ１タンパク質をコードする改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子をもたらす。一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子における改変は、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１タンパク質の３５２位に対応するアミノ酸位置でのＡｓｎのＳｅｒへの置換を含むＢ４ｇａｌｔ１タンパク質をコードする改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子をもたらす（すなわち、「Ｎ３５２Ｓノックイン」）；そのような実施形態では、方法は、そのゲノムがＮ３５２Ｓノックインを含む第一の齧歯類を、第二の齧歯類と交配させて、そのゲノムがＮ３５２Ｓノックインを含む子孫齧歯類を結果としてもたらすことを含む。繁殖（または「交配」または「交雑」）は、当技術分野で容易に入手可能なプロトコルに従って行うことができる。例えば、ＪｏＶＥ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ．Ｌａｂ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ Ｗｅａｎｉｎｇ，ＪｏＶＥ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，（２０１８）（ｖｉｄｅｏ ａｒｔｉｃｌｅ）；Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ Ｃｏｌｏｎｉｅｓ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｉｃｅ，Ａ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｍａｎｕａｌ，φ２００７ Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（すべては参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【0078】
一部の実施形態では、そのゲノムが本明細書に開示される内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に改変を含む第一の齧歯類と、第二の齧歯類との間の交配から得られた齧歯類子孫が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子における改変は、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性が低下したＢ４ｇａｌｔ１タンパク質をコードする改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子をもたらす。一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子における改変は、Ｎ３５２Ｓノックインを含む；このような実施形態では、そのゲノムがＮ３５２Ｓノックインを含む第一の齧歯類と第二の齧歯類との間の交配から取得され、Ｎ３５２Ｓノックインを含む子孫が提供される。一部の実施形態では、子孫齧歯類は、齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子の改変についてヘテロ接合性である。一部の実施形態では、子孫齧歯類は、齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子の改変についてホモ接合性である。子孫は、交配で使用される第二の齧歯類から遺伝する他の望ましい表現型または遺伝子改変を有してもよい。
【0079】
齧歯類モデル
さらなる態様では、動物モデルとしての、内因性Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に改変を含む齧歯類の使用が本明細書に開示されており、これは、脂質代謝におけるＢ４ｇａｌｔ１の機能の解明を可能にし、代謝障害および心血管障害の治療においてＢ４ｇａｌｔ１を標的とする治療剤を試験および開発する機会を提供する。
さらなる態様では、動物モデルとしての、内因性Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に改変を含む齧歯類の使用が本明細書に開示されており、これは、脂質代謝におけるＢ４ｇａｌｔ１の機能の解明を可能にし、代謝障害および心血管障害の治療においてＢ４ｇａｌｔ１を標的とする治療剤を試験および開発する機会を提供する。
【0080】
一部の実施形態では、本明細書に記載される内因性Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に改変を含む齧歯類は、Ｂ４ｇａｌｔ１タンパク質の活性を阻害する薬剤を試験、スクリーニング、または特定する方法において使用される。方法の一部の実施形態では、齧歯類は、内因性Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に改変を含み、改変を伴わない野生型齧歯類とともに使用され、候補薬剤は、野生型齧歯類に投与される。改変を有する齧歯類および野生型齧歯類の両方を調べて、例えば、ＨＤＬ－Ｃ、ＬＤＬ－Ｃ、およびトリグリセリドのレベルなどの脂質プロファイルを測定する。薬剤投与後の野生型齧歯類からの、投与前の野生型齧歯類からの（または薬剤を投与されていない別の野生型齧歯類からの）、および内因性Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に改変を有する齧歯類からの測定値を互いに比較して、薬剤がＢ４ｇａｌｔ１タンパク質の活性を阻害するかどうかを判定する。例えば、内因性Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子における改変がＮ３５２Ｓノックインまたは機能喪失性変異である場合、投与前の野生型齧歯類（または薬剤を投与されていない別の野生型齧歯類と比較してＬＤＬ－Ｃレベルの低下をもたらす（すなわち、Ｎ３５２Ｓノックインまたは機能喪失性変異を有する齧歯類と同じ方向をもたらす）薬剤は、Ｂ４ｇａｌｔ１タンパク質の活性を阻害するとみなされる。一部の実施形態では、薬剤は、薬剤を投与されていない野生型齧歯類と比べて、薬剤を投与された野生型齧歯類における血清ＬＤＬ－Ｃレベルを少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、またはそれ以上減少させる。
【0081】
一部の実施形態では、内因性Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子における改変についてホモ接合性である齧歯類が使用される。一部の実施形態では、内因性Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子における改変についてヘテロ接合性である齧歯類が使用される。一部の実施形態では、内因性Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子における改変に対してホモ接合性の齧歯類と、内因性Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子における改変に対してヘテロ接合性の齧歯類の両方を、本検査で使用する。
【0082】
一部の実施形態では、内因性Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子齧歯類における改変を有する齧歯類はメスである。一部の実施形態では、内因性Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子における改変を有する齧歯類はオス齧歯類である。
【0083】
小分子化合物および大分子（例えば、抗体）の両方を含む、様々な候補薬剤を、本明細書に開示される齧歯類および方法を使用して試験することができる。一部の実施形態では、候補薬剤は、Ｂ４ｇａｌｔ１タンパク質（例えば、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１タンパク質）に特異的な抗体である。本記述は、以下の実施例によってさらに説明されており、これはいかなる方法でも制限していると解釈されるべきではない。すべての引用参考文献（本出願全体を通して引用される文献参照、発行特許、および公表された特許出願を含む）の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【0084】
以下の代表的な実施形態が提示される。
実施形態１
内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１座位で内因性齧歯類β４ガラクトトランスフェラーゼ１（Ｂ４ｇａｌｔ１）遺伝子に改変を含む、齧歯類。
実施形態１
内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１座位で内因性齧歯類β４ガラクトトランスフェラーゼ１（Ｂ４ｇａｌｔ１）遺伝子に改変を含む、齧歯類。
【0085】
実施形態２
改変が、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１タンパク質の３５２位に対応するアミノ酸位置でのＡｓｎのＳｅｒへの置換を含むＢ４ｇａｌｔ１タンパク質をコードする改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子をもたらす、実施形態１に記載の齧歯類。
改変が、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１タンパク質の３５２位に対応するアミノ酸位置でのＡｓｎのＳｅｒへの置換を含むＢ４ｇａｌｔ１タンパク質をコードする改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子をもたらす、実施形態１に記載の齧歯類。
【0086】
実施形態３
齧歯類がマウスであり、置換がマウスＢ４ｇａｌｔ１タンパク質のアミノ酸位置３５３にある、実施形態２に記載の齧歯類。
齧歯類がマウスであり、置換がマウスＢ４ｇａｌｔ１タンパク質のアミノ酸位置３５３にある、実施形態２に記載の齧歯類。
【0087】
実施形態４
齧歯類が、改変を伴わない野生型齧歯類と比較して、ＬＤＬ－Ｃのレベルの減少を呈する、実施形態２または３に記載の齧歯類。
齧歯類が、改変を伴わない野生型齧歯類と比較して、ＬＤＬ－Ｃのレベルの減少を呈する、実施形態２または３に記載の齧歯類。
【0088】
実施形態５
改変が、齧歯類のゲノムにある、実施形態１に記載の齧歯類。
実施形態６
齧歯類が、改変に対してホモ接合性である、実施形態２～５のいずれかに記載の齧歯類。
改変が、齧歯類のゲノムにある、実施形態１に記載の齧歯類。
実施形態６
齧歯類が、改変に対してホモ接合性である、実施形態２～５のいずれかに記載の齧歯類。
【0089】
実施形態７
改変が機能喪失性変異である、実施形態１に記載の齧歯類。
実施形態８
機能喪失性変異が、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子のコード配列の全部または一部に欠失をもたらす一つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む、実施形態７に記載の齧歯類。
改変が機能喪失性変異である、実施形態１に記載の齧歯類。
実施形態８
機能喪失性変異が、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子のコード配列の全部または一部に欠失をもたらす一つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む、実施形態７に記載の齧歯類。
【0090】
実施形態９
一つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換が、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子のエクソン２で発生する、実施形態８に記載の齧歯類。
一つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換が、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子のエクソン２で発生する、実施形態８に記載の齧歯類。
【0091】
実施形態１０
改変が、齧歯類のゲノムにある、実施形態７～９のいずれか一つに記載の齧歯類。
実施形態１１
改変が、齧歯類の標的組織または器官の内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に導入される、実施形態７～９のいずれか一つに記載の齧歯類。
改変が、齧歯類のゲノムにある、実施形態７～９のいずれか一つに記載の齧歯類。
実施形態１１
改変が、齧歯類の標的組織または器官の内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に導入される、実施形態７～９のいずれか一つに記載の齧歯類。
【0092】
実施形態１２
改変が、齧歯類の肝臓の内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に導入される、実施形態１１に記載の齧歯類。
改変が、齧歯類の肝臓の内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に導入される、実施形態１１に記載の齧歯類。
【0093】
実施形態１３
齧歯類が、マウスまたはラットである、実施形態１～２、または４～１２のいずれか一つに記載の齧歯類。
齧歯類が、マウスまたはラットである、実施形態１～２、または４～１２のいずれか一つに記載の齧歯類。
【0094】
実施形態１４
内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１座位で内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に改変を含む、単離された齧歯類細胞または組織。
内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１座位で内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に改変を含む、単離された齧歯類細胞または組織。
【0095】
実施形態１５
改変が、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１タンパク質の３５２位に対応するアミノ酸位置でのＡｓｎのＳｅｒへの置換を含むＢ４ｇａｌｔ１タンパク質をコードする改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子をもたらす、実施形態１４に記載の単離された齧歯類細胞または組織。
改変が、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１タンパク質の３５２位に対応するアミノ酸位置でのＡｓｎのＳｅｒへの置換を含むＢ４ｇａｌｔ１タンパク質をコードする改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子をもたらす、実施形態１４に記載の単離された齧歯類細胞または組織。
【0096】
実施形態１６
齧歯類細胞または組織がマウス細胞または組織であり、置換がマウスＢ４ｇａｌｔ１タンパク質のアミノ酸位置３５３にある、実施形態１５に記載の単離された齧歯類細胞または組織。
齧歯類細胞または組織がマウス細胞または組織であり、置換がマウスＢ４ｇａｌｔ１タンパク質のアミノ酸位置３５３にある、実施形態１５に記載の単離された齧歯類細胞または組織。
【0097】
実施形態１７
改変が機能喪失性変異である、実施形態１４に記載の単離された齧歯類細胞または組織。
改変が機能喪失性変異である、実施形態１４に記載の単離された齧歯類細胞または組織。
【0098】
実施形態１８
機能喪失性変異が、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子のコード配列の全部または一部に欠失をもたらす一つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む、実施形態１７に記載の単離された齧歯類細胞または組織。
機能喪失性変異が、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子のコード配列の全部または一部に欠失をもたらす一つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む、実施形態１７に記載の単離された齧歯類細胞または組織。
【0099】
実施形態１９
一つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換が、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子のエクソン２で発生する、実施形態１８に記載の単離された齧歯類細胞または組織。
一つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換が、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子のエクソン２で発生する、実施形態１８に記載の単離された齧歯類細胞または組織。
【0100】
実施形態２０
齧歯類細胞または組織が、マウス細胞または組織である、実施形態１４～１５、または１７～１９のいずれか一つに記載の単離された齧歯類細胞または組織。
齧歯類細胞または組織が、マウス細胞または組織である、実施形態１４～１５、または１７～１９のいずれか一つに記載の単離された齧歯類細胞または組織。
【0101】
実施形態２１
齧歯類細胞または組織が、ラット細胞または組織である、実施形態１４～１５、または１７～１９のいずれか一つに記載の単離された齧歯類細胞または組織。
齧歯類細胞または組織が、ラット細胞または組織である、実施形態１４～１５、または１７～１９のいずれか一つに記載の単離された齧歯類細胞または組織。
【0102】
実施形態２２
齧歯類細胞が、齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞である、実施形態１４～２１のいずれか一つに記載の単離された齧歯類細胞または組織。
齧歯類細胞が、齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞である、実施形態１４～２１のいずれか一つに記載の単離された齧歯類細胞または組織。
【0103】
実施形態２３
実施形態２２に記載の単離された齧歯類細胞を含む齧歯類胚。
実施形態２４
遺伝子改変齧歯類を作製する方法であって、
（ｉ）齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞の内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１座位で内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子内に改変を導入し、それによって改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子を含む改変齧歯類ＥＳ細胞を得ること、および
（ｉｉ）改変齧歯類ＥＳ細胞を使用して、遺伝子改変齧歯類を作製すること、を含む、方法。
実施形態２２に記載の単離された齧歯類細胞を含む齧歯類胚。
実施形態２４
遺伝子改変齧歯類を作製する方法であって、
（ｉ）齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞の内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１座位で内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子内に改変を導入し、それによって改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子を含む改変齧歯類ＥＳ細胞を得ること、および
（ｉｉ）改変齧歯類ＥＳ細胞を使用して、遺伝子改変齧歯類を作製すること、を含む、方法。
【0104】
実施形態２５
改変が、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１タンパク質の３５２位に対応するアミノ酸位置でのＡｓｎのＳｅｒへの置換を含むＢ４ｇａｌｔ１タンパク質をコードする改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子をもたらす、実施形態２４に記載の方法。
改変が、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１タンパク質の３５２位に対応するアミノ酸位置でのＡｓｎのＳｅｒへの置換を含むＢ４ｇａｌｔ１タンパク質をコードする改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子をもたらす、実施形態２４に記載の方法。
【0105】
実施形態２６
齧歯類がマウスであり、置換がマウスＢ４ｇａｌｔ１タンパク質のアミノ酸位置３５３にある、実施形態２５に記載の方法。
齧歯類がマウスであり、置換がマウスＢ４ｇａｌｔ１タンパク質のアミノ酸位置３５３にある、実施形態２５に記載の方法。
【0106】
実施形態２７
改変が機能喪失性変異である、実施形態２４に記載の方法。
実施形態２８
機能喪失性変異が、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子のコード配列の全部または一部に欠失をもたらす一つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む、実施形態２７に記載の方法。
改変が機能喪失性変異である、実施形態２４に記載の方法。
実施形態２８
機能喪失性変異が、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子のコード配列の全部または一部に欠失をもたらす一つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む、実施形態２７に記載の方法。
【0107】
実施形態２９
一つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換が、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子のエクソン２で発生する、実施形態２８に記載の方法。
一つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換が、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子のエクソン２で発生する、実施形態２８に記載の方法。
【0108】
実施形態３０
改変が、遺伝子編集システムを介して内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子内に導入される、実施形態２４～２９のいずれか一つに記載の方法。
改変が、遺伝子編集システムを介して内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子内に導入される、実施形態２４～２９のいずれか一つに記載の方法。
【0109】
実施形態３１
遺伝子編集システムが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである、実施形態３０に記載の方法。
遺伝子編集システムが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである、実施形態３０に記載の方法。
【0110】
実施形態３２
遺伝子編集システムが、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓ９酵素、および一本鎖オリゴデオキシ核酸分子（ｓｓＯＤＮ）を含む、実施形態３１に記載の方法。
遺伝子編集システムが、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓ９酵素、および一本鎖オリゴデオキシ核酸分子（ｓｓＯＤＮ）を含む、実施形態３１に記載の方法。
【0111】
実施形態３３
ガイドＲＮＡおよびｓｓＯＤＮが、齧歯類ＥＳ細胞内に導入され、齧歯類ＥＳ細胞がＣａｓ９酵素を発現する、実施形態３２に記載の方法。
ガイドＲＮＡおよびｓｓＯＤＮが、齧歯類ＥＳ細胞内に導入され、齧歯類ＥＳ細胞がＣａｓ９酵素を発現する、実施形態３２に記載の方法。
【0112】
実施形態３４
齧歯類組織の内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１座位で内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子内に改変を導入し、それによって遺伝子改変齧歯類を得ることを含む、遺伝子改変齧歯類を作製する方法。
齧歯類組織の内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１座位で内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子内に改変を導入し、それによって遺伝子改変齧歯類を得ることを含む、遺伝子改変齧歯類を作製する方法。
【0113】
実施形態３５
改変が、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１タンパク質の３５２位に対応するアミノ酸位置でのＡｓｎのＳｅｒへの置換を含むＢ４ｇａｌｔ１タンパク質をコードする改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子をもたらす、実施形態３４に記載の方法。
改変が、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１タンパク質の３５２位に対応するアミノ酸位置でのＡｓｎのＳｅｒへの置換を含むＢ４ｇａｌｔ１タンパク質をコードする改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子をもたらす、実施形態３４に記載の方法。
【0114】
実施形態３６
齧歯類がマウスであり、置換がマウスＢ４ｇａｌｔ１タンパク質のアミノ酸位置３５３にある、実施形態３５に記載の方法。
齧歯類がマウスであり、置換がマウスＢ４ｇａｌｔ１タンパク質のアミノ酸位置３５３にある、実施形態３５に記載の方法。
【0115】
実施形態３７
改変が機能喪失性変異である、実施形態３４に記載の方法。
実施形態３８
機能喪失性変異が、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子のコード配列の全部または一部に欠失をもたらす一つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む、実施形態３７に記載の方法。
改変が機能喪失性変異である、実施形態３４に記載の方法。
実施形態３８
機能喪失性変異が、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子のコード配列の全部または一部に欠失をもたらす一つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む、実施形態３７に記載の方法。
【0116】
実施形態３９
一つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換が、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子のエクソン２で発生する、実施形態３８に記載の方法。
一つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換が、内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子のエクソン２で発生する、実施形態３８に記載の方法。
【0117】
実施形態４０
改変が、遺伝子編集システムを介して内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子内に導入される、実施形態３４～３９のいずれか一つに記載の方法。
改変が、遺伝子編集システムを介して内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子内に導入される、実施形態３４～３９のいずれか一つに記載の方法。
【0118】
実施形態４１
遺伝子編集システムが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである、実施形態４０に記載の方法。
遺伝子編集システムが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである、実施形態４０に記載の方法。
【0119】
実施形態４２
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが、ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９酵素を含み、ガイドＲＮＡが、ＡＡＶシステムによって齧歯類内に送達される、実施形態４１に記載の方法。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが、ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９酵素を含み、ガイドＲＮＡが、ＡＡＶシステムによって齧歯類内に送達される、実施形態４１に記載の方法。
【0120】
実施形態４３
ＡＡＶシステムが、齧歯類の肝臓へのガイドＲＮＡの送達を標的とする、実施形態４２に記載の方法。
ＡＡＶシステムが、齧歯類の肝臓へのガイドＲＮＡの送達を標的とする、実施形態４２に記載の方法。
【0121】
実施形態４４
Ｃａｓ９酵素が、齧歯類内にガイドＲＮＡを導入する前に、齧歯類で発現される、実施形態４１～４３のいずれか一つに記載の方法。
Ｃａｓ９酵素が、齧歯類内にガイドＲＮＡを導入する前に、齧歯類で発現される、実施形態４１～４３のいずれか一つに記載の方法。
【0122】
実施形態４５
実施形態２４～４４のいずれか一つに記載の方法によって取得される齧歯類。
実施形態４６
Ｂ４ｇａｌｔ１の活性に対する化合物の効果を試験する方法であって、
実施形態１～１３のいずれか一つに記載の内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に改変を含む齧歯類を提供することと、
改変を伴わない野生型齧歯類を提供することと、
候補Ｂ４ｇａｌｔ１阻害化合物を野生型齧歯類に投与することと、
改変を有する齧歯類および野生型齧歯類を調べて、血清ＬＤＬ－Ｃレベルを測定することと、
化合物を投与した野生型齧歯類からの測定値、化合物の投与前の野生型齧歯類からの測定値、および改変を有する齧歯類からの測定値を比較して、候補化合物が、Ｂ４ｇａｌｔ１の活性を阻害するかどうかを決定することと、を含む、方法。
実施形態２４～４４のいずれか一つに記載の方法によって取得される齧歯類。
実施形態４６
Ｂ４ｇａｌｔ１の活性に対する化合物の効果を試験する方法であって、
実施形態１～１３のいずれか一つに記載の内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に改変を含む齧歯類を提供することと、
改変を伴わない野生型齧歯類を提供することと、
候補Ｂ４ｇａｌｔ１阻害化合物を野生型齧歯類に投与することと、
改変を有する齧歯類および野生型齧歯類を調べて、血清ＬＤＬ－Ｃレベルを測定することと、
化合物を投与した野生型齧歯類からの測定値、化合物の投与前の野生型齧歯類からの測定値、および改変を有する齧歯類からの測定値を比較して、候補化合物が、Ｂ４ｇａｌｔ１の活性を阻害するかどうかを決定することと、を含む、方法。
【0123】
実施形態４７
そのゲノムが内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に改変を含む第一の齧歯類を、第二の齧歯類と交配させることを含む、方法。
そのゲノムが内因性齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子に改変を含む第一の齧歯類を、第二の齧歯類と交配させることを含む、方法。
【0124】
実施形態４８
改変が、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性が低下したＢ４ｇａｌｔ１タンパク質をコードする改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子をもたらす、実施形態４７に記載の方法。
改変が、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性が低下したＢ４ｇａｌｔ１タンパク質をコードする改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子をもたらす、実施形態４７に記載の方法。
【0125】
実施形態４９
改変が、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１タンパク質の３５２位に対応するアミノ酸位置でのＡｓｎのＳｅｒへの置換を含むＢ４ｇａｌｔ１タンパク質をコードする改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子をもたらす、実施形態４７に記載の方法。
改変が、ヒトＢ４ＧＡＬＴ１タンパク質の３５２位に対応するアミノ酸位置でのＡｓｎのＳｅｒへの置換を含むＢ４ｇａｌｔ１タンパク質をコードする改変齧歯類Ｂ４ｇａｌｔ１遺伝子をもたらす、実施形態４７に記載の方法。
【0126】
実施形態５０
実施形態４７～４９のいずれか一つに記載の方法から取得した子孫であって、そのゲノム中に改変を含む、子孫。
実施形態４７～４９のいずれか一つに記載の方法から取得した子孫であって、そのゲノム中に改変を含む、子孫。
【実施例】
【0127】
以下の実施例は、本明細書に請求される組成物、および／または方法がどのようになされて評価されるのかに関して、当業者に完全な開示および説明を提供するように示されており、単に例示的であることを意図しており、本開示を限定することを意図していない。
【0128】
実施例１ Ｎ３５２Ｓ Ｋ／Ｉマウスの生成および特徴付け
Ｎ３５２Ｓ Ｋ／Ｉマウスの設計および生成
Ｂ４ｇａｌｔ１ ｐ．Ｎ３５３Ｓ変異マウスを作製するために、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９遺伝子編集技術を使用した。簡潔に述べると、３５ｕｇの合成されたｓｓＯＤＮ、２．５ｕｇの合成されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、および５ｕｇのＣａｓ９タンパク質を、１００％Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ（ＶＧＢ６）マウス胚性幹細胞（ＥＳＣ）にエレクトロポレーションした。ｓｓＯＤＮの配列は、ＡＴＧＣＴＧＴＡＧＴＡＧＧＧＡＧＧＴＧＴＣＧＡＡＴＧＡＴＣＣＧＧＣＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＣＡＡＧＡＡＡＡＡＴＧＡＧＣＣＣＡｇＴＣＣｃＣＡＧＡＧＧＴＡＣＧＴＣＣＴＣＴＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＣＣＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＡＴＧＴＴＡＧＡＴＴＴＡＴＴＴである（配列番号１３、より低い場合のヌクレオチドは、標的ＥＳクローンにおけるｐ．Ｎ３５３Ｓおよびｐ．Ｐ３５４Ｐ非同義変化を引き起こす点変異である）。ｇＲＮＡの配列は、ＧＡＧＧＡＣＧＴＡＣＣＴＣＴＧＡＧＧＡＴｔｇｇである（配列番号１１、より低い場合のヌクレオチドはＰＡＭ配列である）。標的化細胞を、ＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲアッセイでスクリーニングし、次にＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒアルビノマウス由来の８細胞胚に顕微注入し、１００％標的細胞由来のＦ０ ＶｅｌｏｃｉＭｉｃｅ（商標）を得た（Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１）：９１－９９）。Ｆ０マウスをＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃに１回交配し、１００％ Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃの遺伝的背景で標的マウスを生成した。その後、ホモ接合性に交配し、全期間にわたってＲｅｇｅｎｅｒｏｎの動物施設で維持した。すべての実験で対照として使用された野生型マウスも、１００％ Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃであった。
Ｎ３５２Ｓ Ｋ／Ｉマウスの設計および生成
Ｂ４ｇａｌｔ１ ｐ．Ｎ３５３Ｓ変異マウスを作製するために、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９遺伝子編集技術を使用した。簡潔に述べると、３５ｕｇの合成されたｓｓＯＤＮ、２．５ｕｇの合成されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、および５ｕｇのＣａｓ９タンパク質を、１００％Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ（ＶＧＢ６）マウス胚性幹細胞（ＥＳＣ）にエレクトロポレーションした。ｓｓＯＤＮの配列は、ＡＴＧＣＴＧＴＡＧＴＡＧＧＧＡＧＧＴＧＴＣＧＡＡＴＧＡＴＣＣＧＧＣＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＣＡＡＧＡＡＡＡＡＴＧＡＧＣＣＣＡｇＴＣＣｃＣＡＧＡＧＧＴＡＣＧＴＣＣＴＣＴＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＣＣＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＡＴＧＴＴＡＧＡＴＴＴＡＴＴＴである（配列番号１３、より低い場合のヌクレオチドは、標的ＥＳクローンにおけるｐ．Ｎ３５３Ｓおよびｐ．Ｐ３５４Ｐ非同義変化を引き起こす点変異である）。ｇＲＮＡの配列は、ＧＡＧＧＡＣＧＴＡＣＣＴＣＴＧＡＧＧＡＴｔｇｇである（配列番号１１、より低い場合のヌクレオチドはＰＡＭ配列である）。標的化細胞を、ＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲアッセイでスクリーニングし、次にＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒアルビノマウス由来の８細胞胚に顕微注入し、１００％標的細胞由来のＦ０ ＶｅｌｏｃｉＭｉｃｅ（商標）を得た（Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１）：９１－９９）。Ｆ０マウスをＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃに１回交配し、１００％ Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃの遺伝的背景で標的マウスを生成した。その後、ホモ接合性に交配し、全期間にわたってＲｅｇｅｎｅｒｏｎの動物施設で維持した。すべての実験で対照として使用された野生型マウスも、１００％ Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃであった。
【0129】
血漿収集
マウスは、定期的な固形飼料食餌を摂食し、１３週齢で採血した（メスＷＴ＝１４、Ｈｅｔ＝１６、ＨＯ＝１６；オスＷＴ＝１５、Ｈｅｔ＝１８、ＨＯ＝１４）。マウスを一晩絶食し、その後４．５％イソフルランで麻酔した。ペダル反射の欠如を確認した後、眼窩後方の洞穿刺（ｒｅｔｒｏ－ｏｒｂｉｔａｌ ｓｉｎｕｓ ｔａｐ）を介して１５０～２００ｕｌの全血を採取し、Ｋ３ ＥＤＴＡ（Ｓｔａｒｓｔｅｄｔ）で被覆され、プロテアーゼ（Ｒｏｃｈｅ ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｍｉｎｉ ＥＤＴＡ Ｆｒｅｅ）およびＤＰＰ－４阻害剤を含有する血漿収集管に直ちに移した。血漿をエッペンドルフ管に収集し、－８０°Ｃで保存した。
マウスは、定期的な固形飼料食餌を摂食し、１３週齢で採血した（メスＷＴ＝１４、Ｈｅｔ＝１６、ＨＯ＝１６；オスＷＴ＝１５、Ｈｅｔ＝１８、ＨＯ＝１４）。マウスを一晩絶食し、その後４．５％イソフルランで麻酔した。ペダル反射の欠如を確認した後、眼窩後方の洞穿刺（ｒｅｔｒｏ－ｏｒｂｉｔａｌ ｓｉｎｕｓ ｔａｐ）を介して１５０～２００ｕｌの全血を採取し、Ｋ３ ＥＤＴＡ（Ｓｔａｒｓｔｅｄｔ）で被覆され、プロテアーゼ（Ｒｏｃｈｅ ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｍｉｎｉ ＥＤＴＡ Ｆｒｅｅ）およびＤＰＰ－４阻害剤を含有する血漿収集管に直ちに移した。血漿をエッペンドルフ管に収集し、－８０°Ｃで保存した。
【0130】
試料を、ＡＤＶＩＡ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＸＰＴ（シーメンス）を使用してアッセイした。肝臓脂質特性は、以下の試薬を含有する：アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）－（シーメンスＲＥＦ ０３０３６９２６）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）－（シーメンスＲＥＦ ０７４９９７１８）、コレステロール＿２（ＣＨＯＬ＿２）－（シーメンスＲＥＦ １０３７６５０１）、直接ＨＤＬコレステロール（Ｄ－ＨＤＬ）－（シーメンスＲＥＦ ０７５１１９４７）、ＬＤＬコレステロール直接（ＤＬＤＬ）－（シーメンスＲＥＦ ０９７９３２４８）、非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）－（和光９９９－３４６９１、９９５－３４７９１、９９１－３４８９１、９９３－３５１９１）、トリグリセリド＿２（ＴＲＩＧ＿２）－（シーメンスＲＥＦ １０３３５８９２）。試料を、アナライザーに充填し、試薬の混合、アッセイのタイミング、吸光度および濃度計算を、アナライザーによって行った。統計量は、Ｓｉｄａｋの多重比較検定（Ｐｒｉｓｍ）を用いた二元配置ＡＮＯＶＡを使用して計算された。
【0131】
図２Ａ～２Ｂで示すように、野生型マウスと比較して、オスのマウスおよびメスのマウスの両方でヘテロ接合性およびホモ接合性Ｎ３５２ＳノックインにおいてＬＤＬ－Ｃレベルの減少が観察され、一方でヘテロ接合性またはホモ接合性Ｎ３５２Ｓノックインマウスおよび野生型マウスの間でＨＤＬ－Ｃ、トリグリセリド、コレステロールまたは非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）のレベルに関して明白な差異は観察されなかった。さらに、ヘテロ接合性またはホモ接合性のＮ３５２Ｓノックインマウスと野生型マウスとの間で、ＡＬＴまたはＡＳＴのレベルについて有意差は観察されなかった。
【0132】
実施例２ Ｂ４ｇａｌｔ１肝臓ノックアウトマウスの生成および特徴付け
脂質代謝におけるＢ４ＧＡＬＴ１の役割をさらに理解するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９インビボツールボックスを利用して、肝臓におけるマウスオルソログ（Ｂ４ｇａｌｔ１）をノックアウトした。簡潔に述べると、Ｃａｓ９酵素を構成的に発現する成体マウスにＡＡＶ８を形質導入し、Ｂ４ｇａｌｔ１のエクソン２を標的とするｇＲＮＡの肝臓特異的送達を達成した（以下の方法を参照されたい）。このアプローチは、脾臓におけるＢ４ｇａｌｔ１のおよそ２％の遺伝子編集と比較して、肝臓におけるＢ４ｇａｌｔ１の５０％の遺伝子編集をもたらした（図３Ａ、３Ｂ）。その結果、肝臓におけるＢ４ｇａｌｔ１ ｍＲＮＡレベルの５０％の減少が観察された（図３Ｃ）、脾臓におけるｍＲＮＡの変化はなかった（データは示さず）。次いで、循環ＬＤＬ－Ｃレベルを、ウイルス形質導入から２週間目で開始し、１２週間の試験期間を通して測定した。ＬＤＬ－Ｃの全体的な５０％の減少は、試験の全期間中に検出された（図３Ｄ；２週ｐ＜０．０００１；４週ｐ＜０．０１；８週ｐ＜０．００００１；１２週ｐ＜０．０１）。同時に、循環ＡＳＴ酵素の増加傾向も経時的に観察され、ＨＤＬ－Ｃまたは総コレステロールの有意な変化は観察されなかった（図３Ｅ）。ＬＤＬ－Ｃレベルの減少は、Ｂ４ｇａｌｔ１のエクソン２に対して常に設計される二つの他の独立したｇＲＮＡを使用することによって確認された（図４Ａ～４Ｊ）。
脂質代謝におけるＢ４ＧＡＬＴ１の役割をさらに理解するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９インビボツールボックスを利用して、肝臓におけるマウスオルソログ（Ｂ４ｇａｌｔ１）をノックアウトした。簡潔に述べると、Ｃａｓ９酵素を構成的に発現する成体マウスにＡＡＶ８を形質導入し、Ｂ４ｇａｌｔ１のエクソン２を標的とするｇＲＮＡの肝臓特異的送達を達成した（以下の方法を参照されたい）。このアプローチは、脾臓におけるＢ４ｇａｌｔ１のおよそ２％の遺伝子編集と比較して、肝臓におけるＢ４ｇａｌｔ１の５０％の遺伝子編集をもたらした（図３Ａ、３Ｂ）。その結果、肝臓におけるＢ４ｇａｌｔ１ ｍＲＮＡレベルの５０％の減少が観察された（図３Ｃ）、脾臓におけるｍＲＮＡの変化はなかった（データは示さず）。次いで、循環ＬＤＬ－Ｃレベルを、ウイルス形質導入から２週間目で開始し、１２週間の試験期間を通して測定した。ＬＤＬ－Ｃの全体的な５０％の減少は、試験の全期間中に検出された（図３Ｄ；２週ｐ＜０．０００１；４週ｐ＜０．０１；８週ｐ＜０．００００１；１２週ｐ＜０．０１）。同時に、循環ＡＳＴ酵素の増加傾向も経時的に観察され、ＨＤＬ－Ｃまたは総コレステロールの有意な変化は観察されなかった（図３Ｅ）。ＬＤＬ－Ｃレベルの減少は、Ｂ４ｇａｌｔ１のエクソン２に対して常に設計される二つの他の独立したｇＲＮＡを使用することによって確認された（図４Ａ～４Ｊ）。
【0133】
最後に、ＬＤＬ－Ｃに見られる減少がＢ４ｇａｌｔ１特異的アブレーションによって決定されたことを確認するために、第二の独立した遺伝子の肝臓特異的ノックアウトであるＣｆｂ（補体因子Ｂをコードする）が同時に生成された。Ｃｆｂは、肝臓におけるその高い発現と、そうではあるがＬＤＬ－Ｃおよびコレステロール代謝における機能はないことが理由で対照として選択された。この結果、脾臓における＜１％の編集と比較して、肝臓におけるＣｆｂのおよそ５０％の編集率がもたらされ、Ｃｆｂ肝臓発現の５０％の減少がもたらされた。予想通り、ＬＤＬ－ＣレベルはＣｆｂ肝臓ノックアウトの影響を受けなかった。さらに、このアプローチにより、Ｃａｓ９構成的発現およびウイルス感染から起こり得る任意の副次的効果を除外することが可能となった。経時的なＣｆｂ対照肝臓ノックアウトにおけるＬＤＬ－Ｃレベルの任意の変動は最小限であり、主にインビボ操作の固有の変動性によるものであった（図３Ｄおよび図４Ａ～４Ｊ）。
【0134】
これらの結果は、哺乳類系におけるｂ４ｇａｌｔ１とＬＤＬ－Ｃ代謝との間の機能的リンクを支持する。
方法
Ｃａｓ９ ｍＥＳＣの生成
ｍＥＳＣ（５０％ Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃおよび５０％ １２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃ）の標的化を、前述の方法を使用して行った（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００３．２１（６）：ｐ．６５２－９）。簡潔に述べると、Ｒ２６ ＢＡＣ（ＢＡＣ＿ＥＳｒ２－４４５ｂ１＿ｓｆｉ＿１）を改変して標的化ベクターを作製し、Ｒ２６イントロンワン（ｉｎｔｒｏｎ ｏｎｅ）の一部を、Ｐ２Ａ ＧＦＰを有するＣａｓ９が後に続くＬｏｘＰ部位に隣接するタンデムポリアデニル化シグナルを有するネオマイシン選択（アミノ３’－グリコシルホスホトランスフェラーゼ）を含有するカセットで置換し、転写物をｍＥＳＣのＲ２６プロモーターによって駆動できるようにした。次いで、直線化改変ＢＡＣを、ｍＥＳＣにエレクトロポレーションして、改変ＢＡＣからの標的化アームを利用して、Ｒ２６座位で相同な組換えを駆動した。陽性形質転換体を、ネオマイシン耐性について選択した。トランスジェニック挿入は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）に基づいて標的化組換えと区別された。標的化が確認されたら、クローンをＣｒｅリコンビナーゼでエレクトロポレーションして、ブロッキングカセットを切除し、活性対立遺伝子を生成した。
方法
Ｃａｓ９ ｍＥＳＣの生成
ｍＥＳＣ（５０％ Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃおよび５０％ １２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃ）の標的化を、前述の方法を使用して行った（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００３．２１（６）：ｐ．６５２－９）。簡潔に述べると、Ｒ２６ ＢＡＣ（ＢＡＣ＿ＥＳｒ２－４４５ｂ１＿ｓｆｉ＿１）を改変して標的化ベクターを作製し、Ｒ２６イントロンワン（ｉｎｔｒｏｎ ｏｎｅ）の一部を、Ｐ２Ａ ＧＦＰを有するＣａｓ９が後に続くＬｏｘＰ部位に隣接するタンデムポリアデニル化シグナルを有するネオマイシン選択（アミノ３’－グリコシルホスホトランスフェラーゼ）を含有するカセットで置換し、転写物をｍＥＳＣのＲ２６プロモーターによって駆動できるようにした。次いで、直線化改変ＢＡＣを、ｍＥＳＣにエレクトロポレーションして、改変ＢＡＣからの標的化アームを利用して、Ｒ２６座位で相同な組換えを駆動した。陽性形質転換体を、ネオマイシン耐性について選択した。トランスジェニック挿入は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）に基づいて標的化組換えと区別された。標的化が確認されたら、クローンをＣｒｅリコンビナーゼでエレクトロポレーションして、ブロッキングカセットを切除し、活性対立遺伝子を生成した。
【0135】
マウス産生
Ｃａｓ９ ｍＥＳＣを８細胞胚に注入し、１００％ＥＳ由来Ｆ０マウスを生成した（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００３．２１（６）：ｐ．６５２－９；Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００７．２５（１）：ｐ．９１－９）。注入された８細胞胚を代理母に移し、所望の挿入を担持する生仔を作製した。代理母における妊娠時に、注入された胚は、検出可能な宿主胚の寄与を担持しないＦ０マウスを産生する。完全ｍＥＳＣ由来マウスは、概して正常で、健康で、繁殖可能であった。全ての動物実験は、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎの動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＡＣＵＣ）のガイドライン従って実施した。
Ｃａｓ９ ｍＥＳＣを８細胞胚に注入し、１００％ＥＳ由来Ｆ０マウスを生成した（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００３．２１（６）：ｐ．６５２－９；Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００７．２５（１）：ｐ．９１－９）。注入された８細胞胚を代理母に移し、所望の挿入を担持する生仔を作製した。代理母における妊娠時に、注入された胚は、検出可能な宿主胚の寄与を担持しないＦ０マウスを産生する。完全ｍＥＳＣ由来マウスは、概して正常で、健康で、繁殖可能であった。全ての動物実験は、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎの動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＡＣＵＣ）のガイドライン従って実施した。
【0136】
ガイドＲＮＡの設計
ガイドＲＮＡを、ＣＲＩＳＰＯＲおよびＢＬＡＴ（Ｋｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，２００２．１２（６）：ｐ．９９６－１００６；Ｋｅｎｔ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，２００２．１２（４）：ｐ．６５６－６４；Ｈａｅｕｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ，２０１６．１７（１）：ｐ．１４８）を参照して、ＵＣＳＣ（ＮＣＢＩ３７／ｍｍ９）を使用して設計した。Ｃａｓ９ ＫＯガイドは、Ｂ４ｇａｌｔ１エクソン２：Ｂ４ｇａｌｔ１＿ｍＧＵ１；ＴＡＴＴＡＡＡＧＴＣＡＡＴＣＡＧＣＡＴＧ（配列番号７）をｃｈｒ４：４０７７０６８１－４０７７０７００で、 Ｂ４ｇａｌｔ１＿ｍＧＵ３；ＧＧＧＣＧＧＣＣＧＴＴＡＣＴＣＣＣＣＣＡ（配列番号８）を ｍｓＣｈｒ４：４０７７０６１２－４０７７０６３１で、およびＢ４ｇａｌｔ１＿ｍＧＵ５；ＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧ（配列番号９）をｍｓＣｈｒ４：４０７７０５７５－４０７７０５９４で、標的とするように設計された。さらに、Ｃｆｂを対照として選択し、Ｃａｓ９ ＫＯガイドを、ＧＡＧＣＧＣＡＡＣＴＣＣＡＧＴＧＣＴＴＧ（配列番号１０）をｍｓＣｈｒ１７：３４９９８８８６－３４９９８９０５で標的とするように設計した。
ガイドＲＮＡを、ＣＲＩＳＰＯＲおよびＢＬＡＴ（Ｋｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，２００２．１２（６）：ｐ．９９６－１００６；Ｋｅｎｔ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，２００２．１２（４）：ｐ．６５６－６４；Ｈａｅｕｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ，２０１６．１７（１）：ｐ．１４８）を参照して、ＵＣＳＣ（ＮＣＢＩ３７／ｍｍ９）を使用して設計した。Ｃａｓ９ ＫＯガイドは、Ｂ４ｇａｌｔ１エクソン２：Ｂ４ｇａｌｔ１＿ｍＧＵ１；ＴＡＴＴＡＡＡＧＴＣＡＡＴＣＡＧＣＡＴＧ（配列番号７）をｃｈｒ４：４０７７０６８１－４０７７０７００で、 Ｂ４ｇａｌｔ１＿ｍＧＵ３；ＧＧＧＣＧＧＣＣＧＴＴＡＣＴＣＣＣＣＣＡ（配列番号８）を ｍｓＣｈｒ４：４０７７０６１２－４０７７０６３１で、およびＢ４ｇａｌｔ１＿ｍＧＵ５；ＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧ（配列番号９）をｍｓＣｈｒ４：４０７７０５７５－４０７７０５９４で、標的とするように設計された。さらに、Ｃｆｂを対照として選択し、Ｃａｓ９ ＫＯガイドを、ＧＡＧＣＧＣＡＡＣＴＣＣＡＧＴＧＣＴＴＧ（配列番号１０）をｍｓＣｈｒ１７：３４９９８８８６－３４９９８９０５で標的とするように設計した。
【0137】
ウイルス粒子の生成
ガイドＲＮＡ配列を、標準的なライゲーションによって適切なＡＡＶ骨格にクローニングした。ＡＡＶ８ベクターは、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって作製された。トランスフェクションは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ＭＡＸ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して行った。細胞は、アデノウイルスヘルパー遺伝子をコードする三つのプラスミド、ＡＡＶ２ ｒｅｐおよびＡＡＶ８キャップ遺伝子、ならびにＡＡＶ２末端逆位配列（ＩＴＲ）に隣接した導入遺伝子を含有する組換えＡＡＶゲノムでトランスフェクトされた。ウイルスを含有する培地を収集し、０．２μｍのＰＥＳ膜（Ｎａｌｇｅｎｅ）を通して濾過した。ウイルスは、一連の遠心分離工程または密度勾配超遠心分離のいずれかにより精製された。
ガイドＲＮＡ配列を、標準的なライゲーションによって適切なＡＡＶ骨格にクローニングした。ＡＡＶ８ベクターは、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって作製された。トランスフェクションは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ＭＡＸ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して行った。細胞は、アデノウイルスヘルパー遺伝子をコードする三つのプラスミド、ＡＡＶ２ ｒｅｐおよびＡＡＶ８キャップ遺伝子、ならびにＡＡＶ２末端逆位配列（ＩＴＲ）に隣接した導入遺伝子を含有する組換えＡＡＶゲノムでトランスフェクトされた。ウイルスを含有する培地を収集し、０．２μｍのＰＥＳ膜（Ｎａｌｇｅｎｅ）を通して濾過した。ウイルスは、一連の遠心分離工程または密度勾配超遠心分離のいずれかにより精製された。
【0138】
遠心分離による精製については、ウイルスを含有する培地を、前述のようにＰＥＧ沈殿により濃縮した（Ａｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１６．３（２））。ペレットをＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再懸濁し、１０，０００ ＲＣＦで遠心分離することによってさらに精製した。上清を移し、ＡＡＶを超遠心分離機で１４９，６００ ＲＣＦで３時間１０°Ｃでさらにペレット化した。ＡＡＶ含有ペレットをＰＢＳ中に再懸濁し、遠心分離により精製し、０．２２μｍの酢酸セルロース膜（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を通して濾過した。
【0139】
イオジキサノール勾配分離による精製のために、培地を接線流濾過により濃縮し、イオジキサノール勾配に装填した。イオジキサノール溶液および勾配を、前述のわずかな改変を用いて調製した（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，１９９９．６（６）：ｐ．９７３－８５）勾配を１４９，６００ ＲＣＦで超遠心分離機で１４時間遠心分離した。ＡＡＶ含有画分を抽出し、緩衝液を、Ｚｅｂａスピン脱塩カラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、０．００１％プルロニック（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を有するＰＢＳに交換した。
【0140】
尾静脈注射
尾部の基部の静脈に２７ゲージの針を挿入し、１００μＬ中およそ２×１０１１のウイルスゲノムを注射することによって、側部尾静脈に注入した。
尾部の基部の静脈に２７ゲージの針を挿入し、１００μＬ中およそ２×１０１１のウイルスゲノムを注射することによって、側部尾静脈に注入した。
【0141】
アンプリコンライブラリ調製
肝臓および脾臓の生検を、治療当たり３～５匹の試験動物から採取し（ＡＡＶ Ｂ４ｇａｌｔ１ ＣＲ１－５；非関連対照）、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）をプロテイナーゼＫベースの溶解緩衝液を使用して抽出した。標的特異的オリゴを、プライマー溶解温度（Ｔｍ）が６０～６５℃である３５０ｂｐの最大アンプリコンサイズを生成するように設計した（２１～２７塩基対、ｂｐ）。イルミナアダプターを標的特異的オリゴに加え、完全配列をＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）に注文した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、各ｇＤＮＡ試料上で完了した。簡潔に述べると、各反応において、製造業者の仕様書に従い、４ナノグラム（ｎｇ）のｇＤＮＡをＩＤＴオリゴ、Ｑ５ポリメラーゼ（＃Ｍ０４９１、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、１０ｕＭ ｄＮＴＰ、緩衝液、および水と組み合わせた。次に、増幅産物を１：１００に希釈し、ＰＣＲバーコード化反応に使用して、最終シーケンシングライブラリを作成した。各バーコード化反応は、単一の増幅された標的、ならびに固有のイルミナ特異的バーコードおよびインデックスを有するフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含有した。ＰＣＲの各プレートを等容量でプールし、その後、製造業者の指示に従って、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ試薬（＃Ａ６３８８１、Ｂｅｃｋｍａｎｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して単一管で精製した。最終ライブラリ濃度は、Ｑｕｂｉｔ蛍光光度計（＃Ｑ３２８６６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して測定された。調製されたライブラリの四つのナノモルを、２×３００リードキット（＃ＭＳ－１０２－３００３、イルミナ）を利用して製造業者の指示に従ってイルミナＭｉＳｅｑに装填した。
肝臓および脾臓の生検を、治療当たり３～５匹の試験動物から採取し（ＡＡＶ Ｂ４ｇａｌｔ１ ＣＲ１－５；非関連対照）、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）をプロテイナーゼＫベースの溶解緩衝液を使用して抽出した。標的特異的オリゴを、プライマー溶解温度（Ｔｍ）が６０～６５℃である３５０ｂｐの最大アンプリコンサイズを生成するように設計した（２１～２７塩基対、ｂｐ）。イルミナアダプターを標的特異的オリゴに加え、完全配列をＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）に注文した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、各ｇＤＮＡ試料上で完了した。簡潔に述べると、各反応において、製造業者の仕様書に従い、４ナノグラム（ｎｇ）のｇＤＮＡをＩＤＴオリゴ、Ｑ５ポリメラーゼ（＃Ｍ０４９１、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、１０ｕＭ ｄＮＴＰ、緩衝液、および水と組み合わせた。次に、増幅産物を１：１００に希釈し、ＰＣＲバーコード化反応に使用して、最終シーケンシングライブラリを作成した。各バーコード化反応は、単一の増幅された標的、ならびに固有のイルミナ特異的バーコードおよびインデックスを有するフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含有した。ＰＣＲの各プレートを等容量でプールし、その後、製造業者の指示に従って、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ試薬（＃Ａ６３８８１、Ｂｅｃｋｍａｎｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して単一管で精製した。最終ライブラリ濃度は、Ｑｕｂｉｔ蛍光光度計（＃Ｑ３２８６６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して測定された。調製されたライブラリの四つのナノモルを、２×３００リードキット（＃ＭＳ－１０２－３００３、イルミナ）を利用して製造業者の指示に従ってイルミナＭｉＳｅｑに装填した。
【0142】
配列マッピングおよび特徴付け
バーコード化された試料を、個々のリードに脱多重化した（ＦＡＳＴＱ形式）。次に、各ＦＡＳＴＱファイルのフォワードリードおよびリバースリードを、ＰＥＡＲプログラムを使用してマージした（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１４年３月１日；３０（５）：６１４－６２０に記載される）。マージされたリードを、Ｂｏｗｔｉｅ２プログラム（Ｌａｎｇｍｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１２年３月４日；９（４）：３５７－３５９に記載される）を使用して、ハツカネズミゲノムバージョン９（ｍｍ９）にマッピングした。各試料を、予想されるガイド切断部位にわたって最小２０，０００のマージされたリードで配列決定した。最後に、カスタムパール（ｐｅｒｌ）スクリプトを使用して、バーコード化された試料の特徴付けを行った。簡潔に述べると、予想される切断部位の上流および下流の２０塩基のウィンドウ内の全ての挿入、欠失、または塩基変化（ＩＮＤＥＬ）は、ＣＲＩＳＰＲ誘発性改変であるとみなされた。ＩＮＤＥＬを含有するリードの数を、野生型配列を有するリードの数と比較して、動物および組織当たりのＢ４ｇａｌｔ１の編集の割合を決定した。
バーコード化された試料を、個々のリードに脱多重化した（ＦＡＳＴＱ形式）。次に、各ＦＡＳＴＱファイルのフォワードリードおよびリバースリードを、ＰＥＡＲプログラムを使用してマージした（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１４年３月１日；３０（５）：６１４－６２０に記載される）。マージされたリードを、Ｂｏｗｔｉｅ２プログラム（Ｌａｎｇｍｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１２年３月４日；９（４）：３５７－３５９に記載される）を使用して、ハツカネズミゲノムバージョン９（ｍｍ９）にマッピングした。各試料を、予想されるガイド切断部位にわたって最小２０，０００のマージされたリードで配列決定した。最後に、カスタムパール（ｐｅｒｌ）スクリプトを使用して、バーコード化された試料の特徴付けを行った。簡潔に述べると、予想される切断部位の上流および下流の２０塩基のウィンドウ内の全ての挿入、欠失、または塩基変化（ＩＮＤＥＬ）は、ＣＲＩＳＰＲ誘発性改変であるとみなされた。ＩＮＤＥＬを含有するリードの数を、野生型配列を有するリードの数と比較して、動物および組織当たりのＢ４ｇａｌｔ１の編集の割合を決定した。
【0143】
Ｔａｑｍａｎ発現解析
肝臓をＲＮＡＬａｔｅｒ安定化試薬（Ｑｉａｇｅｎ）に新鮮なままに解剖し、－２０°Ｃで保存した。組織をＴＲＩｚｏｌ中で均質化し、クロロホルムを相分離に使用した。全ＲＮＡを含有する水相を、ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｕａｇｅｎ、カタログ番号２１７００４）を用いて製造業者の仕様書に従って精製した。ＭａｇＭＡＸ（商標）Ｔｕｒｂｏ（商標）ＤＮａｓｅ緩衝液およびＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ（Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＡｍｂｉｏｎ）を使用してゲノムＤＮＡを除去した。ｍＲＮＡ（最大２．５ｕｇ）をＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ（商標）Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡを、ＡＢＩ ７９００ＨＴ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を使用して、ＳｅｎｓｉＦＡＳＹ Ｐｒｏｂｅ Ｈｉ－ＲＯＸ（Ｍｅｒｉｄｉａｎ）で増幅した。ｃＤＮＡ入力の差を標準化するための内部制御遺伝子として、Ｇａｐｄｈを使用した。
肝臓をＲＮＡＬａｔｅｒ安定化試薬（Ｑｉａｇｅｎ）に新鮮なままに解剖し、－２０°Ｃで保存した。組織をＴＲＩｚｏｌ中で均質化し、クロロホルムを相分離に使用した。全ＲＮＡを含有する水相を、ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｕａｇｅｎ、カタログ番号２１７００４）を用いて製造業者の仕様書に従って精製した。ＭａｇＭＡＸ（商標）Ｔｕｒｂｏ（商標）ＤＮａｓｅ緩衝液およびＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ（Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＡｍｂｉｏｎ）を使用してゲノムＤＮＡを除去した。ｍＲＮＡ（最大２．５ｕｇ）をＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ（商標）Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡを、ＡＢＩ ７９００ＨＴ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を使用して、ＳｅｎｓｉＦＡＳＹ Ｐｒｏｂｅ Ｈｉ－ＲＯＸ（Ｍｅｒｉｄｉａｎ）で増幅した。ｃＤＮＡ入力の差を標準化するための内部制御遺伝子として、Ｇａｐｄｈを使用した。
【0144】
血漿収集
マウスを一晩絶食し、その後４．５％イソフルランで麻酔した。ペダル反射の欠如を確認した後、眼窩後方の洞穿刺（ｒｅｔｒｏ－ｏｒｂｉｔａｌ ｓｉｎｕｓ ｔａｐ）を介して１５０～２００ｕｌの全血を採取し、Ｋ３ ＥＤＴＡ（Ｓｔａｒｓｔｅｄｔ）で被覆され、プロテアーゼ（Ｒｏｃｈｅ ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｍｉｎｉ ＥＤＴＡ Ｆｒｅｅ）およびＤＰＰ－４阻害剤を含有する血漿収集管に直ちに移した。血漿をエッペンドルフ管に収集し、－８０Ｃで保存した。
マウスを一晩絶食し、その後４．５％イソフルランで麻酔した。ペダル反射の欠如を確認した後、眼窩後方の洞穿刺（ｒｅｔｒｏ－ｏｒｂｉｔａｌ ｓｉｎｕｓ ｔａｐ）を介して１５０～２００ｕｌの全血を採取し、Ｋ３ ＥＤＴＡ（Ｓｔａｒｓｔｅｄｔ）で被覆され、プロテアーゼ（Ｒｏｃｈｅ ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｍｉｎｉ ＥＤＴＡ Ｆｒｅｅ）およびＤＰＰ－４阻害剤を含有する血漿収集管に直ちに移した。血漿をエッペンドルフ管に収集し、－８０Ｃで保存した。
【0145】
試料を、ＡＤＶＩＡ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＸＰＴ（シーメンス）を使用してアッセイした。肝臓脂質特性は、以下の試薬を含有する：アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）－（シーメンスＲＥＦ ０３０３６９２６）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）－（シーメンスＲＥＦ ０７４９９７１８）、コレステロール＿２（ＣＨＯＬ＿２）－（シーメンスＲＥＦ １０３７６５０１）、直接ＨＤＬコレステロール（Ｄ－ＨＤＬ）－（シーメンスＲＥＦ ０７５１１９４７）、ＬＤＬコレステロール直接（ＤＬＤＬ）－（シーメンスＲＥＦ ０９７９３２４８）、非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）－（和光９９９－３４６９１、９９５－３４７９１、９９１－３４８９１、９９３－３５１９１）、トリグリセリド＿２（ＴＲＩＧ＿２）－（シーメンスＲＥＦ １０３３５８９２）。試料を、アナライザーに充填し、試薬の混合、アッセイのタイミング、吸光度および濃度計算を、アナライザーによって行った。統計量は、Ｓｉｄａｋの多重比較検定（Ｐｒｉｓｍ）を用いた二元配置ＡＮＯＶＡを使用して計算された。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【配列表】
【国際調査報告】